Die Homeostase und Aktivierung von NKT
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Aus dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin Abteilung Immunologie Die Homeostase und Aktivierung von NKT-Zellen und Lipid restringierten T-Lymphozyten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Vorgelegt 2007 von Vera Schwierzeck geboren in Emmendingen Dekan: Prof. Dr. Ch. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. Drs. h.c. H. E. Blum 2. Gutachter: Prof. Dr. U. E. Schaible Jahr der Promotion: 2007 I Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... IV Tabellenverzeichnis ................................................................................................ V Abkürzungen .......................................................................................................... VI Zusammenfassung.................................................................................................. 1 Summary.................................................................................................................. 2 1 Einleitung.......................................................................................................... 3 1.1 Grundzüge der Immunologie...................................................................... 3 1.1.1 Bestandteile des Immunsystems............................................................ 3 1.1.2 Zellen des Immunsystems...................................................................... 4 1.1.3 Konzepte der Immunität ......................................................................... 6 1.1.4 Entwicklung des Immunsystems ............................................................ 9 1.2 Angeborenes Immunsystem .................................................................... 10 1.2.1 Rezeptoren des angeborenen Immunsystems ..................................... 10 1.2.2 Zellen des Angeborenen Immunsystems ............................................. 11 1.3 Adaptives Immunsystem .......................................................................... 12 1.3.1 Rezeptoren des Adaptiven Immunsystems .......................................... 12 1.3.2 Zellen des Adaptiven Immunsystems................................................... 13 1.3.3 Die Adaptive Immunantwort ................................................................. 13 1.4 Antigen Präsentation................................................................................ 15 1.4.1 MHC-I .................................................................................................. 15 1.4.2 MHC-II ................................................................................................. 19 1.4.3 CD1 ..................................................................................................... 21 1.5 Infektion mit Tuberkulose ......................................................................... 25 1.5.1 Mycobacterium tuberculosis................................................................. 26 1.5.2 Infektionsabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis .......................... 27 2 Fragestellungen ............................................................................................. 29 3 Materialien ...................................................................................................... 31 3.1 Mäuse...................................................................................................... 31 3.2 Zellen....................................................................................................... 31 II 4 5 3.3 Antigene .................................................................................................. 31 3.4 Antikörper und Zytokine ........................................................................... 32 3.5 Geräte...................................................................................................... 32 3.6 Chemikalien ............................................................................................. 33 3.7 Reagenzien.............................................................................................. 34 3.8 Zellkulturmedium...................................................................................... 36 3.9 Software .................................................................................................. 36 3.10 Verschiedenes ......................................................................................... 36 Methoden ........................................................................................................ 38 4.1 Mäuse...................................................................................................... 38 4.2 Isolation von NKT-Zellen.......................................................................... 38 4.3 Adoptive Transfer Versuche..................................................................... 39 4.4 Isolation von Leber- und Milzzellen .......................................................... 40 4.5 Analyse der Transferversuche ................................................................. 41 4.6 Zell-Linien und Antigene .......................................................................... 41 4.7 Transfektion ............................................................................................. 42 4.8 T-Zellkultur............................................................................................... 43 4.9 Isolierung und Kultur von DC ................................................................... 43 4.10 FACS-Analyse der Transfektanten........................................................... 44 4.11 Enzyme-Funktionsversuche..................................................................... 45 4.12 T-Zell Proliferationsassay......................................................................... 46 4.13 Fluoreszenz-Mikroskopie ......................................................................... 47 4.14 Konfokale Mikroskopie............................................................................. 48 4.15 Liposomen-Assay .................................................................................... 49 4.16 Crosslinker-Studien.................................................................................. 50 Ergebnisse...................................................................................................... 52 5.1 Adoptiver Transfer von NKT-Zellen.......................................................... 52 5.2 Proliferationsverhalten von NKT-Zellen in Milz und Leber ........................ 54 5.3 Generierung von APC.............................................................................. 57 5.4 SAP-C ist essentiell für die Antigenpräsentation ...................................... 58 5.5 Das lysosomale Kompartiment der PSAP-/--APC ist funktionstüchtig........ 60 5.6 Kolokalisation von Antigen, CD1b und SAP-C im Lysosom...................... 62 5.7 Wechselwirkung von SAP-C und CD1b ................................................... 64 III 5.8 6 7 Substrat- und Enzymaktivierung durch SAP-C......................................... 67 Diskussion ...................................................................................................... 70 6.1 Homeostase und Homingverhalten von NKT-Zellen................................. 70 6.2 SAP sind essentielle Helfermoleküle für CD1b......................................... 75 6.3 Funktionen der Saposine in der Antigenpräsentation ............................... 77 6.4 Die Spezifität der Saposine...................................................................... 82 6.5 Regulationsmechanismen der Saposine .................................................. 84 6.6 Weitere Aufgaben der Saposine im Immunsystem................................... 87 Literatur .......................................................................................................... 89 Publikationen....................................................................................................... 106 Danksagung......................................................................................................... 107 Lebenslauf ........................................................................................................... 108 IV Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Die Zwei Signal-Theorie........................................................................ 8 Abbildung 2: Antikörper- und TZR-Grundstruktur..................................................... 12 Abbildung 3: Th1- und Th2-Antwort......................................................................... 14 Abbildung 4: Der MHC-I Komplex............................................................................ 16 Abbildung 5: Der MHC-II Komplex........................................................................... 17 Abbildung 6: Die Beladung des MHC-I Komplexes.................................................. 18 Abbildung 7: Antigenprozessierung im MHC-I Präsentationsweg ............................ 19 Abbildung 8: Antigenprozessierung im MHC-II Antigenpräsentationsweg................ 20 Abbildung 9: Der CD1d-Komplex............................................................................. 22 Abbildung 10: CD1d-Antigenpräsentationsweg ....................................................... 25 Abbildung 11: Isolierung von Monozyten ................................................................. 44 Abbildung 12: Grundprinzipien der Durchflusszytometrie ........................................ 45 Abbildung 13: Prinzip des Proliferationsassays ....................................................... 47 Abbildung 14: Techniken der Fluoreszenz-Mikroskopie........................................... 48 Abbildung 15: Grundprinzipien der Fluoreszenz ...................................................... 49 Abbildung 16: Das Überleben von NKT-Zellen ist unabhängig von CD1d................ 53 Abbildung 17: Verteilungsverhalten und Überleben von NKT-Zellen ....................... 56 Abbildung 18: Die Leber bietet NKT-Zellen optimale Lebensbedingungen .............. 56 Abbildung 19: Transfektionsfibroblasten.................................................................. 57 Abbildung 20: Mykolsäure und GMM....................................................................... 58 Abbildung 21: Die Präsentation von mykobakteriellen Lipiden ist abhängig von SAP-C.................................................................... 59 Abbildung 22: Das Lysosom ist bei Prosaposin Defizienz intakt .............................. 61 Abbildung 23: Die Kolokalisation von SAP-C, LAM und CD1b................................. 63 Abbildung 24: Die Interaktion von SAP-C und CD1b ............................................... 65 Abbildung 25: Übersicht über den Sphingolipidmetabolismus.................................. 68 Abbildung 26: Die Funktion von SAP-C ................................................................... 69 Abbildung 27: Saposine in der CD1-Antigenpräsentation ........................................ 81 Abbildung 28: Die Sushi-Struktur der Saposin Moleküle.......................................... 83 Abbildung 29: Regulation der Saposine durch Cathepsin L ..................................... 86 Abbildung 30: Saposine in Antigenpräsentation und Sphingolipidmetabolismus...... 88 V Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Einfache Abwehrmechanismen im Schutz vor Infektionen ........................ 3 Tabelle 2: Postulate der Klonalen Selektionshypothese ............................................ 6 Tabelle 3: Die Entwicklung der Angeborenen- und Adaptiven Immunität................... 9 Tabelle 4: TLR und ihre Liganden ........................................................................... 11 Tabelle 5: Phasen im Homingverhalten von Lymphozyten ...................................... 55 VI Abkürzungen AP Adaptor Protein APC Antigenpräsentierende Zellen (engl. antigen presenting cells) APC Abkürzung wird auch für das Fluorochrom Allophycocyanin verwendet AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BCG Bacille-Calmette-Guerin BgVV Bundesministerium für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin BSA Bovines Serum Albumin B-Zelle B-Zelle, ursprünglich „aus der Bursa fabricii stammende Zelle“ BZR B-Zell Rezeptor bzw. beziehungsweise C Kohlenstoff ºC Grad Celsius ca. circa, ungefähr CCR Zytokin Rezeptor CD Leukozytendifferenzierungsantigen (engl. cluster of differentiation) CD1dKO Mäuse mit einer Defizienz des CD1d-Gens CFSE Carboxyfluorescein Diacetat Chol Cholesterin Ci Curie CLIP Klasse II assoziiertes nicht-variables Protein (engl. class II associated invariant chain peptide) cm Zentimeter CpG Cytosin-phosphatidyl-Guanosin Dinukleotid c.p.m gemessener radioaktiver Teilchenzerfall pro Minute (engl. counts per minute) DC Dendritische Zellen (engl. dendritic cells) DMEM Dulbeccos Modifikation von Eagles Medium DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiotreitol VII ELISA Enyzmgekoppelter Immunadsorptionstest (engl. Enzyme-linked immunosorbant assay engl. als englischer Fachausdruck ER Endoplasmatisches Retikulum etc. et cetera Fab Antigen bindendes Fragment, (engl. fragment antigen binding) FACS Fluoreszenz-Aktivierte Zellsortierung FasL Fas Ligand Fc Kristallisierbares Fragment (engl. fragment cristallizable) FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS Fötales Kälberserum GalCer alpha-Galaktosylceramid G418 Geneticinsulfat GD3 Disialogangliosid GMCSF Granulozyten- und Monozyten-Kolonie stimulierender Faktor GMM Glukosemonomykolat GM2AP GM2-Aktivatorprotein Gy Gray h Stunde HBV Hepatitis B HCV Hepatitis C HIV Humanes Immundefizienz Virus HLA Humane Leukozyten Antigene Ig Immunglobulin iGb3 Isoglobotrihexosylceramid Ii nicht-variable Proteinkette (engl. invariant chain associated peptide) IL-4 Interleukin INF Interferon kDa Kilodalton LAM Lipoarabinomannan LAMP-1 Lysosomen-assoziiertes Membranprotein 1 lat. lateinisch für LPS Lipopolysaccharid m Meter VIII MACS Magnetische Zell Sortierung mg Milligramm MHC Hauptgewebsverträglichkeits-Komplex (engl. major histocompatibility complex) MIIC Klasse-II-artige Kompartimente min Minuten mM Millimol µCi Microcurie µg Microgramm µl Microliter µm Micrometer µM Micromol NK Zelle Natürliche Killerzelle NKT-Zelle Natürliche Killer T-Zelle nm Nanometer Normal wird verwendet für humane Wildtyp-Fibroblasten OD Optische Dichte PAF Plättchenaktivierender Faktor PAMPs Pathogen-assoziierte, molekulare Motive (engl. Pathogenassociated molecular patterns) PBS Phosphat gepufferte Salzlösung PC Phosphatidylcholin PE Phycoerythrin pH potentia hydrogenii PI Phosphatidylinositol PIM Phosphatidylinositolmannosid PRRs Motiv erkennende Rezeptoren (engl. pattern recognition receptors) PS PSAP Phosphatidylserin -/- Prosaposin Defizienz RNA Ribonukleinsäure RNI Vorstufen von reaktiven Stickstoffverbindungen ROI Vorstufen von reaktiven Sauerstoffverbindungen rpm Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute) RT Raumtemperatur SAP saposin IX SPF Spezifisch Pathogen-freie Bedingungen ST Standardbedingungen für die Zellkultur, 37C und 5% CO2 TAP Transporter assoziiert mit Antigenpräsentation TGN Trans Golgi Netzwerk Th1 T-Helferzellen vom Typ 1 Th2 T-Helferzellen vom Typ 2 TLR Toll-ähnlicher Rezeptor TNF Tumor Nekrose Faktor T-Zelle ursprünglich benannt nach ihrem Entstehungsort, „aus dem Thymus stammend“ TZR T-Zell Rezeptor U Einheit (engl. unit) UV Ultraviolettes Licht V14 Mäuse, die transgen für den TZR V14 J281 sind vgl. zum Vergleich Vol% Volumen-Prozent WHO Weltgesundheitsorganisation (engl. World Health Organization) WT Wildtyp ZTL zytotoxischer T-Lymphozyt 1 Zusammenfassung Zusammenfassung Ende der 80er Jahre wurde ein Dogma der Immunologie gebrochen: man entdeckte CD1 Proteine als Antigenpräsentationssystem für Lipide. Bis dahin hatte man geglaubt, dass nur Proteine Immunzellen aktivieren können. Im menschlichen Immunsystem existieren fünf CD1 Moleküle (CD1a-CD1e). Diese Antigenpräsentationsmoleküle erkennen verschiedene Lipide und aktivieren dadurch Lipid restringierte T-Lymphozyten (CD1a-CD1c) bzw. NKT-Zellen (CD1d). Die vorliegende, experimentelle Dissertation untersucht die Homeostase und Aktivierung dieser beiden Lymphozyten Populationen. NKT-Zellen haben im Tiermodel eine regulierende Funktion bei der Tumorabwehr, Infektionen und Autoimmungeschehen gezeigt. Ihre Aktivierung über CD1d führt zur Ausschüttung von IL4 und IFN-. NKT-Zellen werden im Thymus auf CD1d Moleküle selektiert. Es war jedoch unbekannt, welche Faktoren Homeostase und Überleben von NKT-Zellen in der Peripherie bestimmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten beweisen, dass murine NKT-Zellen in ihrem Überleben nicht von der CD1dExpression abhängig sind. Weitere adoptive Transfer Versuche konnten erstmalig zeigen, dass die Dominanz hepatischer NKT-Zellen auf die Expansion dieser Zellen zurückzuführen ist. Viele Lipid-reaktive T-Zell Linien werden durch die Präsentation von mykobakteriellen Lipiden aktiviert. Da die Tuberkulose bis heute weltweit zu den Haupttodesursachen unter den Infektionskrankheiten zählt, besteht ein großes Interesse, die Grundlagen dieser Immunantwort aufzuklären. Dabei war jedoch unbekannt, welche Hilfsmoleküle CD1b Moleküle beladen, um Lipid-reaktive T-Zellen zu aktivieren. Diese Dissertation konnte Prosaposin als das gesuchte Hilfsmolekül im CD1b Antigenpräsenationsweg identifizieren. Damit wurde ein großer Meilenstein in der Immunologie der Lipide erreicht. Mit Hilfe von Protein- und Biochemischen Methoden wurde darüber hinaus der Funktionsmechanismus von Prosaposin geklärt. Diese Moleküle aktivieren Lipidantigene im Lysosom und vermitteln anschließend den Kontakt mit CD1b. Dieser Vorgang führt zur Bindung von CD1b und Ligand und damit zur Aktivierung der Lipid-reaktiven T-Zellen. Zusammenfassend beantwortet diese Dissertation grundlegende Fragen der CD1-Immunantwort und ebnet damit den Weg, dieses System für therapeutische Zwecke nutzen zu können. 2 Summary Summary The late 80’s brought the end to one of the great dogmas in immunology: CD1 proteins were discovered as an antigen presenting system for lipids. Until then only proteins were believed capable to activate immune cells. There are five different CD1 molecules in the human immune system (CD1a-CD1e). They recognize various lipids and are able to activate lipid restricted T-lymphocytes (CD1a-CD1c) or NKT-cells respectively (CD1d). This experimental dissertation examines the homeostasis and activation of these two lymphocyte subpopulations. NKT-cells have shown a regulatory function in various animal models for tumor defence, infection and autoimmunity. If activated via CD1d, they rapidly secrete vast amounts of IL4 and INFγ. NKT cells are selected on CD1d molecules inside the thymus. However, it has not been known which factors determine the homeostasis and survival of these cells in the periphery. The results of this thesis prove that the fate of murine NKT-cells is not dependent on CD1d-expression. In addition adoptive transfer experiments demonstrated for the first time that the striking dominance of hepatic NKT-cells is caused by their rapid expansion in the liver. Several lipid-reactive T-cell lines are activated by the presentation of mycobacterial lipids via CD1b. Even today Tuberculosis is still one of the biggest killers among infectious diseases worldwide. For this reason there is a huge interest to understand the immune response towards mycobacterial lipids. Until now the accessory molecule which loads antigens onto CD1b before T-cell activation, has not been described. This thesis identified Prosaposin as the missing accessory molecule in the CD1b-antigen presentation pathway. This achievement marks a major milestone for the immunology of lipids. Furthermore protein chemistry and biochemical methods were used to clarify the mechanism of Prosaposin. These molecules activate lipid antigens within the lysosome and mediate their contact with CD1b. Subsequent binding of CD1b and its ligand leads to the activation of lipid-reactive T-cells. Overall, this dissertation answers fundamental questions in the CD1-immune response and paves the way to explore this system for therapeutic use. 3 1 Einleitung Einleitung Immunologie leitet sich von dem lateinischen Wort immunitas ab, sie ist die „Lehre der Unverletzbarkeit“ der Lebewesen. Die Aufgabe des Immunsystems ist, den Körper vor Körperfremdem oder Schädlichem zu schützen und gleichzeitig körpereigene Stoffe zu tolerieren. Dies bedeutet konkret: die Abwehr von Erregern oder Tumoren und die Vermeidung von Autoimmunität, das heißt die Zerstörung von gesundem, eigenem Gewebe. 1.1 Grundzüge der Immunologie 1.1.1 Bestandteile des Immunsystems Um den Organismus zu schützen, greift die Immunabwehr auf eine Vielzahl von Barrieren, Molekülen und Zellen zurück (siehe Tabelle 1). Physikalische und chemische Barrieren z.B. der Säureschutzmantel der Haut stellen die erste Verteidigungslinie des Körpers dar. Eine Vielzahl verschiedenartiger Proteine gehört zu den „molekularen“ Abwehrmechanismen. Tabelle 1: Einfache Abwehrmechanismen im Schutz vor Infektionen 74 Einfache Abwehrmechanismen im Schutz vor Infektionen Mechanisch Epithelzellen mit festen Zell-Zell Verbindungen, sog. „tight junctions“ Flüssigkeit-, Schleim- und Luftbewegung entlang der Epithelienoberfläche Chemisch Mikrobizide Fettsäuren (Haut) Lysozym in Speichel, Schweiß, Tränenflüssigkeit Pepsin im Magen-Darmtrakt Defensine (Haut, Magen-Darmtrakt) Normalflora Mikrobizide Proteine 4 Einleitung Ein Beispiel ist Lysozym, ein lytisches Enzym, das Bakterien auflösen kann. Das Protein wirkt dabei als Hydrolase und spaltet die β-1,4-Verknüpfungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin, die Peptidoglykane in grampositiven Bakterien stabilisieren99. Diese Fähigkeit wurde zuerst von Alexander Flemming beschrieben, der entdeckte, dass Lysozym in der Lage ist, das Bakterium Micrococcus lysodeikticus aufzulösen. Ein weiteres Beispiel für die molekularen Abwehrmechanismen unseres Immunsystems ist das Komplementsystem. Dabei handelt es sich um ein komplex reguliertes System, das aus einer Kaskade von Serinproteasen besteht. Komplementfaktoren können Pathogene lysieren, oder sie binden an die Oberfläche eines Erregers und markieren ihn für die Phagozytose durch Makrophagen. Außerdem rufen Komplementfaktoren eine Entzündungsreaktion hervor. Das Immunsystem mobilisiert seine Abwehrmechanismen und fokussiert sie auf ein Ziel. Zytokine und andere Entzündungsfaktoren erweitern die Gefäße und erhöhen den Blutfluss. Gleichzeitig erhöht sich die Durchlässigkeit der Gefäße, so dass Immunzellen in das Gewebe immigrieren können. 