Surfactantproteine als Marker für Abstoßung oder - biomed

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wissenschaft & praxis
veolarepithelzellen genannt werden, bilden
und speichern den Surfactant. Surfactant setzt
sich zu 90% aus Lipiden
und zu 10% aus surfactantspezifischen Proteinen zusammen. Die Surfactantproteine werden
in 2 Gruppen gegliedert.
Es gibt die hydrophilen
Zusammenfassung der Diplomarbeit von Michaela Hochenegger,
Surfactantproteine-A
die 2001 an der MTA-Akademie Innsbruck diplomierte.
und -D (SP-A, SP-D) und
die hydrophoben Surfactantproteine-B und -C
(SP-B, SP-C). SP-A, SP-B sowie SP-C sind sehr stark mit Li1.Einleitung
piden assoziiert (Abb.: Gel-Silberfärbung von Surfactantproteine).
1.1 Lungentransplantation
Man glaubte Surfactantproteine nur in der Lunge zu finDie erste erfolgreiche Lungentransplantation den, doch wurden mittlerweile SP-A, SP-B und SP-D bereits
im Serum
(LuTX) am Menschen wurde in den frühen
mittles
80er Jahren durchgeführt. Seit damals steigt
wissenschaft
ELISA
die Zahl der LuTX sowie die Zahl der Patien& praxis
(Enzymeten, die eine Transplantation benötigen, rasch
linked-iman. Der Grund dafür ist die ständige Erweiterung des Krankmunosorheitsspektrums, welches eine LuTX als letztmöglichen Thebent Asrapieansatz zur Heilung vorsieht. Eine LuTX soll dem Patiensay) detekten eine bessere Lebensqualität zurückgeben. Eine LuTX
tiert. Es
wird vor allem bei Patienten mit einer fortgeschrittenen Lungibt vergenparenchym- oder Lungenkreislauferkrankung durchgeschiedene
führt. Die häufigsten Indikationen sind Lungenemphysem,
HypotheMucoviszidose, Lungenfibrose und pulmonale Hypertonie.
Gel-Silberfärbung von Surfactantproteine
sen für den
Statistiken zeigen, dass die 1-, 2- und 3-Jahres-ÜberlebensÜbertritt
raten nach einer LuTX durchschnittlich 70%, 60% und
der Surfac50% betragen. Die Gefahr einer Abstoßung oder Infektion
darf auch nach dem Krankenhausaufenthalt nicht vergessen tantproteine aus der Lunge im Rahmen von Lungenerkranwerden. Um postoperative Komplikationen in Schach zu kungen: 1. eine Destruktion der Barriere zwischen Alveolahalten, ist nach einer LuTX die immunsuppressive Therapie repithel und Gefäß basierend auf einem Basalmembransehr wichtig. Die Unterdrückung der Abwehrreaktion des schaden, 2. eine Erhöhung der Permeabilität im Bereich der
Körpers wird auch als Immuntoleranz bezeichnet. Die Im- Lungenvenen, 3. der Gradient in den Surfactantprotein-Konmunsuppression darf nur in einem gewissen Ausmaß erfol- zentrationen zwischen Alveole und Blut. Im Serum gesunder
gen, denn das Immunsystem soll seine eigentlichen Aufgaben Menschen sind nur sehr geringe Surfactantprotein-Konzennoch erfüllen können. Zu diesen Aufgaben zählen die Er- trationen (ng/ml) zu erwarten. Ziel meiner Untersuchung
kennung und Beseitigung von Bakterien, Viren, Pilzen und war es, einen Immunoassay für SP-A zu entwickeln, der senTumorzellen. Auch soll der Patient so wenig wie möglich sitiv sowie spezifisch genug ist, SP-A im Serum Gesunder sodurch die immunsuppressiven Medikamente beeinträchtigt wie im Serum von LuTX-Patienten zu messen.
