Die Rolle des Notch-Signalweges für die Modulation
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Aus dem Deutschen Rheuma-Forschungs-Zentrum Berlin eingereicht über das Institut für Immunologie und Molekularbiologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Die Rolle des Notch-Signalweges für die Modulation inflammatorischer T-Zell-Reaktionen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin vorgelegt von Nadine Matzmohr geb. Kaßner Tierärztin aus Königs Wusterhausen Berlin 2009 Journal-Nr.: 3365 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Dekan: Prof. Dr.med.vet. Leo Brunnberg Erster Gutachter: Priv.-Doz. Dr.rer.nat. Michael Veit Zweiter Gutachter: Prof. Dr.rer.nat. Andreas Radbruch Dritter Gutachter: Prof. Dr.med.vet. Klaus Osterrieder Deskriptoren (nach CAB-Thesaurus): mice, modulation, immune response, t-lymphocytes, interleukin 10 Tag der Promotion: 11. Juni 2010 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über <http://dnb.ddb.de> abrufbar. ISBN: 978-3-86664-804-3 Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2009 Dissertation, Freie Universität Berlin D 188 Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die der Übersetzung, des Nachdruckes und der Vervielfältigung des Buches, oder Teilen daraus, vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. 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Die Antigenpräsentation ......................................................................................... 9 1.2.1. Antigenpräsentierende Zellen ....................................................................... 10 1.2.1.1. Makrophagen .................................................................................... 10 1.2.1.2. B-Zellen ............................................................................................ 11 1.2.1.3. Dendritische Zellen .......................................................................... 11 1.2.1.3.1. Konventionelle dendritische Zellen .................................. 12 1.2.1.3.2. Plasmazytoide dendritische Zellen ................................... 13 1.3. Toll-like Rezeptoren ................................................................................................ 13 1.4. Die T-Zell-Differenzierung ..................................................................................... 14 1.4.1. TH1-, TH2- und TH17-Zellen .......................................................................... 15 1.4.2. Regulatorische T-Zellen ................................................................................ 16 1.5. Die Regulation von Immunantworten durch T-Zellen ............................................ 17 1.5.1. Die Suppression von Immunantworten durch regulatorische T-Zellen ........ 18 1.5.2. Das immunsuppressive Zytokin IL-10 .......................................................... 19 1.6. Notch – ein transmembranärer Rezeptor und seine Liganden ................................. 20 1.6.1. Der Notch-Signalweg .................................................................................... 21 1.6.2. Die Expression von Notch-Komponenten im Immunsystem ........................ 22 1.6.3. Der Einfluss von Notch auf die T-Zell-Aktivierung ..................................... 23 1.6.4. Der Einfluss von Notch auf die T-Zell-Differenzierung ............................... 24 1.6.4.1. Regulation der TH1-Differenzierung ................................................ 24 1.6.4.2. Regulation der TH2-Differenzierung ................................................ 25 1.6.4.3. Induktion regulatorischer T-Zellen ................................................... 26 1.6.4.4. Notch als Modulator der TH-Zell-Differenzierung ........................... 27 2. Zielsetzung 29 3. Material & Methoden 31 3.1. Medien und Puffer .................................................................................................. 32 3.2. Chemikalien und Reagentien ................................................................................... 33 3.3. Antikörper ................................................................................................................ 34 3.3.1. für die Fluoreszenzmarkierung zum durchflusszytometrischen Nachweis ... 34 3.3.2. für die Blockade von Zytokinen .................................................................... 35 2 3.3.3. für die in vivo Anwendung ........................................................................... 35 3.4. Rekombinante Zytokine .......................................................................................... 35 3.5. TLR-Stimuli ............................................................................................................ 35 3.6. Mäuse ...................................................................................................................... 36 3.7. Zellpräparationen .................................................................................................... 36 3.7.1. Isolierung von Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten ........................... 36 3.7.2. Isolierung von dendritischen Zellen aus Milz und Lymphknoten ................ 36 3.8. Magnetische Zellsortierung (MACS) ...................................................................... 37 3.8.1. Prinzip der magnetischen Zellsortierung ....................................................... 37 3.8.2. Anreicherung naiver Lymphozyten für den adoptiven Transfer ................... 37 3.8.3. Anreicherung naiver CD4+ Lymphozyten für die in vitro Kultivierung ....... 38 3.8.4. Anreicherung von Antigenpräsentierenden Zellen ........................................ 39 3.9. Durchflusszytometrie ............................................................................................... 40 3.9.1. Prinzip der Durchflusszytometrie .................................................................. 40 3.9.2. Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen ..................................... 41 3.9.3. Verstärkung des Fluoreszenzsignales mittels FASER-Kit ............................ 41 3.9.4. Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung ........................................................... 42 3.9.5. CFDA-SE Markierung .................................................................................. 42 3.9.6. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung ............................................................. 43 3.9.6.1. Isolierung von DZ Subpopulationen ................................................. 43 3.10. T-Zell-Kulturen ..................................................................................................... 43 3.11. Restimulation und Fixierung ................................................................................. 44 3.12. Tierexperimentelle Methoden ............................................................................... 44 3.12.1. Adoptiver Transfer .................................................................................... 44 3.12.2. Immunisierungen ....................................................................................... 44 3.12.2.1. Die Immunisierung mit TLR-Liganden ...................................... 44 3.12.2.2. Die Immunisierung mit antigenbeladenen DZ ........................... 45 3.12.3. Die Blockade des Notch-Signalweges in vivo ........................................... 46 3.12.3.1. Die Blockade von Notch-Liganden ............................................ 46 3.12.3.2. Die Inhibition des Enzyms -Sekretase ...................................... 46 3.12.4. Die Depletion von plasmazytoiden dendritischen Zellen …...................... 46 3.13. Statistik .................................................................................................................. 46 3 4. Ergebnisse 49 4.1. Die IL-10- Induktion in TH1-Zellen durch Aktivierung des Notch-Signalweges ... 50 4.1.1. Etablierung einer Immunisierungsstrategie ................................................... 50 4.1.2. Die Blockade des Notch-Signalweges durch Inhibition der -Sekretase ..... 51 4.1.2.1. Die Depletion von MZ B-Zellen ...................................................... 52 4.1.2.2. Die Blockade der IL-10 Induktion durch Inhibition der -Sekretase 53 4.1.3. Die Charakterisierung der Immunisierung mit Ovalbumin und CpG ........... 55 4.1.3.1. Das Zytokinprofil OVA-TZR transgener T-Zellen .......................... 55 4.1.3.2. Das Zytokinprofil der endogenen CD4+ T-Zellen ............................ 57 4.1.3.3. Die Verteilung von CD4+, CD8+, CD19+, CD11c+ Zellen und pDZ nach CpG/OVA Immunisierung ....................................................... 58 4.2. Die Beteiligung der Notch-Liganden an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen .......... 60 4.2.1. Die Blockade von Notch-Liganden in vivo..................................................... 60 4.3. Die Analyse der Beteiligung verschiedener APZ an der IL-10 Induktion .............. 63 4.3.1. Die Notch-Liganden Expression auf verschiedenen DZ Populationen ........ 63 4.3.1.1. Die murinen DZ Populationen in Milz und Lymphknoten .............. 63 4.3.1.2. Die Expression von Notch-Liganden ex vivo ................................... 64 4.3.1.3. Die Expression von Notch-Liganden nach Immunisierung ............. 66 4.3.2. Die Rolle von pDZ für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen .......................... 68 4.3.2.1. pDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vitro ................................... 69 4.3.2.2. Die Rolle von ICOS für die IL-10 Induktion durch pDZ ................ 70 4.3.2.3. pDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vivo .................................... 72 4.3.2.4. Die Depletion von pDZ .................................................................... 73 4.3.2.4.a. Die Effizienz der pDZ Depletion ..................................... 73 4.3.2.4.b. Die Blockade der IL-10 Induktion nach pDZ Depletion .. 74 4.3.3. Die Rolle von B-Zellen für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen .................... 76 4.3.3.1. Analyse der Beteiligung von B-Zellen an der IL-10 Induktion ....... 76 4.3.3.2. Die Notch-Liganden Expression auf B-Zellen ................................. 78 4.3.3.2.a. Die Notch-Liganden Expression ex vivo .......................... 78 4.3.3.2.b. Die Notch-Liganden Expression nach OVA/CpG .......... 79 5. Diskussion 81 5.1. Die Aktivierung der Notch-Signalweges in vivo .................................................... 82 5.1.1. Notch und die T-Zell-Differenzierung .......................................................... 82 4 5.1.2. Notch induziert das immunsuppressive Zytokin IL-10 in TH1-Zellen .......... 83 5.2. Die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch Liganden der Delta-Like Familie ......... 84 5.3. Die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch verschiedene APZ Populationen .......... 86 5.3.1. Die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch pDZ ............................................ 87 5.3.1.1. pDZ können Immunantworten regulieren ........................................ 87 5.3.1.2. Wie wird die Ligandenexpression reguliert? .................................... 89 5.3.1.3. pDZ als Induktoren einer Immunantwort ........................................ 90 5.3.2. Die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch konventionelle DZ ...................... 92 5.3.3. Die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch B-Zellen ...................................... 93 5.4. Die Notchvermittelte Immunregulation als Mechanismus der Selbstlimitation? ... 94 5.5. Hat der Notch-Signalweg therapeutisches Potential? ............................................. 96 5.6. Ausblick und offene Fragen..................................................................................... 98 6. Zusammenfassung 101 7. Summary 105 8. Literaturverzeichnis 107 9. Anhänge 131 I Abbildungsverzeichnis .................................................................................... 132 II Tabellenverzeichnis ......................................................................................... 133 III Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 134 IV Erklärung ......................................................................................................... 137 V Danksagung ..................................................................................................... 138 VI Kongressbeiträge ............................................................................................. 141 VII Publikationen …............................................................................................... 142 5 6 1. Einleitung EINLEITUNG 1. EINLEITUNG 1.1 Das Immunsystem In einer belebten Umwelt ist der Organismus ständig pathogenen Mikroorganismen, Parasiten und Fremdstoffen ausgesetzt, die zu Funktionsstörungen und schweren Erkrankungen führen können. Stoffe, die eine spezifische Immunreaktion auslösen, werden auch Antigene genannt. Um der stetigen Bedrohungen durch diverse Antigene zu begegnen, hat der Organismus sehr komplexe und äußerst effektive Abwehrmechanismen entwickelt, welche in ihrer Gesamtheit als Immunsystem bezeichnet werden. Die Bildung sowie die Stimulation bzw. Aktivierung der Zellen des Immunsystems findet in speziellen Organen, den lymphatischen Geweben, statt. Dabei zählen Knochenmark und Thymus zu den primären, Milz und Lymphknoten zu den sekundären lymphatischen Organen. Alle Immunzellen besitzen Oberflächenmoleküle, die zur Identifizierung einzelner Zellpopulationen herangezogen werden können. Diese unterliegen durch den Cluster of Differentiation (CD) Kodex einer einheitlichen Namensgebung. Das Immunsystem wird in die angeborene und die adaptive Immunität unterteilt, denen unterschiedliche Funktionsweisen zugrunde liegen, die sich jedoch in einer Immunantwort gegenseitig ergänzen. Die angeborene Immunität basiert auf dem System der Erkennung und Eliminierung wiederkehrender Strukturmerkmale von Pathogenen, den sogenannten pathogen associated molecular pattern (PAMP) (1). Das angeborene Immunsystem bedient sich verschiedener Komponenten, wie dem Komplementsystem und einer Vielzahl phagozytierender Zellen, darunter Makrophagen und Granulozyten, zur Bekämpfung dieser Pathogene. Zudem gibt es natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen), die die Apoptose von mit Pathogenen befallenen Körperzellen durch die Ausschüttung zytotoxischer Moleküle herbeiführen. Trotz der hohen Effizienz in der Eliminierung von Pathogenen - man geht davon aus, dass über 90% aller Antigene durch die angeborene Immunantwort bekämpft werden können – ist die angeborene Immunität unspezifisch und nur begrenzt wirksam. Die adaptive Immunität zeichnet sich hingegen durch Antigenspezifität, Anpassungsfähigkeit und die Fähigkeit der Ausbildung eines Gedächtnisses aus (2, 3). Die Zellen der adaptiven Immunität sind in der Lage spezifische Merkmale von Pathogenen zu erkennen und gezielt zu bekämpfen. Gleichzeitig wird im Zuge einer Immunreaktion ein immunologisches Gedächtnis generiert, welches es möglich macht, bei einer erneuten Infektion mit dem gleichen Pathogen, beschleunigt zu reagieren. Zu den Zellen der adaptiven Immunität gehören die B- und die TLymphozyten, die gekennzeichnet sind durch die Expression eines hoch variablen Antigenrezeptors, dem sogenannten B-Zell-Rezeptor (BZR) bzw. T-Zell-Rezeptor (TZR). In 8 EINLEITUNG ihrer frühen Entwicklung durchlaufen B- und T-Zellen eine Phase der somatischen Rekombination. Hierbei entstehen durch Rekombination einer Vielzahl verschiedener Gensegemente nach dem Zufallsprinzip T- und B-Zell-Rezeptoren mit einer enormen Diversität. Nach dem Kontakt mit einem Antigen werden nur die Lymphozyten aktiviert und differenzieren in Effektor-Lymphozyten, die den für das Antigen spezifischen Rezeptor auf der Zelloberfläche tragen. Historisch wird anhand der an der Abwehr beteiligten Lymphozyten eine weitere Einteilung in die zelluläre und in die humorale Immunität vorgenommen. Die humorale Immunabwehr richtet sich vorwiegend gegen extrazelluläre Parasiten sowie gegen von Pathogenen produzierte Toxine. Sie ist gekennzeichnet durch die Aktivierung von B-Zellen und deren Differenzierung in Plasmazellen, die wiederum durch die Produktion von spezifischen Antikörpern gekennzeichnet sind. Antikörper erfüllen vielfältige Funktionen in einer humoralen Immunantwort. Sie können von Pathogenen produzierte Toxine neutralisieren, sowie Pathogene selbst durch Opsonierung für die Phagozytose oder Lyse kennzeichnen. Außerdem können Antikörper das Komplementsystem aktivieren. Die zelluläre Immunabwehr hingegen steht für die Bekämpfung intrazellulärer Erreger und ist gekennzeichnet durch die Elimierung von Pathogenen und den von ihnen befallenen Zellen durch Makrophagen, NK-Zellen und Zytotoxische T-Zellen (3). Die zelluläre Immunität erfordert die Aktivierung von naiven T-Zellen durch Antigen Präsentierende Zellen (APZ) und die Differenzierung der T-Zellen in verschiedene Subpopulationen von T-Helfer(TH)Zellen. Die Grundlagen der Antigenpräsentation, sowie der Aktivierung und Differenzierung von TH-Zellen sollen im Folgenden genauer erläutert werden. 1.2. Die Antigenpräsentation Antigene können nur dann durch T-Zellen mithilfe ihres TZR erkannt werden, wenn sie auf der Zelloberfläche von APZ durch Bindung an den sogenannten major histocompatibility complex (MHC) präsentiert werden. APZ internalisieren Antigen aus dem Extrazellularraum, dieses wird im Folgenden intrazellulär prozessiert und an MHC Moleküle gebunden (4). Zwei verschiedene MHC Moleküle transportieren Peptide aus unterschiedlichen zellulären Kompartimenten an die Zelloberfläche. MHC-I Moleküle binden zytosolisches Antigen und präsentieren dieses an CD8+ T-Zellen. Diese werden nach Erkennung ihres Antigenes aktiviert und sekretieren zytotoxische Moleküle, welche die APZ töten (5). MHC-I Moleküle werden von nahezu allen Körperzellen exprimiert, um im Falle einer Infektion vom Immunsystem erkannt und eliminiert zu werden. Peptide aus intrazellulären Vesikeln hingegen werden an MHC-II Moleküle gebunden und durch CD4+ T-Zellen erkannt. MHC-II 9 EINLEITUNG Moleküle werden im Gegensatz zu den Klasse-1 Molekülen nur von spezialisierten, den sogenannten „professionellen“ APZ exprimiert. Dazu zählen die Makrophagen, die B-Zellen sowie die Dendritischen Zellen (DZ), die im Folgenden noch detailliert beschrieben werden. Neben der Präsentation des Antigens auf MHC Molekülen ist für eine effektive Aktivierung von T-Zellen stets ein ko-stimulatorisches Signal notwendig (6). Dieses Signal wird durch die ko-stimulatorischen Moleküle B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) vermittelt. CD80 und CD86 sind Zelloberflächenmoleküle, die auf APZ exprimiert werden, und deren Expression nach Aktivierung beziehungsweise Stimulierung der APZ verstärkt wird. CD80 und CD86 binden an das Molekül CD28 auf der T-Zelle und vermitteln neben Differenzierungssignalen ein essentielles ko-stimulatorisches Signal zur Aktivierung der T-Zelle (7, 8). 1.2.1. Antigenpräsentierende Zellen (APZ) APZ ermöglichen die Erkennung von Pathogenen und leiten eine effiziente Bekämpfung dieser durch die Initiierung einer spezifischen Immunantwort ein. Man unterscheidet drei verschiedene Subpopulationen von APZ: die Makrophagen, die B-Zellen und die Dendritischen Zellen. 1.2.1.1. Makrophagen Makrophagen entstehen aus im Blut zirkulierenden Monozyten und sind in verschiedensten Geweben des Körpers lokalisiert (9). Dort spielen sie eine große Rolle für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase durch die Beseitigung von gealterten Zellen und den Umbau und die Reparatur von Gewebe nach Entzündungsvorgängen. Makrophagen sind eine heterogene Population mit speziellen Funktionen, die ihrem Aufenthaltsort entsprechen. Beispielsweise ist ein wesentliches Merkmal der Alveolar Makrophagen der Lunge ihre sehr hohe Expression an zahlreichen pathogen pattern receptors (PRR), wie Toll like-, Mannose-, Glycan- und Scavenger Rezeptoren, die bedingt ist durch die stetige Konfrontation mit vielfältigsten Pathogenen und Umweltpartikeln, die in der Atemluft enthalten sind. Makrophagen können durch ihre Komplement- und Fc-Rezeptoren jedoch auch Antigene erkennen, die bereits durch Komponenten des Komplementsystems oder durch Antikörper besetzt sind. Nach ihrer Aktivierung produzieren Makrophagen pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin(IL)-1, IL-6, IL-8, IL-12 und Tumor-Nekrose-Faktor-TNF-α), sowie Entzündungsmediatoren, wie Prostaglandine und Leukotriene, Plättchen- Agglutinationsfaktor (PAF) und Komplementfaktoren (10). Aktivierte Makrophagen 10 EINLEITUNG zerstören die ingestierten Pathogene durch verschiedene Mechanismen, wie die Produktion von Sauerstoff- und Stickstoffmetaboliten, sowie Lysozym und Laktoferrin. 1.2.1.2. B-Zellen Die Aktivierung von B-Zellen wird initiiert durch die Bindung des spezifischen Antigens an den B-Zell-Rezeptor (BZR). Der BZR ist strukturell ein membrangebundenes Immunoglobulin und entspricht dem Antikörper, der nach Aktivierung und Differenzierung der naiven B-Zelle in eine Plasmazelle produziert wird. B-Zellen können sowohl lösliches als auch membrangebundenes Antigen erkennen, wobei vermutet wird, dass die membrangebundene Form wichtiger für die B-Zell-Aktivierung in vivo ist (11, 12). Nach der Stimulation mit Antigen wird der BZR-Komplex internalisiert, das Antigen intrazellulär prozessiert und an MHC-II Moleküle gebunden. Durch die Präsentation von Antigen auf MHC-II Molekülen können B-Zellen CD4+ Helfer Zellen aktivieren, die wiederum die Proliferation und Differenzierung der B-Zelle stimulieren (13, 14). B-Zellen sind jedoch vergleichsweise „schwache“ APZ. Ihre Fähigkeit der Antigenpräsentation ist limitiert durch die Spezifität ihres BZR. Zudem sind sie nicht zu aktiver Phagozytose befähigt. Für B-Zellen als professionelle APZ spricht jedoch die Expression von MHC-II sowie der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. 1.2.1.3. Dendritische Zellen Dendritische Zellen (DZ) sind hochspezialisiert auf die Aufnahme, den Transport, die Prozessierung und die Präsentation von Antigenen an T-Zellen (15). Sie sind in Blutbahn, lymphatischen Organen und Geweben lokalisiert und exprimieren neben Rezeptoren für Entzündungsmediatoren eine Reihe von pathogen recognition rezeptors (PRR). Hierzu gehören neben den Toll Like Rezeptoren (TLR) (16), die nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) Proteine (17), RIG-1-like Rezeptoren, C-type lectin Rezeptoren (18), Zytokin(19) und Chemokin-Rezeptoren (20). Neben der Aktivierung durch PRR können DZ auch in einer bereits anhaltenden Immunantwort durch Typ-1-Interferon, IFN- oder CD40-Ligand aktiviert werden. Eine Aktivierung führt zu einer Migration der DZ in die sekundären lymphatischen Organe, die Lymphknoten. Im Lymphknoten wird das Antigen naiven TZellen auf MHC Molekülen präsentiert und es kommt zu einer verstärkten Expression von kostimulatorischen Molekülen. Neben der Aktivierung der T-Zelle können DZ durch verschiedene Signale und die Sekretion von polarisierenden Zytokinen die T-ZellDifferenzierung steuern. DZ spielen aber auch eine Rolle für die Aufrechterhaltung der 11 EINLEITUNG Toleranz gegenüber körpereigenen Antigenen. Beispielsweise wird die Induktion der Apoptose autoreaktiver T-Zellen im Thymus durch DZ gesteuert (21). Autoreaktive T-Zellen, die der Selektion im Thymus entgehen, werden in der Peripherie durch nicht vollständig aktivierte DZ, die körpereigenes Material ohne Ko-Stimulation präsentieren, deletiert. DZ sind ebenso wie Makrophagen eine sehr heterogene Gruppe. Daher sollen im Folgenden die verschiedenen DZ-Subpopulationen der Maus beschrieben werden. 1.2.1.3.1. Konventionelle dendritische Zellen Konventionelle DZ können anhand des Oberflächenmoleküls CD11c identifiziert werden. Neben CD11c exprimieren die DZ der Maus die T-Zell-Marker CD4 und CD8, anhand derer unterschiedliche DZ-Subpopulationen definiert werden können. Weitere Oberflächenmoleküle zur näheren Unterscheidung von DZ sind CD11b und CD205. Insgesamt lassen sich fünf verschiedene murine DZ Subpopulationen unterscheiden. Einen Überblick gibt die Tabelle 1. Tabelle 1. Konventionelle DZ der Maus Lokalisation Oberflächenmoleküle Bezeichnung Milz / Lymphknoten CD11c+ CD8+ CD4- CD11b- lymphoide DZ Milz CD11c+ CD8- CD4+ CD11b+ myeloide DZ Milz CD11c+ CD8- CD4- CD11b+ myeloide DZ Lymphknoten CD11c+ CD8- CD4- CD11b+ CD205low myeloide DZ Lymphknoten (Haut) CD11c+ CD8low CD4- CD11b+ CD205high Langerhans DZ In der Milz sind drei verschiedene DZ-Populationen lokalisiert: die CD8+CD4-, sowie die CD8-CD4+ und die CD8-CD4- DZ (22). Während die CD8+ DZ in den T-Zell-Arealen zu finden sind, residieren die CD8- hauptsächlich in den Marginalzonen der Milz. Nach Stimulation durch mikrobielle Antigene migrieren jedoch auch die CD8- in die T-Zell-Areale der Milz (23-25). Auch die Expression von CD11b hilft in der Unterscheidung der CD8+ und CD8- DZ. Während die CD8+ Zellen CD11b negativ sind, wird auf den CD8- eine Expression von CD11b beobachtet. Historisch werden für die DZ der Milz unabhängig von ihrem hämatopoetischen Ursprung die Terme „myeloid“ (CD11b+) und „lymphoid“ (CD11b-) benutzt. Im Lymphknoten der Maus können zwei weitere Subpopulationen unterschieden werden, die normalerweise nicht in der Milz vorkommen und offenbar aus dem lymphatischen System einwandern (26). Die CD8-CD4-CD11b+ DZ des Lymphknotens, die im Gegensatz zu den CD8- der Milz geringe Mengen an CD205 exprimieren, sowie eine 12 EINLEITUNG weitere DZ Population, die sich nur in den Lymphknoten der Haut findet und sich durch eine hohe Expression des Oberflächenmoleküls Langerin auszeichnet. Langerin ist ein charakteristischer Marker von Langerhans-Zellen der Haut und die DZ im Lymphknoten sind vermutlich deren reife Form (26). Alle konventionellen DZ exprimieren CD40, CD80, CD86 und MHC Moleküle. Nach einer Stimulation und einer Aktivierung der APZ wird die Expression dieser Moleküle verstärkt. 1.2.1.3.2. Plasmazytoide dendritische Zellen Plasmazytoide dendritische Zellen (pDZ) unterscheiden sich bereits aufgrund ihrer Plasmazell-Morphologie von den konventionellen DZ. PDZ zeichnen sich zudem durch die Expression von nur niedrigen Mengen des Oberflächenmoleküls CD11c aus. Hingegen exprimieren sie den B-Zell-Marker B220 sowie GR1 und Ly6c. Unreife pDZ exprimieren nur geringe Mengen an MHC-II und ko-stimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86. Nach bakterieller und vor allem viraler Stimulation produzieren pDZ große Mengen an IFN- und IFN- (27). Die Produktion von Typ-1-Interferonen durch pDZ ist für eine adequate Aktivierung der antiviralen Aktivität von NK-Zellen absolut essentiell (28). Daher wird den pDZ eine entscheidende Rolle in der Initiierung von Immunantworten nach Virusinfektionen zugeschrieben. 1.3. Toll-Like Rezeptoren Toll-Like Rezeptoren (TLR) gehören zu den pattern recognition receptors (PRR), die von allen APZ exprimiert werden. Die Aktivierung der TLR durch die entsprechenden Agonisten führt zur Aktivierung von multiplen Signalkaskaden, die die Transkription von verschiedenen Genen, die für Zytokine, Chemokine und ko-stimulatorische Moleküle kodieren, initiieren. Während TLR1, TLR2, TLR4 und TLR5 an der Zellmembran lokalisiert sind, befinden sich TLR3, TLR7, TLR8 und TLR9 in intrazellulären Kompartimenten (29). Makrophagen exprimieren alle TLR mit Ausnahme von TLR3. Während für konventionelle DZ die Expression aller TLR beschrieben ist, exprimieren pDZ ausschließlich TLR7 und TLR9. Für B-Zellen ist eine Expression von TLR4 und TLR9 beschrieben (Übersicht in (30)). TLR1/2 und TLR 2/6: TLR2 kooperiert mit TLR1 und TLR6 in der Erkennung mikrobieller Lipopeptide (31, 32). Zusammen mit Dectin wird Zymosan, eine Zellwandkomponente von Hefen, detektiert (33). 