Einfluss der Trastuzumab (Herceptin®) - Ruhr

Ruhr-Universität Bochum
Prof. Dr. med. Gerhard Schaller
Ehem. Dienstort: Marienhospital Herne
Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe
Einfluss der Trastuzumab (Herceptin®) - Therapie auf das zelluläre und humorale
Immunsystem von Patientinnen mit einem Mammakarzinom
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Tanja Hohmeier
aus Witten
2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. G. Schaller
Koreferent: PD. Dr. med. Reinacher-Schick
Tag der mündlichen Prüfung: 12.06.2007
Meinen Eltern
Meinem Bruder
Inhaltsverzeichnis
1.
EINLEITUNG.............................................................................................................1
1.1.
Bedeutung des HER2/neu-Gens beim Mammakarzinom......................................2
1.1.1. HER2/neu Gen und Rezeptor
3
1.2.
Trastuzumab...........................................................................................................5
1.3.
Humorales und zelluläres Immunsystem...............................................................9
1.3.1. Zelluläre Bestandteile
9
T-Helferzellen............................................................................................................9
T-Suppressorzellen ....................................................................................................9
B-Lymphozyten .......................................................................................................10
Natürliche Killerzellen.............................................................................................10
1.3.2. Humorale Bestandteile
11
Interleukin 2.............................................................................................................11
Interleukin 4.............................................................................................................12
Interleukin 10...........................................................................................................13
Interleukin 12...........................................................................................................13
Tumor Nekrosefaktor alpha .....................................................................................14
Interferon-gamma ....................................................................................................14
2.
Material und Methoden............................................................................................17
2.1.
Einleitung.............................................................................................................17
2.2.
Patientenkollektiv ................................................................................................17
2.3.
Gewinnung und Verarbeitung der Analyseproben ..............................................20
2.4.
Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS).....................................................21
2.4.1. Testdurchführung
21
2.4.2. FACS-Durchflußzytometer
23
2.4.4. Auswertung
23
2.5.
Enzym-Immunoassay...........................................................................................23
2.5.1. Testprinzip
23
2.5.2. Testvorbereitungen
24
2.5.3. Testdurchführung
25
2.6.
Statistische Auswertung.......................................................................................26
3.
Ergebnisse..................................................................................................................27
3.1.
Auswirkung einer Antikörpertherapie mit Trastuzumab auf die einzelnen
Parameterkonzentrationen ...................................................................................28
3.1.1. Natürliche Killerzellen
28
3.1.2. B-Lymphozyten
30
3.1.3. T-Helferzellen
32
3.1.4. T-Suppressorzellen
34
3.1.5. Tumor-Nekrosefaktor alpha
36
3.1.6. Interferon-γ
38
3.1.7. Interleukin 2
40
3.1.8. Interleukin 4
42
3.1.9. Interleukin 10
44
3.1.10. Interleukin 12
46
3.2.
Vergleich der Immunzell- und Zytokinkonzentrationen unter
den
klinischen
Gesichtspunkten Responder/Non-Responder, kardiotoxische Nebenwirkungen
und initiale anaphylaktoide Reaktionen...............................................................48
3.2.1. Vergleich der Zytokin- und Immunzellkonzentrationen der Responder und
Non- Responder- Patientinnen im Verlauf einer Trastuzumab- Therapie
48
3.2.1.1.
Natürliche Killerzellen.........................................................................48
3.2.1.2.
T-Suppressorzellen...............................................................................49
3.2.1.3.
Interferon-γ...........................................................................................50
3.2.1.4.
Interleukin 12 .......................................................................................51
3.2.2. Ergebnissdifferenzen der Patientengruppen mit und ohne kardiotoxische
Nebenwirkungen hinsichtlich der Sofortreaktion und Langzeitreaktion
(Gesamtverlauf)
52
3.2.3. Konzentrationsunterschiede der Patientengruppen mit und ohne
anaphylaktoide Initialreaktionen
3.3.
4.
58
Ergebniszusammenfassung..................................................................................60
Diskussion ..................................................................................................................61
4.1.
Einfluss einer Trastuzumab-Therapie auf das humorale und zelluläre
Immunsystem.......................................................................................................61
4.2.
Evaluation des zellulären und humoralen Immunsystems unter Berücksichtigung
klinischer Charakteristika ....................................................................................63
4.3.
Schlussfolgerungen..............................................................................................69
5.
Zusammenfassung ....................................................................................................71
6.
Literaturverzeichnis .................................................................................................74
7.
Danksagung ...............................................................................................................82
8.
Lebenslauf..................................................................................................................83
Abkürzungsverzeichnis
ADCC
antibody- dependent- cellular- cytotoxicity
B-Zellen
B-Lymphozyten
CD
Cluster of Differentiation
EDTA
Ethylendiamin Tetraessigsäure
EGFR
Epidermal growth factor receptor
FITC
Fluorescein
FISH
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
G-CSF
Granulozyten koloniestimulierender Faktor
GTPase
Guanosintriphosphatase
HER
Human epidermal growth factor receptor
IFN-γ
Interferon gamma
IgG
Immunglobulin Typ G
IL
Interleukin
1. Inf.v.
Meßwert vor der ersten Trastuzumab-Infusion
1. Inf.n.
Meßwert nach der ersten Trastuzumab-Infusion
LPS
Lipopolysaccharide
M-CSF
Monozyten koloniestimulierender Faktor
MHC
Major Histokompatibilitätskomplex
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
NW
Nebenwirkungen
NYHA
New York Heart Association
PE
R-Phytoerythrin
pg
Picogramm
PR
Tumorprogression
rpm
rounds per minute
SH2
Schwefelwasserstoff
SD
Stable Disease
TH-Zellen
T-Helferzellen
TNF-α
Tumor Nekrosefaktor alpha
1.
EINLEITUNG
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss einer anti-HER2-Rezeptor-Therapie mit
dem humanisierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab auf das Immunsystem von
Patientinnen mit einem Mammakarzinom.
Die Aufklärung pathogenetisch relevanter zellulärer Signaltransduktionswege hat neue
Möglichkeiten zur gezielten Therapie von malignen Tumoren eröffnet. Im Vordergrund
steht hierbei die Hemmung des Wachstumsfaktor-Rezeptors HER2 (Human Epidermal
Growth Faktor 2) (Baselga et al., 1994) durch den humanisierten Antikörper Trastuzumab.
Dieser rationale gezielte Einsatz eines Therapeutikums führte zur Etablierung des Begriffs
der „targeted therapie“ (Slamon et al., 1984).
1998 wurde der humanisierte monoklonale Antikörper Trastuzumab, der gezielt gegen den
HER2-Rezeptor gerichtet ist, zur Behandlung des metastasierten Mammakarzinoms
zugelassen. Das Protoonkogen HER2 wird in 20-30% Prozent aller Patientinnen mit einem
Mammakarzinom überexprimiert. Die Überexpression wird am häufigsten durch eine
genomische Amplifikation verursacht, die eine Expression von bis zu 2 Millionen HER2Rezeptoren hervorrufen kann. Normale epitheliale Brustdrüsenzellen exprimieren hingegen
lediglich 20.000 – 50.00 solcher Rezeptoren.
Die Therapie fortgeschrittener HER2 überexprimierender Mammakarzinome mit
Trastuzumab als Monosubstanz induziert Remissionsraten von 10-15% (Hung et al., 1999,
Lee et al., 2002, Rueckert et al., 2005, Slamon et al., 1987). In Kombination mit einer
zytostatischen Therapie konnten Ansprechraten bis zu 40-50% erzielt werden. Die
Verträglichkeit dieses Antikörpers ist sehr gut. Als wichtigste toxische Nebenwirkung
treten,
neben
initialen
anaphylaktoiden
Reaktionen,
überwiegend
reversible
Herzinsuffizienzen bisher unbekannter Ätiologie auf (Bell et al., 2002, Harries et al.,
2002).
Es liegen derzeit nur wenige Erkenntnisse über die allgemeine Reaktion des humoralen
und zellulären Immunsystems auf Trastuzumab vor. Die vorliegende Arbeit versucht
einerseits die grundlegenden Effekte von Trastuzumab auf das Immunsystem zu
untersuchen,
sowie
andererseits
eine
potentielle
ätiologische
Beteiligung
des
Immunsystems an den kardiotoxischen Nebenwirkungen aufzuzeigen.
1
1.1.
Eine
Bedeutung des HER2/neu- Gens beim Mammakarzinom
wichtige
Voraussetzung
für
die
Tumorentstehung
ist
eine
Dysfunktion
molekularbiologischer und zellulärer Mechanismen, die für die Wachstumsregulation der
Zellen verantwortlich ist. Die Differenzierung des normalen Brustdrüsengewebes wird
durch Wachstumsfaktoren und ihre entsprechenden Rezeptoren moduliert, die gemeinsam
von Protoonkogenen kodiert werden. In der Genese des Mammakarzinoms ist das
Protoonkogen c–erbB2 (Synonym HER2/neu) von besonderer Bedeutung, da es in 25-30%
aller invasiven und 50% aller inflammatorischen Brustkrebsfälle amplifiziert ist (Albanell
et al., 1999, Albanell et al., 2003, Brand et al., 2006, Carson et al., 2001, De Santes et al.,
1992, Hayes et al., 2002, Smith et al., 2001). Im Tiermodell riefen HER2-Transfektionen
in verschiedenen Zelllinien ein gesteigertes metastatisches Potenzial mit einer verstärkten
Zellproliferation
hervor.
Eine
HER2-Amplifikation
kann
schon
in
frühen
Entwicklungsstadien wie z.B. dem Carcinoma in situ diagnostiziert werden. Diese
Genamplifikation korreliert eng mit den Prognosefaktoren Tumorgröße, Aneuploidie
(Abweichung
vom
euploiden
Chromosomensatz)
und
einem
Mangel
an
Steroidhormonrezeptoren (Hortobagyi et al., 2001, Hortobagyi et al., 2005). Weiterhin ist
sie mit einer Resistenz der Tumorzellen gegenüber Zytostatika wie z.B. Cyclophosphamid,
einer lymphatischen Infiltration, sowie der Abwesenheit von histologisch lobulären
Strukturen vergesellschaftet (Brand et al., 2006, Hayes et al., 2002, Lohrisch et al., 2001,
Menard et al., 2003).
Das c-erbB2-Gen wurde in Karzinomen zu Beginn der achtziger Jahre bei
Transfektionsexperimenten an chemisch induzierten Neuroglioblastomen der Ratte
identifiziert. Anschließend konnte es in verschiedenen humanen Karzinomen, wie dem
Blasen-, Kolon-, Magen-, Brust-, Hoden-, Lungen-, Ovarial-, Endometrium- und
Pankreastumor nachgewiesen werden (Harries et al., 2002, Hung et al., 1999, Peiper et al.,
1997). In der Mamma wird das c-erbB2-Rezeptorprotein vom normalen Brustdrüsenepithel
und in den Myoepithelien in geringen Mengen exprimiert. Die onkogene Transformation
des c-erbB2-Gens erfolgt durch Punktmutation oder Amplifikation des betroffenen
Genabschnittes (Harries et al., 2002, Merlin et al., 2002).
Der immunhistochemische Nachweis von HER2 wird als Standarduntersuchung an allen
malignen Brustdrüsenresektaten durchgeführt. In aller Regel liegt der Überexpression des
HER2-Rezeptorproteins eine Amplifikation des HER2-Gens zugrunde. Die Bestimmung
der Anzahl der Genkopien durch FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) korreliert
zwar besser mit dem klinischen Verlauf als die immunhistochemische Bestimmung,
allerdings ist sie für die tägliche Routine zu aufwendig und zu teuer (Di Leo et al., 2002,
2
Schaller et al., 2001). Nur in Zweifelsfällen wird eine zusätzliche FISH-Analyse
durchgeführt (Bartlett et al., 2003).
1.1.1. HER2/neu Gen und Rezeptor
Das c-erbB2-Gen ist ein Mitglied der Erb-B-Wachstumshormon-Rezeptorfamilie, einer
Untergruppe der epidermal growth factor Rezeptoren (EGFR), die strukturell einen
Proteinkinasenrezeptor darstellen. Infolge einer Erb-B-Rezeptoraktivierung und der sich
anschließenden Signalkaskade können das Wachstum, die Differenzierung, und das
Überleben einer Zelle reguliert werden (Arteaga et al., 2002). Die Erb-B-Gruppe umfasst
vier Gene HER1-4, die für transmembrane Phosphoglykoproteine codieren (Albanell et al.,
2003, Lohrisch et al., 2001, Ozcelik et al., 2002, Sliwkowski et al., 1999). Sie bestehen aus
einer
extrazellulären
Juxtamembransequenz,
Domäne,
einer
d.h.
der
Ligandenbindungsstelle,
hydrophoben
einer
Transmembrandomäne
kurzen
und
einer
intrazellulären Kinaseregion mit autophosphorylierenden Tyrosineinheiten.
Für
alle
Rezeptoren
gilt,
dass
die
Bindung
des
spezifischen
Liganden
Autophosphorylierungen an den Tyrosylresten der ligandenaktivierten Tyrosinkinase des
Rezeptorproteins auslöst und so eine Rezeptordimerisierung und Aktivierung induziert.
Die Autophosphorylierung ist die Initialreaktion einer Signalkaskade, die letztendlich eine
Veränderung der Zellproliferation und Apoptosehemmung induziert (Arteaga et al., 2002,
Hung et al., 1999, Lohrisch et al., 2001, Slichenmyer et al., 2001, Sliwkowski et al., 1999).
3
Abbildung 1: (Der Internist 8, 2005) Signaltransduktion durch EGF-Rezeptoren als therapeutische
Zielstruktur. Im nicht aktivierten Zustand liegt der Rezeptor als Monomer vor. Nach Bindung des Liganden,
EGF oder TGF-α , kommt es durch eine Konformationsänderung zur Homodimerisierung des Rezeptors mit
einem zweiten EGF-R oder Heterodimerisierung, z.B. mit HER2. Hierauf folgen die Autophosphorylierung
durch die EGF-R-Tyrosinkinsae und Rekrutierung von Adapterproteinen wie Grb2 und SOS, die
nachgeschaltete Signalkaskaden anschalten: Durch den PI3/Akt-Kinase-, den JAK/Stat- und Ras-Signalweg
wird Tumorproliferation und Apoptosehemmung bewirkt.
Obwohl die vier verschiedenen HER-Rezeptoren die Möglichkeit haben Homodimere zu
bilden, schließen sie sich am häufigsten zu Heterodimeren zusammen. Der bevorzugte
Partner bei einer Dimerisierung ist der HER2-Rezeptor. In dem normalen, epithelialen
Brustdrüsengewebe sind überwiegend HER2/HER3-Heterodimere aufzufinden, weil sie
sich optimal ergänzen, da der HER3-Rezeptor selbst keine Tyrosinkinase und der HER2Rezeptor keinen spezifischen Liganden besitzt. Die HER2-Heterodimere haben eine
stärkere Signalübermittlungsfähigkeit und zeichnen sich durch eine besondere Stabilität
aus, im Vergleich zu Heterodimeren ohne HER2. Somit besitzt HER2 eine
Verstärkerfunktion und eine Schlüsselrolle bezüglich der Determinierung des onkogenen
Potential, bzw. der Wachstumsrate von epithelialen Brustdrüsengewebe (Harries et al.,
2002, Lohrisch et al., 2001). Normale Brustdrüsenepithelzellen enthalten ca. 20.-50.000
HER2-Rezeptoren,
im
Gegensatz
hierzu
exprimieren
Brusttumorzellen
durch
Amplifikation ungefähr 2 Millionen HER2-Rezeptoren.
Lohrisch und Piccard nehmen an, dass die schlechte Prognose von Brusttumoren mit einer
HER2-Überexpression aus einer hohen Anzahl an HER2-Heterodimeren und der damit
4
einhergehenden
verstärkten
Signalvermittlung
und
der
gesteigerten
malignen
Zellproliferation, resultiert (Lohrisch et al., 2001).
Abbildung 2: Aus Text Lohrisch und Piccard , [3], Mechanism of malignant proliferation
with HER2 overexpression. 1 = HER1, 2 = HER2, 3 = HER3, 4 = HER4.
1.2.
Trastuzumab
Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der an die extrazelluläre
Domäne des HER2-Rezeptors bindet (Albanell et al., 1999, Gerber et al., 2001, Keefe et
al., 2002, Ozcelik et al., 2002). Die Entwicklung von Trastuzumab basierte zunächst auf
der Herstellung eines monoklonalen Mausantikörpers, der die Fähigkeit besaß, das
Wachstum von HER2-positiven Zelllinien zu inhibieren. Der potenteste Antikörper war
muMAb 4D5, der ausschließlich die Proliferation von HER2-überexprimierenden
Zelllinien blockieren konnte. Um eine humane Immmunreaktion gegen den 4D5
Mausantikörper zu umgehen, wurde er humanisiert, indem die variable Region in einem
Plasmid subcloniert wurde, das für eine humane leichte Kette κ und die konstante IgG1Region codierte und auf diese Weise ein Vektor konstruiert, der für einen chimärischen
Antikörper codierte. Dieser Vektor wurde in CHO-Zellen (chinese hamster ovary cells)
transduziert, die anschließend den humanisierten Mausantikörper in das umgebende
Kulturmedium sezernierten. Dieser chimäre Antikörper wurde Trastuzumab genannt. Er
besteht zu 95% aus menschlichen und zu 5% aus murinen Anteilen (Baselga et al., 1994,
Carter et al., 1992). 1998 erfolgte die Zulassung von Trastuzumab als Medikament unter
dem Handelsnamen Herceptin®.
Trastuzumab bewirkt eine Verlängerung der mittleren Progressions- und Überlebenszeit
von Patientinnen mit einem HER2-überexprimierenden Mammakarzinom (Campone et al.,
2004, Piccart-Gebhart et al., 2005, Smith et al., 2001). Den größten Nutzen aus einer
Trastuzumab-Therapie
ziehen
nicht
vorbehandelte
Brustkrebspatientinnen
mit
5
fortgeschrittenen Tumoren, und dem Nachweis einer HER2-Amplifikation (Harries et al.,
2002).
Der genaue Mechanismus der antiproliferativen Wirkung von Trastuzumab auf die
Tumorzelle ist noch Gegenstand der aktuellen Forschung. In der Literatur existieren
diesbezüglich verschiedene Theorien, die im Folgenden genannt werden (Baselga et al.,
1998, De Santes et al., 1992, Hortobagyi et al., 2005, Lohrisch et al., 2001, Merlin et al.,
2002, zum Buschenfelde et al., 2002):
a. Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität
b. Inhibition und Verminderung von Apoptose hemmenden Molekülen
c. Induktion von Reparaturmechanismen nach einer Strahlen- und Zytostatikatherapie
Trastuzumab führt grundsätzlich zu einer Inhibition des Zellwachstums und der
Zellteilungssignale durch eine akzelerierte, endozytotische Internalisierung und DownRegulation des HER2-Rezeptors (De Santes et al., 1992, Petit et al., 1997, Schneider et al.,
2001, Schneider et al., 2002).
Die antikörperabhängige-zelluläre-Zytotoxizität (ADCC) wird als wichtigster immunologischer Mechanismus einer Tumorzellabtötung diskutiert (Brand et al., 2006, Mimura et
al., 2005, Ozcelik et al., 2002, Sliwkowski et al., 1999). Unter diesem Begriff wird die
Zerstörung von Antikörper-markierten Zellen mit Hilfe spezieller Immunzellen (ADCCZellen) zusammengefaßt (Gemsa et al., 1997, Ibelgaufts et al., 1992). ADCC-befähigte
Zellen sind NK-Zellen, zytotoxische T-Zellen, Makrophagen und Monozyten, die einen
spezifischen Rezeptor für den entsprechenden IgG-Antikörper exprimieren. Liljefors et al.
führen an, dass die natürlichen Killerzellen und Makrophagen hauptsächlich für die ADCC
verantwortlich sind, da sie befähigt sind, Zellen ohne vorherige Sensibilisierung abzutöten
(Liljefors et al., 2003).