werden. Die Immuntoleranz wird mit der Basisimmunsuppression eingestellt. Tritt eine Abstoßungsreaktion auf, wird 2. Ziel der Arbeit
zusätzlich zur Basisimmunsuppression eine AbstoßungsbeDurch eine longitudinale Beobachtung der Surfactanthandlung hinzugefügt. Immunsuppressiva zur Prophylaxe einer Abstoßung sind Glucocorticoide, Azathioprin, Cyclos- protein-Konzentrationen im Serum von LuTX-Patienten sollporin, Antithymozytenglobulin und Okt3 (orthoklonaler, te man Erkenntnisse über eine Abstoßung oder Infektion der
gegen den T-Zellrezeptor gerichteter Antikörper). Bei einer transplantierten Lunge erhalten und dadurch eine frühzeitiAbstoßungsbehandlung werden diese Immunsuppressiva in ge gezielte Behandlung des LuTX-Patienten erreichen. Ein
plötzlicher, starker Konzentrationsanstieg der Surfactantverschiedenen Kombinationen eingesetzt.
proteine im Serum könnte auf einen generalisierten Prozeß im
Sinne einer akuten Abstoßungsreaktion in der Lunge hin1.2 Surfactantproteine
weisen. Ein langsamer Anstieg der Surfactantprotein-KonSurfactant ist ein Lipid-Protein-Komplex, dessen Haupt- zentrationen könnte möglicherweise charakteristisch für eiaufgabe die Herabsetzung der Oberflächenspannung an ne Infektion sein, da eher ein lokalisierter Prozeß vorliegt. Soder Gasaustauschfläche der Alveolen in der Lunge ist (Ge- mit lautet die Hypothese, dass bei Abstoßung der Lunge
setz von Laplace, Kurt Neergard, 1929). Die Alveolen wer- höhere Surfactantprotein-Konzentrationen im Serum von
den von Alveolarepithelzellen ausgekleidet. Die Alveola- LuTX-Patienten zu erwarten sind als bei einer Infektion der
repithelzellen vom Typ 2 , welche auch „granulierte“ Al- Lunge.
Surfactantproteine als Marker für
Abstoßung oder Infektion nach
Lungentransplantation
q
wissenschaft & praxis
3. Methodik und
Ergebnisse
Wie schon oben erwähnt,
habe ich mich mit der Entwicklung eines Immunoassay
für das hydrophile SP-A befasst, das im Serum eines Gesunden in einer Konzentration von ca. 50 ng/ml vorliegt.
3.1 Immunoassay
3.1.1 SP-A ELISA
Als erstes versuchte ich
mittels ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent Assay) eine
SP-A-Standardkurve zu erstellen. Gecoatet wurde die
Mikrotiterplatte mit humanem SP-A, das aus einer
bronchoalveolären Lavage
gereinigt wurde. Es wurde eine Verdünnungsreihe in
log2-Schritten ab der Verdünnung 300 ng/ml bis 0,59
ng/ml in der Platte hergestellt. Da ein Gesunder eine
SP-A-Konzentration im Serum von ca. 50 ng/ml hat, sollte er somit innerhalb des pipettierten Bereiches des Standards liegen. Nach dem Blocken der Mikrotiterplatte wurde das Antigen (SP-A) mit einem monoklonalen Antikörper
(Maus-anti-SP-A) inkubiert. Nach dieser Inkubation gab
man zum Antigen-Antikörper-Komplex ein horse-raddishperoxidase markiertes Konjugat (Anti-Maus-IgG-HRP)
in die Mikrotiterplatte. Nach der Inkubation der jeweiligen Antikörper
fand ein mehrmaliges Waschen
ELISA-Prinzip
statt, um überschüssige ungebundene Antikörper zu entfernen. Nach Zugabe des Substrates
(Tetramethylbenzidin) katalysierte das Enzym
des Konjugates
die Substratumsetzung (FarbEntwicklung).