1.1.2 Zellen des Immunsystems Immunzellen erfüllen eine Vielzahl von Funktionen in unserer Körperabwehr und sind durch ein hochkomplexes System reguliert. Jede dieser Zellen stammt von einem gemeinsamen Vorläufer, der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle des Knochenmarks ab. Aus dieser „vielfähigen“, pluripotenten Zelle entwickelt sich die lymphatische und die myeloische Stammzellreihe. Die lymphatische Stammzellreihe differenziert sich zu natürlichen Killerzellen (NK Zellen), B-Lymphozyten und T-Lymphozyten aus. Die myeloische Stammzellreihe entwickelt sich zu Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) aus. Granulozyten verdanken ihren Namen den Granula (lat. Korn), Vesikeln, die eine „körnige“ Färbung des Zytoplasmas hervorrufen. Es gibt drei unterschiedliche Arten von Granulozyten: neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten. Diese Bezeichnung leitet sich von Färbeeigenschaften der Zellen mit Hämatoxylin-EosinFärbung ab. Neutrophile sind zur Phagozytose befähigt80. Die Granula der Neutrophilen enthalten Abwehrmoleküle wie Defensine und eine Reihe von Enzymen, z.B. Myeloperoxidase, Elastase, Kollagenase, Neuramidase oder Cathepsin G. Diese Stoffe erleichtern den Zellen zu Bakterien vorzudringen und diese unschädlich zu machen. Die Granula von eosinophilen Granulozyten enthalten basische Proteine und lassen sich mit Eosin 5 anfärben. Eosinophile sind ebenfalls Einleitung chemotaktisch79,137. Die Anzahl von Eosinophilen erhöht sich bei einer Infektion mit Parasiten und bei Allergien. Basophile Granulozyten speichern in ihren Granula Histamin, Heparin und den Plättchen aktivierenden Faktor (PAF), welche im Rahmen einer allergischen Reaktion ausgeschüttet werden108. Makrophagen, die „Riesenfresszellen“ tragen durch Phagozytose zum Schutz des Körpers bei. Zudem können Makrophagen als APC wirken und Zellen des adaptiven Immunsystems aktivieren149. DC gelten als Schlüsselfiguren in der adaptiven Immunantwort7. Unreife DC dagegen stellen eine Art Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem dar. Sie sind darauf spezialisiert, Antigene aufzunehmen und zu präsentieren. Parallel zu ihrem Reifungsprozess migrieren sie zu den lymphatischen Organen, welche die T-Zellen beherbergen und werden damit Teil der adaptiven Immunantwort95. DC gelten als die „besten“ APC, da sie eine stärkere T-Zellproliferation hervorrufen als Makrophagen oder B-Zellen. NK Zellen gehören zu der „unspezifischeren“ ersten Verteidigungslinie des Körpers und wirken zytolytisch. NK Zellen tragen im Gegensatz zu den Lymphozyten keine antigenspezifischen Rezeptoren auf ihrer Oberfläche12, 42. Die Besonderheit von B- und T-Zellen hingegen ist ihr antigenspezifischer Rezeptor (BZR bzw. TZR). BZR und TZR sind hochspezifisch für ihre Bindungspartner. Sie entstehen in den unreifen Lymphozyten durch eine zufällige Kombination von Genen32,120,161. Dabei entsteht eine Vielzahl von Rezeptoren, von denen jeder einzigartig ist. Der BZR ist nicht nur ein Rezeptor, sondern wird zudem von terminal differenzierten B-Zellen in löslicher Form als Antikörper in die Blutbahn sezerniert. Er besteht aus zwei Schwerketten (engl. „heavy chains“) und zwei Leichtketten (engl. „light chains“). Bei den Leichtketten unterscheidet man zusätzlich zwischen der Kappa- und der Lambda-Form. B-Zellen entwickeln sich im Knochenmark. Ihren Namen tragen die Zellen jedoch, weil sie zuerst bei Vögeln beschrieben wurden, und sich bei diesen Tieren in der Bursa Fabricii bilden. T-Zellen dagegen reifen im Thymus aus, daher werden sie als „aus dem Thymusstammende“ Lymphozyten bezeichnet. Der TZR der meisten T-Zellen verfügt über eine - und über eine -Kette ( T-Zellen). Nur eine Minderheit exprimiert einen TZR, der aus einer - und einer -Kette zusammengesetzt ist ( T-Zellen)136,15,114. Ein weiteres Kriterium teilt T-Lymphozyten nach ihren Corezeptoren CD4 und CD8 6 Einleitung ein. Die Abkürzung CD steht dabei für Differenzierungscluster (engl. Cluster of Differentiation). 1.1.3 Konzepte der Immunität Das Immunsystem ist ein komplexes System, einzelne Abläufe sind eng miteinander verwoben und bilden ein reguliertes Netzwerk aus. Ein System wird leichter durchschaubar, wenn man versteht, nach welchen Grundprinzipien es organisiert ist. Dementsprechend versuchten Immunologen die „Philosophie“ unseres Immunsystems zu ergründen und zu formulieren. Die klassische Immunologie ging davon aus, dass der Körper versucht, „Fremd“ von „Selbst“ zu unterscheiden. Dies bildet die Grundlage der so genannten „Stranger-Hypothese“ („Stranger“ engl. „Fremder“) . Eine neuere Hypothese, die „Danger-Hypothese“ („Danger“ engl. „Gefahr“), rückte später den Schwerpunkt auf die Unterscheidung zwischen „harmlos“ und „gefährlich“. Die Stranger-Hypothese basiert auf grundlegenden Entdeckungen der Immunologie. Schon Ende des 19. Jahrhunderts formulierte der Immunologe Elie Metchnikoff den Gedanken der „Dualität“ in der Immunität: sie etabliert einerseits die Identität eines Organismus und andererseits verteidigt sie seine Integrität. Diese Idee wurde von Sir Frank Macfarlane Burnet in den 40er und 50er Jahren erheblich erweitert107. Er teilte den Ablauf einer Immunantwort in drei Phasen ein: Erkennung, Amplifikation, Gedächtnis. Für die Phase der Amplifikation führte Burnet den Begriff der „Klonalen Expansion“ in die Immunologie ein (siehe Tabelle 2). Tabelle 2: Postulate der Klonalen Selektionshypothese74 Die vier Postulate der Klonalen Selektionshypothese Jeder Lymphozyt trägt einen Rezeptor einzigartiger Spezifität Bindet ein fremdes Antigen mit hoher Affinität an einen Rezeptor, führt dies zur Aktivierung des Lymphozyten Die Effektorzelle trägt den gleichen Rezeptor wie der aktivierte Lymphozyt, aus dem sie sich ursprünglich entwickelt hat Lymphozyten, deren Rezeptoren mit Selbst-Antigenen interagieren, werden in einem frühen Stadium der Entwicklung deletiert; sie sind im Repertoire der reifen Zellen nicht mehr vorhanden 7 Einleitung Darüber hinaus formulierte er die „Theorie der Klonalen Selektion“, die erklärt, wie unser Immunsystem lernt „Selbst“ als körpereigen zu identifizieren157. Damit prägte Burnet zusammen mit Peter Medawar den Begriff der „Toleranz“ für den Vorgang, der unser Immunsystem lehrt „Selbst“ als körpereigen zu identifizieren. Die Arbeit von Charles Janeway Jr. und Ruslan Medzhitov sind weitere Meilensteine der Immunologie und leisteten einen wichtigen Beitrag dazu, die Erkennung des „Fremd“ besser zu begreifen73. Eine Grundlage der Stranger-Theorie ist, körpereigene Stoffe als „Selbst“ zu identifizieren. Damit soll Autoimmunität verhindert werden. Die Voraussetzung dafür bildet die Hypothese, dass T-Zellen während der Neonatalperiode lernen, körpereigene Antigene als „Selbst“ zu tolerieren. Diesen Vorgang bezeichnet man als zentrale Toleranz115,169. Da nicht alle möglichen, körpereigenen Antigene im Thymus präsentiert werden können, müssen weitere, „periphere“ Mechanismen existieren, die diesen Prozess vervollkommnen158. Diese „periphere Toleranz“ verhindert, dass ausgereifte T-Zellen körpereigene Antigene, die nicht aus dem Thymus stammen, angreifen. Ein ähnliches Prinzip soll die Entwicklung autoreaktiver B-Zellen verhindern. Neben der Toleranz existiert ein weiterer Mechanismus, um den Körper vor Autoaggression zu schützen: die ZweiSignal-Theorie (Abbildung 1). Ihr zufolge benötigt man zwei Signale, um Lymphozyten zu aktivieren. Das erste Signal ist die Präsentation des Antigens und die Erkennung durch den BZR bzw. TZR. Das zweite Signal wird durch so genannte „kostimulatorische Moleküle“ vermittelt72. Die bekanntesten kostimulatorische Moleküle sind die Proteine der B7-Familie, B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Sie werden auf APC exprimiert und reagieren mit dem CD28-Rezeptor der T-Zellen. Ein weiteres, gut beschriebenes kostimulatorisches Molekül Signal ist die Interaktion zwischen CD40 und CD40 Ligand54. CD40 Ligand wird von aktivierten T-Zellen exprimiert und bindet an CD40, ein Oberflächenmolekül von APC. Diese Interaktion bewirkt die Aktivierung von T-Zellen und induziert die Expression von B7-Molekülen auf APC. Nur die Kombination von Signal eins und Signal zwei führt zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, die eine erhöhte Synthese von IL2 und gleichzeitig auch des IL2-Rezeptors bewirken. IL2 wird auch als T-Zell-Wachstumsfaktor bezeichnet. Wenn das Zytokin an den IL2-Rezeptor der T-Zelle bindet, wird damit die Proliferation des Lymphozyten ausgelöst. Außerdem regt IL2 die Differenzierung der T-Zelle in die aktivierte Effektorzelle an. Eine Effektorzelle benötigt kein kostimulatorisches Signal mehr, um ihre Effektorfunktion auszuführen. Die heutige 8 Einleitung Immunologie ist mit der Stranger-Hypothese „aufgewachsen“. Sie hat die Grundlage zu zahlreichen Versuchen und Entdeckungen gelegt. Dabei wurden jedoch auch Beobachtungen gemacht, die dazu anregten, diese Hypothese kritisch zu hinterfragen. Täglich nehmen wir mit unserer Nahrung „fremde“ Stoffe z.B. Proteine auf, doch diese werden nicht als „Fremd“ erkannt. Unzählige Bakterien besiedeln den menschlichen Darm, ohne dass dies eine Immunantwort auslöst. Abbildung 1: Die Zwei Signal-Theorie Zur Aktivierung benötigen reife Lymphozyten zwei Signale. Das erste Signal (1) wird über den Antigenrezeptor vermittelt. Das zweite Signal (2) erhalten B-Zellen (links) meist von T-Zellen. T-Zellen (rechts) erhalten ihr zweites Signal in der Regel von einer professionellen APC, z.B. einer DC74. Gesunde Probanden weisen häufig Autoantikörper gegen körpereigene DNA oder Keratin auf, ohne dabei eine Autoimmunerkrankung entwickelt zu haben. Und auch T-Zellen, die gegen ein Selbst-Antigen gerichtet sind, sind in Gesunden nachweisbar. Wie lassen sich diese Beobachtungen mit der Stranger-Theorie erklären? Außerdem, wie ist „Selbst“ definiert? Alle möglichen Antigene, die unser Genom hervorbringen könnte? Alle Antigene, die in unserem Körper tatsächlich existieren? Alle SelbstAntigene, die eine APC exprimiert? Die Entwicklungen von Impfstoffen ist ein Haupteinsatzgebiet für Immunologen. Dabei entdeckte man schon früh, dass aufgereinigte Antigene per se keine gute Immunantwort hervorrufen. Man bediente sich deshalb der Hilfe von Hilfsstoffen, so genannten Adiuvantien. Diese Stoffe sind häufig Derivate von bakteriellen Erregern. Warum reicht ein fremdes Antigen allein zur Vakzinierung nicht aus? Was für eine Rolle spielen Adiuvantien? Diese Beobachtungen veranlassten die Immunologin Polly Matzinger dazu, einen Paradigmenwechsel in der Immunologie einzufordern103. Die Immunologin formulierte die Danger-Theorie. Nicht „Selbst“ und „Fremd“ haben unser Immunsystem geformt, 9 Einleitung sondern das Aufspüren und der Schutz vor Gefahren sind die Triebfeder unserer Immunität. Radikale Anhänger der Danger-Theorie glaubten gar, das Konzept von „Selbst“ sei zu vernachlässigen. Entscheidend für die Immunantwort seien Signale, die von „gefährdeten“ Zellen ausgesandt werden. Der Begriff Gefahr ist hierbei weitgefasst. Darunter fallen die „unprogrammierte“ Zerstörung von Gewebe, Stress auf zellulärer Ebene, wie z.B. Hypoxie und Nekrose. Diese Vorgänge führen zur Aussendung von Signalen, die sich lokal begrenzt ausbreiten und damit eine „Danger Zone“, eine Gefahrenzone, bilden. Nur in dieser Gefahrenzone, lösen Antigene eine Immunantwort aus. Die Danger-Theorie löste kontroverse Diskussionen aus. Dabei wurde schnell deutlich, dass bei einer weniger radikalen Interpretation der Danger Hypothese, die auch den Begriff des „Selbst“ beinhaltet, ein Konsens zwischen beiden Denkschulen erzielt werden kann. Diese Interpretationsweise integriert die Danger-Theorie in das Weltbild der Stranger-Theorie. Der Verdienst der Danger-Theorie ist dabei, die Rolle der APC und des zweiten Signals hervorzuheben und das Interesse der Immunologen für diese Forschungsaspekte zu wecken. 1.1.4 Entwicklung des Immunsystems Tabelle 3: Die Entwicklung der Angeborenen- und Adaptiven Immunität1 Angeborene Immunität Adaptive Immunität Phagozyten NK Zellen Antikörper Lymphozyten Lymphknoten Protozoen ja - - - - Anneliden ja ja - - - Anthropoden ja - - - - Knorpelfische ja ja nur IgM ja - Knochenfische ja ja IgM ja - Amphibien ja ja 2 Klassen ja - Reptilien ja ja 3 Klassen ja - Vögel ja ja 3 Klassen ja teilweise Säugetiere ja ja 7-8 Klassen ja ja Invertebrata Vertebrata 10 Einleitung Unsere Immunabwehr basiert auf zwei Systemen, der „Angeborenen Immunität“ und der Erworbenen, „Adaptiven Immunität“. Die Kombination dieser Verteidigungsstrategien findet sich bei allen Säugetieren. Das evolutionär ältere System ist die Angeborene Immunität, deren Ursprung sich bis zu den „Neumündern“, den Deuterostomia, vor einer Billion Jahren zurückführen lässt (siehe Tabelle 3). Die Adaptive Immunität entstand vor ungefähr 450 Millionen Jahren, parallel zur Entstehung der Kiefermäuler (Gnathostomata). Der wesentliche Unterschied zwischen der Angeborenen und der Adaptiven Immunität ist das Gedächtnis. Die Angeborene Immunität ist unspezifisch und von kurzer Dauer, aber schnell. Die Adaptive Immunität ist zielgerichteter, doch es braucht Zeit, bis sie voll aktiviert ist. Sie wird häufig als „Erlernte” Immunität bezeichnet, da der Kontakt mit einem Antigen einen Lernprozess in Gang setzt. Eine erneute Exposition löst eine stärkere, spezifischere Antwort hervor. Grundlage dafür ist ein „Gedächtnis“, d.h. ein Antigen muss bei erneutem Auftreten wieder erkannt werden. 1.2 Angeborenes Immunsystem Die Angeborene Immunität leistet „erste Hilfe“ in der Körperabwehr, sie antwortet unspezifisch, aber schnell. Sie zieht darauf als „Verstärkung“ die Adaptive Immunität hinzu. Das heißt eine wichtige Funktion der Angeborenen Immunität ist, die Adaptive Immunantwort einzuleiten und zu etablieren. 1.2.1 Rezeptoren des angeborenen Immunsystems Mikroorganismen verwenden im Gegensatz zu höheren Lebewesen vermehrt repetitive Strukturen in ihrem Organismus. Dies ist Kennzeichen einfacher Lebewesen, da Komplexität im Aufbau und der Organisation mit einer höheren Entwicklungsstufe einhergeht. Diese repetitiven Motive finden sich in ihrer DNA und ihrer Oberfläche. Bakterielle und virale DNA, beispielsweise, enthält einen hohen Anteil an unmethyliertem Cytosin-phosphatidyl-Guanosin Dinukleotid (CpG). Und die Zellwand von gram negativen Bakterien enthält wiederkehrende Bausteine aus mit Zuckergruppen besetzten Lipiden, den sogenannten Lipopolysacchariden (LPS). Das Angeborene Immunsystem verfügt über eine Reihe von Rezeptoren, die diese sich wiederholende Strukturen erkennt und eine Abwehrreaktion einleitet68,113. Man fasst diese Rezeptoren unter dem Begriff „Motiv erkennende Rezeptoren“ (PRRs, engl. 11 Einleitung pattern recognition receptors) zusammen, ihre konservierten Motive heißen „Pathogen-assozierte, molekulare Motive“ (PAMPs, engl. pathogen-associated molecular patterns“)104. Vertreter der PRRs sind die Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR, engl. Toll-like receptors)4. Die meisten Säugetier-Arten verfügen über 10 bis 15 verschiedene TLR (siehe Tabelle 4). Die Aktivierung von TLR führt zur Expression von Genen, die für Zytokine, Zytokinrezeptoren und Integrine kodieren. Dadurch entsteht eine Entzündungsreaktion und Zellen wandern in den Infektionsherd ein. Außerdem induzieren TLR kostimulatorische Moleküle wie B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) in APC, die als „Signal 2“ ein wichtiges Element zur Etablierung der adaptiven Immunantwort sind57. Tabelle 4: TLR und ihre Liganden187 TLR Liganden TLR1 Bakterielle Zellwandbestandteile TLR2 Bakterielle Lipoproteine, Lipoteicholsäure, LAM TLR3 Doppelsträngige DNA TLR4 LPS TLR5 Flagellin TLR7 Einzelsträngige, virale DNA TLR9 Unmethylierte DNA-Motive, CpG, bakterielle und virale DNA 1.2.2 Zellen des Angeborenen Immunsystems Phagozytose spielt in der zellulären, Angeborenen Immunantwort eine entscheidende Rolle. Das bedeutet, Erreger werden von Zellen aufgenommen und von zelleigenen Enzymen oder pH-Werterniedrigung unschädlich gemacht. Die Aufnahme von Pathogenen und Fremdstoffen wird den Zellen durch ihren Besatz mit Oberflächenrezeptoren erleichtert. Meist sind dies Scavenger- und Mannose Rezeptoren oder Rezeptoren für Antikörper und Komplementfaktoren. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Abwehr ist die Migration und Invasion der Zellen. Die Angeborene Immunität kann als erste auf potentiell gefährliche Eindringlinge reagieren, da Makrophagen und Neutrophile schnell in die betroffenen Gewebsabschnitte einwandern. 12 Einleitung NK Zellen erfüllen subtilere Aufgaben in der Körperabwehr. Sie können direkt zytotoxisch auf infizierte oder geschädigte Zellen wirken. Darüber hinaus interagieren sie auf komplexe Weise mit Zellen des adaptiven Immunsystems und bewirken damit eine Verstärkung und Spezifizierung der Immunantwort. NK Zellen sind konstitutiv aktiv und reagieren bei Aktivierung mit Proliferation im Sinne einer klonalen Expansion. Der entscheidende Unterschied zu Zellen des adaptiven Immunsystems ist, dass NK Zellen weder über individuelle Rezeptoren verfügen noch anhaltende Immunität induzieren können. 1.3 Adaptives Immunsystem Die herausragenden Leistungen der Adaptiven Immunität sind: Gedächtnis und Spezifität. 1.3.1 Rezeptoren des Adaptiven Immunsystems BZR und TZR sind hochspezifisch für ihre Bindungspartner (siehe Abbildung 2). Sie entstehen in den unreifen Lymphozyten durch eine zufällige Kombination von Genen. Abbildung 2: Antikörper- und TZR-Grundstruktur Ein Antikörper ist ein durch Disulfidbrücken verbundenes Heterodimer und besteht aus einem Antigen bindenden Fragment (Fab) und einem so genannten kristallisierbaren Fragment (Fc). Jedes FabFragment besitzt eine konstante und eine variable Domäne (linke Abbildung). Der TZR gleicht einem membranständigen Fab-Fragment (rechte Abbildung). Er besteht ebenfalls aus zwei durch 74 Disulfidbrücken verknüpfte Ketten. Ihre variablen Anteile bilden die Antigenbindungsstelle aus (rot) . Dabei entsteht eine Vielzahl von Rezeptoren, von denen jeder einzigartig ist. Zudem muss jeder Rezeptor über zwei Eigenschaften verfügen, er muss körpereigene 13 Einleitung Strukturen als „Eigen“ tolerieren und muss mit dem MHC-Komplex interagieren können. 1.3.2 Zellen des Adaptiven Immunsystems Die Aktivierung von B- und T-Zellen durch ein Antigen markiert den Beginn der Adaptiven Immunantwort. In beiden Fällen ist entscheidend, dass das Antigen durch einen „spezifischen“ Rezeptor der Lymphozyten erkannt wird. Ein wichtiges Konzept der zellulären Adaptiven Immunitität ist die „Klonale Expansion“. Nachdem der Rezeptor des Lymphozyten mit dem Antigen-MHC-Komplex interagiert hat, wird die Zelle größer und geht in ein Blastenstadium über. Dieser Blast teilt sich und kann bis zu 1000 Tochterzellen identischer Spezifität hervorbringen (Klonale Expansion). Dabei differenzieren sich die Zellen in Effektorzellen aus. Als Effektorzellen werden diejenigen Lymphozyten bezeichnet, welche die „Abwehrmaßnahmen“ des Immunsystems ausführen. Dies sind Plasmazellen, T-Helferzellen (Th-Zellen), und zytotoxische T-Zellen (ZTL)64. Ein Teil der aktivierten B- und T-Zellen bilden sich zu „Gedächtnis B- und T-Zellen“ aus166,167,131. Sie sind die Basis eines lebenslangen immunologischen Gedächtnisses24. Es garantiert, dass bei einer erneuten Infektion mit dem Erreger ein schneller und spezifischer Schutz bereitsteht. B-Zellen erkennen ein freies Antigen mittels ihres BZR. Daraufhin proliferieren die Lymphozyten und differenzieren zu Plasmazellen, Effektorzellen, die Immunglobuline M (IgM) sezernieren können131. Durch weitere, T-Zell abhängige Prozesse wird bei einer Subpopulation der B-Zellen ein Wechsel des Antikörper-Isotyps induziert150. Zur Aktivierung von T-Zellen muss der Antigen-MHC-Komplex in Verbindung mit kostimulatorischen Molekülen präsentiert und vom TZR-CD3-Komplex der Lymphozyten erkannt werden37. T-Zellen können sich zu den Effektorzellen Th-Zellen und ZTL ausdifferenzieren. 1.3.3 Die Adaptive Immunantwort Die adaptive Immunität ist ein komplexes und flexibles System, das verschiedene Taktiken und Effektorzellen zum Schutz des Körpers anwendet. CD4 T-Zellen können sich entweder in Th-Zellen des Typus 1 oder 2 umwandeln (Th1 oder Th2). Dabei ist noch nicht vollständig geklärt, welche Mechanismen für die Differenzierung in Th1 oder Th2 ausschlaggebend sind. Die Differenzierung zu 14 Einleitung Th1-Helferzellen erfolgt unter dem Einfluss von IL12. IL4 fördert die Bildung von Th2-Helferzellen (siehe Abbildung 3). Th1-Zellen sind durch die Ausschüttung von IFN-, TNF- und IL2 charakterisiert. Diese Zytokine gelten als „proinflammatorisch“. Sie setzen eine Entzündungsreaktion in Gang, die das Abtöten von intrazellulären Pathogenen ermöglicht. Th2-Zellen bilden die Interleukine IL4, IL5, die B-Zellen zur Aktivierung von Antikörpern anregen. Zytokine, die von Th1-Zellen (IFN-) bzw. Th2-Zellen (IL4) sezerniert werden, wirken auf ihre eigene Zellpopulation als autokrine Wachstumsfaktoren und inhibieren dabei gleichzeitig die andere Zellpopulation. Abbildung 3: Th1- und Th2-Antwort CD4 T-Zellen können sich zu T-Helferzellen ausdifferenzieren. Es existieren zwei verschiedene Subtypen: Th1- und Th2-Zellen. Th1-Zellen sind dazu gewappnet, Makrophagen zu aktivieren. Dies geschieht vor allem im Rahmen einer Infektion mit intrazellulären Bakterien, die Makrophagen befallen. T-Zellen vom Th1-Typ sezernieren IFN-. Außerdem exprimieren die T-Zellen CD40 oder den FasLiganden. Während CD40 aktivierend wirkt, löst der Fas-Ligand die Apoptose der Zelle aus. Th2-Zellen aktivieren B-Zellen. Dazu sezernieren sie die Zytokine IL4 und IL5 und den CD40-Liganden, der 74 B-Zellen zur Proliferation anregt . 15 1.4 Einleitung Antigen Präsentation Der Schlüsselmoment in der Immunologie ist die Präsentation eines Antigens und seine Erkennung durch die Abwehrzelle. Dazu stehen verschiedene Systeme der Antigenpräsentation zur Verfügung: MHC Moleküle13 und Proteine der CD1-Familie. Der Hauptgewebsverträglichkeits-Komplex (MHC, engl. major histocompatibility complex) trägt seinen Abstoßungsreaktion von Namen, weil seine Hauttransplantaten Funktion entdeckt erstmals wurde41. bei Dass der MHC- Rezeptoren Antigene präsentieren und mit T-Zellen interagieren, wurde erst 1970 bekannt162. Der MHC-Komplex ist ein polymorpher Genlokus, d.h. er ist zwischen unterschiedlichen Individuen im höchsten Maße variabel. Er liegt bei Menschen auf dem Chromosom 6 und besteht aus über 200 Genen. Die Gene für 2-Mikroglobulin und Ii liegen auf Chromosom 15 und 5. Man nennt die Gene des MHC-Lokus auch humane Leukozytenantigen-Gene (HLA). Der Mensch hat 3 verschiedene MHC-I Ketten: HLA-A, HLA-B, HLA-C. Für die - und -Kette des MHC-II Moleküls existieren 3 Genpaare: HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ. Der CD1-Komplex zeigt im Gegensatz zum MHC-Komplex nur geringen Polymorphismus. Neuere Studien haben jedoch eine limitierte Variabilität im Exon 2 der CD1 Gene gezeigt. Die Gene der CD1-Familie liegen auf dem Chromosom 1, außerhalb des MHC-Komplexes und sind auch nicht mit diesem assoziiert. 