Die Rolle von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des St. Josef-Hospitals - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger Die Rolle von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae bei Kindern mit chronischen Atemwegserkrankungen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität- Bochum vorgelegt von Corinna Hedwig Inge Schmidt aus Hagen 2008 Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. G. Muhr Prof. Dr. med. C. Rieger Prof. Dr. med. A. Bufe Tag der mündlichen Prüfung: 9.Dezember 2008 Abstract Schmidt Corinna Die Rolle von Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae bei Kindern mit chronischen Atemwegserkrankungen. Problem: Chlamydophila pneumoniae (CP) und Mycoplasma pneumoniae (MP) sind atypische Bakterien, die in der Pathogenese von chronischen Atemwegserkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Diese Studie untersucht, ob CP und MP bei Kindern mit Asthma bronchiale und chronisch eitrigen Bronchitiden nachweisbar sind und ob eine Infektion zu einer Veränderung der Lungenfunktion führt. Probanden und Methodik: Es wurden insgesamt 142 Proben von 80 Kindern im Alter von sechs bis sechzehn Jahren untersucht. Als Probenmaterial dienten Nasenbürstenabstriche sowie induziertes Sputum. Mittels nested PCR erfolgte eine Analyse der Proben auf CP und MP. Die Lungenfunktion wurde durch eine Spirometrie in einem Draeger Bodyplethysmographen über die Bestimmung der FEV1 und der VCmax ermittelt. Drei verschiedene Probandengruppen, darunter Kinder mit Asthma bronchiale (n=26), chronisch eitriger Bronchitis (n=12) und Lungengesunde (n=42), wurden in Bezug auf die Häufigkeit von CP und MP sowie auf Veränderungen der Lungenfunktion miteinander verglichen. Ergebnis: CP konnte bei 11% der an Asthma bronchiale erkrankten Kinder und 17% der Probanden mit chronisch eitrigen Bronchitiden nachgewiesen werden. Keiner der lungengesunden Probanden war positiv für CP (p=0,0021). MP war in 4 Proben (5,5%) der kranken Kinder nachweisbar, ebenfalls bei keinem Proband der Kontrollgruppe (p=0,1221). Ein Zusammenhang zwischen einem positiven Erregernachweis und einer verschlechterten Lungenfunktion konnte nicht festgestellt werden. Diskussion: Bisher wurde die Prävalenz von CP und MP mittels unterschiedlich sensitiver Nachweismethoden bei Erwachsenen mit COPD untersucht. Es gibt wenige Daten über den Nachweis und die Pathogenese von CP und MP bei Kindern. Unsere Untersuchung hat gezeigt, dass eine signifikant höhere Prävalenz der Erreger bei lungenkranken Kindern besteht, jedoch kein Zusammenhang mit einer verschlechterten Lungenfunktion. Außerdem konnte gezeigt werden, dass durch eine nicht-invasive Probengewinnung die atypischen Erreger isoliert werden können. Mittels dieser Methoden können Therapiekontrollen bei Interventionsstudien erfolgen. Meinen Eltern gewidmet Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung S. 1 1.1. Obstruktive Atemwegserkrankungen bei Kindern S. 1 1.1.1. Asthma bronchiale bei Kindern S. 1 1.1.2. Bronchiektasen S. 3 1.2. S. 4 Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumonie 1.2.1. Chlamydophila pneumoniae S. 4 1.2.2. Mycoplasma pneumoniae S. 7 1.3. Fragestellung und Zielsetzung S. 10 2. Probanden und Methodik S. 11 2.1. Probandenkollektiv S. 11 2.2. Erfasste Daten S. 12 2.3. Ausschlusskriterien S. 13 2.4. Durchführung des induzierten Sputums S. 14 2.5. Nasenschleimhautabstrich S. 14 2.6. Aufbereitung der Proben und Analyse mittels PCR S. 15 2.6.1. Extraktion von Mycoplasma pneumoniae DNA S. 15 2.6.2. Extraktion von Chlamydophila pneumoniae DNA S. 16 2.7. Statistik S. 18 3. Ergebnis S. 19 3.1. Ergebnis der Lungenfunktionsprüfung S. 20 3.2. Nachweis von Chlamydophila pneumoniae S. 21 3.2.1. Unterschiede der Lungenfunktion unter den Atemwegskranken S. 22 3.3. Nachweis von Mycoplasma pneumoniae S. 22 3.3.1. Unterschiede der Lungenfunktion unter den Atemwegskranken S. 23 3.4. Zusammenfassung der Ergebnisse S. 24 I 4. Diskussion S. 26 4.1. CP und MP bei Erwachsenen S. 27 4.2. CP und MP bei Kindern S. 29 4.3. Bewertung der erhobenen Daten S. 31 4.4. Diskussion der Studienergebnisse S. 32 5. Zusammenfassung S. 35 6. Literatur S. 38 II Abkürzungen: BAL Broncho-alveoläre Lavage BMI Body-mass-Index CFTR Cystic-fibrosis-transmenbrane-conductance-regulator COPD Chronisch obstruktive Lungenerkrankung CP Chlamydophila pneumoniae DNA Desoxy-Ribo-Nukleinsäure ELISA Enzyme-linked-immuno-assay FEV1 Forciertes exspiratosiches Volumen in der 1. Sekunde ISSAC International Study on Asthma an Atopy in children MOMP Major outer transmenbrane protein MEF Maximale exspiratorische Flussgeschwindigkeit bei 25% und 50% der Vitakapazität MP Mycoplasma pneumoniae m/w männlich/weiblich NaCl Natrium Chlorid PCR Polymerase-Ketten-Reaktion RNA Ribonukleinsäure RSV Respiratory-Syncytial Virus SD (engl.) Standardabweichung VC Vitalkapazität III 1. Einleitung 1.1. Obstruktive Atemwegserkrankungen bei Kindern 1.1.1. Asthma bronchiale bei Kindern Als Asthma bronchiale bezeichnet man eine episodisch auftretende Symptomatik mit Pfeifen oder Husten, hervorgerufen durch eine chronische Entzündung und Obstruktion der Bronchialschleimhaut (Riedel, 2004). In Mitteleuropa liegt die Prävalenz unter Kindern bei ca.10% (Asher et al., 2006). Man unterteilt die Erkrankung in drei Formen, das atopische/extrinsische Asthma, das nicht-atopische/intrinsische Asthma und eine Mischform. Pathogenetisch liegt bei allen drei Formen eine chronische Entzündung der Bronchialschleimhaut zu Grunde. In der Schleimhaut zeigen sich Entzündungszellen wie Mastzellen, Eosinophile und Lymphozyten sowie eine Veränderung des Bronchialwandaufbaus. Diese Veränderungen führen zur einer Hyper- und Dyskrinie mit einer reversiblen Symptomatik, die tageszeitlichen Schwankungen unterliegen kann. Das nicht-atopische Asthma kann durch Infektionen, körperliche Anstrengung, chemisch-toxische Stoffe, z.B. Ozon, gastroösophagealen Reflux und pseudoallergische Reaktionen auf Analgetika ausgelöst werden. In vielen Fällen kann keine Ursache gefunden werden. Als atopisches oder extrinsisches Asthma bezeichnet man die Manifestationsform, die durch Allergene wie Pollen, Hausstaubmilben, Pilze und Tierproteine hervorgerufen wird. Diese Form macht den größten Teil der kindlichen Asthmaanfälle aus, wobei auch in diesen Fällen nichtallergische Faktoren eine wichtige Rolle als Auslöser der Krankheitssymptome spielen. 1 Bei allen Asthmaformen können Exazerbationen durch virale und seltener bakterielle Infekte der oberen Atemwege ausgelöst werden. Hierbei spielen als Erreger vor allem Parainfluenzaviren, Adenoviren, RespiratorySyncytial-Viren (RSV) und Rhinoviren eine Rolle. Auch Chlamydophila pneumoniae (CP) und Mycoplasma pneumoniae (MP) können zu einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufes führen (Johnston and Martin, 2005) Die Diagnosestellung des Asthmas erfolgt neben Anamnese und klinischer Untersuchung durch die Lungenfunktionsprüfung mittels Spirometrie und Bodyplethysmographie. Letztere dient ebenfalls der Verlaufskontrolle. Der klinisch wichtigste Parameter zur Beurteilung der obstruktiven Ventilationsstörung ist das forcierte exspiratorische Volumen in der ersten Sekunde (FEV1) als Parameter der zentralen Atemwege und die maximalen exspiratorischen Flussgeschwindigkeiten bei 25% bzw. 50% der Vitalkapazität (MEF 25 bzw. 50) als Parameter der mittleren und kleinen Bronchien. Eine kausale Therapie der chronischen Erkrankung ist nur bedingt durch Meidung des auslösenden Agens möglich. Die symptomatische Therapie erfolgt nach dem Stufenplan der deutschen Atemwegsliga (Buhl et al., 2006). Die Therapie soll eine Verringerung der chronischen Entzündungsaktivität durch inhalative, seltener systemische Steroide, Mastzellstabilisatoren und Leukotrienantagonisten herbeiführen. Bei einer akuten Exazerbation kommen zusätzlich bronchodilatatorische Medikamente, insbesondere inhalative Beta-2-Sympathomimetika, zum Einsatz. Antibiotika spielen eine untergeordnete Rolle. Physikalische Maßnahmen wie Atemschulung sind ebenfalls wichtig. 