Immunologie und zelluläre Mikrobiologie B

Immunologie und zelluläre
Mikrobiologie B
(LvNr. 300344)
WS09
Fragenausarbeitung
GNU General Public License
1. Mit welchen Methoden kann man Virulenzfaktoren, die nur in vivo exprimiert werden,
nachweisen/identifizieren?
– IVET (In Vivo Expression Technology)
– Plasmid/Vektor piVET1, [purA (Purin-Auxotrophie), lacZ(beta-Galaktoidase), beide
promoterlos]
– Random Genom/DNA-Fragmente von Salmonella werden upstream vor purA und lacZ
Selektionskassette hinein ligiert/cloniert ( Sau3A Verdau )
– Plasmide durch Elektroporation in E.coli Stamm Amplifizierung
– Man gibt ∆purA Salmonella-Stamm dazu
– Konjugation des Plasmids von E. Coli zu Salmonella Stamm
– Innerhalb der Salmonella-Zellen kommt es zur homologen Rekombination (durch X´
Fragment) der pIVET-Plasmide in das Salmonella-Genom
– Man injiziert die Salmonella Library in eine Maus(ade-), nur die Stämme, die upstream
vom purA Gen einen aktiven Promoter besitzen überleben
– Isolierung nach 3 Tagen aus Milz
– Plattierung auf X-Gal, Adenin, Amp Medium um auf Promotoren zu differenzieren , die
immer an sind, oder nur im Wirt
– Blaue Kolonien Promotoren invitro und invivo an nicht interessant
– Weiße Kolonien Promotor nur in vivo aktiv
2. Definieren sie „Virulenzfaktor“ und „Virulenz(gen)kassette“ und nennen sie ein
Beispiel!
– Virulenzfaktoren sind die Eigenschaften eines Mikroorganismus, die seine
“krankmachende Wirkung“ bestimmen. Stärke/Grad der Pathogenität - Eigenschaft eines
Erregers in einem Wirt eine Erkrankung auszulösen
– Bakterielle Virulenz-Faktoren: Adhäsine, Antiphagocytose-Faktoren(Kapseln, MProtein, Protein A, Leukocidine), Invasine, Endo/Exotoxine
– Es gibt Virulenzfaktoren die auf Plasmiden codiert werden, also mobil sind. Manche
werden von Phagen codiert, manche werden von Bakterium zu Bakterium
weitergegeben
– Die Virulenz eines Bakteriums ist also eine übertragbare Eigenschaft
– Eine Virulenzkassette ist eine Ansammlung von Genen (Cluster), die Virulenzfaktoren
(meist Toxine) kodieren, oft vom Phagen stammend
–
–
–
Bsp: Vibrio Cholerae Virulenzkassette:
enthält neben Cholera-Toxin noch weitere Enterotoxine und CEP( core encoding pilus ),
der Phage CTXφ bringt dieses „Gift-package“ ein, er bindet an TCP ( toxin coregulated
pilus, Rezeptor für den CTX-Phagen), welcher von VPI-Phagen stammt
Gene für A und B Untereinheiten ( ctxA/B → teilweise überlappend für 5:1 Verhältnis
im Holoenzym)
V. cholerae muss von 2 Phagen befallen werden, um Cholera-Toxin produzieren zu
können
Bsp: Pap Pilus Virulenzkassette von E.coli
3. Geben sie zwei Beispiele für membranschädigende Toxine, erklären sie deren
Wirkungsmechanismen und ihre Funktion im Infektionsprozess.
– Poren-bildendes Staphylococcus aureus Alpha-Toxin: Monomer (34kDa), bindet an
Membran empfindlicher Zellen(Monozyten/Plättchen) über unidentifizierten
-1-
–
spezifischen Alpha-Toxin-Rezeptor. Bildet heptameren Ring mit einer Pore( 8-10 nm),
durch diese gelangt der Inhalt der Zelle nach außen und Ionen nach innen, Zelle
destabilisiert und lysiert → verursacht entzündliche Reaktion im Gewebe (Nekrose).
Lipasen-Clostridium Perfrigens Alpha-Toxin. Lipase spaltet die polare Gruppe des
Phosphatidylcholin (Lecithin) ab, welches die Membran aller tierischen Zellen
stabilisiert. Dadurch wird Membran destabilisiert. In vivo bindet und zerstört es
Leukocyten (und Erythrocyten)
4. Erklären sie (die molekularen Mechanismen von) antigenic shift und antigenic drift,
sowie die Unterschiede. Erläutern sie ebenfalls die epidemiologischen Folgen (bzw.
welches verursacht Pandemien)!
– Influenza Virus Eigenschaft: Nucleocapsid mit 8 separaten ssRNA‐Strängen assoziiert
mit Nucleoprotein umhüllt von der Membran der Wirtszelle, aus der das Hemagglutinin
und die Neuraminidase herausragen
– antigenic shift: Wenn eine Wirtszelle von zwei unterschiedlichen Influenza-Viren
gleichzeitig infiziert wird, kann es beim Aufbau der neuen Influenza-Viren zur
Vermischung der ursprünglich aus verschiedenen Viren stammenden RNA-Stränge
kommen (Neukombination-reassortment) Auf diese Weise entsteht ein neues InfluenzaVirus, mit einer neuen Kombination der Gensegmente die für die Oberflächenproteine
HA und NA codieren. Bisher nur bei Influenza-Viren vom Typ A beobachtet.
Verantwortlich für Auftreten neuer pathogener Varianten /Subtypen ,führt zum Ausbruch
weltweiter Pandemien
– antigenic drift: RNA-abhänige Polymerase ist sehr Fehleranfällig zufällige Mutation
(Punktmutaion). Findet die Mutation in einem RNA-Segment statt, das eines der
Oberflächenantigene HA oder NA codiert, so wird durch diesen antigenic drift die
ursprüngliche potentielle HA- oder NA-AK-WW geschwächt und damit auch die
erworbene Immunität sowie der Impfschutz.
