Post-production of industrial enzymes Inge J. Minten, Nicolas Abello, Margot E. F. Schooneveld-Bergmans, Marco A. van den Berg Appl Microbiol Biotechnol 98:6215-6231 (2014) Seminar von Carl-Lucas Vogel 28.01.2015 2 Enzyme Abb. 1: Animierte Abbildung eines Enzyms. Abb. 2: Henkel-Werk, Düsseldorf-Holthausen Enzym Eigenschaften Industrielle Anwendungsgebiete - hoch effiziente Katalysatoren - Lebensmittelindustrie - umweltverträglich - Waschmittelindustrie - funktionsfähig bei milde Reaktionsbedingungen - pharmazeutische Industrie - gebunden an wässrige Umgebung - Papierherstellung - kompatibel mit anderen Enzyme - hohe Selektivität 3 Post-Produktions-Modifikation (PPM) Lysin Hoch frequentiertes Auftreten an der Oberfläche von Proteinen. -> Gut geeignet, um Proteine über die ε-Aminogruppe der Seitenkette zu modifizieren. Abb. 3: Lysin, rot markiert: ε-Aminogruppe. Abb. 4: Häufig verwendete Methoden zur Modifikation von Lysin. Orange: Protein. Spirale: Modifikation z.B. Polymer. 4 Post-Produktions-Modifikation (PPM) Cystein, Glutamin- und Asparaginsäure a) Kommen seltener auf der Oberfläche von Proteinen vor. -> Gut geeignet, um Proteine regioselektiv zu modifizieren. b) c) Abb. 6: Häufig verwendete Methoden zur Modifikation von Cystein. Orange: Protein. Spirale: Modifikation z.B. Polymer. Abb. 5: a Cystein, rot markiert: Thiolgruppe. b Glutaminsäure, rot markiert: Carboxylgruppe. c Asparaginsäure, rot markiert: Carboxylgruppe. 5 Protein modifizierende Enzyme Der Großteil der PPM werden chemisch durchgeführt und es gibt nur wenige etablierte enzymatische Verfahren. Protein modifizierende Enzyme - Transglutaminase EC 2.3.2.13 - Sortase A EC 3.4.22.70 - Protein Farnesyltransferase EC 2.5.1.58 - Endoglykosidase H EC 3.2.1.96 - Peptide-N-glykosidase EC 3.5.1.52 6 Protein modifizierende Enzyme Transglutaminase (EC 2.3.2.13) Reaktion Verbindung zwischen Glutamin und einer primären Aminogruppe Anwendung - Verklebung von Fleischstücken in der Nahrungsmittelindustrie - Modifizierung von Proteine → bessere Konservierung von Nahrungsprodukten - Durchführung von Desamidierungen → Destabilisierung von Proteinen (= Inhibierung) Abb. 7: Schematische Darstellung der Protein Modifikation durch Transglutaminase. Orange: Protein. Spirale: Modifikation. 7 Protein modifizierende Enzyme Sortase A (EC 3.4.22.70) Protein-Farnesyltransferase (EC 2.5.1.58) Reaktion Ligation von Akzeptor mit LPXTG-Motiv und Donor mit terminalem Stickstoff und Oligoglycin-Motiv. Reaktion Bindung von Farnesyl an ein Cystein mit der Erkennungssequenz CAAX Das C-Terminale Ende wird durch das Substrat ersetzt. Die Franesylgruppe dient als Stiel für funktionale Substanzen (z.B. PEG) a) b) Abb. 8: Schematische Darstellung der Protein Modifikation durch Sortase A (a) und PFTase (b). Orange: Protein. Spirale: Modifikation. 