Protein modifizierende Enzyme

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Post-production of industrial enzymes
Inge J. Minten, Nicolas Abello, Margot E. F. Schooneveld-Bergmans, Marco A. van den Berg
Appl Microbiol Biotechnol 98:6215-6231 (2014)
Seminar von Carl-Lucas Vogel
28.01.2015
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Enzyme
Abb. 1: Animierte Abbildung eines Enzyms.
Abb. 2: Henkel-Werk, Düsseldorf-Holthausen
Enzym Eigenschaften
Industrielle Anwendungsgebiete
- hoch effiziente Katalysatoren
- Lebensmittelindustrie
- umweltverträglich
- Waschmittelindustrie
- funktionsfähig bei milde Reaktionsbedingungen
- pharmazeutische Industrie
- gebunden an wässrige Umgebung
- Papierherstellung
- kompatibel mit anderen Enzyme
- hohe Selektivität
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Post-Produktions-Modifikation (PPM)
Lysin
Hoch frequentiertes Auftreten an der Oberfläche
von Proteinen.
-> Gut geeignet, um Proteine über die ε-Aminogruppe der Seitenkette zu modifizieren.
Abb. 3: Lysin, rot markiert: ε-Aminogruppe.
Abb. 4: Häufig verwendete Methoden zur Modifikation von Lysin. Orange: Protein. Spirale: Modifikation z.B. Polymer.
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Post-Produktions-Modifikation (PPM)
Cystein, Glutamin- und Asparaginsäure
a)
Kommen seltener auf der Oberfläche von
Proteinen vor.
-> Gut geeignet, um Proteine regioselektiv zu
modifizieren.
b)
c)
Abb. 6: Häufig verwendete Methoden zur Modifikation von
Cystein. Orange: Protein. Spirale: Modifikation z.B. Polymer.
Abb. 5: a Cystein, rot markiert: Thiolgruppe.
b Glutaminsäure, rot markiert: Carboxylgruppe.
c Asparaginsäure, rot markiert: Carboxylgruppe.
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Protein modifizierende Enzyme
Der Großteil der PPM werden chemisch durchgeführt und es gibt nur wenige etablierte
enzymatische Verfahren.
Protein modifizierende Enzyme
- Transglutaminase
EC 2.3.2.13
- Sortase A
EC 3.4.22.70
- Protein Farnesyltransferase EC 2.5.1.58
- Endoglykosidase H
EC 3.2.1.96
- Peptide-N-glykosidase
EC 3.5.1.52
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Protein modifizierende Enzyme
Transglutaminase (EC 2.3.2.13)
Reaktion
Verbindung zwischen Glutamin und einer primären Aminogruppe
Anwendung
- Verklebung von Fleischstücken in der Nahrungsmittelindustrie
- Modifizierung von Proteine → bessere Konservierung von Nahrungsprodukten
- Durchführung von Desamidierungen → Destabilisierung von Proteinen (= Inhibierung)
Abb. 7: Schematische Darstellung der Protein Modifikation durch Transglutaminase. Orange: Protein. Spirale: Modifikation.
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Protein modifizierende Enzyme
Sortase A (EC 3.4.22.70)
Protein-Farnesyltransferase (EC 2.5.1.58)
Reaktion
Ligation von Akzeptor mit LPXTG-Motiv und
Donor mit terminalem Stickstoff und Oligoglycin-Motiv.
Reaktion
Bindung von Farnesyl an ein Cystein mit der
Erkennungssequenz CAAX
Das C-Terminale Ende wird durch das
Substrat ersetzt.
Die Franesylgruppe dient als Stiel für funktionale
Substanzen (z.B. PEG)
a)
b)
Abb. 8: Schematische
Darstellung der Protein
Modifikation durch Sortase A
(a) und PFTase (b).
Orange: Protein.
Spirale: Modifikation.
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Polyethylenglycol (PEG)
Abb. 9: Polyethylenglycol (PEG) (a), carboxymethyl funktionalisiertes PEG (CM-PEG) (b).