Die Zielzellerkennung erfolgt durch Interaktion zwischen dem Fab-Rezeptoranteil der
ADCC befähigten Zelle (z.B. NK-Zelle) und dem Fc-Rezeptor des die Tumorzelle
markierenden Antikörpers (Carson et al., 2001). Durch diese Bindung zwischen dem
Antikörper und dem Rezeptor werden zytotoxische, bzw. zytolytische Mechanismen der
ADCC-Zelle, wie die Freisetzung von zytolytischer Granula mit Enzymen und Perforinen,
ausgelöst (De Santes et al., 1992, Kono et al., 2002). Für die ADCC von Tumorzellen
werden vorrangig die natürlichen Killerzellen verantwortlich gemacht (Arnould et al.,
2006, Baselga et al., 2001, Harries et al., 2002, Sliwkowski et al., 1999). Özcelik et
al.vermuten, dass die antitumorgenetische Eigenschaft von Trastuzumab unter anderem
6
durch die ADCC vermittelt werden kann. Trastuzumab ist in der Lage die
antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) gegen maligne Brustkrebszellen zu
induzieren (Liljefors et al., 2003, Niwa et al., 2004, Niwa et al., 2005).
Zytokine besitzen die Fähigkeit, die ADCC von malignen Tumorzellen zu modulieren. IL2, IL-12, IFN-γ und IFN-α können die ADCC steigern, wohingegen sie durch IL-4
unterdrückt wird (Flieger et al., 1999, Flieger et al., 2000). Nach Tsuboi et al. führt
insbesondere Interleukin 12 gemeinsam mit IFN-γ zu einer effektiven Inhibition des
Tumorzellwachstums (Tsuboi et al., 2004).
Als Nebenwirkungen einer Trastuzumab-Therapie sind die klinischen und subklinischen
kardiotoxischen Nebenwirkungen zu nennen, die sich im schwerwiegendsten Fall bis zu
einer fortgeschrittenen bzw. hochgradigen Herzinsuffizienz (hochgradig eingeschränkte
linksventrikuläre Funktion, NYHA IV) manifestieren können. Selten stellen sie jedoch
einen therapielimitierenden Faktor dar (Gerber et al., 2001, Klein et al., 2003).
Höhergradige kardiale Vorerkrankungen gelten als Kontraindikationen einer TrastuzumabTherapie (Deswal et al., 2001, Harries et al., 2002, Lohrisch et al., 2001, Ozcelik et al.,
2002). Im Verlauf einer Kombinationschemotherapie treten in Abhängigkeit von den
zytostatischen
Substanzen
in
bis
zu
30
Prozent
der
Patientinnen
kardiale
Funktionseinschränkungen auf (Campone et al., 2004, Crone et al., 2002, Sparano et al.,
2001). Indes kann die Trastuzumab-Therapie trotz kardiotoxischer Nebenwirkungen häufig
fortgesetzt werden, da sie in den meisten Fällen unter einer konventionellen
medikamentösen Therapie reversibel sind. Kardiotoxisch bedingten Todesfällen traten laut
Literaturangaben nur sehr selten auf (Campone et al., 2004, Ewer et al., 2005, Hortobagyi
et al., 2005, Keefe et al., 2001, Schneider et al., 2001, Suter et al., 2004).
Die mehr oder weniger stark ausgeprägten toxischen Effekte der einzelnen Zytostatika auf
Kardiomyozyten sind bereits bekannt, so das man vermuten kann, daß Trastuzumab
einerseits diese toxischen Einflüsse verstärkt und andererseits Reparaturmechansimen
negativ beeinflußt (Chien et al., 2000, Keefe et al., 2001, Schneider et al., 2001, Schneider
et al., 2002). Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht geklärt.
Mildere Nebenwirkungen wie Fieber, Schüttelfrost, Müdigkeit, Übelkeit und Erbrechen,
als Ausdruck anaphylaktoider Nebenwirkungen, können insbesondere nach der ersten
intravenösen Trastuzumab-Gabe auftreten (Dillman et al., 1999, Hortobagyi et al., 2001,
Sawaki et al., 2004, Slichenmyer et al., 2001).
7
Die dieser Arbeit zugrundeliegende Fragestellung basiert auf der Vermutung, daß eine
Störung des Zytokinregelkreislaufes, ausgelöst durch die immunologische Reaktion im
Rahmen
einer
intravenösen
Antikörpertherapie,
maßgeblich
an
der
Kardiomyozytenschädigung beteiligt sein könnte. Grundlage dieser Vermutung ist der
Nachweis erhöhter Zytokinserumkonzentrationen wie z.B. von TNF-α und IL-10 bei
hochgradiger Herzinsuffizienz (Deswal et al., 2001, Kubota et al., 2000, Vasan et al.,
2003). Zur Überprüfung dieser Hypothese untersucht die vorliegende Arbeit den Einfluß
des zellulären und humoralen Immunsystems im Hinblick auf eine potentielle Schädigung
der Kardiomyozyten.
Ein anderer pathogenetischer Ansatz der Kardiotoxizität bezieht sich auf die reparative
Funktion des HER2-Rezeptors im Verlauf einer Kardiomyozytenschädigung. HER2 ist
zusammen mit HER4, seinem Ko-Rezeptor, und dem Liganden Neuregulin für die
embryonale Entwicklung des Herzens von erheblicher Bedeutung (Crone et al., 2002, Suter
et al., 2004). HER2 und HER4 haben die größte Affinität zu Neuregulin (Schneider et al.,
2001). Sie reichern sich in den T-Tubuli der Kardiomyozyten an, wo sie vom Endokard
bereitgestelltes Neuregulin während der Herzentwicklung im Myokard binden. Diese
Verhältnisse bleiben auch im adulten Herzen bis zu einem gewissen Grad bestehen
(Ozcelik et al., 2002). Eine HER2/4-Rezeptoraktivierung durch Neuregulin vermittelt das
Kardiomyozytenwachstum, die Myofilamentorganisierung und reguliert das Überleben der
Kardiomyozyten (Crone et al., 2002, Rohrbach et al., 1999). Zhao et al. berichten, dass sie
in neonatalen und adulten kultivierten Kardiomyozyten eine HER2/4-Expression entdeckt
haben (Zhao et al., 1998). Durch Experimente mit Rattenkardiomyozyten kamen Rohrbach
et al. zu dem Ergebnis, dass eine Verminderung der HER2/4-Expression auf den
Kardiomyozyten
zu
eine
Abnahme
der
kardioprotektiven
Mechanismen
bei
hypertrophierten Herzen führt und zu der Entwicklung einer Herzinsuffizienz beiträgt.
Demnach scheint der HER2/4-Neuregulin-Signaltransduktionsweg maßgeblich an der
Induktion kardioreparativer Mechanismen infolge einer Herzschädigung beteiligt zu sein
(Rohrbach et al., 1999, Sawyer et al., 2002, Schneider et al., 2001, Schneider et al., 2002,
Suter et al., 2004, Zhao et al., 1998).
Sawyer et al. berichten ebenfalls, dass die Interaktion zwischen den HER2/4-Rezeptoren
und Neuregulin einen protektiven Effekt auf die anthracyclingeschädigten Kardiomyozyten
ausübt. Es scheint plausibel, dass die über den Neuregulin-Signaltransduktionsweg
vermittelten Reparaturmechanismen durch eine Trastuzumab-Therapie inhibiert werden
könnten (Sawyer et al., 2002, Sparano et al., 2001).
8
1.3.
Humorales und zelluläres Immunsystem
1.3.1. Zelluläre Bestandteile
Die Lymphozyten bilden bei einem Erwachsenen ab dem 21. Lebensjahr ca. 34%, (1,0 –
4,8·109 Zellen/l) des gesamten zellulären Blutvolumens. Die Lymphozytenpopulation
gliedert sich auf in T-Lymphozyten (65-80%), B-Lymphozyten (8-15%) und natürliche
Killerzellen (10%) (Freund et al., 1994, Janeway et al., 1997).
Die T-Zellen unterteilen sich in 2 verschiedene T-Effektorzellklassen, den CD4-positiven
T-Helferzellen und den CD8-positiven T-Suppressorzellen. Ihre Entwicklung erfolgt aus
einer pluripotenten Stammzelle im Knochenmark. Von dort wandern sie früh in die
Thymusdrüse aus, um sich in die verschiedenen Subklassen zu differenzieren.
T-Helferzellen
Die T-Helferzellen exprimieren den CD4-Korezeptor auf ihrer Oberfläche. Unterschieden
werden TH1-Zellen, die intravesikuläre Pathogene (zelluläre Abwehr) detektieren, von
TH2-Zellen, die extrazelluläre Antigene (humorale Abwehr) erkennen. Erkannt werden in
Verbindung mit Major-Histo-Kompatibilitäts-Komplex (MHC) dargestellte Proteine bzw.
Antigene auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen mit Hilfe spezifischer
Rezeptoren und Korezeptoren. T-Helferzellen sind verantwortlich für die Aktivierung von
Makrophagen
und
die
Stimulation
nativer
B-Zellen
zur
Proliferation
und
Antikörpersynthese. Nach dem Kontakt mit einem Antigen synthetisieren T-Helferzellen
Interleukine und Zytokine wie z.B. IL-2, TNF-α, IFN-γ die, die sich anschließenden
Immunreaktionen modulieren.
T-Suppressorzellen
Die T-Suppressorzellen werden auch als zytotoxische T-Zellen bezeichnet. Sie
exprimieren den spezifischen CD8-Korezeptor auf ihrer Oberfläche, mit dessen Hilfe sie
gemeinsam mit ihrem spezifischen Antigenrezeptor über MHC-Klasse-I präsentierte
Antigenpeptide erkennen. Sie können potentiell mit allen virusinfizierten bzw.
transformierten Körperzellen reagieren, da MHC-Klassse-I-Peptide von allen kernhaltigen
Zellen exprimiert werden. Ebenso wie die T-Helferzellen benötigen sie für ihre
Aktivierung und Proliferationssteigerung die Interaktion mit einer antigenpräsentierenden,
MHC-Klasse-I positiven Zelle. Die zytotoxische Aktivität der T-Suppressorzellen beruht
9
einerseits auf der Synthese und Sekretion von Zytokinen und andererseits auf der
Programmierung der Zelle für die Apoptose.
B-Lymphozyten
B-Zellen entwickeln sich lebenslänglich wie die T-Zellen aus einer pluripotenten
Stammzelle im Knochenmark und zirkulieren als native Vorstufen mit dem Blut durch die
primären
und
sekundären
Lymphstationen.
Dort
können
sie
dann
mit
antigenpräsentierenden Zellen in Kontakt treten und sich zu reifen B-Zellen differenzieren.
Sie machen etwa 10-15 Prozent des zirkulierenden Lymhozytenpools aus. Im Verlauf einer
Immunantwort übernehmen sie unterschiedliche Funktionen, wie die Antigenpräsentation
mittels MHC Klasse-I Molekülen, die spezifische Antikörperproduktion in Form einer
Plasmazelle
und
die
Bildung
des
immunologischen
Gedächtnisses
durch
die
Differenzierung in B-Gedächtniszellen. Die Differenzierung in eine Plasma- oder
Gedächtniszelle erfolgt durch die Interaktion mit einem TH2-Lymphozyten unter dem
Einfluss von IL-4 und 5. Interleukin 4 ist der wichtigste Wachstumsfaktor, der ruhende BLymphozyten in den Zellzyklus überführt (Oppenheim et al., 1996).
Natürliche Killerzellen
Die NK-Zellen sind die wichtigsten akzessorischen Zellen der humoralen Immunantwort.
Sie sind phagolytische Zellen aus der monozytisch, myeloischen Linie, die sich schon früh
von der lymphatischen Stammzelle differenzieren und die Prägung in den primären
Lymphorganen umgehen. Auf ihrer Oberfläche exprimieren sie keine antigenspezifischen,
jedoch funktionelle Interleukin 2 Rezeptoren. Natürliche Killerzellen befinden sich in der
Milz und im peripheren Blut.
Von besonderer Bedeutung ist ihre Fähigkeit zur zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC),
die durch den Kontakt ihrer Oberflächenrezeptoren mit membranständigen Antikörpern
antigenpräsentierender Zellen ausgelöst werden kann (Arnould et al., 2006, Gemsa et al.,
1997). Die NK-Zellen werden durch Interferone aktiviert, die von virusinfizierten Zellen
gebildet werden, welche anschließend selbst durch die NK-Zellen zerstört werden. Sie
synthetisieren IFN-γ und sind befähigt, speziell veränderte Oberflächenmoleküle auf
tumorösen Zellen zu erkennen und diese zu eliminieren. Demzufolge scheinen sie
bestimmte Proteine des HER2-Rezeptors binden zu können und in dieser Weise die
Zerstörung der HER2 markierten Zellen zu bewirken (Freund et al., 1994, Oppenheim et
al., 1993).
10
Liljefors et al. führen an, dass die natürlichen Killerzellen und Makrophagen hauptsächlich
für die antikörperabhängige-zelluläre-Zytotoxizität verantwortlich sind. Sie stellten eine
positive Korrelation zwischen der Anzahl der NK-Zellen und einer guten Tumorprognose
fest (Liljefors et al., 2003, Niwa et al., 2004, Niwa et al., 2005). Darüber hinaus
beobachteten sie, dass Patientinnen in fortgeschrittenen Tumorstadien einen geringeren
Gehalt an natürlichen Killerzellen besaßen und dass eine gesteigerte natürliche
Killerzellaktivität positiv mit der Überlebenszeit korrelierte.
1.3.2. Humorale Bestandteile
Zytokine sind Botenstoffe, die ein wichtiges Kommunikationssystem zwischen den
humanen Zellen darstellen. Unter dem Überbegriff Zytokine werden verschiedene
Immunmediatoren wie Interleukine, Interferone, koloniestimulierende Faktoren und
Wachstumsfaktoren zusammengefasst. Im menschlichen Organismus produziert jede
lebende kernhaltige Zelle Zytokine. Die Art und Quantität der Zytokinproduktion ist von
dem Zelltyp, der Differenzierungsphase und dem Aktivierungszustand der Zelle abhängig.
Zytokine sind meist glykosylierte Peptide oder Proteine mit einem Molekulargewicht von
6-70 kD.
Sie können autokrin auf ihre Synthesezelle, sowie parakrin auf benachbarte Zellen und
endokrin im gesamten Organismus wirken.
Die Zytokinsynthese und Sekretion von T-Lymphozyten wird induziert bei Kontakt der TZelle mit einem Antigen. Sobald dieser Kontakt aufgehoben ist, wird die Zytokinsekretion
gestoppt. Auf diese Weise wird eine unangemessene Überschwemmung des Organismus
mit in hohen Dosen toxisch wirkenden Zytokinen vermieden (Slifka et al., 2000).
Zu den Zytokinen zählen die Interleukine, die autokrin und parakrin wirksame
Gewebshormone niedrigen Molekulargewichtes und kurzer Halbwertszeit darstellen. Der
Name Interleukin beschreibt die Aufgabe, als Botenstoff zwischen Leukozyten zu
interagieren. In der Reihenfolge ihrer Entdeckung wurden sie nummeriert (Freund et al.,
1994, Gemsa et al., 1997, Ibelgaufts et al., 1992, Janeway et al., 1997).
Interleukin 2
Unter physiologischen Bedingungen wird Interleukin 2 hauptsächlich von aktiven CD4positiven T-Helferzellen und in geringem Maße von aktiven B-Lymphozyten und
natürlichen Killerzellen synthetisiert. Interleukin 2 wird als autokriner T-ZellWachstumsfaktor bezeichnet, da es als antigenunspezifischer Proliferationsfaktor dient und
11
hierdurch eine Schlüsselstellung bei der Aktivierung der T-Helferzellen einnimmt. Die
Hauptaufgabe des IL-2 besteht in der Aktivierung der zytotoxischen T-Lymphozyten.
Interleukin 2 und seine Rezeptoren beeinflussen entscheidend die Stärke und Dauer einer
T-Zell-vermittelten Immunantwort. In den B-Zellen wird die Antikörpersynthese durch IL2 Bindung induziert.
In den peripheren Leukozyten induziert IL-2 die Synthese von IFN-γ und TNF-α und -ß
(Carson et al., 2001). Die Sekretion dieser tumorizidal wirkender Zytokine dürfte neben
der Wirkung auf die Expansion der natürlichen Killerzellen für die Antitumoraktivität von
Interleukin 2 verantwortlich sein, die funktionelle IL-2 Rezeptoren expimieren (Lissoni et
al., 1996, Lissoni et al., 1997, Rovelli et al., 1988). In klinischen Versuchen wurde eine
signifikante Antitumoraktivität von IL-2 bei verschiedenen Tumorzelltypen nachgewiesen,
ausgelöst dadurch, dass es die Proliferation von zytotoxischen T-Zellen und NK-Zellen
stimuliert (Cruse et al., 1995, Freund et al., 1994, Janeway et al., 1997, Oppenheim et al.,
1996, Oppenheim et al., 1993).
Im Einklang mit diesen Erkenntnissen ermittelten Repka et al., dass die subkutane Gabe
von Interleukin 2 die absolute Konzentration der NK-Zellen steigert und dementsprechend
die Abtötung der Tumorzellen mittels ADCC unterstützt (Repka et al., 2003). Da die
Aktivität der natürlichen Killerzellen im Wesentlichen durch Interleukin 2 stimuliert wird,
könnte somit eine lineare Beziehung zwischen der Interleukin 2 Konzentration und der
NK-Zellaktivität bestehen.
Ferner fanden Lissoni et al. bei Patienten mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium
abnormal niedrige IL-2-Blutkonzentrationen, die mit einer schlechten Prognose und einer
verkürzten Überlebenszeit assoziiert sind (Lissoni et al., 1996).
Interleukin 4
Interleukin 4 ist ein hauptsächlich von CD4-positiven TH2-Lymphozyten sezernierter Blymphozytärer Wachstumsfaktor, der dazu befähigt ist, ruhende B-Lymphozyten in den
Zellzyklus zu überführen. In geringeren Konzentrationen wird es von Makrophagen und
basophilen Granulozyten synthetisiert. Interleukin 4 unterstützt den Immunglobulinklassenwechsel von IgM zu IgE und steigert die Expression von MHC-Klasse-II Antigenen
auf den B-Lymphozyten, um sie auf die Antigenpräsentation gegenüber den T-Helferzellen
vorzubereiten (Janeway et al., 1997, Miossec et al., 1993). Ferner besitzt IL-4 einen
hemmenden Einfluss auf die IL-2 abhängige T-Zell- und NK-Zellaktivierung und
Proliferation, da es eine Downregulation der IL-2-Rezeptoren initiiert. Die Differenzierung
und Proliferation von TH2-Zellen wird durch IL-4 stimuliert und ihre Apoptose inhibiert.
12
Interleukin 10
Interleukin 10 wird von CD4-positiven TH2-Zellen, CD8-positiven T-Zellen, aktivierten
B-Zellen, Monozyten und Makrophagen erst im späteren Verlauf einer Immunreaktion
synthetisiert. Es gilt im allgemeinen als antiinflammatorisches Zytokin, da es die Fähigkeit
besitzt, eine Reihe von zytokingesteuerten Reaktionen zu antagonisieren. IL-10
supprimiert die Entwicklung von TH1-Zellen und der von ihnen synthetisierten Zytokine,
wie z.B. IL-2, IFN-γ und TNF-a (Cruse et al., 1995, Gemsa et al., 1997, Ibelgaufts et al.,
1992, Janeway et al., 1997, Oppenheim et al., 1993). Andererseits wird die IL-10 Synthese
durch Interleukin 4 und IFN-γ gehemmt.
Yamaoka et al. heben hervor, dass Interleukin 10 als antiinflammatorisches Zytokin die
Synthese
von
anderen
Zytokinen
herabsetzt,
und
dass
die
Interleukin
10
Blutkonzentrationen bei Patienten mit einer symptomatischen Herzinsuffizienz (ab St.