1.4.1 MHC-I Das MHC-Klasse-I-Molekül ist ein Heterodimer mit einer Größe von 55kDa (Abbildung 4). Es wird auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen exprimiert. Der MHC-I-Komplex wird im Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert und besteht aus einer -Kette mit drei Domänen (1-3) und 2-Mikroglobulin, das nicht kovalent angebunden ist. Die -Kette bildet mit den Domänen 1- und 2 eine Grube, welche Proteinfragmente mit 8-11 Aminosäuren (AS) fassen und präsentieren kann159. Nach ihrer Synthese wird die -Kette zunächst mit dem Hilfsmolekül Calnexin stabilisiert, bevor sie ihre funktionsfähige, räumliche Gestalt ausbildet. Danach lagert sich 2ù Mikroglobulin an und Calnexin wird gegen Calreticulin und Erp57 ausgetauscht78. Das MHC-I System ist auf zytosolische Antigene ausgerichtet oder auf Antigene, die mittels Endozytose aufgenommen wurden188. 16 Einleitung Abbildung 4: Der MHC-I Komplex Der MHC-I Komplex gezeigt als computergraphische Darstellung (a) und als Banddiagramm (b,c). Der MHC-I-Komplex ist ein Heterodimer bestehend aus einer 43 kDa grossen α-Kette und β2-Mikroglobulin (12 kDa, dargestellt in lila). Die α-Kette besteht aus verschiedenen Domänen. Der peptidbindende Spalt des Antigenpräsentationsmoleküls besteht aus der α1- und α2-Portion des Moleküls (d). Diese beiden 74 Domänen bilden zwei α-Helices aus, die auf acht antiparallelen β-Faltblatt-Strängen ruhen (c) . 17 Einleitung Abbildung 5: Der MHC-II Komplex Der MHC-II-Komplex veranschaulicht als computergraphische Darstellung (a) und als Banddiagramm (b, c). Das Antigenpräsentationsmolekül ist aus einer α-Kette (34 kDa) und einer β-Kette (29kDa) zusammengesetzt, die aus jeweils zwei Domänen bestehen. Der peptidbindende Spalt des MHC-II-Komplexes besteht im Gegensatz zum MHC-I-Komplex aus zwei verschiedenen Molekülen, die nicht miteinander kovalent verbunden sind (vgl. Abbildung 4 d). Außerdem ist die Antigenbindungsgrube, nach beiden Seiten hin offen (c)74. 18 Einleitung Abbildung 6: Die Beladung des MHC-I Komplexes Das MHC-I Molekül bildet mit Calreticulin und Erp57 einen Komplex aus. Dieser wird mit Tapasin an den Transporter TAP gebunden2. Zu Anfang sind die Proteine natürlich zu groß für die Antigenbindungsgrube. Sie werden mit den restlichen Proteinen des Zytosols im Proteasom in kurze Peptide zerlegt62. Das Proteasom wird konstitutiv exprimiert und hat die Form eines hohlen Zylinders, der aus zwei Ringen besteht. Jeder der Ringe besteht aus sieben Einheiten, deren Innenseite mit proteolytischen Enzymen versehen ist170. Zwei Untereinheiten des Proteasoms können durch die Proteine LMP2 und LMP7 ersetzt werden. Die Gene für diese beiden Proteine liegen im Lokus des MHC-I Moleküls119. Ihre Synthese wird durch Interferon-gamma (IFN-) angeregt3. LMP2 und LMP7 erhöhen die Proteolyse. Außerdem wirken sie sich auf die Schnittstellen der Enzyme aus und es werden verstärkt Peptide mit hydrophoben oder basischen Endgruppen gebildet. Die degradierten Proteine werden mit dem ATP-abhängigen Transporter TAP (Transporter assoziiert mit Antigenpräsentation) in das ER überführt152,159. TAP ist ein aus TAP1 und TAP2 zusammengesetztes Heterodimer. Wie LMP2 und LMP7 liegt das TAP-Gen innerhalb des MHC-Genkomplexes und wird bei IFN-Ausschüttung vermehrt synthetisiert. TAP wählt Peptide mit geeigneter Aminosäurenkettenlänge und endständiger Carboxylgruppe für den Transport aus. Der MHC-I Komplex mit den Hilfsmolekülen Calreticulin und Erp57 wird an der luminalen Seite des ER mit Hilfe eines Verbindungsmoleküls, Tapasin, an TAP befestigt5. Dadurch wird der Übergang des Antigens von TAP in die MHC-I-Grube erleichtert (Abbildung 6). Das MHC-I Molekül mit seinem Antigen durchläuft das 19 Einleitung Golgi-System und wird über exozytotische Vesikel an die Oberfläche der Zelle gebracht (Abbildung 7). Dort wird das Antigen präsentiert und der MHC-I-Komplex kann mit CD8 Zellen in Kontakt treten. Interessanterweise existiert zusätzlich ein Umweg oder „Schleichweg“ zur Aktivierung von CD8 Zellen. Dieser so genannte „detour pathway“ erlaubt nicht-zytosolischen Antigenen den Zugang in den MHC-IPräsentationsweg. Ein Beispiel für diesen Mechanismus findet sich bei der mykobakteriellen Infektion. Mycobacterium tuberculosis kann die Fusion zwischen Phagosom und Lysosom blockieren, mykobakterielle Antigene sollten aus diesem Grunde nicht in das Zytosol geraten100. Doch Mykobakterien induzieren während der Infektion auch Apoptose, dabei werden von den Zellen „apoptotische“ Vesikel freigesetzt. Diese werden von APC aufgenommen und ihr Inhalt im Zytosol freigesetzt. Auf diese Weise können mykobakterielle Antigene von MHC-I Molekülen präsentiert werden146. Abbildung 7: Antigenprozessierung im MHC-I Präsentationsweg Antigene, die von MHC-I Molekülen gebunden werden, entstehen im Zytosol. Sie werden zunächst vom Proteasom, einer multikatalytischen Protease, degradiert und dann durch den Transporter TAP in das ER überführt. Dort tritt das Antigen mit dem MHC-Komplex in Kontakt. Nur wenn das Peptid fest an das Antigenpräsentationsmolekül bindet, löst sich MHC-I von TAP und wird mittels exozytotischer Vesikel an die Zelloberfläche geschleust74. 1.4.2 MHC-II Das MHC-II Molekül besteht aus einer - und einer -Kette, die jeweils eine Membran-durchspannende Untereinheit beinhaltet (Abbildung 5). Die 1-und 2-Domäne der Ketten formen die Antigenbindungsstelle aus. Im Gegensatz zum MHC-I Molekül ist diese Tasche nach beiden Seiten hin offen. Bevor das Molekül diese dreidimensionale Form annimmt, müssen - und -Kette durch das 20 Einleitung Hilfsmolekül Calnexin stabilisiert werden142. Bis die MHC-II-Komplexe auf ihr Antigen treffen, wird die Antigen-Bindungsstelle durch das li Protein verdeckt. Dies soll die MHC-II-Grube vor ungefalteten Proteinen im ER schützen. Das Protein li bindet drei MHC-II Moleküle, diese Komplexe verlassen das ER in Vesikeln, die mit späten Endosomen fusionieren und dann als Klasse-II-artige Kompartimente (MIIC) bezeichnet werden. MHC-Klasse-II Moleküle werden von APC exprimiert und präsentieren extrazelluläre Antigene, nachdem sie von der Zelle über Rezeptoren mit unterschiedlicher Spezifität und Selektivität von Zellen aufgenommen wurden125. Diese Proteine durchlaufen das frühe Endosom und gelangen dann in das späte Endosom/Lysosom, das über ein saures Milieu verfügt. Bei diesem pH-Wert arbeiten proteolytische Enzyme wie Cathepsin S und Cathepsin I optimal und degradieren das Protein. Dieses Kompartiment entwickelt sich dann zu MIIC, in dem mögliche Antigene und zahlreiche MHC-II Moleküle aufeinander treffen133. Abbildung 8: Antigenprozessierung im MHC-II Antigenpräsentationsweg Der MHC-II Komplex ist im ER an die Ii-Kette gebunden. Dies verhindert, dass MHC-II mit intrazellulären oder nur teilweise gefalteten Proteinen in Kontakt tritt. Ii leitet das MHC-II Molekül aus dem ER in das Endosom. Dort wird das Ii-Protein abgebaut und MHC-II kann mit einem Antigen beladen werden. Danach gelangt das mit dem Antigen beladene MHC-II Molekül an die Oberfläche der Zelle74. Nun wird li durch das Enzym Cathepsin S auf 24 Aminosäuren (AS) gekürzt und heißt danach Klasse-II assoziiertes invariables Protein, CLIP8. Die Beladung des MHC-II Moleküls mit dem Antigen wird durch HLA-DM gewährleistet180. Das Gen für HLA-DM liegt in dem Genabschnitt, der auch die MHC Moleküle beinhaltet. HLM-DM wechselt CLIP gegen ein Antigen aus. Dies ist ein entscheidender Schritt, HLM-DM 21 Einleitung „prüft“ dabei die Affinität des Antigens zum MHC-II Molekül175. Es entfernt Peptide mit nur geringer Bindungsfähigkeit, da sie als Antigen nicht geeignet sind. Ist das geeignete Peptid an die Antigenbindungsstelle gebunden, wird das MHC-II Molekül zur Zelloberfläche transportiert und kann dort CD4 T-Zellen aktivieren (Abbildung 8). 1.4.3 CD1 Ende der 80er Jahre wurde evident, dass nicht nur Proteine, sondern auch Lipide Antigene für das Immunsystem darstellen. Allerdings werden Lipide über ein eigenständiges Antigenpräsentationssystem, das CD1-System präsentiert127,128,164. Phylogenetisch gehört die CD1-Familie zu einem alten Teil der Immunabwehr36. Wahrscheinlich haben sich die CD1- und MHC Moleküle aus einem Vorläufer entwickelt und zeigen deshalb einige Gemeinsamkeiten. Es kann spekuliert werden, ob ein auf Lipidantigene spezialisiertes mykobakteriellen Erregern gefördert wurde System durch die Abwehr mit 58,138 . Bei Menschen liegen die fünf nicht- polymorphen CD1-Gene auf Chromosom 120, bei Mäusen auf Chromosom 323. Sie sind nicht mit dem MHC-Genlocus assoziiert. Die CD1-Familie besteht aus CD1aCD1e6 und ist in vielen Spezies konserviert. Man unterteilt diese Moleküle in zwei Gruppen, CD1a, CD1b, CD1c und CD1e gehören zu den Klasse- I CD1 Molekülen. CD1d ist ein Klasse II CD1 Molekül. Der Mensch besitzt Klasse-I und Klasse-II CD1 Moleküle, Mäuse hingegen verfügen nur über Proteine der Klasse II. Im murinen Genom existieren zwei CD1d-Gene, CD1d1 und CD1d2. Für CD1d2 konnte jedoch bisher keine Funktion nachgewiesen werden. CD1 Moleküle werden hauptsächlich auf kortikalen Thymozyten und APC exprimiert. DC tragen CD1a-, CD1b-, CD1c- und CD1d Moleküle auf ihrer Oberfläche177. Langerhanszellen exprimieren CD1a und CD1c. B-Zellen sind CD1d und CD1c positiv. Expression von CD1d konnte außerdem auf unterschiedlichen Geweben wie Hepatozyten und Gallengangsepithelien festgestellt werden. Die Proteine der CD1-Familie lassen sich, ähnlich den MHC Molekülen, unterschiedlichen Kompartimenten zuordnen143. CD1a bindet extrazelluläre Antigene oder Antigene aus dem frühen Endosom111. CD1c nimmt Antigene im reifen und späten Endosom auf63,110. CD1b und CD1d treten mit Lipiden im späten Endosom oder Lyosom in Kontakt75. Die Grundstruktur der CD1 Moleküle zeigt große Ähnlichkeit zum MHC-I-Komplex. Die Antigenpräsentationsgrube für Lipidantigene ist jedoch größer und tiefer und besteht aus hydrophoben Aminosäuren18. 22 a b Einleitung c Abbildung 9: Der CD1d-Komplex Darstellung des murinen CD1d-Komplexes als Banddiagramm von vorne (a) und oben (b)18. Das CD1dMolekül besteht aus den Domänen α1- α3 und β2-Mikroglobulin. Die Antigenbindungsgrube mit den Taschen A und F aus. A und F nehmen Lipidketten auf, sie sind erheblich tiefer als die vergleichbare Grube des MHC-I-Komplexes (siehe Schema c)112. Wahrscheinlich werden auf diese Weise die unpolaren Anteile der Antigene von der Grube aufgenommen und die polaren Anteile für die Interaktion mit dem TZR in Position gebracht44. Röntgenstrukturanalyse konnte die dreidimensionale Struktur von CD1a, CD1b und CD1d enthüllen55,190,191. Dabei wurde deutlich, warum CD1b Moleküle in der Lage sind, eine Vielzahl unterschiedlichst geformter Antigene aufzunehmen47,109. Die Oberfläche des Moleküls besteht aus drei hydrophoben Taschen, die mit A, T, und F bezeichnet werden und untereinander verbunden sind (Abbildung 9). Von der Oberfläche abgewandt, existiert eine zusätzliche Tasche, C. Dieses flexible Tunnelsystem erlaubt die Aufnahme sehr unterschiedlicher Antigene118. Besitzt ein Antigen mehrere Alkylseitenketten, verteilen sich diese auf verschiedene Taschen. Eine Seitenkette aus ca. 16 C-Atomen findet in der C-Tasche Platz. Eine lange Alkylkette dagegen füllt das ATF-Tunnelsystem aus. CD1d Moleküle aktivieren eine Subpopulation von T-Lymphozyten, NKT-Zellen61. Diese Zellen tragen neben T-Zellrezeptoren auch NK-Zellmarker und Effektormoleküle wie den CD40- und Fas-Liganden. Das Profil von NKT Zellen hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker gleicht dem aktivierten Gedächtnis T-Lymphozyten. NKT-Zellen sind entweder CD4 positiv oder CD4/CD8 negativ. Klassische NKT-Zellen exprimieren einen konservierten TZR-Typus. Für Menschen ist dies der Phänotyp 23 Einleitung Vα24-Jα15123 und für Mäuse Vα14-Jα1811,94. Die Verteilung von NKT-Zellen variiert in unterschiedlichen Geweben, weist jedoch sowohl in der Maus als auch beim Menschen eine Präferenz für die Leber auf. Im murinen System sind unter 1% der Lymphozyten in Thymus, Knochenmark, Milz, Lymphknoten und Blutbahn NKTZellen, der Anteil in der Leber beträgt jedoch bis zu 40%. Zurzeit sind nur wenige Liganden für CD1d bekannt, besonders endogene Lipidbindungspartner geben Rätsel auf. Phosphatidylinositol und Phosphatidylethanolamin binden CD1d, haben jedoch keine antigenen Eigenschaften134,40. Das tumorassoziierte Lipid Disialogangliosid (GD3) aktiviert NKT-Zellen nur schwach186. Das kürzlich entdeckte Isoglobotrihexosylceramid (iGb3) ist ein besseres Antigen und gilt als endogener Ligand193. Weitere Untersuchungen müssen nun jedoch zeigen, welche Zellen dieses Lipid der Globosid-Familie synthetisieren. Bakterielle CD1d-Liganden sind das mykobakterielle Phosphatidylinositolmannosid (PIM)51 und Lipide von Borrelia burgdorferi, vor allem Diacylglycerole87. Die stärkste Aktivierung von NKT-Zellen wird durch -Galaktosylceramid (GalCer) hervorgerufen. GalCer kann im menschlichen Körper nicht synthetisiert werden und ist ein Derivat des Meerschwammes Agelas mauritianus. NKT-Zellen können sowohl klassische Th1- als auch Th2-Zytokine ausschütten60,83. Es ist möglich, dass NKT-Zellen durch dieses Sekretionsprofil in der Lage sind, immunmodulierende Funktionen auszuüben. Man hat deshalb begonnen, Verhalten und Funktion der NKT-Zellen für Tumor-, Infektions- und Autoimmungeschehen zu untersuchen35,44,45,28,174. Die Ergebnisse dieser Versuche sind teilweise kontrovers59,60. Noch ist es nicht gelungen, die Bedeutung der NKTZellen für unser Immunsystem eindeutig zu klären. CD1 vermittelte Antigenpräsentation ist noch immer eine relativ neues Forschungsgebiet. Folglich sind noch viele Fragen über die Prozessierung und die Präsentation der Antigene offen, einige Grundelemente konnten jedoch in den letzten Jahren geklärt werden. Nach der Synthese des CD1 Moleküls wird es im ER mit 2-Mikroglobulin zusammengefügt165. Es wird spekuliert, dass CD1 Moleküle zunächst analog zur Proteinpräsentation ein „Ii“-Lipid enthalten39. Der CD1 Komplex durchläuft die zellulären Kompartimente und wird dann an die Oberfläche der Zelle gebracht (siehe Abbildung 10). Auf diesem Weg nehmen die verschiedenen CD1-Proteine ihr Antigen in ihrem zugewiesenen Kompartiment auf. Diese Darstellung lässt jedoch Fragen zur Prozessierung der Lipidantigene offen und klärt nicht, wie CD1-Proteine mit den Lipiden beladen werden. Werden die potentiellen Lipidantigene durch Enzyme in kleinere Einheiten zerlegt oder nur durch Glukosidasen modifiziert? Wie werden die 24 Einleitung unpolaren Antigene im Lysosom in Lösung gehalten? Gibt es eine Art HLA-DM, das CD1 belädt? Die Ergebnisse dieser Dissertation brachten neue, grundlegende Erkenntnisse für dieses Forschungsgebiet182. Und zusammen mit zwei seminalen Publikationen im Jahre 2004 wurden entscheidende Fortschritte im Verständnis in der CD1-vermittelten Antigenpräsentation gemacht77,192. Ein Lösungsansatz wurde durch Beobachtungen des Sphingolipidmetabolismus gefunden. Endogene Lipide, wie die Sphingolipide, werden im Lysosom metabolisiert. Dazu werden Enzyme und eine Reihe von Hilfsmolekülen, die Sphingolipid-Aktivator-Proteine (SAP), benötigt. Es gibt 5 SAP: das GM2-Aktivatorprotein (GM2AP) und 4 Saposine (SAP A-D)172. Diese Proteine wurden als die postulierten Chaperone im CD1-Präsentationsweg identifiziert. GM2AP stellt den Kontakt zwischen der Hexoaminidase A und seinem Substrat GM2 her153. Eine GM2AP-Defizienz führt zur AB Variante der GM2 Gangliosidose Typ II, auch Sandhoffsche Krankheit genannt. Die SAP-Proteine gehen aus der Spaltung eines gemeinsamen Vorläuferproteins, Prosaposin, im Lysosom hervor69. Die Interaktion zwischen Enzymen, Substraten und SAP-Molekülen gleicht einem komplexen Netzwerk, man kann jedoch verschiedenen SAP bestimmte Lipide und Enzyme zuweisen90,194. Prosaposin Defizienz verursacht das Fehlen aller SAP und führt zu einer schweren Lipidspeicherkrankheit. Nur wenige Fälle dieses genetischen Defektes wurden weltweit beschrieben66. Die Patienten verstarben kurz nach ihrer Geburt oder in utero. Unser zentrales Nervensystem ist in seiner Ausbildung auf komplexe Lipide angewiesen. Eine schwere Lipidspeichererkrankung, wie die Prosaposin-Defizienz, verursacht deshalb letale, neurologische Schäden71. Eine Defizienz von SAP-C ist bekannt, sie verursacht durch verminderter Aktivität der -Glukosidase Morbus Gaucher121. Eine Defizienz von SAP-B führt zur metachromatischen Leukodystrophie, die auf die nicht-funktionsfähige Arylsulfatase zurückzuführen ist93. SAP-Proteine wirken über zwei Mechanismen: Aktivierung von Enzymen141 und Aktivierung von Substraten, endogene Sphingolipide werden im Lysosom metabolisiert. Dabei bilden sie im sauren pH des Lysosomes zunächst multilamelläre Membrane, sogenannte intralysosomale Vesikel, aus189. Enzyme können die Lipide in den Vesikeln nicht bearbeiten, da sie keinen Kontakt mit ihren Substraten herstellen können. Der niedere pH-Wert bewirkt eine Konformationsänderung der SAP. In SAP-C treten Domänen hervor, die über eine hohe Affinität für Phospholipide verfügen173. Intralysosomale Vesikel verfügen über einen hohen Anteil an 25 Einleitung Phospholipiden und „ziehen“ damit SAP-C an. In diesem Prozess inseriert das Molekül in den Vesikel. Abbildung 10: CD1d-Antigenpräsentationsweg Diese schematische Abbildung zeigt den Weg des murinen CD1d-Komplexes durch die Zelle. Neu synthetisierte CD1d Moleküle verbinden sich mit β2-Mikroglobulin im ER. Ein Teil der Moleküle kann hier mit endogenen Lipiden beladen werden und gelangt auf dem sekretorischen Transportweg zur Oberfläche der Zelle. Der übrige Teil der CD1d-Komplexe wird über das Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zu den endosomalen Kompartimenten und der Zelloberfläche geleitet. Mit Antigen beladene CD1d-Komplexe können aufgenommen werden und gelangen mit Hilfe der Adaptor Proteine 2 und 3 18 (AP2 bzw. AP3) über das Sortierungs-Endosom (engl. sorting Endosom) in das Lysosom . Dabei erhöht sich die Oberflächenspannung des Vesikels, die Struktur wird instabil und Sphingolipide treten hervor29. Sie sind damit als Substrate verfügbar (Substrataktivierung)30. Zudem interagieren SAP mit Lipid und Enzym und stellt den Kontakt zwischen beiden Molekülen her140. Die Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms wird dadurch erheblich erhöht (Enzymaktivierung). 1.5 Infektion mit Tuberkulose Tuberkulose ist eine der ältesten Infektionskrankheiten und lässt sich bis in die Steinzeit verfolgen9. Der Erreger, Mycobacterium tuberculosis, wurde jedoch erst 1882 von Robert Koch identifiziert. Diese Entdeckung und Robert Kochs Vortrag 26 Einleitung „Über bakteriologische Forschung“ auf dem 10. Internationalen Medizinischen Kongress in Berlin war die Geburtsstunde der Mikrobiologie und etablierte sie als eigenständige Wissenschaft184. Im Jahre 1921 legten die französischen Wissenschaftler Albert Calmette und Camille Guérin den Grundstein für die Tuberkulose-Impfung25. Nach 13 Jahren harter Arbeit war es ihnen gelungen, aus Mycobacterium bovis einen avirulenten Stamm zu passagieren. Die „Bacille Calmette-Guérin“ (BCG)-Impfung setzte sich in der 50er Jahren durch und wird noch heute als Impfung im Kindesalter eingesetzt. Selman Waksman und sein Doktorand Albert Schatz isolierten 1944 Streptomycin und entdeckten damit das erste Tuberkulostatikum132. Diesen Erfolgen ist zu verdanken, dass die Tuberkulose Erkrankung in den Industrieländern seltener wurde und von der Bevölkerung nicht mehr als Bedrohung gesehen wird. Dennoch gehört die Tuberkulose auch noch heute zu den „großen Seuchen der Menschheit“. Besonders eine Koinfektion mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) verläuft dramatisch. Die WHO registriert 8 Millionen Neuinfektionen mit Mycobacterium tuberculosis und zwei Millionen Todesopfer pro Jahr81,139. Die heutige medikamentöse Behandlung der Tuberkulose besteht aus einer Kombination verschiedener Tuberkulostatika wie Isoniazid, Ethambutol, Rifampicin, Streptomycin und Pyrazinamid. Meist ist die Einnahme dieser Medikamente für mindestens sechs Monate erforderlich. Dies setzt die Compliance des Patienten und kontinuierliche medizinische Versorgung und Betreuung voraus. Die Impfstoffentwicklung ist auch heute noch ein Hauptziel der Tuberkuloseforschung81. Die BCG-Vakzine hat sich als Prophylaxe für Kinder etabliert, weist aber für Erwachsense leider nur eine eingeschränkte Wirksamkeit auf. 1.5.1 Mycobacterium tuberculosis Mykobakterien gehören zu den intrazellulären Erregern. Sie sind aerobe, säurefeste gram-positive, Stäbchen. Man unterscheidet zwischen den schnell- und den langsam wachsenden Gattungen. Besonderes Kennzeichen der Mykobakterien ist ihre stabile, hydrophobe Zellwand17. Sie macht das Bakterium resistent gegenüber Umwelteinflüssen, aber auch Verteidigungsmechanismen des Körpers, wie reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffmetaboliten. Man kann die mykobakterielle Zellwand zur Vereinfachung in vier unterschiedliche Schichten einteilen16. Der inneren Peptidoglykanschicht folgen drei Schichten aus Lipiden und Zuckerderivaten. Viele mykobakterielle Lipide wie z.B. Mykolsäure und der Kordfaktor sind spezifisch für diesen Erreger und können in humanen Zellen nicht synthetisiert werden. Die 27 Einleitung Mykolsäure, beispielsweise, ist ein langkettiger Glyzerinester mit gesättigten Fettsäuren von 60 bis 80 Kohlenstoffatomen Länge. Lipoarabinomannan (LAM) ist ein großes, komplexes Glykolipid, das mit einem Glyzerophosphoinositol-Anker in der Zellwand des Bakteriums befestigt ist. Der hydrophile Anteil des LAM ist mit vielen Mannose-Zuckern verbunden. Glukosemonomykolat (GMM) ist ein Glyzerinester, seine ca. 80 Kohlenstoffatome lange Fettsäurekette ist zusätzlich mit einer Glukoseeinheit substituiert. 