Funktionelle und Strukturelle Charakterisierung von Antikörpern

Funktionelle und Strukturelle Charakterisierung
von Antikörpern gegen das Glykoprotein B des
Humanen Cytomegalovirus
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Nadja Spindler
aus Krasnojarsk
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
06. Juni 2013
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Michael Mach
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Lars Nitschke
Drittberichterstatter:
Prof. Dr. Bodo Plachter
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ................................................................................................................... 1
2 Summary.................................................................................................................................. 2
3 Einleitung ................................................................................................................................. 3
3.1 Das Humane Cytomegalovirus (HCMV): Klassifizierung, Morphologie und Replikation . 3
3.2 Epidemiologie und Pathogenese von HCMV .................................................................... 6
3.3 Die zelluläre und humorale Immunantwort gegen HCMV ............................................... 7
3.4 Prophylaxe und Therapie gegen HCMV............................................................................ 8
3.5 Glykoprotein B von HCMV .............................................................................................. 10
3.6 Immunantwort gegen HCMV gB..................................................................................... 11
4 Fragestellung ......................................................................................................................... 14
5 Material ................................................................................................................................. 15
5.1 Reagenzien, Plastik- und Verbrauchsmaterialien ........................................................... 15
5.2 Medien, Puffer und Lösungen ........................................................................................ 15
5.2.1 Nährmedien und Lösungen für Bakterien ............................................................... 15
5.2.2 Medien für Zellkultur ............................................................................................... 16
5.2.3 Puffer und Lösungen ................................................................................................ 16
5.3 Biologische Materialien .................................................................................................. 19
5.3.1 Zellen ........................................................................................................................ 19
5.3.2 Viren ......................................................................................................................... 19
5.3.3 E. coli Stämme .......................................................................................................... 19
5.3.4 Proteine und Peptide ............................................................................................... 20
5.4 Nukleinsäuren ................................................................................................................. 20
5.4.1 Vektoren und Plasmide ............................................................................................ 20
5.4.2 Oligonukleotide ........................................................................................................ 26
5.5 Enzyme............................................................................................................................ 28
5.6 Antikörper ....................................................................................................................... 29
5.6.1 Primäre Antikörper .................................................................................................. 29
5.6.2 Sekundäre Antikörper .............................................................................................. 30
6 Methoden .............................................................................................................................. 31
6.1 Zellkulturverfahren ......................................................................................................... 31
II Inhaltsverzeichnis
6.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen ....................................................................... 31
6.1.2 Transiente Transfektion von eukaryonten Zellen .................................................... 31
6.1.3 Virusrekonstitution .................................................................................................. 32
6.2 Virologische Methoden .................................................................................................. 32
6.2.1 Viruspropagierung in Zellkultur ............................................................................... 32
6.2.2 Virustitration ............................................................................................................ 32
6.2.3 Bestimmung der Replikationskapazität von Viren ................................................... 33
6.2.4 „Cell-Cell-Spread“-Test ............................................................................................ 33
6.2.5 Luciferase-basierter in vitro Neutralisationstest ..................................................... 34
6.2.6 In vitro Neutralisationstest basierend auf Immediate Early-1 (IE-1)-Expression .... 34
6.3 Molekularbiologische Methoden ................................................................................... 35
6.3.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................................................. 35
6.3.2 „Combined Chain Reaction“ (CCR) ........................................................................... 36
6.3.3 DNA-Gelelektrophorese ........................................................................................... 37
6.3.4 Restriktionsenzymverdau von DNA ......................................................................... 37
6.3.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel ............................................ 38
6.3.6 Ligation von DNA...................................................................................................... 38
6.3.7 Herstellung elektrokompetenter Bakterien............................................................. 38
6.3.8 Transformation von E. coli ....................................................................................... 39
6.3.9 Isolierung von Plasmid-DNA..................................................................................... 39
6.3.10 Isolierung von BAC-DNA......................................................................................... 40
6.3.11 Bestimmung der DNA-Konzentration .................................................................... 40
6.3.12 „Markerless Mutagenesis“ nach Tischer et al. ...................................................... 41
6.3.13 Extraktion von DNA aus infizierten Zellen ............................................................. 43
6.3.14 Sequenzierung von DNA ........................................................................................ 43
6.4 Proteinbiochemische Methoden .................................................................................... 44
6.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration ................................................................... 44
6.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................ 44
6.4.3 Coomassieblue-Färbung .......................................................................................... 44
6.4.4 Deglykosylierung mit PNGase F ............................................................................... 45
6.4.5 Erzeugung und Reinigung von Fab-Fragmenten durch Papain-Spaltung ................ 45
6.4.6 Spaltung mit Thrombin ............................................................................................ 46
6.4.7 Überexpression von Proteinen ................................................................................ 46
Inhaltsverzeichnis III
6.4.8 Reinigung von rekombinant exprimierten Proteinen .............................................. 48
6.4.8.1 Affinitätsreinigung an Glutathione Sepharose 4B............................................ 48
6.4.8.2 Affinitätschromatographie an Nickelagarose .................................................. 48
6.4.8.3 Anionenaustausch-Chromatographie .............................................................. 49
6.4.8.4 Kationenaustausch-Chromatographie ............................................................. 49
6.4.8.5 Größenausschluss-Chromatographie ............................................................... 50
6.5 Immunologische Methoden ........................................................................................... 50
6.5.1 „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) ..................................................... 50
6.5.2 Bestimmung der IgG Konzentration ........................................................................ 51
6.5.3 Western Blot Analyse ............................................................................................... 51
6.5.4 Indirekte Immunfluoreszenz .................................................................................... 52
6.5.5 Kovalente Antigenkopplung an AminoLink Plus ...................................................... 52
6.5.6 Antigenspezifische Affinitätsreinigung von Seren ................................................... 52
6.6 Biophysikalische Methoden............................................................................................ 53
6.6.1 „Surface Plasmon Resonance“ (SPR) ....................................................................... 53
6.6.2 Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie ................................................................. 53
6.7 Tierexperimentelle Methoden ....................................................................................... 53
7 Ergebnisse.............................................................................................................................. 55
7.1 AD-4-Antikörpertiter und Neutralisationskapazität humaner Seren ............................. 55
7.2 Einfluss von AD-4-spezifischen Antikörpern auf „Cell-Cell-Spread“ .............................. 58
7.2.1 Reinigung polyklonaler Antikörper mit AD-4-Spezifität aus HCMVHyperimmunseren ............................................................................................................ 59
7.2.2 „Cell-Cell-Spread“-Test mit humanen AD-4-spezifischen Antikörpern ................... 64
7.3 Immunisierung von CD8-/- Mäusen mit gB und AD-4 ..................................................... 66
7.3.1 Immunantwort nach Immunisierung ....................................................................... 66
7.3.2 Analyse zur Neutralisationskapazität von murinen Hyperimmunseren .................. 68
7.4 Identifizierung essentieller Aminosäurereste für die Antikörperbindung ..................... 72
7.4.1 Bindungsspezifität von AD-4-spezifischen hu-mAbs ............................................... 72
7.4.2 Analysen zur AD-4-Spezifität nach einer Infektion mit HCMV ................................ 82
7.4.3 Generierung und Replikationskapazität von AD-4-Virusmutanten ......................... 89
7.4.4 Neutralisation von AD-4-Virusmutanten durch AD-4-spezifische Antikörper......... 91
7.5 Kristallstrukturanalysen zu AD-4, SM5-1Fab und AD-4 im Komplex mit SM5-1Fab ...... 98
7.5.1 Kristallstruktur von AD-4.......................................................................................... 99
IV Inhaltsverzeichnis
7.5.2 Kristallstruktur von SM5-1Fab ............................................................................... 103
7.5.3 Kristallstruktur von AD-4 im Komplex mit SM5-1Fab ............................................ 112
8 Diskussion ............................................................................................................................ 118
9 Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 136
10 Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................................... 161
Publikationen, Patent, Teilnahmen an Kongressen ............................................................... 165
Danksagung ............................................................................................................................ 167
1 Zusammenfassung 1
1 Zusammenfassung
Die Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) ist weit verbreitet und zeigt einen
klinisch asymptomatischen Verlauf in immunkompetenten Personen. Zu schwerwiegenden
Komplikationen kann es in immunsupprimierten Individuen, wie Transplantationspatienten
oder kongenital infizierten Neugeborenen, kommen. Das adaptive Immunsystem trägt
entscheidend zur Kontrolle der viralen Infektion bei. Virusneutralisierende Antikörper sind in
der Regel gegen Glykoproteine der Hülle, insbesondere gegen Glykoprotein B (gB), gerichtet.
In klinischen Studien konnte die Vakzinierung mit gB einen Teilerfolg erzielen. In der
vorliegenden Arbeit wurde die humane humorale Immunantwort gegen die antigene
Domäne 4 (AD-4) von gB im Detail untersucht. AD-4 wird von >100 Aminosäuren (AS)
gebildet und ist diskontinuierlich aufgebaut (AS 121-132 und 344-438). Die Expression der
vollständigen Sequenz ist essentiell für die Bindung von humanen AD-4-spezifischen
Antikörpern. Ein 3D Modell von HCMV gB wurde benutzt, um benachbarte und oberflächenexponierte AS innerhalb von AD-4 zu identifizieren, die zu Alaninen mutiert wurden. Ein
Screening von AD-4-Mutanten (n=31) ergab, dass die AS-Reste Tyrosin 364 und Lysin 379
(YK-Epitop) für die Bindung von humanen monoklonalen Antikörpern (hu-mAbs) kritisch
sind. Das YK-Epitop und benachbarte AS-Reste waren generell wichtig für die AD-4gerichtete Antikörperantwort während der Infektion. Daneben wurden noch weitere antikörperbindende Regionen auf AD-4 identifiziert. Rekombinante Viren (n=9), die Mutationen
in den kritischen AS-Resten trugen, wurden generiert. Der Verlust der Bindung von hu-mAbs
zur isolierten Domäne korrelierte mit dem Verlust der Neutralisationskapazität. Das
Neutralisationspotential von humanen polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern war
ebenfalls stark abhängig vom YK-Epitop und den benachbarten AS, was die Dominanz für die
antivirale humorale Immunantwort gegen gB unterstreicht. Zudem wurden Kristallstrukturanalysen durchgeführt, um die Antigen-Antikörper-Interaktion auf struktureller Ebene zu
charakterisierten. Die Strukturen von AD-4 (1,76 Å), Fab-Fragment des AD-4-spezifischen
hu-mAb SM5-1 (1,87 Å) und deren Komplex (2,1 Å) wurden gelöst. Die funktionelle
Bedeutung des YK-Epitops konnte strukturell bestätigt werden. In der vorliegenden Arbeit
konnte zum ersten Mal eine Struktur für einen Teil von HCMV gB gelöst werden und die
erste Struktur von herpesviralem gB im Komplex mit einem neutralisierenden Antikörper
bestimmt werden. Die gezielte Induktion von AD-4-spezifischen Antikörpern nach
Immunisierung könnte die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCMV positiv beeinflussen.
2 2 Summary
2 Summary
Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitously distributed virus and infection is usually
clinically asymptomatic in healthy individuals. The pathogen causes severe disease in
immunodeficient patients, like transplant recipients and congenital infected newborns. The
development of antiviral antibodies contributes to the effective control of the infection.
During HCMV infection neutralizing antibodies are mainly directed against envelope
glycoproteins, especially against glycoprotein B (gB). Clinical studies concerning vaccination
with gB demonstrated encouraging results. During this thesis the human humoral immune
response directed against antigenic domain 4 (AD-4) of gB was analyzed in more detail. AD-4
consists of >100 amino acids (aa) and is formed by a discontinuous sequence (aa 121-132
and 344-438). Binding of human antibodies to AD-4 was dependent on the expression of the
complete AD-4 sequence. A 3D model of HCMV gB was generated and used for the
identification of neighboring, surface exposed residues that were exchanged to alanin. An
alanin scan of AD-4 mutants (n=31) was carried out and residues tyrosin 364 and lysine 379
(YK-epitope) were identified to be essential for binding of human monoclonal (hu-mAbs) as
well as polyclonal AD-4-specific (poly AD-4) antibodies. The YK-epitope was of general
importance for the AD-4-directed immune response during infection. However, additional
binding sites within AD-4 were also identified. Since both, hu-mAbs and poly AD-4 have virus
neutralizing capacity, neutralizing activity of AD-4-specific antibodies was investigated
towards recombinant viruses (n=9) harboring mutations at critical contact residues. Loss of
antibody binding to isolated AD-4 correlated with loss of neutralizing capacity by AD-4specific hu-mAbs. Interestingly, neutralization activity of poly AD-4 was also greatly reduced
following mutation of the YK-epitope and neighboring residues, emphasizing the importance
of the YK-epitope for the anti-gB antibody response. Crystal structure analysis was
performed for detailed information on the antigen-antibody-interaction on the structural
level. Structures of AD-4 (1.76 Å), a Fab-fragment of the AD-4-specific hu-mAb SM5-1
(1.87 Å) and the complex of both (2.1 Å) were solved. The importance of the YK-epitope for
antibody binding was confirmed. The crystal structure of a part of HCMV gB was solved for
the first time. This is also the first report of a crystal structure of herpesviral gB in complex
with a human neutralizing antibody. The induction of AD-4-specific antibodies following
vaccination could be beneficial for the development of an effective anti-HCMV vaccine.
3 Einleitung 3
3 Einleitung
3.1 Das Humane Cytomegalovirus (HCMV): Klassifizierung, Morphologie und Replikation
Das Humane Cytomegalovirus (HCMV), das auch als Humanes Herpesvirus 5 (HHV-5)
bezeichnet wird, gehört zu der Familie der Herpesviridae. Insgesamt gibt es mehr als 170
Herpesviren, davon sind acht humanpathogen. Dazu gehören neben HCMV, Herpes Simplex
Virus 1 (HSV-1), Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2), Varizella-Zoster Virus (VZV), HHV-6, HHV-7,
Epstein-Barr Virus (EBV) und das Kaposi Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) (Pellet &
Roizman, 2007). Sie infizieren unterschiedliche Zelltypen, besitzen einen lytischen
Replikationszyklus und entwickeln eine latente Infektion des Wirts, die reaktiviert werden
kann (Alford & Britt, 1993). Die Familie der Herpesviridae wird nach biologischen Kriterien in
drei Subfamilien unterteilt: Alpha-, Beta- und Gamma-Herpesvirinae (Davison, 2010). Die
Subfamilien weisen Unterschiede in Zelltropismus, Wirtsspezifität und Replikationscharakteristika auf (Roizman & Pellet, 2001). HCMV wird der Familie der Betaherpesvirinae
zugeordnet (Davison, 2010). Die Einordnung in die Subfamilien wird durch Daten der
Genomsequenzierung unterstützt und zeigt gleichzeitig die Co-Evolution mit dem Wirt
(McGeoch et al., 2000). Zudem existieren zahlreiche HCMV-Stämme, die sich in ihrer
Genomsequenz unterscheiden (Chee et al., 1990; Dolan et al., 2004; Dunn et al., 2003;
Murphy et al., 2003).
Allen Herpesviren gemeinsam ist ihr struktureller Aufbau. Sie besitzen ein ikosaedrisches
Nukleokapsid, das die virale Doppelstrang-DNA (ds DNA) beinhaltet. Das Nukleokapsid ist
umgeben von den sogenannten Tegumentproteinen und wird von einer polymorphen LipidDoppelschicht umhüllt, in die mehr als zehn virale Glykoproteine eingelagert sind (Britt,
2007). Der strukturelle Aufbau von HCMV, der in Abbildung 3-1 schematisch dargestellt ist,
unterscheidet sich nicht von den restlichen Herpesviren, jedoch besitzt es im Vergleich ein
sehr großes Genom mit ca. 235 kbp und kodiert für mehr als 165 Gene (Murphy et al., 2003).
HCMV-Partikel haben einen Durchmesser von 200-300 nm und sind pleomorph (Gibson,
2008). Das Nukleokapsid ist aus 162 Kapsomeren ikosaedrisch aufgebaut (Butcher et al.,
1998; Zhou et al., 1999). Eine massenspektrometrische Analyse hat ergeben, dass das
HCMV-Virion mehr als 70 Proteine beinhaltet (Varnum et al., 2004), von denen mehr als 20
auf das Tegument entfallen (Mocarski & Courcelle, 2001). Tegumentproteine übernehmen
wichtige Aufgaben während der frühen Infektion. Das Tegument besteht aus viralen und
4 3 Einleitung
zellulären Proteinen und enthält sowohl virale als auch zelluläre mRNAs (Baldick & Shenk,
1996; Terhune et al., 2004; Varnum et al., 2004). In Virionen wurden 19 Glykoproteine
identifiziert, deren prozentualer Anteil am Gesamtproteingehalt 13% beträgt. (Varnum et al.,
2004). In die Membran sind vor allem Glykoproteine eingelagert, die für den Eintritt des
Virus in die Zelle wichtig sind (Vanarsdall & Johnson, 2012). Näher charakterisiert sind die
Glykoproteine gB (UL55), gM (UL100), gN (UL73), gH (UL75), gL (UL115), gO (UL74), UL128,
UL130, UL131A und gpUL132. Drei Glykoproteinkomplexe gCI-III sind beschrieben. gCI wird
von gB gebildet und liegt als Trimer vor, wobei ältere Studien Dimere oder Multimere
vorausgesagt haben (Backovic et al., 2009; Britt, 1984; Britt & Auger, 1986; Heldwein et al.,
2006). gB ist essentiell für die Fusion mit der Zellmembran (Isaacson & Compton, 2009;
Navarro et al., 1993; Tugizov et al., 1994). gM und gN formen den Komplex gCII (Mach et al.,
2000), der sowohl bei Viruseintritt in die Zelle als auch während der Morphogenese eine
wichtige Funktion übernimmt (Kari & Gehrz, 1992; 1993; Krzyzaniak et al., 2007). gH/gL liegt
entweder im Komplex mit gO oder als Pentamerkomplex mit UL128-131 vor, somit sind zwei
gCIII Komplexe bekannt (Huber & Compton, 1997; Li et al., 1997; Ryckman et al., 2006; Wang
& Shenk, 2005a). Die unterschiedlichen gH/gL-Komplexe definieren wahrscheinlich den
Zelltropismus (Gerna et al., 2005; Hahn et al., 2004; Patrone et al., 2007; Ryckman et al.,
2006; Ryckman et al., 2008; Schuessler et al., 2012; Straschewski et al., 2011; Vanarsdall et
al., 2011; Wang & Shenk, 2005b). Dabei fungiert gO als Chaperon und ist unter Umständen
nicht im Viruspartikel enthalten (Ryckman et al., 2010; Wille et al., 2010). gpUL132, ein
weiteres Glykoprotein, übernimmt während der Morphogenese eine wichtige Funktion
(Kropff et al., 2010; Spaderna et al., 2005).
HCMV repliziert in vivo hauptsächlich in Epithel-, Endothel-, Muskel-, Gliazellen und
Fibroblasten (Compton et al., 1992; Ryckman et al., 2006; Sinzger, 2008; Sinzger et al., 1995).
Die initiale Bindung des Virus an die Zelle erfolgt über Glykoproteine an ubiquitär
vorhandene Proteoglykane wie Heparansulfat (HPSG) (Compton et al., 1993). Zudem werden
zahlreiche Moleküle auf der Zelle als Rezeptoren für die HCMV-Infektion diskutiert (Feire et
al., 2004; Grundy et al., 1988; Larsson et al., 1998; McKeating et al., 1987; McKeating et al.,
1986; Nowlin et al., 1991; Soderberg et al., 1993; Soroceanu et al., 2008; Taylor & Cooper,
1990; Wang et al., 2003). Nach Bindung an die Zielzelle erfolgt die Fusion über die
„Fusionsmaschinerie“ gB und den gH/gL-Komplex, die allen Herpesviren gemeinsam ist
(Britt, 2007; Connolly et al., 2011; Heldwein & Krummenacher, 2008; Spear & Longnecker,
3 Einleitung 5
2003). Die Fusion erfolgt entweder pH-unabhängig an der Plasmamembran oder über eine
pH-abhängige Endozytose (Bodaghi et al., 1999; Compton et al., 1992; Sinzger, 2008).
Anschließend wird das Nukleokapsid zum Nukleus transportiert und das virale Genom
gelangt in das Nukleoplasma (Ojala et al., 2000), wo es zum Episom zirkularisiert. Die virale
Genexpression ist kaskadenartig reguliert (Mocarski & Kemble, 1996): das Tegumentprotein
pp71 und zelluläre Transkriptionsfaktoren induzieren die Transkription der Immediate Early
(IE) Proteine, die dann als Transkriptionsfaktoren für die Early und Late Gene fungieren
(Spector, 1996; Stasiak & Mocarski, 1992). Die DNA-Replikation über den „Rolling-CircleMechanismus“ und das „Nukleokapsid-Assembly“ finden im Nukleus statt (Mocarski &
Courcelle, 2001). Das Nukleokapsid wird aus dem Zellkern über „Budding“ an der inneren
Nukleusmembran ausgeschleust (Mettenleiter et al., 2006) und verliert seine erste
Hüllmembran an der äußeren Nukleusmembran beim Austritt in das Zytoplasma
(Mettenleiter, 2002). Die Tegumentproteine werden angelagert und es findet eine zweite
Umhüllung über das endoplasmatische Retikulum und das Trans-Golgi-Netzwerk im
Zytoplasma, in dem sogenannten „Assembly Compartment“, statt (Eggers et al., 1992;
Sanchez et al., 2000; Seo & Britt, 2007). Es wurde aber auch beschrieben, dass die
Umhüllung beim Austritt aus der Zelle an der Zellmembran erfolgt, das auch als „Budding“
bezeichnet wird (Silva et al., 2003).
Abb.
3-1.
Schematische
Darstellung
strukturellen Aufbaus von HCMV.
des
6 3 Einleitung
3.2 Epidemiologie und Pathogenese von HCMV
HCMV ist ein ubiquitär vorhandenes Herpesvirus, jedoch ist die Seroprävalenz abhängig von
geographischen und sozioökonomischen Faktoren, und steigt mit dem Alter an (Alford &
Pass, 1981). In Entwicklungsländern beträgt die Seroprävalenz mehr als 90%, während in
Industrieländern, wie USA oder Deutschland, 20-70% der Bevölkerung infiziert sind (Gold &
Nankervis, 1982; Hecker et al., 2004; Huang et al., 1980).
Nach einer primären Infektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirt und es kommt
wahrscheinlich zu einer latenten Infektion von hämatopoetischen Zellen, wobei es zu
sporadischen Reaktivierungen der Virusreplikation kommen kann (Reeves & Sinclair, 2008).
Es kann auch eine Infektion mit unterschiedlichen HCMV-Stämmen erfolgen (Alford & Britt,
1993; Bale et al., 1996; Boppana et al., 2001; Ross et al., 2010). Der Übertragungsweg von
HCMV erfolgt über Körperflüssigkeiten, außerdem über Blutprodukte und Transplantate
(Alford & Pass, 1981; Cannon et al., 2011; Hayes et al., 1972; Lang & Kummer, 1975;
Reynolds et al., 1973; Stagno et al., 1980). In immunkompetenten Individuen erfolgt eine
Infektion mit HCMV meist klinisch asymptomatisch, da das Immunsystem die HCMVInfektion kontrolliert (Pass, 2001). In einer neueren Studie wird eine HCMV Infektion mit
einer geringeren Lebenserwartung assoziiert (Cannon et al., 2010). In Immunsupprimierten,
wie AIDS-Patienten oder Transplantatempfängern, kann das Virus hingegen unkontrolliert
replizieren, was mit zahlreichen Erkrankungen assoziiert wird (Gandhi & Khanna, 2004;
Griffiths, 2002; Riddell & Greenberg, 2000; Steininger et al., 2006). Zu den
Hauptpathogeneseorten zählen Gastrointestinaltrakt, Retina und Lunge (Landolfo et al.,
2003). CMV-Syndrom, Pneumonie, Hepatitis und ZNS-Erkrankungen sind mit einer HCMVInfektion assoziiert (Razonable, 2008). Ausbruch einer HCMV-assoziierten Erkrankung nach
einer Transplantation ist vom Serostatus abhängig. Die Konstellation Spender-HCMV-positiv/
Empfänger-HCMV-negativ stellt bei Organtransplantationen eine Risikogruppe dar (Paya et
al., 2004; Vancikova & Dvorak, 2001). Bei 20-60% der Organtransplantationspatienten tritt
eine symptomatische CMV-Infektion auf (Mwintshi & Brennan, 2007), die Inzidenz variiert
jedoch je nach Organtransplantat (Cukuranovic et al., 2012). Eine prophylaktische
medikamentöse Behandlung kann das Risiko einer CMV-assoziierten Erkrankung in
Transplantationspatienten reduzieren (Hodson et al., 2008; Mendez-Eirin et al., 2012). Die
kongenitale Infektion von Neugeborenen ist eine weitere Problematik der HCMV-Infektion
(Britt, 2008). Die vertikale Transmission von HCMV auf den Fötus ist stark abhängig vom
3 Einleitung 7
Serostatus der Mutter (intrauterin, perinatal, postnatal), wobei die Übertragungsrate bei
einer seropositiven Mutter geringer ist (Boppana & Britt, 1995; Fowler et al., 2003; Stagno et
al., 1986). Während der Schwangerschaft wird etwa 1% der Frauen primär mit HCMV
infiziert, 40% dieser Frauen übertragen dann das Virus auf ihr ungeborenes Kind (Yinon et
al., 2010). Dies kann zu unterschiedlichen Komplikationen, wie neurologischen Defekten und
Organschäden, oder zum Tod des Kindes führen (Boppana et al., 1992; Duff, 2005). HCMV ist
die häufigste virale Infektion des Fötus mit einem prozentuellen Anteil von 0,2-2%
kongenital infizierter Neugeborener, 5-15% jener entwickeln Folgeschäden (Kenneson &
Cannon, 2007).
3.3 Die zelluläre und humorale Immunantwort gegen HCMV
Die CMV-Infektion wird durch das zelluläre und humorale Immunsystem kontrolliert. Virale
Replikation kann sowohl durch CD4+ als auch CD8+ T-Zellen limitiert werden, so kann eine
klinische Manifestation verhindert werden (Greenberg & Riddell, 1999; Reddehase, 2002). In
gesunden, seropositiven Individuen sind ca. 10% der CD4+ und CD8+ Gedächtnis T-Zellen
HCMV-spezifisch (Mocarski & Courcelle, 2001). 151 der 213 „Open Reading Frames“ (ORFs)
sind immunogen in der Antwort der CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen (Sylwester et al., 2005).
Sowohl strukturelle als auch nicht-strukturelle Proteine sind Antigene für die CMVspezifische T-Zellantwort (Mocarski & Courcelle, 2001).
Die humorale Immunantwort des adaptiven Immunsystems wird durch spezifische CD4+
T-Helferzellen aktiviert. Von den aktivierten B-Zellen werden Antikörper gegen eine Vielzahl
von HCMV-Proteinen sezerniert (Britt, 1991; Landini et al., 1990; Landini & Michelson, 1988).
Die Antikörper sind gegen strukturelle und nicht-strukturelle Proteine gerichtet (Greijer et
al., 1999). Abgesehen von Tegumentproteinen sind auch Glykoproteine Zielantigene HCMVspezifischer Antikörper (Britt, 1991; Britt & Mach, 1996). Man unterscheidet zwischen
neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörpern. Die meisten neutralisierenden
Antikörper werden gegen die Glykoproteine gB, den gH/gL/UL128-131- und den gM/gNKomplex induziert (Britt, 1991; Genini et al., 2011; Li et al., 1995; Lilleri et al., 2012; Macagno
et al., 2010; Marshall et al., 1992; Shimamura et al., 2006; Spaete et al., 1994). Verschiedene
Studien konnten zeigen, dass Antikörper eine wichtige Funktion bei der Kontrolle einer
primären Infektion oder während einer Reaktivierung übernehmen und so die Viruslast
senken (Bonaros et al., 2008; Cekinovic et al., 2008; Chatterjee et al., 2001; Furebring et al.,
8 3 Einleitung
2002; Nigro et al., 2005; Nigro et al., 2012; Wang et al., 2004). Neutralisierende Antikörper,
welche die Infektion von Endothel- und Epithelzellen verhindern, können bereits zehn Tage
nach Infektion im Serum detektiert werden und sind noch 12 Monate später nachweisbar
(Genini et al., 2011; Gerna et al., 2008). Obwohl für HCMV nicht gezeigt, können nichtneutralisierende Antikörper ebenfalls zur Viruseliminierung beitragen, indem sie FcRezeptor-vermittelte Effektorfunktionen wie ADCC („Antibody Dependent Cellular
Cytotoxicity“) oder CDC („Complement Dependent Cytotoxicity“) aktivieren (Hessell et al.,
2007).
3.4 Prophylaxe und Therapie gegen HCMV
„The Institute of Medicine of the National Academy of Science“ (USA) hat die Entwicklung
einer HCMV-Vakzine mit höchster Priorität eingestuft, um so eine kongenitale Infektion des
Fötus verhindern zu können (Development et al., 2000). Die Entwicklung eines Impfstoffes
ist jedoch schwierig, da HCMV zahlreiche Mechanismen besitzt, um der Immunantwort zu
entkommen (Powers et al., 2008). Für eine erfolgreiche HCMV-Vakzine ist sowohl die
Aktivierung des humoralen als auch des zellulären Immunsystems von großer Bedeutung
(Plotkin, 2002), da beide Immunsystemarme wichtige Funktionen bei der Kontrolle der
HCMV-Infektion übernehmen (Gandhi & Khanna, 2004). In klinischen Studien wurden
zahlreiche Vakzinierungsstrategien zur Entwicklung eines erfolgreichen HCMV-Impfstoffes
getestet: attenuiertes Virus, rekombinant exprimierte Subunitvakzine, rekombinante
Expressionsvektoren in Pockenpartikeln (ALVAC) oder in Alphaviren (VRP) und DNA-Vakzine
(Berencsi et al., 2001; Bernstein et al., 2009; Bernstein et al., 2002; Elek & Stern, 1974; Frey
et al., 1999; Griffiths et al., 2011; Heineman et al., 2006; Jacobson et al., 2009; KharfanDabaja et al., 2012; La Rosa et al., 2012; Neff et al., 1979; Pass et al., 2009; Plotkin et al.,
1975; Plotkin et al., 1994; Plotkin et al., 1984; Plotkin et al., 1991). Abgesehen von
attenuierten Viren, werden als Antigen meist gB, pp65 und IE-1 verwendet. Die zahlreichen
Immunisierungsansätze werden immer noch verfolgt, jedoch konnte bis heute kein
erfolgreicher Impfstoff gegen HCMV lizensiert werden. Die Impfung mit rekombinant
exprimierten gB (MF59 als Adjuvans) ist ein erfolgreicher Ansatz in klinischen Studien
(Griffiths et al., 2011; Pass et al., 2009). Hier wurden Frauen im gebärfähigen Alter bzw.
Transplantationspatienten immunisiert und es ließ sich ein Teilerfolg beobachten. Nach
Immunisierung mit gB wird sowohl die Antikörperantwort, die mit einem hohen anti-gB Titer
3 Einleitung 9
assoziiert ist, als auch die CD4+ T-Zell-Antwort induziert (Sabbaj et al., 2011). Die VRPbasierten Immunisierungen führen ebenfalls zur Aktivierung des zellulären und des
humoralen Immunsystems (Bernstein et al., 2009).
Nach einer Knochenmarkstransplantation senkt ein hoher Titer an neutralisierenden
Antikörpern die Viruslast im Blut (Schoppel et al., 1998). Hyperimmunglobulin-Präparate
werden als Prophylaxe oder auch Therapie intravenös verabreicht (Guglielmo et al., 1994).
Hyperimmunglobuline werden aus Seren von HCMV-positiven Personen gewonnen. Die
Gabe von Hyperimmunglobulinen reduziert das Auftreten von HCMV-assoziierten
Erkrankungen in kongenital infizierten Neugeborenen (Nigro et al., 2005; Nigro et al., 2012).
Zudem wirkt sich die therapeutische Verabreichung positiv auf die Manifestierung einer
HCMV-Erkrankung bei transplantierten Patienten aus (Bonaros et al., 2008; Ruttmann et al.,
2006; Snydman et al., 1987; Zaia, 1993). Außerdem konnte im Mausmodell gezeigt werden,
dass die Gabe von neutralisierenden Antikörpern vor Infektion mit murinen Cytomegalovirus
(MCMV) schützt, die Ausbreitung des reaktivierten Virus verhindert und MCMV-induzierte
Läsionen im Gehirn neugeborener Mäuse reduziert (Cekinovic et al., 2008; Farrell & Shellam,
1991; Jonjic et al., 1994; Klenovsek et al., 2007). Passive Immunisierung von schwangeren
Meerschweinchen mit polyklonalem gB-spezifischem Serum konnte die Infektionsraten des
Fötus senken, zudem war die mütterliche Virämie verkürzt und es kam seltener zum Verlust
des Fötus (Chatterjee et al., 2001). Virusneutralisierende monoklonale Antikörper wie
MSL-109, 89-104 oder C23 wurden in klinischen Studien untersucht. Jedoch konnte keiner
der getesteten Antikörper vollen Schutz vermitteln oder die HCMV-assoziierte Erkrankung
abschwächen (Aulitzky et al., 1991; Azuma et al., 1991; Böckh et al., 2001; Masuho et al.,
1990). Das Versagen der Therapie mit monoklonalen Antikörpern könnte unter anderem auf
die Bildung von Resistenzen zurückgehen. In vitro wurde eine Resistenz gegen den gHspezifischen monoklonalen Antikörper MSL-109 gezeigt (Manley et al., 2011).
Adoptiver Transfer von CMV-spezifischen, zytotoxischen T-Zellen ist erfolgreich sowohl im
Tiermodell als auch im Menschen (Cobbold et al., 2005; Reddehase et al., 1988; Reddehase
et al., 1987; Reddehase et al., 1985; Riddell et al., 1992; Walter et al., 1995). Auch der
adoptive Transfer von Gedächtnis B-Zellen schützt vor einer CMV-Infektion und ist
unabhängig von CD4+ T-Helferzellen (Hebeis et al., 2004; Klenovsek et al., 2007).
10 3 Einleitung
Der adoptive Transfer von Zellen ist mit hohen Kosten verbunden, deswegen wird in der
Praxis
bei
Transplantationspatienten
hauptsächlich
die
antivirale
Chemotherapie
angewendet (Lischka & Zimmermann, 2008). Die antiviralen Therapeutika werden dabei
entweder prophylaktisch oder bei nachweisbarer CMV-Replikation verabreicht. Ganciclovir,
Valganciclovir, Foscarnet und Fomivirsen sind die antiviralen Medikamente, die zur
Behandlung der HCMV-Erkrankung eingesetzt werden (Biron et al., 1985; Chrisp & Clissold,
1991; Cihlar & Chen, 1996; Perry & Balfour, 1999). Trotz Erfolgen mit der antiviralen
Chemotherapie (Bacigalupo et al., 1996; Böckh et al., 2003; Enright et al., 1993; Paya et al.,
2004), weist die angewandte medikamentöse Behandlung zahlreiche Nebenwirkungen auf.
Hier zu nennen sind Myelosuppression, Nephrotoxizität, späte Entstehung einer HCMVErkrankung und Resistenzbildung (Eid et al., 2008; Emery & Griffiths, 2000; Jain et al., 2005;
Limaye et al., 2000; Lurain & Chou, 2010; Naesens & De Clercq, 2001).
3.5 Glykoprotein B von HCMV
Unter den Herpesviren ist Glykoprotein B ein konserviertes Hüllprotein und bildet zusammen
mit dem gH/gL-Komplex die herpesvirale „Fusionsmaschinerie“ (Connolly et al., 2011;
Cranage et al., 1986; Heldwein & Krummenacher, 2008; Spear & Longnecker, 2003). Der
Anteil von gB am Gesamtproteingehalt eines HCMV-Partikels entspricht 1% (Varnum et al.,
2004), dabei ist gB essentiell für die Virusreplikation (Hobom et al., 2000). gB ist am „CellCell-Spread“ beteiligt, jedoch nicht notwendig für die Bindung an die Zelloberfläche, den
Zusammenbau von Virionen und den Austritt aus der Zelle (Isaacson & Compton, 2009). gB
interagiert mit einer Vielzahl von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie HeparansulfatProteoglykane, Integrine oder PDGF-α-Rezeptor (Compton et al., 1993; Feire et al., 2004;
Soroceanu et al., 2008). gB ist aus >900 Aminosäuren (AS) aufgebaut und ein Typ I
Membranprotein, das posttranslational glykosyliert wird und von der zellulären
Endoprotease Furin im Trans-Golgi-Netzwerk in die Untereinheiten gp116 und gp58
gespalten wird (Britt & Auger, 1986; Britt & Vugler, 1989; Spaete et al., 1988; Vey et al.,
1995), wobei die Spaltung für die Fusionsaktivität nicht essentiell ist (Strive et al., 2002).
gp116 ist der N-terminale Teil und gp58 der C-terminale Teil, die durch Disulfidbrücken
kovalent verknüpft sind (Britt, 1984; Britt & Mach, 1996; Eickmann et al., 1998; Lopper &
Compton, 2002). Nach bioinformatischen Vorhersage bilden die AS 1-29 die Signalsequenz
(Perlman & Halvorson, 1983). Der hydrophobe Bereich in gp58 verankert gB in der
3 Einleitung 11
Membran. Kristallstrukturanalysen zu gB (HSV-1 und EBV) konnten zeigen, dass es als
Homotrimer vorliegt und ein Monomer aus fünf strukturellen Domänen aufgebaut ist
(Backovic et al., 2009; Heldwein et al., 2006). Ausgehend von den Strukturdaten ist gB in die
Gruppe der Klasse III der Fusionsproteine eingeordnet worden (Backovic & Jardetzky, 2009;
Backovic et al., 2009). Aufgrund der Sequenzhomologie zu HSV-1 gB konnte ein molekulares
Modell von HCMV gB durch komparatives „Alignment“ generiert werden (Pötzsch et al.,
2011). Das Modell von HCMV gB ist in Abbildung 3-2 B dargestellt.
Abb. 3-2. Glykoprotein B (gB) und bekannte Epitope auf
gB. (A) Lineare Darstellung von HCMV gB. Strukturelle
Domänen sind in unterschiedlichen Farben, in Analogie
zur Struktur von HSV-1 gB, dargestellt (Heldwein et al.,
2006).
Klammern
symbolisieren
Disulfidbrücken
innerhalb von gB und die Zahlen geben jeweils den
Beginn der Domänen an. Antikörperbindende Regionen
(AD:
Antigene
Domäne)
Transmembrandomäne.
(B)
sind
eingezeichnet.
TM:
Ribbon-Diagramm
des
Modells von HCMV gB. Die farbliche Darstellung ist anlog
zu (A).
3.6 Immunantwort gegen HCMV gB
Während einer Infektion mit HCMV induziert gB nicht nur die zelluläre Immunantwort
(Sylwester et al., 2005), sondern vor allem die Produktion von Antikörpern. gB-spezifische
Antikörper können in Seren aller HCMV-positiver Individuen detektiert werden, ein Großteil
derer besitzt virusneutralisierende Eigenschaften (Britt et al., 1990; Kniess et al., 1991;
Marshall et al., 1992). Antikörper, die gegen gB gerichtet sind, können entweder die
12 3 Einleitung
Adsorption an den zellulären Rezeptor verhindern (Ohizumi et al., 1992), die Penetration
(Navarro et al., 1993) oder die Fusion mit der Zielzelle blockieren (Gicklhorn et al., 2003).
Zudem induziert gB auch eine Vielzahl von nicht-neutralisierenden Antikörpern (Pötzsch et
al., 2011; Qadri et al., 1992; Utz et al., 1989), die um die Bindungsstelle mit den
neutralisierenden Antikörpern konkurrieren können. Bis jetzt sind fünf antigene Domänen
(AD) auf HCMV gB beschrieben und teilweise näher charakterisiert worden. Ihre Lokalisation
auf gB ist in Abbildung 3-2 dargestellt. Vier der antigenen Domänen sind Zielstrukturen von
neutralisierenden Antikörpern (AD-1, -2, -4 und -5).