2 1.1.2. Bronchiektasen Als Bronchiektasen werden irreversible Aussackungen der mittelgroßen Bronchien durch eine chronische, eitrige Entzündung bezeichnet (King et al., 2006). Bronchiektasen treten vor allem bei Patienten mit humoralen Immundefekten, primärer Ziliendyskinesie und zystischer Fibrose auf. Häufig kann keine Ursache der Erkrankung diagnostiziert werden. Schwere oder unzureichend behandelte, bronchiale Infektionen, z.B. durch Mycoplasmen, Masern, Tuberkulose oder Pertussis liegen diesen idiopathischen Formen häufig zu Grunde. Die zystische Fibrose, auch Mukoviszidose genannt, ist eine der häufigsten angeborenen Erkrankungen in Nord- und Mitteleuropa, bei der es zur Bildung von Bronchiektasen kommt (Tümmler, 2004). Es handelt sich um eine autosomal-rezessive Erbkrankheit, bei der durch einen Defekt des cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator-(CFTR)-Gen ein wichtiger Chloridkanal in der apikalen Epithelmembran der Bronchien fehlt oder unzureichend arbeitet. Dieses führt zur Bildung zähen Schleims in vielen exokrinen Drüsen. Die Mukoviszidose tritt mit einer Inzidenz von 1:3000 Neugeborenen bei Mitteleuropäern auf. Die Heterozygotenhäufigkeit liegt bei 1:25. Das Gen wird auf dem langen Arm des Chromosoms Nr.7 (7q31,2) codiert. Es sind über 1500 CFTR Mutationen bekannt (Cystic Fibrosis Mutation Database, 2008), wovon die homozygote Mutation Delta-F-508 bei Patienten mitteleuropäischer Herkunft die häufigste ist. Besonders betroffen sind das Bronchialsystem, Pankreas, Gallenwege, Gonaden und Schweißdrüsen. Durch die damit verbundene, eingeschränkte Funktion der Organe kommt es zu unterschiedlichen Komplikationen. Im Bereich des Respirationstraktes spielen Infektionen mit pyogenen Keimen eine große Rolle. Neben Staphylococcus aureus und Haemophilus influenza lässt sich vor allem 3 Pseudomonas aeruginosa nachweisen (Lyczak et al., 2002). Durch die chronische Entzündung kommt es zur Ausbildung von Bronchiektasen mit einer zunehmenden Zerstörung des Lungengewebes, die schließlich zur respiratorischen Insuffizienz führt. Zur Diagnostik der zystischen Fibrose steht neben der Genanalyse die Iontophorese als einfache, physikalische Methode im Vordergrund. Hierbei wird mittels Pilocarpin in einem kleinen Hautareal die Schweißproduktion angeregt und der Chloridgehalt im Schweiß bestimmt. Ist der Wert erhöht, liegt mit hoher Wahrscheinlichkeit eine zystische Fibrose vor. Eine kausale Therapie der Erkrankung steht zur Zeit noch nicht zur Verfügung. Wichtigste symptomatische Maßnahmen im Bereich der Atemwege sind medikamentöse und physikalische Sekretolyse und die rechtzeitige antibiotische Therapie. Substitution von Pankreasenzymen, Vitaminen und hochkalorische Kost sollen die Maldigestion ausgleichen. Im Verlauf können eine Sauerstoff-Langzeittherapie und eine Lungentransplantation notwendig werden. 1.2. Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae Sowohl bei Asthma bronchiale als auch bei chronisch eitrigen Bronchitiden, wie der Mukoviszidose, spielen atypische Erreger als Ursache für Exazerbationen eine Rolle. Hierzu gehören Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae. 1.2.1. Chlamydophila pneumoniae Bei Chlamydophila pneumoniae (CP) handelt es sich um einen obligat intrazellulär lebenden Erreger aus der Gruppe der Chlamydien, der akute Infektionen der oberen und unteren Atemwege, wie Pharyngitis, Bronchitis 4 und Pneumonien verursachen kann (Grayston et al., 1990). Chlamydien gehören aufgrund der Teilungsform und des Wandaufbaus zu den gramnegativen Bakterien. Zur Vermehrung benötigen sie aufgrund einer fehlenden, eigenen ATP-Synthese den intrazellulären Stoffwechsel des Wirts. Die Teilung findet in Form eines biphasischen Zyklus statt, der in die inaktive, extrazelluläre Form, das Elementarkörperchen, und die intrazelluläre, aktive Form, das Retikularkörperchen, aufgeteilt wird (Abbildung 1). Abbildung 1: Elektronenmikroskopisches Bild von Chlamydophila pneumoniae (A) und Chlamydia trachomatis (B) E: Elementarkörperchen; R: Retikularkörperchen; om: Außenmembran (Johnston and Martin, 2005) Die extrazelluläre Form, das Elementarkörperchen, kann über einen unbestimmten Zeitraum im Körper persistieren und neue Zellen infizieren. Die Übertragung von CP findet über Aerosole statt (Falsey et al., 1993). Der Erreger infiziert Zellen des Bronchialepithels und verursacht so eine ziliäre Dysfunktion (Shemer-Avni and Lieberman, 1995). In vitro Versuche zeigen, dass Chlamydien neben respiratorischem Epithel auch 5 Makrophagen, Endothelzellen und Zellen der glatten Muskulatur infizieren können (Gaydos et al., 1996). CP verursacht Tracheobronchitiden, Sinusitiden und atypische Pneumonien. Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung mit CP ist sehr hoch. Der erste Kontakt erfolgt oft schon im Schulkindesalter. Epidemiologische Daten bei Kindern im Alter von 10 Jahren haben in über 60% der Fälle eine Seropositivität für CP ergeben (Heiskanen-Kosma et al., 1999). Die Großzahl der Erkrankungen verläuft inapparent. Man geht davon aus, dass bei Erwachsenen 10% der ambulant erworbenen Pneumonien und 5% der Sinusitiden und Bronchitiden durch CP verursacht werden. Bei über 50% der Erwachsenen lassen sich Antikörper gegen CP nachweisen (Kuo et al., 1995). Neben Atemwegserkrankungen wird eine Infektion mit CP im Rahmen von Atherosklerose, Multipler Sklerose und chronischer Polyarthritis diskutiert (Klayoglu et al., 2002, Munger et al., 2003, Villareal et al., 2002). Speziell in der Pathogenese der Atherosklerose ist die Bedeutung einer Chlamydieninfektion seroepidemiologischen lange Zeit Studien untersucht konnte eine worden. In Assoziation großen zwischen Atherosklerose und CP gezeigt werden (Grayston, 2000). Zusätzlich konnte der atypische Erreger in Gefäßplaques mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nachgewiesen werden (Wohlschlaeger et al., 2005). Der Nachweis von CP ist aufgrund des biphasischen Zellzyklus und der Tendenz zur Persistenz der inaktiven Form sehr schwierig. Die Standardmethode, die auch in den meisten Studien verwendet wird, ist die serologische Bestimmung des Antikörpertiters. Eine kulturelle Anzüchtung wird aufgrund einer zu geringen Sensitivität nicht durchgeführt. Die serologische Methode der Wahl ist der Mikroimmunofloureszenz-Test, der einen spezifischen Nachweis von CP-Antikörpern in Abgrenzung zu anderen Chlamydien Subspezies ermöglicht. Die Interpretation der 6 einzelnen Antikörpertiter (IgG, IgM, IgA) ist sehr schwierig. Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung weisen z.B. häufig hohe IgGTiter auf, ohne dass eine Infektion vorliegt (Dowell, 2000). Im Gegensatz dazu sind bei Kindern oft noch keine serologischen Reaktionen in der Akutphase der CP-Infektion nachweisbar (Kuttlin et al., 1998). Der Nachweis von CP mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erweist sich im Gegensatz zur Serologie als sensitiver. Die bisher eingesetzten PCR untersuchen unterschiedliche Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenzen auf dem CP-Genom, wurden jedoch noch nicht in kontrollierten Studien miteinander verglichen. 1.2.2. Mycoplasma pneumoniae In die Gruppe der Mycoplasmen gehören rund 180 Subspezies. Es sind zellwandlose Bakterien, die über Aerosole übertragen werden. Der extrazelluläre Erreger benötigt den intrazellulären Stoffwechsel der Wirtszellen und tritt über spezielle Zellorganellen mit der Wirtzelle in Verbindung (Razin et al., 1998). Neben apathogenen Vertretern der Gruppe wie M. orale, M. salivarium, M. buccale, M. faucium, die zur normalen Flora der oberen Atemwege gehören, ist MP ein wichtiger pathogener Erreger, der für Infektionen der oberen und unteren Atemwege wie Pharyngitis, Tracheobronchitis und interstitielle Pneumonie verantwortlich sein kann. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass sich MP bei 1520% der ambulant erworbenen Pneumonien nachweisen lässt (Foy, 1993). Zusätzlich wird ein endemisches Auftreten von MP in zyklischen Abständen von 3-5 Jahren beschrieben (Lind et al., 1997). Die nicht endemisch auftretenden Infektionen betreffen vor allem Patienten im Kindes- und Jugendlichenalter. Hier lässt sich in 20-40% der Fälle MP als Ursache für eine ambulant erworbene Pneumonie nachweisen (Baer et 7 al., 2003, Esposito et al., 2000). Als weniger schwere Krankheitsbilder bei Kindern und Jugendlichen treten Tracheobronchitiden und Pharyngitiden auf (Esposito et al., 2002). Zusätzlich kann MP zahlreiche extrapulmonale Manifestationen hervorrufen, die sich begleitend oder unabhängig von einer pulmonalen Symptomatik manifestieren. Oft treten Erkrankungen des zentralen Nervensystems auf. Diese schließen unter anderem Polyradikulitis, Meningoenzephalitis, Neuritis nervi optici und Psychosen mit ein (Gilberg, 1980, Lin et al., 2002, Ponka, 1980). Enzephalitiden sind die häufigste Komplikation im Kindesalter (Koskiniemi, 1993). Klinisch ebenfalls relevant sind dermatologische Begleiterscheinungen wie makulopapulöse Exantheme (Cherry, 1993) und in seltenen Fällen schwere Verlaufsformen im Sinne eines Steven-Johnson Syndroms (Stutman, 1987). Kardiale Erkrankungen, hämolytische Anämien oder akute Glomerulonephritiden gehören zu den seltenen Erkrankungen, die durch MP hervorgerufen werden. Die Diagnose der extrapulmonalen Manifestationen während einer MP-Infektion war vor Einführung der PCR-Diagnostik sehr schwierig. Erst durch die PCR gelang der Erregernachweis in verschiedenen Geweben und Sekreten, wie Liquor, Synovialflüssigkeit oder Hautbiopsien. Der frühere Nachweis von MP mittels aufwendiger, kultureller Anzucht wird heute aufgrund der niedrigen Sensitivität und des großen Zeitaufwandes nicht mehr durchgeführt. Der serologische Nachweis einer MP-Infektion erfolgte früher mittels Komplementfixation. Diese Methode wurde jedoch nach Einführung des ELISA (enzyme-linked immunsorbent assay) verlassen. Erhöhte IgM-Titer stehen in der Routinediagnostik für eine akute oder abgelaufene MP-Infektion. Insbesondere bei Erwachsenen hat sich gezeigt, dass die IgM-Titer nicht immer bei einer akuten Infektion oder Reinfektion erhöht sein müssen. Daher ist der kombinierte Nachweis von IgM- und IgG-Titer notwendig. Ein erhöhter Titer >1:80 wird 8 gewöhnlich als Beweis einer akuten Infektion interpretiert. Die Verlaufskontrolle innerhalb von 2-3 Wochen ermöglicht eine weitergehende Einschätzung, ob es sich um eine akute oder abgelaufene Infektion handelt (Daxboeck et al., 2003). Durch die Verwendung der PCR kann zusätzlich der Nachweis des Erregers aus verschiedenen Geweben erfolgen. Es stehen verschiedene PCR zur Verfügung, die unterschiedliche Zielsequenzen im Bereich der MP-DNA (Desoxy-Ribo-Nukleinsäure) amplifizieren. Der Nachweis einer MP-Infektion mittels PCR kann bereits innerhalb eines Tages erfolgen und gelingt somit früher als der mit serologischen Methoden (Talkington et al., 1998). Ein Nachteil der PCRDiagnostik liegt in der fehlenden Differenzierung zwischen lebensfähigen und nicht mehr aktiven Bakterien. Neuere Ribonucleinsäure (RNA)basierte PCR-Methoden können diesbezüglich eine genauere Differenzierung liefern (Daxboeck et al., 2003). 9 1.3. Fragestellung und Zielsetzung Mit dieser Arbeit soll die Prävalenz von CP und MP bei chronisch atemwegskranken Kindern und einem lungengesunden Vergleichskollektiv bestimmt werden. Der Nachweis der Erreger erfolgte durch eine sensitive nested-PCR. Als Material dienten nichtinvasiv gewonnene Proben mittels induziertem Sputum und Nasenschleimhautabstrichen. Die Probanden wurden in einem klinisch stabilen Zustand ohne Anzeichen einer akuten Infektion untersucht. Folgende Fragen sollen geklärt werden: 1. Gelingt mittels nicht-invasiver Probengewinnung der Nachweis intrazellulärer Erreger (CP und MP) bei Kindern. 2. Besteht eine höhere Prävalenz von CP und MP unter chronisch atemwegskranken Kindern im Vergleich zu dem lungengesunden Kollektiv. 3. Gibt es einen Zusammenhang zwischen einer eingeschränkten Lungenfunktion und dem Nachweis von CP und MP. 10 2. Probanden und Methodik 2.1. Probandenkollektiv In die Studie wurden 80 Kinder im Alter von sechs bis sechzehn Jahren eingeschlossen, die sich in der Zeit von 1998 bis 2001 in der ambulanten oder stationären Behandlung der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin des St. Josef-Hospital der Ruhr-Universität Bochum befanden. Einige Kinder nahmen im Verlauf der Studie mehrfach an der Probengewinnung teil, jeweils in einem Abstand von mindestens einem halben Jahr. Die Probanden wurden mittels eines Anamnesebogens erfasst, der in Anlehnung an einen gut validierten Fragebogen einer internationalen epidemiologischen Studie zum kindlichen Asthma (International Study on Asthma and Atopy in childhood - ISAAC) erstellt wurde (Asher et al., 1995). Die Probanden wurden in drei Untergruppen aufgeteilt: 1. Kinder mit allergischem Asthma bronchiale; diese wurden aus der pulmologischen Ambulanz der Kinderklinik rekrutiert. Asthma bronchiale wurde bei Kindern mit rezidivierenden, obstruktiven Episoden in den vergangenen 12 Monaten diagnostiziert. Der Einschluss in die Studie als Proband erfolgte in einem klinisch stabilen Zustand ohne akute Exazerbation zum Zeitpunkt der Untersuchung 2. Kinder mit chronisch eitriger Bronchitis, darunter zystische Fibrose, primäre Ziliendyskinesie, Bronchiektasen und kindliche, chronische Bronchitis (COPD). Letztere wurde wie folgt definiert: Täglicher produktiver Husten über mehr als ein Jahr ohne Zeichen der Exazerbation zum Zeitpunkt der Untersuchung. 