Ciss.ETH ox. 3 - ETH E

Ciss.ETH
ox.
3
1
Diss. ETH Nr.
UUI
POSITIVE
SELECTION
IN THYMIC REAGGREGATION CULTURE
A dissertation submitted to the
Federal Institut of
Technology (ETH),
Zurich, Switzerland, for the degree of
doctor of natural science
presented by
Bettina Ernst
Dipl.
Nat. Wiss. ETH
born December 14th, 1968
from Zurich, Switzerland
Hans
Hengartner, Ph.D,
Jonathan Sprent,
Rolf M.
MD.
Zinkernagel,
Ph.D, coexaminer
MD.
1996
examiner
Ph.D, coexaminer
7
1)
SUMMARY
Generation of
and
positive
insight
a
repertoire
negative
of mature T cells
a
combination of
selection directed to self MHC molecules. To
into the cellular events involved in
aspects of positive selection using
vitro selection
requires
thymic selection,
in vitro
an
thymic
system involves culturing together
a
we
gain
studied two
selection system. The in
slurry
fetal
thymic
populations
of cells
reaggregate together and the immature DP cells differentiate into
mature
positive, DP) thymocytes
epithelial
cells (TEC) at
with
an
positive
whether
requirements
the
cellular
and
MHC class I
(I"II+),
were
class II
molecules. These studies showed that class II
generation
of
of
TCRhi
CD4+8+
culture (TRC)
system
positive selection,
requirement
we
ii)
and
(I+IT)
or
generate TCRn* CD4+8"
or
MHC+ BM-derived cells.
perhaps reflecting
subsets of TEC and
was
cells.
essential for the
apparent with ril+
cross-reactive
Significantly,
the
Unexpectedly,
was
specificity
of
the failure of Til" TEC to
CD4"8+ cells could not be
These
positive
both class I and H (rTT)
expression
cells into CD4+8"
CD4"8+ cells for class II molecules.
in
established with TEC from mice
CD4"8+ cells from CD4+8+ cells
TEC but not with VW TEC,
purified
for
molecular
selection, thymic reaggregation cultures
differentiation
cells within 3-4 d, indicative
selection involves cell division.
address
selectively lacking
TCRhi
purified
the two
thymic reaggregation
the cellular
positive
To
and CD4"8+
selection. With this
investigated i)
dispersed population
air-liquid interphase;
single-positive (SP) CD4+8"
of
a
of
of CD4+8+ (double
findings, together
overcome
with
by adding
experiments
non-thymus-derived epithelial cells, suggest
on
that
8
positive
selection in
thymus reaggregation
cultures is
exclusive
an
property of
cortical TEC.
To
investigate
incubated
were
thymic
whether
various
at
time
bromodeoxyuridine (BrdU),
incorporation. By
found to be
high
and
on
day 1,
absence of blast
the
differentiated
proliferation
to
SP cells
into
low
on
is not
an
generated
TCRhi
SP cells
day
cells, small
DP
a
was
within the first 2-3 d.
a
high
rate of cell
was
cells
also
prominent
cultures
on
day
device to
expand
precursor,
stained
reaggregation
BrdU
cultures
Cell
4-5.
for
was
separation
restricted to DP blast cells.
failed
positive
to
proliferate
selection.
Surprisingly,
and
This
the SP cells
applied
generated
division; the proliferating SP cells
in the normal neonatal
prepared
DNA
division, thus indicating that
essential component of
by stimulatory cytokines
periphery.
1
without cell
perinatal thymic
released from TEC.
the mature T cell
We
TCRhi
and in TEC
speculate
that
microenvironment is
Such
repertoire
Turnover of
thymus
with adult LN T cells.
division of mature SP cells in the
be
high
were
and included both CD4+8" and CD4*8+ cells.
reaggregation
driven
2 and
day
the
with
thymocytes
on
cells
SP
later in culture showed
were
points
this method, T cell division in
studies established that cell division
In
selection involves cell division, TRC
proliferation
could
before export to the
9
ZUSAMMENFASSUNG
1^
T-Zellen, die sich
Saugetieren) befinden,
der
in
konnen
Peripherie
Peptide
von
Fremdantigenen
aus
(und
Mausen
anderen
zusammen
mit
Selbst-MHC als Restriktionselement erkennen. Gewohnlich finden sich keine
autoaggressiven T-Zellen
Eigenschaften
von
der
in
reifen T-Zellen
wahrend
der
negativer
Selektion unterschieden.
Urn
positiven
Peripherie
Reifung
im
detaillierte
Selektion im
Studie zwei bestimmte
kommt
Thymus.
