Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung der

Strukturelle und biophysikalische
Charakterisierung der Oligomerisierung des
humanen Guanylat-bindenden Proteins 1
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie und Biochemie
an der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Adrian Syguda
aus Kattowitz
Bochum 2008
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom September 2004 bis zum Juni 2008 an der
Fakultät für Chemie und Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von
Herrn Prof. Dr. Christian Herrmann angefertigt.
Tag der mündlichen Prüfung:
Referent: Prof. Dr. Christian Herrmann
Koreferent: Prof. Dr. Hermann Weingärtner
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
2
Einleitung
1
1.1
T-Zell-vermittelte Immunität
1
1.2
Regulatorische, GTP-bindende Proteine
3
1.3
Große, Dynamin verwandte, GTPasen
6
1.3.1
Dynamin
7
1.3.2
Dynamin-verwandte Proteine
1
1.3.3
Mx-Proteine
12
1.3.4
Guanylate-bindende Proteine
14
1.4
Das humane Guanylate-bindende Protein 1
19
1.5
Zielsetzung
25
Material und Methoden
2.1
2.2
26
Material
26
2.1.1
Chemikalien
26
2.1.2
Enzyme und Marker
26
2.1.3
Reagenzienkits
27
2.1.4
Säulenmaterialien
27
2.1.5
Mikroorganismen
27
2.1.6
Vektoren
28
2.1.7
Antibiotika
29
2.1.8
Oligonukleotide
29
2.1.9
Nährmedien
30
Molekularbiologische Methoden
32
2.2.1
Isolierung von Plasmid-DNA
32
2.2.2
Polymerase-Kettenreaktion
33
I
Inhaltsverzeichnis
2.3
2.4
2.2.3
Sequenzierung
33
2.2.4
Herstellung kompetenter Zellen
34
2.2.5
Transformation
34
2.2.6
Agarosegelelektrophorese
34
2.2.7
Isolierung von DNA aus Agarosegelen
35
2.2.8
Restriktionsenzymatischer Verdau von DNA
35
2.2.9
Ligation
35
2.2.10 Isolation von Gesamt-RNA aus HUVEC
35
2.2.11 Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVECs
36
2.2.12 Darstellung kompetenter Hefen
37
2.2.13 Transformation in Hefen
37
2.2.14 Hefe 2-Hybrid Screen
38
Proteinbiochemische Methoden
39
2.3.1
Präparative Proteinexpression und Ultraschallaufschluss
39
2.3.2
Glutathion-Affinitätschromatographie
39
2.3.3
Nickel-NTA-Affinitätschromatographie
40
2.3.4
Größenausschlußchromatographie
40
2.3.5
Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration
40
2.3.6
Denaturierende SDS-Gelelektrophorese
40
2.3.7
Konzentrationsbestimmung nach Gill & von Hippel
41
2.3.8
Markierung von Proteinen mit Fluoreszenzfarbstoffen
41
Biophysikalische Methoden
42
2.4.1
Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen
42
2.4.2
Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC
42
2.4.3
Messungen der Nukleotidhydrolyse
43
II
Inhaltsverzeichnis
3
Stopped-flow Kinetik
44
2.4.5
Fluoreszenztitration mit mant-Nukleotiden
45
2.4.6
Größenausschlusschromatographie
45
2.4.7
Dynamische Lichtstreuung
46
2.4.8
Temperatursprung
46
2.4.9
FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)
48
Ergebnisse
3.1
3.2
3.3
4
2.4.4
49
hGBP1
49
3.1.1
Identifizierung einer elektrostatischen Interaktionsstelle
49
3.1.2
Proteinaufreinigung
52
3.1.3
Dynamische Lichtstreuung
52
3.1.4
Analytische Größenausschlusschromatographie
58
3.1.5
Nukleotidaffinität
64
3.1.6
Dynamik der Nukleotidbindung
66
3.1.7
Nukleotidhydrolyse
68
3.1.8
Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne
73
Identifizierung eines hGBP1 Interaktionspartners
77
3.2.1
Darstellung einer INF-γ induzierten HUVEC cDNA-Bank
78
3.2.2
Hefe 2-Hybrid-Screen
79
Biochemische Charakterisierung von hGBP2
3.3.1
Nukleotidabhängige Oligomerisierung
81
3.3.2
Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse
82
3.3.3
Dynamik der Nukleotidbindung
84
3.3.4
Interaktion von hGBP1 und hGBP2
86
Diskussion
92
III
Inhaltsverzeichnis
5
Zusammenfassung
110
6
Literaturverzeichnis
113
7
Anhang
122
7.1
Abkürzungsverzeichnis
122
7.2
Abbildungsverzeichnis
124
7.3
Tabellenverzeichnis
125
IV
Einleitung
1 Einleitung
1.1
T-Zell-vermittelte Immunität
Das angeborene Immunsystem ist für eine schnelle Verteidigung gegen Pathogene
zuständig und bildet die erste Verteidigungslinie während einer Infektion. Interferone
(IFN), Chemokine, Hämatopoetine und die Mitglieder der Tumornekrosefaktor-Familie
gehören aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu der Familie der Cytokine. Sie werden
von T-Zellen nach Antigenerkennung de novo synthetisiert und beeinflussen das Verhalten
oder die Eigenschaft dieser und anderer Zellen. Eines der wichtigsten Cytokine, das von
CD8-T-Effektorzellen freigesetzt wird, ist
das Interferon-γ (IFN-γ). Seine Aufgabe ist
es, die virale Replikation zu hemmen und
sorgt darüber hinaus dafür, dass das Virus
aus infizierten Zellen völlig eliminiert wird
ohne diese Zelle zu töten. Diese wichtige
antivirale Bedeutung der Interferone konnte
an knock-out Mäusen demonstriert werden,
Abbildung 1-1: Humanes Interferon-γ
Darstellung des humanen Interferon-γ im
Bändermodell (PDB: 1HIG). Das in Lösung als
Dimer vorliegende Protein ist hauptsächlich αHelikal aufgebaut und besitzt keine βFaltblätter (Ealick, S.E et al., 1991).
denen die Rezeptoren für INFα/β und INF-γ
fehlen (van den Broek et al., 1995). Viele
Cytokine wirken aber auch lokal und
unterstützen
Effektoren.
dabei
Diese
membrangebundene
membrangebundenen
Effektoren können nur Rezeptoren einer Zelle binden, die mit ihnen in Kontakt sind. So
hat das von TH1-Zellen gebildete IFN-γ und der Tumornekrosefaktor (TNF) auf einige
Zellen eine cytotoxische Wirkung, da sie Makrophagen aktivieren, welche gezielt
infizierte Zellen vernichten können.
Cytokine beeinflussen ihre Zielzellen, indem sie spezifisch an zwei unterschiedlichen
Rezeptoren binden. Einer dieser Rezeptoren wird, da alle Interferone des Typs I an ihnen
binden, Typ I Interferon Rezeptor genannt. Er ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, dem
IFNαR1 und IFNαR2, die cytosolisch mit janus activated kinase (JAK) und tyrosine
kinase 2 (TYK2) assoziiert sind. Der zweite Rezeptortyp ist ebenfalls aus zwei
-1-
Einleitung
Untereinheiten aufgebaut (INFGR1 und INFGR2) und wird Typ II Interferon Rezeptor
genannt. Aktiviert wird er von Interferonen des Typs II (Platanias, 2005). Diese
Rezeptoren dimerisieren nach Bindung und aktivieren so die cytoplasmatischen Domänen,
indem sie sich gegenseitig phosphorylieren (Shuai et al., 1994).
Abbildung 1-2: JAK-STAT-Signalweg.
Die Dimerisierung der Rezeptoren nach Bindung von Typ I oder Typ II Interferonen führt zu einer
Tyrosin Phosphorylierung von STAT1 bzw. STAT2 und folglich zu ihrer Aktivierung. Die Aktivierung
von STAT1 und STAT2 führt zur Bildung von STAT1 Homodimeren oder zur Heterodimerisierung
von STAT1 und STAT2 welche dann an IRF9 (INF-regulatory faktor 9) binden. Diese Komplexe sind
in der Lage in den Zellkern einzudringen um dort an die Promotorelemente ISRE bzw. GAS für die
Aktivierung nachgeschalteter Gene zu binden (Abbildung entnommen aus Platanias, 2005).
-2-
Einleitung
Diese cytoplasmatischen Kinasen gehören zu den Janus-Kinasen, die aus einer Gruppe
naher verwandter Enzyme bestehen, die man als Jak1, Jak2, Jak3 und Tyk2 bezeichnet.
Diese Kinasen aktivieren wiederum Proteine die man als Signal Transducers and
Activators of Transcription (STAT) bezeichnet (Darnell, J.E. et al., 1994).
In Säugetieren gehören ihrer Familie sieben Mitglieder an (STAT1, STAT2, STAT3,
STAT4, STAT5a, STAT5b und STAT6). Bei Aktivierung des Rezeptors kommt es,
abhängig von Rezeptor und Ligand, zur Homo- oder Heterodimerisierung bestimmter
STATs. Ebenso sind liganden- und rezeptorspezifische JAKs beteiligt. So führt Interferonγ unter Beteiligung von JAK1 und JAK2 zur Homodimerisierung von STAT1. Interferon α
und β führen, unter Beteiligung von JAK1 und TYK2, zu einer Heterodimerisierung von
STAT1 und STAT2. Nach Aktivierung sind diese Komplexe fähig in den Zellkern
einzudringen, um dort durch Bindung an interferon response element (ISRE) genannte
Abschnitte der DNA, die Transkription bestimmter Gene in Gang zu setzten (Darnell, J.E.
et al., 1994) Es wurden bereits weit über 1000 Gene identifiziert, deren Transkription so
Aktiviert wird. Darunter sind drei Klassen von GTP-bindenden Proteinen: Die MxGTPasen, die p47 GTPasen und die p65 GTPasen, zu denen auch die humanen Guanylatbindenden Proteine gehören.
1.2
Regulatorische, GTP-bindende Proteine
An vielen fundamentalen, zellulären Prozessen nehmen GTP-bindende Proteine teil, so
wie zum Beispiel an der intrazellulären Signalweiterleitung, der Proteinbiosynthese, der
Organisation des Cytoskeletts oder dem vesikulären Transport (Bourne HR. et al., 1990).
Aufgrund von Sequenzhomologien lassen sich die GTP-bindenden Proteine in mindestens
fünf Superfamilien einteilen:
-3-
Einleitung
Heterotrimere
G-Proteine
Signalerkennungs
partikel
Die fünf Superfamilien der
regulatorischen GTPasen
SRP54
SR
Ffh
Ras-homologe
kleine GTPasen
Ras
Rho
Ran
Rab
Arf
Faktoren für die
Proteinsynthese
EF-Tu
EF-G
IF-2
RF-3
Gαs
Gαi
Gαq
Gα12
Große, Dynamin
verwandte, GTPasen
Dynamin
Mx-Proteine
Mitofusine
GBP
Atlastin
Allen regulatorischen GTPasen gemeinsam ist die Mg2+-abhängige Bindung von
Guaninnukleotiden und die Hydrolyse von GTP zu GDP und freiem Orthophosphat, die
durch konservierte Sequenzmotive vermittelt wird (Bourne et al., 1991). Die größte
Gruppe unter den Guaninnukleotid-bindenden Proteinen (GNBPs), stellt die RasSuperfamilie dar. Es sind kleine monomere GTPasen mit einem Molekulargewicht von 2030kDa.
Die biologische Aktivität der Ras-homologen GTP-bindenden Proteine wird durch den
Nukleotidzustand reguliert (Abbildung 1-3). Die GTP-bindenden Proteine sind im GDPgebundenen Zustand inaktiv. Die Dissoziation des GDP führt zu einem nukleotidfreien
Zustand, der wegen der hohen GTP-Konzentration in der Zelle nur als kurzlebiges
Intermediat auftritt. Die Bindung von GTP induziert eine Konformationsänderung des
Proteins, das daraufhin mit seinen Effektoren interagieren kann. Die Hydrolyse des GTP
zu GDP und Orthophosphat versetzt das Protein wieder in den inaktiven Zustand.
-4-
Einleitung
Pi
Ras*GDP
GEF
GAP
H2O
GTP
Ras*GTP
GDP
Effektorbindung
Abbildung 1-3: GTPase-Zyklus von Ras.
Schematische Darstellung des GTPase-Zyklus. Der aktive Zustand des Ras-Proteins wird durch die
GTP-beladene Form dargestellt, der inaktive durch die Beladung mit GDP. Die GTP-Hydrolyse
kann durch GAPs, der Nukleotidaustausch durch GEFs beschleunigt werden.
Durch verschiedene Regulatoren ist eine Modulation der GTPase Aktivität möglich. Der
Guaninnukleotid Austauschfaktor (GEF), beschleunigt den Austausch von GDP zu GTP
und bewirkt so eine beschleunigte Aktivierung des Proteins. Es besteht bei einigen
GTPasen (Rho, Rab) ebenfalls die Möglichkeit den Austausch zu verlangsamen, indem ein
Guaninnukleotid-Dissoziationsinhibitor (GDI) bindet. Die Inaktivierung der GTPase, die
durch die Hydrolyse von GTP zu GDP und Orthophosphat (Pi) erfolgt, kann durch
GTPase-aktivierende Proteine (GAP) beschleunigt werden.
Mutationen, welche die Interaktion mit GEFs oder GAPs inhibieren, unterbrechen den
Reaktionszyklus und führen zu permanent inaktiven bzw. aktiven GNBPs. Beispielsweise
ist ein aufgrund einer Mutation in der Switch II-Region oder P-Schleife, konstitutiv
aktiviertes Ras-Protein der auslösende Faktor in etwa 10 bis 20% aller menschlicher
Tumoren.
Die bis heute bekannten Kristallstrukturen von Guaninnukleotid-bindenden Proteinen
(GNBPs) zeigen ein sehr homologes Bild der Guaninnukleotid-bindenden Domäne und
geben einen Hinweis darauf, dass diese Domänen einen gemeinsamen evolutionären
Ursprung haben müssen (Bourne, et al., 1990; Bourne, et al., 1991) Vergleicht man die
Struktur GTP-bindener Proteine miteinander, kann die Guaninnukleotid-bindende Domäne
auf eine minimale GTPase-Domäne reduziert werden. Diese minimale GTPase-Domäne
-5-
Einleitung
besteht aus ca. 170 Aminosäuren die strukturell sechs β-Faltblätter und fünf α-Helices
bilden (Milburn et al., 1990).
Eine weitere Gemeinsamkeit neben der Struktur sind die stark konservierten
Bindungsmotive, die einen Teil der Nukleotid- Bindungstasche bilden (Bourne et al.,
1991). Das G1-Motiv, oder auch P-loop genannt, enthält die Konsensussequenz
GX4GK(S/T). Diese Region bildet strukturell eine Schleife, bei denen die Amidprotonen
des Proteinrückgrads und die ε-Aminogruppe des Lysins für die Koordination der α- und
β-Phosphate vom GTP bzw. GDP zuständig sind (Saraste et al., 1990, Walker et al., 1982).
Ein konserviertes Threonin im G2-Motiv, auch switch I genannt, ist in die Hydrolyse des
GTP involviert. Dabei geht die Seitenkette einen H-Brückenkontakt zum γ-Phosphat und
zum Mg2+-Ion ein und hilft so, den GTP-Mg2+-Komplex im aktiven Zentrum korrekt zu
positionieren. Durch die korrekte Positionierung des Mg2+-Ions werden die Ladungen vom
β- und γ-Phosphat vom GTP abgeschirmt und somit ein nukleophiler Angriff von Wasser
an diesen Phosphatresten ermöglicht. Das G3-Motiv (switch II) enthält die Sequenz
DXXG, bei der das Glycin eine Wasserstoffbrückenbindung zu dem γ-Phosphat vom GTP
ausbildet. Das Aspartat bindet durch ein Wassermolekül an das katalytisch aktive Mg2+.
Das vierte Motiv (G4) enthält die Sequenz N/TKXD und konnte zuerst bei dem Protein Ras
gezeigt werden. Das Aspartat bildet eine Wasserstoffbrückenbindung zur Guaninbase aus,
und ist somit für die spezifische Erkennung der Guaninbase zuständig.
1.3
Große, Dynamin verwandte, GTPasen
Die Familie der großen, Dynamin verwandten, GTPasen beinhaltet Proteine die zwar eine
hohe strukturelle Ähnlichkeit zu den kleinen Ras-homologen Proteinen aufweisen, aber
einen deutlichen Unterschied in ihrer Funktion zeigen (Smirnova et al., 1999; Danino et
al., 2001; Praefcke and McMahon, 2004; Song et al., 2002). Die Dynamin verwandten
GTPasen haben eine molekulare Masse zwischen 60 und 100kDa und eine recht ähnliche
strukturelle Zusammensetzung. Allen gemeinsam ist die GTPase Domäne, dessen Aufbau
der
minimalen
Ras-GTPase
Domäne
entspricht,
wobei
zusätzlich
Sekundärstrukturelemente insertiert sind. Carboxyterminal folgt eine Mitteldomäne und
eine GTPase-Effektor Domäne (GED). Diese Domänen sind weniger stark konserviert und
-6-
Einleitung
spielen eine wichtige Rolle in der intramolekularen Faltung (Schumacher und Staeheli,
1998) und der Selbstassemblierung von Mitgliedern der Dynamin-Superfamilie
(Ramachandran et al., 2007; Praefcke and McMahon, 2004). Die Selbstassemblierung ist
ein Weg die Geschwindigkeit der GTPase-Aktivität zu erhöhen, ohne damit zusätzlich auf
GAPs oder GEFs angewiesen zu sein, wie es z.B. bei Ras der Fall ist (Danino et al., 2001).
Über die Pleckstrin-Homologie Domäne (PH-Domäne), sind einiger Mitglieder der
Familie in der Lage mit Phospholipiden zu interagieren und sie ist somit wichtig für die
Endocytose (Zheng et al., 1996; Vallis et al., 1999; Lee et al.; 1999).
Mitglieder der Dynamin-Superfamilie konnten bereits in vielen unterschiedlichen
eukaryontischen Organismen identifiziert werden. Darunter H.sapiens, D. melanogaster,
C.elegans, S.Pombe, S.cerevisiae, A.thaliana und D. discoideum. Ein weiteres, einfacheres
Dynamin-ähnliches Protein, konnte in der Rotalge C. merolae gefunden werden, ist aber
noch nicht näher charakterisiert (Nishida et al., 2003).
1.3.1
Dynamin
Erstmalig wurde Dynamin aus Rinderhirn als
100kDa großes, Mikrotubulin assoziiertes Protein
extrahiert (Shpetner HS et al., 1989). Weitere
Analysen
der
Sequenz
weisen
eine
hohe
Sequenzhomologie des N-Terminalen Bereichs zu
anderen GTPasen, wie Mx oder Vps1p, auf (van
der Bliek et al., 1999). Die wichtigen GTPBindungsmotive
identifiziert
konnten
werden.
bei
Dynamin
Dynamin
spielt
eine
essentielle Rolle in der Endocytose von Clathrin
umhüllten Vesikeln. Dabei übernimmt das
Protein die Aufgabe, die Vesikel von der
Membran abzuschnüren (Koenig und Ikeda,
1989; Damke et al., 1994). Diese wichtige
Funktion
konnte
erstmals
bei
der
Abbildung
1-4:
Elektronenmikroskopische
Aufnahme
der
Ringbildung um Lipidnanoröhren.
Aufgereinigtes Dynamin wurde mit
Lipidnanoröhren unter physiologischen
ionischen
Bedingungen
inkubiert.
Daraufhin bilden sich Ringe um die
Röhren (aus Stowell et al., 1999).
temperatursensitiven Mutante shibire in Drosophila melanogaster beobachtet werden, die
bei einer bestimmten Temperatur reversibel gelähmt wird (Grigliatti et al., 1973). Die
-7-
Einleitung
Ursache für die Lähmung ist ein Defekt in der Endocytose, bei der die Vesikel an den
Membranen der Synapsen persistieren. Die Folge ist eine Verarmung an Neurotransmittergefüllten Vesikeln und damit eine Unterbrechung der synaptischen Signalweiterleitung.
Die Unterbrechung der Endocytose konnte durch einen Fehler im Mechanismus der
Abschnürung der Vesikel erklärt werden (Koenig und Ikeda, 1989). Einen ähnlichen
Effekt auf die Vesikelabschnürung beobachtet man, wenn Synapsen mit dem nicht
hydrolysierbaren GTP Analogon GTPγS inkubiert wird (Takai et al., 1995). Dabei bilden
sich lange röhrenförmige Membraneinstülpungen die mit Hilfe eines Elektronenmikroskop
sichtbar gemacht werden kann. Diese Röhren sind dabei mit Ringen umgeben, die aus
Dynamin bestehen. Diese Ringe können auch in vitro erhalten werden, wenn Dynamin mit
Lipidnanoröhren unter physiologischen ionischen Bedingungen inkubiert wird (Hinshaw et
al.,
1997).
Die
elektronenmikroskopische
Aufnahme
der
mit
Dynaminringen
umschlossenen Lipidnanoröhren ist in Abbildung 1-4 zu sehen. Alle zurzeit bekannten
Dynamine sind aus fünf Domänen aufgebaut. Die N-terminal gelegene GTPase-Domäne
zeigt alle klassischen Sequenzmotive der G-Proteine. Die Kristallstruktur der GTPaseDomäne von Dynamin A aus Dictyostelium discoideum konnte im nukleotidfreien Zustand
und in Komplex mit GDP gelöst werden (Abbildung 1-5) (Niemann et al., 2001).
Strukturell unterscheidet sich die GTPase-Domäne durch mehrere Insertionen von der
minimalen GTPase-Domäne von Ras.
Carboxyterminal
von
der
GTPase-
Domäne schließt sich die Mitteldomäne
an, gefolgt von der PH-Domäne , der
GED und der PRD die als Domäne für
Interaktionspartner von Dynamin zur
Verfügung steht (Abbildung 1-6).
Abbildung 1-5: Kristallstruktur der GTPaseDomäne von Dynamin A.
Abgebildet ist die Kristallstruktur der GTPaseDomäne von Dynamin A aus Dictyostelium
discoideum im Bändermodell. Die Struktur
unterscheidet sich durch mehrere Insertionen zur
minimalen GTPase-Domäne von Ras.
Der
genaue
Mechanismus
Vesikelabschnürung
Vergangenheit
wurde
kontrovers
in
der
der
diskutiert.
Durch die Kombination von Röntgenstrukturanalyse und Kryo-ElektronenMikroskopie wurde vor kurzem ein
Modell für die Dynamin-vermittelte Membran-Abschnürung veröffentlicht. (Mears et al.,
2007). In Lösung liegt Dynamin als Tetramer vor, bevor es in Gegenwart von GTP zu
großen helikalen Strukturen assembliert (Binns et al., 1999; Muhlberg et al., 1997; Carr
-8-
Einleitung
und Hinshaw, 1997). Diese Dynaminhelix legt sich um den Hals entstehender Vesikeln.
Durch die Hydrolyse des GTPs kommt es zur Konformationsänderungen, welche die
gleichzeitige Stauchung und Verengung der Dynaminhelix zur Folge hat und die
Abschnürung des Vesikels bewirkt (Mears et al., 2007). Dynamin zeigt damit das
Verhalten einer molekularen Maschine bei dem die Energie der Nukleotidhydrolyse in
mechanische Arbeit umgewandelt wird.
GTPase
Middle
PH
GED
PRD
Abbildung 1-6: Anordnung der Domänen von Dynamin
Das 100kDa große Dynamin teilt wird in fünf verschiedene Domänen unterteilt. Carboxyterminal
von der GTPase-Domäne schließt sich die Mitteldomäne an, gefolgt von der PH-Domäne
(Pleckstrin homolog), der GED (GTPase Effektor Domäne) und der PRD (Prolinreiche-domain).
(Entnommen aus Praefcke und McMahon, 2004.)
Für die Selbstassemblierung von Dynamin konnte die Mitteldomäne als wichtigste
Interaktionsfläche identifiziert werden (Ramachandran et al. 2007). Durch Mutationen
zweier Arginine zu Alaninen in der Mitteldomäne konnte die tetramere Struktur von
Dynamin gestört und die Bildung höherer oligomere Strukturen verhindert werden. Aber
auch die GED-Domäne scheint eine zentrale Rolle bei der Selbstassemblierung zu spielen
(Muhlberg et al., 1997). Es wurde weiterhin vermutet, dass die GED von Dynamin bei
Selbstassemblierung einen positiven Effekt auf die GTPase-Aktivität besitzt (Muhlberg et
al., 1997; Warnock et al., 1996). Aber die Funktion der GED von Dynamin als ein GAP,
welches wie bei Ras ein katalytisches Arginin in die richtige Position bringt, konnte nicht
bestätigt werden (Marks et al., 2001). Vielmehr konnten durch die Mutationen R361S und
R399A in der Mitteldomäne gezeigt werden, dass diese Domäne neben dem
Oligomerisierungsverhalten auch die Stimulation der GTPase Aktivität beeinflusst
(Ramachandran et al. 2007). Eine genaue Beschreibung der Mechanismen der
Oligomerisierung und der Stimulation der GTP-Hydrolyse sind noch nicht bekannt.
-9-
Einleitung
1.3.2
Dynamin-verwandte Proteine
Neben den echten Dynaminen gibt es auch die Dynamin-verwandten Proteine, die zwar
eine strukturelle Homologie aufweisen, aber deren Funktion und Lokalisation sich von
Dynamin unterscheidet. Strukturell unterscheiden sich die Dynamin-verwandten Proteine
von den klassischen Dynaminen durch das Fehlen der PH-Domäne und/oder der PRDomäne. Allen gemein ist jedoch die GTPase Domäne mit den konservierten
Sequenzmotiven GTP-bindender Proteine. Aufgrund ihrer zellulären Funktion werden die
Mitglieder der Dynamin-verwandten Proteine in Unterfamilien geordnet.
Neben dem klassischen Dynamin ist auch das Vps1p (Vacuolar-Protein-Sorting-1-Protein)
aus S. cerevisiae in den vesikulären Transport involviert (Rothman et al., 1990).
Strukturell unterscheidet sich das Vps1p von Dynamin durch das fehlen der PH- und PRDomäne, besitzt aber zusätzliche Insertionen in der GTPase-Domäne und zwischen der
Mitteldomäne und der GED. Es kontrolliert den Transport zwischen dem trans-Golgi
Netzwerk (TGN) und Endosomen. Für diesen Transport scheint die GTPase-Domäne
alleine ausreichend zu sein, wobei der C-terminale Teil des Proteins mit der GolgiMembran interagiert (Ekena et al., 1993; Vater et al., 1992; Wilsbach et al., 1993). Das
79kDa große Vps1p ist Teil eines Multiproteinkomplexes, welcher für die Sortierung von
Proteinen in die Vesikel (Ekena et al., 1993)zuständig ist. Weiterhin scheint Vps1p einen
Einfluß auf die Anzahl von Peroxisomen zu haben (Hoepfner et al., 2001).
Andere Mitglieder der Dynamin-verwandten Proteine sind in die mitochiondriale
Morphologie involviert. Zu dieser Gruppe zählt das im Menschen und im C.elegans
gefundene Dynamin-related protein 1 (Drp1), das auch als Dynamin related (Dnm1p) aus
S. cerevisiae und Dynamin-like protein1 (Dlp1) bekannt ist. Das Dlp1 ist ein 80kDa großes
Protein, welchem im Vergleich zum Dynamin die PR-Domäne fehlt. Dlp1 konnte in
Lokalisationsstudien an Mitochondrien und anderen Organellen wie z.B. an Peroxisomen
gefunden werden (Yoon et al., 1998; Pitts et al., 1999). Wie auch das Dynamin, liegt Dlp1
unter physiologischen Bedingungen als Homotetramer vor. Das Dlp1 ist für die Spaltung
von Mitochondrien notwendig. Desweiteren konnte auch die Spaltung von Peroxisomen
und eine Assoziation am endoplasmatischen Retikulum gezeigt werden (Koch et al., 2003;
Pitts et al., 1999).
Das 100kDa Protein Mitochondrial genome maintenance 1-protein (Mgm1) aus S.
cerevisiae, welches im Menschen als Optic atrophy type I (Opa1) und in S. pombe als
- 10 -
Einleitung
Msp1 bekannt ist, wird ebenfalls mit der Morphologie von Mitochondrien in Verbindung
gebracht. Diese Proteine haben die gleiche Domänenarchitektur wie Dlp1 mit dem
Unterschied einer zusätzlichen, aminoterminal gelegenen mitochondrialen Importsequenz
(Guan et al., 1993). Diese Sequenz lokalisiert die Proteine an der inneren und äußeren
Mitochondrienmembran. Im Gegensatz zu den Dlp´s sind diese Proteine an der
Mitochondrienfusion beteiligt und gelten daher als Dlp Antagonisten (Olichon et al., 2002;
Satoh et al., 2003). Mutationen in Mgm1 bzw. Msp1 führen zu einer Fragmentierung von
Mitochondrien (Wong et al., 2003), die auch bei Expression von dominant negativen Drp1
Mutanten beobachtet wird.
Die humanen Proteine Mitofusin 1 und 2 (Mfn1/2) sind an der äußeren Membran von
Mitochondrien
lokalisiert
und
ebenfalls
essentiell
für
eine
GTP
abhängige
Mitochondrienfusion (Eura et al., 2003; Chen et al., 2003). Zwei weitere Mfn-Homologe
Proteine sind in D. melanogeaster (FZO) und der Hefe (Fzo1) zu finden.
Die Proteine plant-dynamin like (PDL) aus der Sojabohne und arabidopsis dynamin-like 1
(ADL1) aus Arabidopsis thaliana sind ebenfalls homologe Dynamin-verwandte Proteine
die in Pflanzen gefunden werden konnte. Das 68kDa große PDL ist während der
Zellteilung an Vesikeln der Zellplatte lokalisiert (Gu et al., 1997). Das ArabidopsisDynamin like protein 1 (ADL1) konnte an Thylakoidmembranen von Chloroplasten
gefunden werden (Park et al., 1998).
Abbildung 1-7: Kristallstruktur des dimeren BDLP in GDP-gebundenem Zustand.
Die Bindung von GDP induziert die Homodimerisierung des bacterial dynamin-like protein
(BDLP), indem die GTPase-Domänen und die „Spitzen“ der eingeklappten helikalen Domäne
miteinander Interagieren. Aminoterminal von der GTPase-Domäne (Rot) liegt noch ein 67
Aminosäuren großes Helixelement (Blau). Die C-terminal gelegene, helikale Domäne (Grün)
interagiert nach einer Wende mit der GTPase-Domäne. (PDB: 2j68)
- 11 -
Einleitung
In den Genomen mehrerer Prokaryonten konnten ebenfalls offene Leserahmen entdeckt
werden, die für Dynamin-verwandte Proteine kodieren (van der Bliek et al., 1999).
Kürzlich konnte ein DLP aus dem Cyanobakterium N. punctiforme isoliert werden (Low,
Löwe, 2006). Das bacterial dynamin-like protein (BDLP) genannte Protein zeigt in
Anwesenheit von GppNHp und Lipidextrakt aus E.coli die Bildung von langen
röhrenförmigen Membraneinstülpungen, die mit Hilfe eines Elektronenmikroskops
sichtbar gemacht werden konnten. Diese Röhren sind dabei mit Ringen umgeben, die aus
BLDP´s bestehen, analog zu den Beobachtungen, die bei Dynamin gemacht wurden
(Sweitzer et al., 1998). Dieses Protein konnte mittlerweile in nukleotidfreier und GDPgebundener Form kristallisiert werden (Abbildung 1-7). Es konnten klassische Dynamin
Strukturelemente wie die GTPase Domäne, die Mitteldomäne und die GED gefunden
werden. Der Sequenzvergleich zeigt die höchste Homologie zu Mitofusinen, wie das Fzo
aus D. melanogoaster und dem FZL aus A. thaliana.