1.5.2 Infektionsabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis Die Übertragung von Tuberkulose erfolgt auf dem aerogenen Infektionsweg, Ursprung ist dabei ein Patient mit offener Tuberkulose, meist der Lunge. Mycobacterium tuberculosis infiziert zunächst Makrophagen. Der Erreger kann die Fusion zum Phagolysosom unterbinden und übersteht dadurch erfolgreich körpereigene Abwehrmechanismen100. In diesem Kompartiment überleben und vermehren sich Mykobakterien67. Abwehrmechanismen werden eingeleitet, wenn mykobakterielle Bestandteile d.h. potentielle Antigene von DC aufgenommen werden. Die DC drainieren dann zu den nächstgelegen Lymphknoten. Dabei durchlaufen die DC einen Reifungsprozess und exprimieren kostimulatorische Moleküle wie B7 und CD4072. Als „reife“ DC sind sie APC und können durch „priming“ T-Lymphozyten induzieren14. Sobald die Antigene in das späte Endosom/Lysosom gelangen, können die Peptide von MHC-II Molekülen gebunden werden und so CD4 T-Zellen vom Typ 1 der T-Helferzellen (Th1-Typ) aktivieren33. Diese T-Helferzellen sezernieren das Zytokin INF-, das nicht-infizierte Makrophagen für die Abwehrreaktion rekrutiert. Sie bilden Vorstufen von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffverbindungen, ROI bzw. RNI (engl. für reactive oxygen intermediate bzw. reactive nitrogen intermediate), die über bakterizide und zytotoxische Wirkungen verfügen49,135. ROI und RNI agieren zusätzlich als Botenstoffe und leiten weitere Abwehrprozesse ein. Auch CD8 T-Zellen spielen bei der Abwehr von M. tuberculosis eine Rolle179. Infizierte Makrophagen werden in Apoptose getrieben und bilden apoptotische Vesikel ab. Diese Vesikel enthalten einen „Steckbrief des Mykobakterium“ in Form von Protein- und Lipid-Fragmenten. Dank dieser Informationen können DC eine effektive Abwehrreaktion einleiten. Dabei erweist sich als günstig, dass DC im Gegensatz zu Makrophagen auch CD1 Moleküle besitzen und deshalb auch Lipidantigene präsentieren können84,171,146. Aktivierte CD8 T-Zellen wandeln sich zu 28 Einleitung zytotoxischen T-Zellen (ZTL) um. Diese schütten die Zytokine IFN-, TNF- und TNF- aus und lysieren infizierte Zellen163. Ihr Ziel sind Zellen, die ein köperfremdes Peptid via MHC-I-Komplex präsentieren. Sobald TZR und MHC-I-Peptid-Komplexe in Kontakt treten, sammeln sich TZR auf der ZTL-Oberfläche. Dies führt zur Aktivierung der ZTL. Sie exprimieren das Oberflächenmolekül Fas-Ligand (FasL). Dieser leitet die Apoptose ein, wenn er den Fas-Rezeptor auf der Zielzelle bindet. Darüber hinaus werden bei der Aktivierung kleine Vesikel, sogenannte Granula, zur Kontaktzone zwischen ZTL und Zielzellen gebracht97. Granula und Membran der Zielzelle fusionieren und ihr Inhalt wird freigesetzt27. Granula enthalten Perforin, Granzym und Granulysin. Perforin Proteine polymerisieren Calcium abhängig zu einem tunnelartigen Protein-Komplex aus -Faltblättern. Aufgrund des osmotischen Druckgefälles strömt extrazelluläre Flüssigkeit in die Zelle ein und sie zerplatzt. Durch Perforin-Tunnel gelangen Granzyme in die Zelle und setzen die Caspase Kaskade in Gang. Diese Serinproteasen induzieren die Apoptose der Zelle. Granulysin ist bakterizid und löst die Zellwand der Erreger auf. 29 2 Fragestellungen Fragestellungen Die vorliegende Dissertation bearbeitet zwei Themenkomplexe, deren verbindendes Element die Antigenpräsentation durch CD1 Moleküle ist. Vor ungefähr zehn Jahren entdeckte man, dass CD1-Proteine Lipidantigene präsentieren und T-Lymphozyten aktivieren. Bis heute ist die von Lipiden hervorgerufene Immunantwort ein dynamisches und aufregendes Forschungsgebiet für Immunologen geblieben, viele grundlegende Fragen sind noch ungeklärt und entscheidende Mechanismen warten auf ihre Entdeckung. NKT-Zellen stellen eine besondere Subpopulation der T-Lymphozyten dar. Sie tragen sowohl NK- als auch T-Zell Rezeptoren an ihrer Oberfläche und werden durch Lipide, die ihnen von CD1d präsentiert werden, aktiviert. Man spricht NKT-Zellen eine modulierende Funktion im Immunsystem zu, da sie sowohl Th1- als auch Th2Zytokine ausschütten können. Es ist noch nicht bekannt, welche Faktoren für NKTZellen und ihr Überleben in den peripheren Organen entscheidend sind. Die Leber enthält einen ungewöhnlich hohen Anteil an NKT-Zellen. Eine Erklärung für diese Beobachtung ist wichtig, um die Funktion der NKT-Zellen für das immunologische entscheidend Milieu sein, um der die Leber aufzudecken. Rolle von Dieses NKT-Zellen in Verständnis viralen wird Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Tumoren der Leber zu klären. Ziel dieser Dissertation war, die Homeostase muriner NKT-Zellen in der Peripherie, insbesondere der Leber zu untersuchen, dabei wurden folgende Fragen als Schwerpunkte gewählt: Adoptive Transferversuche sollten klären, ob CD1d das Langzeitüberleben von murinen NKT-Zellen in der Peripherie beeinflusst (adoptiver Transfer, FACS-Analyse) Entwicklung eines Modells für das Homingverhalten muriner NKT-Zellen Vergleich des Expansionsverhalten von NKT-Zellen in Leber und Milz (adoptiver Transfer, FACS-Analyse) Die Tuberkulose zählt auch heute noch zu einer der großen Seuchen der Menschheit, die jährlich zwei Millionen Todesopfer fordert. Die Entwicklung einer 30 Fragestellungen besseren Vakzine ist aus diesem Grund das Hauptziel der Tuberkuloseforschung. Die Grundlagenforschung kann hierbei neue Impulse liefern. CD1 Moleküle präsentieren auch mykobakterielle Lipide. Es ist jedoch immer noch unbekannt, wie diese Antigene prozessiert werden. Ziel dieser Dissertation war, Hilfsmoleküle in der CD1b vermittelten Antigenpräsentation zu identifizieren und ihre Funktionsweise aufzuklären, dabei wurden folgende Fragen als Schwerpunkte gewählt: Generierung von PSAP-/- APC (Transfektion, FACS-Analyse) Einfluss des Prosaposin-Gens auf die Antigenpräsentation von mykobakteriellen Lipiden (Proliferationsassays) Wirkung der Saposine auf die Antigenpräsentation von mykobakteriellen Lipiden (Proliferationsassays) Analyse des Lysosoms der Prosaposin defizienten Zellen (Biochemie, Fluoreszenz-Mikroskopie) Darstellung der Kolokalisation von CD1b, mykobakteriellem Antigen und Saposin im Lysosom (Konfokale Mikroskopie) Untersuchung der molekularen Interaktion zwischen CD1b und Saposinen (Proteinchemie) Einfluss von Saposin abhängiger Enzym- und Substrataktivierung auf die Antigenpräsentation von mykobakteriellen Lipiden (Biochemie und Proliferationsassays, Liposomen-Assay) 31 3 Materialien 3.1 Mäuse Materialien C57BL/6 (H-2b), CD1dKO und Bundesinstitut für gesundheitlichen V14-J281 Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, BgVV, Berlin 3.2 Zellen Fibroblasten Normal- und PSAP-/--Fibroblasten wurden von Professor Sandhoff (Universität Bonn) zur Verfügung gestellt T-Zell Linien Die T-Zellklone LCD4.7, LDN4 und LCD4.6 wurden unserer Arbeitsgruppe von Dr. Sieling (University of California, Los Angeles) überlassen DC 3.3 stammen von einem gesunden Donor Antigene LAM Dr. Belisle von der Colorado State University isolierte mit Mannose-Endgruppen besetztes LAM aus M. tuberculosis H37Rv GMM Prof. Moody von der Harvard University, Boston stellte das Lipid freundlicherweise zur Verfügung Mykolsäure Sigma 32 3.4 Materialien Antikörper und Zytokine NK1.1 (PK136), anti-Maus Pharmingen CD3 (145-2C11), anti-Maus Pharmingen Isotyp IgG1 Pharmingen αGalCer-CD1d Tetramer, Freundlicherweise überlassen von Dr. Robert anti-Maus Hurwitz CD1b (M-T101), anti-human, Pharmingen für FACS CD1b-Antikörper (4A765), MPI anti-human, LAMP1, anti-human Labor Prof. Ulrich Schaible Tetramer-Block (anti-CD16/CD32, MPI Rattenserum) CD1a (OKT6), anti-human MPI MHC-I (W6/32), anti-human MPI MHC-II (L246), anti-human MPI SAP-C, anti-human Freundlicherweise überlassen von Prof. Konrad Sandhoff IL4, human Preprotech IL2, human Boehringer GMCSF, human Preprotech CD8a (Ly-2) MicroBeads, Maus Miltenyi Biotech 3.5 Geräte Durchflusszytometer FACSCalibur, Becton Dickinson Zentrifugen Megafuge 2.0 R (Heraeus), Ultrazentrifuge (Beckmann) Konfokales Mikroskop TCS-NT, Leica ELISA-Lesegerät SpectraMax 250, Molecular Devices Mikroskop Zeiss Waage BP 210 S (Sartorius) Ultraschallwasserbad Branson Sonifier W-250 (G. Heinemann) 33 Materialien CO2 Inkubator Autoflow Incubator CO2 4500 E (NUAIRE) Sicherheitswerkbank Sicherheitswerkbänke HS 12 (Heraeus) pH-Meter 761 Calimatic Knick Elektronische Pipette Pipetboy acu (Integra Biosciences) Zellzählkammer Neubauer Zählkammer (Brand) Mini Wipp-Tisch Biometra Vortex-Gerät IKA-Labortechnik Rühr- und Heizplatte IKA-Labortechnik Filtermatte 196 Harvest-Gerät PerkinElmer FemtoJet Microinjector Eppendorf TopCount Packard Luminometer monolight 3036 BD Bioscience Liposomen-Filter LiposoFast, Amersham 3.6 Chemikalien L-Glutamin Gibco HEPES Gibco Natrium-Pyruvat Gibco Penicillin Sigma Streptomycin Sigma DMSO Sigma DOTAP Roche G418 Gibco FKS Gibco BSA Gibco Ficoll Sigma Conduritol-β-Epoxid Sigma o-Phenylendiamin Sigma CFSE Molecular Probes SNARF-1 Molecular Probes CBZ-(PheArg)2-rhodamin-110 Molecular Probes Leupeptin Sigma 34 DRAG-Cy5 Molecular Probes TexasRed Molecular Probes ALEXA 488 Molecular Probes 4-Methylumbelliferyl-2- Sigma Materialien acetoamido-2-deoxy--Dglucopyranosid 4-Methylumbelliferyl-- D- Sigma galactopyranosid Conduritol--epoxid Sigma PFB aminofluorescein Molecular Probes diglucoside 3.7 Reagenzien FACS-Puffer 1% BSA 0,01% NaN3 in PBS MACS-Puffer 0,5% BSA 2 mM EDTA in PBS Fixierungslösung 4 % Paraformaldehyd Permeabilisierungslösung 0,01% Tween in PBS ELISA Beschichtungs-Puffer PBS oder 100 mM Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6 ELISA Wasch-Puffer 0,1% BSA 0,05 % Tween 20 in PBS ELISA Block-Puffer 0,1% BSA in PBS ELISA Substrat-Lösung Zitronensäure-Puffer (0,1M; pH5) mit 0,1% H2O2 ELISA Stopp-Lösung 20% H2SO4 35 PBS Materialien 8g NaCl 0,2g KCl 0,2g KH2PO4 1,3g Na2HPO4 Gesamtvolumen: 1000 ml Zell-Lyse Puffer TE Puffer (pH 6,5) Protease Inhibitoren: TLCK, E64, Pepstatin, Leupeptin (1/1000) 8,55 % Sucrose Erythrozyten-Lyse Puffer 8,3g NH4Cl 20,6g Tris Gesamtvolumen 1000 ml pH: 7,65 Silberfärbung- 3% Na2CO3 Entwicklungslösung 0,5% Formaldehyd in H2O Silberfärbung-Fixierungslösung 10% Essigsäure 30% Methanol in H2O Fixierungs-Puffer 50 ml Ethanol und 10 ml Essigsäure mit 40 ml H2O Separierungsgel-Puffer(4x) 90,75g Tris Base 20ml 10% SDS Gesamtvolumen: 460 ml, pH 8,8 Lauf-Puffer (4x) 12,12g Tris Base 8ml 10% SDS Gesamtvolumen: 180 ml, pH 6,8 Grund-Puffer (3x) 187,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 6% SDS 0,9 mM EDTA 30% Glycerol 0,03% Bromophenol Blau 7,5% β-Mercaptoethanol Lauf-Puffer 25 mM Tris-HCl 0,1% SDS 36 Materialien 192 mM Glyzin, pH 8,3 Enzym Test Stopp-Puffer 12,6 g Glyzin 18g Na2CO3 Gesamtvolumen 1000ml pH 10 3.8 Zellkulturmedium DMEM und RPMI Medium 10% FKS 2mM L-Glutamin 2mM Natrium Pyruvat 100U/ml Penicillin und Streptomycin 2 mM HEPES T-Zellen 3.9 anstelle des FKS 5% humanes Serum Software Tabellen, Berechnungen, Excel (Microsoft) Statistik Abbildungen, Mikroskopie PowerPoint (Microsoft) Photoshop (Adobe Systems) Analyse der Cell Quest 3.0 (BD) Durchflusszytometrie FCS Express 2.0 (De Novo Software) Text Word (Microsoft) Analyse des ELISA Softmax Pro, Spf 3.0 (Molecular Devices) 3.10 Verschiedenes Ficoll, Percoll Sigma Microscint LSC Cocktail PerkinElmer 37 Zellkulturflaschen, Petrischalen Materialien Nunc und sterile Gefäße Sterile Filter und Membrane Schleicher & Schüll Dialyse Filter Type VS; 0,0025 μm Millipore Corporation ImmuMount Shandon 38 4 Methoden 4.1 Mäuse Methoden Die für diese Experimente verwendeten Mäuse wurden gemäß den Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes gehalten. Sie erhielten Wasser und Futter ad libidum. Die Versuchstiere waren 6-10 Wochen alt und hatten den genetischen Hintergrund C57 BL/6 (H-2b) (WT). Darüber hinaus wurden Tiere mit einer Defizienz des CD1d-Gens (CD1dKO) und Tiere, die transgen für den V14-J281 TZR (V14) sind, verwendet. Alle Mäuse wurden in den Versuchstieranlagen des Bundesinstituts für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin BgVV in Berlin unter spezifisch Pathogen-freien Bedingungen (SPF) gehalten. 4.2 Isolation von NKT-Zellen Der Anteil von NKT-Zellen im murinen Thymus von WT Tieren ist äußerst gering. Tiere, die transgen für den TZR der Ausprägung V14-J281 sind, verfügen über einen erhöhten Anteil an NKT Zellen in der Milz, Leber und im Thymus. Bei den durchgeführten adoptiven Transfer Versuchen wurden NKT-Zellen aus V14 Tieren verwendet. Der Anteil von NKT-Zellen wurde dabei durch Entfernung von CD8 T-Zellen weiter erhöht. Die verwendeten, transgenen Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Ihr Fell wurde mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Dann wurde ein ca. 5 cm langer Hautschnitt mit einer sterilen Schere ausgeführt, anschließend wurde der Thorax parasternal eröffnet und der Thymus vorsichtig entnommen. Die Thymi wurden mit einem Stahlsieb homogenisiert und in sterilen PBS gewaschen. Diese Zellen wurden in sterilem Erythrozyten-Lyse Puffer resuspendiert und bei 37C für 2 min inkubiert. Danach wurden die Zellen in Zellkulturmedium gewaschen. Zur Isolation von Zellen wird in der Immunologie häufig die Technik der magnetischen Zell Sortierung (MACS, engl. magnetic cell sorting) angewendet. Dazu werden Antikörper verwendet, die an ein paramagnetisches Partikel gebunden 39 Methoden wurden. Die Antikörper werden mit den zu isolierenden Zellen inkubiert und binden dabei an diejenigen Zellen, die das entsprechende Antigen an ihrer Oberfläche tragen. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen gewaschen und über eine Filtersäule gegeben, die an einem Magneten angebracht ist. Die Zellen passieren den Magneten langsam als Einzelzellsuspension. Zellen, die den Antikörper gebunden haben, werden dabei durch den Magneten aufgehalten. Zellen, die das Antigen nicht exprimieren, durchlaufen das Filtersystem und können aufgefangen werden (negative Selektionsmethode). Anschließend wird die Säule aus dem Magnetfeld entfernt und die gebundenen Zellen lassen sich aus der Säule lösen (positive Selektionsmethode). Die aus den Thymi gewonnenen Zellen wurden mit MicroBeads (anti-Maus CD8, Miltenyi Biotec) für 20 min inkubiert. Dabei wurden je 8l beads pro 107 Zellen in 1 ml MACS-Puffer verwendet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und nach der beschriebenen Methode isoliert. Die negative Fraktion enthält NKT-Zellen, die positive Fraktion besteht aus CD8 T-Lymphozyten. 4.3 Adoptive Transfer Versuche Für die adoptiven Transfer Versuche wurden gefärbte NKT-Zellen verwendet. Für die Färbungen wurde Carboxyfluorescein Diacetat (CFSE, Molecular Probes) für NKT-Zellen und SNARF-1 (NKTù und CD8 Zellen) verwendet. CFSE dient zur Langzeitmarkierung von Zellen. Die farblose Substanz diffundiert passiv in das Zytoplasma ein, wird von intrazellulären Esterasen gespalten und entwickelt dabei seine Fluoreszenz. Die Succinimidyl Estergruppen reagieren dabei mit den Amin-Gruppen der Proteine. Diese Verbindungen sind stabil und werden von Zellen bei jeder Teilung an ihre Tochterzellen weitergegeben. Bei Anregung mit Licht von 492 nm Wellenlänge, emittiert CFSE Licht mit der Wellenlänge 517 nm, dies entspricht gelb-grüner Fluoreszenz und kann im ersten Kanal des Durchflusszytometers detektiert werden. Da nach der Teilung weitergegebenes CFSE eine geringere Fluoreszenzintensität hat als jenes der Mutterzelle, lässt sich das Proliferationsverhalten von T-Lymphozyten über einen längeren Zeitraum verfolgen. SNARF-1 ist eine dem CFSE verwandte Substanz und färbt nach einem ähnlichen Grundprinzip. Es emittiert jedoch Licht anderer Wellenlänge und wird im zweiten Kanal detektiert. 40 Methoden CFSE und SNARF-1 wurden nach Anweisungen des Herstellers in DMSO gelöst und verdünnt. Das Zellpellet wird in den Färbelösungen resuspendiert und für 8 min lichtgeschützt inkubiert. Dann werden die Zellen in Vollmedium gewaschen, die Färbung im Fluoreszenz-Mikroskop kontrolliert und in sterilen PBS (300l pro Empfänger-Maus) aufgenommen. Pro Empfängertier wurden die Thymi von fünf V14-Tieren gleichen Geschlechts verwendet. Die gefärbten NKT-Zellen wurden in die laterale Schwanzvene einer WT- und einer CD1dKO-Maus injiziert. 4.4 Isolation von Leber- und Milzzellen Nach dem adoptiven Transfer wurden die Empfängertiere zu den gewählten Zeitpunkten zur Analyse der NKT-Zellen getötet. Das Fell der Mäuse wurde zunächst desinfiziert, dann wurde ein longitudinaler Hautschnitt durchgeführt. Anschließend wurden Milz und Leber durch einen Schnitt am linken und rechten Rippenbogen dargestellt, dann wurden die beiden Organe vorsichtig entnommen. Zur Separierung der Milzlymphozyten wurde das Organ mit Hilfe eines Metallsiebes homogenisiert. Danach wurden die Erythrozyten der Zellsuspension mit Erythrozyten-Lyse Puffer entfernt. Die Lymphozyten der Leber wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Zunächst wurde die Leber homogenisiert und in 45 ml RPMI bei 400 rpm für 2 min bei 4C zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, das Pellet wurde zusätzlich dreimal mit jeweils 15 ml RPMI gewaschen und bei oben genannten Bedingungen zentrifugiert. Diese Überstände wurden zusammen mit dem ersten Überstand bei 1500 rpm für 10 min und 4C zentrifugiert. Das entstandene Zellpellet wurde in einer 40%igen Percoll-Lösung resuspendiert und auf eine 70%igen Percoll-Lösung geschichtet. Dieser Gradient wurde bei 1900 rpm für 30 min ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Die Lymphozyten flottieren als eine zarte Schicht zwischen den beiden Percoll-Lösungen. Diese Zellen wurden vorsichtig aufgenommen und zweimal in RPMI gewaschen, danach wurden die Erythrozyten lysiert. 41 4.5 Methoden Analyse der Transferversuche Zur Analyse der Transferversuche wird die Technik der Durchflusszytometrie (FACS, engl. Fluoreszenz-Aktivierte Zell-Sortierung) verwendet (zur Technik des FACS siehe Abbildung 12). Dabei wurden jeweils 1 x 106 der Milz- und Leber-Zellen mit 1 µg eines Antikörpers in 100 µl FACS-Puffer (PBS, 1% BSA, 0,01% NaN3) gefärbt. Es wurden die Färbungen NK1.1-PE/CD3-Cy5 und NK1.1-APC/CD3-Cychrome durchgeführt. Nach einer Inkubation von 30 min bei 4 °C wurden die Zellen in FACS-Puffer gewaschen und dann auf einem Durchflusszytometer (FACSCalibur; BD, USA) analysiert. Außerdem wurden die NKT-Zellen aus Milz und Leber mit Hilfe eines αGalCer-CD1d Tetramers dargestellt. 2x106 Zellen wurden für 10 min bei 4°C mit 0,2 l Ratten Serum und 0,2 l anti-CD16/CD32 in 200l PBS inkubiert. Dieser Schritt soll eine unspezifische Bindung des Tetramers verhindern. Dann wurden 3 μg des PE-konjugierten Tetramers zugefügt und lichtgeschützt in Eis für 1 h auf einer WippPlatte inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und auf dem Durchflusszytometer untersucht. 4.6 Zell-Linien und Antigene Die beiden dermalen Fibroblasten-Zellen wurden freundlicherweise von Prof. Sandhoff (Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie der Universität Bonn) zur Verfügung gestellt. Die Sphingolipid-Aktivator-Protein-defizienten (PSAP-/-) Fibroblasten stammten von einem der wenigen Patienten, bei denen eine Mutation im ProsaposinùGen diagnostiziert wurde66. Humane Wildtyp-Fibroblasten (Normal), die konstitutiv alle SAP-Proteine synthetisieren, wurden als Kontrolle verwendet. Beide Zell-Linien wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FKS), 2 mM L-Glutamin, 2 mM HEPES, 2 mM Natrium-Pyruvat und je 100 U/ml Penicillin und Streptomycin (beides Sigma) unter Standardbedingungen (ST; 37 C, 5% CO2) kultiviert. Zur Rekonstitution der defizienten Zellen wurden 1 x 106 PSAP-/--Fibroblasten für 12 Stunden mit SAP-A-D bei ST inkubiert (25 µg/ml)21. 42 Methoden Prof. Sandhoff (Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie der Universität Bonn) stellte freundlicherweise rekombinante SAP-Proteine zur Verfügung. Sie wurden in Pichia pastoris exprimiert und über Nickel-Säulen aufgereinigt. Dr. Belisle (Colorado State University) isolierte mit Mannose-Endgruppen versehenes LAM aus dem Stamm M. tuberculosis H37Rv. Mykolsäure wurde über die Firma Sigma bezogen. Prof. Moody (Harvard University, Boston) stellte freundlicherweise GMM zur Verfügung. Alle Lipidantigene wurden in einer Konzentration von 10 µg/ml eingesetzt. Dr. Sieling (University of California, Los Angeles) stellte die T-Zellklone LCD4.7 (LAM reaktiv), LDN4 (GMM reaktiv) und LCD4.6 (Mykolsäure reaktiv) zur Verfügung. 4.7 Mit Transfektion Hilfe einer stabilen Transfektion kann man dauerhaft eine in Desoxyribonukleinsäure (DNA) kodierte Information in die Zielzelle einbringen. Für die beiden Fibroblasten-Linien wurden unterschiedliche Methoden der Transfektion gewählt. Normal-Fibroblasten wurden mit einem FemtoJet Microinjector (Eppendorf, Deutschland) mikroinjiziert, PSAP-/--Fibroblasten hingegen wurden lipofiziert mit DOTAP (Roche, Deutschland). Das verwendete Plasmid -NEO-hCD1b enthielt die Information für das CD1b-Gen und ein Resistenzgen für das Antibiotikum Geneticinsulfat (G418). Das bedeutet, dass nur Zellen, die das Plasmid im Genom integriert haben, in G418-haltigem Medium wachsen können. Die WildtypFibroblasten wurden in einer Zelldichte von 1 x 104 Zellen pro Zellkulturschale kultiviert. Dann wurde DNA (1 ng/ml) mit dem FemtoJet direkt in den Zellkern fest adhärenter Zellen injiziert. Nach einem Tag wurde das Medium erneuert und 0,5 mg/ml G418 (Gibco, England) zugegeben. DOTAP hat die chemische Zusammensetzung N [1-(2 dioleoyloxy)propyl]N,N,N. Als kationisches Lipid bildet es mit negativ-geladener DNA Liposomen aus, die von den Zellen per Endozytose aufgenommen werden. 106 Prosaposin-defiziente Fibroblasten wurden in einer 100 mm-Zellkulturschale kultiviert. Nach 24 Stunden wurden 7 µg DNA mit 45 µl der DOTAP-Lösung vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Das DNA-DOTAP-Gemisch wurde der Zellkultur zugefügt. Nach einem Tag wurde das Zellkulturmedium ausgetauscht und nach einem weiteren Tag mit 0,5 mg/ml G418 versetzt. Diese Antibiotikakonzentration wurde auf 0,9 mg/ml aufdossiert. 43 4.8 Methoden T-Zellkultur Die T-Zell-Linien wurden nach einem Standardprotokoll für T-Zellklone in Kultur gehalten. Die Zellen156 wurden in RPMI (RPMI versetzt mit 10% FKS, 5% humanes Serum, 2mM L-Glutamin, 2mM HEPES und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin) auf eine 24-Näpfchen-Platte verteilt. Dabei wurde folgendes Verteilungsschema verwendet: je 1 x 106 T-Zellen, 1 x 105 DC (bestrahlt mit 50 Gy) und das entsprechende Antigen pro Näpfchen. Alle 2 Tage wurde dem Medium 30 U/ml IL-2 (Boehringer, Deutschland) zugefügt. Alle 10 Tage wurde frisches FKS (8%), humanes Serum (2%) und IL-2 (30 U/ml) zu den T-Zellen gegeben. Nach 2 Wochen wurden die T-Zellen restimuliert, d.h. erneut nach oben genanntem Verteilungsschema dem Antigen ausgesetzt. Bei Bedarf wurden die Lymphozyten durch eine Dichtegradientenzentrifugation von Zelldebris gereinigt. Dazu wurden alle Zellen mit ihrem Medium aufgenommen, auf Ficoll geschichtet, und für 25 min bei RT mit 1500 rpm (Heraeus Megafuge, ohne Bremse) zentrifugiert. Die Interphase zwischen Medium und Ficoll (Sigma) wurde mit Medium gewaschen und nach oben genannter Methode auf eine 24-Näpfchen-Platte verteilt 4.9 Isolierung und Kultur von DC Die Blutspende eines gesunden Donors wurde mit Heparin versetzt und im Verhältnis 1:1,25 mit PBS verdünnt. Dann wurden die Monozyten durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert (Abbildung 11). Zunächst wurde das Blut auf Ficoll geschichtet, dann bei 1200 rpm (Heraeus Megafuge, Deutschland) für 25 min ohne Bremse bei RT zentrifugiert. Ficoll trennt die Blutbestandteile nach ihrer Dichte auf. Monozyten und Lymphozyten als Zellen mit geringer Dichte flottieren zwischen Plasma und Ficoll. Diese Interphase wurde vorsichtig abpipettiert, zweimal in PBS gewaschen und auf Zellkulturflaschen verteilt. Nach 1 h Inkubation adhärieren die Monozyten auf dem Boden der Zellkulturflasche. Das PBS wurde mit den nichtadhärierenden Zellen (Lymphozyten) entfernt und durch RPMI ersetzt. Dem Medium wurde IL-4 (100 U/ml, Preprotech, Deutschland) und GMCSF (200 U/ml, Preprotech, Deutschland) zugegeben und die Zellen wurden für drei Tage in Kultur genommen. 44 Methoden Abbildung 11: Isolierung von Monozyten Mononukleäre Zellen können mittels der Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Verdünntes, heparinisiertes Blut wird auf Ficoll oder Percoll aufgeschichtet und dann zentrifugiert. Die zellulären Blutbestandteile sind nun nach ihrer Dichte aufgetrennt. Mononukleäre Zellen flottieren als feiner Ring 22 zwischen Serum und Ficoll, Erythrozyten haften am Boden des Röhrchens . 4.10 Die FACS-Analyse der Transfektanten Methode der FACS-Analyse (Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung, FACSCalibur; BD, USA) wurde verwendet, um die Oberflächenexpression an CD1b der Transfektanten zu überprüfen. 