AS 552-635 von HCMV gB (Virusstamm AD169) bilden die antikörperbindende Region AD-1
(Ohlin et al., 1993; Wagner et al., 1992). Eine Disulfidbrücke zwischen den Positionen AS 573
und 610 sorgt für die Konformation des Epitops, die für die Bindung von
konformationsabhängigen AD-1-spezifischen Antikörpern entscheidend ist (Speckner et al.,
2000). AD-1 ist eine immundominante antigene Domäne auf HCMV gB, die
Seropositivitätsrate beträgt 100% (Pötzsch et al., 2011; Schoppel et al., 1997). Jedoch binden
an das AD-1-Epitop nicht nur neutralisierende Antikörper, sondern auch welche, die nicht in
der Lage sind die Infektion zu verhindern (Speckner et al., 1999). Eine Kompetition um die
Bindungsstelle zwischen den neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörpern
wurde beschrieben (Ohlin et al., 1993; Utz et al., 1989). Zudem können polyklonale AD-1spezifische Antikörper ein infektiöses Virus nicht zu 100% neutralisieren, was die
unterschiedlichen Eigenschaften von AD-1-spezifischen Antikörpern unterstreicht (Speckner
et al., 1999). AD-2 ist ein lineares Epitop und besteht aus zwei Teilen: AS 68-77 („Site I“) und
AS 50-54 („Site II“). „Site I“ induziert virusstammunabhängige, neutralisierende Antikörper,
während „Site II“ virusstammspezifische Antikörper induziert, die keine virusneutralisierende
Aktivität besitzen (Meyer et al., 1990; Meyer et al., 1992). Die Seropositivitätsrate gegen
AD-2 liegt bei 50-60% (Pötzsch et al., 2011; Schoppel et al., 1997). AD-3 ist intraviral
lokalisiert (AS 783-906) und wie zu erwarten ist, binden hier nicht-neutralisierende
Antikörper (Britt & Mach, 1996). Serologische Untersuchungen mit einer kleinen
Probenanzahl ergaben, dass in 100% der analysierten Seren AD-3-bindende Antikörper
enthalten sind (Kniess et al., 1991; Silvestri et al., 1991). Bei der Analyse der humoralen
Immunantwort gegen gB in gesunden, HCMV-positiven Individuen wurden zwei weitere
antigene Domänen identifiziert, die während der Infektion hauptsächlich neutralisierende
Antikörper induzieren: AD-4 und AD-5 (Pötzsch et al., 2011). AD-4 ist eine diskontinuierliche
3 Einleitung 13
Sequenz und entspricht der strukturellen Domäne II von HCMV gB (AS 121-132 und AS 344438). Über 90% der Seren von HCMV-positiven Personen enthalten Antikörper, die gegen
dieses Epitop gerichtet sind. AD-4-spezifische Antikörper besitzen virusneutralisierende
Aktivität. Zudem weisen polyklonale AD-4-spezifische Antikörper ein vergleichbares
Neutralisationspotential wie monoklonale Antikörper auf, die an diese Region binden. Dies
weist darauf hin, dass keine oder nur geringe Konzentrationen von nicht-neutralisierenden
Antikörpern in einer polyklonalen AD-4-spezifischen IgG-Präparation enthalten sind (Pötzsch
et al., 2011). Die AD-5-Sequenz stimmt mit der strukturellen Domäne I von HCMV gB überein
(AS 133-343). Mehr als 50% der Seren von HCMV-positiven Individuen erkennen dieses
Epitop. Auch AD-5-bindende Antikörper neutralisieren das Virus effizient und bis jetzt
konnten dagegen keine nicht-neutralisierenden Antikörper identifiziert werden (Pötzsch et
al., 2011).
14 4 Fragestellung
4 Fragestellung
Die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCMV hat hohe Priorität und könnte
lebensbedrohende
Komplikationen
in
immunsupprimierten
Personen,
wie
Transplantatempfängern oder kongenital-infizierten Neugeborenen, verhindern. Als
erfolgversprechender Kandidat gilt gB. Für die herpesvirale Replikation ist gB essentiell und
seine Funktion, die Fusion der viralen Hüllmembran mit der Wirtszellmembran, ist innerhalb
der Herpesviren konserviert. Bei den Herpesviren ist die Fusion ein komplexer Prozess, in
den zahlreiche virale Proteine involviert sind.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, wie gB-spezifische,
neutralisierende Antikörper mit dem Molekül interagieren und die Bindungspartner sollten
identifiziert werden. Für die funktionelle Analyse sollten „Alanin-Scans“ von AD-4, einer
immundominanten Region von gB, benutzt werden. Die erhaltenen Ergebnisse sollten auf
viraler Ebene verifiziert werden, aus dem Grund sollten auf Basis der Mutantenanalyse
rekombinante Viren generiert werden. Des Weiteren sollte überprüft werden, inwieweit die
identifizierten Reste generell von Bedeutung sind für die AD-4-gerichtete Antikörperantwort
während der Infektion mit HCMV. Für die strukturelle Charakterisierung der AntigenAntikörper-Interaktion sollten Kristallstrukturanalysen durchgeführt werden.
5 Material 15
5 Material
5.1 Reagenzien, Plastik- und Verbrauchsmaterialien
Wenn nicht anders angegeben wurden alle Chemikalien und Reagenzien, die in dieser Arbeit
verwendet wurden, über die Firmen Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim), Carl Roth
GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Merck KGaA (Darmstadt), Roche Diagnostics GmbH
(Mannheim), Life Technologies GmbH (Darmstadt) oder SERVA Electrophoresis GmbH
(Heidelberg) bezogen. Plastik- und Verbrauchsmaterialien wurden von den Firmen Sarstedt
AG & Co. (Numbrecht), Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen), Braun Melsungen AG
(Melsungen), Eppendorf AG (Hamburg), Biozym Scientific GmbH (Hessisch Oldendorf), Nunc
GmbH & Co. KG (Langenselbold), Fisher Scientific GmbH (Schwerte), Corning B. V. Life
Sciences (Amsterdam, Niederlande), Peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen) und
A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH (Würzburg) verwendet.
GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) diente als DNA-Standard und
PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) als Protein-Standard.
5.2 Medien, Puffer und Lösungen
Alle Medien, Puffer und Lösungen wurden ausschließlich mit Reinstwasser aus dem Millipore
System (Schwalbach) angesetzt. Prozentuale Angaben entsprechen Volumenprozent.
Mengenangaben beziehen sich auf ein Endvolumen von 1 l, wenn nicht anders angegeben.
5.2.1 Nährmedien und Lösungen für Bakterien
Alle Medien und Lösungen wurden durch Autoklavieren für 20 min bei 120 °C sterilisiert.
LB-Medium (Luria-Bertani Medium)
10 g Bacto Trypton (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg), 5 g Bacto Yeast
Extract (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg), 5 g NaCl; mit NaOH auf pH 7,2
eingestellt; gegebenenfalls Zugabe von 100 mg Ampicillin (Gerbu Biotechnik
GmbH, Wieblingen) bzw. 30 mg Kanamycin (Gerbu Biotechnik GmbH) bzw.
17 mg Chloramphenicol (Sigma Aldrich Chemie GmbH)
LB-Agar
15 g Bacto Agar (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) in LB-Medium
SOC-Medium
20 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Yeast Extract, 0,58 g NaCl, 0,18 g KCl, 2 g MgCl2
Medien für bakterielle Fermentation (Studier, 2005)
100x505 (100 ml)
50 g Glycerin, 5 g Glucose, 57 ml H2O
16 5 Material
50xM (100 ml)
22,25 g Na2HPO4x2H2O, 17 g KH2PO4, 13,4 g NH4Cl, 3,55 g Na2SO4, 75 ml H2O
1000xmetals (100 ml)
50 ml 0,1 M FeCl3 in 0,12 M HCl, 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MnCl2x4H2O, 1 ml 1 M
ZnSO4x7H2O, 1 ml 0,2 M CoCl2x6H2O, 2 ml 0,1 M CuCl2x2H2O, 1 ml 0,2 M
NiCl2x6H2O, 2 ml 0,1 M Na2MoO4x2H2O, 2 ml 0,1 M Na2SeO3x5H2O, 2 ml 0,1 M
H3BO4, 36 ml H2O (von Firma Diarect AG, Freiburg, zur Verfügung gestellt)
ZY
10 g Bacton Pepton (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg), 5 g Bacto Yeast
Extract
MDG-Medium
2 mM MgSO4, 0,5% Glucose, 0,25% Aspartat, 2 ml 50xM; Zugabe von 100 mg
Kanamycin
ZYM-505 Medium
2 mM MgSO4, 0,2 ml 1000xmetals, 0,25% Aspartat, 10 ml 100x505, 20 ml 50xM;
Zugabe von 100 mg Kanamycin
5.2.2 Medien für Zellkultur
DMEM (Dulbecco’s minimal essential medium; Life Technologies GmbH)
Kultivierung von Cos7, 293T, MRC5 und HFF Zellen unter Zugabe von 10% FKS
(fetales Kälberserum), 350 mg Glutamin und 100 mg Gentamicin
DMEM:Ham’s nutrient mixture F12 1:1 (Sigma Aldrich Chemie GmbH)
Kultivierung von ARPE19 Zellen unter Zugabe von 10% FKS, 350 mg Glutamin,
100 IU/ml Penicillin und 100 mg Streptomycin
EBM-2 (Endothelial cell basal medium; Lonza Ltd., Basel, Schweiz)
Kultivierung von HUVEC Zellen unter Zugabe von EGM-2MV-Kit
MEM (Minimal essential medium)
Kultivierung von HFF Zellen unter Zugabe von 5% FKS, 350 mg Glutamin und
100 mg Gentamicin
RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute; Life Technologies GmbH)
Kultivierung von Hybridomzellen unter Zugabe von 10% FKS, 350 mg Glutamin
und 100 mg Gentamicin
Einfriermedium
3 Volumenanteile 20% Glucose und 2 Volumenanteile DMSO in RPMI-1640
5.2.3 Puffer und Lösungen
Standard Puffer
PBSo (Phospate buffered saline)
137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4; mit HCl auf pH
7,4 eingestellt
0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0 (600 ml)
117 ml 0,2 M NaH2PO4, 183 ml 0,2 M Na2HPO4
0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,4 (600 ml)
57 ml 0,2 M NaH2PO4, 243 ml 0,2 M Na2HPO4
5 Material 17
10xT4-Puffer
330 mM Tris, 660 mM CH3COOK, 100 mM (CH3COO)2Mg; mit Essigsäure pH auf
7,9 eingestellt
Lysierungspuffer
50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS, 2 mM
EDTA pH 7,0
Puffer für DNA-Gelelektrophorese
10xTBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA-Puffer)
900 mM Tris, 900 mM Borsäure, 25 mM EDTA
6xDNA-Probenauftragspuffer
0.25% Bromphenolblau, 30% Glycerin
Puffer und Lösungen für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
5%ige Polyacrylamid (PAA)-Sammelgellösung (10 ml)
1,7 ml Acrylamid 30%, 0,7 ml Bis-acrylamid 2%, 1,24 ml 1 M Tris pH 6,8, 50 μl
10% APS, 20 μl TEMED
10%ige PAA-Trenngellösung (20 ml)
6,79 ml Acrylamid (30%), 1,31 ml Bis-acrylamid (2%), 3,7 ml 2 M Tris pH 8,8,
101 μl 20% SDS, 76 μl 10% APS, 16 μl TEMED
15%ige PAA-Trenngellösung (20 ml)
10,1 ml Acrylamid (30%), 1,31 ml Bis-acrylamid (2%), 3,7 ml 2 M Tris pH 8,8,
101 μl 20% SDS, 76 μl 10% APS, 16 μl TEMED
15%ige High-Bis-PAA-Trenngellösung (20 ml)
10,1 ml Acrylamid (30%), 4 ml Bis-acrylamid (2%), 3,7 ml 2 M Tris pH 8,8, 101 μl
20% SDS, 76 μl 10% APS, 16 μl TEMED
10xSDS-Elektrophoresepuffer
1,9 M Glyzin, 250 mM Tris, 38 mM SDS
2xSDS-Probenpuffer reduzierend (20 ml)
125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% β-Mercaptoethanol, 2 mM
EDTA (pH 6,8), 0,01% Bromphenolblau
2xSDS-Probenpuffer nicht reduzierend (20 ml)
125 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 2 mM EDTA (pH 6,8), 0,01%
Bromphenolblau
Lösungen zum Proteinnachweis in PAA-Gelen
Coomassie Färbelösung (330 ml)
5 g Brillant Blau G 250, 150 ml Methanol, 30 ml Essigsäure
Entfärberlösung I
45% Methanol, 12% Essigsäure
Entfärberlösung II
5% Methanol, 5% Essigsäure
18 5 Material
Puffer und Lösungen für Western Blot
Proteintransferpuffer
25 mM Tris, 192 mM Glyzin, 20% Methanol
Ponceau S Färbelösung
0,2% PonceauS, 3% Trichloressigsäure
Waschlösung
0,1% Tween 20, PBSo
Blocklösung
3% Milchpulver, 0,1% Tween 20, PBSo
ECL-Substratlösung
4 ml ECL-Solution A (Luminol), 40 µl ECL-Solution B (p-Cumarinsäure), 1,24 µl
H2O2
Puffer und Lösungen für ELISA („Enzyme Linked Immunosorbent Assay“)
ELISA-Beschichtungspuffer (Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6)
15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3
ELISA-Waschlösung
0,1% Tween 20, PBSo
ELISA-Blocklösung
2% FKS, 0,1% Tween 20, PBSo
TMB-Substratlösung
1:1 Mischung von TMB Peroxidase Substrate und Peroxidase Subtrate Solution B
(KPL Inc., Gaithersburg, USA)
Puffer für Proteinreinigungen
Periplasmapuffer
100 mM Tris, 500 mM Saccharose, 1 mM EDTA; mit HCl auf pH 8,0 eingestellt
GST-Eluationspuffer
10 mM L-Glutathion reduziert, 50 mM Tris, pH 8,0
GST-Spaltpuffer
50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT
HiTrapQ Puffer A
20 mM Tris; mit HCl auf pH 8,0 eingestellt
HiTrapQ Puffer B
20 mM Tris, 0,6 M NaCl; mit HCl auf pH 8,0 eingestellt
HiTrapSP Puffer A
50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0
HiTrapSP Puffer B
50 mM Natriumacetatpuffer, 0,6 M NaCl, pH 5,0
HisTrap Puffer A
20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 40 mM Imidazol; mit NaOH auf pH 7,4
eingestellt
HisTrap Puffer B
20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol; mit NaOH auf pH 7,4
eingestellt
Gelfiltrationspuffer
20 mM Tris, 150 mM NaCl; mit HCl auf pH 7,4 eingestellt
Puffer und Lösungen für Luciferase Assay
LAP (Luciferase Assay Puffer)
15 mM K3PO4 (pH 7,8), 25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, frisch
zugeben 5 mM ATP und 1 mM DTT
LS (Luciferin Solution)
25 mM Glycylglycin, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, frisch zugeben 0,05 mM
Luciferin und 2 mM DTT
5 Material 19
5.3 Biologische Materialien
5.3.1 Zellen
HFF
primäre humane Vorhautfibroblasten; gewonnen aus Vorhautgewebe ein bis
sieben Tage alter Neugeborener; bis Passage 16 verwendet
MRC5
TM
humane normale Lungenfibroblasten (CCL-171 , ATCC), bezogen von der Firma
LGC Standards GmbH (Wesel)
Cos7
Nierenzellen aus der Grünen Meerkatze, transformiert mit SV40 Large T-Antigen
TM
(CRL-1651 , ATCC)
TM
ARPE19
humane retinale pigmentierte Epithelzellen (CRL-2302 , ATCC)
HUVEC
primäre humane embryonale Endothelzellen; gewonnen aus Nabelschnurvene
Neugeborener; bis Passage 9 verwendet
Hybridome
Hybridomzelllinien, generiert aus Myelomzellen und B-Zellen, welche aus mit
HCMV immunisierten Mäusen stammen und die Antikörper 27-287, p63-27,
14-16A produzieren
5.3.2 Viren
HB15-UL84prluc
rekombinantes
Virus
des
HCMV-Laborstammes
AD169,
welches
das
Luciferasegen trägt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr.
Thomas Stamminger, Universitätsklinikum Erlangen)
TB40E
endothel- und epithelzelltropher HCMV-Stamm (BAC-DNA: TB40/E BAC4; wurde
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Christian Sinzger,
Universität Ulm)
TB40E Virusmutanten
Rekombinante Viren des HCMV-Stammes TB40/E-BAC4, die Mutationen im
AD-4-kodierenden Bereich tragen
5.3.3 E. coli Stämme
DH10B
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139
Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG (Life Technologies GmbH)
BL21
F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal (Pharmacia Biotech)
BL21 Star (DE3)
F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm rne131 (DE3) (Life Technologies GmbH)
Tuner (DE3)
F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) (Novagen)
GS1783
auf
DY380
E.
coli
basierend,
trägt
zusätzlich
die
Sequenz
der
Homingendonuklease I-SceI (Arabinose induzierbar) im Genom; DY380: auf
DH10B basierend – F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZ M15 ΔlacX74 deoR
recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7649 galU galK rspL nupG [ λcI857 (cro-bioA)
<> tet] (Lee EC 2001) (Greg A. Smith Northwestern University Chicago, USA)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Christian Sinzger,
Universitätsklinikum Ulm)
20 5 Material
5.3.4 Proteine und Peptide
gB
in CHO Zellen rekombinant exprimiertes Glykoprotein B des Virusstammes
Towne, die Furinspaltstelle und die Transmembrandomäne sind delitiert (Norais
et al., 1996) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Sanofi Pasteur, Marcy
L’Etoile, Frankreich)
AD-1
prokaryont exprimiertes Fusionsprotein, aufgebaut aus AD-1-Sequenz (AS 484650 HCMV gB) und dem Fusionspartner β-Galaktosidase (AS 1-375)
AD-2 (pep90)
synthetisches Peptid, AS-Sequenz: NETIYNTTLKYGDVVGV
AD-4
in E. coli rekombinant exprimiertes Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein, aufgebaut aus AD-4-Sequenz (AS 112-132 und AS 344-438 HCMV gB des
Virussstammes AD169, verknüpft durch einen synthetischen Linker Ile-Ala-GlySer-Gly) und dem Fusionspartner GST (N-Terminus); GST-Tag abspaltbar mit
PreScission Protease (Spaltstelle LEVLFQ/GP)
AD-4-Mutanten
in E. coli rekombinant exprimierte GST-Fusionsproteine, aufgebaut aus
mutierten AD-4-Sequenzen und dem Fusionspartner GST; GST-Tag abspaltbar
mit PreScission Protease; insgesamt 16 AD-4-Mutanten (K378, K379, IN397/98,
ED359/62, KK378/79, QE380/81, NS383/85, NT405/06, NQ409/10, QT410/11, YL364/76, YK364/79,
ES422/24, KQ435/36, YKK364/78/79, KKQE378-81)
5.4 Nukleinsäuren
5.4.1 Vektoren und Plasmide
Vektoren
pcDNA3
Expressionsvektor für die heterologe Expression von Proteinen unter der
Kontrolle eines CMV-Promotors in eukaryonten Zellen; enthält ein AmpicillinResistenzgen, eine „Multiple Cloning Site“ (MCS) und eine Polyadenylierungssequenz (Life Technologies GmbH)
pcUL132-sigHA
von pcDNA3 abgeleiteter Expressionsvektor, der zusätzlich die Nukleotidsequenz
für ORF UL132 von HCMV AD169 und für Hämagglutinin (HA) beinhaltet (Ködel,
2005)
pGEX-6-P1
Expressionsvektor
mit
einem
tac-Promotor
für
Isopropyl
β-D-1-
thiogalactopyranosid (IPTG)-induzierbare Expression von GST-Fusionsproteinen;
besitzt ein Ampicillin-Resistenzgen, lacI-Repressorgen und Nukleotidsequenz für
die Erkennungsstelle von PreScission Protease (Pharmacia Biotech)
pET31b(+)
Expressionsvektor mit lac-Operator und T7 Promotor für IPTG-induzierbare
Expression von His-Fusionsproteinen; besitzt ein Ampicillin-Resistenzgen, lacIRepressorgen und Nukleotidsequenz für eine ribosomale Bindungsstelle
(Novagen)
5 Material 21
pET24d(+)
Expressionsvektor mit lac-Operator und T7 Promotor für IPTG-induzierbare
Expression von His-Fusionsproteinen; besitzt ein Kanamycin-Resistenzgen, lacIRepressorgen und Nukleotidsequenz für eine ribosomale Bindungsstelle
(Novagen, Merck KGaA, Darmstadt)
Vorhandene Plasmide
pc58
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für ORF UL55 (gB) von HCMV AD169,
Vektor pcDNA3
pCMV71
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für pp71 von HCMV, Vektor pCMVI
(Liu & Stinski, 1992)
pEPkan-S
kodiert für das Kanamycinresistenzgen aphAI und für das FLAG Epitop, enthält
zusätzlich die Erkennungssequenz für I-SceI, Vektor pcDNA3 (Tischer et al., 2006)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Christian Sinzger,
Universitätsklinikum Ulm)
pcDNAgH
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für ORF UL75 (gH) von HCMV, Vektor
pcDNA3 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von W. J. Britt, University of
Alabama, School of Medicine, Birmingham)
pcDNA-gM
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für ORF UL100 (gM) von HCMV,
Vektor pcDNA3 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Dr. h. c.
Thomas Mettenleiter, Friedrich-Löffler-Institut, Greifswald-Insel Riems)
pRcCMV-gN
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für ORF UL73 (gN) von HCMV, Vektor
pRcCMV (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Dr. h. c. Thomas
Mettenleiter, Friedrich-Löffler-Institut, Greifswald-Insel Riems)
pgB 1-400
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 1-400 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcDNA3 (Tschesnych, 2009)
pgB 1-411
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 1-411 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcDNA3 (Tschesnych, 2009)
pgB 1-392
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 1-392 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcDNA3 (Tschesnych, 2009)
pgB 1-342
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 1-342 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcDNA3 (Tschesnych, 2009)
pgB 1-289
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 1-289 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcDNA3 (Tschesnych, 2009)
pgB 55-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 55-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB 100-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 100-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB 150-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 150-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
22 5 Material
pgB 199-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 199-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB 224-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 224-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB 244-448_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 244-448 von HCMV gB des
Stammes AD169, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB DomII_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG), Vektor
pcUL132-sigHA (Tschesnych, 2009)
pgB DomII-A_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 120 und 121, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-B_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 348 und 402, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-C_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 397 und 398, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-D_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 121 und 354, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-E_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 359 und 362, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-F_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 361 und 362, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-G_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378 und 379, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-H_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
5 Material 23
Mutationen an Positionen AS 380 und 381, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-I_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 383 und 385, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-J_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 393 und 394, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-K_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 401 und 402, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-L_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 405 und 406, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-M_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 409 und 410, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-N_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 410 und 411, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-O_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 415 und 417, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-P_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 435 und 436, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII-Q_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 437 und 438, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
24 5 Material
pgB DomII-425_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-425 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 120 und 121, Vektor pcUL132-sigHA (Tschesnych,
2009)
pgB DomII_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG) , Vektor
pGEX-6P-1 (Tschesnych, 2009)
Erzeugte Plasmide
pgB DomII-YL364/76_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364 und 376, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-ES422/24_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 422 und 424, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-LKK376/78/79_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 376, 378 und 379, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-YKK364/78/79_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364, 378 und 379, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-KKQ378-80_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378-380, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-KKE378/79/81_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378, 379 und 381, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-KQE378/80/81_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378, 380 und 381, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-KQE379-81_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 379-381, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-YLK364/76/78_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364, 376 und 378, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-YLK364/76/79_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364, 376 und 379, Vektor pcUL132-sigHA
5 Material 25
pgB DomII-KKQE378-81_HA
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378-381, Vektor pcUL132-sigHA
pgB DomII-ED359/62_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 359 und 362, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-KK378/79_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378 und 379, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-QE380/81_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 380 und 381, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-NS383/85_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 383 und 385, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-NT405/06_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 405 und 406, Vektor PGEX-6P-1
pgB DomII-YL364/76_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364 und 376, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII- ES422/24_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 422 und 424, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-K378_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Position AS 378, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-K379_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Position AS 379, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-YK364/79_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364 und 379, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-YKK364/78/79_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364, 378 und 379, Vektor pGEX-6P-1
pgB DomII-KKQE378-81_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378-381, Vektor pGEX-6P-1
26 5 Material
pgB DomIIT_GST
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-438 von
HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Nukleotidsequenz für Thrombinerkennung, Vektor pGEX-6P-1
pSM5-1Fab
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für leichte und schwere Kette von
SM5-1Fab, ompA, RBS-Spacer (Shine-Dalgarno-Sequenz), Serin-Threonin-Linker,
Thrombinerkennung, Vektor pET31b(+)
pET24SM5-1Fab
Expressionsplasmid mit Nukleotidsequenz für leichte und schwere Kette von
SM5-1Fab, ompA, RBS-Spacer (Shine-Dalgarno-Sequenz), Serin-Threonin-Linker,
Thrombinerkennung, Vektor pET24d(+)
0923819_gB_DomII_R_pMA enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344438 von HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 364 und 376, Vektor pMA (Life Technologies
GmbH, Regensburg)
0923820_gB_DomII_S_pMA enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344438 von HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 422 und 424, Vektor pMA (Life Technologies
GmbH, Regensburg)
1069555_DomII-K378_pMA
enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344438 von HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378, Vektor pMA (Life Technologies GmbH,
Regensburg)
1069556_DomII-K379_
enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344-
pMA-T
438 von HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Position AS 379, Vektor pMA-T (Life Technologies GmbH,
Regensburg)
1069557_DomII-K378-E381_ enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für AS 112-132 und AS 344pMA-T
438 von HCMV gB des Stammes AD169, verknüpft durch einen Linker (IAGSG),
Mutationen an Positionen AS 378-381, Vektor pMA-T (Life Technologies GmbH,
Regensburg)
0941179_SM5_1_FAB_
enthält synthetisch hergestellte Nukleotidsequenz für leichte und schwere Kette
pMK-RQ
von SM5-1Fab, ompA, RBS-Spacer (Shine-Dalgarno-Sequenz), Serin-ThreoninLinker (IAGSG), Thrombinerkennungssequenz, Vektor pMK-RQ (Life Technologies
GmbH, Regensburg)
5.4.2 Oligonukleotide
Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma biomers.net GmbH (Ulm)
synthetisiert (www.biomers.net). Die Sequenzen sind jeweils in 5’ → 3’ Richtung angegeben
und das Symbol ℗ gibt an, dass das Oligonuktleotid am 5‘-Ende phosphoryliert ist.
5 Material 27
Erkennungssequenzen
von
Restriktionsenzymen
sind
unterstrichen,
eingeführte
Mutationenssequenzen sind fett/kursiv dargestellt. Auf die Verwendung wird verwiesen.
gBDomII-Eco5
gattgaattcaccagcatgaagcccatc
AD-4-Mutanten
gBDomII-Not3
agctgcggccgctcaggacttctgcttgatg
AD-4-Mutanten
DomIIA-Xba3
atcttctagattatcaggac
AD-4-Mutanten
pcDNA3 forw2
ctatataagcagagctc
Sequenzierung
pcDNA3 rev2
gagtggcaccttccagg
Sequenzierung
pGEX-forw
tacttgaaatccagcaag
Sequenzierung
pGEX-rev
gccctgacgggcttgtc
Sequenzierung
DomIIG/R1℗
caagatgaccgccaccttcgcaagcgctgcacaggaagtg
AD-4-Mutanten
DomIIG/R2℗
gcgaggccgaggacagcgctcacttcagcagcgccaag
AD-4-Mutanten
DomIIR/G1℗
gaccgccaccttcgccagcgctaaacaagaggtgaacatg
AD-4-Mutanten
DomIIR/G2℗
gccaccttcgccagcaaggcccaagaggtgaacatgagc
AD-4-Mutanten
DomIIG/H1℗
caccttcctgagcgctgcagccgaagtgaacatgagcgac
AD-4-Mutanten
DomIIG/H2℗
cttcctgagcgctgcacaggccgtgaacatgagcgacagc
AD-4-Mutanten
DomIIH/G1℗
gaccgccaccttcctgagcgctaaagccgctgtgaacatg
AD-4-Mutanten
DomIIH/G2℗
gccaccttcctgagcaaggcagccgctgtgaacatgagc
AD-4-Mutanten
5-pET31b
tgctcagcggtggcag
Sequenzierung
5-SM51Fab_628bp
tacgcaggctgctcag
Sequenzierung
5-SM51Fab_1142bp
cggactgctatctgc
Sequenzierung
5-SM51Fab_531bp
gcatccagacgattat
Sequenzierung
5-SM51Fab_865bp
gctctgaaccagct
Sequenzierung
5-SM51Fab-Xho
atctctcgaggctaccacgcgg
SM5-1Fab
3-SM51Fab-BamH
tcgaggatccatgaaaaaaaccgcaattg
SM5-1Fab
DomII-Thrombin-Eco5
gattgaattcctggttccgcgtggtagcaccagcatgaagcccatc
AD-4
gB-MutGH_for
cgtacgcagtccagcgcagagtcggacatgttcacagcggctgca
Virusmutanten
gcagataagaaagtggcggtcaaggatgacgacgataagtaggg
gB-MutGH_rev
cacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcttatctgctgcagcc
Virusmutanten
gctgtgaacatgtccgaccaaccaattaaccaattctgattag
gB-MutG_for
cgtacgcagtccagcgcagagtcggacatgttcacctcttgtgcag
Virusmutanten
cagataagaaagtggcggtcaaggatgacgacgataagtaggg
gB-MutG_rev
cacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcttatctgctgcacaa
Virusmutanten
gaggtgaacatgtccgaccaaccaattaaccaattctgattag
gB-MutH_for
cgtacgcagtccagcgcagagtcggacatgttcacagcggccttct
Virusmutanten
tagataagaaagtggcggtcaaggatgacgacgataagtaggg
gB-MutH_rev
cacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcttatctaagaaggcc
gctgtgaacatgtccgaccaaccaattaaccaattctgattag
Virusmutanten
28 5 Material
gBMut K378_for
cgtacgcagtccagcgcagagtcggacatgttcacctcttgcttagc
Virusmutanten
agataagaaagtggcggtcaggatgacgacgataagtaggg
gBMut K378_rev
cacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcttatctgctaagcaag
Virusmutanten
aggctgaacatgtccgacaaccaattaaccaattctgattag
gBMut K379_for
cgtacgcagtccagcgcagagtcggacatgttcacctcttgtgcctta
Virusmutanten
gataagaaagtggcggt aggatgacgacgataagtaggg
gBMut K379_rev
cacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcttatctaaggcacaag
Virusmutanten
aggtgaacatgtccgaccaaccaattaaccaattctgattag
gBMutGR2_for
agaaagtggcggtcattttggcagaagaaaagtgagccgagtcctcg
Virusmutanten
gcttcggaacaggatgacgacgataagtaggg
gBMut GR2_rev
agcctcggaacgcaccattcgttccgaagccgaggactcggctcactt
Virusmutanten
ttcttctgcccaaccaattaaccaattctgattag
gBMut L376_for
cgcagagtcggacatgttcacctcttgcttcttagatgcgaaagtggc
Virusmutanten
ggtcattttggcaggatgacgacgataagtaggg
gBMut L376_rev
gactcggctcacttttcttctgccaaaatgaccgccactttcgcatcta
Virusmutanten
agaagcaagagcaaccaattaaccaattctgattag
gB-MutGR2H_rev
agcctcggaacgcaccattcgttccgaagccgaggactcggctcactt
Virusmutanten
ttcttctgcccaaccaattaaccaattctgattag
gBMut GR2_for2
agaaagtggcggtcattttg
Virusmutanten
gBMut L376_for2
cgcagagtcggacatgttcac
Virusmutanten
gB-MutGH_G_H for
cgtacgcagtccagcgcagag
Virusmutanten
Universal KAN rev
caaccaattaaccaattctga
Virusmutanten
Seq_gBMutGH
gagttctaccagagat
Sequenzierung
TB40_115814-5
gtagaccagattgtgca
Sequenzierung
TB40_116534-3
ctatcgtgagacctgt
Sequenzierung
5.5 Enzyme
Benzonase Nuclease
Merck KGaA, Darmstadt
EcoRI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
DpnI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
PLUS
Expand HiFi
Enzyme Blend
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Ligase
Life Technologies, Darmstadt
Lysozym
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
NdeI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
NotI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
Pfu Polymerase
Stratagene Corporation, USA
PNGase F
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
PreScission Protease
GE Healthcare GmbH, München
5 Material 29
Proteinase K
Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
“Shrimps Alkaline Phosphotase” (SAP)
USB Co., USA
DreamTaq Polymerase
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
XbaI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
XhoI
New England Biolabs GmBH, Frankfurt am Main
5.6 Antikörper
5.6.1 Primäre Antikörper
87-55/60
Maus-IgG, Spezifität: β-Galaktosidase (Behringwerke AG, Marburg); im ELISA
1:5000 eingesetzt
anti-GST
Maus-IgG, Klon: vpg66, Spezifität: GST (BIOZOL Diagnostika Vertrieb GmbH,
Eching); im ELISA 1:250 eingesetzt
anti-Hämagglutinin (HA)
Maus-IgG, Klon: HA-7, Spezifität: HA (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim);
in indirekter Immunfluoreszenz (IF) und Western Blot 1:1000 eingesetzt
anti-6-His
Maus-IgG, Klon: 13/45/31, Spezifität: 6-Histidin (Dianova GmbH, Hamburg); im
Western Blot 1:500 eingesetzt
anti-Fab
Maus-IgG, Klon: GG-6, Spezifität: human IgG, Fab-Fragment (Sigma Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim)
14-16A
Maus-IgM, Spezifität: glykosyliertes gN von HCMV (Britt & Auger, 1985)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von W. J. Britt, University of Alabama,
School of Medicine, Birmingham)
p63-27
Maus-IgG, Spezifität: IE-1 von HCMV (Andreoni et al., 1989) (freundlicherweise
zur Verfügung gestellt von W. J. Britt, University of Alabama, School of Medicine,
Birmingham)
AP86-SA4
Maus-IgG, Spezifität: gH von HCMV (Urban et al., 1992)
89-104
Human-IgG, Spezifität: AD-1 von HCMV gB (Sandoz Pharmaceuticals GmbH,
Holzkirchen); im ELISA 1:50 eingesetzt
89-109/MSL-109
Human-IgG, Spezifität: gH von HCMV (Sandoz Pharmaceuticals GmbH,
Holzkirchen)
27-287
Maus-IgG, Spezifität: AD-1 von HCMV gB (Britt, 1984; Utz et al., 1989)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von W. J. Britt, University of Alabama,
School of Medicine, Birmingham); im Western Blot als purer Zellkulturüberstand
eingesetzt
C23
Human-IgG, Spezifität: AD-2 von HCMV gB (Masuho et al., 1987)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Fa. TEIJIN LTD, Japan); in IF 1:500
und im ELISA 1:100 eingesetzt
SM1-6
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
30 5 Material
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
SM3-1
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
SM4-5/SM4-10
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
SM5-1
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
SM6-5
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
SM11-17
Human-IgG,
Spezifität:
AD-4
von
HCMV
gB
(Pötzsch
et
al.,
2011)
(freundlicherweise zur Verfügung gestellt von 4-Antibody AG, Jena); mit einer
Konzentration von 1 µg/ml bzw. 0,5 µg/ml in IF, Western Blot und ELISA
eingesetzt
poly AD-4
Human-IgG, Spezifität: AD-4 von HCMV gB; mit einer Konzentration von 1µg/ml
bzw. 0.5 µg/ml im ELISA eingesetzt
poly YKK364/78/79
Human IgG, Spezifität YKK364/78/79 von HCMV gB; mit einer Konzentration von
1µg/ml bzw. 0.5 µg/ml im ELISA eingesetzt
Hyperimmunseren
Hyperimmunseren (6020298, 6030398) hergestellt und freundlicherweise zur
Verfügung gestellt von HUMAN Serum Production and Medicine Manufacturing
Co. Ltd., Gödöllő, Ungarn, Prof. Zsolt Nagy
5.6.2 Sekundäre Antikörper
Enzym- und Fluorenszenzfarbstoffkonjugierte Sekundärantikörper wurden von den Firmen
DAKO Deutschland GmbH (Hamburg), Dianova GmbH (Hamburg) und Sigma Aldrich Chemie
GmbH (Steinheim) bezogen. Es wurden jeweils die vom Hersteller empfohlenen
Verdünnungen benutzt.
6 Methoden 31
6 Methoden
6.1 Zellkulturverfahren
6.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen
Die Kultivierung von Zellen erfolgte in Zellkulturflaschen bei 37°C, 5% CO2 und 80%
Luftfeuchtigkeit. Zellen wurden in ihrem jeweiligen Medium gehalten. Bei Erreichen der
Konfluenz wurden adhärent wachsende Zellen mit 0,05% Trypsin/EDTA (Life Technologies
GmbH) abgelöst; mit Ausnahme von Hybridomzellen, diese wurden durch Abspülen oder mit
einem Zellschaber vom Zellkulturflaschenboden entfernt. Durch Zentrifugation wurden die
Zellen pelletiert und auf neue Zellkulturflaschen verteilt. Für die Kultivierung von HUVEC
Zellen wurde der Zellkulturflaschenboden 15 min bei 37°C mit 0,1% Gelatine beschichtet.
6.1.2 Transiente Transfektion von eukaryonten Zellen
Cos7 Zellen wurden mittels Lipofectamine 2000 (Life Technologies GmbH) transient
transfiziert. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in der angegebenen Zelldichte
ausgesät (Tabelle 6-1). Im 24-Well-Format wuchsen die Zellen auf Deckgläschen (A.
Hartenstein Gesellschaft für Labor- und Medizintechnik mbH, Würzburg). Mix I und Mix II
(Tabelle 6-1) wurden gemischt und für 20 min bei RT inkubiert, um die Bildung des DNALiposom-Komplexes zu ermöglichen. Die Zellen wurden einmal mit PBSo gewaschen und das
Transfektionsmedium (DMEM + 350 mg Glutamin) wurde, in einem Volumen von 650 µl
bzw. 150 µl, auf die Zellen gegeben. Der DNA-Liposom-Komplex wurde auf die Zellen
pipettiert und es erfolgte eine 5-stündige Inkubation bei 37°C. Der DNA-Liposom-Komplex
wurde abgezogen und es folgte eine Inkubation in DMEM (+ 350 mg Glutamin, 10% FKS) bis
zum nächsten Tag bei 37°, dann wurde dieses durch das Vollmedium ersetzt. 48 h nach
Transfektion wurden die Zellen für die Analysen verwendet.
6-Well (Angaben pro Well)
Zelldichte
Mix I
Mix II (5 min Inkubation)
5
24-Well (Angaben pro Well)
4
3,5x10 Zellen
5x10 Zellen
4 µg Plasmid-DNA
0,8 µg Plasmid-DNA
250 µl Transfektionsmedium
50 µl Transfektionsmedium
10 µl Lipofectamine 2000
1 µl Lipofectamine 2000
250 µl Transfektionsmedium
50 µl Transfektionsmedium
Tab. 6-1. Ansatz zur transienten Transfektion von eukaryonten Zellen.
32 6 Methoden
6.1.3 Virusrekonstitution
Die Virusrekonstitution erfolgte durch Transfektion von BAC-DNAs in MRC5 Zellen. Als
Transfektionsreagenz wurde FuGENE HD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) verwendet.
48 h vor Transfektion wurden 2,3x105 Zellen pro Well ausgesät (6-Well-Platten). 30 min vor
Transfektion wurde das Vollmedium durch das Transfektionsmedium (DMEM + 350 mg
Glutamin) ersetzt. Folgender Transfektionsansatz in einem Volumen von 100 µl wurde 30
min bei RT inkubiert: 2-5 µg BAC-DNA, 10 µl FuGENE HD, 1 µg pp71 Plasmid-DNA.
Anschließend wurden 200 µl Vollmedium zu dem Ansatz gegeben und gemischt. Direkt vor
Transfektion wurde das Medium auf den Zellen durch 1 ml Vollmedium ersetzt und der
Transfektionsansatz auf die Zellen geben. Nach Inkubation für 4 h bei 37°C wurde der
Transfektionsansatz abgezogen, die Zellen zweimal mit PBSo gewaschen und das
Vollmedium zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit einem
frischen Medium versorgt und an jedem zweiten Tag, bis die Zellen umgesetzt wurden. Nach
sieben Tagen erfolgte die Umsetzung der Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen. Bildung und
Ausbreitung des zytopathischen Effekts wurde optisch beobachtet.
6.2 Virologische Methoden
6.2.1 Viruspropagierung in Zellkultur
Viruspropagierung erfolgte in MRC5 oder HFF Zellen. Zellkulturüberstände aus vollständig
infiziertem Zellrasen wurden geerntet und zur Entfernung von Zelltrümmern 15 min bei 1200
rpm zentrifugiert. Bis zur Verwendung wurden die Virusüberstände bei -80°C gelagert.
6.2.2 Virustitration
Die Bestimmung des Virustiters in Virusüberständen geschah über Nachweis der IE-1Expression in infizierten Zellen. In 96-Well-Platten wurden pro Well 1,2x104 Zellen (MRC5
oder
HFF)
ausgesät
und
am
nächsten
Tag
mit
jeweils
100
µl
einer
1:10
Virusverdünnungsreihe in Triplikaten infiziert. Das Inokulum wurde 4 h nach Infektion
abgezogen und die Zellen mit 100 µl frischem Medium versorgt. 24 h nach Infektion wurde
das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit PBSo gewaschen. Danach folgte eine
15-minütige Permeabilisierung und Fixierung mit 100 µl kaltem Ethanol (-20°C). Nach
dreimaligem Waschen mit PBSo schloss sich eine 1,5-stündige Inkubation bei 37°C mit dem
murinen monoklonalen Antikörper (mu-mAb) p63-27 an, der spezifisch gegen IE-1 gerichtet
6 Methoden 33
ist. Die Zellen wurden dreimal mit PBSo gewaschen und mit dem Cy3-konjugiertem antiMaus IgG+IgM Antikörper (Dianova GmbH, Hamburg) für 1h bei 37°C inkubiert. Nach dem
letzten Waschschritt wurden die Platten getrocknet und die Anzahl der infizierten Zellen am
inversen Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena)
bestimmt. Der Virustiter wurde daraus rechnerisch ermittelt und in der Einheit IU (infectious
units) pro ml angegeben.
6.2.3 Bestimmung der Replikationskapazität von Viren
Zur Bestimmung der Replikationskapazität von Viren wurden HFF Zellen in einer Dichte von
3x104 Zellen im 24-Well-Format ausgesät. Zur Bestimmung der Infektionsrate 1 Tag nach
Infektion enthielt eine der 24-Well-Platten Deckgläschen (A. Hartenstein Gesellschaft für
Labor- und Medizintechnik mbH, Würzburg). Am folgenden Tag wurden HFF Zellen mit einer
moi („multiplicity of infection“) von 0,4 bis 0,6 in einem Volumen von 500 µl infiziert und
nach 4-stündiger Inkubation wurde das Inokulum entfernt, die Zellen zweimal mit PBSo
gewaschen und mit jeweils 1 ml frischem Medium versorgt. Zellkulturüberstände wurden 1,
4, 7, 11 und 13 Tage nach Infektion geerntet und bei RT bis zur Verwendung aufbewahrt. Ein
Tag nach Infektion wurde die Infektionsrate über indirekte Immunfluoreszenz gegen IE-1
bestimmt. Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz ist in Abschnitt 6.5.4. beschrieben.
