Voll funktionsfähige humane dendritische Zellinie

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Voll funktionsfähige humane
dendritische Zellinie
Dr. Hans Baumeister und Dr. Steffen Goletz
Glycotope GmbH, Berlin
Dendritische Zellen (DC) spielen eine zentrale Rolle im Immunsystem und finden vielfältige
Anwendungen, zum Beispiel als ‚Tool‘ in vielen immunologischen Laboren oder bei der Impfstoffentwicklung. Humane DCs werden meist aus Vorläuferzellen isoliert, welche dann in vitro
zunächst zu unreifen (i-DC), dann zu reifen DC (m-DC) differenziert werden. Diese Prozedur
ist relativ aufwendig, die Zahl der gewonnenen DC ist natürlich begrenzt, und die Qualität der
gewonnenen DCs unterliegt starken Schwankungen. Standardisierte Anwendungen sind mit
derartigen Zellen kaum möglich. Wir präsentieren hier NemodDC – eine humane Zellinie,
die ähnlich wie DC-Vorläuferzellen, aus Blutkonserven zu voll funktionsfähigen i-NMDC und
m-NMDC differenziert werden kann. Bei Differenzierung in Anwesenheit von TGF-β können
auch dendritische Zellen vom Langerhans-Typ (NMLC) erzeugt werden. Es werden Daten zum
Phänotyp und zur Fähigkeit dieser (Antigen-präsentierenden) Zellen gezeigt, native T-Zellen
Antigen-spezifisch zu stimulieren. Darüber hinaus können die dendritischen Produkte von
NemodDC ohne Aktivitätsverluste kryokonserviert werden, so daß mit diesen Zellen erstmals
standardisierte dendritische Zellen für die analytische und therapeutische Anwendung zur
Verfügung stehen.
Key Words: immunologische Assays, T-Zellepitop-Screening, Allergenität, Immunogenität,
Array-Analyse, Cross-Priming von T-Zellen
Dendritische Zellen (DC) werden heute
als zentrale Akteure im Immunsystem
angesehen. Sie entscheiden darüber, welches Antigen erkannt wird und wie die
Immunantwort aussieht 1 (Abb. 1). Die
Vorläufer der dendritischen Zellen zirkulieren im Blutkreislauf, bevor sie durch
Signale einer Entzündung in das Gewebe
einwandern und zu unreifen, dendritischen
Zellen (i-DC) differenzieren. Diese i-DC
Abb. 1: Lebenszyklus von dendritischen Zellen (DC).
T (rot) = T-Helferzellen; T(blau)=Zytotoxische T-Zellen; B=B-Zellen.
Vereinfacht nachgezeichnet nach J. Banchereau et al.1
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fungieren als Antigen-aufnehmende und
-prozessierende Zellen, die alles aus ihrer
Umgebung – von toten Zellen bis Makromolekülen – aufnehmen und prozessieren.
Es werden sowohl pathogene Erreger als
auch körpereigene Stoffe aufgenommen.
Zusätzliche Signale aus der Umgebung der
i-DC lösen die terminale Differenzierung zu
reifen dendritischen Zellen (m-DC) aus. Im
Zuge dieser Reifung erlangen die Zellen die
Fähigkeit, in die Lymphknoten zu wandern,
wo sie auf die Immun-Effektorzellen treffen.
Die Hauptaufgabe der m-DC ist es, durch
Präsentation der prozessierten Antigene
auf der Zelloberfläche die Effektorzellen
Antigen-spezifisch zu stimulieren oder die
Toleranz gegen körpereigene Antigene aufrechtzuerhalten. Abhängig von den äußeren
Signalen, die zu der DC-Reifung geführt
haben, und der Qualität des prozessierten
Antigens erfolgt die Stimulation oder die
Suppression der Immunantwort, oder es
kommt zur Entwicklung einer allergischen
Reaktion2,3.