Polyethylenglycol (PEG) vermittelte Eigenschaften
- nicht toxisches synthetisches Polymer
- amphiphile Eigenschaft
→ verbesserte Löslichkeit in wässrigen und organischen Lösungen
→ erhöhte thermische und pH Stabilität
- hygroskopische Eigenschaft
→ Stabilität und Aktivität der Proteine bleibt in organischen Lösungen erhalten, da eine
H2O-Schicht um die Protein gebildet wird.
- positiver Einfluss auf Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Immunogenität
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PEGylierungs Methoden
Abb. 10: Methoden der PEG-modifizierung von Proteinen an primären Aminen. a PEG Trichlorophenyl Carbonat. b PEG p-Nitrophenylcarbonat. c PEG Benzoltriazol. d PEG Carbonylimidazol. e PEG Succinimidyl Carbonat. f PEG Succinimidyl Ester. g PEG Dichlorotriazin.
h PEG2 Chlorotriazin. i PEG Sucinate Succinimidyl Diester. j PEG Tresylat. k PEG Epoxid. l PEG Propanal. Orange: Protein.
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Glycokonjugation
Polysaccharid vermittelte Eigenschaften
- Verbesserte Löslichkeit
- Verbesserung der Thermo-, pH-, Stabilität
- Steigerung der Substrataffinität
- biologisch abbaubar
- geringe Immunogenität
a)
b)
Abb. 11: Chemische Konjugation von
Polysacchariden zu Proteinen. a Konjugation
durch reduktive Alkylierung. b Konjugation mit
Carbodiimid als Aktivator.
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Glycokonjugations Methoden
1. Methode
2. Methode
1. Schritt: Oxidation der Polysaccharide
mit Natriumperiodat (NaIO4)
→ Amino-Gruppen des Proteins binden an
erzeugten Aldehyden = Schiff`schen Base
1. Schritt: Aktivierung der Carboxymethylcellulose (CMC) mit Carbodiimiden
2. Schritt: Reduktion durch Natriumborhydrid (NaBH4) = stabile Verbindung
zwischen Polysaccharid und Protein
2. Schritt: Protein bindet über primäres
Amid an das Polysaccharid
a)
b)
Abb. 11: Chemische Konjugation von
Polysacchariden zu Proteinen. a Konjugation
durch reduktive Alkylierung. b Konjugation mit
Carbodiimid als Aktivator.
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weitere modifikations Substrate
POA-MAA
- synthetisches Copolymer aus Polyoxyalylen und Maleinsäureanhydrid
- Zusammensetzung bestimmt die hydrophilen Eigenschaften
kleinen Anhydride
- Neutralisierung oder Veränderung der Proteinoberflächenladung
- gezielte Beeinflussung der Thermostabilität
Abb. 12: a Konjugation von Monocarbonsäure Anhydrid und Protein. b Konjugation von Dicarbonsäure Anhydrid und Protein.
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Zusammengetragene Effekte
Tabelle 1:
Zusammengetragene
Effekte verschiedener
Enzymmodifikationen.
Schwarz: negativer
Effekt; dunkelgrau:
positiver Effekt; hellgrau:
kein Effekt; weiß: wurde
im Paper nicht
untersucht.
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Zusammengetragene Effekte
Tabelle 2:
Zusammengetragene
Effekte verschiedener
Enzymmodifikationen.
Schwarz: negativer
Effekt; dunkelgrau:
positiver Effekt; hellgrau:
kein Effekt; weiß: wurde
im Paper nicht
untersucht.
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Eigenschaften
Polyethylenglycol (PEG)
Polysaccharid
- Verbesserte Löslichkeit
- Verbesserte Löslichkeit
- Verbesserung der Thermo- u. pH-Stabilität
- Verbesserung der Thermo- u. pH-Stabilität
- Steigerung der Substrataffinität
- Steigerung der Substrataffinität
- positiver Einfluss auf Pharmakokinetik,
- biologisch abbaubar
Pharmakodynamik und Immunogenität
- geringe Immunogenität
Polymere
Anhydride
- erhöhte Termo- u. pH-Stabilität
- erhöhte Termostabilität
- erhöhte Aktivität
- erhöhte Aktivität
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