Virustiter der Zellkulturüberstände wurden, wie in Abschnitt 6.2.2. beschrieben, ermittelt.
6.2.4 „Cell-Cell-Spread“-Test
Die Fähigkeit von Antikörpern die Ausbreitung der Viren von Zelle zu Zelle zu hemmen wurde
in einem „Cell-Cell-Spread“-Test untersucht. Als Zielzellen wurden 6x104 HFF Zellen pro Well
oder 5x104 ARPE19 Zellen pro Well auf Deckgläschen in 24-Well-Platten ausgesät. Die
Infektion von HFF Zellen erfolgte mit einer moi von 0,002 und ARPE19 Zelle wurden mit einer
moi von 0,5 infiziert. Das Inokulum wurde 4 h später entfernt, die Zellen gewaschen und mit
1 ml des frischen Mediums versorgt. Nach 24 h wurde die Infektion mittels indirekter
Immunfluoreszenz gegen IE-1, die im Abschnitt 6.5.4. beschrieben ist, überprüft und
Antikörper zu den infizierten Zellen gegeben. In die Analyse wurden C23, SM5-1, SM6-5,
HCMV Hyperimmunseren (HCMV HIS) und affinitätsgereinigte Seren mit AD-4-Spezifität
(poly AD-4) eingeschlossen. Die Antikörper wurden in folgenden Konzentrationen eingesetzt:
HCMV HIS mit 1 mg/ml, hu-mAbs und poly AD-4 mit 5 µg/ml. Die Plaquegröße wurde in
34 6 Methoden
Fibroblasten 120 h und in Epithelzellen 216 h nach der Infektion über indirekte
Immunfluoreszenz gegen IE-1, siehe Abschnitt 6.5.4., ermittelt.
6.2.5 Luciferase-basierter in vitro Neutralisationstest
Ein Luciferase-basierter Reporterassay wurde angewandt, um die Neutralisationsaktivität
von humanen Seren, poly AD-4 und hu-mAbs zu bestimmen. Nach der Infektion mit dem
rekombinanten AD169 Virus HB15-UL84prluc erfolgte die Expression der Luciferase unter
der Kontrolle eines Early-1-Promotors (Prof. Dr. Thomas Stamminger, Universitätsklinikum
Erlangen). Am Tag vor der Infektion wurden pro Well 1x104 HFF Zellen in 96-Well-Platte
ausplattiert. Seriellen Serum- oder Antikörper-Verdünnung wurden mit Virusüberstand in
einer 96-Well-Rundbodenplatten für eine 1 h bei 37°C vorinkubiert. Der Antikörper-VirusMix wurde zu den ausplattierten Zellen gegeben und 4 h bei 37°C inkubiert. Inkubationen
nur mit Virus oder nur mit Medium dienten als Referenzen. Das Inokulum wurde entfernt,
die Zellen gewaschen und mit frischem Medium versorgt. Nach einer Inkubation für weitere
42 h bei 37°C wurden die Platten 10 min bei 1200 rpm zentrifugiert, das Medium abgezogen
und die Zellen mit 100 µl Glo Lysis Puffer (Promega Co., USA) lysiert. In weißen 96-Well LIAPlatten wurden 50 µl LAP vorgelegt und 30 µl der lysierten Zellen zugegeben. Am
Luminometer (Eurofins MWG Operon, Ebersberg) wurden 50 µl LS pro Well injiziert und die
Chemilumineszenz in relative light units (RLU) detektiert. Ohne die Zugabe von Antikörpern
lagen die RLU-Werte bei ca. 20000. Die %-Neutralisation wurde mittels der RLU-Werte über
folgende Formel ermittelt: %-Neutralisation = [(1-(RLU-Werte mit Antikörper/RLU-Werte
ohne Antikörper)] x 100.
6.2.6 In vitro Neutralisationstest basierend auf Immediate Early-1 (IE-1)-Expression
Der Neutralisationstest, basierend auf IE-1-Expression, wurde mit dem klinischen Isolat
TB40E und den rekombinanten TB40E Virusmutanten in Fibroblasten, Endothel- und
Epithelzellen durchgeführt. Die Infektion von Endothel- und Epithelzellen mit dem
Laborstamm AD169 ist nicht möglich. TB40E ist ein endothel- und epithelzelltropher HCMVStamm, für den es keinen Luciferase-basierten Reporterassay gab. HFF (1x104 Zellen pro
Well), ARPE19 (1,2x104 Zellen pro Well) und HUVEC (1,5x104 Zellen pro Well) Zellen wurden
am Tag vor der Infektion in 96-Well-Platten ausplattiert. Platten für HUVEC Zellen wurden
vorab mit 0,1%iger Gelatine für 15 min bei 37°C beschichtet. Serielle Verdünnungen der
6 Methoden 35
Antikörper wurden in einer 96-Well-Rundbodenplatte bei 37°C für 1h vorinkubiert und
anschließend wurden die Zellen mit dem Antikörper-Virus-Gemisch infiziert. Die Infektion
von HUVEC Zellen erfolgte in einem heparinfreien Medium (EBM-2 ohne Zugabe von EGM2MV-Kit), mit dem auch die Zellen eine Stunde vor der Infektion inkubiert wurden. 24 h nach
Infektion wurden infizierte Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz gegen IE-1
nachgewiesen. Es wurde verfahren wie in Abschnitt 6.2.2. beschrieben. Die Anzahl der
infizierten Zellen ohne Zugabe von Antikörpern lag bei 60-100 Zellen pro Blickfeld. Die %Neutralisation wurde über folgende Formel rechnerisch ermittelt: %-Neutralisation =
[(1-(Anzahl infizierter Zellen mit Antikörper/Anzahl infizierter Zellen ohne Antikörper)] x 100.
6.3 Molekularbiologische Methoden
6.3.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zur selektiven Amplifikation von DNA wurde eine PCR (Saiki et al., 1985), unter Verwendung
unterschiedlicher thermostabiler DNA-Polymerasen, durchgeführt. Folgende Kits wurden zur
Durchführung einer PCR verwendet: Pfu Turbo DNA Polymerase Kit (Stratagene Co., USA),
Expand High FidelityPLUS PCR System Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) und
DreamTaq DNA Polymerase Kit (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). Das Reaktionsvolumen
betrug 50 µl und es wurde stets eine Probe ohne DNA als Kontrolle für Kontaminationen
mitgeführt. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (Eppendorf AG, Hamburg) unter
folgenden Bedingungen durchgeführt:
PLUS
Pfu Turbo DNA Polymerase Kit
Expand High Fidelity
1xPfu buffer (25 mM MgSO4)
1xExpand HiFi
250 μM dNTPs
200 μM dNTPs
200 μM dNTPs
25 pmol je Primer
20 pmol je Primer
20 pmol je Primer
50 ng DNA-Matrize
50 ng DNA-Matrize
50 ng DNA-Matrize
PLUS
PCR System DreamTaq DNA
reaction buffer
PLUS
2,5 U Pfu Turbo DNA Polymerase
2,5 U Expand HiFi
PCR Bedingungen
PCR Bedingungen
Enzyme Blend
1xDreamTaq buffer
1,25 U DreamTaq DNA Polymerase
PCR Bedingungen
Denaturierung bei 95°C für 5 min
Denaturierung bei 95°C für 5 min
Denaturierung bei 95°C für 5 min
30 Zyklen:
30 Zyklen:
30 Zyklen:
Denaturierung bei 95°C für 30 sek
Denaturierung bei 95°C für 30 sek
Denaturierung bei 95°C für 30 sek
Hybridisierung bei 45°C für 30 sek
Hybridisierung bei 45°C für 1 min
Hybridisierung bei 45°C für 1 min
Elongation bei 72°C für 2 min
Elongation bei 72°C für 2 min
Elongation bei 72°C für 2 min
Elongation bei 72°C für 10 min
Elongation bei 72°C für 5 min
Tab. 6-2. PCR-Ansätze und -Bedingungen.
Elongation bei 72°C für 5 min
36 6 Methoden
Zur Analyse der PCR-Produkte wurde eine DNA-Gelelektrophorese durchgeführt. Die
Reinigung der Amplifikate, die anschließend für die Klonierung von Expressionsplasmiden
verwendet wurden, erfolgte über QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach
Anleitung des
Herstellers. Gereinigte
PCR-Fragmente
wurden
für
die
weiteren
Klonierungsschritte verwendet.
6.3.2 „Combined Chain Reaction“ (CCR)
Zur Einführung definierter Mutationen in die DNA-Sequenz, die für ein rekombinantes
Protein codiert, wurde eine CCR durchgeführt. Bei dieser Methode werden zwei Reaktionen
kombiniert; die der thermostabilen DNA-Polymerase und der thermostabilen DNA-Ligase
(Bi & Stambrook, 1998). Für die Reaktion wurden drei Primer eingesetzt, dabei ist der
Mutageneseprimer am 5‘-Ende phosphoryliert. Die Reaktion wurde in einem Volmen von
20 µl und in einem Thermocycler (Eppendorf AG, Hamburg) durchgeführt. CCR-Puffer und
Ampligase wurden von der Firma Biozym Scientific GmbH (Hessisch Oldendorf) bezogen.
Expand High Fidelity
PLUS
PCR System
1xAmpligase Puffer
200 μM dNTPs
20 ng je Primer
25 ng Mutageneseprimer
20 ng DNA-Matrize
PLUS
1,5 U Expand HiFi
Enzyme Blend
3 U Ampligase
1xBSA (0,4 mg/ml)
PCR Bedingungen
Denaturierung bei 96°C für 2 min
30 Zyklen:
Denaturierung bei 96°C für 30 sek
Hybridisierung bei 55°C für 30 sek
Elongation/Ligation bei 72°C für 4 min
Elongation/Ligation bei 72°C für 7 min
Tab. 6-3. CCR-Ansatz und -Bedingung.
Zur Analyse der CCR-Produkte wurde eine DNA-Gelelektrophorese durchgeführt. 1 µl des
CCR-Produktes wurde anschließend für eine PCR mit dem Pfu Turbo DNA Polymerase Kit
(Stratagene Co., USA) eingesetzt. Die Reinigung der Amplifikate erfolgte über QIAquick PCR
6 Methoden 37
Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) nach Anleitung des Herstellers. Die DNA-Matrize
wurde über einen Restriktionsenzymverdau mit DpnI verdaut. Anschließend wurde das PCRProdukt nochmals über QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden) gereinigt.
Gereinigte PCR-Fragmente wurden für die weiteren Klonierungsschritte verwendet.
6.3.3 DNA-Gelelektrophorese
Separation von DNA-Fragmenten erfolgte über eine horizontale Gelelektrophorese unter
Verwendung 1%iger Agarosegele, die 1 µg/ml Ethidiumbromid enthielten. Als Laufpuffer
wurde 1xTBE eingesetzt. 0,6%ige Gele wurden zur Analyse von BAC-DNAs verwendet.
Proben wurden mit 6xDNA-Ladepuffer gemischt und auf das Gel aufgetragen. GeneRuler
DNA Ladder Mix diente als Größenstandard. DNA wurde durch ultraviolettes Licht (254 nm)
sichtbar gemacht (Gel documentation EasyWin 32, Herolab GmbH, Wiesloch).
6.3.4 Restriktionsenzymverdau von DNA
Präparativer Restriktionsenzymverdau wurde bei der Klonierung von Expressionsplasmiden
angewandt, während der analytische Restriktionsenzymverdau als Kontrolle der generierten
DNA-Plasmide diente.
Präparativer Restriktionsenzymverdau
Restriktionsverdau wurde in einem Volumen von 70 µl oder 100 µl durchgeführt. 3-5 µg
Vektor-DNA oder das PCR-Produkt wurden mit je 10 U Endonukleaseenzym pro µg DNA
verdaut. Um das beste Resultat zu erhalten, wurden enzymspezifische Puffer und BSA für
den Verdau verwendet, die von New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main) mit den
Restriktionsenzymen geliefert wurden. Restriktionsverdau-Ansätze wurden 2-3 h bei 37°C
inkubiert. Fortschritt des Restriktionsenzymverdaus wurde über Agarosegelelektrophorese
kontrolliert. Verdau wurde durch Inkubation für 20 min bei 65°C gestoppt, gefolgt von einer
Inkubation auf Eis. Vektor-DNA wurde nach dem Verdau dephosphoryliert, um
Rückligationsreaktionen zu vermeiden. Dazu wurde 1 U von SAP zum Restriktionsverdau
gegeben und dieser 30 min bei 37°C inkubiert. SAP wurde auf die gleiche Art und Weise wie
die Restriktionsenzyme deaktiviert.
38 6 Methoden
Analytischer Restriktionsenzymverdau
Der Restriktionsenzymverdau wurde in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Idealerweise
wurden 1-2 µg Plasmid-DNA in 1xT4-Puffer mit 2-3 U je Restriktionsenzym verdaut.
Restriktionsverdau-Ansätze wurden 1-1,5 h bei 37°C inkubiert und der Verdau wurde mittels
DNA-Gelelektrophorese analysiert.
6.3.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel
Nach dem Verdau mit Endonukleaseenzymen wurden 70 µl des Ansatzes auf ein
präparatives
Agarosegel
(drei
Spuren
vereinigt)
aufgetragen
und
eine
DNA-
Gelelektrophorese durchgeführt. Das gewünschte DNA-Fragment wurde mit dem Dark
Reader Transilluminator DR88M (Clare Chemicals Research, USA) sichtbar gemacht und mit
einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde aus dem Gel mit dem
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden), nach Anleitung des Herstellers, isoliert.
6.3.6 Ligation von DNA
Für die Ligation wurde die DNA-Menge am 1%igen Agarosegel abgeschätzt und im molaren
Verhältnis von 1:5, Vektor- zu Insert-DNA, eingesetzt. Die enzymatische Reaktion erfolgte in
einem Gesamtvolumen von 20 µl über Nacht bei 14°C. Der Ligationsansatz enthielt 4 µl
5xLigase buffer (Life Technologies GmbH, Darmstadt), 2 µl 100 mM DTT, 1 µl 10 mM ATP und
1 µl Ligase. Als Kontrolle für Rückligationsreaktionen wurde ein Ansatz ohne Insert-DNA
mitgeführt.
6.3.7 Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Zur Herstellung elektrokompetenter Bakterien wurde LB-Medium (+/- Antibiotikum) mit
einer Übernachtkultur in einer 1:50-Verdünnung angeimpft und die Flüssigkultur bei 37°C
bzw. 32°C (GS1783) bis zu einer OD600 ~0,3-0,5 inkubiert. Die Expression der Rekombinase in
GS1783 Bakterien wurde durch eine 15-minütige Inkubation bei 42°C induziert. Die Kulturen
wurden in eiskalte Kolben überführt und 10 min im Eiswasser geschwenkt. Die Bakterien
wurden durch Zentrifugation bei 4000 rpm, 4°C für 10 min geerntet. Das Pellet wurde mit
10 ml + 40 ml eiskaltem H2O gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt und
die Bakterienzellen jeweils bei 5000 rpm, 4°C für 15 min pelletiert. Die kompetenten
Bakterienzellen wurden direkt für die Transformation über Elektroporation eingesetzt.
6 Methoden 39
6.3.8 Transformation von E. coli
Für die Vermehrung von Plasmid-DNA oder für die bakterielle Expression eines gewünschten
Genes wurde die DNA in Bakterienzellen über Elektroporation oder die „Hitzeschock“Methode transferiert.
Transformation von elektrokompetenten Bakterien (DH10B, Tuner (DE3), BL21 und GS1783)
Die Transformation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 26 µl oder 27 µl am Gene Pulser
(Bio-Rad Laboratories GmbH, München). In eiskalten Elektroporationsküvetten wurde ein
Mix aus 10 ng DNA oder 2 µl Ligationsansatz oder 10 µl PCR-Produkt, 10 µl DH10B bzw.
100 µl Tuner (DE3) oder BL21 oder GS1783 und 15 µl eiskaltes H2O vorgelegt. Die
Elektroporation erfolgte bei 2 kV, 200 Ω und 25 µF. Nach Zugabe von 900 µl SOC-Medium
wurden die bakteriellen Zellen 1-2 h bei 37°C bzw. 32°C (GS1783) unter Schütteln inkubiert.
In zwei Verdünnungen wurden die transformierten Bakterienzellen auf LB-Agar-Platten mit
Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert, um auf Bakterien zu
selektionieren, die das Resistenzgen enthalten. Bakterienkolonien wurden gezählt und
mittels Kolonie-PCR (DreamTaq DNA Polymerase Kit) auf das Tragen der gewünschten DNA
kontrolliert.
Transformation von chemischkompetenten Bakterien (BL21 Star (DE3))
Zu 50 µl chemischkompetenten Bakterien wurde 1 µl Plasmid-DNA gegeben und es folgte
eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Anschließend wurden die Bakterienzellen dem
sogenannten „Hitzeschock“ ausgesetzt, dabei wurden sie 45 sek bei 42°C im Heizblock
inkubiert. Nach Inkubation auf Eis für 2 min folgte die Zugabe von 300 µl SOC-Medium und
eine Inkubation für 1 h bei 37 °C unter Schütteln. Die transformierten Bakterienzellen
wurden in zwei Verdünnungen auf LB-Agar-Platten mit Antibiotikum ausplattiert und über
Nacht bei 37°C auf die plasmidtragenden Bakterien selektioniert. Bakterienkolonien wurden
gezählt und mittels Kolonie-PCR (DreamTaq DNA Polymerase Kit) auf das Tragen der
gewünschten Plasmid-DNA kontrolliert.
6.3.9 Isolierung von Plasmid-DNA
Abhängig von gewünschter DNA-Menge wurde entweder PureLink Quick Mini-, Midi- oder
Maxiprep Kit (Life Technologies GmbH, Darmstadt) für die Isolierung von Plasmid-DNA
verwendet. Die Übernachtkulturen der Bakterienzellen wurden über Zentrifugation bei
40 6 Methoden
5000-6000 rpm für 15 min geerntet. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte nach Anleitung
des Herstellers. Die gewonnene Plasmid-DNA wurde nach Restriktionsenzymverdau über
DNA-Gelelektrophorese analysiert.
6.3.10 Isolierung von BAC-DNA
Für analytische Zwecke wurde die BAC-DNA aus 5 ml Bakterienkultur isoliert, die über Nacht
bei 32°C inkubiert wurde. Die Isolierung wurde unter Verwendung von Puffern aus dem
QIAGEN Plasmid Mega Kit (Qiagen GmbH, Hilden) durchgeführt. Zunächst wurden die
Bakterienzellen bei 3500 rpm, 4°C für 10 min zentrifugiert und das Pellet in 300 µl P1-Puffer
resuspendiert. Für die Lyse der Bakterienzellen erfolgte die Zugabe von 300 µl P2-Puffer und
es folgte eine Inkubation für 5 min bei RT. Anschließend wurden 300 µl P3-Puffer zugegeben
und es erfolgte eine Inkubation auf Eis für 5 min. Eine Zentrifugation bei 14000 rpm für 10
min schloss sich an, der Überstand wurde vorsichtig entfernt und die DNA wurde durch
Zugabe von 600 µl 2-Propanol und Zentrifugation bei 14000 rpm für 15 min aus dem
Überstand gefällt. Das Pellet wurde mit 500 µl 70%igen Ethanol gewaschen. Nach
Zentrifugation bei 14000 rpm für 10 min wurde das Pellet 10 min an der Luft getrocknet und
in 50 µl H2O aufgelöst, ohne zu resuspendieren.
Die Virusrekonstitution erfolgte nach Transfektion der BAC-DNA in MRC5 Zellen. BAC-DNA
wurde mit dem NucleoBond BAC 100-Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren)
gewonnen.
Zur Analyse der BAC-DNA erfolgte ein Restriktionsenzymverdau mit HindIII. Der Verdau
wurde in einem Volumen von 50 µl durchgeführt. Der Ansatz enthielt 1 µg BAC-DNA und 20
U HindIII in 1xT4-Puffer. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37°C wurde das entstandene
Bandenmuster mittels DNA-Gelelektrophorese ausgewertet.
6.3.11 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über Messung der Absorption bei 260 nm
am Bio Photometer (Eppendorf AG, Hamburg), dazu wurde die DNA in einem Volumen von
100 µl 1:50 oder 1:100 in H2O verdünnt.
6 Methoden 41
6.3.12 „Markerless Mutagenesis“ nach Tischer et al.
In das virale Genom wurden Punktmutationen nach dem „Markerless Mutagenesis“
Protokoll nach Tischer et al. (2006) eingeführt. Das experimentelle Vorgehen zur
Generierung von viralen Mutanten ist in Abbildung 6-1 schematisch dargestellt.
Abb. 6-1. Schematische Darstellung zur Einführung von Punktmutationen in das virale Genom über „Markerless
Mutagenesis“. Über eine PCR wurde eine Rekombinationskassette amplifiziert. Die Primer enthielten
gewünschte Mutation, homologe Bereiche zu dem TB40/E-BAC4-Genom und pEPkan-S-Plasmid. Farben:
homologe Bereiche, über die die Rekombinationen erfolgten; Roter Punkt: Punktmutation; S: I-SceI
Erkennungssequenz. Modifiziert nach Tischer et al. (2006).
Zunächst wurde eine Rekombinationskassette über zwei PCRs mit dem Expand High
FidelityPLUS PCR System Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) generiert. Als DNA-Matrize
42 6 Methoden
diente pEPkan-S, über die das Kanamycinresistenzgen und die I-SceI Schnittstelle amplifiziert
wurden. Die Primer enthielten die gewünschte Mutation und Homologien zum viralen
Genom. Die Reaktion wurde in einem Volumen von 100 µl und im Thermocycler (Eppendorf
AG, Hamburg) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Expand High Fidelity
PLUS
1xExpand HiFi
PLUS
PCR System
reaction buffer
400 μM dNTPs
50 pmol je Primer
1,25 ng DNA-Matrize
PLUS
5,2 U Expand HiFi
Enzyme Blend
PCR Bedingungen
Denaturierung bei 95°C für 5 min
10 Zyklen:
Denaturierung bei 95°C für 45 sek
Hybridisierung bei 51°C für 2 min
Elongation bei 68°C für 2 min
25 Zyklen:
Denaturierung bei 95°C für 45 sek
Hybridisierung bei 51°C für 2 min
Elongation bei 68°C für 3 min
Elongation bei 72°C für 10 min
Tab. 6-4. PCR-Ansatz und -Bedingung für die Amplifikation einer Rekombinationskassette.
Die PCR-Produkte wurden jeweils über die DNA-Gelelektrophorese analysiert und über
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden), nach Anleitung des Herstellers,
gereinigt, dabei wurde die Rekombinationskassette in 15 µl H2O eluiert. Die DNA-Matrize
wurde über einen Restriktionsenzymverdau mit DpnI verdaut. Die Rekombinationskassette
wurde in elektrokompetente GS1783 Bakterien transformiert, die das Genom von TB40/EBAC4 tragen und bei denen durch eine 15-minütige Inkubation bei 42°C die Expression der
Rekombinase induziert wurde. Nach der ersten Rekombination über homologe Regionen
wurde auf Kanamycinresistenz selektioniert. Das Vorhandensein des Kanamycinresistenzgens wurde über eine Kolonie-PCR überprüft. Bei der zweiten Rekombination wurde das
Kanamycinresistenzgen wieder eliminiert. Dazu wurde eine Vorkultur der Bakterienzellen
über Nacht bei 32°C inkubiert. Die Vorkultur wurde 1:20 verdünnt und 2 h bei 32°C inkubiert.
Es erfolgte die Zugabe von 1%iger Arabinoselösung in 2 ml LB (+ Chloramphenicol) und eine
6 Methoden 43
weitere Inkubation für 30 min bei 32°C. Dadurch wurde die Expression des Enzyms I-SceI
induziert,
das
im
bakteriellen
Genom
codiert
ist
und
an
der
eingeführten
Erkennungsschnittstelle in TB40/E-BAC4 schnitt. Es schloss sich eine Inkubation für 15 min
bei 42°C an, welche die Expression der Rekombinase induziert. Eine 2-stündige Inkubation
bei 32°C folgte. Verschiedene Verdünnungen der Kulturen wurden auf LB-Platten mit
Chloramphenicol + 1% Arabinose ausplattiert und die Platten bei 32°C inkubiert. Mittels
Stempeln der Klone auf kanamycinhaltige Platten, Kolonie-PCR und Restriktionsenzymverdau der BAC-DNAs wurde das Entfernen des Kanamycinresistenzgens überprüft.
Zur Bestätigung der eingeführten Mutation wurde eine Sequenzierung durchgeführt, dazu
wurde vorher ein PCR-Produkt von diesem Bereich mit Expand High FidelityPLUS PCR System
Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) amplifiziert und gereinigt.
6.3.13 Extraktion von DNA aus infizierten Zellen
Zur Extraktion viraler DNA aus infizierten Zellen wurden die Zellen mit Trypsin vom
Flaschenboden abgelöst, pelletiert und mit PBSo gewaschen. Für die Extraktion wurde 1/4
der Zellen aus einer Nunc Zellkulturflasche verwendet. Die DNA wurde durch Inkubation der
Zellen mit Proteinase K für 45 min bei 56°C extrahiert, dann wurden die Proteine durch eine
Inkubation für 10 min bei 95°C inaktiviert und die Proben auf Eis abgekühlt. Die Extraktion
erfolgte in 150 µl Proteinase K Puffer, dem die Proteinase K in einer Konzentration von
0,1 µg/ml zugegeben wurde. Der Proteinase K Puffer hatte folgende Zusammensetzung:
0,5% Tween20 (w/v), 50 mM KCl, 15 mM Tris, 2,5 mM MgCl2.
6.3.14 Sequenzierung von DNA
Für die Sequenzierung von DNA wurde der BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems, Inc., USA) verwendet. Es wurde eine PCR in einem Gesamtvolumen von
20 µl durchgeführt. Der PCR-Ansatz enthielt 50 ng/kbp DNA-Matrize, 3,5 µl 5xTM-buffer,
15 pmol Primer und 1 µl BigDye. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 25 Zyklen mit 10 min
bei 96°C zum Denaturieren der DNA, 10 sek bei 50°C zum Anlagern der Primer, 4 min bei
60°C zur Elongation der naszierenden DNA. Sequenzierung erfolgte am Sequencer ABI PRISM
3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA) und die Sequenzen wurden mit der
Software Vector NTI ausgewertet.
44 6 Methoden
6.4 Proteinbiochemische Methoden
6.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde entweder der Bio-Rad Protein Assay
(Bio-Rad Laboratories GmbH, München) durchgeführt oder die Absorprtion bei 280 nm am
Photometer NanoDrop ND-1000 (Eppendorf AG, Hamburg) gemessen.
Bio-Rad Protein Assay
Der Bio-Rad Protein Assay wurde in Triplikaten, nach Anleitung des Herstellers, durchgeführt
und die optische Dichte bei 595 nm am Emax Microplate Reader (Eurofins MWG Operon,
Ebersberg) gemessen.
NanoDrop
Zur Bestimmung des Proteingehalts am NanoDrop ND-1000 wurden 5 µl Probe eingesetzt
und die Absorption bei 280 nm gemessen. Durch die Eingabe des molaren
Extinktionskoeffizienten, sowie des theoretischen Molekulargewichts des Proteins
errechnete die NanoDrop-Software, unter Anwendung des Lambert-Beerschen-Gesetzes, die
Proteinkonzentration in der Einheit mg/ml. Sowohl der Extinktionskoeffizient als auch das
Molekulargewicht wurden mittels ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)
durch Eingabe der Aminosäuresequenz ermittelt (Gasteiger et al., 2003).
6.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgte im
Modular Mini Vertical Gel Electrophoresis System von Bio-Rad Laboratories GmbH
(München). Zur Proteinauftrennung wurden 10%ige, 15%ige oder 15%ige High-Bis PAA-Gele
benutzt. Dazu wurde zunächst das entsprechende Trenngel gegossen und nach dessen
Polymerisierung das Sammelgel. Als Laufpuffer wurde 1xSDS-Elektrophoresepuffer
verwendet. Die Proben wurden in 1xSDS-Probenpuffer (reduzierend oder nicht reduzierend)
für 5 min bei 95°C denaturiert. 5 µl PageRuler Prestained Protein Ladder wurden als
Proteingrößenstandard aufgetragen.
6.4.3 Coomassieblue-Färbung
Die SDS-PAA-Gele wurden 15 min in Coomassieblue Färbelösung geschwenkt und
anschließend unter mehrfachen Wechseln der Entfärberlösungen I und II entfärbt. Zum
6 Methoden 45
Aufbewahren wurden die Gele im Protein Gel Dryer Model 583 (Bio-Rad Laboratories GmBH,
München) getrocknet.
6.4.4 Deglykosylierung mit PNGase F
PNGase F wurde zur Abspaltung der N-Glykane von Asparaginresten verwendet. Für die
Spaltung wurden Viruspartikel oder Zelllysate transient transfizierter Zellen eingesetzt. Für
die Herstellung von Zelllysaten wurden Cos7 Zellen im 6-Well-Format transfiziert. 48 h nach
Transfektion wurden die Zellen eines Wells in 40 µl Lysierungspuffer aufgenommen und
20 min auf Eis inkubiert. Die Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation bei 13000 rpm für
5 min abgetrennt. Viruspartikel wurden dankenswerterweise von Barbara Kropff zur
Verfügung gestellt. Der Verdau mit PNGase F wurde nach Anleitung des Herstellers (New
England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) durchgeführt. Dazu wurden die Proben mit dem
Denaturierungspuffer versetzt und 10 min bei 99°C inkubiert. Nach Abkühlen der
denaturierten Proben wurden PNGase F (500 U pro 10 µl Probe), Reaktionspuffer (1xG7), 1%
NP40 zugegeben und der Reaktionsansatz für 3 h bei 37°C inkubiert. Zur Inaktivierung von
PNGase F wurden die Proben für 5 min bei 95°C in 1xSDS-Probenpuffer reduzierend
aufgekocht und so in der Analyse mittels Western Blot verwendet.
6.4.5 Erzeugung und Reinigung von Fab-Fragmenten durch Papain-Spaltung
Durch den Verdau mit Papain wird ein IgG Molekül in zwei Fab-Fragmente und den Fc-Teil
gespalten. Zur Gewinnung von Fab-Fragmenten wurde SM5-1 IgG mit Papain verdaut. Dazu
wurde das Pierce Fab Peparation Kit von Thermo Fisher Scientific, Perbio Science
Deutschland (Bonn) verwendet. Es wurde nach Anleitung des Herstellers vorgegangen.
SM5-1 wurde in Digestion buffer + Cystein umgepuffert. Für die Spaltung von 5 mg SM5-1
wurden 250 µl des immobilisierten Papains eingesetzt und für 7-8 h bei 37°C inkubiert. Der
Großteil an ungespaltenem IgG und Fc-Fragment wurde zunächst im Batch-Verfahren über
Protein A entfernt. Die Protein A Agarose wurde für erneute Reinigungen regeneriert. Zur
Entfernung des restlichen IgGs und des Fc-Fragmentes wurde die Fab-Fraktion am ÄKTA
Purifier unter Verwendung einer HiTrap Protein A Säule (1 ml) (GE Healthcare GmbH,
München)
gereinigt.
Die
Säule
wurde
mit
5
Säulenvolumen
(SV)
50
mM
Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 äquilibriert. Die Probe wurde vor Auftrag auf die Säule steril
filtriert (Porengröße: 0,2 µm) und bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert. Die Fab-Fraktion
46 6 Methoden
wurde mit 0,8 ml/min auf die Säule geladen und die Säule mit 2 SV 50 mM
Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 gewaschen. Der Durchfluss und die Waschfraktion wurden in
3 ml-Fraktionen aufgefangen. Gebundenes IgG und Fc-Fragment wurden mit 0,2 M Glyzin,
pH 3,0 über eine Länge von 5 SV eluiert. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen gesammelt und
mit 100 µl 1M Tris, pH 9,0 pro Fraktion neutralisiert. Die Reinheit der Proben wurde mittels
SDS-PAGE und Western Blot Analyse überprüft. Als finaler Reinigungsschritt wurde eine
Größenausschluss-Chromatographie durchgeführt (siehe Abschnitt 6.4.8.5.).
6.4.6 Spaltung mit Thrombin
Die Spaltung mit immobilisierten Thrombin erfolgte nach Anleitung des Herstellers (Sigma
Aldrich Chemie GmbH, Steinheim). Nach Dialyse des Proteins gegen Cleavage buffer wurde
es mit immobilisierten Thrombin über 24 h bei 4°C inkubiert. Die Agarose wurde
anschließend mit PBSo gewaschen, um die Ausbeute zu erhöhen. Die Effizienz der Spaltung
wurde mit einer Western Blot Analyse überprüft.
6.4.7 Überexpression von Proteinen
Überexpression His- und GST-getaggter Proteine wurde in Bakterien unter der Kontrolle
eines lac-Operators durchgeführt. Dazu wurde zunächst LB-Medium (+ Antibiotikum) mit
einer Übernachtkultur in einer 1:50-Verdünnung angeimpft und die Flüssigkultur bei 37°C bis
zu einer OD600 ~0,6-0,8 inkubiert. Für die Expression von SM5-1Fab als His-Fusionsprotein
wurde die Temperatur auf 30°C bei einer OD600 ~0,5 herabgesetzt und die Bakterien weiter
inkubiert, bis eine OD600 ~0,6-0,8 erreicht wurde. Die Expression wurde anschließend durch
Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Weitere Inkubation für 3 h bei 37°C bzw. für 4 h bei 30°C
folgte. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 rpm, 4°C für 15 min
geerntet.
Für die Reinigung von GST-Fusionsproteinen wurden Bakterienlysate hergestellt, da die
Fusionsproteine als lösliche Proteine im Zytoplasma vorlagen. Dazu wurde wie folgt
vorgegangen: Das Bakterienpellet wurde in eiskaltem PBSo resuspendiert und die Bakterien
durch „freeze-thaw“ in flüssigem Stickstoff aufgeschlossen. Um den Aufschluss zu
verbessern, wurde die Bakteriensuspension zusätzlich mit Ultraschall am Sonifier 450
(Branson Ultrasonics Co., USA) behandelt. Nach einer 30-minütigen Inkubation mit 1%
Triton-X 100 bei RT wurde die Zytoplasmafraktion von den Zelltrümmern durch
6 Methoden 47
Zentrifugation bei 10000 rpm, 4°C für 20 min abgetrennt. Bakterienlysate wurden bis zur
weiteren Verwendung bei 4°C bzw. -20°C aufbewahrt.
Das His-Fusionsprotein SM5-1Fab wurde aus dem Periplasma gereinigt. Im Periplasma
herrschen oxidierende Bedingungen, welche die Bildung von Disulfidbrücken innerhalb des
Fab-Fragments ermöglichen. Für den Periplasmaaufschluss wurden die Bakterienzellen
gewogen und mit dem 3-fachen Volumen (w/v) an Periplasmapuffer versetzt, ohne zu
resuspendieren. Durch langsames Rühren auf Eis für 30-60 min wurde das Periplasma aus
den Bakterienzellen herausgelöst. Zur Abtrennung von Zelltrümmern folgten zwei
Zentrifugationsschritte bei 10000 rpm und anschließend bei 24000 rpm und 4°C für jeweils
20 min. Die Periplasmafraktion wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Die Expression und der Aufschluss wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse
überprüft.
Für die Produktion von SM5-1Fab im bakteriellen Fermenter (Techfors S 30 l) wurden die
Bakterien im MDG-Medium bis zu einer OD600 ~6,4 angezogen. Der Fermentationsprozess
wurde bei der Firma Diarect AG in Freiburg durchgeführt. Der Fermenter wurde mit 10,152 l
H2O befüllt. Nach der Zugabe von 7 ml Antifoam 204 (Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Steinheim) und der Kalibrierung der pH-Sonde wurde der Inhalt für 20 min bei 121°C
sterilisiert. Nach Abkühlen auf 22 °C wurden folgende Komponenten über einen sterilen
Zugang (Septum) zugegeben: 32 ml 1 M MgSO4 + 1 l H2O, 3,2 ml 1000xmetals + 1 l H2O, 1 l
8% Glyzin, 540 ml 25xM-NH4Cl, 100 ml 25xM, 40 ml 20% Glukose, 400 ml 2,5 M NH4Cl, 2 l
Startmedium (160 g Pepton, 80 g Hefeextrakt, 160 ml 25% Aspartat) und 32 ml
Kanamycinlösung = PepYMD-505, das eine Modifikation von ZYM-505 darstellte. Die O2- und
die OD-Sonde wurden kalibriert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 21,25 ml
Bakterienvorkultur (OD600 ~0,0085) und es folgte eine Inkubation über Nacht bei 22°C und
500 rpm. Am folgenden Tag wurde mehrmals die OD600 bestimmt und dO2 durch Zuluft und
Rührgeschwindigkeit reguliert, um dO2 bei 40-60% zu halten. Gleichzeitig wurde die Zugabe
von insgesamt 4 l Zugabemedium (240 g Pepton, 120 g Hefeextrakt, 120 g Glycerin, 8 ml
MgSO4, 0,8 ml 1000xmetals, 240 ml 25% Aspartat, 160 ml 25xM, 8 ml Kanamycin) gestartet.
Bei einer OD600 ~23 und der Hälfte des Volumens an Zugabemedium wurde die Expression
durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und es folgte eine 3-stündige Inkubation bei 22°C.
Während der Inkubation wurde das restliche Zugabemedium zugepumpt und dO2 durch
48 6 Methoden
Zugabe von insgesamt 500 ml 20% Glycerin reguliert. Nach 3 h wurden die Bakterien bei
einer OD600 ~38 mittels Zentrifugation geerntet und es schloss sich der Periplasmaaufschluss
an.
6.4.8 Reinigung von rekombinant exprimierten Proteinen
6.4.8.1 Affinitätsreinigung an Glutathione Sepharose 4B
GST-Fusionsproteine
(AD-4
und
AD-4-Mutanten)
wurden
aus dem
hergestellten
Bakterienlysat über eine Affinitätsreinigung an Glutathione Sepharose 4B nach Anleitung des
Herstellers (GE Healthcare GmbH, München) gereinigt. Das Bakterienlysat und die Sepharose
wurden für 2 h bei RT inkubiert. Nach Waschen der Sepharose mit PBSo wurde das GSTFusionsprotein entweder mit 10 mM reduzierten L-Glutathion eluiert (GST-Eluationspuffer)
oder die Proteine über Abspaltung des GST-Tags in GST-Spaltpuffer an der Sepharose
erhalten. Für die Abspaltung des GST-Tags wurde die Sepharose mit PreScission Protease (GE
Healthcare GmbH, München) für 5 h bei 4°C inkubiert; pro 400 µl Sepharose wurden 24 U
PreScission Protease eingesetzt. Die Reinigung wurde mittels SDS-PAGE analysiert.
6.4.8.2 Affinitätschromatographie an Nickelagarose
Das His-Fusionsprotein SM5-1Fab wurde aus dem Periplasma mittels Affinitätschromatographie
an
Nickelagarose
(IMAC
=
Immobilisierte
Metallionenaffinitäts-
Chromatographie) gereinigt. Die Bildung eines Chelatkomplexes zwischen dem Hisx6-Tag
und dem zweiwertigen Nickel ist die Basis für diese Reinigung. Die Periplasmafraktion wurde
exzessiv gegen HisTrap Puffer A dialysiert, um den Chelatbildner EDTA aus der Probe zu
entfernen. Die Reinigung erfolgte am ÄKTA Purifier, dabei wurde die Säule HisTrap FF (1 ml)
(GE Healthcare GmbH, München) als Nickelmatrix verwendet. Für die Reinigung wurde die
Säule zunächst mit 10 SV HisTrap Puffer A äquilibriert und anschließend wurde die Probe mit
0,8 ml/min auf die Säule geladen. Die Probe wurde vor Auftrag steril filtriert (Porengröße:
0,2 µm) und 10 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Nach Bindung an die Säule wurden
unspezifische Proteine mit HisTrap Puffer A weggewaschen und das Fusionsprotein über
einen linearen Imidazolgradienten von 0-60% HisTrap Puffer B über eine Länge von 20 SV
eluiert. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen gesammelt. Die Peakfraktionen wurden mittels
SDS-PAGE analysiert.
6 Methoden 49
6.4.8.3 Anionenaustausch-Chromatographie
AD-4 und seine Derivate wurden nach Abspaltung des GST-Tags weiter über eine
Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt, um Verunreinigungen mit GST und GSTFusionsprotein zu entfernen. Um eine Anionenaustausch-Chromatographie durchführen zu
können, wurde der Bindepuffer so gewählt, dass der pH-Wert größer ist als der theoretische
pI-Wert
des
zu
reinigenden
Proteins.
Der
pI-Wert
wurde
mittels
ProtParam
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) durch Eingabe der Aminosäuresequenz
ermittelt. Die Reinigung erfolgte am ÄKTA Purifier, dabei wurde die Säule HiTrapQ FF (1 ml)
(GE Healthcare GmbH, München) verwendet und vor dem Auftrag der Probe wurde die
Säule mit 10 SV HiTrapQ Puffer A äquilibriert. Nachdem die Probe steril filtriert wurde
(Porengröße: 0,2 µm) und bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert wurde, wurde sie auf die
Säule mit 0,8 ml/min aufgetragen. Anschließend wurden unspezifische Proteine mit 5 SV
HiTrapQ Puffer A weggewaschen und die Eluation erfolgte mittels eines linearen Gradienten
von 0-80% bzw. 0-60% HiTrapQ Puffer B über eine Länge von 20 SV. In 1 ml-Fraktionen
wurde das Eluat aufgefangen. Die Peakfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
6.4.8.4 Kationenaustausch-Chromatographie
Der Affinitätsreinigung von SM5-1Fab an Nickelagarose folgte die Reinigung der
Proteinlösung mittels Kationenaustausch-Chromatographie. Damit das Protein an die
Säulenmatrix binden konnte, wurde der Bindepuffer so gewählt, dass der pH-Wert der
Pufferlösung kleiner ist als der pI-Wert des Proteins. Der pI-Wert wurde mittels ProtParam
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) durch Eingabe der Aminosäuresequenz
ermittelt. Die Säule HiTrapSP FF (1 ml) wurde in das ÄKTA Purifier Pumpensystem (GE
Healthcare GmbH, München) geschraubt und mit 10 SV HiTrapSP Puffer A äquilibiert. Die
Probe wurde vorbereitet, indem sie steril filtriert (Porengröße: 0,2 µm) und bei 5000 rpm für
10 min zentrifugiert wurde. SM5-1Fab wurde an die Säule bei einem Fluss von 0,8 ml/min
gebunden und unspezifische Proteine mit 5 SV HiTrapSP Puffer A weggewaschen. Eluiert
wurde über einen linearen Gradienten von 0-100% HiTrapSP Puffer B über eine Länge von 20
SV. Das Eluat wurde in 1 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Peakfraktionen wurden mittels SDSPAGE und anschließender Coomassieblue-Färbung analysiert.