NYHA II) höher sind als bei gesunden Probanden (Yamaoka et al., 1999).
Lissoni et al. beobachteten bei Tumorpatienten ein antiproportionales Verhalten zwischen
dem IL-10- und dem IL-12-Blutkonzentrationsspiegel (Lissoni et al., 1996). In diesem
Zusammenhang wiesen De Vita et al. ein Anstieg der IL-10-Konzentration bei NonResponder Patientinnen nach und betonen die hemmende Wirkung von IL-10 auf die
Zytokin-gesteuerte Immunantwort von Tumorzellen (De Vita et al., 1998, De Vita et al.,
2000).
Interleukin 12
Interleukin 12 konnte erstmalig aus dem Medium einer Ebstein-Barr-Virus transformierten
B-Lymphoblastenzelllinie identifiziert werden. Es wird von Monozyten, Makrophagen, BZellen und neutrophilen Granulozyten nach infektiösem Stimulus, aber auch von malignen
Zellen produziert. Die spezifischen IL-12-Rezeptoren befinden sich auf aktivierten
peripheren Blutmonozyten, CD8-positiven und CD4-positiven T-Lymphozyten und
natürlichen Killerzellen. Es stimuliert die CD4-positive T-Zellantwort, vermittelt die
Aktivierung und Proliferation von NK-Zellen und die IFN-γ-Synthese. Des Weiteren übt
Interleukin 12 antiangiogenetische Effekte und eine direkte inhibitorische Wirkung auf
Tumorzellen aus (Parihar et al., 2002, Parihar et al., 2004). Die Ein-Jahres Überlebensrate
bei Tumorpatienten war signifikant höher bei Patienten mit erhöhten IL-12Konzentrationen (Lissoni et al., 1996, Lissoni et al., 1997, Lissoni et al., 1997). Die
Hauptaufgabe von Interleukin 12 ist die Induktion von IFN-γ in den T-Lymphozyten und
NK-Zellen. Gemeinschaftlich mit TNF-α kann IL-12 die Synthese großer Mengen IFN-γ
durch die NK-Zellen induzieren und so die zytotoxische Aktivität von NK- und T13
Helferzellen verstärken. Umgekehrt stimuliert IFN-γ die IL-12 Expression, wohingegen sie
durch IL-4 und IL-10 gehemmt wird.
IL-12 ist ein zentraler Punkt in der Gleichgewichtsregulation zwischen zellulärer und
humoraler Immunität (Cruse et al., 1995, Ibelgaufts et al., 1992, Oppenheim et al., 1996,
Oppenheim et al., 1993).
Tumor Nekrosefaktor alpha
TNF-α wird von allen kernhaltigen Zellen des Organismus gebildet. Stimulierte
Makrophagen, Monozyten, neutrophile Granulozyten, CD4-pos-T-Lymphozyten und NKZellen synthetisieren TNF-α. Im Plasma unterliegt TNF-α einer kurzen Halbwertszeit von
unter fünf Minuten. Spezifische Rezeptoren befinden sich mit Ausnahme der Erythrozyten
auf allen somatischen Zellen. TNF-α stimuliert seine eigene Synthese und die von IL-10,
IL-6 und IL-2. Es ist einer der wichtigsten entzündungsvermittelnden endogenen
Mediatoren, über den die klassischen Entzündungszeichen Rötung, Schwellung, Schmerz
und Überwärmung induziert werden (Cruse et al., 1995, Freund et al., 1994, Ibelgaufts et
al., 1992, Nicola et al., 1994, Oppenheim et al., 1993).
Bei herzinsuffizienten Patienten charakterisiert ein erhöhter TNF-α-Spiegel eine
Subgruppe mit ausgeprägter Kachexie, Nach- und Vorlasterhöhung und deutlich
eingeschränkter Prognose. TNF-α wird bei einer fortgeschrittenen Herzinsuffizienz
hochreguliert und ist ätiologisch hierfür mitverantwortlich (Deswal et al., 2001,
Haunstetter et al., 1998). Murray et al. bemerken, dass Kardiomyozyten in der Lage sind,
TNF-α infolge kardialer Stresssituationen wie z.B. Herzinfarkt, Bluthochdruck und oder
Nachlasterhöhung zu sezernieren. TNF-α induziert eine Kardiomyozytenhypertrophie, eine
linksventrikuläre Dilatation und beeinträchtigt die kontraktile Funktion des Herzens. TNFα und sein löslicher Rezeptor dienen unabhängig von dem Alter oder der Ausprägung der
kardialen Dysfunktionen, als positiv prädiktive Werte einer kardiotoxisch bedingten
Mortalität (Murray et al., 2003, Rohrbach et al., 1999, Sawyer et al., 2002, Zhao et al.,
1998).
Interferon-gamma
Interferone sind Proteine, die eine unspezifische antivirale Aktivität aufweisen,
antiproliferativ und immunmodulierend wirken, und in dieser Weise den Metabolismus,
das Wachstum und die Differenzierung der Zellen beeinflussen können. Es sind
speziesspezifisch wirkende multifunktionale Proteine, die im Verlauf der Aktivierung des
körpereigenen Abwehrsystems von unterschiedlichen Zellarten gebildet und sezerniert
14
werden. Man unterscheidet drei Hauptklassen: Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ. Ihr
Hauptwirkspektrum richtet sich gegen virusinfizierte Zellen, von denen sie selbst
produziert werden, um nicht-infizierte Zellen zu schützen.
Des Weiteren beeinflussen sie die Antikörpersynthese von aktivierten B-Zellen und
regulieren den Aktivitätsgrad von Makrophagen, natürlichen Killerzellen und TLymphozyten. Eine weitere wichtige Funktion ist ihre antiproliferative Wirkung, die bei
bestimmten Tumoren zytotoxische Effekte erzielen kann.
Interferon-gamma wird hauptsächlich von CD4-positiven TH1-Zellen, CD8-positiven TLymphozyten und von natürlichen Killerzellen synthetisiert. Die spezifischen IFN-γRezeptoren werden auf allen humanen Zellen mit Ausnahme der Erythrozyten exprimiert.
Im Serum unterliegt IFN-γ einer kurzen Halbwertszeit (Cruse et al., 1995, Freund et al.,
1994, Ibelgaufts et al., 1992, Oppenheim et al., 1993). IFN-γ aktiviert hauptsächlich
Monozyten und Makrophagen, die daraufhin TNF-α synthetisieren. Außerdem induziert es
die Transkription der koloniestimulierenden Faktoren G-CSF und M-CSF, wodurch es das
T-Zellwachstum und die funktionelle Differenzierung der T-Lymphozyten moduliert. Im
Vergleich zu den anderen Interferonen spielt IFN-γ eine große immunmodulatorische Rolle
und besitzt die stärkste antiproliferative Wirkung.
15
1.4.
Fragestellungen:
I.
Welchen Einfluß übt eine Trastuzumab-Therapie auf das zelluläre (NK-Zellen, THelferzellen, T-Suppressorzellen, B-Lymphozyten) und humorale Immunsystem
(IL-2, 4, 10, 12, TNF-α, INF-γ) aus? Gibt es signifikante Konzentrationsunterschiede der Parameter im Anschluß an die erste intravenöse TrastuzumabGabe und im Gesamtverlauf?
II.
Beurteilung der Immunzell- und Zytokinkonzentrationen unter Berücksichtigung
folgender klinischer Charakteristika:
a. Bestehen signifikante Konzentrationsdifferenzen zwischen den Responder- und
Non-Responder-Patientinnen?
b. Bestehen signifikante Konzentrationsdifferenzen zwischen den Patientinnen mit
und ohne kardiotoxische Nebenwirkungen?
Lassen sich hier Anhaltspunkte für eine Beteiligung des Immunsystems an der
Trastuzumab-vermittelten Kardiotoxizität finden ?
c. Bestehen signifikante Konzentrationsdifferenzen zwischen den Patientinnen mit
und ohne initiale anaphylaktoide Reaktionen?
16
2.
Material und Methoden
2.1.
Einleitung
Über einen Zeitraum von 16 Wochen wurden von insgesamt 18 HER2-positiven
Brustkrebspatientinnen,
die
sich
einer
Herceptintherapie
unterzogen,
an
acht
Infusionszeitpunkten Blutproben entnommen. Diese erfolgten jeweils vor und nach der
ersten (1.Inf.), sowie vor der dritten (3. Inf.), der vierten (4. Inf.), der siebten (7. Inf.), der
zehnten (10.Inf.), der 13. (13 Inf.) und der 16. (16 Inf.) Trastuzumab-Infusion. Folgende
Parameter wurden aus diesen Blutproben bestimmt:
*
*
*
*
Natürliche Killerzellen
B-Lymphozyten
T-Helferzellen
T-Suppressorzellen
*
*
*
*
*
*
Tumor Nekrosefaktor alpha
Interferon gamma
Interleukin 2
Interleukin 4
Interleukin 10
Interleukin 12
Da die einzelnen Parameter im zeitlichen Verlauf, d.h. die ersten zwei Konzentrationen vor
und nach der ersten Infusion, sowie die Konzentrationen vor der 1. und 16. Infusion und
die Konzentrationen unter klinischen Gesichtpunkten, verglichen werden sollten ist bei der
Planung und Durchführung dieser Untersuchung keine Kontrollgruppe miteinbezogen
worden.
2.2.
Patientenkollektiv
Insgesamt 18 Patientinnen mit einem fortgeschrittenen Mammakarzinom und einem
positiven HER2-Rezeptorstatus, bei denen eine Herceptintherapie in Form einer Monooder Kombinationschemotherapie durchgeführt werden sollte, wurden in diese
Untersuchung aufgenommen.
Um potentielle kardiotoxische oder infusionsabhängige, anaphylaktoide Nebenwirkungen
zu identifizieren, sind zu Beginn jedes Infusionstages eine Ganzkörperuntersuchung
einschließlich
einer
orientierenden
neurologischen
Untersuchung,
eine
Elektrokardiographie und eine transthorakale Echokardiographie durchgeführt worden. Die
bei diesen Untersuchungen ermittelten klinischen Daten, wie z.B. das Auftreten von
kardiologischen
Funktionsstörungen
oder das
Vorkommen
von
anaphylaktoiden
Symptomen, sollen neben dem klinischen Outcome der Patientinnen mit der Höhe der
Immunzell- und Zytokinkonzentrationen verglichen werden.
Zu den häufig auftretenden Nebenwirkungen einer Herceptintherapie zählen einerseits
anaphylaktoide Reaktionen, wie Fieber und Schüttelfrost, sowie gastrointestinale
17
Beschwerden mit Übelkeit und Erbrechen. Da diese Nebenwirkungen unmittelbar nach der
ersten Herceptininfusion auftreten, liegt ein Hauptaugenmerk insbesondere auf dem
Ergebnisvergleich
zwischen
dem
ersten
(1.Inf.v.)
und
dem
zweiten
(1.Inf.n)
Messzeitpunkt, d.h. vor und nach der ersten Herceptininfusion. Bei insgesamt acht der
achtzehn
Patientinnen
traten
Nebenwirkungen
unmittelbar
nach
der
initialen
Herceptininfusion auf.
Bezüglich der kardialen Beeinflussung zeigten insgesamt acht Patientinnen im Verlauf der
Studienzeit kardiotoxische Nebenwirkungen. Sechs dieser Patientinnen litten bereits vor
dem Beginn der Herceptintherapie unter leichtgradigen kardialen Funktionsstörungen, von
denen 3 Patientinnen eine mittel- bis hochgradige Einschränkung der LVEF
(Linksventrikuläre Ejektionsfraktion) entwickelten. In den übrigen zwei Fällen trat eine
Beeinflussung der LVEF ohne kardiale Vorerkrankungen ein.
Die klinischen Daten der Patientinnen sind in der folgenden Tabelle zusammenfassend
dargestellt.
18
Tabelle 1:
Übersicht der klinischen Patientendaten
Nr. Alter Histo.
klin .
initiale
kardiale
kardiotox.
Outcome
Infusions-NW
Risikofaktoren
NW
1
43
inv. dukt. Non-Responder
2
63 inv. lobul.
Responder
3
30
inv. dukt.
Responder
keine Symptome
4
55
inv. dukt.
Responder
anaphylaktoide Sympt.
5
49 inv. lobul. Non-Responder
6
39
inv. dukt. Non-Responder anaphylaktoide Sympt. keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
7
67
inv. dukt.
8
45
inv. dukt. Non-Responder
keine Symptome
keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
9
49
inv. dukt. Non-Responder
keine Symptome
leicht° LVEF Strg. leicht° LVEF Strg.
10
51 inv. lobul.
Responder
anaphylaktoide Sympt. keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
11
58 inv. lobul.
St. disease
anaphylaktoide Sympt. keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
12
45
inv. dukt. Non-Responder anaphylaktoide Sympt. leicht° LVEF Strg. keine kardiot.NW.
13
43
inv. dukt.
unbek.
14
53
inv. dukt.
Responder
anaphylaktoide Sympt. keine Risikofaktoren leicht° LVEF Strg.
15
49
inv. dukt.
Responder
anaphylaktoide Sympt. keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
16
32
inv. dukt.
Responder
keine Symptome
keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
17
51
inv. dukt.
Responder
keine Symptome
keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
18
47
inv. dukt.
Responder
keine Symptome
keine Risikofaktoren leicht° LVEF Strg.
Responder
keine Symptome
keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
anaphylaktoide Sympt. leicht° LVEF Strg. hoch° LVEF Strg.
keine Symptome
keine Symptome
keine Symptome
leicht° LVEF Strg. hoch° LVEF Strg.
art. Hypertonie
Mittel ° LVEF Strg.
keine Risikofaktoren leicht° LVEF Strg
leicht° LVEF Strg. leicht° LVEF Strg.
keine Risikofaktoren keine kardiot.NW
Patientin 1-18.; Initiale Infusions-NW.: Nebenwirkungen infolge der ersten Trastuzumab-Infusion,
anaphylaktoide Symptome: Fieber, Schüttelfrost, Gliederschmerz, Übelkeit und Erbrechen; kardiotox. NW.:
kardiotoxische Nebenwirkungen: leicht°(<70%), mittel° (<50%,>30%) und hoch°(<30%) LVEFStrg.(Einschränkung der Linksventrikulären Ejektionsfraktion); Klin. Outcome: Responder, Patientinnen mit
Ansprechen auf die Trastuzmab-Therapie; Non-Responder: Patientinnen mit Tumorprogression unter der
Trastuzumab-Therapie; Histo: Tumorhistologie: inv.dukt.: Invasiv duktales Wachstum, inv.lobul.: invasiv
lobuläres Wachstum. Alter: Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt des Nachweis der HER2-Überexpression.
19
2.3.
Gewinnung und Verarbeitung der Analyseproben
Unmittelbar vor der 1.,3.,4.,7.,10.,13. und 16. Trastuzumab-Infusion sowie nach der ersten
Infusion wurde jeder Patientin 12 ml venöses Citratblut für die Zytokinbestimmung, sowie
3 ml EDTA-Blut für die Durchflusszytometrie entnommen. Das Citratblut wurde sofort
nach der Entnahme für den Transport tiefgekühlt, um potentielle Zerfallsprozesse zu
verhindern. Im Labor wurden die Proben über 15 Minuten bei 1500 rpm zentrifugiert und
der Serumüberstand anschließend in 14 Eppendorfgefäße a 500 µl aliquotiert. Diese
Aliquots wurden dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.
Das EDTA-Blut wurde innerhalb von 36 Stunden weiterverarbeitet. Zunächst wurden pro
Blutprobe sechs Kunststoffreagenzgläser kompatibel für das FACS-Durchflußzytometer
bereitgestellt, und jeweils 10µl der spezifischen Antikörperkombination für die zu
bestimmenden Zellen vorgelegt. Eine Auflistung der verschiedenen Antikörper zeigt
Tabelle 2. Sämtliche hier verwendeten Antikörper wurden bei der Firma Beckmann
Coulter bezogen.
Die Blutproben wurden mit der Hand vorsichtig durchmischt und 100µl der Zellsuspension
zu den Antikörpergemischen hinzupipettiert. Anschließend wurden diese Ansätze bei
Raumtemperatur für 15 Minuten unter Lichtausschluß inkubiert und danach mit dem
Lysiergerät von Beckmann Coulter (Coulter Multi-Q-Prep) lysiert. Im Anschluss hieran
wurden die Proben in das FACS-Durchflußzytometer der Firma Beckmann Coulter
gegeben, welches die quantitative Bestimmung der einzelnen Lymphoyztentypen
durchführte.
Tabelle 2:
Antikörper der Durchflusszytometrie
Monozyten
CD 45 – FITC (IMMU19.2)
CD 14 – PE (RMO52)
Kontrolle
IgG1 - FITC
IgG1- PE
B- Lymphozyten
CD 3 – FITC negativ (UCHT1) CD 19 – PE (J4.119)
T- Helferzellen
CD 3 – FITC (UCHT1)
CD 4 – PE (13B8.2)
T- Suppressorzellen
CD 3 – FITC (UCHT1)
CD 8 – PE (B9.11)
Natürliche Killerzellen
CD 3 – FITC (UCHT1)
CD 16 + CD 56 – PE ( 3G8+NKH1)
20
2.4.
Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS)
2.4.1. Testdurchführung
Die Durchflusszytometrie (FACS) ermöglicht die Identifizierung und das Sortieren von
Zellen aufgrund ihrer Oberflächenantigene. Dazu werden die zu bestimmenden Zellen
zunächst mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Bei der direkten Messung verwendet man
spezifische, gegen die Antigene der Zelloberfläche gerichtete Antikörper, an die ein
Farbmolekül gekoppelt ist. Die indirekte Markierung erfolgt mit fluoreszenzmarkierten
Anti-Immunglobulinen, wodurch unmarkierte, zellgebundene Primärantikörper nachgewiesen werden können. Die zu bestimmende Zellsuspension wird mit Druckluft durch
eine Düse gepresst und so ein linearer Zellstrom erzeugt. Gleichzeitig wird eine
Trägerflüssigkeit zugeführt. Unterhalb der Düsenöffnung trifft der Flüssigkeitsstrahl auf
einen fokussierten Laserstrahl. Die den Laserstrahl passierenden Zellen streuen das
Laserlicht und die markierten Zellen emittieren zusätzlich Fluoreszenzlicht. Durch die
Verwendung von Fluorochromen wie Fluorescein (FITC) und R-Phytoerythrin (PE), die
einen Exzitationsbereich von 488 nm haben, ist die Detektion membranständiger Antigene
mittels fluorochromkonjugierter, monoklonaler Antikörper möglich. Zu ihrer Anregung
wird ein Argonlaser mit einer Emissionslinie bei 488 nm verwendet. In Richtung des
Laserstrahls wird das Vorwärtsstreulicht (engl. forward light scatter, FSC) gemessen, im
rechten Winkel das Seitwärtsstreulicht (engl. side scatter, SSC). Das durch die
Fotodetektoren gemessene Vorwärtsstreulicht ist in erster Linie ein Maß für die Zellgröße
und das seitwärts gestreutes Licht für die intrazelluläre Granularität und Membranfaltung,
sodass anhand dieser physikalischen Parameter die verschiedenen Subpopulationen der
Lymphozyten differenziert werden können.
21
Abbildung 3:
Schematische Darstellung der Apparatur der fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung.
Die Ergebnisse werden in dieser Arbeit als „Dot-Plot“ dargestellt, eine zweidimensionale
Darstellung zweier Parameter. Jede Zelle wird entsprechend ihrer Werte für Parameter 1
(X-Achse) und Parameter 2 (Y-Achse), zwischen X- und Y- Achse als Punkt eingetragen.
Abbildung 4:
Beispiel einer durchflusszytometrischen Ergebnisdarstellung mittels Dot-Plot.