1 x 106 Zellen wurden mit 1 µg Antikörper (MT101) oder mit 1 µg Isotyp IgG1 in 100 µl FACS-Puffer inkubiert. Beide Antikörper sind an Fluoresceinisothiocyanat (FITC), ein Fluorochrom, gekoppelt. Mit Isotyp gefärbte und ungefärbte Zellen dienen als Färbekontrollen. Die Isotyp-Kontrolle zeigt die unspezifische Bindung des verwendeten Antikörpers, ungefärbte Zellen zeigen die bereits vorhandene Auto-Fluoreszenz der Zellen. Die Fibroblasten wurden für 30 min bei 4 °C inkubiert und anschließend dreimal in FACS-Puffer gewaschen. Im Durchflusszytometer FACSCalibur passieren die Fibroblasten Zelle für Zelle als Einzelzellsuspension einen Laser (Abbildung 12). Sein Licht wird gestreut und die abgelenkten Strahlen werden von Photomultiplikatoren gemessen. Man unterscheidet zwischen Vorwärtsstreuung (forward scatter) und Seitwärtsstreuung (sideward scatter). Forward scatter korreliert mit der Größe der Zellen. Sideward scatter korreliert mit der Fluoreszenz und der Plasma-Kern-Relation der Zellen und ist definiert als im Winkel von 90 zum Laserstrahl gemessene Lichtstreuung. Mit verschiedenen Antikörpern können die Zellen nach ihren Oberflächenmolekülen, z.B. CD3, NK1.1, CD1b etc., charakterisiert werden. FITC wird durch Licht der Wellenlänge 450-500 nm angeregt und sendet dabei energieärmeres, langwelligeres Licht im Bereich von 500-550 nm aus. Dieses Licht wird entsprechend seiner Wellenlänge von Photomultiplikatoren registriert und einem bestimmten Kanal zugeordnet. Andere Fluorochrome emittieren Licht größerer oder kleinerer Wellenlänge und werden deshalb in einem anderen Kanal detektiert. Phycoerythrin 45 Methoden (PE) wird im zweiten Kanal, Allophycocyanin (APC) im vierten Kanal und Cychrome im dritten Kanal gemessen. Die Intensität des gemessenen Lichts im Wellenbereich 500-550 nm ist proportional zur Menge an gebundenem anti-CD1b-FITC-Antikörper und zeigt, wie stark dieses Molekül an der Oberfläche exprimiert wird. Abbildung 12: Grundprinzipien der Durchflusszytometrie Die Zellen der zu untersuchenden Probe werden in einer Fließkammer in Einzelzellsuspension gebracht und als Tröpfchen an einem Laserstrahl vorbeigeleitet. Dabei entsteht Streulicht, das von Photomultiplikatoren gemessen wird. Das Vorwärtsstreulicht korreliert dabei mit der Größe der Zellen, das um 90 abgelenkte Licht wird als Seitwärtsstreulicht bezeichnet und stellt die Granularität bzw. die Kern-Plasmarelation der Zelle dar. Weitere Photomultiplikatoren registrieren Fluoreszenz verschiedener Wellenlängen. Die Fluoreszenz einer Zelle spiegelt die Antigendichte an ihrer Zelloberfläche wieder (siehe Histogramm rechts)22. 4.11 Enzyme-Funktionsversuche Conduritol-β-Epoxid (Sigma, USA), ein spezifischer Inhibitor der lysosomalen β-Glukosidase, wurde zu den bestrahlten DC gegeben (100 µM oder 500 µM). Nach 1h Inkubation wurden die DC für die Versuche verwendet. Die Inhibition des Enzyms wurde mit einem Substrat überprüft, das durch lysosomale β-Glukosidase in ein fluoreszierendes Substrat gespalten wird. Die vorbereiteten DC wurden für 15 min bei RT mit PFB Aminofluorescein Diglucosid inkubiert und dann auf dem Durchflusszytometer untersucht. Um die Aktivität der Enzyme Cathepsin L und B nachzuweisen, wurden die Zellen auf Glasdeckgläschen eingesät, in PBS (ph 7,35) gewaschen und dann mit 10 µM CBZ-(PheArg)2-rhodamin-110 in PBS für 20 min bei ST inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die Zellen in Ringerlösung eingebettet und mikroskopiert. Als Kontrollen wurde Leucin, ein Cystein-Serin-Proteasen Konzentration von 25 µM zu den Versuchsansätzen gegeben. Inhibitor, in einer 46 Für die Messung der Enzymaktivität Methoden von β-Hexaminosaminidase und β-Galaktosidase wurden zuerst die Lysosomen von Normal- und PSAP-/-Fibroblasten isoliert144. Dazu wurden die Zellen auf Eis in Lysepuffer in einem Homogenisator zermahlen. Diese Suspension wurde bei 800 rpm für 10 min und 4C zentrifugiert. Zunächst wurde mikroskopisch untersucht, ob der Überstand noch ganze Zellen enthält. Dann wurden 4 ml des Überstandes auf 10 ml einer 20%igen Percoll-Lösung aufgeschichtet. Nun erfolgte eine 21 minütige Zentrifugation bei 18000 rpm ohne Bremse bei 4C. Der Überstand wurde entfernt und jeweils 3 ml in den Röhrchen belassen. Die Proben wurden vereinigt und für 1h bei 50000 rpm und 4C ultrazentrifugiert. Dieses Pellet enthält die Lysosomen und wird in PBS aufgenommen. Die Substrate der β-Hexaminosaminidase (4-Methylumbelliferyl-2-acetoamido-2deoxy--D-glucopyranosid) und β-Galaktosidase (4-Methylumbelliferyl-- D-galactopyranosid) wurden nach Anweisung des Herstellers verdünnt. Je 10 l der Proben wurden zu 40 l der Substratlösungen in ELISA-Platten gegeben. Die Platte wurde bedeckt und für 60 min bei 37C inkubiert. Dann wurde die Reaktion mit dem Enzym Test Stopp-Puffer beendet und in einem ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 364 nm ausgewertet. 4.12 T-Zell Proliferationsassay Im Proliferationsassay wird die Proliferation von T-Zellen nach Kontakt mit dem Antigen gemessen (Abbildung 13). Wenn sich T-Zellen teilen, verdoppelt sich auch ihre DNA. Gibt man radioaktiv-markiertes Thymidin in die Zellkultur, wird Thymidin in die neu gebildete Erbsubstanz eingebaut und kann als freigesetzte β-Strahlung gemessen werden. In diesen Versuchen wurden die APC, DC oder Transfektanten, zunächst mit 50 Gy bestrahlt und dann mit den Lipiden (10 µg/ml LAM oder GMM oder Mykolsäure) inkubiert. Nach ca. 60 min wurden die T-Zellen zugegeben. Richtschnur war dabei ein Triplikat je Einsatz und folgendes Schema: 5 x 104 TZellen (LCD4.7, LDN4 oder LCD4.6) auf 5 x 104 DC oder DC + CBE, 1 x 104 NormalCD1b, 1 x 104 PSAP-/--CD1b oder mit SAP rekonstituierte Transfektanten. Nach 3 Tagen wurde jedem Näpfchen 1µCi zugegeben. Der Assay wurde 12 h später auf 47 Methoden TopCount (Packard) analysiert. Diese Maschine gibt die Strahlung in der Einheit Teilchenzerfall pro Minute (engl.: counts per minute, c.p.m) an. Abbildung 13: Prinzip des Proliferationsassays Proliferationsfähigkeit ist ein Aspekt der T-Zellfunktion. Sie kann mit Hilfe des Proliferationsassays für ein bestimmtes Antigen gemessen werden. T-Zellen werden mit dem Antigen und radioaktiv markiertem Thymidin für ca. 48-72 h inkubiert. Im Rahmen der Zellteilung kommt es zu einer Verdoppelung der DNA und das radioaktive Material wird in das Erbgut eingebaut. Nach ca. 16 h Inkubationszeit werden die Zellen mit einem so genannten Harvester geerntet, der die Zellen auf einen Glasfaserfilter überträgt. Mit einem β-Zähler wird dann die Radioaktivität des Filters bestimmt. Sie ist ein Maß für die DNA-Replikation und Proliferation der T-Zellen22. 4.13 Fluoreszenz-Mikroskopie Um das lysosomale Kompartiment darzustellen, wurden Glasdeckgläschen mit 100 µl FKS beschichtet. 15 min später wurden darauf 1 x 105 PSAP-/-- und 1 x 104 Normal-Zellen aufgebracht und für 12 h in Kultur gehalten. Die Fibroblasten wurden über Nacht in 4 % Paraformaldehyd fixiert und permeabilisiert (10 min, PBS mit 0,01% Tween). Die Funktion von LAMP-1 (Lysosomen-assoziiertes Membranprotein 1, CD147) ist unbekannt, es wird präferentiell im Lysosom und terminalen Endosom exprimiert und dient deshalb als Marker für diese Kompartimente. Die Fibroblasten wurden für 45 min bei RT mit einem anti-LAMP-1 Antikörper inkubiert und anschließend in PBS gewaschen. Darauf folgte eine Färbung mit einem Zweitantikörper (siehe Abbildung 14 und 15). Dieser ist gegen den Fc-Teil des LAMP-1-Antikörpers gerichtet und an das Fluorochrom Cy2 gekoppelt. Lysosom bzw. das späte Endosom wird nun als grünes, fein-granuläres Muster sichtbar. Der Zellkern der Zellen wurde mit DRAG-Cy5 angefärbt. DRAG ist eine interkalierende 48 Methoden Substanz, das heißt, sie legt sich zwischen die DNA-Stränge. Das Fluorochrom Cy5 verursacht die blaue Färbung. Die Fibroblasten werden gewaschen, fixiert (Immumount) und mit einem Leica TCS-NT Mikroskop (Leica, Deutschland) untersucht. Abbildung 14: Techniken der Fluoreszenz-Mikroskopie Bei der Fluoreszenz-Mikroskopie werden verschiedene Färbetechniken verwendet. Ist ein Antikörper an ein Fluorochrom gebunden, bezeichnet man dies als Direkte Immunfluoreszenz (1.). Eine Zelle kann natürlich durch zwei Antikörper markiert werden. Dies führt zu einer Doppel-Fluoreszenz (2.). Bei der Indirekten Immunfluoreszenz (3.) wird in zwei Schritten gefärbt. Der Primär-Antikörper (z.B. anti-Mensch) ist nicht an ein Fluorochrom gebunden. Die Färbung entsteht durch einen zweiten, Sekundär-Antikörper, der gegen den Primär-Antikörper gerichtet ist22. 4.14 Konfokale Mikroskopie Die Konfokale Mikroskopie verfügt über eine hervorragende Auflösung der Aufnahmen. Während sich bei der herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie Areale aus unterschiedlichen Ebenen überlagern können, werden solche Artefakte dieser Art bei der Konfokalen Mikroskopie vermieden. Dazu werden durch die Objekte „optische Schnitte“ gelegt und gezielt Informationen einer Bildebene ausgewählt. Lichtreflexe außerhalb des Fokus werden unterdrückt. Das hat zur Folge, dass eine Kolokalisation der Fluoreszenz nur zustande kommt, wenn sich die Farbstoffe in derselben Struktur und in derselben Ebene einlagern. Um die Kolokalisation von LAM und SAP-C darzustellen, wurden folgende Marker-Substanzen verwendet: LAM-ALEXA-488 (grüne Fluoreszenz), SAP-C-Texas-Red (rote Fluoreszenz) und Dextran-Texas-Red (rote Fluoreszenz). Dextran-Texas-Red reichert sich im späten Endosom bzw. Lysosom an und stellt deshalb diese Kompartimente der Zellen dar. Deckgläschen mit Fibroblasten wurden vorbereitet, dann wurden LAM-ALEXA-488, SAP-C-Texas-Red und Dextran-Texas-Red als Tropfen auf die Deckgläschen gegeben (Konzentration von 10 µg/ml in 100 µl Medium). Nach einer Inkubationszeit von 5h für SAP-C, 4h für LAM-Alexa-488 und 3 h für Dextran-Texas-Red wurden die Fibroblasten gewaschen, in Ringer-Lösung auf den Objektträger eingebettet und 49 Methoden mikroskopiert. Um das Zusammentreffen von SAP-C und CD1b nachzuweisen, wurden rekonstituierte PSAP-/--Transfektanten und DC wie zuvor beschrieben auf Deckgläschen eingesät und mit einem CD1b-Antikörper (4A765) und einem SAPAntikörper (freundlicherweise überlassen von Prof. Konrad Sandhoff) für 1h gefärbt (Konzentration von 10 µg/ml in 100 µl Medium). Dann wurden die Zellen gewaschen, eingebettet und mikroskopiert. Abbildung 15: Grundprinzipien der Fluoreszenz Das Leuchten eines Stoffes wird als Fluoreszenz bezeichnet. Fluoreszierende Stoffe absorbieren ein Teil der eingestrahlten Lichtenergie, die ungenutzte Energie strahlen sie als Licht größerer Wellenlänge ab. Ein häufig verwendetes Fluorochrom ist das Molekül FITC. Es wird durch Licht der Wellenlänge 450500 nm angeregt und emittiert Licht mit der Wellenlänge von 500-550 nm, das als gelbliches Grün wahrgenommen wird. Beim Fluoreszenz-Mikroskop passiert nur das Licht einer bestimmten Wellenlänge einen Sperrfilter, um auf das Untersuchungsobjekt gelenkt zu werden. Das Objekt emittiert wie zuvor beschrieben das Licht, das über einen Farbteiler und Bandpassfilter zum Betrachter geleitet wird22. 4.15 Liposomen-Assay Zunächst wurden Liposomen konstruiert, die LAM enthalten, dann wurde SAP-C zugegeben und das freigesetzte LAM in einem Enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) gemessen. Die Zusammensetzung der Liposomen war Cholesterin (Chol) 35 Vol%, Phosphatidylcholin (PC) 25 Vol%, Phosphatidylserin (PS) 20 Vol% und Phosphatidylinositol (PI) 10 Vol%. Das Gemisch wurde in Stickstoff-Gas getrocknet und in Puffer gelöst. Diese Dispersion wird in einem Ultraschallwasserbad in liposomale Strukturen gebracht. Die Liposomen wurden zweimal gewaschen (Ultrazentrifugation bei 100000 g, 4 C für 20 min) und mit Hilfe eines Filters (LiposoFast, Amersham, Kanada; 2 Filter mit Porendurchmesser 100 µm) in eine einheitliche Größe gebracht. Nun wurde biotinyliertes LAM (8 µg/µl) zugegeben, die Liposomen gewaschen und in PBS pH 4 aufgenommen. Zu den Liposomen wurden 50 Methoden jeweils SAP-C, SAP-A, BSA oder kein Protein zugegeben (zwei Konzentrationen 5 oder 50 g/l) und für 5 min bei 37 ºC unter Bewegung inkubiert. Die Versuchsansätze wurden abzentrifugiert (4 C für 10 min) und die Überstände eingesammelt. Das freigesetzte LAM der Überstände wurde mit Hilfe eines ELISA quantifiziert. Der Antikörper CS40 erkennt ein Epitop im LAM-Molekül. Er wurde auf eine Mikrotiterplatte gegeben (0,2 µg/Vertiefung). Die Überstände wurden für 1h bei RT inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde Streptavidin-Peroxidase in die Vertiefungen der Platte gegeben. Das Streptavidin bindet an Biotin. Die Peroxidase macht durch eine enzymatische Farbreaktion die Menge an Biotin und damit auch LAM quantifizierbar. Der Indikator o-Phenylendiamin (OPD, Sigma, GB) und Wasserstoffperoxid werden in die Vertiefungen pipettiert. Das Wasserstoffperoxid wird durch die Peroxidase in Wasser und flüchtigen Sauerstoff umgesetzt. Dabei sinkt der pH-Wert und das o-Phenylendiamin wird protoniert und ändert seine Farbe. Diese Reaktion wird bei Beginn des Farbumschlags mit 25%iger Schwefelsäure beendet. Die Farbänderung wird als optische Dichte (OD) bei 450 nm mit einem Photometer gemessen. 4.16 Crosslinker-Studien Crosslinker-Studien wurden verwendet, um zu untersuchen, ob SAP-C mit CD1b in Wechselwirkung tritt. Dies wurde auch für die Proteine SAP-A, SAP-B und SAP-D überprüft. Um die Spezifität der Versuche zu veranschaulichen, wurde auch die Wechselwirkung zwischen den Molekülen MHC-I, MHC-II und CD1a einerseits und den Saposin-Proteinen andererseits untersucht. SAP-A bis SAP-D wurden mit einem UV-Licht-empfindlichen Crosslinker (SAND, Pierce Biotechnologies, USA) gekoppelt und für 4h mit DC inkubiert. Dann wurden die DC mit UV-Licht bestrahlt (Stratalinker 1800; Stratagene, USA). Dadurch wird eine Reaktion ausgelöst, welche die Saposine an ihre Interaktionspartner koppelt. Die Zellen wurden dann in PBS mit 1% Triton-X100 lysiert und ihre Proteine in Laemmli-Puffer gekocht. Diese Proben wurden mit CD1b-, CD1a (OKT6)- und MHC-I (W6/32)-Antikörpern präzipitiert, per SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem ABC-System (Avidin-Biotin-Verstärker) gefärbt. Mit Streptavidin aufgereinigte Isolate dienten als Kontrolle für die SAP-Banden. Zuerst wurden die SAP-Fraktionen aus den Proben isoliert. Dazu wurde der Crosslinker mit seinem Biotin-Anteil durch eine Streptavidin-Biotin-Fällung präzipiert. Die Hälfte der 51 Methoden Proben wurden mit Dithiotreitol (DTT, Sigma, GB), einem Reduktionsmittel, versetzt. Dieses befreit komplexierte Proteine aus der Bindung mit dem Crosslinker. Alle Isolate wurden auf ein 15%iges Polyacrylamid-Gel übertragen, mit SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit einem CD1b- oder einem MHC-II (Eu 45)-Antikörper gefärbt. Dann wurden die Proben zusammen mit den übrigen Proteinen des Gels mit dem ABC-System nachgewiesen und über das ECL-System (Amersham, USA) detektiert. Unaufgereinigte Zell-Lysate aus DC wurden als Positivkontrollen für die CD1b- bzw. MHC-II-Banden verwendet. 52 Ergebnisse 5 Ergebnisse 5.1 Adoptiver Transfer von NKT-Zellen NKT-Zellen sind eine besondere Subpopulation von T-Lymphozyten, die auch NK-Marker exprimieren. Diese Zellen werden durch Antigenpräsentationsmoleküle aktiviert, welche auf Lipidantigene spezialisiert sind. Mäuse ohne CD1d Moleküle entwickeln keine NKT-Zellen105. Eine grundlegende Frage war deshalb, ob die Zellen auch in der Peripherie auf CD1d angewiesen sind. Um diesen Aspekt im murinen System zu untersuchen, wurden adoptive TransferVersuche in WT- und CD1dKO-Mäusen durchgeführt. Der Anteil von klassischen NKT-Zellen mit dem Rezeptor V14 ist im Thymus von WT-Tieren nur gering. Aus diesem Grund wurden Thymi von Tieren verwendet, die transgen für diesen Rezeptortyp sind und deshalb einen erhöhten Anteil von NKT-Zellen aufweisen. Die Thymi der V14-Mäuse wurden entnommen und der Anteil der NKT-Zellen durch eine Depletion der CD8 Lymphozyten weiter erhöht. Diese Zellen wurden mit CFSE gefärbt und in eine CD1dKO-Maus und ein WT-Tier transferiert. CFSE erlaubt die Verfolgung von Lymphozyten über einen längeren Zeitraum, da die Substanz eine feste Verbindung mit den Proteinen im Inneren der Zelle eingeht und fluoresziert. Außerdem lässt sich mit CFSE die Zellproliferation verfolgen, da die Fluoreszenzintensität mit jeder Durchflusszytometrie werden neuen diese Zellgeneration Generationen als abnimmt. scharf In der abgegrenzte Populationen sichtbar. Die erste Generation liegt dabei am weitesten distal, die Tochtergenerationen weisen geringere Fluoreszenzintensität auf und liegen deshalb näher am Achsenursprung. Die Empfängertiere wurden am ersten, 10. und 20. Tag nach Transfer getötet, um Milz und Leber zu entnehmen und die Lymphozyten durchflusszytometrisch zu untersuchen (Abbildung 16). Dazu wurden die Zellen zum einen mit den Antikörpern NK1.1-PE und CD3 APC charakterisiert und zum anderen mit einem GalCer-CD1d Tetramer gefärbt. NKT-Zellen werden deshalb entweder als doppelt positive Zellen (CD3/NK1.1-Färbung) oder Tetramer positive Zellen dargestellt. Die transferierten NKT-Zellen sind zusätzlich CFSE positiv. 53 Ergebnisse Tag 10 WT CD1d KO Tag 20 WT CD1d KO Abbildung 16: Das Überleben von NKT-Zellen ist unabhängig von CD1d Thymozyten von Vα14-Mäusen wurden CD8 depletiert, mit CFSE gefärbt und in die laterale Schwanzvene von WT- und CD1dKO-Tieren injiziert. Leber und Milz der Empfängertiere wurden entnommen und die Lymphozyten mit dem FACS analysiert. Es ließ sich kein Unterschied im Verhalten der transferierten NKT-Zellen in den beiden Empfängertieren feststellen. Auch die Expression des Markers NK1.1 (mittlere Reihe, beispielhaft für Tag 10 und 20) blieb konstant. 54 Ergebnisse Bei der Auswertung der Versuche ergab sich, dass sich weder in den Kurz- noch in den Langzeitversuchen ein Unterschied im Verhalten der NKT-Zellen zwischen WT und CD1dKO-Mäusen feststellen ließ. Die NKT-Zellen zeigten in beiden Tieren das gleiche Proliferationsverhalten. Auch die Expression des NK-Zellmarkers NK1.1 war vergleichbar. Aus diesem Ergebnis lässt sich ableiten, dass CD1d zwar für die Entwicklung der NKT-Zelle prägend ist, nicht jedoch für ihr Überleben in der Peripherie. 5.2 Proliferationsverhalten von NKT-Zellen in Milz und Leber Adoptive Transfer Versuche haben gezeigt, dass die Expression CD1d nicht für das Überleben von NKT-Zellen in den peripheren Organen erforderlich ist. Dies bedeutet, dass andere Faktoren das Wachstum der Zellen beeinflussen müssen. Die Leber verfügt über einen hohen Prozentsatz an NKT-Zellen. Auch in den Experimenten fand sich ein erhöhter Anteil der transferierten NKT-Zellen in der Leber. NKT-Zellen werden mit der Abwehr von Infektionen und Tumoren sowie der Entwicklung von Autoimmunität in Verbindung gebracht. In diesem Kontext wird interessant, ob die NKT-Zellen der Leber durch das Milieu des Organs beeinflusst werden. Man bezeichnet die „Verteilung“ von Zellen z.B. nach adoptivem Transfer als Homing. Man könnte dies als den Prozess beschreiben, in dem die Lymphozyten ihr „Heim“ und „zu Hause“ (engl. home) finden, die ihnen optimale Lebensbedingungen bieten. In vivo gliedert sich Homing von Zellen in verschiedene Phasen (Tabelle 5). Man kann sich vorstellen, dass nach einer initialen Verteilungsphase, die wesentlich durch die Perfusion der Organe bestimmt wird, eine Ansiedlung der Lymphozyten im Gewebe stattfindet. Dies wird maßgeblich durch Rezeptoren der Gewebe und der Zellen bestimmt76. Danach erfolgt eine „Lebensphase“, in der die Zellen expandieren. Diese Phase wird durch Zytokine und das Milieu des Organs beeinflusst. 55 Ergebnisse Tabelle 5: Phasen im Homingverhalten von Lymphozyten Verteilung Ansiedlung Leben Zellen verteilen sich in Zellen besiedeln das Organ Zellen leben im Organ und pro- verschiedenen Organen liferieren bestimmt durch: bestimmt durch: bestimmt durch: Organperfusion Rezeptoren der Zelle und des Wachstumsfaktoren wie Zyto- Gewebes kine Experimente, welche das Homingverhalten von NKT-Zellen klären sollten, haben sich bislang auf Rezeptoren der Lymphozyten oder des Lebergewebes 45 konzentriert , nicht aber auf das Proliferationsverhalten der NKT-Zellen. Um diesen Aspekt zu untersuchen, wurden zuerst mit CFSE gefärbte NKT-Zellen in WT- und CD1dKO-Mäuse transferiert. 10 Tage später wurden SNARF-1 gefärbte NKT-Zellen in dieselben Empfängertiere injiziert. 4 Stunden nach dem zweiten adoptiven Transfer wurden Leber und Milz der Empfängertiere entnommen und die Lymphozyten charakterisiert (Abbildung 17). Für die Identifizierung der NKT-Zellen wurde eine CD3/NK1.1-Färbung verwendet. Durch den zweifachen Transfer zu zwei verschiedenen Zeitpunkten erhält man einen Bezugspunkt für die Expansion der transferierten NKT-Zellen. Bei der Analyse der Versuche wird deutlich, dass die ersten beiden Generationen der transferierten Zellen in Leber und Milz ungefähr gleich groß sind. Danach jedoch proliferieren die NKT-Zellen der Milz nur geringfügig. Die NKT-Zellen der Leber jedoch teilen sich weiter (Abbildung 18). Dies ist ein Anhaltspunkt dafür, dass die Präferenz der NKT-Zellen für die Leber nicht nur auf der „Verteilung“ der Zellen beruht oder der Expression von CD1d im Organ, sondern auch auf der Proliferation der NKT-Zellen. 56 Ergebnisse Leber 10 SNARF-1 10 10 10 10 Milz 4 10 3 10 2 10 4321 1 10 0 0 1 10 2 10 3 10 10 4 10 10 4 3 2 4321 1 0 0 1 10 2 10 3 10 10 4 10 CFSE Abbildung 17: Verteilungsverhalten und Überleben von NKT-Zellen Zehn Tage nach dem Transfer von CFSE markierten NKT-Zellen wurden erneut NKT-Zellen transferiert, diese waren jedoch mit SNARF-1 gefärbt worden. 4h später wurden Milz und Leber der Empfängertiere entnommen und die NKT-Zellen der Organe durchflusszytometrisch untersucht. Die Darstellung der CSFE-Färbung macht deutlich, dass sich die NKT-Zellen der Leber ca. 3-4 mal geteilt haben (Generationen 3 und 4), die der Milz jedoch nur 1-2 mal. Die Verteilung der frisch transferierten NKTZellen unterscheidet sich in den beiden Organen kaum. Leber SNARF-1 10 10 10 10 10 Milz 4 10 3 10 2 10 1 10 0 0 10 1 10 2 10 3 10 10 4 10 4 1 : 1,5 3 2 1 2,5 : 1 0 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 CFSE Abbildung 18: Die Leber bietet NKT-Zellen optimale Lebensbedingungen Durch den zweifachen, adoptiven Transfer von NKT-Zellen, erhält man einen Bezugspunkt, um die Expansion der Lymphozyten in Milz und Leber vergleichen zu können. Bezogen auf die Gesamtzahl an Leukozyten im Organ enthalten Leber und Milz einen gleichen Anteil an neu transferierten NKT-Zellen (SNARF-1 positiv). Vergleicht man jedoch dieses Verhältnis erneut zehn Tage post Transfer, so finden sich mehr NKT-Zellen in der Leber. Dies wird besonders deutlich, wenn man gezielt die 3.-4. Generation der NKT-Zellen betrachtet. Dies weist darauf hin, dass die NKT-Zellen in der Leber besser expandieren, dies jedoch nicht auf der CD1d Expression oder der Exposition mit Antigenen beruht. 