Ciss.ETH ox. 3 - ETH E
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Ciss.ETH ox. 3 1 Diss. ETH Nr. UUI POSITIVE SELECTION IN THYMIC REAGGREGATION CULTURE A dissertation submitted to the Federal Institut of Technology (ETH), Zurich, Switzerland, for the degree of doctor of natural science presented by Bettina Ernst Dipl. Nat. Wiss. ETH born December 14th, 1968 from Zurich, Switzerland Hans Hengartner, Ph.D, Jonathan Sprent, Rolf M. MD. Zinkernagel, Ph.D, coexaminer MD. 1996 examiner Ph.D, coexaminer 7 1) SUMMARY Generation of and positive insight a repertoire negative of mature T cells a combination of selection directed to self MHC molecules. To into the cellular events involved in aspects of positive selection using vitro selection requires thymic selection, in vitro an thymic system involves culturing together a we gain studied two selection system. The in slurry fetal thymic populations of cells reaggregate together and the immature DP cells differentiate into mature positive, DP) thymocytes epithelial cells (TEC) at with an positive whether requirements the cellular and MHC class I (I"II+), were class II molecules. These studies showed that class II generation of of TCRhi CD4+8+ culture (TRC) system positive selection, requirement we ii) and (I+IT) or generate TCRn* CD4+8" or MHC+ BM-derived cells. perhaps reflecting subsets of TEC and was cells. essential for the apparent with ril+ cross-reactive Significantly, the Unexpectedly, was specificity of the failure of Til" TEC to CD4"8+ cells could not be These positive both class I and H (rTT) expression cells into CD4+8" CD4"8+ cells for class II molecules. in established with TEC from mice CD4"8+ cells from CD4+8+ cells TEC but not with VW TEC, purified for molecular selection, thymic reaggregation cultures differentiation cells within 3-4 d, indicative selection involves cell division. address selectively lacking TCRhi purified the two thymic reaggregation the cellular positive To and CD4"8+ selection. With this investigated i) dispersed population air-liquid interphase; single-positive (SP) CD4+8" of a of of CD4+8+ (double findings, together overcome with by adding experiments non-thymus-derived epithelial cells, suggest on that 8 positive selection in thymus reaggregation cultures is exclusive an property of cortical TEC. To investigate incubated were thymic whether various at time bromodeoxyuridine (BrdU), incorporation. By found to be high and on day 1, absence of blast the differentiated proliferation to SP cells into low on is not an generated TCRhi SP cells day cells, small DP a was within the first 2-3 d. a high rate of cell was cells also prominent cultures on day device to expand precursor, stained reaggregation BrdU cultures Cell 4-5. for was separation restricted to DP blast cells. failed positive to proliferate selection. Surprisingly, and This the SP cells applied generated division; the proliferating SP cells in the normal neonatal prepared DNA division, thus indicating that essential component of by stimulatory cytokines periphery. 1 without cell perinatal thymic released from TEC. the mature T cell We TCRhi and in TEC speculate that microenvironment is Such repertoire Turnover of thymus with adult LN T cells. division of mature SP cells in the be high were and included both CD4+8" and CD4*8+ cells. reaggregation driven 2 and day the with thymocytes on cells SP later in culture showed were points this method, T cell division in studies established that cell division In selection involves cell division, TRC proliferation could before export to the 9 ZUSAMMENFASSUNG 1^ T-Zellen, die sich Saugetieren) befinden, der in konnen Peripherie Peptide von Fremdantigenen aus (und Mausen anderen zusammen mit Selbst-MHC als Restriktionselement erkennen. Gewohnlich finden sich keine autoaggressiven T-Zellen Eigenschaften von der in reifen T-Zellen wahrend der negativer Selektion unterschieden. Urn positiven Peripherie Reifung im detaillierte Selektion im Studie zwei bestimmte kommt Thymus. Dabei Thymus Aspekte zu der positiven untersucht: zellularen fiir die Zellteilung Das Beantwortung Kultivierungs-System erlaubt die zwischen zellularen positiver und Vorgiinge der Rahmen im dieser Selektion anhand eines in vitro 1) Was sind die molekularen und positive dieser Thymus Fragen Reifung von Findet Thymus? 