22
2.4.2. FACS-Durchflußzytometer
Die Messung der präparierten Leukozytensuspensionen erfolgte mit einem FACSDurchflusszytometer (Coulter R EPICS R XL TM flow cytometer, Beckmann Coulter,
Frankreich). Der 2 W Argon-Ionen-Laser dieses Gerätes wurde auf eine Anregungswellenlänge von 488 nm justiert. Die Emission erfolgte bei 525 nm für FITC und 575 nm
für PE. Das FACS-Durchflußzytometer wurde täglich auf eine optimale Diskriminierung
der Fluoreszenzsignale geeicht.
2.4.4. Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit dem Programm XL SYSTEM II TM (Beckmann Coulter).
Um bei der Auswertung die zelluläre Autofluoreszenz, d.h. das Fluoreszenzlicht, das die
Zellen aufgrund ihrer eigenen chemischen Zusammensetzung emittieren und ein
Überlappen von spezifischen und unspezifischen Bindungen zu vermeiden, wurden die
IgG1-FITC und IgG1-PE Proben als unspezifische Kontrolle bei jeder Messung
mitgeführt. Von den präparierten Leukozyten wurden insgesamt jeweils 5000 Leukozyten
pro Messansatz durchflusszytometrisch analysiert. Die endgültigen Messdaten der Proben
errechneten sich aus dem statistischen Mittel von zwei Messergebnissen. Da das Gerätnicht
alle, sondern nur eine definierte Anzahl von Zellen analysiert hat, kann somit nur eine
Aussage über den prozentualen Anteil des einzelnen Zelltyps an der gesamten
Lymphozytenpopulation
getroffen
werden.
Eine
Aussage
über
die
absoluten
Zellkonzentrationen ist demzufolge nicht möglich.
2.5.
Enzym-Immunoassay
Ein Enzym-Immunoassay ist ein sensitiver und spezifischer Test zur Bestimmung
antigener Substanzen, wie z.B. Proteine in Flüssigkeiten. Zur quantitativen Bestimmung
der Zytokine wurden kommerziell erhältliche Testkits des Unternehmens Beckman Coulter
verwendet.
2.5.1. Testprinzip
Die
hier
verwendeten
Testkits
sind
Sandwich-Enzym-Immunoassays
mit
zwei
immunologischen Schritten. Im ersten Schritt bindet das Zytokin aus dem Standard bzw.
aus den Serumproben an die wandständigen Primärantikörper der Mikrotiterplatten. Im
zweiten Schritt wird dann der zweite biotinylierte Sekundärantikörper, gemeinsam mit
einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat in die Vertiefungen der Platte pipettiert. Über die
23
hohe Affinität von Avidin zu Biotin entsteht so ein Komplex aus Zytokin und Peroxidase.
Das Enzym oxidiert im folgenden Schritt das zugegebene Substrat TBM, wodurch ein
farbiges Reaktionsprodukt entsteht. Diese Reaktion wird durch die Zugabe einer
Stoplösung nach einer definierten Zeit unterbrochen und die Konzentration des
entstandenen Farbstoffs photometrisch bestimmt. Hierbei verhält sich die Farbintensität
proportional zu der Zytokinkonzentration in dem Standard bzw. der Probe.
Exemplarisch für alle Parameter werden im folgenden Text anhand des Interleukin 4ELISA die Testkitbestandteile und der Testablauf beschrieben.
Tabelle 3:
Testkitbestandteile
- Interleukin 4 Mikrotiterplatte
beschichtet mit monoklonalem Antikörper gegen
humanes Interleukin 4
- Interleukin 4 Standard
rekombinantes
humanes
Interleukin
4,
lyophilisiert
- Interleukin 4 Konjugat
biotinylierter
monoklonaler
anti
IL
4
Antikörper, in gepufferter Lösung
- Verdünnungspuffer 1
gepufferte Proteinlösung
- Streptavidin-HRP Konjugat
enthält Streptavidin Peroxidase Konjugat in
gepufferter Lösung
- Waschpufferkonzentrat
gepufferte Lösung mit Detergenz
- TMB Substrat
Tetramethylbenzidin
- Stoplösung
Schwefelsäure
2.5.2. Testvorbereitungen
Die zu untersuchenden Proben wurden eine Stunde vor Beginn der Durchführung des
ELISA langsam bei Raumtemperatur aufgetaut. Alle für den Kit notwendigen Reagenzien
wurden auf eine Raumtemperatur von 22-26 °C gebracht und vorsichtig durchmischt.
Während der Auftauzeit wurde die Waschlösung (50ml) mit 950ml Aqua destillata
verdünnt und der lyophilisierte Interleukin 4 Standard in Aqua destillata aufgelöst. Nach
einer Wartezeit von 10 Minuten konnte dann die Standardreihe mit Hilfe des
Verdünnungspuffers (Diluent 1) angesetzt werden. Der Konzentrationsbereich der
Verdünnungsreihen für die Standards ist abhängig von dem zu bestimmenden Interleukin
(siehe Tabelle 4).
24
Tabelle 4: Konzentrationsbereiche der Nachweisgrenzen
TNF-α
von 0 pg/ml bis 1000 pg/ml
IFN-γ
von 0 IU/ml bis 25 IU/ml
IL 2
von 0 pg/ml bis 250 pg/ml
IL 4
von 0 pg/ml bis 1000 pg/ml
IL 10
von 0 pg/ml bis 2000 pg/ml
IL 12
von 0 pg/ml bis 1000 pg/ml
2.5.3. Testdurchführung
Zunächst wurden in die Vertiefungen der bereits mit monoklonalem Antikörper
beschichteten Mikrotiterplatte 100µl IL-4 Standard bzw. 100µl Serumprobe pipettiert.
Hiernach wurde die Platte mit einer Folie verschlossen und für zwei Stunden bei
Raumtemperatur
unter
Schüttelbewegungen
(350rpm)
inkubiert.
Lediglich
beim
Interleukin 2 wird bereits in diesem ersten Schritt der Standard bzw. die Probe gemeinsam
mit dem biotinylierten Sekundärantikörper in die Vertiefungen pipettiert. Im Anschluss
hieran wurde die Folie entfernt, die Platte dekantiert und dreimal mit ca. 300 µl
Waschlösung überschüssige Bestandteile von Proben und Standards entfernt. Im nächsten
Schritt wurden 50µl des biotinylierten monoklonalen Sekundärantikörpers und 100 µl des
Streptavidiv-HRP Konjugats in die Vertiefungen pipettiert. Erneut wurde die Platte mit
Laborfolie verschlossen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur und unter
Schüttelbewegungen (350 rpm) inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde durch
erneutes Waschen mit 3 mal 300µl Waschlösung überschüssiges Material entfernt.
Anschließend wurden 100µl TMB Substrat hinzugefügt und die Mikrotiterplatte für
weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Schüttelbewegungen und unter
Lichtausschluß inkubiert. Nach Abschluss dieser 15 Minuten wurde zur Beendigung dieser
Reaktion 50µl Stoplösung hinzugefügt. Anschließend erfolgte die Erstellung der
Standardkurve und die Ermittlung der unbekannnten Probenwerte computergesteuert durch
das Photometer. Die optische Dichte des farbigen Produkts wurde bichromatisch
photometrisch gemessen. Die Wellenlänge des Testfilters betrug 450 nm und die des
Referenzfilters 550 nm. Aus den Absorptionswerten der mitgeführten Standards wurde
eine Eichkurve erstellt. Dazu wurden die Mittelwerte der Doppelbestimmungen gegen die
bekannten Konzentrationen der Standards aufgetragen. Die doppelt logarithmische
Abtragung der Daten ermöglichte eine lineare Darstellung der Standardkurve. Aus den
Schnittpunkten der Absorptionswerte der Serumproben mit der Standardkurve ergaben sich
die entsprechenden Konzentrationen der Interleukine. Bei jeder Messung wurden die
25
Proben und Standards doppelt bestimmt und jeweils eine neue Standardkurve
aufgenommen.
2.6.
Statistische Auswertung
Zur Analyse der Daten wurde SPSS 11.0 und 12.0 für WINDOWS-software package
(SPSS Inc., Chicago, IL) verwendet. Da die Ergebnisse nicht in einer Normalverteilung
vorlagen,
wurden
verteilungsunabhängige
und
parameterfreie
Tests
angewandt.
Demzufolge wurde die Signifikanz der Ergebnisdifferenzen, die sich aus den einzelnen
Wertevergleichen ergaben, mit dem Wilcoxon-Tests für verbundene Stichproben überprüft.
Um die Stärke des Zusammenhangs kontinuierlicher Variablen zu ermitteln, wurde die
Korrelation nach Spearman berechnet. Die Daten sind als Mediane ± Standardfehler des
Mittelwertes (SEM) angegeben. Signifikante Unterschiede (p<0,05) wurden mit (*),
hochsignifikante (p<0,01) (**) bzw. (p<0,001) mit (***) gekennzeichnet. Im Ergebnisteil
erfolgt zunächst eine Ergebnisübersichtsdarstellung der einzelnen Parameter in Form von
Box Plots. Die rechteckigen Kästchen (Boxes) der Box Plots repräsentieren den
Wertebereich von der 25. Perzentile (unteres Ende) bis zur 75. Perzentile (oberes Ende).
Der waagerechte Strich innerhalb
der Kästchen stellt den Median dar. Die von den
Kästchen nach oben und unten ziehenden Linien kennzeichnen die 90. und 10. Perzentile.
Extremwerte werden mit einem Kreis bzw. Sternchen einzeln dargestellt.
Abbildung 5: Beispiel der Gesamtergebnisdarstellung mittels Box Plot
26
3.
Ergebnisse
Das Verhalten der untersuchten immunologischen Parameter wurde im Hinblick auf
verschiedene Reaktionsmuster überprüft und in Box Plots dargestellt:
1. Verlaufskontrolle (vor 1. bis 16. Infusion)
2. Initialreaktion (Meßwert vor und nach der ersten Infusion)
3. Langzeitreaktion Vergleich des Basiswertes (1. Infusion) mit dem Wert am Ende des
Beobachtungszeitraumes (16. Infusion)
Im weiteren werden dann verschiedene Patientinnengruppen unter den unten genannten
klinischen Gesichtspunkten verglichen:
1. Vergleich der Non-Responder mit den Responder-Patientinnen
2. Vergleich der Patientinnen mit und ohne kardiotoxische Symptome
3. Vergleich der Patientinnen mit und ohne initiale Infusionsreaktionen
Bezüglich dieser Vergleiche werden hauptsächlich die gemäss der Literatur relevanten
Parameter überprüft.
27
3.1.
Auswirkung einer Antikörpertherapie mit Trastuzumab auf die
einzelnen Parameterkonzentrationen
3.1.1. Natürliche Killerzellen
60,00
50,00
NK-Zellen in Prozent
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4.Inf.
7.Inf.
10. Inf.
13.Inf.
16.Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 6: Konzentrationsentwicklung der NK-Zellen vor
den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in Prozent.
Initialreaktion
50,00
Langzeitreaktion
50,00
***
40,00
NK-Zellen in Prozent
NK-Zellen in Prozent
40,00
30,00
20,00
30,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1.Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 7: Konzentration der NK-Zellen vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in Prozent. (***p<0,001)
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 8: Konzentration der NK-Zellen vor der
1. und der 16. Trastuzumab-Infusion bei MammaCa.-Patientinnen (n=17) in Prozent.
28
Unter der ersten intravenösen Gabe von Trastuzumab (1.Inf.; Abb.7) kommt es zu einer
hochsignifikanten (p=0,001) Reduktion der medianen Konzentration der natürlichen
Killerzellen auf die Hälfte, von 16,50% (± 7,97%) auf 8,65% (± 3,54%).
Im Gesamtverlauf (Abb.8) der sechszehnwöchigen Trastuzumab-Therapie erfolgt keine
signifikante Konzentrationsänderung von der ersten (16,50%) bis zur sechzehnten
intravenösen Trastuzumab-Gabe (16,10%).
29
3.1.2. B-Lymphozyten
40,00
B-Zellen in Prozent
30,00
20,00
10,00
0,00
1.Inf.
3.Inf.
4. Inf.
7.Inf.
10.Inf.
13.Inf.
16.Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung
9:
Konzentrationsentwicklung
der
BLymphozyten vor den Trastuzumab-Infusion 1.-16. bei
Mamma-Ca.-Patientinnen (n=16) in Prozent.
Initialreaktion
Langzeitreaktion
40,00
40,00
***
30,00
B-Zellen in Prozent
B-Zellen in Prozent
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 10: Konzentration der B-Zellen vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=16) in Prozent. (*** p< 0,001)
1.Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 11: Konzentration der B-Zellen vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=14) in Prozent.
30
Im Verlauf der ersten Trastuzumab-Infusion (Abb.10) tritt eine hochsignifikante
Steigerung (p=0,001) der Konzentration der B-Lymphozyten um 11%, von 10,95% (±
7,70%) auf 21,95% (± 10,10%) ein.
Im Gesamtverlauf (Abb.11; 1.-16.Inf.) des sechzehnwöchigen Therapiezeitraumes ist keine
signifikante Reaktion der B–Lymphozytenkonzentration zu verzeichnen (10,95 ± 7,70%
vs. 10,95 ± 9,98%).
31
3.1.3. T-Helferzellen
80,00
T-Helferzellen in Prozent
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
1.Inf.
3.Inf.
4.Inf.
7.Inf.
10.Inf.
13.Inf.
16.Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 12: Konzentrationsentwicklung der THelferzellen vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei
Mamma-Ca.-Patientinnen (n=16) in Prozent.
Initialreaktion
Langzeitreaktion
70,00
70,00
**
60,00
T-Helferzellen in Prozent
T-Helferzellen in Prozent
60,00
50,00
40,00
50,00
40,00
30,00
30,00
20,00
20,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 13: Konzentration der T-Helferzellen vor
und nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei MammaCa.-Patientinnen (n=16) in Prozent. (** p<0,006)
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 14: Konzentration der T-Helferzellen
vor der 1. und der 16. Trastuzumab-Infusion bei
Mamma-Ca.-Patientinnen (n=14) in Prozent.
32
Im Verlauf der ersten intravenösen Trastuzumab-Gabe (Abb.13) erfolgt ein hochsignifikanter (p=0,006) Anstieg der medianen Konzentration der T-Helferzellen um 3,95%
(45,00 ± 9,42% vs. 48,95 ± 9,18%).
Im Verlauf des gesamten Studienzeitraumes (Abb.14) zwischen der ersten und der
sechzehnten intravenösen Trastuzumab-Gabe ist eine nicht signifikante Reduktion der THelferzellen um 2,4% (45,00 ± 9,42% vs. 42,60 ± 13,25%) zu verzeichnen.
33
3.1.4. T-Suppressorzellen
T- Suppressorzellen in Prozent
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf.
13. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung
15:
Konzentrationsentwicklung
TSuppressorzellen vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16.
bei Mamma-Ca.-Patientinnen (n=16) in Prozent.
Initialreaktion
60,00
Langzeitreaktion
60,00
**
50,00
T-Suppressorzellen in Prozent
T-Suppressorzellen in Prozent
50,00
40,00
30,00
20,00
40,00
30,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung
16:
Konzentration
der
TSuppressorzellen vor und nach der 1. TrastuzumabInfusion bei Mamma-Ca.-Patientinnen (n=16) in
Prozent. (**p<0,01)
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung
17:
Konzentration
der
TSuppressorzellen vor der 1. und der 16.
Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.-Patientinnen
(n=14) in Prozent.
34
Die erste intravenöse Trastuzumab-Gabe (Abb.16) induziert eine signifikante (p=0,01)
Reduktion der medianen Konzentration der T-Suppressorzellen um 4,52%, von 23,62% (±
12,17%) auf 19,10% (± 8,85%;).
Im Verlauf des gesamten Untersuchungszeitraumes (Abb.17) zwischen der ersten und der
sechzehnten
Trastuzumab-Gabe
ist
eine
nicht
signifikante
Reduktion
der
T-
Suppressorzellen um 0,48% zu verzeichnen (23,62 ± 12,17% vs. 23,14 ± 12,76%).
35
3.1.5. Tumor-Nekrosefaktor alpha
120,00
100,00
TNF-a in pg/ml
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 18: Konzentrationsentwicklung von TNF-α vor
den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=18) in pg/ml.
Langzeitreaktion
140,00
140,00
120,00
120,00
100,00
100,00
TNF-a in pg/ml
TNF-a in pg/ml
Initialreaktion
80,00
60,00
***
40,00
80,00
60,00
40,00
20,00
20,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 19: Konzentration von TNF-α vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=18) in pg/ml. (***p<0,001).
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 20: Konzentration von TNF-α vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=16) in pg/ml.
36
Die mediane TNF-α-Konzentration der gesamten Untersuchungsgruppe vor der
Trastuzumab-Therapie beträgt 11,41 (± 13,22) pg/ml. Unter dem Einfluss der ersten
Infusion (Abb.19) tritt eine hochsignifikante Steigerung des TNF-α-Spiegels (p=0,001) um
15,46 (± 35,05) pg/ml, bzw. 235% ein.
Hinsichtlich des gesamten Untersuchungszeitraumes (Abb.20) tritt von der ersten bis zu
der letzten Trastuzumab-Gabe eine nicht signifikante TNF-α Reduktion um 4,06 pg/ml ein
(11,41 ± 13,22 pg/ml vs. 7,35 ± 7,32 pg/ml).
Die erste intravenöse Trastuzumab-Gabe induziert eine relevante und signifikante mediane
TNF-α-Konzentrationssteigerung.
37
3.1.6. Interferon-γ
1,000
IFN- g in IU/ml
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf.
13. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 21: Konzentrationsentwicklung IFN–γ in IU/ml
vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=18).
Langzeitreaktion
0,700
0,700
0,600
0,600
0,500
0,500
INF-g in IU/ml
IFN-g in IU/ml
Initialreaktion
0,400
0,300
0,400
0,300
0,200
0,200
0,100
0,100
0,000
0,000
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 22: Konzentration von IFN-γ vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=18) in IU/ml.
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 23: Konzentration von IFN-γ vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in IU/ml.
38
Im Verlauf der ersten Trastuzumab-Infusion (Abb.22) tritt eine nicht signifikante Abnahme
der medianen IFN-γ-Konzentration um 0,02 IU/ml ein (0,30 ± 0,16 IU/ml vs. 0,28 ± 0,18
IU/ml).
Insgesamt tritt während der sechszehnwöchigen Untersuchungszeit (Abb.23) zwischen der
ersten und der sechzehnten intravenösen Trastuzumab-Gabe eine nicht signifikante
Reduktion der INF-γ-Konzentration um 0,04 IU/ml (13,3%) ein (0,30 ± 0,16 IU/ml vs.
0,26 ± 0,22 IU/ml).
39
3.1.7. Interleukin 2
30,00
Interleukin 2 in pg/ml
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf.
13. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 24: Konzentrationsentwicklung Interleukin 2 in
pg/ml vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei MammaCa.-Patientinnen (n=10).
Langzeitreaktion
30,00
30,00
25,00
25,00
20,00
20,00
Interleukin 2 in pg/ml
Interleukin 2 in pg/ml
Initialreaktion
15,00
10,00
15,00
10,00
5,00
5,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 25: Konzentration von IL-2 vor und nach
der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=10) in pg/ml.
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 26: Konzentration von IL-2 vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=10) in pg/ml.
40
Die erste Trastuzumab-Infusion (Abb.25) führt zu einer nicht signifikanten Verringerung
des Interleukin 2-Spiegels (9,82 ± 9,93 pg/ml vs. 9,76 ± 8,86 pg/ml) um 0,06 pg/ml
(entsprechend 0,61%).
Insgesamt tritt während der sechszehnwöchigen Untersuchungszeit (Abb.26) zwischen der
ersten und der sechzehnten Trastuzumab-Gabe eine nicht signifikante Reduktion des IL-2
Gehaltes um 3,16 pg/ml (32,17%) ein (9,82 ± 9,93 pg/ml vs. 6,66 ± 4,92 pg/ml).