Aufgrund ihrer herausragenden Bedeutung werden dendritische Zellen oder ihre
Vorläufer vielerorts zu Forschungszwecken
oder therapeutischen Ansätze aufwendig
aus humanen Blutkonserven isoliert und
– meist in vitro – differenziert4. Die Zellzahl
und Qualität der so erhaltenen Zellen variieren abhängig vom jeweiligen Spender
sowie – beim einzelnen Spender – von dessen
Tagesform.
Die Anwendung dieser primären DC-Kulturen reicht von der Grundlagenforschung
über in vitro-Tests zur Immunogenität oder
Allergenität unterschiedlichster Produkte bis
hin zur Entwicklung von, Antiinfektiva oder
Krebs-Immuntherapeutika.
Dendritische Zellen werden etwa benötigt,
um bei der Entwicklung von Impfstoffen in
vitro zu testen, ob die gewünschten T-Zellen
Antigen-spezifisch aktiviert werden können. Nahrungsmittel- und Kosmetikzusätze
sowie Produkte der pharmazeutischen Industrie müssen auf ihr Potential überprüft
werden, allergische Reaktionen auszulösen.
DC-basierte zelluläre Assays spielen dabei
eine wichtige Rolle. Bei der therapeutischen
Anwendung werden die DC in vitro mit dem
gewünschten Antigen beladen, um im Patienten eine Immunreaktion gegen den Tumor
oder die Virus-infizierte Zelle zu induzieren.
Solche und andere Impfstoffe müssen in
klinischen Studien getestet werden, wobei
die immunologische Wirksamkeit durch das
„Immunomonitoring“ überprüft wird, wozu
auch DC notwendig sind.
Vor diesem Hintergrund gab es viele Versuche, eine permanente Zellinie zu erzeugen,
die DC-Eigenschaften besitzt. Bislang gibt
es Zellinien, die aus der Maus gewonnen
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men insbesondere in der Haut vor und sind
wesentlich schwieriger zu isolieren als DC
aus Blutkonserven. Mit der Herstellung
von NMLC aus NemodDC stehen deshalb
erstmals Langerhans-Zellen in größeren
Mengen zur Verfügung, was für die klinische
Anwendung und für Forschungszwecke
sehr nützlich erscheint. Die aus NemodDC
gewonnenen m-NMDC haben die für reife
dendritische Zellen typische Morphologie
(Abb. 4) und sind in allen Belangen voll
funktionsfähig.
Phänotypische Charakterisierung
von NemodDC
Abb. 2: Die humane Zellinie NemodDC hat die Eigenschaft von dendritischen Vorläuferzellen.
Durch Kultivierung der Zellinie (NemodDC oder prec-NMDC) in Anwesenheit von IL-4 und
GM-CSF differenzieren die Zellen zu unreifen, CD11c-positiven, CD83-negativen, dendritischen
Zellen (i-NMDC) und anschließend durch weitere Kultivierung mit TNF-α zu reifen, CD11cund CD83-positiven, dendritischen Zellen (m-NMDC). Der untere Teil der Abbildung stellt
das Ergebnis einer durchflußzytometrischen Analyse der drei Entwicklungsstadien
(prec-NMDC, i-NMDC und m-NMDC) nach Doppelfärbung mit anti CD11c- und anti CD83- Antikörpern dar.
werden konnten – allerdings mit Techniken,
die nicht für den menschlichen Organismus
anwendbar sind5. Deshalb blieb die Herstellung einer humanen dendritischen Zellinie
bisher erfolglos. Mit NemodDC wird diese
Lücke geschlossen. Die Zellinie besitzt die
Eigenschaften von Vorläuferzellen (precNMDC), die sich in Anwesenheit von IL-4
und GM-CSF zu den unreifen dendritischen
Zellen (i-NMDC) und anschließend in Anwesenheit von TNF-α-Konzentrationen zu
m-NMDC differenzieren lassen (Abb. 2).
