Immuntherapie mit Dendritischen Zellen - biomed

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wissenschaft & praxis
Immuntherapie mit
­Dendritischen Zellen
Neue Erkenntnisse zur Kryokonservierung von
­Monozyten und Dendritischen Zellen*
Theoretischer Hintergrund und
Zielsetzung
Im Vergleich zur peripheren Blutabnahme mit anschließender immunomagnetischer
Isolation haben Apherese und Elutriation
den Vorteil, dass eine große Menge an Monozyten durch eine einmalige Punktion gewonnen werden kann. Daraus lässt sich eine
große Zahl an DC generieren, die gleich für
eine Serie von mehreren Impfungen verwendet werden kann – Qualitätsunterschiede
zwischen verschiedenen Chargen können so
hintangehalten werden und der/die PatientIn muss nur einmal zur Punktion erscheinen. Die gewonnenen Zellen müssen aber bis zu ihrer weiteren Verwendung kryokonserviert
(d.h. in flüssigem Stickstoff gelagert) werden. Hinsichtlich
der Kryokonservierung gibt es Arbeiten, die zeigen, dass das
Einfrieren von unreifen oder bereits ausgereiften DC keinen
Nachteil im Vergleich zu frisch hergestellten, nicht kryokonservierten DC hat [4,5]. Gerade diesen Punkt hat unsere Arbeitsgruppe immer wieder kritisch hinterfragt. In den letzten
Jahren wurden nämlich am Patienten eine Reihe klinischer
Studien unter Verwendung von differenzierten kryokonservierten DC durchgeführt. Diese Studien hatten im Vergleich
mit den zuvor im Tiermodell erfolgreich durchgeführten
Versuchen nur mäßigen Erfolg. Unsere berechtigte zweite
Fragestellung war nun zu prüfen, ob es wirklich sinnvoll ist,
bereits differenzierte (unreife oder reife) Dendritische Zellen
einzufrieren oder ob es nicht von Vorteil wäre, die Zellen
doch gleich nach ihrer Isolation, d.h. im Monozytenstadium einzufrieren und dann batchweise bei Bedarf zu DC zu
differenzieren.
Die Immuntherapie maligner Erkrankungen mit ex vivo generierten Dendritischen Zellen (DC) hat in den letzten zehn bis 15 Jahren
eine rasante Entwicklung durchlaufen und ist für das Prostatakarzinom in den USA ein bereits zugelassenes therapeutisches Verfahren. Bei der Immuntherapie mit DC macht man
sich die Fähigkeit dieser Zellen zunutze, (Tumor-)Antigene
aufzunehmen, sie zu verarbeiten und in Form von kleineren
Einheiten, sogenannten Epitopen, gemeinsam mit HLA-Molekülen und kostimulatorischen Molekülen (CD40, CD80,
CD86, IL-12 etc.) auf der Zelloberfläche den Effektoren der
adaptiven Immunantwort, den CD4+- und CD8+-T-Zellen,
zu präsentieren [1, 2]. Ein vorteilhafter Nebeneffekt von ex
vivo generierten DC ist, dass hier der Einfluss unerwünschter immunmodulatorischer Stoffe, wie IL-10, IL-6, TGF-ß
oder VEGF, die im Tumor häufig und in signifikanter Konzentration vorhanden sind, umgangen wird.
Dendritische Zellen zur Immuntherapie können direkt aus dem Blut
oder aus CD34+-Vorläuferzellen generiert werden, die Ausbeute ist hier
aber sehr gering. Zumeist werden daher Monozyten verwendet, die durch
In-vitro-Inkubation mit GM-CSF
und IL-4 zu unreifen Dendritischen
Zellen (imDC) differenziert werden
[3]. Durch Behandlung mit TNF-a,
IFN-g und LPS können imDC zu reifen Dendritischen Zellen (mDC) prozessiert werden. Für die Isolierung
der Monozyten gibt es unterschiedliche Methoden. Weit verbreitet ist die
immunomagnetische Isolation, dabei
werden die Monozyten mit Hilfe von
Antikörpern, die gegen das auf Mo- Abb. 1: Überblick über die untersuchten Präparationen von DC und deren Generierung.