8 Polyethylenglycol (PEG) Abb. 9: Polyethylenglycol (PEG) (a), carboxymethyl funktionalisiertes PEG (CM-PEG) (b). Polyethylenglycol (PEG) vermittelte Eigenschaften - nicht toxisches synthetisches Polymer - amphiphile Eigenschaft → verbesserte Löslichkeit in wässrigen und organischen Lösungen → erhöhte thermische und pH Stabilität - hygroskopische Eigenschaft → Stabilität und Aktivität der Proteine bleibt in organischen Lösungen erhalten, da eine H2O-Schicht um die Protein gebildet wird. - positiver Einfluss auf Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Immunogenität 9 PEGylierungs Methoden Abb. 10: Methoden der PEG-modifizierung von Proteinen an primären Aminen. a PEG Trichlorophenyl Carbonat. b PEG p-Nitrophenylcarbonat. c PEG Benzoltriazol. d PEG Carbonylimidazol. e PEG Succinimidyl Carbonat. f PEG Succinimidyl Ester. g PEG Dichlorotriazin. h PEG2 Chlorotriazin. i PEG Sucinate Succinimidyl Diester. j PEG Tresylat. k PEG Epoxid. l PEG Propanal. Orange: Protein. 10 Glycokonjugation Polysaccharid vermittelte Eigenschaften - Verbesserte Löslichkeit - Verbesserung der Thermo-, pH-, Stabilität - Steigerung der Substrataffinität - biologisch abbaubar - geringe Immunogenität a) b) Abb. 11: Chemische Konjugation von Polysacchariden zu Proteinen. a Konjugation durch reduktive Alkylierung. b Konjugation mit Carbodiimid als Aktivator. 11 Glycokonjugations Methoden 1. Methode 2. Methode 1. Schritt: Oxidation der Polysaccharide mit Natriumperiodat (NaIO4) → Amino-Gruppen des Proteins binden an erzeugten Aldehyden = Schiff`schen Base 1. Schritt: Aktivierung der Carboxymethylcellulose (CMC) mit Carbodiimiden 2. Schritt: Reduktion durch Natriumborhydrid (NaBH4) = stabile Verbindung zwischen Polysaccharid und Protein 2. Schritt: Protein bindet über primäres Amid an das Polysaccharid a) b) Abb. 11: Chemische Konjugation von Polysacchariden zu Proteinen. a Konjugation durch reduktive Alkylierung. b Konjugation mit Carbodiimid als Aktivator. 12 weitere modifikations Substrate POA-MAA - synthetisches Copolymer aus Polyoxyalylen und Maleinsäureanhydrid - Zusammensetzung bestimmt die hydrophilen Eigenschaften kleinen Anhydride - Neutralisierung oder Veränderung der Proteinoberflächenladung - gezielte Beeinflussung der Thermostabilität Abb. 12: a Konjugation von Monocarbonsäure Anhydrid und Protein. b Konjugation von Dicarbonsäure Anhydrid und Protein. 13 Zusammengetragene Effekte Tabelle 1: Zusammengetragene Effekte verschiedener Enzymmodifikationen. Schwarz: negativer Effekt; dunkelgrau: positiver Effekt; hellgrau: kein Effekt; weiß: wurde im Paper nicht untersucht. 14 Zusammengetragene Effekte Tabelle 2: Zusammengetragene Effekte verschiedener Enzymmodifikationen. Schwarz: negativer Effekt; dunkelgrau: positiver Effekt; hellgrau: kein Effekt; weiß: wurde im Paper nicht untersucht. 15 Eigenschaften Polyethylenglycol (PEG) Polysaccharid - Verbesserte Löslichkeit - Verbesserte Löslichkeit - Verbesserung der Thermo- u. pH-Stabilität - Verbesserung der Thermo- u. pH-Stabilität - Steigerung der Substrataffinität - Steigerung der Substrataffinität - positiver Einfluss auf Pharmakokinetik, - biologisch abbaubar Pharmakodynamik und Immunogenität - geringe Immunogenität Polymere Anhydride - erhöhte Termo- u. pH-Stabilität - erhöhte Termostabilität - erhöhte Aktivität - erhöhte Aktivität 16 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit 17