3. Anamnestisch lungengesunde Kinder, die sich aufgrund von Verhaltensstörungen, Diabetes mellitus, neurologischen Erkrankungen 11 wie Epilepsie, Brandverletzungen im Stadium der Vernarbung und einfachen Gastroenteritiden in der stationären oder ambulanten Behandlung befanden. Die Kinder wurden erst nach erziehungsberechtigten Person Einverständniserklärung untersucht. ausführlicher und Die nach Studie Aufklärung Unterschrift wurde der einer durch die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum geprüft und genehmigt. 2.2. Erfasste Daten Die erhobenen Daten umfassen 1) Alter, Geschlecht, Body-Mass-Index (BMI) (Tabelle 1) 2) Diagnostizierte Erkrankung, eingenommene Medikamente (z.B. inhalative oder systemische Kortikoide, Beta-Sympatomimetika, Mastzellstabilisatoren, Leukotrienantagonisten) (Tabelle 1) 3) Anamnese: Klinische Symptome wie Belastungsdyspnoe, Hustenund Auswurffrequenz 4) Spirometrisch erfasste Daten: Forcierte-exspiratorische Volumen in der ersten Sekunde (FEV1[%]/ Soll), Vitalkapazität (VC[%]/ Soll) 5) Nasenbürstenabstriche 6) Induziertes Sputum 7) Mittels PCR ermittelte mikrobiologische Befunde 12 Tabelle 1: Erhobene Daten Asthma Chronisch eitrige Gesunde Bonchitiden Kontrollgruppe (n=26) (n=12) (n=42) 10,8 (7-15) 11,8 (7-15) 12,1 (6-15) Geschlecht (m/w) 12/14 6/6 24/18 BMI (kg/m²) 19,1 (SD 4,945) 18,08 (SD 3,796) 18,72 (SD 3,923) Inhalative Steroide 15 3 0 Antibiotika 12 0 Mittleres Alter in Jahren 2.3. 0 Ausschlusskriterien An den Untersuchungen nahmen keine Kinder teil, die unter aktueller Luftnot oder Zeichen einer akuten Infektion litten oder Kinder, die in den letzten drei Monaten Antibiotika eingenommen haben, die effektiv gegen Chlamydien und Mycoplasmen wirksam sind (Makrolide, Tetrazykline, Chinolone). Patienten mit einem Immunmangelsyndrom wurden ebenfalls ausgeschlossen. 13 2.4. Durchführung des induzierten Sputums Das induzierte Sputum wurde nach einer standardisierten Methode und festgelegtem Protokoll durchgeführt (Popov et al., 1995). Die Kinder inhalierten jeweils sieben Minuten mittels eines Vernebelungsgerätes, PariBoy®, mit Kochsalzlösung. Im ersten bis dritten Schritt wurde dies mit ansteigender Konzentration von 0,9%iger, 3,0%iger und 4,5%iger Natrium-Chlorid (NaCl)-Lösung durchgeführt. Während der Inhalation wurden die Kinder alle zwei bis drei Minuten aufgefordert zu husten und das produzierte Sputum in eine Petrischale zu expektorieren. Vor Beginn der Inhalation und nach jedem Schritt erfolgte die spirometrische Messung zur Bestimmung von VC und FEV1 mittels FlußVolumen-Kurve (Jaeger Bodyscreen®, Viasys Healthcare, Würzburg) Das so gewonnene Sputum wurde makroskopisch vom Speichel getrennt und bei –80°C bis zur weiteren Aufbereitung eingefroren. Die Sputuminduktion wurde bei subjektivem Unwohlsein der Kinder wie zum Beispiel Schwindel, Übelkeit oder Luftnot abgebrochen. Außerdem erfolgte ein Abbruch bei Absinken des FEV1 um mehr als 20% vom Ausgangswert. 2.5. Nasenschleimhautabstrich Zur Gewinnung von zusätzlichen Epithelzellen aus dem oberen Respirationstrakt erfolgte ein Abstrich mittels einer 2mm-Biospiebürste (BC-15 AE, Olympus) von der Nasenschleimhaut. Die so gewonnen Zellen wurden in normotoner Kochsalzlösung gelöst und bei –80°C gefroren. 14 2.6. Aufbereitung der Proben und Analyse mittels PCR Die Proben zur Aufbereitung mittels PCR wurden in Bezug auf Name und Erkrankung verblindet. Zur Weiterverarbeitung wurden 500µl der Sputumproben und der gelösten epithelialen Zellen aus den Nasenabstrichen in sterile Gefäße verbracht und bei 15000 Umdrehungen 30 min zentrifugiert. Die viskösen Sputumproben wurden mit 0,5%igem Acetylcystein für eine Minute vorbehandelt. Die DNA wurde aus den Proben mittels des QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Die Durchführung erfolgte bezugnehmend auf die Protokolle zur nested PCR des Herstellers. 2.6.1. Extraktion von Mycoplasma pneumoniae DNA Zunächst wurde das Primer Paar MP-1 5`-GAA GCT TAT GGT ACA GGT TGG -3` und MP-2 5`-ATT ACC ATC CTT GTT GTA ACG-3` (MWG-Biotech, Ebersburg, Deutschland) für die erste PCR verwandt, und nach Bernet (Bernet et al.,1989) durchgeführt; dieser Primer kodiert einen Teil des ATPase Operon Gens. Fünf Mikroliter der DNA wurde mit 45µl der ersten PCR Mischung zu einem Gesamtvolumen von 50µl ergänzt. Die Reaktionsmischung enthält 10-fache PCR Pufferlösung mit 1,5mM MgCl2 (Amersham Bioscences, Freiburg Deutschland), 0,2 mM von jedem Desoxyribonukleosidtriphosphat (Amersham Biosciences), 1µM von jedem Primer und 1,25 U einer Taq DNA-Polymerase (Amersham Biosciences). 5µl Lösung der ersten PCR, welche 1:10 verdünnt wurde, wurde mit dem Primer-Paar MUH-1 5`- TGA CTG GAA GGA TGT TAA GC-3` und MUH-2 5`-TTG TAA TCG TCT TTA TTT CG –3` (Abele-Horn et al., 1998) für die zweite PCR unter gleichen Bedingungen verwandt. 15 Jede Amplifikation wurde im Perkin Elmer Gene Amp 2400 Thermocycler durchgeführt. Diese beinhaltet 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95°C für 2s, Abkühlen auf 52°C für 2min und Erwärmen auf 72°C für 1min; der letzte Zyklus wird mit 7min bei 72°C durchgeführt und endet bei 18°C. Die Produkte aus der ersten und zweiten PCR haben eine Größe von 144bp und 104bp und werden in einem 2%igen, Ethidiumbomid-haltigen Agarose Gel dargestellt. 2.6.2. Extraktion von Chlamydophila pneumoniae DNA Die PCR zur Extraktion von Chlamydophila pneumoniae - DNA wurde in der oben beschriebenen Weise, mit Ausnahme der unterschiedlichen Primer, durchgeführt. Für die erste PCR wurde das Primerpaar CpHL-1 5`-GTT GTT CAT GAA GGC CTA CT-3`und CpHR-1 5`-TGC ATA ACC TAC GGT GTG TT3`verwandt (Campbell et al., 1992); für die zweite PCR das folgende Paar: CpIn 5`-AGT TGA GCA TAT TCG TGA GG-3`und CpIn-2 5`-TTT ATT TCC GTG TCG TCC AG-3` (Maass et al., 1997). Diese Primer haben ein Genprodukt unklarer Funktion und kodieren keine DNA der normalen, bakteriellen Flora oder anderer pathogener Keime. Die DNA-Amplifikation wurde in einem Perkin Elmer Gene Amp 2400 Thermocycler nach dem folgenden Schema durchgeführt: 95°C für 1:30 min, 55°C für 1:45min, 72°C für 1:45 min, mit dem letzten Zyklus von 72°C für 7min endend bei 18°C. Die entstehenden Produkte wiesen eine Größe von 438bp und 128bp auf und wurden ebenfalls im Agarose Gel aufgetrennt (Abbildung 2). Jede aufgetrennte DNA und jede PCR wurden durch eine Negativ-Probe (QIAamp, sterile water, PC-master mix) und eine Positiv-Probe ergänzt (M. pneumoniae FH ATCC 15531, freundlicherweise zur Verfügung 16 gestellt durch K. Oberle, Freiburg und C. pneumoniae ATCC VR 2282 freundlicherweise zur Verfügung gestellt von M. Maass, Lübeck). Jede Probe wurde auf das Vorhandensein eines Inhibitors mittels pACYC 177 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) überprüft. Zur Vermeidung von Kontamination durch Reagenzien wurden allgemeine Vorkehrungen unternommen. Darunter Pipettenspitzen mit Filtern, ausgedehntes Reinigen der Oberflächen mit Hypochlorit und räumliche Trennung von Extraktion der Proben, Vorbereitung und Durchführung der PCR. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abbildung 2: CP nested PCR Banden 1 und 10 100bp DNA Leiter von CP, 2-5 klinische Proben, 6 positive Kontrolle, 7-9 negative Kontrolle, Bande 3 und 6 zeigen positive Ergebnisse für 128 bp von CP 17 2.7. Statistik Die Daten wurden mittels GraphPad Prism 4.0 für Windows ausgewertet. Für kontinuierliche Daten wurden das arithmetische Mittel und die Standardabweichung berechnet. Zur Kalkulation signifikanter Unterschiede wurde der zweiseitige t-test für unabhängige Stichproben und der FisherExakt-Test für kategoriale Daten verwendet. Ein p-Wert <0,05 wurde als signifikant gewertet. Das Erstellen der Grafiken erfolgte ebenfalls mittels GraphPad Prism 4.0. 