1.3.3
Mx-Proteine
Die Mx-Proteine nehmen eine Schlüsselrolle ein bei der Typ I Interfron induzierten
antiviralen Immunantwort (Haller et al., 1998). Im Laborversuch an Mäusen konnte die
zentrale Rolle bei der Immunabwehr von RNA-Viren gezeigt werden (Haller und Kochs,
2002). Die Mx-Proteine haben eine Masse von 70-80kDa und besitzen eine hohe
Homologie zum humanen Dynamin und den Vps1 aus der Hefe. Im Vergleich zum
klassischen Dynamin besitzen die Mx-Proteine keine PR und PH-Domäne. Im Menschen
konnten zwei Isoformen identifiziert werden, die beide auf Chromosom 21 lokalisiert sind
und mit MxA und MxB bezeichnet werden (Haller et al., 2002). Es konnte nur für MxA
eine antivirale Aktivität nachgewiesen werden. Das MxA hat eine Masse von 76kDa, liegt
cytoplasmatisch vor und besitzt eine antivirale Aktivität gegen Mitglieder der Bunyaviren,
Togaviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Rhabdoviren, Picornaviren und Hepatitis B
Viren (Zurcher et al., 1992; Hefti et al., 1999; Landis et al., 1998; Haller et al., 2002). Die
Lokalisation der Mx-Proteine variiert je nach Isoform und Virusbefall der Zelle zwischen
cytoplasmatisch und nukleär. Für MxA konnte eine Assoziation mit dem glatten
endoplasmatischen Retikulum nachgewiesen werden (Accola et al., 2002). Frühere
Vermutungen, in denen MxA mit Aktin und dem Zytoskelett assoziiert ist, konnten nicht
- 12 -
Einleitung
bestätigt werden. MxA zeigt analog zu Dynamin eine relativ niedrige Nukleotidaffinität im
mikromolaren Bereich und neben der hohen GTPase Aktivität auch die Fähigkeit zur
Selbstassemblierung (Richter et al., 1995; Nakayama et al., 1993). In Experimenten unter
physiologischen Salzbedingungen, zeigte MxA eine lange filamentöse Struktur, die unter
dem Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden kann. In Gegenwart von
Guaninnukleotiden zeigte sich analog zu Dynamin eine Assemblierung zu einer
ringförmigen Struktur (Kochs et al., 2002). Da das Protein nach der INF-Stimulation nur
für
eine
sehr
kurze
Zeit
expremiert
wird,
wird
angenommen
das
eine
Homooligomerisierung ein Weg ist, einen stabilen intrazellulären Pool von MxA zu
schaffen, um das Protein für einen längeren Zeitraum verfügbar zu machen. Das
monomere MxA könnte möglicherweise nach Dissoziation vom homooligomeren
Komplex aktiv in der antiviralen Abwehr werden (Janzen et al., 2000; Haller and Kochs,
2002).
Abbildung 1-8: Gegenwärtiges Modell der
MxA Aktivität.
Das MxA assembliert wahrscheinlich zu
einem homooligomeren Komplex, wenn
keine antivirale Aktivität erforderlich ist.
Diese Form der „Lagerung“ ermöglicht das
Protein für einen längeren Zeitraum
verfügbar zu halten. Erst das monomere
Protein ist aktiv und in der Lage sich ein
virales Ziel zu suchen. Dieses Ziel kann ein
virales Nukleokapsid oder Nukleokapsid
ähnliches Objekt sein, an dem MxA bindet
um so einen intrazellulären Transport zu
inhibieren (entnommen aus Haller and
Kochs, 2002)
In die Selbstassemblierung von MxA ist die Mitteldomäne und die GED beteiligt und bei
Deletion der GED ist eine verminderte GTPase-Aktivität zu beobachten (Schwemmle et
al., 1995). Beide Domänen, sowohl die GED als auch die Mitteldomäne sind für die
antivirale Aktivität wichtig. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass diese Domänen an
- 13 -
Einleitung
der Bindung von viralen Nukleokapsid-Proteinen beteiligt sind. Anhand dieser Daten
konnte ein vorläufiges Modell der MxA Aktivität erstellt werden (Abbildung 1-8.)
Weiterhin scheint MxA in der Lage zu sein in Abwesenheit von einer Lipid
interagierenden Domäne an Membranen zu binden und diese zu tubulären Strukturen zu
formen (Accola et al., 2002).
Für das humane MxB konnte bis heute keine antivirale Funktion nachgewiesen werden. Es
zeigte sich das MxB ausschließlich extrazellulär vorliegt und hauptsächlich auf der
zytoplasmatischen Seite von Kernporen zu finden ist, was auf seine Funktion hindeutet.
Durch Expression einer dominant negativen MxB Mutante konnte tatsächlich eine
Blockierung des Zellkern-Imports beobachtet werden (King et al., 2004). Ein weiterer
Effekt der Mutation war die Blockierung des Zellzyklus zwischen der G1 und der S-Phase.
Mit Hilfe der RNAi-Technologie konnte in einem anderen Experiment das Gen für MxB
ausgeschaltet werden. Es konnte zwar ebenfalls eine Blockierung des Zellzyklus, aber
nicht der Effekt auf den Zellkernimport beobachtet werden (King et al., 2004).
1.3.4
Guanylat-bindende Proteine
Nach der Behandlung von humanen Fibroblasten mit Interferonen konnte gezeigt werden,
dass eine Replikation von vesicular stomatitis virus (VSV) in den Zellen inhibiert ist. Der
anschließende Vergleich des Zelllysats mit dem von unbehandelten Zellen zeigte die
Expression von vier unterschiedlichen Proteinen mit einer Masse von 44kDa bis 68kDa,
die wahrscheinlich für den Replikations-inhibierenden Effekt verantwortlich sind (Knight
and Korant, 1979). Für zwei dieser Proteine konnte die Bindung an Agaroseimmobilisiertes Guaninnukleotid nachgewiesen werden. Die Bindung an andere
Nukleotide konnte nicht gezeigt werden (Cheng et al., 1982). Bei diesen Versuchen zeigte
sich, dass sich die Affinitäten, mit denen GMP, GDP und GTP gebunden wurden, keine
Unterschiede aufwiesen. Nach ihrer Eigenschaft und ihrer Größe wurden die beiden
Proteine 67k GBP und 56k GBP (Guanylate-Binding-Proteins) genannt (Cheng et al.,
1985; Cheng et al., 1991). Bei der Klonierung der cDNA konnten zunächst zwei 67k GBP
Isoformen im Menschen und eins in der Maus gefunden werden (Cheng et al., 1991).
Im Menschen wurden mittlerweile sieben GBP-Isoformen identifiziert (Cheng et al., 1991;
Fellenberg et al., 2004; Olszewski et al., 2006; Tripal et al., 2007). Alle sieben humanen
- 14 -
Einleitung
GBP´s und ein Pseudogen (ψGBP1) sind innerhalb eines Clusters auf Chromosom 1
lokalisiert (Olszewski et al., 2006). Des Weiteren konnten sechs Maus-Isoformen
(mGBP1-mGBP6), und je eins in der Ratte (Asundi et al., 1994) und im Huhn
(Schwemmle et al., 1996) gefunden und kloniert werden. Des Weiteren wurden GBPhomologe im Affen, Hund, Schaf, Kuh sowie in verschiedenen Fischen gefunden, aber
nicht in Invertebraten, was darauf schließen lässt, dass die GBP´s sich ausschließlich in
Vertebraten entwickelt haben könnten (Olszewski et al., 2006).
Durch die Analyse des humanen GBP Gencluster auf Chromosom 1 konnten mehrere
Promotorelemente identifiziert werden, die für die Transkription der GBP´s verantwortlich
sind. Darunter ein interferon-stimmulated response element (ISRE) welches für die
Initiierung der Transkription durch INF-α verantwortlich ist und ein gamma-interferon
activation side (GAS) welches durch INF-γ gesteuert wird (Lew et al., 1991; Decker et al.,
1991). Die Überlappung der beiden Elemente konnte bei hGBP1 festgestellt werden und
ist verantwortlich für eine maximale Expression durch INF-γ (Lew et al., 1991). Kürzlich
konnte auch ein NF-κB (nuclear factor κB) Promotor gefunden werden, der zusammen mit
ISRE für die Expression durch Interleukin-1β, Interleukin-β und TNF-α verantwortlich ist
(Lubeseder-Martellato et al., 2002; Guenzi et al., 2001; Naschberger et al., 2004).
Über die zelluläre Funktion der GBP´s ist bis heute noch nicht viel bekannt. Eine antivirale
Funktion der GBP aufgrund der inflammatorischen Cytokin-vermittelten Expression ist
jedoch zu vermuten. Experimente mit HeLa-Zellen, in denen hGBP1 stabil exprimiert
wurde, konnten die Replikation des VS-Virus und des EMC-Virus (encephalomyocarditis
virus) hemmen (Anderson et al., 1999). Dieser antivirale Effekt konnte auch für das
mGBP2 beobachtet werden (Carter et al., 2005). Jedoch ist der beobachtete antivirale
Effekt von hGBP1 im Vergleich zu dem von MxA deutlich geringer. Einen
Zusammenhang zwischen hGBP1 und einer antibakteriellen Immunantwort konnte
ebenfalls hergestellt werden. Bei der Untersuchung des cerebralen Spinalfluids von
Patienten mit bakterieller Meningitis, konnte eine erhöhte Konzentration von hGBP1 im
Vergleich zu Kontrollpatienten, beobachtet werden. Es zeigte sich dabei, dass etwa 27%
des gesamten hGBP1 über einen nicht-klassischen, möglicherweise ABC-Transporterabhängigen Weg sekretiert wird. Für die Sekretion ist weder die Bindung und Hydrolyse
von GTP, noch die Farnesylierung des Proteins notwendig. Die Funktion von hGBP1 bei
bakterieller Meningitis konnte jedoch noch nicht geklärt werden (Naschberger et al.,
2006).
- 15 -
Einleitung
Die inflammatorische Cytokin abhängige Expression von hGBP1 konnte in vivo bereits in
vaskulären Endothelzellen unterschiedlicher Organe, wie Herz, Lunge, Uterus und Milz,
beobachtet werden. Dagegen konnte in vitro die Expression von hGBP1 auch in anderen
Zellsorten gezeigt werden (Lubeseder-Martellato et al., 2002).
Bei der Lokalisation von hGBP1 in Endothelzellen, zeigte sich bei einer INF-γ induzierten
Überexpression eine diffuse granuläre Verteilung im Cytoplasma. Im Zellkern dagegen
konnte kein hGBP1 gefunden werden. Bei der gleichzeitigen Gabe von INF-γ und
Aluminiumfluorid zeigt sich eine Translokation von hGBP1 am Golgi-Apparat
(Lubeseder-Martellato et al., 2002; Modiano et al., 2005, Tripal et al., 2006). Diese
Umverteilung von hGBP1 in der Zelle ist abhängig von der Farnesylierung, da bei der
Verwendung einer CaaX-Box defizienten Mutante keine Golgi-Lokalisation beobachtet
werden konnte. Jedoch ist für die Rekrutierung an den Golgi-Apparat noch ein weiterer
INF-γ induzierter Faktor notwendig, da hGBP1 in Abwesenheit von INF-γ im Cytosol
verbleibt (Modiano et al., 2005).
Werden Endothelzellen mit inflammatorischen Cytokinen wie INF-γ, TNFα oder IL-1β
behandelt, wird ein anti-proliferativer und wachstumshemmender Effekt beobachtet. Es
konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt mit der Expression von hGBP1 korreliert.
Interessanterweise ist der anti-proliferative Effekt unabhängig von der GTPase-Aktivität
und wird ausschließlich durch die Anwesenheit der helikalen Domäne vermittelt. Eine
Farnesylierung des Proteins scheint nicht notwenig zu sein (Guenzi et al., 2001). Für
mGBP2 wurde ebenfalls eine Korrelation zwischen Expression und Proliferation gefunden
(Gorbacheva et al., 2002). Wurde jedoch mGBP2 konstitutiv in Fibroblasten des Typs NIH
3T3 exprimiert, zeigte sich eine um 50% erhöhte Wachstumsrate, was ein gegensätzliches
Bild zu hGBP1 in Endothelzellen zeigt. Ein weiterer Unterschied ist, das für die
Stimulation der Proliferation in Fibroblasten eine funktionierende GTPase-Domäne
notwendig ist. Wird die Hydrolysegeschwindigkeit durch die Punktmutation S52N
herabgesetzt, führt dies zu einer verminderten Wachstumsgeschwindigkeit (Gorbacheva et
al., 2002).
Für die Angiogenese ist neben der Proliferation auch das Eindringen von Endothelzellen in
die extrazelluläre Matrix eine wichtige Funktion. Diese Invasion der Endothelzellen ist ein
mehrstufiger Prozess, bei dem die Zellbeweglichkeit und die Proteolyse miteinender
verknüpft sind. Die angiogenetische Proteolyse ist abhängig von Matrixmetalloproteasen
(MMP), einer Familie die strukturell mit Zink-abhängigen Peptidasen verwandt ist. Es
konnte gezeigt werden, dass bei der Expression von hGBP1 selektiv die Expression von
- 16 -
Einleitung
MMP-1 inhibiert wird. Für diesen Effekt ist die GTPase-Aktivität essentiell (Guenzi et al.,
2003).
Für das Maus Ortholog mGBP2 konnte ein ähnlicher Effekt beobachtet werden. Die
Expression von mGBP2 oder die Behandlung mit INF-γ inhibiert die Ausbreitung von
Fibroblasten auf Fibronektin. Die Inhibition der Ausbreitung ist dabei begleitet von einer
verminderten Synthese von MMP-9, kann jedoch durch die Überexpression von MMP-9
wieder rückgängig gemacht werden (Vestal 2005). Bei einem Vergleich der
Aminosäuresequenzen
aller
humanen
GBP´s
ist
eine
hohe
Sequenzhomologie
untereinander zu beobachten (Abbildung 1-9). Dabei zeigt sich die größte Sequenzidentität
zwischen hGBP1 und hGBP3, die bei etwa 87% liegt. Die Gene der beiden GBP´s liegen
im Gencluster auf Chromosom 1 direkt beieinander (Olszewski et al., 2006).
Die größten Homologien zwischen den humanen GBP´s liegen bei den N-Terminal
lokalisierten LG-Domänen. In allen sieben hGBP´s sind die vier Sequenzmotive GTPbindender Proteine zu finden. Der P-Loop (GxxxxGKS), das Threonin in Switch II und
DxxG-Motix sind sogar in allen sieben hGBP´s identisch. Das vierte Motiv, das bei
hGBP1 abweichend als (T/A)xRD-Motiv bekannt ist, ist in den meisten GTP-bindenden
Proteine als NKxD-Motiv bekannt. Die größte Diversität unter den sieben humanen GBP´s
liegt im C-terminalen Teil der Proteine. Dabei fällt auf, dass nur hGBP1, hGBP2 und
hGBP5 das CaaX-Motiv für die posttranslationale Isoprenylierung besitzen. Bei dieser
posttranslationalen Modifikation wird eine C15-Farnesylgruppe oder eine C20Geranylgeranylgruppe durch eine Thioether-Bindung an das Cystein des CaaX-Motivs
gebunden (Nantais et al., 1996). Über das an das Protein gebundene Isoprenoid können
Proteine an die Zellmembran oder an Membranen von Zellkompartimenten gebunden
werden. Experimentell konnte eine Isoprenylierung für hGBP1 (Nantais et al., 1996),
mGBP1 (Stickney et al., 2000), mGBP2 (Vestal et al. 1998) und beim p67 GBP aus der
Ratte nachgewiesen werden (Asundi et al., 1994). Bei in vivo Studien zur Zelllokalisation
von hGBP1-5, konnte für hGBP5 eine konstitutive Assoziation an den Golgi-Apparat
gezeigt werden.
- 17 -
Einleitung
Abbildung 1-9: Sequenzvergleich der sieben humanen GBP´s.
Abgebildet sind die Aminosäuresequenzen aller sieben hGBP´s. Schwarz markiert sind die
Aminosäuren, die zwischen den hGBP´s identisch sind, graue Markierungen implizieren
Aminosäuren die homolog zueinander sind. Die Markierungen mit einem Stern oder einem Kreuz
kennzeichnen Aminosäuren, die in den humanen und den GBP´s aus der Maus invariant bzw. fast
invariant sind. Angegeben sind auch die konservierten Sequenzmotive GTP-bindender Proteine wie
die des P-Loops, des DxxG-Motifs und das (T/A)xRD-Motif, welches zwischen den hGBP´s
Unterschiede aufweist. Das C-Terminale CaaX-Motiv, welches für die posttranslationale LipidModifikation wichtig ist, ist nur in drei humanen GBP´s zu finden. (Entnommen aus Olszewski et
al. 2006)
Die Assoziation von hGBP1 und hGBP2 an den Golgi-Apparat trat aber erst nach
Stimulation der Zellen mit INF-γ und gleichzeitiger Gabe von Aluminiumfluorid auf. In
unstimulierten Zellen liegt hGBP1 und hGBP3 cytosolisch vor, wogegen hGBP2 und
hGBP4 im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert werden konnten (Tripal et al., 2006;
Modiano et al., 2005; Stickney et al., 2000). Die Zelllokalisation von mGBP1 und mGBP2
- 18 -
Einleitung
konnte ebenfalls in in vivo Experimenten geklärt werden. Das mGBP1 zeigte dabei eine
homogene Verteilung im Cytoplasma, wogegen mGBP2 im Cytoplasma in Vesikeln
unterschiedlicher Größe vorgefunden wurde (Vestal et al., 2000).
1.4
Das humane Guanylat-bindende Protein 1
Das bisher am besten biochemisch und strukturell charakterisierte Mitglied aus der Familie
der großen Guanylat-bindenden Proteine ist das hGBP1. Die Kristallstruktur des full length
hGBP1 (Abbildung 1-10) konnte bereits in Nukleotid-freier Form und im Komplex mit
GppNHp gelöst werden (Prakash et al., 2000a; Prakash et al., 2000b). Das hGBP1 besteht
aus einer kompakten, globulären large GTP-binding (LG-Domäne) und einer lang
gezogenen helikalen Domäne. Die N-terminal gelegene LG-Domäne ist ca. 30-kDa groß
und besteht aus einem achtsträngigen β-Faltblatt, das von neun α-Helices umgeben ist.
Diese Domäne ist bei allen GTPasen der Dynamin-Familie sehr ähnlich (Haller et al.
2002), unterscheidet sich aber von den G-Domänen aus anderen Familien der GTPbindenden
Proteine
aufgrund
von
Sequenzinsertionen.
Die
Nomenklatur
der
Sekundärstruktur von hGBP1 baut auf der von Ras auf, die aus einem sechsträngigen βFaltblatt besteht, das von fünf α-Helices umgeben ist. Hinzu kommen N-terminal die
Elemente β0, α0 und β1 und die Helices α3´ (I3) und α4´(I4). Neben der kleinen Insertion
(I1) in Bereich des switch I gibt es noch große loop Insertionen zwischen dem 97DxxG100
Motiv und α2 (I2) und zwischen β6 und α5 (I5) (Prakash et al., 2000). Die helikale
Domäne besteht aus sieben α-Helices (α7-α13)und kann in die Subdomänen α7-11 und
α12-13 unterteilt werden. Die Helices α7 bis α11 bilden zwei Helix-Bündel, wobei α9
Bestandteil beider Bündel ist. Diese zwei Dreierhelixbündel geben dem hGBP1 eine
charakteristische langgezogene Form.
- 19 -
Einleitung
α12-13
C
α7-11
LG-Domäne
N
Abbildung 1-10: Darstellung der Kristallstruktur von hGBP1 im Bändermodell.
Dargestellt ist die Kristallstruktur vom nukleotidfreien hGBP1 im Bändermodel (PDB:1dg3). Rot
eingefärbt ist die aminoterminal gelegene LG-Domäne, die topologisch Ähnlichkeiten zu Ras
aufweist, aber um ca. 100 Aminosäuren vergrößert ist. Der Rest des Proteins ist α-helikal und kann
in zwei Subdomänen eingeteilt werden. Die erste Subdomäne (blau) besteht insgesamt aus fünf
Helices und bildet zwei Helix-Bündel, wobei α9 Bestandteil beider Bündel ist. Angeschlossen an
diese Bündel ist die 120Å lange Helix α12, die das gesamte Protein flankiert und auch mit der LGDomäne interagiert (grün). An die Helix α12 schließt sich nach einer Kehre die Helix α13 an, die
das CaaX-Motiv für die posttranslationale Farnesylierung trägt.
Angeschlossen an diese Helixbündel ist die 120Å lange Helix α12, die das gesamte Protein
flankiert und auch mit der LG-Domäne interagiert. An die Helix α12 schließt sich nach
einer Kehre die Helix α13 an, die zusammen eine kurze Coiled-Coil bilden. Betrachtet
man das elektrostatische Oberflächenpotential der helikalen Domäne wenn die Helices
α12-13 ausgeblendet ist, erkennt man dass die exponierten Aminosäuren überwiegend
polar sind aber durch die Anwesenheit von α12 maskiert werden. (Abbildung 1-11). Die
Kontakte zwischen dem Helixbündeln und α12 sind relativ schwach und liegen
hauptsächlich am ersten Helixbündel und der LG-Domäne (Pakash et al., 2000a). Das
zweite Helixbündel hat keinen Kontakt zur α12, die aber durch mehrere elektrostatische
Kontakte mit der Helix α4´ an die LG-Domäne gebunden ist.
- 20 -
Einleitung
Abbildung 1-11: Interaktion des Cteminalen Helixmotiv α12/13 mit der
Helikalen- und LG-Domäne.
Das elektrostatische Oberflächenpotential
zeigt dass die Regionen mit vielen polaren
Aminosäuren durch die Helices α12und
α13
maskiert
werden
(Abbildung
entnommen aus Prakash et al., 2000a).
Die letzten zehn Aminosäuren des Proteins am C-teminus sind ungeordnet. Sie enthalten
unter anderem die CaaX-Box, die Erkennungssequenz für die Farnesylierung des Proteins
(Prakash et al., 2000a).
hGBP1 zeigt, wie auch andere Mitglieder der Familie großer, Dynamin ähnlicher
GTPasen, eine nukleotidabhängige Oligomerisierung, die eine Stimulation der GTPase
Aktivität zur Folge hat. Einzigartig bei hGBP1 ist seine Fähigkeit GTP nicht nur zu GDP,
sondern sukzessiv zu GMP hydrolysieren zu können, wobei das Produktverhältnis
temperaturabhängig ist (Schwemmle et al., 1994). Das Hauptprodukt der Hydrolyse von
GTP durch hGBP1 ist bei 37°C, mit über 80% das GMP (Kunzelmann et al., 2006),
verschiebt sich aber bei kleiner werdenden Temperaturen auf die Seite des GDP´s
(Praefcke et al., 1999). Die GTPase-Aktivität ist konzentrationsabhängig und erhöht sich
um das achtfache in Messungen bei 37°C. Dieser kooperative Mechanismus konnte
ebenfalls für Dynamin gezeigt werden (Warnock et al., 1996) und deutet auf eine
intermolekulare
Interaktion
von
hGBP1
hin.
Mit
Hilfe
der
analytischen
Größenausschlußchromatographie und analytischer Ultrazentrifugation, konnte eine
nukleotidabhängige Oligomerisierung nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass hGBP1
im
nukleotidfreien
Zustand
als
Monomer
vorliegt.
In
Gegenwart
der
nicht
hydrolysierbaren GTP-Analoga GppNHp bzw. GTPγS bildet es ein Dimer. Im Komplex
mit GDP und Aluminiumfluorid assembliert hGBP1 zu einem Tetramer (Prakash et al.,
2000; Praefcke et al., 2004).
- 21 -
Einleitung
Monomer I
Monomer II
Abbildung 1-12: Kristallstruktur des LG-Domänen Dimers in GppNHp-gebundener Form.
Abgebildet ist die Bänderdarstellung des GppNHp-gebundenen Dimers der LG-Domänen (PDB:
2bc9). Die Interaktionsfläche des Dimers ist etwa 4000Ų groß. In die Dimerisierung sind die
Guaninkappe, switch I und switch II involviert.
Die Kristallisation des full length hGBP1 in einem assemblierten dimeren- oder tetrameren
Zustand ist bis heute nicht gelungen. Jedoch konnten die Kristallstrukturen der isolierten
LG-Domänen von hGBP1 in unterschiedlichen Nukleotid-gebundenen Zustanden gelöst
werden (Ghosh et al., 2006). Es zeigte sich, dass die LG-Domänen im Komplex mit
GppNHp, GMP*ALF3 und GDP*AlF4- als Dimer kristallisierten (Abbildung 1-12).
Für die Bildung von Tetrameren ist jedoch die Anwesenheit der helikalen Domäne
erforderlich.
Experimente
mit
dem
Hefe-2-Hybrid
System
und
analytischer
Größenausschlusschromatographie zeigten eine Interaktion der helikalen Domäne die über
die Helices α12 und α13 vermittelt wird (Dissertation Benscheid, 2005). Für die
Stimulierung der GTPase Aktivität ist jedoch die Interaktion der LG-Domänen
ausreichend (Ghosh et al., 2006; Praefcke et al.; 2001). Anhand der Kristallstrukturen der
dimeren LG-Domäne konnte erstmals der Mechanismus der sukzessiven Spaltung von
GTP zu GMP und die Beschleunigung der GTP- und GDP-Hydrolyse erklärt werden. Eine
Dimerisierung hat zur Folge, dass das im P-loop gelegene Arginin 48 eine Bewegung in
Richtung Nukleotid-Bindungstasche macht. Im monomeren, nukleotidfreien Protein
dagegen, zeigt das Arg48 vom Nukleotid weg (Ghosh et al., 2006). Dieses Arginin ist
- 22 -
Einleitung
wichtig für die Beschleunigung der GTPase-Aktivität und ist vergleichbar mit dem
Arginin des RasGAP, welches in die Nukleotid-Bindungstasche von Ras orientiert wird,
um
dessen
Aktivität
zu
steigern
(Scheffzek
et
al.,
1997).
Eine
weitere
Konformationsänderung im Zuge der Dimerisierung ist beim switch I zu beobachten. Das
dort gelegene Serin 73 orientiert sich nach der Dimerisierung so um, dass ein
Wassermolekül in die Nähe des γ-Phosphat vom Nukleotid positioniert wird und dieses
somit für einen nukleophilen Angriff positioniert und/oder aktiviert wird (Ghosh et al.,
2006).
Dass diese beiden Aminosäuren essentiell für die Aktivität von hGBP1 ist, konnte durch
die Punktmutanten R48A und S73A gezeigt werden. Die R48A Mutante hatte eine im
Vergleich zum Wildtyp, 100fach niedrigere maximale Hydrolyseaktivität und zeigte kein
kooperatives Verhalten mehr (Praefcke et al., 2004). Die Punktmutation S73A dagegen
zeigte
im
Vergleich
zum
Wildtyp
nur
eine
zehnfach
kleinere
maximale
Hydrolysegeschwindigkeit war, aber ebenfalls nicht mehr kooperativ (Ghosh et al., 2006).
Diese Beobachtungen konnten sowohl für das full length Protein als auch für die isolierte
LG-Domäne gemacht werden.
Eine weitere wichtige Aminosäure ist das Aspartat 184 aus dem vierten GTPSequenzmotiv, das in allen GTP-bindenen Proteinen für die Spezifität der Base zuständig
ist. Die Punktmutante D184N im hGBP1, änderte die Substratspezifität von Guanin- zu
Xanthinnukleotiden. Das Motiv, welches für die Spezifität der Guaninnukleotide
verantwortlich ist, wurde erst nachträglich als
181
TLRD184 Motiv gefunden, da es von den
üblichen N/TKxD-Motiven aus z.B. Ras, abweicht (Praefcke et al. 1999). Ein weiteres
wichtiges Merkmal bei hGBP1 ist die Position der Guaninbase in der Bindungstasche.
Abweichend zu Proteinen wie z.B. EF-Tu, den Gα Untereinheiten, aber auch den Rasähnlichen Proteinen ist der N-glykosidische Bindungswinkel, verändert. Als Konsequenz
dieser Änderung zeigt sich eine abweichende Interaktion zwischen dem Nukleotid und
dem Protein. In hGBP1 wird die Nukleotidbindungstasche im Gegensatz zu Ras vom
Lösungsmittel abgeschirmt. Dafür zuständig sind die Guaninkappe und die Phosphatkappe
die
aus
Insertionen
bezogen
auf
die
Topologie
von
Ras
gebildet
werden.
Interessanterweise sind beide Regionen in die Dimerisierung der LG-Domänen involviert.
Eine Besonderheit der isolierten LG-Domäne ist, dass sie in der Lage ist aus der Lösung
heraus GDP zu binden und in relativ hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren. Dagegen ist
die maximale spezifische GTPase-Aktivität der LG-Domänen jedoch kaum höher als im
full length Protein. Weiterhin bildet die LG-Domäne im Komplex mit GDP*AlFx und im
- 23 -
Einleitung
Gegensatz zum full length Protein, sogar mit GMP*AlFx Dimere (Ghosh et al., 2006;
Praefcke et al., 2001). Durch Überlagerung der beiden LG-Domänen Strukturen im
GMP*AlFx und GDP*AlFx gebundenen Zustand, die den Übergangszustand der GTP- und
der GDP-Hydrolyse simulieren, zeigte sich, das dass Aluminiumfluorid in beiden Fällen
eine ähnliche Position einnimmt. Es wird angenommen, dass die Abspaltung des γPhosphats eine Positionsänderung des Nukleotids im aktiven Zentrum zur Folge hat, damit
das β-Phosphat mit den gleichen Seitenketten wie das γ-Phosphat interagieren kann. Der
zweite Hydrolyseschritt kann somit durch die gleichen Aminosäuren katalysiert werden
(Ghosh et al., 2006). Durch den Einsatz verschiedener transienter kinetischer Methoden
konnte die Kinetik der Nukleotidhydrolyse von hGBP1 detailliert untersucht werden.
Dabei konnten einzelne Reaktionsschritte, der Substratbindung, Dimerbildung, GTP und
GDP Hydrolyse sowie die Produktdissoziation ermittelt werden (Abbildung 1-13)
2E + 2GTP
k
GTP
2E + 2GDP
-1
on
= 2,5 µM s
-1
2E·GTP
kGDPoff = 26s-1
2E·GDP
k1 = 0,45s-1
(E·GDP)2
kGMPoff = 20s-1
2E·GMP
k3 = 0,87s
schnell
(E·GTP)2
2E + 2GMP
-1
k2 = 2,2s-1
k4 = 0,26s-1
(E·GMP)2
Abbildung 1-13: Reaktionsmodell der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1.
Es konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse (k1) langsamer ist
als die der GDP-Hydrolyse (k2). Dieses Ergebnis ist ein Hinweis darauf, dass die
Verschiebung des Nukleotids innerhalb des katalytischen Zentrums sehr schnell sein muss.
Die Bildung eines Dimers nach der GTP-Bindung ist ein sehr schneller Vorgang und nicht
Geschwindigkeits-limitierend. Ausserdem ist, im Gegensatz zum GTP-Dimer, die
Dissoziation des GDP- und GMP-gebundenen Dimers irreversibel. (Entnommen aus
Kunzelmann et al., 2006)
Die Geschwindigkeit der Hydrolyse von GTP zu GDP im dimeren hGBP1 liegt bei 0,45s-1
(k1) und ist damit langsamer als die Umsetzung von GDP zu GMP, die bei 2,2s-1 (k2) liegt.
Die Spaltung von GDP ist etwa 5-fach schneller als die GTP-Spaltung. Dieses Ergebnis ist
ein Hinweis darauf, dass die Verschiebung des Nukleotids innerhalb des katalytischen
Zentrums sehr schnell sein muss.
- 24 -
Einleitung
In weiteren Experimenten zur Kinetik der Abspaltung des γ-Phosphats, konnte ein
phosphate burst beobachtet werden, was auf einen Geschwindigkeitsbestimmenden Schritt
nach der Abspaltung des ersten Phosphats hinweist. Der langsame Schritt wurde als
Übergang des GMP-gebundenen Dimers zum GMP-gebundenen Monomer vorgeschlagen.
Weiterhin wurde festgestellt, dass im Gegensatz zum GTP-gebundenen Dimer die
Dissoziation des GDP- und GMP-gebundenen Dimers irreversibel ist (Kunzelmann et al.,
2006).
1.5 Zielsetzung
Die Selbstassemblierung von Proteinen der Dynamin Familie ist ein wichtiger Bestandteil
ihrer Funktion. Vorrangegangene Arbeiten konnten bereits für das hGBP1 eine
Assemblierung zu einem dimeren Komplex beobachtet werden, die eine starke
Beschleunigung der Hydrolyse zur Folge hat. Des Weiteren konnte auch die
Oligomerisierung zu einem tetrameren Komplex gezeigt werden, in der die Helices α12/13
als Interaktionsdomäne dient.
Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten,
die Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen
Subdomäne α12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Des Weiteren sollte in dieser
Arbeit eine c-DNA-Bank aus INF-γ induzierten HUVECs hergestellt werden, um mit
dieser und der Hilfe des Hefe 2-Hybrid-Systems einen Interaktionspartner von hGBP1 zu
identifizieren. Diese Arbeit beschäftigte sich ebenfalls mit der biochemischen
Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine Interaktion zwischen
hGBP1 und hGBP2.
- 25 -
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1
Chemikalien
Alle Chemikalien wurden von den Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhofen), AmershamPharmacia (Freiburg), Applichem (Darmstadt), Baker (Deventer, Niederlande), Boehringer
Mannheim (Mannheim), Fermentas (St. Leon-Rot), Fluka (Neu-Ulm), GERBU (Gaiberg),
Merck (Darmstadt), Qiagen (Hilden), Riedel-de Haen (Seelze), Roth (Karlsruhe) und Serva
(Heidelberg) in jeweils höchster Reinheit bezogen.