Dabei
Thymus
Aspekte
zu
der
positiven
untersucht:
zellularen
fiir die
Zellteilung
Das
Beantwortung
Kultivierungs-System
erlaubt die
zwischen
zellularen
positiver
und
Vorgiinge
der
Rahmen
im
dieser
Selektion anhand eines in vitro
1) Was sind die molekularen und
positive
dieser
Thymus
Fragen
Reifung
von
Findet
Thymus? 2)
Selektion im
wahrend der Toleranz-Induktion im
zur
diesen
Zu
Selektionsprozesse
erhalten, wurden
Zell-Kultivierungs-Systems
Voraussetzungen
wird
die
Mausen.
durch
es
iiber
Erkenntnisse
von
statt?
gewahlte
CD4+CD8+
in
vitro
Zell-
doppelt positiven
(DP) T-Zellen, die noch keinen T-Zell-Rezeptor exprimieren (TCR"CD4+8+),
zu
nur
noch CD4 oder CD8
Dichte aufweisen (einfach
Dazu wurden
Zellen des
positive (SP)
gereinigte TCR~CD4+8+
Thymus reaggregiert
differenzieren innerhalb
und
positiven
CD4"8+ TCRn'
Selektion bezeichnend.
von
Zellen
3-4
T
Zellen, die hohe T-Zell-Rezeptor
CD4+8" und CD4'8+
Zellen
zusammen
und kultiviert.
Tagen
heran.
zu
TCRhi Zellen).
mit fotalen
Anfangs
Epithel
unreife DP Zellen
reifen, einfach positiven CD4+8"
Dieser
Vorgang
ist
fiir die
positive
10
Untersuchung
die
Fiir
Voraussetzungen
wurden
die
Antigene
1)
von
Klasse II (I'll")
von
Klasse
dass MHC Klasse II
(I+II~) Antigene
II
beobachtet werden, nicht
konnte eine Reaktivitat
Antigen Expression
Reifung
jedoch
von
Desweiteren wurde
gereinigten Teilgruppen
wurden
Untersuchung
den
Zeitpunkten
Die
zeigte,
dass die
fiir die
TEZ
die
eine exklusive
keine
und
von
positive
Eigenschaft
von
Zellen
DP Zellen
aus
am
1.
mit
von
Zellen
zu
der Zellen
zu
Beobachtungen
epithelialen
Selektion
Zellen
aus
Thymus-
in
der TEZ des Kortex ist.
Thymus Zellteilung verlangt
zugefiigt
verschiedenen
zu
und anschliessend die BrdU
gezeigt werden,
1. und 4.-5.
Fraktionierung
Zellteilung
Differenzierung
Reifung
zusammen
ob die Selektion im
am
Diese Studien
Antigen exprimierenden
Thymozyten
von
Es konnte
Zellteilung
war.
Zelloberflachen
dass im Falle der Zufuhr
gezeigt,
der DNA Vorlaufer BrdU
gering
den
exprimieren.
Thymus-Reaggregations-Kulturen
Inkorporation getestet.
Kulturen die
auf
Kulturen mit I'll" TEZ. Dieser Effekt
MHC
dass
zeigten,
Reaggregations-Kulturen
Zur
Mausen
Mausen, die keine
von
TCRhi CD4"8+
stattfindet. Dieses Resultat
Geweben
von
CD4~8+ Zellen mit dem MHC Klasse II Molekul
Knochenmark stammenden
anderen
von
in
Kulturen mit MHC" TEZ und DP
mit
Gruppen
ist. Ueberraschenderweise konnte in
unabdingbar
Kulturen mit I"II+ TEZ die
Thymozyten
2)
exprimieren;
auf den Zelloberflachen
DP Zellen in CD4+8" Zellen
SP
drei
Mausen, die weder funktionelle MHC Klasse I noch
Antigene
wiederspiegeln.
Reaggregations-Kulturen
in
von
molekularen
und
Mausen, die keine funktionellen MHC Klasse I (I"II+)
MHC
exprimieren; 3)
vom
Zellen (TEZ)
auf den Zelloberflachen
funktionellen
Selektion
positive
Thymus epitheliale
verwendet:
zeigten,
fiir
zellularen
der
dass in
Tag ausgepragt,
Reaggregations-
und
am
2.-3.
Tag
der unreifen DP Zellen nach ihrer Grosse
Tag
nur
bei Blast-Zellen
erfolgt:
Kleine DP
11
Zellen
(DP Zellen ohne Blast Zellen) proliferieren nicht, konnen aber
trotzdem
zu
SP Zellen reifen. Dies
Zellteilung notig
ist. Dies
zeigt,
gilt jedoch
dass fiir die
zeigten
iiberraschenderweise ausgepragte
Zellen
(CD4+8"
Teilung
und in
von
CD4"8+)
sowie
TCRhi
SP Zellen
Zellteilung;
Lymphknotens hinzugegeben
Zellteilung
von
reifen
vorgeburtlichen Thymus
von
SP
T-Zell-Repertoires
vor
Export
Thymus
wurden. Dies lasst vermuten, dass
Zellen
Zytokinen,
dem
Zellen. Die
in denen ausdifferentierte T-
in
die
der
von
in die
Mikroumgebung
Epithel
wurden, verursacht wird. Diese Zellteilung konnte
reifen
TCRhi
auch in normalem neonatalen
Reaggregations-Kulturen ausgepragt,
Zellen des
produziert wurden,
diese sich teilenden SP
vornehmlich
waren
war
Selektion keine
fiir SP Zellen, die in den ersten 2-3
nur
reifen. Reife T-Zellen, die spater in der Kultur
Tagen
die
positive
zur
Peripherie
Zellen
des
freigesetzt
Erweiterung
sinnvoll sein.
des