18 3. Ergebnis Es wurden insgesamt 142 Proben, sowohl Sputum als auch Nasenaspirate, von insgesamt 80 Probanden untersucht. Die Probanden wurden in drei Gruppen unterteilt: Lungengesunde Kinder, chronisch Atemwegskranke mit eitrigen Bronchitiden und Patienten mit Asthma bronchiale. Es konnten 44 Sputumproben und Nasenaspirate von 26 Kindern mit Asthma bronchiale gewonnen werden. 29 Proben von insgesamt 12 Kindern mit chronisch eitrigen Bronchitiden wurden mittels nested PCR auf CP und MP untersucht. Aus der Gruppe der 42 lungengesunden Kinder wurden 69 Proben analysiert. Die Gruppen unterscheiden sich nicht bezüglich des mittleren Alters oder der Geschlechterverteilung. Bei 76% der erkrankten Kinder und bei 64% der lungengesunden Probanden war die Durchführung eines induzierten Sputums mit Gewinnung einer ausreichenden Materialmenge möglich. Es zeigt sich somit kein signifikanter Unterschied in der Möglichkeit einer nichtinvasiven Probengewinnung zwischen kranken und gesunden Probanden (p = 0,3). Bei allen Probanden wurde ein Nasenbürstenabstrich gewonnen. Mit einem mittleren Alter von 10 Jahren besteht kein Unterschied zwischen den positiv und den negativ getesteten Probanden. Die Häufigkeit verwendeter inhalativer Steroide war in den beiden Gruppen der chronisch kranken Probanden mit 40% bzw. 50% gleich. 19 3.1. Ergebnis der Lungenfunktionsprüfung Lungengesunde hatten eine signifikant höhere FEV1 und Vitalkapazität als die chronisch atemwegskranken Kinder ohne Nachweis von CP und MP, hier zunächst zusammengefasst in einer Gruppe aller chronisch Lungenkranken (Abbildung 3 und 4). mittleres FEV1[%/soll] 150 100 50 p< 0,001 0 Lungengesunde Lungenkranke Abbildung 3: Mittlere Einsekunden-Kapazität mittlere VC[%/soll] 125 100 75 50 25 p< 0,001 0 Lungengesunde Lungenkranke Abbildung 4: Mittlere Vitalkapazität 20 3.2. Nachweis von Chlamydophila pneumoniae Chlamydophila pneumoniae konnte in insgesamt 10 von 142 Proben nachgewiesen werden. Diese unterteilten sich in je fünf Proben aus Sputum und Nasenabstrichen bei lungenkranken Kindern. CP war zu gleichen Teilen sowohl bei Asthmakranken, wie auch bei Patienten mit chronisch eitriger Bronchitis nachweisbar (Tabelle 2). Ein signifikanter Unterschied zwischen der Inzidenz von CP bei Asthmatikern und der bei Probanden mit chronisch eitriger Bronchitis besteht nicht (p=0,5). In den Proben der lungengesunden Probanden konnten keine Chlamydien nachgewiesen werden (p = 0,0021). Tabelle 2: Inzidenz von CP (positiv/negativ) Nasenabstrich Sputum Gesamt Asthma 2/22 3/22 5/44 Chr.eitr.Bronchitits 3/15 2/14 5/29 Lungengesunde 0/42 0/27 0/69 Fünf von 44 Proben (11%) der Asthmatiker waren für CP positiv, darunter drei Sputumproben und zwei Nasenabstriche. Kein Proband war sowohl im Sputum als auch im Nasenbürstenabstrich positiv. In fünf von 29 Proben (17%) der Kinder mit chronisch eitriger Bronchitis lässt sich CP nachweisen. Auch hierbei kann der Erreger nicht aus beiden Medien isoliert werden. 21 3.2.1 Unterschiede der Lungenfunktion unter den Atemwegskranken Bezüglich der Spirometrie stellt sich der Vergleich der chronisch kranken Probanden ohne Chlamydiennachweis mit den chronisch Kranken mit Chlamydiennachweis in Nasenabstrich oder Sputum wie folgt dar: Das mittlere FEV1 der negativ getesteten Probanden von 89% (SD:19,46) im Vergleich zu den positiv getesteten mit einem FEV1 von 97,8% (SD:14,09) weist keinen Unterschied in Richtung einer verschlechterten Lungenfunktion auf; p= 0,1533. Das gleiche gilt für die Vitalkapazität bei Kranken ohne Nachweis in der PCR mit einer mittleren VC von 91,1% (SD:13,84) und bei Kindern mit Nachweis von Chlamydophila pneumoniae mit einer mittleren VC von 98,3% (SD:13,28) p = 0,1514. 3.3. Nachweis von Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae konnte in insgesamt vier von 142 Proben nachgewiesen werde (Tabelle 3). Davon ließ sich der Erreger in drei Proben aus Nasenabstrichen isolieren und aus einer Sputumprobe. Bei keinem Probanden waren beide Medien positiv auf MP geprüft worden. In den Proben der lungengesunden Kinder konnten keine Mycoplasmen nachgewiesen werden. Auf alle Proben gesehen waren 5,5% der Lungenkranken positiv für Mycoplasma pneumoniae und keiner der Lungengesunden (p= 0,1221) Es zeigte sich keine Korrelation zwischen Alter und der Gabe inhalativer Steroide. 22 Tabelle 3: Inzidenz von MP (positiv/negativ) Nasenabstrich Sputum Gesamt Asthma 2/22 1/22 3/44 Chr.eitr.Bronchitits 1/15 0/14 1/29 Lungengesunde 0/42 0/27 0/69 Drei von 44 Asthmatikern, das heißt 6,8%, waren für Mycoplasma pneumoniae positiv in der PCR, darunter eine Sputumprobe und drei Nasenbürstenabstrichen. Es konnte in einer Probe eines Nasenabstrichs bei einem Proband mit chronisch eitriger Bronchitis Mycoplasma pneumoniae nachgewiesen werden. Kein Proband war sowohl im Sputum als auch im Nasenabstrich positiv für Mycoplasma pneumoniae. 3.3.1. Unterschiede der Lungenfunktion unter den Atemwegskranken Stellt man die mittleren Messwerte aus der Lungenfunktion der Patienten mit positivem und negativem Mycoplasmennachweis in der PCR einander gegenüber, so zeigt sich folgendes Ergebnis: Das mittlere FEV1 der Kranken ohne Mycoplasmennachweis liegt bei 89%, (SD 19,5), das der positiv getesteten Probanden bei 92% (SD 19,9), p= 0,7749. Die mittlere Vitalkapazität bei kranken Kindern ohne Nachweis von MP beträgt 91% vom Soll (SD 13,8), die VC der positiv getesteten 99% vom Soll (SD 8,7); p= 0,2754. 23 3.4. Zusammenfassung der Ergebnisse Es konnte ein signifikanter Unterschied gezeigt werden, hinsichtlich der Lungenfunktion der Gesamtheit aller Lungenkranken im Vergleich zu denen der lungengesunden Kinder. Ein signifikanter Unterschied besteht sowohl in Bezug auf die mittlere Forcierte-Einsekunden-Kapazität und die Vitalkapazität. Bei Kindern mit Atemwegserkrankungen konnte signifikant häufiger Chlamydophila pneumoniae nachgewiesen werden. Es besteht kein signifikanter Unterschied bezüglich des Nachweises von Mycoplasma pneumoniae. Bei insgesamt drei Probanden konnte sowohl CP als auch MP nachgewiesen werden. Die Gewinnung von Keimen konnte sowohl mittels induziertem Sputum als auch durch Nasenbürstenabstriche erfolgen. Ein Vorteil einer der beiden Methoden zeigte sich nicht. Bei keinem der gesunden oder kranken Kinder musste die Sputuminduktion aufgrund einer Verschlechterung der Lungenfunktion abgebrochen werden. In dem Vergleich der Lungenfunktionsergebnisse der lungenkranken Kinder mit und ohne Nachweis der beiden untersuchten Erreger konnte bezüglich der untersuchten Parameter (FEV1, VC) kein signifikanter Unterschied gezeigt werden (Abbildungen 5 und 6). Die sehr große Standardabweichung sowohl bei FEV1 und VC in der Gruppe der lungenkranken Kinder ist durch einen Patienten mit einem schweren Verlauf einer CF zu begründen, der eine schwerste respiratorische Einschränkung in der Spirometrie zeigte. 