Unter veränderten Differenzierungs- und
Reifungsbedingungen können zudem die
DC-Subtypen DC1 (IL-12-sekretierend),
DC2 (IL-10-sekretierend) und NMLC (Langerin-exprimierende Langerhans-Zellen)
erzeugt werden. Langerhans-Zellen kom-
Abb. 3: Analyse von Zelloberflächenmarkern, die charakteristisch für die unterschiedlichen Differenzierungsstadien von dendritischen Zellen sind. Die Zellen wurden durchflußzytometrisch analysiert, wobei der prozentuale Anteil der für den jeweiligen CD-Marker positiven Zellen angegeben ist. Es wurden die Zellinie (prec-NMDC, blau), die differenzierten, aber unreifen DC (i-NMDC,
grün) und die daraus gewonnenen reifen DC (m-NMDC, rot) analysiert. Die i-NMDC wurden nach
Differenzierung kryokonserviert und für die Analyse und die Reifung zu m-NMDC aufgetaut.
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Die immunzytologischen Analysen von
Oberflächenmarkern, die typisch für dendritische Zellen sind, ergaben, daß der Phänotyp
der i-NMDC und m-NMDC dem Phänotyp
von dendritischen Zellen entspricht, die aus
Blutkonserven gewonnen wurden (Abb. 3).
Die Vorläufer-Zellinie (prec-NMDC), die
ursprünglich von einem AML-Patienten gewonnen wurde, ist CD11c-, CD34- und CD14positiv und entspricht damit dem Phänotyp
von myeloid-monozytären Stammzellen.
Durch Differenzierung zu i-NMDC und Reifung zu m-NMDC (oder m-NMLC) nimmt
die CD34- und CD14-Expression ab, und die
für dendritische Zellen charakteristischen Proteine erscheinen auf der Zelloberfläche (Abb.
3). So wird die Expression der Antigen-präsentierenden Moleküle (z.B. CD1a und CD1d),
der co-stimulatorischen Moleküle (z.B. CD40,
CD80 und CD86) und von Rezeptoren für
die Erkennung von Pathogenen (z.B. CD209)
stimuliert. Der für die vollständige DC-Reifung wichtige Marker, CD83, ist nicht auf der
Zellinie, kaum auf den i-NMDC, dagegen
auf den m-NMDC vorhanden (Abb. 3). Eine
einzige Abweichung stellt die Expression
der Antigen-präsentierenden MHC I- und
II-Komplexe dar, die während der gesamten
Zelldifferenzierung von der Zellinie bis zu
den m-NMDC in hohem Maße auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden können.
Die molekularbiologische HLA-Typisierung
hat ergeben, daß die Zellen A2, A3, B44, B56,
Cw4, Cw7 (MHCI) und DR10, DR11, DR52,
DQ5, DQ7, DPw3, DPw4 (MHC II) positiv
sind.
Die Expression der für die DC-Migration
wichtigen Chemokin-Rezeptor CCR5, CCR6
CXCR4 und CCR7 wurde molekularbiologisch nach der Differenzierung oder nach der
Reifung nachgewiesen. Für die Pathogen-Erkennung und Reifung der DC ist die Familie
der Toll-like Rezeptoren (TLR) wichtig6, deren
Vorhandensein wir in bezug auf 10 Rezeptoren (TLR1-10) mittels RT-PCR analysiert
haben. NemodDC synthetisiert zumindest
die mRNA für die TLR1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 und
10. Die TLR1, 2 und 4 sind charakteristisch
für die häufigsten dendritischen Zellen vom
myeloiden Typ, wogegen die Expression von
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TLR9 typisch für die wesentlich selteneren
plasmocytoiden DC ist7.
Charakterisierung der
DC-Aktivitäten
Entscheidend für die DC-Eigenschaft einer
Zelle ist die Fähigkeit native T-Zellen, die
noch keine Stimulation erfahren haben, Antigen-spezifisch zu aktivieren. Dies wurde
in zahlreichen T-Zellassays erfolgreich für
die m-NMDC getestet. Das in Abbildung
5 gezeigte Beispiel einer ELISPOT-Analyse
verdeutlicht, daß m-NMDC in der Lage sind,
native CD8+ T-Zellen Antigen-spezifisch zu
stimulieren. In anderen ELISPOT-Analysen
und Proliferationsassays wurde deutlich, daß
neben nativen CD8+-T-Zellen auch „memory“
CD8+- und native sowie „memory“ CD4+T-Zellen und regulatorische NKT-Zellen
(‚natural killer‘-T-Zellen) aktiviert werden
können.