50 6 Methoden
6.4.8.5 Größenausschluss-Chromatographie
Eine Größenausschluss-Chromatographie wurde zur finalen Reinigung von Proteinen
durchgeführt, dabei wurden die Gelfiltrationssäulen HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade
oder HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare GmbH, München) verwendet.
Die Probe wurde mittels Vivaspin, mit entsprechender Ausschlussgröße, bei 4800 rpm
ankonzentriert und mit einem Ultrafree MC Zentrifugenfilter (Porengröße: 0,2 µm; Sigma
Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) steril filtriert. Nach Äquilibrierung mit 1,5 SV
Gelfiltrationspuffer wurde die Probe über den 10 ml-Loop auf die Säule geladen, dabei lag
das Volumen der Probe bei 1-2 ml. Der Chromatographielauf erfolgte über eine Länge von
1,5 SV bei einer konstanten Flussrate von 0,4 ml/min. Das Eluat wurde in 2 ml-Fraktionen
gesammelt. Die Peakfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
6.5 Immunologische Methoden
6.5.1 „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA)
Der ELISA wurde in NuncImmuno Platten oder NuncImmuno Modulen mit MaxisorbOberfläche durchgeführt. Die Platten wurden mit dem Antigen in ELISA-Beschichtungspuffer
oder in 6 M Harnstoff (nur für AD-1 und β-Galaktosidase) in einem Volumen von 50 µl pro
Well über Nacht bei 4°C beschichtet. Falls ein Fusionsprotein verwendet wurde, wurde auch
jeweils der Fusionspartner analysiert. Alle nachfolgenden Reaktionen wurden bei RT
durchgeführt. Die Platten wurden mit ELISA-Waschlösung dreimal für 5 min gewaschen und
mit ELISA-Blocklösung für 2 h inkubiert, um die Welloberfläche mit irrelevanten Proteinen
abzusättigen. Nachdem die Platten wiederum gewaschen wurden, folgte eine Inkubation mit
Seren (1:50 verdünnt) oder spezifischen Antikörpern für 2 h, die in ELISA-Blocklösung
verdünnt wurden. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen entfernt und zur
Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte eine Inkubation mit den entsprechenden
Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörpern für 45 min. Die Platten wurden nochmals
gewaschen und es folgte eine 5-minütige Inkubation mit 100 µl TMB-Substratlösung pro
Well, die eine optische Auswertung der Daten ermöglichte. Die enzymatische Reaktion der
Peroxidase wurde durch Zugabe von 100 µl 1 M Phosphorsäure pro Well gestoppt und die
optische Dichte bei 450 nm am Emax Microplate Reader (Eurofins MWG Operon, Ebersberg)
gemessen. Als Sekundärantikörper wurden verwendet: Peroxidase (HRP)-gekoppelte
polyklonale Kaninchen anti-Human IgG (1:10000; Dako Deutschland GmbH, Hamburg),
6 Methoden 51
polyklonaler Kaninchen anti-Maus IgG (1:1000; Dako Deutschland GmbH, Hamburg) oder
polyklonaler Kaninchen anti-Human IgM (1:000; Dianova GmbH, Hamburg) Antikörper.
6.5.2 Bestimmung der IgG Konzentration
Die IgG Konzentration von humanen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern erfolgte in
einem Anti-Human-IgG-ELISA. Dazu wurden pro Well 100 ng AffiniPure Ziege anti-Human
IgG, Fcγ-Fragment spezifisch, (Dianova GmbH, Hamburg) in ELISA-Beschichtungspuffer an
NuncImmuno Platten Maxisorb über Nacht bei 4°C gekoppelt. Alle nachfolgenden
Reaktionen wurden bei RT durchgeführt. Nachdem die Platten dreimal für 5 min mit ELISAWaschlösung gewaschen wurden, mit ELISA-Blocklösung für 2 h blockiert wurden und
anschließend nochmals gewaschen wurden, wurden die zu testenden Proben in ELISABlocklösung titriert. Als Standardreihe wurde eine Präparation mit humanen polyklonalen
IgG (Dianova GmbH, Hamburg) mit einer Anfangskonzentration von 500 ng/ml in
Zweierschritten titriert. Ein weiterer Waschschritt und eine 45-minütige Inkubation mit dem
Peroxidase-konjugierten Ziege anti-Human IgG, Fcγ-Fragment spezifisch, AffiniPure F(ab‘)2
Fragment (1:5000; Dianova GmbH, Hamburg) folgten. Zum Schluss wurden die Platten
nochmals gewaschen und die Wells mit 100 µl TMB-Substratlösung für 5 min inkubiert. Nach
Abstoppen der enzymatischen Reaktion der Peroxidase mit 100 µl 1 M Phosphorsäure wurde
die optische Dichte bei 450 nm am Emax Microplate Reader (Eurofins MWG Operon,
Ebersberg) gemessen und die IgG Konzentration an Hand der Standardkurve bestimmt.
6.5.3 Western Blot Analyse
Für den Nachweis von viralen und rekombinant exprimierten Proteinen in Zelllysaten,
Virionen, Bakterienlysaten oder bakteriellen Periplasma wurden die Proteine über SDS-PAGE
aufgetrennt und dann auf eine Nitrozellulosemembran (Protran, Whatman GmbH, Dassel)
transferiert. Alle Schritte wurden bei RT durchgeführt. Um unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren, wurde die Membran 2 h in ELISA-Blocklösung geschwenkt und es folgte eine
Inkubation mit Primärantikörpern für 2 h. Ungebundene Antikörper wurden durch
dreimaliges Waschen für 5 min mit ELISA-Waschlösung entfernt und es folgte eine
1-stündige Inkubation mit dem entsprechenden Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper; es sei denn der Primärantikörper war bereits Peroxidase-gekoppelt. Die
Membran wurde exzessiv gewaschen: dreimal mit ELISA-Waschlösung, zweimal mit PBSo
52 6 Methoden
und einmal mit H2O für jeweils 5 min. Anschließend wurde die Membran kurz in ECLSubstratlösung geschwenkt und das Chemilumineszenzsignal am Luminescent Image
Analyzer LAS-1000 CH (Fuji Photo Film Co., LTD, Japan) detektiert.
6.5.4 Indirekte Immunfluoreszenz
Die indirekte Immunfluoreszenz wurde mit transient transfizierten oder infizierten Zellen in
24-Well-Platten auf runden Deckgläschen (A. Hartenstein Gesellschaft für Labor- und
Medizintechnik mbH, Würzburg) durchgeführt. 8-Well Objektträger wurden ebenfalls
verwendet, auf welche die Zellen aus der Transfektion in 24-Well-Platten überführt wurden.
Die Objektträger wurden anschließend getrocknet. Die Zellen wurden zweimal mit PBSo
gewaschen und mit kaltem Methanol oder Ethanol (-20°C) für 15 min bei RT permeabilisiert
und fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBSo erfolgte die Inkubation mit
Primärantikörper für 1,5 h bei 37°C. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen
entfernt und es schloss sich eine Inkubation mit den fluoreszenzgekoppelten Sekundärantikörpern für 1 h bei 37°C an. Nach dem letzten Waschschritt (5x mit PBSo) wurden die
Deckgläschen aus der 24-Well-Platte mit einer heißen Kanüle herausgehoben und mit
VECTASHIELD Mounting Medium (Vector Laboratories Inc., USA), das 4′,6-Diamidin-2phenylindol (Dapi) beinhaltete, eingedeckelt. Der Rand der Deckgläschen wurde mit
Nagellack luftdicht verschlossen und die gefärbten Zellen am Fluoreszenzmikroskop
Axioplan 2 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena) ausgewertet.
6.5.5 Kovalente Antigenkopplung an AminoLink Plus
Zur antigenspezifischen Affinitätsreinigung von Seren wurde das Antigen kovalent an
AminoLink Plus Agarosekügelchen (Thermo Fisher Scientific, Perbio Science Deutschland,
Bonn) über reduktive Amininierung gekoppelt. Die Kopplung von 2,4-3,8 mg Antigen wurde
nach Anleitung des Herstellers (Thermo Fisher Scientific, Perbio Science Deutschland, Bonn)
durchgeführt und mittels SDS-PAGE überprüft.
6.5.6 Antigenspezifische Affinitätsreinigung von Seren
Antigengekoppelte AminoLink Plus Agarosekügelchen wurden zur Affinitätsreinigung von
Seren verwendet. HCMV HIS wurden zunächst auf ihre Reaktivität mit dem entsprechenden
Antigen im ELISA untersucht und dann für die Affinitätsreinigung 1:3 mit PBSo verdünnt. Die
6 Methoden 53
Affinitätsreinigung erfolgte nach Anleitung des Herstellers (Thermo Fisher Scientific, Perbio
Science Deutschland, Bonn). Die IgG Konzentration der Eluate wurde, wie in Abschnitt 6.5.2.
beschrieben, bestimmt.
6.6 Biophysikalische Methoden
6.6.1 „Surface Plasmon Resonance“ (SPR)
Die Dissoziationskonstante KD von AD-4-spezifischen Fab-Fragmenten an AD-4 und AD-4Derivate wurde über SPR am Biacore T100 (GE Healthcare GmbH, München) bei 25°C
bestimmt. Es wurden ungefähr 300 RUs der Proteine an den Series S Sensor Chip CM5 (GE
Healthcare GmbH, München) bei einer Kontaktzeit von 400 sek und einer Flussrate von
10 µl/min gekoppelt. PBS + 0,05% P20 wurde als Laufpuffer benutzt. Verschiedene
Konzentrationen der Fab-Fragmente wurden mit einer Kontaktzeit von 90 sek injiziert und
die Dissoziationszeit betrug 600 sek bei einer Flussrate von 30 µl/min. Die Sensoroberfläche
wurde zwischen den Messungen mit 10 mM Glyzin, pH 2,0 regeneriert. Bei der
Regenerierung betrug die Kontaktzeit 20 sek und die Flussrate 30 µl/min. Die Auswertung
der kinetischen Daten erfolgte über das 1:1 Bindungsmodel.
6.6.2 Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie
Zur Durchführung der CD-Spektroskopie wurde der GST-Tag von den AD-4-Fusionsproteinen
abgespalten und die Konzentration der Proteinlösungen auf ungefähr 8 µM eingestellt. Die
Proteinlösungen wurden gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 dialysiert und steril
filtriert (Porengröße: 0,2 µm; Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim). Die CD-Spektren
wurden mit einem Jasco Spektralpolarimeter J-850 (Jasco Deutschland GmbH, GroßUmstadt) über eine Brandbreite von 180-250 nm bei einer Temperatur von 20°C
aufgenommen. Die Messung erfolgte in einer Quarzglasküvette mit 0,1 cm Schichtdicke in
0,1 nm Etappen, mit einer Geschwindigkeit von 20 nm/min, bei einer Spaltbreite von 1 nm
und einer Sensitivität von 100 mdeg. Es wurden jeweils 8 Spektren derselben Probe
akkumuliert, gemittelt und um den Hintergrundwert des Phosphatpuffers korrigiert.
6.7 Tierexperimentelle Methoden
Murine Hyperimmunseren wurden nach Immunisierung von jeweils vier CD8 -/- Mäusen mit
gB, AD-4-GST und GST als Kontrolle gewonnen. Die Tiere wurden im Abstand von sechs
54 6 Methoden
Wochen immunisiert, dabei erfolgten die ersten beiden Immunisierungen durch
intraperitoneale Applikation (i. p.) von je 5 µg gB, 30 µg oder 60 µg AD-4-GST und 60 µg GST.
Die Proteine wurden vorher an das Adjuvans Imject Alum, nach Anleitung des Herstellers
(Thermo Fisher Scientific, Perbio Science Deutschland, Bonn), adsorbiert. Die dritte
Antigengabe erfolgte ohne Adjuvans und durch intravenöse Applikation (i. v.) von jeweils
2 µg Protein. Eine Woche nach dem letzten Boost wurde den Tieren Serum über das Auge
abgenommen und das Experiment beendet.
7 Ergebnisse 55
7 Ergebnisse
Die vorliegende Arbeit ist eine konsequente Weiterführung meiner Masterarbeit
(Tschesnych, 2009), die im Folgenden kurz zusammengefasst wird. Ich konnte ein neues
Epitop auf HCMV gB identifizieren und teilweise näher charakterisieren. Über die transiente
Expression von N- und C-terminalen Verkürzungen von gB in eukaryonten Zellen konnte das
Epitop zunächst auf die Aminosäuren (AS) 100-447 eingegrenzt werden. Die strukturellen
Domänen I und II bilden diesen Bereich, die anschließend jeweils separat auf
Antikörperbindung untersucht wurden. Domäne I ist eine kontinuierliche Sequenz, während
Domäne II aus einer diskontinuierlichen Sequenz aufgebaut ist. Für die Expression von
Domäne II wurde der N- und C-terminale Bereich (AS 112-132 und 344-438) über einen
synthetischen 5-AS-Linker (IAGSG) verknüpft. Die exprimierten Proteine besaßen eine
Signalsequenz für die Translokation in das Endoplasmatische Retikulum und zur Detektion
einen N-terminalen Hämagglutinin (HA)-Tag. Nach transienter Expression in eukaryonten
Zellen wurde Domäne II als Epitop von sechs humanen monoklonalen Antikörpern
(hu-mAbs) identifiziert und als vierte bekannte antigene Domäne auf gB wurde sie AD-4
genannt. Für die Analysen im ELISA-Format wurde AD-4 als GST-Fusionsprotein verwendet.
Nach Zugabe von IPTG wurde AD-4 in Bakterien exprimiert und über den N-terminalen GSTTag aus dem Bakterienlysat gereinigt. Im ELISA wurde die Seropositivitätsrate von 80 Seren
HCMV-positiver Individuen mit >90% bestimmt. Um essentielle Kontakt-AS zu identifizieren,
wurde ein „Di-Alanin-Scan“ durchgeführt. Es wurden 17 Expressionsplasmide für die
Expression von AD-4-Mutanten (siehe Abbildung 7-10, S. 73) als HA-Fusionsproteine
konstruiert. Eine Signalsequenz sorgte für die Translokation in das Endoplasmatische
Retikulum. Nach transienter Expression in eukaryonten Zellen konnten die AS K378 und K379
als kritische AS-Reste für die Bindung der getesteten AD-4-spezifischen hu-mAbs, mit einer
Ausnahme (SM5-1), identifiziert werden.
7.1 AD-4-Antikörpertiter und Neutralisationskapazität humaner Seren
Wie in der Einleitung erörtert wurde, können in allen Seren HCMV-positiver Personen
Antikörper gegen gB nachgewiesen werden. In der Literatur wird gB als ein dominantes
Antigen diskutiert, das vor allem virusneutralisierende Antikörper während einer Infektion
induziert. Zudem wurde im Menschen (Marshall et al., 1992) und in Rhesus Makaken (Yue et
al., 2003) eine Korrelation zwischen anti-gB Titer und Neutralisationskapazität beschrieben.
56 7 Ergebnisse
Es ist unklar, ob die Neutralisationskapazität mit einer Vielzahl unterschiedlicher Epitope auf
gB assoziiert ist oder ob eine einzige antigene Domäne die beschriebene Korrelation
zwischen anti-gB-Titer und Neutralisationskapazität erklärt. Es wurde untersucht, inwiefern
AD-4-spezifische Antikörper zum Gesamtneutralisationspotential eines HCMV-positiven
Serums beitragen. In diesem Zusammenhang sollte dieselbe Fragestellung auch für AD-1 und
AD-2 untersucht werden. Außerdem sollte die Korrelation für gB in unserem Testverfahren
überprüft
werden.
Für
diese
Analyse
wurden
80
Seren
verwendet
und
die
Neutralisationskapazität jedes einzelnen Serums wurde bestimmt. Hierzu wurden die Seren
im Medium verdünnt und mit dem HCMV-Stamm AD169 (HB15-UL84prluc), der zusätzlich
das Luciferasegen besitzt, für eine Stunde inkubiert. Fibroblasten (MRC5) wurden mit dem
Antikörper-Virus-Gemisch infiziert und 48 h später die Biolumineszenzsignale (RLU = relative
light units) am Luminometer detektiert. RLU-Werte wurden zur Berechnung der
%-Neutralisation herangezogen (Daten nicht gezeigt). Die Titer der Seren wurden während
meiner Masterarbeit ermittelt (Tschesnych, 2009). Hierzu wurde ein ELISA mit den
Antigenen gB, AD-1, AD-2 und AD-4 durchgeführt. Sanofi Pasteur stellte HCMV gB
freundlicherweise zur Verfügung (Marcy L’Etoile, Frankreich) gestellt, AD-1 wurde als βGalaktosidase-Fusionsprotein (hergestellt von Tanja Fisch), AD-2 als synthetisches Peptid
und AD-4 als GST-Fusionsprotein eingesetzt. Die Antigenmenge, die zum Beschichten
verwendet wurde, wurde jeweils vorher in einem separaten ELISA bestimmt. ELISA-Platten
wurden mit den Antigenen beschichtet, freie Bindungsstellen mit FKS blockiert und die
Bindung von Antikörpern über einen HRP-gekoppelten Sekundärantikörper nachgewiesen.
Für die Auswertung der ELISA-Daten wurden die OD-Werte der Fusionspartner abgezogen.
Wie bei Marshall et al. (1992) beschrieben, konnte auch in unserem Testsystem eine
Korrelation zwischen anti-gB-Titer und Neutralisationskapazität detektiert werden, dabei
war die Korrelation hochsignifikant und nach dem Spearman-Korrelationstest bestand ein
deutlicher Zusammenhang (r=0,5136; P<0,0001). Dies galt auch für die Korrelation zwischen
Antikörpertitern gegen AD-1 und Neutralisationskapazitäten der Seren (r=0,5834; P<0,0001).
Im Fall von AD-2 (r=0,2199; P=0,05) und AD-4 (r=0,3782; P=0,0005) deutete der SpearmanKorrelationskoeffizient auf einen schwachen bis mäßigen Zusammenhang zwischen
Antikörpertiter und Neutralisationskapazität hin (Abbildung 7-1). Diese Befunde ließen
erkennen, dass das Gesamtneutralisationspotential eines HCMV-positiven Serums sich aus
mehreren Spezifitäten gegen HCMV-Proteine ergibt.
7 Ergebnisse 57
Abb. 7-1. Korrelation zwischen Antikörpertiter und Neutralisationskapazität. Der 50%ige Neutralisationstiter
eines Serums wurde in einem Neutralisationstest in Fibroblasten bestimmt und gegen OD450 aus einem ELISA
mit den Antigenen gB, AD-1, AD-2 und AD-4 aufgetragen. gB: in CHO Zellen exprimiertes HCMV gB, bei dem
Furinspaltstelle und Transmembrandomäne deletiert sind (Sanofi Pasteur, Marcy L’Etoile, Frankreich); AD-1:
prokaryont exprimiertes β-Galaktosidase-Fusionsprotein, AS-Sequenz: AS 484-650 von HCMV gB; AD-2:
synthetisches pep 90 Peptid, AS-Sequenz: NETIYNTTLKYGDVVGV; AD-4: prokaryont exprimiertes GSTFusionsprotein, AS-Sequenz: AS 112-132 und 344-438 HCMV gB. r=Spearman-Korrelationskoeffizient: 0,2<r≤0,5
schwacher bis mäßiger Zusammenhang, 0,5<r≤0,8 deutlicher Zusammenhang. P<0,0001 hochsignifikant,
P=0,0005 signifikant, P=0,05 nicht signifikant. Sowohl der 50%-Neutralisationstiter als auch die Antikörpertiter
wurden in zwei unabhängigen Tests untersucht.
58 7 Ergebnisse
7.2 Einfluss von AD-4-spezifischen Antikörpern auf „Cell-Cell-Spread“
SM-Antikörper sind hu-mAbs, die gegen gB von HCMV gerichtet sind und während einer
Infektion mit HCMV induziert wurden. Herkunft, Bindungsspezifitäten und biologische
Aktivität wurden bei Pötzsch et al. (2011) beschrieben. gB-spezifische Gedächtnis B-Zellen
einer HCMV-positiven Person wurden durch Zugabe von CpG aktiviert und mit EBV
immortalisiert. Ig Gene der SM-Antikörper wurden kloniert und als IgG1 Moleküle
rekombinant exprimiert. Zwei der acht SM-Antikörper banden an AD-5 (SM10, SM12) und
die restlichen sechs an AD-4 (SM1-6, SM3-1, SM4-5, SM5-1, SM6-5, SM11-17). In dieser
Arbeit wurden AD-4-spezifische SM-Antikörper näher charakterisiert. Die antivirale Aktivität
von AD-4-spezifischen SM-Antikörpern wurde größtenteils schon untersucht und
beschrieben. Sie neutralisierten in vitro unterschiedliche HCMV-Stämme in Fibroblasten,
Endothel-, Epithelzellen und Dendritischen Zellen. In Tabelle 7-1 sind die 50%igen
Neutralisationsaktivitäten von AD-4-spezifischen SM-Antikörpern zusammengefasst.
Fibroblasten Endothelzellen Epithelzellen Dendritische Zellen
SM1-6
1,3
1,3
0,3
1,3
SM3-1
1,2
1,0
0,4
1,0
SM4-5
0,6
0,8
0,9
0,4
SM5-1
0,3
0,2
0,2
0,3
SM6-5
0,5
0,4
0,3
0,5
SM11-17 1,0
1,0
0,3
1,3
Tab. 7-1. 50%ige Neutralisationsaktivitäten von AD-4-spezifischen SM-Antikörpern, angegeben in µg/ml
(Pötzsch et al., 2011). Für den Neutralisationstest wurden HCMV (AD169: Fibroblasten oder TB40E:
Endothelzellen, Epithelzellen, Dendritische Zellen) und Antikörper inkubiert und die Zellen mit dem AntikörperVirus-Gemisch infiziert. Die Infektionsrate wurde entweder über Luciferaseexpression (AD169) oder über IE-1Färbung
(TB40E)
bestimmt
und
daraus
wurde
%-Neutralisation
in
Abhängigkeit
von
der
Antikörperkonzentration berechnet.
Nach der Infektion verbreitet sich HCMV entweder als freies Virus oder direkt von Zelle zu
Zelle, ohne dass extrazelluläres Virus von der Zelle freigesetzt wird (Digel et al., 2006; Sinzger
et al., 1999). Im Blut kann nur wenig extrazelluläres Virus detektiert werden (Ljungman et
al., 2002), was darauf deutet, dass HCMV sich in vivo hauptsächlich von Zelle zu Zelle
ausbreitet (Stoddart et al., 1994). Die Expression der HCMV Glykoproteine gB und gH/gL
7 Ergebnisse 59
führt in vitro zu Synzytienbildung, die wiederum durch neutralisierende Antikörper inhibiert
werden kann (Kinzler & Compton, 2005; Tugizov et al., 1994). Zudem konnten frühere
Publikationen, ebenfalls in vitro Studien, zeigen, dass monoklonale gB- und gH-spezifische
Antikörper die Ausbreitung von HCMV von Zelle zu Zelle reduzieren können (Navarro et al.,
1993; Rasmussen et al., 1985). Die Reduktion von „Cell-Cell-Spread“ durch anti-CMV Seren
wird kontrovers diskutiert: 1) Seren von knochenmarktransplantierten Patienten konnten
zwar effektiv das freie Virus neutralisieren, jedoch die Ausbreitung in Fibroblasten von Zelle
zu Zelle nicht reduzieren oder verhindern (Sinzger et al., 2007). 2) Andere konnte hingegen
im Mausmodell zeigen, dass polyklonale MCMV-spezifische Antikörper zellassoziierte
Ausbreitung von MCMV in Organen inhibieren können (Wirtz et al., 2008). 3) Inhibierung von
„Cell-Cell-Spread“ scheint zelltypabhängig zu sein. Während ein anti-HCMV Serum in
Fibroblasten keinen Effekt hat, reduziert es in Endothelzellen die Ausbreitung von Zelle zu
Zelle (Jiang et al., 2008).
In diesem Zusammenhang sollte analysiert werden, ob AD-4-spezifische Antikörper in der
Lage sind zellassoziierte Ausbreitung von HCMV zu reduzieren oder zu verhindern. Für die
Analyse wurden sowohl hu-mAbs als auch humane polyklonale Antikörper mit AD-4Spezifität verwendet. AD-4-spezifische polyklonale Antikörper wurden aus einem HCMVHyperimmunserum (HCMV HIS) isoliert.
7.2.1 Reinigung polyklonaler Antikörper mit AD-4-Spezifität aus HCMV-Hyperimmunseren
SM-Antikörper stammen alle aus einem Spender und die AD-4-spezifischen SM-Antikörper
sind klonal verwandt, wie Sequenzanalysen ergaben(Pötzsch et al., 2011). Um das Spektrum
von AD-4-spezifischen Antikörpern zu untersuchen wurden polyklonale Antikörper mit AD-4Spezifität aus HCMV HIS isoliert. Für die Isolierung der polyklonalen Antikörper wurden
HCMV-Hyperimmunseren zunächst im ELISA auf ihre Reaktivität mit dem AD-4Fusionsprotein untersucht. Für die Herstellung von AD-4 und GST in Bakterien wurde die
Expression durch Zugabe von IPTG induziert, die Bakterien aufgeschlossen und die Proteine
über den GST-Tag aus dem Bakterienlysat gereinigt. Die Platten wurden mit AD-4-GST und
als Kontrolle mit GST beschichtet. Bindung von Hyperimmunseren an das beschichtete
Antigen wurde über einen HRP-gekoppelten Sekundärantikörper nachgewiesen. Alle Seren
(n=11) zeigten nach Abzug der OD-Werte für GST vergleichbare Reaktivitäten mit AD-4
(Daten nicht gezeigt). Für die Isolierung von affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern
60 7 Ergebnisse
wurde ein Serum ausgesucht, das den höchsten Titer gegen AD-4 aufwies. Zunächst wurden
2,6 mg AD-4-Fusionsprotein durch eine reduktive Aminierung an aldehydaktivierten
Agarosekügelchen (AminoLink Plus) immobilisiert. Die kovalente Kopplung wurde über SDSPAGE überprüft. Die Analyse ergab, dass AD-4-GST fast vollständig an die Agarose gekoppelt
wurde (Daten nicht gezeigt). Ein Hyperimmunserum wurde 1:3 in PBSo verdünnt, mit der
generierten AD-4-Affinitätsmatrix inkubiert und anschließend wurden die AD-4-spezifischen
Antikörper eluiert. Für die folgenden Versuche wurde die IgG Konzentration der
affinitätsgereinigten polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern (poly AD-4) und des
dazugehörigen Hyperimmunserums bestimmt (Daten nicht gezeigt).
HCMV HIS besitzt viele Spezifitäten, die nicht nur gegen gB sondern auch gegen andere
HCMV Proteine, insbesondere Glykoproteine, gerichtet sind. Um sicher zu stellen, dass die
hergestellte Immunglobulin Präparation nur AD-4-spezifische Antikörper enthält, wurde sie
auf Erkennung von AD-4, weiteren Antigenen Domänen auf gB, und anderen HCMV
Glykoproteinen wie gH oder gM/gN getestet, da Antikörper gegen diese Proteine/antigene
Domänen ebenfalls virusneutralisierende Eigenschaften besitzen (Meyer et al., 1990; Ohlin
et al., 1993; Shimamura et al., 2006; Urban et al., 1996; Wagner et al., 1992). Die Reaktivität
von poly AD-4, HCMV HIS vor (prae) und nach (post) Isolierung wurde in einem ELISA mit gB,
AD-1, AD-2 und AD-4 als Antigen untersucht (Abbildung 7-2 A). Die Platten wurden mit dem
Antigen und dem jeweiligen Fusionspartner (AD-1 und AD-4) beschichten und die Bindung
der Antikörper optisch nachgewiesen. Pro Antigen wurde ein Kontrollantikörper mitgeführt
und der Wert des Fusionspartners bzw. der Leerwert (jeweiliger Sekundärantikörper) bei der
Auswertung subtrahiert. Eine Bindung von poly AD-4 an gB und AD-4 war zu beobachten,
jedoch nicht für AD-1 und AD-2. Das eingesetzte Hyperimmunserum erkannte alle
getesteten Antigene und es zeigte nach Isolierung der AD-4-spezifischen Antikörper keine
Reaktivität mit AD-4. Diese Analyse konnte zeigen, dass AD-4-spezifische Antikörper aus dem
Hyperimmunserum zu 100% isoliert wurden und poly AD-4 nicht mit den Antigenen AD-1
und AD-2 von gB reagierte. Für die Bindungsanalyse an andere HCMV Glykoproteine wurden
Cos7 Zellen mit gM/gN und gH transient transfiziert und eine mögliche Bindung an diese
wurde über die indirekte Immunfluoreszenz (Abbildung 7-2 B) getestet. Eine Signalsequenz
im Expressionsvektor von AD-4 sorgte für die Translokation ins Endoplasmatische Retikulum
und eine HA-Sequenz am N-Terminus diente als Expressionskontrolle von AD-4. Die
Expression wurde über Kontrollantikörper nachgewiesen. Bindung an gB und AD-4 konnte
7 Ergebnisse 61
detektiert werden, jedoch nicht an gM/gN oder gH. Die Reaktivität der Kontrollantikörper
bestätigte die transiente Expression der jeweiligen Proteine. Die Analysen konnten eindeutig
zeigen, dass die affinitätsgereinigten Antikörper ausschließlich AD-4-Spezifität besaßen und
zudem frei von der Immunoglobulin Klasse M (IgM) waren (Daten nicht gezeigt).
Abb. 7-2. Analyse zur Spezifität von affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern. (A) ELISA mit gB, AD-1, AD-2
und AD-4 als Antigen. gB: rekombinant exprimiert in CHO Zellen; AD-2: synthetisches Peptid; AD-1 und AD-4:
bakterielle Fusionsproteine. Als Kontrollantikörper dienten: C23 (hu-mAb, AD-2-spezifisch), 89-104 (hu-mAb,
AD-1-spezifisch) und anti-GST. (B) Indirekte Immunfluoreszenz von transient transfizierten Cos7 Zellen mit AD-4
als HA-Fusionsprotein, gB, gM/gN und gH. Als Kontrollantikörper dienten anti-HA, C23, 14-16A (gM/gNspezifisch) und SA4 (gH-spezifisch). Zellkerne wurden mit Dapi gefärbt.
62 7 Ergebnisse
Wie ich in meiner Masterarbeit zeigen konnte, ist für die Bindung der SM-Antikörper die
komplette AD-4-Sequenz ausschlaggebend. Fehlte der N-terminale Bereich (AS 121-132)
oder die letzten 13 AS am C-Terminus, konnte keine Reaktivität der AD-4-spezifischen humAbs mittels indirekter Immunfluoreszenz detektiert werden. Es stellte sich die Frage, ob es
auch zum Verlust der Bindung von poly AD-4 kommt, wenn nicht die vollständige AD-4Sequenz exprimiert wurde. Die Reaktivität wurde für folgende N- und C-terminale
Verkürzungen von gB und AD-4 analysiert: gB 100-448, gB 150-448 und AD-4trunc425. Die
N-terminalen Verkürzungen wurden mit der Signalsequenz von UL132 und einem Nterminalen HA-Tag exprimiert. Für die transiente Expression der rekombinanten Proteine
wurden Cos7 Zellen transfiziert und die Bindung über indirekte Immunfluoreszenz
nachgewiesen. Als Kontrolle wurde die Bindung an AD-4 untersucht, das als HAFusionsprotein in Cos7 Zellen exprimiert wurde. Eine Bindung von poly AD-4 konnte für AD-4
und gB 100-448 und nicht für gB 150-448 und AD-4trunc425 detektiert werden (Abbildung 73). Dies entsprach dem Erkennungsmuster von AD-4-spezifischen hu-mAbs, die das AD-4Antigen nur in seiner vollständigen Struktur erkannten. In einem polyklonalen AD-4spezifischen Serum muss der Anteil an Antikörpern, die an Teilbereiche oder lineare Epitope
binden, sehr klein sein.
Abb. 7-3. Reaktivität von affinitätsgereinigten polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern mit N- und
C-terminalen gB- und AD-4-Verkürzungen. Nach transienter Transfektion von Cos7 Zellen mit den angegebenen
rekombinanten Proteinen wurde eine indirekte Immunfluoreszenz zur Detektion der Bindung durchgeführt. Die
Expression wurde über den anti-HA Antikörper nachgewiesen. Zellkerne wurde mit Dapi gefärbt.
7 Ergebnisse 63
Für polyklonale AD-1-spezifische Antikörper war bekannt, dass sie keine potente
Neutralisationskapazität aufweisen (Speckner et al., 1999). Da es aber AD-1-spezifische
Antikörper (hu-mAb 89-104) gibt, die HCMV effizient neutralisieren können, war dies ein
Hinweis dafür, dass während einer Infektion mit HCMV gegen das AD-1-Epitop sowohl
neutralisierende als auch nicht-neutralisierende Antikörper gebildet werden. Die
Neutralisationsaktivität von polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern sollte untersucht
werden (Abbildung 7-4). Dazu wurden poly AD-4, HCMV HIS oder der AD-2-spezifische humAb C23 mit HB15-UL84prluc für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden Fibroblasten
(MRC5) mit dem Antikörper-Virus-Gemisch infiziert. 48 h später wurde die Biolumineszenz
am Luminometer bestimmt und die %-Neutralisation in Abhängigkeit von der
Antikörperkonzentration berechnet (Abbildung 7-4 A). Bei einer Konzentration von 5 µg/ml
konnten AD-4-spezifische Antikörper HCMV zu 100% neutralisieren und der Wert für die
50%ige Neutralisation lag bei 0,6 µg/ml, was im Bereich von monoklonalen AD-4spezifischen Antikörpern lag (Tabelle 7-1). Das Hyperimmunserum inhibierte die Infektion
vollständig bei einer Konzentration von 1 mg/ml und neutralisierte 50% der Viren bei
170 µg/ml, was fast um den Faktor 300 schlechter war im Vergleich zu den polyklonalen
AD-4-spezifischen Antikörpern. Die Neutralisationskurve von hu-mAb C23 zeigte den
erwarteten Verlauf. Zudem wurden polyklonale AD-4-spezifische Antikörper auch aus dem
Serum eines einzigen HCMV-positiven Individuums isoliert und lieferten vergleichbare
Ergebnisse im Neutralisationstest (Daten nicht gezeigt). Der Neutralisationstest mit poly AD4 und hu-mAb C23 als Kontrolle wurde anschließend in Epithel- (ARPE19) und Endothelzellen
(HUVEC) durchgeführt. Als Virusstamm wurde TB40E verwendet, der im Gegensatz zu AD169
Epithel- und Endothelzellen infizieren kann. Infizierte Zellen wurden über IE-1-Färbung
nachgewiesen, gezählt und daraus die %-Neutralisation bestimmt. Auch in Epithel- und
Endothelzellen
zeigten
polyklonale
AD-4-spezifische
Antikörper
vergleichbare
Neutralisationsaktivitäten (Abbildung 7-4 B und C) wie AD-4-spezifische hu-mAbs (Tabelle
7-1). Daraus konnte geschlossen werden, dass gegen das AD-4-Epitop hauptsächlich
neutralisierende Antikörper induziert werden und nur geringe Mengen an nichtneutralisierenden Antikörpern. Darüber hinaus war die Neutralisationsaktivität von
affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern mit AD-4-Spezifität, soweit getestet, zelltypund virusstammunabhängig.
64 7 Ergebnisse
Abb. 7-4. Neutralisationskapazität von affinitätsgereinigten polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern. (A)
MRC5 Zellen wurden mit dem Antikörper-Virus Gemisch (AD169) infiziert und nach 48 h Inkubation erfolgte die
Auswertung am Luminometer. Aus den Biolumineszenzdaten wurde die %-Neutralisation bestimmt. (B und C)
Der Neutralisationstest wurde mit TB40E in Epithelzellen (B) und Endothelzellen (C) durchgeführt. Die
Auswertung erfolgte über Detektion von IE-1-positiven Zellen. Die Analysen wurde in Duplikaten durchgeführt
(+/- SD). Die Ergebnisse wurden in einem zweiten unabhängigen Experiment bestätigt. Hu-mAb C23 wurde als
Kontrollantikörper verwendet.
7.2.2 „Cell-Cell-Spread“-Test mit humanen AD-4-spezifischen Antikörpern
In den folgenden Versuchen wurde die Kapazität von humanen AD-4-spezifischen
Antikörpern, die zellassoziierte Ausbreitung von HCMV einzuschränken oder zu inhibieren,
untersucht. Die Experimente wurden sowohl mit monoklonalen als auch polyklonalen AD-4bindenden Antikörpern durchgeführt. Als Zielzellen wurden einerseits Fibroblasten (HFF)
und andererseits Epithelzellen (ARPE19) verwendet, da andere Gruppen zeigen konnten,
dass die Inhibierung von „Cell-Cell-Spread“ durch Antikörper zelltypspezifisch ist (Jiang et al.,
2008). Die Zellen wurden mit einer geringen moi TB40E infiziert (HFF: 0,002 moi; ARPE19: 0,5
moi) und nach 24 h wurden die Antikörper in einer Konzentration, bei der sie das Virus zu
100% neutralisieren, zugegeben. Untersucht wurden die „Cell-Cell-Spread“-inhibierenden
Eigenschaften von SM5-1, SM6-5, den affinitätsgereinigten polyklonalen AD-4-spezifischen
7 Ergebnisse 65
Antikörpern und zwei HCMV-Hyperimmunseren (HCMV HIS1, HCMV HIS2). Als Kontrolle
wurde das Potential, die zellassoziierte Ausbreitung von HCMV zu reduzieren, von hu-mAb
C23 analysiert. Hu-mAb C23 reduziert „Cell-Cell-Spread“ in HFF und Endothelzellen reduziert,
wobei der Effekt in HFF gering ist (Jiang et al., 2011). Über indirekte Immunfluoreszenz
gegen IE-1 wurden die infizierten Zellen gefärbt und die Plaquegröße in Fibroblasten 120 h
und in Epithelzellen 216 h nach Infektion bestimmt. Die Plaquegröße in der Viruskontrolle
(HFF: 10-32 Zellen pro Plaque; ARPE19: 14-33 Zellen pro Plaque) wurde auf 100% gesetzt
und mit den Infekten, die unter Antikörpereinfluss standen, verglichen. In Abbildung 7-5
wurde die Reduktion der Plaquegröße in Prozent dargestellt. Es konnte bestätigt werden,
dass in Fibroblasten hu-mAb C23 die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle nur in geringem
Maße inhibieren kann (Plaquereduktion: 25%), während in Epithelzellen die Plaquegröße um
ca. 70% reduziert werden konnte. Für die HCMV-Hyperimmunseren konnte in Fibroblasten
eine Plaquereduktion um 25-40% und in Epithelzellen um ca. 70% beobachtet werden. In
Fibroblasten und Epithelzellen konnte kein wesentlicher Unterschied zwischen polyklonalen
und monoklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern, die zellassoziierte Ausbreitung des Virus
zu inhibieren, detektiert werden (Fibroblasten: 40-45%; Epithelzellen: 60-70%). Der „CellCell-Spread“-Test verdeutlichte erneut, dass sich monoklonale und polyklonale AD-4spezifische Antikörper in ihren biologischen/antiviralen Eigenschaften nicht unterscheiden.
Abb. 7-5. Analyse zur Inhibierung der zellassoziierten Ausbreitung von HCMV durch Antikörper. HFF und
ARPE19 Zellen wurden mit dem Virusstamm TB40E infiziert und 24 h nach Infektion wurde jeweils der
angegebene Antikörper zugegeben. Ausgewertet wurde 120 h nach Infektion in HFF Zellen und 216 h nach
Infektion in ARPE19 Zellen. Infizierte Zellen wurden über indirekte Immunfluoreszenz gegen IE-1 nachgewiesen
66 7 Ergebnisse
und die Anzahl positiver Zellen in mindestens fünf Plaques bestimmt. HCMV HIS1/2: HCMV-Hyperimmunseren.
Kontrollantikörper: hu-mAb C23. Der Test wurde zweimal durchgeführt und SD ist angegeben.