41
3.1.8. Interleukin 4
100,00
Interleukin 4 in pg/ml
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 27: Konzentrationsentwicklung Interleukin 4 in
pg/ml vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei MammaCa.-Patientinnen (n=17).
Langzeitreaktion
20,00
20,00
15,00
15,00
Interleukin 4 in pg/ml
Interleukin 4 in pg/ml
Initialreaktion
10,00
10,00
5,00
5,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 28: Konzentration von IL-4 vor und nach
der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in pg/ml.
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 29: Konzentration von IL-4 vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in pg/ml.
42
Der Effekt der ersten Trastuzumab-Gabe (Abb.28) auf die Interleukin 4 Konzentration ist
minimal. Es tritt eine nicht signifikante Reduktion um 0,4 pg/ml, (4,85 ± 20,07 pg/ml vs.
4,81 ± 12,36 pg/ml), entsprechen 8,24% desAusgangswertes ein.
Bezüglich des gesamten Untersuchungszeitraum von der ersten bis zur sechzehnten
(Abb.29) Trastuzumab-Infusion, ist eine nicht signifikante Reduktion der IL-4
Serumkonzentration um 0,1 pg/ml (4,85 ± 20,07 pg/ml vs. 4,75 ± 4,51 pg/ml),
entsprechend 2,08% des Ausgangswertes, nachweisbar.
43
3.1.9. Interleukin 10
100,00
Interleukin 10 in pg/ml
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 30: Konzentrationsentwicklung Interleukin 10 in
pg/ml vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei MammaCa.-Patientinnen (n=17).
Langzeitreaktion
80,00
80,00
70,00
70,00
60,00
60,00
Interleukin 10 in pg/ml
Interleukin 10 in pg/ml
Initialreaktion
50,00
40,00
**
30,00
50,00
40,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 31: Konzentration von IL-10 vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=17) in pg/ml. (**p<0,005).
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 32: Konzentration von IL-10 vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=16) in pg/ml.
44
Die erste Trastuzumab-Infusion (Abb.31) induziert einen hochsignifikanten Anstieg
(p=0,005) der Interleukin 10 Konzentration um 10,03 pg/ml (4,50 ± 9,56 pg/ml vs. 14,53 ±
46,77 pg/ml), entsprechend 222,88% des Ausgangswertes.
Im Verlauf des gesamten Therapiezeitraumes ist eine nicht signifikante Steigerung der
Interleukin 10 Konzentration um 3,53 pg/ml (4,50 ± 9,65 pg/ml vs. 8,03 ± 5,76 pg/ml),
entsprechend 178,44% des Ausgangswertes nachweisbar (Abb.32).
45
3.1.10. Interleukin 12
125,000
Interleukin 12 in pg/ml
100,000
75,000
50,000
25,000
0,000
1. Inf.
3. Inf.
4. Inf.
7. Inf.
10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 33: Konzentrationsentwicklung von Interleukin
12 in pg/ml vor den Trastuzumab-Infusionen 1.-16. bei
Mamma-Ca.-Patientinnen (n=12).
Langzeitreaktion
40,00
40,00
30,00
30,00
Interleukin 12 in pg/ml
Interleukin 12 in pg/ml
Initialreaktion
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 34: Konzentration von IL-12 vor und
nach der 1. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=6) in pg/ml.
1. Inf.
16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 35: Konzentration von IL-12 vor der 1.
und der 16. Trastuzumab-Infusion bei Mamma-Ca.Patientinnen (n=11) in pg/ml.
46
Die erste Trastuzumab-Infusion (Abb.34) induziert einen nicht signifikanten Anstieg der
Interleukin 12 Konzentration um 0,57 pg/ml (1,83 ± 33,53 pg/ml vs. 2,41 ± 27,73 pg/ml),
entsprechend 30% des Ausgangswertes.
Im Wechsel zwischen Zu- und Abnahme erfolgt im Verlauf des gesamten
Untersuchungszeitraumes (Abb.35) eine nicht signifikante Zunahme des Interleukin 12
Gehaltes um 8,60 pg/ml (1,84 ± 33,53 pg/ml vs. 10,44 ± 13,51 pg/ml), entsprechend
467,39% des Ausgangswertes. Dies ist zurückzuführen auf die Steigerung der Anzahl der
IL-12 positiven Patientinnen von 6 vor der ersten, auf 11 vor der letzten TrastuzumabGabe. Die Stichprobenanzahl ist hier reduziert, da die Patientinnen deren Interleukin 12
Spiegel an allen Messzeitpunkten unter der Nachweisgrenze lagen, nicht berücksichtigt
wurden.
47
3.2.
Vergleich der Immunzell- und Zytokinkonzentrationen unter
den klinischen Gesichtspunkten Responder/Non-Responder,
kardiotoxische Nebenwirkungen und initiale anaphylaktoide
Reaktionen
3.2.1. Vergleich der Zytokin- und Immunzellkonzentrationen der Responder
und Non- Responder- Patientinnen im Verlauf einer TrastuzumabTherapie
3.2.1.1. Natürliche Killerzellen
PR
SD
24,00
22,00
NK- Zellen in Prozent
20,00
18,00
16,00
14,00
12,00
10,00
1. Inf. 3. Inf. 4. Inf. 7. Inf. 10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 36: Gegenüberstellung der medianen Konzentrationen der
NK-Zellen bei Non-Responder- (PR; n=6) und ResponderPatientinnen (SD; n=8) im Verlauf der 16 wöchigen TrastuzumabTherapie in Prozent.
Die Konzentrationsverläufe der Responder- und Non-Respondergruppe zeigen eine
konträre Entwicklung. Bei der Responder-Patientengruppe (SD=stable disease) ist im
Verlauf der sechszehnwöchigen Trastuzumab-Therapie im Vergleich zu der NonResponder-Patientengruppe, eine relevante aber nicht signifikant höhere Konzentration an
natürlichen Killerzellen (16,51% vs. 14,35%) messbar. Lediglich vor der 13. TrastuzumabInfusion ist eine höhere Konzentration der NK-Zellen der Non-Responder (20,70% vs.
18,55%) nachweisbar.
48
3.2.1.2. T-Suppressorzellen
PR
SD
30,00
T-Suppressorzellen in Prozent
27,00
24,00
21,00
18,00
15,00
1. Inf. 3. Inf. 4. Inf. 7. Inf. 10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 37: Gegenüberstellung der medianen Konzentrationen der
T- Suppressorzellen bei Non–Responder- (PR; n=6) und ResponderPatientinnen (SD; n=8) im Verlauf einer 16 wöchigen TrastuzumabTherapie in Prozent.
Die Non-Responder-Patientinnen zeigen vor jeder intravenösen Trastuzumab-Gabe eine
nicht signifikant höhere Konzentration der T-Suppressorzellen im Vergleich zu den
Responder-Patientinnen (24,75% vs.17,6%).
49
3.2.1.3. Interferon-γ
PR
SD
0,40
IFN-y in IU/ml
0,35
0,30
0,25
0,20
1. Inf. 3. Inf.
4. Inf. 7. Inf. 10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 38: Gegenüberstellung der medianen IFN-γKonzentrationen bei Non-Responder- (PR; n = 10) und ResponderPatientinnen (SD; n = 8) im Verlauf einer 16 wöchigen TrastuzumabTherapie in IU/ml.
Die IFN-γ-Konzentrationen der Non-Responder-(PR) und Responder-Patientengruppen
(SD) zeigen einen konträren Verlauf. Der IFN-γ-Spiegel der Non-Responder-Patientinnen
steigt, im Vergleich zu der Responder-Patientengruppe nicht signifikanten von der dritten
(3. Inf.) bis zur siebten (7. Inf.) Trastuzumab-Infusion an. Die IFN-γ-Konzentration der
Responder-Patientinnen fällt hingegen zunächst ab. Lediglich die Ergebnisdifferenz der 16.
Trastuzumab-Infusion ist signifikant (p=0,043).
50
3.2.1.4. Interleukin 12
PR
SD
Interleukin 12 in pg/ml
15,00
10,00
5,00
0,00
1. Inf. 3. Inf. 4. Inf. 7. Inf. 10. Inf. 13. Inf. 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 39: Gegenüberstellung der medianen IL-12Konzentrationen bei Non-Responder- (PR; n=4) und ResponderPatientinnen (SD; n=7) im Verlauf der 16-wöchigen TrastuzumabTherapie in pg/ml.
Initial sinkt der IL-12-Spiegel der Non-Responder-Patientinnen (PR) bis zur 4.
Trastuzumab-Infusion ab, im Gegensatz zu den Responder-Patientinnen (SD) bei denen ein
Anstieg zu beobachten ist. Im weiteren Verlauf der Trastuzumab-Therapie zeigen die
Responder-Patientinnen (SD), im Vergleich zu den Non-Responder-Patientinnen (PR),
eine relevante aber nicht signifikant höhere IL-12 Konzentration. Denn der IL-12-Spiegel
der Non-Responder-Gruppe steigt ebenfalls im weiteren Verlauf der Therapie wieder an.
51
3.2.2. Ergebnissdifferenzen der Patientengruppen mit und ohne
kardiotoxische Nebenwirkungen hinsichtlich der Sofortreaktion und
Langzeitreaktion (Gesamtverlauf)
3.2.2.1. TNF-α
90,00
90,00
80,00
80,00
70,00
70,00
60,00
60,00
TNF-a in pg/ml
TNF-a in pg/ml
Sofortreaktion
50,00
40,00
30,00
**
*
50,00
40,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Wert vor 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 40: TNF-α Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen
ohne kardiotoxische Nebenwirkungen (n=13)
(**p<0,009).
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 41: TNF-α Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen mit
kardiotoxischen
Nebenwirkungen
(n=5)
(*p<0,043).
60,00
60,00
50,00
50,00
40,00
40,00
TNF-a in pg/ml
TNF-a in pg/ml
Langzeitreaktion
30,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 42: TNF-α Konzentrationsdifferenz
im Gesamtverlauf (1. und 16. TrastuzumabInfusion) bei Patientinnen ohne kardiotoxische
Nebenwirkungen (n=13) in pg/ml.
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 43: TNF-α Konzentrationsdifferenz
im Gesamtverlauf (1. und 16 TrastuzumabInfusion) bei Patientinnen mit kardiotoxischen
Nebenwirkungen (n=5) in pg/ml.
52
Im Rahmen der Sofortreaktion zeigt die Patientengruppe mit kardiotoxischen
Nebenwirkungen (n=5) einen signifikanten (p=0,043) medianen Anstieg des TNF-aKonzentration um 32,83 pg/ml (8,16 ± 21,02 pg/ml vs. 40,99 ± 25,92 pg/ml). Die kardial
gesunde Patientengruppe (n=13) zeigt ebenfalls einen hochsignifkanten (p=0,009) jedoch
geringeren medianen Anstieg um 10,53 pg/ml (14,66 ± 8,27 pg/ml vs. 25,19 ± 38,95
pg/ml).
Hinsichtlich der Langzeitreaktion zeigt die Gruppe mit kardiotoxischen Symptomen einen
nicht signifikanten Abfall der TNF-α-Konzentration um 5,91 pg/ml (8,16 ± 21,02 pg/ml vs.
2,25 ± 8,34 pg/ml) im Verlauf der sechszehnwöchigen Trastuzumab-Therapie. Die kardial
gesunde Patientengruppe zeigt ebenfalls einen nicht signifkanten Abfall um 6,35 pg/ml
(14,66 ± 8,27 pg/ml vs. 8,31 ± 7,07 pg/ml).
53
3.2.2.2. Interferon gamma
0,70
0,70
0,60
0,60
0,50
0,50
IFN-y in IU/ml
IFN-y in IU/ml
Sofortreaktion
0,40
0,30
0,40
0,30
0,20
0,20
0,10
0,10
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.vneg
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 44: INF-γ Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion bei Patientinnen (n=13) ohne
kardiotoxische Nebenwirkungen in IU/ml.
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 45: INF-γ Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion
bei
Patientinnen
mit
kardiotoxischen Nebenwirkungen (n=5) in IU/ml.
0,70
0,70
0,60
0,60
0,50
0,50
IFN-y in IU/ml
IFN-y in IU/ml
Langzeitreaktion
0,40
0,30
0,40
0,30
0,20
0,20
0,10
0,10
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 46: INF-γ Konzentrationsdifferenz im
Gesamtverlauf (1. und 16. Trastuzumab-Infusion)
bei
Patientinnen
ohne
kardiotoxische
Nebenwirkungen (n=13) in IU/ml.
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 47: INF-γ Konzentrationsdifferenz im
Gesamtverlauf (1. und 16. Trastuzumab-Infusion)
bei
Patientinnen
mit
kardiotoxischen
Nebenwirkungen (n=5) in IU/ml.
54
Die Patientengruppe mit kardiotoxischen Nebenwirkungen (n=5) verfügt im Vergleich zu
der Gruppe ohne kardiale Symptomatik (n=13) über eine deutliche, jedoch nicht signifikant
niedrigere, mediane IFN-γ-Konzentration (0,17 ± 0,14 IU/ml vs. 0,32 ± 0,166 IU/ml).
Im Verlauf der ersten intravenösen Trastuzumab-Gabe erfolgt bei der Patientengruppe mit
kardiotoxischen Symptomen (Abb.45) eine nicht signifikante Steigerung der medianen
IFN-γ-Konzentration um 0,03 IU/ml (0,17 ± 0,14 IU/ml vs. 0,20 ± 0,11 IU/ml).
Die kardial gesunden Patienten (Abb.44) hingegen zeigten einen nicht signifikanten
medianen Abfall um 0,04 IU/ml (0,32 ± 0,16 IU/ml vs. 0,28 ± 0,19 IU/ml).
Im Verlauf des gesamten Therapiezeitraumes (Abb.47) tritt bei der Patientengruppe mit
kardiotoxischen Symptomen ein nicht signifikanter (p=0,333), medianer Abfall um 0,07
IU/ml (0,17 ± 0,14 IU/ml vs. 0,10 ± 0,35 IU/ml) ein. Ebenso ist ein nicht signifikanter
Abfall um 0,06 IU/ml im Median bei der Gruppe ohne kardiotoxische Symptome (Abb.46)
zu verzeichnen (0,32 ± 0,16 IU/ml vs. 0,26 ± 0,19 IU/ml.
Die Vergleiche der beiden Gruppen untereinander ergeben keine signifikanten
Ergebnisdifferenzen.
55
3.2.2.3.Interleukin 10
80,00
80,00
70,00
70,00
60,00
60,00
Interleukin 10 pg/ml
Interleukin 10 in pg/ml
Sofortreaktion
50,00
40,00
**
30,00
50,00
40,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 48: IL-10 Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion bei Patientinnen (n=13) ohne
kardiotoxische
Nebenwirkungen
in
pg/ml.
(**p<0,01).
Abbildung 49: IL-10 Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion bei Patientinnen mit
kardiotoxischen Nebenwirkungen (n=5) in pg/ml.
30,00
30,00
25,00
25,00
20,00
20,00
Interleukin 10 in pg/ml
Interleukin 10 in pg/ml
Langzeitreaktion
15,00
10,00
5,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 50: IL-10-Konzentrationsdifferenz im
Gesamtverlauf (1. und 16. Trastuzumab-Infusion)
bei
Patientinnen
ohne
kardiotoxische
Nebenwirkungen (n=13) in pg/ml.
Wert vor 1. Inf.
Wert vor 16. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 51: IL-10-Konzentrationsdifferenz im
Gesamtverlauf (1. und 16. Trastuzumab-Infusion)
bei den Patientinnen mit kardiotoxischen
Nebenwirkungen (n=5) in pg/ml.
56
Der Vergleich der IL-10-Blutkonzentrationen zeigt keine eindeutigen, signifikanten
Differenzen zwischen der Patientengruppe mit und ohne kardiotoxische Symptome.
Bei der Gruppe ohne kardiale Nebenwirkungen (n=13; Abb.48) ist ein signifikanter
(p=0,009) Anstieg der Il-10-Konzentration nach der ersten Trastuzumab-Gabe, um 10,68
pg/ml (4,60 ± 8,43 pg/ml vs. 15,28 ± 53,57 pg/ml), messbar.
Die Initialreaktion der Patientengruppe mit kardiotoxischen Symptomen (Abb.49) ist durch
einen nicht signifikanten Anstieg um 5,0 pg/ml gekennzeichnet (4,50 ± 12,53 pg/ml vs.
9,50 ± 11,06 pg/ml).
Bezüglich der Langzeitreaktion zeigt die
Patientengruppe
ohne
kardiotoxische
Nebenwirkungen (Abb.50) einen nicht signifikanten medianen Anstieg um 1,92 pg/ml
(4,60 ± 8,43 pg/ml vs. 6,52 ± 6,12 pg/ml). Die Gruppe mit kardiotoxischen
Nebenwirkungen (Abb.51) zeigt einen nicht signifikanten medianen Anstieg um 3,84
pg/ml (4,50 ± 12,53 pg/ml vs. 8,34 ± 5,14 pg/ml).
Der Vergleich der beiden Patientengruppen untereinander ergibt keine signifikanten
Ergebnisdifferenzen.
57
3.2.3. Konzentrationsunterschiede der Patientengruppen mit und ohne
anaphylaktoide Initialreaktionen
3.2.3.1. TNF-α
140,00
140,00
120,00
120,00
100,00
100,00
TNF-a in pg/ml
TNF-a in pg/ml
Sofortreaktion
80,00
60,00
80,00
60,00
40,00
40,00
20,00
20,00
*
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 52: TNF-α Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen
ohne initiale anaphylaktoide Infusionsreaktionen
(n=10).
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 53: TNF-α Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen mit
initialen
anaphylaktoiden
Infusionsreaktionen
(n=8); (*p<0,012).
Die Patientengruppe mit anaphylaktoiden Reaktionen (n=8) nach der ersten TrastuzumabInfusion zeigt einen signifikanten (p=0,012) medianen TNF-α-Anstieg um 39,13 pg/ml
(6,99 ± 8,64 pg/ml vs. 46,12 ± 43,23 pg/ml). Im Gegensatz hierzu ist bei den
asymptomatischen Patientinnen (n=10) ein nicht signifikanter medianer Anstieg um 7,26
pg/ml (15,40 ± 15,27pg/ml vs. 22,66 ± 26,09 pg/ml) zu verzeichnen.
Der Vergleich der beiden Patientengruppen untereinander zeigt keine signifikanten
Ergebnisdifferenzen.
58
3.2.3.2. Interleukin 10
80,00
80,00
70,00
70,00
60,00
60,00
Interleukin 10 in pg/ml
Interleukin 10 in pg/ml
Sofortreaktion
50,00
40,00
30,00
50,00
40,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
0,00
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 54: IL-10 Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen
ohne initiale anaphylaktoide Infusionsreaktionen
(n=9).
*
Wert vor 1. Inf.
Wert nach 1. Inf.
Infusionszeitpunkte
Abbildung 55: IL-10 Antwort auf die 1.
Trastuzumab-Infusion in pg/ml bei Patientinnen mit
initialen
anaphylaktoiden
Infusionsreaktionen
(n=8). (*p<0,05).
Parallel zur TNF-α-Konzentration steigt die IL-10-Konzentration bei den Patientinnen mit
anaphylaktoiden Nebenwirkungen (n=8) im Rahmen der ersten intravenösen TrastuzumabApplikation signifikant ( p=0,043) an, um 13,44 pg/ml (2,09 ± 3,51 pg/ml vs. 15,53 ±
67,23 pg/ml). Bei der Patientengruppe ohne Nebenwirkungen (n=9) ist indes eine nicht
signifikante mediane Steigerung um 3,44 pg/ml (10,12 ± 11,12 pg/ml vs. 13,56 ± 18,13
pg/ml) messbar.
Der Vergleich der beiden Patientengruppen untereinander zeigt keine signifikanten
Ergebnsidifferenzen.
Somit ist bei den Patientinnen mit anaphylaktoiden Initialreaktionen ein um ein Vielfaches
höherer IL-10-Anstieg zu verzeichnen.
59
3.3.