24 FEV1[%/soll] 150 100 50 0 Gesunde Kranke CP positiv MP positiv Abbildung 5: Mittlere forcierte Einsekunden-Kapazität, FEV1 [%/soll] 125 VC[%/soll] 100 75 50 25 0 Gesunde Kranke CP positiv MP positiv Abbildung 6: Mittlere Vitalkapazität, VC [%/soll] 25 4. Diskussion Allergisches Asthma bronchiale und chronisch eitrige Bronchitiden sind die häufigsten chronischen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter. Atopische Erkrankungen, wie allergisches Asthma, haben an Häufigkeit in den letzten Jahren zugenommen (Lau et al., 2002, Maziak et al., 2003). Obwohl die Pathogenese der Erkrankungen gut beschrieben ist, sind insbesondere die Faktoren noch nicht geklärt, die den Schweregrad des Krankheitsverlaufs bestimmen. In den Mittelpunkt der Untersuchungen rücken hierbei virale und bakterielle Erreger, darunter Parainfluenzavirus, Respiratory-Syncytial Virus, Staphylokokken, Streptokokken und Hämophilus influenza (Gern, 2000, Gern, 2004, Oehling, 1999). Von besonderem Interesse sind auch die atypischen Bakterien Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae (Clementsen et al., 2002, Montalbano and Lemanske, 2002). Man weiß aus vielen, vorwiegend seroepidemiologischen Studien, dass CP und MP häufige Auslöser akuter Atemwegsinfekte im Kindes– und Jugendalter sind (Oehling, 1999, Blasi et al., 2005). Durch die Neigung zur Persistenz und die Fähigkeit zur Ausbreitung im Körper verursachen sie komplexe immunologische Reaktionen (Dallo and Baseman, 2000). Es wird vermutet, dass sie auf diese Weise Einfluss auf die Pathogenese chronischer Atemwegserkrankungen haben können. Drei verschiedene Wege der Einflussnahme auf den Krankheitsverlauf sind denkbar. Erstens wird vermutet, dass die Infektion zu einer Initiierung der obstruktiven Veränderung führt. Zweitens besteht die Möglichkeit der Auslösung von Exazerbationen und drittens die Verstärkung der Erkrankung durch persistierende Infektionen. Da initial die Bedeutung von CP und MP bei erwachsenen Patienten mit Asthma und COPD entdeckt wurde, geht der erste Abschnitt der Diskussion auf diese ein. 26 4.1. CP und MP bei Erwachsenen Untersuchungen bei Erwachsenen belegen, dass CP und MP den Verlauf einer chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) und allergischem Asthma bronchiale negativ beeinflussen können. Als erste zeigten Hahn et al. in einer klinisch prospektiven Beobachtungsstudie mit über 300 erwachsenen Patienten, dass ein Zusammenhang zwischen einer Infektion mit CP und dem Ausmaß der Bronchialobstruktion besteht (Hahn, 1991). Die Probanden wurden im Rahmen einer akuten Atemwegserkrankung und im weiteren Verlauf untersucht. Die Diagnose einer CP-Infektion wurde serologisch gestellt, die Schwere des Verlaufs an klinischen Symptomen festgelegt. Ein signifikanter Zusammenhang konnte zwischen dem Vorliegen einer Chlamydieninfektion und der Entstehung einer asthmatischen Bronchitis nach Ablauf der akuten Infektion gezeigt werden. Ein Zusammenhang mit dem Vorkommen von MP konnte in dieser Studie nicht nachgewiesen werden. Diese Studie unterstreicht die Überlegung, dass eine Infektion durch CP zu einer Initiierung einer obstruktiven Erkrankung führen kann. In einer Studie von Cook et al. wurden drei Gruppen untersucht: Patienten mit akutem Asthma bronchiale, mit schwerem chronischen Asthma bronchiale mit höher dosierter, inhalativer Steroidtherapie und gesunde Probanden. Die Diagnose einer CP-Infektion wurde ebenfalls mittels serologischer Tests gestellt. Es konnte gezeigt werden, dass bei 37% der Patienten mit schwerem, chronischem Asthma erhöhte CP-Antikörpertiter vom IgG- und IgA-Typ als Zeichen einer chronischen Infektion vorlagen (Cook, 1998) und somit eine mögliche Einflussnahme durch Persistenz des Erregers aus den Krankheitsverlauf besteht. Die Gruppen der Asthmatiker mit akuter Symptomatik und der gesunden Probanden unterschieden sich 27 nicht. Außerdem konnte bei keinem Patienten eine Korrelation zwischen einer akuten Infektion mit CP und einer Exazerbation gezeigt werden. In einer anderen Studie mit kleinen Fallzahlen wurde erstmals der Nachweis von MP mittels PCR aus bronchoalveolären Lavagen (BAL) vorgenommen. Bei 10 von 18 Probanden mit stabilem Asthma bronchiale konnte MP in der BAL nachgewiesen werden. Es bestand ein signifikant häufigeres Vorkommen von Mycoplasmen in der BAL von Patienten mit chronischem Asthma im Vergleich zu einem gesunden Vergleichskollektiv (Kraft et al., 1998). Auffällig bei dieser Studie ist, dass sämtliche Untersuchungen mittels Serologie und Kultur keine Infektion durch den Erreger ergaben. In einer Studie mit erwachsenen COPD-Patienten konnten Blasi et al. zeigen, dass eine Kolonisation der Bronchien mit CP mit erniedrigter Lungenfunktionskapazität und häufigeren Exazerbationen einhergeht (Blasi et al., 2002). In der ersten Stufe der Studie konnte bei Patienten mit stabiler, chronischer Bronchitis in 38% der Fälle CP mittels PCR aus dem Sputum nachgewiesen werden. Diese Patienten hatten zusätzlich eine signifikant schlechtere Lungenfunktionskapazität. In der zweiten Stufe der Studie wurden aus einem ähnlichen Patientenkollektiv 141 Probanden rekrutiert, unter denen 43% PCR-positiv für CP waren. Im Verlauf von zwei Jahren entwickelte diese Patientengruppe signifikant häufiger Exazerbationen. Die Studie konnte also zeigen, dass es eine Korrelation zwischen der Besiedlung durch CP und der Schwere des Verlaufs einer chronischen Bronchitis gibt. 28 Zusammengefasst gibt es nach aktueller Studienlage bei Erwachsenen keine eindeutige Korrelation zwischen einer akuten CP- oder MP-Infektion und einem schlechteren Krankheitsverlauf. Die Daten lassen jedoch vermuten, dass eine Besiedlung oder eine chronisch persistierende Infektion durch die atypischen Erregern Einfluss auf die Klinik haben. Der Vergleich der beschriebenen Studien ist jedoch erschwert, da unterschiedliche Methoden, Kultur, Serologie und PCR, verwendet wurden. 4.2. CP und MP bei Kindern Bis heute gibt es nur wenige Studien, die das Vorkommen von Chlamydien und Mycoplasmen bei chronisch atemwegskranken Kindern untersuchen. Principi et al. untersuchten CP und MP als Auslöser von akuten, tiefen Atemwegerkrankungen. In einer großen Untersuchung mit über 600 Kindern konnte eine Prävalenz von 34,3% durch MP und 14,1% durch CP gezeigt werden (Principi et al., 2001). Diese Studie unterstreicht die Bedeutung der Erreger MP und CP bei akuten Atemwegserkrankungen im Kindesalter. 