7.3 Immunisierung von CD8-/- Mäusen mit gB und AD-4
Humane AD-4-spezifische Antikörper, die während einer Infektion mit HCMV induziert
werden, zeigten in vitro virusneutralisierende Eigenschaften im nanomolaren Bereich
(Abschnitt 7.1.). Einige ältere Studien beschäftigten sich mit der Induktion von gBspezifischen Antikörpern nach Immunisierung von Tieren (Britt, 1984; Britt & Auger, 1985;
Britt et al., 1988; Cranage et al., 1986; Gönczöl et al., 1986; Kniess et al., 1991; Pereira, 1982;
Rasmussen et al., 1985). Hierbei wurden zahlreiche gB-spezifische Antikörper generiert, die
virusneutralisierende Eigenschaften in vitro besaßen, jedoch war die Neutralisation meist
vom Komplement abhängig. Zudem waren diese Antikörper größtenteils gegen die
Untereinheit gp58 von gB, insbesondere gegen AD-1 gerichtet. Qadri et al. (1992) konnte
zeigen, dass einige komplementabhängige, virusneutralisierende Antikörper aus der Maus
eukaryont exprimierte N-terminale gB-Verkürzungen erkannten, welche die AD-4-Region
enthalten. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass man in tierexperimentellen Versuchen
neutralisierende, gB-spezifische Antikörper herstellen kann und diese auch an den
N-Terminus von HCMV gB binden können. Seren aus Mäusen, die mit in E. coli rekombinant
hergestellten Gesamt-gB immunisiert wurden, konnten HCMV auch komplementunabhängig
neutralisieren (Britt et al., 1988). Hier sollte untersucht werden, ob AD-4-spezifische
Antikörper nach Immunisierung von Mäusen mit rekombinant exprimierten gB und AD-4
induziert werden, und ob diese virusneutralisierende Eigenschaften, unabhängig von der
Zugabe von Komplement, besitzen.
7.3.1 Immunantwort nach Immunisierung
Für die Vakzinierungsstudien wurden CD8-/- Mäuse mit den rekombinant exprimierten
Antigenen gB (5 µg; Sanofi Pasteur, Marcy L’Etoile, Frankreich) und AD-4 als GSTFusionsprotein (30 µg bzw. 60 µg), wie im Methodenteil beschrieben, immunisiert. Zur
Kontrolle erfolgte eine Immunisierung der Mäuse mit GST (60 µg). Die Immunisierung wurde
in Zusammenarbeit mit Anna Bootz durchgeführt. Den Tieren wurde Serum abgenommen
und die induzierte Antikörperantwort analysiert. Zunächst wurden die einzelnen Seren in
einem ELISA auf Erkennung von antigenen Domänen von HCMV gB (AD-1, AD-2 und AD-4)
getestet (Abbildung 7-6). Dazu wurden die Seren 1:50 verdünnt und die Bindung mit einem
7 Ergebnisse 67
mausspezifischen,
HRP-gekoppelten
Sekundärantikörper
nachgewiesen.
Vor
der
Vakzinierung wurden den Tieren Seren abgenommen, von denen eins als Kontrolle
mitgeführt und von den OD-Werten abgezogen wurde. Für AD-1 wurden die OD-Werte des
Fusionspartners subtrahiert. Wie der ELISA zeigen konnte, waren alle Tiere mit dem
entsprechenden Antigen erfolgreich immunisiert worden. Durch die Immunisierung mit gB
konnten sowohl AD-1-, AD-2- als auch AD-4-spezifische Antikörper mit vergleichbarer
Effizienz induziert werden. Die Reaktivität mit AD-2 war nur mit einem Serum (gB#1) hoch
(Abbildung 7-6 A). In Abbildung 7-6 B wurden die Daten für die Vakzinierung mit 30 µg AD-4
dargestellt, da es keinen Unterschied zu den Seren gab, die von der Immunisierung mit 60 µg
AD-4 stammten (Daten nicht gezeigt). Wie erwartet wurden keine Antikörper gegen AD-1
und AD-2 gebildet, jedoch gegen AD-4 und GST. Nach dem Mann-Whitney-Test war die
Reaktivität von AD-4-Seren mit gB signifikant reduziert im Vergleich zu der Reaktivität mit
AD-4 (P=0,0286). Dies könnte bedeuten, dass durch die Immunisierung mit bakteriellem
AD-4-Fusionsprotein Antikörper induziert wurden, die gB nur zum Teil erkennen oder auch
eine geringere Affinität zu gB besitzen. Jedoch erfolgte die Beschichtung hier nicht äquimolar
(gB: 100 ng; AD-4: 100ng). Wie erwartet reagierten Seren aus GST-Immunisierung mit GST
und AD-4, nicht aber mit gB, AD-1 und AD-2 (Abbildung 7-6 C). Serum GST#2 zeigte
wiederholt Bindung an gB, diese Reaktion war wahrscheinlich unspezifisch oder es kann
nicht ausgeschlossen werden, dass das Tier mit GST in Berührung kam.
68 7 Ergebnisse
Abb. 7-6. Immunantwort nach Immunisierung von
CD8
-/-
Mäusen mit gB und AD-4. ELISA mit gB,
AD-1, AD-2 und AD-4 als Antigen. AD-1 und AD-4
wurden als bakterielle Fusionsproteine verwendet.
Seren wurden den Mäusen nach Immunisierung
mit 5 µg gB (A), 30 µg AD-4 (B) und 60 µg GST (C)
abgenommen. Die Seren wurden 1:50 verdünnt.
P<0,5 wurde mit Sternchen gekennzeichnet. Die
Ergebnisse
wurden
in
zwei
unabhängigen
Versuchen bestätigt.
7.3.2 Analyse zur Neutralisationskapazität von murinen Hyperimmunseren
Die Ergebnisse aus Abschnitt 7.3.1. zeigten, dass die Immunisierung von CD8-/- Mäuse mit
den
Antigenen
gB,
AD-4
und
GST
erfolgreich
war.
Anschließend
wurde
die
Neutralisationskapazität von den einzelnen murinen Hyperimmunseren untersucht. Der
Neutralisationstest wurde in Fibroblasten (MRC5) durchgeführt und als Virusstamm wurde
AD169 (HB15-UL84prluc) verwendet. Im Gegensatz zu den Analysen zur Neutralisationsaktivität von Seren aus immunisierten Tieren, die in der Literatur beschrieben wurden,
wurde hier kein Komplement zugesetzt. Nach Verdünnung der Seren wurde das Virus
zugegeben und die Zellen damit infiziert. Die Infektionsrate wurde über Biolumineszenz
gemessen und anschließend die %-Neutralisation bestimmt. Aus Abbildung 7-7 ist
ersichtlich, dass die murinen Hyperimmunseren bei keiner der getesteten Verdünnungen in
der Lage waren das Virus zu neutralisieren, unabhängig davon welches Antigen für die
Immunisierung verwendet wurde. Im selben Experiment wurde die Neutralisationsaktivität
7 Ergebnisse 69
von hu-mAb C23 als Kontrolle analysiert (Daten nicht gezeigt), die den Erwartungen
entsprach.
Abb. 7-7. Neutralisationskapazität von
murinen
Hyperimmunseren.
CD8
-/-
Mäuse wurden mit gB, AD-4 als GSTFusionsprotein oder GST immunisiert.
Die
Neutralisationskapazität
der
murinen Seren gegen den Virusstamm
AD169 wurde in Fibroblasten (MRC5)
bestimmt. Die Biolumineszenzsignale
infizierter Zellen wurden detektiert und
anschließend
die
%-Neutralisation
berechnet. Naiv: naives Mausserum.
Hu-mAb C23 wurde als Kontrolle
mitgeführt (Daten nicht gezeigt).
Im Folgenden wurden mögliche Gründe untersucht, warum murine Hyperimmunseren nicht
die Eigenschaft besitzen HCMV zu neutralisieren. Die intialen Ergebnisse aus Abbildung 7-5 B
konnten eindeutig zeigen, dass AD-4-spezifische Antikörper in Folge der Immunisierung
induziert wurden. Dennoch gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den anti-gBund anti-AD-4-Titern. Dies wies darauf hin, dass zwar Antikörper gegen prokaryont
exprimiertes AD-4 effizient induziert wurden, jedoch nur in geringen Mengen gegen GesamtgB. Es konnte nicht ausgeschlossen werden, dass das AD-4-Epitop in gB eine andere
Konformation einnimmt als im bakteriellen Fusionsprotein. Die jeweiligen Seren wurden
zunächst vereinigt und es wurde nochmals ein ELISA mit den Antigenen gB und AD-4
durchgeführt, dabei wurde diesmal im äquimolaren Verhältnis beschichtet (gB: 100 ng; AD-4:
16,7 ng). Für diese Analyse wurde AD-4 verwendet, dessen GST-Tag proteolytisch mit der
PreScission Protease abgespalten wurde. Die Seren wurden titriert und es wurde bei einer
1:500-Verdünnung begonnen (Abbildung 7-8). Dieses Experiment konnte zeigen, dass das
anti-AD-4-Serum nur geringe Mengen an Antikörpern, die gB binden können, enthält und der
Titer rasch abfällt, während das anti-gB-Serum noch bei einer Verdünnung von 1:100000 mit
gB reagiert (Abbildung 7-8 A). Das Gegenteil ließ sich im ELISA, in dem AD-4 als Antigen
verwendet wurde, beobachten. Der Titer des anti-gB-Serums fiel rasch ab und der Titer des
70 7 Ergebnisse
anti-AD-4-Serums sank im Verlauf der Titration nur sehr langsam (Abbildung 7-8 B). In
beiden Ansätzen zeigte das anti-GST-Serum keine Reaktion sowohl mit gB als auch mit AD-4.
Auch die OD-Werte der Anfangsverdünnung sprachen dafür, dass durch die Immunisierung
mit AD-4 nur ein Bruchteil der induzierten AD-4-spezifischen Antikörpern an gB binden
konnten, im Gegensatz zu dem anti-gB-Serum, das bei einer Verdünnung von 1:500 AD-4 mit
gleicher Effizienz erkannte wie das anti-AD-4-Serum.
Abb. 7-8. Titration der murinen Hyperimmunseren. gB (A) und AD-4 (B), dessen GST-Tag abgespalten wurde,
wurden als Antigene im ELISA verwendet. Das Ergebnis wurde in einem weiteren unabhängigen Versuch
bestätigt.
Diese Resultate sprachen dafür, dass eventuell Antikörper induziert wurden, die an andere
Epitope innerhalb von AD-4 als die SM-Antikörper oder poly AD-4 banden und diese nichtneutralisierend waren. Für die Neutralisationsaktivität ist es entscheidend, dass die
Antikörper die Konformation des AD-4-Epitops auf dem freien Virus erkennen und so das
Virus inaktivieren können. Aus diesem Grund wurde die Bindung der murinen
Hyperimmunseren an HCMV AD169 Viruspartikel (von Barbara Kropff zur Verfügung gestellt)
mittels Western Blot Analyse untersucht. Im Western Blot können hauptsächlich
konformationsunabhängige Epitope, also lineare Epitope, detektiert werden. Wie bereits
erwähnt, ist gB ein stark glykosyliertes Protein und für AD-4 wurden 2-3 potentielle NGlykosylierungsstellen vorhergesagt. In diesem Zusammenhang wurde die Erkennung von
viralem gB in glykosylierter und deglykosylierter Form durch die murinen Hyperimmunseren
analysiert, dazu wurde ein Teil der Viruspartikel mit PNGase F verdaut. Die Proteine wurden
zunächst mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine
Nitrozellulosemembran geblottet. Die gebundenen Antikörper wurden über den
7 Ergebnisse 71
entsprechenden
HRP-gekoppelten
Sekundärantikörper
nachgewiesen
und
das
Chemilumineszenzsignal detektiert. Zur Kontrolle wurden die Antikörper SM5-1 und 27-287,
ein muriner Antikörper gegen gp58 von gB (Utz et al., 1989), in die Analyse eingeschlossen
(Abbildung 7-9 A). SM5-1 ist ein konformationsabhängiger Antikörper, daher war es
verwunderlich, dass er im Western Blot mit der Untereinheit gp116 von gB reagierte. Eine
mögliche Erklärung ist, dass AD-4 auch unter reduzierenden Bedingungen dazu neigt sich
zurück zu falten. Nach Deglykosylierung von gp116 von gB müsste ein Protein, das ein
Molekulargewicht von 55 kDa besitzt, mit SM5-1 detektiert werden können, jedoch konnte
nur eine unspezifische Bande bei 40 kDa nachgewiesen werden. 27-287 erkannte die
Untereinheit gp58 von gB, deren Molekulargewicht nach Abspaltung der Zucker auf 40 kDa
reduziert wurde. Das anti-GST-Serum reagierte unspezifisch mit Virusproteinen. Das murine
anti-gB-Serum erkannte eine definierte Bande bei 55 kDa (gp58), nach dem Verdau mit
PNGase F wurde das Molekulargewicht der gp58 Bande auf 40 kDa reduziert (Abbildung 7-9
B). Des Weiteren konnte ein Schmier zwischen 130 und 110 kDa detektiert werden, welcher
der Untereinheit gp116 entsprechen könnte. Der Verdau mit PNGase F bewirkte auch hier
die Reduktion des Molekulargewichtes. Mit dem anti-AD-4-Serum konnte eine schwache,
unspezifische Reaktion mit HCMV-Partikeln detektiert werden, unabhängig davon ob die
Viruspartikel mit PNGase F inkubiert wurden. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die
Immunisierung mit AD-4 kaum Antikörper induzierte, die AD-4 auf viralem gB erkennen. Aus
diesem Grund war das anti-AD-4-Serum nicht in der Lage HCMV zu neutralisieren.
Immunisierung mit gB führte anscheinend hauptsächlich zur Produktion von Antikörpern, die
mit der gp58 Untereinheit reagierten, und diese besitzen keine virusneutralisierenden
Eigenschaften.
72 7 Ergebnisse
Abb.7-9. Western Blot Analyse mit murinen Hyperimmunseren. Es wurden jeweils 10 µl der Viruspartikelpräparation aufgetragen. Plus gibt an, dass die Partikel mit PNGase F behandelt wurden. Mit minus sind die
Spuren gekennzeichnet, bei denen die Viruspartikel nicht mit PNGase F verdaut wurden. Das Molekulargewicht
ist in kDa angegeben. (A) Kontrollantikörper: SM5-1, 27-287. (B) Murine Hyperimmunseren, die aus
Immunisierung mit GST, gB und AD-4 gewonnen wurden.
7.4 Identifizierung essentieller Aminosäurereste für die Antikörperbindung
In der vorliegenden Arbeit sollte das Epitop der SM-Antikörper im Detail charakterisiert
werden und Versuche dazu durchgeführt werden, ob zusätzliche antikörperbindende
Regionen auf AD-4 vorhanden sind. In die Analysen wurden SM-Antikörper, weitere humAbs mit AD-4-Spezifität, humane polyklonale AD-4-spezifische Antikörper und Seren von
HCMV-positiven Individuen eingeschlossen. Zudem wurden HCMV-Virusmutanten generiert
und es wurde die Neutralisationskapazität der AD-4-spezifischen Antikörper gegen diese
Virusmutanten getestet.
7.4.1 Bindungsspezifität von AD-4-spezifischen hu-mAbs
Zur Identifizierung kritischer AS für die Antikörperbindung wurde ein „Di-Alanin-Scan“
durchgeführt. Dabei handelte es sich nicht um einen traditionellen, systematischen
Aminosäureaustausch gegen Alanine, sondern um einen hypothesenbasierten Ansatz. Die
Hypothese war, dass an der Antikörperbindung nur AS beteiligt sind, die auf der Oberfläche
des gB Trimers exponiert sind.
7 Ergebnisse 73
Abb. 7-10. „Di-Alanin-Scan“ von AD-4. (A) Aminosäuresequenz des rekombinant exprimierten AD-4-Proteins
(oberste Sequenz) und 19 AD-4-Mutanten. In blau ist die Sequenz des synthetischen Linkers dargestellt. AS, die
zu Alaninen mutiert wurden, sind rot gekennzeichnet. Sternchen entsprechen identischen AS. (B) RibbonDarstellung von AD-4 und AD-4-Mutanten aus dem HCMV gB Modell. In rot wurden die mutierten AS als
Kalotten-Modell hervorgehoben. Die Strukturabbildungen wurden mit dem Programm PyMOL hergestellt.
Aus vorangegangenen Analysen konnten, nach transienter Expression von 17 AD-4Mutanten in Cos7 Zellen (Abbildung 7-10), die beiden Lysine an Position 378 und 379 als
74 7 Ergebnisse
essentiell für die Bindung von fünf der sechs getesteten SM-Antikörper identifiziert werden.
SM5-1 war der AD-4-spezifische Antikörper mit der besten Neutralisationskapazität und
dieser reagierte mit allen analysierten AD-4-Mutanten (Tschesnych, 2009). Dies deutete
darauf hin, dass es trotz klonaler Verwandtschaft Unterschiede zwischen den SMAntikörpern gibt und mehrere antikörperbindende Regionen auf AD-4 vorhanden sein
könnten. Pia Rücker und Prof. Heinrich Sticht (Institut für Biochemie, Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg) haben unter Verwendung des Modells von HCMV gB zwei
weitere AD-4-Mutanten vorgeschlagen, die Mutationen in der Nähe der beiden Lysine
trugen: YL364/76 und ES422/24 (Abbildung 7-10). Die mutierten AS und die Position innerhalb
von HCMV gB sind im Namen der Mutanten vermerkt.
Die beiden AD-4-Mutanten YL364/76 und ES422/24 wurden als HA-Fusionsproteine in Cos7 Zellen
transient exprimiert, dabei sorgte eine Signalsequenz am N-Terminus für die Translokation in
das Endoplasmatische Retikulum, und die Bindung der SM-Antikörper wurde mittels
indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen. Diese Analyse lieferte keine weiteren Hinweise
bezüglich der antikörperbindenden Region, da alle SM-Antikörper diese beiden Mutanten
erkannten (Daten nicht gezeigt). Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz beruht auf
einer subjektiven Auswertung der Daten und die Effizienz der Bindung kann nicht
quantifiziert werden. Aus diesem Grund sollte ein ELISA mit ausgewählten AD-4-Mutanten
die Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz verifizieren. Ausgewählt wurden solche
AD-4-Mutanten, die sowohl räumliche Nähe als auch Distanz zu dem „Di-Lysin-Motiv“
besaßen (Abbildung 7-11 A). Hierfür wurden zunächst die kodierenden DNA-Sequenzen von
sieben AD-4-Mutanten (ED359/62, KK378/79, QE380/81, NS383/85, NT405/06, ES422/24, YL364/76) in einer
PCR amplifiziert und in den prokaryonten Expressionsvektor pGEX-6-P1 kloniert, der die
Expression der AD-4-Mutanten als GST-Fusionsproteine ermöglichte. Im Anschluss wurden
die DNA-Sequenzen überprüft und die Bakterienklone zur Herstellung von rekombinanten
Proteinen verwendet. Die mutierten Proteine wurden in den Bakterien DH10B nach Zugabe
von IPTG rekombinant exprimiert und als GST-Fusionsproteine aus den Bakterienlysaten
gereinigt. Die AD-4-Mutanten wurden analog zu dem Reinigungsverfahren von AD-4
gereinigt. Die Reinheit der rekombinanten Fusionsproteine wurde nach SDS-PAGE über
Coomassieblue Färbung überprüft. In Abbildung 7-11 B sind exemplarisch die
Proteinpräparationen von AD-4 und sechs AD-4-Mutanten (KK378/79, YL364/76, ED359/62,
7 Ergebnisse 75
QE380/81, NS383/85, NT405/06) dargestellt. Die Proteinpräparationen bestanden zu ca. 90% aus
dem Fusionsprotein, das ein Molekulargewicht von 38 kDa besitzt, und wenigen
Degradationsprodukten. Die AD-4-Mutante ES422/24 wies einen vergleichbaren Reinheitsgrad
auf (Daten nicht gezeigt). Die Proteinmengen, die im ELISA eingesetzt wurden, wurden
vorher mit dem anti-GST Antikörper getestet. Die hergestellten Proteinlösungen wurden an
die ELISA-Platten über Nacht gekoppelt. Der Fusionspartner GST wurde als Referenz in die
Analyse mit einbezogen und dessen OD-Werte wurden bei der Auswertung subtrahiert. Die
Bindung der SM-Antikörper und des Kontrollantikörpers anti-GST an das beschichtete
Protein
wurde
durch
den
entsprechenden
HRP-gekoppelten
Sekundärantikörper
nachgewiesen. Der anti-GST Antikörper zeigte vergleichbare OD-Werte mit allen AD-4Mutanten, folglich wurde mit gleichen Mengen an funktionellem Protein beschichtet und
der Test konnte zur quantitativen Auswertung herangezogen werden (Abbildung 7-11 C). Die
Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz konnten bestätigt werden. Mit Ausnahme
von SM5-1 binden alle SM-Antikörper nicht an die Mutante KK378/79, wobei sie mit den
restlichen Mutanten reagieren. Für die Analyse mit transient exprimierten Proteinen in Cos7
Zellen wurde an Stelle von SM4-10 der klonal verwandte Antikörper SM4-5 verwendet und
dieser zeigte keine Reaktion mit KK378/79. Es wurde davon ausgegangen, dass SM4-10 und
SM4-5 sich in der Bindungsspezifität nicht unterscheiden, da nur geringe Sequenzunterschiede zwischen den beiden bestanden, die wahrscheinlich durch PCR-Amplifikation
des Klones SM4 entstanden. Wie der ELISA jedoch zeigen konnte, bindet SM4-10 an KK378/79
und dieses Ergebnis konnte auch in der indirekten Immunfluoreszenz bestätigt werden
(Daten nicht gezeigt). Interessanterweise reagierte SM1-6, SM3-1 und SM11-17 mit der AD4-Mutante YL364/76 mit einer geringeren Effizienz wie mit den restlichen Mutanten. Folglich
war eine oder waren beide mutierte AS an der Interaktion mit diesen SM-Antikörpern
beteiligt sein.
76 7 Ergebnisse
Abb. 7-11. Reaktivität von SM-Antikörpern mit AD-4-Mutanten. (A) Oberflächendarstellung (links) und RibbonDarstellung (rechts) von AD-4 aus dem HCMV gB Modell. Mutationen, die als prokaryont exprimierte Proteine
zur Verfügung standen, sind farblich gekennzeichnet. Schwarz: ED359/62, rot: KK378/79, blau: QE380/81, magenta:
NS383/85, gelb: NT405/06, türkis: YL364/76, braun: ES422/24. Strukturabbildungen wurden mit PyMOL generiert. (B)
SDS-PAGE von prokaryont exprimierten AD-4 und AD-4-Mutanten. Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
(C) ELISA mit prokaryont exprimierten AD-4 und AD-4-Mutanten. Die rekombinanten Proteine wurden aus
Bakterienlysaten als GST-Fusionsproteine gereinigt und auf Reaktivität mit SM-Antikörpern untersucht. AntiGST Antikörper wurde als Kontrolle für die Beschichtung verwendet.
Ausgehend
von
diesen
ELISA-Ergebnissen mit
den
AD-4-Mutanten
wurden die
Gleichgewichtskonstanten KD mittels „Surface Plasmon Resonance“ (SPR)-Analyse von SM5-1
und SM6-5 zu prokaryont exprimierten AD-4 und den Mutanten KK378/79 und YL364/76
bestimmt. Diese Versuche wurden in Kooperation mit 4-Antibody AG am Biacore T100 in
Jena durchgeführt. Für dieses Experiment wurden Fab-Fragmente von SM5-1 und SM6-5
7 Ergebnisse 77
verwendet. Die Proteine wurden an die Series S Sensor Chips CM5 gekoppelt. Auf den
Sensorchips
wurde
auch
jeweils
GST
als
Referenz
immobilisiert.
Verschiedene
Konzentrationen der Fab Fragmente wurden für die Bindung injiziert und die Dissoziation
wurde bei einem konstanten Fluss über einen Zeitraum von 600 sek detektiert. Für die
Auswertung der kinetischen Daten wurden zunächst die GST-Referenzwerte subtrahiert. Die
Auswertung der kinetischen Daten erfolgte nach dem 1:1 Bindungsmodell, aus dem die
Assoziationskonstante ka, Dissoziationskonstante kd und die daraus resultierende
Gleichgewichtskonstante KD bestimmt werden konnten. In Tabelle 7-2 wurden die
ermittelten Konstanten zusammengefasst. Die Bindung von SM5-1 an AD-4, KK378/79 und
YL364/76 konnte auch mittels SPR-Analyse nachgewiesen werden. Die Ergebnisse für SM6-5
aus indirekter Immunfluoreszenz und ELISA konnte auch über diese Methode bestätigt
werden: 1) Bindung an AD-4 und YL364/76; 2) keine Bindung an KK378/79. Beide Fab-Fragmente
zeigten eine vergleichbare Reaktivität mit gB und AD-4. Beide Antikörper weisen eine sehr
hohe Affinität zu ihrem Antigen auf, wobei SM5-1 mit einem KD-Wert von 10-11 M besonders
hohe Affinität zu gB und AD-4 besaß. Zudem lieferten die Daten den Hinweis, dass die
mutierten AS an der Antigen-Antikörper-Interaktion sowohl für SM5-1 als auch für SM6-5
beteiligt sein müssten, da die KD-Werte im Vergleich zu gB und AD-4 erhöht waren.
gB
ka [1/Msek] 4,25 x 105
SM5-1 kd [1/sek]
1,75 x 10-5
KD [M]
AD-4
KK378/79
YL364/76
2,94 x 106
3,13 x 104
4,90 x 105
1,29 x 10-4
1,84 x 10-3 1,57 x 10-2
4,12 x 10-11 4,37 x 10-11 5,86 x 10-8 3,19 x 10-8
ka [1/Msek] 6,34 x 104
SM6-5 kd [1/sek]
9,62 x 10-5
4,84 x 105
k. B.
2,27 x 104
5,08 x 10-4
k. B.
1,96 x 10-3
1,52 x 10-9
1,05 x 10-9
k. B.
8,63 x 10-8
KD [M]
Tab. 7-2. Kinetischen Daten aus den SPR-Analysen. Die Kinetik der Fab-Fragmente von SM5-1 und SM6-5 zu den
angegebenen Antigenen wurde unter Verwendung der SPR-Technologie ermittelt. ka Assoziationskonstante, kd
Dissoziationskonstante, KD Gleichgewichtskonstante, k. B. = keine Bindung. In eckigen Klammern ist die Einheit
angegeben.
Die Ergebnisse der SPR-Analyse ließen darauf schließen, dass die AS Y364, L376, K378 und
K379 an der Bindung von SM5-1 und SM6-5 an AD-4 beteiligt sein müssen. Auf Grund der
hohen Affinität von SM5-1 bestand die Möglichkeit, dass für die Bindung mehr als zwei AS
78 7 Ergebnisse
essentiell sind. In Folge dessen wurden zwölf weitere Mutanten hergestellt, die Mutationen
der bereits untersuchten AD-4-Mutanten trugen. In Tabelle 7-3 sind die neuen AD-4Mutanten (schwarz) angegeben, die Kombinationen der Mutanten KK378/79, QE380/81 und
YL364/76 waren. Die DNA-Sequenzen der Mutanten K378, K379 und KKQE378-81 wurden von der
Firma Life Technologies GmbH synthetisch hergestellt, die anschließend in den
Expressionsvektor pcUL132-sigHA kloniert wurden. Die restlichen Mutationen wurden über
die Methode der „Combained Chain Reaction“ (CCR) in die entsprechenden DNA-Sequenzen
eingebracht und wurden ebenfalls in den Expressionsvektor pcUL132-sigHA kloniert. Die
eingeführten Mutationen in die DNA-Sequenz wurden über Sequenzierungsanalysen
bestätigt. Für die Untersuchungen zur Bindung von SM-Antikörpern wurden die generierten
Plasmide in Cos7 Zellen transient transfiziert und 48 h nach Transfektion die Expression der
HA-Fusionsproteine in der indirekten Immunfluoreszenz nachgewiesen. Über die
Signalsequenz
des
UL132-Proteins
wurden
die
rekombinanten
Proteine
in
das
Endoplasmatische Retikulum transportiert. Die Expression jedes einzelnen Konstrukts wurde
über die Detektion des N-terminalen HA-Tags belegt (Daten nicht gezeigt). In die folgenden
Analysen wurden die Antikörper SM1-6, SM3-1, SM5-1 und SM6-5 eingeschlossen. Die
Eigenschaften von SM4-5/10 und SM11-17 wurden während der restlichen Arbeit aus
Mangel an Material nur sporadisch untersucht und werden nicht mehr erwähnt. Die
Ergebnisse der Immunfluoreszenz wurden in Tabelle 7-3 zusammengefasst. Der AS-Rest
K379 konnte als essentielle Kontakt-AS für die Bindung von SM1-6 und SM3-1 identifiziert
werden, die Mutation von K378 hingegen führt nicht zum Verlust der Bindung. Die
Reaktivität von SM6-5 war deutlich reduziert mit AD-4-Proteinen, die eine Mutation in K379
trugen. Es konnte keine Bindung von SM5-1 zu YKK364/78/79 detektiert werden und es war
eine eindeutig verringerte Reaktivität mit den AD-4-Mutanten YK364/79 und KKQE378-81 zu
beobachten. Zudem wurden die Resultate der vorhergehenden Experimente nochmals
bestätigt.
7 Ergebnisse 79
Mutante
KK378/79
QE380/81
K378
K379
YK364/79
YL364/76
YLK364/76/78
YLK364/76/79
LKK376/78/79
YKK364/78/79
KKQ378-80
KKE378/79/81
KQE378/80/81
KQE379-81
KKQE378-81
Sequenz
Antikörper
362DSYHFSSAKMTATFLSKKQENV383
SM1-6 SM3-1 SM5-1 SM6-5
****************KK****
******************QE**
****************K*****
*****************K****
**Y**************K****
**Y***********L*******
**Y***********L*K*****
**Y***********L**K****
**************L*KK****
**Y*************KK****
****************KKQ***
****************KK*E**
****************K*QE**
*****************KQE**
****************KKQE**
Tab. 7-3. Zusammenfassung der Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz mit transient transfizierten
Cos7 Zellen. In der linken Spalte sind die getesteten AD-4-Mutanten angegeben, in grau bereits untersuchte
Konstrukte und in schwarz neu generierte. Die zweite Spalte von links gibt einen Ausschnitt der AS-Sequenz der
AD-4-Mutanten an, in rot AS, die gegen Alanine ausgetauscht wurden. Cos7 Zellen wurden mit AD-4-Mutanten
transient transfiziert und 48 h nach Transfektion wurden Bindungsstudien mit vier SM-Antikörpern
durchgeführt. Bindung wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen. Grün symbolisiert Bindung,
gelb reduzierte Reaktivität und rot keine Bindung.
Wiederum wurden zur quantitativen Auswertung der Bindung die DNA-Sequenzen von fünf
AD-4-Mutanten (K378, K379, YK364/76, YKK364/78/79, KKQE378-81; Abbildung 7-12 A) in den
bakteriellen Expressionsvektor pGEX-6-P1 kloniert. Die rekombinanten Proteine wurden in
den Bakterien exprimiert und über ihren N-terminalen GST-Tag aus den Bakterienlysaten
gereinigt. Die Reinheit wurde mittels SDS-PAGE überprüft, auch hier konnten höchstens 10%
Kontamination durch Degradationsprodukte nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Im
ELISA wurde die Reaktivität von SM-Antikörpern zu AD-4 und seinen Derivaten untersucht
(Abbildung 7-12 B). Die Ergebnisse der indirekten Immunfluoreszenz ließen sich im ELISA
bestätigen. Während alle getesteten SM-Antikörper mit AD-4 und K378 reagierten, konnte
kein Signal mit den Mutanten YK364/79, YKK364/78/79 und KKQE378-81 detektiert werden. Es
konnte die Bindung von SM5-1 an K379 bestätigt werden, als auch der Verlust der Reaktivität
der restlichen SM-Antikörper mit dieser Mutante. K379 wurde als kritische Kontakt-AS für
die Antikörper SM1-6, SM3-1 und SM6-5 identifiziert. Für die Bindung von SM5-1 an AD-4
80 7 Ergebnisse
sind die AS Y364 und K379 (YK-Epitop) essentiell. Zudem ist die Bindung der SM-Antikörper
durch die Mutation KKQE378-81 beeinflusst, wobei diese Aminosäurereste, für sich
genommen, nicht kritisch sind.
Abb. 7-12. Analyse zur Erkennung von AD-4-Mutanten durch SM-Antikörper. (A) Ribbon-Darstellung von AD-4Mutanten, in rot hervorgehoben sind die mutierten AS als Kalotten-Modell. Die Strukturabbildungen wurden
mit PyMOL generiert. (B) ELISA mit bakteriell exprimierten GST-Fusionsproteinen als Antigen. Das Experiment
wurde in einem unabhängigen zweiten Versuch wiederholt und lieferte dieselben Befunde.
Anschließend stellte sich die Frage, war der Verlust der Bindung wirklich das Resultat der
fehlenden Kontakt-AS oder löste das Einführen der Mutationen strukturelle Veränderungen
innerhalb des AD-4-Epitops aus. Um diese Frage zu klären, wurde die Methode der
Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie angewandt. Mittels dieser Methode konnte
bestimmt werden, ob das Protein gefaltet vorliegt und die bekannten Sekundärstrukturen
gebildet werden. In Kooperation mit dem Lehrstuhl für Biotechnik (Uschi Diestel, FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg) wurden die CD-Spektren für folgende Proteine
aufgenommen: AD-4, K378, K379, KK378/79, QE380/81, YL364/76, YK364/79, YKK364/78/79 und KKQE378-81.
7 Ergebnisse 81
Die Proteine wurden nach Expression in DH10B Bakterien und Reinigung aus dem
Bakterienlysat gewonnen, dabei wurde der GST-Tag proteolytisch mit PreScission Protease
auf der Glutathione Sepharose 4B Matrix abgespalten. Um Verunreinigungen aus den
Lösungen zu entfernen, wurden die Proben mittels Anionenaustausch-Chromatographie final
gereinigt (siehe Abschnitt 7.5.1.). Die Proteinlösungen besaßen anschließend eine Reinheit
von ca. 98% (Insertionen Abbildung 7-13). Jeweils acht CD-Spektren wurden mit einem
Spektralpolarimeter über eine Brandbreite von 180-250 nm aufgenommen, gemittelt und
um den Hintergrundwert des Puffers korrigiert. In Abbildung 7-13 sind sechs der neun
aufgenommenen CD-Spektren beispielhaft dargestellt (AD-4, K378, K379, YK364/79, YKK364/78/79,
KKQE378-81). Das CD-Spektrum von AD-4 wies ein Minimum bei 209 nm und ein Maximum bei
190 nm auf. Diese Werte waren charakteristisch für gefaltete Proteine, deren Struktur aus
den Sekundärstrukturelementen anti-paralleles β-Faltblatt und α-Helix aufgebaut ist. Das
Modell von HCMV gB sagte ebenfalls diese Sekundärstrukturen für die Faltung von AD-4
voraus (Abbildung 7-10, S. 73). Die CD-Spektren aller AD-4-Mutanten unterschieden sich
nicht von dem Spektrum des AD-4 Proteins (Abbildung 7-13 und Daten nicht gezeigt), somit
war die Struktur der Mutanten aus den gleichen Sekundärstrukturelementen aufgebaut wie
Wildtyp AD-4. Größere strukturelle Veränderungen der AD-4-Mutanten konnten somit
ausgeschlossen werden. Der Verlust der Bindung an AD-4-Mutanten war folglich mit dem
Fehlen der Kontaktaminosäuren assoziiert.
82 7 Ergebnisse
Abb. 7-13. CD-Spektren von AD-4 und AD-4-Mutanten. Für die Aufnahme der Spektren wurden rekombinant
exprimierte Proteine verwendet, dessen GST-Tag proteolytisch abgespalten wurde. Als Insertion sind
Ergebnisse der SDS-PAGE der Proteine gezeigt. Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben. Elliptizität
entspricht der Einheit mdeg.
7.4.2 Analysen zur AD-4-Spezifität nach einer Infektion mit HCMV
Für die Bindung von SM-Antikörpern waren die AS Y364 und K379 essentiell. Die Kontakt-AS
für die Antikörperbindung sind in räumlicher Nähe auf der Oberfläche des HCMV gB Modells
7 Ergebnisse 83
lokalisiert. AD-4 ist aus über 100 AS aufgebaut und besitzt somit noch mehr
oberflächenexponierte Bereiche, die mit Antikörpern interagieren könnten. Im Folgenden
sollte analysiert werden, inwieweit es sich bei dem identifizierten Epitop (YK-Epitop)
innerhalb von AD-4 um eine dominante Erkennungssequenz handelt.
Während der B-Zell Repertoireanalyse gegen gB in infizierten Personen wurden noch weitere
hu-mAbs mit AD-4-Spezifität, abgesehen von den SM-Antikörpern, von Sonja Pötzsch isoliert
(Pötzsch, 2010). Sie müssten zusätzliche Informationen über die Epitope innerhalb von AD-4
liefern können, da sie aus drei unterschiedlichen Spendern stammten. Soweit Material
vorhanden
war,
wurden
sie
auf
Reaktivität
mit
AD-4-Mutanten
untersucht.
Zellkulturüberstände von insgesamt 19 aktivierten und immortalisierten Gedächtnis BZellen, die AD-4-spezifische IgGs produzierten, wurden abgenommen und auf Erkennung von
AD-4-Mutanten aus dem ersten Satz (Abbildung 7-10, S. 73) getestet. Weil nicht alle AD-4Mutanten als bakterielle GST-Fusionsproteine vorlagen, wurden Cos7 Zellen mit den
jeweiligen Plasmiden transient transfiziert und die Erkennung der jeweiligen AD-4-Mutanten
über indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. Die IgG-Konzentration der AD-4spezifischen Zellkulturüberstände wurde auf Konzentrationen von 0,5-1µg/ml eingestellt
oder sie wurden pur verwendet, falls die Konzentration des Zellkulturüberstandes darunter
lag. In Abbildung 7-14 A wurden die Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz
zusammengefasst.
84 7 Ergebnisse
Abb. 7-14. Reaktivität von humanen monoklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern mit AD-4-Mutanten.
(A) Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz. Nach transienter Transfektion von Cos7 Zellen mit dem
jeweiligen Plasmid wurde eine indirekte Immunfluoreszenz zum Nachweis der Antikörperbindung
durchgeführt. Plus bedeutet Erkennung der AD-4-Mutanten durch AD-4-spezifische Antikörper, minus und rot
zeigt keine Bindung von AD-4-spezifischen Antikörpern an die getesteten AD-4-Mutanten an. (B) ELISA mit
humanen monoklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern. Als Antigene wurden prokaryont exprimierte GSTFusionsproteine der AD-4-Mutanten verwendet. Die Beschichtung der Wells wurde mit dem anti-GST
Antikörper überprüft (Daten nicht gezeigt).
Für sechs der 19 untersuchten AD-4-spezifischen IgG-Zellkulturüberstände war die Mutation
der beiden Lysine an Position 378 und 379 kritisch. In räumlicher Nähe der kritischen AS im
HCMV gB Modell befinden sich auch die AS-Reste LR121/354, ED359/62, YL364/76 und
7 Ergebnisse 85
ES422/24, deren Mutation zum Verlust der Bindung von zwei Antikörpern führte. Die
besondere Bedeutung dieser Region innerhalb von AD-4 konnte hiermit bestätigt werden.
Für acht der analysierten Antikörper wurde die Interaktion durch Mutationen in AD-4 nicht
beeinflusst. Daraus können zwei Schlussfolgerung gezogen werden: 1) Antikörper binden an
das Epitop von SM5-1, das durch die getesteten Mutanten nicht erfasst wird oder 2) es gibt
noch weitere Epitope innerhalb von AD-4, die mit den vorhandenen AD-4-Mutanten nicht
erfasst wurden. Die Resultate aus der indirekten Immunfluoreszenz lieferten für die zweite
Hypothese Hinweise. Zwei Antikörper erkannten die Mutante RD393/94 nicht, dabei besitzt
von diesen beiden nur hu-mAb 3G11 virusneutralisierende Eigenschaften. Für einen
Antikörper konnte keine Reaktivität mit der Mutante IN397/98 nachgewiesen werden. Die
beiden zuletzt genannten Mutationen liegen im HCMV Modell in der α-Helix von AD-4,
während sich das Epitop der SM-Antikörper im Bereich der β-Faltblätter befindet (Abbildung
7-10 B, S. 73). Die erste Hypothese sollte in einem ELISA mit den AD-4-Mutanten untersucht
werden, die als bakterielle GST-Fusionsproteine zur Verfügung standen (Abbildung 7-14 B).
Aus Materialmangel konnten nur zehn der 19 AD-4-spezifischen Antikörper im ELISA getestet
werden. Es waren aber solche vertreten, für deren Bindung entweder die kritischen AS nicht
bekannt waren oder AS KK378/79 (2F11, 3G5, 4E3, 5C11) oder RD393/94 (3G11) essentiell
waren. Um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, wurde die IgG Konzentration der
Zellkulturüberstände und des Kontrollantikörpers SM5-1 auf 0,125 µg/ml eingestellt. Als
Beschichtungskontrolle wurde die Reaktivität mit dem anti-GST Antikörper überprüft (Daten
nicht gezeigt). Wie aus Abbildung 7-14 B ersichtlich, wurden die Ergebnisse aus der
indirekten Immunfluoreszenz bestätigt, da für die jeweiligen Antikörper keine Reaktivität mit
KK378/79 nachgewiesen werden konnte. Zudem korrelierte der Verlust/die Reduktion der
Reaktivität mit KK378/79 auch mit dem Verlust/der Reduktion der Bindung an Mutante K 379,
abgesehen von 2F11, der an K379 bindet aber nicht an KK378/79. Die Bindung der untersuchten
IgG-Zellkulturüberstände wurde durch die Mutation der AS QE380/81, YL364/76 und K378
nicht beeinflusst. Während noch drei der zehn getesteten IgG-Überständen mit Mutante
YK364/79 reagierten, konnte nur für einen einzigen Antikörper (3G11) eine Reaktivität mit den
Mutanten YKK364/78/79 und KKQE378-81 nachgewiesen werden. Somit war für sieben der zehn
getesteten Antikörper die Erkennungssequenz von SM5-1 kritisch für die Bindung an AD-4.