13 EINLEITUNG TLR3: TLR3 erkennt doppelsträngige RNA (dsRNA) und führt zur Induktion von Typ-1Interferonen (34). dsRNA entsteht im Replikationszyklus zahlreicher Viren. Einige künstliche dsRNA, wie Polyinosinsäure – Polycytidylsäure (poly:I:C) haben jedoch den gleichen immunstimulatorischen Effekt wie virale dsRNA. TLR4: TLR4 ist spezifisch für Lipopolysaccharid (LPS) (35), dem Hauptbestandteil der Zellwand von Gram-negativen Bakterien. LPS kann TLR4 jedoch nicht direkt aktivieren, sondern wird von dem Serumprotein LPS-binding Protein (LBP) gebunden. Der LPS-LBP Komplex bindet daraufhin an CD14, den LPS-Rezeptor auf Monozyten und Makrophagen, und die räumliche Nähe zwischen CD14 und TLR4 führt im Folgenden zur Interaktion und Aktivierung von TLR4. TLR5: TLR5 wird durch die bakterielle Komponente Flagellin aktiviert (36). Flagellin ist ein Protein, welches den Hauptbestandteil des bakteriellen Flagellums ausmacht. Das Flagellum sind Ausstülpungen der Außenmembran einiger Gram-negativen oder –positiver Bakterien (z.B. Listeria monocytogenes), die der Fortbewegung dienen. TLR7/TLR8: Für TLR7 und TLR8 konnte erst 2004 virale, einzelsträngige RNA (ssRNA) als natürlicher Ligand identifiziert werden (37). Synthetische Liganden von TLR7 und TLR8 sind Abkömmlinge der Imidazoquinoline, wie Imiquimod (R837) und Resiquimod (R848). TLR9: Bakterielle DNA ist ein potenter Aktivator von Zellen des Immunsystems. Die immunstimulatorische Wirkung von bakterieller DNA ist mit dem Vorkommen von unmethylierten Cytosin-Guanin-Dinukleotiden (CpG) verbunden. Diese kommen im Vertebraten Genom sehr selten und wenn dann in methylierter Form vor. TLR9 erkennt bakterielle DNA, die CpG Motive enthält (38). Für die Stimulation von TLR9 im experimentellen System werden künstlich hergestellte Oligonukleotide, die CpG Motive enthalten, verwendet. 1.4. Die T-Zell-Differenzierung Nach antigenspezifischer Stimulation durch eine APZ kann eine naive TH-Zelle in verschiedene Subpopulationen von TH-Zellen differenzieren. Jede dieser Subpopulationen erfüllt spezielle Aufgaben im Rahmen einer Immunantwort gegen unterschiedliche Mikroorganismen. Hierfür werden von den T-Zellen verschiedene Zytokine und Chemokine 14 EINLEITUNG sekretiert, die zur Aktivierung bzw. Rekrutierung von Zielzellen führen. Die Richtung der Differenzierung (Priming) zu Effektor-T-Zellen ist von der Art der APZ, vom Zytokinmilieu und der Stärke der Aktivierung abhängig. Einen Überblick vermittelt die Abbildung 1. Abbildung 1. Die T-Zell-Differenzierung. Naive TH-Zellen können in verschiedene Subpopulationen von T HZellen differenzieren. Die Differenzierung wird von verschiedenen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren gesteuert. Nach ihrer Differenzierung sekretieren die T H-Zellen verschiedene Effektorzytokine und erfüllen unterschiedliche Aufgaben im Rahmen der Immunabwehr. 1.4.1. TH1-, TH2- und TH17-Zellen TH1-Zellen werden durch das von APZ sekretierte Zytokin IL-12 induziert (39). Die Produktion von IL-12 führt im Folgenden zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors signal transducer and activator of transcription (STAT) 4 (39, 40) und einer damit verbundenen Expression des pro-inflammatorischen Zytokins IFN-. IFN- führt wiederum über die Aktivierung von STAT1 zu einer Induktion der Expression des Transkriptionsfaktors T-bet (41). T-bet wird als Hauptregulator der TH1-Differenzierung angesehen, da er wiederum die IFN- Produktion induziert und die Expression der IL-122-Rezeptor Kette heraufreguliert. Die IFN- Produktion führt über einen positiven feedback loop zur Aktivierung von T-bet, was wiederum eine verstärkte IFN- Sekretion induziert. TH1-Zellen 15 EINLEITUNG vermitteln eine effektive Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene und sekretieren die Zytokine IFN- und TNF-, die die zelluläre Immunität aktivieren. IFN- ist ein entscheidender Faktor für die Aktivierung von Makrophagen (42-44). Interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass TH1-Zellen neben den pro-inflammtorischen Zytokinen auch das suppressorische Zytokin IL-10 sekretieren können (45). Für eine Differenzierung in TH2-Zellen sind sowohl das Zytokin IL-2 als auch IL-4 wichtig. IL-4 aktiviert das Molekül STAT6 und führt zur Expression des Haupt-Transkriptionsfaktors GATA-3 (46). GATA-3 bindet im Folgenden an einen regulatorischen Bereich des IL-4 Genes und steuert sowohl die Transkription von IL-4 als auch von IL-5 (47). Jedoch ist GATA-3 allein für eine IL-4 Induktion nicht ausreichend, sondern eine durch IL-2 vermittelte STAT5 Induktion ist ebenso notwendig. Eine Bindung von STAT5 an eine Region im IL-4 Gen ist essentiell für eine effektive TH2-Differenzierung (48, 49). TH2-Zellen vermitteln die Immunabwehr gegen extrazelluläre Pathogene. Sie produzieren neben IL-4 die Zytokine IL5, IL-9, IL-10 sowie IL-13. IL-4 vermittelt dabei einen positiven feedback loop für die TH2Differenzierung (50, 51) und ist außerdem der Hauptmediator des Klassenwechsel zum Immunglobulin IgE in B-Zellen (52). Die Population der TH17-Zellen wurde erst kürzlich als eigenständige Subpopulation von THZellen beschrieben (53, 54). Für die Differenzierung in TH17-Zellen sind die Zytokine TGF- und IL-6 essentiell (55-57). IL-23, das zunächst als Differenzierungsfaktor für TH17 Zellen beschrieben wurde, spielt hingegen nur eine Rolle für das Überleben und die Erhaltung der Funktion von TH17-Zellen (55, 58). TH17-Zellen exprimieren den spezifischen Transkriptionsfaktor RORt (59) und produzieren das Zytokin IL-17, welches die Expression von weiteren pro-inflamatorischen Zytokinen, wie TNF- und IL-6 induziert (60). TH17Zellen wird eine Rolle bei der Bekämpfung extrazellulärer Pathogene, sowie in Entzündung und Autoimmunität zugeschrieben (61, 62). 1.4.2. Regulatorische T-Zellen (Treg) Die Entdeckung, dass CD25+CD4+ Treg den Transkriptionsfaktor forkhead box P3 (FOXP3) exprimieren, führte zu der Erkenntnis, dass Treg eine individuelle Subpopulation innerhalb der TH-Zellen repräsentieren (63, 64). Beim Menschen führt das Fehlen der FOXP3 Funktion zu einer Dysfunktion des Immunsystems, auch immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked (IPEX) genannt. IPEX ist eine akute Autoimmunerkrankung verbunden mit Allergien und chronisch entzündlichen Darmveränderungen (65). Ebenso führt die 16 EINLEITUNG Depletion von FoxP3+ Zellen im murinen System zu multiplen Autoimmunerkrankungen, die die Bedeutung von Treg für die Regulation des Immunsystems aufzeigen (66, 67). Innerhalb der regulatorischen T-Zellen gibt es mehrere Subpopulationen, die an der Aufrechterhaltung der Homöostase des Immunsystems beteiligt sind. Die wohl am besten charakterisierten Treg sind die natürlich vorkommenden CD4+CD25+Foxp3+, die im Thymus entstehen. Zum anderen können in der Peripherie aus naiven CD4+CD25- TH-Zellen die sogenannten adaptiven Treg durch verschiedene Signale entstehen. Diese Signale beinhalten die Stimulation mit Antigen in Anwesenheit von Zytokinen wie IL-10 und TGF- (68) und/oder Retinolsäure (69, 70), oder die Aktivierung durch unreife dendritische Zellen (71). Weniger gut charakterisiert, insbesondere im Hinblick auf die Expression eines spezifischen Transkriptionsfaktors, sind die in der Peripherie induzierten regulatorischen Subpopulationen. Hierzu gehören die TH3- und TR1-Zellen, deren Induktion durch verschiedene Methoden beschrieben ist, die sich jedoch alle auf eine Aktivierung unter suboptimalen oder reprimierenden Bedingungen zurückführen lassen, so z.B. die wiederholte Stimulation durch nicht professionelle APZ oder die Anwesenheit von immunsuppressiven pharmakologischen Substanzen oder Zytokinen wie TGF- oder IL-10. TH3-Zellen wurden in Studien zu oraler Toleranz identifiziert und zeichnen sich durch die Produktion von TGF-, aber auch IL-10 und IL-4 aus (72). Es wurde gezeigt, dass in einem Mausmodell für Multiple Sklerose durch die orale Zufuhr des Antigens MBP (Basisches Mylein Protein) TH3-Zellen induziert werden, die durch TGF- vermittelt eine Enzephalitis supprimieren können (73). TR1-Zellen entstehen hingegen, wenn naive TH-Zellen unter Zugabe von IL-10 (74) oder Vitamin D3 und Dexamethason (75) mit Antigen und APZ stimuliert werden. TR1-Zellen können ebenso durch die Präsentation von Antigen durch unreife DZ induziert werden (76). TR1 Zellen supprimieren sowohl naive als auch Gedächtniszellen durch ihre Produktion von IL-10, wobei auch eine Ko-Expression von IFN- durch TR1-Zellen beschrieben wurde (77). Obwohl TH3- und TR1-Zellen den regulatorischen T-Zellen zugeordnet werden, ist ihre Anerkennung als eigenständige Population regulatorischer T-Zellen bisher aufgrund des Fehlens eines linienspezifischen Transkriptionsfaktors umstritten. 1.5. Die Regulation von Immunantworten durch T-Zellen Für ein ausgeglichenes Immunsystem ist neben einer effizienten Immunantwort gegen Pathogene die Fähigkeit entscheidend, eine Aktivierung des Immunsystems zu regulieren, um eine Immunantwort auf körpereigene Antigene zu verhindern. Eine Regulation der Immunantwort bezüglich körpereigener Antigene beginnt bereits frühzeitig in der T-Zell17 EINLEITUNG Entwicklung im Thymus. Hier werden autoreaktive T-Zellen selektiert und anschließend deletiert. Autoreaktive Zellen, die dieser Selektion entgehen, werden in der Peripherie durch Präsentation körpereigener Antigene durch APZ ohne Ko-Stimulation, deletiert. Die Regulation von Immunantworten umfasst jedoch neben der Verhinderung einer Immunantwort gegen körpereigene Stoffe, auch die Kontrolle einer „überschießenden“ Aktivierung gegenüber Fremdantigenen. Bei einer Vielzahl von Infektionskrankheiten entsteht die Immunpathologie des Wirtes nicht durch das Pathogen selbst, sondern durch eine exzessive Aktivierung des Immunsystems (78-80). Die massive Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine IFN- und TNF- durch TH1-Zellen und CD8+ T-Zellen kann im Verlauf von Infektionen beispielsweise mit Toxoplasma gondii (81) oder Trypanosoma spp. (80) zu Entzündungen und damit einhergehenden starken Gewebszerstörungen führen. Daher müssen Immunantworten reguliert werden. Eine Übersicht über die Mechanismen der Immunregulation soll im Folgenden gegeben werden. 1.5.1. Die Suppression von Immunantworten durch regulatorische T-Zellen (Treg) Treg supprimieren die Aktivierung und Expansion von CD4+ und CD8+ Effektor-Zellen (82), die Proliferation von B-Zellen (83), die zytotoxische Funktion von NK-Zellen (84) sowie die Reifung und Aktivierung von DZ (85). Für die Aktivierung von Treg bedarf es einer Antigenstimulation, die Treg vermittelte Suppression hingegen ist antigenunabhängig (86). Eine Depletion von CD25+ TH-Zellen führt zu fatalen Autoimmunerkrankungen (87), hingegen verhindert der Transfer von Treg den Ausbruch verschiedenster Erkrankungen (88, 89). Die Mechanismen, die der Suppression durch Treg zugrunde liegen, sind noch nicht abschließend geklärt. Diskutiert werden derzeit drei verschiedene Mechanismen der Suppression: der direkte Zell-Zell-Kontakt, die durch lokale Sekretion von Zytokinen vermittelte Suppression und die Kompetition um Wachstumfaktoren und ko-stimulatorische Moleküle. Für die zellkontaktabhängige Suppression kommen einige Moleküle in Betracht. Neben membrangebundenem TGF- (90) nehmen zytolytische Moleküle wie Fas und Granzym B (91, 92), sowie Zelloberflächenmoleküle wie LAG3 (93) und CTLA-4 an der Suppression teil. Insbesondere für die durch CTLA-4 vermittelte Suppression sind zahlreiche Mechanismen beschrieben (94-96). Ein weiterer zellkontaktabhängiger Mechanismus ist die Modulation von cyclic adenosine mono phosphate (cAMP) in der Zielzelle. Eine Erhöhung des cAMP Spiegels wird mit der Inhibition von Proliferation und Differenzierung und in Lymphozyten mit der Inhibition der IL-2 und IFN- Expression in Verbindung gebracht (97, 18 EINLEITUNG 98). Es wird angenommen, dass Treg den cAMP Spiegel in der Zielzelle zum einen durch den direkten Transfer von cAMP durch gap junctions (99) oder indirekt durch die lokale Generierung von Adenosin in der Zielzelle erhöhen (100, 101). Neben der Zell-Zell-Interaktion als suppressiven Mechanismus können Treg inhibitorische Zytokine sekretieren. Hier wurden TGF- und IL-10 beschrieben. Eine Defizienz von TGF- oder einem Bestandteil der Signaltransduktionskette von TGF- führt zu einer frühen und fatalen Multi-Organ-Pathologie (102). TGF- ist ein essentieller Faktor für die Homöostase der Treg und kann sowohl die Produktion von IFN- (103) als auch die TH1-Differenzierung inhibieren (102). Treg können TGF- selbst produzieren oder deren Produktion in APZ induzieren. Ebenso entscheidend für die Treg-vermittelte Suppression ist die Sekretion des immunsuppressiven Zytokins IL-10. Studien in Mäusen, deren Treg defizient für IL-10 sind, zeigen, dass Treg das immunologische Gleichgewicht an Schnittstellen zur Außenwelt (z.B. Darm, Lunge und Haut) mit Hilfe von IL-10 erhalten (104). Dementsprechend wurde eine essentielle Rolle von Treg und IL-10 in Asthma- (105), Allergie-, Pneumonitis- (106), Hauttransplantations- (107) und Kolitismodellen (108) gezeigt. Neueste Arbeiten in einem murinen Modell der Multiplen Sklerose zeigen, dass Treg auch im ZNS Immunreaktionen mittels IL-10 Sekretion kontrollieren (109). Ein weiteres Zytokin, welches vermutlich ebenso eine Rolle für die Treg vermittelte Suppression spielt und erst kürzlich beschrieben wurde, ist IL-35. Ebi3-/- (eine der beiden Untereinheiten von IL-35) Treg zeigen sowohl in vitro als auch in vivo eine reduzierte Suppression. Interessanterweise ist Ebi3 zudem ein downstream Zielgen von FoxP3, was womöglich die präferentielle Expression von IL-35 in Treg erklären könnte. Ein letzter Mechanismus der Suppression durch regulatorische T-Zellen ist die Kompetition von Treg und Effektorzellen um Wachstumfaktoren. Treg exprimieren die -Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) konstitutiv, hingegen wird diese von Effektor T-Zellen ausschließlich nach TZR Stimulation exprimiert. Da IL-2 ein entscheidender Wachstumfaktor für T-Zellen ist, geht man davon aus, dass das IL-2 durch die konstitutive Expression von CD25 durch Treg besser aufgenommen wird und den Effektorzellen dadurch entzogen wird (110-112). 1.5.2. Das immunsuppressive Zytokin IL-10 Die Bedeutsamkeit von IL-10 für die Aufrechterhaltung einer Immunregulation wurde bereits in zahlreichen Infektionen beschrieben (78-81). In verschiedenen Krankheitsmodellen wurde gezeigt, dass IL-10 die Immunreaktion des Wirtes in Infektionen limitiert und somit die Entzündung und die damit einhergehende Gewebszerstörung begrenzt. Durch Ablation des 19 EINLEITUNG IL-10-Signales kommt es zu einem oftmals fatalen Ausgang der Infektion, durch eine ungehemmte Aktivierung des Immunsystems. Viele der Effekte von IL-10 auf T-Zellen sind indirekt, das heißt, sie sind vermittelt durch die Wirkung von IL-10 auf APZ. IL-10 inhibiert die Reifung von DZ aus Monozytenvorläufern im Knochenmark (113, 114) und führt zur Differenzierung von DZ, die nur geringe Level an MHC-II Molekülen und kostimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 exprimieren (115-117). Die immunsuppressive Wirkung von IL-10 beruht weiterhin auf einer Inhibition der Expression von zahlreichen pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-12, IL-2, IFN- und TNF-(118). IL-10 kann durch die Suppression von APZ die Differenzierung und die Proliferation von TZellen hemmen und hierdurch die Initiierung und die Ausrichtung einer T-Zell-Antwort regulieren. IL-10 wurde ursprünglich als ein von TH2-Zellen produzierter Faktor, der die Differenzierung und Effektorfunktionen von TH1-Zellen inhibiert, beschrieben (119). Im Laufe der letzten Jahre wurde jedoch gezeigt, dass neben TH2-Zellen auch zahlreiche andere Zellen IL-10 produzieren können. Hierzu gehören neben Makrophagen und DZ, auch B-Zellen sowie verschiedene Subpopulationen von CD4+ und CD8+ Effektor-T-Zellen (118, 120). Interessanterweise zeigen die neuesten Veröffentlichungen, dass auch pro-inflammatorische TH1-Zellen selbst, dass immunsuppressive Zytokin exprimieren und sich somit in Infektionen selbst regulieren können (121, 122). Die Mechanismen, die dieser IL-10 Induktion in TH1Zellen zugrunde liegen, waren bisher weitestgehend unbekannt. Wir konnten kürzlich zeigen, dass der Notch-Signalweg IL-10 in TH1-Zellen induziert (123). Im Folgenden soll ein Überblick über den Notch-Signalweg gegeben werden. 1.6. Notch – ein transmembranärer Rezeptor und seine Liganden Notch ist ein transmembranärer Rezeptor, der sowohl in der Embryonalentwicklung als auch im adulten Stadium eine entscheidende Rolle für eine Vielzahl von Differenzierungsprozessen spielt (124, 125). Eine Defizienz der Notch-Rezeptoren Notch-1 und Notch-2, sowie der Liganden Jagged-1, Jagged-2, Delta-like-1 und Delta-like-4 resultiert in embryonaler und perinataler Letaliät und zeigt somit die Bedeutung und Unabkömmlichkeit der NotchRezeptoren und ihrer Liganden für verschiedenste Entwicklungsprozesse. In Vertebraten sind vier verschiedene Notch-Rezeptoren (Notch-1-4) bekannt. Der extrazelluläre Anteil des Notch-Rezeptors besteht hauptsächlich aus EGF (Epidermal growth Factor) ähnlichen repeats, an welche die verschiedenen Liganden binden (126, 127). Außerdem sind in allen vier Rezeptoren nahe des Carboxyl Endes jeweils drei sogenannte 20 EINLEITUNG LIN12/Notch repeats vorhanden, die ein unspezifisches Signal ohne die Bindung eines Liganden verhindern. Der intrazelluläre Anteil des Notch-Rezeptors beinhaltet die für die Signaltransduktion entscheidenden Elemente. Hierzu gehören eine RAM-Domäne und sieben Ankyrin repeats, die die Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor CSL/RBPj- vermitteln. Neben zwei Kernlokalisationssequenzen (NLS) ist eine Transaktivierungsdomäne (TAD) enthalten. Außerdem eine C-terminale PEST (Prolin-, Glutamat-, Serin-, Threonin-reiche) Domäne, die die Proteinstabilität vermittelt. Im Säugetierorganismus wird das Notch-Signal über die Bindung von fünf verschiedenen Notch-Liganden an die Notch-Rezeptoren vermittelt. Es werden zwei verschiedene Familien von Notch-Liganden unterschieden – die Delta-like (Delta-like-1,-3, und -4) und die Jagged-Liganden (Jagged-1, Jagged-2). Die Liganden sind ebenso wie die Rezeptoren Transmembranproteine, deren extrazellulärer Anteil EGF repeats und eine charakteristische Cystein-reiche Region, genannt Delta-Serrate-Lag 2 (DSL) Domäne, enthält. Während die DSL Domäne und die EGF repeats hochkonserviert und in allen Notch-Liganden enthalten sind, besitzen die Jagged Liganden zusätzlich eine Cysteine-reiche Region mit struktureller Ähnlichkeit zum von Willebrand Faktor (VWF). Diese Region ist in den Liganden der Delta-like Familie nicht vorhanden und könnte an den unterschiedlichen biologischen Funktionen beteiligt sein. Bisher ist wenig darüber bekannt, welche Notch-Liganden unter physiologischen Bedingungen welche Notch-Rezeptoren aktivieren und ob es durch verschiedene Rezeptor/Ligand Kombinationen zu unterschiedlichen Signalkaskaden downstream des Rezeptors kommt. Die verschiedenen Notch-Proteine können jedoch im Golgi-Apparat durch die 1,3-N- Acetylglucosaminyltransferase Fringe, welche Zuckermoleküle auf Fucose-Reste an bestimmte EGF repeats bindet, modifiziert werden. So kann die Bindung der verschiedenen Liganden an die Rezeptoren moduliert werden (128, 129). 1.6.1. Der Notch-Signalweg Sowohl die Rezeptoren als auch die Liganden sind zellmembrangebunden. Dementsprechend stellt der Notch-Signalweg ein Mittel der Zell-Zell-Interaktion dar. Funktionell gesehen ist Notch nicht nur ein transmembranärer Rezeptor, sondern gleichzeitig auch ein membrangebundener Transkriptionsfaktor (130). Die Notch-vermittelte Signaltransduktion ist daher direkt und bedarf keiner second messenger. In Abbildung 2 ist schematisch der NotchSignalweg dargestellt. Mit der Bindung des Liganden an den Rezeptor werden zwei Spaltungen initiert, die in der Abspaltung der intrazellulären Untereinheit des Notch-Rezeptors (NIZD) resultieren. 21 EINLEITUNG Zunächst spaltet eine extrazelluläre Metalloprotease (ADAM) den Notch-Rezeptor außerhalb der transmembranären Domäne (131, 132). Die zweite Spaltung, die zur Freisetzung der intrazellulären Domäne führt, wird durch einen -Sekretase Enzymkomplex gespalten (133, 134). Dieser Enzymkomplex enthält neben dem Enzym -Sekretase, die Proteine Presenilin, Nicastrin, APH-1 und PEN-2 (135). Eine Inhibition der -Sekretase oder eine Defizienz in Presenilin oder Nicastrin blockiert den Notch-Signalweg. Nach der Spaltung kommt es, vermittelt durch die zwei Kernlokalisationssequenzen (NLS), zu einer Translokation der NIZD in den Nukleus. Hier bindet NIZD zusammen mit Ko-Faktoren wie Mastermind like Proteinen (MAML) und p300 mithilfe der RAM und Ankyrin repeats an den Transkriptionsfaktor CSL/RBPj- und aktiviert die Transkription verschiedener Zielgene (136). Zu den Zielgenen gehören neben den Mitgliedern der HES-Familie (Hairy/Enhancer of Split) (137), die Gene der Deltex Familie von E3-Ligasen sowie PTCRA (pre-T-cell receptor ) (138, 139). Ebenfalls als Notch-Zielgene beschrieben sind das TH2-Zytokin IL-4, sowie die Transkriptionsfaktoren GATA-3 (140, 141) und T-bet (142). Abbildung 2. Der Notch-Signalweg. Nach der Bindung des Notch-Liganden an den Notch-Rezeptor und der Spaltung der NIZD durch eine ADAM Metalloprotease sowie den -Sekretase Komplex, transloziert die NIZD in den Nukleus. Dort bindet sie zusammen mit Ko-Faktoren wie MAML und p300 an den Transkriptionsfaktor CSL/RBPj- und initiiert die Transkription verschiedener Zielgene. 1.6.2. Die Expression von Notch-Komponenten im Immunsystem Die Expression der verschiedenen Notch-Liganden und -Rezeptoren auf Zellen des peripheren Immunsystems ist in einer Vielzahl von Studien untersucht worden. Obwohl feststeht, dass TZellen Notch-Rezeptoren exprimieren, sind die Ergebnisse bisher widersprüchlich. Zudem 22 EINLEITUNG fehlt bisher eine Untersuchung der Liganden-Expression auf verschiedenen DZ Subpopulationen. Bisher wurde nur gezeigt, dass die Liganden Expression durch mikrobielle Stimuli wie TLR Signale reguliert wird (143, 144). Eine Zusammenfassung der bisherigen Erkenntnisse über die Expression von Notch-Rezeptoren und -Liganden im Immunsystem zeigt die Tabelle 2. Tabelle 2. Expression von Notch-Liganden und Notch-Rezeptoren (adaptiert nach Sascha Rutz) B-Zellen Notch-1 - (145-147) CD4+ T-Zelle + (146, 148-150) CD8+ T-Zelle + (146, 149, 150) DZ - (147) + (146) Notch-2 + (145, 147, 150) + (148, 150) Notch-3 + (148) Notch-4 + (148) Dll-1 - (147, 151) Dll-4 - (147) + (150) - (147) + (147, 152) + (147) - (152) Jag-1 Jag-2 - (147) + (146) + (146) - (147) + (146, 151, 153, 154) + (146, 152) - (147) + (147, 152) 1.6.3. Der Einfluss von Notch auf die T-Zell-Aktivierung Zahlreiche Studien belegen, dass Notch eine Rolle für die T-Zell-Aktivierung spielt. Die Ergebnisse sind jedoch kontrovers. Adler et al. haben gezeigt, dass eine Stimulation des TZR zu einer Verstärkung der Expression aller vier Notch Rezeptoren in CD4+ T-Zellen führt (148). Außerdem wurde nach der Stimulation von T-Zellen eine erhöhte Expression des Notch Zielgenes HES1 beobachtet und intrazellulär die abgespaltene Notch Untereinheit detektiert, was für eine Aktivierung des Notch-Signalweges spricht (148, 152). Es wurde außerdem gezeigt, dass eine pharmakologische Blockade des Notch-Signales in peripheren CD8+ und CD4+ T-Zellen signifikant die Proliferation und IFN- Produktion nach Stimulation des TZR hemmt (155). Eine weitere Studie in CSL/RBPj- defizienten CD4+ T-Zellen zeigt eine verminderte Proliferation nach TZR Stimulation. Weiterhin ist bekannt, dass der Notch Signalweg Teil eines positiven feedback loop ist, der die IL-2 Produktion und die Expression 23 EINLEITUNG von CD25 (der IL2Ra Kette) reguliert. Die Überexpression von intrazellulären Notch Proteinen führte zu einer anhaltenden CD25 Expression von T-Zellen (148). Andererseits zeigen kontroverse Studien, dass naive T-Zellen, die mit immobilisierten NotchLiganden oder stimulierenden Antikörpern behandelt wurden, um Notch-Rezeptoren zu stimulieren, eine verminderte Proliferation aufweisen (156, 157). Zudem konnte in CD4+ TZellen, die defizient für Notch-1 sind, kein negativer Effekt auf die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen gezeigt werden (158). In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der T-Zelle von der Art des Liganden abhängt. Während Jagged-1 und Dll-1 die T-Zell-Aktivierung supprimieren, wirkt Dll-4 stimulierend (159). 1.6.4. Der Einfluss von Notch auf die T-Zell-Differenzierung Die Rolle des Notch-Signalweges für die Differenzierung von TH-Zellen wurde in zahlreichen Publikationen gezeigt. Sowohl eine Beteiligung an der TH1- und TH2-Differenzierung als auch eine Induktion regulatorischer T-Zellen ist beschrieben. 1.6.4.1. Regulation der TH1-Differenzierung Die Notch-vermittelte Differenzierung von naiven TH-Zellen in TH1-Zellen wurde in zahlreichen Studien untersucht. Gezeigt wurde, dass eine Expression des Liganden Dll-1 und dessen Interaktion mit Notch-3 die Induktion von TH1-Zellen fördern (157). Insbesondere wurde hier gezeigt, dass ein Dll-1Fc Fusionsprotein eine starke IFN- Produktion in CD4+ TZellen induziert und zudem der Transkriptionsfaktor T-bet in diesen Zellen erhöht ist (157). Außerdem zeigte sich nach in vivo Applikation des Dll-1Fc Fusionproteins eine robuste TH1Antwort auf eine Infektion mit Leishmania major in Balb/c Mäusen, die sonst hierzu nicht in der Lage sind. Hingegen führte die Gabe eines „mutierten“ Dll-1Fc Proteins in C57Bl/6 Mäusen, die normalerweise eine robuste TH1-Antwort gegen Leishmania major entwickeln, zu einer Verstärkung der Erkrankung (157). Eine weitere Studie zeigt, dass auch die retrovirale Überexpression von Notch-1 oder Notch-3 in naiven T-Zellen, unabhängig von der Anwesenheit des TH1-polarisierenden Zytokins IL-12, TH1 Zellen und eine Expression von Tbet induziert (142, 157). Die molekularen Mechanismen, die dieser Notch-vermittelten TH1-Induktion zugrunde liegen, sind jedoch bisher nicht eindeutig identifiziert worden. Es wird vermutet, dass die durch DllProteine induzierte Notch-Aktivierung, die IL-4 Rezeptor Signalkaskade inhibiert und somit eine TH1-Polarisierung favorisiert (160). Außerdem wurde gezeigt, dass Notch die Transkription von Tbx21 aktiviert, ein Gen, das für den TH1-spezifischen Transkriptionsfaktor 24 EINLEITUNG T-bet kodiert (142). Zahlreiche potentielle RBPj- Bindungsstellen wurden aufwärts vom transkriptionellen Startpunkt des Tbx21 Genes entdeckt (142). Zudem wurde gezeigt, dass Notch mit dem Transkriptionsfaktor Nuklear Faktor B (NF-B) interagiert (161). NotchProteine können so die Expression der NF-B Gene in verschiedenen Zelltypen aktivieren und dadurch die Transkription von pro-inflammatorischen Zytokinen induzieren (162, 163). Zudem können Notch Proteine den IB Kinase Komplex stimulieren, der wiederum NF-B aktiviert (164-166). Notch kann außerdem durch direkte Bindung an p50 und p60 die Aktivität von NF-B in T-Zellen verlängern und obwohl keine potentiellen Bindungsstellen von RBPj- im IFN- Promoter vorhanden sind, kann Notch durch die Interaktion mit den Proteinen p50 und p60 mit dem IFN- Promoter interagieren (167). Allerdings ist die Verbindung zwischen NF-B und der TH1-Differenzierung durch Notch umstritten. Andere Studien zeigen hingegen, dass die Interaktion von Notch und NF-B die TH2-Differenzierung induzieren kann. 1.6.4.2. Regulation der TH2-Differenzierung Zahlreiche Studien belegen eine Relevanz des Notch-Signalweges für die TH2Differenzierung. Gezeigt wurde, dass die Expression aller vier verschiedenen intrazellulären Notch-Proteine in T-Zellen in einer starken TH2-Polarisierung resultiert (140, 141, 144). Bei Defizienz des Transkriptionsfaktors RBPj- ist keine TH2-Polarisierung mehr nach Stimulation mit parasitären Antigenen möglich (140, 141, 168). Außerdem ist keine TH2Antwort mehr induzierbar, wenn Notch-1 und -2 deletiert sind (141). Mäuse, die eine dominant negative Form des mit Notch interagierenden Transkriptionsfaktors Mastermind-1 exprimieren, entwickeln eine normale TH1-Antwort auf eine Infektion mit Leishmania major, hingegen sind sie nicht in der Lage, eine Wurminfektion mit dem intestinalen Parasiten Trichuris muris zu bekämpfen, weil dies eine robuste TH2-Antwort erfordert (168). Auch die Mechanismen, die die TH2-Differenzierung durch Notch induzieren, sind bisher nicht eindeutig geklärt. Bekannt ist, dass die Expression von Liganden der Jagged Familie durch APZ TH2-Zellen induziert. Die Stimulation von DZ mit mikrobiellen Produkten (beispielsweise Schistosoma mansoni egg antigen, SEA oder Vibrio cholerae Toxin), mit Allergenen (Hausstaubmilbenextrakt) oder mit pro-inflammatorischen Mediatoren (wie ProstaglandinE2) führt zur Induktion des Liganden Jagged-2 auf DZ (169, 170). Hingegen werden Liganden der Dll-Familie durch TH2-Stimuli auf DZ nicht exprimiert (171). Ein Jagged Fc Fusions Protein kann eine TH2-Antwort im Mausmodel der Multiplen Sklerose induzieren (172). Zudem inhibiert eine verminderte Expression des Liganden Jagged-1 die 25 EINLEITUNG Induktion von TH2-Zellen durch humane mDZ (173) und eine Jagged-2 Defizienz reduziert die TH2-Differenzierung durch DZ, die mit SEA stimuliert wurden. Kontrovers hingegen sind wiederum die Studien, die zeigen, daß eine verminderte Expression von Jagged-2 die TH2Differenzierung nicht beeinflusst (171). Die Erkenntnis, dass eine TH2-Differenzierung abhängig von der Anwesenheit des Transkriptionsfaktors RBPj- ist, legt nahe, dass Notch diesen Prozess durch Aktivierung von TH2-Zielgenen induziert. Zwei Zielgene wurden hierfür identifiziert. Sowohl IL-4 als auch GATA-3 sind als Notch und RBPj- Zielgene beschrieben. Der 3`Enhancer von IL-4, bekannt als HS5 und CNS2, beinhaltet zahlreiche RBPj- Bindungsstellen. Es wurde gezeigt, dass sowohl Notch-1 als auch RBPj- an HS5 in CD4+ T-Zellen binden können (140). Auch innerhalb des GATA-3 Promoters befinden sich Bindungsstellen für RBPj-. Es wurde gezeigt, dass sowohl Notch als auch RBPj- an diese Bindungsstelle binden und die Expression von GATA-3 induzieren (140, 141). Kontrovers ist wiederum eine Studie, die Mäuse verwendet, in denen Notch-1 konditionell aus CD4+ T-Zellen deletiert ist. Die Daten dieser Experimente implizieren, dass Notch weder für TH1- noch für TH2-Differenzierung in vitro, noch für TH1-Differenzierung in vivo benötigt wird (174). Diese Studie ging jedoch nicht auf die Tatsache ein, dass Notch-Rezeptoren redundant sein können. 