Ergebniszusammenfassung
I.a
Alle zellulären Parameter (NK-Zellen, B-Lymphozyten, T-Helferzellen, TSuppressorzellen), sowie TNF-α und Interleukin 10 zeigen insbesondere nach der
ersten Trastuzumab-Gabe hochsignifikante Infusionsreaktionen.
I.b
Im Gesamtverlauf steigt die Zahl der Interleukin 12 positiven Serumproben von 6
auf 11 Patientinnen. Darüber hinaus lassen sich
keine
weiteren
signifikanten
Konzentrationsunterschiede nachweisen.
Die mediane IFN-γ-Konzentration aller Patientinnen ist vor der Trastuzumab-Gabe
am höchsten, im Verlauf der sechszehnwöchigen Tratsuzumab-Therapie fällt sie
jedoch ab.
II.a
Die Non-Responder-Patientengruppe zeigt im Verlauf der Trastuzumab-Therapie
niedrigere NK-Zellzahlen, höhere T-Suppressorzellzahlen und höhere IFN-γ-Blutkonzentrationen im Vergleich zu den Responder-Patientinnen.
Der IL-12-Serumspiegel fällt innerhalb der ersten Wochen bei den Non-ResonderPatientinnen ab, wohingegen er bei den Responder-Patientinnen ansteigt.
II.b
Die Patientengruppe mit kardiotoxischen Symptomen zeigt im Anschluß an die
erste Trastuzumab-Infusion einen stärkeren Anstieg der TNF-α-Konzentration als
die Gruppe ohne kardiale Nebenwirkungen.
Außerdem ist bei dieser Patientengruppe initial vor der ersten Trastuzumab-Gabe
eine niedrigere IFN-γ Konzentration, als bei der Gruppe ohne kardiotoxische
Symptomatik messbar. Im Verlauf der ersten Infusion steigt die IFN-γKonzentration jedoch bei den Patientinnen mit kardiotoxischen Symptomen
an. Bei den Patientinnen ohne kardiotoxische Nebenwirkungen fällt der IFN-γSpiegel ab.
II.c
Die Patientengruppe mit initialen anaphylaktoiden Reaktionen zeigt im Verlauf der
ersten intravenösen Trastuzumab-Gabe einen signifikant stärkeren Anstieg der
TNF-α-Konzentration, als die Patientinnen ohne anaphylaktoide Reaktionen.
Ebenso ist ein signifikant stärkerer Anstieg der IL-10 Konzentration der
Patientinnen mit initialen anaphylaktoiden Reaktionen messbar.
60
4.
Diskussion
4.1.
Einfluss einer Trastuzumab-Therapie auf das humorale und
zelluläre Immunsystem
Ziel
dieser
Untersuchung
ist
die
Evaluation
der
Immunzell-
und
Zytokinkonzentrationsverläufe unter einer Trastuzumab-Therapie, um zunächst allgemeine
Reaktionen des Immunsystems im Verlauf einer therapeutischen Antikörpertherapie
aufzuzeigen. Erwähnenswert hierbei ist, dass bisher nur wenige Publikationen bezüglich
dieser Fragestellung existieren.
Bei allen zellulären Parametern, sowie TNF-α und Interleukin 10 wird insbesondere als
Antwort auf die erste intravenöse Trastuzumab-Gabe, eine signifikante initiale
Infusionsreaktion hervorgerufen. Diese stellt während des Gesamtverlaufes, d.h. innerhalb
des sechszehnwöchigen Therapiezeitraumes, die größte Infusionsreaktion dar.
Dagegen zeigen die Infusionsreaktionen der humoralen Parameter Interleukin 2, 4, 12 und
IFN-γ keine signifikanten initiale Infusionsreaktionen. So läßt sich beispielweise beim
Interleukin 2 Verlauf erst ab dem dritten, bzw. vierten Infusionszeitpunkt eine eindeutig
messbare, signifikante Infusionsreaktion nachweisen. Der IFN-γ-Verlaufes zeigt ebenso
erst nach der vierten Trastuzumab-Gabe eine eindeutige Reaktion.
Zusammenfassend lässt sich somit festhalten, dass die erste Trastuzumab-Infusion
grundsätzlich zu einer signifikanten Beeinflussung des zellulären und teilweise humoralen
Immunsystems führt. Hierbei zeigen insbesondere die zellulären Bestandteile BLymphozyten, T-Helferlymphozyten, T-Suppressorzellen, natürliche Killerzellen sowie die
humoralen Komponenten TNF-α und IL-10 eindeutig signifikante Reaktionen.
Hinsichtlich
der
sechzehnwöchigen
Einflussnahme
der
Trastuzumab-Therapie
Untersuchungszeitraum
wurden
die
auf
den
Differenzen
gesamten
aus
den
Konzentrationen vor der ersten und der letzten, sechzehnten Trastuzumab-Infusion
ermittelt. Bei jedem Parameter, mit Ausnahme der B-Lymphozyten, ist nur eine sehr
geringe Konzentrationsdifferenz zu verzeichnen. Die Differenzen der zellulären Parameter
umfassen wenige Prozent ihres Ausgangswertes. So erfolgt z.B. bei den T-Helferzellen
eine signifikante prozentuale Reduktion um 2,4 Prozent, sowie ein nicht signifikanter
Abfall der natürlichen Killerzellen um 0,4 Prozent.
61
Bezüglich der humoralen Parameter weisen TNF-α, Interleukin 2, 10 und IFN-γ eine
eindeutige, jedoch nicht signifikante Konzentrationsdifferenz im sechzehnwöchigen
Gesamtverlauf auf. Hervorzuheben sind IFN-γ- und IL-12-Konzentrationen. Denn im
Vergleich zu den Beobachtungen anderer Studien (Portielje et al., 2003), in denen ohne
bakterielle Stimulation bei gesunden Probanden die IFN-γ-Konzentrationen unter der
Nachweisgrenze lagen, sind in dieser Untersuchung bei 83% der Patientinnen IFN-γKonzentrationen messbar (Peiper et al., 1997). Die höchste mediane IFN-γ-Konzentration
ist vor der ersten Trastuzumab-Infusion nachweisbar. Hieraus ergibt sich der Verdacht, das
HER2-positive Brustkrebspatientinnen möglicherweise über eine erhöhte IFN-γKonzentration verfügen. Diese These wird durch die Beobachtung von Goedegebuure et al.
unterstützt, die eine durch das HER2/neu Peptid p654-662 gesteigerte Synthese von IFN-γ
festgestellt haben. Dieses Peptid wurde als tumorassoziiertes Antigen in verschiedenen
humanen Tumoren entdeckt (Goedegebuure et al., 1997). Im Gegensatz hierzu wiesen
Caras et al. bei Brustkrebspatientinnen indes eine verminderte IFN-γ-Synthese der mit
einem Antigen stimulierten T-Lymphoyzten nach (Caras et al., 2004). Der nicht
signifikante Rückgang des IFN-γ-Gehaltes über den gesamten Studienzeitraumes um 13
Prozent könnte durch eine Internalisierung des HER2-Rezeptors und potentielle
Blockierung des Peptids p654-662 infolge der Antigen-Antikörperbildung im Rahmen der
Trastuzumab-Therapie begründet werden (Goedegebuure et al., 1997).
Parihar et al. geben an, dass Interleukin 12 in Verbindung mit Antikörper-markierten
Tumorzellen verstärkt sezerniert wird. Demnach liegt die Vermutung nahe, dass die mit
Trastuzumab behandelten Patientinnen über erhöhte IL-12-Blutkonzentrationen verfügen
könnten (Parihar et al., 2002). In der Tat zeigen die hier vorliegenden Ergebnisse, einen
Anstieg der Anzahl der Patientinnen, bei denen IL-12 im Serum nachgewiesen werden
konnte, von sechs vor der ersten auf elf vor der sechzehnten Trastuzumab-Gabe. Demnach
könnte die Trastuzumab-Therapie bei den hier untersuchten Patientinnen zu einer starken
Induktion der IL-12 Sekretion geführt haben.
Zusammenfassend konnten in dieser Untersuchung somit keine signifikanten Differenzen
der Zell- und Zytokinblutkonzentrationen im Gesamtverlauf der festgestellt werden.
Um die zeitlichen Zusammenhänge zwischen den untersuchten Parametern genauer
beurteilen zu können, müssten serielle Bestimmungen der Parameter wöchentlich vor und
nach den Trastuzumab-Infusionen erfolgen.
62
4.2.
Evaluation des zellulären und humoralen Immunsystems unter
Berücksichtigung klinischer Charakteristika
Liljefors et al. postulieren, dass die Aktivität der NK-Zellen positiv mit der Überlebenszeit
von Tumorpatienten korreliert. Sie wiesen bei fortgeschrittenen Tumoren eine erniedrigte
Aktivität der natürlichen Killerzellen nach (Liljefors et al., 2003). Unter der Annahme,
dass
eine
erhöhte
Aktivität
der
natürlichen
Killerzellen
mit
einer
erhöhten
Zellkonzentration korreliert, zeigt sich in Übereinstimmung mit der oben genannten
Beobachtung in dieser Arbeit eine höhere, jedoch nicht signifikante Konzentration der
natürlichen Killerzellen bei den Responder-Patientinnen (Abb.36) (Liljefors et al., 2003).
Demnach könnten Patientinnen mit einem Ansprechen auf die Trastuzumab-Therapie über
höhere Konzentrationen der natürlichen Killerzellen verfügen. Niwa et al. beobachteten im
Rahmen einer Rituximab®-Studie und Arnould et al. unter einer Trastuzumab-Therapie
eine positive Korrelation zwischen der Konzentration natürlicher Killerzellen und der
Intensität der ADCC (Arnould et al., 2006, Niwa et al., 2004). Hingegen wiesen Repka et
al. eine gesteigerte Tumorzellabtötung mittels Trastuzumab-induzierter ADCC über NKZellen nach. Sie stellten jedoch fest, daß die NK-Zellexpansion nicht mit dem klinischen
Ausgang korreliert (Repka et al., 2003). Caras et al. beobachteten generell eine
verminderte Anzahl der natürlichen Killerzellen bei Brustkrebspatientinnen (Caras et al.,
2004). Da unklar bleibt, inwieweit die Anzahl der NK-Zellen mit ihrer zytotoxischen
Aktivität korreliert, sollte die Aktivität der NK-Zellen zukünftig anhand ihrer spezifischen
Zytokinsekretion bestimmt werden. Hierdurch könnte das Ausmaß, der durch eine
Trastuzumab-Infusion induzierten ADCC, eindeutiger definiert werden. Des Weiteren
könnte eine Identifizierung der tumorinfiltrierenden Lymphozyten Aufschluß über das
Ausmaß der zytotoxischen Aktivität und der Art der dafür verantwortlichen Zellen geben
(Liljefors et al., 2003, Parihar et al., 2002).
Meyer zum Büschenfelde et al. stellten fest, dass die durch Internalisierung und
Degeneration des HER2-Rezeptor entstehenden Proteinspaltprodukte zu einer gesteigerten
MHC Klasse-I Antigenpräsentation führen, welche im Sinne einer Opsonierung zu einer
gesteigerten Rekrutierung von T-Suppressorzellen führt. Darüber hinaus kamen sie zu dem
Ergebnis, dass durch diesen Prozess die zytotoxischen Eigenschaften der TSuppressorzellen aktiviert werden, die ebenso wie die NK-Zellfunktionen zu einer
Tumorzelleliminierung beitragen können (zum Buschenfelde et al., 2002). Diese Theorie
gibt Anlass zur Vermutung, dass Responder-Patientinnen über erhöhte CD8-positiven T63
Zellkonzentrationen verfügen könnten, im Gegensatz zu den Non-Responder-Patientinnen.
Diese Annahme kann anlässlich der in dieser Arbeit ermittelten Ergebnissen jedoch nicht
verifiziert werden. Die Non-Responder-Patientinnen weisen, im Gegensatz zu denen im
progressfreien Intervall, eine nicht signifikant höhere mediane Konzentration der TSuppressorzellen auf (Abb.37).
Interferon-γ wird unter anderem von den natürlichen Killerzellen synthetisiert. Es besitzt
im Vergleich zu den anderen Interferonen die größte immunmodulatorische und stärkste
antiproliferative Wirkung aller Zytokine. Vermutlich kann IFN-γ durch die Steigerung der
MHC Klasse-I und –II-Antigenexpression auf den Tumorzellen die Empfindlichkeit für
eine NK-Zellen-vermittelte Zytotoxizität steigern. Flieger et al. wiesen in diesem
Zusammenhang eine IFN-γ induzierte ADCC Steigerung nach (Flieger et al., 1999). Diese
Feststellung lässt erwarten, dass Responder-Patientinnen, im Vergleich zu den NonResponder-Patientinnen, über höhere IFN-γ-Konzentrationen verfügen könnten. Martin et
al. wiesen entgegen dieser Vorstellung eine verminderte IL-2, TNF-α und IFN-γBlutkonzentrationen bei Patienten mit einem Lungentumor nach. Ferner beobachteten sie
einen Zusammenhang zwischen einer niedrigen IFN-γ-Konzentration und einer niedrigeren
Lymphozytenanzahl sowie einer schlechten Prognose (Martin et al., 1999). Ebenso
beobachteten Caras et al. eine verringerte IFN–γ-Synthese bei Brust- und LungentumorPatienten (Caras et al., 2004). Diese Beobachtungen stehen jedoch im Gegensatz zu den in
dieser Studie erhobenen Ergebnissen. Die Patientinnen mit einem progressiven
Krankheitsverlauf (Non-Responder-Patientinnen) zeigen im Verlauf des Therapiezeitraumes einen Anstieg der IFN-γ-Konzentration, im Gegensatz zu den ResponderPatientinnen (Abb.38). Hieraus ergibt sich die Vermutung, dass die IFN-γ-Konzentration
von Patientinnen mit progressiver Brustkrebserkrankung unter einer Trastuzumab-Therapie
initial ansteigt. Der hier beobachtete IFN-γ-Konzentrationsanstieg könnte möglicherweise
durch die persistierende Präsentation des Peptids p654-662 begründet sein, welches eine
progrediente IFN-γ-Synthese initiieren könnte (Goedegebuure et al., 1997).
Die Interleukin 2 Konzentrationen sind nicht beurteilbar, da bei den ersten acht
Patientinnen die Serumkonzentrationen nachweisbar unter der Nachweisgrenze lagen und
somit eine zu geringe Probenanzahl vorlag. Vermutlich war das Zytokin während des
Lagerung teilweise zerfallen.
64
Lissoni et al. geben an, dass die Einjahresüberlebensrate bei Patienten mit erhöhten
Interleukin 12 Ausgangswerten signifikant höher ist, als bei Patientinnen mit normalen
Interleukin 12 Konzentrationen (Lissoni et al., 1997). Interleukin 12 könnte demnach eine
prognostische Bedeutung haben, da es möglicherweise positiv mit einer längeren
Überlebenszeit korreliert. Diesbezüglich wiesen Flieger et al. eine gesteigerte ADCC durch
IL-12 nach (Flieger et al., 1999). Infolgedessen besteht die Vermutung, dass bei
Responder-Patientinnen höhere Interleukin 12 Konzentrationen vorliegen, als bei NonResponder-Patientinnen.
Patientinnen
im
Konzentrationen,
Dieser
Vergleich
an
vier
zu
von
Annahme
den
entsprechend
zeigen
Non-Responder-Patientinnen
sieben
Messzeitpunkten
die
Responder-
höhere
(Abb.39).
IL-12-
Unter
der
Berücksichtigung der medianen IL-12-Konzentrationen vor den jeweiligen Trastuzumabgaben zeigt der Vergleich dieser beiden Gruppen speziell in den ersten vier Wochen einen
konträren Verlauf. Als Ausgangswert vor der Therapie zeigen die Responder-Patientinnen
im Vergleich zu den Non-Responder- Patientinnen, eine niedrigere IL-12-Konzentration.
In der Anfangsphase erfolgt dann ein Anstieg der IL-12-Konzentration der ResponderPatientinnen, im Vergleich zu den Non-Responder, bei denen ein Abfall beobachtet
werden kann. Im weiteren Verlauf erfolgt jedoch ein Anstieg der IL-12-Konzentration
beider Patientengruppen, wobei die Konzentration der Responder-Patientinnen immer
höher als die, der Non-Responder-Patientinnen liegt. Zusammengefaßt ließe sich hieraus
die Schlußfolgerung ziehen, dass der initiale (in den ersten 4 Wochen) IL-12
Konzentrationsverlauf als positiv prädiktiver Wert für das Ansprechen des Tumorgewebes
auf die Trastuzumab-Therapie herangezogen werden könnte. Diesbezüglich wiesen Tsuboi
et al. einen höheren IL-12-Blutspiegel bei Patienten mit einem Ösophagustumor nach. Sie
vermuten, dass infolge einer Tumorprogression die Immunantwort zu einer Steigerung der
Interleukin 12 Konzentration führt und demzufolge die Patientinnen mit einer hohen IL12-Konzentration eine kürzere mittlere Überlebenszeit besitzen (Tsuboi et al., 2004). Diese
Aussage stimmt jedoch nicht mit dem oben genannten Ergebnis der vorliegenden
Untersuchung überein.
Zusammengefaßt müsste in weiteren Studien der Stellenwert des IL-12 und IFN-γ als
positiver bzw. negativer prädiktiver Wert überprüft werden. Ein generelles Problem - hier,
wie auch bei allen anderen Auswertungen – ist die geringe Probenanzahl. Die individuellen
Streuungen der Parameter überlagern möglicherweise einen Trastuzumab-induzierten
Trend, der bei einer ausreichenden Patientenzahl erkannt werden könnte.
65
Insgesamt traten bei acht von 18 Patientinnen kardiale Dysfunktionen auf, die bis auf eine
Ausnahme durch eine konventionelle Behandlung reversibel waren. Eine Reihe von
Literaturstellen geben Anlass zu der Vermutung, dass die erhöhte Inzidenz kardiotoxischer
Nebenwirkungen durch eine Störung des Zell- bzw. Zytokin-Regelkreislaufes ausgelöst
werden könnte. Entsprechend der hier ermittelten Ergebnisse kann diese Theorie jedoch
nicht belegt werden. So unterscheiden sich die Konzentrationen der Immunzellen der
Patientinnen mit kardiotoxischen Dysfunktionen nicht von denen der kardial gesunden
Patientinnen.
Entgegen den anderer Autoren, die die Funktion von TNF-α als prädiktiver Wert für eine
kardiotoxische Morbidität bzw. eine positive Korrelation mit der Entwicklung
hochgradiger Herzinsuffizienzen postulieren (Deswal et al., 2001, Gerber et al., 2001,
Harries et al., 2002, Keefe et al., 2002, Kubota et al., 2000, Merlin et al., 2002, Ozcelik et
al., 2002, Petit et al., 1997) zeigt die Patientengruppe mit kardiotoxischen
Nebenwirkungen, im Vergleich zu der kardial gesunden Gruppe nicht signifikant
niedrigere, mediane TNF-α-Konzentrationen. Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten
kardiotoxischer Nebenwirkungen und einer erhöhten TNF-α-Konzentration kann anhand
der in dieser Untersuchung erhobenen klinischen Angaben demnach nicht bestätigt werden
(Abb.40,41,42,43). Insgesamt sechs der 18 Patientinnen weisen leichte kardiale
Vorschädigungen
(z.B.
arterielle
Hypertonie,
leichtgradige
Einschränkung
der
linksventrikulären Ejektionsfraktion) auf. Diese kardial vorerkrankten Patientinnen zeigen,
im Vergleich zu den kardial gesunden Patientinnen vor der ersten Trastuzumab-Therapie
keine erhöhten TNF-α-Ausgangswerte. Dieses Ergebnis wird durch die Beobachtung von
Kubota et al. unterstützt, die betonen, dass Patienten mit einer beginnenden
Herzinsuffizienz im Vergleich zu Gesunden über gleich bis gering erhöhte TNF-αKonzentrationen verfügen, wohingegen in fortgeschrittenen Herzinsuffizienzstadien
deutlich erhöhte TNF-α-Konzentrationen nachweisbar wären (Kubota et al., 2000).
