Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital - Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. E. H. Hamelmann Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Caroline Doris Schmitz aus Emsbüren 2008 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Koreferent: Prof. Dr. med. W. Görke Tag der mündlichen Prüfung: 12. Mai 2009 Abstract Schmitz Caroline Doris Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen Problem: Regulatorische T-Zellen stellen eine Subpopulation von T-Lymphozyten dar. Sie zeichnen sich durch die Oberflächenproteine CD4 und CD25 aus, exprimieren CD25 hoch und entwickeln sich teilweise FOXP3-abhängig. FOXP3 ist als Transkriptionsfaktor von zentraler Bedeutung in der Entwicklung FOXP3 positiver regulatorischer T-Zellen. Regulatorische T-Zellen werden anhand ihrer Oberflächenproteine CD45RA und CD45RO, welche sie vor bzw. nach Antigenkontakt exprimieren, in naive-like und memorylike regulatorische T-Zellen unterschieden. Sie spielen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase und sind mit ihrer Funktion Effektorzellen zu unterdrücken an verschiedenen Krankheitsbildern wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen oder Transplantatabstoßungen beteiligt. Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis ist bisher wenig erforscht. In der vorliegenden Pilotstudie wird im Sinne der Grundlagenforschung erstmalig vergleichend die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht. Methode: Mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen wurden in 5 ml heparinisiertem Vollblut von gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden die Zellzahlen regulatorischer T-Zellen bestimmt. Ergebnisse: Patienten mit atopischer Dermatitis wiesen höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen auf als gesunde Probanden. Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren konnten deutlich höhere Zellzahlen bei Patienten mit atopischer Dermatitis beobachtet werden. Die Anzahl naive-like regulatorischer T-Zellen verringerte sich in beiden Probandengruppen mit zunehmendem Alter statistisch signifikant. Umgekehrt stieg gleichzeitig die Anzahl der memory-like regulatorischen T-Zellen beider Probandengruppen. Diskussion: Als mögliche Ursache der höheren Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis wird eine geringere Funktion der Zellen und die daraus resultierende kompensatorische Erhöhung der Zellzahl diskutiert. Die deutlich höheren Zellzahlen in den ersten vier Lebensjahren werden als Reaktion auf eine hohe entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter gesehen. Als Grund des signifikanten Abfalls naive-like regulatorischer T-Zellen wird die stagnierende Ausschleusung naiver Zellen aus dem Thymus abhängig von der Thymusinvolution erörtert. Für die Aufrechterhaltung eines suffizienten Pools regulatorischer T-Zellen im Alter nach der Thymusinvolution wird die periphere Expansion und die daraus resultierende Zunahme der memory-like regulatorischen TZellen diskutiert. Die vorliegende Studie leistet einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der immunologischen Grundlagenforschung, indem sie basierend auf ihren Erkenntnissen zu absoluten Zellzahlen regulatorischer T-Zellen und deren Veränderungen neue Fragen für die weitere Erforschung der Funktion und der Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei Gesunden und im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis aufwirft. INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 3 Abbildungsverzeichnis.................................................................................... 5 1 Einleitung ............................................................................................. 7 1.1 T-Lymphozyten...................................................................................... 7 1.2 CD4+ T-Zellen........................................................................................ 9 1.3 Regulatorische T-Zellen ...................................................................... 10 1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3 ................................................................ 16 1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen.......................................................... 18 1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen ............................... 19 2 Fragestellung ..................................................................................... 21 3 Probanden, Material und Methoden................................................. 22 3.1 Probanden........................................................................................... 22 3.2 Materialien........................................................................................... 23 3.3 3.2.1 Labormaterialien und Geräte .................................................. 23 3.2.2 Reagenzien............................................................................. 24 3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper ........................................... 25 Methoden ............................................................................................ 25 3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes ........................................ 25 3.3.2 Isolation der PBMC ................................................................. 26 3.3.3 Anfärbung der PBMC.............................................................. 27 3.3.4 Durchflusszytometrie .............................................................. 31 3.3.5 Statistische Auswertung.......................................................... 