Ausarbeitung zum Seminar „Post-production of industrial enzymes

Ausarbeitung zum Seminar „Post-production of industrial enzymes“
3. Folie Enzyme
Enzyme sind umweltverträgliche Katalysatoren mit einem breiten Reaktionsspektrum.
Industriell finden sie unteranderem Anwendung in den Bereichen der Lebensmittel-,
Waschmittel- und pharmazeutischen Industrie, so wie in der Papierherstellung.
Während Enzyme meist wasserlöslich und bei milden Reaktionsbedingungen (Raumtemperatur, physiologischem pH-Wert) funktionstüchtig sind, werden je nach industriellem
Anwendungsgebiet Enzyme mit unterschiedlichen Eigenschaften in der Substratspezifikation,
Stabilität und Löslichkeit benötigt.
Mit Hilfe des „Protein-engineerings“ und der „Post-production modification“ (PPM) können
Enzyme auf industrielle Reaktionsbedingungen angepasst werden. Das „Protein-engineering“
ermöglicht diverse Enzymoptimierungen, jedoch sind die Möglichkeiten des „Protein-engineerings“ limitiert auf die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren und ähnliche Moleküle,
die sich in eine Aminosäure-Sequenz integrieren lassen. Dazu kommt, dass Modifikationen
der Aminosäure-Sequenz häufig die Expression der Enzyme und deren Aufreinigung
behindern.
Alternativ können Enzyme per „Post-production modification“ mit natürlichen und
synthetischen Substanzen kombiniert werden, wodurch die Eigenschaften der Enzyme
vielfältig verändert werden können.
4. Folie Post produktions Modifikation
Die PPM kann sowohl chemisch als auch enzymatisch erfolgen. Dabei werden Substanzen
wie beispielsweise Glucose oder Polyethylenglycol (PEG) mit Proteinen kombiniert.
Über funktionelle Gruppen von Aminosäuren, die sich auf der Oberfläche von Proteinen
befinden, erfolgt die PPM. Da Lysin sehr häufig auf Proteinoberflächen vorkommt, bietet es
sich an Modifikationen über die ε-Aminogruppe (siehe Abb. 3, rot umkreist) des Lysins an
das gewünschte Protein zu binden. Als Bindeglied werden häufig Isothiocyanate, Isocyanate
oder Ester verwendet (sieh Abb. 4).
5. Folie
Weniger häufig kommen die Aminosäuren Cystein, Glutamin- und Asparaginsäure auf der
Oberfläche von Proteinen vor, daher bieten sie sich für regioselektive Modifikationen an.
Wie beim Lysin würde auch hier die Bindung über deren Seitenketten erfolgen (Thiol-Gruppe
von Cystein oder die Carboxylgruppen der Säuren). In der Abbildung 6 sind häufig genutzte
Bindeglieder von Cystein gezeigt. Dazugehören Imide, Idolacetyl und Disulfide.
Weitere Aminosäuren, die sich von der chemischen Struktur her als Bindestellen anbieten
würden, sind beispielsweise Serin, Tyrosin und Tryptophan, sie werden nur kaum als
Bindestellen verwendet, da sie zu selten auf der Proteinoberfläche vorkommen.
6. Folie Protein modifizierende Enzyme
Der Großteil der PPMs wird chemisch durchgeführt. Enzymatische Verfahren zur
Modifikation von Proteinen werden von Transglutaminase, Sortase A, Protein Farnesyltransferase (PFTase), Endoglykosidase H und Peptide-N-glykosidase durchgeführt.
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7. Folie
Transglutaminase ist in der Lage Glutamin mit einer primären Aminogruppe (z.B. von Lysin)
zu verbinden (siehe Abb. 7). Und findet unteranderem Anwendung in der Lebensmittelindustrie, um Fleischbestandteile miteinander zu verbinden oder um Proteine zu modifizieren, um Nahrungsprodukte besser zu konservieren. Des Weiteren ist Transglutaminase
aber auch in der Lage Desaminierungen durchzuführen (Abspaltung von Amino-gruppen).