Drei dieser insgesamt sechs Patientinnen mit kardialen Symptomen erleiden eine stärkere
progrediente Herzschädigung. Indes sind auch bei diesen Patientinnen, wider Erwarten
keine außergewöhnlich hohen TNF-α Konzentrationen messbar.
Zusammenfassend kann hinsichtlich des Vergleiches der TNF-α Spiegel der Patientinnen
mit und ohne kardiale Funktionseinschränkungen festgehalten werden, dass entgegen der
Auffassung der Literatur, in dieser Arbeit keine Korrelation zwischen einer
kardiotoxischen Nebenwirkung und der Höhe der TNF-α-Konzentrationen festgestellt
66
werden konnte. Somit kann TNF-α als Kofaktor für die Entwicklung kardiotoxischer
Symptome im Rahmen einer Trastuzumab-Therapie nach den Ergebnissen dieser Studie
ausgeschlossen werden. Eine stärkergradige kardiale Beeinträchtigung, Herzinsuffizienz
Stadium NYHA III/IV trat lediglich bei einer Patientin auf, bei der gemäß der Literatur
deutlich erhöhte TNF-α-Konzentrationen nachgewiesen werden konnten. Demzufolge
kann vermutet werden, dass die hier beobachteten kardiotoxischen Phänomene zu keiner
ausreichend starken kardialen Beeinflussung mit entsprechendem TNF-α Anstieg geführt
haben. Bei der Beurteilung dieser Ergebnisse sollte des Weiteren berücksichtigt werden,
dass die meisten kardiotoxischen Symptome mit einer herkömmlichen konservativen
Therapie reversibel waren. Weiterhin bleibt zu klären, inwieweit ein TNF-αKonzentrationsanstieg durch eine medikamentöse Therapie beeinflusst werden kann
(Schneider et al., 2001, Schneider et al., 2002).
Die IFN-γ-Konzentration der Patientinnen ohne kardiotoxische Nebenwirkungen zeigt
einen nicht signifikanten, indes eindeutig höheren medianen Wert der Patientinnen über
den gesamten Studienzeitraum, im Vergleich zu den Patientinnen mit kardialen
Symptomen (Abb.44,45,46,47). Gegebenenfalls könnte der IFN-γ-Blutspiegel hier als
prädiktiver Wert für die Entstehung einer kardialen Funktionsstörung herangezogen
werden. Diesbezüglich gibt es jedoch in der derzeitigen Literatur keine Angaben über den
Stellenwert des Interferon-γ bei Herzerkrankungen.
Yamaoka et al. [34] stellten fest, dass bei Patienten mit einer Herzinsuffizienz höhere
Interleukin 10 Spiegel als bei Gesunden nachweisbar sind (Yamaoka et al., 1999).
Entgegen
dieser
Darstellung
kann
bei
den
Patientinnen
mit
kardiotoxischen
Nebenwirkungen, unter dem Median der gesamten Untersuchungsgruppe liegende
Interleukin 10 Spiegel gemessen werden. Sie zeigen im Gegensatz zu den kardial gesunden
Patientinnen keine höhere mediane IL-10-Konzentration (Abb.48,49,50,51). Lediglich bei
einer Patientin, die im Verlauf der Therapie an den Folgen ihrer kardialen
Funktionsstörung verstarb, ist unmittelbar vor dem Tod parallel zu den TNF-α
Veränderungen eine stark erhöhte Interleukin 10 Konzentration messbar.
Da keine signifikanten IL-10-Konzentrationsdifferenzen zwischen den Patientinnen mit
und ohne kardiotoxische Nebenwirkungen nachgewiesen werden konnten, könnte vermutet
werden, dass eine Trastuzumab-Therapie die Expression von Interleukin 10 unterdrückt.
Andererseits könnten ebenso wie bei TNF-α, die kardiotoxischen Einflüsse zu gering sein,
67
um eine gesteigerte IL-10-Expression zu initiieren. Die Wirkung einer medikamentösen
Behandlung der kardialen Nebenwirkungen sollte ebenfalls berücksichtigt werden, die sich
u.U. hemmend auf eine Interleukin 10 Sekretion auswirken könnte. Letztendlich kann nach
den Ergebnsissen dieser Untersuchung vermutete werden, dass die unter einer TrastuzmabTherapie verstärkt auftretenden kardiotoxischen Nebenwirkungen wahrscheinlich nicht
durch immunologische Effekte bzw. Reaktionen ausgelöst werden.
Wie
bereits
in
der
Einleitung
beschrieben,
ist
TNF-α
ein
wichtiger
entzündungsvermittelnder Mediator, der für eine Vielzahl von Symptomen verantwortlich
ist. So werden die klassischen Entzündungszeichen wie Rötung, Schwellung, Schmerz und
Temperatur durch TNF-α ausgelöst. Anlässlich dieser Funktionen ist eine positive
Korrelation zwischen dem Auftreten von unspezifischen Nebenwirkungen, z.B. Fieber und
Schüttelfrost und der Höhe der TNF-α- Konzentration nach der ersten intravenösen
Trastuzumab-Gabe zu erwarten (Campone et al., 2004, Dillman et al., 1999).
In Übereinstimmung mit dieser Aussage ist bei 75 Prozent der Patientinnen mit
anaphylaktoiden Symptomen nach der initialen Trastuzumab-Infusion eine prozentuale
Steigerung des TNF-α-Spiegels nachweisbar (Abb.52,53). Im Gegensatz hierzu sind bei
den Patientinnen ohne initiale Reaktionen vor den sich anschließenden TrastuzumabInfusionen (2.-16.) höhere mediane TNF-α-Konzentrationen nachweisbar. Abschließend
lässt sich somit festhalten, dass der TNF-α-Anstieg im Verlauf der ersten Trastuzumabgabe
(1.Inf.v, 1.Inf.n) positiv mit den gleichzeitig auftretenden klinischen anaphylaktoiden
Symptomen korreliert.
Die Patientinnen ohne initiale anaphylaktoide Nebenwirkungen zeigen, entgegen den
Erwartungen, nach der ersten Trastuzumab-Gabe niedrigere IL-10 Konzentrationen
(Abb.54,55) im Vergleich zu den Patientinnen mit Initialreaktionen. Denn IL-10 gilt
generell als antiinflammatorisches Zytokin, welches somit eher zu einer Hemmung
entzündlicher und anaphylaktoider Reaktionen führen müßte (Crone et al., 2002, Gemsa et
al., 1997, Ibelgaufts et al., 1992, Nicola et al., 1994, Oppenheim et al., 1993). Eine
interessante Beobachtung hierbei ist die signifikante positive Korrelation der TNF-α und
Interleukin 10 Blutkonzentrationen, da IL-10 unter physiologischen Bedingungen die
Synthese der proinflammatorischen Zytokine, wie z.B. TNF-α, IFN-γ, IL-2 und IL-12
hemmt. Eine Erklärung hierfür wäre z.B., daß TNF-α zu einer kompensatorischen
Steigerung der IL-10-Blutkonzentration geführt hat, um einer noch stärkeren Reaktion
entgegenzuwirken, im Sinne einer negativen feed-back-Reaktion.
68
4.3.
Schlussfolgerungen
1. Um genauere Angaben über den Einfluss der ADCC auf die Tumorzelleliminierung
treffen zu können, müssten weitere gezielte Untersuchungen unternommen werden. So
wäre es vielleicht von Nutzen, das Tumorgewebe histologisch aufzuarbeiten und so
eine Differenzierung der sich im Gewebe befindlichen Immunzellen durchzuführen.
Demzufolge stellt sich die Frage, inwieweit die durch die natürlichen Killerzellen
und/oder zytotoxischen T-Zellen induzierte Zytotoxizität das klinische Outcome von
Tumorpatienten beeinflusst?
2. Des
Weiteren
sollte
bei
zukünftigen
Untersuchungen
die
Stoffklasse
der
unterschiedlichen Chemotherapeutika berücksichtigt werden, da diese im Einzelnen
selbst unterschiedliche Einflüsse auf das Immunsystem nehmen, die in dieser Arbeit
nicht berücksichtigt werden konnten.
3. Da aus einigen wenigen Literaturangeben hervorgeht, dass eine IFN-γ-Konzentration
ohne antigene oder mitogene Stimulation nicht nachweisbar sei, stellt sich die Frage:
Verfügen Patientinnen mit einem HER2-amplifizierten Brusttumor über einen im
Vergleich zu Gesunden erhöhten IFN-γ-Serumspiegel?
4. Bei der Betrachtung der Grafiken ist zu beachten, dass die Abstände auf der Abszisse
nicht den eigentlichen Zeitverlauf wiedergeben, da die gleichen Abstände für die
Zeiträume Stunden und Wochen ausgewählt wurden. Die einzelnen Werteverteilungen
zeigen insbesondere bei den Zytokinkonzentrationen eine über den Median erhöhte
Standardabweichung. Dies kann einerseits durch die überhöhten Lagerungszeiten und
dem daraus resultierendem Proteinzerfall der Serumproben, sowie durch die geringe
Anzahl an Patientinnen, bzw. Blutproben bedingt sein.
5. In acht von 18 Fällen konnte keine Interleukin 2 Konzentration gemessen werden.
Hierbei ist zu beachten, dass die positiven Blutproben zu einem früheren Zeitpunkt als
die negativen Blutproben getestet wurden. Diesbezüglich sollte eine mögliche
Zersetzung von Zytokinen in den eingefrorenen Serumproben, während der Lagerung
bei –80°C berücksichtigt werden. Infolgedessen ist die Probenanzahl der IL-2Messungen
deutlich
reduziert
worden.
Die
geringe
Probenanzahl
könnte
69
demzufolge die Überprüfung der Zusammenhänge zwischen dem Interleukin 2Gehalt und dem Auftreten von klinischen Merkmalen beeinträchtigen.
70
5.
Zusammenfassung
Problem: Im Vordergrund dieser Arbeit steht der Einluß einer anti-HER2-RezeptorTherapie mit Trastuzumab auf das humorale und zelluläre Immunsystem bei HER2/neupositiven Patientinnen mit einem Mammakarzinom. Die untersuchten Fragestellungen
beziehen sich erstens auf die allgemeine Reaktion der einzelnen hier untersuchten
Immunparameter (NK-Zellen, T-Helferzellen, T-Suppressorzellen, B-Lymphozyten, Il2,4,10,12, TNF-α und IFN-γ) auf die Infusion des HER2-Rezeptor-Antagonisten
Trastuzumab, eines weitestgehend humanisierten Proteins. Zweitens wurden die
ermittelten Immunzell- und Zytokinkonzentrationen auf signifikante Konzentrationsunterschiede zwischen den folgenden Patientengruppen untersucht: Non-Responder und
Responder-Patientinnen, Patientinnen mit und ohne kardiotoxische Nebenwirkungen,
sowie Patientinnen mit und ohne initiale Nebenwirkungen. Ziel hierbei war einerseits
potentiell eine prädiktive Aussage, bezüglich des Ansprechens des Tumorgewebes auf eine
Trastuzumab-Therapie, anhand eines oder mehrerer Immunparameter treffen zu können.
Andererseits eine mögliche Immunzell- oder Zytokindysregulation als Ursache für die
vermehrt auftretenden kardiotoxischen Nebenwirkungen nachzuweisen. Ferner sollte
überprüft werden, ob die häufig nach der ersten Infusion auftretenden anaphylaktoiden
Reaktionen, auf Veränderungen der Immunzell- und Zytokinreaktionen zurückzuführen
sind.
Methode: Von insgesamt 18 Mammakarzinom Patientinnen mit HER2-positiven Tumoren
wurden über einen sechszehnwöchigen Therapiezeitraum (Trastuzumab wöchentlich)
jeweils vor der 1., 3., 4., 7., 10., 13., 16., sowie nach der 1. Trastuzumab-Infusion
Blutproben entnommen. Aus diesen wurden durchflußzytometrisch die Konzentrationen
der T-Helferzellen, B-Lymphozyten, T-Suppressorzellen und natürlichen Killerzellen
ermittelt. Zusätzlich wurden mittels ELISA die Konzentrationen der Interleukine 2, 4, 10
und 12, Tumor-Nekrosefaktor-alpha und Interferon-γ gemessen.
Ergebnis: Alle zellulären Parameter, sowie TNF-α und Interleukin 10 zeigen insbesondere
nach
der
ersten
Trastuzumab-Gabe
hochsignifikante
Infusionsreaktionen.
Im
sechszehnwöchigen Therapieverlauf tritt ein nennenswerter Anstieg der medianen
Interleukin 12-Konzentration auf, der sich in der Steigerung der Anzahl positiver Proben
bzw. Patientinnen von 6 auf 11 begründet, und nicht in einem Anstieg der IL-12Konzentration
der
einzelnen
Proben.
Alle
weiteren
Parameter
zeigen
keine
erwähnenswerte Veränderung im 16-wöchigen Gesamtverlauf.
Die Non-Responder-Patientengruppe zeigt im Verlauf dieser Untersuchung, im Vergleich
zu den Responder-Patientinnen, eine nicht signifikant niedrigere NK-Zell- und IL-1271
Konzentration, sowie eine nicht signifikant höhere T-Suppressorzellen und IFN-γSerumkonzentrationen.
Weiterhin zeigt der TNF-α Spiegel der Patientengruppe mit kardialen Symptomen eine
nicht signifikant niedrigere mediane Blutkonzentration, als die Gruppe ohne kardiale
Nebenwirkungen.
Bei der Patientengruppe mit initialen anaphylaktoiden Infusionsreaktionen im Verlauf der
ersten Trastuzumab-Infusion wurde eine nicht signifikant höhere TNF-α-Konzentration, im
Vergleich zu den Patientinnen ohne initiale, anaphylaktoide Reaktionen, nachgewiesen.
Diskussion: Zusammengefaßt führt nur die erste Trastuzumab-Infusion zu einer
signifikanten Beeinflussung der Konzentration aller zellulären Parameter und den
Zytokinen TNF-α und IL-10. Hinsichtlich der Gesamtverläufe bestehen keine weiteren
signifikanten Differenzen der Zell- und Zytokinblutkonzentrationen. Erwähnenswert ist die
Beobachtung, daß bei allen Patientinnen ein meßbarer IFN-γ-Spiegel nachgewiesen
werden
konnte,
da
die
IFN-γ-Konzentrationen
bei
gesunden
Probanden,
laut
Literaturangaben, häufig unter der Nachweisgrenze lagen. In gleicher Weise beobachteten
Goedegebure et al. bei Tumorpatientinnen eine erhöhte IFN-γ-Konzentrationen, im
Vergleich zu gesunden Patientinnen. Weiterhin konnte in dieser Arbeit eine Induktion der
IL-12-Synthese beobachtet werden. Dieses Ergebnis stimmt mit der Beobachtung von
Parihar et al. überein, die einen Anstieg der IL-12-Konzentrationen unter einer
Trastuzumab-Therapie nachwiesen.
Die Responder-Patientinnen zeigen entsprechend den Literaturangaben eine höhere NKZell- und IL-12-Konzentration, insbesondere zu Beginn der Trastuzumab-Therapie.
Weiterhin zeigt sich bei den Non-Responder-Patientinnen in den ersten Wochen der
Therapie ein nicht signifikanter aber relevanter Anstieg der IFN-γ, entgegen den
Beobachtungen anderer Autoren. Ursächlich hierfür könnte das Protein p654-662 sein, ein
Bestandteil des HER2-Rezeptors der die IFN-γ-Synthese stimuliert. Zusammengefaßt
könnten demnach eine prognostische Bedeutung von IL-12 und IFN-γ als positive bzw.
negative Prädiktoren für die Vorhersage des Ansprechens auf eine Trastuzumab-Therapie
vermutet werden.
Entgegen der Auffassung einiger anderer Autoren, die insbesondere die Zytokine TNF-α
und IL-10 als auslösende Faktoren einer Herzschädigung ansehen, zeigt die
Patientengruppe mit kardiotoxischen Nebenwirkungen in dieser Untersuchung eine im
Vergleich zu den kardial gesunden Patientinnen niedrigere TNF-α und IL-10Konzentration. Darüberhinaus konnte eine nicht signifikante aber deutlich höherer IFN-γKonzentration der Patientinnen ohne kardiotoxische Nebenwirkungen nachgewiesen
72
werden. IFN-γ hat in der Literatur bislang jedoch keinen Stellenwert, im Bezug auf eine
Störung der Herzfunktion. Ein protektiver Effekt von IFN-γ auf die Kardiomyozyten
könnte somit vermutet werden. Zusammengefaßt können, nach den Ergebnissen dieser
Untersuchung, die verstärkt auftretenden kardiotoxischen Effekte unter einer TrastuzumabTherapie demnach eher nicht auf eine Störung des Immunzell- und Zytokinregelkreislaufes
zurückgeführt werden.
Entsprechend
den
Literaturangaben
korrelieren
die
intialen
anaphylaktoiden
Infusionsreaktionen mit einem signifikanten Anstieg der TNF-α Konzentration im Verlauf
der ersten Trastuzumab-Infusion. Weiterhin ist indes entgegen der Auffassung anderer
Autoren ebenfalls ein Anstieg der IL-10 Konzentration zu verzeichnen, welches jedoch als
inhibierendes inflammatorisches Zytokin, somit eher bei der Patientengruppe ohne initiale
Infusionsreaktionen zu erwarten wäre. Wider Erwarten ist eine positive Korrelation des
TNF-α- und IL-10-Konzentrationsverlaufes unter einer intravenösen TrastuzumabTherapie zu beobachten.
73
6.
Literaturverzeichnis
Albanell J., Baselga J. (1999). Trastuzumab, a humanized anti-HER2 monoclonal
antibody, for the treatment of breast cancer. Drugs Today (Barc) 35, 931-946.
Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado B., Gascon P. (2003). Mechanism of
action of anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and
2C4. Adv Exp Med Biol 532, 253-268.
Arnould L., Gelly M., Penault-Llorca F., Benoit L., Bonnetain F., Migeon C.,
Cabaret V., Fermeaux V., Bertheau P., Garnier J., Jeannin J.F., Coudert B. (2006).
Trastuzumab-based treatment of HER2-positive breast cancer: an antibodydependent cellular cytotoxicity mechanism? Br J Cancer 94, 259-267.
Arteaga C.L., Moulder S.L., Yakes F.M. (2002). HER (erbB) tyrosine kinase
inhibitors in the treatment of breast cancer. Semin Oncol 29, 4-10.
Bartlett J., Mallon E., Cooke T. (2003). The clinical evaluation of HER-2 status:
which test to use? J Pathol 199, 411-417.
Baselga J., Mendelsohn J. (1994). Receptor blockade with monoclonal antibodies
as anti-cancer therapy. Pharmacol Ther 64, 127-154.
Baselga J., Norton L., Albanell J., Kim Y.M., Mendelsohn J. (1998). Recombinant
humanized anti-HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of
paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer
xenografts. Cancer Res 58, 2825-2831.
Baselga J., Albanell J., Molina M.A., Arribas J. (2001). Mechanism of action of
trastuzumab and scientific update. Semin Oncol 28, 4-11.
Bell R. (2002). What can we learn from Herceptin trials in metastatic breast
cancer? Oncology 63 Suppl 1, 39-46.
Brand F.X., Ravanel N., Gauchez A.S., Pasquier D., Payan R., Fagret D., Mousseau
M. (2006). Prospect for anti-her2 receptor therapy in breast cancer. Anticancer Res
26, 715-722.
Campone M., Bourbouloux E., Fumoleau P. (2004). [Cardiac dysfunction induced
by trastuzumab]. Bull Cancer 91 Suppl 3, 166-173.
Caras I., Grigorescu A., Stavaru C., Radu D.L., Mogos I., Szegli G., Salageanu A.
(2004). Evidence for immune defects in breast and lung cancer patients. Cancer
Immunol Immunother 53, 1146-1152.