39 1 4 Ergebnisse ......................................................................................... 40 4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit atopischer Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als Gesunde.............................................................................................. 41 4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer TZellen: Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like regulatorischen T-Zellen...................................................................... 43 4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer Dermatitis erkrankter Kinder................................................................ 45 4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten............. 45 4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen ................... 48 5 Diskussion ......................................................................................... 51 5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis: geringere Funktion kompensatorische Erhöhung der Zellzahl?! ........................................ 51 5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von memory-like regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und periphere Expansion............................................................................ 54 5.3 Ausblick ............................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis .......................................................................... 60 7 Anhang ............................................................................................... 67 2 Abkürzungsverzeichnis + positiv - negativ AD atopische Dermatitis Ag Antigen aTregs adaptive regulatorische T-Zellen (= iTregs) BD Becton Dickinson Cat.-No. Katalognummer CD cluster of differentiation (Oberflächenmerkmale) DNA Desoxyribonukleinsäure DMSO Dimethylsulfoxid Emmax Emissionsmaximum Exmax Exzitationsmaximum FACS fluorescence activated cell sorter FCS fötales Kälberserum FH forkhead-domain FITC Fluorescein Isothiocyanat FOXP forkhead box protein FSC forward scatter g Erdschwerebeschleunigung Ig Immunglobulin IFN Interferon IL Interleukin IPEX kompexes Krankheitsbild: Immundysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-chromosomal vererbt iTregs induzierte regulatorische T-Zellen (= aTregs) Jr Junior LZ Leucin Zipper M1 Marker1 M2 Marker2 MHC major histocompatibility complex mRNA messenger ribonucleic acid 3 nm Nanometer nTregs natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen p Signifikanzniveau PBMC peripher blood mononuclear cells PBS phosphatgepufferte Salzlösung PE Phycoerythrin PerCP Peridinin Chlorophyll R1 Region1 R2 Region2 R3 Region3 RAST Radio-Allergen-Sorbent-Test RPMI Roswell Park Memorial Institute (Zellkulturmedium) SSC side scatter SCORAD severity scoring of atopic dermatitis TCR t cell receptor Teff T-Effektorzelle TGF transforming growth factor TH T-Helferzelle TNF tumor necrosis factor Tr/ Tregs T regulatorische Zellen ZNfinger Zinkfinger 4 Abbildungsverzeichnis Seite Abbildung 1 Schematische Darstellung der Entwicklung, des 14 Phänotyps und der Effektorfunktionen von regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen Abbildung 2 Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins 17 Abbildung 3 Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient 26 Abbildung 4 Zellzählung mittels Neubauerkammer 27 Abbildung 5 FOXP3 Antigen-Antikörperbindung 29 Abbildung 6 Immunfluoreszenz 30 Abbildung 7 Schematische Darstellung des Durchflusszytometers 32 Abbildung 8 Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung 33 Abbildung 9 Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut 35 Abbildung 10 Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von 36 Lymphozyten Abbildung 11 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten 37 in Bezug auf Region1 (Abbildung 10) Abbildung 12 Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf 37 Region2 (Abbildung 11) Abbildung 13 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten 38 in Bezug auf Region1 (Abbildung 10) Abbildung 14 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf 38 Region2 (Abbildung 13) Abbildung 15 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf 39 Region3 (Abbildung 13) Abbildung 16 Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen 42 (CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+ naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like) regulatorischer T-Zellen Abbildung 17 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der 44 Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen Abbildung 18 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der 46 Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten 5 Abbildung 19 Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten, 47 mononukleären Zellen und Lymphozyten Abbildung 20 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der 49 Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen Abbildung 21 Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+, + + + 50 - CD4 CD45RA (naiven) und CD4 CD45RA (Memory) THelferzellen 6 1 1.1 Einleitung T-Lymphozyten T-Lymphozyten oder kurz T-Zellen sind eine für die Immunabwehr wichtige Gruppe von Leukozyten. Sie sind in der Lage, spezifische Antigene zu erkennen, gezielt zelluläre Abwehrmechanismen einzusetzen und Antikörperbildung zu induzieren. T-Lymphozyten erkennen Antigene ausschließlich in Form von Oligopeptiden, die ihnen auf MHC-Molekülen von speziellen antigenpräsentierenden Zellen (dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) präsentiert werden. Dieses Phänomen wird als MHC-Restriktion bezeichnet. Die Antigen-MHCKomplexe werden von