Natürliche Killerzellen – Welche Rolle spielen Sie in der
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6. Februar 2013 Natürliche Killerzellen – Welche Rolle spielen Sie in der Immunabwehr ? Dr. med. Volker von Baehr Institut für Medizinische Diagnostik Berlin, Nicolaistraße 22, 12247 Berlin +49 3077001-220, [email protected] Zelluläre Elemente des Immunsystems Unspezifisches Immunsystem Spezifisches Immunsystem (angeboren, nicht lernfähig) (erworben, lernfähig) Monozyten → Gewebemakrophagen Granulozyten - Neutrophile (PMN) - Eosinophile - Basophile Mastzellen Natürliche Killerzellen - T-Lymphozyten - B-Lymphozyten ? Was sind NK-Zellen ? Lymphozytenähnliche Zellen des unspezifischen Immunsystems, die veränderte körpereigene Zellen (Tumorzellen, virusinfizierte Zellen) erkennen und abtöten können Sie benötigen kein priming (Erstkontakt) Sie haben keinen antigenspezifischen Rezeptor (nicht zur AntigenSelektion befähigt) NK-Zellen haben Rezeptoren für: IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IFN-α α, IFN-γγ NK-Zellen setzen proentzündliche Zytokine frei: IFN-γγ, TNF-α α, GM-CSF, IL-2 NK-Zellen haben die gleichen Effektormoleküle wie zytotoxische T-Lymphozyten Perforin, Granzyme, FAS-Ligand, TRAIL 10 – 30 % der Lymphozyten-ähnlichen Zellen im Blut sind Natürliche Killerzellen 18 806 363 28 28 31 15,7 g 52 48 0,82 Was differenziert NK-Zellen und T-Lymphozyten ? CD4-Helferzelle CD3+ reife NK-Zelle CD57++ CD4+ T NK CD16+ CD8-Lymphozyt CD56(+) CD3+ CD8+ T Den NK-Zellen fehlt der T-Zellrezeptor CD3. NK-T-Zelle (ca. 5 %) CD3+ CD8+ T Merkmal der NK-Zellen: CD16+ CD56+ Reifeprozess einer NK-Zellen gereifte NK-Zelle unreife NK-Zelle CD57++ NK NK NK CD16+ CD56++ CD16+ CD16+ CD56+ Rückgang der CD56-Expression Zunahme der Granuladichte CD56(+) Zunahme der CD57-Expression Die Anzahl der reifen CD57+ NK-Zellen ist bei Patienten mit chronischen Infektionen erniedrigt. ... auch bei der chronischen Borreliose Normalbefund Normale Zahl an NK-Zellen, niedriger Anteil an reifen NK-Zellen Chronische Infektion möglich Erniedrigte NK-Zellen, dadurch bedingt niedrige Zahl an reifen NK-Zellen Chronische Infektion möglich, DD: Immundefizit Wie erkennen NK-Zellen die „Entartung“ ihrer Zielzelle? ... anders als CD8+ T-Lymphozyten Wie machen es zytotoxischen T-Lymphozyten (CD3+/CD8+/CD28+) ? essentielle kostimulierende Moleküle „Gesunde“ Körperzelle CD80/86 CD28 CD8+ T-zytotoxisch -spezifisch keine Aktivierung, d.h. Toleranz der körpereigenen Zelle MHCI Kein passender T-Zell-Rezeptor für körpereigene Proteiner Tumorzelle CD80/86 CD28 CD8+ T-zytotoxisch -spezifisch MHCI passender T-Zell-Rezeptor für das (neue) Fremdantigen Klonale Expansion dieser T-Zellspezifität Zytokinproduktion Zytotoxizität Ein Problem entsteht, wenn sich die Tumorzellen der Kontrolle durch CD8+ zytotox. T-Zellen durch fehlende MHC-I-Expression entziehen ! Tumorzelle CD80/86 CD28 CD8+ T-zytotoxisch -spezifisch keine Aktivierung, d.h. Toleranz gegenüber der körpereigenen Zelle kein MHC-I keine Präsentation des Tumorantigens Auch Viren wie CMV und EBV nutzen diesen „escape“ – Mechanismus. Dann bleiben nur noch die NK-Zellen, denn: eine fehlende MHC-I-Expression stellt für NK-Zellen einen Angriffsreiz dar „Duldung“ der normalen MHC-I-exprimierenden Wirtszelle, da der KIRRezeptor binden kann. Bei fehlender MHC-I-Expression „Angriff“ der (entarteten oder virusinfizierten) Zelle, da der KIRRezeptor nicht binden kann. Angriff einer Tumorzelle durch zwei NK-Zellen Wie eliminiert die NK-Zelle die „entartete“ Zielzelle ? NK-Zellen lösen über 2 unabhängige Wege die Apoptose der Zielzelle aus 1. Perforin-/Granzyme-Weg Granzyme Perforin IFN-γγ Targetzelle DNAAbbau NK DNAAbbau NK Antikörper gegen das Zielantigen Perforineffekt öffnet Zellmembran Granzyme wird internalisiert und induziert in der Zielzelle die Apoptose Perforineffekt unter zusätzlicher Vermittlung eines Antikörpers = ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) 2. Fas/ Fas-Ligand-Weg FASLigand FAS NK DNAAbbau „Todeskuss“ Induktion von Zellapoptose Die Apoptose (altgr. apoptosis‚ abfallen‘) ist eine Form des programmierten Zelltods. Es ist ein „Selbstmordprogramm“ über welches jede Körperzelle verfügt. Das bedeutet, dass NK-Zellen ihre Zielzellen nicht lysieren, sondern sie induzieren in der Zielzelle den programmierten Zelltod (Apoptose). Labordiagnostik rund um die NK-Zelle Die Zahl der im Blut zirkulierenden NK-Zellen ist von geringer Bedeutung 18 806 363 28 28 31 15,7 g 52 48 0,82 Bei der Labordiagnostik von NK-Zellen spielt die Funktion der NK-Zellen die überragende Rolle Indikationen für den NK-Zell-Zytotoxizitätstest: - Kontrolle der NK-Zellfunktion bei Tumorerkrankungen - Ausschluss eines primären oder sekundären NK-Zelldefektes bei Patienten mit chronischen Infektionen - CMV - EBV, - Borrelien? - Chlamydien? - Mykoplasmen? - Mykobakterien? Wie funktioniert der NK-Zell-Funktionstest 10 ml Heparinblut des Patienten Isolation der NK-Zellen des Patienten NK NK NK K562-Tumorzelle (MHC-Klasse I negativ) Färbung der Tumorzellen mit dem lipophilen Membranfarbstoff Calcein NK NK NK „Pooling“ der TumorZellen mit den NK-Zellen des Patienten Start der Tumorzell-Apoptose durch die NK-Zellen des Patienten Abtötung der Tumorzellen in Abhängigkeit von der NK-Zell-Funktion Die zerstörten Tumorzellen setzen den Farbstoff Calcein frei Nach Zentrifugation wird der „freie“ Farbstoff im Überstand durch Fluorometrie gemessen Die Apoptose-Rate wird in % angegeben Welche Aussagen hat der NK-Zell-Zytotoxizitätstest ? Wie ist die aktuelle NK-Zellfunktion ? Welche NK-Zellfunktion kann bei optimaler Aktivierung der vorhandenen NK-Zellen erreicht werden? Aussagekraft des IL2-Wertes im NK-Zell-Zytotoxizitätstest Patient A NK-Zellfunktion: schlecht Prognose für IS: schlecht Patient B NK-Zellfunktion: schlecht Prognose für IS: gut Patient C NK-Zellfunktion: gut Prognose für weitere IS: gut, wenn gewollt Patient D NK-Zellfunktion: sehr gut IS nicht notwendig Eine fehlende TH1-Unterstützung auf Grund einer TH2-Dominanz macht eine Rekonstitution der NK-Zellfunktion schwieriger A.K. 11.2.48, Colon-Ca Ausgangsbefund Folgebefund nach 10 Wochen immunstimulierender Therapie Lässt sich mit einem Labortest seriös vorhersagen, welche Präparate die NK-Zellen eines Patienten aktivieren können? ... zumindest kann eine Aussage getroffen werden, welche Präparate individuelle NK-Zellen aktivieren ! Untersucht wird die in vitro-Induktion des Aktivierungsmarkers CD69 auf NK-Zellen durch immunstimulierende Präparate CD69 CD16 18-22 h nur NK-Zellen in der Zellkultur (Basalwert) CD56 NK NK NK-Zellen + Immunpräparate + Mitogenkontrolle Zytofluorometrische Analyse der CD69-Expression Negativkontrolle Positivkontrolle Die Steigerung der Expression von CD69 auf den Patienten-NK-Zellen im Vergleich zum Basalwert ist der Gradmesser für das individuell zu erwartende Ansprechen auf die Therapie. In diesem Fall zeigen Biobran und Curcumin einen deutlichen Effekt Veränderung der NK-Zellen im Alter Anzahl im Blut nimmt im Alter zu aber die Funktionalität nimmt ab - Lysekapazität ↓ trotz unverändertem Perforingehalt der NK-Zellen - Aktivierbarkeit (CD25 und CD71-Expression) nimmt ab - Freisetzung von IFN-γ und Chemokinen nimmt ab - Proliferationsfähigkeit nimmt ab Widerspruch zur erhöhten Zahl ist durch verminderte Chemotaxis in das Gewebe zu erklären. Zusammenfassung Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) unterscheiden sich von zytotoxischen CD8+/CD28+ T-Lymphozyten dadurch, dass sie veränderte körpereigene Zellen (Tumorzellen, virusinfizierte Zellen) T-Zell-Rezeptor-unabhängig erkennen und abtöten. NK-Zellen töten Zielzellen durch Induktion von Apoptose. Ihre Zahl im Blut ist für die Immundefektdiagnostik wenig relevant. (Ausnahme: Anteil an CD57++ reifen NK-Zellen) Die Funktionsdiagnostik erfolgt mit dem NK-Zell-Funktionstest. Die Testung von Präparaten ist nur an Hand der CD69-Aktivierung möglich. Im Alter nimmt die Funktion der NK-Zellen ab, die NK-Zellzahl im Blut steigt (kompensatorisch) eher an.