5. Welche Bakterien können durch welche Mechanismen das Zytoskelett ihres
eukaryotischen Wirtes beeinflussen? Mit welchen Molekülen wechselwirken die
verantwortlichen Virulenzfaktoren und zu welchem Zweck? Wie wurden diese
Virulenzfaktoren entdeckt? Nennen sie zwei Beispiele.
– Yersinia & Listeria: Zipper Mechanismus. Yersinia bindet mit Invasin an Integrin (beta
Teil)-Rezeptor, an der Zelloberfläche der Wirtszelle. Das Integrin wird aktiviert,
rekrutiert Kinasen (FAK,Scr,PKC) GEF (Guanidin nucleotide Exchange Factor) dieser
tauscht GDP durch GTP aus und aktiviert so die Rho GTPasen die das Cytoskelett
regulieren:Rac(Actinpolymerisierung für Lamellipodien), Cdc42 (Actinpolymerisierung
für Filopodien) und Rho(Actinfaserbündelung für Stressfasern. Bakterium wird durch
diese Umstrukturierung des Zytoskeletts von der Membran umhüllt und dringt in die
Zell ein. Listeria bindet über Internalin (IntA/IntB) an E-Cadherin der Wirtszelle und
verändert dabei ebenfalls das Zytoskelett lokal. Listeria bewegt sich innerhalb der Zelle
durch sogenannte Aktin-Kometen, lassen sich von einem Strang aus kurzen
Actinfilamenten wegschieben, dessen Polymerisierung sie durch ActA und Profilin
kontrollieren
– Salmonella & Shigella: Trigger Mechanismus. Salmonella injiziert durch ein Typ3
Sekretions-System Effektoren ( SipA, SopE, SopB, SptP) in die Wirts-Zelle. SipA
stabilisiert F-Actin, stimuliert T-PLastin Aktinfaserkomplexe. SopE wirkt als GEF für
Cdc42,RhoA und Rac und aktivert diese Umstrukturierung des Cytoskeletts.
SopB(Inositolphosphatpolyphosphatase) und SopE essentiell für Invasion- stimuliert
Aktionrearrangement für Eintritt des Bakteriums. SptP wirkt als GAP (GTPase
-2-
–
Activating Protein), also dem GEF/SopE entgegen, blockiert also weitere AktinPolymerisierung. Shigella ähnlicher Mechanismus wie Salmonella.
Experiment Stanley Faltrow: Genom von pathogenen Bakterien(zB Yersinia)
fragmentiert, in nicht pathogene Bakterien, die nicht invasieren können(E.coli) inseriert.
Auf eukaryotischen Zellen geben und inkubieren, gründlich waschen. Gentamicinangereichertes Medium tötet prokaryotische Zellen. Lysieren der Wirtszellen, suche nach
Kolonien → diese hatten das Invasin Gen → Untersuchung
6. Welches gramnegative Bakterium produziert zwei Toxine, die zur erhöhten Produktion
von cAMP durch die Wirtszelle führen? Nennen sie die zwei Toxine und beschreiben
sie kurz deren Wirkungsmechanismen.
– Bordatella Pertussis, ein gram-negativer Coccobacillus, produziert PTX (Pertussis
Toxin) und IAC-(Adenylatcyclase) CyaA. CyaA Adenylatcyclase besteht aus:
1. katalytische AC (=AdenlylatCyclase)-Domäne mit Calmodulin binding site
2. Hydrophobem Teil (Transmembran-Domäne)
3. Palmitoylierungs-Stelle (zur Verankerung in die Membran)
4. Ca2+ bindender Domäne
5. Sekretorischem Signalabschnitt
– Als inaktives Zymogen synthetisiert und sekretiert. Geringe Ca2+ Konzentration:
Hydrophobe Domäne und das Palmitoyl lagert sich in die Membran der Wirtszelle ein.
– Hohe Ca2+Konzentration: Ca2+ bindet an die Ca2+Domäne wodurch sich die
Konformation von CyaA verändert und die katalytische Domäne in die Zelle gedrückt
wird.
– AC-Domäne wird innerhalb der Zelle nach Bindung von Calmodulin aktiv. Dort wandelt
CyaA ATP in cAMP um.
– CyaA inhibiert somit die Phagocytenmigration, wirkt auf Neuronen, und wirkt
schleimhautschädigend
– Pertussis-Toxin (PTX) ist ein AB-Toxin mit 5 B Untereinheiten. Das Bakterium bindet
an Cilien von Ephithelzellen v.a. in den Atemwegen. A hat ADP Ribosyltransferase
Aktivität. PTX bindet an einen Rezeptor in der Membran der Zielzelle, der darauf den
inhibitorischen G-Protein-Komplex hemmt. Keine Inhibierung der zelleigenen
Adenylatcyclase → Erhöhung des cAMP Spiegels. Steigt die Konzentration von cAMP
wird die Protein Kinase A (PKA) aktiviert, die wiederum Proteine phosphoryliert, was
wiederum das Verhalten der Zelle ändert (Apoptose).
7. Beschreiben sie die Mechanismen und Unterschiede, die dem Entstehen der Lepra
lepromatosa bzw. der Lepra tuberkoloides zugrunde liegen.
– Beide Krankheitsbilder werden durch das Mycobakterium leprae verursacht, das Zellen
v.a. Makrophagen invadieren kann. Es werden entweder IL-12 (stimuliert TH1 subset)
oder IL-4 (stimuliert TH2 subset) vermehrt exprimiert.
– Lepra tuberculoides zeichnet sich durch eine starke zelluläre Immunantwort durch Th1Zellen gegen infizierte Makrophagen aus. Es entstehen lokale Granulome, beträchtliche
lokale Haut- und Nervenschäden. Die Bakterien bleiben lokal und ihre Zahl niedrig,
somit bestehen gute Überlebenschancen.