2.1.2
Enzyme und Marker
Pepsin
Sigma (Deisenhofen)
Trypsin
Serva Electrophoresis (Heidelberg)
DNA Polymerase I
Novagen (Madison, USA)
T4-DNA Polymerase
Novagen (Madison, USA)
T4 Polynukleotid Kinase
Novagen (Madison, USA)
Alkaline Phosphatase
Novagen (Madison, USA)
RNase H
Novagen (Madison, USA)
BamHI
Fermentas (St. Leon-Rot)
DpnI
Fermentas (St. Leon-Rot)
EcoRI
Fermentas (St. Leon-Rot)
Pfu-DNA-Polymerase
Fermentas (St. Leon-Rot)
Taq-DNA-Polymerase
Fermentas (St. Leon-Rot)
SalI
Fermentas (St. Leon-Rot)
NcoI
Fermentas (St. Leon-Rot)
T4 DNA-Ligase
Fermentas (St. Leon-Rot)
Thrombin
(Serva, Heidelberg)
Protein molekular weight marker:
14,4; 18,4; 25; 35; 45; 66; 116 kDa
Fermentas (St.Leon-Rot)
MassRuler DNA-Leiter High-Range
Fermentas (St.Leon-Rot)
MassRuler DNA-Leiter Low-Range
Fermentas (St.Leon-Rot)
- 26 -
Material und Methoden
Presicion Plus Protein Standard:
Mg: 10; 15; 20; 25; 37; 50; 75; 100; 150; 250 kD
Biorad (München)
DNA-Marker 100Bp-Leiter
Sigma (Deisenhofen)
2.1.3
Reagenzienkits
QIAprep Spin Miniprep Kit
Qiagen (Hilden)
Plasmid Midi- und Maxiprep Kit
Qiagen (Hilden)
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen (Hilden)
RNeasy Midi Kit
Qiagen (Hilden)
Oligotex mRNA Kit
Qiagen (Hilden)
OrientExpress Oligo(dT) cDNA Synthese Kit
Promega
2.1.4
Säulenmaterialien
Nickel-NTA-Agarose Superflow, Qiagen (Hilden)
Superdex® 75, Amersham-Pharmacia (Freiburg)
Superdex® 200, Amersham-Pharmacia (Freiburg)
GSH-Sepharose Superflow, Amersham-Pharmacia (Freiburg)
HisPur Cobald Resin, Pierce (Rockford,USA)
2.1.5
Mikroorganismen
E.coli TG1:
supE, hsdD5, thi, D (lac-proAB), F‘[traD36, proAB+,
lacIq, lacZDM15], (Gibson, 1984)
E.coli XL1-Blue:
recA1, end A1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,
lac, [F‘, proAB,
lacIqZDM15, Tn10 (Tetr)], (Bullock et al., 1981)
E.coli BL21 (DE3): B, F-, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm, ompT, l(DE3),
(Studier & Moffatt, 1986)
- 27 -
Material und Methoden
2.1.6
Vektoren
pGEX 4T3
Der pGEX 4T3 Vektor hat eine Größe von 4950 bp. Er beinhaltet eine Ampicillin
Resistenz (Ampr) und einen durch IPTG induzierbaren lac Promotor (Lac). N-Terminal
von der MCS (multiple cloning site) liegt das Gen, das für die Glutathion-S-Transferase
(GST) kodiert, welche für die Aufreinigung des Proteins über eine Gluthathion-SepharoseSäule benötigt wird. Für die spätere Abspaltung des GST liegt dahinter eine Schnittstelle
für die Protease Thrombin.
pProEx HTb (Invitrogen, Carlsbad, USA)
Der pProEx HTb Vektor hat eine Größe von 4779 bp. Er beinhaltet eine Ampicillin
Resistenz (Ampr) und einen IPTG induzierbaren lac Promotor (Lac).
N-Terminal von der MCS werden 6 Histidine codiert, die als Fusionspartner für das
inserierte Protein fungieren. Mit dem Histidin-Tag kann das Protein über eine NickelNTA-Agarose-Säule aufgereinigt werden. Um den His-Tag abzuspalten, liegt davor eine
aus sechs Aminosäuren bestehende Erkennungssequenz für die Protease TEV.
pQE9 (Qiagen, Hilden)
Der pQe9 Vektor hat eine Größe von 3,4 kb. Er beinhaltet eine Ampicillin Resistenz
(Ampr) und einen IPTG-induzierbare T5-Promotor/Lac-Operator-Element.
N-Terminal von der MCS werden 6 Histidine codiert, die als Fusionspartner für das
insertierte Protein fungieren. Mit dem Histidin-Tag kann das Protein über eine
imobillisierte Nickel-Säule aufgereinigt werden.
pGBKT7 (Clonetech, Mountain view, USA)
Der Vektor pGBKT7 exprimiert Proteine welche an eine verkürzte GAL4 DNA
Bindedomäne fusioniert sind. In Hefen werden diese Proteine in einem hohen Level, durch
den konstitutiven ADH1 Promotor (PADH1) exprimiert. Die Transkription wird durch ein T7
und ein ADH1- transkriptions-terminations Signal beendet. Der Vektor besitzt außerdem
einen T7-Promotor und ein c-Myc Epitop Tag Der Vektor repliziert sich autonom sowohl
in E.coli als auch in
S.cerevisiae durch pUC und 2µ Ori. Der Vektor trägt eine
Kanamycin-Resistenz für E.coli und einen TRP1 Selektionsmarker für Hefen.
- 28 -
Material und Methoden
pGADT7 (Clonetech, Mountain view, USA)
Der Vektor pGADT7 exprimiert Proteine welche an eine verkürzte GAL4-DNAAktivierungs- Domäne fusioniert sind. In Hefen werden diese Proteine in einem hohen
Level durch den konstitutiven ADH1-Promotor (PADH1) exprimiert. Die Transkription wird
durch ein ADH1-transkriptions-terminations Signal beendet. Das Fusionsprotein wird mit
Hilfe des SV40 Kern-Lokalisationssignal in den Kern transportiert. Der Vektor besitzt
außerdem einen T7 Promotor und ein HA-Epitop-Tag Der Vektor repliziert sich autonom
sowohl in E.coli als auch in S.cerevisiae durch pUC und 2µ Ori. Der Vektor trägt eine
Ampicillin Resistenz für E.coli und einen LEU2 Selektionsmarker für Hefen.
2.1.7
Antibiotika
Ampicillin
GERBU Biotechnik (Gaiberg)
Tetracyclin
Sigma (Deisenhofen)
Kanamycin
GERBU Biotechnik (Gaiberg)
Die Antibiotika wurden den Medien in Konzentrationen von 100mg/l (Ampicillin), 50mg/l
(Kanamycin) und 12,5mg/l (Tetracyclin) zugesetzt.
2.1.8
Oligonukleotide
Alle Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg) bezogen. Die
Sequenzen sind in 5´-3´-Richtung angegeben und bezüglich ihrer Leserichtung mit s
(sense) oder as (antisense) gekennzeichnet. Die für die Sequenzierprimer angegebenen
Zahlen beziehen sich auf die Nukleotidsequenz von hGBP1, bzw. hGBP2.
Für Mutagenesen:
hGBP1-R227E-s
CCTGCCCAGA CTCTGTATCG AGAAATTCTT CCCAAAG
hGBP1-R227E-as
CTTTGGCAAG AATTTCTCGA TACAGAGTCT GGGCAGG
hGBP1-K228E-s
CCCAGACTCT GTATCCGGGA ATTCTTCCCA AAG
hGBP1-K228E-as
TCCTGGGAAG AATTCCCGGA TACAGAGTCT GGG
hGBP1-E563R-s
GCAACTACTA AAACGCGGAT TTCAAAAAGA AAGC
hGBP1-E563R-as
GCTTTCTTTT TGAAATCCGC GTTTTAGTA GTTG
- 29 -
Material und Methoden
Für Sequenzierungen:
pQE-s
GTATCACGAG GCCCTTTCGT CT
pQE-as
CATTACTGGA TCTATCAACA GGAG
hGBP1 300-319-s
ATCTGGATGT CGTGTGTGCC
hGBP1 300-319-as
CGCACACACC ACATCCAGAT
hGBP1 570-589-s
TCAGCTGACT TTGTGAGCTT
hGBP1 570-589-as
AAGCTCACAA AGTCAGCTGA
hGBP1 1000-1018-s GCATGGAGAA CGCAGTTCCT
hGBP1 1000-1018-as AGGACTGCGT TCTCCATGC
hGBP2 500s
CTGTAGACGA CTCAGCTGAC TTTGTGAGC
hGBP2 1000s
CAGCAGATGG GCCAGAAGGT GCAGGTCC
pProEx-s
AGCGGATAACAATTTCACACAGG
pProEx-as
TTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAG
pGBKT7-s
GAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAG
pGBKT7-as
GCGCGCAAAAAACCCCTCAAGACCC
pGex-s
ATAGCATGGCCTTTGCAGG
pGex-as
GAGCTGCATGTGTCAGAGG
2.1.9
Nährmedien
LB-Medium:
10g/l Bacto-Trypton
5g/l
Hefeextrakt
10g/l NaCl
pH 7,4 mit NaOH
LB-Agar-Medium:
LB-Medium
12g/l Agar
TB-Medium:
12g/l Bacto-Trypton
24g/l Hefeextrakt
4ml/l Glycerol
- 30 -
Material und Methoden
0.17mM
KH2PO4
0.072mM
K2HPO4
YPD-Medium (Vollmedium):
20g/l BactoPepton
10g/l Hefeextrakt
2%
Glucose
18g/l Agar (bei festem Nährmedium) pH 5,8
Yeast Nitrogen Base (YNB):
1g/l
Kaliumphosphat
0,5g/l Magnesiumsulfat
0,1g/l Natriumchlorid
0,1g/l Calciumchlorid
0,002mg/l
Biotin
0,4mg/l
Calciumphatothenat
0,002mg/l
Folsäure
2mg/l
Inositol
0,4mg/l
Nicotinsäure
0,2mg/l
4-Aminobenzoesäure
0,4mg/l
Pyridoxin
0,2mg/l
Riboflavin
0,4mg/l
Thiamin
0,5mg/l
Borsäure
0,04mg/l
Kupfersulfat
0,1mg/l
Kaliumiodid
0,2mg/l
Eisenchlorid
0,4mg/l
Mangansulfat
0,2mg/l
Natriummolybdat
0,4mg/l
Zinksulfat
5g/l
Ammoniumsulfat
20g/l
Dextrose
- 31 -
Material und Methoden
SD-Medium:
20mg/l
Arginin
30mg/l
Isoleucin
30mg/l
Lysin
20mg/l
Methionin
50mg/l
Phenylalanin
200mg/l
Threonin
30mg/l
Tyrosin
20mg/l
Uracil
150mg/l
Valin
20mg/l
Adenin
20mg/l
Histidin
100mg/l
Leucin
20mg/l
Tryptophan
Selektionsmedium:
THL-
SD-Medium ohne Tryptophan, Histidin und Leucin
Die Nährmedien wurden vor Verwendung 15 Minuten lang bei 121°C autoklaviert.
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1
Isolierung von Plasmid-DNA
Für die Isolierung von Plasmiden aus E-coli Zellen wurde ein Präparationskit der Firma
Qiagen (Hilden) verwendet. Die Durchführung geschah nach Angaben des Herstellers.
Dabei werden 1,5 ml Zellen einer Übernachtkultur durch alkalische Lyse aufgeschlossen
und
nach
Fällung
der
Proteine
mit
Natrium-Dodecylsulfat
über
eine
Anionenaustauschersäule aufgereinigt. Die Plasmid-DNA wird somit hochrein in einem
Tris-Puffer (pH 7,5) erhalten.
- 32 -
Material und Methoden
2.2.2
Polymerase-Kettenreaktion
Zur Amplifikation von Genfragmenten wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR,
polymerase chain reaction) verwendet. Die selektive Vervielfältigung wurde unter
Verwendung hitzestabiler DNA-Polymerasen sowie zweier Oligonukleotide vollzogen. Die
Primer für die Amplifizierung wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) bezogen.
Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammen gesetzt:
PCR-Ansatz (für 50 µl Gesamtvolumen):
30–500 ng Template DNA
1 µl 5’-Primer (sense) (100 µM)
1 µl 3’-Primer (anti-sense) (100 µM)
2,5 µl dNTP-Mix
5 µl 10x Taq-Polymerase Puffer
3 µl MgCl2
1 µl Taq-Polymerase (5U)
Die PCR-Zyklen wurden mit einem PCR-Gerät von Eppendorf wie folgt durchgeführt:
Initiale Denaturierung bei 95°C für eine Minute, 25-35 Zyklen mit einer Minute bei 95°C,
1 Minute bei 54°C (Primer Anlagerung), 1-16 Minuten bei 72°C (Synthese).
2.2.3
Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA wurde am Lehrstuhl für Biochemie II an einem ABI 3130xl
(Applied Biosystems, Foster City, USA) durchgeführt. Dazu wurde das Plasmid isoliert
und eine Probe von 5µl in ein Reaktionsgefäß pipettiert. Die beiden Sequenzierprimer
wurden auf 10pmol/µl verdünnt und jeweils zu 5µl mitgeschickt.
- 33 -
Material und Methoden
2.2.4
Herstellung kompetenter Zellen
Für die Herstellung kompetenter Zellen (E-coli TG1, XL1-blue und BL21 (DE3)) wurden
5 ml Übernachtkulturen angesetzt. Je 1 ml wurden am nächsten Tag auf 100 ml LBMedium übergeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 – 0,6 herangezogen (1-3
Stunden). Die Bakteriensuspension wurde dann für 20
Minuten auf Eis gestellt und
anschließend bei 4°C 5 Minuten bei 8000 U/min sedimentiert. Das Pellet wurde in 10 ml
eisgekühltem TSS-Puffer (10% PEG 8000, 5% DMSO, 50mM MgCl2 in LB ohne NaOH
pH6,5 ) resupendiert. Nach Zugabe von 1,5 ml 15%igen Glycerin wurden 300 µl Aliquots
hergestellt und diese direkt in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung erfolgte
bei -80°C.
2.2.5
Transformation
Für die Transformation von E-coli Zellen wurden 250 µl kompetenter Zellen langsam auf
Eis aufgetaut. Danach wurden 5-20 µl eines Ligationsansatzes mit den 250µl kompetenter
Zellen versetzt und für eine Stunde auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz
einem Hitzeschock unterzogen, indem eine Inkubation für 60 Sekunden bei 42°C erfolgte.
Nach 2 Minuten Abkühlung auf Eis wurden dem Ansatz 900 µl Antibiotika-freies LBMedium zugefügt, und der Ansatz eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann
bei 14000 UpM zentrifugiert und in 150 µl des Überstandes resuspendiert. Diese
Suspension wurde dann auf Antibiotika haltige Agar-Nährböden verteilt und über Nacht
bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
2.2.6
Agarosegelelektrophorese
Zur Analytischen und präparativen Trennung der DNA-Proben wurden diese mit
Probenpuffer (0,25% (w/v) Bromphenolblau, 30% (v/v) Glycerol, 0,25% (w/v) XylenCyanol pH 8,0) versetzt und auf ein einprozentiges Agarosegel aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 100 V und einer Laufzeit von ca. 60 min.
Nach Färbung mit 0,001%igen Ethidiumbromid konnten die DNA-Banden auf einem UVSchirm (320nm) detektiert werden.
- 34 -
Material und Methoden
2.2.7
DNA-Isolierung aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem Gelelutions
Kitsystem der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers. Sie beruht auf der
Auflösung der Agarose in Puffer bei 50 °C und anschließender Reinigung der DNA über
Anionenaustauschersäulen. Die Elution der DNA erfolgte mit 30µl eines 10 mM Tris-HCl
Puffers.
2.2.8
Restriktionsenzymatischer Verdau von DNA
Die enzymatische Spaltung von Plasmiden und DNA-Fragmenten durch spezifische
Restriktionsenzyme wurde in einem Gesamtvolumen von je 40 µl durchgeführt. Da die
Enzyme bei unterschiedlichen Puffern auch unterschiedliche Aktivitäten besitzen, muss
gerade bei einem Doppelverdau auf die Menge und Art des Puffers und die Länge der
Inkubation geachtet werden. Die Inkubation erfolgte bei 37°C im Brutschrank gemäß den
Angaben der Hersteller der Enzyme. Vor der weiteren Verwendung der geschnittenen
Fragmente wurde zur Reinigung der gesamte Ansatz auf ein 1%iges Agarosegel
aufgetragen und nachher die benötigten Fragmente aus dem Gel extrahiert.
2.2.9
Ligation
Zur Ligation wurden Vektor-DNA und die DNA des Fragments, das eingesetzt werde soll,
in einem Mengenverhältnis von 1:4 gemischt. Bei der Ligation mit überlappenden Enden
wurden die Fragmente in einem Endvolumen von 20 µl mit 1 U T4-DNA Ligase und 5µl
eines Ligase-Puffers (10x) des Herstellers Fermentas (St. Leon-Rot) über Nacht bei 16 °C
inkubiert.
2.2.10 Isolation von Gesamt-RNA aus HUVEC
Für die Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVEC (humane
Endothelzellen der Nabelschnurvene) musste im Vorfeld die gesamte RNA aus den Zellen
isoliert werden. Es wurden HUVEC in insgesamt 7 Zellkulturschalen (T75) bis zur
Konfluenz wachsen gelassen. Sechs dieser Schalen wurden dann mit 100U/µl INF-γ
induziert. Nach jeweils 5, 12 und 24 Stunden wurden Zellen von je zwei Platten mit
- 35 -
Material und Methoden
geerntet. Die Zellen wurden in einem 2ml Reaktionsgefäß mit 1 ml Trizol versetzt. Mit
Hilfe einer Kanüle wurde die Lösung mehrfach eingezogen und abgelassen, um
genomische DNA zu scheren. Durch die Zugabe von Chloroform und nachfolgender
Zentrifugation (10 Minuten bei 10000g) wurden die Proteine abgetrennt und durch
Isopropanol die RNA präzipitiert. Die RNA wurde nachfolgend mit 75% Ethanol/DEPCH2O gewaschen. Der Überstand wurde vollständig abgenommen und das RNA-Pellet
getrocknet.
2.2.11 Darstellung einer cDNA-Bank aus INF-γ stimulierten HUVECs
Die zur Isolation der RNA verwendeten Zellen wurden vor der Ernte mit 100U/ml INF-γ
stimuliert. Inkubationszeiten von 0, 5, 12 und 24 Stunden wurden gewählt, um
unterschiedliche Expressionsstadien abzudecken, da nicht bekannt ist, zu welchem
Zeitpunkt ein möglicher Interaktionspartner von hGBP1 exprimiert wird.
Die erhaltene Gesamt-RNA wurde auf ihre Integrität hin kontrolliert und die Konzentration
bestimmt. Je 30µg der Gesamt-RNA wurde in einem großen Ansatz vereinigt und mit
Hilfe eines Oligotex mRNA-Kits (Qiagen, Hilden) die mRNA aufgereinigt. Für die
Aufreinigung von mRNA wurde eine Säulenmatrix benutzt, an der kovalent (dT)Oligonukleotide immobilisiert sind. Die so aufgereinigte mRNA wurde dann als Matrix für
die cDNA Synthese benutzt. Für die Synthese der cDNA wurde das Sythese-Kit
OrientExpress der Firma Promega verwendet.
Für die Erststrangsynthese wurden 30µl der aufgereinigten mRNA mit 3µg Oligo(dT)Primern in DEPC-H2O bei 70°C für 10 Minuten vorinkubiert. Nach kurzen Abkühlen auf
Eis wurden 12µl Erststrangpuffer (5x), 6mM DTT, 100µM dNTP-Mix (methyliert) und
800U MMLV reverse Transskriptase hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für
eine Stunde, gefolgt von 70°C für 10 Minuten. Für die Zweitstrangsynthese wurden 50µl
eines Zweitstrangpuffers (5x), 6µl DTT, 100µM dNTP (methyliert), 50U DNAPolymerase I und 1,6U RNaseH hinzugefügt. Nach 90 Minuten bei 15°C wurde der
gesamte Ansatz mit Hilfe des PCR-Purification-Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt.
Um die cDNA erfolgreich in einen Vektor klonieren zu können, wurden die Enden der
cDNA modifiziert. Dazu wurde die cDNA mit 2,5U einer T4 DNA-Polymerase bei 11°C
für 20 Minuten inkubiert. Um den Puffer zu wechseln und die T4 DNA-Polymerase zu
entfernen, wurde abermals eine Aufreinigung durch ein PCR Purifikations Kit
vorgenommen.
- 36 -
Material und Methoden
Um Schnittstellen einzufügen, wurden EcoRI-Linker verwendet. Diese Oligonukleotide
waren doppelsträngige palindromische Dodecamere, welche in ihrer Mitte eine EcoRI
Schnittstelle trugen. Durch Phosphorylierung durch eine T4-Polynukleotid-Kinase und
nachfolgender Verwendung einer T4 DNA Ligase wurden diese Linker an die
doppelsträngige cDNA ligiert. Nachdem Vektor und cDNA mit EcoRI restringiert worden
waren, wurde der Vektor (pGBKT7) durch alkalische Phosphatase dephosphoryliert und
die cDNA durch T4 Polynucleotid-Kinase phosphoryliert, um die Ligationseffizienz zu
erhören. Nach der Ligation wurde der Vektor in kompetente Zellen (E.coli, Nova Blue)
transformiert und auf 150 LB-Platten mit Kanamycin ausplattiert.
2.2.12 Darstellung kompetenter Hefen
Für die Methode der Co-Transformation wurde die LiAc-Methode nach Ito et al. (1983)
gewählt, in der die DNA mit einer Carrier-DNA in LiAc inkubiert wird. Die cDNA-Bank
und der Vektor mit dem Köder wurden simultan in den Hefestamm AH109 transferiert.
Dabei ist die Transfereffizienz zwar um eine Größenordnung kleiner gegenüber der
sequenziellen Transformation, aber es besteht sonst das Risiko, dass das erste Plasmid für
ein toxisches Protein kodiert. Um eine möglichst große Transformationseffizienz zu
erreichen, wurden die kompetenten Hefezellen direkt vor der Transformation hergestellt.
Dazu wurden aus dem Glycerol-Stock einige Hefezellen entnommen, diese in ca. 500µl
YPD Puffer gelöst und auf einer YPD-Agar Platte ausgestrichen. Von den gewachsenen
Kolonien wurde eine Kolonie in 3ml YPD-Medium resuspendiert und über Nacht bei
30°C, 180 UpM inkubiert. Diese wurde am nächsten Tag auf 50ml YPD-Medium verdünnt
und bei 30°C, 180 UpM inkubiert, bis zu einer Zelldichte
von OD600 = 0,15-0,3.
Anschließend wurden die Hefen bei 700xg in 5min bei Raumtemperatur sedimentiert,
einmal mit 60ml TE/LiAc-Puffer gewaschen und erneut sedimentiert und abschließend in 8
ml TE/LiAc-Puffer resuspendiert. Danach erfolgte eine finale Inkubation bei RT für
mindestens 10 min.
2.2.13 Transformation in Hefen
Für die Transformation wurden dann zu 1ml Zellen 20 mg Lachs-Sperma DNA, 1mg
HUVEC-cDNA, 0,3mg hGBP1-pGADT7 DNA und 60 ml TE/LiAc-Puffer gegeben. Nach
- 37 -
Material und Methoden
30 Minuten Inkubation bei 30°C und 200 UpM wurden 7ml DMSO hinzugefürt.
Anschließend erfolgte bei 42°C für 20 min der Hitzeschock. Die abschließend
sedimentierten Hefen (1000xg, 5min, RT) wurden in 10ml YPD-Medium aufgenommen
und 1 h bei 30°C, 180 UpM regeneriert.
2.2.14 Hefe 2-Hybrid Screen
Der Transformationsansatz wurde auf YPD-Agar-Platten ausplattiert, denen die
Aminosäuren Histidin, Tryptophan und Leucin fehlten, um die Transformanten auf eine
HIS3-Expression hin zu testen. Um das Histidin-Basallevel zu unterdrücken, wurde zu
dem Medium außerdem noch 20µM 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT) gegeben. Die
erhaltenen Kolonien wurden dann auf Platten umgesetzt, denen zusätzlich noch die
Aminosäure Adenin fehlte, um die Stringenz weiter zu erhöhen.
Die hier erhaltenen Kolonien wurden darüber hinaus auf die Expression des lacZ-Gens
bzw. auf die Aktivität der ß-Galactosidase getestet. Dazu wurde ein Rundfilter auf die
Platten gelegt und angedrückt, um einen Teil der Zellen auf den Filter zu übertragen. Diese
Filter wurden für ein paar Sekunden in flüssigen Stickstoff gehalten und dann mit einer XGAL-Lösung getränkt. Sofern das (künstliche) Substrat X-Gal durch die ß-Galactosidase
umgesetzt wurde, zeigten die entsprechenden Kolonien eine Blaufärbung.
Um die Hefezellen auf ihre Kompetenz hin zu testen, wurden vor der Transformation der
Bibliothek einige Zellen entnommen und mit den Vektoren pGBKT7-T (Large T-Antigen)
und pGADT7-p53 kotransformiert. Diese wurden dann auf YPD-Nährböden ausplattiert,
denen die Aminosäuren Tryptophan und Leucin fehlten. Da die Proteine p53 und Large TAntigen interagieren, konnte durch das Umsetzten der erhaltenen Kolonien auf Nährböden
ohne Tryptophan, Leucin, Histidin und Adenin das 2-Hybrid System auf seine
Funktionsfähigkeit hin überprüft werden.
Für die Analyse der DNA aus den positiven Klonen wurde eine Plasmid-Extraktion
vorgenommen. Dazu wurden die Hefezellen in 4 ml Puffer resuspendiert, anschließend mit
5mg Lytikase versetzt und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch den Verdau der
Zellwände durch die Lytikase konnte die DNA-Extraktion nachfolgend mit Hilfe eines
DNA Extraktions Kits der Firma Qiagen (Plasmid Mini Kit, Qiagen, Hilden) erfolgen.
Die Analyse des Inserts erfolgte durch eine PCR mit Hilfe von Standard-Vektor-Primern
für den Vektor pGADT7.
- 38 -
Material und Methoden
2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.3.1
Präparative Proteinexpression und Ultraschallaufschluss
Um größere Mengen eines Proteins herstellen zu können, wurden bis zu 10 Liter eines
entsprechenden antibiotikumhaltigen Nährmediums (TB-Medium) benötigt, welches mit
einer Übernacht-Kultur von 1/100 des Nährmedien-Volumen angeimpft wurde. Nach ca. 56 Stunden Inkubation bei 37°C bzw. einer OD600 von 0,5 bis 0,6 wurde die Temperatur auf
25°C reduziert und nach Erreichen der Temperatur mit 100µM IPTG induziert und die
Inkubation über Nacht bei 25°C und 150upm weitergeführt. Die Zellen wurden durch
10minütige Zentrifugation bei 7000g und 4°C geerntet, der Überstand verworfen und das
Sediment bei -80°C gelagert. Zur Isolation des Proteins wurde das Pellet in Lysepuffer
(50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 1mM PMSF, 4ml Triton X100) resuspendiert und
so langsam aufgetaut. Der Zellaufschluß erfolgte mit Hilfe eines Ultraschallgeräts unter
Eiskühlung. Dauer und Stärke der Beschallung richteten sich nach der Menge des
Zellpellets (ca. 10 Minuten bei 250ml Zellsuspension). Schließlich wurde die Suspension
30 Minuten lang bei 23000upm (SC-300 Rotor) und 4°C in einer Zentrifuge (Sorvall
Evolution RC) zentrifugiert.
2.3.2
Glutathion-Affinitätschromatographie
Die affinitätschromatographische Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen wurde mit
einer GSH-Sepharose-Fastflow-Säule, 25 ml Säulenvolumen, (Amersham-Pharmacia,
Freiburg) durchgeführt. Auf die zuvor mit 10 mM Tris/HCl pH 7,4, 500 mM NaCl und 2
mM DTE äquilibrierte Säule wurde der Überstand bei einem Fluss von 2 ml/min
aufgetragen und anschließend mit 4 Säulenvolumen Tris-Puffer (10mM) gewaschen. Die
Spaltung des Fusionsproteins erfolgte durch Auftragen von 250U Thrombin in 10 ml TrisPuffer und nachfolgender Inkubation über Nacht. Das gespaltene Protein wurde mit ca. 125
ml Tris-Puffer mit 500 mM NaCl und 2mM DTE von der Säule eluiert und die Säule mit 4
Säulenvolumen Tris-Puffer mit 20mM Glutathion, und 4 Säulenvolumen 6 M GuanidinHCl gereinigt.
- 39 -
Material und Methoden
2.3.3
Zur
Nickel-NTA-Affinitätschromatographie
affinitätschromatographischen
Reinigung
von
N-terminal
Histidin-markierten
Proteinen, wurde der Überstand des Aufschlusses auf eine in 50mM Tris/HCl pH 8,0,
500mM NaCl, 5mM MgCl2, 2mM Imidazol äquilibrierte HisPur-Cobalt Resin mit 25 ml
Säulenvolumen bei einem Fluß von 4 ml/min aufgetragen. Anschließend wurde die Säule
mit 5 Säulenvolumina 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), 500mM NaCl, 5mM MgCl2 und 10mM
Imidazol, sowie 5 Säulenvolumina 20mM Tris/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 5mM MgCl2,
10mM
Imidazol
gewaschen.
Die
Elution
des
Proteins
erfolgte
durch
einen
Imidazolgradienten von 10mM bis 150mM in 20mM Tris/HCl pH 8,0, 100mM NaCl,
5mM MgCl2.
2.3.4
Größenausschlußchromatographie
Für die weitere Aufreinigung der Proteine wurde eine Größenausschlusschromatographie
durchgeführt. Für die zu trennenden Proteine wurde das Säulenmaterial Superdex® 75
(26/60) oder Superdex® 200 (26/60) verwendet (Amersham-Pharmacia, Freiburg). Die
Säule wurde mit 3 Säulenvolumen 50mM Tris/HCl, 2mM MgCl2, 2mM DTE äquilibriert,
bevor die Proteine über Nacht mit einem Fluss von 0,5 ml/min aufgetragen wurden. Der
Durchfluss wurde durch einen Probensammler in 4 ml Fraktionen aufgefangen.
2.3.5
Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration
Mit Hilfe von Zentrifugationsröhrchen (Vivascience, USA) wurden die Proteinlösungen
aus der Gelfiltration aufkonzentriert. Die Porengröße der Membran lag, je nach
Proteingröße, bei Mw = 10kDa bis Mw = 100kDa. Durch Zentrifugation bei 4000 upm und
4°C wurden alle Bestandteile, die kleiner als die Membranporen waren, durch diese
durchgedrückt, und es verblieb die aufkonzentrierte Proteinlösung.
2.3.6
Denaturierende SDS-Gelelektrophorese
Proteine wurden entsprechend ihrem Molekulargewicht in einem denaturierenden
Polyacrylamidgel aufgetrennt (Schägger und von Jagow 1987). Dazu wurde ein vertikales
Gelelektrophoresesystem (BioRad, München) verwendet. Die Trenngele enthielten je nach
Molekulargewicht der aufzutrennenden Proteine 6-18% Acrylamid.
- 40 -
Material und Methoden
Die Proteinproben wurden mit Probenpuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50 % Glycerin,
10 % SDS, 10 mM ß-Mercaptoethanol und 0.01 % Bromphenolblau) versetzt. Die
Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 100-120 V. Das Gel wurde für 15 min in
der Färbelösung (0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250, 0,1 % (w/v) Coomassie
Brilliant Blue R250, 40 % Ethanol (v/v), 10 % Essigsäure (v/v)) gefärbt. Nicht an Protein
gebundener Farbstoff wurde mit Wasser ausgewaschen.
2.3.7
Konzentrationsbestimmung nach Gill & von Hippel
Die Proteinbestimmung nach Gill und Hippel (1989) beruht auf der Bestimmung des
molaren
Extinktionskoeffizienten
bei
Wellenlängen
um
280
nm.
Der
Extinktionskoeffizient des Proteins kann aus der Anzahl der Tryptophan-, Tyrosin und
Phenylalaninreste pro Molekül bestimmt werden. Die Konzentration der Lösungen wurde
nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ermittelt: A = a*c*d
Das Protein wurde in 20mM Kaliumphosphat, 6M Guanidiniumhydrochlorid (GuaHCl),
pH6,5 verdünnt, so dass die Extinktion zwischen 0,3 und 0,8 lag. Die Absorption wurde
gegen 20mM Kaliumphosphat, 6M GuaHCl, pH6,5 gemessen. Der Extinktionskoeffizient
konnte
mit
Hilfe
des
Internetprogramms
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)
Absorptionsmessungen
wurden
im
berechnet
UV-Bereich
„ProtParam„
werden.
mit
dem
Die
Zweistrahl-
Absorptionsspektrometer (Specord 200, Analytik Jena) durchgeführt.