1.6.4.3. Induktion von regulatorischen T-Zellen Es gibt zahlreiche Publikationen, die sich mit der Frage beschäftigen, ob Notch eine Rolle für die Suppression einer Immunantwort spielt. Es wurde gezeigt, dass humane CD4+CD25+ Treg einen hohen Anteil an Notch-4 mRNA, murine CD4+CD25+ Treg hingegen Notch-3 mRNA exprimieren (175). Blockiert man Notch-1 mit einem Antikörper in vivo oder inhibiert den Notch Signalweg mit einem -Sekretase-Inhibitor, so ist die Fähigkeit der Suppression durch Treg in einem Asthma Modell beeinträchtigt (176). Die potentielle Bedeutung von Notch für eine Immunsuppression wird unterstützt durch die Entdeckung, dass Mäuse, die eine reduzierte Expression von Presenilin besitzen oder in denen der Notch-Signalweg durch Sekretase-Inhibitor blockiert ist, Zeichen einer Autoimmunerkrankung aufweisen (177, 178). Auch die Rolle der individuellen Liganden für die Immunsuppression wurde in verschiedenen Studien adressiert. Es wurde gezeigt, dass eine Überexpression des Notch Liganden Jagged-1 in einer B-Zell-Linie die Differenzierung von CD4+ T-Zellen mit einer suppressiven Aktivität in vitro induziert. Die hier beobachtete Suppression korrelierte mit der Produktion der antiinflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-(179, 180). In einer anderen Studie wurde 26 EINLEITUNG gezeigt, dass DZ, die Jagged-1 überexprimieren, T-Zell-Toleranz in vivo induzierten. Diese Toleranz konnte durch adoptiven Transfer auf Wildtyp-Mäuse übertragen werden (146). Zudem induzierte eine endogene Expression von Jagged-2 durch hämatopoetische Vorläuferzellen Treg in vivo (181). Jedoch auch durch Liganden der Dll-Familie können Zellen mit regulatorischem Potential induziert werden (182). Eine Studie zeigt, dass die Expression von Dll-1 in Mäusen, die eine tolerogene intranasale Peptid-Applikation erhalten haben, verstärkt ist (183). Ein über Dll-1 vermitteltes Signal schien verantwortlich für die Toleranzinduktion zu sein. Später wurden erhöhte Zahlen von Dll-1 Transkripten in natürlich vorkommenden humanen CD4+CD25+ Treg Zellen nach einer Stimulation mit CD3 und CD28 beschrieben (184). In einem Mausmodell von Allotransplantatabstoßung wurde gezeigt, dass eine konstitutive Expression von Dll-1 durch APZ eine immunogene Antwort verhindert und so signifikant das Überleben des Transplantates verlängert. Diese Immunantwort war gekennzeichnet durch eine gesteigerte IL-10 Induktion und eine regulatorische CD8+ Population (182). Zudem ist bekannt, dass die IL-10 Induktion in T-Zellen nach Blockade des Notch Signalweges durch einen -Sekretase Inhibitor stark reduziert ist (185). 1.6.4.4 Notch als Modulator der TH-Zell-Differenzierung Dass der Notch-Signalweg eine Rolle für die Differenzierung von naiven T-Zellen in verschiedene Populationen von TH-Zellen spielt, ist bereits vielfach beschrieben worden. Sowohl eine TH1- und TH2-Differenzierung als auch eine Induktion von regulatorischen TZellen sind bekannt (142, 146, 157, 168, 186, 187). Das Bild der Notch-vermittelten THelfer-Zell-Differenzierung wird jedoch noch komplexer durch erst kürzlich veröffentlichte Arbeiten der eigenen Arbeitsgruppe. Hier wurde gezeigt, dass Notch pro-inflammtorische TH1-Zellen so modulieren kann, dass diese Zellen neben IFN-das immunsuppressive Zytokin IL-10 exprimieren (123). Diese Arbeit zeigt, dass durch eine Transfektion von TZellen mit einem Notch-Expressionsplasmid in vitro IL-10 in diesen Zellen induziert werden kann. Diese IL-10 Induktion ist sowohl in naiven als auch in bereits etablierten T-Zellen möglich, dieser Effekt benötigt jedoch die Aktivierung von STAT4 durch die proinflammatorischen Zytokine IL-12 oder IL-27 (123). Interessanterweise verlieren diese Notch modifizierten TH1-Zellen ihr pro-inflammatorisches Potential in vivo in einem Modell einer akuten Entzündung und wirken in diesem Modell sogar suppressiv (123). Der in dieser Publikation beschriebene Effekt der Notch-vermittelten IL-10 Induktion in TH1Zellen ist insofern interessant für weitere Untersuchungen, als dass IL-10 ein 27 EINLEITUNG „Schlüsselzytokin“ in der Suppression und Kontrolle von pro-inflammatorischen Immunantworten darstellt (78-80). Insbesondere das von TH1-Zellen ko-exprimierte IL-10 gilt als entscheidend für die Vemeidung einer Immunpathologie in Infektionen mit den Pathogenen Toxoplasma gondii (121) oder Leishmania major (122). Die Mechanismen, die dieser IL-10 Induktion in TH1-Zellen zugrunde liegen, sind jedoch weitestgehend unbekannt. Daher ist eine Untersuchung der bisher ausschließlich in vitro untersuchten Modulation von TH1-Zellen durch den Notch-Signalweg auch in vivo durchaus interessant. 28 2. Zielsetzung ZIELSETZUNG TH1-Zellen können neben dem pro-inflammatorischen Zytokin IFN- auch das immunsuppressive Zytokin IL-10 exprimieren, was zur der Selbstregulation und Begrenzung der TH1-Immunreaktion dient. Die molekularen Mechanismen, die dieser Selbstregulation zugrunde liegen, sind jedoch bisher wenig verstanden. Wir konnten in in vitro Vorarbeiten zeigen, dass der Notch-Signalweg die IL-10 Produktion von TH1-Zellen reguliert, indem er die Reaktion der T-Zelle auf pro-inflammatorische Zytokine wie IL-12 und IL-27 moduliert. Die durch Notch bewirkte Umwandlung pro-inflammatorischer T-Zellen in suppressorische T-Zellen könnte demnach ein wichtiger Mechanismus zur Selbstlimitierung von starken TH1Immunantworten sein. Der Hauptfokus der vorliegenden Arbeit lag nun auf der Untersuchung der Notch-vermittelten IL-10 Induktion in TH1-Zellen Zellen in vivo. Insbesondere wurde die Fragestellung adressiert, in welchen Situationen die Notch-induzierte IL-10 Produktion in vivo stattfindet und welche Notch-Liganden die IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo vermitteln. Darüber hinaus wurde untersucht, welche APZ als Induktoren von IL-10 produzierenden TH1-Zellen in Frage kommen. Die Untersuchungen dieser Arbeit sollen helfen zu verstehen, unter welchen Umständen es in vivo in TH1-Zellen zur Induktion eines regulatorischen Phänotyps durch Notch kommt, welche Mechanismen der Selbstregulation von TH1-Zellen in vivo zugrunde liegen und wie diese für immunmodulatorische Ansätze therapeutisch genutzt werden können. 30 MATERIAL & METHODEN 3. Material & Methoden MATERIAL & METHODEN 3. MATERIAL & METHODEN 3.1. Medien und Puffer Tabelle 3. Medien und Puffer RPMI 1640 Medium Invitrogen/Life Technologies Penicillin 100 U/ml PAA Laboratories FCS 10% Sigma 2-Mercaptoethanol 50µM Invitrogen/Life Technologies Streptomycin 100g/ml PAA Laboratories NaCl 137 mM Merck KCl 2,7 mM Merck KH2PO4 1,5 mM Merck Na2HPO4 x 2 H2O 8,0 mM Merck 0,5% (w/v) PAA Laboratories 0,02% (w/v) Merck KHCO3 0,01 M Merck NH4Cl 0,155 M Merck EDTA 0,1 mM Sigma 0,5 g Sigma 27 ml Merck PBS; pH 7,2 PBS/BSA; pH 7,2 PBS bovine serum albumin frV (BSA) PBS/BSA/Azid; pH 7,2 PBS/BSA NaN3 Erythrozyten Lysis Puffer Saponin 0,5% (w/v) Saponin ad 100 ml PBS/BSA/Azid Formaldehyd 2% Formaldehyd 37% ad 500 ml PBS 32 MATERIAL & METHODEN 3.2. Chemikalien und Reagentien Tabelle 4. Chemikalien und Reagentien Quelle Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Sigma Ionomyzin Sigma Ovalbumin (OVA) Sigma Peptid OVA323−339 AG Mol.Bibliotheken, Charité Brefeldin A Sigma Propidium Iodid (PI) Roth Carboxy-Fluoreszein-Diacetat-Siccinimidester (CFDA-SE) Molecular Probes Kollagenase Typ 4 Sigma DNAseI Sigma DBZ Syncom Methocel 60HG Sigma Tween80 Sigma Isofluran Baxter Ratten IgG2b BioXCell Hamster IgG NatuTec GmbH aBiotin Microbeads Miltenyi Biotec CD62L Microbeads Miltenyi Biotec CD11c Microbeads Miltenyi Biotec FITC MultiSort Kit Miltenyi Biotec Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotec Faser-Kit PE/APC Miltenyi Biotec 33 MATERIAL & METHODEN 3.3. Antikörper 3.3.1. für Fluoreszenzmarkierung zum durchflusszytometrischen Nachweis Tabelle 5. Antikörper für Fluoreszenzmarkierung Spezifität Klon Fluorochrom Quelle CD4 RM4-5 Pacific Blue/PERCP BD Biosciences CD11c HL3 FITC/PE-CY7 BD Biosciences CD11b M1/70 Alexa700 BD Biosciences CD19 1D3 APC BD Biosciences CD23 B3B4 PE BD Biosciences CD21 7G6 FITC BD Biosciences CD62L MEL-14 PE BD Biosciences B220 RA3-6B2 Pacific Blue/APC BD Biosciences OVA-TZR KJ1.26 Biotin/CY5 BD Biosciences OVA-TZR KJ1.26 PE DRFZ PDCA-1 JF05-1C2.4.1 FITC/PE Miltenyi Biotec Ly6c 1G7.G10 Biotin/PE Miltenyi Biotec Jag-1 HMJ1-29 Biotin H.Yagita, Japan Jag-2 HMJ2-1 Biotin H.Yagita, Japan Dll-1 HMD1-5 Biotin H.Yagita, Japan Dll-4 (188) Biotin Genentech, USA Fc R II/III 2.4G2/75 - DRFZ IFN- XMG1.2. PE-CY7 BD Biosciences IFN- AN18.17.23 FITC/PE/APC BD Biosciences IL-2 JES6-5H4 PE BD Biosciences IL-4 11B11 PE BD Biosciences IL-10 JES5-16E3 PE/APC BD Biosciences IL-10 JES5-16E3 PE Ebiosciences IL-17 TC11-18H10 PE BD Biosciences Streptavidin (sek.Antikörper) PE/APC BD Biosciences V5 TZR MR9-4 PE BD Biosciences V2 TZR B20.1. Biotin BD Biosciences 34 MATERIAL & METHODEN 3.3.2. für die Blockade von Zytokinen Tabelle 6. Antikörper für die Blockade von Zytokinen Spezifität Klon IL-4 11.B.11 Quelle DRFZ 3.3.3. für die in vivo Anwendung Tabelle 7. Antikörper für die in vivo Anwendung Spezifität Klon Quelle PDCA-1 JF05-1C2.4.1 Miltenyi Biotec Jag-1 HMJ1-29 H.Yagita, Japan Jag-2 HMJ2-1 H.Yagita, Japan Dll-1 HMD1-5 H.Yagita, Japan Dll-4 (188) Genentech, USA 3.4. Rekombinante Zytokine Tabelle 8. Rekombinante Zytokine Zytokin rIL-12 Konzentration 10 ng/ml Quelle R&D Systems 3.5. TLR-Stimuli Tabelle 9. Verwendete TLR-Stimuli Stimulus Quelle LPS (E.coli) Sigma Aldrich CpG (ODN1826) Tib Molbiol, Berlin Poly I:C Invivogen Flagellin Invivogen Imiquimod Invivogen Zymosan Invivogen 35 MATERIAL & METHODEN 3.6. Mäuse Die Mäuse der Inzuchtstämme Balb/c und C57Bl/6 wurden unter pathogenfreien Bedingungen (spf - specific pathogen free) in der Versuchstierzucht des Bundesinstitutes für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) in Berlin Marienfelde gezüchtet und gehalten. Es wurden männliche und weibliche Tiere im Alter zwischen 6-12 Wochen verwendet. Darüber hinaus wurden die in Tabelle 10 gelisteten knockout- und transgenen Mausstämme verwendet. Tabelle 10. Verwendete Mausstämme Bezeichnung Phänotyp Quelle DO11.10 exprimieren transgenen TZR spezifisch für DRFZ das Peptid OVA323−339 (Balb/c Hintergrund) OT-II exprimieren transgenen TZR spezifisch für DRFZ das Peptid OVA323−339 (C57Bl/6 Hintergrund) ICOS JHT -/- defizient für ICOS RKI, A. Hutloff defizient für B-Zellen DRFZ 3.7. Zellpräparationen 3.7.1. Isolierung von Lymphozyten aus Milz- und Lymphknoten Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und mittels zervikaler Dislokation getötet. Anschließend wurden die Milz sowie die axillären-, mandibulären-, brachialen, inguinalen und mesenterialen Lymphknoten entnommen. Mithilfe eines Zellsiebes der Maschenweite 70 μm wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt. Nach einem Waschschritt in PBS/BSA und einer Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Erythrozyten in einem hypotonischen Erythrozyten-Lysepuffer lysiert (3 min, 1 mL/Milz). Anschließend wurden die Zellen in PBS/BSA gewaschen und verbleibende Zellaggregate mit Hilfe eines weiteren Nylonsiebs (70 μm Porengröße) entfernt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen in PBS/BSA aufgenommen und standen zur weiteren Verwendung zur Verfügung. Alle Schritte wurden auf Eis durchgeführt. 3.7.2 Isolierung von dendritischen Zellen aus Milz und Lymphknoten Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Milz und 36 Lymphknoten (axilläre-, mandibuläre-, brachiale, inguinale und mesenteriale MATERIAL & METHODEN Lymphknoten) wurden entnommen, mit einer Schere zerkleinert und in serumfreies RPMI Medium, welches Collagenase Typ 4 (1 mg/ml; Sigma) und DNAse I (0,5 mg/ml; Sigma) enthielt, überführt und für 20 min im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Organsuspension über ein Zellsieb der Maschenweite von 70 μm weiter zerkleinert und homogenisiert. Nach einem Waschschritt mit PBS/BSA wurden die Zellen zentrifugiert (300x g, 4°C, 10 min) und die Erythrozyten in hypotonischem Erythrozyten-Lysepuffer (3 min, 1ml/Milz) lysiert. Nach einem weiteren Waschschritt in PBS/BSA und der Entfernung der verbliebenen Zellaggregate durch ein Nylonsieb mit der Maschenweite 70 µm, wurden die Zellen zentrifugiert (300x g, 4°C, 10 min), in PBS/BSA aufgenommen und standen zur weiteren Verwendung zur Verfügung. 3.8. Magnetische Zellsortierung (MACS) 3.8.1. Prinzip der magnetischen Zellsortierung Die magnetische Zellsortierung (MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) basiert auf der Markierung von Zellen mit Hilfe von magnetischen Partikeln (microbeads) und ermöglicht die Isolierung einer definierten Zellpopulation aus einem Gemisch verschiedenster Zellen. Die magnetischen Partikel haben einen Durchmesser von 20-100 nm und sind an einen monoklonalen Antikörper gegen die Oberflächenstruktur eines bestimmten Zelltyps gekoppelt. Die Zellen, die die entsprechende Zielstruktur auf der Oberfläche tragen, werden über eine Antigen/Antikörper Reaktion immunologisch markiert und erhalten durch die Partikel magnetische Eigenschaften. Die magnetisch markierten Zellen durchlaufen nun eine Säule, die sich in einem starken magnetischen Feld befindet. Aufgrund von magnetischen Wechselwirkungen binden die markierten Zellen an die Säulenmatrix, hingegen die restlichen, nicht magnetischen Zellen in mehreren Waschschritten durch die Säule hindurchlaufen. Wird die Säule aus dem Magnetfeld entfernt, ist es im Folgenden möglich die markierten Zellen von der Säule zu eluieren. So erhält man bei diesem Verfahren eine magnetisch markierte, positive und eine nicht magnetische, negative Fraktion. In der Regel werden bei der MACS Sortierung Reinheiten zwischen 95% und 99% erreicht. 3.8.2. Anreicherung naiver Lymphozyten für den adoptiven Transfer Beim adoptiven Transfer (nähere Erläuterungen hierzu finden sich unter 3.12.1.) wurden OVA-TZR transgene Zellen in kongene Balb/c Mäuse transferiert. Um T-Zellen bei der anschließenden Analyse auszuschließen, die bereits Antigenkontakt hatten, wurden die 37 MATERIAL & METHODEN transgenen Zellen vor dem Transfer naiv sortiert. Hierfür benutzt man das Oberflächenmolekül CD62L (L-Selectin). CD62L wird von naiven T- und B-Lymphozyten exprimiert und ist ein Adhäsionsmolekül, welches für den Eintritt der naiven Lymphozyten in den Lymphknoten durch die High Endothelial Venules (HEV) notwendig ist. Mit der Sortierung der transgenen Zellen auf den Marker CD62L ist gesichert, dass ausschließlich naive Zellen transferiert werden, die erstmals Antigenkontakt im Rezipienten haben werden. DO11.10 Mäuse, deren T-Zellen einen für das Peptid OVA323−339 spezifischen, transgenen TZR exprimieren, wurden mit Isofluran betäubt und mittels zervikaler Dislokation getötet. Anschließend wurden die Milz sowie die axillären-, mandibulären-, brachialen, inguinalen und mesenterialen Lymphknoten entnommen und eine Einzelzellsuspension wie in 3.7.1. beschrieben hergestellt. Anschließend wurden die Zellen mit CD62L Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) markiert und durch magnetische Zellsortierung isoliert. Die Reinheit der isolierten Zellen lag routinemässig bei über 95%. Die Zellen wurden nach der Sortierung zentrifugiert (300x g, 4°C, 10 min), in PBS aufgenommen und für den Transfer in naive Balb/c Mäuse benutzt. 3.8.3. Anreicherung naiver CD4+ T-Lymphozyten für die in vitro Kultivierung Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und mittels zervikaler Dislokation getötet. Die Milz und Lymphknoten (axilläre-, mandibuläre-, brachiale, inguinale und mesenteriale Lymphknoten) wurden entnommen und wie in 3.7.1. eine Einzelzellsuspension hergestellt. Im Folgenden wurden die Milz- und Lymphknotenzellen mit CD4-FITC (BD Biosciences, CTR3) für 15 min auf Eis gefärbt. Nach einem Waschschritt mit PBS/BSA und einer Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen mit -FITC-Multisort-Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte erneut ein Waschschritt in PBS/BSA und eine Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min). Die Zellen wurden in PBS/BSA aufgenommen und über eine Magnetsäule gegeben. Nach zwei Waschschritten wurde die Säule aus dem Magnetfeld entnommen und die Zellen mit PBS/BSA eluiert. Die Reinheit der so angereicherten CD4+ Zellen betrug routinemäßig >99%. Im Folgenden sollten die CD4+ Zellen auf die Expression des Oberflächenmarkers CD62L sortiert werden. Hier ist der Vorteil einer Sortierung mit Multisort-Microbeads, dass man die Magnetpartikel nach der Sortierung wieder entfernen kann, so dass man die sortierten CD4+ positiven Zellen anschließend erneut magnetisch sortieren kann. Die -FITC-MultisortMicrobeads wurden daher nun mit Hilfe des MACS Multisort Release Reagent (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) entfernt. Hierfür wurden die Zellen in PBS/BSA aufgenommen 38 MATERIAL & METHODEN und 30 min bei 4°C mit MACS Multisort Release Reagent (Miltenyi Biotec, BergischGladbach) inkubiert. Nach einem Waschritt in PBS/BSA und einer Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurden die CD4+ T-Zellen mit CD62L Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) markiert und erneut mittels der magnetischen Zellsortierung sortiert. Die Reinheit der CD4+CD62L+ T-Zellen wurde stets durchflusszytometrisch überprüft und betrug in der Regel >98%. Diese Zellen wurden für Ko-Kulturexperimente mit verschiedenen APZ Populationen verwendet. 3.8.4. Anreicherung von Antigenpräsentierenden Zellen Zunächst erfolgte eine Isolierung der dendritischen Zellen aus Milz und Lymphknoten naiver Mäuse wie in 3.7.2. beschrieben. Die Einzelzellsuspension wurde im Folgenden in PBS/BSA aufgenommen und mit CD11c Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS/BSA und einer Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurde die Zellsuspension in PBS/BSA aufgenommen und über zwei Säulen aufgereinigt. Die Reinheit der CD11c+ Zellen betrug in der Regel >90%. Für die Sortierung in die Subpopulationen CD11c+CD11b+ und CD11c+CD11b- wurden die Zellen mithilfe des FACS weiter sortiert. Für die Isolierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDZ) erfolgte zunächst die Herstellung einer Einzelzellsuspension aus Milz und Lymphknoten wie in 3.7.1. beschrieben. Im Folgenden wurde der Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) benutzt, um pDZ aus dem Zellgemisch zu isolieren. Hierfür wurde die Einzelzellsuspension in PBS/BSA aufgenommen und mit einem Mix aus biotinylierten Antikörpern sämtliche andere Zellpopulationen außer den pDZ über ihre Oberflächenmoleküle immunologisch markiert. Die Markierung erfolgt über eine Inkubation der Zellsuspension mit Plasmacytoid Dendritic Cell Biotin Cocktail (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) für 10 min bei 4°C. Nach einem Waschschritt in PBS/BSA und einer Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen in PBS/BSA aufgenommen und mit Biotin-Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) für 10 min bei 4°C inkubiert. Nach einem erneuten Waschritt in PBS/BSA und anschließender Zentrifugation (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen über eine Säule gegeben. Die negative Fraktion, das heißt die die Säule durchlaufene Zellsuspension, enthält die vorangereicherten pDZ. Alle übrigen Zellpopulationen verbleiben aufgrund der Kopplung an die magnetischen Partikel an der Säule. Bei diesem Verfahren wurde durchschnittlich eine Reinheit von etwa 80% erreicht. Daher wurden die pDZ im Folgenden mithilfe des FACS weiter sortiert. 39 MATERIAL & METHODEN 3.9. Durchflusszytometrie 3.9.1. Prinzip der Durchflusszytometrie In dem in dieser Arbeit verwendeten Durchflusszytometer können Zellen anhand ihrer Größe, der Granularität und ihrer Oberflächenmarker auf Einzelzellebene charakterisiert werden. Hierfür passieren die Zellen in einem Flüssigkeitsstrahl mehrere Laserstrahle. Hierdurch werden zum einen Fluorochrome zur Fluoreszenz angeregt, zum anderen wird das auftreffende Licht gestreut. Die Streulicht- und Fluoreszenzsignale werden mittels eines optischen Systems auf Detektoren geleitet und in elektrische Impulse umgewandelt. Die Messdaten werden an einen Computer übertragen und gespeichert. Beim Streulicht unterscheidet man das Vorwärts- und das Seitwärtsstreulicht. Das Vorwärtsstreulicht wird nahezu im gleichen Winkel (5-10°) wie das auftreffende Licht gemessen und kennzeichnet die Größe der Zelle. Das Seitwärtsstreulicht hingegen wird in einem Winkel von 90° gemessen. Hierdurch kann man Aussagen über die Granularität der Zelle machen. Trägt man beide Eigenschaften (Zellgröße/Granularität) gegeneinander auf, so ist eine Darstellung verschiedener Zellpopulationen möglich. Neben der Streuung des Lichtes können durch Laserstrahlen Fluorochrome zur Fluoreszenz angeregt werden. Mithilfe von an Fluorochrome gekoppelten Antikörpern ist es daher möglich, Zytokine und Oberflächenmoleküle von Einzelzellen zu charakterisieren. Durchläuft die mit dem Antikörper-Fluorochrom-Konjugat gekoppelte Zelle den Laserstrahl, wird das Fluorochrom zur Fluoreszenz angeregt. Durch Laser verschiedener Wellenlängen sowie durch verschiedene Detektionsfilter lässt sich in verschiedenen Kanälen emittiertes Fluoreszenzlicht aufnehmen und so gleichzeitig bis zu 18 verschiedene Eigenschaften einer Zelle analysieren. Das in dieser Arbeit verwendete Durchflusszytometer LSRII (Becton Dickinson) verfügt über vier Laser mit verschiedenen Wellenlängen: 488nm (blau), 633nm (rot), 405nm (violett) und 305nm (UV). Folgende Fluorochrome wurden in dieser Arbeit verwendet: Tabelle 11. Verwendete Fluorochrome Fluorochrom Anregung Emission FITC 488 nm 530 nm PE 488 nm 585 nm PERCP 488 nm 678 nm PI 488 nm 650 nm PE-Cy7 488 nm 785 nm 40 MATERIAL & METHODEN APC/Cy5 635 nm 661 nm Pacific Blue 405 nm 450 nm Alexa700 635 nm 720 nm Eine genauere Beschreibung der Prinzipien der Durchflusszytometrie findet sich bei RADBRUCH (189). Die durchflusszytometrische Analyse in dieser Arbeit wurde an einem LSRII (Becton Dickinson) durchgeführt. Die aufgenommenen Daten wurden mit dem Programm FlowJo ausgewertet (Tree Star Inc.). 3.9.2. Fluoreszenzmarkierung von Oberflächenmolekülen Für die durchflusszytometrische Analyse müssen die Moleküle auf der Zelloberfläche fluoreszent markiert sein. Hierfür wurden sogenannte Antikörper-Fluorochrom-Konjugate verwendet. Hierbei bindet der Antikörper an das Oberflächenmolekül und das an den Antikörper gekoppelte Fluorochrom liefert bei Anregung durch Licht einer bestimmten Wellenlänge das Fluoreszenzsignal. Für einen Färbeansatz wurden 1x106-1x107 Zellen zunächst durch eine Zentrifugation bei 300x g für 10 min und 4°C pelletiert. Im Folgenden wurden die Zellen für 10 Minuten mit Fc–Rezeptor in PBS/BSA inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Anschließend wurde die Zellsuspension für 10 min bei 4°C mit einer optimalen Konzentration an Antikörpern inkubiert. Sofern es sich beim Primärantikörper um ein biotinyliertes Konjugat handelte, wurde in einem weiteren Färbeschritt noch mit Streptavidin-konjugierten Fluorochromen gefärbt. Zwischen den Färbeschritten beziehungsweise nach der Färbung schloss sich ein Waschschritt in PBS/BSA an. Nach einer Zentrifugation der gefärbten Zellen (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen in 300-500µl PBS/BSA aufgenommen und im Durchflusszytometer gemessen. Unmittelbar vor der Färbung wurde 1 µg/ml Propidiumjodid (PI) zu den Zellen gegeben. Dieser nukleinsäurespezifische Farbstoff färbt spezifisch tote Zellen, die so aus der Analyse ausgeschlossen werden können. Dies ist unbedingt notwendig, da tote Zellen unspezifisch die Antikörper-Konjugate binden können und so bei der Analyse ein falsch positives Signal liefern. 3.9.3. Verstärkung des Fluoreszenzsignals mittels FASER-Kit Für Oberflächenmoleküle, die nur sehr gering exprimiert sind, bietet sich die Verstärkung des Fluoreszenzsignales mittels des FASER-Amplifikationssystems (Miltenyi Biotec, BergischGladbach) an. Hierbei werden die Zellen mit einem biotinylierten Primärantikörper gegen das 41 MATERIAL & METHODEN Oberflächenmolekül von Interesse gefärbt. Im Folgenden schließt sich eine abwechselnde Inkubation mit einem fluorochromkonjugierten Biotin Antikörper (Activator) und einem Fluorochrom-Antikörper (Enhancer) an. Für den Nachweis der schwach exprimierten Notch-Liganden auf den verschiedenen APZ Populationen wurde das FASER System entsprechend des Protokolls des Herstellers verwendet. Hierfür wurden die Zellen mit einem biotinylierten Primärantikörper markiert. Hieran schlossen sich wiederholte Zyklen einer Inkubation mit dem Fluoreszenz-Aktivator, anschließendem Waschen in PBS/BSA, der Inkubation mit dem Fluoreszenz-Enhancer und einem erneuten Waschschritt in PBS/BSA an. In der Regel wurden zwei Amplifikationszyklen durchgeführt. 3.9.4. Intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung Für eine Färbung der intrazellulär fixierten Zytokin, muss die Zellmembran durch das Detergenz Saponin (0,5% Saponin in PBS/BSA/Azid) permeabilisiert werden. Daher wurden sowohl die Färbung mit Antikörper als auch die Waschschritte in Saponin vorgenommen. Der geeignete Verdünnungsfaktor der Antikörper wurde vor der erstmaligen Verwendung austitriert. Für einen Färbeansatz wurden etwa 1x106-1x107 Zellen verwendet. Zunächst wurden die Zellen für 10 Minuten mit Fc–Rezeptor in Saponin inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Anschließend wurde die Zellsuspension für 20 min bei 4°C mit einer optimalen Konzentration an Antikörpern in Saponin inkubiert. Der Färbung schloss sich ein Waschschritt in Saponin an. Nach einer Zentrifugation der gefärbten Zellen (300x g, 4°C, 10 min) wurden die Zellen in 300-500µl PBS/BSA aufgenommen und im Durchflusszytometer analysiert. 3.9.5. CFDA-SE Markierung Um die Proliferation von naiven T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden die CD62L+ TZellen für die Vakzinierung mit antigenbeladenen DZ mit dem Farbstoff CFDA-SE (Carboxy-Fluorescein-Diacetat-Succinimidylester; Sigma) gefärbt. Dieser Farbstoff verbindet sich mit den Proteinen der Zellen. Die Färbung ist auch nach der Teilung der Zelle noch vorhanden, allerdings wird die Intensität der Färbung auf die Tochterzellen gleichermaßen verteilt, so dass ein Bandenmuster entsteht, das die einzelnen Zellgenerationen darstellt. Zur Markierung der naiven T-Zellen mit CFDA-SE wurden die Zellen zunächst mit PBS gewaschen, um die Proteine des Puffers zu entfernen. Dann erfolgte die Inkubation von 1x107 Zellen/mL in 1 µM CFDA-SE in PBS für drei Minuten bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von RPMI beendet und die Zellen anschließend gewaschen. 