– Lepra lepromatosa zeichnet sich durch eine schwache Zelluläre Antwort, aber starke
humorale Immunantwort durch Th2-Zellen aus. Die TH2-Zellen schütten noch mehr IL4 aus, wodurch kaum zelluläre Immunantwort mehr gegeben werden kann.
Hypergammaglobulinämie, große Anzahl von Bakterien. Befallene Makrophagen
verbreiten sich im ganzen Körper, dadurch wird Bindegewebe und das periphere
Nervensystem erheblich geschädigt. Es kommt zu Knochen- & Knorpelveränderungen.
-3-
Schlechte Überlebensprognose.
8. Was ist die Normalflora, ihre Vor- und Nachteile und warum löst sie keine
Entzündungsreaktion aus?
– besiedelt den Körper nach der Geburt überall dort, wo der Körper mit der Außenwelt in
Kontakt ist → offenes System! Nicht alle Orte sind gleich gut besiedelbar z.B.: Magen:
ungünstiger pH-Wert; Haut: zu trocken; Schleimhaut & Darm: ideal;
– Positive Funktionen der Normalflora: Mutualismus (Mensch und Bakterium profitieren
vom Zusammenleben), Synthese von Vitaminen (Vit K)/Resorption von Steroiden,
Stimulierung des Abwehrsystems (mehr sekretorische IgAs)-Meningitis, Verhinderung
der Kolonisierung durch Pathogene
– Negative Funktionen der Normalflora: vorallem gefährlich für Immunsupprimierte Wirte
(Candida , normalerweise nicht gefährlich), Kreuzreaktionen mit eigenen Antigenen →
Allergien, Infektionsquelle (E. coli, C. difficile, C. albicans, S. epidermidis) wenn am
falschen Ort (E. coli in Blase). Harmlose Normalflora durch Antibiotika reduziert
(resistente Minderheit setzt sich durch – C. difficile), physische Beschädigung des
Körpers (Verbrennungen,...), -Produktion krebserregender, schädlicher Substanzen (H.
Pilori)
– Keine Entzündung durch Commensal bacteria der Normalflora weil: Eingeschränkte
Fähigkeit dem trapping im Mucus zu entkommen; Eingeschränkte Fähigkeit in
Epithelien einzudringen, da ihnen Adhäsine fehlen; Geringe Endotoxicität wegen
pentacyliertem Lipid A (Gram-negative)
9. Erläutern sie die Konzepte „Infektion“, „Krankheit“ und „Virulenz“, außerdem
„Parasit“ und „Pathogen“.
– Infektion ist die Begegnung bzw die Aufnahme eines Mikroorganismus, muss aber nicht
zu einer Krankheit führen bzw mit Symptomen einhergehen. Eine Infektion kann bei
einem Menschen eine krankheit auslösen, bei einem anderen muss das aber nicht der
Fall sein.
– Krankheit sind die Symptome die ein Pathogen in seinem Wirt hervorruft, führt eine
Infektion zu einer Krankheit spricht man von einer Infektionskrnakheit. Unterschiedliche
Bakteriele Wachstumsrate bei verschiedenen Stadien der Krankheit.
– Virulenz: Stärke/Grad der Pathogenität, Eigenschaft eines Erregers in einem Wirt eine
Erkrankung auszulösen, multifunktionell/situationsabhängig. Für Pathogen: Invasivität,
Toxizität; für Wirt: Gesundheitszustand, Immunstatus, Alter/Geschlecht etc.
– Nachteile der Virulenz: Beeinträchtigung und Verlust des Wirtes
– Vorteil der Virulenz: schnelle Replikation und hohe Infektiösität
– Parasit: Organismus der einen anderen lebenden organismus befällt und aus diesem nur
Vorteile zieht, die Nachteile für den anderen Organismus können gravierend sein, nur
der Parasit hat bei diesem Zusammenleben Vorteile.
– Pathogen – Krankheitserreger, sind Stoffe oder Organismen, die in anderen Organismen
gesundheitsschädigende Abläufe verursachen. Pathogen kann nicht definiert werden,
ohne auch den Wirt zu definieren
10. Beschreiben sie die Funktion, Zusammensetzung und den Aufbau des Pap-Pilus von
E.coli!
– Pap(pyelonephritis adhesion pilus) ist ein Adhäsin von E.coli. Flexibler Stab mit
helicaler Struktur, besteht aus mehreren Untereinheiten mit unterschiedlichen
Funktionen. Alle Gene, die zur Pilusbildung notwendig sind,befinden sich in einem
cluster am Chromosom:
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–
PapA: Stab: viele PapA bilden zusammen den Pilus-Stab)
PapH: Stab-Anker
PapC: Türsteher („usher“)
PapD: Chaperon, bindet subunits und bringt sie zum usher
PapJ
PapK: Adaptor
PapE: Spitze (daran noch PapF und PapG)
PapF: Adaptor
PapG: Adhäsin, an Galabiose-hältige Rezeptoren auf Erythrozyten, Nieren- und
Blasenepithel
Untereinheiten werden Sec-abhängig ins Periplasma sezeniert und in korrekter
reihenfolge durch unterschiedliche affinität der Chaperon-Untereinheiten-Komplexe für
den usher eingebaut.
PapG-Adhäsin wird als erstes eingebaut, erkennt Isorezeptoren, die D-Gal-(α1-4)D-Gal
(Galabiose)enthalten. 95% aller Menschen gehören der ‚P’-Blutgruppe an, d.h. Das
Disaccharid Galabiose befindet sich auf der Oberfläche der Erythrocyten, aber auch der
Epithelzellen in der Blase. Die anderen 5 % sind P- und erkranken nicht an
Harntraktinfektionen durch E. coli.