2.3.8
Markierung von Proteinen mit Fluoreszenzfarbstoffen
Die Markierung von Proteinen wurde mit Maleinimid- gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen
durchgeführt, die unter Bildung eines Thioethers selektiv an Cysteine binden. Um einen
Fluoreszenz-Energie Transfer zu erhalten, wurden die beiden FRET-Paare Fluorescein und
Coumarin zum Markieren verwendet. Alle Fluoreszenzmarker wurden von der Firma
MoBiTec GmbH (Göttingen) bezogen. Die Markierungsreaktion erfolgte in einem
gegenüber dem Protein zweifachen Überschuss an Fluorophor in 50mM Tris-HCl pH 7,4,
5mM MgCl2 und wurde bei 4°C durchgeführt. Um die Kopplungsreaktion zu stoppen,
wurden zu der Probe 2mM Dithioerytrithol (DTE) hinzugefügt. Zum Abtrennen von
überschüssigem
Fluorophor
wurde
der
Reaktionsansatz
- 41 -
über
eine
NAP-5
Material und Methoden
Gelfiltrationssäule
(GE
Healthcare,
München)
aufgereinigt
und
anschließend
aufkonzentriert.
Der Reaktionsansatz wurde dann mit Hilfe von Absorptionsmessungen hinsichtlich seiner
Markierungseffizienz (Menge an Fluorophor pro Protein) überprüft. Dazu wurde die
Kontentration an Fluorophor mit Hilfe des jeweiligen Extinktionskoeffizienten bestimmt
(Fluorescein λmax= 492nm, ε=83000M-1cm-1; Cumarin λmax=384nm, ε=18464M-1 cm-1) und
in Relation zur Proteinkonzentration gesetzt.
2.4 Biophysikalische Methoden
2.4.1
Bestimmung von Nukleotidkonzentrationen
Die Konzentration von Guaninnukleotiden wurde durch Absorptionsmessungen bei 253nm
in 20mM Tris-HCl bei pH 7,9 durchgeführt. Für unmodifizierte Guaninnukleotide wurde
der
molare
Extinktionskoeffizienz
von
ε253=13700
M-1cm-1verwendet.
Für
Guaninnukleotide, die mit einer 3´-O-(N-Methyl-anthraniloyl)-Gruppe (mant-) gekoppelt
sind, wurde der molare Extinktionskoeffizient von ε253=22500 M-1cm-1verwendet
(Hiratsuka, 1983).
2.4.2
Analyse von Nukleotiden mittels reversed-phase HPLC
Die Bestimmung der Reinheit und die Analyse von Nukleotidgemischen erfolgte mittels
reversed-phase HPLC nach der Methode von Lenzen et al. (Lenzen et al., 1995). Die
Methode beruht auf der Interaktion der hydrophoben stationären Phase mit dem Ionenpaar
aus Nukleotid und dem Tetrabutylammoniumbromid-Ion (TBA-Br) in der mobilen Phase.
Die Menge an gebundenen TBA richtet sich nach der Menge an vorhandenen
Phosphatgruppen wodurch sich entsprechend die Retentionszeit verlängert.
Die zu untersuchende Probe wurde mit Hilfe einer BT4100 HPLC-Pumpe (Jasco, GrossUmstadt) auf die Säule aufgetragen. Die Trennung erfolgte durch eine 25cm Reprosil 100
C18 Säule (Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen). Denaturierte Proteine wurden an einer
Nucleosil 100-5 C18 Vorsäule absorbiert. Der verwendete Laufpuffer enthielt 100mM
- 42 -
Material und Methoden
Kaliumphosphat (pH6,5), 10mM TBA-Bromid, 0,3mM Natriumazid und 7,5% Acetonitril.
Die Detektion erfolgte über die Absorption bei Wellenlängen zwischen 200 und 370nm mit
Hilfe des Photodiodenarray-Detektors MD-2010 (Jasco, Gross-Umstadt).
2.4.3
Messungen der Nukleotidhydrolyse
Die steady-state Hydrolysegeschwindigkeiten von GTP und GDP durch GBP´s wurde
mittels reversed-phase HPLC gemessen. Dabei wurden die Proteine in Puffer (50mM TrisHCl, 5mM MgCl2, 2mM DTE) mit 350µM GTP bzw. GDP und 50µM BSA bei 25°C
inkubiert. Nach verschieden Zeitpunkten wurden 20µl der Probe auf die HPLC-Anlage
aufgetragen und die Nukleotide getrennt. Die Anteile an GTP, GDP und GMP konnten
dann dem Elugramm entnommen werden. Der Anteil am nicht umgesetzten Substrat wurde
dann gegen die Reaktionszeit aufgetragen und die Anfangsgeschwindigkeit in einem
Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare Regression angepasst. Der Quotient aus
Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität. Durch
Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration wurde
die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten wurde entweder eine
quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) oder ein modifizierte Hill-Funktion angepasst
(Formel 2-2)
Formel 2-1:
k = k 0 + (k max − k 0 )
Formel 2-2:
k = k 0 + (k max − k 0 )
2[E ] + K D −
(2[E ] + K D )2 − 4[E ]2
2[E ]
1
1 + ([E ] / K )
n
Dabei ist k die spezifische Aktivität bei der Enzymkonzentration E in mol/l, k0 die
spezifische Aktivität bei unendlich hoher Verdünnung von E, kmax ist die maximale
Erhöhung der spezifischen Aktivität, n der Hill-Parameter für das Maß der Kooperativität
und KD die Gleichgewichtskonstante der Dissoziation des Dimers in mol/l.
- 43 -
Material und Methoden
2.4.4
Stopped-flow Kinetik
Für die Betrachtung schneller, im Millisekunden-Bereich liegender Reaktionen wurden
zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen an einem SFM400 stopped-flow Gerät (Bio-Logic,
Grenoble, Frankreich) durchgeführt. Für diese Messungen wurden zwei Reaktanden bei
einer Flussrate von 14ml/s in einer Probenküvette (FC08) gemischt und die zeitliche
Änderung der Fluoreszenzintensität detektiert. Die Totzeit des Systems betrug bei diesen
Bedingungen 1,1ms. Für die Auswertung wurde über mindestens drei einzelne Messungen
gemittelt.
Mit dieser Methode wurden Assoziations- und Dissoziationskinetiken von mantNukleotiden (mGMP, mGDP, mGppNHp) bestimmt. In diesen Experimenten wurden die
mant-Guaninnukleotid-Konzentrationen
konstant
bei
0,5µM
gehalten
und
Proteinkonzentrationen zwischen 5µM und 40µM variiert. Der hohe Proteinüberschuss
wurde verwendet, um eine Bindungskinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten. Die
Anregung der mant-Fluorophore erfolgte bei 366nm und die Emission wurde, um das
Streulicht herauszufiltern, mit Hilfe eines Kantenfilters oberhalb von 420nm detektiert.
Aus einer einfach exponentiellen Anpassung an die zeitliche Fluoreszenzänderung wurde
kobs, die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, erhalten.
Bei Auftragung der erhaltenen Geschwindigkeitskonstante (kobs) gegen die Konzentration
(B0) zeigte sich die lineare Abhängigkeit (Formel 2-3).
Formel 2-3
k obs = k ass [B ]0 + k diss
Die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante
der Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt. Für
eine
genauere
Bestimmung
der
Dissoziationsgeschwindigkeit
wurden
Verdrängungsexperimente vorgenommen. Dabei wird ein Komplex aus Protein und mantNukleotid vorgelegt. Durch einen großen Überschuss an nicht markierten Nukleotid wird
dann das mant-Nukleotid aus dem Komplex verdrängt.
- 44 -
Material und Methoden
2.4.5
Fluoreszenztitration mit mant-Nukleotiden
Fluoreszenztitrationen zur Bestimmung von
Nukleotidaffinitäten wurden an einem
Kontron SFM25 Spektrofluorometer bei 25°C durchgeführt. Dafür wurden 0,5µM mantGuaninnukleotid in einer Fluoreszenzküvette vorgelegt und in kleinen Schritten bis zu
250µl einer Proteinlösung hinzutitriert, in der auch 0,5µM mant-Nukleotid vorlag, um den
Verdünnungseffekt zu umgehen. Nach jedem Titrationsschritt wurde bis zu Einstellung des
Gleichgewichts gewartet, um ein konstantes Fluoreszenzsignal zu erhalten. Die Titration
wurde beendet, sobald eine Sättigung zu beobachten war. Die Anregung der mantFluoreszenz erfolgte bei 366nm und die Emission wurde bei 435 nm detektiert. An die
Auftragung der relativen Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration wurde eine
quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst.
Formel 2-4
[E ]0 * [L]0 * K D − ([E ]0 + [L]0 + K D ) 2 − 4[E ]0 [L]0
F = F0 + ΔFmax
2[E ]0
Dabei ist F die Gesamtfluoreszenz, F0 die Grundfluoreszenz, ΔFmax die maximale
Fluoreszenzerhöhung, [E]0 die Konzentration des vorgelegten Fluorophors, [L]0 die
Gesamtkonzentration
des
hinzutitrierten
Reaktionspartners
und
KD
die
Dissoziationskonstante. Aus dieser Anpassung wurde die Gleichgewichtskonstante der
Dissoziation (KD) erhalten.
2.4.6
Die
Größenausschlusschromatographie
analytische,
größenspezifische
Trennung
von
Proteinen
erfolgte
durch
Größenausschlusschromatographie. Dazu wurde die Säule (Superdex S200 10/30, GE
Healthcare) mit 2 Säulenvolumen Puffer (50mM Tris-HCl, pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM
DTE) equilibriert. Diese Puffer enthielten, je nach Experiment, 200µM eines
Guaninnukleotids (GMP, GDP, GppNHp). Um das Oligomerisierungsverhalten der
Proteine im Übergangszustand der Nukleotidhydrolyse zu analysieren, wurde ein Puffer
verwendet, in dem 200 µM eines Guaninnukleotids (GMP oder GDP) und AlFx
hinzugegeben wurden (300µM AlCl3, 10mM NaF, 50mM Tris-HCl, pH7,9 ,5mM MgCl2,
2mM DTE).
- 45 -
Material und Methoden
Bei einer Flussrate von 0,5ml/min wurden 200µl der vorinkubierten Probe auf die Säule
aufgetragen. Die Detektion erfolgte mit einem Photodiodenarray-Detektor MD-2010
(Jasco, Gross-Umstadt) zwischen 200nm und 600nm.
Die Kalibrierung der analytischen Gelfiltrationssäule erfolgte mit Standardproteinen
(Cytochrom C (12,4kDa), Carboanhydrase (29kDa), Albumin (66kDa), ADH (150kDa)
und β-Amylase (200kDa)) und einem hochmolekularen Farbstoff (Dextran Blue), um das
Ausschlussvolumen zu bestimmen (MW-GF-200, Sigma-Aldrich, Deisenhofen).
2.4.7
Dynamische Lichtstreuung
Bei der Methode der dynamischen Lichtstreuung wird Laserlicht (He-Ne-Laser, 632,8nm)
auf eine Küvette fokussiert, in der ein im Puffer gelöstes Protein vorliegt. Das dabei
entstehende Streulicht wird in einem Winkel von 90° zum Strahlengang detektiert. Durch
die Brownsche Molekularbewegung der Proteine wird die Wellenlänge des Streulichts so
verändert, dass eine Schwankung in der Streuintensität resultiert. Aus den detektierten
Fluktuationen des Streulichts berechnet ein digitaler Korrelator in Echtzeit eine
Korrelationsfunktion. Diese Korrelationsfunktion beschreibt die Ähnlichkeit der
Intensitäten des detektierten Streulichts in Relation zur Korrelationszeit τ. Dadurch lässt
sich nun die Diffusionsgeschwindigkeit des Makromoleküls in Lösung ableiten. Mit Hilfe
des Diffusionskoeffizienten und der Viskosität des Lösungsmittels lässt sich so, auf
Grundlage der Stokes-Einstein-Gleichung, der hydrodynamische Radius des einzelnen
Proteins bestimmen.
Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und hGBP2 wurden 20µM
des jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst,
und durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette gefüllt. Um den nukleotidabhängigen
Oligomerisierungsstatus zu überprüfen, wurden jeweils 200µM eines Guaninnukleotids
(GMP, GDP, GppNHp, GDP*AlFx) hinzugegeben.
2.4.8
Temperatursprung
Die Temperatursprung-Methode (T-Jump) ist eine Methode, in der ein System, in diesem
Fall ein Monomer-Dimer-Gleichgewicht, durch eine kontrollierte Temperaturänderung aus
dem Gleichgewicht gebracht wird. Das Einstellen des neuen Gleichgewichts kann dann
- 46 -
Material und Methoden
durch unterschiedliche Methoden (Anisotropie, Absorption oder Fluoreszenz) detektiert
werden. Die Temperaturänderung wird erreicht, indem zwei Lösungen unterschiedlicher
Anfangstemperaturen sehr schnell miteinander vermischt werden. Die Endtemperatur
ergibt
sich
aus
den
Anfangstemperaturen
der
beiden
Lösungen
und
dem
Mischungsverhältnis. Als Grundlage für den experimentellen Aufbau dient eine stopped
flow Anlage (Bio-Logic, Grenoble, Frankreich), die um ein Element für die
Temperaturregelung der Proben erweitert wurde. Die Temperaturregelung erfolgt durch
drei
Peltier-Elemente,
welche
eine
schnelle
und
genaue
Temperaturanpassung
gewährleisten.
Mit dieser Methode wurden die Affinitäten der Deletionsmutanten α12-13, α7-13 und der
Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E analysiert. Dazu wurden diese Proteine mit
Fluoreszenzmarkern versehen, die bei einer Interaktion der Proteine ein FRET-Signal
liefern. Der Donor und der Akzeptor wurden in equimolaren Konzentrationen in eine
Spritze gegeben und gewartet, bis die Lösungen die jeweiligen Temperaturen angenommen
hatten. In die andere Spritze wurde der Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9 ,5mM MgCl2, 2mM
DTE) ohne Protein vorgelegt. Dabei wurde, ausgehend von der Zieltemperatur von 25°C,
eine Temperatur von 10°C für die Proteinlösung und 40°C für den Puffer gewählt. Es
wurden Proteinkonzentrationen zwischen 1µM und 20µM verwendet. Nach dem Mischen
der beiden Lösungen, konnte die Einstellung des neuen Gleichgewichts durch die
Fluoreszenzänderung detektiert werden. Die Datenpunkte wurden mit Hilfe der
Gerätesoftware (Bio-Kine32, Bio-Logic, Grenoble, Frankreich) angepasst.
Formel 2-5
k obs = k ass 2 [B ]0 + k diss
Die resultierenden Geschwindigkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration
aufgetragen und eine lineare Anpassung der Datenpunkte vorgenommen (Formel 2-5) Die
Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante der
Dissoziation (kdiss) wurden aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt.
- 47 -
Material und Methoden
2.4.9
FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)
Die Methode des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Förster 1946), kann eingesetzt
werden, um auf molekularer Ebene sowohl Interaktionen als auch Distanzen quantitativ in
zellfreien oder zellulären Systemen zu bestimmen. Sie eignet sich zur Bestimmung von
Interaktionen zwischen löslichen Proteinen, Membranproteinen sowie Lipidkomponenten
von Membranen oder Nukleinsäuren. Grundlage dieser Methode ist der strahlungslose
Energietransfer von einem angeregten Energiedonor auf einen Energieakzeptor
(Flurophorenpaar) mittels einer intermolekularen long range Dipol-Dipol-Kopplung
(Förster 1946). Voraussetzungen für diesen Energietransfer sind u.a. die Überlappung des
Fluoreszenzemissionsspektrums des Donors und des Absorptionsspektrum des Akzeptors,
sowie ein geringer Abstand zwischen dem Paar. Der Abstand sollte innerhalb des FörsterRadius liegen, der für jedes Donor-Akzeptor-Paar unterschiedlich ist (Clegg et al. 1995).
Der angeregte Donor übermittelt dann seine Energie strahlungslos auf den Akzeptor, der
seinerseits angeregt wird. Im Zuge des Energietransfers findet ein Quenching der
Fluoreszenz des Donors statt, dagegen wird die Fluoreszenz des Akzeptors verstärkt
angeregt.
Die Analyse der Oligomerisierung von hGBP1 Deletionsmutanten, α12/13, α7-13 und der
Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E, wurde mit dem eYFP/eCFP-System oder einem
System bestehend aus Fluorescein und Coumarin vorgenommen. Das eYFP hat sein
Absorptionsmaximum bei 514nm und das Emissionsmaximum bei 525nm und fungiert als
Akzeptor. Das eCFP, das in diesem System als Donor agiert, besitzt sein
Absorptionsmaximum bei 453nm und emittiert maximal bei einer Wellenlänge von
475nm.
Das Coumarin hat sein Absorptionsmaximum bei 384nm und sein Emissionsmaximum bei
472nm. Das Fluorescein hat sein Absorptionsmaximum bei 492nm und sein
Emissionsmaximum bei 521nm.
Aufgrund der guten Überlappung des Emissionsspektrums von Coumarin und dem
Absorptionsspektrum von eYFP war es möglich, diese beiden Fluorophore als FRETSystem zu verwenden.
- 48 -
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 hGBP1
3.1.1
Identifizierung einer elektrostatischen Interaktionsstelle
In vorangegangenen Arbeiten konnten unter anderem die Kristallstrukturen der LGDomäne von hGBP1 im GMP (PDB: 2d4h) gebundenen Zustand und im Komplex mit
GDP und AlFx (PDB: 2b92) gelöst werden (Ghosh et al., 2006). Die Überlagerung dieser
beiden Strukturen zeigte große Unterschiede in der Position der Helix α4´. Diese Helix
α4´
bewegt
sich
in
der
GDP*AlFx-gebundenen
Struktur
weg
von
der
Nukleotidbindungstasche (Abbildung 3-1)
α4´
hGBP1 LG • GMP
hGBP1 LG • GDP*AlFx
Abbildung 3-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1.
Die Abbildung zeigt die Überlagerung der Kristallstrukturen der LG-Domäne von hGBP1 im GMP
(rot, PDB: 2d4h) und GDP*AlFx-(blau, PDB: 2b92) gebundenen Zustand. Die Überlagerung
dieser beiden Strukturen zeigt große Unterschiede in der Position der Helix α4´.
- 49 -
Ergebnisse
α12-13
α4´
Abbildung 3-2: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13.
Die LG-Domäne interagiert mit den Helices α12-13 aufgrund einer elektrostatischen Bindung
zwischen einem Lysin (K228) und einem Arginin (R227) auf Seite der Helix α4´ und
mehreren Glutaminsäuren (E563, E568, E556 und E575) auf Seiten von α12-13.
In einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur ist zu erkennen, dass die Helix
α4´ mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion zwischen der LG-Domäne und
dem C-Terminus ist ein elektrostatischer Kontakt bestehend aus einem Lysin (K228) und
einem Arginin (R227) auf Seite der Helix α4´ und mehreren Glutaminsäuren (E563, E568,
E556 und E575) auf Seiten von α12-13 (Abbildung 3-2). Die Bewegung der Helix α4´ um
ca. 7Å hat auch Folgen für die beiden Aminosäuren Arginin 227 und Lysin 228, die bei
näherer Betrachtung der Kristallstruktur die einzigen Interaktionspunkte der LG-Domäne
zu den Helices α12-13 darstellen. Das Arginin 227 wird um 3Å in seiner Position
verändert. Die Bindungsabstände zu dem Interaktionspartner E563 erhöht sich auf über
4,5Å, was für eine polare Bindung eine Schwächung bedeutet. Beim E556, dem zweiten
Interaktionspartner von R227, wird der Abstand auf unter 2Å verkürzt. Das Lysin 228 ist
durch Positionsänderung von α4´ um 5Å zur vorherigen Position verschoben. Die
Entfernung zu den Bindungspartnern E568 und E575 liegen bei über 8Å bzw. 5Å.
- 50 -
Ergebnisse
α12-13
α4´
7Å
Abbildung 3-3: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13
vor und nach Konformationsänderung von α4´.
Die Abbildung zeigt den elektrostatischen Kontakt zwischen der LG-Domäne und α12-13
im nukleotidfreien Zustand des Proteins (grün, PDB: 1DG3). Durch eine
Konformationsänderung der α4´, die durch die Bindung von GDP und AlFx induziert wird
(transparent, PDB: 2b92), verändern sich auch die Positionen der Aminosäuren R227 und
K228. Aufgrund dieser Positionsänderungen liegen die an der Bindung beteiligten
Aminosäuren für die Aufrechterhaltung der Interaktion zu weit auseinander. Als
Konsequenz wird die Bindung der α12-13 zur LG-Domäne unterbrochen und steht
möglicherweise dadurch für eine intermolekulare Interaktion zur Verfügung.
Weiterhin ist zu beachten, dass durch die Positionsänderung um 7Å ein sterischer Konflikt
zwischen der α4´ und den Helices α12-13 hervorgerufen würde. Dadurch werden die
Helices α12-13 von der LG-Domäne weggedrückt. Zusammengenommen werden
möglicherweise durch diese Positionsänderungen die Bindungsabstände zwischen den an
der Interaktion beteiligten Aminosäuren so weit erhöht, dass sie unterbrochen werden.
Das hätte zur Konsequenz, dass die Helices α12-13 nicht mehr an der LG-Domäne fixiert
sind (Abbildung 3-3). Der C-terminale Teil des Proteins wäre somit flexibel und könnte
für eine intermolekulare Interaktion zur Verfügung stehen.
Durch den Übergangszustand der Hydrolyse werden diese strukturellen Änderungen der
LG-Domäne induziert, welche nachfolgend auf die Helices α12-13 übertragen werden
- 51 -
Ergebnisse
könnten. Es ist aber bis heute keine full length Struktur im GDP und AlFx gebundenen
Zustand verfügbar, so dass diese Annahme anhand der Struktur nicht bewiesen werden
kann. Um zu zeigen, dass für eine Interaktion am C-terminus die Fixierung an der LGDomäne unterbrochen sein muss, wurden die beteiligten Aminosäuren so mutiert, dass
eine Ladungsumkehr resultiert und die Helices voneinander abgestoßen werden. Die
eingefügten Mutationen waren R227E, K228E, E563R und die Doppelmutante
R227E/K228E.
3.1.2
Proteinaufreinigung
Die Aufreinigung der Proteine erfolgte affinitätschromatographisch mit nachfolgender
Größenausschlusschromatographie. Dafür wurden die Proteine, die N-terminal mit einem
(His)6-Tag versehen sind, im E.coli Expressionsstamm BL21 expremiert. Um eine
ausreichende Menge an Protein zu erhalten, erfolgte die Expression in einer 10L-Kultur.
Nach der Zellernte wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen. Durch
Zentrifugation wurden die nicht löslichen Bestandteile abgetrennt und der lösliche
Überstand auf eine HisPur Cobalt-Säule aufgegeben. Die Säule wurde mit Puffer, welcher
10mM Imidazol enthielt, gespült, um unspezifisch gebundenes Protein von der Säule zu
entfernen. Anschließend wurde das Protein mit 150mM Imidazol eluiert und in Fraktionen
von je 4 ml gesammelt. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden vereinigt, mit 3M
Ammoniumsulfat gefällt und das gefällte Protein sedimentiert. Das Sediment wurde mit
Puffer C (50mM Tris-HCl, pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst und auf eine Superdex
S200 Gelfiltrationssäule aufgetragen. Der Durchfluss der Säule wurde wiederum in
Fraktionen
von
je
4ml
gesammelt.
Die
proteinhaltigen
Fraktionen
wurden
gelelektrophoretisch analysiert und entsprechend höchster Reinheit vereinigt und
aufkonzentriert.
3.1.3
Dynamische Lichtstreuung
Durch die dynamische Lichtstreuung gelingt es, den Diffusionskoeffizienten und damit
den hydrodynamischen Radius eines Proteins zu ermitteln. Durch den hydrodynamischen
- 52 -
Ergebnisse
Radius kann der Grad der Selbstassemblierung der GBPs in unterschiedlichen Nukleotidgebundenen Zuständen analysiert werden.
Da die Kristallstruktur von hGBP1 bereits gelöst werden konnte, ist es möglich über das
Programm HydroPro (Carrasco et al. 1999) den theoretischen Diffusionskoeffizient von
hGBP1 inklusive seiner Hydrathülle zu bestimmen. Dazu wird die Röntgenstruktur des
nukleotidfreien Monomers von hGBP1 (1dg3) aus der Proteindatenbank (RCSB.org)
verwendet. Durch HydroPro wird mit diesen Daten ein theoretischer Diffusionskoeffizient
von hGBP1wt, inklusive Hydrathülle, von 4,74•10-7 cm2•s-1 erhalten. Dieser liegt nahe am
experimentellen über die DLS-Messungen erhaltenen Wert von 4,98•10-7 cm2•s-1.
Mit dem Diffusionskoeffizienten und der Stokes-Einstein-Beziehung (Formel 3-1) kann
der hydrodynamische Radius von hGBP1 berechnet werden. Dabei ist k die BoltzmannKostante, T die Messtemperatur, D der Diffusionskoeffizient und η die Viskosität des
Lösungsmittels bei 298,15K.
Formel 3-1:
D=
k ∗T
6π ∗η ∗ r
Mit den aus HydroPro erhaltenden Diffusionskoeffizienten und der Stokes-EinsteinnBeziehung erhält man somit einen Wert für den theoretischen hydrodynamischen Radius
von 4nm. Durch die Messungen mit der DLS-Apparatur wird ein hydrodynamischer
Radius von 4,3nm erhalten. Da die Stokes-Einstein-Beziehung die Diffusion eines
sphärischen Objekts beschreibt erhält man mit dem aus den DLS-Messungen erhaltenen
hydrodynamischen Radius ein mit einer Sphäre korrespondierendes Volumen von
322nm³. Bei der Annahme einer durchschnittlichen Hydrathüllenstärke von 0,3nm, erhält
man für das mit einer Sphäre korrespondierende Volumen ohne Hydrathülle einen Wert
von 248nm³.
Jedoch ist zu beachten, dass hGBP1 geometrisch eher als Ellipsoid zu betrachten ist
(Abbildung 3-4). Das reelle Volumen des Proteins mit und ohne Hydrathülle konnte durch
das Programm HydroPro, anhand der Röntgenstruktur errechnet werden und liegen bei
118nm³ (mit Hydrathülle) bzw. 78nm³ (ohne Hydrathülle).
- 53 -
Ergebnisse
b
a
c
Abbildung 3-4: Darstellung des Oberflächenmodells von hGBP1.
Abgebildet ist die Röntgenstruktur von hGBP1 als Oberflächenmodell. Für die Volumenberechnung
von hGBP1 kann das Molekül nährungsweise als Ellipsoid behandelt werden. Die drei Radien
(a,b,c) wurden durch das Programm PyMOL bestimmt und liegen bei 6,1nm•1,9nm•2nm.
Betrachtet man hGBP1 nährungsweise als Ellipsoid (V = a•b•c), können die Halbachsen
für die Volumenberechnung durch das Programm PyMol aus der Röntgenstruktur mit
6,1nm•1,9nm•2nm abgeschätzt werden (Abbildung 3-4). Damit ergibt sich ein mit einem
Ellipsoid korrespondierendes Volumen (4/3π•a•b•c) für das Protein ohne Hydrathülle, von
97nm³. Dieser Wert weicht nur gering von dem über HydroPro interpolierten Volumen
von 78nm³ ab. Mit diesem Volumen (78nm³) und einer Proteindichte von 1,4g/cm³
(Quillin et al. 2000) kann die Masse des Proteins mit 65,8kDa berechnet werden. Dieses
Ergebnis stellt nur eine geringe Abweichung von der tatsächlichen Masse von hGBP1
(69kDa)
dar.
Bei
Addition
von
jeweils
0,3nm
auf
die
drei
Halbachsen
(6,4nm•2,2nm•2,3nm), kann das Volumen des Proteins inklusive einer Hydrathülle mit
136nm³ berechnet werden, was ebenfalls relativ nah and dem von HydroPro errechneten
Wert von 118nm³ liegt.
- 54 -
Ergebnisse
Volumen
Volumen
Masse
(ohne Hydrathülle)
(inkl. Hydrathülle)
(g/mol)
HydroPro/Interpoliert
78nm³
118nm³
65,8
PyMol/Ellipsoid
97nm³
136nm³
81,8
Sphäre
248nm³
322nm³
209
Diese
Berechnungen
zeigen
deutlich,
dass
die
Annahme
einer
ellipsoiden
Proteingeometrie viel exakter ist als die einer sphärischen. Das mit einer Sphäre
korrespondierende hydrodynamische Volumen liegt für das Monomer bei 322nm³ und ist
damit 2,7mal größer als das tatsächliche, durch HydroPro berechnete Volumen. Jedoch ist
für einen relativen Vergleich des Assemblierungsstatus die vereinfachte Berechnung der
sphärischen hydrodynamischen Volumina ausreichend.
In der Abbildung 3-5 sind die aus den gemessenen hydrodynamischen Radien errechneten
Volumina aufgetragen. Dabei wurde zunächst vereinfacht angenommen, dass hGBP1 eine
sphärische Form besitzt. Für des monomere und nukleotidfreie hGBP1 konnte
experimentell ein Radius von 4,25nm erhalten werden. Das mit einer Sphäre
korrespondierende Volumen liegt damit bei 320nm³. Bei der Zugabe von 200µM
GppNHp, einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, erhöht sich der hydrodynamische
Radius von hGBP1 auf 5,33nm und damit das Volumen auf 634nm³. Die Verdoppelung
des Volumens zeigt, dass der Wildtyp von hGBP1 im GppNHp gebundenem Zustand zu
einem Dimer assembliert. In einem Komplex aus GDP und AlFx (50mM Tris-HCl, 5mM
MgCl2, 2mM DTE, 300µM AlCl3, 10mM NaF, 200µM GDP) liegt der Wert für den
hydrodynamischen Radius bei 6,5nm, was einem Kugelvolumen von 1161nm³ entspricht.
Dies entspricht in etwa dem vierfachen Volumen einer monomeren Einheit und zeigt, dass
hGBP1 im Komplex mit GDP und AlFx als Tetramer vorliegt. Diese Ergebnisse der
nukleotidabhängigen Oligomerisierung bestätigen das Modell von Praefcke et al. (2004).
- 55 -
Ergebnisse
2500
Volumen (nm³)
2000
1500
1000
500
0
hGBP1 wt
E563R
K228E
R227E/K228E
R227E
Abbildung 3-5: Dynamische Lichtstreuung von hGBP1 und Mutanten.
Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und seinen Mutanten, wurden 20µM
des jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst, und
durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt. Der erhaltene
hydrodynamische Radius wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet und aufgetragen. Die
gelbe Säule zeigt das theoretische Volumen des hGBP1-Wildtyps, welches durch HydroPro unter
Verwendung der PDB-Datei „1dg3“ errechnet wurde. Aufgetragen sind die Volumina von hGBP1wt
(Blau), E563E (Cyan), K228E (Rot), R227E/K228E (Magenta) und R227E (Grün). Die Säulen
einer Farbe stellen (von links nach rechts) die Volumina der unterschiedlichen Proteine im
nukleotidfreien, im GppNHp-gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx dar.
Für die Doppelmutante hGBP1-R227E/K228E (Abbildung 3-5; Magenta), konnte ein
verändertes Oligomerisierungsverhalten gegenüber dem Wildtyp in der DLS beobachtet
werden. Die hGBP1 Doppelmutante, R227E/K228E, zeigt im nukleotidfreien Zustand
einen hydrodynamischen Radius von 5,0nm, was ungefähr dem Radius des Wildtyps im
GppNHp- gebundenem Zustand entspricht. Diese Mutante liegt bereits im nukleotidfreien
Zustand als Dimer vor. Der GppNHp gebundene Zustand der R227E/K228E besitzt einen
hydrodynamischen Radius von 6,5nm. Dieser Wert entspricht dem des GDP*AlFxgebundenen Wildtyps.
- 56 -
Ergebnisse
Wildtyp
E563R
K228E
R227E/K228E
R227E
rH (nm)
Volumen (nm³)
P.D.I
Nt-frei
4,2 ± 1,0
322
0,0562
GppNHp
5,3 ± 0,9
634
0,043
GDP*AlFx
6,5 ± 1,5
1161
0,064
Nt frei
4,4 ± 1,1
357
0,0556
GppNHp
5,4 ± 1,2
660
0,052
GDP*AlFx
7,1 ± 1,9
1499
0,0723
Nt frei
4,3 ± 1,0
333
0,0499
GppNHp
5,4 ± 1,1
660
0,076
GDP*AlFx
6,6 ± 1,6
1204
0,0564
Nt frei
5,0 ± 1,2
524
0,055
GppNHp
6,5 ± 1,5
1150
0,068
GDP*AlFx
6,9 ± 1,6
1376
0,068
Nt frei
5,4 ± 2,2
660
0,179
GppNHp
7,5 ± 2,6
1767
0,134
GDP*AlFx
7,6 ± 2,1
1839
0,15
Tabelle 3-1: Zusammenfassung der DLS-Ergebnisse von hGBP1 und Mutanten.