T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) erkannt, welche auf den Oberflächen von T-Lymphozyten zu finden sind. Ein T-Zell-Antigenrezeptor ist an den Proteinkomplex CD3 gebunden. CD3 ist für die intrazelluläre Signaltransduktion nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors verantwortlich. Die Signaltransduktion führt zur differenzierten Gentranskription, die für die Proliferation, Differenzierung, Ausbildung der Effektorfunktionen und das Überleben von T-Zellen notwendig ist. Für eine effektive Antigenerkennung und Antigenreaktion sind verschiedenste Korezeptoren von enormer Bedeutung. Sie verbessern und stabilisieren den Kontakt zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle bzw. Zielzelle. Außerdem sind sie an der Regulierung der Signaltransduktion über kostimulierende oder hemmende Signale beteilgt. Zwei dieser Korezeptoren dienen gleichzeitig als Oberflächenmarker für THelferzellen: CD4 und CD45. CD4 interagiert mit MHC-Klasse-II-Molekülen und stabilisiert den Kontakt zwischen T-Zelle und Zielzelle. Außerdem ist CD4 durch Bindung einer Thyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt. CD45 besitzt eine katalytische Funktion als Thyrosinphosphatase und trägt daher eine zentrale Rolle in der Bereitstellung notwendiger Kinasen für die Signaltransduktion. Ohne funktionales CD45 können T-Lymphozyten nicht über ihren Antigenrezeptor stimuliert werden. 7 T-Zellen entwickeln sich aus lymphatischen Vorläuferzellen, die wie alle Blutzellenvorläufer im Knochenmark aus einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle entstehen. Einige dieser lymphatischen Vorläuferzellen wandern zum Thymus. Dort werden sie als Thymozyten bezeichnet. Der Thymus als primär lymphatisches Organ wird als Ort der zentralen T-ZellEntwicklung bezeichnet (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002). Der Thymus wächst rapide während der Embryonalphase und in der Kindheit und erreicht seine absolut maximale Größe in der Pubertät. Danach stagniert sein Wachstum und er involiert fortschreitend bis in das hohe Alter. Die Involution ist gekennzeichnet durch ein vermindertes Gewicht des Thymus, eine lymphoide Atrophie und einen Ersatz durch Fettstrukturen (Simpson J.G. et al., 1975). Im Thymus reifen Thymozyten durch verschiedene Stimuli von hämatopoetischen und epithelialen Stromazellen zu naiven T-Zellen aus. Die Reifung der Thymozyten erfolgt in verschiedenen Stadien. Das erste Stadium zeichnet sich durch die fehlende CD4 und CD8 Expression und den Mangel eines vollständigen T-Zell-Antigenrezeptors auf Thymozyten aus. Die Thymozyten werden hier als doppelt-negativ bezeichnet. In der zweiten Reifungsphase zeichnen sich die Thymozyten durch eine Expression von CD4 und CD8 aus. Sie werden nun als doppelt-positive Thymozyten bezeichnet. Aus den doppelt-positiven Thymozyten entwickeln sich schließlich im dritten Stadium die reifen, einfach positiven, naiven CD4+CD8- oder CD4-CD8+ TLymphozyten. Diese naiven T-Zellen verlassen den Thymus und wandern über Blut oder Lymphgefäße in das periphere lymphatische Gewebe. Im Thymus unterliegen die reifenden T-Zellen einem Prozess der als positive oder negative Selektion bezeichnet wird. Dieser Prozess stellt sicher, dass reife T-Zellen Fremd-Antigene ausschließlich im Kontext mit eigenen MHCMolekülen erkennen und dass eine Immunantwort gegen Selbst-Antigene ausbleibt. Diese Selektion findet auf der zweiten Entwicklungsstufe der Thymozyten statt. 8 Thymische Selektion kann nicht in jedem Fall gewährleisten, dass autoreaktive T-Zellen daran gehindert werden, als reife, funktionelle Zellen den Thymus zu verlassen. Dieses Phänomen ist erklärbar durch die Antigen-Vielfalt des Körpers und die gleichzeitige Insuffizienz des Thymus, alle körpereigenen Antigene zu exprimieren. Zur Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz, die die Fähigkeit des Körpers beschreibt, peripher autoreaktives Verhalten zu unterdrücken, sind verschiedene Mechanismen bekannt. Als wahrscheinlich wichtigster Bestandteil der peripheren T-Zell-Toleranz ist hier die Aktivität der regulatorischen T-Zellen zu nennen (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002). 1.2 CD4+ T-Zellen CD4+ T-Zellen, auch T-Helferzellen genannt, stellen eine Subpopulation der TLymphozyten dar und tragen den CD4-Korezeptor an ihrer Oberfläche. Sie werden, wie in 1.1 beschrieben, im Thymus aus Thymozyten differenziert und wandern als naive CD4+ T-Zellen in die Peripherie. Dort werden sie zu TEffektorzellen aktiviert oder differenzieren zu CD4+ Gedächtniszellen, den Memory T-Zellen. Diese Aktivierung der CD4+ T-Zellen erfolgt über Antigenkontakt. Antigene werden von antigenpräsentierenden Zellen auf MHC-II-Molekülen dargeboten. Durch Bindung des MHC-II/ Antigen-Komplexes an den TCR wird die CD4+ TZelle aktiviert, setzt Zytokine frei und beginnt zu proliferieren. Anhand des sezernierten Zytokinmusters können die aktivierten CD4+ T-Zellen, die T-Effektorzellen, in zwei Subpopulationen unterteilt werden. Die Zellen vom Subtyp TH1, auch TH1-Effektorzellen genannt, sezernieren typischerweise IFNχ, IL-2 und TNFβ. Die TH2-Zellen, auch TH2-Effektorzellen genannt, sezernieren die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und TGFβ. 9 TH1-Zellen steuern durch ihre Zytokinausschüttung die Immunantwort in eine zellulär betonte Richtung, die sich unter anderem in einer Aktivierung von Makrophagen äußert. TH2-Zellen steuern die Immunantwort in eine humoral betonte Richtung. Sie aktivieren durch ihr Zytokinmuster B-Zellen und veranlassen eine Antikörperproduktion. Etwa 5% aller naiven CD4+ T-Zellen differenzieren zu Memory T-Zellen. Die phänotypische Unterscheidung von naiven CD4+ T-Zellen und Memory T-Zellen wird durch die Isoformen des Oberflächenproteins CD45 ermöglicht. Naive CD4+ T-Zellen exprimieren die Isoform CD45RA, Memory T-Zellen hingegen die Isoform CD45RO, die einer Spleißvariante des CD45RA entspricht. Memory T-Zellen steuern im Gegensatz zu den T-Effektorzellen die Immunantwort nicht in eine spezifische Richtung. Sie können sowohl dendritische Zellen als auch B-Zellen aktivieren und die entsprechenden Signale zur Antikörperproduktion bereitstellen. Memory T-Zellen besitzen zudem die Fähigkeit, auch nach Jahren bei erneutem Kontakt mit dem gleichen Antigen eine schnelle und effiziente Immunantwort zu vermitteln (Holländer G.A. et al., 2006). 