2) Selektion im wahrend der Toleranz-Induktion im zur diesen Zu Selektionsprozesse erhalten, wurden Zell-Kultivierungs-Systems Voraussetzungen wird die Mausen. durch es iiber Erkenntnisse von statt? gewahlte CD4+CD8+ in vitro Zell- doppelt positiven (DP) T-Zellen, die noch keinen T-Zell-Rezeptor exprimieren (TCR"CD4+8+), zu nur noch CD4 oder CD8 Dichte aufweisen (einfach Dazu wurden Zellen des positive (SP) gereinigte TCR~CD4+8+ Thymus reaggregiert differenzieren innerhalb und positiven CD4"8+ TCRn' Selektion bezeichnend. von Zellen 3-4 T Zellen, die hohe T-Zell-Rezeptor CD4+8" und CD4'8+ Zellen zusammen und kultiviert. Tagen heran. zu TCRhi Zellen). mit fotalen Anfangs Epithel unreife DP Zellen reifen, einfach positiven CD4+8" Dieser Vorgang ist fiir die positive 10 Untersuchung die Fiir Voraussetzungen wurden die Antigene 1) von Klasse II (I'll") von Klasse dass MHC Klasse II (I+II~) Antigene II beobachtet werden, nicht konnte eine Reaktivitat Antigen Expression Reifung jedoch von Desweiteren wurde gereinigten Teilgruppen wurden Untersuchung den Zeitpunkten Die zeigte, dass die fiir die TEZ die eine exklusive keine und von positive Eigenschaft von Zellen DP Zellen aus am 1. mit von Zellen zu der Zellen zu Beobachtungen epithelialen Selektion Zellen aus Thymus- in der TEZ des Kortex ist. Thymus Zellteilung verlangt zugefiigt verschiedenen zu und anschliessend die BrdU gezeigt werden, 1. und 4.-5. Fraktionierung Zellteilung Differenzierung Reifung zusammen ob die Selektion im am Diese Studien Antigen exprimierenden Thymozyten von Es konnte Zellteilung war. Zelloberflachen dass im Falle der Zufuhr gezeigt, der DNA Vorlaufer BrdU gering den exprimieren. Thymus-Reaggregations-Kulturen Inkorporation getestet. Kulturen die auf Kulturen mit I'll" TEZ. Dieser Effekt MHC dass zeigten, Reaggregations-Kulturen Zur Mausen Mausen, die keine von TCRhi CD4"8+ stattfindet. Dieses Resultat Geweben von CD4~8+ Zellen mit dem MHC Klasse II Molekul Knochenmark stammenden anderen von in Kulturen mit MHC" TEZ und DP mit Gruppen ist. Ueberraschenderweise konnte in unabdingbar Kulturen mit I"II+ TEZ die Thymozyten 2) exprimieren; auf den Zelloberflachen DP Zellen in CD4+8" Zellen SP drei Mausen, die weder funktionelle MHC Klasse I noch Antigene wiederspiegeln. Reaggregations-Kulturen in von molekularen und Mausen, die keine funktionellen MHC Klasse I (I"II+) MHC exprimieren; 3) vom Zellen (TEZ) auf den Zelloberflachen funktionellen Selektion positive Thymus epitheliale verwendet: zeigten, fiir zellularen der dass in Tag ausgepragt, Reaggregations- und am 2.-3. Tag der unreifen DP Zellen nach ihrer Grosse Tag nur bei Blast-Zellen erfolgt: Kleine DP 11 Zellen (DP Zellen ohne Blast Zellen) proliferieren nicht, konnen aber trotzdem zu SP Zellen reifen. Dies Zellteilung notig ist. Dies zeigt, gilt jedoch dass fiir die zeigten iiberraschenderweise ausgepragte Zellen (CD4+8" Teilung und in von CD4"8+) sowie TCRhi SP Zellen Zellteilung; Lymphknotens hinzugegeben Zellteilung von reifen vorgeburtlichen Thymus von SP T-Zell-Repertoires vor Export Thymus wurden. Dies lasst vermuten, dass Zellen Zytokinen, dem Zellen. Die in denen ausdifferentierte T- in die der von in die Mikroumgebung Epithel wurden, verursacht wird. Diese Zellteilung konnte reifen TCRhi auch in normalem neonatalen Reaggregations-Kulturen ausgepragt, Zellen des produziert wurden, diese sich teilenden SP vornehmlich waren war Selektion keine fiir SP Zellen, die in den ersten 2-3 nur reifen. Reife T-Zellen, die spater in der Kultur Tagen die positive zur Peripherie Zellen des freigesetzt Erweiterung sinnvoll sein. des