Der erhaltene hydrodynamische Radius (rH) wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet. Der
Polydispersitätsindex (P.D.I.) gibt die Molekulargewichtsverteilung in der gemessenen Probe an.
Ein Wert von unter 0,1 bedeutet, dass hauptsächlich Moleküle einer Molmasse in der Probe
vorliegen.
Die hydrodynamischen Radii der Punktmutante hGBP1-R227E (Abbildung 3-5; Grün)
zeigten ebenfalls ein abweichendes Bild gegenüber dem Wildtyp. Im nukleotidfreien
Zustand zeigt hGBP1-R227E einen Radius welcher dem des Wildtyp Dimer entspricht. Im
GppNHp- und GDP*AlFx-gebundenem Zustand liegen die Werte des hydrodynamischen
Radius bei 7,5nm bzw. 7,6nm. Diese Radien liegen über denen des
GDP*AlFx
gebundenem Wildtypproteins. Auffallend bei den Messungen der R227E-Mutante war
aber ein vergleichsweise hoher Polydispersitätsindex (P.D.I.). Wahrscheinlich liegt das
Protein in verschiedenen oligomeren Zuständen vor
Die hGBP1-Punktmutanten K228E (Abbildung 3-5; rot) und E563R (cyan) wiesen
gegenüber dem Wildtyp kein verändertes Oligomerisierungsverhalten auf. Im GppNHpgebundenem Zustand liegt bei beiden Mutanten der Radius bei etwa 5,4nm, was einem
sphärischen Volumen von 660nm³ entspricht. Die Radii der Mutanten im Komplex mit
- 57 -
Ergebnisse
GDP und AlFx liegen für E563R bei 7,1nm und für K228E bei 6,6nm und bewegen sich
somit im Bereich eines tetrameren Proteins.
3.1.4
Analytische Größenausschlusschromatographie
Das Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und seinen Mutanten wurde in Gegenwart
verschiedener
Nukleotide
mittels
analytischer
Größenausschlusschromatographie
analysiert. Die dafür verwendete Säule (Superdex S200 10/30 HR) wurde im Vorfeld
durch
Standardproteine
(MW-GF-200,
Sigma-Aldrich,
Deisenhofen)
nach
Herstellerangaben kalibriert (Abbildung 3-6).
molekulare Masse (kDa)
100
10
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Ve/V0
Abbildung 3-6: Kalibrierung der analytischen Größenausschlusschromatographiesäule.
Die Kalibrierung erfolgte durch fünf Standardproteine und einen hoch-molekularen Farbstoff zur
Messung des Ausschlussvolumens V0. Die Säule wurde gemäß Herstellerangaben (50mM TrisHCl, pH 7.5, 100mM KCl) equilibriert und die Proteine in Konzentrationen zwischen 2mg/ml
und 10mg/ml aufgetragen. Die Detektion erfolgte über die Absorption bei 280nm.
Für die Messungen von hGBP1 und seinen Mutanten wurde die Säule vorher mit dem
Messpuffer equilibriert (50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 2mM DTE). Für die Messungen
- 58 -
Ergebnisse
mit Nukleotiden wurde dem Puffer 200µM des jeweiligen Nukleotids (GDP, GMP,
GppNHp) beigefügt.
320kDa
148kDa 100kDa
1,0
rel. Absorption
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ve/V0
Abbildung 3-7: Analytische Größenausschlusschromatographie vom hGBP1 Wildtyp.
Die normierten Elutionsprofile zeigen, dass hGBP1 im nukleotidfreien Zustand mit einer Molmasse
von 100kDa als Monomer eluiert (Blau).Die Abweichung zur reellen Monomermasse von 70kDa
wird durch die geringe Ionenstärke des Laufpuffers verursacht. In Gegenwart von GppNHp liegt
der Wildtyp mit einer Molmasse von 148kDa als Dimer (rot), und in Gegenwart von GDP und AlFx,
mit einer Molmasse von 320kDa als Tetramer (Schwarz) vor.
Der Puffer für die AlFx Messungen beinhaltete zusätzlich 300µM AlCl3 und 10mM NaF.
Das Elutionsverhalten des hGBP1 Wildtyps (Praefcke et al. 2004) ist in Abbildung 3-7
gezeigt. In einem nukleotidfreien Puffer eluiert der hGBP1-Wildtyp als Monomer bei ca.
100kDa. Diese Masse liegt um 30kDa über der reellen Masse vom monomeren hGBP1.
Die Ursache liegt in der geringen Ionenstärke der verwendeten Laufpuffers (Masterarbeit,
M. Wehner, 2007). Fügt man dem Laufpuffer 500mM NaCl hinzu, eluiert das Protein mit
einer Masse von 70kDa.
- 59 -
Ergebnisse
In Gegenwart des nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon GppNHp eluiert das Protein
schneller und liegt mit ca. 148kDa als Dimer vor. Die Bindung des Komplexes bestehend
aus GDP und AlFx, lässt hGBP1 bei noch höheren Massen eluieren und liegt mit ca.
320kDa bei einer Masse, die in etwa einem Tetramer entspricht (Praefcke et al. 2004). Bei
Betrachtung des Elutionsprofils der Mutante hGBP1-R227E/K228E zeigt sich ein im
Vergleich zum Wildtyp verändertes Elutionsverhalten (Abbildung 3-8).
320kDa
148kDa 100kDa
1,0
rel. Absorption
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ve/V0
Abbildung 3-8: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante hGBP1
R227E/K228E.
Aufgetragen sind die Elutionsprofile der hGBP1-Doppelmutante R227E/K228E, nukleotidfrei
und im Komplex mit GppNHp bzw. GDP*AlFx. Die senkrechten Linien zeigen den Vergleich
zum hGBP1 Wildtyp. Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima des Wildtyps im
nukleotidfreien Zustand (blau) und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw. GDP*AlFx (schwarz).
Im Vergleich zeigen die Elutionsprofile von R227E/K228E, dass diese Mutante im
nukleotidfreien Zustand wahrscheinlich als Monomer/Dimer Gemisch eluiert (blau). Neben dem
Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein auch eine kleine Schulter bei ca. 310kDa zu
beobachten. In Gegenwart von GppNHp (rot) und dem Komplex aus GDP und AlFx (schwarz)
eluiert diese Mutante mit derselben Masse wie der tetramere Wildtyp.
Die Elution der nukleotidfreien Mutante erfolgt bei einer Masse von ca. 120kDa. Dieser
Wert liegt genau zwischen den Massen des nukleotidfreien (100kDa) und GppNHp
- 60 -
Ergebnisse
gebundenen (140kDa) hGBP1-Wildtyps. Möglicherweise eluiert das Protein in einem
Monomer/Dimer Gemisch. Neben dem Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein
auch ein kleiner Peak bei ca. 310kDa zu beobachten.
Die Mutante R227E/K228E eluiert im GppNHp gebundenen Zustand und im Komplex
mit GDP*AlFx bei sehr ähnlichen Massen von 333kDa (GDP*AlFx) bzw. 310kDa
(GppNHp). Diese Massen entsprechen ungefähr denen des tetrameren hGBP1-Wildtyps,
der bei ca. 320kDa eluiert. Die Durchführung der Größenausschlusschromatographie mit
der Mutante hGBP1 R227E ergab ein sehr ähnliches Elutionsverhalten im Vergleich zur
Doppelmutante R227R/K228E (Abbildung 3-9). Das nukleotidfreie Protein hGBP1
R227E eluiert bei einer Masse von 114kDa. Diese Masse liegt zwischen den Massen des
nukleotidfreien und des GppNHp-gebundenem Wildtyps..
320kDa
148kDa 100kDa
1,0
rel. Absorption
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ve/V0
Abbildung 3-9: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R227E.
Die Elutionsprofile zeigen, dass R227E im nukleotidfreien Zustand als Monomer eluiert (blau).
Neben dem Hauptpeak ist bei dem nukleotidfreien Protein auch ein kleiner Peak bei ca. 310kDa zu
beobachten. In Gegenwart von GppNHp (schwarz) und dem Komplex aus GDP und AlFx (rot) liegt
diese Mutante als Tetramer vor. Die senkrechten Linien zeigen den Vergleich zum hGBP1 Wildtyp.
Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima des Wildtyps im nukleotidfreien Zustand (blau)
und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw. GDP*AlFx (schwarz)
- 61 -
Ergebnisse
Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass diese Mutante in einem Gemisch aus
Monomer und Dimer eluiert. Bei der R227E ist wie auch bei der Doppelmutante
R227E/K228E ein kleiner Peak bei höheren Massen (ca.280kDa) zu beobachtenBei der
Mutante R227E ist ein ähnliches Laufverhalten im GppNHp- und GDP*AlFx-gebundenem
Zustand zu beobachten wie bei der Doppelmutante R227E/K228E. Im Komplex mit
GppNHp eluiert das Protein bei einer Masse von ca. 295kDa. Im GDP*AlFx gebundenen
Zustand liegt die beobachtete Masse bei 330kDa. Dieses Oligomerisierungsverhalten ist
vergleichbar mit dem des GDP*AlFx gebundenen hGBP1 Wildtyp. Diese Beobachtungen
der Mutanten R227E und R227E/K228E bestätigen die Daten der hydrodynamischen
Radii, welche in der dynamischen Lichtstreuung beobachtet werden konnten.
Die Punktmutante K228E eluiert im nukleotidfreien Zustand bei einer Masse von 108kDa,
was ungefähr der Masse des nukleotidfreien Wildtyp Protein entspricht (Abbildung 3-10).
320kDa
148kDa 100kDa
1,0
rel. Absorption
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ve/V0
Abbildung 3-10: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R228E.
Die Elutionsprofile zeigen, dass R228E im nukleotidfreien Zustand mit einer Masse von 108kDa
als Monomer eluiert (blau). In Gegenwart von GppNHp (schwarz) eluiert das Protein bei
155kDa, wobei eine Schulter bei 271kDa zu beobachten ist. In dem Komplex aus GDP und AlFx
(rot) eluiert diese Mutante als Tetramer bei einer Masse von 325kDa. Die senkrechten Linien
zeigen den Vergleich zum hGBP1 Wildtyp. Sie entsprechen den Positionen der Elutionsmaxima
des Wildtyps im nukleotidfreien Zustand (blau) und im Komplex mit GppNHp (rot) bzw.
GDP*AlFx (schwarz).
- 62 -
Ergebnisse
Der Komplex von GppNHp und der Mutante K228E eluiert bei etwa 155kDa, wobei eine
ausgeprägte Schulter bei 271kDa zu beobachten ist. Die Mutation K228E zeigt in
Gegenwart von GDP und AlFx eine Masse von 325kDa, was in etwa der Masse des
tetrameren Wildtyps entspricht.
320kDa
148kDa 100kDa
1,0
rel. Absorption
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Ve/V0
Abbildung 3-11: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante E563R.
Das Elutionsprofil der Mutante E563R zeigt im nukleotidfreien Zustand mit einer Masse von
102kDa einen Monomeren Zustand (Blau). In Gegenwart von GppNHp (Schwarz) eluiert das
Protein bei 178kDa. In einem Komplex aus GDP und AlFx (Rot) eluiert diese Mutante bei einer
Masse von 276kDa. Die senkrechten Linien beschreiben die Elutionsmaxima des Wildtyps
nukleotidfrei (Blau) und in Gegenwart von GppNHp (Schwarz) bzw. GDP und AlFx (Rot).
Die Punktmutante hGBP1 E563R (Abbildung 3-11) eluiert im nukleotidfreien Zustand mit
einer Masse von 102kDa. Im GppNHp-gebundenem Zustand assembliert diese Mutante zu
einem Dimer und eluiert mit einer Masse von 178kDa. Dieser Wert zeigt damit im
Vergleich zum Wildtyp (148kDa) eine Verschiebung zu höheren Massen. Im Komplex
mit GDP und AlFx eluiert diese Mutante bei einer Masse von 276kDa. Dies stellt, im
Vergleich zum Wildtyp-Tetramer, eine Verschiebung zu kleineren Massen dar.
- 63 -
Ergebnisse
3.1.5
Nukleotidaffinität
Zur Bestimmung der Affinitäten von mant-Nukleotiden wurden Fluoreszenztitrationen am
Fluoreszenzspektrometer (Kontron SFM25) durchgeführt. Dabei wurden in einer Küvette
0,5µM mant-Nukleotid vorgelegt und dazu eine Proteinlösung, die ebenfalls 0,5µM mantNukleotid enthielt, hinzutitriert. Die Anregungswellenlänge lag bei 366nm und die
Emission wurde bei 435nm detektiert. An die Auftragung der Fluoreszenz gegen die
Proteinkonzentration wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst und
somit die Dissoziationskonstante erhalten. Mit dieser Methode wurden die Affinitäten der
Nukleotide mGMP, mGDP und mGppNHp von verschiedenen Mutanten bei 25°C
gemessen.
Die Ergebnisse der Fluoreszenztitrationen sind in der Abbildung 3-12 (A-E) zu sehen. Die
ermittelten Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation aller untersuchten Mutanten zeigen
im Vergleich zum Wildtyp keine signifikanten Unterschiede. Die Kontaktregion von α1213 und α4´ hat keinen Einfluss auf die mant-Nukleotid-Bindung. Eine Zusammenfassung
der Ergebnisse der Fluoreszenztitrationen des Wildtyps von hGBP1 und den Mutanten
R227E, K228E, R227E/K228E und E563R sind in der Tabelle 3-2 gezeigt.
KD(µM)
mGMP
mGDP
mGppNHp
Wildtyp
0,56
3,53
1,67
R227E
0,88
3,5
1,53
K228E
0,7
3,94
2,16
R227E/K228E
1,0
3,75
2,49
E563R
0,54
4,05
1,74
Tabelle 3-2: Gleichgewichtskonstanten von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Die Gleichgewichtskonstanten der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und verschiedene
Mutanten
des
hGBP1
wurden
durch
Gleichgewichtstitrationen
bei
25°C
im
Fluoreszenzspektrometer bestimmt. Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid in
Puffer (50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt, und dazu eine Proteinlösung,
ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert. Die Anregungswellenlänge lag bei 366nm und
die Emission wurde bei 435nm detektiert. An die Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die
Proteinkonzentration wurden quadratische Bindungskurven (Formel 2-4) angepasst und somit die
Dissoziationskonstanten erhalten.
- 64 -
Ergebnisse
4
4
B
rel. Fluoreszenz
rel. Fluoreszenz
A
3
2
1
3
2
1
0,01
0,1
1
10
100
0,01
0,1
[hGBP1 wt] (µM)
4
10
100
4
C
D
rel. Fluoreszenz
rel. Fluoreszenz
1
[hGBP1 R227E/K228E] (µM)
3
2
1
3
2
1
0,01
0,1
1
10
100
0,01
[hGBP1 K228E] (µM)
0,1
1
10
100
[hGBP1 R227E] (µM)
4
rel. Fluoreszenz
E
3
2
1
0,01
0,1
1
10
100
[hGBP1 E563R] (µM)
Abbildung 3-12: Bestimmung der mant-Nukleotidaffinitäten durch Fluoreszenz-titrationen.
Aufgetragen sind die Fluoreszenztitrationen vom hGBP1 Wildtyp (A) und den Mutanten
R227E/K228E (B), K228E (C), R227E (D) und E563R (E) mit mGMP (●), mGDP (○) und
mGppNHp (□).Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid vorgelegt, und dazu eine
Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert. Die Dissoziationskonstanten
wurden durch Anpassung an eine quadratische Funktion erhalten.
- 65 -
Ergebnisse
3.1.6
Dynamik der Nukleotidbindung
Mit Experimenten an der stopped flow-Apparatur wurden Assoziations- und
Dissoziationskinetiken von mant-Nukleotiden (mGMP, mGDP, mGppNHp) bestimmt.
Die mant-Nukleotid Konzentrationen wurden konstant bei 0,5µM gehalten und
Proteinkonzentrationen zwischen 5µM und 40µM variiert. Der hohe Proteinüberschuss
wurde verwendet, um eine Bindungskinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten. Die
Anregung der mant-Fluorophore erfolgte bei 366nm und die Emission wurde, um das
Streulicht heraus zu filtern, mit Hilfe eines Kantenfilters oberhalb von 420nm detektiert.
Aus einer einfach exponentiellen Anpassung an die zeitliche Fluoreszenzänderung wurde
kobs, die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, erhalten. Bei Auftragung der erhaltenen
Geschwindigkeitskonstante (kobs) gegen die Konzentration (B0) zeigte sich eine lineare
Abhängigkeit (Formel 2-3). Die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die
Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem
Achsenabschnitt bestimmt. Für eine genauere Bestimmung der Dissoziationskonstante
wurden Verdrängungsexperimente vorgenommen (kdiss*).
A
B
150
100
kobs (s-1)
kobs (s-1)
150
100
50
50
0
0
0
10
20
30
40
0
50
[hGBP1wt] (µM)
10
20
30
40
50
[hGBP1-R227E/K228E] (µM)
Abbildung 3-13: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1wt und hGBP1
R227E/K228E.
Die Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden an hGBP1 wt (A) und die Doppelmutante
R227E/K228E (B) wurde mit 0,5µM mant-Nukleotid und unterschiedlichen Proteinkonzentration
bei 25°C gemessen. Aus der Anpassung einer einfach exponentiellen Funktion wurde die
Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung erhalten, die gegen die Proteinkonzentration
aufgetragen wurde. Die Anpassung der linearen Funktion lieferte die Geschwindigkeitskonstante
der Dissoziation (kdiss) und Assoziation (kass). Gemessen wurden die Bindungskinetiken von
mGMP(○), mGDP(●) und mGppNHp(□).
- 66 -
Ergebnisse
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse aus den stopped-flow Experimenten ist in Tabelle
3-3 zu finden. Aus dem Verhältnis kdiss*/ kass wurden die Dissoziationskonstanten
bestimmt. Dabei zeigt sich, dass zwischen dem hGBP1 Wildtyp und den verschiedenen
Mutanten keinen signifikanten Unterschied bei den Dissoziationskonstanten festzustellen
ist.
Die
ermittelten
Geschwindigkeitskonstanten
der
Dissoziation,
aus
den
Verdrängungsexperimenten (kdiss*) und dem Achsenabschnitt bei der Auftragung von kobs
gegen die Konzentration (kdiss ), sind bei mGDP und mGppNHp sehr ähnlich. Wogegen
bei mGMP bei allen Messungen ein Unterschied im Bereich einer Großenordnung
festzustellen war.
Wildtyp
R227E/
K228E
R227E
K228E
E563R
kass(µM-1s-1)
kdiss(s-1)
kdiss*(s-1)
KD*(µM)
KD (µM)
mGMP
3,36
11,43
1,3
0,25
0,56
mGDP
1,9
9,9
8,2
3,57
3,53
mGppNHp
1,2
1,68
0,66
1,43
1,67
mGMP
3,6
16,3
1,67
0,46
1,0
mGDP
2,8
8,0
6,98
2,49
3,75
mGppNHp
0,5
2,1
0,77
1,57
2,49
mGMP
6,5
21,1
2,4
0,37
0,88
mGDP
2,9
9,8
14,1
4,86
3,5
mGppNHp
0,8
1,5
1,46
1,85
1,53
mGMP
6,4
17,6
1,57
0,25
0,7
mGDP
2,8
14,2
10,82
3,93
3,94
mGppNHp
0,7
3,4
1,1
1,64
2,16
mGMP
3,5
16,5
1,55
0,44
0,54
mGDP
3,3
11,2
13,27
4,02
4,05
mGppNHp
1,2
0,5
1,52
1,32
1,74
Tabelle 3-3: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation und die Dissoziation wurden mit Hilfe der
stopped-flow Apparatur bei 25°C bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation
wurde aufgrund der höheren Genauigkeit separat durch Verdrängungsexperimente bestimmt
(kdiss*). Die KD*-Werte wurden aus dem Verhältnis kdiss*/kass bestimmt. Die KD Werte sind die
Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation, die aus den Fluoreszenztitrationen erhalten wurden.
- 67 -
Ergebnisse
Im Vergleich zwischen den Gleichgewichtskonstanten der Fluoreszenztitration und der
kinetischen Messung sind keine signifikanten Unterschiede zu erkennen. Auch die
Tendenz der Bindungsstärke stimmt in beiden Methoden gut überein, in der mGMP am
stärksten und mGDP am schwächsten gebunden wird. Diese Beobachtungen bestätigen
vorherige Messungen des Wildtyps (Praefcke et al., 2001; Praefcke et al., 2004).
3.1.7
Nukleotidhydrolyse
Die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse wurde für den Wildtyp von hGBP1 und
alle hGBP1-Mutanten mittels reversed-phase HPLC gemessen. Nach Inkubation des
Proteins mit 350µM GTP (bzw. GDP) bei 25°C wurde nach bestimmten Zeitpunkten eine
Probe auf ihre Nukleotid Zusammensetzung hin analysiert. Der Anteil an nicht
umgesetzten Substrat wurde dann gegen die Reaktionszeit aufgetragen und die
Anfangsgeschwindigkeit in einem Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare
Regression
angepasst.
Der
Quotient
aus
Anfangsgeschwindigkeit
und
Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität.
spezifische Aktivität (min-1)
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
[hGBP1 R227E/K228E](µM)
Abbildung 3-14: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von hGBP1 R227E/K228E.
Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die Inkubation
erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE, 100µM
Rinderserumalbumin bei 25°C. Aufgetragen ist die konzentrationsabhängige spezifische Aktivität
von hGBP1-R227E/K228E. Die Datenanpassung erfolgte durch eine modifizierte Hill-Funktion.
- 68 -
Ergebnisse
Durch
Auftragung
der
Änderung
der
spezifischen
Aktivität
gegen
die
Proteinkonzentration wurde die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten
wurde entweder eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) oder eine modifizierte
Hill-Funktion angepasst (Formel 2-2).
spezifische Aktivität (min-1)
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
[hGBP1](µM)
Abbildung 3-15: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von verschiedenen
hGBP1 Mutanten.
Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die
Inkubation erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM
DTE, 100µM Rinderserumalbumin bei 25°C. Abgebildet sind konzentrationsabhängig die
spezifischen Aktivitäten der hGBP1 Punktmutanten R227E(Δ), K228E (□) und E563R (●). Die
maximalen Hydrolysegeschwindigkeiten zeigen zwischen den drei Mutanten keinen signifikanten
Unterschied und liegen bei etwa 37min-1. Die dargestellten Kurven wurden durch Anpassung mit
Formel 2-1 erhalten.
Die in Abbildung 3-14 gezeigte Auftragung der spezifischen Aktivität der GTP Hydrolyse
der hGBP1 Doppelmutante R227E/K228E zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Die
Datenpunkte wurden durch eine modifizierte Hill-Funktion angepasst, welche einen Wert
für die kooperativen Einheiten von n=2,6 liefert. Die spezifische Aktivität zeigt eine
Basalaktivität von k0=11,1min-1 und steigt dann mit 36,2min-1 auf das 3-fache an. Dieser
Verlauf zeigt einen deutlichen Unterschied zum Wildtyp, bei dem eine 16-fache
Selbstaktivierung zu beobachten ist (Kunzelmann et al., 2006). Einen weiteren
Unterschied zum Wildtyp stellt das Produktverhältnis dar. Beim Wildtyp ist bei 25°C das
Hauptprodukt der GTP Hydrolyse mit 60% das GDP, bei der Doppelmutante
R227E/K228E liegt das Hauptprodukt mit 78% jedoch auf der Seite des GMPs. Das liegt
- 69 -
Ergebnisse
wahrscheinlich an der Besonderheit, dass die Doppelmutante in der Lage ist, GDP als
Substrat in hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren. Die Geschwindigkeit der GDPHydrolyse bei 25°C ist in (Abbildung 3-16) gezeigt. Die Geschwindigkeit der GDPHydrolyse hängt zwar ebenfalls von der Proteinkonzentration ab, jedoch muss für die
maximale Aktivität eine sehr viel höhere Konzentration verwendet werden. Ähnliche
Beobachtungen konnten bei der Deletionsmutante hGBP1 1-481 und der isolierten LGDomäne gemacht werden, die ebenfalls eine erhöhte GMP-Produktion besitzen und in der
Lage sind GDP aus der Lösung umzusetzen (S. Kunzelmann, Dissertation; Praefcke et al.,
2001).
spezifische Aktivität (min-1)
0,6
0,4
0,2
0
0
5
10
15
20
[hGBP1 R227E/K228E](µM)
Abbildung 3-16: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E/K228E.
Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse von GDP gegen die Proteinkonzentration. Die
Geschwindigkeit der GDP Hydrolyse wurde mit 350µM GDP bei 25°C gemessen. Die Anpassung
an die Daten lieferte eine maximale Hydrolysegeschwindigkeit von 0,73min-1.
Die
in
Abbildung
3-15
aufgetragenen
spezifischen
Hydrolyseaktivitäten
der
Punktmutanten R227E, K228E und E563R zeigen in ihrem Verlauf keine signifikanten
Unterschiede. Die maximalen Geschwindigkeiten liegen bei 37min-1 und es war bei allen
drei Punktmutanten keine Basalaktivität feststellbar. Das Hauptprodukt der Hydrolyse ist
hier ebenfalls GMP und liegt bei etwa 66%. Die Mutanten K228E und E563R zeigen
beide keine messbare GDPase-Aktivität, die R227E (Abbildung 3-17) jedoch zeigt, wie
- 70 -
Ergebnisse
auch schon die Doppelmutante R227E/K228E (Abbildung 3-16), eine erweiterte
Substratspezifität.
spezifische Aktivität (min-1)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
5
10
15
20
25
30
[hGBP1 R227E](µM)
Abbildung 3-17: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E.
Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse von GDP gegen die Proteinkonzentration. Die
Geschwindigkeit der GDP Hydrolyse wurde mit 350µM GDP bei 25°C gemessen. Die Anpassung an
die Daten lieferte eine maximale Hydrolysegeschwindigkeit von 0,94min-1.
Für eine bessere Datenanpassung wurde die spezifische Aktivität für gegen Null gehende
Konzentrationen gleich Null gesetzt. Ob diese Annahme zutrifft, konnte experimentell
nicht bestimmt werden, da bei sehr kleinen Konzentrationen die Inkubationsdauer zu hoch
war. Der Vergleich der GDPase Aktivitäten der Mutanten R227E und R227E/K228E zeigt
keine signifikanten Unterschiede sowohl in der maximalen spezifischen Aktivität als auch
bei der apparenten Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation.
- 71 -
Ergebnisse
Kdapp(µM)
kmax(min-1)
kmin(min-1)
GMP(%)
GTP
0,032
22,8
n.b.
40
GTP
0,74(Hill)
36,2
11,1
78
GDP
1,93
0,73
n.b.
GTP
0,038
40,4
n.b.
GDP
2,6
0,94
n.b.
K228E
GTP
0,06
37,6
n.b.
64
E563R
GTP
0,05
37,9
n.b.
66
Wildtyp
R227E/K228E
R227E
67
Tabelle 3-4: Konzentrationsabhängige Hydrolyse von hGBP1 und Mutanten des hGBP1.
Die Hydrolysegeschwindigkeiten wurden bei 25°C in Gegenwart von 350µM GTP bzw. GDP
und verschiedenen Proteinkonzentrationen gemessen. Die Anpassung der durch Auftragung der
Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration erhaltenen Datenpunkte
lieferten die apparenten Gleichgewichtskonstanten (Kdapp) sowie die Werte der maximalen (kmax)
und minimalen (kmin) Aktivitäten. Das Produktverhältnis wurde im steady state der GTP
Hydrolyse ermittelt. Die Kurvenanpassung der Daten für die GTP-Hydrolyse der Mutante
R227E/K228E erfolgte durch eine modifizierte Hill-Funktion. Aus diesem Grund ist der Wert für
die apparente Dissoziationskonstante nicht mit dem der anderen Mutanten vergleichbar. (n.b. =
nicht bestimmt)
Eine Zusammenfassung aller Ergebnisse der steady state-Hydrolyse von hGBP1wt und
Mutanten ist in der Tabelle 3-4 zu sehen. Die Daten für die Messungen am Wildtyp
wurden der Dissertation von Simone Kunzelmann entnommen. Die apparenten
Dissoziationskonstanten der Selbstassemblierung Kdapp sowie die Werte der maximalen
(kmax) und minimalen (kmin) Aktivitäten wurden aus den Kurvenanpassungen abgeleitet.
Dabei ist zu beachten, dass der Wert für die apparente Dissoziationskonstante der
Doppelmutante aus einer Hill-Funktion abgeleitet ist und somit mit den anderen Werten
nicht vergleichbar ist.
Die maximalen Geschwindigkeiten der Hydrolyse der vier Mutanten sind um ca. 30%,
gegenüber der maximalen Geschwindigkeit des Wildtyps erhöht. Das Hauptprodukt der
Hydrolyse ist bei allen Mutanten GMP, wobei der Anteil zwischen 78% (R227E/K228E)
und 64% (K228E) liegt. Beim Wildtyp liegt der GMP-Anteil bei 40%. Interessanterweise
ist bei der Mutante R227E/K228E das GDP/GMP-Produktverhältnis im verwendeten
Messbereich konzentrationsunabhängig. Dagegen zeigt sich im Wildtyp eine Erhöhung
des GMP-Anteils mit zunehmender Proteinkonzentration.
- 72 -
Ergebnisse
3.1.8
Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne
Für die Analyse der Kinetik der Dimerisierung an der helikalen Domäne von hGBP1
wurde die Methode des Temperatursprungs gewählt. Die verwendeten Proteine wurden
mit
luoreszenzmarkern versehen, um die Gleichgewichtseinstellung durch einen
Fluoreszenz- Energie-Transfer (FRET) sichtbar zu machen. Es wurden zwei
unterschiedliche FRET-Systeme verwendet. eYFP-Fusionsproteine wurden als Akzeptor
(Excitation: 495nm, Emission: 525nm), in einem FRET-System verwendet, in dem
Coumarin (Excitation: 384nm, Emission: 472nm) als Donor fungiert. Als Alternative für
eYFP als Akzeptor wurde Fluorescein verwendet (Excitation: 497nm, Emission: 523nm).
Das Coumarin und das Fluorescein wurden jeweils in einer Kupplungsreaktion an die
Cysteine des Proteins gekoppelt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde
überschüssiger Farbstoff über eine NAP5-Säule nach Herstellerangaben abgetrennt und
die Zahl der markierten Cysteine aus dem Verhältnis der Absorption von Protein zu
Fluorophor (280nm/495nm bzw. 280nm/384nm) bestimmt.
Fluoreszenzmarker Kupplungseffizienz
Konzentration
hGBP1-α12-13
CPM
80%
824µM
hGBP1-α7-13
Fluorescein
40%
240µM
hGBP1-α7-13
CPM
84%
176µM
hGBP1-R227E/K228E
CPM
400%
123µM
Tabelle 3-5: Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzmarkern an hGBP1 Deletions- und
Punktmutanten.
Die Markierung von Proteinen wurde mit Maleinimid-gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen
durchgeführt, die unter Bildung eines Thioethers selektiv an Cysteine binden. Nachdem die
Reaktion abgeschlossen war, wurde die Effizienz der Kupplung spektroskopisch erfasst.
Die Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzfarbstoffen an Cysteinen von hGBP1 konnte
von Tobias Vöpel im Rahmen seiner Diplomarbeit bestimmt werden. Dabei zeigte sich,
dass von den neun vorhandenen Cysteinen in hGBP1wt nur vier für die Kupplungsreaktion
zugänglich sind. Es handelt sich um die Cysteine an den Stellen C12, C82, C225 und
C589. Dabei ist zu beachten, dass die Cysteine an den Stellen C12, C82 und C225 in der
LG-Domäne liegen. Für die Deletionsmutante α12-13 bedeutet das, dass ausschließlich
das Cystein des CaaX-Motivs, C589, für eine Kupplungsreaktion zugänglich ist.
- 73 -
Ergebnisse
α12/13
LGDomäne
α7-11
Abbildung 3-18: Position der Cysteine innerhalb der hGBP1 Struktur.
Dargestellt ist das Bändermodell von hGBP1 und die Positionen der Cysteine. In seiner Struktur
besitzt hGBP1 neun Cysteine. Fünf befinden sich in der LG-Domäne (C12, C82, C235, C270,
C225; blau), zwei in der helikalen Subdomäne α7-11 (C396, C407; rot) und eins zwischen diesen
beiden Domänen (C311). Das neunte Cystein liegt C-terminal an der Position 589. Dieser Bereich
des Proteins konnte aber kristallographisch nicht aufgelöst werden und ist deshalb in der Struktur
nicht markiert.