Für die Anwendung von NemodDC als
DC-Quelle ist zudem die Fähigkeit entscheidend, Antigene zu prozessieren und
diese anschließend T-Zellen zu präsentieren. In zahlreichen ELISPOT-Analysen
und Zytotoxizitäts-Assays wurden Peptide
durch m-NMDC effizient präsentiert sowie
Proteine, Zellysate und DNA-Vakzine durch
die i-NMDC prozessiert, um anschließend
von den m-NMDC in Form von Peptiden
erfolgreich T-Zellen präsentiert zu werden.
In diesem Zusammenhang konnte auch
ein effizientes Cross-Priming beobachtet
werden. Auch die Fusion der m-NMDC mit
Tumorzellen ist ein vielversprechender Weg,
Antigene auf m-NMDC zu präsentieren.
Diese Ergebnisse machen deutlich, daß die
bekannten Möglichkeiten von dendritischen
Zellen, Antigene zu präsentieren und
T-Zellen (über MHC I-, MHC II- und CD1Komplexe) zu stimulieren, bei NemodDC
weitgehend zur Verfügung stehen. Am Rande sei erwähnt, daß die stimulierten CD8+T-Zellen in der Lage sind, ihre zytotoxische
Aktivität Antigen-spezifisch an Tumorzellen
zu entfalten, daß sehr erfolgreich T-Zellklone erzeugt werden konnten, und – wichtig
für eine therapeutische Anwendung von
NemodDC– auch bestrahlte m-NMDC in
der Lage sind, auf CCR7-spezifische Chemokine chemotaktisch durch Zellmigration
zu reagieren.
einem sehr schonenden Verfahren aufgetaut,
ist kaum eine Beeinträchtigung der Zellvitalität zu beobachten (80% ± 10% vs. 85% ±
7% für i-NMDC und 50% ± 10% vs. 40% ±
10% für m-NMDC jeweils vor und nach dem
Einfrieren/Auftauen). Eine grundlegende
Veränderung des dendritischen Phänotyps
konnte nicht beobachtet werden (vgl. Abb.
3). Schließlich wurde der kritischste Punkt
überprüft: sind die aufgetauten Zellen noch
in der Lage Antigene zu präsentieren und
T-Zellen zu stimulieren? Zu diesem Zweck
wurde eine ELISPOT-Analyse mit Antigenpräsentierenden m-NMDC durchgeführt,
die entweder aus kryokonservierten i-NMDC
gewonnen oder „frisch“ produziert wurden.
Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Abbildung 5 dargestellt und zeigen, daß keine gravierenden Einbußen in der T-Zellaktivierung
Abb. 4: Morphologie reifer dendritischer Zellen (m-NMDC), die aus der Zellinie NemodDC
durch Differenzierung und Reifung gewonnen
wurden. Zur Herstellung der m-NMDC siehe
Text und Abbildung 2.
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Strathmann
‚Ready-to-use‘ dendritische Zellen
und passende T-Zellen
Um NemodDC zur Verfügung stellen zu
können, haben wir die Möglichkeit getestet,
die differenzierten, unreifen i-NMDC und
die reifen m-NMDC ohne Verlust der dendritischen Eigenschaften einzufrieren und
auf Trockeneis zu verschicken. Werden die
in einem DMSO-haltigen Einfriermedium
eingefrorenen i-NMDC und m-NMDC in
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zu beobachten sind, wenn die i-NMDC
einmal eingefroren und aufgetaut wurden.
Vergleichbare ELISPOT-Analysen ergaben,
daß auch die m-NMDC kryokonserviert werden können, ohne daß die Fähigkeit, T-Zellen
zu stimulieren, größere Einbußen erfahren
hätte. Die mögliche Dauer der Lagerung der
eingefrorenen Zellen hängt von deren Art ab,
wobei die Lagerung im flüssigen Stickstoff
am günstigsten ist und mindestens ein Jahr
ohne größere Veränderungen der Zellen
möglich ist.