Das Abspalten von Aminogruppen aus Proteinen hat eine Destabilisierung zur Folge und
findet ebenfalls in der Lebensmittelindustrie Anwendung. Damit Verbraucher, die in
Lebensmitteln enthaltenden Enzyme inaktivier zu sich nehmen, ist es günstig, wenn diese
bereits bei geringen Temperaturen inaktiviert werden.
8. Folie
Sortase A ist in der Lage einen Akzeptor mit LPXTG-Motiv (Lysin-Prolin-irgendeine Aminosäure-Threonin-Glycin) und einem Donor mit terminalem Stickstoff und Oligoglycin-Motiv zu
ligieren (siehe Abb. 8a). Dabei wird das C-Terminale Ende (Seite mit der Carboxyl-gruppe)
durch das Substrat ersetzt. Die Ligation durch Sortase A ermöglicht zielgerichtete
Modifikation von Proteinen. Wird per Protein Engineering sowohl das LPXTG- als auch
Oligoglycin-Motiv in Proteine eingebaut, dann können über Soratse A cyclische Proteine
gebildet werden. Diese haben dann eine höhere Stabilität erzeugt durch verringerte N- und
C-Terminale Reaktivität und Flexibilität.
Die Protein Farnesyltransferase (PFTase) ist in der Lage Farnesyl an ein Cystein zu binden,
wenn es von zwei Alanin gefolgt ist. Die Franesylgruppe selber kann als Griff für funktionale
Substanzen dienen, wie beispielsweise fluoreszierenden Stoffen oder PEG (siehe Abb. 8b).
Die Enzyme Endoglykosidase H und Peptide-N-glykosidase finden in der Lebensmittelindustrie Anwendung. Sie sind in der Lage Glycosylierungen von Proteinen abzuspalten, um
ähnlich zur Desaminierung der Transglutaminase Enzyme zu destabilisieren, damit sie bei
geringen Temperaturen inaktiviert werden.
9. Folie Polyethylenglycol (PEG)
Polyethylenglycol (PEG) ist eines der meist angewendesten PPM. Es ist ein nicht toxisches
synthetisches Polymer, das kovalent an die Oberfläche von Protein bindet. Mit seiner
amphiphile Eigenschaft, ermögliche es Proteinen verbesserte Löslichkeit in wässrigen und
organischen Lösungen. Die Stabilität und Aktivität der Proteine bleibt in organischen
Lösungen erhalten, da das PEG hygroskopische Eigenschaft aufweist und so eine H2O-Schicht
um die Proteine bildet.
Modifizierte Proteine zeigen eine erhöhte thermo- und pH-Stabilität, die vermutlich aus der
amphiphilen Eigenschaft resultiert. Theoretisch würden die hydrophilen Regionen des PEGs
mit der des Proteins binden, ebenso die hydrophoben Regionen, wodurch das Protein
Schalenartig geschützt würde. Des Weiteren könnte die thermische Stabilität aus einer
sterischen Hinderung resultieren.
In der pharmazeutischen Industrie werden die positiven Effekte von PEG für therapeutische
Proteine genutzt. Neben den bestehenden Eigenschaften, soll PEG auch noch positive
Einflüsse aus die Pharmakokinetik (kleinere PEG-modifizierte Proteine werden schlechter
von den Nieren aus dem Blut gereinigt, Erhöhte Stabilität = Erhöhte Halbwertszeit) und
pharmakodynamik haben.
Des Weiteren aggregieren PEG-modifizierte Protein weniger und weisen auch eine geringere
Immunogenität auf.
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Für die Proteinkonjugation werden carboxymethyl funktionalisiertes PEG (CM-PEG)
verwendet, so dass nur das hydroxylierte Ende funktional bindet und Querverbindungen
zwischen Proteinen verhindert werden (siehe Abb. 9b).