nozyten exprimierte Molekül CD14
gerichtet und an mikroskopisch kleine magnetische Teilchen
gekoppelt sind, isoliert. Seit einiger Zeit ist es auch möglich, Methodik
Monozyten durch Apherese und Elutriation zu gewinnen. Es
handelt sich dabei um eine Methode, die in ähnlicher Weise
Monozyten der ProbandInnen wurden sowohl mithilauch bei der Thrombozytenspende eingesetzt wird. Unklar fe von immunomagnetischen Beads als auch per Apherese
war bis dato, ob Monozyten, die immunomagnetisch iso- und Elutriation isoliert und entweder sofort zu reifen DC
liert worden sind, und Monozyten, die durch Apherese und generiert oder im Stadium der Monozyten, unreifer (imDC),
Elutriation gewonnen worden sind, vergleichbare Präpara- halbreifer (smDC) oder reifer Dendritischen Zellen (fmDC)
tionen an Dendritischen Zellen liefern – das ist zugleich die kryokonserviert, um nach deren Wiederauftauen zu reifen
erste Fragestellung dieser wissenschaftlichen Arbeit.
DC differenziert zu werden. Eine Übersicht über die untersuchten Präparationen und deren Benennung ist aus Abb. 1
ersichtlich. Zur Herstellung aller DC-Präparationen wurde
* Zusammenfassung der Publikation „Cryopreservation of Monocyein Protokoll verwendet, das von unserer Forschungsgruppe
tes is Superior to Cryopreservation of Immature or Semi-mature
entwickelt wurde und es erlaubt, DC ohne Zusatz von fetaDendritic Cells for Dendritic Cell-based Immunotherapy“, erschielem Kälberserum zu generieren [6].
nen im Journal of Immunotherapy, 2009 Jul-Aug; 32(6): 638-54.
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Abb. 2, a+b: Ausbeute (Recovery, a) und Viabilität (b) verschiedener
DC-Präparationen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt
3) ist gezeigt.
In der hier vorgestellten Arbeit wurden die diversen Präparationen Dendritischer Zellen hinsichtlich der Parameter der
Zellausbeute, Reinheit und Viabilität, ihrer phänotypischen
Merkmale (Expression von Zelloberflächenmolekülen, Produktion von IL-12p70) und ihrer funktionellen Eigenschaften
(Stimulation von T-Zellen zur Zytokinproduktion und Proliferation, Aktivierung regulatorischer T-Zellen) analysiert.
In unreifem Zustand am Tag 3 zeigten alle DC-Präparationen vergleichbare
Ausbeuten. Nach Ausreifung mit TNF-a,
IFN-g und LPS am Tag 4 betrug die Ausbeute zwischen 22,2 und 28,5 Prozent
(bezogen auf die Anzahl der eingesetzten Monozyten). Eine Ausnahme stellten reife DC, die aus kryokonservierten
smDC generiert wurden, mit 2,6 Prozent
Ausbeute dar (Abb. 2a). Alle Präparationen an unreifen DC zeigten vergleichbare
Werte hinsichtlich der Viabilität (92,6
bis 96,1%). Nach Ausreifung fiel die
Viabilität von DC aus kryokonservierten
imDC und von DC aus kryokonservierten
smDC deutlich ab, während die Werte bei
anderen Präparationen fast unverändert
blieben (Abb. 2b).
Vergleichbare Ergebnisse wurden
bezüglich der Morphologie der untersuchten DC-Entitäten gefunden. Reife
DC aus immunomagnetisch isolierten
Monozyten sowie aus elutrierten nicht
kryokonservierten Monozyten und
elutrierten kryokonservierten Monozyten zeigten eine typischen Morphologie
mit Clusterbildung, während sich das Clustering von reifen
DC aus kryokonservierten imDC und kryokonservierten
smDC nur mäßig präsentierte und eher dem Bild unreifer
DC glich (Abb. 3).
Phänotypische Merkmale und Reinheit der
­Präparationen
In Tab. 1 sind die Ergebnisse der FACS-Analyse der Expression von Zelloberflächenmarkern auf reifen DC ver-
Resultate
Ausbeute, Viabilität und Morphologie
Abb. 3: Morphologie verschiedener DC Präparationen. Reife DC
aus CD14+-isolierten Monozyten (a), reife DC aus elutrierten nicht
kryokonservierten Monozyten (b), reife DC aus elutrierten kryokonservierten Monozyten (c), reife DC aus kryokonservierten imDC (d),
reife DC aus kryokonservierten smDC (e), unreife DC (f).