11. Erläutern sie KURZ die Funktion des Komplementsystems. Beschreiben sie außerdem
die Wege für die Aktivierung des Komplementsystems und jeweils den ersten Schritt
der Verteidigung der Bak gegen das Komplementsystem.
– Das Komplementsystem ist ein System aus Proteinen im Plasma, die in der Leber als
Zymogene synthetisiert werden und in inaktiver Form im Serum zirkulieren und sich
gegenseitig aktivieren.
– Funktionen:
1. Lyse von Mikroben( MAC Lyse)
2. Opsonisierung von Mikroben (C3b)
3. Anlocken von Phagocyten zur Phagocytose von opsonisiertem Material
4. Entfernung von Immunkomplexen
5. Entzündungsreaktion (C3a)
6. Mastzellen Degranulation Histamin Vasodilation Diapedese
– Aktivierung:
1. durch Immunkomplexe im klassischen Weg
2. durch Mikroorganismen im alternativen Weg oder Lektinweg
3. Aktivierung erfolgt durch eine proteolytische Kaskade
4. Aktivierung mündet in der Bildung eines "membrane attack complex" (MAC)
– 3 Wege: Klassisch: AK-Antigen Interaktion, Antikörper erkennt Antigen und wird
wiederum von Komplementprotein (C1) erkannt und spaltet C4 und C2 (durch C1r2 und
C1s2 Enzym) C2a und C4b bilden C3 Konvertase. Alternativ: C3 spontane Spaltung der
Thioesterbindung C3b bindet an Oberfläche von MOs C3b bildet mit Bb dann die C3
Konvertase. Lectin-Weg: Mannose Binding Lectine (MBL) bindet an polysaccharide auf
MO MBL aktiviert C1-ähnlichen Komplex C4bC2b bilden C3 Konvertase.
– Alle drei Wege führen dazu, dass C3 Konvertase gebildet wird C5 Konvertase wird
gebildet, spaltet C5 C5b + C6 + C7 + C8 + C9 bilden den MAC (Pore in der Membran
des MO's)
– Verteidigung gegen das Komplement-System
1. Hyaluronsäure-Kapsel-verdecken gebundenes C3b (S. pneumoniae)
2. Peptidoglykanschicht bei gram+ -verhindert Bindung von Komplement
(Streptococcus)
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3. Lange LPS-Ketten verhindern Kontakt zwischen C3b und dem Rezeptor an
Phygozyten und MAC kann nicht in Membran inserieren
4. Verhinderung von MAC Integration in Membran (N. Gonorrhoeae)
5. Bakt. Elastase baut C3a und C5a ab (Pseudomonas aeruginosa)
6. Sekretieren von Proteinen die Komplement nachahmen und damit deaktivieren
12. Beschreiben sie die biochemische Natur und Beschaffenheit, den molekularen
Wirkungsmechanismus und die biologische Aktivität der Neurotoxine von C.tetani und
C.botulinum und auf welche Zellen sie wirken!
– beide sind gram+, sporenbildende Bakterien
– Neurotoxine sind AB Toxine mit einer Zink Endopeptidase als katalytische A Domäne
– Synthetisiert als 150kDa inaktives Zymogen, gespalten (Disulfidbrücken) durch
bakterielle oder Gewebsprotease, internalisiert durch Rezeptor vermittelte Endocytose
an Gangliosiden auf Neuronen.
– Ziel sind Proteine, welche Sekretion von Transmitter in Synapse regulieren. Im
Endosom bei niederem pH → Konformationsänderung des Toxins, A Domäne wird ins
Cytosol translociert und durch Zink aktiviert
– BoNT(Botulinus Toxin): bleibt nach der Internalisierung durch synaptische Vesikel in
der neuromuskulären Synapse, ist hochaktiv aber reversibel. Greift im Cytosol Proteine
der SNARe Familie an die für die Regulation der Neurotransmitterausschüttung
verantwortlich sind (VAMP, Syntaxin, Snap25; vermitteln Verschmelzung von
sekretorischen Vesikel mit präsynaptischer Membran), verhindert so Asschüttung von
Acetylcholin an der neuromuskulären Synapse, ist ein Muskelrelaxans, ist Lunge
betroffen kann es zum Ersticken führen.
– TeNT (Tetanospasmin): Nach Internalisierung retrograder Transport durch
Motorneuronen (Transcytosis) gelangt in inhibitorische Interneuronen, die
normalerweise den inhibitorischen Neurotransmitter Glycin freisetzen, der Freisetzung
von Acetylcholin durch die Motorneuronen an der neuromuskulären Synapse stoppt.
TeNT blockiert Glycin Freisetzung durch Spaltung von VAMP → Muskelkontraktion
wird nicht inhibiert, kontinuierliche Kontraktion. Kann zu Ersticken führen.
13. Was haben Superantigene und Endotoxine gemeinsam? Wie wirken sie? Erklären sie
die molekularen Mechanismen und wodurch sie sich unterscheiden!