42 MATERIAL & METHODEN 3.9.6. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Mit einem fluoreszenzaktivierten Cell Sorter (FACS) lassen sich Zellpopulationen, die sich in der Expression verschiedener Oberflächenantigene unterscheiden, trennen. Das Prinzip des Cell Sorter entspricht im Wesentlichen dem Prinzip der Durchflusszytometrie. Zusätzlich können Flüssigkeitstropfen, welche die markierten Zellen enthalten, durch ein elektrisches Feld aus dem Flüssigkeitsstrom abgelenkt werden. So können die markierten Zellen von den unmarkierten Zellen getrennt werden. Zur Sortierung wurde in dieser Arbeit ein FACS ARIA (BD Biosciences) verwendet. Die erreichte Reinheit bei der Fluoreszenzaktivierten Zellsortierung lag stets über 99%. 3.9.6.1. Isolierung von DZ Subpopulationen Die bereits wie in 3.8.4. beschrieben durch magnetische Zellsortierung angereicherten DZ Populationen wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter sortiert. Die angereicherten pDZ wurden hierfür mit CD11c-APC (BD Biosciences), PDCA-1-Fitc (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) und Ly6c-Pe (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) gefärbt und CD11cmedPDCA1+Ly6c+ Zellen sortiert. Gleichzeitig wurden tote Zellen durch eine Färbung mit Propidiumjodid (PI) von der Sortierung ausgeschlossen. Die vorangereicherten CD11c+ konventionellen DZ wurden mit CD11c und CD11b gefärbt und die entsprechenden Subpopulationen, CD11c+CD11b+ und CD11c+CD11b-, am FACS sortiert. Auch hier erfolgte eine gleichzeitige Färbung mit Propidiumjodid, um tote Zellen auszuschließen. Die Reinheit nach der Fluoreszenzaktivierten Sortierung betrug sowohl für die pDZ als auch für die konventionellen DZ stets >99%. 3.10. T-Zell-Kulturen Für die Ko-Kulturen der verschiedenen DZ Populationen und naiven T-Zellen wurden nach 3.8.3. isolierte T-Zellen aus DO11.10 Mäusen mit isolierten DZ in einem Verhältnis von 15:1 in RPMI Medium mit 10% FCS ko-kultiviert. Es wurde 1µg/ml OVA-Peptid323-339 (AG Mol.Bibliotheken, Charité Berlin), 10ng/ml rekombinantes IL-12 (R&D Systems) und 500nM CpG (TIB Molbiol, Berlin) zugegeben. In einigen Ansätzen wurde 125 nM GSI (Insolution secretase inhibitor X) zugesetzt. Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit 10ng/ml PMA (Sigma) und 1µg/ml Ionomyzin (Sigma) in Anwesenheit des Sekretionshemmers 5µg/ml Brefeldin A (Sigma) für 6 Stunden restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. 43 MATERIAL & METHODEN 3.11. Restimulation und Fixierung Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurden die Zellen mit 1 µg/ml Ionomycin (Sigma) und 10 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA, Sigma) in RPMI-Medium (max. Konz. 5x106 Zellen/ml) für 6h im Brutschrank stimuliert. Gleichzeitig wurde der Sekretionshemmer Brefeldin A (5 µg/ml, Sigma) zugegeben. Die stimulierten Zellen wurden anschließend mit PBS gewaschen und mit 2% Formaldehyd (Merck) in PBS für 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden mit PBS/BSA gewaschen und bis zur intrazellulären Färbung im Kühlschrank gelagert. 3.12. Tierexperimentelle Methoden 3.12.1. Adoptiver Transfer Um die Untersuchung antigenspezifischer T Zellen in vivo zu erleichtern, nutzt man in der immunologischen Forschung die Strategie des adoptiven Transfers. Hierbei werden T-Zellen aus einem Mausstamm, dessen T Zellen einen transgenen T-Zell-Rezeptor exprimieren, in syngene Mäuse transferiert. Durch Immunisierung mit dem entsprechenden Antigen können die zuvor transferierten, für dieses Antigen spezifischen T-Zellen in der in vivo Situation analysiert werden. In dieser Arbeit wurden Zellen der transgenen DO11.10 oder OT-II Mäuse benutzt. Die T-Zellen der DO11.10 Maus bzw. der OT-II Maus exprimieren einen T-ZellRezeptor, der spezifisch für das Peptid323-339 des Ovalbumin (OVA) ist. Zellen der transgenen Mäuse wurden wie in 3.8.2. beschrieben aus Milz und Lymphknoten isoliert und mithilfe der MACS Sortierung angereichert und schließend in einer Konzentration von 1x108 Zellen pro ml in PBS aufgenommen. Im Folgenden wurden die Venen der Rezipienten mit Hilfe einer Wärmelampe geweitet. Mit Hilfe einer 30G Kanüle (Braun, Melsungen, Deutschland) wurden den Mäusen dann 1x107 Zellen in einem Volumen von 100 µl intravenös in die Schwanzvene appliziert. 3.12.2. Immunisierungen 3.12.2.1. Die Immunisierung mit TLR Liganden 24 Stunden nach dem Transfer der transgenen Zellen in die syngenen Balb/c Mäuse, wurden diese subkutan (s.c.) mit dem Antigen Ovalbumin immunisiert. Die subkutane Immunisierung an der Schwanzbasis führt zu einer starken Immunantwort insbesondere in den regionalen Lymphknoten der Leistengegend (Lnn.inguinales). Für eine effektive Immunantwort im Zuge 44 MATERIAL & METHODEN einer Immunisierung wird jedoch neben dem Antigen immer ein Adjuvans benötigt. Adjuvantien können APZ über die Bindung an Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf deren Oberfläche stimulieren. Diese TLR-Stimulation führt zu einer Aktivierung der APZ und einer damit verbundenen Expression von ko-stimulatorischen Molekülen und somit zu einer effektiven Antigenpräsentation. Einen Überlick über die in dieser Arbeit verwendeten Immunisierungslösungen gibt die Tabelle 12. Für die Immunisierung wurden die Tiere fixiert und die Applikationsstelle mit Alkohol desinfiziert. Jeweils 50 µl der Immunisierungslösung wurden rechts und links der Schwanzbasis mithilfe einer 30G Kanüle subkutan appliziert. Sechs Tage nach der Immunisierung der Balb/c Mäuse mit Ovalbumin und Adjuvans wurden die transgenen Zellen aus dem drainierenden Lymphknoten, bei der s.c. Immunisierung die Lnn.inguinales, isoliert und nach Restimulation das Zytokinprofil der transgenen Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Tabelle 12. Verwendete Immunisierungslösungen Verwendete Immunisierungslösungen 5 mg Zymosan + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 50 µg Poly I:C + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 10 µg LPS + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 30 µg Flagellin + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 30 µg Imiquimod + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 30 µg CPG + 50 µg OVA Protein in 100 µl PBS 3.12.2.2. Die Immunisierung mit antigenbeladenen DZ Für die Vakzinierung mit antigenbeladenen DZ wurden konventionelle DZ und pDZ durch magnetische Zellsortierung wie in 3.8.4. angereichert und wie in 3.9.6.1. beschrieben durchflusszytometrisch sortiert. Anschließend wurden die Zellen in einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml in RPMI Medium mit 10% FCS aufgenommen und 12-16h in Anwesenheit von 1µg/ml OVA-Peptid323-339 (AG Mol.Bibliotheken, Charité Berlin) und 500 nM CpG (TIB Molbiol) inkubiert. Die antigenbeladenen Zellen wurden in PBS gewaschen und 1x106 Zellen in 100 µl PBS intravenös in die Schwanzvene appliziert. 45 MATERIAL & METHODEN 3.12.3. Die Blockade des Notch-Signalweges in vivo 3.12.3.1. Die Blockade von Notch-Liganden in vivo Für die Blockade der Notch-Liganden in vivo erhielten die Tiere zwei intraperitoneale (i.p.) Injektionen von jeweils 0,25 mg Dll-1, Jag-1, Jag-2 (H.Yagita, Japan) oder Dll-4 (Genentech, USA) im Abstand von 3 Tagen. Die Kontrolltiere blieben entweder unbehandelt oder erhielten 0,25 mg einer Isotypkontrolle (hamster IgG, NatuTec GmbH). Die Applikation erfolgte in 100 µl PBS mithilfe einer 30G Kanüle nach Desinfektion der Bauchwand. 3.12.3.2. Die Inhibition des Enzyms -Sektretase Der -Sektretase-Inhibitor (DBZ, Syncom) wurde in einer Formulierung aus 0.5% Hydroxypropylmethylcellulose (Methocel, Sigma) and 0.1% Tween 80 (Sigma) in Wasser suspendiert. Methocel ist ein Stärkederivat und wird in der Arzneimittelherstellung als Verdickungsmittel zur Einstellung der Viskosität und als Dispergierhilfsmittel bei flüssigen Zubereitungen eingesetzt. Tween 80 ist ein nicht-ionisches Tensid und wird beispielsweise als Emulgator ebenfalls in der Arzneimittelherstellung verwendet. Beide Inhaltsstoffe tragen einzig zur Löslichkeitsverbesserung des Inhibitors bei. Für die Blockade des NotchSignalweges in vivo erhielten die Tiere täglich eine i.p. Applikation in der Dosierung von 10µmol/kg in einem Volumen von 100µl. Um auszuschließen, dass bereits die Lösungsformulierung des Inhibitors einen Effekt hat, erhielten die Kontrollgruppen nur das Solvens ohne den gelösten Inhibitor. 3.12.4. Die Depletion von plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDZ) Für die Depletion von pDZ wurden die Mäuse mit zwei Injektionen von jeweils 0,5 mg PDCA-1 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen behandelt. Die Kontrollgruppen erhielten eine Isotyp Kontrolle (RatIgG2b, BioXCell). Mit Hilfe einer 30G Kanüle (Braun, Melsungen, Deutschland) wurden die Antikörper in einem Volumen von 100 µl PBS i.v. in die Schwanzvene appliziert. 3.13. Statistik Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardfehlern (Standard Error of the Mean, SEM) dargestellt. Zur Bestimmung der Signifikanzwerte wurde der MannWhitney-Test durchgeführt, da die Daten nicht normalverteilt waren. Das Signifikanzniveau () wurde auf 5% festgelegt. Wenn p < 0,05 war, wurden die Werte als signifikant 46 MATERIAL & METHODEN angenommen. Die Berechnung erfolgte mit Hilfe der Software Prism (Graphpad Software, Inc.). In Abbildung 9 sowie Abbildung 17 entsprechen die gezeigten Daten einer Zusammenfassung mehrerer unabhängiger Wiederholungsversuche. Daher wurden die Ergebnisse normiert dargestellt. Die unbehandelte Kontrollgruppe wurde in jedem Einzelexperiment 100% gesetzt und die anderen Versuchsgruppen entsprechend berechnet. Ein repräsentatives Punktdiagramm enspricht der Darstellung des Zytokinprofils der OVATZR transgenen Zellen eines einzelnen Tieres der Versuchsgruppe. 47 48 4. Ergebnisse ERGEBNISSE Dass TH1-Zellen als Mechanismus der Selbstlimitation das suppressorische Zytokin IL-10 produzieren, ist bereits in zahlreichen Studien beschrieben worden (45, 121). Die Mechanismen, die dieser IL-10 Produktion in TH1-Zellen zugrunde liegen, sind jedoch nur unzureichend verstanden. Unsere Arbeitsgruppe hat kürzlich gezeigt, dass der NotchSignalweg IL-10 in pro-inflammatorischen TH1-Zellen induziert (123). In dieser Arbeit soll die Notch-vermittelte IL-10 Induktion in vivo näher untersucht werden. Insbesondere sollen die hierfür relevanten Notch-Liganden, die sie exprimierenden APZ, sowie Faktoren, die die Expression dieser Liganden verstärken, identifiziert werden. 4.1. Die Induktion von IL-10 in TH1-Zellen durch Aktivierung des Notch-Signalweges in vivo 4.1.1. Etablierung einer Immunisierungsstrategie In verschiedenen Studien anderer Arbeitsgruppen (144) und auch in eigenen Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe (123) konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation von APZ mit verschiedenen TLR-Agonisten in vitro zur Induktion der Expression von Notch-Liganden auf der Oberfläche der APZ führt. Wurden diese durch TLR-Liganden voraktivierten APZ mit naiven T-Zellen ko-kultiviert, zeigte sich eine starke Induktion von IL-10+IFN-+ produzierenden T-Zellen. In dem folgenden Versuchsansatz sollte nun untersucht werden, welche TLR-Stimulation antigenpräsentierender Zellen in vivo zu einer IL-10 Induktion in TH1-Zellen führt. Hierfür wurden CD62L+OVA-TZRtg/tg T-Zellen in kongene Balb/c Mäuse transferiert und die Tiere am darauffolgenden Tag mit Ovalbumin und verschiedenen TLR-Liganden subkutan immunisiert. Für die Immunisierung wurden Zymosan (TLR2), polyI:C (TLR3), LPS (TLR4), Flagellin (TLR5), Imiquimod (TLR7/8) oder CpG (TLR9) verwendet. Nach sechs Tagen wurden die transgenen Zellen entnommen, mit PMA/Ionomyzin in vitro restimuliert und die IFN- und IL-10 Produktion mittels intrazellulärer Färbung durchflusszytometrisch analysiert. 50 ERGEBNISSE Abbildung 3. Die Immunisierung mit Ovalbumin und TLR-Liganden induziert IL-10 in TH1-Zellen in vivo. CD62L+OVA TZRtg/tg transgene Zellen wurden in naive Balb/c Mäuse transferiert und diese am darauffolgenden Tag mit OVA und verschiedenen TLR-Liganden (Zymosan, Poly I:C, LPS, Flagelling, Imiquimod, CpG) subkutan immunisiert. Die transgenen Zellen wurden an Tag 6 aus Milz und Lymphknoten isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. Gezeigt sind A) die Frequenz von IL-10+IFN-+ Doppelproduzenten anteilig an IFN-Produzenten nach Immunisierung mit verschiedenen TLR-Agonisten, n=4-12 sowie B) eine repräsentative Zytokinfärbung der OVA-TZR transgenen T-Zellen aus einem drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung mit OVA und dem TLRAgonisten CpG, die Zahlen geben den prozentualen Anteil der Zytokinproduzenten an allen transferierten OVA-spezifischen T-Zellen an. Das Ergebnis des Versuches zeigt, dass es möglich ist, durch die Immunisierungen mit OVA und den verschiedenen TLR-Liganden in vivo IL-10 in TH1-Zellen zu induzieren. Die stärkste Induktion von IL-10 wurde nach Immunisierung mit OVA und CpG detektiert. Nach dieser Immunisierung produzierten etwa 15-20% der OVA-TZR transgenen T-Zellen das proinflammatorische Zytokin IFN-. Etwa 25-30% dieser Zellen ko-exprimieren das antiinflammatorische Zytokin IL-10. Ein repräsentatives Punktdiagramm der IL-10 Induktion nach OVA/CpG Immunisierung ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Ergebnis spiegelt die in in vitro Vorversuchen gemachten Beobachtungen wider. Auch in Ko-Kulturexperimenten konnte gezeigt werden, dass eine Voraktivierung der APZ mit dem TLR9 Agonist CpG zu einer starken IL-10 Induktion in TH1-Zellen führt. Aufgrund der in vitro Befunde und der signifikanten IL-10 Induktion in vivo wurde entschieden, in den nachfolgenden Experimenten die CpG/OVA Immunisierung zu verwenden. 4.1.2. Die Blockade des Notch-Signalweges durch Inhibition der -Sekretase Durch die Immunisierung mit Ovalbumin und dem TLR-Ligand CpG werden in naiven Mäusen TH1-Zellen induziert, die neben IFN- das suppressorische Zytokin Interleukin-10 produzieren. In dem folgenden Versuchsansatz sollte nun untersucht werden, ob diese IL-10 Induktion durch den Notch-Signalweg vermittelt ist. 51 ERGEBNISSE 4.1.2.1. Die Depletion von MZ B-Zellen Dass die Applikation eines -Sekretase Inhibitors (GSI) in vivo den Notch-Signalweg blockieren kann, ist in zahlreichen Publikationen beschrieben (190). Die -Sekretase ist ein Enzymkomplex, welcher die proteolytische Spaltung des Notch-Rezeptors im NotchSignalweg vermittelt (133, 134). Ist dieses Enzym pharmakologisch inhibiert, kommt es zu keiner Dissoziation der intrazellulären Untereinheit des Notch-Rezeptors und zu keiner Translokation derer in den Nukleus. Der Notch-Signalweg ist somit blockiert. Um die Wirksamkeit des GSI in vivo zu zeigen, eignet sich der Nachweis der B-Zellen des Marginalsinus der Milz (auch Marginal Zonen B-Zellen genannt, im Folgenden MZ BZellen). MZ B-Zellen machen etwa 5% der B-Zellen der Milz aus und exprimieren die Oberflächenmoleküle CD19, CD21 und CD23 (191). Für die Entwicklung der MZ B-Zellen spielen neben anderen Signalen auch Notch-Signale eine entscheidende Rolle. Es ist zum einen beschrieben, dass RBPj-, der Transkriptionsfaktor an den die intrazelluläre Einheit des Notch-Rezeptors nach Translokation in den Nukleus bindet, für die Entwicklung der MZ BZellen unabdingbar ist. Zum anderen ist die Interaktion von Notch-2 und dem Notch Liganden Dll-1 für die Entwicklung von MZ B-Zellen beschrieben (192). Blockiert man nun den Notch-Signalweg in vivo durch die Applikation eines GSI, ist die Entwicklung der MZ B-Zellen gestört. Die Zellen sind bereits am Tag 3 nach täglicher Applikation des GSI nicht mehr detektierbar. Der Nachweis von MZ B-Zellen in der Milz eignet sich daher, um die Wirksamkeit des GSI in vivo zeigen. Abbildung 4. MZ B-Zellen sind nach GSI Behandlung depletiert. Naive Mäuse wurden täglich mit -Sekretase-Inhibitor (GSI) durch intraperitoneale Applikation behandelt. Die Kontrollgruppe (w/o) erhielt ausschließlich das Solvens des Inhibitors. An Tag 3 wurde die Milz entnommen und die MZ B-Zellen anhand der Oberflächenmarker CD19, CD21 und CD23 gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Die Abbildung zeigt eine repräsentative Färbung eines mit Solvens behandelten Tieres (w/o) im Vergleich zu einem mit GSI behandelten Tier (GSI). Die Abbildung 4 zeigt, dass nach einer täglichen Behandlung von 3 Tagen mit GSI mehr als 90% der MZ B-Zellen in der Milz depletiert sind. Die Färbung von MZ B-Zellen eignet sich daher, um die Wirksamkeit des Notch Inhibitors in vivo zu überprüfen. Sie wurde 52 ERGEBNISSE routinemässig in allen Versuchen, die die Blockade des Notch-Signalweges durch einen GSI einschließen, angewendet. 4.1.2.2. Die Blockade der IL-10 Induktion durch Inhibition der -Sekretase In Abbildung 4 konnte gezeigt werden, dass man durch eine pharmakologische Inhibition des Enzymkomplexes -Sekretase den Notch-Signalweg in vivo blockieren kann. Dadurch ist es nun möglich, zu untersuchen, ob der Notch-Signalweg für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen nach Immunisierung mit Ovalbumin und dem TLR-Agonist CpG eine Rolle spielt. Für diesen Versuch wurden CD62L+OVA TZRtg/tg transgene T-Zellen in naive Balb/c Mäuse transferiert und diese am darauffolgenden Tag mit OVA und CpG subkutan immunisiert. Der Notch-Signalweg wurde durch tägliche intraperitoneale (i.p.) Applikation eines -SekretaseInhibitors in vivo blockiert. Die Kontrollgruppen erhielten nur das Solvens des Inhibitors. 53 ERGEBNISSE Abbildung 5. Die Reduktion der IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch Blockade des Notch-Signalweges in vivo. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen wurden intravenös in naive Balb/c Mäuse transferiert und diese am darauffolgenden Tag mit OVA/CpG subkutan immunisiert. Gleichzeitig wurden die Tiere täglich durch intraperitoneale Applikation mit GSI behandelt. Die Kontrollgruppe (w/o) erhielt ausschließlich das Solvens des Inhibitors. An Tag 6 nach Immunisierung wurden Zellen aus Milz und drainierendem Lymphknoten entnommen, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und das Zytokinprofil der transgenen Zellen durchflußzytometrisch untersucht. Gezeigt sind die Kontrollgruppen (w/o) im Vergleich zu den behandelten Gruppen (GSI) in Milz und drainierendem Lymphknoten. (A) zeigt das Zytokinprofil OVATZRtg/tg transgener T-Zellen im Lymphknoten, die Zahlen geben den prozentualen Anteil der Zytokinproduzenten an allen transferierten OVA-spezifischen T-Zellen an, die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens acht unabhängige Experimente. (B) zeigt graphisch das Zytokinprofil der OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen, dargestellt sind IL-10+, IFN-+ sowie IL-10+IFN-+ Produzenten im drainierenden Lymphknoten, n=12-20. (C) zeigt das Zytokinprofil OVA-TZRtg/tg transgener T-Zellen in der Milz, die Zahlen geben den prozentualen Anteil der Zytokinproduzenten an allen transferierten OVA-spezifischen T-Zellen an, die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens sechs unabhängige Experimente. (D) zeigt graphisch das Zytokinprofil der OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen, dargestellt sind IL-10+, IFN-+ sowie IL-10+ IFN-+ Produzenten in der Milz, n=12-20. Die Versuchsauswertung zeigt, dass die OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen in den beiden Versuchsgruppen (w/o vs. GSI) unterschiedlich stark proliferieren. Sowohl im drainierenden Lymphknoten als auch in der Milz der mit GSI behandelten Tiere ist eine etwa dreifach stärkere Proliferation der transgenen T-Zellen im Vergleich zu den Kontrollgruppen zu beobachten (Lnn.ing.: 1,02% vs. 3,66%, Milz: 0,27% vs. 0,96%). In der Kontrollgruppe (w/o) exprimieren nach Immunisierung im drainierenden Lymphknoten etwa 30% aller TH1-Zellen neben IFN-das immunsuppressorische Zytokin IL-10 (Abb. 5A und B). In der Milz hingegen exprimieren nur etwa 20% der T H1-Zellen neben IFN- auch IL-10 (Abb.5.C und D). In beiden Organen kommt es jedoch nach Blockade des Notch54 ERGEBNISSE Signalweges in vivo durch Applikation eines GSI zu einer drastischen Reduktion der IFN- +IL-10+-Doppelproduzenten. Nur noch etwa 5% aller TH1-Zellen produzieren neben IFN- gleichzeitig IL-10 (Abb.5B und D, linker Graph). Auch die IL-10+ Produzenten sind sowohl in Milz als auch in Lymphknoten der GSI behandelten im Vergleich zu den unbehandelten Tieren signifikant um ca. 50% reduziert (Abb.5.B und D, mittlerer Graph). Auffällig ist, dass sowohl im drainierenden Lymphknoten als auch in der Milz die Frequenz der IFN- produzierenden Zellen nach Blockade des Notch-Signalweges im Vergleich zu der Kontrollgruppe drastisch erhöht ist (Abb.5.B und D, rechter Graph). Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieses Versuches, dass der Notch-Signalweg in vivo durch eine Immunisierung mit dem TLR-Liganden CpG und OVA aktiviert werden kann. Es werden TH1-Zellen induziert, die neben dem pro-inflammatorischen IFN- das immunsuppressorische Zytokin IL-10 exprimieren. Im Folgenden wurde diese Immunisierung näher charakterisiert. 4.1.3. Die Charakterisierung der Immunisierung mit Ovalbumin und CpG Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Immunisierungsprotokoll etabliert, mit dem es möglich ist, den Notch-Signalweg in vivo zu aktivieren. Bisher wurde jedoch einzig die IL-10 Induktion in den zuvor transferierten OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen untersucht. Im Folgenden stellte sich jedoch die Frage, ob die Aktivierung des Notch-Signalweges in vivo auch Auswirkung auf die Expression anderer relevanter Zytokine hat. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob die Zahl und Verteilung von verschiedenen Populationen von Immunzellen verändert ist. Außerdem sollte analysiert werden, ob auch das Zytokinprofil der endogenen CD4+ T-Zellen durch die Aktivierung des Notch-Signalweges beeinflusst wird. 4.1.3.1. Das Zytokinprofil OVA-TZR transgener T-Zellen Bisher wurden die OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen nur auf die Expression der Zytokine IFN- und IL-10 untersucht. Im Folgenden sollte nun analysiert werden, ob auch die Expression anderer relevanter Zytokine verändert ist. Hierfür wurden wiederum OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen aus DO11.10 Mäusen in naive Balb/c Mäuse transferiert. Diese wurden am darauffolgenden Tag subkutan mit Ovalbumin und CpG immunisiert. Während einer Gruppe täglich der -Sekretase-Inhibitor intraperitoneal appliziert wurde, erhielt die Kontrollgruppe ausschließlich das Solvens. Am Tag 6 nach Immunisierung wurde das Zytokinprofil der OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen untersucht. 55 ERGEBNISSE Gemessen wurde der Wachstumfaktor IL-2, das TH2-polarisierende Zytokin IL-4, das von TH17-Zellen produzierte Zytokin IL-17 sowie das pro-inflammatorische Zytokin TNF-. Abbildung 6. Das Zytokinprofil OVA-TZRtg/tg transgener T-Zellen. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen wurden in naive Balb/c Mäuse transferiert. Diese wurden am darauffolgenden Tag subkutan mit OVA/CpG immunisiert. Gleichzeitig wurde täglich ein GSI (+) intraperitoneal appliziert, die Kontrollgruppe (-) erhielt nur das Solvens des Inhibitors. Am Tag 6 nach Immunisierung wurden OVA-TZR transgene T-Zellen aus Milz und Lymphknoten isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflußzytometrisch auf die Expression von IL-2, IL-4, IL-17 und TNF- untersucht. (A) zeigt repräsentative Punktdiagramme der OVA-TZR transgenen Zellen, ausgewählt aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die Zahlen geben den prozentualen Anteil der Zytokinproduzenten unter den CD4+OVA-TZR+ Zellen an, (B) zeigt eine graphische Auswertung der Zytokinexpression (n=5), n.d. = nicht detektierbar. Die Analyse der Zytokinexpression der OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen nach sechs Tagen Immunisierung zeigte keine Unterschiede in der Expression von TNF-. Unabhängig von der Behandlung mit GSI sezernierten über 95% der transgenen Zellen beider Versuchsgruppen TNF-. Die Zytokine IL-4 und IL-17 hingegen waren in keiner der beiden Gruppen detektierbar. Einziger Unterschied innerhalb der beiden Gruppen war die Expression des Zytokins IL-2. Die Zellen, in denen durch die Applikation des GSI der Notch-Signalweg pharmakologisch inhibiert wurde, zeigten eine leichte, jedoch signifikante Erhöhung der IL-2 Sekretion (Abb.6). Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieses Versuches keine Veränderung in der Zytokinexpression von OVA-TZR transgenen Zellen aus GSI behandelten Tieren im 56 ERGEBNISSE Vergleich zu mit Solvens behandelten Kontrollen. Einzig die IL-2-Sekretion ist in den Tieren, in denen der Notch-Signalweg blockiert wurde, signifikant erhöht. 4.1.3.2. Das Zytokinprofil der endogenen CD4+ T-Zellen Bisher wurden ausschließlich die Frequenz und das Zytokinprofil der transferierten OVATZRtg/tg transgenen T-Zellen untersucht. Das Zytokinprofil der endogenen CD4+ T-Zellen wurde bisher nicht gemessen. Um dies zu analysieren, wurden nach dem üblichen Protokoll naive OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen in naive Balb/c Mäuse transferiert, diese darauffolgend mit OVA/CpG immunisiert und gleichzeitig mit GSI behandelt. Der adoptive Transfer wurde durchgeführt, weil im gleichen Versuchsansatz das Zytokinprofil der transgenen Zellen untersucht wurde. Die Kontrollgruppe erhielt anstelle des GSI wiederum nur das Solvens. Bei der Analyse wurden jedoch in diesem Versuch nicht die OVA-TZRtg/tg transgenen T-Zellen, sondern die CD4+, jedoch OVA-TZR negativen Zellen eingegrenzt und diese auf die Expression von IFN-und IL-10 untersucht. Abbildung 7. Das Zytokinprofil endogener CD4 T-Zellen. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen wurden in naive Balb/c transferiert. Diese wurden am darauffolgenden Tag mit Ovalbumin und CpG immunisiert. Gleichzeitig wurden die Mäuse mit -Sekretase-Inhibitor (GSI) behandelt, die Kontrollgruppe (w/o) erhielt ausschließlich das Solvens des GSI. Am Tag 6 nach Immunisierung wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. Die Abbildung zeigt eine repräsentative Zytokinfärbung von CD4 +OVA-TZR- Zellen des drainierenden Lymphknotens aus zehn unabhängigen Experimenten. Die Zahlen in den Punktdiagrammen geben die prozentualen Anteil der Zytokinproduzenten der CD4+OVA-TZR- Zellen an. Im Gegensatz zu den transgenen T-Zellen exprimieren nur etwa 2-3% der CD4+ T-Zellen IFN-. Auffällig ist, dass die endogenen CD4+ T-Zellen, in denen der Notch-Signalweg durch GSI blockiert wurde, etwas mehr IFN- als die unbehandelte Kontrollgruppe sekretieren (w/o: ca 3%, GSI: ca. 4%). Im Vergleich zu den transgenen Zellen werden in den endogenen Zellen kaum IL-10+-IFN-+ Doppelproduzenten induziert. Nur etwa 10-15% aller IFN- Produzenten ko-experimieren IL-10. Zudem existieren keine Unterschiede in der Frequenz der IL-10+ Produzenten zwischen mit GSI behandelten und unbehandelten Tieren (0,48% vs. 0,42%). 57 ERGEBNISSE Die Versuchsergebnisse zeigen, dass die IL-10 Induktion ausschließlich in den antigenspezifischen transgenen Zellen zu beobachten ist. In den endogenen CD4+ T-Zellen sind keine signifikanten Unterschiede in der IL-10 Produktion zu beobachten. Einzig die leichte Erhöhung der IFN--Produktion nach der Behandlung mit GSI ist dem Effekt, der bei den transgenen Zellen beobachtet wurde, vergleichbar. 4.1.3.3. Die Verteilung von CD4+ , CD8+ , CD19+ , CD11c+ Zellen und pDZ nach OVA/CpG Immunisierung Um das etablierte Immunisierungsprotokoll mit OVA/CpG weitergehend zu charakterisieren, sollte im folgenden Versuch analysiert werden, ob sich womöglich das Verhältnis der verschiedenen Zellpopulationen in der Milz sowie im drainierenden Lymphknoten durch die Immunisierung verändert. Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang die starke Vergrößerung der Milz nach Immunisierung mit CpG, welche bei der Präparation der lymphatischen Organe am Versuchsende beobachtet wurde. Es sollte daher untersucht werden, welche Zellpopulation in der Milz eventuell durch ihre Proliferation für die Vergrößerung verantwortlich sein könnte. Hierfür wurden Mäuse mit OVA/CpG immunisiert und Milz und Lymphknoten nach 6 Tagen entnommen. Als Kontrollgruppe wurden unbehandelte, naive Mäuse verwendet. Nach Entnahme von Milz und Lymphknoten wurde die absolute Zellzahl der individuellen Organe bestimmt. Anschließend wurden die verschiedenen Zellpopulationen gefärbt und ihre Frequenzen durchflusszytometrisch bestimmt. Ausgehend von den Frequenzen wurde dann die Zellzahl der einzelnen Populationen errechnet. Neben T-Zellen (CD4+ und CD8+) wurden die Frequenz und Zellzahl von B-Zellen (CD19+) sowie die Verteilung von konventionellen dendritischen Zellen (CD11c+) und pDZ (CD11cmed, PDCA1+) bestimmt. 58 ERGEBNISSE Abbildung 8. Die Verteilung verschiedener Zellpopulationen nach CpG/OVA Immunisierung. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen wurden in naive Balb/c intravenös transferiert und diese am darauffolgenden Tag mit OVA/CpG (+) subkutan immunisiert. Die Kontrollgruppe (-) wurde nicht immunisiert. Am Tag 6 nach Immunisierung wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten isoliert, die absolute Zellzahl und der Anteil der verschiedenen Zellpopulationen durchflusszytometrisch bestimmt. Basierend auf den Frequenzen wurden die Zellzahlen errechnet. Gezeigt sind A) die Verteilung der Zellpopulationen in der Milz und B) die Verteilung der Zellpopulationen im drainierenden Lymphknoten, n=5. Die Bestimmung der absoluten Zellzahl der verschiedenen Zellen des Immunsystems zeigt, dass in der Milz insbesondere die Zahl der B- und T-Zellen erhöht sind. Die Zahl der BZellen (CD19+) stieg in der Milz von 3x106 auf 1x107 Zellen, die Zahl der T-Zellen von 1x106 auf 4x106 Zellen. Die CD8+ T-Zellen zeigten hingegen nur eine leichte, jedoch ebenso signifikante Erhöhung der Zellzahl von 1x106 auf 2x106. Die Anzahl der konventionellen dendritischen Zellen (CD11c+) hatte sich von 1x106 auf 5x106 etwa verfünffacht. Hingegen waren etwa achtfach mehr pDZ in der Milz immunisierter Tiere (3x106) zu detektieren als in nicht immunisierten Mäusen (4x105). Während sich die erhöhte Zahl der CD4+, CD8+ und CD19+ Zellen auf eine Proliferation dieser zurückführen lässt, ist die erhöhte Zahl der Subpopulationen dendritischer Zellen wohl vielmehr ein Ergebnis der Rekrutierung von APZ an den Ort der Immuneaktion. Während in der Milz sowohl die B-Zellen als auch die T-Zellen gleich stark proliferierten, zeigte sich im drainierenden Lymphknoten eine etwa achtfache Proliferation der CD4+ TZellen von 2,5x106 auf 2x107 Zellen. Die Zahl der B-Zellen vervierfachte sich auf 2x107 Zellen. Auch die Zahl der CD8+ T-Zellen hatte sich nach Immunisierung von 2,5x106 auf 7x107 mehr als verdoppelt. Die Anzahl der konventionellen dendritischen Zellen sowie der pDZ hatte sich im drainierenden Lymphknoten der immunisierten Tiere etwa verdreifacht. Nach den vorliegenden Ergebnissen lässt sich die starke Vergrößerung der Milz sowie der Lymphknoten nicht auf die Proliferation einer einzigen Zellpopulation zurückführen, sondern ist vielmehr ein Resultat der Aktivierung, Proliferation und Rekrutierung verschiedener 59 ERGEBNISSE Immunzellen nach der Initiierung einer Immunantwort durch eine Immunisierung mit OVA und CpG. 4.2. Die Beteiligung der Notch-Liganden an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Immunisierungsprotokoll etabliert und näher charakterisiert, mit dem es möglich ist, den Notch-Signalweg in vivo zu aktivieren. Es konnte durch Blockade des Notch-Signalweges durch Applikation eines GSI gezeigt werden, dass der Notch-Signalweg auch in vivo eine Rolle für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen spielt. Dass verschiedene Notch-Liganden für die Differenzierung von naiven T-Zellen in verschiedene THelfer-Zell-Subpopulationen eine Rolle spielen, ist bereits bekannt (144). Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte nun untersucht werden, welche Notch-Liganden an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo beteiligt sind. 4.2.1. Die Blockade von Notch-Liganden in vivo Das Notch-Signal wird physiologisch über die Bindung eines Notch-Liganden an einen Notch Rezeptor vermittelt. Es sind vier verschiedene Notch Liganden (Jagged-1, Jagged-2, Deltalike-1, Delta-like-4) im Säugetierorganismus bekannt. Welche dieser Notch-Liganden eine Rolle für die IL-10 Induktion in vivo spielen, sollte im folgenden Versuchsansatz untersucht werden. Hierfür wurden OVA-TZR transgene T-Zellen in naive Mäuse transferiert und diese mit OVA/CpG subkutan immunisiert. Für dieses Immunisierungsprotokoll konnte im ersten Teil dieser Arbeit bereits gezeigt werden, dass IL-10 in TH1-Zellen induziert wird und dieses nach Blockade des Notch-Signalweges durch Applikation eines GSI drastisch reduziert ist. Um die Beteiligung der verschiedenen Notch-Liganden an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen zu untersuchen, wurden die Mäuse mit Notch-Liganden blockierenden Antikörpern behandelt. Anschließend wurde das Zytokinprofil der transgenen Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Da die gezeigten Daten eine Zusammenfassung mehrerer unabhängiger Wiederholungsversuche sind, wurden die Ergebnisse normiert dargestellt. Die unbehandelte Kontrollgruppe wurde in jedem Einzelexperiment 100% gesetzt und die anderen Versuchsgruppen entsprechend berechnet. 60 ERGEBNISSE Abbildung 9. Beteiligung der verschiedenen Notch-Liganden an der IL-10 Induktion in vivo. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen wurden intravenös in naive Balb/c Mäuse transferiert. Diese wurden am darauffolgenden Tag mit OVA/CpG subkutan immunisiert. Gleichzeitig erhielten die Mäuse zwei intraperitoneale Injektionen im Abstand von drei Tagen mit Notch-Ligand blockierenden Antikörpern (Dll-1, Dll-4, Jag-1, Jag-2). Die Kontrollgruppen blieben entweder unbehandelt (w/o) oder erhielten jeweils zwei Injektionen einer Isotypkontrolle (hamster IgG). Am Tag 6 wurden Zellen aus drainierendem Lymphknoten und Milz isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. A) zeigt ein repräsentatives Punktdiagramm CD4+OVA-TZR+ Zellen eines drainierenden Lymphknotens nach Blockade des Notch Liganden Dll-4 im Vergleich zur Isotypbehandelten Kontrollgruppe, die Zahlen geben den Anteil der Zytokinproduzenten an allen transferierten OVA-TZR transgenen T-Zellen an. B) zeigt eine graphische Darstellung des prozentualen Anteils der IFN-+IL-10+ Doppelproduzenten an CD4+OVA-TZR+ Zellen, C) zeigt graphische Darstellungen des prozentualen Anteils der IL-10+ und IFN-+ sekretierenden Zellen an CD4+OVA-TZR+ Zellen, (n=3-8). Der Versuch zeigt, dass die IFN-+IL10+ Doppelproduzenten nach Blockade des Liganden Dll-4 um ca. 60% reduziert sind (Abb.9B). Hingegen zeigt sich keine Veränderung der IL-10 Induktion nach Blockade des Liganden Dll-1 im Vergleich zur Behandlung mit der Isotypkontrolle hIgG. Interessanterweise kommt es nach der Blockade der Liganden der Jagged-Familie zu einer leichten Erhöhung der IFN-+IL10+ Doppelproduzenten (Abb.9B). Gezeigt ist neben der graphischen Darstellung des prozentualen Anteils der IFN-+IL10+ Doppelproduzenten nach Blockade der individuellen Liganden ein repräsentatives Punktdiagramm einer durchflusszytometrischen Analyse der OVA-TZR transgenen Zellen der 61 ERGEBNISSE mit einer Isotypkontrolle behandelten Gruppe im Vergleich zur Gruppe, in der der Ligand Dll-4 blockiert wurde (Abb.9A). Betrachtet man nun die IL-10+ Produzenten (Abb.9C, links), so wird auch hier deutlich, dass ausschließlich der Ligand Dll-4 zu einer signifikanten Reduktion der IL-10 Induktion führt. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen kommt es nach Blockade von Dll-4 zu einer Reduktion der IL-10+ Produzenten um 50% (Abb.9C, links). Auffällig ist in diesem Experiment auch die starke Erhöhung der Frequenz der IFNProduzenten ausschließlich in der Gruppe der mit Dll-4 behandelten Tiere (Abb.9C, rechts). Der Anteil der IFN- Produzenten ist in den mit GSI behandelten Tieren etwa dreimal so hoch wie im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dies spiegelt die Ergebnisse der Versuche, in denen der Notch-Signalweg durch einen GSI blockiert wurde, wider. Auch dort war eine starke Erhöhung der Frequenz der IFN- Produzenten in den GSI behandelten Tieren zu beobachten. Die Ergebnisse dieses Versuches zeigen, dass ausschließlich der Notch-Ligand Dll-4 an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen beteiligt zu sein scheint. Einzig eine Blockade des Liganden Dll-4 führt zu einer drastischen Reduktion IFN-+IL10+ Doppelproduzenten. Hingegen zeigt die Blockade des Liganden Dll-1 keinen Effekt. Werden die Liganden Jag-1 oder Jag-2 inhibiert, dann zeigt sich eine leichte Erhöhung in der Frequenz der IFN-+IL10+ Doppelproduzenten. 62 ERGEBNISSE 4.3. Die Analyse der Beteiligung verschiedener APZ Populationen an der IL-10 Induktion Unter physiologischen Bedingungen erfolgt die Aktivierung von naiven T-Zellen in vivo durch die Präsentation des Antigens zusammen mit kostimulatorischen Molekülen durch APZ. Es ist bereits bekannt, dass APZ auch über die Notch-Liganden auf ihrer Zelloberfläche und deren Bindung an Notch-Rezeptoren auf der T-Zelle, die Differenzierung dieser in verschiedene T-Helfer-Zell-Populationen steuern können. So wurde beispielsweise die Differenzierung in TH1-Zellen durch Liganden der Delta-Like Familie gezeigt. Ebenfalls ist beschrieben, dass Liganden der Jagged Familie die Differenzierung in TH2-Zellen induzieren (144). Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung des NotchSignalweges zu einer verstärkten IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo führt. Im folgenden Versuchsteil wurden die beteiligten Notch-Liganden näher analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass ausschließlich der Notch-Ligand Dll-4 an der IL-10 Induktion in vivo beteiligt ist. Ausgehend von der Tatsache, dass APZ über die Notch-Liganden auf ihrer Zelloberfläche die T-Zell-Differenzierung steuern können, sollte in diesem Teil der Arbeit die Fragestellung adressiert werden, welche APZ in untersuchten System den Liganden Dll-4 exprimieren. 4.3.1. Die Notch-Liganden Expression auf verschiedenen DZ Populationen 4.3.1.1. Die murinen DZ-Populationen in Milz und Lymphknoten Zunächst sollten die verschiedenen DZ-Populationen der Maus dargestellt werden. Aus naiven Balb/c Mäusen wurden hierfür Milz und Lymphknoten entnommen und mit einem Gemisch aus den Enzymen Kollagenase und DNase verdaut. Der Verdau ist notwendig, um DZ aus dem umliegenden Gewebeverband zu lösen. Anschließend wurden die Zellen aus Milz und Lymphknoten für die Oberflächenmarker der verschiedenen DZ Populationen gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. 63 ERGEBNISSE Abbildung 10. Die DZ Populationen der Maus. Milz und die Lymphknoten inguinales wurden aus naiven Mäusen isoliert und durchflusszytometrisch analysiert. A) zeigt die DZ Populationen der Milz, wobei zwischen plasmazytoiden DZ (CD11cmed,PDCA-1+) und den konventionellen DZ (CD11c+CD11b- und CD11c+CD11b+) unterschieden werden kann, B) zeigt die DZ Populationen der Lnn. inguinales, wobei hier nur zwischen pDZ (CD11c med,PDCA-1+) und konventionellen DZ (CD11c+) unterschieden werden kann. Die Abbildung 10 zeigt die Verteilung der DZ Populationen in Milz und Lymphknoten einer naiven Maus. In der Milz erreichen die konventionellen DZ etwa eine Frequenz von 2-3%. Von diesen 2-3% CD11c+ DZ sind etwa 2/3 der Zellen CD11b+ („myeloid“) und etwa 1/3 der Zellen CD11b- („lymphoid“). Die pDZ hingegen machen nur knapp 0,5-1% aller Milzzellen aus. Eine ähnliche Verteilung der DZ findet sich auch im Lymphknoten. Hier erreichen die konventionellen DZ etwa eine Frequenz von 1-2%. Aufgrund der geringen Zellzahlen im Lymphknoten ist eine Unterscheidung anhand der CD11b Expression in myeloide und lymphoide DZ nicht möglich. Die Frequenz der pDZ beträgt in etwa 0,5-1% der Gesamtzellen im Lymphknoten. Aufgrund der hier gezeigten möglichen Unterscheidung der verschiedenen DZ Populationen durch Färbung subpopulationsspezifischer Oberflächenmoleküle ist im Folgenden eine Analyse der Notch-Liganden Expression auf den individuellen DZ Populationen möglich. 4.3.1.2. Die Expression von Notch-Liganden ex vivo Anhand von Oberflächenfärbungen sollte nun die Expression der verschiedenen NotchLiganden auf den individuellen Populationen von DZ bestimmt werden. Hierfür wurden Lymphknoten und Milz aus naiven Mäusen isoliert, und die DZ wie in Abbildung 10 gezeigt gefärbt. Zusätzlich wurden die individuellen Notch-Liganden (Jag-1, Jag-2, Dll-1, Dll-4) gefärbt. Aufgrund der geringen Expression der Notch-Liganden musste eine Verstärkung der Färbung durch das FASER-Amplifikationssystem (Miltenyi Biotec) vorgenommen werden. Hierbei wird durch abwechselnde Verwendung von Fluorochrom-konjugiertem Biotin und 64 ERGEBNISSE biotinyliertem Fluorochrom-Antikörper die Fluoreszenzmarkierung des Zielantigens schrittweise verstärkt. Abbildung 11. Notch-Liganden Färbung auf DZ A) der Milz oder B) des Lymphknotens ex vivo. Aus naiven Balb/c Mäusen wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten entnommen und die Oberflächenmarker der verschiedenen DZ Populationen und Notch-Liganden gefärbt. Nach Verstärkung des Fluoreszenzsignales durch das FASERAmplifikationssystem (Miltenyi Biotec), wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die Abbildungen zeigen repräsentative Histogramme für A) die Milz und B) die Lymphknoten aus mindestens 6 unabhängigen Experimenten. In den Histogrammen sind jeweils die Färbungen für die einzelnen Notch Liganden (nicht gefüllte Kurve) im Vergleich zu den ungefärbten Zellen (grau unterlegte Kurve) dargestellt. Die Färbungen der verschiedenen Notch-Liganden zeigen, dass alle Subpopulationen von DZ ex vivo sowohl in Milz als auch im Lymphknoten geringe Mengen des Liganden Dll-1 65 ERGEBNISSE exprimieren. Die Liganden der Jagged-Familie werden hingegen nur von den konventionellen DZ exprimiert. Während die myeloiden DZ sowohl geringe Mengen des Liganden Jag-1 als auch Jag-2 exprimieren, findet sich auf der Oberfläche der lymphoiden DZ ausschließlich eine Expression des Liganden Jag-2. Im Lymphknoten, in dem aufgrund der geringen Zellzahl eine Unterscheidung von CD11b+ und CD11b- DZ nicht möglich ist, exprimieren ausschließlich die konventionellen DZ die Liganden der Jagged Familie. Der Ligand Dll-4 hingegen wird ausschließlich von pDZ sowohl im Lymphknoten als auch in der Milz exprimiert. Konventionelle DZ exprimieren den Liganden Dll-4 hingegen nicht. 4.3.1.3. Die Expression von Notch-Liganden nach OVA/CpG Immunisierung Die ex vivo Färbungen der Notch-Liganden auf den verschiedenen DZ Populationen verdeutlichen die konstitutive Expression der Notch-Liganden auf DZ der naiven Maus. Es stellte sich jedoch die Frage, ob die Stimulation mit dem TLR-Liganden CpG zu einer Veränderung der Expression der individuellen Notch-Liganden auf DZ führt. Hierbei sollte insbesondere die Regulation des an der IL-10 Induktion beteiligten Liganden Dll-4 untersucht werden. Eine Regulation der Expression der verschiedenen Liganden durch mikrobielle Stimuli wurde bereits beschrieben (143, 144). Für diesen Versuch wurden naive Mäuse mit OVA/CpG immunisiert und Zellen aus Milz und Lymphknoten 48h nach Immunisierung entnommen und durchflusszytometrisch untersucht. In Vorexperimenten wurde zunächst die Kinetik der Notch-Liganden Expression analysiert und festgestellt, dass die Liganden die stärkste Expression 48-72h nach Immunisierung aufweisen. Zu späteren Zeitpunkten sinkt die Expression der Notch-Liganden bereits wieder und nähert sich der ex vivo Situation an (Daten nicht gezeigt). 66 ERGEBNISSE Abbildung 12. Die Notch-Liganden Expression nach OVA/CpG Immunsierung. 48h nach OVA/CpG Immunisierung wurden Zellen der Milz und der drainierenden Lymphknoten (Lnn.ing.) entnommen und die Oberflächenmarker der verschiedenen DZ Populationen und Notch-Liganden gefärbt. Nach Verstärkung des Fluoreszenzsignales durch das FASERAmplifikationssystem (Miltenyi Biotec) wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die Abbildung zeigt repräsentative Histogramme aus A) Milz und B) Lymphknoten aus mindestens 6 unabhängigen Experimenten. Die grau unterlegte Kurve kennzeichnet die ungefärbten Zellen. Die dünn gezeichnete schwarze Kurve zeigt die Notch-Liganden Expression ex vivo. Die Notch-Liganden Expression nach Immunisierung zeigt die fett gezeichnete schwarze Kurve. In der oberen rechten Ecke des Histogrammes ist jeweils die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für die Färbung ex vivo (dünn) und nach Immunisierung (fett) angegeben. Die Notch-Liganden Expression auf DZ nach Immunisierung mit OVA/CpG zeigt folgendes Bild: Der Ligand Dll-1, der bereits ex vivo von allen DZ exprimiert wird, ist auf allen DZ 67 ERGEBNISSE Populationen sowohl im Lymphknoten als auch in der Milz leicht heraufreguliert (vgl. MFI ex vivo und nach Stimulation). Die Liganden der Jagged Familie hingegen werden in der Milz auch nach Immunisierung ausschließlich von den konventionellen DZ exprimiert. Man kann jedoch auch hier eine leichte Verstärkung der Expression beobachten. Die myeloiden DZ der Milz exprimieren wiederum sowohl Jag-1 (MFI 119 vs. MFI 138) als auch Jag-2 (MFI 127 vs. MFI 156), hingegen exprimieren die lymphoiden DZ ausschließlich den Liganden Jag-2 (MFI 103 vs. MFI 122). Im Lymphknoten exprimieren die konventionellen DZ sowohl Jag-1 als auch Jag-2. Auch hier ist die Expression beider Liganden der Jagged Familie leicht verstärkt (Lnn.ing.: Jag-1 MFI 138 vs. MFI 157; Jag-2 MFI 169 vs. MFI 183). Der Ligand Dll-4 wurde ex vivo ausschließlich durch pDZ exprimiert. Nach der Immunisierung mit Ovalbumin und dem TLR Liganden CpG zeigt sich nun, dass die Expression des Liganden Dll-4 auf pDZ sowohl in der Milz als auch im drainierenden Lymphknoten nochmals stark erhöht ist (Milz: MFI 371 vs. MFI 695; Lnn.ing.: MFI 350 vs. MFI 512). Auffällig ist jedoch auch, dass auch auf den myeloiden DZ eine deutliche Verstärkung der Expression des Liganden Dll-4 zu beobachten ist (Milz: MFI 83 vs. MFI 161; Lnn.ing.: MFI 72 vs. MFI 97). Die lymphoiden DZ der Milz exprimieren hingegen kein Dll-4. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der Notch-Liganden Färbungen eine Expression des an der IL-10 Induktion beteiligten Liganden Dll-4 exklusiv auf der Oberfläche plasmazytoider DZ. pDZ exprimieren sowohl ex vivo als auch nach Stimulation mit CpG große Mengen an Dll-4. Daher soll im Folgenden die Fähigkeit von pDZ, IL-10 in TH1-Zellen zu induzieren, untersucht werden. 4.3.2. Die Rolle von pDZ für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen In den bisherigen Teilen der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IL-10 Induktion in vivo durch den Notch-Signalweg und hierbei insbesondere durch den Liganden Dll-4 vermittelt ist. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass vornehmlich pDZ den Notch-Liganden Dll-4 ex vivo und nach Stimulation mit Ovalbumin und CpG auf der Oberfläche exprimieren. Es stellte sich daher im Folgenden die Frage, ob es die pDZ sind, die in vivo die Differenzierung einer TH-Zelle in eine IFN-+IL-10+ Doppelproduzenten steuern. Daher sollte die Fähigkeit von pDZ mithilfe von Notch-Signalen, IL-10 in TH1-Zellen zu induzieren, in vitro und in vivo untersucht werden. 68 ERGEBNISSE 4.3.2.1. pDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vitro Dass pDZ unter bestimmten Vorraussetzungen, IL-10 in TH1-Zellen induzieren können, ist bereits bekannt (193). Die Mechanismen, die dieser IL-10 Induktion zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bisher auch nicht untersucht worden, ob der Notch-Signalweg hierfür eine Rolle spielt. Dies sollte im folgenden Versuchsansatz analysiert werden. Für diesen Versuch wurden CD4+CD62L+ sortierte OVA-TZR transgene T-Zellen mit durchflusszytometrisch isolierten CD11c+CD11b- (lymphoiden) oder CD11c+CD11b+ (myeloiden) DZ oder PDCA-1+CD11cmedB220+Ly6c+ (pDZ) für 5 Tage in Gegenwart von IL-12 und CpG ko-kultiviert. Gleichzeitig wurde in einem weiteren Ko-Kulturansatz der Notch-Signalweg durch Zugabe einer GSI blockiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. Abbildung 13. Plasmazytoide DZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen. CD4+CD62L+ T-Zellen wurden aus Milz und Lymphknoten naiver DO11.10 Mäuse isoliert und mit verschiedenen Subpopulationen dendritischer Zellen (pDZ, CD11b+CD11c+ und CD11b-CD11c+) in Anwesenheit von OVA sowie des TH1-polarisierenden Zytokins IL-12 und CpG kokultiviert (w/o). Gleichzeitig wurde in einem zweiten Ansatz der Notch-Signalweg mithilfe eines -Sekretase-Inhibitors (GSI) blockiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen beider Ansätze mit PMA/Ionomyzin restimuliert und das Zytokinprofil durchflusszytometrisch untersucht. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Die Zahlen in den Punktdiagrammen geben den Anteil der Zytokinproduzenten an CD4 + T-Zellen an. Im Hinblick auf die IFN- Produktion zeigen sich Unterschiede im Vergleich der pDZ zu den konventionellen DZ. Während die pDZ und die myeloiden DZ über 80% IFN-+ Produzenten induzierten, war die Frequenz der IFN- Produzenten in Ko-Kulturen mit lymphoiden DZ mit 73% etwas geringer. Die Blockade des Notch-Signalweges hatte keinen Einfluss auf die IFN- Produktion. 69 ERGEBNISSE Hinsichtlich der IL-10 Induktion zeigt der Versuch, dass alle DZ Populationen IL-10 in TH1Zellen induzieren können. Auffällig jedoch ist, dass besonders pDZ sehr effizient in der Induktion des suppressorischen Zytokins sind. Etwa 50% aller IFN-+ Produzenten produzieren neben IFN- das Zytokin IL-10. Dagegen sind es im Fall der konventionellen DZ jeweils nur etwa 25% aller TH1-Zellen, die IL-10 ko-exprimieren. Um die Abhängigkeit dieser IL-10 Induktion vom Notch-Signalweg zu überprüfen, wurden alle Ko-Kulturen gleichzeitig mit GSI behandelt. Hierbei zeigte sich, dass die IL-10 Induktion in den pDZ Ko-Kulturen nach Blockade des Notch-Signalweges um etwa 55% reduziert ist. Auch in Ko-Kulturen mit CD11c+CD11b+ DZ zeigte sich eine Reduktion der IL-10 Induktion um etwa 40%. Auf die IL-10 Induktion durch lymphoide CD11c+CD11b- DZ hatte die Behandlung mit GSI praktisch keinen Einfluss. Die Resultate der Ko-Kulturen zeigen, dass pDZ sehr effiziente Induktoren von IL-10 in TH1Zellen sind. Die Blockade mit GSI zeigt, dass die durch pDZ vermittelte IL-10 Induktion zu großen Teilen durch den Notch-Signalweg vermittelt ist. 4.3.2.2. Die Rolle von ICOS (Inducible Costimulator) für die IL-10 Induktion durch pDZ Wie bereits erwähnt, ist die Fähigkeit der IL-10 Induktion durch pDZ, bereits publiziert. Eine Veröffentlichung aus dem Jahr 2007 zeigt, dass die Interaktion von ICOS mit ICOS-Ligand eine wichtige Rolle für die Regulation der IL-10 Induktion durch pDZ spielt (193). ICOSLigand ist ein ko-stimulatorisches Molekül, welches sowohl von B-Zellen als auch von Makrophagen und DZ konstitutiv exprimiert wird. Hingegen wird ICOS ausschließlich nach Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert. Die bereits erwähnte Publikation zeigt, dass pDZ über die Bindung von ICOS-Ligand an ICOS auf der T-Zelle, IL-10 in dieser induzieren können. Im Folgenden soll daher untersucht werden, welche Rolle ICOS für die von uns beobachtete IL-10 Induktion spielt. Für diesen Versuchsansatz wurden pDZ mit naiven T-Zellen aus Wildtyp-Mäusen oder mit ICOS-/- defizienten T-Zellen in Gegenwart von IL-12 und CpG kokultiviert. Gleichzeitig wurden die Ko-Kulturen in einem zweiten Ansatz mit GSI behandelt, um den Notch-Signalweg zu blockieren. Nach 5 Tagen wurden die Zellen restimuliert und das Zytokinprofil durchflusszytometrisch analysiert. 70 ERGEBNISSE Abbildung 14. Die Rolle von ICOS für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch pDZ. CD4+CD62L+ T-Zellen aus Wildtyp oder ICOS-defizienten Mäusen wurden mit pDZ ko-kultiviert. Gleichzeitig wurde in einem weiteren Ansatz der Notch-Signalweg durch Zugabe eines GSI blockiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch untersucht. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens 2 unabhängige Experimente. Die Zahlen in den Punktdiagrammen geben den Anteil der Zytokinproduzenten an CD4+ T-Zellen an. Kultiviert man pDZ mit naiven T-Zellen aus Wildtyp Mäusen, so beobachtet man eine starke IL-10 Induktion. Nahezu 60% aller TH1-Zellen ko-exprimieren IL-10 (Abb.14, oben links). Kultiviert man pDZ jedoch mit ICOS defizienten T-Zellen, so wird eine leichte Reduktion der IL-10 Induktion in TH1-Zellen deutlich. Nur noch etwa 45 % aller TH1-Zellen ko-exprimieren IL-10 (Abb.14, oben rechts). Blockiert man nun in beiden Ansätzen den Notch-Signalweg durch Zugabe eines GSI, dann ist in beiden Fällen die IL-10 Induktion drastisch reduziert. Während jedoch in den Wildtypzellen wiederum etwa 50% Reduktion zu beobachten ist, sieht man bei der Ko-Kultur mit ICOS-defizienten T-Zellen einen deutlich stärkeren Effekt. Die IL10 Induktion ist hier um etwa 75% reduziert. (Abb.14, unten) Das Experiment zeigt, dass die IL-10 Induktion in ICOS defizienten T-Zellen leicht reduziert ist. Diese Beobachtung entspricht bereits veröffentlichten Ergebnissen. Trotzdem zeigen die Ergebnisse dieses Versuches, dass erst eine Blockade des Notch-Signalweges zu einer nahezu vollständigen Inhibition der IL-10 Produktion führt. Daher lassen die Daten vermuten, dass der Mechanismus der ICOS induzierten IL-10 Expression in unserem System eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint. 71 ERGEBNISSE 4.3.2.3. pDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vivo In den vorangegangenen Experimenten wurde ausschließlich in vitro gezeigt, dass pDZ effiziente IL-10 Induktoren sind und diese IL-10 Induktion durch den Notch-Signalweg vermittelt ist. Im Folgenden sollte nun untersucht werden, ob pDZ auch eine Rolle für die IL10 Induktion in vivo spielen. Hierfür wurden naive T-Zellen aus OVA-TZR transgenen Mäusen mit CFDA-SE markiert und in naive Balb/c Mäuse transferiert. Anschließend wurden die gleichen Mäuse mit antigenbeladenen DZ immunisiert. Hierfür wurden aus naiven Mäusen pDZ sowie konventionelle DZ sortiert und über Nacht mit Antigen (= OVA-Peptid) beladen und mit CpG voraktiviert. Am darauffolgenden Tag wurden diese über Nacht voraktivierten und mit antigenbeladenen DZ i.v. in die mit naiven OVA-TZR transgenen Zellen transferierten Rezipienten ko-transferiert. Zusätzlich zu der Gruppe, die mit pDZ immunisiert wurde, erhielt eine weitere mit pDZ immunisierte Gruppe den Notch-Inhibitor, um den Notch-Signalweg in vivo zu blockieren. Abbildung 15. pDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vivo. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene Zellen wurden mit CFDASE markiert und intravenös in naive Balb/c Mäuse transferiert. Gleichzeitig wurden aus Spendertieren pDZ und konventionelle DZ isoliert. Diese wurden über Nacht mit OVA-Peptid beladen und mit CpG aktiviert und am darauffolgenden Tag in die kongenen Rezipiententiere transferiert. 6 Tage nach Immunisierung wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. In die Analyse des Experimentes wurden nur die transgenen Zellen eingeschlossen, die in vivo proliferierten. (Abb.15,links). Die Zahlen geben den Anteil der Zytokinproduzenten an allen proliferierten OVA-TZR transgenen T-Zellen an. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente (n=3). Immunisiert man Mäuse mit antigenbeladenen konventionellen DZ, so ist eine starke IFN- Induktion beobachten. Etwa 50% aller transgenen, proliferierten Zellen produzieren IFN-. Jedoch ko-exprimieren nur etwa 5% dieser TH1-Zellen IL-10 (Abb.15, rechts). Immunisiert man naive Mäuse hingegen mit antigenbeladenen pDZ so sekretieren über 70% aller transgenen proliferierten Zellen IFN-, von denen wiederum über 60% das suppressorische Zytokin IL-10 exprimieren (Abb.15, links). Behandelt man die Mäuse, die mit pDZ immunisiert werden, gleichzeitig mit einem GSI, so ist die durch pDZ vermittelte IL-10 72 ERGEBNISSE Induktion drastisch reduziert. Nach Blockade des Notch-Signalweges ko-exprimieren nur noch etwa 20% aller TH1-Zellen das Zytokin IL-10 (Abb.15, Mitte). Die Versuchsergebnisse zeigen, dass pDZ auch in vivo im Vergleich zu konventionellen DZ starke Induktoren des Zytokins IL-10 in TH1-Zellen sind. Die Blockade mit einem GSI zeigt, dass die durch pDZ vermittelte IL-10 Induktion auch in vivo zu großen Teilen vom NotchSignalweg abhängig zu sein scheint. 