57 5.3 Ergebnisse Generierung von APC Die Prosaposin-Defizienz gehört zu den Sphingolipidosen. In den Zellen der Patienten findet sich eine Akkumulation komplexer Sphingolipide im lysosomalen Kompartiment. Im Elektronenmikroskop werden diese Ablagerungen als „Lipidpakete“, intralysosomale Vesikel, sichtbar. Im Lichtmikroskop wird deutlich, dass sich PSAP-/--Fibroblasten auch in ihrem Äußeren von Wildtyp-Zellen unterscheiden (Abbildung 19, links). Ihr Zell-Leib wirkt verplumpt, die Zellausläufer sind verkürzt. Abbildung 19: Transfektionsfibroblasten -/- PSAP -Fibroblasten wirken plumper als die spindelartigen Normal-Fibroblasten (lichtmikroskopische Bilder, links). Um das CD1b-Expressionsniveau der Transfektanten zu messen, wurden beide Fibroblastenarten mit einem anti-CD1b-Antikörper-FITC und einem IgG-FITC (Isotyp) inkubiert und mit einem FACS-Gerät untersucht. Das CD1b-Expressionsniveau spiegelt sich in Fluoreszenzintensität wieder. Je mehr CD1b-Antikörper an der Zelloberfläche gebunden wurden, desto größer wurde der Abstand zwischen der schwarzen (anti-CD1b-Antikörper) und der grauen Kurve (Isotyp-Kontrolle). In der FACSùAnalyse zeigen Normal-CD1b-Transfektanten und PSAP-/--CD1b-Transfektanten eine hohe CD1b-Expression (Histogramm, rechts). Prosaposin-Defizienz ist eine extrem seltene Sphingolipidstoffwechselerkrankung und nur wenige wurden weltweit dokumentiert. Aus diesem Grunde war es nicht möglich, DC von Patienten zu verwenden. Stattdessen wurden PSAP-/-- und Normal-Fibroblasten als APC verwendet. Dazu wurden die Zellen mit humanem CD1b-Gen transfiziert. Sie exprimieren damit das Molekül, um Lipidantigene zu präsentieren. In einem Proliferationsassay kann untersucht werden, ob sich die Prosaposin-Defizienz bei der Präsentation von GMM, LAM und Mykolsäure an T-Lymphozyten bemerkbar macht. Die Transfektanten wurden mit G418 auf Expression des CD1b-Gens selektiert. Mit Hilfe der FACSùAnalyse wurde das Ausmaß der CD1b Moleküle an der Zelloberfläche dokumentiert. Die Fibroblasten 58 Ergebnisse wurden mit anti-CD1b-Antikörpern oder dem dazugehörigen Isotyp inkubiert und die Intensität der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer gemessen (Abbildung 19, Histogramm rechts). Die Fluorochrome des Antikörpers verursachen das „Leuchten“ der Zellen und korrelieren mit dem Anteil an CD1b-exprimierender Transfektanten. 5.4 SAP-C ist essentiell für die Antigenpräsentation GMM, LAM und Mykolsäure sind mykobakterielle Lipide und Liganden für CD1b (Abbildung 20)47,109,155. Die Lipide können jedoch nicht direkt an dieses Antigenpräsentationsmolekül binden. Die Bindung zwischen CD1b und Lipidantigen muss im lysosomalen Kompartiment stattfinden130. Es ist unbekannt, welche Prozesse oder Prozessierungsvorgänge dabei stattfinden müssen. Proliferationsassays sollten zeigen, ob Prosaposin-defiziente APC in der Lage sind, Lipidantigene zu präsentieren. Mykolsäure GMM Abbildung 20: Mykolsäure und GMM Die Strukturformeln der mykobakteriellen Lipide Mykolsäure und GMM sind in der Abbildung 20 dargestellt. LAM ist ein viel komplexeres Glykolipid. Für die Versuche wurde mannosyliertes LAM 47 verwendet, d.h. LAM, dessen Endgruppen mit Mannose verbunden sind . Die PSAP-/-- und Normal-CD1b-Transfektanten wurden mit LAM (a), GMM (b) oder Mykolsäure (c) und antigen-spezifischen T-Zellklonen inkubiert (siehe Abbildung 21). Als Positivkontrolle für die T-Zellantwort wurden DC verwendet. Die PSAP-/-Transfektanten konnten die Lipidantigene GMM, LAM oder Mykolsäure nicht präsentieren und die T-Zellen proliferierten nicht. Normal-CD1b-Zellen dagegen induzierten eine spezifische T-Zellantwort für alle drei Antigene. 59 Ergebnisse Abbildung 21: Die Präsentation von mykobakteriellen Lipiden ist abhängig von SAP-C Proliferationsassays sollten zeigen, ob Prosaposin defiziente APC humanen T-Zellklonen Lipidantigene präsentieren können. PSAP-/-- und Normal-CD1b-Transfektanten wurden mit LAM (a), Mykolsäure (mycolic acid b) oder GMM (c) inkubiert und spezifischen T-Zellen ausgesetzt. Parallel dazu wurden PSAP-/--CD1b-Fibroblasten mit allen SAP-Proteinen rekonstituiert und als APC eingesetzt. Drei Tage später wurde das Medium mit radioaktiv-markiertem Thymidin versetzt. Nach weiteren 12 h wurde das eingebaute radioaktive Material mit einem β-Zähler bestimmt. Humane DC eines gesunden Donors wurden als Positivkontrolle verwendet. Normal-CD1b und DC induzieren eine vergleichbare Proliferation -/der T-Zellen. Im Gegensatz dazu sind PSAP -CD1b-Fibroblasten nicht in der Lage, die T-Zellen zu aktivieren. Mit Hilfe der rekonstituierten PSAP-/--CD1b-Fibroblasten sollte die Rolle der Saposin-Proteine individuell untersucht werden. Die Rekonstitution mit SAP-A, SAP-B und SAP-D blieb ohne Auswirkungen auf die T-Zellantwort. Transfektanten mit SAP-C hingegen zeigten für GMM, LAM und Mykolsäure signifikante Proliferationswerte. Eine Zugabe sämtlicher Saposine steigerte die Proliferation nicht (a). Die Proliferation lässt sich durch einen CD1b-blockierenden Antikörper unterdrücken (b,c), d.h. SAP-C rekonstituiert eine CD1b abhängige T-Zellantwort. Daraus lässt sich schließen, dass SAP-C eine entscheidende Rolle bei der Präsentation dieser Lipidantigene zukommt. 60 Ergebnisse Die verwendeten APC sind keine „professionellen“ APC. Der Vergleich zwischen Normal-CD1b-Transfektanten und DC zeigt jedoch, dass Fibroblasten eine T-ZellProliferation hervorrufen können. Es kann deshalb ausgeschlossen werden, dass z.B. fehlende kostimulierende Moleküle für die ausbleibende T-Zellantwort in den Prosaposin defizienten Zellen verantwortlich sind. PSAP-/--Zellen können kurzfristig durch die Zugabe von Saposin-Proteinen rekonstituiert werden21. Dazu wurden PSAP-/--CD1b-Transfektanten mit den Saposin-Proteinen A-D inkubiert und in Proliferationsassays eingesetzt. Eine Rekonstitution mit SAP-C konnte für alle drei Antigene T-Zellantwort hervorrufen. SAP-A, SAP-B oder SAP-D beeinflusste die Antigenpräsentation nicht, es wurde kein Unterschied zu den nicht-rekonstituierten PSAP-/--CD1b-Transfektanten in der T-Zellproliferation sichtbar. Um sicherzustellen, dass die durch SAP-C rekonstitutierte T-Zellantwort tatsächlich CD1b-vermittelt ist, wurde zusätzlich ein CD1b-blockierender Antikörper zugegeben (Abbildung 21 b, c). Unter diesen Bedingungen war trotz Zugabe von SAP-C keine T-Zellproliferation nachweisbar. Des weiteren wurde untersucht, ob eine Zugabe aller Saposine die T-Zellantwort zusätzlich verbessert. Es zeigte sich, dass die Proliferation der T-Zellen durch eine Rekonstitution mit allen Proteinen nicht weiter gesteigert wird (Abbildung 21 a). Ein Hinweis für eine Zusammenarbeit verschiedener Saposine lässt sich demzufolge aus diesem Versuch nicht ableiten. SAP-C muss folglich eine Schlüsselfunktion in der Antigenpräsentation der drei Lipide, GMM, LAM oder Mykolsäure, spielen. 5.5 Das lysosomale Kompartiment der PSAP -/- -APC ist funktionstüchtig Die zuvor dargestellten Ergebnisse lassen darauf schließen, dass SAP-C eine entscheidende Funktion in der Beladung von CD1 Molekülen spielt. Nun war wichtig zu untersuchen, ob die Beobachtungen auf eine „Fehlfunktion“ des Lysosoms zurückgeführt werden können. Prosaposin-Defizienz gehört zu den lysosomalen Speicherkrankheiten. Dennoch ist das Lysosom als Zellorgan in seiner Funktion und Anatomie nicht beeinträchtigt, und auch die lysosomalen Enzyme sind in vitro reaktionsfähig. 61 Ergebnisse Mit verschiedenen Versuchstechniken sollte die Funktionsfähigkeit des Lysosoms der PSAP-/--Transfektanten untersucht werden. Um zu zeigen, dass wesentliche lysosomale Proteasen auch in PSAP-/-Transfektanten aktiv sind, wurde die Funktion von Cathepsin B und L bestimmt (Abbildung 22, links). Diese beiden Enzyme spalten das Substrat CBZ-(PheArg)2rhodamin-110, wobei eine grün-gelbe Fluoreszenz entsteht. PSAP-/-- und NormalTransfektanten zeigen beide eine regelgerechte, lysosomale Verteilung der grünen Färbung (Abbildung 22, obere Reihe links). Abbildung 22: Das Lysosom ist bei Prosaposin Defizienz intakt Die Grundfunktionen des Lysosoms sind durch Prosaposin Defizienz nicht eingeschränkt. Die in vivo Funktion der Enzyme Cathepsin B und L wurde mit Hilfe von CBZ-(PheArg)2-rhodamin-110 untersucht. Diese Proteasen spalten das Substrat, wodurch Fluoreszenz austritt. Zur Kontrolle werden die Enzyme in einem weiteren Ansatz durch den spezifischen Inhibitor Leucin blockiert. Sowohl Normal- als auch PSAP-/--Zellen zeigen nach Inkubation mit dem Substrat Fluoreszenz (Mikroskopische Bilder, obere Reihe links). Der Inhibitor verhindert in beiden Transfektanten das Entstehen des fluoreszierenden Produkts (untere Reihe, links). Darüber hinaus wurde die Enzymaktivität der β-Hexaminosaminidase (H) und β-Galaktosidase (G) in beiden Transfektanten in vitro bestimmt (Balkendiagramm, obere Reihe rechts). Es zeigte sich deutlich, dass die in vitro Aktivität der Enzyme in beiden Fibroblasten gleich ist. Die Morphologie des Lysosoms sollte mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskopie verglichen werden. Beide Transfektanten wurden mit DRAG-Cy5 (blau) und LAMP1 (grün) gefärbt (untere Reihe, rechts). PSAP-/-und Normal-Fibroblasten zeigen das Lysosom bzw. das späte Endosom regelgerecht als grünes Muster, das den Zellkern (blau) umrahmt. Die Spezifität dieses Versuches lässt sich mit Hilfe des Inhibitors Leupeptin nachweisen. Leupetin blockiert die Proteasen Cathepsin B und Cathepsin L. Wird Leupeptin zu den Versuchsansätzen gegeben, werden diese beiden Enzyme 62 Ergebnisse spezifisch inhibiert und das Substrat kann nicht umgesetzt werden. Beide Fibroblasten zeigen daraufhin keine Fluoreszenz mehr (Abbildung 22 untere Reihe, links). Zusätzlich sollte die Enzymaktivität der Glukosidasen β-Hexaminosaminidase (H) und β-Galaktosidase (G) ermittelt werden (Abbildung 22, Balkendiagramm obere Reihe rechts). Dazu wurden die Lysosomen von PSAP-/-- und Normal Fibroblasten isoliert und die Aktivität der Enzyme pro Gewichtseinheit isolierten Proteins gemessen. Auch in diesem Versuch zeigen die PSAP-/--Transfektanten keinen Unterschied zu Normal-Zellen. Dieses Ergebnis veranschaulicht, dass die Enzyme aus PSAP-/-Zellen in vitro vollkommen funktionsfähig sind. Die „lysosomale Speicherkrankheit“ entsteht in diesem Gendefekt, da in vivo zur optimalen Funktionsfähigkeit der Enzyme Saposin-Proteine benötigt werden. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie sollte auch die Anatomie des Lysosoms verglichen werden. Dazu wurde das Lysosom von PSAP-/-- und Normal-Fibroblasten mit LAMP-1-Antikörpern und DRAG-Cy5 dargestellt (Abbildung 22, untere Reihe rechts). Beide Fibroblasten zeigen das Lysosom bzw. das späte Endosom als grünes, feinkörniges Muster, das den Zellkern (blau gefärbt mit DRAG-Cy5) umgibt und sich bis in die Zellausläufer fortsetzt (LAMP1-Färbung). 5.6 Kolokalisation von Antigen, CD1b und SAP-C im Lysosom Saposin-Proteine werden im Lysosom aktiviert. Sie stellen den Kontakt zwischen Sphingolipiden und Enzymen her und könnten mit ähnlichen Mechanismen helfen, CD1b Moleküle mit Lipidantigenen zu beladen. Konfokale Mikroskopie sollte illustrieren, dass ein Lipidantigen auch in den Prosaposin defizienten Zellen in das Lysosom aufgenommen wird (Abbildung 23, obere Reihe). Als Antigen wurde das Lipid LAM, das an ALEXA-488 (grüne Fluoreszenz) gekoppelt wurde, verwendet. Das lysosomale bzw. späte endosomale Kompartiment wurde mit Dextran-TexasRed (rote Fluoreszenz) markiert. PSAP-/--Zellen wurden mit beiden Farbstoffen inkubiert und dann mikroskopiert. Wenn grüne und rote Fluoreszenz, d.h. LAM und der Marker Dextran, in derselben optischen Ebene zusammentreffen, entsteht gelbe 63 Ergebnisse Abbildung 23: Die Kolokalisation von SAP-C, LAM und CD1b Mit der konfokalen Mikroskopie sollte untersucht werden, ob Saposine und mykobakterielle Lipide in rekonstituierten Transfektanten aufeinander treffen. Zunächst wurde nachgewiesen, dass LAM auch in -/PSAP --Fibroblasten in das Lysosom gelangt. Die Fibroblasten wurden mit LAM-ALEXA-488 und Dextran-Texas-Red inkubiert. Dextran markiert das lysosomale Kompartiment in rot, LAM fluoresziert durch ALEXA-488 grün. Gelbe Areale entstehen durch die Kolokalisation beider Moleküle, d.h. der Aufnahme von LAM in das Lysosom (Abbildung a). Abbildung b illustriert das Zusammentreffen von SAP-C und LAM. Für diese Färbung wurde neben LAM-ALEXA-488 (grün) SAP-C-Texas-Red (rot) verwendet. Die Verteilung der gelben Areale und Abbildung legen nahe, dass SAP-C und LAM im Lysosom kolokalisieren. Daraufhin wurde die Kolokalisation von SAP-C und CD1b untersucht. PSAP-/-Fibroblasten wurden mit einem SAP-C-Antikörper (α-SAP-C, rot) und einem anti-CD1b Antikörper (αCD1b, grün) gefärbt. Lokalisierte, gelbe Färbung zeigt, dass die Moleküle zusammentreffen (Overlay, c). Dieses punktuelle Färbe- bzw. Verteilungsmuster findet sich in gleicher Ausprägung in DC, die als Vergleich mit derselben Technik gefärbt wurden (Overlay, d). 64 Ergebnisse Fluoreszenz. Abbildung 23 a zeigt deutlich, dass sich LAM im Lysosom der Zellen befindet. Nun sollte dargestellt werden, dass SAP-C und LAM in diesem Kompartiment zusammentreffen. Dazu wurden dieselben Bedingungen wie bei der Rekonstitution der Transfektanten angewandt. Rekombinantes SAP-C wurde an den Farbstoff Texas-Red (rote Fluoreszenz) gebunden. SAP-C-Texas-Red und LAM-ALEXA-488 (grün) wurde zu den Transfektanten gegeben und die Zellen wurden nach einer Inkubationszeit mikroskopiert. Die Kolokalisation von SAP-C und LAM resultiert in einem gelben Verteilungsmuster, wie sie Abbildung 23 b deutlich zeigt. Nachdem festgestellt wurde, dass Lipidantigene auch in PSAP-/--Zellen in das Lysosom aufgenommen werden, und dort mit SAP-C kolokalisieren, war interessant, ob es dabei auch zu einem Zusammentreffen mit CD1b kommt. Diese Frage sollte ebenfalls mit Hilfe der Konfokalen Mikroskopie beantwortet werden. Dazu wurden PSAP-/--Transfektanten mit einem rot-fluoreszierenden SAP-C- und einem CD1b-Antikörper (α-CD1b, grün) gefärbt. Abbildung 23 c zeigt vereinzelte gelbe Areale, welche die Kolokalisation von SAP-C und CD1b widerspiegeln (Overlay). Als Vergleich dazu sollte nun das Verteilungsmuster von SAP-C und CD1b in DC, einer professionellen APC, untersucht werden (Abbildung d). Dazu wurden DC eines gesunden Donors mit SAP-C-Texas-Red und einem CD1b-Antikörper inkubiert. Auch hier zeigten sich dezente, gelbe Areale, wenn SAP-C und CD1b kolokalisieren. Dies bedeutet, dass SAP-C in PSAP-/--Transfektanten und DC mit CD1b in Kontakt tritt. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass nach der Rekonstitution der Transfektanten SAP-C mit Lipidantigenen und CD1b in Kontakt tritt und dies auch in DC mit gesundem Phänotyp geschieht. Weitere Versuche sollten klären, welche Mechanismen dabei in Kraft treten könnten. 5.7 Wechselwirkung von SAP-C und CD1b Nachdem festgestellt wurde, dass SAP-C für die Aktivierung von Lipid-reaktiven T-Zellen notwendig ist und im Lysosom mit Lipidantigenen und auch CD1b zusammentrifft, sollte untersucht werden, wie innig der Kontakt zwischen SAP-C und dem Antigenpräsentationsmolekül ist. SAP-C interagiert im Sphingolipidmetabolismus nicht nur mit Lipiden, sondern auch mit Proteinen, wie dem Enzym β-Glukosidase. Es wäre demnach möglich, dass 65 Ergebnisse Abbildung 24: Die Interaktion von SAP-C und CD1b Crosslinker-Studien sollten die Interaktion zwischen Saposin-Proteinen und CD1b zeigen. Saposine wurden mit UV-Licht sensitiven Crosslinkern verbunden und dann mit DC inkubiert. Nach UV-Lichtbestrahlung wurden diese Zellen lysiert und danach mit verschiedenen Techniken analysiert. Um eine Wechselwirkung der SAP-Proteine mit Antigenmolekülen nachzuweisen, wurden die Lysate mit CD1b-, CD1a-, MHC-I- oder MHC-II-Antikörpern aufgereinigt (Abbildung a). Nur das Präzipitat mit CD1b zeigt 14 kDa Banden für SAP-C und SAP-D. Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde eine weitere Methode verwendet, den SAP-CD1b-Komplex nachzuweisen. Zuerst wurden die Saposine mittels ihres biotinylierten Crosslinkers isoliert. Dann wurden die Proben unter reduzierenden (+DTT) oder unter nicht-reduzierenden (-DTT) Verhältnissen aufgetrennt und mit CD1b- Antikörpern (Abbildung b) oder MHC-II-Antikörpern (Abbildung c) gefärbt. In den SAP-C und SAP-D Isolaten konnten CD1b-Banden detektiert werden (Lanes 6 und 7). Darüber hinaus fand sich eine Bande in der Größe des SAP-C-CD1b-Komplexes (Lane 10). 66 Ergebnisse SAP-C direkt mit CD1b in Kontakt tritt, um das Molekül mit dem Antigen zu beladen. Crosslinker-Studien sollten diese Frage beantworten. Auch wenn SAP-A, SAP-B und SAP-D in den Proliferationsassays keine Wirkung gezeigt haben, so könnten sie dennoch, für andere Lipidantigene als die getesteten, notwendig sein. Aus diesem Grund wurden die folgenden Versuche mit allen Saposin-Proteinen durchgeführt. Zunächst wurden die Saposine an einen UV-Licht-empfindlichen, biotinylierten Crosslinker gekoppelt und mit DC inkubiert. Nach 4 h wurden die Zellen mit UV-Licht bestrahlt. Durch diesen Vorgang werden alle Proteine mit dem Crosslinker vernetzt, die in diesem Augenblick mit dem SAP-Protein assoziiert sind. Die DC wurden lysiert und die gewonnenen Proben mit CD1b-, CD1a, MHC-I- oder MHC-II-Antikörpern aufgereinigt (Abbildung 24 a). Die Proben wurden danach mit SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose gepresst und mit dem ABC-System gefärbt. Für jedes SAP wurde als Kontrolle Zell-Lysat mit Streptavidin ausgefällt. Dies zeigt die maximal isolierbare Menge an Saposin Protein in den Proben und dient als VergleichsBanden. Die CD1a, MHC-I und MHC-II-Präzipitate enthielten keine Saposine. In der CD1b-Fällung wurden jedoch eine deutliche 14 kDa-Bande in der SAP-C und SAP-D-Probe sichtbar. Dies beweist, dass SAP-C und SAP-D mit CD1b interagieren. Um diese Resultate zu bekräftigen, wurde zusätzlich der entgegengesetzte Weg beschritten. Die Proteine wurden zunächst über SAP-A, SAP-B, SAP-C bzw. SAP-D aufgereinigt (Abbildung 24 b). Weil der Crosslinker biotinyliert ist, kann dazu eine Streptavidin-Biotin-Reaktion verwendet werden. Dann wurde die Hälfte der Proben mit dem Reduktionsmittel Dithiotreitol (DTT) behandelt. DTT löst komplexierte Proteine aus der Bindung mit dem Crosslinker. Sämtliche Isolate wurden dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran gepresst. Anschließend wurde eine Färbung mit CD1b- oder MHC-II-Antikörpern durchgeführt und das ECL-System zur Detektion verwendet. Die SAP-Isolate zeigen keinen MHC-II-Komplex. Im Gegensatz dazu lassen sich CD1b-Banden von 45 kDa in den SAP-C bzw. SAP-D-Proben nachweisen. Unaufgereinigte Zell-Lysate (auch verdünnt 1:10 und 1:100) zeigen als Kontrolle die Größe der CD1b- bzw. MHC-II-Banden. Eine Silberfärbung des Gels demonstriert die Gesamtmenge des präzipitierten Proteins (Abbildung 24 c, Silver stain). Interessanterweise findet sich im nicht reduzierten Zustand eine 60 kDa Bande, die CD1b und SAP-C als Komplex widerspiegelt. Diese Bande findet sich nicht in dem SAP-D-Isolat. Wahrscheinlich bilden SAP-C mit CD1b stabilere Komplexe aus. 67 5.8 Ergebnisse Substrat- und Enzymaktivierung durch SAP-C Nachdem gezeigt wurde, dass SAP-C mit CD1b interagiert, sollte nun aufgeklärt werden, welche Funktion SAP-C in der CD1b-Antigenpräsentation übernimmt. SAP-C aktiviert im Sphingolipidmetabolismus Enzyme und Lipidsubstrate. Zunächst sollte überprüft werden, ob Interaktion mit einem Enzym für die Antigenpräsentation entscheidend ist. SAP-C aktiviert das Enzym β-Glukosidase (Abbildung 25), welches über eine breite Substratspezifität verfügt90. Nun sollte untersucht werden, ob die Wirkung von SAP-C auf die Antigenpräsentation von LAM auf eine Reaktion mit βGlukosidase zurückzuführen ist. Conduritol-β-Epoxid (CBE), ein spezifischer Inhibitor der lysosomalen β-Glukosidase wurde mit DC inkubiert. Um die Wirksamkeit des Inhibitors zu testen, wurden diese DC mit einem fluorogenen Substrat des Enzyms inkubiert. DC, welche nicht mit dem Inhibitor behandelt wurden, strahlen eine Fluoreszenz aus, die durchflusszytometrisch gemessen werden kann (Abbildung 26 a). Im Gegensatz dazu fluoreszieren DC, deren β-Glukosidase nicht blockiert wurde nicht. DC mit und ohne CBE-Behandlung wurden mit LAM gepulst und in einem Proliferationsassay als APC eingesetzt. Abbildung 26 b zeigt, dass der Inhibitor die T-Zellantwort nicht vermindert. Es kann ausgeschlossen werden, dass β-Glukosidase an der CD1b-vermittelten Antigenpräsentation beteiligt ist. SAP-C tritt im Sphingolipidstoffwechsel nicht nur mit Enzymen, sondern auch mit verschiedenen Lipiden in Wechselwirkung. Im Lysosom sind Lipide in multilamellären Vesikeln zusammengelagert. Das bedeutet, dass die Substrate zunächst für die Enzyme unzugänglich sind. SAP-C befreit die Lipidsubstrate, indem sie die Vesikel destabilisiert und dadurch die Sphingolipide an die Oberfläche bringt. Wenn Lipidantigene ebenfalls in den multilamellären Vesikeln gefangen werden, könnte SAP-C die Antigene auf ähnliche Weise zur Präsentation vorbereiten. Um diese Funktion von SAP-C zu überprüfen wurden Liposomen hergestellt, die LAM enthalten. Diese Liposomen wurden mit SAP-C und SAP-A (verschiedene Konzentrationen, high: 5 g/l und low: 50 g/l) inkubiert. Als Kontrolle für unspezifische Interaktionen wurde BSA verwendet. Das exstirpierte LAM wurde mittels eines ELISA quantifiziert. Abbildung 26 c zeigt, dass die LAM-Konzentration durch die Wirkung von SAP-C deutlich ansteigt. SAP-A hingegen hat einen geringeren Effekt. Eine Zugabe von BSA bleibt wirkungslos, die LAM-Konzentration steigt nicht signifikant über das Niveau der Kontrolle. Es ist interessant, dass die 68 Ergebnisse zehnfache Konzentration an SAP-C oder SAP-A das freigesetzte LAM nur etwa verdoppelt. Abbildung 25: Übersicht über den Sphingolipidmetabolismus Diese Darstellung des Sphingolipidmetabolismus und der dazugehörigen Enzyme veranschaulicht, dass der Umsetzung von Ceramiden (markiert durch blauen Punkt im Diagramm) eine Schlüsselfunktion im 106 Stoffwechsel zukommt . Die Umwandlung der Ceramide in Glucosylceramide durch die β-Glukosidase (roter Pfeil) wurde für die Inhibitionsversuche gewählt, da dadurch auch die Enzyme der Globoside und Ganglioside beeinflusst werden. Es war zu erwarten, dass LAM Anschluss an diese Stoffwechselwege findet. Eine Inhibition der β-Glukosidase müsste sich in diesem Fall auf die Antigenpräsentation von LAM auswirken. Das könnte darauf hinweisen, dass bei der Reaktion nicht ein 1:1-Verhältnis der Moleküle vorliegt. Vermutlich reichen wenige Saposine aus, um das Liposom zu destabilisieren und LAM freizusetzen. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass SAP-C für exogene, mykobakterielle Lipide die gleiche Funktion übernehmen kann wie für endogene Lipide. 