– Die meisten Super-Antigene sind Exotoxine(exogenous superantigen) führen zu Toxic
Shock,es gibt aber auch retroviral kodierte endogene Superantigene auf Oberflächen von
APCs
– Superantigene: Bei normaler Erkennung durch CD4+ T Helfer Zellen binden sowohl Valpha als auch V-beta-Regionen des TCR direkt an das Antigen. SA binden den MHC2
Rezeptor von APCs von außen und stabilisieren Bindung des TCR (binden an alle TCRs,
die ein von einem entsprechenden V-beta-Gen abgeleitetes V-beta-Segment enthalten)
der TH zellen mit dem MHC2. Resultiert in der antigen-nonspecific Stimulation von 525% von allen Tcells → Überproduktion von IL2 (Fieber, Übelkeit, Kreislaufprobleme)
und Stimulation der Überproduktion von IL-1 und TNF alpha durch Macrophagen. Kann
zu Autoimmunity führen
– Endotoxine: Bestandteile von Bakterien, normalerweise nicht pathogen zB LPS(gram-)
Teichonsre(gram+), es lassen sich keine Toxoide herstellen. LPS= komplexe, amphiphile
Moleküle, MW ca. 10kD, O-Kette variabel, toxischer Teil ist Lipid A ,wird bei
Wachstum oder nach Tod freigesetzt → Septic Shock (Sepsis = LPS im Blut). Pathogene
Wirkung der Endotoxine erst durch Immunantwort. LPS von LPS binding Protein
gebunden und dieses bindet an TLR (Monocyten/makrophagen) Daraufhin werden
-6-
Cytokine produziert TNFalpha und IL8 → Entzündungen/Fieber (Pyrogene),
Ausschüttung von O-Radikalen (Neutrophile). Ist zB LPS-Konzentration sehr hoch(zB
Antibiotikaeinsatz gegen Bakterien), fällt auch die Iimmunantwort stark aus und kann zu
massiven Schäden am Wirt selber führen. ARDS(Acute respiratory disease syndrom),
DIC(disseminated intravascular coagulation), MOSF(multiples organ system failure)
14. Erklären sie die verschiedenen Funktionen und Wirkungsweisen des M-Proteins von
Streptococcus!
– M-Protein ist ein Virulenzfaktor, welcher von Streptococcus (gram+) zb (S.pyogenes)
produziert wird. Coilded coil Protein, steht weit über die Oberfläche des Bakteriums
hinaus. Mit dem C-Terminus in der Membran und Zellwand verankert. In der Nähe vom
N-Terminus variable Region durch Deletionen, erschwert Bindung von AK.
– Der N-Terminus ist wie die Phagozyten an ihrer Oberfläche negativ geladen.
Elektrostatische Abstoßung. Zwischen N und C Terminus konstanter Teil, bindet
eukaryontischen H-Faktor (Komplementregulator), inhibiert die Bindung von Factor B
an C3b und rekrutiert Factor I. Factor I spaltet Membran‐gebundenes C3b, verhindert
Opsonisierung durch C3b.
– So werden drei wichtige Mittel des Immunsystems unterdrückt, die Opsonisierung durch
das Komplementsystem und Antikörper und die Phagocytose durch Phagozyten.
15. Vergleichen sie Cholera Toxin und Pertussis Toxin in Aufbau, Struktur, Funktion etc.!
– Cholera Toxin CTX von Vibrio cholera, gram– Pertussis Toxin PTX von Bordatella pertussis, gram– Beide Toxine erhöhen den cAMP-Spiegel in der Zelle. Beide sind AB-Toxine CTX : 5 B
Units und 1 A Unit- Enterotoxin, PTX besteht auch aus 6 Subunits S1 = A ,S2- S5 =B
Unit
– Pathogenität durch die Infektion mit Bakteriophagen.
– CTX wirkt v.a. auf Epithelzellen im Dünndarm, bewirkt eine Störung des Ionenhaushalts
der Zelle, führt zu Durchfall durch erhöhte H2O Sekretion aus Zelle. Rezeptor: GM1
Gangliosid, A Unit wird im Cytosol proteolytisch gespalten. A1 wird von ARF zur
basolateralen Membran gebracht, aktiviert Adenylatcyclase, cAMP aktiviert PKA →
Crypt cells sekretieren Cl- Ionen und in Villus cells wird Na+ (und Cl-) Resorption
verhindert. Efflux von H2O ins Dünndarm Lumen. Virulenzkassette kodiert CTX,
Expression benötigt Infektion mit 2 Phagen (VPI und CTX Phage).
– PTX wirkt v.a. auf Epithelzellen und Phagocyten in den Atemwegen Keuchhusten , stört
die Phagocytenmigration, schädigt die Schleimhautzellen, reizt Neuronen. PTX bindet
an einen Rezeptor in der Membran der Zielzelle, A gelang ins Cytoplasma, besitzt ADP
Ribosyltransferase Aktivität (Übertragung eines ADP-Ribosylrestes von NAD auf das GProtein) Hemmt den inhibitorischen G-Protein-Komplex . Keine Inhibierung der
zelleigenen Adenylatcyclase Erhöhung des cAMP Spiegels Aktivierung von PKA.
16. Vergleichen sie AB-Toxine und Endotoxine in ihrer chemischen Natur, Wirkung,
Funktion etc.!
– AB-Toxine gehören zusammen mit membranschädigenden Toxinen und Superantigenen
zur Gruppe der Exotoxine. Sie sind Proteine und bestehen im einfachsten Fall aus einer
A-Domäne, welche die katalytische Aktivität besitzt und im Cytosplasma nach
Abspaltung von B aktiv wird und einer B-Domäne, welcher die spezifische Bindung an
die Zielzelle vermittelt. Es gibt jedoch zahlreiche AB-Toxine, die mehrere BUntereinheiten besitzen (zum Beispiel Pertussistoxin, Choleratoxin, Diphtherietoxin).
– AB-Toxine sind im Gegensatz zu Endotoxinen sehr spezifisch, da sie an Rezeptoren
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binden können und dadurch die Aufnahme via Endocytose vermitteln.
Bsp: Neurotoxine (Tetanus/Botulinumtoxin). Zn-Endopeptidasen greifen SNARE
Proteine an, die für die Verschmelzung von sekretorischen Vesikel mit präsynaptischer
Membran der Neuronen verantwortlich sind
G-Protein wechselwirkende Toxine (Cholera Toxin/Pertussistoxin) erhöhen cAMP
Gehalt in der Zelle, behindert Makrophagenmigration etc.
Diphteria : Elongationsfaktor 2 wird inaktiviert inhibierung der Proteinsynthese
Endotoxine LPS /Teichonsäure sind keine Peptide, haben keine katalytische Aktivität
und sind unspezifisch. Wirken im Normalfall nicht pathogen, sondern sind Teile der
Bakterienoberfläche, mit schützender Funktion (Fettsäuren/Lipid A/Oligosaccharide).