1994 wiesen Emre et al. bei 11% der untersuchten Kinder mit akuter Luftnot CP mittels Kultur nach. Bei 60% der Kinder mit CP-Infektion zeigten sich keine Antikörper gegen den Keim. Diese prospektive Studie mit 118 Probanden zeigt auch die Problematik der Diagnosestellung mittels unterschiedlicher Verfahren. In der gleichen Studie konnte auch die Tendenz zu einer persistierenden Infektion belegt werden. Bei 14% der Probanden konnte der Erreger über bis zu fünf Monaten nachgewiesen werden. (Emre et al., 1994). In einer longitudinalen Studie von Cunningham et al. wurde gezeigt, dass die Prävalenz von CP bei Kindern mit Asthma in etwa gleich hoch bei den symptomatischen (23%) wie bei den asymptomatischen (28%) Patienten 29 war (Cunningham et al., 1998). Aus anderen Studien ist bekannt, dass Infektionen mit atypischen Erregern häufig inapperent verlaufen (Miyashita et al., 2001). In der Studie von Cunningham wurde eine PCR zum Nachweis von CP aus nasalen Aspiraten verwendet. Die Patienten, die PCR positiv waren, berichteten signifikant häufiger über Episoden mit Dyspnoe. Auch war bei den Patienten mit gravierenderem Verlauf der Erkrankung der Titer des sekretorischen IgA-Antikörpers mehr als siebenfach höher verglichen mit Patienten mit geringen Exazerbationsraten. Die erhöhten IgA-Titer wurden in dieser Studie als Zeichen einer chronischen Infektion gewertet. Bei nur sehr geringen Prävalenzzahlen wurde MP in dieser Studie keine Bedeutung beigemessen. Im Jahr 2000 konnten Esposito et al. bei Kindern mit Asthma bronchiale und Exazerbation eine hohe Infektionsrate durch CP und MP nachweisen (Esposito et al., 2000). In 22,5% der Fälle wurde eine akute Infektion mit MP festgestellt, im Vergleich zu 7,5% bei gesunden Kindern. Eine akute Infektion mit erhöhtem IgM-Titer gegen CP wurde bei 15,5% der an Asthma erkrankten Kinder im Vergleich zu 2,5% bei Gesunden ermittelt. Der Nachweis erfolgte mittels Serologie und PCR aus Nasenschleimhautaspiraten. Es wurde außerdem eine Verlaufskontrolle aller Probanden durchgeführt. Kinder mit Asthma bronchiale und einer Infektion durch MP oder CP, die nicht antibiotisch behandelt wurden, erlitten mehr Rezidive in Form von wiederholten Exazerbationen und mussten häufiger hospitalisiert werden. In einer ähnlichen prospektiven Studie konnten 2003 Biscardi et al. (Biscardi et al., 2004) die Ergebnisse bezogen auf den Nachweis von MP bestätigen. Die Kinder mit schwerem Asthma bronchiale waren zu einem signifikant größeren Teil mit dem Erreger infiziert. Im Verlauf konnte außerdem gezeigt werden, dass genau diese Kinder eine erhöhte Rate an Rückfällen erlitten. 30 Zusammengefasst konnte bei Kindern ein Zusammenhang zwischen gehäuften Exazerbationen und dem Nachweis von CP und MP gezeigt werden. Es handelte sich um den Nachweis akuter Infektionen und nicht um eine Besiedlung. Weiterhin scheint bei Kindern eine hohe Persistenz der Erreger über Monate vorzuliegen (Emre et al., 1994, Cunningham et al., 1998). 4.3. Bewertung der erhobenen Daten Im Vergleich zu anderen Studien ist diese Untersuchung, der Kenntnis nach, die erste, die an klinisch stabilen Kindern mit Asthma bronchiale und chronisch eitriger Bronchitis den Nachweis von CP und MP mittels PCR erbringt. Mittels PCR aus Sputum und Nasenschleimhautabstrichen konnten sowohl CP als auch MP ausschließlich bei chronisch atemwegskranken Kindern nachgewiesen werden. In keinem der bei lungengesunden Kindern entnommenen Proben waren die Erreger nachweisbar. Da die Kinder frei von Symptomen einer akuten Infektion waren, muss man eine Persistenz der Erreger in den Atemwegen vermuten. In anderen Studien ließ sich sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern CP über bis zu einem Jahr nach Infektion in Sputum und Nasen-Rachen-Abstrichen nachweisen (Blasi et al., 2002, Cunningham et al., 1998). Allerdings ist die Prävalenz der beiden Erreger im Vergleich zu anderen Studien verhältnismäßig gering. Eine mögliche Ursache dafür kann sein, dass ausschließlich Kinder in einem klinisch stabilen Zustand untersucht wurden. Anzeichen einer Exazerbation oder akuten Infektion wie Dyspnoe, Husten oder verminderte Leistungsfähigkeit galten als Ausschlusskriterien. In den aufgeführten, 31 vergleichbaren Studien wurden fast ausschließlich Probanden im Stadium der akuten respiratorischen Verschlechterung untersucht. Außerdem beeinflusst die Wahl der unterschiedlichen Methoden die Ergebnisse. In den meisten älteren Studien wurde ausschließlich eine serologische Diagnostik verwendet. Vereinzelt wurde der Nachweis mittels Kultur geführt, was heutzutage als obsolet gilt. Die Studien, die eine PCR verwendeten, unterschieden sich in dem Material aus welchem die DNA isoliert wurde. Sowohl Nasenschleimhautaspirate, Sputum, BAL wie auch Bronchialbiopsien wurden untersucht. Aufgrund der Heterogenität der einzelnen Studien und den unterschiedlichen Studiendesigns, lässt sich nicht beurteilen, ob eine Methode oder ein Material größere Nachweisraten ergab als eine andere. In unserer Studie wurden zwei verschiedene Materialen untersucht. Keine der beiden gewählten Medien, weder das induzierte Sputum noch der Nasenschleimhautabstrich, stellte sich als überlegen, im Sinne einer höheren Nachweisrate, heraus. Die Kombination beider Methoden erhöht jedoch die Nachweisrate und könnte als Kontrollparameter für Interventionsstudien eine nützliche Hilfe sein. Sowohl bei kranken als auch bei lungengesunden Kindern war eine Sputuminduktion gleich häufig möglich. In Schleimhautabstrichen und in induziertem Sputum konnten CP und MP nachgewiesen, jedoch nie bei einem Probanden in beiden Proben, so dass eine Kombination aus beiden Medien sinnvoll erscheint. 4.4. Diskussion der Studienergebnisse Vor allem seroepidemiologischen Studien müssen kritisch betrachtet werden. So zeigten Kern et al. 1994, dass die IgA- und IgG-Antikörper nicht spezifisch für CP sind und vermutlich Kreuzreaktionen mit anderen Chlamydien sp. wie Chlamydia trachomatis auftreten (Kern et al., 1993). 32 Eine Studie, die den bisher aufgeführten Ergebnissen widerspricht, ist von Graham et al. In dieser konnte keine Korrelation zwischen erhöhten Antikörpertitern und bekanntem Asthma bronchiale bei Probanden im Kindes– und Jugendalter gezeigt werden. Die Antikörpertiter unterschieden sich bei Patienten mit nachgewiesenem Asthma bronchiale und dem gesunden Vergleichskollektiv nicht (Graham et al., 2000). Graham et al. geben allerdings auch in der Diskussion der Ergebnisse zu bedenken, dass dies am ehesten an der Nachweismethode und nicht an einem mangelnden Zusammenhang zwischen atypischen Erregern und ihrer Rolle in der Pathogenese chronischer Atemwegserkrankungen liegen könnte. So konnte z.B. eine Studie zeigen (Kuttlin et al., 1998), dass eine Infektion mit CP nicht zwingend mit einer Serokonversion einhergeht, und somit auch bei stattgehabter Infektion diese nicht durch eine Veränderung der Antikörpertiter nachgewiesen werden kann. Ein weiterer Nachteil ist die in einigen Studien dokumentierte Tatsache, dass bei durch Mycoplasmen hervorgerufenen, akuten Infektionen die IgMAntikörper erst nach zwei bis drei Wochen ansteigen, während der Erreger mittels PCR bereits früher nachgewiesen werden kann (Marmion et al., 1993, Waris et al., 1998). Trotz der unterschiedlichen Studiendesigns zeigen viele Untersuchungen und auch die vorliegende, dass ein Zusammenhang zwischen dem Vorkommen der beiden atypischen Erreger CP und MP und chronischen Atemwegserkrankungen besteht. Es müssen noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden, ob es sich um eine persistierende Infektion oder eine Besiedlung handelt, wenn die Erreger nachgewiesen werden können. Und ob diese Persistenz für eine Erkrankung steht oder ob sie vielmehr Ausdruck vermehrter Entzündungszellen ist, die CP latent beherbergen. 