Carson W.E., Parihar R., Lindemann M.J., Personeni N., Dierksheide J., Meropol
N.J., Baselga J., Caligiuri M.A. (2001). Interleukin-2 enhances the natural killer
74
cell response to Herceptin-coated Her2/neu-positive breast cancer cells. Eur J
Immunol 31, 3016-3025.
Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B., Henner D., Wong W.L.,
Rowland A.M., Kotts C., Carver M.E., Shepard H.M. (1992). Humanization of an
anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 89,
4285-4289.
Chien K.R. (2000). Myocyte survival pathways and cardiomyopathy: implications
for trastuzumab cardiotoxicity. Semin Oncol 27, 9-14; discussion 92-100.
Crone S.A., Zhao Y.Y., Fan L., Gu Y., Minamisawa S., Liu Y., Peterson K.L.,
Chen J., Kahn R., Condorelli G., Ross J., Jr., Chien K.R., Lee K.F. (2002). ErbB2
is essential in the prevention of dilated cardiomyopathy. Nat Med 8, 459-465.
Cruse J.M. (1995). Illustrated Dictionary of Immunology. CRC Press, Boca Raton,
pp 170-171.
De Santes K., Slamon D., Anderson S.K., Shepard M., Fendly B., Maneval D.,
Press O. (1992). Radiolabeled antibody targeting of the HER-2/neu oncoprotein.
Cancer Res 52, 1916-1923.
De Vita F., Orditura M., Auriemma A., Infusino S., Catalano G. (1998). Serum
concentrations of proinflammatory cytokines in advanced non small cell lung
cancer patients. J Exp Clin Cancer Res 17, 413-417.
De Vita F., Orditura M., Galizia G., Romano C., Lieto E., Iodice P., Tuccillo C.,
Catalano G. (2000). Serum interleukin-10 is an independent prognostic factor in
advanced solid tumors. Oncol Rep 7, 357-361.
Deswal A., Petersen N.J., Feldman A.M., Young J.B., White B.G., Mann D.L.
(2001). Cytokines and cytokine receptors in advanced heart failure: an analysis of
the cytokine database from the Vesnarinone trial (VEST). Circulation 103, 20552059.
Di Leo A., Dowsett M., Horten B., Penault-Llorca F. (2002). Current status of
HER2 testing. Oncology 63 Suppl 1, 25-32.
Dillman R.O. (1999). Infusion reactions associated with the therapeutic use of
monoclonal antibodies in the treatment of malignancy. Cancer Metastasis Rev 18,
465-471.
Ewer M.S., Vooletich M.T., Durand J.B., Woods M.L., Davis J.R., Valero V.,
Lenihan D.J. (2005). Reversibility of trastuzumab-related cardiotoxicity: new
insights based on clinical course and response to medical treatment. J Clin Oncol
23, 7820-7826.
75
Flieger D., Spengler U., Beier I., Kleinschmidt R., Hoff A., Varvenne M.,
Sauerbruch T., Schmidt-Wolf I. (1999). Enhancement of antibody dependent
cellular cytotoxicity (ADCC) by combination of cytokines. Hybridoma 18, 63-68.
Flieger D., Spengler U., Beier I., Sauerbruch T., Schmidt-Wolf I. (2000).
Combinations of the cytokines IL-12, IL-2 and IFN-alpha significantly augment
whereas the cytokine IL-4 suppresses the cytokine-induced antibody-dependent
cellular cytotoxicity of monoclonal antibodies 17-1A and BR55-2. Cytokine 12,
756-761.
Freund (1994). Cytokines in Hemopoiesis, Oncology, and Immunology III.
Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp 57-62.
Gemsa D. (1997). Immunologie. Grundlagen-Klinik-Praxis. Thieme Verlag,
Stuttgard, pp 13;36-44;50-60.
Gerber B., Krause A., Markmann S., Reimer T., Fietkau R., Muller H. (2001).
Effectiveness of Trastuzumab (Herceptin) in a patient with locally recurrent breast
cancer after cardiac failure caused by severe cytotoxic pretreatment. Oncology 61,
271-274.
Goedegebuure P.S., Douville C.C., Doherty J.M., Linehan D.C., Lee K.Y.,
Ganguly E.K., Eberlein T.J. (1997). Simultaneous production of T helper-1-like
cytokines and cytolytic activity by tumor-specific T cells in ovarian and breast
cancer. Cell Immunol 175, 150-156.
Harries M., Smith I. (2002). The development and clinical use of trastuzumab
(Herceptin). Endocr Relat Cancer 9, 75-85.
Haunstetter A., Izumo S. (1998). Apoptosis: basic mechanisms and implications for
cardiovascular disease. Circ Res 82, 1111-1129.
Hayes D.F., Thor A.D. (2002). c-erbB-2 in breast cancer: development of a
clinically useful marker. Semin Oncol 29, 231-245.
Hortobagyi G.N. (2001). Overview of treatment results with trastuzumab
(Herceptin) in metastatic breast cancer. Semin Oncol 28, 43-47.
Hortobagyi G.N. (2005). Trastuzumab in the treatment of breast cancer. N Engl J
Med 353, 1734-1736.
Hung M.C., Lau Y.K. (1999). Basic science of HER-2/neu: a review. Semin Oncol
26, 51-59.
Ibelgaufts H. (1992). Lexikon Zytokine. Medikon Verlag, München.
Janeway C. (1997). Immunologie. Spektrum Akademischer Verlag.
76
Keefe D.L. (2001). Anthracycline-induced cardiomyopathy. Semin Oncol 28, 2-7.
Keefe D.L. (2002). Trastuzumab-associated cardiotoxicity. Cancer 95, 1592-1600.
Klein P.M., Dybdal N. (2003). Trastuzumab and cardiac dysfunction: update on
preclinical studies. Semin Oncol 30, 49-53.
Kono K., Takahashi A., Ichihara F., Sugai H., Fujii H., Matsumoto Y. (2002).
Impaired antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by herceptin in patients
with gastric cancer. Cancer Res 62, 5813-5817.
Kubota T., Miyagishima M., Alvarez R.J., Kormos R., Rosenblum W.D., Demetris
A.J., Semigran M.J., Dec G.W., Holubkov R., McTiernan C.F., Mann D.L.,
Feldman A.M., McNamara D.M. (2000). Expression of proinflammatory cytokines
in the failing human heart: comparison of recent-onset and end-stage congestive
heart failure. J Heart Lung Transplant 19, 819-824.
Lee S., Yang W., Lan K.H., Sellappan S., Klos K., Hortobagyi G., Hung M.C., Yu
D. (2002). Enhanced sensitization to taxol-induced apoptosis by herceptin
pretreatment in ErbB2-overexpressing breast cancer cells. Cancer Res 62, 57035710.
Liljefors M., Nilsson B., Hjelm Skog A.L., Ragnhammar P., Mellstedt H., Frodin
J.E. (2003). Natural killer (NK) cell function is a strong prognostic factor in
colorectal carcinoma patients treated with the monoclonal antibody 17-1A. Int J
Cancer 105, 717-723.
Lissoni P., Rovelli F., Giani L., Fumagalli L., Meregalli S., Comi G., Merlini D.
(1996). Correlation between IL-12 and IL-2 blood levels in the metastatic
neoplastic disease: a possible inhibitory feedback system regulating their secretion.
J Biol Regul Homeost Agents 10, 92-94.
Lissoni P., Rovelli F., Fumagalli L., Mauri E., Barni S., Tancini G. (1997).
Increased blood concentrations of interleukin-12 are associated with a longer
survival in untreatable metastatic solid tumor patients: preliminary observations. Int
J Biol Markers 12, 125-127.
Lissoni P., Rovelli F., Pittalis S., Casati M., Perego M.S., Grassi M.G., Brivio F.,
Fumagalli L. (1997). Interleukin-12 in early or advanced cancer patients. Eur J
Cancer 33, 1703-1705.
Lohrisch C., Piccart M. (2001). An overview of HER2. Semin Oncol 28, 3-11.
Martin F., Santolaria F., Batista N., Milena A., Gonzalez-Reimers E., Brito M.J.,
Oramas J. (1999). Cytokine levels (IL-6 and IFN-gamma), acute phase response
and nutritional status as prognostic factors in lung cancer. Cytokine 11, 80-86.
Menard S., Pupa S.M., Campiglio M., Tagliabue E. (2003). Biologic and
therapeutic role of HER2 in cancer. Oncogene 22, 6570-6578.
77
Merlin J.L., Barberi-Heyob M., Bachmann N. (2002). In vitro comparative
evaluation of trastuzumab (Herceptin) combined with paclitaxel (Taxol) or
docetaxel (Taxotere) in HER2-expressing human breast cancer cell lines. Ann
Oncol 13, 1743-1748.
Mimura K., Kono K., Hanawa M., Kanzaki M., Nakao A., Ooi A., Fujii H. (2005).
Trastuzumab-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity against esophageal
squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 11, 4898-4904.
Miossec P. (1993). Clinical Applications of Cytokines:Role in Pathogenesis,
Diagnosis and Therapy, New York, pp 172-175.
Murray D.R., Freeman G.L. (2003). Proinflammatory cytokines: predictors of a
failing heart? Circulation 107, 1460-1462.
Nicola N.A. (1994). Guidebook to Cytokines and Their Receptors. Oxford Univ.
Press., Oxford, pp 27-29;44-46;83-91;103-104;118-119.
Niwa R., Hatanaka S., Shoji-Hosaka E., Sakurada M., Kobayashi Y., Uehara A.,
Yokoi H., Nakamura K., Shitara K. (2004). Enhancement of the antibodydependent cellular cytotoxicity of low-fucose IgG1 Is independent of
FcgammaRIIIa functional polymorphism. Clin Cancer Res 10, 6248-6255.
Niwa R., Sakurada M., Kobayashi Y., Uehara A., Matsushima K., Ueda R.,
Nakamura K., Shitara K. (2005). Enhanced natural killer cell binding and activation
by low-fucose IgG1 antibody results in potent antibody-dependent cellular
cytotoxicity induction at lower antigen density. Clin Cancer Res 11, 2327-2336.
Oppenheim J., Fujiwara H. (1996). The role of cytokines in cancer. Cytokine
Growth Factor Rev 7, 279-288.
Oppenheim J.J. (1993). Clinical Applications of cytokines:Role in Pathogenesis,
Diagnosis and Therapie. Oxford Univ. Press, New York, pp 3-13.
Ozcelik C., Erdmann B., Pilz B., Wettschureck N., Britsch S., Hubner N., Chien
K.R., Birchmeier C., Garratt A.N. (2002). Conditional mutation of the ErbB2
(HER2) receptor in cardiomyocytes leads to dilated cardiomyopathy. Proc Natl
Acad Sci U S A 99, 8880-8885.
Parihar R., Dierksheide J., Hu Y., Carson W.E. (2002). IL-12 enhances the natural
killer cell cytokine response to Ab-coated tumor cells. J Clin Invest 110, 983-992.
Parihar R., Nadella P., Lewis A., Jensen R., De Hoff C., Dierksheide J.E.,
VanBuskirk A.M., Magro C.M., Young D.C., Shapiro C.L., Carson W.E., 3rd
(2004). A phase I study of interleukin 12 with trastuzumab in patients with human
epidermal growth factor receptor-2-overexpressing malignancies: analysis of
sustained interferon gamma production in a subset of patients. Clin Cancer Res 10,
5027-5037.
78
Peiper M., Goedegebuure P.S., Linehan D.C., Ganguly E., Douville C.C., Eberlein
T.J. (1997). The HER2/neu-derived peptide p654-662 is a tumor-associated antigen
in human pancreatic cancer recognized by cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol
27, 1115-1123.
Petit A.M., Rak J., Hung M.C., Rockwell P., Goldstein N., Fendly B., Kerbel R.S.
(1997). Neutralizing antibodies against epidermal growth factor and ErbB-2/neu
receptor tyrosine kinases down-regulate vascular endothelial growth factor
production by tumor cells in vitro and in vivo: angiogenic implications for signal
transduction therapy of solid tumors. Am J Pathol 151, 1523-1530.
Piccart-Gebhart M.J., Procter M., Leyland-Jones B., Goldhirsch A., Untch M.,
Smith I., Gianni L., Baselga J., Bell R., Jackisch C., Cameron D., Dowsett M.,
Barrios C.H., Steger G., Huang C.S., Andersson M., Inbar M., Lichinitser M., Lang
I., Nitz U., Iwata H., Thomssen C., Lohrisch C., Suter T.M., Ruschoff J., Suto T.,
Greatorex V., Ward C., Straehle C., McFadden E., Dolci M.S., Gelber R.D. (2005).
Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl
J Med 353, 1659-1672.
Portielje J.E., Lamers C.H., Kruit W.H., Sparreboom A., Bolhuis R.L., Stoter G.,
Huber C., Gratama J.W. (2003). Repeated administrations of interleukin (IL)-12 are
associated with persistently elevated plasma levels of IL-10 and declining IFNgamma, tumor necrosis factor-alpha, IL-6, and IL-8 responses. Clin Cancer Res 9,
76-83.
Repka T., Chiorean E.G., Gay J., Herwig K.E., Kohl V.K., Yee D., Miller J.S.
(2003). Trastuzumab and interleukin-2 in HER2-positive metastatic breast cancer: a
pilot study. Clin Cancer Res 9, 2440-2446.
Rohrbach S., Yan X., Weinberg E.O., Hasan F., Bartunek J., Marchionni M.A.,
Lorell B.H. (1999). Neuregulin in cardiac hypertrophy in rats with aortic stenosis.
Differential expression of erbB2 and erbB4 receptors. Circulation 100, 407-412.
Rovelli F., Lissoni P., Crispino S., Barni S., Fumagalli G., Paolorossi F., Tancini G.
(1988). Increased level of soluble interleukin-2 receptor in advanced solid tumors: a
preliminary study. Tumori 74, 633-637.
Rueckert S., Ruehl I., Kahlert S., Konecny G., Untch M. (2005). A monoclonal
antibody as an effective therapeutic agent in breast cancer: trastuzumab. Expert
Opin Biol Ther 5, 853-866.
Sawaki M., Ito Y., Tada K., Mizunuma N., Takahashi S., Horikoshi N., Kasumi F.,
Akiyama F., Sakamoto G., Imai T., Nakao A., Hatake K. (2004). Efficacy and
safety of trastuzumab as a single agent in heavily pretreated patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer. Tumori 90, 40-43.
Sawyer D.B., Zuppinger C., Miller T.A., Eppenberger H.M., Suter T.M. (2002).
Modulation of anthracycline-induced myofibrillar disarray in rat ventricular
myocytes by neuregulin-1beta and anti-erbB2: potential mechanism for
trastuzumab-induced cardiotoxicity. Circulation 105, 1551-1554.
79
Schaller G., Evers K., Papadopoulos S., Ebert A., Buhler H. (2001). Current use of
HER2 tests. Ann Oncol 12 Suppl 1, S97-100.
Schneider J.W., Chang A.Y., Rocco T.P. (2001). Cardiotoxicity in signal
transduction therapeutics: erbB2 antibodies and the heart. Semin Oncol 28, 18-26.
Schneider J.W., Chang A.Y., Garratt A. (2002). Trastuzumab cardiotoxicity:
Speculations regarding pathophysiology and targets for further study. Semin Oncol
29, 22-28.
Slamon D.J., deKernion J.B., Verma I.M., Cline M.J. (1984). Expression of cellular
oncogenes in human malignancies. Science 224, 256-262.
Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L.
(1987). Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification
of the HER-2/neu oncogene. Science 235, 177-182.
Slichenmyer W.J., Fry D.W. (2001). Anticancer therapy targeting the erbB family
of receptor tyrosine kinases. Semin Oncol 28, 67-79.
Slifka M.K., Whitton J.L. (2000). Clinical implications of dysregulated cytokine
production. J Mol Med 78, 74-80.
Sliwkowski M.X., Lofgren J.A., Lewis G.D., Hotaling T.E., Fendly B.M., Fox J.A.
(1999). Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab
(Herceptin). Semin Oncol 26, 60-70.
Smith I.E. (2001). Efficacy and safety of Herceptin in women with metastatic
breast cancer: results from pivotal clinical studies. Anticancer Drugs 12 Suppl 4,
S3-10.
Sparano J.A. (2001). Cardiac toxicity of trastuzumab (Herceptin): implications for
the design of adjuvant trials. Semin Oncol 28, 20-27.
Suter T.M., Cook-Bruns N., Barton C. (2004). Cardiotoxicity associated with
trastuzumab (Herceptin) therapy in the treatment of metastatic breast cancer. Breast
13, 173-183.
Tsuboi K., Miyazaki T., Nakajima M., Fukai Y., Masuda N., Manda R., Fukuchi
M., Kato H., Kuwano H. (2004). Serum interleukin-12 and interleukin-18 levels as
a tumor marker in patients with esophageal carcinoma. Cancer Lett 205, 207-214.
Vasan R.S., Sullivan L.M., Roubenoff R., Dinarello C.A., Harris T., Benjamin E.J.,
Sawyer D.B., Levy D., Wilson P.W., D'Agostino R.B. (2003). Inflammatory
markers and risk of heart failure in elderly subjects without prior myocardial
infarction: the Framingham Heart Study. Circulation 107, 1486-1491.
80
Yamaoka M., Yamaguchi S., Okuyama M., Tomoike H. (1999). Anti-inflammatory
cytokine profile in human heart failure: behavior of interleukin-10 in association
with tumor necrosis factor-alpha. Jpn Circ J 63, 951-956.
Zhao Y.Y., Sawyer D.R., Baliga R.R., Opel D.J., Han X., Marchionni M.A., Kelly
R.A. (1998). Neuregulins promote survival and growth of cardiac myocytes.
Persistence of ErbB2 and ErbB4 expression in neonatal and adult ventricular
myocytes. J Biol Chem 273, 10261-10269.
zum Buschenfelde C.M., Hermann C., Schmidt B., Peschel C., Bernhard H. (2002).
Antihuman epidermal growth factor receptor 2 (HER2) monoclonal antibody
trastuzumab enhances cytolytic activity of class I-restricted HER2-specific T
lymphocytes against HER2-overexpressing tumor cells. Cancer Res 62, 2244-2247.
81
7.
Danksagung
Ich möchte Herrn Prof. Dr. med. G. Schaller für die Rahmenbedingungen danken, die diese
Promotionsarbeit ermöglicht haben.
Desweiteren möchte ich mich bei Herrn Dr. rer. nat. Bühler sowie Blanka Duvnjak für die
außerordentliche Unterstützung während der ganzen Arbeitsphase bedanken.
Mein weiterer Dank gilt meiner Mutter und insbesondere meinem Bruder, dem ich für die
wertvolle Unterstützung beim Erstellen der Arbeit danke. Schließlich möchte ich mich bei
meinem Freund für die fast unermüdliche Unterstützung, Motivation und tatkräftigen
Ratschläge bedanken.
82
8.
Lebenslauf
Name:
Tanja Hohmeier
Geboren am:
27. Dezember 1974
Geburtsort:
Witten
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
Deutsch
Anschrift:
Wartburgstraße 1
44892 Bochum
0234/7929018
Eltern:
Ulrich Hohmeier
Eva Hohmeier, geb. Brandstäter
Schulausbildung:
1981 – 1985 Pferdebachgrundschule, Witten
1985 – 1991 Adolf-Reichwein-Realschule, Witten
1991 – 1994 Ruhrgymnasium, Witten
Berufsausbildung:
10/1994 - 08/1997 Ausbildung zur Krankenschwester
im Marienhospital Witten
Hochschulstudium :
10/1996 - 05/2005
Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum
08/1999
Ärztliche Vorprüfung
08/2000
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
03/2004
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
05/2005
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Beruflicher Werdegang: 05/2005 - 01/2006 Assistenzärztin im Evangelischen
Krankenhaus Witten, Abteilung: Innere
Medizin
01/2006 - heute
Assistenzärztin im Prosperhospital
Recklinghausen Abteilung: Medizinische
Klinik II (Kardiologie/Pneumologie)
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