Werden beim Wachstum oder nach Bakterientod freigesetzt. Endotoxine werden nicht
aufgenommen, sondern von TLRs von Leukocyten erkannt, worauf diese eine
Immunantwort einleiten.
Haben Leukozyten Endotoxine erkannt produzieren sie z.B. TNF-α und IL-1 Septischer
Schock Fieber /Entzündungen. Bei starker Immunantwort ARDS=Acute respiratory
disease syndrom; DIC=disseminated intravascular clotting; MOSF=multiple organ
system failure. TNF und IL-1 wirken auf Endothelzellen von Kapillaren, Ausbildung
von Selektinen → Diapedese, Extravasation, Vasodilatation. Impfstoffe gegen ABToxine können die alleinigen B-Domänen sein. Von Endotoxinen lassen sich keine
Toxoide herstellen.
17. A1B1 ist ein Neurotoxin und interagiert mit Aktin, A2B2 bindet Schleimhautzellen und
inhibiert die Proteinsynthese. Wo binden A1B2 und A2B1 und welchen Effekt haben
sie?
– Die aktivierende/toxische Wirkung geht von der jeweiligen A-Domäne aus. Für die
Bindung und den Eintritt in Zellen sind die jeweiligen B-Domänen verantwortlich.
– A1B1 bindet Neuronen und interagiert mit Aktin. Neurotoxin
– A2B2 bindet Schleimhautzellen und inhibiert die Proteinsynthese.
– A1B2 bindet Schleimhautzellen und interagiert mit Aktin
– A2B1 bindet an Neuronen und inhibiert Proteinsynthese
18. Welche Abwehrmechanismen haben Bakterien gegen das Immun- und
Komplementsystem?
– Abwehrmechanismen gegen Immun/Komplementsystem
1. Streptococcus pyogenes: -Kapseln umgeben viele pathogene MO- bestehen aus
Polymeren (Polysacchariden/ Proteinen). Können gebundenes C3b verdecken,
Opsonisierung verhindern/Phagozytose erschweren, die C3-Konvertase inhibieren
und Faktor H rekrutieren.
2. M-Protein, rekrutiert Faktor H, Abstoßung von Phagozyten durch negativen NTerminus,variable Region an Spitze, welche die Bindung von AK erschwert.
3. Staphylococcus aureus: Protein A, ein Fc-Rezeptor an der Oberfläche des
Bakteriums. Dieser Rezeptor bindet den Fc-Teil von Antikörpern, welche dadurch
verkehrt auf dem Bakterium sitzen und so keine Funktion mehr haben. Die
Opsonisierung ist somit verhindert.
4. Yersinia(gram-): Inhibiert Phagozytose durch Sekretion von Virulenzfaktoren durch
Typ 3 Sekretionssystem. YopE, ein GAP, welches Rac, Cdc42 und Rho inaktiviert;
YopH, eine Phosphatase, die Cas-pY inhibiert, wodurch die GEFs für rac, cdc42 und
Rho nicht aktiviert werden. Aktindepolymerisierung, Inhibierung von Makrophagen
migration/phagozytose und TNF Sekretion, Porenbildung in Membran, Apoptose des
MP – release des Bakteriums.
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–
5. Salmonella typhemurium (gram-): Virulenzfaktor SipB induziert Apoptose (SPI‐1).
Salmonella injiziert über ein Typ3 Sekretionssystem das Protein SipB welches eine
zelleigene Initiatorcaspase (IPAF-Inflammosom) aktiviert. Diese aktiviert darauf die
Caspase-1 durch proteolytische Spaltung → Apoptose. (Caspasen sind eine Familie
von Proteinen, die Apoptose und Entzündungen regulieren. Sie sind CysteinAspartat-Proteasen, daher der Name. Initiator- und Effektorcaspasen bilden eine
proteolytische Kaskade die durch Signale aus der Umgebung gestartet wird).
6. Listeria(gram+): Entkommt vom Phagosome, indem es nach Zipper Invasion
Listeriolysin bzw. die Phospholipase C sekretiert und so das Phagosom lysiert.
Bewegung innerhalb der Zelle durch ActA initiierte Aktinpolymerisierung (AktinKometen). Lecithinase lysiert die 2 Membran-Vacuole nach Sprung in andere Zelle
7. Mycobakteria: resistent gegen Säuren (Laugen & Austrocknung), kann im Phagosom
von Makrophagen überleben. Langsame Vermehrung im Phagosom. Verhindert
Einbau der Protonen ATPase und die Fusion des Phagosoms mit Lysosomen. Kann
Sauerstoffradikale durch Zellwandkomponenten unschädlich machen
Weitere Abwehrmechanismen:
1. Peptidoglykanschicht der gram+ kann Bindung von Komplementproteinen
verhindern.
2. LPS der gram- verhindern, dass der MAC in die Membran inseriert wird
3. mikrobielle Elastase kann Bestandteile des Komplementsystem abbauen
4. MO können Proteine sekretieren, welche inhibitorisch auf das KS wirken
19. Nennen sie drei Beispiele, wie Organismen durch Veränderungen der
Oberflächenproteine der Immunantwort entgehen, und erklären sie welche
Mechanismen diesen Veränderungen zu Grunde liegen!
– Neisseria gonorrheae (gram-,cocci): verändert die Sequenz seiner Pilins durch
Genkonversion. Bei der Genkonversion rekombiniert (unidirektionale Rekombination)
das aktive Gen mit einem promortorlosen „Silent Gene“, dadurch variiert die Sequenz
und damit das Genprodukt. Außerdem produziert es eine Protease die die „hinge“
Domäne vom sekretorischen IgA spaltet.