4.3.2.4. Die Depletion von pDZ Wir konnten in den vorangegangenen Versuchen zeigen, dass pDZ sowohl in vitro auch in vivo IL-10 in TH1-Zellen induzieren können. Wir wollten daher nun untersuchen, welche Auswirkung eine Depletion der pDZ in unserem Modell auf die IL-10 Induktion in vivo hat. 4.3.2.4.a Die Effizienz der pDZ Depletion Plasmazytoide dendritische Zellen können in vivo durch die Applikation eines anti-PDCA-1 Antikörpers depletiert werden. Zunächst musste jedoch die Effizienz des depletierenden PDCA-1 Antikörpers in unserem Mausmodell getestet werden. Hierfür wurden naive Mäuse im Abstand von 24 Stunden zweimalig mit PDCA-1 intravenös behandelt. 48h nach der zweiten Antikörperapplikation wurden Lymphknoten und Milz entnommen und auf das Vorhandensein von pDZ gefärbt. Die Kontrollgruppen wurden mit einer Isotypkontrolle behandelt. Abbildung 16. PDZ lassen sich mit PDCA-1 zu 95% depletieren. Naive Balb/c Mäuse erhielten an zwei aufeinanderfolgenden Tagen intravenöse Injektionen von 0,5 mg PDCA-1. Die Kontrollgruppe (w/o) erhielt eine Isotypkontrolle (ratIgG). 48h nach der letzten Injektion wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten entnommen und pDZ anhand ihrer Oberflächenmarker CD11c und Ly6c gefärbt. Gezeigt ist ein repräsentatives Punktdiagramm aus mindestens 10 unabhängigen Experimenten. Die Zahlen zeigen den Anteil der pDZ an den Gesamtzellen des Lymphknotens. Die Abbildung 16 zeigt, dass bereits durch eine zweimalige intravenöse Applikation von PDCA-1 über 95% der pDZ im drainierenden Lymphknoten depletiert werden können. 73 ERGEBNISSE Auch in der Milz zeigt sich eine nahezu vollständige Depletion der pDZ nach zweimaliger Applikation des Antikörpers (Daten nicht gezeigt). Eine für diesen Versuch im Voraus angefertigte Kinetik der pDZ Depletion zeigte, dass die Frequenzen der pDZ sowohl im Lymphknoten als auch in der Milz nach ca.7 Tagen wieder im Normalbereich lagen. Die Frequenzen anderer Zellpopulationen, beispielsweise CD4+, CD8+, CD19+ und konventionellen DZ, blieb unverändert, was auf eine spezifische Depletion der pDZ schließen läßt (Daten nicht gezeigt). Im Folgenden wurde dieses Protokoll daher für die Depletion von pDZ in vivo angewendet. 4.3.2.4.b Die Blockade der IL-10 Induktion nach der Depletion von pDZ Wie bereits erläutert, sollte in diesem Versuchsteil untersucht werden, welchen Einfluss die Depletion von pDZ auf die IL-10 Induktion in TH1-Zellen in unserem experimentellen System hat. Hierfür wurden naive T-Zellen aus OVA-TZR transgenen Mäusen isoliert und i.v. in naive Balb/c Mäuse transferiert. Am darauffolgenden Tag wurden die Mäuse mit OVA/CpG immunisiert. Vor der Immunisierung wurden pDZ durch zwei Injektionen mit PDCA-1 an zwei aufeinanderfolgenden Tagen depletiert. Die Kontrollgruppen blieben entweder unbehandelt (w/o) oder erhielten zwei Injektionen einer Isotypkontrolle (ratIgG). Um eine vollständige Depletion der pDZ durch PDCA-1 vor Immunisierung sicherzustellen, wurde stets ein Tier der Gruppe vor Immunisierung entnommen und auf das Vorhandensein von pDZ in Milz und Lymphknoten von pDZ untersucht. Sechs Tage nach Immunisierung wurden die transgenen Zellen aus dem drainierenden Lymphknoten isoliert und das Zytokinprofil dieser Zellen nach Restimulation mit PMA/Ionomyzin durchflusszytometrisch bestimmt. Bei den gezeigten Daten handelt es sich um eine Zusammenfassung der Ergebnisse aus mehreren Einzelexperimenten. Um diese Einzelexperimente vergleichen zu können, wurden die Ergebnisse normiert Einzelexperimentes dargestellt. auf 100% Hierfür gesetzt wurde und die Einzelexperimentes prozentual entsprechend angepasst. 74 jeweils die anderen Kontrollgruppe des Versuchsgruppen des ERGEBNISSE Abbildung 17. pDZ sind an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo beteiligt. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene Zellen wurden intravenös in naive Balb/c Mäuse transferiert. Gleichzeitig erhielten die Mäuse an zwei aufeinanderfolgenden Tagen intravenöse Injektionen von 0,5 mg PDCA-1. Die Kontrollgruppe blieb entweder unbehandelt (w/o) oder erhielt eine Isotypkontrolle (rIgG). Nach vollständiger Depletion der pDZ wurden die Tiere mit OVA/CpG subkutan immunisiert. Sechs Tage nach Immunisierung wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten entnommen, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und das Zytokinprofil der transgenen Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. (A) zeigt ein repräsentatives Punktdiagramm der OVA-TZR transgenen Zellen aus dem drainierenden Lymphknoten, die Zahlen geben den Anteil der Zytokinproduzenten an allen transferierten OVA-TZR transgenen T-Zellen, die Daten sind repräsentativ für mindestens 4 unabhängige Experimente. (B) zeigt eine graphische Darstellung der IFN-+IL-10+ Doppelproduzenten aus mindestens 4 unabhängigen Experimenten (n=10-12). (C) zeigt eine graphische Darstellung der IFN-+ und der IL-10+ sekretierenden Zellen aus mindestens 4 unabhängigen Experimenten (n=12). Die Abbildung 17 zeigt die Auswirkung einer pDZ Depletion auf die Induktion von IL10+IFN-+ Doppelproduzenten. Hierbei ist auffällig, dass eine Depletion der pDZ im Vergleich zu den Kontrollgruppen zu einer Reduktion der IL-10+IFN-+ Produzenten um etwa 50% führt (Abb.17A). Ein repräsentatives Punktdiagramm zeigt exemplarisch das Zytokinprofil der transgenen Zellen nach pDZ Depletion im Vergleich zur Isotypbehandelten Gruppe. Auch hier zeigt sich eine etwa 50%ige Reduktion der Doppelproduzenten (Abb.17B) Desweiteren wurden die IL-10+ Produzenten dargestellt. Auch hier zeigt sich eine Reduktion des produzierten IL-10 um etwa 40% in den pDZ depletierten Tieren im Vergleich zur Kontrolle (Abb.17C, links). Die IFN-+ Produzenten sind in diesem Versuchansatz in ihren Frequenzen in den individuellen Gruppen unverändert (Abb.17C, rechts). 75 ERGEBNISSE Die Ergebnisse der pDZ Depletion verdeutlichen erneut die Rolle von pDZ für eine IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo. Die Induktion von IL-10+IFN-+ Produzenten ist nach einer Depletion von pDZ um ca. 50% reduziert. Dies enspricht in etwa der Reduktion der IL10+IFN-+ Produzenten nach einer Blockade des Liganden Dll-4. 4.3.3. Die Rolle von B-Zellen für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen Bei der Untersuchung der Rolle der verschiedenen APZ für die IL-10 Induktion in vivo lag das Augenmerk bisher ausschließlich auf den verschiedenen Subpopulationen dendritischer Zellen, da diese hauptsächlich zur Aktivierung naiver T-Zellen beitragen. Jedoch wie bereits in einem früheren Abschnitt erwähnt, gehören neben den DZ auch B-Zellen zu den APZ. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde nun die Rolle von B-Zellen für die IL-10 Induktion in vivo untersucht. 4.3.3.1. Die Analyse der Beteiligung von B-Zellen an der IL-10 Induktion Um den Einfluss von B-Zellen für die IL-10 Induktion zu untersuchen, wurden JHT-Mäuse verwendet. Dieser Mausstamm besitzt keine funktionellen B-Zellen, da den JHT-Mäusen die JH-Gensegmente fehlen und dadurch die B-Zell-Entwicklung in einem frühen Stadium blockiert ist. JHT-Mäuse sind auf dem genetischen Hintergrund der C57Bl/6 Maus gezüchtet. Dementsprechend wurden als Kontrollmäuse C57Bl/6 Mäuse verwendet. Für den Transfer der OVA-TZR transgenen T-Zellen wurden in diesem Fall Zellen aus der OT-II Maus verwendet. Die T-Zellen der OT-II Maus sind wie die T-Zellen der DO11.10 Maus spezifisch für das Peptid 323-333 des Ovalbumin. Für das Experiment wurden naive OVA-TZR transgene T-Zellen aus OT-II Mäusen in naive C57Bl/6 beziehungsweise in JHT-Mäuse transferiert und diese am darauffolgenden Tag mit OVA/CpG immunisiert. Zusätzlich erhielt eine Gruppe der C57Bl/6 Mäuse täglich einen GSI, um den Notch-Signalweg zu blockieren. Am Tag sechs nach Immunisierung wurden die transgenen Zellen aus Lymphknoten und Milz isoliert, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch auf ihr Zytokinprofil untersucht. 76 ERGEBNISSE Abbildung 18. Die Rolle von B-Zellen für die IL-10 Induktion in vivo. CD62L+OVA-TZRtg/tg transgene T-Zellen aus OTII Mäusen wurden in naive C57Bl/6 (=WT) beziehungsweise JHT-Mäuse transferiert. Die Mäuse wurden am darauffolgenden Tag subkutan mit OVA/CpG immunisiert. Zusätzlich wurde eine Gruppe der C57Bl/6 Mäuse mit Sekretase-Inhibitor (GSI) behandelt. Am Tag 6 wurden Zellen aus Milz und drainierendem Lymphknoten entnommen, mit PMA/Ionomyzin restimuliert und durchflusszytometrisch analysiert. (A) zeigt repräsentative Punktdiagramme aus dem drainierenden Lymphknoten der verschiedenen Versuchsgruppen, die Zahlen zeigen den Anteil der Zytokinproduzenten an den OVA-TZR transgenen T-Zellen, (B) zeigt eine graphische Darstellung der Frequenz an IFN-+IL-10+ doppelpositiven Zellen im Lymphknoten, (C) zeigt repräsentative Punktdiagramme aus der Milz der verschiedenen Versuchsgruppen, die Zahlen zeigen den Anteil der Zytokinproduzenten an den OVA-TZR transgenen T-Zellen, (D) zeigt eine graphische Darstellung der Frequenz IFN-+IL-10+ doppelpositiver Zellen in der Milz. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. In C57Bl/6 Mäusen führt eine Immunisierung mit CpG und Ovalbumin sowohl in der Milz als auch im Lymphknoten zu einer Induktion von etwa 30-35% IFN- in den TH Zellen. Etwa 10% der IFN-+ Produzenten im Lymphknoten und 15-20% in der Milz ko-exprimieren das suppressorische Zytokin IL-10 (Abb.18B und D). Blockiert man in diesen Mäusen den Notch-Signalweg, so ist die IL-10 Induktion deutlich reduziert. Im Lymphknoten sind die Doppelproduzenten etwa um 60%, in der Milz etwa um 75% reduziert (Abb.18B und D) Immunisiert man nun B-Zell-defiziente Mäuse (JHT) mit OVA/CpG, so beobachtet man auch in diesem Fall eine Reduktion der IL-10 Induktion. Jedoch ist diese bei weitem nicht so drastisch wie bei einer Behandlung mit GSI. Im Lymphknoten sind die Doppelproduzenten um etwa 35% reduziert, in der Milz hingegen um ca. 50%. Die IFN- Produktion ist in JHTMäusen im Vergleich zu den Wildtypmäusen unverändert. Hingegen beobachtet man auch in diesem Versuch einen drastischen Anstieg der Frequenz der IFN-+ Produzenten in den mit GSI behandelten Mäusen. 77 ERGEBNISSE Die Ergebnisse dieses Versuches legen die Vermutung nahe, dass auch B-Zellen an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo beteiligt sind. In B-Zell-defizienten JHT-Mäusen ist die IL-10 Induktion um ca. 50% reduziert. Im folgenden soll daher untersucht werden, ob die IL-10 Induktion durch B-Zellen durch den Notch-Signalweg vermittelt sein könnte. 4.3.3.2. Die Notch-Liganden Expression auf B-Zellen Durch die Reduktion der IL-10 Induktion in B Zell-defizienten JHT-Mäusen konnte im vorhergehenden Versuch gezeigt werden, dass offensichtlich auch B-Zellen an der IL-10 Induktion in vivo beteiligt sind. Wir wissen durch Blockade der Notch-Liganden durch Antikörper, dass in vivo der Ligand Dll-4 für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen verantwortlich ist. Daher soll nun untersucht werden, ob auch die durch B-Zellen vermittelte IL-10 Induktion durch den Notch-Signalweg vermittelt ist. Hierfür sollte die Notch-Liganden Expression, und dabei insbesondere die Expression von Dll-4, auf B-Zellen analysiert werden. 4.3.3.2.a Die Expression von Notch Liganden auf B-Zellen ex vivo Zunächst sollte die Expression der individuellen Notch Liganden auf der Oberfläche von BZellen ex vivo bestimmt werden. Hierfür wurden Milz und Lymphknoten aus naiven Mäusen entnommen und die Notch-Liganden auf B-Zellen gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Für die Färbung der Notch-Liganden musste wiederum eine Verstärkung durch das FASER-Amplifikationssystem (Miltenyi Biotec) benutzt werden. Abbildung 19. Die Notch-Liganden Expression auf B-Zellen ex vivo. Zellen aus Milz und Lymphknoten wurden aus naiven Mäusen isoliert, die B-Zellen anhand des Oberflächenmarkers B220 gefärbt und durchflusszytometrisch auf die Expression von Notch Liganden untersucht. 78 ERGEBNISSE Die Färbungen der Notch-Liganden zeigt eine geringe Expression der Liganden Jag-1 und Jag-2 durch naive B-Zellen. In der Milz hingegen werden keine Liganden der Jagged Familie auf B-Zellen exprimiert. Der Notch Ligand Dll-1 wird sowohl in Milz als auch in Lymphknoten auf B-Zellen stark exprimiert. Der Ligand Dll-4 konnte auf naiven B-Zellen sowohl in der Milz als auch im Lymphknoten nicht detektiert werden (Abb.19). Die Analyse der Notch-Liganden Expression ex vivo spricht zunächst gegen eine Notchvermittelte IL-10 Induktion durch B-Zellen, da B-Zellen den Liganden Dll-4 nicht exprimieren. Eventuell wird eine Expression von Dll-4 jedoch erst durch eine Stimulation mit CpG induziert. Daher soll im Folgenden die Notch-Liganden Expression nach Immunisierung mit OVA/CpG untersucht werden. 4.3.3.2.b Notch-Liganden Expression auf B-Zellen nach OVA/CpG Immunisierung Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die Expression der Notch Liganden auf BZellen durch eine Stimulation mit CpG verändert. Hierfür wurden Mäuse nach unserem Immunisierungsprotokoll mit OVA und CpG immunisiert und anschließend die Notch Liganden auf der Oberfläche von B-Zellen gefärbt. Bezugnehmend auf die Bestimmung der Liganden Expression von DZ, wurde auch für die B-Zellen der Zeitpunkt 48h nach Immunisierung gewählt. Abbildung 20. Die Notch-Liganden Expression auf B-Zellen nach OVA/CpG Immunisierung. Naive Mäuse wurden subkutan mit OVA/CpG immunisiert. 48h später wurden Zellen aus Milz und Lymphknoten entnommen und die B-Zellen anhand des Oberflächenmarkers B220 gefärbt und durchflusszytometrisch auf die Expression von Notch-Liganden untersucht. Die grau unterlegte Kurve kennzeichnet die ungefärbten Zellen. Die dünn gezeichnete schwarze Kurve zeigt die Notch-Liganden Expression ex vivo. Die Notch-Liganden Expression nach Immunisierung zeigt die fett gezeichnete schwarze Kurve. In der oberen rechten Ecke des Histogrammes ist jeweils die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für die Färbung ex vivo (dünn) und nach Immunisierung mit OVA/CpG (fett) angegeben. 79 ERGEBNISSE Nach einer Stimulation der B-Zellen durch eine Immunisierung der Mäuse mit CpG und Ovalbumin die Liganden der Jagged-Familie im drainierenden Lymphknoten geringfügig herunter reguliert werden (Jag-1: MFI 92 vs. MFI 72; Jag-2: MFI 120 vs. MFI 85). Hingegen exprimieren die B-Zellen der Milz auch nach Stimulation keine Liganden der Jagged-Familie. Die Dll-1 Expression ist sowohl in Milz als auch im Lymphknoten leicht heraufreguliert (Milz: MFI 346 vs. MFI 392; Lnn.ing.: MFI 220 vs. MFI 228). Die Expression des Liganden Dll-4 ist hingegen unverändert. Er wird weder auf naiven B Zellen noch von B-Zellen nach einer Stimulation mit CpG exprimiert. Die Ergebnisse der Notch-Liganden Färbungen nach einer Stimulation von B-Zellen mit CpG zeigen, dass die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch B-Zellen aufgrund der fehlenden Expression von Dll-4 wahrscheinlich unabhängig vom Notch-Signalweg erfolgt. Eventuell könnten hierfür andere Mechanismen in Frage kommen. 80 5. Diskussion DISKUSSION 5. Diskussion 5.1. Die Aktivierung des Notch Signalweges in vivo 5.1.1. Notch und die T-Zell-Differenzierung Naive T-Zellen differenzieren nach der Erkennung ihres Antigens auf MHC-II-Molekülen in verschiedene Subpopulationen von TH-Zellen. Diese erfüllen unterschiedliche Aufgaben im Rahmen einer Immunantwort. Die Signale, die die Differenzierung der naiven T-Zelle steuern sind vielfältig und bisher nur teilweise aufgeklärt. Bekannt ist eine Steuerung der T-ZellPolarisierung zum einen durch die Sekretion von Zytokinen (39, 51) und zum anderen durch die Expression von ko-stimulatorischen Molekülen durch APZ (8). Zahlreiche Untersuchungen beschäftigen sich in diesem Zusammenhang auch mit der Rolle des NotchSignalweges. Offenbar besitzt dieser hochkonservierte Signalweg das Potential die T-ZellDifferenzierung in vielfältiger Weise zu steuern. So sind sowohl eine TH1- und eine TH2– Differenzierung (142, 144, 157, 194), als auch eine Induktion von regulatorischen T-Zellen beschrieben (179, 182, 195). Das Bild der Notch vermittelten TH-Zell-Differenzierung wird jedoch noch komplexer durch erst kürzlich veröffentlichte Arbeiten der eigenen Arbeitsgruppe. Hier konnte gezeigt werden, dass Notch in vitro TH1-Zellen induziert, die neben dem proinflammatorischen Zytokin IFN- das immunsuppressive Zytokin IL-10 sekretieren (123). Daher sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob der Notch-Signalweg auch in vivo eine Rolle für die IL-10-Induktion in TH1-Zellen spielt. Hierfür wurde ein Protokoll etabliert, um den Notch-Signalweg in vivo zu aktivieren. Durch eine Immunisierung mit dem TLR-Liganden CpG und Ovalbumin konnten Zellen induziert werden, die neben IFN- auch das suppressorische Zytokin IL-10 produzieren. Blockiert man in diesen Zellen den NotchSignalweg so ist die IL-10-Produktion drastisch reduziert. Hier zeigt sich erstmals in vivo eine deutliche Abhängigkeit der IL-10-Induktion in TH1-Zellen von Notch-Signalen. Die Tatsache, dass die transgenen Zellen in vivo nach Aktivierung des Notch-Signalweges ausschließlich die Zytokine IFN-, IL-10, IL-2 und TNF-, nicht aber das TH2-Zytokin IL-4 oder das TH17-Zytokin IL-17 produzieren, spricht für eine Differenzierung in TH1-Zellen und bestätigt Veröffentlichungen, die eine Rolle von Notch für die TH1-Polarisierung zeigen (144, 157, 194). Auffällig in den vorliegenden Experimenten ist jedoch eine stark erhöhte IFN--Produktion der transgenen Zellen nach einer Blockade des Notch-Signalweges in vivo. Dieser Effekt 82 DISKUSSION wurde sowohl nach einer pharmakologischen Inhibition durch einen GSI als auch nach Blockade des Notch Liganden Dll-4 beobachtet. Ein ähnlicher Effekt wurde in der Literatur bereits in RBPj-k defizienten T-Zellen beschrieben, auch hier zeigte sich eine erhöhte IFNSekretion (196). Die Beobachtung der Zunahme der IFN--Produktion nach einer Notch-Blockade passt gut ins Konzept der Selbstregulation von TH1-Zellen. Denkbar ist, dass Notch in TH1-Zellen das Zytokin IL-10 induziert und so das pro-inflammatorische Potential dieser Zelle reduziert, indem die IFN--Sekretion supprimiert wird. Wird nun der Notch-Signalweg in diesen TH1Zellen blockiert, wie in den vorliegenden Versuchen durch die Applikation eines GSI, entfällt ein für die IL-10-Induktion essentielles Signal. Dadurch ist eine Selbstlimitation der TH1Zelle nicht mehr möglich und es kommt zu einer massiven Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IFN-. Diese Selbstregulation von TH1-Zellen durch IL-10 ist in der Literatur bereits vielfach beschrieben worden (121, 122, 197), jedoch waren die zugrunde liegenden Mechanismen bisher nicht bekannt. Diese Arbeit identifiziert Notch als Modulator der Zytokinexpression von TH1-Zellen in vivo und zeigt eine wesentlich komplexere Rolle des Notch-Signalweges für die T-Zell-Differenzierung in vivo als bisher angenommen wurde. 5.1.2. Notch induziert das immunsuppressive Zytokin IL-10 in TH1-Zellen In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Aktivierung des Notch-Signalweges in vivo das Zytokinprofil IFN- produzierender TH1-Zellen so moduliert, dass etwa 30-35% aller TH1-Zellen das immunsuppressive Zytokin IL-10 ko-exprimieren. Diese Beobachtung ist jedoch nicht unerwartet, ist die Rolle des Notch Signalweges für eine IL-10 Induktion doch bereits beschrieben worden (123, 179, 180). Eine Stimulation von humanen CD4+- und CD8+-T-Zellen mit Jag-1 exprimierenden DZ führt zu einer IL-10Induktion (195). Zudem konnte in einem Mausmodell von Allotransplantatabstoßung gezeigt werden, dass das Überleben des Transplantates durch Dll-1 und einer damit einhergehenden IL-10 Induktion verlängert werden kann (182). Auch eine Inhibition der IL-10 Induktion durch pharmakologische Blockade des NotchSignalweges mit GSI konnte bereits gezeigt werden (185). In dieser Studie untersuchen die Autoren den IL-10-Promoter und entdeckten putative Bindungsstellen für RBPj- (185)Offensichtlichwirkt RBPj-bis zu seiner Bindung an Notch als transkriptioneller Repressor und reprimiert so die IL-10 Induktion. Erst nach Notch-Aktivierung und Bindung der intrazellulären Notch-Untereinheit an RBPj-wird die Transkription von IL-10 initiiert. 83 DISKUSSION Diese Veröffentlichung zeigt erstmals eine direkte Regulation der IL-10-Produktion durch Notch. Trotzdem eine generelle IL-10-Induktion durch Notch in der Literatur beschrieben ist, war bisher nicht bekannt, dass Notch insbesondere TH1-Zellen so modulieren kann, dass diese das suppressive IL-10 ko-exprimieren. Unsere in vitro Experimenten zeigten bereits eine starke IL-10-Induktion nach einer retroviralen Überexpression eines Notch-Expressionsplasmids (123). Die vorliegende Arbeit zeigt nun, dass Notch auch für die IL-10-Induktion in TH1Zellen in vivo verantwortlich ist. Zudem wurden die Grundlagen der IL-10-Produktion durch Notch in den meisten bisher veröffentlichten Studien nicht weitergehend untersucht. Insbesondere die Beteiligung der individuellen Liganden wurde bisher kaum adressiert. Und das obwohl eine Steuerung der T-Zell-Differenzierung durch verschiedene Liganden bereits bekannt ist (144). In dieser Arbeit sollte daher die Beteiligung der verschiedenen Liganden an der IL-10-Induktion in TH1-Zellen untersucht werden. 5.2. Die IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch Liganden der Delta-like- Familie Dass die zwei Familien von Notch-Liganden – Delta-like und Jagged - unterschiedliche Funktionen in verschiedensten Systemen erfüllen, ist bereits vielseitig untersucht worden (198). Auch die Differenzierung von naiven T-Zellen durch die Liganden in verschiedene Subpopulationen von TH-Zellen ist bekannt. Während die Liganden der Jagged-Familie zu einer Differenzierung in TH2-Zellen führen, induzieren Delta-Like-Liganden TH1-Zellen (144). Die Rolle der verschiedenen Liganden für eine IL-10 Induktion ist jedoch bisher nur selten adressiert worden und die Ergebnisse weisen eine hohe Diskrepanz auf. Während eine Arbeitsgruppe zeigt, dass im humanen System der Ligand Jag-1 IL-10 in CD4+- und CD8+-TZellen induziert (179), ist in einer anderen Studie eine Induktion von IL-10 durch den Liganden Dll-1 in CD8+-T-Zellen beschrieben (182). Beide Arbeiten untersuchten jedoch die IL-10-Induktion in anderen T-Zell-Populationen als TH1-Zellen. Da in dieser Arbeit, der Notch-Signalweg aktiviert und so IL-10 in TH1-Zellen induziert werden konnte, war es nun möglich die Beteiligung der verschiedenen Liganden an der Regulation der IL-10-Sekretion zu untersuchen. Hierbei zeigte sich, dass einzig eine Blockade des Liganden Dll-4 in vivo in einer 50%igen Reduktion der IL-10 Induktion in TH1-Zellen resultiert. Dies zeigte wiederum, dass über die Hälfte des in TH1-Zellen induzierten IL-10 durch den Notch-Liganden Dll-4 vermittelt ist. Offen ist, ob die noch verbliebenen 50% des IL-10 in einer unvollständigen Blockade des Liganden Dll-4 zu begründen sind oder aber ob „Notch-unabhängige“ Mechanismen an der IL-10-Induktion beteiligt sind. Für eine 84 DISKUSSION unvollständige Blockade von Dll-4 spricht die Tatsache, dass die Inhibition des Notch Signalweges durch einen GSI in einer fast vollständigen Blockade der IL-10-Sekretion resultierte. Während der Ligand Dll-4 offensichtlich der entscheidende Ligand für die IL-10-Induktion in vivo ist, zeigte sich keine Beteiligung von Dll-1. Die IL-10-Sekretion in TH1-Zellen ist nach einer Blockade des Liganden Dll-1 im Vergleich zur Kontrollgruppe unverändert, obwohl eine Dll-1 vermittelte IL-10-Produktion beschrieben ist (182). Hingegen ist die IL-10Expression nach einer Inhibition der Liganden der Jagged-Familie in unseren Experimenten leicht erhöht. Denkbar ist, dass die zwei Familien von Notch-Liganden entgegengesetzte Effekte besitzen oder sich eventuell gegenseitig in ihrer Funktion inhibieren. Dies wurde bereits für die Liganden Dll-4 und Jag-1 in der Angiogenese beschrieben (199). Doch worauf könnten diese gegensätzlichen Funktionen der Notch-Liganden beruhen? Hierfür könnte zum einen die Bindungsaffinitäten der Liganden an die verschiedenen Rezeptoren eine Rolle spielen. Es ist beispielsweise gezeigt, dass der Ligand Dll-4 eine stärkere Affinität für den Notch-1-Rezeptor als der Ligand Dll-1 aufweist (200). Auch in Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten unterschiedliche Bindungsaffinitäten festgestellt werden. Hierbei wies Dll-4 im Vergleich zu den Liganden Dll-1 und Jag-1 die stärkste Affinität gegenüber Notch auf T-Zellen auf (159). Aufgrund dieser Beobachtungen ist eine Regulation der Funktion der verschiedenen Liganden über Bindungsaffinitäten durchaus plausibel. Interessanterweise wird die Bindung der verschiedenen Notch Liganden ebenfalls durch eine Modifizierung der Notch Rezeptoren durch die Glycosyltransferase Fringe reguliert (128, 201, 202). Fringe überträgt Zuckerreste auf Fucosereste an bestimmte EGF repeats der NotchRezeptoren und moduliert so die Bindung der verschiedenen Liganden. Während eine Glykosylierung von Notch-1 die Aktivierung durch Jagged inhibiert, kommt es durch die Modifikation zu einer Potenzierung der aktivierenden Interaktion mit Dll (203, 204). Zudem unterscheiden sich die Liganden der Jagged-Familie hinsichtlich ihres Aufbaus durch eine zusätzliche Cystein-reiche Region, die in den Delta-Like-Liganden nicht enthalten ist (127). Dieser strukturelle Unterschied könnte beispielsweise auch an den gegensätzlichen biologischen Funktionen beteiligt sein, wurde aber bisher nicht weitergehend untersucht. Aufgrund der hier diskutierten unterschiedlichen Bindungsaffinäten der Liganden an die Rezeptoren sowie der hier beschriebenen strukturellen Unterschieden sind verschiedene Funktionen der Notch-Liganden auch in der T-Zell-Differenzierung denkbar und teilweise auch beschrieben. 85 DISKUSSION 5.3. Die IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch verschiedene APZ-Populationen Die durch den Liganden Dll-4 vermittelte IL-10-Induktion ließ im Folgenden die Frage aufkommen, welche Subpopulation von APZ das Notch-Signal an die T-Zelle vermittelt. Antigenpräsentierende Zellen steuern die Differenzierung der T-Zelle in verschiedene Subpopulationen von T-Helfer-Zellen durch die Sekretion polarisierender Zytokine, die Präsentation von Antigen auf MHC-Molekülen, sowie die Vermittlung von kostimulatorischen Molekülen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Induktion von IL-10 in TH1-Zellen durch den Notch-Signalweg und hierbei exklusiv durch den Liganden Delta-like-4 vermittelt ist. Interessanterweise ist die Funktion des Liganden Dll-4 in der Literatur als nicht redundant (205, 206) und seine Expression als stark restringiert beschrieben (188, 207, 208). Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob eventuell auch exklusiv eine Population von APZ durch eine restringierte Expression von Dll-4 an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen beteiligt ist. Hierfür wurden verschiedene APZ Populationen auf die Expression der verschiedenen NotchLiganden untersucht. Die Literatur bietet derzeit keine detaillierten Expressionsdaten der Notch-Liganden auf APZ, insbesondere beziehen sich die wenigen veröffentlichten Daten meist auf mRNA-Analysen. Daher wurde in dieser Arbeit durch Oberflächenfärbungen die Expression der individuellen Notch-Liganden auf Proteinebene auf ex vivo aus Milz und Lymphknoten isolierten DZ analysiert. Die Analyse der Ligandenexpression zeigte, dass alle Subpopulationen von DZ den Liganden Dll-1 exprimieren. Hingegen werden die Liganden der Jagged-Familie ausschließlich von den konventionellen DZ exprimiert. Für den Liganden Dll-4 wurde im Rahmen der Expressionsanalyse auf DZ der Milz und der Lymphknoten festgestellt, dass insbesondere pDZ Dll-4 exprimieren können. Hingegen ist keine Expression auf konventionellen DZ zu beobachten. Ein Vergleich mit bereits veröffentlichten Daten zur Expression von NotchLiganden auf DZ ist in diesem Zusammenhang nicht möglich, da sich die bisher publizierten Studien stets auf die Gesamtheit der DZ der Milz beziehen (209-211). Aufgrund der hier gezeigten Unterschiede in den Expressionsmustern der individuellen DZ Populationen erscheinen diese Daten jedoch fraglich. An die ex vivo Analyse schloss sich im Folgenden eine Untersuchung der Expression von Notch-Liganden auf DZ nach TLR-Stimulation an, da es verschiedentlich Hinweise auf eine Regulation der Notch Liganden durch eine TLR Stimulation gibt (143, 144, 173, 194). Zudem konnte in den vorliegenden Experimenten eine starke IL-10 Induktion in vivo nach der Immunisierung mit dem TLR Agonisten CpG beobachtet werden. Erwartungsgemäss zeigte 86 DISKUSSION eine Stimulation von ex vivo isolierten DZ mit CpG eine Regulation der Notch-Liganden. Während der Ligand Dll-1 auf allen Subpopulationen leicht nach oben reguliert wurde, zeigten ausschließlich die konventionellen DZ eine erhöhte Expression der Jagged-Liganden. Aufgrund der Erkenntnis, dass der Ligand Dll-4 in vivo die IL-10 Induktion vermittelt, wurde besonderes Augenmerk auf die Dll-4-Expression gelegt. Hier konnte gezeigt werden, dass es nach der Stimulation mit CpG zu einer leichten Hochregulation auf myeloiden und einer drastischen Expression von Dll-4 auf pDZ kommt. Da offensichtlich exklusiv pDZ den Liganden Dll-4 ex vivo und nach Stimulation stark exprimieren, wurden im Folgenden insbesondere pDZ bezüglich ihrer Fähigkeit IL-10 zu induzieren untersucht. 