Die Ergebnisse aus der indirekten Immunfluoreszenz haben für 3G11 die α-Helix (RD393/94)
innerhalb von AD-4 als Epitop identifiziert. Im ELISA wurden keine weiteren Mutationen in
86 7 Ergebnisse
diesem strukturellen Bereich (α-Helix) untersucht, somit konnte für 3G11 eine Reaktivität
mit allen Mutanten im ELISA nachgewiesen werden. Insgesamt lässt sich sagen, dass nach
einer Infektion Antikörper induziert werden, die an unterschiedliche Regionen innerhalb von
AD-4 binden, dabei scheint das Epitop der SM-Antikörper dominant zu sein.
Als nächstes wurden polyklonale AD-4-spezifische Antikörper auf ihre Reaktivität mit den
generierten AD-4-Mutanten untersucht. Die Isolierung der polyklonalen Antikörper aus
einem Hyperimmunserum wurde bereits im Abschnitt 7.2.1. beschrieben. Mit diesem
Verfahren konnte AD-4-spezifisches IgG gewonnen werden. Als erstes wurde diese
affinitätsgereinigte IgG-Präparation auf Erkennung von sieben AD-4-Mutanten in einer
Einpunktmessung im ELISA getestet, die aus dem ersten Satz der Mutanten stammten und
als bakterielle GST-Fusionsproteine vorlagen (Abbildung 7-11 A, S. 76). Für poly AD-4 und
SM5-1 konnten vergleichbare OD-Werte für die untersuchten AD-4-Mutanten detektiert
werden, was zu der Schlussfolgerung führte, dass die mutierten Aminosäuren im
Wesentlichen nicht zur Interaktion mit polyklonalen AD-4-spezifischen Antiköpern beitrugen
(Abbildung 7-15 A). Als zweites wurde die Bindung von poly AD-4 an fünf weitere AD-4Mutanten, die in Abbildung 7-12 A (S. 80) dargestellt sind, im ELISA untersucht. Poly AD-4
und SM-Antikörper wurden diesmal 1:2 titriert, um zusätzliche Informationen aus dem
Kurvenverlauf zu erhalten. In Abbildung 7-15 B sind die Ergebnisse dokumentiert. Durch
Detektion des GST-Anteils konnte gezeigt werden, dass vergleichbare Mengen an GSTreaktivem Protein beschichtet wurden. Für die Antigene AD-4, K378 und K379 konnte, wie
erwartet, eine Bindung von SM5-1 beobachtet werden, wobei ein ähnlicher Kurvenverlauf
von poly AD-4 und SM5-1 beobachtet wurde. Der Bindungsverlust von SM5-1 an die
Mutanten YK364/79, YKK364/78/79 und KKQE378-81 konnte erneut bestätigt werden, wohingegen
für poly AD-4 eine Reaktivität mit diesen Mutanten detektiert werden konnte. Es konnte
gezeigt werden, dass eine affinitätsgereinigte polyklonale AD-4-spezifische IgG-Präparation
zusätzliche Regionen innerhalb von AD-4 erkennt, abgesehen von der Bindungsregion der
SM-Antikörper.
7 Ergebnisse 87
Abb. 7-15. Bindung von affinitätsgereinigten polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern an AD-4-Mutanten.
(A) Einpunktmessung der Reaktivität von poly AD-4 mit prokaryont exprimierten Fusionsproteinen, die aus
bakteriellen Lysaten durch Affinitätsreinigung gewonnen wurden (ELISA). Poly AD-4 und SM5-1 wurden bei
einer Konzentration von 0,5 µg/ml eingesetzt. (B) Konzentrationsabhängige Messung der Reaktivität von poly
88 7 Ergebnisse
AD-4 mit den angegebenen GST-Fusionsproteinen im ELISA. Gestrichelte Linie gibt OD-Wert des anti-GST
Antikörpers an.
Um Informationen über Spezifitäten von individuellen Seren zu bekommen, wurden 23
Seren von HCMV-positiven Personen auf die Erkennung von AD-4 und acht Mutanten
(KK378/79, K378, K379, QE380/81, YL364/76, YK364/79, YKK364/78/79 und KKQE378-81) untersucht. Die
Seren wurden in einer Verdünnung von 1:50 eingesetzt. Für dieses Experiment wurde nach
Affinitätsreinigung der Fusionsproteine aus den Bakterienlysaten der GST-Tag proteolytisch
abgespalten und die Proteine so im ELISA eingesetzt. Als Beschichtungskontrolle wurde die
Reaktivität aller Mutanten mit einem murinen Hyperimmunseren (Abschnitt 7.3.)
nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die OD-Werte für AD-4 wurden auf 100% gesetzt und in
Bezug darauf wurde die %-Reaktivität mit den Mutanten berechnet (Abbildung 7-16).
Generell wurde für alle Mutanten eine hoch signifikante Reduktion in der 100%igen
Erkennung beobachtet. Willkürlich wurde ein Referenzpunkt bei einer 50%igen Reaktivität
festgelegt und es wurde der Anteil an Seren errechnet, der über dem Referenzwert lag
(Prozentangaben unter dem Graphen in Abbildung 7-16). Der Prozentuale Verlustanteil an
Serenreaktivität korrelierte mit dem identifizierten Epitop auf AD-4, hierbei waren die
identifizierten essentiellen AS entscheidend für die Bindung der Seren. Während nur 4% der
Seren weniger als 50%-Reaktivität mit K378 zeigten, ließ sich eine Reaktivität von >50% nur
für 57% der getesteten Seren mit der Mutante KKQE378-81 nachweisen. Diese Ergebnisse
sprachen dafür, dass in Seren aus HCMV-positiven Individuen ein beträchtlicher Anteil an
SM-artigen Antikörpern enthalten ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die AS-Reste, die für die Bindung von SMAntikörpern essentiell sind, wichtig sind für die AD-4-gerichtete Antikörperantwort gegen gB.
Die Reaktivität sowohl von weiteren humanen monoklonalen AD-4-spezifische Antikörpern
als auch von humanen polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern war abhängig von
demselben Erkennungsmuster, das für SM-Antikörper ermittelt wurde.
7 Ergebnisse 89
Abb. 7-16. Reaktivität von Seren aus HCMV
positiven Individuen mit AD-4-Mutanten. ELISA
mit angegebenen AD-4-Mutanten und AD-4.
GST-Tag wurde vorher proteolytisch abgespalten. Die Reaktivität zu AD-4 wurde auf
100% gesetzt und die Reaktivität mit AD-4Mutanten
dazu
in
Bezug
gesetzt.
Die
gestrichelte Linie liegt bei 50%-Reaktivität.
Prozentualer Anteil der Seren, die über der
50%igen Reaktivität liegen, ist angegeben
(unten). Die Seren wurden 1:50 verdünnt. Die
statistische Auswertung erfolgte über den
t-Test. ** entspricht P<0,005 und *** P<0,0005.
7.4.3 Generierung und Replikationskapazität von AD-4-Virusmutanten
Die vorhergehenden Ergebnisse konnten für die Bindung von AD-4-spezifischen Antikörpern
essentielle AS innerhalb von AD-4 identifizieren. CD-Spektroskopie konnte zeigen, dass die
strukturelle Faltung der rekombinant exprimierten AD-4-Proteine durch die Einführung der
Mutationen nicht beeinflusst war. Was die Einführung dieser Mutationen auf viraler Ebene
bewirkte, wurde im Folgenden analysiert. Diese Versuche sollten unter anderem
verdeutlichen, ob die Mutation der AS Y364, K378, K379, Q380 und E381 zur
Beeinträchtigung wichtiger Funktionen während der Virusreplikation führt. Es war natürlich
nicht auszuschließen, dass in Folge der Mutagenese replikationsunfähige Viren entstehen.
Insgesamt wurden neun rekombinante Viren generiert, die Mutationen im AD-4kodierenden Bereich trugen (Tabelle 7-4, S. 92). Die Mutationen wurden in das Genom des
Virusstammes TB40E eingeführt. TB40E wurde ausgewählt, da dieser Stamm im Gegensatz
zu AD169 Epithel- und Endothelzellen infizieren kann. „Markerless Mutagenesis“ wurde als
Methode für die Herstellung von mutierten viralen Genomen verwendet, die von Tischer et
al. (2006) beschrieben wurde. Die Durchführung erfolgte, wie im Methodenteil im Abschnitt
6.3.12. dargestellt ist.
90 7 Ergebnisse
Anschließend wurde die Replikationskapazität der generierten AD-4-Virusmutanten
untersucht. Dazu wurden HFF Zellen infiziert und die Zellkulturüberstände am Tag 1, 4, 7, 11
und 13 nach Infektion geerntet. Die Virustiter der Zellkulturüberstände wurden in MRC5
Zellen nach indirekter Immunfluoreszenz gegen IE-1 ermittelt. Die Replikationskinetik konnte
nicht für alle Viren simultan durchgeführt werden, in einem Test waren 3-5 Viren involviert
und die Replikation jedes Virus wurde mindestens zweimal analysiert. Als Kontrolle wurde
jeweils die Replikationskapazität des Wildtyp Virus TB40E (RV TB40) bestimmt. Mit
Ausnahmen von RV gB-YKK364/78/79 erreichten alle mutierten Viren einen vergleichbaren
finalen Virustiter an Tag 13 nach Infektion,. Für RV gB-YKK364/78/79 war der Virustiter an Tag
13 nach Infektion um den Faktor 1000 erniedrigt im Vergleich zu Wildtyp RV TB40
(Abbildung 7-17 A/B). Zudem ließ sich eine verlangsamte Replikationskinetik für die AD-4Virusmutanten beobachten, bei denen die AS Y364 gegen ein Alanin ausgetauscht war
(Abbildung 7-17 B). Insgesamt lässt sich sagen, dass rekombinante Viren generiert werden
konnten, die Mutationen in der AD-4-kodierenden Region Mutationen trugen.
Abb. 7-17. Replikationskapazität von AD-4 Virusmutanten. Nach Infektion von HFF Zellen wurden die
Zellkulturüberstände an den angegebenen Tagen geerntet. Färbung der IE-1-positiven Zellen diente als
Nachweis für die Infektion. IU = „Infectious Units“. (A) Replikationskapazität von rekombinanten Viren, bei
denen AS Y364 nicht mutiert wurde. (B) Replikationskapazität von rekombinanten Viren, die eine Mutation an
Position Y364 tragen. Titer von 2-8 unabhängigen Experimenten +/- SD angegeben.
7 Ergebnisse 91
7.4.4 Neutralisation von AD-4-Virusmutanten durch AD-4-spezifische Antikörper
Sowohl SM-Antikörper als auch die affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper mit AD-4Spezifität besaßen Eigenschaften zur Neutralisation von freiem Virus (Abschnitt 7.2.1.). Die
für die Antikörperbindung essentiellen AS wurde im Virusstamm TB40E zu Alanin mutiert
(Abschnitt 7.4.3.) und nun wurde untersucht, ob die identifizierten kritischen AS für die
Neutralisation von freiem Virus entscheidend sind. Es wurde die Neutralisationskapazität
von humanen polyklonalen und monoklonalen Antikörpern (SM-Antikörper) gegen die AD-4Virusmutanten analysiert. Der AD-2-spezifische Antikörper C23 wurde jeweils als Kontrolle
verwendet, dessen Neutralisationsaktivität durch die eingeführten Mutationen nicht
beeinflusst sein durfte. Die Neutralisationstests konnte nicht alle gleichzeitig durchgeführt
werden, deswegen wurde in jedem Experiment die Neutralisationskapazität der Antikörper
gegen RV TB40 bestimmt.
Zunächst wurde die Neutralisationskapazität von vier SM-Antikörpern (SM1-6, SM3-1, SM5-1
und SM6-5) gegen die AD-4-Virusmutanten analysiert. Dazu wurden Antikörper und Viren für
1 h inkubiert und anschließend wurden HFF Zellen mit dem Antikörper-Virus-Gemisch
infiziert. Das Inokulum wurde nach 4 h entfernt und 24 h später eine indirekte
Immunfluoreszenz zum Nachweis von infizierten Zellen durchgeführt. Die Anzahl der
infizierten Zellen wurde ermittelt und daraus %-Neutralisation in Abhängigkeit von der
Konzentration der Antikörper bestimmt. In Abbildung 7-18 und Tabelle 7-4 wurden die
Ergebnisse zusammengefasst. Die Neutralisationsaktivität der SM-Antikörper gegen RV TB40
war vergleichbar mit den bisherigen Ergebnissen (Pötzsch et al., 2011), da für SM5-1, SM6-5
und C23 50% des eingesetzten Virus bei einer IgG Konzentration von 0,1-0,3 µg/ml
neutralisiert wurden und für SM1-6 und SM3-1 bei 0,6-0,8 µg/ml. Außerdem wurde RV TB40
bei Antikörperkonzentrationen von 5 µg/ml zu 100% neutralisiert. Des Weiteren wurde die
Neutralisationsaktivität des AD-2-spezifischen hu-mAb C23 gegen alle AD-4-Virusmutanten,
wie erwartet, durch die Mutationen nicht beeinflusst. Somit konnte der Einfluss der
schlechteren
Replikationskinetik
mancher
Virusmutanten
auf
die
Neutralisation
ausgeschlossen werden. Die Neutralisationskapazität der SM-Antikörper gegen die AD-4Virusmutanten ließ sich in zwei Gruppen einteilen: SM1-6, SM3-1 und SM5-1, SM6-5 zeigten
jeweils vergleichbare Reaktivitäten. Für SM1-6 und SM3-1 gab es keine nennenswerten
Veränderungen der 50%igen Neutralisationskonzentrationen (IC50) gegen die Virusmutanten
RV gB-K378 und RV gB-QE380/81, jedoch wurde ein Plateau bei 50-80% in der
92 7 Ergebnisse
Neutralisationsaktivität bei einer IgG-Konzentration von 5 µg/ml erreicht. Auch höhere
Antikörperkonzentrationen (10 µg/ml; RV gB-QE380/81) konnten diesen Effekt nicht beheben
(Daten nicht gezeigt). IC50 wurde für die restlichen AD-4-Virusmutanten für SM1-6 und
SM3-1 nicht erreicht. Die AD-4-Virusmutanten RV gB-K378 und RV gB-QE380/81 wurden von
SM5-1 und SM6-5 mit vergleichbarer Effizienz wie RV TB40 neutralisiert. Die restlichen
Mutationen hatten jedoch einen Effekt auf die Neutralisationskapazität von SM5-1 und
SM6-5, wenn auch Unterschiede zwischen den Viren bestanden. Durch die Mutation der AS
Y364 (RV gB-Y364, RV gB-YL364/76) waren zwar die IC50-Werte nicht stark beeinflusst, jedoch
wurden bei einer Konzentration von 5 µg/ml nur 80% der Viren neutralisiert. Für die
Virusmutanten RV gB-K379 und RV gB-KK378/79 stieg der IC50-Wert um den Faktor 10 an und es
konnte keine Neutralisation der Viren RV gB-YK364/79, RV gB-YKK364/78/79 und RV gB-KKQE378-81
beobachtet werden. Diese Befunde konnten eindeutig zeigen, dass das identifizierte
Erkennungsmuster, das kritisch ist für die Bindung von SM-Antikörpern, auch für deren
Neutralisationskapazität ausschlaggebend ist.
SM1-6 SM3-1 SM5-1 SM6-5 poly-AD-4 C23
RV TB40
0,77
0,64
0,21
0,30
1,92
0,14
RV gB-K378
0,84
1,10
0,39
0,40
n. b.
0,26
RV gB-K379
>5
>5
2,86
>5
7,35
0,30
RV gB-KK378/79
>10
>5
4,20
>10
n. b.
0,23
RV gB-QE380/81
1,23
2,86
0,30
0,39
n. b.
0,22
RV gB-Y364
>5
>5
0,61
0,75
n. b.
0,18
RV gB-YL364/76
>5
>5
0,76
0,81
n. b.
0,40
RV gB-YK364/79
>5
>5
>5
>5
8,18
0,37
RV gB-YKK364/78/79
>10
>5
>10
>10
>10
0,40
RV gB-KKQE378-81
>10
>10
>10
>10
>10
0,19
Tab. 7-4. 50%ige Neutralisationsaktivität (IC50) von SM-Antikörpern. Die linke Spalte führt die generierten Viren
auf, die auf der genetischen Ebene des Virusstammes TB40E basierten. Die IgG Konzentration des IC50-Wertes
ist in µg/ml angegeben. Grün: IC50<5/10µg/ml, rot: IC50>5/10 µg/ml, n. b.: nicht bestimmt.
7 Ergebnisse 93
94 7 Ergebnisse
Abb. 7-18. Neutralisation von AD-4-Virusmutanten durch SM-Antikörper. HFF Zellen wurden mit AntiköperVirus-Gemisch infiziert und die infizierten Zellen über indirekte Immunfluoreszenz gegen IE-1 nachgewiesen.
C23 diente als Kontrolle. %-Neutralisation wurde errechnet. Die Analysen wurden in Duplikaten durchgeführt
(+/- SD). Die Ergebnisse konnten in einem weiteren unabhängigen Versuch reproduziert werden.
Die Neutralisationskapazität von poly AD-4 war im Bereich des Neutralisationspotentials der
SM-Antikörper. Zudem ergab die Analyse von poly AD-4, dass gegen AD-4-Antikörper mit
weiteren Spezifitäten gerichtet sind, abgesehen von dem identifizierten YK-Epitop. Es sollte
untersucht werden, ob die Neutralisationskapazität von polyklonalen AD-4-spezifischen
Antikörpern hauptsächlich mit dem Vorhandensein von SM-artigen Antikörpern assoziiert ist
oder ob Antikörper mit zusätzlichen Spezifitäten ebenfalls das Virus neutralisieren können.
Methodisch wurde derselbe Neutralisationstest, der indirekte Immunfluoreszenz als
Nachweis von infizierten Zellen nutzt, durchgeführt. C23 und SM5-1 fungierten hier als
Kontrollantikörper. In Abbildung 7-19 wurde das Neutralisationspotential der untersuchten
Antikörper dargestellt. Die Ergebnisse für RV TB40 waren vergleichbar mit den früheren
Ergebnissen (Pötzsch et al., 2011 und Abschnitt 7.2.1.). Für C23 und SM5-1 konnten die
Ergebnisse aus vorhergehenden Versuchen reproduziert werden (siehe oben), wobei SM5-1
hier das Virus RV gB-YK364/79 bei einer IgG Konzentration von 4,62 µg/ml zu 50%
neutralisierte. Die Neutralisationskapazität (IC50=400 µg/ml) des Hyperimmunserums war
vergleichbar für alle getesteten Viren. Für die Virusmutanten RV gB-K379 und RV gB-YK364/79
wurde ein IC50-Wert erreicht, der um das 4-fache erhöht war im Vergleich zu
RV TB40.
Auch polyklonale AD-4-spezifische Antikörper zeigten Verlust in Neutralisations-kapazität
gegen die Virusmutanten RV gB-YKK364/78/79 und RV gB-KKQE378-81, indem bei einer IgG
Konzentration von 10 µg/ml die 50%ige Neutralisation nicht erreicht wurde. Diese
Ergebnisse ließen darauf schließen, dass die Neutralisationskapazität einer polyklonalen
AD-4-spezifischen IgG-Präparation sich größtenteils aus dem Neutralisationspotential von
SM-artigen Antikörpern zusammensetzt.
7 Ergebnisse 95
Abb. 7-19. Neutralisation von AD-4-Virusmutanten durch affinitätsgereinigte polyklonale AD-4-spezifische
Antikörper (poly AD-4). HFF Zellen wurden mit Antiköper-Virus-Gemisch infiziert und die infizierten Zellen über
indirekte Immunfluoreszenz gegen IE-1 nachgewiesen. C23 und SM5-1 dienten als Kontrolle. %-Neutralisation
wurde rechnerisch ermittelt. Die Analysen wurden in Duplikaten durchgeführt (+/- SD). Die Ergebnisse wurden
in einem zweiten unabhängigen Test bestätigt.
Ausgehend von den vorgehenden Ergebnissen (Abbildung 7-19) sollte untersucht werden, ob
eine polyklonale IgG-Präparation, die keine SM-artigen Antikörper enthält, TB40E
neutralisieren kann. Dazu wurde das Protein YKK364/78/79 in E. coli rekombinant exprimiert,
über den GST-Tag affinitätsgereinigt und an AminoLink Plus Agarosekügelchen kovalent
gekoppelt. Diese Matrix wurde für die Isolierung von polyklonalen AD-4-spezifischen
96 7 Ergebnisse
Antikörpern verwendet, die das Epitop von SM-Antikörpern nicht erkennen (poly
YKK364/78/79). Parallel wurde dieser Versuchsaufbau für eine neue polyklonale AD-4spezifische IgG-Präparation (poly AD-4) durchgeführt. Die IgG-Präparationen wurden auf
Erkennung der Antigene AD-4 und YKK364/78/79 im ELISA untersucht. Abgesehen von den
polyklonalen IgG-Präparationen wurden HCMV HIS vor (prae) und nach (post) Isolierung von
AD-4/YKK364/78/79-spezifischen Antikörpern untersucht. Wie erwartet reagierte SM5-1 mit
AD-4, jedoch nicht mit YKK364/78/79 (Abbildung 7-20). Die IgG-Präparationen erkannten
sowohl AD-4 als auch YKK364/78/79, was dem Nachweis der erfolgreichen Isolierung aus dem
Hyperimmunserum diente. HCMV HIS prae reagierte ebenfalls mit beiden Antigenen,
wohingegen HCMV HIS post AD-4 keine Bindung an beide Antigene zeigte. Für HCMV HIS
post YKK364/78/79 konnte beobachtet werden, dass es mit AD-4 eine reduzierte Reaktivität im
Vergleich zu HCMV HIS prae aufwies, aber es konnte keine Reaktivität mit YKK364/78/79
detektiert werden. Diese Ergebnisse wurden als indirekter Nachweis der Spezifitäten in den
IgG-Präparationen interpretiert. Poly YKK364/78/79 beinhaltete AD-4-spezifische Antikörper, die
an das Epitop der SM-Antikörper nicht binden können, und poly AD-4 enthielt das gesamte
Spektrum an AD-4-spezifischen Antikörpern.
Abb.
7-20.
polyklonalen
Reaktivität
von
AD-4-spezifischen
Antikörpern. Polyklonale AD-4spezifische Antikörper wurden
aus HCMV HIS isoliert. Für die
Isolierung wurden als Antigen
AD-4 und YKK364/78/79 eingesetzt.
Im ELISA wurden AD-4 (A) und
YKK364/78/79
(B)
Fusionsproteine
als
GST-
verwendet.
Gestrichelte Linie gibt OD-Wert
des anti-GST Antikörpers an.
7 Ergebnisse 97
Anschließend wurde erneut ein Neutralisationstest unter Verwendung der Viren RV TB40
und RV gB-YKK364/78/79 mit der bekannten Methode durchgeführt (Abbildung 7-21). Hu-mAb
C23, der als Kontrolle für dieses Experiment diente, neutralisierte RV TB40 und RV gBYKK364/78/79 mit vergleichbarer Effizienz. Wie erwartet besaß SM5-1 virusneutralisierende
Eigenschaften gegen RV TB40, jedoch nicht gegen RV gB-YKK364/78/79. Für die AD-4spezifischen IgG-Präparationen poly AD-4 und poly YKK364/78/79 konnte eine vergleichbare
Neutralisationskapazität gegen RV TB40 detektiert werden, jedoch konnten sie das Virus bei
einer IgG Konzentration von 10 µg/ml nicht vollständig neutralisieren. Beide zeigten Verlust
an Neutralisationspotential gegen RV gB-YKK364/78/79, wobei poly YKK364/78/79 im Gegensatz zu
poly AD-4 bei einer IgG Konzentration von 8 µg/ml 50% des Virus neutralisieren konnte.
Diese Ergebnisse konnten die Annahme nicht bestätigen, dass das Neutralisationspotential
einer polyklonalen IgG-Präparation mit AD-4-Spezifität von SM-artigen Antikörpern
bestimmt wird. Es konnte gezeigt werden, dass es weitere Epitope auf AD-4 geben muss, an
die Antikörper mit virusneutralisierenden Eigenschaften binden. Desweiteren bestätigten
diese Versuche die Ergebnisse aus der indirekter Immunfloureszenz (Abschnitt 7.4.2.): für die
Bindung von neutralisierenden AD-4-spezifischen hu-mAbs (nicht SM-Antikörper) ist das YKEpitop nicht allein ausschlaggebend.
Abb. 7-21. Neutralisationskapazität von polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern. poly AD-4 und poly
YKK364/78/79 unterscheiden sich in ihrer Spezifität, indem poly YKK 364/78/79 keine SM-artigen Antikörper
beinhaltet. Als Zielzellen für den Neutralisationstest wurden HFF Zellen verwendet. Infizierte Zellen wurden
über indirekte Immunfluoreszenz nachgewiesen. Als Kontrollantikörper wurden C23 und SM5-1 eingesetzt. Die
Analysen wurden in Duplikaten durchgeführt (+/- SD). Die Ergebnisse wurden in einem zweiten unabhängigen
Experiment bestätigt.
98 7 Ergebnisse
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Summe an AD-4-spezifischen Antikörpern
(polyklonal und monoklonal) HCMV effizient neutralisieren kann, dabei ist die
Neutralisationskapazität unabhängig von Zelltyp und Virusstamm. Für die Bindung von SMAntikörpern sind die AS-Reste Y364 und K379 essentiell. Die Serumreaktivität von HCMVpositiven Individuen und die Reaktivität einer AD-4-spezifischen polyklonalen IgGPräparation sind ebenfalls abhängig von dem YK-Epitop, das somit ein dominantes Epitop
innerhalb von AD-4 ist. Die Analyse der Neutralisationsaktivität von SM-Antikörpern gegen
virale Mutanten, die Mutationen der kritischen Kontaktaminosäuren besaßen, ergab, dass
Antikörperbindung mit dem Neutralisationspotential korreliert. Die Neutralisationskapazität
von poly AD-4 ist auch signifikant reduziert durch die Mutation der AS Y364 und K379. Das
YK-Epitop ist folglich auch ein dominantes Epitop bezüglich der Induktion von
neutralisierenden Antikörpern. Desweiteren konnten auf AD-4 weitere antikörperbindende
Regionen identifiziert werden, die neutralisierende Antikörper binden.
7.5 Kristallstrukturanalysen zu AD-4, SM5-1Fab und AD-4 im Komplex mit SM5-1Fab
Für HSV-1 und EBV sind die Kristallstrukturen von gB bekannt (Backovic et al., 2009;
Heldwein et al., 2006). Die Struktur von HCMV gB wurde noch nicht bestimmt, es konnte
aber mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass HCMV gB ebenfalls Trimere
ausbildet und eine ähnliche strukturelle Gestalt wie HSV-1 und EBV gB besitzt (Sharma et al.,
2013). Die bisherigen Daten der vorliegenden Arbeit haben wichtige Erkenntnisse über
funktionelle Epitope auf AD-4 geliefert. Die Gesamtheit der Antigen-Antikörper-Interaktion
wurde damit aber sicher nicht charakterisiert; dies ist nur durch Strukturaufklärung möglich.
Mutationen außerhalb der strukturell bestimmten Antikörperbindestellen können die
Reduktion der Bindungsaffinität oder der Neutralisationskapazität bewirken (Li et al., 2011).
Daher sollte auch das strukturelle Epitop eines AD-4-spezifischen Antikörpers mit dem
Antigen definiert werden. Als Nebeneffekt würden sich auch Aussagen zur Qualität des
HCMV gB Modells ergeben, mit dessen Hilfe die bisherigen Ergebnisse erzielt wurden.
Alle Experimente zur Kristallisation und Strukturklärung wurden in Kooperation mit Prof.
Yves Muller und Uschi Diestel (Lehrstuhl für Biotechnik, Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg) durchgeführt.
7 Ergebnisse 99
7.5.1 Kristallstruktur von AD-4
Abb. 7-22. Experimentelles Vorgehen zur
Reinigung und Strukturaufklärung von AD-4.
Zur Lösung der Kristallstruktur von AD-4 sollte das Protein möglichst rein vorliegen. Für die
Kristallstrukturanalysen wurde AD-4 als prokaryont exprimiertes Protein verwendet. Ein
Schema der Herstellung und des Reinigungsprozesses ist in Abbildung 7-22 dargestellt. Die
Durchführung zur Expression des Fusionsproteins und die Abspaltung des GST-Tags wurde
bereits in Abschnitt 7.4.1. beschrieben. In Kürze, die Expression wurde durch Zugabe von
IPTG induziert und es folgte eine Affinitätsreinigung über den GST-Tag, der im Folgenden
durch Inkubation mit PreScission Protease abgespalten wurde, da der GST-Tag bei der
Aufklärung der Kristallstruktur stören könnte und Kristallkeimbildung kleinerer Proteine in
der Regel begünstigt ist. Die Reinheit der Proteinpräparationen wurde jeweils über SDSPAGE überprüft. Die Reinigung wurde mehrmals durchgeführt und im Folgenden ist eine
AD-4-Reinigung exemplarisch dargestellt.
100 7 Ergebnisse
Abb. 7-23. SDS-PAGE der Affinitätsreinigung und GST-Abspaltung
von AD-4. Die Proben wurden während der Reinigung entnommen
und auf eine nicht reduzierende SDS-PAGE aufgetragen. Es wurden
jeweils 9 µl der Proben aufgetragen. Lysat: Bakterienlysat, n. B.:
nach Bindung, G.: Glutathione, n. S.: nach Spaltung. Das
Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
In der SDS-PAGE enthielt die Eluatfraktion neben der Bande für AD-4 (13 kDa) noch
Kontaminationen von GST (25 kDa) und des Fusionsproteins (38 kDa) (Abbildung 7-23), um
diese zu entfernen wurde eine Anionenaustausch-Chromatographie durchgeführt. Um eine
gute Bindung an die Säule zu gewährleisten, wurde der theoretische pI von AD-4 (=5,01)
rechnerisch ermittelt und die Proteinlösung gegen den Bindepuffer dialysiert. Nach Bindung
des Proteins an die Säule und einem Waschschritt wurde AD-4 über 20 Säulenvolumen (SV)
mit einem linearen Gradienten von 0-80% des Elutionspuffers in einem Fraktionsvolumen
von 1 ml eluiert. Das Elutionsprofil lieferte einen Peak in den Fraktionen 3-10 (Abbildung 724 A). Die Peakfraktionen wurden mittels SDS-PAGE auf Reinheit untersucht (Abbildung 7-24
B). In den Eluaten 3-7 wurde nur eine einzige Bande bei 13 kDa detektiert. Fraktionen 8-10
wiesen Verunreinigungen mit GST-Protein auf, da GST und das Fusionsprotein einen
niedrigeren pI als AD-4 besitzen, waren für deren Eluation höhere Konzentrationen an NaCl
notwendig.
7 Ergebnisse 101
Abb. 7-24. Anionenaustausch-Chromatographie von AD-4. (A) Elutionsprofil der AnionenaustauschChromatographie am ÄKTA Purifier. Als Chromatographiesäule wurde HiTrapQ FF (1 ml), als Bindepuffer
HiTrapQ Puffer A und als Elutionspuffer HiTrapQ Puffer B verwendet. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen.
(B) Coomassieblue Färbung einer reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 7 µl der 1ml-Fraktionen 3-10
aufgetragen. Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
Anschließend wurde eine Größenausschluss-Chromatographie durchgeführt, um Aggregate
und Multimere aus der Proteinlösung zu entfernen. Dazu wurden aus der AnionenaustauschChromatographie die Eluatfraktionen 3-7 vereinigt, ankonzentriert und für die finale
Reinigung eingesetzt. Nach Äquilibrierung der Säule wurde die Probe auf die Säule geladen
und die enthaltenen Proteine nach Größe über 1,5 SV aufgetrennt und in 2 ml-Fraktionen
eluiert. Die eingesetzte AD-4-Präparation beinhaltete nur geringe Mengen an aggregierten
Proteinen oder Verunreinigungen (Fraktionen 27-34, Daten nicht gezeigt) und eine
dominante Fraktion an monomerem AD-4 (13 kDa) (Fraktionen 35-40), wie aus dem
Elutionsprofil und der Analyse über SDS-PAGE ersichtlich wurde (Abbildung 7-25 und Daten
nicht gezeigt). Die Fraktionen 35-40 wurden vereinigt, ankonzentriert und dabei gleichzeitig
gegen 20 mM Tris pH 7,4 umgepuffert. Die Proteinkonzentration wurde am NanoDrop
bestimmt. Die Proteinlösungen, die für die Kristallisation eingesetzt wurden, hatten eine
Konzentration von 11,4-12,0 mg/ml. Je nach Präparation schwankte die Ausbeute an AD-4
zwischen 1,8 und 4,7 mg pro 1 l Bakterienkultur.
102 7 Ergebnisse
Abb. 7-25. Größenausschluss-Chromatographie von AD-4. (A) Elutionsprofil der GrößenausschlussChromatographie am ÄKTA Purifier. HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade wurde als Säule und
Gelfiltrationspuffer als Laufpuffer verwendet. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue
Färbung einer reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 7,5 µl der 2 ml-Eluatfraktionen 34-41 aufgetragen.
Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
Die Kristallbildung konnte unter mehreren Bedingungen, die hohe Salzkonzentrationen
enthielten, beobachtet werden (Abbildung 7-26 A und Daten nicht gezeigt). Für AD-4 und die
nachfolgenden Kristallstrukturanalysen wurde jeweils ein Datensatz an Beamline 14.1
(Berliner Elektronen-Speicherring Gesellschaft für Synchrotronstrahlung mbH, „BESSY“,
Berlin) generiert und als Methode zur Strukturaufklärung wurde generell „Molecular
Replacement“ verwendet. AD-4 lag als monomeres Protein in der asymmetrischen Einheit
vor. Die Kristallstruktur von AD-4 wurde bei einer Auflösung von 1,76 Å gelöst (Abbildung 726 B), dabei diente der homologe Bereich von HSV-1 gB (Heldwein et al., 2006) als Modell.
Abb. 7-26. Strukturanalyse von AD-4. (A) Proteinkristall von AD-4. Kristallisationsbedingung: 1,5 M Li2SO4, 0,1 M
Na-HEPES, pH 7,5. (B) Kristallstruktur von AD-4 als Ribbon-Darstellung. Für die Lösung der Struktur wurde als
Methode „Molecular Replacement“ angewandt und als Modell wurde der homologe Bereich von HSV-1 gB
(Heldwein et al., 2006; pdb ID: 2GUM) verwendet. Pink: synthetischer Linker. (C) Überlagerung des Modells von
HCMV gB (AD-4 Region) mit Kristallstruktur von AD-4 als „Tube-Modell“. Grau: Modell, grün: Kristallstruktur
(pink: synthetischer Linker). Lage der Seitenketten im Vergleich, Modell vs. Kristallstruktur, am Beispiel von
K379 (rechts). Blau: Modell, rot: Kristallstrukur. Für die Darstellung der Strukturen wurde PyMOL verwendet.
In Abbildung 7-26 C (links) ist eine Überlagerung der AD-4-Kristallstruktur mit dem AD-4Bereich aus dem HCMV gB Modell dargestellt. Wie aus der Abbildung ersichtlich, ist eine
Korrespondenz der beiden Strukturen weitgehend gegeben. Prof. Heinrich Sticht führte
zudem eine bioinformatische Kalkulation des „Root Mean Square Deviation“ (rmsd)-Wertes
7 Ergebnisse 103
für das Proteinrückgrat durch, mit dem die Genauigkeit eines Modells bestimmt werden
kann. Daraus ergab sich ein rmsd-Wert von 2 Å, was der erwarteten Genauigkeit eines
Modells entspricht. Obwohl eine generelle Übereinstimmung in der Topologie gegeben ist,
treten dennoch Abweichungen in der Orientierung der Seitenketten auf, wie am Beispiel von
K379 gezeigt (Abbildung 7-26 C, rechts).
7.5.2 Kristallstruktur von SM5-1Fab
Für die Herstellung und Reinigung von SM5-1Fab wurden zwei Strategien verfolgt. Die erste
Strategie war die rekombinante Expression in Bakterien und in der zweiten Strategie sollte
SM5-1Fab durch Verdau eines IgG Moleküls mittels Papain gewonnen werden. Aufgrund des
unterschiedlichen Ursprungs wurden verschiedene Methoden zur Reinigung des FabFragmentes
angewandt.
Das
experimentelle
Vorgehen
Strukturaufklärung von SM5-1Fab ist in Abbildung 7-27 dargestellt.
zur
Präparation
und
104 7 Ergebnisse
Abb. 7-27. Schema zur Präparation und Strukturaufklärung von SM5-1Fab. Es wurden zwei Strategien zur
Herstellung und Reinigung verfolgt. Links: prokaryont exprimiertes Fab-Fragment; rechts: Fab-Fragment durch
Spaltung von IgG.
Für die Herstellung eines Fab-Fragmentes in E. coli wurde eine gängige Methode angewandt,
bei der die beiden Ketten zunächst co-exprimiert werden, mit anschließender Sekretion der
beiden Ketten in das bakterielle Periplasma (Kipriyanov, 2002; Plückthun et al., 1990; Skerra,
1993). Dort herrschen oxidierende Bedingungen, welche die kovalente Verknüpfung
zwischen der leichten und schweren Kette durch eine Disulfidbrücke ermöglichen. Das
Konstrukt war wie in Abbildung 7-28 dargestellt aufgebaut. Für die bicistronische Expression
der leichten (VλCλ) und schweren Kette (VHCH) wurden die Nukleotidsequenzen optimiert für
E. coli „Codon Usage“ und die kodierenden Sequenzen auf einem Plasmid nacheinander
angeordnet, wobei ein RBS-Spacer zwischen den beiden Sequenzen für die erneute Bindung
der ribosomalen Untereinheiten sorgte. Die ompA Signalsequenz ermöglichte die
Translokation der beiden Ketten in das bakterielle Periplasma (Movva et al., 1980).
Zusätzlich enthielt das Konstrukt eine Erkennungssequenz für die Protease Thrombin und
einen Serin-Threonin-Linker, der als Abstandshalter fungierte.
Abb. 7-28. Konstrukt zur Expression von SM5-1Fab als His-Fusionsprotein in Bakterien. Die Nukleotidsequenz
für das Expressionskonstrukt von SM5-1Fab wurde von der Firma Life Technologies GmbH (Regensburg)
synthetisiert. ompA: Signalsequenz (MKKTAIAIAVALAGFATVAQA); Vλ: variable Region der leichten Kette; Cλ:
konstante Region der leichten Kette; STOP: Stopsequenz; RBS-Spacer: Shine-Dalgarno-Sequenz (5’AGGAGGTNNNNNN-3’); VH: variable Region der schweren Kette; CH: konstante Region der schweren Kette (CH1),
Ser/Thr: Serin-Threonin-Linker, Thrombin: Erkennungssequenz für die Protease Thrombin, 6xHis: His-Tag.
Für die Herstellung von prokaryont exprimierten Fab-Fragment im Großmaßstab wurden
zwei Strategien verfolgt: 1) Expression in Schüttelkolben, 2) Fermentation im Techfors S 30 l
Fermenter. Die Fermentation wurde unter der Anleitung von Dr. Thomas Simon bei der
Firma Diarect AG in Freiburg durchgeführt. Bei der bakteriellen Fermentation konnte jedoch
kein Fab-Fragment für die Kristallisation gewonnen werden. Die Expression in Schüttelkolben
lieferte letztendlich 20 mg SM5-1Fab als His-Fusionsprotein. Die einzelnen Schritte sind im
Folgenden dargestellt. Durch Zugabe von 1 mM IPTG wurde die Fab-Expression induziert und
7 Ergebnisse 105
die Bakterien nach Inkubation für 4 h bei 30°C mittels Zentrifugation geerntet. Die
Periplasmafraktion wurde mit der 3-fachen Menge (w/v) an Periplasmapuffer aus den
Bakterien extrahiert und der Extrakt gegen Bindepuffer dialysiert. Auf diese Weise konnte
aus insgesamt 30 l Bakterienkultur 390 ml (vor Dialyse) bzw. 640 ml (nach Dialyse)
Periplasmaextrakt erhalten werden. Die Periplasmafraktion wurde zur Reinigung über eine
Affinitätschromatographie an Ni-Agarose eingesetzt. Die Säule wurde mit Bindepuffer
äquilibiert, das His-Fusionsprotein an die Säule gebunden und nach einem Waschschritt
wurde SM5-1Fab über 20 SV mit einem linearen Gradienten von 0-60% des Elutionspuffers in
1ml-Fraktionen eluiert. In Abbildung 7-29 A ist ein Elutionsprofil als Beispiel gezeigt. Die
Eluate 2-17 wurden mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 7-29 B und Daten nicht gezeigt).
Alle analysierten Eluatfraktionen enthielten das gewünschte Produkt mit einem
Molekulargewicht von 40 kDa. Es konnten zudem geringe Verunreinigungen mit bakteriellen
Proteinen und Kontaminationen mit einzelner leichter und schwerer Kette, wie eine Western
Blot Analyse ergab (Daten nicht gezeigt), detektiert werden.