Tab. 1:
FACS-Analyse verschiedener Präparationen von mDC.
(a) Prozentsatz an positiven Zellen,
(b) Mean Flourescence Intensity (MFI).
Ein repräsentatives ­Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.
a
% positive cells
mDC from
CD40
CD1a
CD14
CD83
CD80
CD86
HLAABC
HLADR
89.2
19.2
4.3
85.8
89.2
90.2
91.5
91.6
84.3
13.4
6.0
87.4
82.6
84.5
92.4
89.2
89.8
41.0
3.0
91.1
89.8
90.7
93.9
92.3
31.2
6.2
5.8
19.7
28.5
40.9
95.6
93.8
49.5
5.4
4.1
24.4
43.9
91.9
96.2
96.2
CD14+ isolated
­monocytes
elutriated fresh
monocytes
elutriated frozen
monocytes
frozen imDC
frozen smDC
b
MFI (mean fluorescence intensity)
mDC from
CD40
CD1a
CD14
CD83
CD80
CD86
HLAABC
HLADR
22.6
8.1
0.6
7.8
12.8
56.2
77.0
50.4
17.7
4.5
1.0
3.6
10.0
43.2
82.4
29.1
13.8
9.4
0.8
4.5
11.3
53.9
68.9
31.4
CD14+ isolated
­monocytes
elutriated fresh
monocytes
elutriated frozen
monocytes
frozen imDC
3.8
1.2
0.7
1.2
2.2
11.3
33.9
16.9
frozen smDC
3.7
1.0
0.6
2.1
3.0
21.9
18.5
14.7
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sere Werte liefert als Apherese und
Elutriation.
Bewertung der Produktion von
IL-12p70
Abb. 4: Zytokinproduktion von CD3+-T-Zellen nach 24h Kokultivierung mit verschiedenen
DC-Präparationen. Prozentsätze an positiven T-Zellen für IFN-γ, IL-4, IL-10 und CD69 sind in der
Abb. ausgewiesen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.
Das Zytokin IL-12p70 ist ein
wesentlicher Faktor für die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen.
Durch die Ausreifung der DC mit
TNF-a, IFN-g und LPS sollen die
DC gedrängt dazu gedrängt werden, möglichst viel von diesem Zytokin zu produzieren.
Dabei zeigte sich, dass die Kryokonservierung, egal in welchem
Stadium der DC-Generierung, die
Produktion von IL-12p70 hemmt.
Dies erfolgt jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Während die
IL-12p70-Sekretion bei Kryokonservierung im Monozytenstadium
um etwa 40 Prozent zurückgeht
(bezogen auf Monozyten, die nicht
kryokonserviert wurden), beträgt
die Reduktion bei DC aus kryokonservierten imDC und DC aus
kryokonservierten smDC beachtliche 75 bzw. 90 Prozent.
Zytokinproduktion von
CD3+-T-Zellen
Dendritische Zellen können TZellen nach Aktivierung in zwei
unterschiedliche Richtungen polarisieren. Der (erwünschte) TH1Phänotyp ist charakterisiert durch
IFN-g-Produktion und Stimulation
zytotoxischer T-Zellen, der (unerwünschte) T H2-Phänotyp durch
IL-4- und IL-10-Produktion. Alle
untersuchten DC-Präparationen
polarisieren in vitro kokultivierte
T-Zellen in Richtung TH1-Phänotyp – jedoch in unterschiedlichem
Ausmaß. Werden die Zellen bereits
im Monozytenstadium kryokonAbb. 5: Proliferation von CD3+-, CD4+- und CD8+-T-Zellen nach Kokultivierung mit verschiedenen
serviert, so ist die Produktion von
DC-Präparationen. Prozentsätze an proliferierten und nicht proliferierten T-Zellen sind in der
IFN-g in kokultivierten T-Zellen
Abb. ausgewiesen. Ein repräsentatives Experiment (von insgesamt 3) ist gezeigt.