69 Ergebnisse c Abbildung 26: Die Funktion von SAP-C Saposine wirken durch Enzym- und Substrataktivierung. SAP-C aktiviert insbesondere das Enzym β-Glukosidase. Aus diesem Grund sollte die Rolle dieses Enzyms bei der Antigenpräsentation untersucht werden. Mit Conduritol-ß-Epoxid (CBE) wurde die lysosomale -Glukosidase von DC inhibiert. Mit Hilfe eines fluorogenen Substrats wurde gezeigt, dass diese Inhibition vollständig ist (a). Mit CBE inkubierte DC können das Substrat nicht umsetzen, deshalb kann im Durchflusszytometer keine Fluoreszenz gemessen werden. Dann wurden die DC in Proliferationsassays mit LAM-reaktiven T-Zellen eingesetzt (b). Der Inhibitor hatte sowohl in niedriger als auch in hoher Konzentration (high: 500 µM CBE, low: 100 µM CBE) keinen Einfluss auf die Präsentation von LAM. Die Wirkung von SAP-C auf die Antigenpräsentation scheint folglich nicht über -Glukosidase zu erfolgen. Deshalb wurde untersucht, ob SAP-C Lipidantige „aktiviert“, d.h. aus intralysosomalen Vesikeln exstirpiert und sie für CD1 Moleküle zugänglich macht (c). LAM-haltige Liposomen wurden bei 37 C und pH4 mit SAP-C, SAP-A oder BSA inkubiert. Der Kontrolle wurde kein Protein zugegeben. Mit Hilfe einer ELISA-Reaktion wurde die Konzentration an freigesetztem LAM in den Überständen der Proben gemessen. Die Konzentration an freiem LAM in den Kontrollen und den Proben mit BSA sind in etwa vergleichbar. SAP-A setzt geringe Mengen LAM frei, SAP-C hingegen steigert die Konzentration an freiem LAM immens. Dies indiziert, dass SAP-C in der Antigenpräsentation über eine Interaktion mit Lipidantigen wirkt. 70 6 Diskussion 6.1 Homeostase und Homingverhalten von Diskussion NKT-Zellen NKT-Zellen sind eine außergewöhnliche T-Lymphozyten Subpopulation, die auch klassische NK-Marker an ihrer Oberfläche tragen. Sie exprimieren den semivariablen TZR V24 im Menschen bzw. V14J281 in der Maus und werden durch CD1d Moleküle im Thymus selektiert10,98. Die CD1d-vermittelte Stimulation von NKTZellen induziert eine prompte Ausschüttung von hohen Konzentrationen an IFN- und IL411. Diese Fähigkeit, sowohl klassische Th1- als auch Th2-Zytokine zu sezernieren, gibt NKT-Zellen die Möglichkeit eine regulierende Funktion im Infektionsgeschehen, der Tumorenabwehr und Autoimmunerkankungen auszuüben43,59. In Tiermodellen für Typ 1 Diabetes, Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis und Lupus Erythematodes konnte der Krankheitsverlauf durch NKT-Zellen positiv beeinflusst werden. NKT-Zellen benötigen zu ihrer Entwicklung die Expression von CD1d Molekülen im Thymus10. Aber brauchen NKT-Zellen auch nach Verlassen des Thymus Kontakt mit dem CD1d Molekül? Diese Frage orientiert sich natürlich an Beobachtungen, die für das MHC-System gemacht wurden. Naive T-Lymphozyten können ohne den Kontakt zu MHC Molekülen oder IL7 nicht überleben166. Um diesen Aspekt zu untersuchen wurden NKT-Zellen von V14 Tieren mit CFSE gefärbt und in WT- und CD1dKO-Mäuse transferiert (Abbildung 16). Nach 10 und 20 Tagen post Transfer wurde den Empfängertieren Leber und Milz entnommen und die NKT-Zellen analysiert. Wenn NKT-Zellen auch in der Peripherie regelmäßigen Kontakt mit CD1d bräuchten, würde sich ein Unterschied zwischen den WT- und den CD1dKO-Mäusen zeigen. Die NKT-Zellen würden sich weniger häufig teilen oder würden den Transfer nur kurze Zeit überleben. Es wäre auch denkbar, dass die endogenen NKT-Zellen der Empfängertiere einen Einfluss auf den Transfer haben könnten. CD1dKO Tiere besitzen keine endogenen NKT-Zellen. Wenn die Anzahl an NKT-Zellen über periphere, CD1d unhabhängige Mechanismen reguliert wäre, könnte CD1d Defizienz einen Vorteil für die transferierten Zellen darstellen. 71 Diskussion Tatsächlich aber zeigte sich keinerlei Unterschied zwischen WT- und CD1dKOMäusen. Dies bedeutet, dass NKT-Zellen in der Peripherie nicht zwingend von der CD1dvermittelten Aktivierung abhängig sind. Die transferierten NKT-Zellen unterscheiden sich weder in ihrem Überleben noch in der Expression ihrer Oberflächenrezeptoren oder ihrer Proliferation. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch für Gedächtnis T-Zellen gemacht. Auch sie sind nicht abhängig von der Expression von MHC Molekülen166. NKT-Zellen weisen zudem ein bemerkenswertes Profil an Oberflächenmolekülen auf. Sie exprimieren CD11, CD44 und CD122, Rezeptoren, die gewöhnlich mit aktivierten T-Lymphozyten und Effektorzellen in Verbindung gebracht werden86. Warum aber könnte es wichtig für NKT-Zellen sein, auch unabhängig von CD1d existieren zu können? Lange Zeit waren kaum Antigene für CD1d bekannt. Der stärkste CD1d-vermittelte Aktivator von NKT-Zellen ist α-GalCer34. Es wird aus einem marinen Schwamm gewonnen, existiert nicht im menschlichen Körper und konnte bisher nicht in klinisch relevanten Pathogenen isoliert werden. Erst kürzlich wurden Lipidantigene aus M. tuberculosis, Sphingomonas capsulata, Ehrlichia muris und aus Borrelia burgdorferi isoliert102,51,87,88,185. Mit diesen Antigenen könnte unsere Körperabwehr tatsächlich konfrontiert werden. Auch ein endogener Ligand wurde in jüngster Zeit identifiziert, das Globosid iGb3102. Da bis heute nur wenige CD1d Liganden bekannt sind, konnte noch nicht eindeutig geklärt werden, wie häufig NKTZellen in vivo auf ein Lipidantigen treffen, das sie aktivieren kann. Vielleicht ist dies ein seltenes Ereignis? CD1d könnte meist mit endogenen Lipiden besetzt sein, welche keine Aktivierung auslösen. Vielleicht sind nur im Rahmen eines Infektionsgeschehens Antigene präsent, die NKT-Zellen aktivieren können. Läuft die Biologie der NKT-Zellen nach diesen Spielregeln ab, müssen NKT-Zellen relativ unabhängig von CD1d sein. Vielleicht ist die Anzahl an CD1d Lipidantigenen weitaus größer als bisher angenommen. CD1d-Liganden könnten in vivo häufig sein, sind aber bis jetzt einfach noch nicht entdeckt worden. In diesem Fall zeigen die Ergebnisse der adoptiven Transfer Versuche, dass eine fehlende Aktivierung durch CD1d kompensiert werden kann. Forschungsergebnisse jüngster Zeit haben im Infektionsmodel für Salmonella typhimurium gezeigt, dass der IL12 der Hauptstimulus für NKT-Zellen ist. Die 72 Diskussion Produktion von IL12 geht von DC aus, die mit den Bakterien in Kontakt geraten sind19,154. Diese Erkenntnisse werfen die Frage auf, welche Moleküle für die Homeostase der NKT-Zellen in der Peripherie entscheidend sind und welche Faktoren eine fehlende Stimulation durch CD1d ausgleichen können. Adoptive Transfer Versuche anderer Forschergruppen konnten beweisen, dass NKT-Zellen ähnlich wie NK Zellen und Gedächtnis T-Zellen auf IL15 angewiesen sind101,96. In IL15 defiziente Mäuse transferierte NKT-Zellen überlebten nicht. Ein wichtiger Faktor für NKT-Zellen ist folglich IL15. Welche Rolle spielen jedoch die peripheren Organe selbst? Eine hohe Präferenz der NKT-Zellen für die Leber wurde schon häufig beobachtet. Wie lässt sich dieses Phänomen erklären? Die Leber weist eine hohe Expression von CD1d auf. Hepatozyten, Gallengangsepithelien und Ito-Zellen sind mit dem Antigenpräsentationsmolekül besetzt. Man hat aus diesem Grund vermutet, dass NKT-Zellen der Leber optimal mit Lipidantigenen stimuliert werden und deshalb zahlreicher als in anderen Organen sind. Dies kann jedoch nicht der Hauptgrund für die Verteilung der NKT-Zellen sein, da injizierte NKT-Zellen in CD1dKO-Mäuse gleich verteilt sind wie in WT-Mäusen. Weitere Versuche sollten nun zeigen, welche Faktoren für die Verteilung der NKTZellen entscheidend sind. Dazu musste zunächst das Ziel der Versuche definiert werden. Aus diesem Grund wurde das Homingverhalten der NKT-Zellen als ein Prozess mit drei Phasen interpretiert. Die Experimente sollten sich auf die letzte Phase des Homingverhaltens konzentrieren um festzustellen, ob NKT-Zellen in der Leber besser proliferieren als in der Milz. Dazu wurde zuerst ein adoptiver Transfer von CFSE gefärbten NKT-Zellen durchgeführt, zehn Tage später wurden NKT-Zellen einer anderen Fluoreszenz in dieselben Empfängertiere injiziert. Nach vier Stunden wurden die NKT-Zellen aus Leber und Milz analysiert (Abbildung 17 und 18). Auf diese Weise kann man untersuchen, welchen Anteil die transferierten NKTZellen zu beiden Zeitpunkten an der Gesamtleukozyten-Zahl des Organs darstellen. Wenn NKT-Zellen in beiden Organen gleichstark proliferieren, müsste sich der Anteil der transferierten NKT-Zellen in Milz und Leber über den Beobachtungszeitraum gleichartig verändern. Dies war jedoch nicht der Fall, denn zehn Tage nach Transfer fanden sich mehr NKT-Zellen in der Leber als der Milz. Im Gegensatz dazu war der Anteil der frisch transferierten NKT-Zellen in beiden Organen vergleichbar. Die 73 Diskussion CFSE-Färbung veranschaulichte dies deutlich. Die Proliferation von Zellen zeigte sich in der CFSE-Färbung als „abgegrenzte Populationen“ oder Generationen. Während sich in der Leber 3-4 unterschiedliche Generationen finden, haben sich die NKT-Zellen der Milz nur einmal geteilt und man findet 2 Populationen (Abbildung 18). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Präferenz der NKT-Zellen für die Leber nicht allein auf der Perfusion des Organs oder Adhäsionsmolekülen beruht, sondern auch auf einer gesteigerten Expansion der Lymphozyten in diesem Organ. Ein bestimmender Faktor für das Migrationsverhalten von Lymphozyten ist die Interaktion mit verschiedenen Chemokinen und Adhäsions-Rezeptoren85,76. Nichtaktivierte T-Lymphozyten beispielsweise exprimieren die Rezeptoren L-Selektin56, Vimentin und den Zytokin Rezeptor CCR7. Mit Hilfe dieser Rezeptoren werden diese T-Zellen in das lymphoide Gewebe rekrutiert. Im Gegensatz dazu weisen Effektorzellen andere Oberflächenmoleküle auf. Sie erleichtern dieser Lymphozyten Subpopulation aus den Lymphknoten auszutreten und in entzündetes Gewebe einzutreten. Für NKT-Zellen wurde ein ähnlicher Besatz an Oberflächenmolekülen festgestellt, wie für Effektorzellen. Ihre Expression von L-Selektion und Vimentin ist deutlich reduziert. Dafür tragen NKT-Zellen Zytokin Rezeptoren wie CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR3 und CCL5 an ihrer Oberfläche, welche die Extravasion von Lymphozyten ermöglichen und sie für das Einwandern in Entzündungsherde rekrutieren168,53,65. Man glaubte, diese Eigenschaft sei der Hauptgrund, weshalb NKTZellen in der Leber akkumulieren. NKT-Zellen befinden sich nicht wie „gewöhnliche“ T-Lymphozyten in den Lymphknoten, sondern liegen in der Leber auf der Lauer bis ihre Hilfe gebraucht wird. Darüber hinaus interagieren NKT-Zellen mit dem Oberflächenmolekül LFA-1. Es stellt ein Homingrezeptor für die Leber dar. Mäuse, die defizient für LFA-1 sind, verfügen über eine deutlich reduzierte Anzahl an hepatischen NKT-Zellen46. Die Versuche dieser Arbeit konnten diese Erkenntnisse vervollständigen. Nach der Ankunft und Ansiedlung der NKT-Zellen in der Leber bietet das Organ diesen Zellen optimale Lebensbedingungen. Dadurch ist ihnen auch die Möglichkeit zur Expansion gegeben. Weitere Experimente müssen nun die Faktoren identifizieren, die für Überleben und Expansion hepatischer NKT-Zellen entscheidend sind. IL15 ist ein essentielles Zytokin für NKT-Zellen101. IL15 interagiert mit einer Untereinheit des IL2-Rezeptors. Im Gegensatz zu IL2, wird IL15 von aktivierten Makrophagen und Monozyten 74 Diskussion sezerniert26,178. Von unserer Forschungsgruppe konnte nachgewiesen werden, dass Ito-Zellen nicht nur CD1d exprimieren, sondern auch IL15 sezernieren181. Ito-Zellen weden auch als hepatische Sternzellen bezeichnet und sind spezifisch für die Leber. Außerdem speichern sie Fett und Vitamin A. Die Aktivierung von Ito-Zellen führt zu einer erhöhten Kollagenproduktion und dem fibrotischen Umbau der Leber. Weitere Studien müssen zeigen, welche Rolle die Ito-Zellen für das Homingverhalten der NKT-Zellen spielen. Dass ein und dieselbe Zelle Antigenpräsentation und Versorgung mit IL15 gewährleisten kann, könnte entscheidend sein. Darüber hinaus sollte auch die Funktion der Ito-Zelle in der Abwehr der Leber untersucht werden. Die Leber bietet Immunologen einige faszinierende Eigenschaften. Die Rolle der Leber in der Entwicklung peripherer Toleranz wird diskutiert. Allogene Lebertransplantate werden auch über die MHC Barrieren hinweg akzeptiert. Bei einer Nierentransplantation ist solch ein Vorgehen nicht möglich. In der Leber kommt es aber auch zur effektiven Immunreaktion gegenüber Pathogenen und Tumoren. Diese werden über lösliche Faktoren, zytotoxische T-Lymphozyten und NK Zellen ausgeführt. NKT-Zellen stellen mit ca. 40-50% einen hohen Anteil der Leberlymphozyten in der Maus. In der menschlichen Leber machen NKT-Zellen einen geringeren Anteil aus. Hepatitis B und C (HBV und HCV) sind weltweit der häufigste Grund für chronische Lebererkrankungen. Es steht fest, dass die zelluläre Immunantwort die Klärung des Virus und den Verlauf der Erkrankung beeinflusst. Welche Mechanismen dabei jedoch entscheidend sind, ist noch nicht geklärt117,147,148,122. Bei Patienten mit chronischer Hepatitis C konnte ein erhöhter Anteil an intrahepatischen, HCV-spezifischen CD8 T-Zellen festgestellt werden, die nur mangelhaft IFN- sezernieren160,50. Des weiteren wurde in einem Mausmodell für HBV demonstriert, dass eine protektive Antikörperantwort nur durch eine Ausschüttung von IFN- durch Th1 Zellen erhalten bleibt148. Diese Beobachtungen liefern Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen der hepatischen NKT-Zellen. Wie wichtig ist Produktion von IFN- durch NKT-Zellen in diesen Erkrankungen? Und weisen NKT-Zellen im Rahmen der Infektion ein Th1 oder Th2 Profil auf48? Welchen Einfluss hat die Wechselwirkung zwischen Ito-Zellen, IL15 und NKT-Zellen auf den Verlauf einer Hepatitis? Aufgrund der außergewöhnlichen Eigenschaften von NKT-Zellen, besteht ein großes Interesse ihre Rolle in der Immunabwehr der Leber zu definieren. Hauptanliegen dabei ist ihre immunmodulierende Wirkung für therapeutische Zwecke zu nutzen. 75 Diskussion Auch wenn die bisher gewonnenen Erkenntnisse viel versprechend sind, so müssen dennoch einige grundlegende Fragen in der Biologie der NKT-Zellen geklärt werden. Die Zukunft wird zeigen, ob NKT-Zellen dann den entscheidenden Schritt von „bench“ zu „bedside“ meistern. 6.2 SAP sind essentielle Helfermoleküle für CD1b Erst seit Ende der 80er Jahre ist bekannt, dass Lipide als Antigene in unserem Immunsystem wirken können126. Das bedeutet, dass unser Verständnis der Antigenpräsentation auf Erfahrungen und Erkenntnissen mit Proteinantigenen beruht. Die Antigenpräsentation von Proteinen beinhaltet immer die „Prozessierung“ des Antigens. Exogene Proteine werden von Zellen aufgenommen, durch Enzyme degradiert und anschließend im späten Endosom an MHC-II Moleküle gebunden125. Endogene Proteinantigene werden im Zytosol durch das Proteasom in das ER transportiert und auf das MHC-I Molekül geladen13. Prozessierung bedeutet in beiden Fällen, dass Proteine in charakteristische Bruchstücke zerlegt werden. Mit Hilfe dieser „antigenen Determinanten“ oder Epitope kann eine T-Zelle das Protein identifizieren. MHC-System und die CD1-Familie sind bei der Entwicklung unseres Immunsystems aus einem Vorläufermolekül hervorgegangen36. Sie weisen deshalb eine hohe Ähnlichkeit auf. Es lag daher auf der Hand, dass sich die Mechanismen und Abläufe der Antigenpräsentation der CD1- und der MHC-Familie ähneln. Analog zu der Welt der Proteinpräsentation wurde ein HLA-DM und Ii für Lipide postuliert. Außerdem wurde die Rolle verschiedener Enzyme in der Prozessierung der Lipidantigene diskutiert129,151. Doch wie sehr sich auch MHC- und CD1- Moleküle ähneln mögen, Proteine und Lipide sind unterschiedliche, chemische Stoffgruppen. Stellen Lipide deshalb nicht ganz und gar andere Anforderungen an die Antigenpräsentation? In der Hoffnung, dass die Auseinandersetzung mit dieser Frage neue Impulse bringen würde, begann man der chemischen Natur der Lipide mehr Beachtung zu schenken. Proteine verfügen über eine dreidimensionale Gestalt und sind aus einer individuellen Folge von Aminosäuren zusammengesetzt. Lipide werden nach ihrer Stereospezifität, ihren Substituenten und der Länge ihre Kohlenstoffketten charakterisiert. Ihr Grundgerüst ist viel weniger individuell und damit viel weniger „charakteristisch“ als das der Proteine. Die Prozessierung eines Proteinantigens arbeitet darauf hin, Bruchstücke 76 Diskussion zu gewinnen, die das spezifische Merkmal eines Antigens tragen. Solch ein Prozessierungsvorgang scheint für Lipide nicht geeignet. Ein Epitop aus 3-5 Kohlenstoffatomen könnte keine spezifische Immunantwort hervorrufen. Aus diesem Grund haben, wie Röntgenstrukturanalysen deutlich zeigen, CD1 Moleküle größere Antigenbindungstaschen entwickelt als die verwandten MHC-Komplexe89,55. Man vermutet, dass die Länge der Lipidketten und ihre Positionierung in der Grube des CD1 Moleküls eine entscheidende Rolle in der Aktivierung der T-Zellen spielt. Außerdem interagieren T-Zellen mit den polaren Anteilen des Antigens18. Das bedeutet, dass bestimmte Substituenten des Lipids, meist Zuckergruppen, keinesfalls entfernt werden dürfen. CD1 Antigene benötigen scheinbar weniger eine rigorose Prozessierung sondern vielmehr eine vorsichtige Modifikation. Lipidantigene sind unpolar, dies offenbart ein weiteres Problem für die Antigenpräsentation. Wie werden die Lipide im Zytoplasma oder im Lysosom in Lösung gehalten bis der Kontakt mit dem CD1 Molekül hergestellt ist? Der Grundansatz der vorliegenden Arbeit war, sich den Metabolismus von endogenen Sphingolipiden als Vorbild für den Umgang mit Lipidantigenen zu nehmen. Dort spielen SAP-Proteine eine entscheidende Rolle im Auf- und Abbau der Lipide (Abbildung 21). Die Ergebnisse dieser Dissertation182 konnten zeigen, dass eine CD1b-abhängige Präsentation von mykobakteriellen Lipiden nur mit der Hilfe von SAP-C möglich ist. PSAP-/--Fibroblasten wurden mit dem humanen CD1b-Gen transfiziert und mit GMM-, LAM- und Mykolsäure-reaktiven T-Zellen in Proliferationsassays verwendet. PSAP-/-CD1b-Fibroblasten konnten für keines der Lipidantigene eine T-Zell-Antwort hervorrufen. Nachdem die defizienten APC mit SAP-C rekonstituiert waren, konnte eine GMM, LAM und Mykolsäure-spezifische T-Zellantwort induziert werden. Die Forschungsgruppen um Albert Bendelac und Peter Cresswell haben die Bedeutung von SAP-Proteinen bei der CD1d-vermittelten Antigenpräsentation untersucht77,192. Dabei verwendeten sie ein Mausmodell mit defektem ProsaposinGen. Die Lebensdauer der Tiere ist nur kurz, denn sie zeigen schon bald neurologische Schäden. Bei der Charakterisierung der Immunzellen dieser Mäuse ließ sich nachweisen, dass diese Tiere über eine normale Anzahl von T-, NK- und BZellen verfügen, ihnen aber NKT-Zellen fehlen. Um die Ursache für diese Beobachtung zu ergründen, wurden Mäusefibroblasten mit humanem CD1d transfiziert. Diese APC wurden mit -GalCer inkubiert und mit humanen NKT-ZellLinien in einem Proliferationsassay verwendet. Die Transfektanten konnten keine 77 Diskussion T-Zellantwort hervorrufen, nachdem die Fibroblasten jedoch mit einem ProsaposinGenkonstrukt transfiziert wurden, konnten sie T-Zell Proliferation induzieren. Damit wurde bewiesen, dass Saposine auch für die CD1d vermittelte Antigenpräsentation essentiell sind. Die Ergebnisse dieser Dissertation und der oben genannten Veröffentlichungen konnten somit Saposine als Hilfsmoleküle im CD1-Antigenpräsentationsweg identifizieren182,192,77. Damit wurde ein weiterer, wichtiger Meilenstein im Verständnis der Immunologie der Lipide erreicht. 6.3 Funktionen der Saposine in der Antigenpräsentation Weiterführende Experimente sollten die Funktion und den Wirkmechanismus von Saposinen in der Antigenpräsentation klären. Die Vermutung lag nahe, dass komplexe Lipide vor der Bindung an CD1 Moleküle modifiziert werden. Im Lysosom stehen zahlreiche Enzyme zur Verfügung, die dies ausführen könnten. Es ist bekannt, dass Saposine eine entscheidende Rolle in der Aktivierung vieler dieser Enzyme spielen. Das Unvermögen der PSAP-/--Zellen Lipidantigene zu präsentieren, könnte deshalb auf eine mangelnde Aktivität von Schlüsselenzymen in der Antigenprozessierung beruhen. Um dieser Hypothese nachzugehen, musste zunächst geklärt werden, ob die lysosomalen Enzyme der PSAP-/--Transfektanten in vitro funktionsfähig sind. Im Gegensatz zu anderen Speicherkrankheiten sind bei der Prosaposin Defizienz entscheidende lysosomale Glukosidasen in vitro funktionsfähig. Dieses Unterscheidungskriterium beruht auf der Tatsache, dass die Erkrankung nicht auf einer Mutation der Enyzme beruht. Nur in der in vivo Situation offenbaren sich die Auswirkungen des Saposin Mangels66. Um die Enzymaktivität der Transfektanten zu untersuchen wurden deshalb verschiedene Versuche durchgeführt. Zunächst wurde die Funktion von Cathepsin B und L in den PSAP-/--CD1b Transfektanten überprüft (Abbildung 22 links). Cathepsin B und Cathepsin L sind Schlüsselenzyme für das Lysosom und nicht abhängig von Saposinen. Es sollte ausgeschlossen werden, dass die Funktion sämtlicher lysosomaler Enzyme durch Prosaposin Defizienz eingeschränkt ist. Die Fibroblasten wurden mit dem Substrat CBZ-(PheArg)2- 78 Diskussion rhodamin-110, das durch lysosomale Proteasen in ein fluoreszierendes Produkt gespalten wird, inkubiert. Normal- und PSAP-/--Zellen zeigten beide eine regelmäßige Verteilung des Farbstoffes und damit Normalaktivität von Cathepsin B und L. Auch die Funktion von Saposin abhängigen Glukosidasen ist in vitro bei PSAP-/--Zellen normal. Die Aktivität der lysosomalen β-Hexaminosaminidase und β-Galaktosidase wurde gemessen und war bei PSAP-/-- und Normal-Zellen vergleichbar (Abbildung 22, obere Reihe rechts). Auch die reine Anatomie des Lysosoms von PSAP-/--Zellen ist intakt. Mittels Fluoreszenz Mikroskopie konnte das lysosomale Kompartiment in einer Färbung mit LAMP-1-Antikörpern dargestellt werden (Abbildung 22, untere Reihe rechts). Um die Rolle der ß-Glukosidase in der Präsentation von LAM zu untersuchen, wurde dieses Enzym in APC inhibiert und die Proliferation von LAM-reaktiven T-Zell-Klonen mittels Proliferationsassays untersucht. Die Inhibition dieses SAP-C-abhängigen Enzyms beeinflusste die Aktivierung der T-Zellen nicht (Abbildung 26 b). Dieses Ergebnis beweist streng genommen nur, dass β-Glukosidase nicht an der Antigenpräsentation von LAM beteiligt ist. Eine Interaktion mit SAP-C wird auch für andere Enzyme vermutet, wie zum Beispiel der -Galaktosidase. Theoretisch könnte LAM durch eines dieser Enzyme modifiziert werden, oder durch ein Enzym dessen Assoziation mit SAP-C noch nicht beschrieben oder untersucht wurde. Es ist bemerkenswert, dass sich die in den Versuchen verwendeten Antigene extrem in ihrer Struktur unterscheiden. CD1b kann so verschiedenartige Lipide aufnehmen, da sich seine Antigenbindungsgrube an diese Moleküle anpassen kann55. Dies bedeutet aber auch, dass Prozessierung und Modifikation der Antigene über eine hohe Flexibilität verfügen muss. Prinzipiell scheint diese Vorraussetzung durch die Saposine erfüllt. Im Sphingolipidmetabolismus zeigt sich, dass jedes Saposin den Kontakt zu verschiedenen Enzymen herstellen kann und auch mit verschiedenen Substraten interagieren kann. Betrachtet man die Struktur der mykobakteriellen Lipide LAM, Mykolsäure und GMM genauer, erscheint es wenig wahrscheinlich, dass alle Antigene durch dieselben Enzyme modifiziert werden. Dadurch wird es natürlich auch schwierig, das entscheidende Schlüsselenzym der CD1 Antigenpräsentation durch Enzyminhibition zu identifizieren. Im Sphingolipidmetabolismus wirken die Saposine über die Aktivierung von Enzymen121,90 aber auch über Interaktion mit Substraten172. Die Substrataktivierung, d.h. die Interaktion mit Sphingolipiden, läuft über folgende Mechanismen ab: 79 Diskussion Sphingolipide finden sich in konzentrierter Form in intralysosomalen Vesikeln, die ebenfalls reich an negativ-geladenen