– Streptococcus (gram+): Ändert die Sequenz des exponierten N‐Terminus vom M‐Protein
durch Deletion. Hilft den Bakterien dem Immunsystem durch schlechtere AK Bindung
zu entkommen.
– Typanosoma brucei (Schlafkrankheit) variiert periodisch sein Hüllenglykoprotein VSG
(Variable Surface Glycoprotein). Genduplikation/Translokation mehrerer VSG-GenVarianten. Dabei werden Teile der promotorlosen Varianten an eine Stelle kopiert,
welche danach exprimiert wird. Dadurch muss das Immunsystem ständig seine
Antikörper neu anpassen
20. Erklären sie die Invasions-, Infektions- und Ausbreitungsstrategie von Listeria
monocytogenes!
– Listeria m.(gram+): Invasion durch Zipper Mechanismus in Zelle (Internalin bindet an
E-cadherin), welches darauf das Cytoskelett lokal rearrangiert (Aktivierung der Rho
GTPasen durch GEF) und das Bak umhüllt. Entkommt Endosom durch die Lyse der
Membran mithilfe von Listeriolysin bzw. Phospholipase C nur in inaktiven
Makrophagen möglich, da bei aktiven Makrophagen die Fusion von Phagosom und
Lysosom zu schnell geschieht und die Bakterien lysiert werden. Ausbreitung der Bak
durch „Aktin Kometen“ Polymerisation: Kometen bestehen aus quervernetzten
Aktinfilamenten. Die Polymerisierung ist polar, Aktinmonomer mit Profilin bindet an
das (+)Ende. Sobald Monomer an (+)Ende gebunden hat, löst es sich von Profilin und
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macht so Platz für die Anhaftung eines weiteren Monomers. Protein ActA initiiert die
Polymerisierung an Oberfläche des Bakteriums. Bakterium wird von den wachsenden
Filamenten (die selbst stationär im Cytosol bleiben) "weggeschoben". Listeria kann sich
so von Zelle zu Zelle ausbreiten. In neuen Zelle hat das Bakterium eine doppelte
Membran um sich herum Lyse der Doppel-Membran-Vakuole durch Lecithinase. So
gelangt Listeria in andere Zellen hinein, ohne in den Interzellulärraum zu müssen.
21. Was sind Biofilme, welche Auswirkungen haben sie? Pathophysiologische und
epidemiologische Bedeutung?
– Biofilm ist eine Ansammlung von Mikroorganismen die entweder auf Zellen, ECM,
Plastik oder auf einer inerten Oberfläche (Zahnschmelz, Prothesen), übereinander
Wachsen. Bsp. S. aureus auf Katheter
– Bildung beginnt mit einer reversiblen Adsorption(schwache Bindung) von Bakterien an
der Oberfläche (Sekunden). Danach Anhaftung irreversibel (Minuten bis Stunden).
Wachstum/Kolonisierung der Bakterien und gleichzeitig Produktion von Exopolymere.
Biofilme werden von Kanälen durchquert, die für die Nährstoffweiterleitung hinein und
den Abtransport von Schadstoffen sorgen. Resistenzen verbreiten sich in Biofilmen
besonders schnell (nosokomialen Infektionen im Krankenhaus → multiresistent)
– -Antibiotika wirken nicht gut, lokal benötigte Konzentration kann nicht erreicht werden
kann, viele Gene coreguliert mit Resistenzgenen. Wachstum in Biofilmen sehr langsam,
Antibiotika greifen nur gut wenn das Wachstum schnell ist.
– Phagocyten können nicht phagocytieren, jedoch stoßen sie lytische Enzyme aus.
Schädigung des umliegenden Gewebes. Beispiel P. aeruginosa und Cystische Fibrose:
Mutation im Chloridkanal alle Sekrete, auch in Lunge, sehr zähflüssig, wodurch
Bakterien sich gut festsetzen können.
22. Welche Ereignisse spielen in den meisten Infektionskrankheiten eine Rolle? Können sie
Ausnahmen nennen, z.B. Krankheiten, in deren Verlauf MO und Wirt nie in direkten
Kontakt kommen?
– Begegnung zwischen Mikroorganismus und Wirt
– Kolonisierung:
1. Eintritt des Mikroorganismus in den Wirt
2. Verbreitung des Mikroorganismus in dem Wirt
3. Vermehrung des Mikroorganismus im Wirt
4. Unterschiedliche Reihenfolge: zB Verbeitung → Vermehrung: Brucella abortus,
Vermehrung → Verbreitung: Staphylococcus
– Beschädigung des Wirtes durch den Mikroorganismus
– Endergebnis:
1. Wirt und Mikroorganismus koexistieren
2. Mikroorganismus gewinnt
3. Wirt gewinnt
– Ausnahme: Clostridium tetani (Tetanustoxin). Die Infektion erfolgt durch das
Eindringen der Sporen in Wunden (Kontamination). Germination der Sporen →
Toxinbildung. Clostridium botulinum (Botulinumtoxin). Durch Nahrungsaufnahme
Konserven erhitzt bei 100°C für ca. 30 Minuten, Konserve kühlt ab Germination der
Sporen → Toxinbildung
23. Beschreiben sie die molekularen Grundlagen der Invasionsstrategie von Salmonella
(typhimurium)!
– Salmonella (gram-) → Invasion via Trigger Mechanismus. Salmonella injiziert durch ein
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–
Typ3 Sekretions-System Effektoren ( SipA, SopE, SopB, SptP) in die Wirts-Zelle. Diese
wechselwirken direkt mit Proteinen (Rho GTPasen) innerhalb der Zelle
Umstrukturierung des Cytoskeletts Macropinosom schließt Bak ein. Gene für Faktoren
befinden sich auf Salmonalle Pathogenicity Island 1: SipA stabilisiert F-Actin, stimuliert
T-PLastin Aktinfaserkomplexe. SopE wirkt als GEF für Cdc42,RhoA und Rac und
aktivert diese → Umstrukturierung des Cytoskeletts.