1.3 Regulatorische T-Zellen Regulatorische T-Zellen, auch T-Regulatorzellen oder Tregs genannt, stellen eine Subpopulation der CD4+ T-Zellen dar. Sie wurden 1995 erstmalig von Sakaguchi et al. beschrieben. So genannte Suppressor-Zellen, denen regulatorische Funktionen zugesprochen wurden, wurden schon 1971 von Gershon und Kondo identifiziert (Gershon R.K. et Kondo K., 1971). Wegen widerspüchlicher Forschungsergebnisse verschwand jedoch das Konzept der T-Zell-Suppression in den 1980ern. Sakaguchi et al. erregten als Erste wieder das Interesse an den nun so genannten regulatorischen T-Zellen durch Entdeckung einer Population von CD4+ Zellen, die CD25 (alpha-Kette des IL-2-Rezeptors) hoch exprimierte und in einem Mausmodell Autoimmunität verhinderte (Sakaguchi S. et al., 1995). 10 Heute weiß man, dass regulatorische T-Zellen bei Menschen in der Lage sind, zerstörende immunologische Abwehrreaktionen zu kontrollieren und Immunantworten gegen ungeeignete Ziele wie Selbst-Antigene oder nichtschädliche externe Antigene zu verhindern. Ihre Funktion ist wesentlicher Bestandteil der periperen Toleranz (Bacchetta R. et al., 2007). Es sind verschiedene Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen beschrieben, die koexistieren und zur Immunsuppression beitragen (vgl. Abbildung 2, S. 19). Zu unterscheiden sind natürlich vorkommende CD4+CD25high regulatorische TZellen, peripher induzierte CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, zum Beispiel Tr1 und TH3 Zellen, sowie CD4+CD25high regulatorische T-Zellen, die sich in der Peripherie durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entwickeln (Beyer M. et Schultze L., 2006). Die natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen werden auch als nTregs bezeichnet. Sie entwickeln sich im Thymus und sind daher von denjenigen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen abzugrenzen, welche in der Peripherie induziert regulatorischen werden. T-Zellen Die werden peripher auch als induzierten adaptive oder CD4+CD25+ induzierte regulatorische T-Zellen (aTregs/ iTregs) bezeichnet (Bacchetta R. et al., 2007; Casares N. et al., 2007). aTregs werden in verschiedene Zelltypen unterschieden: die IL-10 produzierenden Typ 1 regulatorischen T-Zellen (Tr1), deren suppressive Funktion bei Allergien, Autoimmunität und allogener Transplantation gut belegt ist (Bacchetta R. et al., 2007), sowie die TH3-Zellen, die die Aktivität konventioneller T-Zellen in einer TGF-β abhängigen Art unterdrücken (Buckner J.H. et al., 2004) und nach oralem Antigenkontakt oder durch Stimulation von CD4+CD25- T-Zellen in Anwesenheit von TGF-β induziert werden (Valmori D. et al., 2005). 11 aTregs entwickeln sich unter dem Einfluss von vermutlich unreifen dendritischen Zellen und/ oder der Anwesenheit von IL-10 und TGF-β, aber auch unter Anwesenheit immunsuppressiver Medikamente wie Glukokortikoiden und Vitamin D3 (Verhagen J. et al., 2006). Sie entwickeln sich Foxp3 unabhängig (Vieira P.L. et al., 2004). Foxp3-abhängig entwickeln sich die nTregs (Hori S. et al., 2003) und die peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs, die den nTregs sehr ähnlich sind (Bacchetta R. et al., 2007). nTregs, die im Thymus entstehen, unterdrücken die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Effektorzellen, sowie die IL-2 mRNA-Transkription und die damit verbundene IL-2 Produktion, welche als Wachstumsfaktor für die autokrine Proliferation von T-Zellen fungiert. Sie supprimieren hauptsächlich via Zell-ZellKontakt (Bacchetta R. et al., 2007). Der genaue Mechanismus der Suppression ist jedoch bisher noch nicht bekannt. nTregs unterdrücken nicht nur T-Zellen, wie die aTregs, sondern auch natural killer cells, die Reifung von dendritischen Zellen und die Antikörperproduktion der B-Zellen (Bacchetta R. et al., 2007). Die peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs sind eine von Akbar et al. beschriebene Population von regulatorischen TZellen. Sie ähneln phänotypisch den nTregs und sind vermutlich diejenigen Zellen, die nach der Thymusinvolution den Pool der nTregs aufrecht erhalten. Das Modell für die periphere Entstehung von diesen Tregs im Menschen lautet: Naive T-Zellen werden durch die Begegnung mit einem Antigen oder einer antigenpräsentierenden Oberflächenmarker Zelle CD45RA geprimed. und Sie verlieren exprimieren daraufhin CD45RO. ihren Erneuter Antigenkontakt führt zur Differenzierung der nun aktivierten Zellen zu einer hoch differenzierten Population, den CD4+CD45RO+ Memory T-Zellen. Diese hoch differenzierten Zellen neigen zu Apoptose und produzieren insuffiziente Levels von IL-2 für die autokrine Proliferation. Sie sind daher leicht in das Stadium der Anergie zu überführen. Mit der Überführung erlangen sie ihre suppressive Aktivität und werden als regulatorische T-Zellen bezeichnet. 