Phospholipiden sind. Saposine zeigen eine hohe Bindungsaffinität für diese Phospholipide und werden von ihnen „angezogen“189. SAP-C taucht nun in die Vesikelmembran ein und destabilisiert dabei den Vesikel, der unter einer lokalen Erhöhung der Oberflächenspannung in sich zusammenbricht173. Sphingolipide werden durch diese Vorgänge „hervorgehoben“ und können mit Enzymen in Kontakt treten. Eine zweite Domäne des SAP-C Moleküls kann den Kontakt zwischen -Glukosidase und den extrahierten Sphingolipiden herstellen und erhöht somit die Umsatzgeschwindigkeit des Enzyms. Nun sollte untersucht werden, ob Saposine auch mit mykobakteriellen Lipiden interagieren und ob es dabei zu einer Protein-Protein-Wechselwirkung mit CD1b kommt. Zuerst wurde mittels der Konfokalen Mikroskopie demonstriert, dass ein mykobakterielles Lipid auch in den Prosaposin defizienten Zellen in das Lysosom aufgenommen wird (Abbildung 23 a). Als Antigen wurde das Lipid LAM ALEXA-488 verwendet, als Marker für das Lysosom wurde Dextran-Texas-Red benutzt. Ein gelbes Fluoreszenzmuster zeigte die Kolokalisation der beiden Moleküle und beweist, dass LAM im Lysosom der Transfektanten aufgenommen wird. Nun sollte dargestellt werden, dass SAP-C und LAM in diesem Kompartiment zusammentreffen. Dazu wurden dieselben Bedingungen wie bei der Rekonstitution der Transfektanten verwendet. Bei diesem Experiment wurde jedoch rekombinantes SAP-C eingesetzt, welches zuvor mit dem Farbstoff Texas-Red (rote Fluoreszenz) markiert worden war. SAP-C-Texas-Red und LAM-ALEXA-488 (grün) wurden zu den Transfektanten gegeben und die Zellen nach einer Inkubationszeit mikroskopiert. Die Kolokalisation von SAP-C und LAM resultiert in einem gelben Verteilungsmuster, wie sie Abbildung 23 b deutlich zeigt. Nachdem festgestellt wurde, dass Lipidantigene auch in PSAP-/--Zellen in das Lysosom aufgenommen werden und dort mit SAP-C kolokalisieren, war interessant, ob es dabei auch zu einem Zusammentreffen mit CD1b kommt. Diese Frage sollte ebenfalls mit Hilfe der Konfokalen Mikroskopie beantwortet werden. Dazu wurden PSAP-/--Transfektanten mit einem rot-fluoreszierenden SAP-C- und einem CD1bgerichteten Antikörper (α-CD1b, grün) gefärbt. Abbildung 23 c zeigt vereinzelte gelbe Areale, welche die Kolokalisation von SAP-C und CD1b widerspiegeln (Overlay). Diese Ergebnisse führten zu der Frage, ob SAP-C im Zusammenhang mit dem Transfer von Lipidantigenen mit CD1b interagieren könnte. Um diese Interaktion 80 Diskussion nachzuweisen wurden Crosslinker-Studien durchgeführt (Abbildung 24). Saposin Moleküle wurden mit einem Crosslinker versehen und mit DC inkubiert. Die Zellen wurden lysiert und dann gegen SAP und CD1b kopräzipiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass SAP-C CD1b in DC binden kann. SAP-A und SAP-B hingegen zeigten keine Bindung an CD1b. SAP-D konnte CD1b in geringerem Maße binden, die Rekonstitution von PSAP-/--Transfektanten mit SAP-D hatte jedoch im Proliferationsassay keine Hinweise auf eine Interaktion erbracht. Um die Wirkung von SAP-C auf mykobakterielle Lipide zu untersuchen, wurden Experimente mit LAM-haltigen Liposomen durchgeführt (Abbildung 26). Die Liposomen wurden mit SAP-C inkubiert und die Menge an freigesetztem LAM gemessen. Es zeigte sich, dass SAP-C in der Lage ist, LAM aus Liposomen zu extrahieren. Das bedeutet, dass SAP-C auch direkt mit dem Antigen in Kontakt tritt. Ähnliche Beobachtungen wurden im Zusammenhang mit der CD1d-vermittelten Antigenpräsentation gemacht77,192. Man untersuchte, ob Saposine in der Lage sind, Lipide auf ein CD1d-Molekül zu laden. CD1d wurde mit einem Lipid komplexiert und dann mit Cerebrosulfatid-haltigen Liposomen inkubiert. Anschließend wurden Saposine zugegeben. Nun wurde mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung die Menge an transferiertem Lipid bestimmt. SAP-A und SAP-C förderten in diesem Versuch die Beladung mit Phosphatidylserin und Cerebrosulfatiden. Gibt man nur Saposine zu den mit Lipiden-komplexierten CD1d Molekülen, bleiben die Lipide an dem Antigenpräsentationsmolekül gebunden. Das bedeutet, dass Saposine nicht „kontinuierlich“ Lipide aus dem CD1d-Molekül entfernen, sondern die „Interaktion“ mit anderen Lipiden benötigen. Dieselben Untersuchungen wurden auch mit GM2AP durchgeführt. Dieses Molekül konnte ebenfalls unter in vitro Bedingungen Lipide von CD1d entladen. Basierend auf diese Ergebnisse lässt sich folgende Modellvorstellung von der Beladung des CD1 Moleküls entwickeln (siehe Abbildung 27). Mykobakterielle Lipidantigene reichern sich wie endogene Lipide in den intralysosomalen Vesikeln der APC an. Saposine interagieren mit diesen Strukturen, ihr Gefüge wird instabil und Sphingolipide und Antigene werden an die Oberfläche gebracht. Diese exstirpierten Lipide können nun mit Enzymen in Kontakt treten oder auch mit dem CD1 Molekül. Im Fall eines affinen Lipidantigens vermittelt Saposin den Kontakt und die Bindung zwischen Ligand und CD1. Nach der Bindung an das CD1 Molekül, wird das Antigen durch die APC präsentiert und kann T-Zellen aktivieren. 81 Diskussion Es bleibt zu prüfen, ob Saposine neben CD1b und CD1d auch für weitere Vertreter der CD1-Familie wichtig sind. Da die SAP-Moleküle nur im sauren pH-Bereich ihr Wirkoptimum entfalten, liegt nahe, dass sie nur an der Präsentation von Antigenen über CD1b, CD1c und CD1d beteiligt sind. Abbildung 27: Saposine in der CD1-Antigenpräsentation Intralysosomale Vesikel enthalten neben endogenen Sphingolipiden auch Lipidantigene (dargestellt in Rot), die den CD1 Molekülen nicht zugänglich sind (A). SAP-Moleküle interagieren mit den Vesikeln und destabilisieren sie (B). Im Laufe dieses Prozesses werden die Lipidantigene frei (C). Die SAP-Moleküle können nun den Kontakt mit Enzymen, aber auch mit den CD1-Proteinen herstellen. Das Lipidantigen 82 kann auf diese Weise auf das Antigenpräsentationsmolekül geladen werden (D) . CD1a dagegen präsentiert nur Antigene aus dem frühen Endosom, dessen pH-Wert nicht im sauren Bereich liegt. Lange Zeit wurde ausgeschlossen, dass CD1e an der Antigenpräsentation beteiligt ist, da das Protein nicht an die Zelloberfläche gebracht 82 Diskussion wird6. Kürzlich wurde jedoch erwiesen, dass CD1e als Kofaktor an der CD1bAntigenpräsentation beteiligt ist38. Es konnte gezeigt werden, dass das mykobakterielle Antigen PIM nur von Zellen, die CD1e und CD1b exprimieren, präsentiert werden kann. Eine Überexpression von Prosaposin konnte dabei das Fehlen von CD1e nicht kompensieren. Dafür blieb eine T-Zellantwort aus, wenn das Enzym α-Mannosidase inhibiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen neue Aspekte der Funktion von CD1 Proteinen. Leider konnte bisher noch kein Funktionsmechanismus für CD1e geklärt werden. Ist es nur an der Antigenpräsentation von PIM beteiligt? Interagiert es nur mit dem Enzym αMannosidase? CD1e könnte ein alternatives Hilfsmolekül zu den Saposinen im CD1b-Präsentationsweg darstellen. Um diesen Gedanken weiterzuverfolgen, müsste jedoch zuerst die Wechselwirkung zwischen Saposinen und CD1e einerseits und CD1b und Lipidantigenen andererseits weiter untersucht werden. Es wäre interessant festzustellen, ob auch andere CD1b-Antigene von CD1e abhängig sind, z.B. LAM, GMM und Mykolsäure. Außerdem ist es möglich, dass eine Überexpression von Prosaposin nicht ausreicht, um eine Interaktion von Saposinen und CD1e auszuschließen. Versuche mit Liposomen haben gezeigt, dass wenige SAP-Moleküle ausreichen, um Lipide aus Vesikeln zu extrahieren. Das kann bedeuten, dass die durch endogene SAP-Moleküle vermittelte Wirkung auf die TZellantwort nicht durch zusätzliche Moleküle gesteigert werden kann. 6.4 Die Spezifität der Saposine Es ist bemerkenswert, dass nur SAP-C die T-Zellantwort der PSAP-/--Transfektanten wiederherstellen konnte. SAP-A, SAP-B, SAP-C und SAP-D sind zueinander in hohem Maße homolog. Man nimmt an, dass sie in der Evolution durch die Duplikation eines Genes entstanden sind. Die Grundstruktur der Saposine ist das „Sushi“-Motiv (Abbildung 28). SAP-B, SAP-C und SAP-D sind aus einer Folge von sechs Cysteinen aufgebaut. Zwischen den Cysteinen 1 und 6, 2 und 5 sowie 3 und 4 bilden sich Disulfid-Bindungen aus. Auf diese Weise bildet sich eine charakteristische, globuläre Schleifenstruktur aus, die man auch als „saposin-fold“ bezeichnet. Diese dreidimensionale Form erlaubt den Proteinen als Detergenzien zu wirken. Wie Seifen können diese Proteine mit hydrophoben und hydrophilen Substanzen in Wechselwirkung treten und mizelläre 83 Diskussion Strukturen auflösen. Es existiert eine Reihe von Proteinen mit „saposin-fold“. Man nennt sie SAPlip, eine Abkürzung von Saposin-like-proteins. Beispiele sind das Surfaktant protein B, NK-lysin und Granulysin91. SAP-C SDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCKLPKSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSG 1 2 3 Sushi 1 2 4 3 4 5 5 6 6 Abbildung 28: Die Sushi-Struktur der Saposin Moleküle Saposine verfügen über eine charakteristische Abfolge von sechs Cysteinen, die untereinander mit Disulfidbrücken verbunden sind. Man bezeichnet dies auch als Sushi-Struktur, da die Verknüpfung der Cysteine einer Sushi-Rolle ähnelt. Trotz der ausgeprägten Homologie zeigte nur SAP-C eine Wirkung auf die Antigenpräsentation. Wie ist dies zu erklären? Zum einen mag dies an der membrandestabilisierenden Wirkung von SAP-C liegen173. Diese Eigenschaft ist bei SAP-C besonders ausgeprägt und könnte den entscheidenden Faktor bei der Interaktion mit CD1b darstellen. Enzyminhibition hatte bei den durchgeführten Experimenten keine Auswirkungen auf die Antigenpräsentation gezeigt. Dennoch kann eine Beteilung von Enzymen bei der CD1b vermittelten Antigenpräsentation nicht vollständig ausgeschlossen werden. Auch dies könnte eine Erklärung für die Wirkung von SAP-C bieten. Denn, trotz Homologie, aktiviert jedes Saposin nur bestimmte Enzyme90. Und jedes Saposin interagiert nur mit bestimmten SphingolipidSubstraten. Dieser Aspekt ist auch für die Antigenpräsentation von Interesse. Sind die Saposine auch spezifisch für Antigene? Es wäre möglich, dass beispielsweise SAP-D andere Antigene bevorzugt. Eine andere Frage wäre, ob Saposine eine Vorauswahl für CD1 Moleküle trifft. GalCer ist ein potentes CD1d-Antigen, das βIsomer hingegen aktiviert NKT-Zellen kaum124. Noch ist nicht bekannt, ob Saposine zwischen α- und β-Form unterscheiden können. Bis heute sind nur wenige 84 Diskussion „endogene Liganden“ für CD1d bekannt102. Die Saposine könnten bei der Suche nach neuen Liganden Hilfestellung leisten. Basierend auf den Abläufen in der MHCAntigenpräsentation hat man eine Art Ii Lipid für die CD1 Proteine postuliert. Ein endogenes Lipid könnte zunächst die Antigenbindungsgrube ausfüllen und damit sowohl die dreidimensionale Gestalt des Moleküls festigen als auch verhindern, dass endogene Lipide präsentiert werden. Saposine wären dann in der Lage, Lipidantigene mit guter Affinität zum CD1 Molekül gegen das „Schutzlipid“ auszutauschen. Es erscheint wahrscheinlich, dass CD1 noch im Endosom mit einem „Schutzlipid“ beladen wird. In diesem Kompartiment dominieren Phospholipide39. Ein Lipid dieser Subklasse ist außerdem günstig für die „Entfernung“ durch Saposine, die eine hohe Affinität zu Phospholipiden aufweisen. Ein weiterer Schritt, der die Präsentation von endogenen Lipiden verhindern könnte, ist die „Spezifität“ der Saposine für Lipidsubstrate und Enzyme. Möglicherweise ist es dadurch viel wahrscheinlicher, dass ein Sphingolipid wie z.B. Galaktosylceramid auf eine Glukosidase trifft, als auf ein CD1 Molekül. Das nächstes Ziel in der Erforschung der Saposine wird sein, die Spezifität dieser Proteine in der CD1-Immunantwort zu bestimmen. Können Saposine fremde von endogenen Lipiden unterscheiden? Dies stellt einen neuen Ansatz für das Verständnis von Autoimmunität dar. 6.5 Regulationsmechanismen der Saposine Nachdem Saposine als essentielle Kofaktoren im CD1 Präsentationsweg identifiziert und entscheidende Funktionsmechanismen dieser Proteine aufgedeckt wurden, ist nun von Interesse, wie diese Moleküle reguliert werden. Prosaposin ist ein großes Protein. Es wird im Lysosom in SAP-A bis SAP-D gespalten69. Prosaposin selbst ist ebenfalls ein aktives, funktionelles Protein. Der aktive Teil des Proteins entspricht dabei dem SAP-C Molekül. Prosaposin wird im Gegensatz zu den Saposin-Proteinen sezerniert und kann dann über Rezeptoren erneut aufgenommen und in das Lysosom geschleust werden176. Hilfsmoleküle im MHC-Antigenpräsentationsweg werden reguliert und regulieren damit selbst die Prozessierung der Antigene. TAP1 und TAP2 oder LMP2 und LMP7 beispielsweise liegen innerhalb des MHC-Genkomplexes und werden bei Ausschüttung von IFN- vermehrt synthetisiert188. 85 Diskussion Theoretisch können Saposine auf verschiedenen Ebenen reguliert werden. Die Expression des Prosaposin Gens kann kontrolliert werden. Die Sekretion bzw. die Aufnahme Prosaposins durch Rezeptoren kann ebenfalls die Menge an aktiven Proteinen im Lysosom beeinflussen. Und ein weiterer, entscheidender Schritt ist die Spaltung Prosaposins in die einzelnen Proteine. Es ist interessant, dass nicht nur eine Defizienz für CD1d105 oder Prosaposin zu einem Fehlen von NKT-Zellen führt, sondern auch eine Defizienz für Cathepsin L70. Bei Cathepsin L handelt es sich um lysosomale Cystein-Protease. Cathepsin L und S regulieren die Antigenpräsentation im MHC-II-System durch Spaltung von Ii. Mit der Entdeckung der Saposine für die Antigenpräsentation im CD1-System ergibt sich eine neue Erklärung für das Fehlen von NKT-Zellen bei Cathepsin L defizienten Mäusen. Ein Mangel an Cathepsin L könnte zu einem Mangel an Saposinen führen, da diese Protease Prosaposin in die einzelnen Saposine spaltet. Tatsächlich finden sich in den Zellen der Cathepsin L defizienten Mäuse Zeichen einer lysosomalen Speicherkrankheit. Da Prosaposin selbst funktionsfähig ist und auch andere Proteasen das Protein degradieren können, bildet sich wahrscheinlich nicht das Vollbild einer Lipidspeicherkrankheit aus. Interessant ist die Beobachtung, dass die Expression von Cathepsin L in mit Mycobacterium tuberculosis oder Mycobacterium avium infizierten Makrophagen vermindert ist116. Dies könnte sich negativ auf die Antigenpräsentation von mykobakteriellen Lipiden auswirken. Dieses Beispiel veranschaulicht, welche Konsequenzen sich für die Antigenpräsentation durch eine Regulation von Saposinen ergeben können (Abbildung 29). Das Immunsystem ist komplex reguliert und versteht auf verschiedene Stimuli zu reagieren. Ob diese Warnungen nun „stranger“ oder „danger“ rufen, in der Immunologie untersucht man, wie diese Signale umgesetzt werden und welche Reaktionen sie hervorrufen. Nun, da die Saposine in die Immunologie eingeführt wurden, interessiert, ob sie in bekannte Signalwege eingebunden sind. Wirkt sich eine Aktivierung über TLR auf Saposine aus? Oder die Ausschüttung von IFN-, IL4 oder TNF-α? Diese Fragen sind noch ungeklärt und sind auch noch nicht bearbeitet worden. 86 Diskussion CD1-Antigenpräsentation SAP-A Prosaposin-A-B-C-D Cathepsin L Lysosom SAP-B CD1d SAP-C CD1b SAP-D Prosaposin-A-B-C-D Cathepsin L Lysosom Infektion mit M. tuberculosis Abbildung 29: Regulation der Saposine durch Cathepsin L Das Vorläuferprotein Prosaposin wird durch lysosomale Proteasen in die einzelnen Moleküle SAP-A bis D gespalten. Diese Saposine beladen CD1-Proteine und ermöglichen damit die LipidAntigenpräsentation. Cathepsin L kann Prosaposin spalten. Dadurch ergibt sich ein Regulationsmechanismus. Es wurde beobachtet, dass eine Infektion mit M. tuberculosis zu einer verminderten Synthese von Cathepsin L führt. Dadurch könnte es zu einer Verringerung der Saposine im Lysosom kommen. Dies kann sich negativ auf die Antigenpräsentation auswirken, da die Lipidantigene nun nicht optimal präsentiert werden können. Wenn Saposine aber auch eine antiapoptotische Wirkung ausüben wird auf diese Weise gleichzeitig die Apoptose infizierter Zellen gefördert. Bekannt ist, dass es bei verschiedenen Tumoren zu einer Überexpression von Prosaposin kommt. Beispiele sind das squamöse Zell-Karzinom der Lunge, Melanome und das Prostata-Karzinom. Im Androgen-unabhängigen ProstataKarzinom scheint die Überexpression sogar mit einem fortgeschrittenen Glisson Score zu korrelieren. Welche Funktionen Prosaposin jedoch in der Karzinogenese spielt, ist bis jetzt nicht geklärt. Untersuchungen für das Prostata-Karzinom lassen vermuten, dass Prosaposin Zellen vor Apoptose schützen kann, indem es die Aktivität von Kaspasen moduliert und den PI3K/Akt Signalweg aktiviert. Zusammenfassend zeigen diese Überlegungen, dass sich mit der Entdeckung der Saposine für die Immunologie neue Perspektiven für die Erforschung des CD1Systems aufgetan haben. Es existiert nun ein Angriffspunkt, die Regulation der CD1-Antigenpräsentation aufzuklären, um zu verstehen, wie dieses System zu unserer Immunantwort beiträgt. 87 6.6 Diskussion Weitere Aufgaben der Saposine im Immunsystem Mit der Entdeckung der Saposine für die Lipidantigenpräsentation, stellt sich die Frage, ob diese Proteine noch weitere Funktionen im Immunsystem übernehmen könnten. Saposine können wie Detergenzien wirken und haben eine Membran- destabilisierende Wirkung. Aber können sie ähnlich wie Seifen auch bakterizid wirken? Granulysin und NK-lysin gehören derselben Proteinfamilie an und wirken beide bakterizid und zytolytisch31. Mit Hilfe ihrer aktiven Domänen könnten Saposine oder Prosaposin intrazelluläre Erreger angreifen oder an ihrer Degradierung beteiligt sein. Einige Studien in der Abwehr von Salmonella enteritidis in Hühnern weisen daraufhin, dass eine Expression von Prosaposin die bakterielle Last verringert92. Ob Prosaposin für das menschliche Immunsystem ähnliche Funktionen ausüben kann und z.B. Mykobakterien im Lysosom angreift145,182, muss noch untersucht werden. Die Interaktion der Saposine mit intralysosomalen Vesikeln ist ein interessanter Mechanismus. Apoptotische Vesikel sind ähnlich aufgebaut wie die endogenen Vesikel des Lysosoms. Apoptotische Vesikel dienen als Quelle von Antigenen und können damit eine Immunantwort initiieren. Im Rahmen der Apoptose verändert sich die Zellmembran. PS, das an der Innenseite der Membran sitzt, kehrt sich nach außen52. Die apoptotischen Vesikel werden über Rezeptoren, Scavenger Rezeptoren oder Rezeptoren für PS aufgenommen und gelangen dann in das lysosomale Kompartiment. Die Antigene der gestorbenen Zelle, Proteine oder auch Lipide, sind nun im Lysosom in den apoptotischen Vesikeln gefangen. Die Funktion der Saposine in der CD1b-Antigenpräsentation lieferte den Hinweis, wie diese Antigene befreit werden können. Saposine integrieren in die aufgenommenen Vesikel und destabilisieren sie29, dadurch können die Antigene extrahiert werden und sind der Antigenpräsentation zugänglich (Abbildung 30). Unsere Forschungsgruppe konnte diesen Mechanismus bestätigen183. Diese Ergebnisse zeigen, dass Saposine auch die Antigenpräsentation von Proteinen unterstützen. 88 CD1-Antigenpräsentation Diskussion Sphingolipidmetabolismus Antigenpräsentation Saposine Lipidantigene Saposine Saposine Lipidantigene Proteinantigene Sphingolipide Apoptotische Vesikel Intralysosomale Vesikel Abbildung 30: Saposine in Antigenpräsentation und Sphingolipidmetabolismus Saposine wirken im Lysosom. Ihre Angriffspunkte sind dabei die intralysosomalen Vesikel oder die ähnlich zusammengesetzten apoptotischen Vesikel. Saposine führen Sphingolipide ihrem Metabolismus zu. Außerdem machen sie Lipide und Proteine aus diesen Strukturen für die Antigenpräsentation zugänglich. Die vorliegende Arbeit hat Prosaposin und die Saposine als Hilfsmoleküle in der CD1-Antigenpräsentation identifiziert und ihren Funktionsmechanismus entschlüsselt182. Damit wurden intralysosomale Vesikel als Schnittstelle zwischen Sphingolipidmetabolismus und Antigenpräsentation von Lipiden und Proteinen entdeckt. Dies stellt einen Meilenstein für das Verständnis der CD1-Immunantwort dar. Nun kann sich dieses Forschungsgebiet weiterentwickeln. Das Ziel für die Zukunft wird sein, die Immunologie der Lipide besser begreifen zu können. 89 7 Literatur Literatur 1 Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS (2000) Cellular and Molecular Immunology. 4th Edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, London, New York, St. Louis, Sydney, Toronto 2 Ackerman AL, Cresswell P (2004) Cellular mechanisms governing crosspresentation of exogenous antigens. 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Saposin C orchestrates lipids and CD1b for antigen presentation to human T cells 34th Annual Meeting of the German Society of Immunology, Berlin, 2003 Workshop Antigen Processing and Presentation 107 Danksagung Danksagung Ich möchte mich herzlich für die große Hilfe und unablässige Unterstützung durch Herrn Professor Dr. Drs. h.c. Blum bedanken. Ohne ihn wäre die Anfertigung dieser Dissertation niemals möglich gewesen. Herrn Professor Dr. Ulrich Schaible möchte ich für die großartige Betreuung bei der Erstellung dieser Arbeit und darüber hinaus für seine immerwährende Diskussionsund Hilfsbereitschaft danken. Es ist ein großes Glück von seinem Fachwissen und Erfahrungsschatz lernen zu dürfen. Herr Dr. Florian Winau stand mir während der experimentellen Arbeit mit Elan und Esprit zur Seite. Dabei wurde er für mich zu einem außergewöhnlichen Mentor und ich möchte mich für diese Zeit herzlich bedanken. Für proteinchemische Arbeiten und Verständnis über Saposine möchte ich Herrn Dr. Robert Hurwitz und Herrn Professor Dr. Konrad Sandhoff danken. Ein großer Dank geht an Herrn Stephan Weber für seine tatkräftige Unterstützung im Labor. An Frau Kristine Hagens, Frau Jana Enders und Frau Jane Kowall geht mein Dank für eine wunderbare Zusammenarbeit und ihre Hilfe bei allen Schwierigkeiten im Laboralltag. Bei Herrn Dr. Markus Niemayer möchte ich mich für die Hilfe bei allen Arbeiten mit NKT-Zellen bedanken. Herrn Professor Dr. Kaufmann und seinen Mitarbeitern danke ich für die vorzüglichen Arbeitsmöglichkeiten am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie. 108 Lebenslauf Lebenslauf Name: Vera Schwierzeck Geburtsdatum: 05.04.1979 Geburtsort: Emmendingen Staatsangehörigkeit: Deutsch Schulbildung: 1985-1989 Meerwein-Grundschule Emmendingen 1989-1998 St. Ursula Gymnasium Freiburg Studiengang: 1998 Summer Session in Molekular Biologie und Mikrobiologie an der University of California, Los Angeles 1998-2002 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Physikum 06.09.2000 1. Staatsexamen 17.09.2001 2002-2005 Studium der Humanmedizin an der Charité, Humboldt-Universität Berlin 2. Staatsexamen 01.04.2004 Praktisches Jahr Charité Berlin Innere Medizin: Klinische Immunologie und Infektiologie Neurologie Chirurgie: Herz- und Unfallchirurgie 3. Staatsexamen 07.06.2005 Forschungstätigkeiten: 1998 Praktikum am Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg, Abteilung Professor Böhm 2002-2005 Experimentelle Dissertation am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin, Abteilung Immunologie 2005 Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der University of Oxford, Weatherall Institute of Molecular Medicine