SopB(Inositolphosphatpolyphosphatase) und SopE essentiell für Invasion- stimuliert
Aktionrearrangement für Eintritt des Bakteriums. SptP wirkt als GAP (GTPase
Activating Protein), also dem GEF/SopE entgegen, blockiert also weitere AktinPolymerisierung.
SPI-2 codiert Gene für das Überleben im Makrophagen. M Zell-Adhäsion und
Translocation zur basolateralen Seite (Transcytose). Aufnahme durch Makrophagen:
entweder überleben sie (Recruitment of Vesikel) und Wachsen in den Makrophagen,
oder sie induzieren Apoptose (SPI-1) Protein SipB wird sekretiert , welches eine
zelleigene Initiatorcaspase aktiviert. Diese aktiviert darauf die Caspase1 durch
proteolytische Spaltung Apoptose. Bakterien werden entlassen und können auf der
basolateralen Seite Epithelzellen invadieren.
24. Manche Bakterien können das Zytoskelett eukaryontischer Zellen beeinflussen. Zu
welchem Zweck? Durch welche Virulenzfaktoren? Mit welchen Molekülen
wechselwirken diese Virulenzfaktoren, und durch welche Mechanismen?
– Zweck: Aufnahme in nicht-phagozytische Zellen, zur Überquerung von Barrieren
(Darm) und Eintritt in geschützte Nischen
– Virulenzfaktoren der beiden Mechanismen:
– Zipper (Yersinia+Invasin, Listeria+Internalin). Mechanismus: Bindung an Rezeptoren,
die das Zytoskelett verändern
– Trigger (beide mit Typ III Sekretion: Salmonella+SopE SopB SptB, Shigella+IpaA,
IpaB/C). Mechanismus: Einschleusen von GAPs und GEFs.
– Generell werden in beiden Fällen die G-Proteine Rac, Rho und CDC42 aktiviert (und
auch wieder deaktiviert)
25. Welche Rolle spielen Exotoxine im Infektionsprozess? Welche Exotoxine begünstigen
den Infektionsprozess und welche tun das nicht?
– Exotoxine: extrazelluläre proteine mit hoher biologischer aktivität und spezifität
– begünstigend:
1. cAMP - Wachstum durch cAMP reguliert → wachsen besser
2. Pertussis und Cholera beeinflussen Wirts-cAMP Spiegel
– nicht begünstigend:
1. Neurotoxine (z.B. Botulinum und Tetanum Toxine) Diphterie Toxin
26. Funktionen des Flagellums als Virulenzfaktor?
– Die monomere Form des Flagellums ist das Flagellin
– Besteht aus konservierten alpha-Helices und aus flexiblen beta-sheets. alpha-helices im
Inneren, beta-Faltblätter bilden Oberfläche, wirken als Adhesin. Wenn Flagellum
depolymerisiert alpha helices treten mit Wirt in Kontakt → Bindungstellen für TLR-5
Rezeptoren (bindet an konservierten D1 Teil der alpha helix) und können
Entzündungsreaktion initiieren.
– Das Flagellum ist wichtig für die Kolonisierung, denn durch die Motilität steigt die
Chance, dass das Bakterium mit den Wirtzellen in Berührung kommt (V.Cholerae)
– Flagellum hat bei manchen Bakterien auch Adhesinfunktion, z.B. bei P.aeruginosa und
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C. difficile.
Flagellum als Sekretionssystem und als Invasin Y. enterocolitica
27. Wie definiert man Virulenz? Ist es eine konstante Eigenschaft? Erklärung!
– Virulenz ist die Fähigkeit, einem Wirt Schaden zuzufügen, der Grad/ die Stärke der
Pathogenität. Sie wird bestimmt durch Toxizität (wie viele Keime reichen, um schädlich
zu sein) und Invasivität (Fähigkeit, in den Wirt einzudringen und zu vermehren). Eine
Definition von Virulenz ohne den Wirt ist nutzlos.
– Virulenz ist keine konstante Eigenschaft, Erklärung an Beispiel HIV: HIV ist ein
Beispiel für einen wenig virulenten Erreger, der durch replicative fitness eine hohe
Latenz erreicht. Das Virus befällt langlebige CD4+ Zellen, wodurch die Effizienz einer
adaptiven Immunantwort sinkt, die hohe Mutationsrate torpediert zusätzlich die CTLvermittelte Immunität. Infektionsroute ist abhängig vom Sozialverhalten, die notwendige
direkte Übertragung (vertical transfer) zeichnet den Erreger als wenig virulent aus.
Pathogenic fitness, viral load und replicative fitness hängen mit der HLA-Diversität
zusammen, von der die Effizienz der CTL-Immunität abhängt. In einem Beispiel sei eine
Person A mit HIV infiziert. Über Jahre sammeln sich Mutationen im HIV-Genom an,
sodass die replicative fitness auf 4 steigt (dimensionsloser Index). Nun kommt es zu
zwei Transmissionsereignissen. Im ersten wird eine Person X infiziert, dessen HLAAllele denen von Person A stark ähneln. Daher ist der Virus resistenter gegen die CTLvermittelte Immunität, die viral load steigt, der Erreger ist virulenter geworden (höhere
pathogenic fitness). Im zweiten Ereignis wird eine Person B infiziert, dessen HLAAllele stark von denen von Person A abweichen. Die CTL-vermittelte Immunität ist
effektiver, es können Polymorphismen gegen die neuen Epitope entwickelt werden, der
Erreger wird effektiver bekämpft. Im Vergleich zu Person A müsste die replicative
fitness etwa 8 betragen, was aber nicht so schnell erreicht werden kann, die Virulenz des
Erregers ist sehr gering, als Folge sinkt die pathogenic fitness und die viral load.
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