12 Dieses Modell schließt die Koexistenz anderer Populationen von thymisch produzierten oder cytokin-abhängigen Populationen regulatorischer T-Zellen nicht aus (Akbar A.N. et al., 2003). Abschließend lässt sich festhalten, dass in der aktuellen Literatur zu den Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen keine klare schematische Darstellung der Populationen vorliegt. Abbildung 1 zeigt ein selbsterstelltes Schema aus Informationen zu regulatorischen T-Zellen der angegeben Quellen. 13 CD4 + nTregs CD4 CD4 + CD25 + CD25 - FOXP3 CD4 high FOXP3 - CD25 + CD45RA + high FOXP3 + naive-like + CD45RA nTreg + Antigenstimulation Thymus Naive CD4 T-Zelle + CD4 + CD25 CD4 - FOXP3 + CD25 - high memory- FOXP3 + CD45RO Antigen- Antigen- In vivo: stimulation stimulation like nTreg + Zell-Zell Kontakt Cytokinunabhängig TH1: IFNχ, IL-2, TNFβ Memory T-Zelle CD4 CD4 + CD25 CD25 - FOXP3 - TH2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGFβ + + FOXP3 - CD45RO TH1, TH2 Z (Teff) I + E aTregs / iTregs CD4 CD25 IL-10 high FOXP3 Z E + L + CD25 high FOXP3 Th3 - CD45RO CD4 high Tr1 - CD45RO CD4 L + TGF-β high L E + N + CD25 high FOXP3 ? + CD45RO + Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entwicklung, des Phänotyps und der Effektorfunktionen von regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen. (Akbar, 2003; Banham, 2006; Buckner, 2004; Chatenoud, 2006; Holländer, 2006; Shevach, 2004; Toda, 2006; Vieira, 2004) 14 Regulatorische T-Zellen können nach ihrem Entwicklungsstand in zwei verschiedene Zelltypen unterschieden werden. Der eine Typ regulatorischer T-Zellen ist charakterisiert durch die Expression von CD45RAhigh und CD45ROlow. CD45RA gilt, wie bei den T-Helferzellen, als Marker für naive Zellen. Zugehörige zu diesem Typ Zellen werden als naive-like regulatorische T-Zellen bezeichnet. Der andere Typ regulatorischer Zellen ist durch die Marker CD45ROhigh und CD45RAlow charakterisiert. CD45RO gilt als Memory-Zell-Marker. Daher werden Zugehörige zu diesem Typ Zellen als memory-like regulatorische T-Zellen bezeichnet (Banham A.H. et al., 2006). Zusammenfassend ist zu sagen, dass regulatorische T-Zellen CD4 und CD25 als Oberflächenproteine exprimieren, über Zell-Zell Kontakt und Zytokinausschüttung Zielzellen unterdrücken und damit die Immunhomöostase aufrecht erhalten. Außerdem sind sie anerg (inaktiv), besitzen eine geringe Proliferationskapazität und neigen zu Apoptose (Akbar A.N. et al., 2003). CD25 ist jedoch als Marker für regulatorische T-Zellen nicht spezifisch. CD25 wird außer auf regulatorischen T-Zellen auf aktivierten T-Effektorzellen, den TH1- und TH2-Zellen exprimiert. Er kann daher nicht direkt genutzt werden, um regulatorische T-Zellen von aktivierten T-Effektorzellen zu unterscheiden. Um die regulatorischen T-Zellen mit einer nur geringen Kontamination von TEffektorzellen bestimmen zu können, bedarf es der Analyse der CD4+CD25high Population. Diese Population besitzt regulatorische Aktivität und exprimiert CD25 auf einem hohen Niveau. Als signifikantester Marker für die regulatorischen T-Zellen gilt jedoch FOXP3, ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung der regulatorischen T-Zellen von zentraler Bedeutung ist (Banham A.H. et al., 2006). 15 1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3 Das „Forkhead box Protein“ FOXP3 ist Mitglied der P Subfamilie der FoxTranskriptionsfaktoren (Lopes J.E. et al., 2006). Die Familie der Fox-Transkriptionsfaktoren wurde 1990 erstmalig von Weigel und Jäckle beschrieben (Weigel D. et Jäckle H., 1990) und besteht heute aus mindestens 43 Mitgliedern, welche in zwei Klassen unterteilt werden. Klasse 1 besteht aus den Subfamilien A-G, I-L und Q, Klasse 2 wird von den Familien H und M-P gebildet. FOXP3 gehört demnach zur Klasse 2 dieser Familien transkriptionaler Regulatoren (Katoh M. et al., 2004). Die Schreibweise in Großbuchstaben definiert FOXP3 als einen humanen Transkriptionsfaktor. Per Nomenklatur definiert die Schreibweise Foxp3 den Transkriptionsfaktor in Mäusen, die Schreibweise FoxP3 den Transkriptionsfaktor in allen anderen Spezies (Carlsson P. et al., 2002). Die Fox-Transkriptionsfaktoren sind charakterisiert durch eine invariante, d.h. stabile winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne (Lopes J.E. et al., 2006). Diese besteht aus ca. 100 Aminosäuren (Kaestner K.H. et al., 2000). Das FOXP3-Protein besteht aus insgesamt 431 Aminosäuren. Strukturell ist es aus der C-terminalen winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne, einem mittig liegenden C2H2 Zink Finger und einem ebenfalls mittig liegenden Leucin Zipper aufgebaut. Der N-Terminus ist reich an Prolin, jedoch bisher nicht funktionell definiert (Lopes J.E. et al., 2006). Das FOXP3-Protein ist kodiert aus 11 Exons. Bei Menschen, im Gegensatz zu Mäusen, ist eine zweite kürzere Isoform des FOXP3-Proteins bekannt, in welcher das Exon 2 fehlt. Im Moment ist jedoch die Funktion dieser zwei Unterformen nicht bekannt (Bacchetta R. et al., 2007). 16 Abbildung 2: Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins (Lopes, 2006) mit C-terminaler Forkhead-Domain, mittig liegendem Zink Finger (ZN finger) und Leucin Zipper (LZ) und alternativ gesplicetem Exon 2. Die winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne des FOXP3- Transkriptionsfaktors kann an den IL-2 Promotor binden und die IL-2-mRNA Transkription unterdrücken. Zusätzlich besitzt der N-Terminus des Proteins essentielle Stellen für die Repressoraktivität. FOXP3 gilt allgemein als Repressor, der die Bildung von IL-2, welches als Wachstumsfaktor für die autokrine Proliferation von T-Zellen fungiert, unterdrückt. Neben der DNA-bindungs Domäne, die außerdem wichtig für die Kernlokalisation von FOXP3 ist, kodiert das Protein Zink Finger und Leucin Zipper Domänen, die Homodimerisation und Heterodimerisation mit anderen forkhead-Familienmitgliedern oder anderen DNA-bindenden