Diese Farbentwicklung wurde
nach einer bestimmten Zeit gestoppt und anschließend
photometrisch gemessen (Abb.: ELISA-Prinzip). Es ist
wichtig, bei jedem ELISA einen Blank (kein Antigen-Coating) sowie eine Konjugat-Kontrolle (Fehlen des spezifischen Antikörpers) mitzuführen. Mit dieser ELISA-Methode erhielt ich eine relativ kurze Standardkurve, mit einer unteren Nachweisgrenze von 18,75 ng/ml. Da unsere
negative Kontrolle (Gesunder) bei dieser Standardkurve im
unteren Bereich zu erwarten wäre, wurde eine sensitivere
Methode in Betracht gezogen.
Während der Operation
3.1.2. SP-A DELFIA
Da Fluoreszenz-Messungen meist sensitiver sind als photometrische Messungen, wurde eine SP-A-Standardkurve nach
dem DELFIA-Prinzip (Dissoziation-enhancement linked fluoreszenz immunosorbent Assay) erstellt. Diese Methode beruht auf der speziellen fluoreszierenden Wirkung der Lanthaniden. Lanthanide gehören zu der 3. Nebengruppe im Periodensystem. Meistens wird Europium (Eu3+) verwendet. Eu3+
kann stabile Fluoreszenz-Komplexe formen, welche lange
Halbwertszeiten sowie hohe Fluoreszenz-Intensitäten besitzen.
Um dieses Nachweisverfahren noch sensitiver zu gestalten,
wird ein enzymatischer Schritt (Streptavidin-Europium) eingeführt. Nachdem der spezifische Antikörper an das gecoatete
Antigen gebunden hat, wird der Antigen-Antikörper-Komplex mit einem biotinylierten Antikörper inkubiert. Nach der
Inkubation und nach dem Waschschritt wird Streptavidin mit
Europium gekoppelt hinzugegeben. Streptavidin hat eine sehr
hohe Affinität zu Biotin. Dieser enzymatische Schritt vervielfacht das Assay-Signal. Überschüssiges Streptavidin mit Europium gekoppelt wird weggewaschen und als letzten Schritt
gibt man die Enhancement Solution dazu. Die Enhancement
Solution bewirkt aufgrund ihres niederen pH-Wertes das Ablösen des Europiums vom nicht fluoreszierenden StreptavidinKomplex. Die freien Kationen des Europiums formen neue
hochfluoreszierende, stabile Chelate, welche schützend von
Mizellen der Enhancemant Solution umgeben werden. Dieses
DELFIA-System bietet hohe Sensitivität, stabile Fluoreszenz
und reproduzierbare Resultate. Gemessen wird die Fluoreszenz
für 1 sec in einem Time-resolved-Fluorometer bei einer Extinktions-Wellenlänge von 340 nm und einer Emission von
614 nm. Angegeben wird die gemessene Fluoreszenz in Fluorescence counts per seconds (Fl-cps). Mit diesem Prinzip
erreichte ich eine zufriedenstellende SP-A-Standardkurve,
die einen interessanten, relevanten Messbereich (300 – 0,59
ng/ml) für SP-A zeigte. Für alle weiteren Versuche wurde daher diese DELFIA-Methode angewandt.
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3.2 Messung der SP-A-Konzentration
im Serum
Nachdem ich die DELFIA-SP-A-Standardkurve einer
Qualitätssicherung unterzogen hatte, wollte ich im nächsten
Schritt die SP-A-Konzentration im Serum eines Gesunden
(negative Kontrolle) messen. Leider konnte kein SP-A direkt
nachgewiesen werden, da wahrscheinlich kein Coating von
SP-A stattfindet. Das menschliche Serum hat einen Gesamtproteingehalt von ca. 70 mg/ml. Es ist zu berücksichtigen, dass
möglicherweise SP-A mit all den anderen Proteinen um die
Bindungsstellen in der Mikrotiterplatte konkurrieren muss.
Da SP-A nur in sehr geringen Mengen im Serum zu vermuten
ist, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass all die anderen „Störproteine“ die Bindungsstellen an der Mikrotiterplatte besetzen. Weiters darf man nicht vergessen, dass Surfactantproteine stark mit Phospholipiden assoziiert sind, die auf diese
Weise das Protein maskieren und für spezifische erste Antikörper schwer erkennbar machen. Auf alle Fälle bedarf es einer Vorbehandlung des Serums, damit man SP-A im Serum
mit diesem Testprinzip messen kann.