5.3.1. Die IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch pDZ 5.3.1.1. pDZ können Immunantworten regulieren pDZ sind eine Subpopulation dendritischer Zellen, die bekannt sind für ihre Fähigkeit große Mengen an Typ-1-Interferonen als Antwort auf eine virale Infektion zu produzieren, um so sowohl Zellen der angeborenen als auch der adaptiven Immunität zu aktivieren (212, 213). Neben ihrer Funktion als wichtige Mediatoren der antiviralen Immunität sind pDZ jedoch auch als Regulatoren von Immunantworten beschrieben, indem sie die Differenzierung von TZellen steuern. pDZ können beispielsweise TH1-Zellen und eine IFN- Produktion induzieren (214, 215). Gleichzeitig sekretieren pDZ das Zytokin IL-12, welches die Induktion von TH1Zellen fördert (212). Auch das von pDZ produzierte IFN- gilt als TH1-polarisierendes Zytokin (216). Daneben ist auch eine Induktion von TH2-Zellen durch pDZ beschrieben (217). Zusätzlich zu der Fähigkeit TH1- bzw. TH2-Zellen zu induzieren, können pDZ durch die Induktion von regulatorischen T-Zellen als auch durch eine Induktion des immunsuppressorischen Zytokins IL-10 an der Suppression einer Immunantwort teilnehmen (218-221). Auch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass pDZ an einer Immunregulation über die Steuerung der T-Zell-Differenzierung beteiligt sein könnten. Sowohl in Ko-Kulturen mit naiven T-Zellen als auch in vivo durch eine Vakzinierung mit Antigen beladenen pDZ werden TH1-Zellen induziert, die neben IFN- das Zytokin IL-10 koexprimieren. Vergleicht man diese Fähigkeit von pDZ mit der konventioneller DZ, so wird deutlich, dass pDZ sehr effiziente Induktoren des Zytokins IL-10 sind. Ko-Kulturen mit pDZ zeigen, dass über 50% aller TH1-Zellen IL-10 koexprimieren, hingegen sind es im Falle der konventionellen DZ nur etwa 20% IL-10-IFN--Doppelproduzenten. Ebenso zeigt die in vivo Vakzinierung mit 87 DISKUSSION Antigen beladenen DZ-Subpopulationen deutliche Unterschiede in der IL-10-Induktion durch pDZ im Vergleich zu konventionellen DZ. Während die Frequenz der IL-10-Produzenten im Falle der konventionellen DZ nur etwa 2-3% beträgt, induzieren pDZ mehr als 45% IL-10Produzenten. Doch welche Mechanismen unterliegen dieser Immunregulation durch pDZ? Hier ist bisher wenig bekannt. Gezeigt wurde, dass pDZ die Differenzierung von T-Zellen über die Expression von kostimulatorischen Molekülen wie OX40-Ligand (217) oder inducible costimulator (ICOS) (193) steuern können. In der vorliegenden Arbeit wurde nun ein neues ko-stimulatorisches Signal für die Steuerung von T-Zell-Antworten durch pDZ beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch den NotchLiganden Dll-4 vermittelt ist und dieser ausschließlich durch pDZ exprimiert wird. Kokultiviert man pDZ mit naiven T-Zellen, so beobachtet man eine deutliche IL-10-Induktion, die durch eine Blockade des Notch-Signalweges fast vollständig aufzuheben ist. Auch die in vivo Induktion von IL-10 in TH1-Zellen durch Vakzinierung mit Antigenbeladenen pDZ, ist durch eine gleichzeitige Behandlung der Tiere mit GSI nahezu vollständig zu blockieren. Interessanterweise ist die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch pDZ bereits in der Literatur als ein durch das Molekül inducible costimulator (ICOS) vermittelter Mechanismus beschrieben worden (193). Daher wurde in dieser Arbeit in einer Ko-Kultur von pDZ mit ICOS defizienten T-Zellen die Rolle von ICOS für die IL-10-Induktion untersucht. Im Vergleich zur Kontrolle sah man eine leichte Reduktion der IL-10-Sekretion in den ICOS defizienten TZellen. Diese Beobachtung entspricht den bereits veröffentlichten Ergebnisse (193). Trotzdem ist in diesem Experiment auffällig, dass erst eine Blockade des Notch Signalweges zu einer nahezu vollständigen Inhibition der IL-10-Produktion führt. Dies spricht wiederum dafür, dass die IL-10-Induktion in unserem Modell zum größten Teil abhängig von Notch ist und der Mechanismus der ICOS induzierten IL-10 Expression hier eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint. Neben der Steuerung der T-Zell-Differenzierung über ko-stimulatorische Moleküle kommt aber auch eine Steuerung über die Sekretion von polarisierenden Zytokinen in Betracht. Hier ist bekannt, dass pDZ nach ihrer Aktivierung das TH1-polarisierende Zytokin IL-12 exprimieren (222, 223). IL-12 ist neben seiner entscheidenden Rolle für die TH1Differenzierung weiterhin für seine fördernde Wirkung auf die IL-10-Expression beschrieben (224-228). Zudem hat unsere Arbeitsgruppe kürzlich gezeigt, dass die Notch vermittelte IL10-Induktion in vitro synergistisch mit dem TH1-polarisierenden Zytokin IL-12 wirkt (123). Dementsprechend könnte man vermuten, dass das von pDZ nach Aktivierung sekretierte IL12, zusätzlich synergistisch zum Notch-Signal auf die IL-10-Induktion wirkt. Für die 88 DISKUSSION Bestätigung dieser Hypothese müssten jedoch weitergehende Untersuchungen durchgeführt werden. Festzuhalten ist, dass pDZ über verschiedene Mechanismen an der Regulation einer Immunantwort teilnehmen können. Diese Arbeit beschreibt den Mechanismus der KoStimulation von T-Zellen durch den von pDZ exprimierten Notch Liganden Dll-4 und die daraus resultierende IL-10 Induktion in TH1-Zellen. Wie jedoch die Ligandenexpression auf pDZ reguliert sein könnte, soll im Folgenden diskutiert werden. 5.3.1.2. Wie wird die Ligandenexpression reguliert? Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten zeigen, dass der Notch-Ligand Dll-4 ein potenter Induktor der IL-10-Sekretion in TH1-Zellen ist. Die Dll-4 vermittelte IL-10-Induktion nach einer Immunisierung mit OVA und CpG macht in den Versuchen der vorliegenden Arbeit etwa 50% der Gesamtexpression des IL-10 aus. Die Expression von Dll-4 muss daher in vivo streng reguliert sein, um eine unerwünschte IL-10-Induktion in Infektionen zu vermeiden, da sie dort der unbedingt benötigten Immunaktivierung entgegenstehen würde. Erst bei der Gefahr einer Überaktivierung des Immunsystems sollte Dll-4 reguliert werden und eine IL10-Induktion initiiert werden. Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass pDZ den Notch-Liganden Dll-4 bereits ex vivo in großen Mengen exprimieren. Daher stellt sich zunächst die Frage, warum die ex vivo Expression von Dll-4 auf pDZ nicht ein stetiges Signal für die IL-10 Induktion an die TZellen vermittelt? Dies lässt sich vermutlich darin begründen, dass die Aktivierung einer TZelle neben einer Präsentation von Antigen auch die Anwesenheit von ko-stimulatorischen Molekülen wie CD80, CD86 oder CD40 erfordert (8). Diese werden jedoch von pDZ nur nach Aktivierung exprimiert (229), so dass eine nicht aktivierte pDZ zwar Dll-4, nicht jedoch die für die Aktivierung einer T-Zelle notwendige Ko-Stimulation bereitsstellen kann. Hinzu kommt, dass der Effekt der Notch-vermittelten IL-10 Induktion die Expression proinflammatorischer Zytokine wie IL-12 benötigt (123). Dies bedeutet wiederum, dass allein die Expression von Dll-4 auf der Oberfläche von nicht aktivierten pDZ keine IL-10 Induktion hervorruft. Wird die pDZ hingegen aktiviert und sekretiert das pro-inflammatorische Zytokin IL-12, ist eine IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch eine Interaktion von Dll-4 und Notch auf der T-Zelle möglich. In diesem Zusammenhang stellt sich jedoch dann die Frage, warum der Notch-Ligand Dll-4 überhaupt ex vivo in so großen Mengen durch pDZ exprimiert wird? Hier lässt sich nur 89 DISKUSSION vermuten, dass Dll-4 stetig exprimiert wird, um im Falle einer Aktivierung der pDZ eine schnelle Bereitstellung des Notch-Signales zu gewährleisten. Doch auch nach der Aktivierung der pDZ muss die Expression von Dll-4 reguliert sein, um die IL-10-Induktion zu kontrollieren. Dies könnte zum einen direkt über die Stimulation des TLR-9 durch CpG erfolgen. Die Stimulation von pDZ über TLR-9 führt zur Aktivierung multipler Signalkaskaden, die die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen und ko-stimulatorischen Molekülen in pDZ initiieren (230). Es lässt sich nur vermuten, dass eventuell auch die Transkription der Notch-Liganden und somit deren Expression auf pDZ über TLR-Stimuli und den damit verbundenen Signalkaskaden reguliert ist. Hinweise darauf finden sich in der Literatur (144), jedoch erscheint diese Art der Regulation nicht sehr wahrscheinlich, denn das würde bedeuten, dass jede Stimulation und Aktivierung von pDZ über TLR-9 gleichwohl mit einer Regulation von Dll-4 und somit einer IL-10-Induktion verbunden ist. Dies würde jedoch einer adequaten Immunantwort durch eine gleichzeitige Suppression entgegenstehen. Daher stellt sich die Frage, ob eventuell Rückkopplungsmechanismen existieren, die die Expression der Liganden Dll-4 und somit die IL-10-Induktion regulieren könnten. Denkbar wäre ein Mechanismus der über das von pDZ sekretierte Zytokin IFN- vermittelt ist. Dafür spricht, dass eine Stimulation von pDZ über TLR-9 zu einer Aktivierung und einer damit verbundenen IFN- Sekretion führt (231, 232). Die IFN-Produktion wurde auch bereits mit einer IL-10 Induktion in Verbindung gebracht (233). Denkbar wäre daher, dass IFN- möglicherweise einen Rückkopplungsmechanismus auslöst, der die Dll-4 Expression auf pDZ reguliert. Für einen solchen Mechanismus spricht zudem die in den vorliegenden Experimenten beobachtete verzögerte Expression der Notch-Liganden. Erst nach 48-72h war eine deutlich erhöhte Expression des Liganden Dll-4 auf der Oberfläche von pDZ zu detektieren. Dies spricht gegen eine direkte Regulation des Liganden über den TLR-Stimulus und für einen zwischengeschalteten Mechanismus, der die verzögerte Expression bedingt. Jedoch bedarf die genaue Klärung dieses zugrunde liegenden Mechanismus weiterer Untersuchungen, die sich dieser Arbeit anschließen könnten. 5.3.1.3. pDZ als Induktoren einer Immunantwort Die vorliegende Arbeit beschreibt einen Mechanismus mithilfe dessen pDZ IL-10 in TH1Zellen induzieren können und es wird gezeigt, dass pDZ aktiv an der Steuerung der T-ZellDifferenzierung teilnehmen. Die T-Zell-Differenzierung setzt jedoch eine effektive Antigenpräsentation durch pDZ voraus. Die Effektivität dieser Fähigkeit durch pDZ ist 90 DISKUSSION derzeit jedoch trotz der zahlreichen Publikationen, die pDZ im Zusammenhang mit einer erfolgreichen T-Zell-Polarisierung beschreiben, kontrovers diskutiert. Konventionelle DZ sind als auf die Aufnahme und die Präsentation von Antigen hochspezialisierte Zellen beschrieben (15). Durch die Expression von unterschiedlichsten Rezeptoren sind sie in der Lage nahezu jedes extrazelluläre Material zu phagozytieren und das prozessierte Antigen im Folgenden zu präsentieren (234). Im Gegensatz hierzu ist die Fähigkeit der Phagozytose von pDZ umstritten. Zahlreiche Studien sowohl im humanen als auch murinen System zeigen, dass pDZ weder tote Zellen, noch Zymosan oder künstliche Partikel phagozytieren können (235-238), andere Studien jedoch zeigen das Gegenteil (239, 240). Vermutlich beruhen die kontroversen Resultate dieser Studien auf der Tatsache, dass pDZ unter verschiedenen Stimulationsbedingungen untersucht wurden. Unumstritten und für diese Arbeit essentiell ist in diesem Zusammenhang jedoch, dass pDZ lösliches Protein wie Ovalbumin in vivo und in vitro durch Makro- bzw. Mikropinozytose aufnehmen können (241243). Neben ihrer hohen endozytotischen Aktivität zeichnen sich konventionelle DZ durch einen weiteren entscheidenden Vorteil für die Antigenpräsentation aus. Konventionelle DZ können nach ihrer Aktivierung im Vergleich zu pDZ langlebige MHC-II-Peptid-Komplexe auf der Oberfläche exprimieren. Dies ist durch Unterschiede in der Synthese der MHC-Moleküle begründet. Sowohl in konventionellen DZ als auch in pDZ unterliegt die Expression von MHC-Molekülen auf der Oberfläche einem ständigen Wechsel zwischen der Neu-Synthese und dem endosomalen Abbau bereits existierender MHC-Moleküle (244-246). Nach einer Aktivierung kommt es in den konventionellen DZ zu einer Reprimierung des Haupttranskriptionsfaktors der MHC-Synthese CIITA (247) und es wird so eine NeuSynthese von MHC-Molekülen unterbunden (246, 248). Hierdurch verzögert sich natürlich auch der Abbau bereits bestehender MHC-Komplexe auf der Oberfläche und konventionelle DZ verfügen daher über langlebige, stabile MHC-II-Peptid-Moleküle für die Antigenpräsentation (244). Im Gegensatz hierzu wird die MHC-II-Synthese auf der Oberfläche von aktivierten pDZ nicht reguliert (243, 249). Das bedeutet wiederum, dass pDZ nicht die Fähigkeit besitzen, langlebige MHC-II-Peptid Komplexe zu exprimieren und sich das nachteilig auf die Antigenpräsentation auswirken könnte (243). Aufgrund ihrer im Vergleich zu konventionellen DZ beeinträchtigten Fähigkeit der Antigenpräsentation wird derzeit diskutiert, ob pDZ vielleicht weniger die APZ sind, die die naive T-Zelle primär stimulieren oder ob sie vielmehr den Infektionsort erst dann erreichen, wenn die Immunantwort bereits initiiert ist, um dort bereits Antigenerfahrene T-Zellen zu 91 DISKUSSION stimulieren. Zu dieser Hypothese passt die Beobachtung, dass in zahlreichen Krankheitsmodellen eine Akkumulation von pDZ am Infektionsort beschrieben wurde (250256). Zudem exprimieren pDZ Moleküle wie E-Selektin und zahlreiche Chemokinrezeptoren und könnten so über die Vermittlung von Entzündungsmediatoren den Infektionsort penetrieren (257) und dort eventuell bereits initiierte Immunantworten durch eine Sekundärstimulation der T-Zellen regulieren oder sogar neu ausrichten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen trotz den bereits veröffentlichten teils kontroversen Daten zur Fähigkeit der Antigenpräsentation, dass pDZ naive T-Zellen sowohl in vivo als auch in vitro aktivieren und stimulieren können. Trotzdem ist derzeit nicht klar, ob pDZ innerhalb einer Infektion in vivo das Dll-4/Notch-Signal und die damit verbundene IL-10 Induktion als Primärstimulation an eine naive T-Zelle oder als Sekundärstimulation an die bereits polarisierte TH1-Zelle vermitteln. Für den in dieser Arbeit beschriebenen Mechanismus der Notch vermittelten IL-10 Induktion durch pDZ wären beide Varianten der T-Zell-Aktivierung denkbar. 5.3.2. Die IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch konventionelle DZ In dieser Arbeit wurde die Beteiligung verschiedener APZ-Populationen an der Notch vermittelten IL-10-Induktion in TH1-Zellen untersucht. Hierbei wurden auch die auf die Antigenpräsentation hochspezialisierten konventionellen DZ auf ihre Fähigkeit der IL-10Induktion untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass konventionelle DZ sowohl in vitro als auch in vivo vergleichsweise schwache Induktoren des Zytokins IL-10 in TH1-Zellen sind. Jedoch lassen sich innerhalb der konventionellen DZ Subpopulationen anhand der Expression des Oberflächenmoleküls CD11b die myeloiden und die lymphoiden DZ unterscheiden. Für beide Subpopulationen sind bereits Unterschiede in der Steuerung der T-Zell-Differenzierung beschrieben (258, 259). Auch in den hier durchgeführten Ko-Kultur Experimenten war auffällig, dass trotz einer vergleichsweise schwachen IL-10 Induktion, insbesondere die myeloiden DZ nach Aktivierung mit CpG moderat IL-10 in TH1-Zellen induzieren konnten. Durch die Blockade des Notch Signalweges war diese IL-10 Produktion nahezu vollständig aufzuheben. Ausgehend von der Tatsache, dass die IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo durch den Notch-Liganden Dll-4 vermittelt ist, wurde das Expressionsprofil konventioneller DZ untersucht. Myeloide DZ exprimieren wie lymphoide DZ ex vivo kein Dll-4, jedoch zeigen die vorliegenden Ergebnisse nach einer Stimulation mit CpG eine leichte Hochregulation des Liganden Dll-4 auf myeloiden DZ. Dies erklärt die Ergebnisse der Ko-Kulturversuche und 92 DISKUSSION zeigt, dass offensichtlich auch myeloide DZ durch eine Aktivierung des Notch-Signalweges die Fähigkeit erlangen, IL-10 in TH1-Zellen zu induzieren. Jedoch sind sie, betrachtet man die Frequenz der IL-10-Produzenten, vergleichsweise schwache Induktoren im Gegensatz zu pDZ. Dies kann jedoch in den Stimulationsbedingungen begründet sein. Die Literatur bietet verschiedentlich Hinweise auf eine Regulation des an der IL-10-Induktion beteiligten Liganden Dll-4 auf konventionellen DZ durch andere TLR-Stimuli, wie beispielsweise durch den TLR-4 Agonisten LPS (194, 260). Die Stimulation von APZ mit anderen TLR-Liganden und ihre Rolle für die Liganden Expression und die möglicherweise daraus folgende IL-10 Induktion wurden jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht. Grundsätzlich kann eine Beteiligung konventioneller DZ an der IL-10-Induktion in vivo nicht ausgeschlossen werden, sondern es sollte vielmehr untersucht werden unter welchen Bedingungen verschiedene Subpopulationen von DZ, die Fähigkeit der IL-10 Induktion erlangen. 5.3.3. Die IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch B-Zellen In dieser Arbeit wurde weiterhin untersucht, ob auch B-Zellen als APZ an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo beteiligt sein könnten. B-Zellen können sowohl lösliches als auch membrangebundenes Antigen mithilfe ihres BZR erkennen und durch Präsentation des Antigens auf MHC-II-Molekülen CD4+-Helferzellen aktivieren (14, 261-263). Zahlreiche Studien beschreiben B-Zellen als tolerogene APZ. Beispielsweise wurde gezeigt, dass eine Präsentation des Antigens durch naive B-Zellen in vitro zu einer Inhibition der Proliferation sowie zur Apoptose von T-Zellen führt (264). Ebenso beschrieben ist, dass die Präsentation von Antigen durch B-Zellen in vivo in tolerogenen T Zellen resultiert (265, 266). Aber können B-Zellen auch die Polarisierung von TH-Zellen steuern? Hier ist bisher nur eine durch B-Zellen vermittelte Induktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen beschrieben (267). Hinsichtlich der Differenzierung in andere TH-Zell-Subpopulationen ist bisher wenig bekannt. Im Allgemeinen wird jedoch angenommen, dass B-Zellen TH2-Zellen induzieren, da diese für die Aktivierung und Differenzierung einer B-Zelle in eine Plasmazelle unabdingbar sind. Hinsichtlich des immunsuppressiven Zytokins IL-10 ist bisher ausschließlich bekannt, dass BZellen selbst IL-10 produzieren können und so Immunantworten supprimieren können (268), jedoch gibt es außer der Induktion von Treg bisher keinen Hinweis auf eine durch B-Zellen vermittelte IL-10 Induktion in T-Zellen. In den vorliegenden Experimenten wurde untersucht, ob B-Zellen als APZ eine Rolle für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen spielen. Hierfür wurden B-Zell-defiziente Mäuse JHT-/- Mäuse 93 DISKUSSION nach dem Transfer von naiven OVA-TZR-transgenen T-Zellen mit OVA und CpG immunisiert. Interessanterweise war die Frequenz der IL-10-Produzenten innerhalb der TH1Zellen in diesen Mäusen im Vergleich zur Kontrolle um 30-40% reduziert. Jedoch sollte bei der Interpretation dieser Ergebnisse in Betracht gezogen werden, dass JHT-/- Mäuse aufgrund des Fehlens des kompletten B-Zell-Kompartimentes kein intaktes Immunsystem besitzen. Demnach kann in einem derart artifiziellen System eine unzureichende T-Zell-Aktivierung nicht ausgeschlossen werden. Trotzdem wurde im Folgenden anhand von Oberflächenfärbungen die Expression des Liganden Dll-4 auf B-Zellen bestimmt, da die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit eine Abhängigkeit der IL-10 Induktion von dem Notch Liganden Dll-4 zeigen. Hierbei wurde deutlich, dass B-Zellen den Liganden Dll-4 sowohl ex vivo als auch nach Stimulation mit CpG nicht exprimieren. Daher ist davon auszugehen, dass B-Zellen nicht an der Notch vermittelten IL-10-Induktion in vivo teilnehmen. Die verminderte Frequenz der IL-10-Produzenten in B-Zell-defizienten Mäusen deutet jedoch eventuell auf andere Mechanismen der IL-10-Induktion. Diese wurden jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht weitergehend untersucht. 5.4. Die Notchvermittelte Immunregulation durch pDZ als Mechanismus der Selbstlimitation? Das immunsuppressive Zytokin IL-10 ist für die Aufrechterhaltung einer Immunregulation unabdingbar (78-81). Zahlreiche Studien beschreiben Krankheitsmodelle, in denen IL-10 die Immunreaktion des Wirtes in Infektionen limitiert und somit die Entzündung und die damit einhergehende Gewebszerstörung begrenzt. Eine Ablation des IL-10-Signales führt oftmals zu einem fatalen Ausgang der Infektion durch eine ungehemmte Aktivierung des Immunsystems. Inzwischen ist bekannt, dass IL-10 nicht nur als Effektorzytokin von Treg produziert wird, sondern dass auch andere T-Zell-Populationen, insbesondere auch die Zellen der Immunabwehr, wie TH1-, TH2- und TH17-Zellen, das Zytokin IL-10 produzieren können. Insbesondere IFN-IL-10-Doppelproduzenten sind seit langem bekannt und wurden sowohl im Menschen als auch in der Maus in diversen Krankheitsgeschehen beschrieben (269-273). Jedoch wurde die Rolle dieser Zellen erst kürzlich näher untersucht. Es zeigte sich, dass in einer Infektion mit dem Parasiten T.gondii die Schädigung des Wirtes nicht primär durch das Pathogen selbst, sondern vielmehr durch die übermässige Aktivierung des Immunsystems erfolgt. TH1-Zellen wurden in diesem Modell interessanterweise als die entscheidende Quelle für das protektive IL-10 identifiziert (270). Eine Ablation von IL-10 führte zu einem tödlichen Ausgang der Infektion, die durch ein Überschießen der Immunantwort und eine massive IFN94 DISKUSSION -Produktion gekennzeichnet war (197). Diese und auch andere Publikationen zeigten erstmals, dass sich TH1-Zellen in vivo in Infektionen durch die Sekretion von IL-10 selbst regulieren können (121, 122). Demnach muss innerhalb einer Immunreaktion stets ein Gleichgewicht gefunden werden zwischen einer effektiven Bekämpfung des Pathogens und einer gleichzeitigen Suppression der Immunantwort, um Schädigungen des Wirtes zu verhindern (45, 274). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen der IL-10 Produktion von TH1-Zellen ist derzeit Gegenstand intensiver Forschungen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen nun, dass pDZ über die Expression des Notch-Liganden Dll-4 das immunsuppressive Zytokin IL-10 in TH1-Zellen induzieren und so an der Regulation von Immunantworten beteiligt sein könnten. Interessanterweise zeigen zahlreiche Studien, dass pDZ Immunantworten in Infektionen kontrollieren und abschwächen können, und so eine Immunpathologie verhindern. Beispielsweise führt eine Depletion von pDZ vor der Inhalation von normalerweise harmlosem Antigen zu einer massiven TH2-Antwort mit den Kardinalsymptomen von Asthma. Hingegen schützt der adoptive Transfer von pDZ vor der Sensibilisierung mit diesem Antigen vor einer entzündlicher Reaktion (241). Eine andere Studie zeigt, dass pDZ eine Immunpathologie in der Lunge nach einer Infektion mit dem respiratory syncytial virus (RSV) verhindern können (251). Denkbar wäre in diesem Zusammenhang eine Beteiligung von pDZ an der Regulation an pro-inflammatorischen Immunantworten durch ihre Fähigkeit der IL-10-Induktion in TH1-Zellen. Folgendes Modell könnte hierfür in Frage kommen: eingedrungene Pathogene aktivieren naive pDZ, welche daraufhin das Zytokin IL-12 sekretieren und das Antigen präsentieren. Unter dem Einfluss des Zytokins IL-12 differenzieren naive T-Zellen in TH1-Zellen, die durch eine Produktion von IFN- gekennzeichnet sind. Gleichzeitig wird durch eine Stimulation mit dem TLR-9 Agonisten der Notch-Ligand Dll-4 auf pDZ reguliert. Ob eine direkte Regulation über den TLR-Stimulus stattfindet oder ob andere Rückkopplungsmechanismen wie beispielsweise IFN- an der Dll-4 Expression beteiligt sind, ist derzeit noch fraglich. Das durch den Liganden Dll-4 vermittelte Notch-Signal moduliert im Folgenden die TH1-Zelle und führt zur Expression von IL-10. Durch die Produktion von IL-10 erlangt die proinflammatorische TH1-Zelle nun das Potential sich selbst zu regulieren. Dieses Modell steht im Einklang mit den gemachten Beobachtungen, jedoch sollte aufgrund der bereits diskutierten umstrittenen Fähigkeit der Antigenpräsentation von pDZ folgende Überlegung mit in die Diskussion aufgenommen werden. Obwohl sowohl die Ergebnisse der Ko-Kultur Versuche sowie die Daten der in vivo Vakzinierung für eine direkte T-Zell95 DISKUSSION Aktivierung durch pDZ sprechen, muss man aufgrund der veröffentlichten Literatur für das vorgeschlagene Modell in Betracht ziehen, dass pDZ vielleicht in vivo weniger notwendig für die Initiierung einer Immunantwort im Lymphknoten sind, sondern vielmehr bereits initiierte T-Zell-Antworten am Infektionsort durch die Sekretion von Zytokinen, wie IL-12, oder die Vermittlung von ko-stimulatorischen Signalen, wie Dll-4/Notch, als Sekundärstimulus modulieren. Dementsprechend ist das vorgeschlagene Modell dahingehend zu erweitern, dass es auch durchaus denkbar ist, dass bereits durch konventionelle DZ stimulierte TH1-Zellen am Infektionsort durch aktivierte Dll-4 exprimierende pDZ einen Sekundärstimulus erhalten und zur IL-10 Induktion und Selbstregulation angeregt werden. Der in dieser Arbeit beschriebene Mechanismus der IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch pDZ bietet jedoch unabhängig von der Art der Stimulation durch pDZ, im Lymphknoten oder am Infektionsort, interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen - insbesondere in Krankheitsmodellen, die eine Akkumulation von pDZ beschreiben, in denen die Rolle von pDZ jedoch bisher nicht hinreichend bekannt ist. 5.5. Hat der Notch-Signalweg therapeutisches Potential? Das therapeutische Potential des Notch-Signalweges ist bereits für zahlreiche Krankheitsmodelle untersucht und beschrieben worden (275). Beispielsweise werden Sekretase Inhibitoren zur Blockade der Generierung des für die Pathogenese der Erkrankung verantwortliche A-Peptides in der Therapie der Alzheimerschen Krankheit eingesetzt (276). Ebenso wurden -Sekretase-Inhibitoren oder blockierende Antikörper (188) wegen ihrer antitumoralen Wirkung sowie ihrer Bedeutung für die Gefäßbildung in der Therapie von malignen Tumoren angewendet (277, 278) Das Problem bei der Behandlung von Erkrankungen mit -Sekretase-Inhibitoren sind jedoch stets die zahlreichen unerwünschten Nebeneffekte. Hervorzuheben ist in diesem Zusammenhang insbesondere die Zytotoxizität im Gastrointestinaltrakt nach Blockade des Notch-Signalweges (279). Dies ist darin begründet, dass der Notch Signalweg in eine Vielzahl von Zell-Differenzierung-Prozessen involviert ist. Daher gestalten sich Therapieversuche, die die Applikation eines GSI einschließen schwierig. Trotzdem bietet der Notch-Signalweg für die Immunologie großes therapeutisches Potential, da er offensichtlich an der Steuerung der Differenzierung von T-Zellen teilnimmt. Hierbei ist insbesondere der Effekt des Notch-Signalweges auf die IL-10-Induktion in TH1-Zellen von Interesse. IL-10-IFN-Doppelproduzenten treten in zahlreichen Infektionen auf und sind für eine wirksame Bekämpfung des Pathogens bei gleichzeitigem Schutz des Organismus vor Schädigung durch übermässige Aktivierung des Immunsystems essentiell (45, 274, 280). 