Kofaktoren erlauben (Bacchetta R. et al., 2007). Bei einer Gen-Sequenzanalyse bildete sich das FOXP3 Gen auf dem Chromosom Xp11.23 ab (Zavattari P. et al., 2004). Ist das FOXP3-Protein durch Genmutationen in der kodierenden Region verändert, kommt es klinisch zum seltenen, verherenden Krankheitsbild IPEX. Das Krankheitsbild IPEX wurde vor mehr als 20 Jahren zum ersten Mal beschrieben. IPEX steht als Abkürzung für ein Syndrom, das einem xchromosomal-rezessiven Erbgang unterliegt und sich in Immundysregulation, Polyendokrinopathie und Enteropathie äußert. Es ist assoziiert mit einem autoimmunen Diabetes, Hypothyreoidismus, autoimmuner hämolytischer Anämie, wiederkehrenden Infektionen, membranöser Nephropathie, einem Hyper-IgE und atopischer Dermatitis. Das Krankheitsbild geht meist mit einem frühen Tod der männlichen hemizygoten Träger um den 24. Lebensmonat einher. Todesursachen sind Sepsis und massive Gedeihstörung (Owen C.J. et al., 2003; Torgerson T.R. et al., 2007). Das FOXP3 Gen mutiert bei IPEX im Intervall 17-20-cM auf Chromosom Xp 11.23-Xq13.3 (Bennett C.L. et al., 2001). 17 1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen Die Entdeckung von Foxp3 als einem spezifischen Marker für natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Hori S. et al., 2003) hat zu einer regelrechten Explosion der Forschung auf dem Gebiet der regulatorischen TZellen geführt. FOXP3 fungiert als Hauptregulator in der Entwicklung und Funktion von natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und ist damit ein Schlüssel für die Aufrechterhaltung der normalen Immunhomöostase. Der Funktionsverlust von FOXP3 führt zu einem Mangel an regulatorischen TZellen und resultiert in dem letalen Krankheitsbild IPEX. Die Überexpression dieses Modulators führt zu schwerer Immundefizienz (Ochs H.D. et al., 2005). Bei verschiedenen Krankheiten wurden Änderungen in der Anzahl und Funktion von FOXP3 positiven regulatorischen T-Zellen gefunden. Patienten mit Tumoren zum Beispiel zeigen lokal einen relativen Überfluss an FOXP3 positiven Zellen, welche die Möglichkeit des Körpers inhibieren, die Bildung von tumorösen Zellen zu unterdrücken (Beyer M. et Schultze J.L., 2006). Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes hingegen besitzen eine relative Dysfunktion von FOXP3 positiven Zellen (Alvarado-Sánchez B. et al., 2006). In Tierstudien führte die Induktion oder Zugabe von Foxp3 positiven T-Zellen zu einer merklichen Reduktion der Schwere von Erkrankungen wie Diabetes, Multipler Sklerose, Asthma, inflammatorischen Darmerkrankungen, Thyreoiditis und renalen Krankheiten (Suri-Payer E. et al., 2006). Um jedoch regulatorische Zellen für humane Immuntherapien, die zum Beispiel zur Heilung von Autoimmunerkrankungen, zur Verhinderung von Transplantatabstoßungen oder zur Tumorzellinhibition beitragen, nutzen zu können, ist es wichtig die Biologie der regulatorischen T-Zellen genau zu verstehen (Banham A.H. et al., 2006). Dies ist Gegenstand der aktuellen Forschung. 18 1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen Die atopische Dermatitis, auch atopisches Ekzem genannt, ist eine chronisch rezidivierende, inflammatorische Hautkrankheit. Die Diagnose der atopischen Dermatitis basiert auf folgender klinischer Konstellation: Pruritus, faziale und extensorseitige rote, schuppende, manchmal auch nässende Ekzeme bei Kindern, flexorseitige Ekzeme derselben Morpholgie bei Erwachsenen und Chronizität der Dermatitis, die unter anderem zur Lichenifikation führen kann. Der klinische Phänotyp der atopischen Dermatitis ist als ein Produkt der Interaktion zwischen Hyperreagibilität prädisponierenden aufgrund einer Genen, defekten Umweltreizen, kutaner Hautbarrierefunktion und immunologischen Antworten zu sehen. Die atopische Dermatitis ist typischerweise eine Erkrankung des Säuglings- und Kindesalters. Sie kann bis zur Pubertät ausheilen aber auch bis in das Erwachsenenalter persistieren. Verschiedene Beobachtungen deuten darauf hin, dass die atopische Dermatitis die kutane Manifestation einer systemischen Erkrankung ist. Sie ist die initiale Erkrankung, die mit Nahrungsmittelallergien, allergischer Rhinitis und Asthma bronchiale assoziiert sein kann. All diese Erkrankungen gehören zum atopischen Formenkreis und sind charakterisiert durch erhöhte Serum-IgE Spiegel (Leung D.Y. et al., 2004; Sitzmann F.C., 2002; Koletzko B. et al., 1999). Zur Beurteilung des Schweregrades der Erkrankung kann der SCORAD-Score angewandt werden. SCORAD dient zur Klassifizierung des Schweregrades einer atopischen Dermatitis. Als Einstufungskriterien gelten: Alter des Patienten, dermale Ausbreitung der atopischen Dermatitis anhand der 9-er Regel (Gesicht, Hände, Torso,...), Intensität (Erythem, Ödem/ Papulation, Exkoriation, Lichenifikation, trockene/ nässende/ verkrustete Stellen) und subjektive Beschwerdezeichen (Pruritus, Insomnie) (Oranje A.P. et al., 2007). Auf histologischer Ebene kann eine dermale mononukleäre Infiltration der Hautläsion der atopischen Dermatitis beobachtet werden. 19 Während der initialen Inflammationsphase wandern T-Effektorzellen in die Dermis der Läsion ein und sezernieren IFN-χ. IFN-χ induziert die Apoptose von Keratinozyten, was wahrscheinlich zu der charakteristischen ekzematösen Hautveränderung der Patienten mit atopischer Dermatitis führt. Als Antwort auf INF-χ regulieren die Keratinozyten die Produktion der durch INF-χ induzierten Zytokine hoch. Dies fördert die Infiltration weiterer T-Zellen in die Epidermis und erhöht damit die Schwere der Inflammation und der Keratinozyten-Apoptose (Verhagen J. et al., 2006). Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis ist bisher wenig erforscht. Bei Patienten mit atopischer Dermatitis konnten FOXP3 positive regulatorische T-Zellen nicht in inflammatorischen Hautläsionen nachgewiesen werden. Allerdings waren Tr1 Zellen, als eine Gruppe der peripher induzierten regulatorischen T-Zellen nachweisbar. regulatorischen T-Zellen deutete auf FOXP3+ Die Abwesenheit der eine dysregulierte Kontrolle der Inflammation hin (Verhagen J. et al., 2006). Dass FOXP3 positive regulatorische T-Zellen eine zentrale Rolle in der Regulation immunologischer Erkrankungen spielen, ist spätestens seit der Beobachtung des Krankheitsbildes IPEX klar. IPEX Patienten besitzen aufgrund eines Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine nTregs und leiden darausfolgend an einer schweren Immundefizienz, die unter anderem von einer atopischen Dermatitis begleitet wird (Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006). Die genaue Rolle regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis sowie die potentielle Einsetzbarkeit regulatorischer T-Zellen in der Immuntherapie, welche möglicherweise zu einer Heilung der atopischen Dermatitis beitragen könnte, wird weiterhin nachhaltig Gegenstand der Forschung bleiben. 20 2 Fragestellung Regulatorische T-Zellen wurden zuerst 1995 beschrieben. Seither sind die regulatorischen T-Zellen zu einem zentralen Punkt der immunologischen Forschung geworden. Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Erforschung der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen. Außerdem umfasst sie die Analyse der altersabhängigen Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen beider Probandengruppen. Hierbei stellen sich folgende Fragen: • Gibt es hinsichtlich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen Unterschiede zwischen der gesunden Kontollgruppe und der Gruppe von Patienten mit einer atopischen Dermatitis? Wie wären diese zu werten? • Ändern sich mit dem Alter die Zellzahlen verschiedener Subpopulationen regulatorischer T-Zellen in beiden Probandengruppen? In welchem Zusammenhang wären diese Veränderungen zu sehen? 21 3 Probanden, Material und Methoden In diesem Kapitel werden zunächst die Auswahlkriterien für die teilnehmenden gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden dargestellt. Es folgt eine Auflistung der verwandten Materialien. Daraufhin werden die angewandten Verfahren zur Markierung der Oberflächenantigene CD4 CD25 und CD45 sowie des intrazellulären Markers FOXP3 und die durchflusszytometrische Analyse der Zellpopulationen beschrieben. Das Kapitel schließt mit der Darstellung der verwandten statistischen Analyseverfahren der experimentellen Daten. 3.1 Probanden Insgesamt nahmen 54 Probanden an der klinischen Pilotstudie teil. Die Probanden befanden sich im Alter von 0 bis 18 Jahren. 37 Probanden gehörten der gesunden Kontrollgruppe an; 31 männlichen, 6 weiblichen Geschlechts; 32 deutscher, 5 anderer Herkunft. 17 Probanden waren der Gruppe an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zuzuordnen; 11 männlichen, 6 weiblichen Geschlechts; 13 deutscher, 4 anderer Herkunft. Als Kriterien für die Gruppe der gesunden Kinder und Jugendlichen galten: • Kein Leiden an einer akuten oder chronischen Krankheit • Insbesondere kein Leiden an atopischer Dermatitis, Asthma oder Allergien • Keine Einnahme immunsupprimierender oder immunmodulierender Medikamente Als Kriterien für die Gruppe der an atopischer Dermatitis erkrankten Kinder und Jugendlichen galten: • Leiden an atopischer Dermatitis klassifiziert nach dem SCORAD-Score • Erhöhtes Gesamt-IgE • Positive RAST-Ergebnisse 22 Untersucht wurden 5 ml heparinisierten Vollbluts von gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen. Die Teilnahme an der klinischen Querschnittsstudie beschränkte sich auf die einmalige Abnahme von 5 ml Blut. Die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum und die Eltern der Kinder erklärten ihre Zustimmung. Die Blutproben wurden im Rahmen einer geplanten Operation durch einen standardmäßig gelegten venösen Zugang, im Rahmen einer erforderlichen Blutabnahme zur Vaterschaftstestung oder im Rahmen einer geplanten Allergietestung abgenommen. Mitwirkende Abteilungen waren: • die kinderchirugische Praxis Dr. med. M. Standke, BochumWattenscheid • die anästhesiologische und unfallchirurgisch-orthopädische Abteilung des St. Josef-Hospital Bochum • die Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum • die Praxis für Allgemeinmedizin Dr. med. J. Möllers, Rheine • die Sprechstunde für Kinder mit atopischer Dermatitis von Herrn Prof. Dr. med. U. Schauer in der Kinderklinik Bochum. 3.2 Materialien 3.2.1 Labormaterialien und Geräte Labormaterialien 1,5 ml sicher verschließbares Röhrchen Eppendorf, Bestell-Nr. 0030 120.086 1,8 ml Cryo Röhrchen Nunc, Dänemark, Cat.-No. 363401 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352052 10 ml serologische Pipette, steril Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 357530 15 ml konisches Röhrchen (Blue Max Jr.) Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352096 50 ml konisches Röhrchen (Blue Max) Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352070 Deckgläser optisch plan geschliffen Pipettenspitzen (klein/ groß) Eppendorf 23 Geräte Arbeitsbank Heraeus LaminAir, steril Heraeus Instruments Auflichtmikroskop Zeiss (West Germany) Automatische Pipette Express Durchflusszytometer FACScan Falcon/ BD, USA TM BD Eppendorf Reference 20 Pipette (2-20 µl) Eppendorf Gefriertruhe (–88°C) Profiline, National Lab Gubtt Kühlschrank Liebherr Labsystems 4500 Finnpipette (200-1000 µl) Thermo Scientific Stickstoffbehälter Chronos Biosafe, Messer Styroporbehälter Falcon Vortexer (VF2) Janke und Kunkel IKA-Labortechnik Wasserbad Köttermann Zählkammer nach Neubauer Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS) Heraeus sepatech 3.2.2 Reagenzien Biocoll-Trennlösung (Dichte 1.077 g/ ml) Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L6115 Einfriermedium (Freeze): 4,4 ml RPMI 1640 100 µl Penicillin/ Steptomycin (1%) 1 ml DMSO 4,5 ml FCS FoxP3 Staining Buffer Set Cat.