Im Falle der Deletionsmutante α7-13 ist ebenfalls, obwohl in diesem Bereich des Proteins
drei Cysteine vorhanden sind, nur das Cys589 für eine Fluoreszenzmarkierung
zugänglich.
Die Effizienz der Kopplung von CPM an die Doppelmutante R227E/K228E war sehr
hoch und mit einem Wert von 400% konnten alle vier zugänglichen Cysteine mit dem
Fluoreszenzfarbstoff markiert werden. Bei hGBP1-α12-13 und hGBP1-α7-13 wurden
lediglich 80% Kopplungseffizienz erreicht, was bedeutet, dass nicht jedes Protein mit
einem Fluorophor versehen ist. Die Kopplung von hGBP1-α7-13 mit Fluorescein erreichte
nur eine sehr geringe Effizienz von 40%.
Für die Messungen an der Temperatursprung Apparatur wurde jeweils Donor und
Akzeptor markiertes Protein in aufsteigenden Konzentrationen equimolar miteinander
vermischt und in der Apparatur auf 10°C temperiert. Durch die 1:1 Vermischung der 10°C
warmen Proteinlösung mit 40°C warmer Puffer wurde ein Temperatursprung auf 25°C
erzielt. Die dadurch hervorgerufene Einstellung des neuen Gleichgewichts wurde durch
einen Kantenfilter oberhalb von 515nm detektiert.
- 74 -
Ergebnisse
6
1,2
B
4
kobs (s-1)
rel. Fluoreszenz
A
1,1
2
1
0
0
1
2
0
t (s)
2
4
6
8
[hGBP1 α7-13 + hGBP1 R227E/K228E] (µM)
Abbildung 3-19: Kinetik der Dimerisierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E.
Die Proteine hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E, die jeweils mit einem FRET-Partner
markiert waren, wurden in einer äquimolaren Mischung bei 10°C in der TemperatursprungApparatur inkubiert. Durch das schnelle Mischen mit 40°C warmer Puffer wurde die Einstellung
der neuen Gleichgewichtslage der Dimerisierung bei 25°C anhand des FRET-Signals oberhalb
von 515nm beobachtet. (A) Die zeitliche Änderung der Fluoreszenz nach einer schnellen
Temperaturerhöhung von 10°C auf 25°C. Die Anpassung einer einfach exponentiellen Funktion
liefert
die
Geschwindigkeitskonstante
kobs.
(B)
Auftragung
der
beobachteten
Geschwindigkeitskonstanten kobs gegen die Konzentration des Komplexes aus der
Deletionsmutante hGBP1 α7-13 und der Doppelmutante hGBP1 R227E/K228E. Aus der
Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für die
Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und der Dissoziation (kdiss) entnommen.
Aus einer einfach exponentiellen Anpassung an die zeitliche Fluoreszenzänderung wurde
die
Geschwindigkeitskonstante
kobs
erhalten.
Die
resultierenden
Geschwindigkeitskonstanten wurden gegen die Konzentration aufgetragen und eine
lineare Anpassung der Datenpunkte vorgenommen ( k obs = k ass 2 [B ]0 + k diss ). Die
Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (kass) und die Geschwindigkeitskonstante der
Dissoziation (kdiss) wurde aus der Steigung und dem Achsenabschnitt bestimmt.
Für die Analyse der Kinetik der Assemblierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1
R227E/K228E wurden die Proteine mit den Fluorophoren Coumarin und Fluorescein
versehen, in einem equimolaren Verhältnis miteinander vermischt und bei 10°C inkubiert.
Durch die schnelle Zugabe von 40°C warmen Puffer wurde eine Änderung des
Komplexgleichgewichts induziert. Zur Detektion der Neueinstellung des Gleichgewichts
wird der Energietransfer vom Coumarin auf das Fluorescein genutzt und die Emission des
Fluorescein bei 515nm aufgenommen. Die Abbildung 3-19 (A) zeigt die zeitabhängige
Fluoreszenzänderung nach der schnellen Temperaturerhöhung von 10°C auf 25°C von
unterschiedlichen Konzentrationen des Proteinkomplexes aus hGBP1 α7-13 und hGBP1
R227E/K228E. Die Anpassung der Daten erfolgte über eine einfach exponentielle
- 75 -
Ergebnisse
Funktion, die einen Wert für die Geschwindigkeitskonstante kobs liefert. In der Abbildung
3-19 (B) sind die erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten gegen die verwendeten
Proteinkonzentrationen aufgetragen, und mit Hilfe einer linearen Regression angepasst.
Aus der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für
die
Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und Dissoziation (kdiss)
entnommen.
Für die Analyse der Homodimerisierung der Deletionsmutanten hGBP1 α12-13 und
hGBP1 α7-13 wurde eYFP und Coumarin markierte Proteine verwendet. Die verwendeten
Konzentrationen der Komplexe lagen zwischen 2µM und 20µM.
6
kobs (s-1)
4
2
0
0
10
20
[Protein] (µM)
Abbildung 3-20:Analyse der Homodimerisierung von hGBP1 α12-13 und hGBP1 α7-13 durch
die Temperatursprung-Methode.
Auftragungen der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentrationen der
homodimeren Komplexe der Deletionsmutanten hGBP1 α12-13 (○) und hGBP1 α7-13 (▲). Aus
der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung wurden die Werte für die
Die
Abbildung
3-20
zeigt
die
Auftragungen
der
beobachteten
Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentration. Durch lineare Anpassung der
Datenpunkte wurde aus den Steigungen die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation
und aus dem Achsenabschnitt die Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation erhalten.
Die Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation liegen für hGBP1 α12-13 bei 24,4µM und
für α7-13 bei 9,7µM.
- 76 -
Ergebnisse
Die Dissoziationskonstanten der Komplexe liegen bei den drei Messungen deutlich
auseinander (Tabelle 3-6). Die geringste Affinität zeigt die Deletionsmutante α12-13, was
an der Geschwindigkeitskonstante für die Assoziation liegt, die um eine Größenordnung
verringert ist. Im Vergleich dazu weisen die Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation
nur geringe Unterschiede auf. Die Dissoziationskonstante für die Bindung der
Deletionsmutante α7-13 an die Doppelmutante R227E/K228E zeigt eine relativ hohe
Affinität von 1,78µM.
hGBP1 α7-13 /
hGBP1 R227E/K228E
hGBP1 α7-13
(Homodimerisierung)
hGBP1 α12-13
(Homodimerisierung)
kass (µM-1s-1)
kdiss (s-1)
KD (µM)
0,82
1,46
1,78
0,36
3,5
9,7
0,046
1,12
24,4
Tabelle 3-6: Gleichgewichts- und Geschwindigkeitskonstanten der Assemblierung an der
helikalen Domäne.
Untersucht wurde die Homodimerisierung der Deletionsmutanten α12-13 und α7-13 und die
Heterodimerisierung zwischen α7-13 und der Punktmutante R227E/K228E von hGBP1 mittels
Temperatursprung. Die Werte für die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation (kass) und
Dissoziation (kdiss) wurden der Steigung und dem Achsenabschnitt der linearen Anpassung der
Auftragungen der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten gegen die Konzentrationen
entnommen.
3.2 Identifizierung eines hGBP1 Interaktionspartners
Über die zelluläre Funktion von hGBP1 ist bis heute noch nicht viel bekannt. Bisher
konnte zwar eine antivirale und eine anti-proliferative Wirkung von hGBP1 in
Zellkulturexperimenten nachgewiesen werden, aber über die Signaltransduktion ist nichts
Genaues bekannt. Dementsprechend sind auch keine Proteine bekannt, die mit hGBP1
interagieren. Die Verwendung des Hefe 2-Hybrid Systems und einer embryonalen full
mouse cDNA-Bank führte in der Vergangenheit nicht zur Identifizierung eines
Interaktionspartner (Dissertation, Benscheid, 2005). Für die Suche nach einem
Interaktionspartner von hGBP1 mit Hilfe des Hefe 2-Hybrid Systems, wurde im Rahmen
- 77 -
Ergebnisse
dieser Arbeit erstmals eine INF-γ-induzierte cDNA Bank aus humanen Zellen hergestellt.
Verwendet wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC), welche
freundlicherweise von Prof. Dr. M. Stürzl (Universität Nürnberg-Erlangen) zur Verfügung
gestellt wurden. Aufgrund einer starken Expression von hGBP1 in HUVECs nach
Stimulation mit INF-γ (Lubeseder-Martellato et al., 2002), wurde die mRNA aus Zellen
isoliert, welche im Vorfeld mit 100U/ml INF-γ versetzt wurden. Da nicht bekannt ist, in
welchem Expressionsstadium von hGBP1 der potentielle Interaktionspartner erscheint,
wurde die mRNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Induktionsstart entnommen, um
unterschiedliche Expressionsstadien der Zelle zu erfassen.
3.2.1
Darstellung einer INF-γ induzierten HUVECs cDNA-Bank
Für die Darstellung einer cDNA-Bank aus mit INF-γ stimulierten HUVECs (humane
Endothelzellen der Nabelschnurvene) musste im Vorfeld die Gesamt-RNA aus den Zellen
isoliert werden. Es wurden HUVEC in insgesamt 8 Zellkulturschalen (T75) bis zur
Konfluenz wachsen gelassen. Sechs dieser Kulturschalen wurden dann mit 100U/µl INF-γ
versetzt. Nach jeweils 5, 12 und 24 Stunden wurden Zellen von je zwei Platten geerntet.
Die beiden anderen Schalen wurden nicht mit INF-γ induziert und direkt geerntet. Durch
die Entnahme der mRNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten können unterschiedliche
Expressionsstadien der Zellen untersucht werden. Nach der Zellernte und der Extraktion
der Gesamt-RNA wurde die Konzentration mittels UV-Absorption bei 254nm bestimmt
und die Integrität der RNA überprüft (Abbildung 3-6). Dazu wurde die RNA der
unterschiedlichen Erntezeitpunkte separat auf ein Agarosegel aufgetragen. Die Integrität
wird durch zwei Banden bestätigt, bei denen es sich um die 28S und 18S rRNA handelt.
Wenn diese Banden klar zu sehen sind, kann man davon ausgehen, dass die isolierte RNA
frei von RNasen ist. Es wurden von den zwei Schalen jedes Zeitpunktes jeweils 0,70,9µg/µl Gesamt-RNA in jeweils 100µl Puffer erhalten.
Die Konzentrationsbestimmung ergab:
0h = 0,9µg/µl
5h = 0,9µg/µl
12h = 0,95µg/µl
24h = 0,7 µg/µl
- 78 -
Ergebnisse
0
5h 12h 24h
Abbildung 3-21: Integrität der isolierten
Gesamt-RNA aus INF-γ induzierten
HUVECs.
Abgebildet ist ein 1%iges Agarosegel auf
dem die Banden der 28s rRNA und 18s
rRNA zu sehen sind. Die Integrität dieser
Banden erlaubt eine Aussage über den
Zustand der
erhaltenen RNA. Die
unterschiedlichen Auftragungen zeigen die
RNA der vier verschiedenen Zeitpunkte (0,
5, 12, und 24 Stunden) nach denen die INF-γ
induzierten Zellen geerntet wurden.
28s rRNA
18s rRNA
Nach der Bestimmung der Konzentrationen wurden von den vier Proben jeweils 30µg
entnommen und in einem Ansatz vereint, um daraus die polyA-mRNA zu isolieren. Die
Aufreinigung erfolgte über ein mRNA Extraktions-Kit (Oligotex mRNA-Kit) der Firma
Qiagen. Nachdem die mRNA zur cDNA umgeschrieben und mit Hilfe der EcoRI-Linker
in den Vektor pGBKT7 kloniert worden war, wurde zur Überprüfung der Effizienz der
gesamten Prozedur 1µl, 3µl und 5µl der cDNA Bank in kompetente E. coli Nova BlueZellen transformiert. Nach dem Ausplattieren auf mit Kanamycin versetzten LB-Platten
wurden nach 24 Stunden Inkubation die Anzahl der Kolonien gezählt. Pro Mikroliter
eingesetzter cDNA wurde auf den Platten ca. 2800 unabhängige Bakterienkolonien
gezählt. Daraus resultieren, nach der Transformation der gesamten cDNA-Bank (150µl),
ca. 420000 unabhängige Kolonien. Diese Kolonien wurden vereinigt und in 25% Glycerin
bei -80°C gelagert.
3.2.2
Hefe 2-Hybrid-Screen
Das Screenen der INF-γ induzierten HUVEC cDNA-Bank wurde in einem großen Ansatz
(large scale) durchgeführt. Dabei wurden 0,3 mg der HUVEC-cDNA-Bank und 0,3mg
hGBP1-pGADT7 DNA eingesetzt und gleichzeitig in den Hefestamm S. cerevisiae
AH109 transformiert.
Innerhalb von 5 Tagen wuchsen auf selektivem Medium THL- (ohne Tryptophan, Histidin
und Leucin) ca. 1400 Klone. Alle Klone wurden manuell auf selektiveres Medium
- 79 -
Ergebnisse
(zusätzlich ohne Adenin und mit 20mM 3-AT zur Inhibition basaler Histidinproduktion)
übertragen. Daraufhin sind 174 Klone interaktionsabhängig gewachsen.
Die Klone wurden jeweils separat von der Platte gepickt und in ca. 5ml YPD –His-AdeTrp-Leu resuspendiert. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C und 200upm wurden von
diesen Kulturen 25%ige Glycerin-Stocks hergestellt. Die verbliebenen Klone wurden
daraufhin analysiert, indem die Vektoren extrahiert und nachfolgend eine PCR mit
Vektorprimern durchgeführt wurde. Leider lieferte die PCR keine auswertbaren
Ergebnisse.
- 80 -
Ergebnisse
3.3 Biochemische Charakterisierung von hGBP2
Die biochemische Charakterisierung des humanen Guanylat-bindenden Proteins 2
(hGBP2) wurde bereits von Agnidipta Ghosh im Rahmen seiner Dissertation begonnen.
Ziel dieser Arbeit die biochemische Charakterisierung fortzusetzen und Daten bezüglich
des
Oligomerisierungsverhaltens,
der
mant-Nukleotidaffinität
und
der
nukleotidabhängigen GTP-Hydrolyse von hGBP2 zu erhalten.
3.3.1
Nukleotidabhängige Oligomerisierung
Die Messungen der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 erfolgten mittels
dynamischer Lichtstreuung analog zu den Messungen von hGBP1. Durch die dynamische
Lichtstreuung wurden der Diffusionskoeffizient und damit der hydrodynamische Radius
von hGBP2 ermittelt. Im Gegensatz zum hGBP1 ist jedoch die Struktur von hGBP2 nicht
bekannt
und
es
kann
deshalb
noch
keine
theoretische
Berechnung
des
Diffusionskoeffizienten mittels HydroPro erfolgen. Die ermittelten Radii und die daraus
errechneten sphärischen Volumina wurden in Bezug zu den bereits ermittelten Werten für
hGBP1 gesetzt. Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP2 wurden
20µM des Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst
und durch einen 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt.
Die Zugabe von GppNHp bewirkt bei hGBP1 eine Zunahme des hydrodynamischen
Radius die eine Verdopplung des Volumens zur Folge hat. Bei hGBP2 zeigt die Zugabe
von GppNHp keine signifikante Veränderung des hydrodynamischen Radius bzw. des
Volumens. Bei der Messung von hGBP1 im Komplex mit GDP und AlFx erhöht sich der
Radius auf 6,5nm. Im Vergleich zum nukleotidfreien Zustand vervierfacht sich das
Volumen.
- 81 -
Ergebnisse
Volumen
(nm³)
Volumen (nm³)
1500
1000
500
0
hGBP1
hGBP2
Abbildung 3-22: Nukleotidabhängige Oligomerisierung von hGBP1 und hGBP2.
Für die Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von hGBP1 und hGBP2 wurden 20µM des
jeweiligen Proteins in Puffer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) gelöst, und durch
ein 0,2µm Spritzenfilter in die Küvette der DLS-Apparatur gefüllt. Der erhaltene
hydrodynamische Radius wurde in ein sphärisches Volumen umgerechnet und aufgetragen.
Aufgetragen sind die Volumina von hGBP1wt (rot), und hGBP2 (grün). Die Säulen einer Farbe
(von links nach rechts) stellen die Volumina der unterschiedlichen Proteine im nukleotidfreien,
im GppNHp gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx dar. Die Nukleotide
GppNHp und GDP wurden jeweils in Konzentrationen von 200µM verwendet.
Der Radius des Komplexes aus hGBP2, GDP und AlFx liegt bei 6,13nm und ergibt damit
ein Kugelvolumen von 965nm³. Dieses Volumen ist im Vergleich zum nukleotidfreien
Zustand von hGBP2 dreimal größer und liegt zwischen dem hGBP1 Dimer im GppNHp
gebundenem Zustand und dem Tetramer im GDP und AlFx Komplex. Es kann nicht
eindeutig festgestellt werden, ob es sich im GDP und AlFx gebundenem Zustand von
hGBP2 um ein Dimer, Trimer oder ein Tetramer handelt.
3.3.2
Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse
Die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse wurde für hGBP2wt mittels reversedphase HPLC gemessen. Es wurden 20µM des Proteins mit 350µM GTP (bzw. GDP) bei
25°C inkubiert und nach bestimmten Zeitpunkten eine Probe auf ihre NukleotidZusammensetzung hin analysiert. Der Anteil am nicht umgesetzten GTP wurde gegen die
Reaktionszeit aufgetragen und die Anfangsgeschwindigkeit in einem Bereich bis 40%
- 82 -
Ergebnisse
Substratumsatz durch lineare Regression angepasst, Abbildung 3-23 (A). Der Quotient aus
Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die spezifische Aktivität. Durch
Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die Proteinkonzentration
wurde die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt. An diese Daten wurde eine
12
1
8
0,8
[GTP]/[GTP]0
spezifische Aktivität (min-1)
quadratische Bindungskurve (Formel 2-1) angepasst Abbildung 3-23 (B).
4
0,6
A
B
0
0,4
0
2
4
0
6
20
40
50
100
150
200
t (min)
[hGBP2] (µM)
Abbildung 3-23: Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse von hGBP2.
Auftragung der spezifischen Aktivität der Hydrolyse gegen die Proteinkonzentration. Die
Inkubation erfolgte zusammen mit 350µM GTP in 50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2,2mM
DTE, 100µM Rinderserumalbumin bei 25°C. (A) Auftragung des Anteils an nicht umgesetztem
Substrat gegen die Reaktionszeit unterschiedlicher hGBP2 Konzentrationen. Die
Anfangsgeschwindigkeit wurde in einem Bereich bis 40% Substratumsatz durch lineare Regression
angepasst. Der Quotient aus Anfangsgeschwindigkeit und Proteinkonzentration liefert die
spezifische Aktivität. (B) Auftragung der Änderung der spezifischen Aktivität gegen die
Proteinkonzentration. An diese Daten wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-1)
angepasst und die Kooperativität der Hydrolyse bestimmt.
Im Vergleich zum hGBP1 (22,8min-1) zeigt hGBP2 (15min-1) bei 25°C eine etwas
geringere GTPase-Aktivität. Dagegen unterscheidet sich hGBP2 am deutlichsten von
hGBP1 dadurch, dass die Produktion von GMP nicht nachgewiesen werden konnte. Als
Produkt der GTP Hydrolyse konnte demnach nur GDP detektiert werden.
- 83 -
Ergebnisse
3.3.3
Dynamik der Nukleotidbindung
Die Dynamik der Nukleotidbindung vom hGBP2wt wurde unter Verwendung von mantNukleotiden an der stopped-flow-Apparatur gemessen. Das Protein wurde in einem
Überschuss verwendet, um eine Kinetik pseudo-erster Ordnung zu erhalten.
An die erhaltenen Datenpunkte wurde eine einfach exponentielle Funktion angepasst um
die Geschwindigkeitskonstante kobs zu erhalten. Durch Auftragung von kobs gegen die
Konzentration und linearer Anpassung wurden die Geschwindigkeitskonstanten der
Assoziation (kass) erhalten (Abbildung 3-24). Die Geschwindigkeitskonstante der
Dissoziation (kdiss) wurde separat durch Verdrängungsexperimente ermittelt. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 3-7 zusammengefasst.
60
kobs (s-1)
40
20
0
0
10
20
30
[hGBP2] (µM)
Abbildung 3-24: Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden.
Die Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden an hGBP2 wurde mit 0,5µM mant-Nukleotid
und ansteigender Proteinkonzentration bei 25°C gemessen. Aus der Anpassung einer einfach
exponentiellen Funktion wurde die Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung erhalten, die
gegen die Proteinkonzentration aufgetragen wurde. Die Anpassung der linearen Funktion lieferte
die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation (kdiss) und Assoziation (kass). Gemessen wurden die
Bindungskinetiken von mGMP(○), mGDP(●) und mGppNHp(□).
Die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und Dissoziation vom mGMP zeigen
gegenüber den anderen mant-Nukleotiden einen deutlichen Unterschied. Sie liegen etwa
um eine Größenordnung über den Werten vom mGDP und mGppNHp. An den Werten für
- 84 -
Ergebnisse
die Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation ist aber zu erkennen, dass alle Nukleotide
mit der gleichen Affinität gebunden werden.
hGBP2 wt
kass(µM-1s-1)
kdiss(s-1)
kdiss*(s-1)
KD*(µM)
KD(µM)
mGMP
2,41
15,2
1,7
0,7
1,8
mGDP
0,82
1,79
0,19
0,23
0,3
mGppNHp
0,35
1,68
0,06
0,17
0,9
Tabelle 3-7: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Die Geschwindigkeitskonstanten für die Assoziation und der Dissoziation wurden mit Hilfe der
stopped-flow Apparatur bei 25°C bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation wurde
aufgrund der höheren Genauigkeit separat durch Verdrängungsexperimente bestimmt (kdiss*). Die
KD*-Werte werden aus dem Verhältnis kdiss*/ kass bestimmt. Die KD-Werte sind die
Gleichgewichtskonstanten der Dissoziation, die aus den Fluoreszenztitrationen erhalten wurden.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Nukleotidaffinitäten zusätzlich durch
Fluoreszenztitrationen bestimmt. Dabei wurden in einer Küvette 0,5µM mant-Nukleotid
in Puffer (50mM Tris-HCl pH 7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt, und dazu eine
Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM mant-Nukleotid, hinzutitriert.
rel. Fluoreszenz
4
3
2
1
0,1
1
[hGBP2wt] (µM)
10
Abbildung 3-25: Fluoreszenztitration von mant-Nukleotiden mit hGBP2.
In einer Küvette wurden 0,5µM mGMP(○), mGDP(●) bzw. mGppNHp(□) vorgelegt, und eine
Proteinlösung, ebenfalls mit 0,5µM des jeweiligen mant-Nukleotids, hinzutitriert. Die Anregung
erfolgte bei einer Wellenlänge von 366nm und die Emission wurde bei 435nm detektiert. An die
Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration wurde eine quadratische
Bindungskurve angepasst, um die Dissoziationskonstante zu erhalten.
- 85 -
Ergebnisse
Die Anregung erfolgte bei einer Wellenlänge von 366nm und die Emission wurde bei
435nm detektiert. An die Auftragung der rel. Fluoreszenz gegen die Proteinkonzentration
wurde eine quadratische Bindungskurve (Formel 2-4) angepasst und somit die
Dissoziationskonstante erhalten.
In der Abbildung 3-25 sind die Fluoreszenztitrationen bei 25°C, von mGMP (□), mGDP
(●) und mGppNHp (○) aufgetragen. Die Fluoreszenztitrationen bestätigen, dass die
Gleichgewichtskonstante der Dissoziation im Fall von mGMP (○), mit 1,8µM im
Vergleich zu den anderen mant-Nukleotiden größer ist. Die anderen beiden mantNukleotide, mGDP (●) und mGppNHp (□), weisen mit ca. 0,3µM und 0,9µM eine
stärkere Bindung zum hGBP2 Wildtyp auf.
3.3.4
Interaktion von hGBP1 und hGBP2
Für die Analyse einer möglichen Interaktion von hGBP1 und hGBP2 wurde die Methode
des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers verwendet. Grundlage dieser Methode ist
der strahlungslose Energietransfer von einem angeregten Donor auf einen Akzeptor
(Flurophorenpaar), welcher eintritt, sobald die Fluorophore in räumlicher Nähe zueinander
liegen. Der Abstand sollte in der Nähe des Förster-Radius liegen, welcher beim
eCFP/eYFP-Fluorophorenpaar bei 4,95nm liegt. Der angeregte Donor übermittelt dann
seine Energie strahlungslos auf den Akzeptor, der seinerseits angeregt wird. Im Zuge des
Energietransfers findet ein Quenching der Fluoreszenz des Donors statt, dagegen wird die
Fluoreszenz des Akzeptors verstärkt angeregt.
Für die Analyse der Assemblierung von hGBP1 und hGBP2 wurden die Fusionsproteine
hGBP1-eCFP, hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP hergestellt. Dabei liegen die
Fluorophore bei allen Proteinen am N-terminus. Das eYFP hat sein Absorptionsmaximum
bei 514nm und das Emissionsmaximum bei 525nm und fungiert als Akzeptor. Das eCFP,
das in diesem System als Donor agiert, besitzt sein Absorptionsmaximum bei 453nm und
emittiert maximal bei einer Wellenlänge von 475nm.
- 86 -
Ergebnisse
1
rel. Fluoreszenz
0,8
0,6
0,4
0,2
0
450
500
550
600
Wellenlänge (nm)
Abbildung 3-26: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart
unterschiedlicher Nukleotide.
Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die
Anregungswellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde im Bereich von 430nm bis 600nm
detektiert. Die Messungen wurden nukleotidfrei (cyan) oder in Gegenwart von GMP (blau), GDP
(gelb), GppNHp (rot) bzw. GDP im Komplex mit AlFx (schwarz) durchgeführt. Im Bereich von
475nm ist die Emission des Donors zu beobachten und bei 525nm Emittiert der Akzeptor.
Für die Untersuchung der Nukleotidabhängigkeit der Assemblierung der Wildtypproteine
von hGBP1 und hGBP2 wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM
hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM
DTE) vorgelegt. Der Donor wurde bei 407nm angeregt, um eine möglichst geringe
Direktanregung des Akzeptors zu erhalten. Die Emission wurde zwischen 430nm und
600nm detektiert (Abbildung 3-26). Die Zugabe von GMP (blau), GDP (gelb) oder
GppNHp (rot) zeigt im Vergleich zu dem Spektrum der nukleotidfreien Probe (cyan)
keine signifikante Änderung in der Fluoreszenz. Diese Nukleotide sind entweder nicht in
der Lage eine Assemblierung zu induzieren, oder die Fluorophore haben bei der
Interaktion einen zu großen Abstand zueinander. Dagegen ist eine deutliche Änderung in
der Fluoreszenz zu beobachten, sobald GDP und AlFx gebunden wird (schwarz). Im
Bereich der Akzeptoremission von 525nm steigt die Fluoreszenz um ca. 30% an, welcher
nur durch einen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer verursacht werden kann. Die
Bindung von Nukleotiden ist demnach zwar notwendig, aber für die Assemblierung von
hGBP1 und hGBP2 wird die Hydrolyse des Nukleotids benötigt. Erst der
- 87 -
Ergebnisse
Übergangszustand der Hydrolyse, welcher durch den Komplex aus GDP und AlFx
dargestellt wird, induziert eine Interaktion.
Um die Assoziation von hGBP1 und hGBP2 in Gegenwart von GTP zu zeigen, wurde die
Emission des Akzeptors zeitabhängig bei 525nm erfasst. Dazu wurden 200nM des
Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer
(50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt und nach ca. 10 Sekunden
70µM GTP dazugegeben. Die Anregungswellenlänge lag bei 407nm. Die in Abbildung
3-27 gezeigte Fluoreszenzänderung zeigt einen schnellen Anstieg gefolgt von einer
langsameren Phase, die kurz darauf ein Maximum erreicht. Aufgrund der durch die
Hydrolyse schwindenden GTP-Konzentration dissoziiert der Komplex und die
Akzeptorfluoreszenz erreicht nach ca. 220 Sekunden ihren Ausgangszustand. Der GTPUmsatz wird aufgrund der 10x höheren verwendeten Konzentration, hauptsächlich vom
hGBP2 getragen. Dazu tragen zusätzlich die geringeren Nukleotidaffinitäten vom hGBP1
im Vergleich zum hGBP2 bei.
rel. Fluoreszenz
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
t (s)
Abbildung 3-27: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart von GTP.
Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die
Anregungswellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde bei 525nm detektiert. Die
Messungen wurden in Gegenwart von GTP zeitabhängig durchgeführt. Die Zugabe von 70µM GTP
nach ca. 10s führt zu einer starken Erhöhung der Akzeptorfluoreszenz. Nach vollständigem Umsatz
des GTPs erreicht die Akzeptorfluoreszenz wieder ihren Ausgangszustand.
- 88 -
Ergebnisse
Max.
Affinitäten
Hydrolysegeschwindigkeit
mGMP
mGDP
mGppNHp
hGBP1
22,8 min-1
0,56µM
3,53µM
1,67µM
hGBP2
15min-1
1,8µM
0,3µM
0,9µM
Um zu zeigen, dass bei der hGBP1/hGBP2 Assemblierung die helikale Domäne von
hGBP1 involviert ist, wurde das hGBP1 Wildtypprotein durch die Deletionsmutante
hGBP1-α7-13 ersetzt und die Experimente wiederholt. Dabei wurde die Fusion von α7-13
mit eCFP als Donor verwendet (Abbildung 3-28).
1
rel. Fluoreszenz
0,8
0,6
0,4
0,2
0
450
500
550
600
Wellenlänge (nm)
Abbildung 3-28: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1 Deletionsmutante α7-13-eCFP
in Gegenwart unterschiedlicher Nukleotide.
Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die
Anregungs-wellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde im Bereich von 430nm bis
600nm detektiert. Die Messungen wurden nukleotidfrei (Cyan), in Gegenwart von GMP (Blau),
GDP (Gelb), GppNHp (Rot) oder mit GDP im Komplex mit AlFx (Schwarz) durchgeführt. Im
Bereich von 475nm ist die Emission des Donors zu beobachten und bei 525nm emittiert der
Akzeptor.
Analog zu den Messungen mit den beiden Wildtypproteinen zeigen die Zugaben von
GMP (Blau), GDP (Gelb) und GppNHp (Rot) im Vergleich zur nukleotidfreien Messung
(Cyan) keine Änderung in der Fluoreszenz. Erst die Zugabe von GDP im Komplex mit
- 89 -
Ergebnisse
AlFx (Schwarz) bewirkt eine Erhöhung in der Akzeptorfluoreszenz, was auf eine
räumliche Nähe von Donor und Akzeptor, und somit eine Interaktion der Proteine
schließen lässt. Ebenso scheint auch hier die Nukleotidbindung nicht ausreichend für eine
Assemblierung zu sein. Erst die Darstellung des Übergangszustands der Hydrolyse durch
GDP im Komplex mit AlFx, induziert eine Assemblierung der Proteine.
Da anscheinend die Hydrolyse des Nukleotids eine Assemblierung hervorruft, wurde
analog zu dem Experiment mit den Wildtypproteinen eine zeitabhängige Messung in
Gegenwart von GTP durchgeführt. Es wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13eCFP und 2µM hGBP2-eYFP in einem Spektrofluorometer (50mM Tris-HCl pH7,9, 5mM
MgCl2, 2mM DTE) vorgelegt und die Messung gestartet. Nach ca. 20 Sekunden wurden
70µM GTP in die Küvette pipetiert.
rel. Fluoreszenz
0,2
0,1
0
0
200
400
600
800
1000
t (s)
Abbildung 3-29: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP in Gegenwart von
GTP.
Vorgelegt wurden 200nM des Fusionsproteins hGBP1-α7-13-eCFP und 2µM hGBP2-eYFP. Die
Anregungs-wellenlänge lag bei 406nm und die Emission wurde bei 525nm detektiert. Die
Messungen wurden in Gegenwart von GTP zeitabhängig durchgeführt. Die Zugabe von 70µM
GTP nach ca. 10s führt zu einer starken Erhöhung der Akzeptorfluoreszenz. Nach vollständigem
Umsatz des GTPs erreicht die Akzeptorfluoreszenz wieder ihren Ausgangszustand. Die Zugabe
von 70µM GTP wurde insgesamt viermal wiederholt.
Die in Abbildung 3-29 gezeigte Fluoreszenzänderung zeigt einen sehr schnellen Anstieg
gefolgt von einer langsameren Phase, die kurz darauf ein Maximum erreicht. Die
Akzeptorfluoreszenz erreicht nach Umsatz des GTPs wieder den Ausgangszustand. Um zu
- 90 -
Ergebnisse
untersuchen, ob es sich um eine reproduzierbare Assemblierung handelt, wurde nach
Erreichen des Grundzustands der Akzeptorfluoreszenz erneut 70µM GTP in die Küvette
pipetiert. Es erfolgte wiederum ein starker Anstieg der Akzeptorfluoreszenz bei 525nm,
der nach Umsatz vom GTP zurück auf seinen Grundzustand fiel. Die Zugabe von GTP
wurde insgesamt viermal wiederholt.