3.2.1 Detergens-Vorbehandlung des Serums
Detergenzien sind synthetisch hergestellte Seifen mit stark
polaren und apolaren Verbindungen. Der apolare Teil des
Detergenz reicht ins Fetttröpfchen (Phospholipide) hinein,
der polare Teil hingegen ist der Lösung (Wasser / Hauptbestandteil des Serums) zugewandt. Auf diese Weise sollten die
Phospholipide, die unser SP-A-Molekül umgeben können,
feinst emulgiert werden. Anstatt des üblich verwendeten PBSPuffer als Probenpuffer, um die Verdünnungsreihe in der Mikrotiterplatte herzustellen, wurde eine Detergenzlösung mit
0,2 % BSA, 0,05 % Tween 20 und 1 % Triton in PBS verwendet. Weder vorbehandeltes, gereinigtes SP-A noch vorbehandeltes Serum eines Gesunden zeigten ein Fluoreszenzsignal. Daraus war zu schließen, dass das Detergenz an die
Mikrotiterplatte ebenfalls coatet und somit mit dem Ag um
die Bindungsstellen konkurrierte. Aufgrund dieser Tatsache
wurde dieselbe Detergenzlösung erst nach dem Coaten und
Blocken als zusätzlicher Schritt eingefügt. Das Ergebnis dieser Vorbehandlung zeigte zwar eine zufriedenstellende Standardkurve mit gereinigtem SP-A, jedoch im Serum waren
keine Fl-cps-Signale zu messen.
3.2.2 EDTA-Vorbehandlung des Serums
Es ist bewiesen, dass Lipidbindungen durch Ca2+-Ionen
verstärkt werden. Da EDTA (Ethylendiamine-tetraacetic
Acid) Ca2+-Ionen bindet, sollte man dadurch die Lipide vom
Protein lösen. Es wurde 5 mM EDTA dem Probenverdünnungspuffer beigefügt. Die Signale der SP-A-Standardkurve
mit EDTA-Behandlung beim Coating waren wesentlich geringer als die der Standardkurve ohne Behandlung. Im Serum
eines gesunden Patienten konnten wiederum keine Fluoreszenzsignale nachgewiesen werden.
3.2.3 Lipase-Vorbehandlung des Serums
Durch eine Inkubation des Serums mit Lipase erhofft
man sich, dass störende Phospholipide an den Surfactantproteinen abgebaut werden und die Epitope dadurch frei
zugänglich werden. Die Lipase spaltet die Phospholipide
zwischen dem Glycerol und den Fettsäuren. Die gesamte Lipidkonzentration im Serum eines Gesunden beträgt ca. 9
mmol/l. Die verwendete Lipase stammt aus dem Chromobacterium viscosum und spaltet bei 37 °C 1 µmol Fettsäure/min bei einem pH-Wert von 8 ab. Die Lipase wurde im
Verhältnis 1:2 und 1:10 zu der normalen Lipidkonzentration im Serum eingesetzt. Da die Lipase ein Enzym und somit
ein Protein ist, wurde diese Behandlung auch erst nach dem
Blocken eingeschoben, um ein Coating der Lipase zu verhindern. Überraschend war zu beobachten, dass die SP-AStandardkurve mit der 10fachen Lipase-Anwendung wesentlich höhere Signale zeigte als bei unbehandeltem SP-A.
Doch leider waren im Serum wiederum keine Fluoreszenzsignale aufgetreten.