Für einige Anwendungen der dendritischen Zellen (siehe unten) werden neben den
DC auch T-Zellen benötigt. In vielen Labors
werden T-Zellen und DCs aus demselben
Spender gewonnen, um einen identischen
HLA-Typ von T-Zellen und DCs zu garantieren. Für NemodDC wurde dieses Problem
gelöst, indem T-Zellen von zahlreichen
HLA-A2+-Spendern in ELISPOT-Analysen
getestet getestet wurden. Aufgrund dieser
Analysen können nun T-Zellen bereitsgestellt
werden, die funktionell gut zu NemodDC
passen. Diese können auch kryokonserviert
als PBMC, isolierte CD8+- oder CD4+-T-Zellen
verschickt werden.
Fazit
NemodDC und die davon abgeleiteten
dendritischen Produkte DC-Tools sind geeignet, humane DC aus Blutkonserven in
DC-basierten in vitro-Assays zu ersetzen.
Bei Verwendung der passenden T-Zellen
kann bei in vitro-T-Zellassays ganz auf Blutkonserven verzichtet werden. Die konstante
Abb. 5: Ergebnis eines repräsentativen TZellassays (ELISPOT-Analyse). Die m-NMDC
wurden durch Differenzierung und Reifung
(s. Abb. 2) aus der Zellinie NemodDC gewonnen, mit einem bekannten HLA-A2-Peptid
aus dem MART-1 Protein beladen und zur
ersten Stimulation (Prime) von isolierten
HLA-A2 + -, CD8 + -T-Zellen verwendet. Die
T-Zellantwort wurde durch Bestimmung der
Zahl der aktivierten (IFN-γ-sekretierenden)
CD8+-T-Zellen quantifiziert. Der Antigen (MART1)-spezifische Anteil dieser T-Zellantwort wird
dadurch deutlich, daß die auf das MART-1
Peptid ‚geprimten‘ T-Zellen (i) mit MART-1
Peptid-präsentierenden Zellen restimuliert
wurden, (ii) mit Zellen, die ein irrelavantes
HLA-A2+- Peptid (aus dem HIVgag-Protein) oder
(iii) kein Peptid präsentierten. Schließlich wird
die Qualität von m-NMDC, die aus aufgetauten
i-NMDC (grün) bzw. „frischen“ i-NMDC (blau)
gewonnen wurden, miteinander verglichen.
Qualität und nahezu unbegrenzte Zellzahl
der aus NemodDC gewonnenen i-NMDC
und m-NMDC ermöglichen erstmals die
notwendige Standardisierung dieser Assays.
Dazu gehören etwa die in vitro-Analysen
zur Wirksamkeit von Impfstoffen und des
Allergie-Potentials von Nahrungsmitteln und
Kosmetikzusätzen sowie von pharmazeutischen Produkten (Abb. 6).
Methoden, die bisher nicht möglich oder
nur unter großen Schwierigkeiten durchführbar waren, weil humane DC nur in
sehr variabler Qualität und Zellzahl zur
Verfügung standen, können jetzt etabliert
werden. Dazu gehören die Entwicklung
von Screening-Techniken (Abb. 6), um
immunmodulierende Eigenschaften einer
Substanzgruppe zu identifizieren oder zu
optimieren, und die Möglichkeit der Identifizierung neuer T-Zellepitope beispielsweise
von Tumormarkern oder die Optimierung
solcher Epitope.
Eine ganz neue Perspektive bietet die Möglichkeit auch Langerhans-Zellen im Labor in
ausreichender Menge und standardisierter
Qualität zur Verfügung herstellen zu können.
Eine klinische Anwendung von NemodDC
erscheint sehr vielversprechend, zumal die
Zellinie Virus-frei ist und inzwischen Serumfrei kultiviert wird.
Literatur
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Korrespondenzadresse
Abb. 6: In vitro-Assays unter Verwendung von dendritischen Zellen (DC). NemodDC erlaubt die
Standardisierung dieser Assays, da Qualitätsschwankungen entfallen, die bei aus Blutkonserven
isolierten DCs zu beobachten sind.
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Dr. Hans Baumeister
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