Dabei war zu beobachten, dass das Emissionsmaximum bei jeder Messung geringer
wurde. Der Grund dafür liegt in der Produktinhibierung, die deshalb auftritt, weil die
Affinitäten von GMP, GDP und GTP kaum Unterschiede aufweisen.
- 91 -
Diskussion
4 Diskussion
Die Selbstassemblierung von Mitgliedern der Dynamin Familie ist ein essentieller
Bestandteil ihrer Funktion. Wie auch bei MxA und Dynamin zeigt die nukleotidabhängige
Oligomerisierung bei hGBP1 eine starke Beschleunigung der GTPase Aktivität (Prakash et
al., 2000, Praefcke et al., 2004). Vorangegangene Arbeiten an der isolierten LG-Domäne
zeigten detailliert den Mechanismus der Dimerisierung und den Effekt auf die GTPaseAktivität (Ghosh et al. 2006). Belege für die Bildung von tetrameren Strukturen, bei denen
der C-terminale Teil als Interaktionsfläche dient, konnten ebenfalls gefunden werden.
Durch Interaktionsstudien mit dem Hefe 2-Hybrid-System mit den Deletionsmutante α1213 und α7-13 konnte bereits gezeigt werden, dass diese Subdomänen in der Lage sind
miteinander zu interagieren (Benscheid, 2005). Studien an der Deletionsmutante 1-481, bei
der die Helices α12-13 deletiert sind, zeigen dass diese Mutante im GppNHp gebundenen
Zustand zwar dimerisiert, aber keine Tetramere mehr bilden kann. Des Weiteren hat die
Mutante 1-481 die Eigenschaft, ebenso wie die isolierte LG-Domäne, GDP aus der Lösung
zu binden und mit hoher Geschwindigkeit zu hydrolysieren (Kunzelmann, 2006). Diese
Ergebnisse zeigten, dass die Helices α12-13 nicht nur einen Einfluss auf die
Oligomerisierung haben, indem sie als Interaktionsdomäne funktionieren, sondern auch
eine Wirkung auf die Substratspezifität haben. Ein Ziel dieser Arbeit war es den Cterminalen Teil von hGBP1 in seiner Funktion als Interaktionsdomäne und die
Auswirkungen der Selbstassemblierung auf die GTPase-Aktivität zu untersuchen.
Die Unterbrechung eines elektrostatischen Kontakts zwischen der LGDomäne und α12-13 verändert die nukleotidabhängige
Selbstassemblierung
Die Überlagerung der Kristallstrukturen der LG-Domänen von hGBP1 im GMP (PDB:
2d4h) gebundenen Zustand und im Komplex mit GDP und AlFx (PDB: 2b92) zeigt große
Unterschiede in der Position der Helix α4´. Diese Helix α4´ ist in der GDP*AlFx
gebundenen
- 92 -
Diskussion
Abbildung 4-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von
hGBP1
Die
Abbildung
zeigt
die
Überlagerung der Kristallstrukturen
der LG-Domäne von hGBP1 im
GMP (rot, PDB: 2d4h) und
GDP*AlFx (blau, PDB: 2b92)
gebundenen
Zustand.
Die
Überlagerung
dieser
beiden
Strukturen zeigt große Unterschiede
in der Position der Helix α4´.
Struktur weiter weg von der Nukleotidbindungstasche positioniert (Abbildung 4-1). In
einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur ist zu erkennen, dass die Helix α4´
mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion zwischen der LG-Domäne und dem
C-Terminus des Proteins stellt einen elektrostatischen Kontakt dar, bestehend aus einem
Lysin (K228) und einem Arginin (R227) in der Helix α4´ und mehreren Glutaminsäuren
(E563, E568, E556 und E575) in den Helices α12-13 (Abbildung 4-2). Die Bewegung der
Helix α4´ um ca. 7Å hat auch Folgen für die beiden Aminosäuren Arginin 227 und Lysin
228, die bei näherer Betrachtung der Kristallstruktur die einzigen Interaktionspunkte der
LG-Domäne zu den Helices α12-13 darstellen. Das Arginin 227 wird um 3Å und das
Lysin um 5Å in seinen Positionen verändert. Die Bindungsabstände zu dem
Interaktionspartnern erhöhen sich auf über 4,5Å, was für eine polare Bindung eine zu
große Distanz darstellt. Weiterhin ist wahrscheinlich die Positionsänderung der α4´ aus
sterischen Gründen auch für eine Änderung der Position von α12-13 verantwortlich. Das
würde ebenfalls seinen Teil zur Unterbrechung der polaren Bindungen beitragen, ist aber
anhand der Kristallstruktur schwer zu quantifizieren.
- 93 -
Diskussion
A
B
E568
E563
3,2
E575
2,8
2,7
K228
3,3
5Å
3Å
E556
3,5
R227
3,5
Abbildung 4-2: Detailansicht des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und
α12-13
Dargestellt ist die Überlagerung dem nukleotidfreien full length hGBP1 (grün, PDB: 1DG3) und
der isolierten LG-Domäne im Komplex mit GDP*AlFx (transparent, PDB: 2b92). (A) Nach der
Positionsänderung der Helix α4´ durch die GDP*AlFx-Bindung, wird das Lysin 228 um ca. 5Å
verschoben. Die Bindungsabstände zu den beiden Glutaminsäuren E568 und E575 sind aufgrund
dieser Positionsänderung nicht mehr in einem Bereich welcher eine polare Bindung zulässt (B)
Durch die Positionsänderung der α4´ wird das Arginin 227 in seiner Position um 3Å verändert.
Dadurch werden auch die Interaktion mit den zwei Glutaminsäuren E563 und E556 unterbrochen,
da die Abstände nicht mehr innerhalb des Maximalabstands für polare Bindungen liegen.
Um zu analysieren welchen Einfluss diese Interaktion zwischen α4´ der LG-Domäne und
α12-13 auf das Protein hat, wurden einzelne Aminosäuren so mutiert, dass eine
Ladungsumkehr resultiert und die Helices voneinander abgestoßen werden. Es wurden die
Einzelmutationen R227E, K228E, E563R sowie die Doppelmutation R227E/K228E
hergestellt. Nach rekombinanter Herstellung und Aufreinigung der Mutanten, wurden
diese
mit
Hilfe
von
dynamischer
Lichtstreuung
und
analytischer
Größenausschlusschromatographie auf ihre nukleotidabhängige Selbstassemblierung hin
untersucht. Das hGBP1wt liegt im nukleotidfreien Zustand als Monomer vor (Prakash et
al., 2000). Dies ist auch bei den Mutanten K228E und E563R der Fall, deren
nukleotidabhängige Selbstassemblierung, auch im Komplex mit GppNHp oder GDP*AlFx,
keine Unterschiede zum Wildtyp aufweisen.
Dagegen liegen die Mutante R227E und die Doppelmutante R227E/K228E in
nukleotidfreier Form bereits als Dimer vor. Die Zugabe des nicht hydrolysierbaren GTP
Analogon GppNHp bewirkt bei R227E und R227E/K228E die Assemblierung zu einem
Tetramer, was beim Wildtyp nur im Komplex mit GDP*AlFx geschieht.
- 94 -
Diskussion
Nukleotid frei
GppNHp
GDP*AlFx
Wildtyp
Monomer
Dimer
Tetramer
K228E
Monomer
Dimer
Tetramer
E563R
Monomer
Dimer
Tetramer
R227E
Dimer
Tetramer
Tetramer
R227E/K228E
Dimer
Tetramer
Tetramer
1-481 (Δ12-13)
Monomer
Dimer
Dimer
Tabelle 4-1: Übersicht des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und
Mutanten.
Im nukleotidfreien Zustand liegen der Wildtyp, sowie die Mutanten K228E und E563R als
Monomer vor. Dagegen liegen die Mutanten R227E und R227E/K228E bereits als Dimer vor. Die
Zugabe von GppNHp bewirkt beim Wildtyp dessen Dimerisierung. Die gleiche Beobachtung
konnte auch bei den Mutanten K228E und E563R gemacht werden. Die Mutanten R227E und
R227E/K228E dagegen liegen im Komplex mit GppNHp bereits als Tetramer vor, was im Wildtyp
erst mit GDP und AlFx beobachtet werden kann. Bei der Mutante hGBP1-1-481(Dissertation, S.
Kunzelmann), in der die Helices α12-13 deletiert sind, ist eine Tetramerisierung nicht zu
beobachten. Es bilden sich sowohl im GppNHp als auch im GDP*AlFx gebundenem Zustand
dimere aus.
Durch die Mutante hGBP1 1-481, bei der der C-terminale Teil des Proteins (α12-13)
deletiert ist, konnte gezeigt werden, dass α12-13 für die Tetramerisierung von hGBP1
essentiell ist (Dissertation, S. Kunzelmann, 2006). Dieser Befund wird durch
Interaktionsstudien mit den isolierten Domänen α7-13 und α12-13 erhärtet (Dissertation,
U.Benscheid, 2005). Im Wildtyp kommt die Interaktion an den Helices α12-13 jedoch erst
durch die Bindung von GDP und Aluminiumfluorid zustande. Diese Ergebnisse legen
nahe, dass die Tetramerisierung durch die Helices α12-13 erfolgt, aber eines vorher
erfolgten Prozesses bedarf, welcher die Interaktionsfläche zur Verfügung stellt.
Bei den Mutanten R227E und R227E/K228E scheint dieser Prozess nicht mehr notwendig
für eine Interaktion an der helikalen Domäne zu sein. Die Helices α12-13 stehen dauerhaft
für eine Interaktion zur Verfügung, was bereits zur Dimerisierung im nukleotidfreien
Zustand führt. Die Aminosäuren Arginin 227 und Lysin 228 und somit der elektrostatische
Kontakt zwischen α4´ und α12-13, scheinen daher eine zentrale Rolle im Vorgang der
Tetramerisierung zu spielen. Aus diesem Grund ist möglicherweise im Wildtyp die
Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts durch die Positionsänderung von α4´ Teil
des Mechanismus, welcher zur Tetramerisierung führt.
Zusammengefasst bewirkt die Bindung von GDP*AlFx durch den Wildtyp eine
Konformationsänderung, bei der sich die Helix α4´ verschiebt. Als Konsequenz dieser
veränderten Position wird die elektrostatische Interaktion zwischen LG-Domäne und α12- 95 -
Diskussion
13 gelöst. Dadurch werden die Helices α12-13 freigegeben und stehen als
Interaktionsfläche zur Verfügung. Bei den Mutanten R227E und R227E/K228E ist die
Konformationsänderung der α4´nicht notwendig. Diese elektrostatische Interaktion spielt
demnach eine wichtige Rolle für eine Weiterleitung der Information der GTP Hydrolyse
an die helikale Domäne.
Die Tetramerisierung hat keinen Effekt auf die Nukleotidaffinitäten
Die Analyse des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten zeigt, dass die
Mutationen R227E und R227E/K228E einen Effekt auf die Selbstassemblierung haben.
Das deutet darauf hin, dass die elektrostatische Interaktion zwischen der LG-Domäne und
dem C-terminalen Teil des Proteins eine wichtige Rolle in der Selbstassemblierung spielt.
Die Interaktion an der helikalen Domäne kommt im Wildtyp Protein erst bei dem
Übergangszustand der GTP Hydrolyse zustande, die durch den Komplex mit GDP*AlFx
dargestellt werden kann. Es sollte nun weiterhin analysiert werden, ob die Mutationen
auch die Dynamik der Nukleotidbindung beeinflussen. Bereits die Fluoreszenztitrationen
mit mant-Nukleotiden zeigten, dass die ermittelten Dissoziationskonstanten im Vergleich
zum Wildtyp keine signifikanten Unterschiede aufweisen. Dieses Ergebnis wird durch die
Messungen der Dynamik der Nukleotidbindung mit der stopped flow Apparatur bestätigt.
Auch die Geschwindigkeitskonstanten der Assoziation und der Dissoziation zeigen
gegenüber dem Wildtyp keine signifikanten Unterschiede. Die Mutationen an der Stelle
zwischen der LG-Domäne und den Helices α12-13 haben somit keinen Einfluss auf die
Bindungskinetik der mant-Nukleotide. Dass die Helices α12 und α13 keinen Einfluss auf
die Nukleotidbindung haben, wurde bereits durch die Mutante 1-481 gezeigt (Kunzelmann
2006), bei der der C-Terminus deletiert ist. Sowohl die Geschwindigkeitskonstanten der
Assoziation als auch die der Dissoziation entsprechen den Wildtypwerten. Durch die
Unterbrechung der Interaktion zwischen C-Terminus und LG-Domäne konnte nun
zusätzlich gezeigt werden, dass die Tetramerisierung, also die intermolekulare
Wechselwirkung an den helikalen Domänen, ebenfalls keinen Einfluss auf die Kinetik der
Nukleotidbindung hat.
- 96 -
Diskussion
Die Tetramerisierung beeinflusst die Nukleotid-Hydrolyse
Einen wichtigen Hinweis auf die Kommunikation zwischen der LG-Domäne und den
Helices α12 und α13 liefert die Nukleotid-Hydrolyse. In vorangegangenen Arbeiten konnte
bereits gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Helices α12-13 einen Einfluss auf die
Substratspezifität von hGBP1 hat. Bei der Deletionsmutanten 1-481, aber auch bei den
isolierten LG-Domänen konnte die Bindung und Umsetzung von GDP festgestellt werden
(Kunzelmann 2006, Ghosh et al., 2006). Diese veränderte Substratspezifität konnte auch
bei der Punktmutante R227E und bei der Doppelmutante R227E/K228E beobachtet
werden. Interessanterweise zeigte sich, dass die 1-481, mit 9 min-1eine bis zu 10mal
höhere maximale GDP Hydrolysegeschwindigkeit besitzt als die beiden Mutanten R227E
und R227E/K228E, die ca. 0,9 min-1 erreichen. Die maximale GDPase-Aktivität vom
Wildtyp-hGBP1 konnte mittlerweile ebenfalls bestimmt werden (Kunzelmann, 2006) und
liegt bei unter 0,02 pro Minute. Die Anwesenheit der Helices α12-13 zeigen demzufolge
einen inhibitorischen Einfluss auf die Hydrolyse von GDP aus der Lösung. Der
elektrostatische Kontakt scheint dabei auch eine wichtige Rolle zu spielen, da die
Unterbrechung des Kontaktes die Geschwindigkeit der GDP-Hydrolyse aus der Lösung
um mehr als eine Größenordnung, im Vergleich zum Wildtyp anhebt. Die GDPaseAktivitäten sind wie bei den Deletionsmutanten abhängig von den Proteinkonzentrationen.
Die apparenten Dissoziationskonstanten der Selbstassemblierung liegen sowohl bei der
Deletionsmutante 1-481, mit 10µM, als auch bei den Punktmutanten R227E und
R227E/K228E, mit 4µM bzw. 17,7µM, in der gleichen Größenordnung. Die
Unterbrechung des Kontakts zwischen der LG-Domäne und der Helices α12-13 reicht
somit für hGBP1 aus, um GDP als Substrat zu akzeptieren und nachfolgend zu
hydrolysieren.
Aber auch die GTP Hydrolyse wird durch die Unterbrechung des Kontakts beeinflusst. Die
erhaltenen Datenpunkte aus der Messung der konzentrationsabhängigen Hydrolyse von
GTP konnten im Falle der Doppelmutante R227E/K228E nur durch eine Hill-Funktion
angepasst werden. Es zeigte sich eine basale Aktivität bei 11 pro Minute und der HillParameter liegt bei 2,7. Dieses Ergebnis für die Doppelmutante zeigte aber auch einen
Unterschied zu der Punktmutante R227E, bei der keine Basalaktivität beobachtet wurde
und die Datenpunkte durch eine quadratische Bindungskurve angepasst werden kann.
Obwohl die einzelne Mutation R227E ausreichend ist, um das Oligomerisierungsverhalten
- 97 -
Diskussion
und die Substratspezifität zu verändern, scheint die K228E zusätzlich nötig zu sein um
eine Basalaktivität in der GTP-Hydrolysekurve zu verursachen. Der Grund dafür bleibt
jedoch ungeklärt.
Ein weiter Unterschied zwischen der Doppelmutante R227E/K228E und dem Wildtyp ist
das
Verhältnis
der
Hydrolyseprodukte.
Der
Wildtyp
zeigt
bei
kleinen
Proteinkonzentrationen einen GMP-Anteil von 13% welcher bei Erhöhung der
Proteinkonzentrationen bis auf 73% ansteigt. Im Wildtyp wird also mit zunehmender
Proteinkonzentration mehr GMP erhalten. Bei der Doppelmutante R227E/K228E konnte
jedoch
in
dem
verwendeten
Konzentrationsbereich
keine
Änderung
der
Produktverhältnisse detektiert werden. Bei Proteinkonzentrationen zwischen 30nM und
4µM liegt das Hauptprodukt mit 78% konzentrationsunabhängig beim GMP. Das
entspricht ungefähr dem maximalen Wert der auch für den Wildtyp experimentell
bestimmt werden konnte.
Im Rahmen ihrer Dissertation konnte Simone Kunzelmann ein Reaktionsmodell für die
Nukleotidhydrolyse vom hGBP1 entwickeln (Abbildung 4-1). Demnach folgt der Bindung
von GTP eine Konformationsänderung von einer inaktiven in eine aktive Konformation.
Dadurch wird durch die richtige Positionierung des Arginin 48 erst die Möglichkeit zur
Hydrolyse geschaffen. Erst die aktive Konformation ist in der Lage GTP und GDP zu
spalten. Durch die Dimerisierung von hGBP1 wird diese aktive Konformation stabilisiert
und die maximale Geschwindigkeit der GTP-Hydrolyse wird erreicht.
Der Übergang der nach Dissoziation der GDP- und GMP- gebundener Dimere stattfindet,
ist quasi-irreversibel. Daher ist die Hydrolyse von GDP aus der Lösung sehr langsam und
die
Bildung
von
GDP-
oder
GMP-Dimeren
findet
nicht
statt.
Die
Konzentrationsabhängigkeit der Produktverhältnisse kann ebenfalls durch das Schema 4-1
beschrieben werden. Demnach ist die produzierte Menge an GMP von den
Konzentrationen der Intermediate E*GDP und (E*GDP)2, und dementsprechend auch von
der Dissoziationskonstante der Dimerisierung abhängig.
- 98 -
Diskussion
2E + 2GTP
Nukleotidbindung
-1
2,7s
2E + 2GDP
-1
2,0 µM-1s-1
26s
inaktiv 2E·GTP
Konformationsänderung
aktiv
Dimerisierung
-1
1,9 µM-1s-1
20s
2E·GDP
*
15s-1
K1 = 16
2E*·GTP
2E + 2GMP
0,45s-1
4,5 µM-1s-1
2E·GMP
*
K2 > 6000
2E*·GDP
2,2s-1
2E*·GMP
Kd = 3nM
(E*·GTP)2
0,45s
-1
-1
(E*·GDP)2
2,2s
(E*·GMP)2
Schema 4-1: Reaktionschema der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1.
Nach der Bindung von GTP folgt eine Konformationsänderung von hGBP1 von einer inaktiven zu
einer aktiven (*) Konformation. Im aktiven Zustand ist hGBP1 erst in der Lage GTP zu spalten. Im
monomeren, GTP-gebundenem Zustand liegt nur ein geringer Teil in der aktiven Konformation vor
und die Hydrolyse ist deshalb langsam. Die Hydrolyse wird beschleunigt indem die aktive
Konformation durch die Dimerisierung stabilisiert wird. Im GDP- und GMP-gebundenem Zustand
ist das Konformationsgleichgewicht, im Vergleich zum GTP-gebundenen Zustand, weiter zur
inaktiven Konformation verschoben. Der nach der Dissoziation der GDP- und GMP-gebundenem
Dimere Übergang in den inaktiven Zustand ist quasi-irreversibel. (Abbildung entnommen aus
Dissertation, S. Kunzelmann)
Dieses Reaktionsschema kann nun um den Schritt der Tetramerisierung erweitert werden
(Schema 4-2). Im Zeitraum der Umsetzung von GTP zum GDP findet eine
Konformationsänderung statt, welche Vorraussetzung für die Interaktion an der helikalen
Domäne α12-13 ist. Abhängig von der Affinität der helikalen Interaktion, stellt sich ein
Gleichgewicht zwischen dem Dimer und dem Tetramer im GDP gebundenen Zustand ein.
Eine wichtige Frage die noch zu klären wäre, ist die Lebensdauer des Tetramers. Möglich
wäre, dass das Tetramer bereits im GDP gebundenen Zustand wieder zerfällt. Weiterhin
wäre aber auch die Dissoziation des tetrameren hGBP1 nach der Hydrolyse des GDP zum
GMP möglich. Daten bezüglich der Stabilität des tetrameren hGBP1 fehlen jedoch bisher,
sodass diese Vermutungen experimentell bestätigt werden müssen. Eine weitere Spezies
könnte ein helikal, GDP-gebundenes Dimer sein, welches neben dem LG-Domänen-Dimer
existiert. Dieses könnte nach der GTP-Hydrolyse durch das monomere hGBP1 auftreten.
Die Existenz dieser Spezies konnte aber bisher nicht nachgewiesen werden.
- 99 -
Diskussion
4E + 4GDP
4E + 4GMP
4E·GDP
4E·GMP
4E*·GDP/P
4E*·GDP
4E*·GMP
2(E*·GDP/P)2
2(E*·GDP)2
2(E*·GMP)
(E*·GDP)4
(E*·GMP)2
4E + 4GTP
Nukleotidbindung
4E·GTP
Konformationsänderung
4E*·GTP
Intermediat
Dimerisierung
2(E*·GTP)2
Tetramerisierung
Schema 4-2: Erweitertes Reaktionsschema der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1.
Das Reaktionsschema der Nukleotidhydrolyse welches von S. Kunzelmann in ihrer Arbeit
entwickelt wurde, ist hier um den Schritt der Tetramerisierung erweitert worden. Demnach erfolgt
im Laufe der GTP-Hydrolyse eine Konformationsänderung, die die nötige Vorraussetzung für eine
Interaktion an den helikalen Domänen liefert. Das Tetramer ist ein weiterer Schritt das aktive Dimer
zu stabilisieren und trägt zur Erhöhung der GMP-Produktion bei.
Mit Hilfe dieses erweiterten Hydrolyseschemas kann für die hohe GMP-Produktion bei der
Doppelmutante R227E/K228E eine mögliche Erklärung gefunden werden. Da die
nukleotidfreie Doppelmutante bereits als dimeres, über die helikale Domäne assoziiertes,
Protein vorliegt führt schon die GTP-Bindung zu einer Tetramerisierung. Im Wildtyp
erfolgt jedoch der Schritt der LG-Domänen-Assoziation vor der helikalen Interaktion.
Diese Änderung im Ablauf der Homooligomerisierung bewirkt, dass sich die
Kontaktfläche für die Interaktion an den LG-Domänen verdoppelt, da nun zwei LGDomänen für eine Assoziation bereitstehen. Daraus resultiert eine höhere Affinität, die das
Verhältnis 4E*GTP/2(E*GTP)2 in die Richtung der GTP-gebundenen Dimere verschiebt.
Ein weiter Grund für die höhere GMP-Produktion ist, dass das Gleichgewicht zwischen
den GDP-gebundenen Dimeren und Monomeren stärker auf die Seite der Dimere liegt.
Somit folgt das der quasi-irreversible Übergang des GDP-gebundenen Monomers in die
inaktive Form schwieriger zu erreichen ist. Die Tetramerisierung ist eine Möglichkeit die
Affinität an der LG-Domäne zu erhöhen, um somit den aktiven Zustand weiter zu
stabilisieren. Dies wirkt sich auf das Produktverhältnis der Hydrolyse aus, das somit in die
Richtung des GMP´s verschoben wird.
Für die hohe basale Aktivität (11min-1), die bei der GTP-Hydrolyse der Doppelmutante
beobachtet wurde ist scheinbar die helikalen Domäne α12-13 verantwortlich. Da bei der
Deletionsmutante 1-481 in der die α12-13 fehlen, eine Basalaktivität nicht beobachtet
- 100 -
Diskussion
werden konnte, scheinen die Helices α12-13 für diesen Effekt notwendig zu sein. Die im
Vergleich zum Wildtyp später einsetzende Aktivierung ist möglicherweise in einer
verminderten Affinität an der LG-Domäne begründet. Dadurch erfolgen die Assoziation an
den LG-Domänen und die damit verbundene Beschleunigung der Hydrolyse erst bei
höheren Proteinkonzentrationen.
Die Tetramerisierung verläuft nicht nur über α12-13
Mit Hilfe der Temperatursprung-Methode wurde die Kinetik der Assemblierung der
helikalen Domäne näher bestimmt. Die Messungen mit den isolierten Helices α12-13
weisen mit einer Dissoziationskonstante von 24,4µM eine relativ geringe Affinität
zueinander auf. Bei der Homodimerisierung der isolierten helikalen Domäne α7-13, erhöht
sich die Affinität auf 9,7µM. Diese höhere Affinität gegenüber α12-13 liegt hauptsächlich
an einer um eine Größenordnung höheren Assoziationsgeschwindigkeit. Dieses Ergebnis
zeigt, dass die Helices α7 bis α11 ebenfalls einen kleinen, wenn auch nur relativ kleinen,
Beitrag zur Interaktion der helikalen Domänen liefern. Möglicherweise resultiert diese
Erhöhung durch eine Stabilisierung der α12-13 durch die α7-11.
Die Affinität wird durch die Anwesenheit der LG-Domäne weiter erhöht. Die Bindung von
α7-13 an die Doppelmutante R227E/K228E ist mit 1,78µM um mehr als eine
Größenordnung stärker als bei der Homodimerisierung von α12-13. Die Interaktion von
hGBP1 an der helikalen Domäne ist also nicht nur auf die Helices α12-13 beschränkt. Es
findet auch eine Interaktion zwischen der α12-13 des einen Interaktionspartners mit der
LG-Domäne des anderen statt. Durch Messungen mit dem Hefe-2-Hybrid–System konnte
keine Interaktion zwischen der isolierten LG-Domäne und der Subdomäne α12-13 bzw.
α7-13 festgestellt werden (Dissertation U. Benscheid, 2006). Da aber die Detektion von
schwachen Interaktionen mit dem Hefe-2-Hybrid-System sehr schwierig ist, muss eine
sensitivere Methode zur Bestimmung der Interaktion zwischen den isolierten LG- und
helikalen Domänen verwendet werden.
- 101 -
Diskussion
α12-13
α7-13
R227E/K228E
α7-13
9,7µM
1,78µM
R227E/K228E
1,78µM
α12-13
24.4µM
Die Messung der Homodimerisierung der Doppelmutante konnte leider im Rahmen dieser
Arbeit nicht durchgeführt werden. Möglicherweise ist die Dissoziationskonstante in
Gegenwart beider LG-Domänen noch kleiner und die Bindung noch fester. Im Vergleich
dazu konnte die Gleichgewichtskonstante der Dimerisierung der LG-Domänen mit 40nM
bestimmt werden (Dissertation S. Kunzelmann, 2006).
Die Helix α4´ ist innerhalb der hGBP´s stark konserviert
Der Vergleich der Aminosäurensequenz aller sieben hGBPs zeigt eine hohe Konservierung
ihrer Primärsequenz (Tabelle 4-1). Allen gemein sind die konservierten GTP-Bindemotive.
Jedoch existieren weitere Bereiche, deren Sequenzen identische Aminosäuren beinhalten,
die charakteristisch für die GBPs zu sein scheinen.
hGBP-1
hGBP-2
hGBP-3
hGBP-4
hGBP-1
hGBP-2
hGBP-3
hGBP-4
hGBP-5
hGBP-6
hGBP-7
100%
77%
88%
56%
68%
54%
56%
100%
76%
55%
65%
54%
57%
100%
55%
68%
53%
56%
100%
52%
74%
81%
100%
52%
53%
100%
74%
hGBP-5
hGBP-6
hGBP-7
100%
Tabelle 4-2: Prozentualer Vergleich der Primärsequenzidentität.
Die Aminosäuresequenzen der Proteine hGBP1-7 wurden miteinander verglichen und die
Übereinstimmungen der Aminosäuren prozentual angegeben. Die höchste Übereinstimmung haben
hGBP1 und hGBP3 (übernommen aus Olszewski et al., 2006).
- 102 -
Diskussion
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
GxxxxGK(S/T)
---------------MASEIHMTGPMCLIENTNGRLMANPEALKILSAITQPMVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKKKGFSL
---------------MAPEINLPGPMSLIDNTKGQLVVNPEALKILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKKNGFSL
---------------MAPEIHMTGPMCLIENTNGELVANPEALKILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFSL
MGERTLHAAVPTPGYPESESIMMAPICLVENQEEQLTVNSKALEILDKISQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNRLAGKRNGFPL
---------------MALEIHMSDPMCLIENFNEQLKVNQEALEILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFSV
---------------MESGPKMLAPVCQVENNNEQLLVNQQAIQILEKISQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNHLAGQNHGFPL
---------------MASEIHMPGPVCLIENTKGHLVVNSEALEILSAITQPVVVVAIVGLYRTGKSYLMNKLAGKNKGFPL
(67)
(67)
(67)
(82)
(67)
(67)
(67)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
T
DxxG
GSTVQSHTKGIWMWCVPHPKKPGHILVLLDTEGLGDVEKGDNQNDSWIFALAVLLSSTFVYNSIGTINQQAMDQLYYVTELT
GSTVKSHTKGIWMWCVPHPKKPEHTLVLLDTEGLGDIEKGDNENDSWIFALAILLSSTFVYNSMGTINQQAMDQLHYVTELT
GSTVKSHTKGIWMWCVPHPKKPEHTLVLLDTEGLGDVKKGDNQNDSWIFTLAVLLSSTLVYNSMGTINQQAMDQLYYVTELT
GSTVQSETKGIWMWCVPHLSKPNHTLVLLDTEGLGDVEKSNPKNDSWIFALAVLLSSSFVYNSVSTINHQALEQLHYVTELA
ASTVQSHTKGIWIWCVPHPNWPNHTLVLLDTEGLGDVEKADNKNDIQIFALALLLSSTFVYNTVNKIDQGAIDLLHNVTELT
GSTVQSETKGIWMWCVPHPSKPNHTLVLLDTEGLGDVEKGDPKNDSWIFALAVLLCSTFVYNSMSTINHQALEQLHYVTELT
GCTVKSETKGIWMWCVPHPSKPNHTLILLDTEGLGDMEKSDPKSDSWIFALAVLLSSSFVYNSMGTINHQALEQLHYVTELT
(149)
(149)
(149)
(164)
(149)
(149)
(149)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
TLRD
Helix α4´
HRIRSKSSPDENENEVEDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLTYSLKLKKGTSQKDETFNLPRLCIRKFFP
DRIKANSSP--GNNSVDDSADFVSFFPAFVWTLRDFTLELEVDGEPITADDYLELSLKLRKGTDKKSKSFNDPRLCIRKFFP
HRIRSKSSPDENEN--EDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLEYSLKLTQGTSQKDKNFNLPRLCIRKFFP
ELIRAKSCP--RPDEAEDSADFVSFFPDFVWTLRDFSLDLEADGQPLTPDEYLEYSLKLTQGTSQKDKNFNLPRLCIRHFFR
DLLKARNSP--DLDRVEDPADSASFFPDLVWTLRDFCLGLEIDGQLVTPDEYLENSLRPKQGSDQRVQNFNLPRLCIQKFFP
LIKAKSSP--RPDGVEEDSTEFVSFFPDFLWTVRDFTLELKLNGHPITEDEYLENALKLIQGNNPRVQTSNFPRECIRRFFP
ELIRAKSCP--RPDEVEDSSEFVSFFPDFIWTVRDFTLELKLDGHPITEDEYLENALKLISGKNPQIQNSNKPREWIRHFFP
(231)
(229)
(229)
(244)
(229)
(229)
(229)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
KKKCFVFDRPVH-RRKLAQLEKLQDEELDPEFVQQVADFCSYIFSNSKTKTLSGGIQVNGPRLESLVLTYVNAISSGDLPCM
KRKCFVFDWPAP-KKYLAHLEQLKEEELNPDFIEQVAEFCSYILSHSNVKTLSGGIAVNGPRLESLVLTYVNAISSGDLPCM
KKKCFVFDLPIH-RRKLAQLEKLQDEELDPEFVQQVADFCSYIFSNSKTKTLSGGIKVNGPRLESLVLTYINAISRGDLPCM
KRKCFVFDRPTNDKQYLNHMDEVPEENLERHFLMQSDNFCSYIFTHAKTKTLREGIIVTGKRLGTLVVTYVDAINSGAVPCL
KKKCFIFDLPAH-QKKLAQLETLPDDELEPEFVQQVTEFCSYIFSHSMTKTLPGGIMVNGSRLKNLVLTYVNAISSGDLPCI
KRKCFVFDRPTNDKDLLANIEKVSEKQLDPKFQEQTNIFCSYIFTHARTKTLREGITVTGNRLGTLAVTYVEAINSGAVPCL
KQKCFVFDRPINDKKLLLHVEEVREDQLDSNFQMQSENFCSYIFTHAKTKTLREGILVTGNRLGMLVETYLDAINSGATPCL
(312)
(310)
(310)
(326)
(310)
(311)
(311)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
ENAVLALAQIENSAAVQKAIAHYEQQMGQKVQLPTETLQELLDLHRDSEREAIEVFIRSSFKDVDHLFQKELAAQLEKKRDD
ENAVLALAQIENSAAVEKAIAHYEQQMGQKVQLPTETLQELLDLHRDSEREAIEVFMKNSFKDVDQMFQRKLGAQLEARRDD
ENAVLALAQIENSAAVQKAIAHYDQQMGQKVQLPAETLQELLDLHRVSEREATEVYMKNSFKDVDHLFQKKLAAQLDKKRDD
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(394)
(392)
(392)
(408)
(392)
(393)
(393)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
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(476)
(474)
(474)
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(474)
(475)
(475)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
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hGBP7
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(558)
(556)
(556)
(572)
(552)
(557)
(557)
hGBP1
hGBP2
hGBP3
hGBP4
hGBP5
hGBP6
hGBP7
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(593)
(592)
(595)
(641)
(587)
(634)
(639)
Arg227
Abbildung 4-3: Sequenzvergleich der humanen GBP´s 1-7.