10. Folie PEGylierungs Methoden
Eine Reihe von Methoden wurde entwickelt, um Proteine mit PEG zu verbinden. Ist
beispielsweise die positive Ladung des Lysins an der Außenseite des Proteins für die
Anwendung des Proteins wichtig, so würden sich alkylierte PEGs anbieten (siehe Abb. 10 j-l).
Das Substrat bindet als Schiff`schen Base an das Protein und wird anschließend durch
Cyanoborhydridreduktion zu einer Stabilen Verbindung. Der Nachteil wäre hierbei, dass die
Reaktion selber sehr lange dauert (etwa einen Tag) und dass Cyanoborhydrid toxisch ist. Bei
den restlichen Methoden (siehe Abb. 10 a-i) handelt es sich um Acetylierungen, bei denen
das Lysin seine positive Ladung verliert.
Die Modifikation von Proteinen über Trichlorotriazin ist weitverbreitet, jedoch kann es
hierbei zu Querverbindungen zwischen Proteinen kommen. Um den negativen Aspekt zu
umgehen wurde Trichlorotriazin mit zwei PEG-Molekülen verbunden. Als Nebenwirkung
verliert das Molekül allerdings an Reaktivität (weil die negative Ladung abnimmt). Zu
erwähnen ist ebenfalls, dass die Reaktionszwischenprodukte hierbei toxisch sind.
Enzymatisch gelingt es per Transglutaminase PEG an Proteine zu koppeln.
Quantifizierung
Die Menge des gebundenen PEGs kann mit MALDI oder ESI-TOF überprüft werden. Eine
weitere Methode wäre, dass die Menge des PEGs quantitativ über Norleucin bestimmt wird.
Dabei wird Norleucin als Spacer zwischen PEG und Protein integriert. Nach der Modifizierung
des Proteins wird über hydrolytische Spaltung das Norleucin vom Protein gespalten, um
anschließend den Durchschnitt der Menge zu bestimmen. Auf Grund der hohen Kosten
eignet sich das Verfahren jedoch nicht für industrielle Anwendungen.
11. Folie Glycokonjugation
In der Natur tritt ebenfalls PPM in Form von Glycosylierung auf. Darüber werden Proteine
gekennzeichnet und die Aktivität, Löslichkeit und Stabilität beeinflusst.
Mit Hilfe der Glycokonjugation können sich die Eigenschaften zunutze gemacht werden,
indem Proteine mit natürlichen oder synthetischen Polysacchariden konjugiert werden.
So kann beispielsweise von Trypsin (was z.B. Anwendung in der Waschmittelindustrie findet)
die pH-Stabilität verbessert und Substrataffinität gesteigert werden, indem es mit
Carboxymethylcellulose (CMC) modifiziert wird. Aber auch die Thermostabilität wird durch
Glycokonjugation verbessert. So steigt die Thermostabilität von Candida antartica lipase B
nachdem es mit Dextran modifiziert wurde von 18 auf 168 min bei 70 °C an. Ähnlich wie
beim PEG wird dieser Effekt durch sterische Hinderung erzeugt, die das Protein am Auffalten
hindern. Als positiver Nebeneffekt erfolgt eine Steigerung der spezifischen Aktivität, um
65 %. Verglichen mit PEG weisen Polysaccharide konjugiert an Protein ähnliche Effekte auf.
Ein geringer Unterschied besteht allerdings doch. Polysaccharide sind biologisch abbaubar
und weisen eine geringere Immunogenität als PEG auf.
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12. Folie Glycokonjugations Methoden
Es gibt zwei häufig verwendete chemische Methoden, um eine Glycokonjugation an
Proteinen durchzuführen. Beide Methode erfolgen in zwei Schritten (siehe Abb. 11). Im
ersten Schritt der ersten Methode wird zuerst das Polysaccharid mit Natriumperiodat
(NaIO4) oxidiert, so dass Aminogruppen des Proteins mit den erzeugten Aldehyden
reagieren können und Schiff`sche Basen entstehen. Anschließend erfolgt eine Reduktion
durch beispielsweise Natriumborhydrid (NaBH4), wodurch eine stabile Verbindung zwischen
Polysaccharid und Protein gebildet wird.