3.2.4 Affinitätschromatographie und Immunpräzipitation
Aufgrund der vorhergehenden Ergebnisse wurde der
„Seize-X-Protein-G-Immunoprecipitation-Kit“ (Firma Pierce)
als weitere Vorbehandlungsmöglichkeit des Serums verwendet. Mit diesem Testkit sollte man das gewünschte Antigen (SP-A) mittels eines monoklonalen Antikörpers spe-
wissenschaft & praxis
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munoprecipitation Kit). Sämtliche
Versuche mit dem „Seize-X-Immunoprecipitation-Kit“, die mittels
DELFIA kontrolliert wurden, wiesen darauf hin, dass der Antikörper
SP-A bindet, jedoch SP-A nicht
mehr eluiert werden kann. Dies ist
vermutlich auf die extrem hohe Affinität des Antikörpers zum SP-AMolekül (Ka = 1 x 1011 M–1) zurückzuführen.
4. Zusammenfassung
Spenderlunge
zifisch aus dem Serum gewinnen und gleichzeitig den Antigen-Gehalt konzentrieren können. Diese Affinitätschromatographie basiert auf einer hochspezifischen Interaktion
zwischen dem Protein (Antigen) und dem immobilisierten Liganden. Der Ligand setzt sich aus 3 Teilen zusammen, den
„Trägerbeads“ (6 % Agarose), die mit Protein G beschichtet sind, und dem spezifischen Antikörper, der mit seinem
Fc-Teil an Protein G bindet. Der 1. Schritt bei der klassischen
Immunpräzipitationsmethode ist die Inkubation des Liganden mit der zu reinigenden Antigenlösung. Nach einer bestimmten Inkubationszeit haben sich Antigen-AntikörperKomplexe gebildet, die nun mit Hilfe der Trägerbeads abzentrifugiert werden können, alle Störproteine verbleiben im
Überstand. Anschließend muß das Antigen nur noch vom
Antikörper eluiert werden (Abb.: Seize-X-Protein-G-Im-
Das Ziel der Arbeit, einen immunologischen Test zur Messung
von SP-A im Serum zu entwickeln,
konnte bis jetzt teilweise erreicht
werden. Insbesondere fanden wir,
dass mittels DELFIA der interessante Meßbereich für SP-A abgedeckt werden kann. Gereinigtes, lipidfreies SP-A konnte
mittels DELFIA einfach und reproduzierbar genau gemessen werden. Im Gegensatz dazu bereitete die Messung von
SP-A im Serum Probleme, da SP-A-assoziierte Lipide sowie
die große Menge an Serumproteinen störten. Der Versuch,
durch eine Vorbehandlung des Serums mit Detergenzien,
EDTA oder Lipase die Detektierbarkeit von SP-A im Serum
zu ermöglichen, führte nicht zum Erfolg. Darüber hinaus erbrachten durchgeführte Immunpräzipitationen mit unterschiedlichen SP-A-Antikörpern zwecks Anreicherung des
Proteins bisher nicht den gewünschten Effekt. Abschließend
kann jedoch gesagt werden, daß die gewonnenen Erkenntnisse zu einem besseren Verständnis der komplexen
Protein-Lipid-Bindung führten und Affinitätsunterschiede
■
diverser SP-A-Antikörper aufzeigten.
Dipl. MTA
Michaela Hochenegger
Abstrakt der Diplomarbeit,
MTA-Akademie Innsbruck, 2001.
Ausgeführt an der Univ.-Klinik für Anästhesie
und Allgemeine Intensivmedizin der Universität
Innsbruck, in Zusammenarbeit mit dem
Institut für Pathophysiologie der Universität
Innsbruck, betreut durch A. Univ.-Prof. Dr. G.
Putz und A. Univ.-Prof. Dr. H. Wolf.
Herzlichst bedanken möchte ich mich bei MTA
Monika Blunder für ihre zuvorkommende, unermüdliche Betreuung während der gesamten Diplomarbeit sowie MTA Katharina Rossi für die
Einschulung auf dem Gebiet ELISA und DELFIA.
OP-Bilder dankenswerterweise von Univ.-Prof.
Dr. L. Müller, Univ.-Klinik für Chirurgie, klinische
Abteilung für Herzchirurgie (Innsbruck), zur Verfügung gestellt.
E-Mail: [email protected]