Abb. 7-29. Affinitätschromatographie von SM5-1Fab an Ni-Agarose. (A) Elutionsprofil der Affinitätsreinigung
am ÄKTA Purifier. Säule: HisTrap FF (1 ml), Bindepuffer: HisTrap Puffer A, Elutionspuffer: HisTrap Puffer B. Blau:
Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue Färbung einer nicht reduzierenden SDS-PAGE. Es
wurden jeweils 7,5 µl der 1 ml-Eluatfraktionen 2-15 aufgetragen. Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
106 7 Ergebnisse
Aus der Affinitätsreinigung an Ni-Agarose wurden die Eluatfraktionen 1-19 vereinigt und eine
Kationenaustausch-Chromatographie durchführt. Die Reinigung über einen Kationenaustauscher diente zur Entfernung von kontaminierenden Proteinen und Resten von Phosphat, das
unlösliches Ca3(PO4)2 unter den nachfolgenden Bedingungen bilden würde. Um die Bindung
an die äquilibrierte Säule zu ermöglichen, wurde die Proteinlösung gegen den Bindepuffer
dialysiert. Die Bindebedingungen wurde festgelegt über die Bestimmung des theoretischen
pI von SM5-1Fab (pI=9,06). Nachdem SM5-1Fab an die Säule gebunden hatte und die Säule
gewaschen wurde, wurde mittels eines linearen Gradienten von 0-100% Elutionspuffer in 1
ml-Fraktionen eluiert, was in einem Peak von Fraktion 8 bis 17 resultierte. Der Proteingehalt
der Eluate 7-18 wurde in der SDS-PAGE analysiert (Abbildung 7-30 A und B). Die Bande für
SM5-1Fab (40 kDa) konnte in den analysierten Fraktionen detektiert werden, des Weiteren
konnten auch hier die Banden für die einzelnen Ketten beobachtet werden (Western Blot
Analyse, Daten nicht gezeigt). Die Eluate 7-18 wurden vereinigt und für die Abspaltung des
His-Tags gegen „Cleavage buffer“ dialysiert.
Abb. 7-30. Kationenaustausch-Chromatographie von SM5-1Fab. (A) Elutionsprofil der KationenaustauschChromatographie am ÄKTA Purifier. Säule: HiTrapSP FF (1 ml), Bindepuffer: HiTrapSP Puffer A, Elutionspuffer:
HiTrapSP Puffer B. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue Färbung einer nicht
7 Ergebnisse 107
reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 7,5 µl der 1 ml-Eluatfraktionen 7-18 aufgetragen. (C) Western Blot
Analyse nach Abspaltung des His-Tags von SM5-1Fab. Es wurde jeweils 1 µg Probe aufgetragen und das
Fusionsprotein mit dem anti-6-His Antikörper nachgewiesen, der wiederum über einen HRP-gekoppelten
Sekundärantikörper detektiert wurde. Das Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
Für die Abspaltung des His-Tags mit immobilisiertem Thrombin wurden 2 mg von SM5-1Fab
als His-Fusionsprotein eingesetzt. Die Spaltung wurde nach Anleitung des Herstellers
durchgeführt, dabei wurde die Probe über 24 h mit der Thrombinagarose bei 4°C inkubiert.
Die Spalteffizienz wurde über eine Western Blot Analyse überprüft (Abbildung 7-30 C).
Während für die unbehandelte Probe ein eindeutiges Chemilumineszenzsignal detektiert
werden konnte, erschien nach Inkubation mit Thrombinagarose nur eine schwache Bande
bei 40 kDa. Die Western Blot Analyse konnte zeigen, dass der His-Tag mit hoher Effizienz
abgespalten wurde.
Als finaler Reinigungsschritt für SM5-1Fab wurde eine Größenausschluss-Chromatographie
durchgeführt. Die Säule wurde mit Laufpuffer äquilibriert, die Proteinlösung auf die Säule
geladen und die Proteine nach Größe in 2 ml-Fraktionen aufgetrennt. Das Elutionsprofil und
die SDS-PAGE der Eluate 21-25 und 28-34 zeigten (Abbildung 7-31), dass die Proteinlösung
aus monomerem SM5-1Fab bestand (Fraktion 28-34) und nur wenige kontaminierende
Aggregate beinhaltete (Fraktionen 21-24). Die Eluatfraktionen 28-34 wurden vereinigt,
ankonzentriert und in 20 mM Tris pH 8,0 umgepuffert. Für die Kristallisation hatte die
Proteinlösung eine Konzentration von 12,05 mg/ml.
108 7 Ergebnisse
Abb. 7-31. Größenausschluss-Chromatographie von SM5-1Fab. (A) Elutionsprofil der GrößenausschlussChromatographie am ÄKTA Purifier. Säule: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade, Laufpuffer:
Gelfiltrationspuffer. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue-Färbung einer nicht
reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 10 µl der 2 ml-Eluatfraktionen 21-25 und 28-34 aufgetragen. Das
Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
SM5-1 IgG, das durch rekombinante Expression in eukaryonten Zellen produziert wurde,
wurde von der Firma 4-Antibody AG (Jena) zur Verfügung gestellt. Über die Spaltung des IgG
Moleküls mit Papain wurde das Fab-Fragment hergestellt. Für die Papain-Spaltung wurde
der Pierce Fab Preparation Kit von Thermo Fisher Scientific benutzt. 5 mg SM5-1 wurden
jeweils mit 250 µl Papain-Sepharose für 7-8 h bei 37°C inkubiert. Anschließend folgte eine
Reinigung über Protein A Agarose, um ungespaltenes IgG und Fc-Fragment zu entfernen. Die
Spaltung wurde mittels reduzierender SDS-PAGE überprüft (Abbildung 7-32 A). Durch die
Inkubation mit Papain konnte SM5-1 IgG in die beiden Fab-Fragmente (reduzierende SDSPAGE: Bande bei 20 kDa) und den Fc-Teil (reduzierende SDS-PAGE: Bande bei 30 kDa)
gespalten werden. Das IgG Molekül wurde nicht vollständig gespalten, weil nach der
Spaltung eine Bande der schweren Kette des IgG-Moleküls bei 50 kDa (reduzierende SDSPAGE) detektiert werden konnte. Wie aus einer Western Blot Analyse hervorging, wurde
ungespaltenes IgG und Fc-Fragment durch die Reinigung über Protein A vollständig entfernt
7 Ergebnisse 109
(Abbildung 7-32 B). In der Fab-Fraktion und in der Waschfraktion konnte, im Gegensatz zum
IgG Eluat, keine Bande für den Fc-Teil (30 kDa) und die schwere Kette des IgG Moleküls (50
kDa) detektiert werden.
Abb. 7-32. Präparation von SM5-1Fab über Papain-Spaltung von SM5-1 IgG. (A) Kontrolle der Papain-Spaltung
über eine reduzierende SDS-PAGE. (B) Western Blot Analyse nach Reinigung über Protein A. Säule: HiTrap
Protein A HP (1 ml), Laufpuffer: 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, Elutionspuffer: 0,2 M Glyzin, pH 3,0.
Der Proteinnachweis erfolgte über ein HRP-gekoppeltes anti human IgG (Fc-spezifisch) F(ab´)2-Fragment. Das
Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
Im Anschluss wurde das Fab-Fragment über die Größenausschluss-Chromatographie am
ÄKTA Purifier gereinigt. Der Äquilibrierung folgte die Beladung der Säule und die Elution über
1,5 SV. Das Eluat wurde in 2 ml-Fraktionen gesammelt. Wie aus dem Elutionsprofil
ersichtlich, wies die eingesetzte SM5-1Fab-Proteinlösung bereits einen hohen Reinheitsgrad
auf (Abbildung 7-33 A). Über SDS-PAGE konnte SM5-1Fab in den Eluatfraktionen 29-35
nachgewiesen werden (Abbildung 7-33 B und Daten nicht gezeigt). Die Eluate, die SM5-1Fab
enthielten, wurden vereinigt, ankonzentriert, umgepuffert in 20 mM Tris pH 8,0 und zur
Kristallisationsanalyse eingesetzt. Die Proteinlösung besaß eine Konzentration von
9,70 mg/ml. Aus 10 mg SM5-1 IgG konnte mit diesem Verfahren in unterschiedlichen
Experimenten zwischen 1,85 und 3,26 mg SM5-1Fab hergestellt werden.
110 7 Ergebnisse
Abb. 7-33. Größenausschluss-Chromatographie von SM5-1Fab nach Papain-Spaltung. (A) Elutionsprofil der
Größenausschluss-Chromatographie am ÄKTA Purifier. Säule: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade,
Laufpuffer: Gelfiltrationspuffer. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue-Färbung einer
nicht reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 10 µl der 2 ml-Eluatfraktionen 29-33 aufgetragen. Das
Molekulargewicht ist in kDa angegeben.
Beide SM5-1Fab Präparation wurden auf ihre neutralisierende Aktivität untersucht
(Abbildung
7-34).
So
konnte
festgestellt
werden,
ob
die
unterschiedlichen
Herstellungsverfahren zu Produkten mit unterschiedlichen Eigenschaften führten und ob das
Fab-Fragment ebenfalls virusneutralisierende Aktivität besitzt. Beide Fab-Fragmente wurden
einerseits in Medium und andererseits in Medium, dem ein anti-Fab Antikörper zugegeben
wurde, verdünnt. Der Anti-Fab Antikörper sollte die Kreuzvernetzung der Fab-Fragmente
bewirken. Als Kontrolle wurde die Neutralisationskapazität der Antikörper SM5-1 und C23
analysiert. Die beiden Fab-Präparationen von SM5-1 unterschieden sich in ihrer
Neutralisationskapazität nicht. Beide zeigten eine 50%ige Neutralisation bei einer
Proteinkonzentration von 0,7 µg/ml und es trat ein Plateau bei 80% Neutralisation auf.
SM5-1Fab konnte HCMV (RV TB40) nicht zu 100% neutralisieren. Im Gegensatz dazu
bewirkte die Kreuzvernetzung des Fab-Fragmentes durch einen Antikörper, dass der IC50Wert sich zu Proteinkonzentrationen um 0,3 µg/ml verschob und HCMV bei 5 µg/ml
7 Ergebnisse 111
vollständig neutralisiert wurde. Die beiden Fab-Präparationen besaßen virusneutralisierende
Eigenschaften, die sich jedoch von denen eines IgG Moleküls unterschieden. Folglich ist
SM5-1Fab in der Lage die Infektion zu verhindern, allerdings nicht komplett. Für vollständige
(100%ige) Neutralisation ist die Vernetzung der Fab-Fragmente notwendig. Zudem konnte
aus diesem Experiment geschlossen werden, dass beide Fab-Präparationen an virales gB
binden.
Abb. 7-34. Neutralisationskapazität von SM5-1Fab aus unterschiedlichen Herstellungsverfahren. HFF Zellen
wurden mit dem Antikörper-Virusgemisch infiziert und zum Nachweis der infizierten Zellen wurde eine
indirekte Immunfluoreszenz durchgeführt. SM5-1Fab (prok): Fab-Fragment aus bakterieller Expression,
SM5-1Fab (Pap): Fab-Fragment durch Spaltung von IgG. Die Analysen wurden in Duplikaten durchgeführt (+/SD). Die Ergebnisse wurden in einem zweiten unabhängigen Experiment bestätigt.
Um die Kristallisationsbedingungen für SM5-1Fab zu kennen und um strukturelle
Veränderungen nach Bindung an AD-4 bestimmen zu können, sollte auch die Kristallstruktur
für SM5-1Fab gelöst werden. Zu diesem Zweck wurden beide Präparationen von SM5-1Fab
(prok und Pap) verwendet. Beide Proteinlösungen führten zur Kristallbildung (Abbildung
7-35 A und Daten nicht gezeigt). Ein Datensatz zur Strukturaufklärung wurde jedoch nur für
SM5-1Fab (Pap) generiert. Die Auflösung lag bei 1,87 Å und SM5-1Fab lag als monomeres
Protein in der asymmetrischen Einheit vor. Für die Bestimmung der Kristallstruktur wurde als
Modell ein humanes Fab-Fragment, das gegen gp120 von HIV-1 gerichtet ist (Huang et al.,
2004), ohne CDR-Bereiche („Complementarity Determining Region“), verwendet (Abbildung
7-35 B/C). Auffällig an der Struktur war der lange „Loop“ von HCDR3 mit 24 AS (Pötzsch et
112 7 Ergebnisse
al., 2011), der aufgrund der gering definierten Elektronendichte in seiner Konformation/Lage
flexibel sein muss (Abbildung 7-35 B und C).
Abb. 7-35. Strukturanalyse von SM5-1Fab. (A) Proteinkristall von SM5-1Fab (Pap). Kristallisationsbedingung:
4 M Natriumformiat. (B) Kristallstruktur von SM5-1Fab (Pap) als Ribbon-Darstellung. Für die Lösung der
Struktur wurde als Methode „Molecular Replacement“ angewendet und als Modell ein humanes anti HIV-1
gp120 Fab-Fragment (Huang et al., 2004; pdb ID: 1RZF), ohne CDR-Bereiche, verwendet. Gelb: variable (Vλ) und
konstante (Cλ) Region der leichten Kette, blau: variable (VH) und konstante (CH1) Region der schweren Kette. Die
CDRs sind in unterschiedlichen Farben markiert und in (C) vergrößert dargestellt. LCDR: CDR der leichten Kette,
HCDR: CDR der schweren Kette. Orange: CDR1, grau: CDR2, rot: CDR3. PyMOL wurde zur Darstellung der
Strukturen eingesetzt.
7.5.3 Kristallstruktur von AD-4 im Komplex mit SM5-1Fab
Das eigentliche Ziel war die Strukturaufklärung von AD-4 im Komplex mit SM5-1Fab, um die
Antigen-Antikörper-Interaktion auf struktureller Ebene zu charakterisieren. Die SPR-Analyse
ergab für die Interaktion von AD-4/SM5-1Fab („Pap“) eine Gleichgewichtskonstante KD von
4,37 x 10-11 M (Tabelle 7-2, S. 77). Die Gleichgewichtskonstante zeigte, dass SM5-1Fab mit
sehr hoher Affinität an AD-4 bindet, was eine wichtige Voraussetzung für die Bildung und die
Stabilität des Komplexes ist.
7 Ergebnisse 113
Abb.
7-36.
Experimentelles
Vorgehen
zur
Präparation und Strukturaufklärung des Komplexes
AD-4/SM5-1Fab.
Das experimentelle Vorgehen zur Präparation und Strukturaufklärung des Komplexes
AD-4/SM5-1Fab ist in Abbildung 7-36 schematisch dargestellt. Die einzelnen Komponenten
wurden, wie vorher in den Abschnitten 7.5.1 und 7.5.2. beschrieben, gereinigt. Für die
Bildung des Komplexes wurde SM5-1Fab und die doppelte Menge (w/w) an AD-4 gemischt.
Nach einer Inkubation über Nacht bei 4°C wurde eine Größenausschluss-Chromatographie
durchgeführt, dabei wurde wie in vorhergehenden Experimenten vorgegangen. Ein
Elutionsprofil ist in Abbildung 7-37 A exemplarisch dargestellt. Die Peakfraktionen wurden
über eine nicht reduzierende SDS-PAGE analysiert (Abbildung 7-37 B). Die Fraktionen 28-35
enthielten Aggregate des Komplexes, da Banden für SM5-1Fab (40 kDa) und auch für AD-4
(13 kDa) detektiert werden konnten. Die Eluate 39-43 wiesen ebenfalls Banden für SM51Fab und AD-4 auf, jedoch traten in diesen Fraktionen vermehrt verunreinigende Proteine
auf. Dabei könnte es sich um Degradationsprodukte von SM5-1Fab handeln. In den Eluaten
44-49 konnte das überschüssige AD-4 abgetrennt werden. Die Fraktionen 36-38 wurden
vereinigt, ankonzentriert und in 20 mM Tris, pH 8,0 umgepuffert. Für die
Kristallisationsversuche wurden Proteinlösungen mit Konzentrationen von 9,52-26,69 mg/ml
eingesetzt. Nachdem bei initialen Kristallisationsexperimenten Kristallbildung zwar
beobachtet werden konnte (Abbildung 7-37 C), aber keine verwertbaren Röntgenbeugungen
erhalten wurden, sollten AD-4-Mutanten im Komplex mit SM5-1Fab kristallisiert werden.
114 7 Ergebnisse
Abb. 7-37. Präparation und Kristallisation des Komplexes AD-4/SM5-1Fab. (A) Elutionsprofil der
Größenausschluss-Chromatographie am ÄKTA Purifier. Säule: HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade,
Laufpuffer: Gelfiltrationspuffer. Blau: Absorption in mAU, rot: Fraktionen. (B) Coomassieblue-Färbung einer
nicht reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 7 µl der 2 ml-Eluatfraktionen 28-49 aufgetragen. Das
Molekulargewicht
ist
in
kDa
angegeben.
(C)
Proteinkristalle
des
Komplexes
AD-4/SM5-1Fab.
Kristallisationsbedingung: 0,1 M HEPES-Na, pH 7,5, 10% (v/v) 2-Propanol, 20% (w/v) PEG4000.
Um die Kristallisationseigenschaften/Oberflächeneigenschaften des Proteinkomplexes zu
verbessern/verändern, wurden für die Kristallisation des Komplexes Kandidaten aus den
vorhandenen AD-4-Mutanten von Prof. Yves Muller und Uschi Diestel vorgeschlagen. Als
Kriterien dienten einerseits die Veränderung des pI, um andere Kristallisationsbedingungen
7 Ergebnisse 115
zu begünstigen, und andererseits die Veränderung der Größe der Seitenketten, um
Unterschiede in der Kristallpackung zu erhalten. Insgesamt wurden sechs AD-4-Mutanten
(IN397/98, K378, NT405/06, NQ409/10, QT410/11, KQ435/36) ausgewählt und analog zu Wildtyp AD-4
gereinigt (Daten nicht gezeigt). Die Präparation des Proteinkomplexes erfolgte nach dem
Schema in Abbildung 7-36. Für die Kristallisationsversuche wurden Proteinlösungen mit
Konzentrationen im Bereich von 10,76-14,60 mg/ml verwendet. Erfolg brachten schließlich
die Proteinkristalle von AD-4-Mutanten IN397/98, K378, NT405/06 im Komplex mit SM5-1Fab, für
die Datensätze mit einer guten Auflösung generiert werden konnten (Abbildung 7-38 B und
Daten nicht gezeigt). Die Struktur wurde für SM5-1Fab im Komplex mit IN397/98 bei einer
Auflösung von 2,1 Å gelöst (Abbildung 7-38 C). Die Strukturen von AD-4 und SM5-1Fab
diente als Modelle zur Bestimmung der Komplexstruktur. AS-Reste, deren Abstand
zueinander ≤3,5 Å war, wurden als Kontakt-AS im Antigen-Antikörper-Komplex definiert
(Abbildung 7-38 D). Die Interaktionsfläche für AD-4 mit der leichten Kette beträgt 232,3 Å2
und mit der schweren Kette 511,5 Å2, dabei interagiert AD-4 mit AS in LCDR1, LCDR2, LFR3a
(Framework Region 3a der leichten Kette) und HCDR3. Aus der Kristallstruktur wurde
ersichtlich, dass LCDR3, HCDR1 und HCDR2 von SM5-1Fab nicht mit AD-4 interagieren.
Obwohl beim „Alanin-Scan“ Y364 von AD-4 als essentieller Rest für die Bindung und das
Neutralisationspotential von AD-4-spezifischen hu-mAbs identifiziert werden konnte
(Abbildung 7-12, S. 80; Abbildung 7-18, S. 93; Tabelle 7-4, S. 92), konnte für Y364 kein
direkter Kontakt zu SM5-1Fab in der Kristallstruktur detektiert werden (Abbildung 7-38 D).
Multiple Kontakte mit dem Fab-Fragment von SM5-1 machte hingegen K379 von AD-4:
HCDR3 (Y114) und LCDR1 (K31, N32). Wie aus der Kristallstruktur ersichtlich, trugen ASReste, die sich in räumlicher Nähe zu K379 von AD-4 befinden (z. B. QE380/81 oder
ED361/62) ebenfalls zur Bindung von SM5-1Fab bei. Diese konnten jedoch mit den
angewandten biologischen Methoden nicht als kritische Kontakt-AS identifiziert werden.
116 7 Ergebnisse
Abb. 7-38. Strukturanalyse des Komplexes AD-4/SM5-1Fab. (A) Coomassieblue Färbung einer nicht
reduzierenden SDS-PAGE. Es wurden jeweils 3 µl der Proteinlösungen, die für die Kristallisationsversuche
verwendet wurden, aufgetragen. (B) Proteinkristall des Komplexes IN 397/98/SM5-1Fab. Kristallisationsbedingung: 0,2M L-Prolin, 0,1M HEPES, pH 7,5, 24% (w/v) PEG1500. (C) Kristallstruktur von IN397/98 im Komplex
mit SM5-1Fab als Oberflächen-/Ribbon-Darstellung. Für die Lösung der Struktur wurde als Methode „Molecular
Replacement“ angewandt. Die gelösten Strukturen von AD-4 und SM5-1Fab dienten als Modelle.
7 Ergebnisse 117
Grün: AD-4/IN397/98, pink: synthetischer Linker, gelb: variable (Vλ) und konstante (Cλ) Region der leichten Kette,
blau: variable (VH) und konstante (CH1) Region der schweren Kette, orange: CDR1, grau: CDR2, rot: CDR3. (D)
Der Interaktionsbereich von AD-4 und SM5-1Fab. Ribbon-Darstellung von AD-4/IN397/98 und des variablen
Bereiches von SM5-1Fab im Komplex; die Kontakt-AS von AD-4 sind als „Capped Sticks Modell“ in gelb
dargestellt und die Kontakt-AS von SM5-1Fab als „Capped Sticks Modell“ in grün (links). Tube-Darstellung der
einzelnen Interaktionspartner aus der Kristallstruktur des Komplexes: AD-4/IN397/98 und variabler Bereich von
SM5-1Fab; die Kontakt-AS sind angegeben (rechts). Die Farben sind analog zu (C). PyMOL wurde zur
Darstellung der Strukturen verwendet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es teilweise Unterschiede zwischen dem
funktionellen und dem strukturellen Epitop von SM5-1 gibt. Für die antivirale Wirkung von
SM5-1 ist der AS-Rest Y364 in Kombination mit K379 entscheidend, obwohl Y364 keinen
direkten Kontakt zum Fab-Fragment von SM5-1 ausbildet. Die Reste KQE379-81 machen in
der Struktur multiple Kontakte zu SM5-1Fab, was im Einklang zu den Ergebnissen aus der
Mutantenanalyse steht, denn die Mutation der Aminosäuren KKQE378-81 bewirkt den
Verlust von Bindung und Neutralisationsaktivität. Die Mutation einzelner Kontakt-AS hat
keinen/geringen Einfluss auf die Bindung und das Neutralisationspotential von SM5-1. Dies
wurde am Beispiel der AD-4-Mutante QE380/81 gezeigt. Die zahlreichen Interaktionen sind
kennzeichnend für die Bindung von SM5-1 an AD-4 und bilden somit die Grundlage für die
hohe Affinität des Antikörpers.
118 8 Diskussion
8 Diskussion
Das Glykoprotein B ist ein erfolgversprechender Kandidat für die Entwicklung eines
Impfstoffes gegen HCMV. In klinischen Studien führte die Vakzinierung mit gB, das in CHO
Zellen rekombinant exprimiert wurde, zu einem partiellen Schutz vor kongenitaler Infektion
und die Dauer der Virämie verkürzte sich in Transplantationspatienten (Griffiths et al., 2011;
Pass et al., 2009). Beide Studien konnten belegen, dass nach Immunisierung gB-spezifische
Antikörper induziert wurden. Griffiths et al. (2011) konnte zusätzlich zeigen, dass die Dauer
der Virämie invers mit dem Antikörpertiter korrelierte. Die Gründe für den partiellen Schutz
sind nicht bekannt. Denkbar wäre jedoch, dass gB nicht das richtige Antigen für eine
Immunisierung ist oder dass die induzierten Antikörper nicht dem natürlichen Repertoire
entsprechen, das nach einer Infektion entsteht. gB ist ein immundominantes Antigen
während der Infektion (Britt et al., 1990), allerdings werden nach der Infektion nicht nur
neutralisierende, sondern auch nicht-neutralisierende Antikörper induziert (Pötzsch et al.,
2011). Es ist zu erwarten, dass sowohl neutralisierende als auch nicht-neutralisierende
Antikörper nach Immunisierung mit gB gebildet werden. Erstaunlicherweise ist wenig über
die humorale Immunantwort gegen gB nach der Infektion mit HCMV bekannt. Es konnten
fünf antigene Bereiche auf gB identifiziert werden: AD-1 – AD-5. Die humorale
Immunantwort gegen die antigenen Domänen 1-3 wurde bereits in älteren Arbeiten
beschrieben. Gegen AD-1 und AD-2 werden neutralisierende und nicht-neutralisierende
Antikörper nach der Infektion induziert, gegen AD-3, das intraviral lokalisiert ist, werden
hingegen nur nicht-neutralisierende Antikörper gebildet. Die AS-Reste 552-635 in gB des
Virusstammes AD169 entsprechen AD-1 (Ohlin et al., 1993; Wagner et al., 1992). AD-2, das
N-terminal (AS 50-77) lokalisiert ist, besitzt zwei Antikörperbindestellen („Site I“: AS 50-54;
„Site“ II: AS 68-77). „Site I“ wird von neutralisierenden Antikörpern erkannt, während „Site
II“ von nicht-neutralisierenden Antikörpern gebunden wird (Meyer et al., 1990; Meyer et al.,
1992). Die antigenen Regionen AD-4 und AD-5 wurden erst kürzlich identifiziert, die beide
Targets von neutralisierenden Antikörpern sind (Pötzsch et al., 2011). Nicht-neutralisierende
Antikörper werden hingegen nur in geringen Konzentrationen gegen diese antigenen
Domänen induziert. Welche Eigenschaften sollte ein Antikörper mitbringen, um einen
effizienten Schutz vor Infektion zu vermitteln? Um das Wissen zur humoralen Immunantwort
gegen HCMV gB zu erweitern, wurde in dieser Arbeit das immundominante Epitop AD-4 und
daran bindende Antikörper im Detail untersucht.
8 Diskussion 119
Strukturelle Aspekte
Zurzeit sind in der PDB für humanpathogene Viren Kristallstrukturdaten für 80 AntigenAntikörper-Komplexe hinterlegt, wobei die Mehrzahl der Kristallstrukturen (ca. 90%) für HIV
(Humanes Immundefizienz Virus) und das Influenza Virus gelöst wurden. Bis jetzt gibt es
keine
Kristallstruktur
eines
Antigen-Antikörper-Komplexes
für
humanpathogene
Herpesviren. Lediglich für das Pseudorabiesvirus, das für Tiere pathogen ist, konnte eine
Struktur für gH/gL im Komplex mit einem Fab-Fragment aufgeklärt werden (Backovic et al.,
2010).
In die Interaktion der Antikörper mit ihrem Antigen sind in der Regel 4-6 CDRs involviert und
sie bilden eine Kontaktfläche von ~600-900 Å2 (Ekiert et al., 2012; Kringelum et al., 2013). Die
Interaktionsfläche für den Komplex AD-4/SM5-1Fab beträgt 743,8 Å2 und entspricht somit
einer erwarteten durchschnittlichen Größe für eine Epitop-/Paratopkontaktfläche. SM5-1Fab
kontaktiert AD-4 sowohl über VL (variable Region der leichten Kette) als auch über VH
(variable Region der schweren Kette), wobei VH die größere Kontaktfläche (69%) ausbildet.
Die CDRs der schweren Kette (HCDR) sind in Regel mehr an Antigenkontakten beteiligt als
die CDRs der leichten Kette (LCDR) (Davies et al., 1990; Ekiert et al., 2009; Ekiert et al., 2011;
Gustchina et al., 2010; Lee et al., 2012; Zhou et al., 2010). Es gibt sogar Antikörper, die
ausschließlich über ihre HCDRs Kontakte zum Antigen machen (Corti et al., 2011; Ekiert et
al., 2012). Dabei nimmt vor allem HCDR3 eine wichtige Rolle bei der Antigenerkennung ein
und besitzt die höchste Anzahl an Kontakten zum Antigen (Kuroda et al., 2008; Zhao et al.,
2012). Der überdurchschnittlich lange HCDR3-„Loop“ von SM5-1Fab (24 AS) (Pötzsch et al.,
2011) trägt auch entscheidend zur Bindung von AD-4 bei. Die meisten HCDR3s von humanen
Antikörpern haben eine Länge von 12 AS (www.bioinf.org.uk/abysis/index.html), aber
HCDR3s, die aus 24-28 AS-Resten aufgebaut sind, sind zum Beispiel für HIV oder Influenza
Virus bekannt (Ekiert et al., 2012; Pejchal et al., 2010). Diese Antikörper können zahlreiche
Virusstämme/-varianten oder Subtypen neutralisieren; diese werden als „Broadly
Neutralizing Antibodies“ bezeichnet. Es wird spekuliert, dass die lange HCDR3-Region infolge
einer langen Antigenexposition vom Immunsystem gebildet wird (Pejchal et al., 2010).
Aufgrund der Länge kann der HCDR3-„Loop“ in Taschen/Gruben auf der Oberfläche des
Antigens hineingreifen und so eine selektive Bindung zum Antigen ausbilden (Corti et al.,
2011). Die meisten murinen Antikörper bilden CDR3-Regionen mit einer Länge von 9 AS aus
120 8 Diskussion
(www.bioinf.org.uk/abysis/index.html). Das Versagen, Antikörper mit virusneutralisierenden
Eigenschaften nach Immunisierung von Mäusen mit gB oder AD-4 zu induzieren, könnte
hierin begründet liegen. Aus VH von SM5-1Fab wird ausschließlich der HCDR3-„Loop“
benutzt, um Kontakt zum Antigen aufzubauen, und bindet in einer Grube in AD-4 (R131,
V382, E386, E422 von AD-4; S105, S107 von SM5-1Fab). 11 AS in den CDRs von SM5-1Fab
sind an der Antigenbindung über direkten Kontakt beteiligt, dabei sind die AS Asn (2x), Tyr
(2x) und Ser (3x) am meisten vertreten und bilden mit 64% einen hohen prozentualen Anteil
an Kontakt-AS. In der Tat sind die AS-Reste Trp, Tyr, Ser und Asn die häufigsten Kontakt-AS in
Antigen-Antikörper-Komplexen (Mian et al., 1991). Obwohl weder HCDR1 noch HCDR2 von
SM5-1Fab an der Bindung zum Antigen direkt beteiligt sind, kann nicht ausgeschlossen
werden, dass sie zur Stabilität und Konformation des HCDR3-„Loops“ oder anderer
antigenbindender Bereiche beitragen, zumal HCDR1 mehrere Wasserstoffbrückenbindungen
(H-Bindung) zum HCDR3-„Loop“ ausbildet. H-Bindungen können auch über Wassermoleküle
in Antigen-Antikörper-Komplexen gebildet werden und so die Antigen-Antikörper-Bindung
vermitteln (Bhat et al., 1994). Es können Spekulationen darüber angestellt werden, ob die
zahlreichen Wassermoleküle, die in dem Interaktionsbereich von AD-4/SM5-1Fab liegen
(Daten nicht gezeigt), einen Einfluss auf die Antigen-Antikörper-Bindung haben, wobei
anzumerken ist, dass die entscheidenden Kontakte ohne
die Beteiligung von
Wassermolekülen hergestellt werden.
Auch Kohlenhydrate können Teil eines Epitops sein (Calarese et al., 2003; Colman, 1994;
Jeffrey et al., 1995; Pejchal et al., 2011; Scanlan et al., 2003). Da sich die Affinität von
SM5-1Fab zu prokaryont exprimierten AD-4 und eukaryont exprimierten gB nicht
unterscheidet, ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass Kohlenhydrate maßgebend zur
Bindung von SM5-1Fab beitragen. Die Oberfläche von gB ist glykosyliert (Britt & Vugler,
1989). Prof. Heinrich Sticht (Lehrstuhl für Biochemie, Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg) erstellte ein Modell zu glykosyliertem gB (Abbildung 8-1 A).
Kohlenhydrate auf HCMV gB vermitteln die initiale Bindung des Virus an die Zelle über
ubiquitär vorhandene Proteoglykane (Compton et al., 1993). Zudem nutzen Viren die
Glykanschicht ihrer Proteine als Schutz gegen das Immunsystem (Ekiert et al., 2009; Kropff et
al., 2012; Kwong et al., 1998; Labrijn et al., 2003). In AD-4 sind 2-3 potentielle NGlykosylierungsstellen vorhergesagt, dadurch wird die frei zugängliche Oberfläche von AD-4
minimiert. In der Tat ist durch eine Überlagerung von glykosyliertem gB Modell mit der
8 Diskussion 121
Kristallstruktur des Komplexes AD-4/SM5-1Fab über die AD-4 Struktur (Abbildung 8-1 B) zu
erkennen, dass die Region, die von SM5-1Fab kontaktiert wird, eine der wenigen Bereiche in
AD-4 ist, die für Antikörper gut zugänglich ist. Der Antikörper muss eine bestimmt räumliche
Orientierung einnehmen, um an die Oberfläche von AD-4 binden zu können, dabei nutzt der
Antikörper die Lücke zwischen der glykosylierten „gB-Krone“ und dem glykosylierten Bereich
von struktureller Domäne I und II. Es ist denkbar, dass nach Immunisierung von Mäusen mit
AD-4, das in Prokaryonten als GST-Fusionsprotein rekombinant exprimiert wurde, Antikörper
induziert wurden, die diese Orientierung nicht einnehmen können oder an Epitope binden,
die im gB-Trimer nicht zugänglich sind und somit keine antivirale Aktivität haben. Eine
weitere freiliegende Region auf AD-4 ist die α-Helix (Abbildung 8-1 B, links), die auch als
Zielstruktur von Antikörpern genutzt wird, wie die Analyse von AD-4-spezifischen hu-mAbs,
SM-Antikörper ausgenommen, ergab. Jedoch darf nicht unerwähnt bleiben, dass es sich
hierbei um ein Modell handelt und die räumliche Lage der Zuckerketten flexibel ist.
122 8 Diskussion
Abb. 8-1. Modell von HCMV gB mit modellieten Kohlenhydraten und Lage von SM5-1Fab in diesem Modell. (A)
HCMV gB Modell. gB Modell ist als Trimer in der Ribbon-Repräsentation und die modellierten Kohlenhydrate
sind als Kalotten-Modell dargestellt. (B) Überlagerung von glykosyliertem HCMV gB Modell und der
Kristallstruktur des Komplexes AD-4/SM5-1Fab aus unterschiedlichen Blickwinkeln. Die Darstellungsform des
glykosylierten gB Modells ist analog zu (A). Die Struktur des Komplexes ist als Ribbon-Diagramm gezeigt. Grün:
AD-4/IN397/98, gelb: variable (Vλ) und konstante (Cλ) Region der leichten Kette, blau: variable (VH) und konstante
(CH1) Region der schweren Kette, orange: CDR1, grau: CDR2, rot: CDR3.
Die Interaktion eines Antikörpers mit seinem Antigen kann konformationelle/strukturelle
Veränderungen sowohl auf Antikörper- als auch Antigenebene hervorrufen, meist infolge
einer Umorientierung der Seitenketten und Umlagerung der individuellen CDRs (Davies &
Cohen, 1996; Sela-Culang et al., 2012). Strukturelle Änderungen werden durch die
Interaktion mit AD-4 vor allem in der Struktur des HCDR3-„Loops“ von SM5-1Fab induziert
(Abbildung 8-2 A). Dabei ist in HCDR3 eine signifikante Umorientierung/Bewegung der
Seitenketten der interagierenden AS-Reste zu erkennen. Sela-Culang et al. (2012) stellten
einen systematischen Vergleich zwischen Strukturen von freien und antigengebundenen
Antikörpern an. Die Autoren kamen zu dem Ergebnis, dass viele Antikörper nur eine geringe
Konformationsänderung im HCDR3 zeigen (37%), aber verglichen mit den anderen CDRs
ließen sich für HCDR3 die größten strukturellen Veränderungen ermitteln. Für den
Antikörper C05, der mehrere Subtypen von Influenza A Viren neutralisiert und dessen
Bindung ausschließlich über den HCDR3-„Loop“ an HA (Hämagglutinin) erfolgt, wurde
ebenfalls eine identische Konformation für HCDR3 in freier und gebundener Form
beschrieben. Die benachbarten HCDRs sollen dabei stabilisierend auf die Konformation von
HCDR3 wirken (Ekiert et al., 2012). Folglich können auch solche Regionen, die keinen
direkten Kontakt zum Antigen ausbilden, zur Affinität oder Funktionalität eines Antikörpers
beitragen. Die relative Orientierung der variablen und konstanten Domänen oder V H zu VL ist
ebenfalls wichtig für die Antigenbindung und kann sich nach Interaktion mit dem Antigen
verändern (Narayanan et al., 2009; Piekarska et al., 2006). Bei der Orientierung der Ketten
zueinander übernimmt der Winkel zwischen variabler und konstanter Domäne
(„Ellbogenwinkel“) einer Kette eine gewichtige Aufgabe, für den als Konsequenz einer
Antigenbindung eine Differenz von 30° beschrieben wurde (Sotriffer et al., 1998; Tsibane et
al., 2012). Die Differenz des „Ellbogenwinkels“ zwischen freiem und gebundenem SM5-1Fab
beträgt 2° für die leichte Kette und 3° für die schwere Kette. Allgemein ist hier anzumerken,
dass sich die Struktur von SM5-1Fab vor und nach Bindung nicht wesentlich unterscheidet,
8 Diskussion 123
was unter anderem aus der Differenz des „Ellbogenwinkels“ ersichtlich wird. Wie oben
bereits erwähnt scheinen nur in HCDR3 größere strukturelle Umlagerungen stattzufinden,
der auch den größten Beitrag zur Antigenbindung zeigt. Allerdings war die genaue Lage des
HCDR3-„Loops“ im freien Fab-Fragment nur schwer zu ermitteln, was auf seine Flexibilität
hindeutet. Es ist allgemein akzeptiert, dass Antikörper ihre Antigene nicht nach dem
strengen
„Schlüssel-Schloss-Prinzip“
binden,
sondern,
dass
vielmehr
multiple
Antikörperkonformationen existieren, die zur Bindung des Antigens führen (Stanfield &
Wilson, 1994). Es ist jedoch unklar, ob die Konformationsänderung auf Antikörperebene
durch die Antigenbindung induziert wird („Induced Fit“) oder eine der vorhandenen
Antikörperkonformationen an sein Epitop bindet (Keskin, 2007; Koshland, 1958; SchulzeGahmen et al., 1993; Sela-Culang et al., 2012). Die konformationellen Änderungen in AD-4
sind
nach
Bindung
von
SM5-1Fab
klein.
Für
die
Kontakt-AS
ist
eine
Umorientierung/Bewegung der Seitenketten zu beobachten (Abbildung 8-2 B). Die relative
Lage des AS-Restes Y364, der zusammen mit K379 kritisch für die Bindung/Funktion von
SM5-1 in ELISA- und Neutralisationstests ist, wurde durch die Bindung von SM5-1Fab kaum
verändert. Durch die Interaktion von AD-4 mit SM5-1 wird also keine signifikante
Konformationsänderung außerhalb des strukturellen Epitops in AD-4 hervorgerufen, in Folge
derer AD-4 seine Funktion auf viraler Ebene nicht mehr ausführen könnte. Es spricht jedoch
vieles dafür, dass die charakterisierte/kritische Region innerhalb von AD-4 für die Funktion
entscheidend ist und durch die Bindung von SM5-1Fab blockiert ist.
Abb. 8-2: Vergleich der freien und gebundenen Strukturen von SM5-1Fab und AD-4. Ribbon-Darstellung des
Kontaktbereiches von AD-4 und SM5-1Fab. Kontakt-AS sind als „Capped Sticks Modell“ dargestellt. (A) Grau:
AD-4/IN397/98-Struktur aus dem Komplex, blau: freie Struktur von SM5-1Fab, rot: antigengebundene Struktur
124 8 Diskussion
von SM5-1Fab. (B) Grau: SM5-1Fab-Struktur aus dem Komplex, blau: freie Struktur von AD-4, rot:
antikörpergebundene Struktur von AD-4.
Zwar konnten aus der Kristallstruktur des Komplexes AD-4/SM5-1Fab insgesamt 11 KontaktAS auf AD-4 identifiziert werden, die SM5-1Fab kontaktieren, dennoch können wenige AS für
die Bindung/Funktion von Antiköpern entscheidend sein; die so genannten „Hot Spots“
(Dall'Acqua et al., 1998). Beispiele sind unter anderem für Viren wie Influenza A oder HIV
bekannt, bei denen ein einzelner Aminosäureaustausch Neutralisationsresistenz bewirken
kann (Ekiert et al., 2009; Ekiert et al., 2011; Li et al., 2011; McLellan et al., 2011). Für SM5-1
konnten mittels „Di-Alanin-Scan“ Y364 und K379 als kritische AS-Reste für die Bindung und
die Neutralisationskapazität identifiziert werden. Tyr ist eine Aminosäure, die mit hoher
Frequenz in „Hot Spots“ enthalten ist, weil sie sowohl aromatische π-Interaktionen als auch
H-Bindungen ausbilden kann und zudem hydrophobe Eigenschaften aufweist (Bogan &
Thorn, 1998). Aber ein Lys-Rest kann auch eine essentielle Aminosäure sein, die z. B.
Wechselwirkungen über eine Salzbrücke eingehen kann (McLellan et al., 2010). Die
Kristallstrukturanalyse des Komplexes AD-4/SM5-1Fab zeigte allerdings, dass Y364 keinen
direkten Kontakt zum Fab-Fragment besitzt, sondern Y364 stabilisiert eher die Konformation
von K379, das den Kontakt über eine H-Bindung herstellt. Nach bioinformatischen Analysen
von Prof. Heinrich Sticht bewirkt die Mutation dieser Reste (YK-Epitop) eine Veränderung der
Oberfläche in diesem Bereich, was zum Verlust der Antikörperbindung führen kann. Die CDSpektroskopie konnte zeigen, dass die allgemeine strukturelle Faltung von AD-4 durch die
Einführung einer Mutation an Position YK364/79 nicht beeinflusst ist. Die Mutation der
Reste
QE
an
Position
380/81
hat
allein
keinen
Einfluss
auf
die
Bindung/
Neutralisationskapazität von SM5-1, in Kombination mit KK378/79 führt sie jedoch zum
Verlust der Reaktivität. Aus der strukturellen Analyse zur Interaktion von AD-4 und
SM5-1Fab ist ersichtlich, dass drei der mutierten AS (KQE379-81) eine direkte
Wechselwirkung mit SM5-1Fab eingehen und sich so die Reduktion in Reaktivität erklären
lässt.