vergleichbar mit Zellen, die nicht
kryokonserviert wurden. Eine
schiedener Präparationen dargestellt. Es wurden sowohl die Kryokonservierung im Stadium von imDC oder smDC wirkt
prozentuelle Expression (Tabelle 1a) als auch die Stärke der sich inhibitorisch auf die Stimulation zur IFN-g-Produktion
Expression (ausgedrückt durch MFI, Tabelle 1b) verschiede- aus (Abb. 4).
ner Marker ermittelt. Hier zeigte sich, dass die Kryokonservierung von imDC und smDC negative Auswirkungen auf Proliferation von CD3+-T-Zellen
diese Zellpräparationen hat (reduzierte Anzahl an CD40+-,
Nachdem die T-Zellen von DC aktiviert wurden, sollen
CD80+- und CD83+-Zellen sowie verringerter MFI-Wert auf sie proliferieren (sich vermehren), um in möglichst hoher
ausgereiften Zellen), während der Effekt auf DC von kryo- Anzahl ihr Ziel, auf das sie geprimt wurden (in Kontext der
Immuntherapie: der Tumor), zu bekämpfen. Die Proliferakonservierten elutrierten Monozyten geringer ausfiel.
Bei der Immuntherapie mit DC ist man bestrebt, die Ver- tion der T-Zellen wurde mithilfe des Fluoreszenzfarbstoffs
CFSE determiniert. Frisch isolierte T-Zellen werden mit
unreinigung mit anderen Leukozytenpopulationen möglichst
gering zu halten. Die Kontamination aller DC-Präparationen CFSE gefärbt und anschließend mit reifen DC verschiedener
mit T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Granulozyten war Präparationen kokultiviert. Bei jeder Zellteilung erhält jede
gering, wobei die immunomagnetische Isolation etwas bes- Tochter-T-Zelle die halbe Menge an CFSE der Mutterzelle
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und fluoresziert deshalb nur halb so stark. Im Flowzytometer lässt sich so die Zellteilung, also die Proliferation, der
T-Zellen verfolgen. Auch hier zeigte sich eine verringerte stimulatorische Kapazität von DC aus kryokonservierten imDC
und DC aus kryokonservierten smDC gegenüber frisch generierten DC oder DC aus kryokonservierten elutrierten
Monozyten (Abb. 5). Weiters wurden die kokultivierten
T-Zellen auf die Expression von Perforin und Granzyme B,
Mediatoren der zytotoxischen T-Zell-Antwort, untersucht.
Analog zu den bisher gefundenen Ergebnissen war der Prozentsatz an T-Zellen, die Granzyme B exprimieren, nach
Kokultivierung mit DC aus nicht kryokonservierten Zellen
oder DC aus kryokonservierten Monozyten am höchsten.
Die Expression von Perforin war jedoch unabhängig von der
gewählten DC-Population.
Induktion von regulatorischen T-Zellen
Die Aktivierung von regulatorischen T-Zellen ist eine
unerwünschte Begleiterscheinung der Immuntherapie mit
Dendritischen Zellen. Diese T-Zell-Population hat die Fähigkeit, eine T-Zell-Antwort, die gegen den Tumor gerichtet
ist, zu unterdrücken [7]. Die untersuchten Präparationen von
DC zeigten keine Aktivierung von regulatorischen T-Zellen
nach 96-stündiger Kokultur.
Diskussion
Unsere Studie zeigt, dass frisch isolierte Monozyten, egal
ob immunomagnetisch oder mittels Apherese und Elutriation
isoliert, vergleichbare Präparationen an reifen Dendritischen
Zellen liefern. Aufgrund der großen Anzahl an Monozyten,
die per Apherese und Elutriation gewonnen werden kann, ist
eine einzige Blutabnahme ausreichend, um genügend Zellen
für einen kompletten Impfzyklus zu generieren (in der Regel
zehn Impfungen). Werden Zellen gleich zu Beginn des Behandlungszyklus durch Apherese und Elutriation gewonnen
und nicht kurz vor jeder geplanten Impfung frisch immunomagnetisch isoliert, so hat man die Möglichkeit, die Immuntherapie mit DC auch nach Strahlentherapie oder Chemotherapie des/der PatientIn durchzuführen. Strahlentherapie
und Chemotherapie waren bis jetzt Kontraindikationen für
die Immuntherapie, weil sie negative Auswirkungen auf die
zellulären Blutbestandteile haben – eine Generierung von DC
aus strahlen- oder chemotherapierten Monozyten ist schwer
möglich. Bei Durchführung von Apherese und Elutriation
und Wegfrieren der Zellen vor Stahlen- oder Chemotherapie
kann dieses Problem umgangen werden.