Bei der zweiten Methode wird die Bindung zwischen Carboxymethylcellulose (CMC) zu einer
primären Amino-Gruppe (z.B. von Lysin) ermöglicht (siehe Abb. 11b). Hierbei dienen
Carbodiimide als Aktivatoren der Polysaccharide, die anschließend an das Protein binden
können.
Es gibt allerdings auch chemoenzymatische Kopplungen. Beispielsweise ist Transglutaminase
in der Lage Polysaccharide, die zuvor mit Diamin funktionalisiert wurden an Primäre
Carboxylgruppen von Proteinen zu binden.
13. Folie
Neben PEG und Polysacchariden gibt es noch weitere Modifikationen mit beispielsweise
POA-MAA. POA-MAA ist ein synthetisches Copolymer, dass aus Polyoxyalylen und
Maleinsäureanhydrid besteht und dessen hydrophylen Eigenschaften je nach Zusammensetzung beeinflusste werden.
Industriell findet beispielsweise POA-MAA-Modifikationen in der Bioethanol Herstellung
Anwendung. Dabei wird Cellualse modifiziert, was zu einer gesteigerten Umsatzrate von
Glucose führt.
Des Weiteren sind Modifikationen von Proteinen mit kleinen Anhydriden weit verbreitet.
Häufig werden sie Eingesetzt, um die Ladung von Proteinoberflächen zu neutralisieren oder
zu verändern und um die Thermostabilität gezielt zu beeinflussen. So zeigte ein Versuch, in
dem Meerettichperoxidase sowohl mit Monocarbonsäure als auch mit Dicarbonsäure
Anhydriden modifiziert wird (siehe Abb. 12), dass beide modifizierten Proteine bei 65 °C
stabil sind. Bei Temperaturen über 65 °C ist jedoch nur noch die Meerettichperoxi-dase mit
Monocarbonsäure stabil. Es scheint eine Balance zu bestehen, bei der hydrophyle
Eigenschaft der Carbonsäuren die Proteine stabilisieren und elektrostatische
Wechselwirkungen die Proteine destabilisiert. Während die Bedeutung des hydrophylen
Effekts bei niedrigeren Temperaturen größer ist, nimmt die Bedeutung der elektrostatischen
Wechselwirkungen mit zunehmender Temperatur zu. Dieses duale Verhalten findet in der
Lebensmittelindustrie Anwendung. Dabei bleiben die Enzyme während des Prozess stabil
und liegen und im Endprodukt inaktiviert vor.
14. Folie Zusammengetragene Effekte
Die Natur hat unzähliche Enzyme geschaffen, deren industrielle Anwendung, im Vergleich zu
chemishen Verfahren wesentlich Umweltschonender ist. Sie erlaben die Herstellung neuer
Produkte, die chemisch nur schwer herzustellen sind. Allerdings kann nur ein Teil der
Enzyme für industrielle Zwecke genutzt werden. Der Hauptgrund dafür ist, dass die
industriellen Prozessbedingungen sich sehr stark von denen im Wirtsorganismus
unterscheiden.
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Über die PPM können Proteine sowohl mit natürlichen als auch mit synthetischen
Substarten kombiniert werden, wodurch ein weites Spektrum an Modifikationen möglich ist.
Wird allerdings ein Protein mit einem Molekül kombiniert so ist nicht gleich damit zu
rechnen, dass auch die Stärken beider kombiniert werden. Proteine haben eine individuelle
Struktur, die Kombination mit anderen Molekülen kann bei jedem Protein unterschiedlich
Resultate erzeugen. Aus der bestehenden Literatur lassen sich allerdings ein paar
Erkenntnisse zusammentragen, die in den folgenden Tabellen aufgelistet sind.
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