Mit Ausnahme von SM5-1 ist für die Bindung der SM-Antikörper an AD-4 die Mutation von
AS K379 kritisch. Diese wechselwirken also mit der gleichen Region wie SM5-1 auf AD-4,
unterscheiden sich aber in ihren Eigenschaften, hinsichtlich Bindung und Neutralisationspotential. Alle SM-Klone stammen aus einem Spender und wie über Sequenzanalysen
8 Diskussion 125
bekannt ist, sind sie klonal verwandt. In Abbildung 8-3 sind die Sequenzen der CDRs der SMAntikörper angegeben (Pötzsch et al., 2011). Die meisten Mutationen, im Vergleich zu
SM5-1, treten in HCDR1, HCDR3 und LCDR3 auf. Die LCDR2-Sequenz ist vollständig
konserviert und es gibt kaum Unterschiede in den Sequenzen von LCDR1 und HCDR2. Die ASReste von SM5-1, die in der Kristallstruktur des Komplexes mit AD-4 in Wechselwirkung
treten, sind in den einzelnen SM-Klonen größtenteils konserviert, mit Ausnahme der Serine
in HCDR3, die an der Spitze des HCDR3-„Loops“ lokalisiert sind und den größten
Konformationsänderungen vor und nach Bindung an das Antigen unterliegen. Es ist jedoch
anzumerken, dass die Serine keinen direkten Kontakt mit K379 von AD-4 ausbilden. K379
von AD-4 interagiert mit den AS-Resten Tyr114 (HCDR3) und Lys31, Asn32 (LCDR1) in SM51Fab, wobei diese Reste innerhalb der SM-Antikörper jedoch konserviert sind. Diese
Tatsache spricht keineswegs dagegen, dass für alle SM-Antikörper, abgesehen von SM5-1,
die Mutation von K379 von AD-4 kritisch ist. Durch die AS-Austausche in der
Antikörpersequenz kann es zu Konformationsumlagerungen kommen und dadurch die
räumliche Lage der Kontakt-AS von SM5-1 variieren, als Konsequenz könnte der Kontakt
über andere AS der Antikörper hergestellt werden und dann ist die Mutation einer einzigen
AS im Antigen (in dem Fall K379) kritisch für die Bindung der Antikörper.
Abb. 8-3. AS-Sequenzen der CDRs von SM-Antikörpern. Es konnte keine Sequenz für die leichte Kette von
SM11-17 erhalten werden (Pötzsch et al., 2011). Rot: Kontakt-AS zu AD-4, die über die Auswertung der
Kristallstruktur des Komplexes AD-4/SM5-1 bestimmt wurden. Grün: AS-Austausch im Vergleich zu SM5-1.
Durch Mutationen in den CDRs könnten die essentiellen Kontakt-AS auf Antikörperebene,
ausgehend von den Kristallstrukturdaten des Komplexes, bestimmt werden. Auffällig ist,
126 8 Diskussion
dass K379 sowohl zur schweren als auch zur leichten Kette von SM5-1Fab wechselwirkt.
E359 von AD-4 ist der einzige AS-Rest, der ebenfalls mit beiden Ketten interagiert. Auf Seiten
von AD-4 wäre also die Mutationskombination EK359/79 interessant. Beide AS treten mit
K31 in LCDR1 in Wechselwirkung, was diesen Rest als Kandidaten für eine Mutation
hervorhebt. Analog dazu, wäre Y114 in HCDR3 ebenfalls eine mögliche essentielle AS für die
Bindung, da auch Y114 mit EK359/79 von AD-4 interagiert. Als weiteres wäre die Mutation
der Serine in HCDR3 sicherlich eine gute Ergänzung zur Charakterisierung und zum
Hervorheben der Unterschiede in den SM-Antikörpern. Die durchgeführten „Di-AlaninScans“ haben bereits alle Kontakt-AS in AD-4 abgedeckt, mit Ausnahme von R131, V382 und
D386. Die Mutation dieser Reste und anschließende Bindungsanalysen könnten zusätzlich
Informationen über das Epitop liefern. Interessanterweise ist nur eine einzige AS (R131) aus
dem N-terminalen Teil (AS 121-132) von AD-4 direkt an der Bindung zu SM5-1Fab beteiligt.
Jedoch ist der Verlust von Bindung an AD-4, dessen N-terminale Region deletiert wurde,
wahrscheinlich mit dem Verlust der strukturellen Integrität von AD-4 assoziiert, da auch eine
polyklonale AD-4-spezifische IgG-Präparation (poly AD-4) keine Reaktivität mit N-terminalen
Verkürzungen von AD-4 aufweist. Dies ist aber auch gleichzeitig ein Hinweis darauf, dass
gegen AD-4 keine Antikörper oder nur in geringen Konzentrationen gegen lineare Epitope
nach einer Infektion mit HCMV gebildet werden.
Funktionelle Aspekte
Der Effekt der eingeführten Mutationen innerhalb von AD-4 wurde nicht nur auf
Proteinebene durch den Nachweis vom Verlust der Bindung untersucht, sondern es wurde
auch die Relevanz der kritischen AS für das Neutralisationspotential von AD-4-spezifischen
Antikörpern analysiert. Für HIV wurde berichtet, dass eine reduzierte Bindungsaffinität nicht
zwingenderweise mit reduzierter Neutralisationskapazität assoziiert sein muss und einzelne
Mutationen nicht ausreichen, um Neutralisationsaktivität eines Antikörpers völlig zu
inhibieren (Li et al., 2011). Die Konformation des Antigens auf der Virusoberfläche oder
sogar ein alternativer Infektionsmechanismus als Folge der Mutation, sind mögliche
Erklärungen für dieses Phänomen. Im Fall von AD-4 ließ sich jedoch eine Korrelation
zwischen Bindung und Neutralisationsaktivität für humane monoklonale Antikörper
(hu-mAbs) nachweisen. Folglich muss AD-4 auf viralem gB eine ähnliche Konformation
einnehmen, wie für das rekombinant exprimierte AD-4 über die Kristallstrukturanalyse
ermittelt wurde. Obwohl Y364 nach Strukturdaten keinen Kontakt zu SM5-1 aufbaut, ist
8 Diskussion 127
Affinität, Bindung und Neutralisationskapazität durch die Mutation dieser Stelle beeinflusst.
Folglich sind auch nicht-Kontakt-AS in die Erkennung eines Epitops involviert. Die Mutation
sogenannter nicht-Kontakt-AS führte bei HIV vermehrt zur verstärkten Affinität und
Neutralisationsaktivität von Antikörpern (Li et al., 2011). Dies könnte in weiteren Versuchen
für AD-4/gB untersucht werden, indem man zum Beispiel Glykosylierungsstellen mutiert und
so die Zugänglichkeit des Epitops erhöht. Der Effekt von Epitop maskierenden Glykanen auf
die Neutralisationskapazität von AD-4-spezifischen Antikörpern wurde bereits gezeigt, dabei
schirmen Zuckerreste in gN das AD-4-Epitop ab (Kropff et al., 2012). Der Anteil von
YK364/79-abhängigen Antikörpern in Seren von HCMV infizierten Personen ist groß, da das
Neutralisationspotential für poly AD-4 von diesen AS-Resten abhängig war. Die
Neutralisationsaktivität des humanen HCMV-Hyperimmunserums (HCMV HIS) war hingegen
nicht beeinflusst durch die eingeführten Mutationen in das virale Genom. Das war auch nicht
zu erwarten, da HCMV eine Reihe von neutralisationsrelevanten Proteinen besitzt. Für HIV
wurde Ähnliches in Bezug auf die Reaktivität einer IgG-Präparation beschrieben (Li et al.,
2011), obwohl bei HIV oder auch Influenza Viren ein Protein den Zelleintritt, im Gegensatz zu
dem komplexen Vorgang bei den Herpesviren, vermittelt. Die Neutralisationskapazität eines
Serums aus einer HCMV-positiven Person korreliert nicht mit dem Vorhandensein von AD-4spezifischen Antikörpern. Die Isolierung von AD-4-spezifischen Antiköpern, für die eine
Mutation von YKK364/78/79 irrelevant ist (poly YKK364/78/79), zeigte, dass gegen AD-4 auch
Antikörper mit anderen Spezifitäten gebildet werden und deren Neutralisationspotential nur
gering reduziert ist, im Vergleich zum Gesamtspektrum an AD-4-spezifischen Antikörpern.
Dies ist ein Hinweis dafür, dass es durchaus weitere Epitope innerhalb von AD-4 gibt, die
virusneutralisierende Eigenschaften besitzen. Dieses Ergebnis war kongruent zu den
Reaktivitäten von Seren HCMV-positiver Individuen, die mittels ELISA gegen die kritischen
AD-4-Mutanten bestimmt wurden. Überraschend war hingegen das Resultat eines
Neutralisationstestes für poly YKK364/78/79 gegen das rekombinante Virus RV gB-YKK364/78/79,
das eine Mutation der Reste YKK364/78/79 trug. Die Neutralisationskapazität gegen das
rekombinante Virus war signifikant reduziert im Vergleich zum Wildtypvirus. Entweder
wurde durch die Mutation im Virus die Kontaktoberfläche mehr verändert als im
rekombinanten Protein, was die Konsequenz hätte, dass die Antikörper ihr Epitop nicht
ausreichend kontaktieren können oder das rekombinante Virus benutzt einen alternativen
Infektionsmechanismus, der durch AD-4-spezifische Antikörper nicht effektiv inhibiert
128 8 Diskussion
werden kann. Die verminderte Replikationskapazität von RV gB-YKK364/78/79 wäre ein
möglicher Hinweis auf einen alternativen Infektionsmechanismus, der langsamer abläuft und
daher im Wildtypvirus nicht genutzt wird, um Fibroblasten zu infizieren. Zudem ist bekannt,
dass HCMV unterschiedliche Mechanismen, wie die Fusion an der Plasmamembran,
Endozytose oder Makropinozytose, für den Zelleintritt in die jeweiligen Zellen nutzt (Bodaghi
et al., 1999; Compton et al., 1992; Ryckman et al., 2006). Auf das Neutralisationspotential
des AD-2-spezifischen hu-mAb C23 hatten alle Mutationen keine Auswirkungen, was darauf
hinweist, dass die Varianzen in der Replikationskinetik keinen Einfluss auf die
Neutralisationsaktivität von gB-spezifischen Antikörpern, die außerhalb der AD-4-Sequenz
binden, haben.
Es konnten Unterschiede in der Neutralisationsaktivität von SM5-1 (IgG) im Vergleich zu
SM5-1Fab detektiert werden. Zwar können beide 50% des Virus bei vergleichbaren
Konzentrationen (ungeachtet der molaren Verhältnisse) neutralisieren, jedoch konnte keine
100%ige Neutralisation von HCMV mit SM5-1Fab bei einer Konzentration von 10 µg/ml
erreicht werden, im Gegensatz zum SM5-1. Durch Kreuzvernetzung von SM5-1Fab konnte
die Differenz in der Neutralisationskapazität eliminiert werden. Aus Gründen der Avidität
konnte also eine Steigerung im Neutralisationspotential bewirkt werden. Dies steht im
Einklang mit den Daten aus der Literatur (Cavacini et al., 1994; Klein et al., 2009; Pejchal et
al., 2011; Wu et al., 2005). Im Gegensatz zum Fab-Fragment besitzt ein IgG-Molekül die
Fähigkeit zwei identische Antigene simultan zu binden, was die Neutralisationsaktivität in
vielen Fällen steigert. Die Voraussetzung für intermolekulare Kontakte (Kontakt zu zwei
Molekülen) ist jedoch, dass die Dichte des Antigens auf einem Pathogen erhöht ist, das
heißt, das Antigen ist ein Hauptbestandteil der viralen Oberfläche, wie im Fall von HA auf
Influenza A (Yamaguchi et al., 2008), oder die Dichte ist lokalisiert auf eine Region, wie für
gp160 von HIV berichtet wurde (Doms, 2000; Klein et al., 2009; Zhu et al., 2006). CryoElektronen-Mikroskopie von HSV-1 zeigte, dass lokale Dichteunterschiede für Glykoproteine
auf der Oberfläche zu beobachten sind (Maurer et al., 2008), was der Situation in HIV
entspricht. Die intermolekulare Reaktivität von Antikörpern mit Antigenen, die keine hohe
Dichte auf der Virusoberfläche aufweisen, wird wahrscheinlich durch die Mobilität der
Proteine bewirkt (Klein et al., 2009; Maurer et al., 2008). Da es sich bei gB um ein Trimer
handelt, wäre es theoretisch möglich, dass der Antikörper oder das kreuzvernetzte FabFragment intramolekular Kontakt zu zwei AD-4 Einheiten auf einem gB aufbaut. Dies jedoch
8 Diskussion 129
ist aus strukturellen Gründen eher unwahrscheinlich, was der gängigen Meinung in der
Literatur entspricht (Klein et al., 2009; Liu et al., 2008).
AD-4-spezifische Antikörper, die während einer Infektion induziert werden, können HCMV
effizient neutralisieren. Interessanterweise weisen humane polyklonalen AD-4-spezifische
Antikörper ein vergleichbares Neutralisationspotential wie AD-4-spezifische hu-mAbs auf.
Dies spricht dafür, dass gegen AD-4 hauptsächlich neutralisierende Antikörper gebildet
werden, im Gegensatz zu AD-1-spezifischen Antikörpern (Speckner et al., 1999). Um die
Bindung an AD-1 kompetieren neutralisierende und nicht-neutralisierende Antikörper. Was
ist die Funktion von nicht-neutralisierenden Antikörpern? Sie könnten als Schutzmechanismus des Virus vor Neutralisation interpretiert werden oder tragen sie doch zum Schutz des
Wirts bei? Dazu muss man wissen über welche Mechanismen Antikörper vor Viren schützen
können. Antikörper schützen vor infektiösen Erregern direkt durch Bindung an das Virus
oder indirekt, indem sie nach Bindung an das Virus oder die infizierte Zelle
Effektorfunktionen aktivieren. Unter Neutralisation eines Virus in vitro versteht man per
Definition, dass in Folge einer Antikörperbindung der Erreger ohne Beteiligung weiterer
Komponenten des nativen oder adaptiven Immunsystems inaktiviert wird (Dimmock, 1993).
Im Prinzip korreliert Neutralisation in vitro mit Schutzpotential in vivo, nur wenige
Ausnahmen sind bekannt (Law & Hangartner, 2008). Mechanismen der Neutralisation
werden immer noch kontrovers diskutiert und zahlreiche Hypothesen entwickelt: Antikörper
können die Rezeptorbindung blockieren, die Penetration und Zelleintritt inhibieren, das
Entpacken des Viruspartikels und des viralen Genoms verhindern, die Virionstruktur
destabilisieren, konformationelle Veränderungen der Virushülle oder des Kapsids induzieren,
die Virionen aggregieren (Dimmock, 1993). Neutralisation kann auch einfach eine Frage der
Antigen-Antikörper-Stöchiometrie sein (Klasse & Sattentau, 2001; Parren & Burton, 2001). In
vivo können auch noch weitere Faktoren zum Schutz vor Pathogenen beitragen. In Folge
dessen können auch nicht-neutralisierende Antikörper in vivo schützend wirken (Hangartner
et al., 2006). Der kann in vivo durch Fc-vermittelte Effektorfunktionen erfolgen, dabei wird
die Lyse oder Phagozytose der infizierten Zelle bzw. des Virus durch CDC oder ADCC induziert
(Hangartner et al., 2006; McCullough et al., 1988; Mehlhop et al., 2005; Ochsenbein et al.,
1999). Ein nicht-neutralisierender Antikörper, der gegen HIV gerichtet ist, erkennt die
Struktur des Zielantigens nach der Fusion und verhindert somit die initiale Infektion über
direkte Neutralisation des Virus nicht (Nicely et al., 2010). Aber dieser Antikörper wäre in
130 8 Diskussion
vivo durchaus in der Lage eine infizierte Zelle zu erkennen und so zum Schutz beizutragen. In
diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass das Epitop dieses Antikörpers mit dem eines
neutralisierenden Antikörpers überlappt, jedoch besitzt der nicht-neutralisierende
Antikörper eine geringere Affinität zum Antigen und es sind Differenzen in dem strukturellen
Aufbau des Antikörpers zu erkennen (Nicely et al., 2010).
Da gegen AD-4 überwiegend neutralisierende Antikörper gebildet werden, soll im Folgenden
der mögliche Neutralisationsmechanismus von AD-4-spezifischen Antikörpern erörtert
werden. AD-4-spezifische Antikörper neutralisieren das Virus nach dem „Attachment“, also
nach Rezeptorbindung (Pötzsch et al., 2011). Daher ist eine Neutralisation über Inhibierung
der Rezeptorbindung unwahrscheinlich, kann aber nicht ausgeschlossen werden, da für
HCMV eine Vielzahl von möglichen Rezeptoren zur Diskussion stehen (Feire et al., 2004;
Soroceanu et al., 2008; Wang et al., 2003). Ein plausiblerer Neutralisationsmechanismus ist
das Blockieren der Penetration und des Zelleintritts, der über Fusion der viralen und
zellulären Membran vermittelt wird. Dieser Mechanismus wird auch durch Studien in HSV
unterstützt (Atanasiu et al., 2010a; Atanasiu et al., 2010b). gB und gH/gL gelten als die
„Fusionsmaschinerie“ der Herpesviren. Sie sind essentiell für den Eintritt der Herpesviren in
die Zelle, benötigen aber in der Regel akzessorische Proteine für ihre Funktion (Eisenberg et
al., 2012). So zum Beispiel gezeigt für HSV oder EBV (Atanasiu et al., 2010a; Avitabile et al.,
2007; Borza & Hutt-Fletcher, 2002). Für HCMV scheint es so zu sein, dass die
unterschiedlichen gH/gL-Komplexe (gH/gL/gO und gH/gL/UL128-131) zwar den Zelltropismus
bestimmen, jedoch können gB und gH/gL alleine die Fusion der Membranen initiieren und
durchführen (Hahn et al., 2004; Patrone et al., 2007; Vanarsdall et al., 2008). Die Kristallstrukturdaten von gB und gH/gL weisen darauf hin, dass nur gB Eigenschaften eines
Fusionsproteins besitzt (Backovic et al., 2010; Backovic et al., 2009; Chowdary et al., 2010;
Heldwein et al., 2006; Matsuura et al., 2010). Dennoch erfolgt die Fusion nur in Anwesenheit
von gH/gL (Chowdary et al., 2010; Heldwein & Krummenacher, 2008; Spear & Longnecker,
2003). In HSV wird nach der Rezeptorbindung eine Reaktionskaskade ausgelöst, die zur
Fusion von Virus- und Zellmembran führt, dabei wird gB von gH/gL aktiviert (Atanasiu et al.,
2010a; Eisenberg et al., 2012). Viele Studien postulieren, dass die Interaktion zwischen gB
und gH/gL ein wichtiger Schritt in der Membranfusion ist (Atanasiu et al., 2010a; Atanasiu et
al., 2007; Avitabile et al., 2007; Patrone et al., 2007). Bei dem Fusionsprozess kommt es
wahrscheinlich zu konformationellen Veränderungen in gB, in Analogie zu VSV G, das
8 Diskussion 131
genauso wie gB zu den viralen Fusionsproteinen der Klasse III gehört und pH-vermittelten
konformationellen Änderungen während der Fusion unterliegt (Cairns et al., 2011;
Muggeridge, 2012; Patrone et al., 2007; Roche et al., 2006; Roche et al., 2007). Wo können
nun AD-4-spezifische Antikörper in diesem komplexen Prozess angreifen? Die strukturelle
Domäne II in HSV-1 gB, welche die funktionelle Region 2 (FR2) beinhaltet, entspricht der
AD-4 Region in HCMV (Bender et al., 2007). Neutralisierende Antikörper, die an FR2 binden,
können sowohl die Fusion blockieren als auch die Interaktion von gB und gH/gL inhibieren
(Atanasiu et al., 2010b). Ob ein ähnlicher Mechanismus auch für HCMV existiert muss noch
gezeigt werden. An Hand der Kristallstrukturdaten des Komplexes AD-4/SM5-1Fab lässt sich
spekulieren, ob die Oberfläche, die vom Antikörper blockiert ist, für die Interaktion mit
gH/gL essentiell ist oder die Zugänglichkeit von gH/gL an gB durch die Bindung des
Antikörpers reduziert wird. Eine Konformationsänderung von gB als Folge der
Membranfusion/pH-Änderung ist in der Literatur strittig, da nur geringe Unterschiede in den
Strukturen unter neutralem und niedrigem pH für HSV-1 gB detektiert werden konnten
(Stampfer et al., 2010). Dennoch wird diskutiert, dass die bekannte gB Struktur der „PostFusion“-Konformation entspricht, und ein hypothetisches Modell für die „Pre-Fusion“Struktur wurde generiert (Backovic et al., 2009; Heldwein et al., 2006; Rücker, 2011). Die
relative Lage von AD-4 verändert sich in diesem Modell, jedoch nicht die Konformation von
AD-4. Diese Daten sind auch im Einklang mit den strukturellen Daten zu AD-4, wie sie in
dieser Arbeit beschrieben wurden. Wie bereits erwähnt, induziert die Bindung von SM5-1
keine konformationellen Veränderungen in AD-4, was jedoch für Gesamt-gB nicht
ausgeschlossen werden kann. Ob AD-4-spezifische Antikörper über andere Mechanismen
HCMV neutralisieren, kann an dieser Stelle nicht geklärt werden.
Antikörper können die Virusfreisetzung aus infizierten Zellen (Gerhard, 2001) oder die
Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle („Cell-Cell-Spread“) inhibieren (Burioni et al., 1994;
Pantaleo et al., 1995). AD-4-spezifische Antikörper sind in der Lage sowohl das freie Virus zu
neutralisieren als auch die zellassoziierte Ausbreitung zu verhindern. Sie vermindern „CellCell-Spread“ in Fibroblasten weniger effizient als in Epithelzellen, was mit dem unterschiedlichen Infektionsmechanismus assoziiert sein kann. Hingegen ist die Neutralisationskapazität
zelltyp- und virusstammunabhängig (Pötzsch, 2010; Pötzsch et al., 2011). Daraus kann der
Schluss gezogen werden, dass AD-4-spezifische Antikörper eine wichtige Funktion bei der
Infektion
der
Zelle
blockieren.
Für
HCMV
gB
sind
auf
Grund
polymorpher
132 8 Diskussion
Sequenzen/Bereiche verschiedene Genotypen bekannt (Chou, 1992). AD-4 liegt jedoch
außerhalb dieser Bereiche und ist eine konservierte Domäne, wie eine Sequenzüberlagerung
des C-terminalen Fragmentes von AD-4 mit 46 HCMV gB Sequenzen, die in den Datenbanken
hinterlegt sind, ergab (Abbildung 8-4). An Hand dieses Sequenzvergleiches lässt sich
erkennen, dass AD-4 in zwei Gruppen unterteilt werden kann, basierend auf
Sequenzunterschieden in der α-Helix. Das funktionelle Epitop (YK364/79) der SM-Antikörper
ist vollständig konserviert. Die Kontakt-AS, die strukturell bestimmt wurden, sind
größtenteils ebenfalls konserviert, mit wenigen Ausnahmen an der Stelle ED361/62. Somit
erfüllen die SM-Antikörper die Kriterien eines „Broadly Neutralizing Antibody“, wie sie für
HIV oder Influenza beschrieben wurden (Corti et al., 2011; Ekiert et al., 2009; Ekiert et al.,
2011; Walker et al., 2009). Konservierte Bereiche gelten als Regionen, die wichtige
Funktionen ausführen. Über die komplement-unabhängige Neutralisation von HCMV durch
AD-4-spezifische Antikörper kann darauf geschlossen werden, dass durch sie eine wichtige
Funktion während der Infektion blockiert wird. Dies wird einerseits auch durch die
verlangsamte Replikationskinetik eines rekombinanten Virus, als Folge der Mutation von
YKK364/78/79,
und
andererseits
durch
das
Fehlen
natürlich
vorkommender
„Escapemutanten“ bestätigt. Für HSV (Highlander et al., 1989) oder auch für HCMV wurden
Antikörper-„Escapemutanten“ beschrieben, die in vitro generiert wurden (Manley et al.,
2011). Interessanteweise entwickelte HCMV gegen den gH-spezifischen Antikörper MSL-109
dabei keine Mutationen im Antigen, sondern der Antikörper wird von der infizierten Zelle
aufgenommen und in die neuen Viren integriert, die dann über den Fc-Teil des IgG-Moleküls
neue Zellen infizieren konnten (Manley et al., 2011). Dies ist ein durchaus untypischer
„Escapemechanismus“ (Eisenberg et al., 2011), da die Resistenz des Virus relativ schnell
auftritt, allerdings auch schnell verschwindet, falls kein Selektionsdruck besteht. Im
Gegensatz zu einer Resistenz, die über Mutationen in das virale Genom eingeführt wird. Dies
zeigt, dass Viren unterschiedliche Mechanismen besitzen, um dem Immunsystem des Wirtes
zu entkommen. In Bezug auf die Daten von Manley et al. (2011) sollte die Entstehung von
„Escapemutanten“ unter Selektionsdruck eines SM-Antikörpers untersucht werden, um
mögliche virale Resistenzbildung bestimmen zu können. SM-Antikörper neutralisieren nicht
nur ein breites Spektrum an HCMV-Isolaten (Pötzsch, 2010), sondern blockieren auch die
Infektion unterschiedlicher Zellarten. Der Zelltropismus wird wahrscheinlich durch die
akzessorischen Proteine gO oder UL128-131, die im Komplex mit gH/gL vorliegen, definiert
8 Diskussion 133
(Hahn et al., 2004). SM-Antikörper neutralisieren das Virus jedoch davon unabhängig, da sie
wahrscheinlich eine Funktion inhibieren, die für die Infektion aller Zelltypen kritisch ist.
134 8 Diskussion
Abb. 8-4. Sequenzvergleich des C-terminalen AD-4-Fragmentes mit HCMV-Isolaten. Die gB AS-Sequenzen aus
den Datenbanken (gekennzeichnet durch die „Accession Number“, links) wurden gegen den C-terminalen Teil
der AD-4-Sequenz (AS 344-438) des HCMV-Stammes AD169 (ACL51135.1) abgeglichen. Die α-Helix von AD-4
wurde als Ribbon-Diagramm dargestellt (oben). Sternchen symbolisieren Identität. Die Kontakt-AS, wie sie
durch die Kristallstrukturanalyse bestimmt werden konnten, sind rot gekennzeichnet. Die funktionellen ASReste YK364/79 sind grün unterlegt.
Da SM-Antikörper an ein konserviertes Epitop binden und die Infektion unterschiedlicher
Zellen blockieren, wären diese hu-mAbs vielversprechende Kandidaten für die Therapie in
Transplantationspatienten oder für die passive Immunisierung von schwangeren Frauen bei
einer Primärinfektion. Passiver Transfer von HCMV HIS wirkt sich positiv auf die HCMVProblematik sowohl in
Transplantationspatienten
als auch
kongenital infizierten
Neugeborenen aus (Nigro et al., 2005; Snydman et al., 1995; Zaia, 1993). Zudem trägt der
mütterliche HCMV-Serostatus auch entscheidend zum Schutz des Kindes bei (Fowler et al.,
1992). AD-4 wäre auch ein erfolgversprechender Vakzinekandidat, da neutralisierende
Antikörper mit hoher Frequenz nach Infektion induziert werden. Dies stellt einen
entscheidenden Vorteil zu Gesamt-gB dar, gegen das hauptsächlich nicht-neutralisierende
Antikörper gebildet werden, wie eine Analyse des B-Zell-Repertoires in HCMV-positiven
Individuen ergab (Pötzsch et al., 2011). Zwei Vakzinierungsstudien mit rekombinant
exprimierten gB aus CHO Zellen und MF59 als Adjuvans konnten bereits einen Teilerfolg
erzielen (Griffiths et al., 2011; Pass et al., 2009), es konnte jedoch keine sterile Immunität
nach Immunisierung mit gB erzeugt werden. Als mögliche Ursache hierfür kann angeführt
werden, dass induzierte Antikörper keine virusneutralisierenden Eigenschaften besitzen und
somit sind sie nicht gegen funktionelle Bereiche in gB gerichtet. Die Effektivität der meisten
erfolgreichen Vakzine korreliert hingegen mit der Bildung von neutralisierenden Antikörpern
(Amanna et al., 2008; Burton, 2002; Plotkin, 2001).
In der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte Analyse/Charakterisierung des AD-4Epitops hinsichtlich Funktion und Struktur durchgeführt, die zahlreiche Erkenntnisse
bezüglich
der
humoralen
Immunantwort
gegen
HCMV
gB
liefert.
Gegen
die
immundominante Domäne AD-4 werden nach der Infektion mit HCMV hauptsächlich
neutralisierende Antikörper induziert, die eine für die Replikation wichtige Funktion von gB
blockieren. Innerhalb von AD-4 konnten mehrere antikörperbindende Regionen identifiziert
werden. Das funktionelle YK-Epitop scheint eine dominante Rolle bei der Induktion von
8 Diskussion 135
AD-4-spezifischen Antikörpern einzunehmen. Durch die Einführung von Mutationen in das
virale Genom wurde der Befund erhalten, dass auch das Neutralisationspotential von AD-4spezifischen Antikörpern von dem YK-Epitop abhängig ist. Des Weiteren wurden während
dieser Arbeit strukturelle Daten zu AD-4, dem humanen AD-4-spezifischen Antikörper SM5-1
und deren Komplex generiert. Es sind die ersten Strukturanalysen von HCMV gB und eines
herpesviralen gB-spezifischen, neutralisierenden Antikörpers im Komplex mit seinem
Antigen. Das strukturelle Epitop ließ erkennen, dass die hohe Affinität von SM5-1 in den
multiplen Kontakten, die zwischen Antigen und Antikörper gebildet werden, begründet ist.
Die strukturell bestimmte Binderegion von AD-4 entsprach nicht zu 100% dem funktionellen
Epitop, denn der AS-Rest Y364 wurde nicht als direkter Interaktionspartner identifiziert.
Diese Daten dienen der Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCMV, denn die Induktion von
„Broadly Neutralizing Antibodies“ nach Immunisierung wird als Leitfaden für die Entwicklung
von Impfstoffen angesehen (Burton et al., 2005; Ekiert et al., 2009; Ekiert et al., 2011;
Walker & Burton, 2008; Walker et al., 2011).
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10 Abkürzungsverzeichnis 161
10 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen
3D
aa
Abb.
AD
ADCC
AIDS
ALVAC
ARPE19
AS
ATCC
ATP
BAC
bp
bzw.
ca.
CCR
CD
CDC
CDR
CH1
CHO
CL
CMV
Cos7
C-Terminus
Cy3
Dapi
DMEM
DMSO
DNA
dNTP
ds
DTT
E. coli
EBM
EBV
ECL
EDTA
EGTA
ELISA
et al.
FKS
FR
gB (H, L, M, N, O)
gC
GST
HA
H-Brücke
3-dimensional
amino acid
Abbildung
Antigene Domäne
Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity
Acquired Immunodeficiency Syndrome
Canary Pox Virus
Humane retinale Pigmentephitelzellen
Aminosäure
American Type Culture Collection
Adenosintriphosphat
Bacterial Artificial Chromosome
Basenpaar
beziehungsweise
circa
Combined Chain Reaction
Circulardichroismus
Complement Dependent Cytotoxicity
Complementarity Determining Region
Konstante Region der schweren Kette
Zelllinie aus Ovarien des chinesischen Hamsters
Konstante Region der leichten Kette
Cytomegalovirus
Nierengewebszellen von Grünen Meerkatzen
Carboxy-Terminus
Cyanin-Farbstoff
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleosidtriphosphat
Doppelstrang
Dithiothreitol
Escherichia coli
Endothelial cell basal medium
Epstein-Barr Virus
Enhanced Chemiluminescence
Ethylendiamintetraessigsäure
Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et alii/alia
Fetales Kälberserum
funktionelle Region
Glykoprotein B (H, L, M, N, O)
Glykoproteinkomplex
Glutathion-S-Transferase
Hämagglutinin
Wasserstoffbrückenbindung
162 10 Abkürzungsverzeichnis
HCDR
HCMV HIS
HCMV
HFF
HHV
HIV
HPSG
HRP
HSV
hu-mAb
HUVEC
i. p.
i. v.
IC50
IE
IF
Ig (G oder M)
IMAC
IPTG
k. B.
Ka
Kd
KD
KSHV
LAP
LB
LCDR
LFR
LS
MCMV
MCS
MEM
moi
MRC5
mRNA
mu-mAb
n
n. b.
N-Terminus
OD
ORF
P
PAA
PAGE
PBSo
PCR
PDB
PDGF
pH
r
rmsd
Complementarity Determining Region der schweren Kette
HCMV-Hyperimmunserum
Humanes Cytomegalovirus
Humane Vorhautfibroblasten
Humanes Herpesvirus
Humanes Immundefizienz Virus
Heparansulfat Proteoglykan
Meerrettichperoxidase
Herpes Simplex Virus
Humaner monoklonaler Antikörper
Humane Nabelvenen Endothelzellen
Intraperitoneale Applikation
Intravenöse Applikation
IgG Konzentration bei der 50% des Virus neutralisiert sind
Immediate Early
Indirekte Immunfluoreszenz
Immunglobulin (der Klasse G oder M)
Immobilisierte Metallionenaffinitäts-Chromatographie
Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
keine Bindung
Assoziationskonstante
Dissoziationskonstante
Gleichgewichtskonstante
Kaposi Sarkom-assoziiertes Herpesvirus
Luciferase assay Puffer
Luria-Bertani
Complementarity Determining Region der leichten Kette
Framework Region der leichten Kette
Luciferin Solution
Murines Cytomegalovirus
Multiple Cloning Site
Minimal essential medium
Multiplicity of infection
Humane fetale Lungenfibroblasten
Messenger Ribonukleinsäure
Muriner monoklonaler Antikörper
Anzahl
nicht bestimmt
Amino-Terminus
Optische Dichte
Open Reading Frame
Signifikanzwert
Polyacrylamid
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Phospate buffered saline
Polymerasekettenreaktion
Protein Data Bank
Platelet-derived growth factor
potentia Hydrogenii
Spearman-Korrelationskoeffizient
Root Mean Square Deviation
10 Abkürzungsverzeichnis 163
rpm
RPMI
RT
RV
S.
SAP
SD
SDS
SOC
SPR
SV
Tab.
TBE
TEMED
TM
TMB
Tris
USA
v/v
VH
VL
VRP
VZV
w/v
z. B.
ZNS
Umdrehungen pro Minute
Roswell Park Memorial Institute
Raumtemperatur
Rekombinantes Virus
Seite
Shrimps Alkaline Phosphotase
Standardabweichung
Natriumdodecylsulfat
Super Optimal Broth
Surface Plasmon Resonance
Säulenvolumen
Tabelle
Tri-Borat-EDTA
N,N,N′,N′-Tetramethylethan-1,2-diamin
Transmembrandomäne
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol
Vereinigte Staaten von Amerika
Volumenprozent
Variable Region der schweren Kette
Variable Region der leichten Kette
Alphavirus Replicon Particle
Varizella-Zoster Virus
Gewichtsprozent
zum Beispiel
Zentrales Nervensystem
Einheiten
Vorsatzzeichen
°C
Å
AU
Da
deg
F
g
h
IU
l
m
M
min
mol
RLU
RU
sek
U
V
Ω
k
c
m
µ
n
Grad Celsius
Ångström
Adsorption Unit
Dalton
Degree
Farad
Gramm
Stunde
Infectious Unit
Liter
Meter
Molar
Minute
Mol
Relative Light Unit
Responce Unit
Sekunde
Unit
Volt
Ohm
3
kilo (10 )
-2
centi (10 )
-3
milli (10 )
-6
mikro (10 )
-9
nano (10 )
Griechische Buchstaben
α
β
γ
Ω
λ
µ
alpha
beta
gamma
omega
lambda
mü
Basen
A
C
G
T
N
Adenin
Cytosin
Guanin
Thymin
A, C, G oder T
164 10 Abkürzungsverzeichnis
Aminosäuren: Dreibuchstaben- und
Einbuchstabencode
Alanin
Arginin
Asparagin
Asparaginsäure
Cystein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionin
Phenylalanin
Prolin
Serin
Threonin
Tryptophan
Tyrosin
Valin
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
A
R
N
D
C
Q
E
G
H
I
L
K
M
F
P
S
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W
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Publikationen, Patent, Teilnahmen an Kongressen 165
Publikationen, Patent, Teilnahmen an Kongressen
Publikationen
„Characterization of a discontinuous neutralizing epitope on glycoprotein B of human
cytomegalovirus.”
Nadja Spindler, Pia Rücker, Sonja Pötzsch, Uschi Diestel, Heinrich Sticht, Luis Martin-Parras, Thomas H. Winkler
und Michael Mach
(Erstautorschaft, eingereicht bei Journal of Virology im Februar 2013)
„Protective humoral immunity.” In: Cytomegaloviruses – From Molecular Biology to
Intervention (Ed.: M. Reddehase).
Michael Mach, Anna-Katharina Wiegers, Nadja Spindler und Thomas H. Winkler
(Co-Autorschaft, Buch, in Press bei Caister Academic Press)
„B cell repertoire analysis identifies new antigenic domains on glycoprotein B of human
cytomegalovirus which are target of neutralizing antibodies.”
Sonja Pötzsch*, Nadja Spindler*, Anna-Katharina Wiegers, Tanja Fisch, Pia Rücker, Heinrich Sticht, Nina Grieb,
Tina Baroti, Florian Weisel, Thomas Stamminger, Luis Martin-Parras, Michael Mach und Thomas H. Winkler
(*Geteilte Erstautorschaft, publiziert bei PLoS Pathogens im August 2011; PLoS pathogens 7, e1002172)
Patent
European patent application EP 10003669 (eingereicht im Dezember 2009, Mitinhaberin des
Patentrechts)
Kongressteilnahmen
10/2012
International Symposium on Regulators of Humoral Immunity,
Erlangen
08/2012
IHW – 37th Annual International Herpesvirus Workshop,
Calgary, Kanada
„Fine specificity of neutralizing human monoclonal antibodies binding to the
antigenic domain 4 of glycoprotein B of human cytomegalovirus.”
(Vortrag, Poster)
166 Publikationen, Patent, Teilnahmen an Kongressen
06/2012
International Symposium “Forty Years of Virology at the
University Erlangen-Nuremberg”, Erlangen
„Identification of critical binding sites within the antigenic domain 4 of
glycoprotein B of human cytomegalovirus.”
(Poster)
07/2011
IHW – 36th Annual International Herpesvirus Workshop,
Danzig, Polen
„Identification of critical binding sites within the antigenic domain 4 of
glycoprotein B of human cytomegalovirus.”
(Vortrag, Poster)
03/2011
21st Annual Meeting of the “Gesellschaft für Virologie“ 2011,
Freiburg im Breisgau
„Characterization of the antigenic domain 4 of glycoprotein B of HCMV.”
(Poster)
2010
4th European Congress of Virology / Annual Spring Meeting of
the “Gesellschaft für Virologie” 2010, Comer See, Italien
„Characterization of a new antigenic domain on glycoprotein B of human
cytomegalovirus that is target of neutralizing antibodies.”
(Vortrag, Poster)
2009
19th Annual Meeting of the “Gesellschaft für Virologie“ 2009,
Leipzig
“Identification of a novel immunodominant antigenic domain on
glycoprotein B of human cytomegalovirus that is target of neutralizing
antibodies.”
(Poster)
Danksagung 167
Danksagung
Ich möchte mich bei allen herzlich bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben und mich unterstützt haben. Insbesondere gilt ein großer Dank …
… Herrn Prof. Dr. Michael Mach für die Ermöglichung meines Promotionsvorhabens und die
kompetente Betreuung dieser Arbeit. Ich danke ihm für seine Diskussionsbereitschaft, für
seine Ratschläge und für die hervorragenden Arbeitsvoraussetzungen.
… Herrn Prof. Dr. Lars Nitschke für die Erstellung des Zweitgutachtens.
… Herrn Prof. Dr. Bodo Plachter für die Anfertigung des Drittgutachtens.
… Herrn Prof. Dr. Thomas H. Winkler für sein großes Interesse an diesem Projekt und seine
fachliche Unterstützung.
… Herrn Prof. Dr. Heinrich Sticht und Dr. Pia Rücker für die Erstellung eines HCMV gB
Modells und für die Hilfe bei bioinformatischen Fragestellungen.
… Herrn Prof. Dr. Yves Muller und Uschi Diestel für die erfolgreiche und freundliche
Zusammenarbeit im Kristallstrukturprojekt. Ich bedanke mich bei Uschi Diestel für ihre Hilfe
bei der CD-Spektroskopie und ihre Leistung bei der Aufklärung der Kristallstrukturen.
… Claudia Eberhardt und Dr. Thomas Simon für ihre Hilfe bei der Durchführung von
Experimenten.
… meinen Arbeitskolleginnen Anna Bootz, Dr. Monika Dietz, Dr. Astrid Karbach, Barbara
Kropff, Dr. Sonja Pötzsch und Anna-Katharina Wiegers für die freundschaftliche Atmosphäre,
Hilfsbereitschaft, Zusammenarbeit und Diskussion. Bei Anna Bootz bedanke ich mich für ihre
Hilfe mit den Mäusen. Barbara Kropff danke ich für ihre wertvollen Ratschläge bei der
Durchführung der experimentellen Arbeit.
… meiner Mama, die mich in allen Lebenslagen unterstützt und für mich da ist. Ich danke dir
für alles, was du mir ermöglicht hast!
… meinem Mann für seine Liebe, sein Verständnis und seine Freundschaft. Ich danke dir für
die Unterstützung und die Zuneigung, die du mir entgegenbringst!