Literatur:
1) Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of
immunity. Nature. 1998;392:245-252.
2) Sallusto F, Cella M, Danieli C, et al. Dendritic cells use
­macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate
macromolecules in the major histocompatibility complex class
II compartment: downregulation by cytokines and bacterial
products. J Exp Med. 1995;182:389-400.
3) Kiertscher SM, Roth MD. Human CD14+ leukocytes acquire
the phenotype and function of antigen- presenting dendritic
cells when cultured in GM-CSF and IL-4. J Leukoc Biol.
1996;59:208-218.
4) Lewalle P, Rouas R, Lehmann F, et al. Freezing of dendritic
cells, generated from cryopreserved leukaphereses, does not
Unsere Daten zeigen weiters, dass reife DC aus kryokonservierten Monozyten vergleichbar sind mit reifen DC
aus nicht kryokonservierten Monozyten. Werden Zellen jedoch im Stadium unreifer oder reifer DC kryokonserviert,
so ergibt sich nach dem Wiederauftauen eine phänotypisch
und funktionell wesentlich schlechtere Zellpopulation.
Die Kryokonservierung von Monozyten hat im Vergleich
zur Kryokonservierung von differenzierten Zellen einen
weiteren Vorteil. Genauso wie bei Strahlen- und Chemotherapie kann es auch bei der Immuntherapie mit Dendritischen Zellen zu Resistenzentwicklungen des Tumors
gegen die Therapie kommen. Ein möglicher Ausweg ist es,
die Dendritischen Zellen mit einer anderen Tumorantigenmischung zu beladen, um so die T-Zellen gegen andere
Tumorepitope zu primen. Werden für die Therapie unreife
oder reife DC kryokonserviert, so ist aufgrund des Protokolls zur DC-Generierung ein Wechsel der Tumorantigenmischung nicht mehr möglich (weil die Zellen schon vor
der Kryokonservierung mit Tumorantigen in Berührung
gekommen sind). Ein solcher Antigenwechsel ist aber sehr
wohl möglich, wenn anstatt der differenzierten DC frisch
isolierte Monozyten eingefroren werden, die noch nicht
mit den Tumorantigenen konfrontiert worden sind. Ein
möglicher Nachteil der Kryokonservierung der Zellen im
Monozytenstadium ist die erforderliche batchweise Generierung reifer DC und damit die verbundenen potenziellen
Batch-zu-Batch-Variationen.
n
Hubert Hayden
Biomedizinischer Analytiker an der
Medizinischen Universität Wien
Die vorgestellte Arbeit entstand in den Forschungslaboratorien der Universitätsklinik für Chirurgie in der Arbeitsgruppe für
klinisch-experimentelle Onkologie unter der Leitung von
Univ.-Prof. Dr. Michael Gnant, Univ.-Prof. Dr. Anton Stift und
Priv.-Doz. Dr. Josef Friedl. Die Arbeit belegte den ersten Platz
der Ausschreibung „ Abbott-Preis 2011 für wissenschaftliche
Publikationen“. Der Preis wurde am 1. April 2011 im Rahmen
der 19. Jahrestagung der Biomedizinischen AnalytikerInnen in
Innsbruck überreicht.
influence their ability to induce antigen-specific immune
­responses or functionally react to maturation stimuli.
J Immunol Methods. 2000;240:69-78.
5) Hori S, Heike Y, Takei M, et al. Freeze-thawing procedures
have no influence on the phenotypic and functional development of dendritic cells generated from peripheral blood
CD14+ monocytes. J Immunother (1997). 2004;27:27-35.
6) Dubsky P, Hayden H, Sachet M, et al. Allogeneic tumor lysate
can serve as both antigen source and protein supplementation for dendritic cell culture. Cancer Immunol Immunother.
2008;57:859-870.
7) Banerjee DK, Dhodapkar MV, Matayeva E, et al. Expansion of
FOXP3high regulatory T cells by human dendritic cells (DCs) in
vitro and after injection of cytokine-matured DCs in myeloma
patients. Blood. 2006;108:2655-2661.
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