96 DISKUSSION Autoimmunerkrankungen hingegen, die durch proinflammatorischer TH1- und TH17-Zellen vermittelt werden, zeichnen sich durch eine Aktivierung und eine Reaktion des Immunsystems gegen körpereigenes Gewebe aus. In diesen Fällen scheint die Selbstregulation des Immunsystems nicht zu funktionieren. Verschiedene experimentelle Ansätze zeigen nun, dass IL-10 in diesen Autoimmunerkrankungen protektiv wirkt (74, 109, 281-285). Daher wäre es wünschenswert eine Produktion des Zytokins IL-10 in diesen Krankheitsmodellen zu induzieren oder zu verstärken. Es wäre daher denkbar, dass man durch eine gezielte Aktivierung des Notch-Signalweges in vivo, die IL-10 Produktion in TH1-Zellen anschaltet und somit ihr pro-inflammatorisches Potential minimiert. Dies könnte zum einen durch eine Stimulation von Notch durch Antikörper oder durch die Herstellung eines rekombinanten Dll-4 geschehen. Darüber hinaus wäre eine Vakzinierung mit voraktivierten pDZ möglich. Eventuell käme auch eine Impfung mit CpG zur Aktivierung von pDZ in vivo in Frage. Doch nicht in allen Krankheitsmodellen ist eine IL-10-Induktion erwünscht. In chronischen Infektionen ist es oftmals das dort sekretierte IL-10, welches eine optimale Eliminierung des Pathogen verhindert. Hier wäre es denkbar die Interaktion von Notch mit Dll-4 durch Antikörper zu blockieren oder den Notch-Signalweg durch einen-Sekretase-Inhibitor zu blockieren. Der Notch-Signalweg bietet interessante Therapieansätze insbesondere in Autoimmunerkrankungen oder chronischen Entzündungen. Um jedoch letztendlich Aussagen über das therapeutische Potential des Notch Signalweges treffen zu können, sollte zunächst in Mausmodellen verschiedener Autoimmunerkrankungen oder chronischen Entzündungen untersucht werden, wo die Notch-vermittelte IL-10-Induktion in TH1-Zellen durch pDZ in vivo eine Rolle spielt, um diesen Mechanismus dann gezielt zu aktivieren oder zu blockieren. 97 DISKUSSION 5.6 Ausblick und offene Fragen In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass pDZ Immunantworten durch die Induktion von IL-10 in TH1-Zellen regulieren und steuern können. PDZ bedienen sich hierfür des NotchSignalweges. Das Projekt eröffnet derzeit vielfältige interessante Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen. Zum einen könnten die Mechanismen der Regulation der Liganden auf pDZ genauer untersucht werden. Hierfür wäre beispielsweise eine genauere Untersuchung der IL-10 Induktion durch feedback Mechanismen wie IFNinteressant. Zum anderen stand bisher ausschließlich die Untersuchung der durch pDZ vermittelten IL-10 Induktion in TH1-Zellen im Fokus dieser Arbeit. Jedoch sollte auch die Rolle anderer APZ Populationen für die Notchvermittelte Immunregulation in vivo untersucht werden. Beispielsweise ist die Beteiligung von Makrophagen an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo noch gänzlich unklar. Hingegen zeigte eine erste Analyse der Beteiligung von B-Zellen, dass diese zwar nicht über den Mechanismus der Dll4/Notch-Interaktion an der IL-10 Induktion teilnehmen, wohl aber andere Mechanismen eine Rolle spielen könnten. Hier sollte sich eine genauere Untersuchung der Beteiligung von B-Zellen anschließen. Desweiteren sollte untersucht werden in welchen Krankheitsmodellen, die hier beschriebene Immunregulation durch pDZ eine Rolle spielen könnte. Hierfür sollen Krankheitsmodelle wie Toxoplasmose oder Leishmaniose untersucht werden, in denen das Auftreten von IL-10+IFN+ Doppelproduzenten bereits beschrieben wurde. In einem weiteren Schritt sollen dann Krankheitsmodelle wie Asthma, Influenza oder RSVV untersucht werden, in denen eine Immunregulation durch pDZ bereits bekannt ist. In den hier aufgeführten Krankheitsmodellen wäre interessant, ob eine Blockade des Notch-Signalweges durch -Sekretase-Inhibitor, eine Blockade des Liganden Dll-4 oder eine Depletion von pDZ zu einer Reduktion der IL-10 Sekretion in diesen Modellen führt oder den Ausgang der Krankheit verändert. Diese Untersuchungen werden derzeit innerhalb der eigenen Arbeitsgruppe beziehungsweise in Kooperationen mit anderen Arbeitsgruppen durchgeführt. Ein weiterer interessanter Ansatzpunkt ist die Untersuchung der Möglichkeiten den hier beschriebenen Mechanismus der IL-10 Induktion durch pDZ therapeutisch nutzen zu können. Hier könnte zum einen versucht werden durch die Gabe von Notch stimulierenden Antikörpern, rekombinantem Dll-4 oder voraktivierten pDZ das suppressorische Zytokin IL10 in pro-inflammatorischen Immunantworten zu induzieren und diese so zu kontrollieren und abzuschwächen. Zum anderen könnten durch pDZ modulierte T-Zellen auf ihrer 98 DISKUSSION Suppressivität gegenüber autoreaktiven T-Zellen in verschiedenen Krankheitsmodellen getestet werden. Abschließend soll in einem weiteren Teilprojekt in unserer Arbeitsgruppe die Übertragbarkeit der hier im Mausmodell gemachten Beobachtungen auf den Menschen untersucht werden. 99 100 6. Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG TH1-Zellen können neben dem pro-inflammatorischen Zytokin IFN- auch das immunsuppressive Zytokin IL-10 exprimieren. Die auf diese Weise erzielte Selbstlimitierung von TH1-Immunantworten ist für den Organismus, wie bereits in Krankheitsmodellen wie Leishmaniose oder Toxoplasmose beschrieben, von entscheidender Bedeutung. Dennoch ist die Regulation dieser IL-10 Produktion in TH1-Zellen bisher nur unzureichend verstanden. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass der Notch-Signalweg eine grundlegende Rolle in der Regulation der IL-10 Produktion von TH1-Zellen spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser in vitro beschriebene Mechanismus der Notch-vermittelten IL-10 Induktion nun in vivo näher untersucht. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass der Notch-Signalweg auch in vivo eine entscheidende Rolle in der Regulation der Selbstlimitierung pro-inflammatorischer T-Zell-Antworten durch die Induktion von IL-10 in TH1-Zellen darstellt. Eine Immunisierung mit Ovalbumin und dem TLR-Liganden CpG führte zu einer starken IL-10 Induktion in TH1-Zellen, die durch eine pharmakologische Blockade des Notch-Signalweges in vivo nahezu vollständig aufzuheben ist. Bei der Untersuchung der an der IL-10 Induktion beteiligten Notch-Liganden stellte sich heraus, dass insbesondere die Aktivierung von Notch durch den Liganden Delta-like 4 zur Expression des immunsuppressiven Zytokins IL-10 in TH1-Zellen führt. Daher wurde im Folgenden untersucht, welche APZ den Liganden Delta-like 4 exprimieren und so maßgeblich an der IL-10 Induktion in vivo beteiligt sein könnten. Hierbei zeigte sich, dass exklusiv die plasmazytoiden dendritischen Zellen den Liganden Delta-like 4 ex vivo in großen Mengen exprimieren und die Expression des IL-10 induzierenden Notch-Liganden Dll-4 auf pDZ durch die Stimulation mit dem TLR-Liganden CpG noch verstärkt wird. Interessanterweise zeigten weitergehende Untersuchungen, dass insbesondere pDZ im Vergleich zu anderen APZ Populationen sehr effiziente Induktoren von IL-10 in TH1-Zellen sind und diese IL-10 Induktion sowohl in vitro als auch in vitro abhängig von einer Aktivierung des NotchSignalweges ist. Die vorliegende Arbeit beschreibt daher einen Mechanismus, mithilfe dessen pDZ über die Delta-like 4 vermittelte Aktivierung des Notch-Signalweges TH1-Immunantworten regulieren können, in dem sie zusätzlich zur Expression des pro-inflammatorischen Zytokins IFN- eine Expression des suppressiven Zytokins IL-10 TH1-Zellen induzieren. Der hier beschriebene Mechanismus ist auch therapeutisch durchaus interessant, bietet er doch die Möglichkeit in Autoimmunerkrankungen, die durch pro-inflammatorische TH1-Zellen vermittelt werden, durch eine gezielte Aktivierung von Notch, die IL-10 Produktion pathogener autoreaktiver TH1-Zellen zu stärken und damit ihr pro-inflammatorisches Potential zu vermindern. Dies 102 ZUSAMMENFASSUNG könnte zum einen durch eine Stimulation von Notch mit Antikörpern oder einem rekombinant hergestellten Notch-Liganden Dll-4 geschehen, oder aber auch über eine Stimulation mit Dll4 exprimierenden pDZ. In anderen Fällen könnte in chronischen Infektionen oder auch in der Tumorbekämpfung, in der eine Expression des Zytokins IL-10 unerwünscht ist, da es die Immunreaktion supprimiert, durch eine gezielte Blockade der Notch/Dll-4 Interaktion die IL10 Produktion begrenzt werden und so eine wirksame Immunreaktion ermöglicht werden. 103 104 7. Summary SUMMARY Role of the Notch Signalling pathway for the modulation of inflammatory T cell responses Pro-inflammatory TH1 cells can produce large amounts of the immunosuppressive cytokine IL-10. This may reflect a regulatory mechanism that seems to be essential for the selflimitation of inflammatory T cell responses as it has been shown in disease models such as leishmaniosis or toxoplasmosis. In our group we could recently show that the Notch signalling pathway is a main regulator of IL-10 production by TH1 cells. In the present work, the mechanism of the Notch-mediated IL-10 induction has been further investigated in vivo. The results of the present thesis demonstrate that the Notch signalling pathway also plays a prominent role in the regulation of the self limitation of inflammatory T cell responses by the induction of IL-10 in TH1 cells in vivo. IL-10 induction in TH1 cells could be induced by an immunisation with Ovalbumin and Toll-like receptor 9 ligand CpG in vivo and was strongly reduced by pharmacological inhibition of Notch signalling. The contribution of the individual Notch ligands for IL-10 induction in TH1 cells in vivo was further investigated by the application of Notch ligand blocking antibodies and the given results clearly suggest that IL10 induction in vivo is dependent on the Notch ligand Delta-like 4 (Dll-4). Hence, it was examined which subset of antigen presenting cells (APC) expresses the Notch ligand Dll-4 and could therefore be involved in the IL-10 induction in vivo. Interestingly, the expression of Dll-4 was found to be largely restricted to the APC subset of plasmacytoid dendritic cells (pDC) and was selectively acquired upon stimulation with Toll-like receptor 9 ligand CpG in vitro and in vivo. Furthermore, pDC, compared to other APC subsets, were most efficient in inducing IL-10 production by TH1 cells both in vitro and in vivo in a Dll-4/Notch dependent manner. The present thesis describes a mechanism by which pDC can regulate an immune response by inducing IL-10 production by TH1 cells. The given data contribute to a better understanding of the self limitation of inflammatory T cell responses and has implications for future therapeutic interventions for TH1 driven autoimmune diseases. This can be done by strengthening the IL10 production of potentially autoreactive TH1 cells by activation of Notch either by stimulation with Notch antibodies or recombinant Dll-4 or a vaccination with Dll-4 expressing pDC. On the other hand one could block Notch/Dll-4 interactions in chronic infections or in tumor models where IL-10 expression is undesirable, to enable an appropriate immune response. 106 8. Literaturverzeichnis LITERATUR 1. Janeway, C.A., Jr., and R. Medzhitov. 2002. Innate immune recognition. Annu.Rev.Immunol. 20:197-216. 2. Delves, P.J., and I.M. Roitt. 2000. The immune system. First of two parts. N.Engl.J.Med. 343:37-49. 3. Delves, P.J., and I.M. Roitt. 2000. The immune system. Second of two parts. N.Engl.J.Med. 343:108-117. 4. Bjorkman, P.J. 1997. MHC restriction in three dimensions: a view of T cell receptor/ligand interactions. Cell 89:167-170. 5. Atkinson, E.A., and R.C. Bleackley. 1995. Mechanisms of lysis by cytotoxic T cells. Crit Rev.Immunol. 15:359-384. 6. Dubey, C., M. Croft, and S.L. Swain. 1996. Naive and effector CD4 T cells differ in their requirements for T cell receptor versus costimulatory signals. J.Immunol. 157:3280-3289. 7. Lu, P., Y.L. Wang, and P.S. 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Die Immunisierung mit Ovalbumin und TLR Liganden induziert IL-10 in TH1-Zellen in vivo ................................................................................... 51 Abb.4. MZ B-Zellen sind nach GSI Behandlung depletiert .................................... 52 Abb.5. Die Reduktion in TH1-Zellen durch Blockade des Notch-Signalweges ...... 53 Abb.6. Das Zytokinprofil OVA-TZRtg/tg transgener Zellen ..................................... 56 Abb.7. Das Zytokinprofil endogener CD4 T-Zellen ................................................ 57 Abb.8. Die Verteilung verschiedener Zellpopulationen nach Immunisierung ......... 58 Abb.9. Beteiligung der verschiedenen Notch-Liganden an der IL-10 Induktion ..... 61 Abb.10. Die DZ Populationen der Maus ..................................................................... 64 Abb.11. Die Notch-Ligandenexpression ex vivo.......................................................... 65 Abb.12. Die Notch-Ligandenexpression nach CpG/OVA Immunisierung ................. 67 Abb.13. PDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen ............................................................. 69 Abb.14. Die Rolle von ICOS für die IL-10 Induktion in TH1-Zellen durch pDZ ...... 71 Abb.15. PDZ induzieren IL-10 in TH1-Zellen in vivo ................................................. 72 Abb.16. PDZ lassen sich mit PDCA-1 zu 95% depletieren ...................................... 73 Abb.17. PDZ sind an der IL-10 Induktion in TH1-Zellen in vivo beteiligt ................. 75 Abb.18. Die Rolle von B-Zellen für die IL-10 Induktion in vivo ............................... 77 Abb.19. Die Notch-Ligandenexpression auf B-Zellen ex vivo ................................... 78 Abb.20. Die Notch-Ligandenexpression auf B-Zellen nach Immunisierung .............. 79 132 ANHÄNGE II Tabellenverzeichnis Tabelle 1. Konventionelle DZ der Maus ........................................................................ 12 Tabelle 2. Expression von Notch-Liganden und Notch-Rezeptoren .............................. 23 Tabelle 3. Medien und Puffer ......................................................................................... 32 Tabelle 4. Chemikalien und Reagentien ......................................................................... 33 Tabelle 5. Antikörper für die Fluoreszenzmarkierung .................................................. 34 Tabelle 6. Antikörper für die Blockade von Zytokinen ................................................. 35 Tabelle 7. Antikörper für die in vivo Anwendung ......................................................... 35 Tabelle 8. Rekombinante Zytokine ................................................................................ 35 Tabelle 9. Verwendete TLR-Stimuli .............................................................................. 35 Tabelle 10. Verwendete Mausstämme .............................................................................. 36 Tabelle 11. Verwendete Fluorochrome ............................................................................ 40 Tabelle 12. Immunisierungslösungen ............................................................................... 45 133 ANHÄNGE III Abkürzungsverzeichnis antiADAM ................................. a disintegrin and metalloprotease APC ..................................... Allophycocyanin APZ ...................................... antigenpräsentierende Zelle BSA ...................................... bovine serum albumin BZR ...................................... B-Zell-Rezeptor cAMP ................................... cyclic adenosine monophosphate CD ........................................ cluster of differentiation CFA ...................................... complete Freund`s adjuvant CFDA-SE ............................. Carboxyfluoreszeindiacetat-Succinimidester CpG ...................................... Cytosin-Guanin-Dinukleotid CSL ...................................... CBF1/RBP-,suppresor of hairless, Lag-1 CTLA-4 ................................ Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen-4 Cy ......................................... Cy-Chrome Dll ........................................ Delta-like DNA ..................................... Desoxyribonukleinsäure dsDNA ................................. doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure DSL ...................................... Delta, Serrate, Lag-2 dsRNA .................................. doppelsträngige Ribonukleinsäure DTH ......................................delayed type hypersensitivity DZ .........................................dendritische Zelle EAE ...................................... Experimentelle Autoimmun-Enzephalitis Ebi3 ...................................... Eppstein-Barr-Virus induced gene 3 EGF ...................................... epidermal growth factor FACS ................................... fluorescence activated cell sorter FCS ...................................... fetal calf serum FITC ..................................... Fluoreszeinisothiocyanat FL ......................................... Fluoreszenzkanal FOXP3 ................................. forkhead box P3 FSC ...................................... foreward scatter GSI ....................................... -Sekretaseinhibitor HES ...................................... Hairy/Enhancer of Split i.p. ........................................ intraperitoneal 134 ANHÄNGE i.v. ........................................ intravenös IDO ...................................... Indolamin-2,3-dioxygenase IFN ....................................... Interferon Ig .......................................... Immunglobulin IL .......................................... Interleukin IPEX ..................................... immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, xlinked iTreg ...................................... induzierte regulatorische T-Zellen Jag ........................................ Jagged LBP ...................................... LPS binding protein LNR ..................................... Lin/Notch repeat LPS ...................................... Lipopolysaccharid MACS .................................. Magnetische Zellsortierung MAML ................................. Mastermind like MHC ..................................... major histocompatibility complex NF-B .................................. nuclear factor kappa B NIZD .................................... Notch intrazelluläre Domäne NK-Zellen ............................ natürliche Killer-Zellen NLS ...................................... Kernlokalisationssequenzdomäne nTreg ..................................... natürliche regulatorische T-Zellen OVA ..................................... Ovalbumin PAMP .................................. pathogen associated molecular pattern PEST .....................................Prolin-, Glutamat-, Serin-, Threoninreiche Domäne PBA ...................................... PBS/BSA/Azid PBS ...................................... phosphate buffered saline pDZ ...................................... plasmazytoide dendritische Zelle PE ......................................... Phycoerythrin PEN-2 ................................... Presenilin Enhancer - 2 PI .......................................... Propidiumiodid PMA ..................................... Phorbol-12-Myristat-13-Acetat poly I:C ................................ polyinosinic:polycytidylic acid PRR ...................................... pattern recognition receptors PTCRA ................................ pre-T-cell receptor R .......................................... Rezeptor 135 ANHÄNGE RAM .................................... RBPj associated module RNA .................................... Ribonukleinsäure RPMI ................................... Rosewell Park Memorial Institute Medium RT ........................................ Raumtemperatur s.c. ........................................ subkutan SA ........................................ Streptavidin SEA ...................................... Schistosoma mansoni egg antigen spf ......................................... specific pathogen free SSC ...................................... side scatter ssRNA .................................. einzelsträngige Ribonukleinsäure STAT .................................... signal transducer and activator of transcription TAD ......................................Transaktivierungsdomäne T.gondii ................................ Toxoplasma gondii tg .......................................... transgen TGF ......................................transforming growth factor TH-Zellen .............................. T-Helfer-Zellen TLR ...................................... Toll-like Rezeptor TNF ...................................... Tumor-Nekrose-Faktor Treg ........................................ regulatorische T-Zelle TZR ...................................... T-Zell-Rezeptor VWF ..................................... Von Willebrand Faktor wt .......................................... Wildtyp w/o ........................................ without ZNS ...................................... Zentrales Nervensystem 136 ANHÄNGE IV Erklärung Hiermit bestätige ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt habe. Ich versichere, dass ich ausschließlich die angegebenen Quellen und Hilfen Anspruch in genommen habe. Nadine Matzmohr Mittenwalde, im November 2009 137 ANHÄNGE V Danksagung An dieser Stelle möchte ich allen Personen danken, ohne deren Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Zunächst möchte ich Michael Veit für die Übernahme der Betreuung dieser Arbeit danken. Andreas Radbruch, Dir danke ich für die Möglichkeit diese Arbeit innerhalb des Deutschen Rheuma Forschungs-Zentrums anzufertigen, aber auch für die vielen Diskussionen und Anregungen. Vor allem aber danke ich dir für Deine immer offenstehende Tür und das immer offene Ohr … und das trotz deiner oftmals knapp bemessenen Zeit. Danke! Allen Kollegen im DRFZ möchte ich für die nette und freundliche Arbeitsathmosphäre danken. Ich hatte eine wunderbare Zeit hier. Danke! Alex Scheffold, Dir danke ich für die zweite Chance sowie für die Betreuung dieser Arbeit, die Du selbst aus der Ferne zu jeder Tages- und Nachtzeit stets wahrgenommen hast. Ich danke Dir außerdem für die Möglichkeit absolut selbstständig und eigenverantwortlich arbeiten zu dürfen und natürlich dafür, dass ich mit meinen Ergebnissen die ganze Welt bereisen durfte. Meine Doktorarbeit innerhalb Deiner Arbeitsgruppe hier am DRFZ anfertigen zu dürfen, war das Beste, was mir passieren konnte! Sascha Rutz, Dir danke ich vor allem für Deine Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit und für die uneingeschränkte Möglichkeit, Dich 7 Tage die Woche rund um die Uhr mit meinen (kleinen und größeren) wissenschaftlichen Problemen belästigen zu dürfen - und das selbst jetzt noch, wo Du tausende Kilometer entfernt bist! Du warst mir eine riesige Hilfe (wahrscheinlich die größte) und ich danke Dir von Herzen für Deinen Ideenreichtum und Deine Hilfestellungen, die weit über Deine Anwesenheit hier am DRFZ hinausreichten und bis zum Abschluss dieser Arbeit andauerten. Und auch wenn so manches Mal ein Sturm bei uns aufzog, so haben wir uns doch immer wieder zusammengerauft und ich bin froh, dass ich Dich kennengelernt habe. Also komm recht bald wieder aus dem fernen San Francisco nach Haus’ und dann verschlägt es uns in diesem Leben ja vielleicht doch noch mal in ein und dasselbe Labor …. 138 ANHÄNGE Freddy Heinrich, Du bist so ein lebenslustiges, fröhliches Kerlchen, hast immer gute Laune im Labor verbreitet und wir hatten viel Spaß miteinander. Und auch wenn ich Dich minimal einmal wöchentlich „nerven“ mußte, Du manchmal zickig wie ein Mädchen bist und Du erst das Wörtchen „Bitte“ lernen musstest, werde ich Dich als Kollegen vermissen … also mach’s gut und immer schön dran denken: der Kalender ist Dein Freund Manu Krüger, Dir danke ich dafür, dass Du mir bedingungslos frühmorgens um 5 Uhr im Labor zur Seite gestanden, um mich bei meinen zum Teil riesigen, wahnwitzigen Experimenten zu unterstützen. Und auch wenn wir dann so manches Mal um die Mittagsstunde bemerkten, dass alles umsonst war, hast Du trotzdem beim nächsten Mal wieder bereitwillig Deine Hilfe angeboten. Und danke auch für die lustige und fröhliche Arbeitsathmosphäre – ich habe einfach immer gern mit Dir zusammengearbeitet. Ich wünsch Dir eine wunderschöne und aufregende Zeit mit der kleinen Ava und hoffe, wir zwei verlieren uns nicht aus den Augen! Weil Du weißt ja, irgendwann wollen wir doch noch unsere Suppenküche eröffnen Und der liebe Rest der AG Scheffold, Marko, Lasse, Andrej, Christian, Diana und Dennis, Euch danke ich dafür, dass Ihr mich in Euren Reihen aufgenommen habt, dass Ihr mehr als einmal den beschwerlichen Weg nach Motzen auf Euch genommen habt, dass Ihr meinen Ordnungs- und Aufräumwahnsinn ertragen habt, und natürlich auch meine sich ständig wiederholende Annett Louisan CD, und schließlich auch dafür, dass Ihr immer ganz lieb meine Pipetten zurück in meinen Schrank gelegt habt! Also habt lieben Dank und macht’s gut! Ein besonderer Dank gilt natürlich auch meinen lieben Freunden: Nadja, Moni, Sandy, Jürgen, Danila, Sabrina, Anke, Heini, Mulle, Fritz, Manja, Melli, Nico, Mareen, Volki, Christian & Caro: Euch möchte ich für die wunderbaren Stunden der Ablenkung danken - die Tage und Abende in Eurer Gesellschaft waren für mich unverzichtbar! Und ich wünsche mir noch viele weitere gemeinsame Jahre mit Euch, denn Ihr seid die besten Freunde, die man sich nur wünschen kann! Schließlich möchte ich den Menschen danken, denen ich diese Arbeit gewidmet habe – meiner Familie. Liebe Vicky, liebe Mama, lieber Papa, Worte können kaum ausdrücken, was ich Euch verdanke! Ich möchte euch für die liebevolle Motivation während des Studiums und 139 ANHÄNGE der Doktorarbeit danken, für das immer währende, grenzenlose Vertrauen, für den Zuspruch, wenn das Leben mal nicht „geradeaus“ ging und natürlich nicht zuletzt für die seelische und moralische Unterstützung in allen Lebenslagen. Ohne Euch hätte ich das niemals geschafft! Mein größter Dank gilt meinem Mann Danny. Du hast stets geduldig an meiner Seite gestanden, hast meine Launen ertragen, meine Tränen getrocknet und versucht immer die richtigen Worte im richtigen Moment zu finden. Ich danke Dir für Deine uneingeschränkte Liebe zu mir und Dein unendliches Verständnis für alle Sorgen und Nöte! Ich weiß, ich habe Deine Nerven zu weilen sehr strapaziert und vieles unbewußt von Dir vorrausgesetzt, was nicht immer selbstverständlich ist. Nichts desto trotz – Du warst stets für mich da! Und ich hoffe, Du bist jetzt bereit für unser nächstes großes Abenteuer: unser gemeinsames Kind … Ich liebe Dich! 140 ANHÄNGE VI Kongressbeiträge Postervorstellung: “Notch regulates IL-10 production by TH1 cells” Joint Annual Meeting of Immunology of the Austrian and German Societies 3.-6.9.2008, Wien, Österreich Postervorstellung: “Notch mediated IL-10 induction in T helper 1 cells by plasmacytoid dendritic cells” International Congress on Cytokines in Immune Regulation and Disease 4.-6.12.2008, Florenz, Italien Postervorstellung: “Notch mediated IL-10 induction in T helper 1 cells by plasmacytoid dendritic cells” Keystone Symposia „Regulatory T cells“ 01.-06.03.2009 Keystone/Colorado, USA Postervorstellung: “Self-limitation of inflammatory T cell responses: Notch induces interleukin-10 production by T helper 1 cells” World Immune Regulation Meeting 22.-25.3.2009, Davos, Schweiz Vortrag: “Self-limitation of inflammatory T cell responses: Notch mediated IL-10 induction in T helper 1 cells by plasmacytoid dendritic cells” 12th German Meeting on T cells: Subsets and functions 24.-25.06.2009 Marburg, Deutschland Vortrag: “Self-limitation of inflammatory T cell responses: Notch mediated IL-10 induction in T helper 1 cells by plasmacytoid dendritic cells” European Congress of Immunology (ECI2009) 13.-16.09.2009 Berlin, Deutschland 141 ANHÄNGE VII Publikationen RUTZ S, JANKE M, KASSNER N, HOHNSTEIN T, KRUEGER M, SCHEFFOLD A: Notch regulates interleukin-10 production by T helper 1 cells. Proc Nat Acad Sci USA, 105(9):3497-502, 2008 KASSNER N, KRUEGER M, YAGITA H, DZIONEK A, HUTLOFF A, KROCZEK R, SCHEFFOLD A, RUTZ S: Cutting Edge: Plasmacytoid dendritic cells induce interleukin-10 production in T cells via the Deltalike-4/Notch axis. Journal of Immunology, 184, 550-554, 2010 142