33 Eine Möglichkeit die Besiedlung in ihrer Wertigkeit zu beurteilen, besteht in der neueren PCR-Methode, die auf dem Nachweis der RNA beruht. Biscione et al haben in ihrer Studie eine reverse transcrpitase PCR verwendet, die die RNA des Major outer membrane protein (MOMP) nachweist. Ein Protein, welches nur von CP während einer aktiven Infektion produziert wird. Biscione konnte in dieser Studie eine gehäuftes Vorkommen von MOMP-RNA im Nasensekret von klinisch stabilen Patienten mit atopischem Asthma nachweisen im Vergleich zu einem gesunden Vergleichskollektiv (Biscione et al., 2004). Zur weiteren Einschätzung der Rolle der CP und MP-Infektion werden außerdem Interventionsstudien benötigt, die die Therapie der Infektion und deren Einflussnahme auf den Krankheitsverlauf bei Kindern untersuchen. Interventionsstudien bei erwachsenen Patienten haben unterschiedliche Ergebnisse gezeigt. So konnte eine Studie an Patienten mit chronischem Asthma bronchiale belegen, dass eine Therapie mit Clarithromycin zur einer signifikanten Verbesserung der Lungenfunktion bei denen führte, die positiv für CP und MP in der PCR der BAL und Bronchialbiopsien waren (Kraft et al., 2002). Eine andere Studie, die die Wirkung einer Roxithromycintherapie auf die Lungenfunktion von Asthmapatienten mit positivem Nachweis von CP prüfte, konnte lediglich marginale Veränderungen aufweisen (Black et al., 2001). In keiner der beschriebenen Interventionsstudien wurde überprüft, ob die intrazellulären Erreger durch die Therapie eradiziert werden konnten. Unsere Studie hat gezeigt, dass zur Erfolgskontrolle nach Therapieende die nicht-invasiven Techniken wie induziertes Sputum und Nasenbürstenabstriche zum Keimnachweis mittels PCR verwendet werden können. Durch diese Methoden können Interventionsstudien insbesondere mit pädiatrischen Patienten abschließend beurteilt und eine größere Anzahl von Patienten untersucht werden. 34 5. Zusammenfassung Chronische Atemwegserkrankungen spielen bereits im Kindes- und Jugendalter eine große Rolle. So beträgt die Prävalenz von Asthma bronchiale bei Kindern in Mitteleuropa ca. 10%. Chronisch eitrige Bronchitiden, darunter kindliche COPD, Bronchiektasen, primäre Ziliendyskinesie und zystische Fibrose verursachen ebenfalls schwere chronische Atemwegserkrankungen bei Kindern. Der Krankheitsverlauf wird beeinflusst durch das Auftreten von Exazerbationen in Form von geringer körperlicher Belastbarkeit und Dyspnoe. Hierfür verantwortlich sind unter anderem Infektionen der Atemwege durch pathogene Erreger. Hierzu gehören neben anderen die in dieser Studie untersuchten atypischen Bakterien Chlamydophila pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae. CP und MP sind atypische, intrazelluläre Erreger, die über Aerosole übertragen werden und deren Infektionen häufig inapperent verlaufen. Sie verursachen im Kindes- und Jugendalter häufig akute Infektionen der oberen und unteren Atemwege. Es wird die Möglichkeit der Einflussnahme dieser atypischen Erreger auf chronische Atemwegserkrankungen diskutiert. Unsere Studie hat Kinder im Alter von sechs bis sechzehn Jahren mit Asthma bronchiale und chronisch eitriger Bronchitis, darunter Kinder mit kindlicher COPD, Bronchiektasen, primärer Ziliendyskinesie und zystischer Fibrose, untersucht. Die Probanden befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung in einem klinisch stabilen Allgemeinzustand ohne Anzeichen einer akuten Exazerbation. Die Ergebnisse wurden mit den von lungengesunden Kindern gewonnenen Befunden verglichen. Es wurden insgesamt 80 Kinder untersucht und 142 Proben mittels Sputuminduktion und Nasenschleimhautabstrichen gewonnen. Parallel 35 erfolgte die Messung der Lungenfunktionskapazität mittels Spirometrie. Die Proben wurden anschließend mittels einer nested PCR auf das Vorliegen von MP- und CP- DNA untersucht. Eine Probengewinnung induzierten Sputums mittels war bei der nicht-invasiven chronisch kranken Methode des Kinder und Lungengesunden mit 76% bzw. 64% gleich häufig möglich (p=0,3). CP war in 10 von 73 Proben der Kinder mit Asthma und chronisch eitriger Bronchitis nachweisbar (13,7%); bei keinem Proband der lungengesunden Vergleichsgruppe konnte CP-DNA isoliert werden (p=0,0021). MP konnte aus 4 von 73 Proben der chronisch Kranken nachgewiesen werden, jedoch aus keiner Probe der lungengesunden Kinder. Da nur eine sehr geringe Probenanzahl positiv für Mycoplasmen war, zeigte sich hier kein signifikanter Unterschied (p= 0,1221) hinsichtlich einer gehäuften Prävalenz von Mycoplasma pneumoniae bei Kindern mit Asthma bronchiale und chronisch eitriger Bronchitis. Eine Korrelation zwischen dem mikrobiologischen Nachweis von CP und MP und einer Verschlechterung der Lungenfunktion bestand nach Analyse der Ergebnisse der Spirometrie nicht. Es konnte lediglich eine insgesamt schlechtere Lungenfunktion bezogen auf die VC und FEV1 der chronisch atemwegskranken Kinder im Vergleich zu den lungengesunden Probanden nachgewiesen werden. Bisherige Studien zeigten vor allem an erwachsenen COPD Patienten, dass eine chronische Besiedlung bzw. Infektion mit CP und MP zu einer Verschlechterung des Krankheitsverlaufs führen kann. Die Ergebnisse in Studien mit Kindern ergaben bisher keine eindeutigen Ergebnisse. Die Beurteilung der Ergebnisse ist insbesondere durch die unterschiedlichen Nachweismethoden erschwert. Der serologische Nachweis erscheint fehlerhaft, da aufgrund einer fehlenden oder verzögerten Serokonversion falsch negative Ergebnisse resultieren. Die verwendeten PCR Methoden 36 sind ebenfalls uneinheitlich. Die bisherigen Studien konnten zeigen, dass eine Besiedlung oder chronische Infektion Einfluss auf den Krankheitsverlauf chronisch atemwegskranker Patienten hat. In Studien konnte außerdem die Neigung zu einer langen Persistenz der Erreger im Organismus nachgewiesen werden. Schließlich fehlen Interventionsstudien, die zum einen den Erfolg einer antibiotischen Therapie bezüglich einer Eradikation der Erreger überprüfen, zum anderen eine Beurteilung bezüglich eines verbesserten Krankheitsverlaufes ermöglichen. Mittels der in dieser Studie verwendeten nicht-invasiven Methoden können Interventionsstudien an größeren pädiatrischen Patientenkollektiven durchgeführt werden. 37 6. Literatur Abele-Horn, M., Franck, W., Busch, U., Nitschko, H., Roos, R., Heesemann, J. (1998). Transverse Myelits associated with Mycoplasma pneumoniae. Infection 26, 909-924 Asher, M. I., Keil, U., Anderson, H. R., Beasley, R., Crane, J., Martinez, F., Mitchell, E. A., Pearce, N., Sibbald, B., Stewart, A. 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Besonderer Dank gilt Karin Kogelheide und den Arzthelferinnen und Krankenschwestern der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin, die mich in der praktischen Umsetzung der Arbeit unterstützt haben. Insbesondere möchte ich mich bei den Kindern und ihren Eltern bedanken, die mit so viel Freude an meiner Studie teilgenommen haben, und ohne die diese Arbeit nicht zustande gekommen wäre. Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Geburtsdatum: Geburtsort: Familienstand: Nationalität: Corinna Hedwig Inge Schmidt 22.06.1977 Hagen ledig deutsch Schulausbildung: 1983- 1987 Robert-Bonnermann Grundschule, Herdecke 1987- 1996 Friedrich-Harkort-Gymnasium, Herdecke Erlangung der allgemeinen Hochschulreife Studium: 1996-2002 Studium der Humanmedizin An der Ruhr-Universität-Bochum August 1998 August 1999 August 2001 2001/2002 Herbst 2002 Physikum 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Praktisches Jahr im St. Josef Hospital Bochum 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Facharztausbildung: Seit 1. Dez. 2002 Assistenzärztin der Medizinischen Klinik I Abteilung Prof. Dr. med. W.E. Schmidt St. Josef Hospital Bochum