Die humanen GBP´s 1-7 weisen untereinander eine sehr hohe Aminosäurenidentität auf
(Olszewski et al., 2006). Die vier konservierten Motive GTP-bindender Proteine sind
schwarz hinterlegt. Die Helix α4´ ist bei hGBP1-5 ebenfalls stark konserviert (grauer
Kasten). Das Arginin an der Stelle 227 (Pfeil), welches bei hGBP1 die wichtigste
Kontaktstelle zwischen α4´und α12-13 darstellt, ist ebenfalls konserviert. Die einzige
Ausnahme macht hGBP5, bei der das Arginin gegen ein Glutamat getauscht ist.
- 103 -
Diskussion
Besonders ausgeprägt ist die Aminosäurenidentität zwischen hGBP1 bis hGBP7 in der
LG-Domäne. Auch bei der in der LG-Domäne liegenden Helix α4´ ist zwischen den sieben
hGBP´s eine hohe Homologie zu finden (Abbildung 4-3). Jedoch zeigen die beiden
Proteine hGBP6 und hGBP7 von allen mit knapp über 50% die geringsten
Sequenzhomologien zu den anderen Familienmitgliedern.
Beim Vergleich aller Sequenzen ist auffällig, dass das Arginin 227, welches im hGBP1 für
die Bindung der α12-13 an die α4´ essentiell ist, auch in allen anderen hGBP´s an gleicher
Stelle zu finden ist. Als einzige Ausnahme trägt hGBP5 an dieser Stelle ein Glutamin.
Nimmt man die beiden Proteine hGBP6 und hGBP7 aufgrund der geringen
Sequenzhomologien (<60%) beiseite und vergleicht nur hGBP1-5, zeigt sich, dass die
Helix α4´in diesen fünf Proteinen nahezu identisch sind. Möglicherweise hat diese Helix in
hGBP2-4 eine ähnliche Aufgabe wie in hGBP1 und ist deswegen stark konserviert
Modell der Tetramerisierung von hGBP1
Die Oligomerisierung von GTP-bindenden Proteinen ist eine essentielle Eigenschaft, die
einen direkten Einfluss auf die Hydrolyseaktivität hat. Das gereinigte hGBP1 liegt
nukleotidfrei als Monomer vor (Dissertation, Praefcke, 2001). Die Bindung von GTP bzw.
dem Analogon GppNHp, lässt das Protein an den LG-Domänen dimerisieren. Durch die
Dimerisierung wird die im Monomer Solvens-exponierte Seitenkette von Arg48 des PLoop in das aktive Zentrum orientiert, was die Hydrolyse des GTPs stark beschleunigt
(Ghosh et al., 2006). Wie die full length Struktur des dimeren hGBP1 aussieht, ist noch
nicht vollständig geklärt. Es konnte aber erfolgreich eine Dimerstruktur der isolierten LGDomänen im Komplex mit GppNHp gelöst werden (PDB: 2bc9), die einen Anhaltspunkt
liefert wie das Dimer, bestehend aus zwei full length Molekülen, aussehen könnte. Dazu
wurde an die beiden LG-Domänen aus der Dimerstruktur jeweils eine hGBP1 full length
Struktur überlagert (Ghosh et al., 2006). Das resultierende Modell zeigt ein gewinkeltes
Dimer, bei dem die helikale Domänen voneinander weg zeigen. Betrachtet man die
putative Dimerstruktur von oben (Abbildung 4-4, B), so ist zu erkennen, dass die Helices
α12-13 an entgegengesetzten Seiten der LG-Domänen liegen.
- 104 -
Diskussion
Für eine Assemblierung von zwei Dimermolekülen an den helikalen Domänen muss die
Interaktion der α12-13 gelöst werden, um die Beweglichkeit der Helices zu erhöhen
(Abbildung 4-4).
Die Unterbrechung der intramolekularen Interaktion zwischen der LG-Domäne und α1213 wird durch die Helix α4´ vermittelt, die durch seine Konformationsänderung die
elektrostatische Bindung unterbricht. Diese Konformationsänderung wird durch die
Bindung von GDP und AlFx induziert, was den Übergangszustand der Hydrolyse darstellt.
Erst wenn der Übergangszustand der Hydrolyse erreicht ist, ist das Protein in der Lage die
nötigen Konformationsänderung für die Tetramerisierung von hGBP1 zu vollziehen. Die
Bindung des GTPs alleine reicht nicht aus. Das Zeitfenster, in dem beim hGBP1wt die
Tetramerisierung stattfinden kann ist demnach klein, konnte aber bereits durch single
turnover Experimente bestimmt werden. Die Geschwindigkeitskonstante des GTPUmsatzes liegt dabei bei 0,47s-1. Interessanterweise ist jedoch die nachfolgende GDPHydrolyse schneller und die ermittelte Geschwindigkeitskonstante liegt hier bei 2,2s-1
(Kunzelmann et al., 2006). Eine mögliche Begründung für den, im Vergleich zur GDPHydrolyse, langsameren GTP-Umsatz könnte in der Konformationsänderung im Zuge der
Tetramerisierung liegen.
- 105 -
Diskussion
A
B
α12-13
90°
α12-13
Abbildung 4-4: Bänderdarstellung des dimeren hGBP1.
Durch die Überlagerung der Dimerstruktur der isolierten LG-Domänen im Komplex mit GppNHp
(PDB: 2bc9) und jeweils einer hGBP1 full length Struktur entsteht ein full length-dimer Modell.
(A) Das resultierende Modell zeigt ein gestrecktes Dimer, bei dem die helikale Domänen
voneinander weg zeigen und eine gewinkelte Konformation einnehmen.
(B) Dreht man das Molekül um 90°, wird deutlich dass die Helices α12-13 an entgegen gesetzten
Seiten zueinander liegen und für eine Tetramerisierung an den Helices α12-13 eine Erhöhung der
Beweglichkeit notwendig ist.
Möglicherweise besteht die Konformationsänderung nicht nur aus der Neuausrichtung von
α4´, denn ein weiteres Problem stellt die gewinkelte Konformation des LG-DomänenDimers dar (Abbildung 4-4 A). Nach Analyse der Daten aus den mT-Jump-Messungen
erfolgt die Tetramerisierung sowohl über α12-13 als auch über die LG-Domäne des
Interaktionspartners. Diese Art der Interaktion ist aber bei dieser gewinkelten
Dimerstellung nicht möglich und könnte bedeuten, dass die Konformationsänderung im
Übergangszustand der Hydrolyse nicht nur die Helix α4´ betrifft, sondern zusätzlich der
Winkel vergrößert wird. Jedoch konnte diese These anhand der Daten dieser Arbeit nicht
bewiesen werden.
- 106 -
Diskussion
= GTP
α12-13
α7-13
LG-Domäne
α4/
= Phosphat
Im nukleotidfreien, GMP- und
GDP-gebundenen Zustand liegt
hGBP1 als Monomer vor.
GTP-Bindung
Die Bindung von GTP, nicht aber
GDP oder GMP induziert eine
Dimerisierung, bei der die LGDomänen das Interface stellen. Die
Proteine nehmen dabei eine
gewinkelte Konformation ein.
Dimerisierung
GTP-Hydrolyse
GTP-Hydrolyse
A
Tetramerisierung
B
Die Hydrolyse von GTP zu GDP induziert
Konformationsänderungen: Die Helix α4´wird in
ihrer Position so verändert, dass die
elektrostatische Interaktion zur LG-Domäne
abbricht. Dadurch lösen sich die Helices α12-13
von der LG-Domäne und eine Interaktion mit
einem anderen dimeren hGBP1 an den helikalen
Domänen kann erfolgen. Für diese helikale
Assoziation
gibt
es
zwei
denkbare
Möglichkeiten. (A) Zum einen könnte es eine
reine coiled-coil-Interaktion der Helices α12-13
geben. Dabei erhalten die Proteine ihre
gewinkelte Ausrichtung.
(B) Die zweite Möglichkeit ist, dass neben der
helikalen
coiled-coil-Interaktion,
ein
interrmolekularer Kontakt zwischen der α12-13
und der LG-Domäne der Interaktionspartner
zustande kommt. Dafür müsste sich aber der
Winkel des Dimers vergrößern und sich das
Molekül „strecken“.
Bei Messungen an der mT-Jump-Apparatur
zeigte sich, dass die Tetramerisierung sowohl
über die α12-13 als auch die LG-Domäne
erfolgt. Dieses Ergebnis spricht für das Modell
der Winkelvergrößerung, muss aber noch durch
weitere Experimente bestätigt werden.
- 107 -
Tetramerisierung
Diskussion
Das Oligomerisierungsverhalten von hGBP2 unterscheidet sich zu
dem von hGBP1
Die Analyse des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP2 zeigte ein
verändertes Bild im Vergleich zu hGBP1. Der hydrodynamische Radius von hGBP2 im
Komplex mit GppNHp zeigt keine signifikante Änderung zum nukleotidfreien Protein. Im
Gegensatz zum hGBP1, welches im Komplex mit GppNHp an den LG-Domänen
dimerisiert, ist hGBP2 sowohl im nukleotidfreien als auch im Komplex mit GppNHp
Monomer. Obwohl die beiden Proteine gerade in der LG-Domäne eine sehr hohe
Aminosäurenidentität besitzen, gibt es Unterschiede in wichtigen Aminosäuren, welche in
hGBP1 die Dimer Interaktionsfläche bilden (Dissertation A. Ghosh, 2004). Vor allen das
R240 und das R244 aus der Guaninkappe, welche im hGBP1 den Hauptbeitrag zur
Affinität des Dimers liefern (Dissertation, S. Kunzelmann; 2006), sind im hGBP2
verändert. Das R240 aus hGBP1 ist im hGBP2 ein Tryptophan und das R244 und R245
liegen im hGBP2 als Lysine vor.
Im Komplex mit GDP*AlFx liegt hGBP2 in einem höheren oligomeren Zustand vor. Im
Vergleich mit hGBP1 liegt der hydrodynamische Radius bei hGBP2 in einem Bereich
zwischen einem Dimer und einem Tetramer. Da aber nichts über die Faltung des Proteins
bekannt ist, kann nicht eindeutig bestimmt werden, wie viele monomere Einheiten in die
Assemblierung involviert sind.
Dieser Unterschied in der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 weist auf
Unterschiede in der Biochemie zwischen hGBP1 und hGBP2 hin. Bei hGBP1 folgt auf die
Bindung von GTP die Dimerisierung an den LG-Domänen und eine damit verbundene
Beschleunigung der GTP-Spaltung (Ghosh et al., 2006). Das hGBP2 dagegen ist nach
Nukleotidbindung weiterhin Monomer, was bedeutet, dass die Beschleunigung der
Hydrolyse durch einen anderen Mechanismus als bei hGBP1 hervorgerufen wird, da auch
die hGBP2-Hydrolyse einen kooperativen Verlauf hat. Beim Vergleich der apparenten
Dissoziationskonstanten der Dimerisierung liegt der Kdapp von hGBP2 mit 0,76µM
deutlich über den von hGBP1 mit 0,032µM.
Die Messung der nukleotidabhängigen Oligomerisierung von hGBP2 zeigte in einer
früheren Arbeit ein anderes Bild (Dissertation A. Ghosh, 2004). Dabei liegt hGBP2
nukleotidfrei zwar als Monomer vor, aber dimerisierte im Komplex mit GppNHp bzw.
GDP*AlFx. Der Grund für diese Unterschiede ist nicht bekannt.
- 108 -
Diskussion
Auch die konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse macht die unterschiedliche
Biochemie zwischen hGBP1 und hGBP2 deutlich. Zwar weisen die maximalen GTPaseAktivitäten kaum Unterschiede auf, jedoch konnte GMP bei 25°C nicht als Produkt
nachgewiesen werden. Als Hauptprodukt konnte ausschließlich GDP detektiert werden. In
früheren Arbeiten konnte bei der konzentrationsabhängigen GTP-Hydrolyse bei 37°C eine
geringe GMP Produktion nachgewiesen werden (Neun et al., 1996). Das könnte bedeuten,
dass die GMP Produktion stark temperaturabhängig ist. Interessanterweise konnten bei
Messungen mit der isolierten LG-Domänen von hGBP2 bei 37°C keine Produktion von
GMP festgestellt werden (Dissertation, Ghosh, 2004).
Ein weiterer Unterschied zwischen hGBP1 und hGBP2 ist bei den Messungen der mantNukleotid-Affinitäten zu beobachten. Dabei sind bei hGBP2, mGDP und mGppNHp um
eine Größenordung fester gebunden als bei hGBP1. Dagegen bindet mGMP bei beiden
Proteinen mit derselben Affinität. Die Ergebnisse der mant-Nukleotidaffinitäten stimmen
mit den Messungen überein, die A. Ghosh bereits im Rahmen seiner Dissertation
vorgenommen hat.
Die helikale Domäne von hGBP1 interagiert mit hGBP2
Die Sequenzanalyse zwischen hGBP1 und hGBP2 zeigt eine Sequenzidentität von ca. 77%
(Olszewski et al., 2006). Die größte Sequenzidentität liegt dabei in der LG-Domäne (82%).
Dagegen zeigen die C-terminalen Bereiche eine geringe Homologie. In dieser Arbeit
konnte nicht nur gezeigt werden, dass hGBP1 mit hGBP2 interagiert, sondern auch dass
diese Interaktion über die helikale Domäne von hGBP1 vermittelt wird. Interessanterweise
findet eine Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2 im Übergangszustand der GTPHydrolyse statt, welcher durch den Komplex mit GDP*AlFx induziert wird. Die Bindung
von
GppNHp
zeigt
dagegen
in
FRET-Messungen
keine
Veränderung
der
Akzeptorfluoreszenz und damit auch keine Interaktion zwischen den Proteinen. Diese
Beobachtung stellt einen Unterschied zu der Homooligomerisierung von hGBP1 dar, das
bei Bindung von GppNHp über die LG-Domänen dimerisiert. Möglicherweise ist eine
Interaktion an der LG-Domäne zwischen hGBP1 und hGBP2 nicht möglich.
- 109 -
Zusammenfasung
Denn trotz der großen Homologie zwischen den LG-Domänen sind gerade die
Aminosäuren die in der hGBP1 Dimerisierung den größten Beitrag leisten, im hGBP2
verändert. Das R240 aus hGBP1 ist im hGBP2 ein Tryptophan und das R244 und R245
liegen im hGBP2 als Lysine vor.
Es ist zu berücksichtigen, dass bei Verwendung von GDP*AlFx dauerhaft ein Zustand
dargestellt wird, der bei der Hydrolyse von GTP sehr kurzlebig ist. Um zu zeigen, dass
dieser Zustand während der GTP-Hydrolyse lang genug anhält, damit die Interaktion
zustande kommt, wurde der Versuch zeitabhängig unter multi turnover Bedingungen mit
GTP durchgeführt. Nach der Zugabe des GTP ist eine Zunahme der Akzeptorfluoreszenz
zu beobachten, die nur durch die Interaktion von hGBP1 und hGBP2 erfolgen kann.
5
Zusammenfassung
Die Selbstassemblierung von Proteinen der Dynamin Familie ist ein wichtiger Bestandteil
ihrer Funktion. In vorangegangenen Arbeiten konnte bereits für das hGBP1 eine
Assemblierung zu einem dimeren Komplex beobachtet werden, die eine starke
Beschleunigung der Hydrolyse zur Folge hat. Des Weiteren konnte auch die
Oligomerisierung zu einem tetrameren Komplex gezeigt werden, in der die Helices α12/13
als Interaktionsdomäne dienten.
Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten die
Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen Subdomäne
α12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Diese Arbeit beschäftigt sich ebenfalls mit
der biochemischen Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine
Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2.
In einer detaillierten Betrachtung der full length Struktur von hGBP1 ist zu erkennen, dass
die Helix α4´ aus der LG-Domäne mit den Helices α12-13 interagiert. Diese Interaktion
zwischen der LG-Domäne und dem C-Terminus ist ein elektrostatischer Kontakt
bestehend aus einem Lysin (K228) und einem Arginin (R227) auf Seiten der Helix α4´ und
mehreren Glutaminsäuren (E563, E568, E556 und E575) auf Seiten von α12-13. Durch die
Bindung von GDP*AlFx durch den Wildtyp erfolgt die Tetramerisierung des Proteins.
Aufgrund einer Konformationsänderung, bei der sich die Helix α4´ verschiebt, wird beim
Wildtyp die elektrostatische Interaktionen zwischen der LG-Domäne und der Subdomäne
- 110 -
Zusammenfasung
α12-13 gelöst. Dadurch stehen die Helices α12-13 als Interaktionsdomäne zur Verfügung.
Um diese These zu stützen, wurde in dieser Arbeit erfolgreich eine Mutation in hGBP1
eingefügt (R227E/K228E), die diese elektrostatische Interaktion dauerhaft unterbricht. Das
hat zur Folge, dass diese Mutante in nukleotidfreier Form bereits als helikal assoziiertes
Dimer vorliegt. Die Bindung des nicht hydrolysierbaren GTP Analogon GppNHp bewirkt
die Assemblierung zu einem Tetramer, was beim Wildtyp nur im Komplex mit GDP*AlFx
geschieht.
Durch
die
Unterbrechung
des
elektrostatischen
Kontakts
ist
die
Konformationsänderung der α4´nicht mehr notwendig und die Helices α12-13 stehen
dauerhaft für eine Interaktion zur Verfügung. Somit kann bereits im nukleotidfreien
Zustand eine Assemblierung an der helikalen Domäne stattfinden. Dadurch konnte gezeigt
werden, dass diese elektrostatische Interaktion verantwortlich für eine Weiterleitung der
Information der GTP Hydrolyse an die helikale Domäne ist.
Diese Unterbrechung des elektrostatischen Kontakts zeigt auch einen Einfluss auf die
Nukleotid-Hydrolyse. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hydrolysegeschwindigkeit
zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Dabei ist zwar die maximale Hydrolysegeschwindigkeit
der Mutante dem Wildtyp sehr ähnlich, jedoch besitzt sie schon bei geringen
Proteinkonzentrationen eine relativ hohe Aktivität.
Bei der Deletionsmutanten 1-481, aber auch bei den isolierten LG-Domänen konnte die
Bindung und Umsetzung von GDP festgestellt werden (Kunzelmann 2006, Ghosh et al.,
2006). Diese veränderte Substratspezifität konnte auch bei der Punktmutante R227E und
bei der Doppelmutante R227E/K228E beobachtet werden. Jedoch ist die GDP
Hydrolysegeschwindigkeit dieser Mutanten 10mal kleiner als die der Deletionsmutante
1-481, zeigt aber den Einfluss der α12-13 im Bezug auf die Substratspezifität.
Um die Interaktion an der helikalen Domäne untersuchen zu können, wurden zusätzlich
zur Doppelmutante R227E/K228E unterschiedliche Deletionsmutanten hergestellt und
hinsichtlich ihrer Affinität an der mT-Jump-Apparatur analysiert. Dabei zeigte sich, dass
die Tetramerisierung nicht nur über die Subdomäne α12/13 vermittelt wird. Bei der
zusätzlichen Anwesenheit von weiteren Domänen (α7-11 bzw. LG-Domäne), sind die
Affinitäten um bis zu einer Größenordnung höher.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der biochemischen und
biophysikalischen Charakterisierung von hGBP2. Im Gegensatz zur GTP-Hydrolyse durch
hGBP1 ist bei der Hydrolyse durch hGBP2 GDP das Hauptprodukt. Die Produktion von
GMP konnte nicht festgestellt werden. Auch in der nukleotidabhängigen Oligomerisierung
konnten Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. In Gegenwart von GppNHp liegt
- 111 -
Zusammenfasung
hGBP2 als Monomer vor, während für hGBP1 eine Dimerisierung in Gegenwart von
GppNHp beschrieben wird. Dagegen liegt hGBP2 im Komplex mit GDP*AlFx in einem
oligomeren Zustand vor, welcher im Vergleich zum hGBP1 einem Trimer entspricht.
Die GTP-Hydrolyse von hGBP2 ist wie die von hGBP1 kooperativ. Die maximale
spezifische Aktivität von 15 min-1 bei sättigenden Proteinkonzentrationen ist allerdings
niedriger als die von hGBP1 (22,8 min-1).
Unter Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine konnte eine Interaktion zwischen
hGBP1 und hGBP2 nachgewiesen werden. Diese Interaktion wird über die α12-13 von
hGBP1 vermittelt.
- 112 -
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- 122 -
7 Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
µl
µM
A
Amp
APS
bp
BSA
bzw.
C
C-Terminus
DMSO
DNA
DNase
DTE
E. coli
EDTA
ER
FPLC
FRET
g
G
GAP
GBP
GDI
GDP
GEF
Gl.
GMP
GppNHp
GSH
GTP
h
HPLC
IPTG
ITC
kb
KD
kDa
kJ
LB
min
mM
nm
Mikroliter
mikromolar
Adenin
Ampicillin
Ammoniumperoxodisulfat
Basenpaar
bovine serum albumine
beziehungsweise
Cystein
Carboxyterminus
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonucleinsäure
Desoxyribonuklease
Dithioerythritol
Escherichia coli
Ethylendiamintetraacetat
Endoplasmatisches Retikulum
Fast Performance Liquid Chromatography
Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
Gramm, Erdbeschleunigung
Guanin
GTPase Aktivierendes Protein
Guanylat-bindendes Protein
Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor
Guanosindiphosphat
Guaninnukleotid Austauschfaktor
Gleichung
Guanosinmonophosphat
Guanosin-[β/γ-imido]-triphosphat
reduziertes Glutathion
Guanosintriphosphat
Stunde
High Performance Liquid Chromatography
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
isothermes Titrationskalorimeter
Kilobasenpaar
Gleichgewichtskonstante der Dissoziation
Kilodalton
Kilojoule
Luria Bertani
Minute
millimolar
Nanometer
- 123 -
Anhang
NMR
nt
NTA
N-Terminus
OD
PAGE
PCR
PEG
Pi
PMSF
RNA
rpm
RT
s
SDS
T
Tab.
TBA
TBK
TEMED
Tris
Units / U
UV
V
XTP
dNTP
S
Å
Kernspinresonanz
Nukleotide
Nitrilotriacetat
Aminoterminus
Optische Dichte
Polyarcrylamidgelelektrophorese
Polymerase Chain Reaction
Polyethylenglycol
Orthophosphat
Phenylmethylsulfonylfluorid
Ribonucleinsäure
Umdrehungen pro Minute
Raumtemperatur
Sekunde
Sodiumdodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
Tymidin
Tabelle
Tetrabutylammoniumbromid
Triethylammonium-Bikarbonat
N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin
Trishydroxymethylaminomethan
enzymatische Aktivität
Ultraviolett
Volt
Xanthosintriphosphat
2‘-Desoxinukleosid-5‘-triphosphat
Svedbergeinheit 1 S = 10-13 s
Angström (1Å = 1 • 10 −10 nm)
Für die Aminosäuren wurde der Ein- und Dreibuchstabencode verwendet:
A
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
x
Ala
Alanin
Asn Asparagin
Pro
Prolin
Gln Glutamin
Arg Arginin
Ser
Serin
Thr
Threonin
Val
Valin
Trp
Tryptophan
Tyr
Tyrosin
beliebige AS
M
C
D
E
F
G
H
I
K
L
Met
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
- 124 -
Methionin
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Lysin
Leucin
Anhang
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1-1: Humanes Interferon-γ
Abbildung 1-2: JAK-STAT-Signalweg.
Abbildung 1-3: GTPase-Zyklus von Ras.
Abbildung 1-4: Elektronenmikroskopische Aufnahme der Ringbildung um Lipidnanoröhren.
Abbildung 1-5: Kristallstruktur der GTPase-Domäne von Dynamin A.
Abbildung 1-6: Anordnung der Domänen von Dynamin
Abbildung 1-7: Kristallstruktur des dimeren BDLP in GDP-gebundenem Zustand.
Abbildung 1-8: Gegenwärtiges Modell der MxA Aktivität.
Abbildung 1-9: Sequenzvergleich der sieben humanen GBP´s.
Abbildung 1-10: Darstellung der Kristallstruktur von hGBP1 im Bändermodell.
Abbildung 1-11: Interaktion des Cteminalen Helixmotiv α12/13 mit der Helikalen- und LGDomäne.
Abbildung 1-12: Kristallstruktur des LG-Domänen Dimers in GppNHp-gebundener Form.
Abbildung 1-13: Reaktionsmodell der Nukleotidhydrolyse durch hGBP1.
Abbildung 3-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1.
Abbildung 3-2: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13.
Abbildung 3-3: Darstellung des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13
vor und nach Konformationsänderung von α4´.
Abbildung 3-4: Darstellung des Oberflächenmodells von hGBP1.
Abbildung 3-5: Dynamische Lichtstreuung von hGBP1 und Mutanten.
Abbildung 3-6: Kalibrierung der analytischen Größenausschlusschromatographiesäule.
Abbildung 3-7: Analytische Größenausschlusschromatographie vom hGBP1 Wildtyp.
Abbildung 3-8: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante hGBP1
R227E/K228E.
Abbildung 3-9: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R227E.
Abbildung 3-10: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante R228E.
Abbildung 3-11: Analytische Größenausschlusschromatographie der Mutante E563R.
Abbildung 3-12: Bestimmung der mant-Nukleotidaffinitäten durch Fluoreszenztitrationen.
Abbildung 3-13: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1wt und hGBP1
R227E/K228E
Abbildung 3-14: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von hGBP1 R227E/K228E.
Abbildung 3-15: Konzentrationsabhängigkeit der GTP-Hydrolyse von verschiedenen
hGBP1 Mutanten.
Abbildung 3-16: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E/K228E.
Abbildung 3-17: GDPase-Aktivität von hGBP1 R227E.
Abbildung 3-18: Position der Cysteine innerhalb der hGBP1 Struktur.
Abbildung 3-19: Kinetik der Dimerisierung von hGBP1 α7-13 und hGBP1 R227E/K228E.
Abbildung 3-20:Analyse der Homodimerisierung von hGBP1 α12-13 und hGBP1 α7-13
durch die Temperatursprung-Methode.
Abbildung 3-21: Integrität der isolierten Gesamt-RNA aus INF-γ induzierten HUVECs.
Abbildung 3-22: Nukleotidabhängige Oligomerisierung von hGBP1 und hGBP2.
Abbildung 3-23: Konzentrationsabhängige Nukleotidhydrolyse von hGBP2.
Abbildung 3-24: Kinetik der Assoziation von mant-Nukleotiden.
Abbildung 3-25: Fluoreszenztitration von mant-Nukleotiden mit hGBP2.
Abbildung 3-26: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart
unterschiedlicher Nukleotide.
Abbildung 3-27: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-eCFP in Gegenwart von GTP.
Abbildung 3-28: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1 Deletionsmutante α7-13-eCFP
in Gegenwart unterschiedlicher Nukleotide.
Abbildung 3-29: FRET zwischen hGBP2-eYFP und hGBP1-α7-13-eCFP in Gegenwart von
GTP.
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Abbildung 4-1: Konformationsänderung der LG-Domäne von hGBP1
93
Abbildung 4-2: Detailansicht des elektrostatischen Kontakts zwischen LG-Domäne und α12-13 94
Abbildung 4-3: Sequenzvergleich der humanen GBP´s 1-7.
103
Abbildung 4-4: Bänderdarstellung des dimeren hGBP1.
106
- 125 -
Anhang
7.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 3-1: Zusammenfassung der DLS-Ergebnisse von hGBP1 und Mutanten.
Tabelle 3-2: Gleichgewichtskonstanten von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Tabelle 3-3: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Tabelle 3-4: Konzentrationsabhängige Hydrolyse von hGBP1 und Mutanten des hGBP1.
Tabelle 3-5: Effizienz der Kupplung von Fluoreszenzmarkern an hGBP1 Deletions- und
Punktmutanten.
Tabelle 3-6: Gleichgewichts- und Geschwindigkeitskonstanten der Assemblierung an der
helikalen Domäne.
Tabelle 3-7: Kinetik der Bindung von mant-Nukleotiden an hGBP1 und Mutanten.
Tabelle 4-1: Übersicht des nukleotidabhängigen Oligomerisierungsverhalten von hGBP1 und
Mutanten.
Tabelle 4-2: Prozentualer Vergleich der Primärsequenzidentität.
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Anhang
Danksagung
Zum Abschluss möchte ich mich noch bei all jenen bedanken die zum Gelingen
dieser Arbeit beigetragen haben.
Bei Prof. Dr. Christian Herrmann für die Möglichkeit in seiner Abteilung an
diesem spannenden Forschungsthema arbeiten zu dürfen. Danke auch für die
hervorragende Betreuung, die stetig offene Tür und die vielen konstruktiven
Gespräche.
Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Prof. Weingärtner für die Bereitschaft das
Zweitgutachten zu übernehmen.
Ein großer Dank gilt der gesamten Arbeitsgruppe für die unzähligen gemeinsamen
Stunden im Labor und den vielen interessanten Diskussionen. Allen voran Agne,
Andy, Christine B., Christine D., Cihan, Daniel, Diana, Klaus, Maik, Mark,
Nadine, Semra, Tobias und Herrn Hostmeier. Euch allen wünsche ich viel Erfolg
in eurem weiteren wissenschaftlichen Werdegang.
Ein spezieller Dank gilt noch Semra Ince und Christine Dovengerds für die
vielfältige Unterstützung meiner Arbeit im Labor. Christine Bee, Mark Wehner
und Tobias Vöpel danke ich für das Korrekturlesen meiner Arbeit.
Ich möchte mich auch bei Prof. Michael Stürzl, Dr. Michael Bauer und Dr. Philipp
Tripal (Universität Erlangen-Nürnberg) für das zur Verfügung stellen der HUVECmRNA bedanken. Danke auch für die mir entgegen gebrachte Gastfreundschaft
und die interessanten Einblicke in die Zellbiologie.
Mein ganz persönlicher Dank gilt meiner Familie. Ohne eure Unterstützung wäre
ich nie so Weit gekommen. Besonders dir Steffi danke ich für alles!
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LEBENSLAUF
Adrian Syguda
Richard-Strauss Allee 1
42289 Wuppertal
Geburtsdatum:
21. Juni 1977
Geburtsort:
Kattowitz (Polen)
Familienstand:
verheiratet
Staatsangehörigkeit:
deutsch
1984 - 1988
Städt. Gemeinschaftsgrundschule Einern in Wuppertal
1988 - 1990
Städt. Realschule im Schulzentrum Ost in Wuppertal
1990 - 1994
Städt. Hauptschule Wichlinghausen-Süd in Wuppertal
1994 - 1997
Gesamtschule Wuppertal-Langerfeld
28. Mai 1997
Allgemeine Hochschulreife
1998 - 2004
Studium der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum
Jan.2004 – Jul. 2004
Diplom an der Ruhr-Universität Bochum am Lehrstuhl für
Physikalische Chemie I, AG Proteininteraktionen
bei Prof. Dr. Chr. Herrmann
Titel: Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung
des dimeren hGBP1
13.07.2004
Abschluss: Diplom Biochemiker
Sep. 2004 – Jul. 2008
Promotion an der Ruhr-Universität Bochum am Lehrstuhl
für Physikalische Chemie I, AG Proteininteraktionen bei
Prof. Dr. Chr. Herrmann
Titel: Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung
der Oligomerisierung des humanen Guanylat-bindenden
Protein 1
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