-No. 00-5523-00, NatuTec • Fixation/ Permeabilization Diluent • Cat.-No. 00-5223-56, NatuTec • 10x Permeabilization Buffer • Cat.-No. 00-8333-56, NatuTec • Fixation/ Permeabilization Concentrate • Cat.-No. 00-5123-43, NatuTec Heparin-Natrium Braun 100.000 I.E. Braun Melsungen AG, Melsungen Cat.-No. 3212010 PBS (Dulbecco), steril Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L1825 PBS-0,1% NaAcid Rattenserum Sigma, USA, Cat.-No. R 9759 24 Türk´sche Lösung Fluka Chemie GmbH, Schweiz, Cat.-No. 93770 3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper Antikörper FITC anti-human CD25 BD-Pharmingen™ Cat.-No. 555431 FITC labeled anti-human CD45RA BD-Pharmingen™ Cat.-No. 555488 PE anti-human CD25 BD-Pharmingen™ Cat.-No. 555432 PE-conjugated anti-human Foxp3 eBioscience Cat.-No. 12-4776-73 PerCP labeled anti-human CD4 BD Biosciences, USA Cat.-No. 345770 Kontrollantikörper Mouse IgG2a PerCP BD Immuncytometry systems, USA Cat.-No. 349054 Mouse γ1 FITC BD Immuncytometry systems, USA Cat.-No. 345815 Mouse γ1 PE BD Immuncytometry systems, USA Cat.-No. 345816 PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control eBioscience Cat.-No. 12-4321-71 3.3 Methoden 3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes Zu Beginn der durchgeführten Studie wurden 5 ml Vollblut von gesunden Kindern sowie von Patienten mit atopischer Dermatitis der Kinderklinik Bochum abgenommen und in 200 µl Heparin aufgenommen. Von jeder heparinisierten Blutprobe wurden 500 µl für ein Differentialblutbild entnommen. Die Erstellung 25 des Differentialblutbildes erfolgte im Labor des St. Josef-Hospital Bochum. Das Blutbild wurde verwandt, um prozentuale Zellwerte in absolute Zellzahlen umzurechnen. 3.3.2 Isolation der PBMC Für die Präparation der PBMC, der peripher blood mononuclear cells, wurde das heparinisierte Blut im Verhältnis 1:3 mit PBS gemischt und anschließend in einem 50 ml Falcon Röhrchen auf 15 ml Ficoll (Biocoll) geschichtet. Danach erfolgte die Auftrennung der Zellen bei 660xg und Zimmertemperatur für 20 Minuten in der Zentrifuge ohne Aktivierung der Bremse. Abbildung 3: Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient. (Jacobs, 1996) Charakteristische Schichtung vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation von auf Ficoll-Lösung geschichtetem heparinisiertem Vollblut. Rechts: mittig liegende Interphase mit Lymphozyten und Monozyten. Der PBMC-Ring mit Lymphozyten und Monozyten wurde abpipettiert und zweimalig in PBS bei 300xg und 200xg sowie Zimmertemperatur und unter Aktivierung der Bremse in der Zentrifuge gewaschen. Für die Zellzählung wurde das gewonnene Zellpelet in 5 ml PBS aufgenommen. Eine 10 µl Probe wurde entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt. Die angefärbten Zellen wurden nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Dabei wurden alle neun Quadranten mit ihren 16 Feldern berücksichtigt. 26 Abbildung 4: Zellzählung mittels Neubauerkammer. (Jacobs, 1996) Die Kammer (links) enthält zwei Zählgitter, eines davon ist rechts vergrößert dargestellt. Die isolierten PBMC wurden in 1 ml gekühltes Einfriermedium aufgenommen und zunächst in Styroporbehältern in einer Tiefkühltruhe langsam auf –80°C heruntergekühlt, um sie dann nach einigen Tagen in die mit flüssigem Stickstoff befüllten Tanks zu überführen. Dort wurden die Proben bis zu den endgültigen Messungen gelagert und gesammelt. 3.3.3 Anfärbung der PBMC Zur Analyse der Zellsubpopulationen wurden die eingefrorenen Zellen in 40 ml 37°C warmem PBS aufgetaut und resuspendiert. Bei 300xg wurde diese Zellsuspension 10 Minuten in der Zentrifuge gewaschen und anschließend nochmals in kaltem PBS bei 200xg für 15 Minuten zentrifugiert. Das gewaschene Zellpelet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und hiervon wurde eine 10 µl Probe entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt. Die Zellen wurden erneut nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer NeubauerZählkammer ausgezählt. Die ermittelte Zellzahl diente zur Berechung des Verdünnungsfaktors. Anschließend wurden zwei Färbereihen durchgeführt. 27 3.3.3.1 Markierung von CD4, CD25 und FOXP3 Ziel der ersten Färbereihe war es, die Oberflächenmarker CD4 und CD25 und den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3 fluoreszierend kenntlich zu machen. Dazu wurde die Probe zunächst mit PBS auf einen Wert von 1x106 Zellen/ 100 µl verdünnt. Von dieser geeichten Zellsuspension wurden zwei Proben à 100 µl entnommen. Die Oberflächenmarker CD4 und CD25 wurden in beiden Proben durch Zugabe von 20 µl PerCP labeled anti-human CD4 und 20 µl FITC antihuman CD25 angefärbt. Anschließend wurden die mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern angereicherten Proben für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. In jede Probe wurde 1 ml kühlschrankkaltes PBS hinzu gegeben und die Proben wurden 5 Minuten bei 200xg gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes wurde zu beiden Proben 1 ml nach Herstellerangabe erstellte Fix/ Perm Solution gegeben. Diese diente der Perforierung der Zellmembran, sowie der Nukleolenmembran, um eine Markierung des intranukleären Transkriptionsfaktors FOXP3 durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper zu ermöglichen. Dann wurden die Proben 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank fixiert. Nach darauf folgendem einmaligem Waschen mit 3 ml PBS bei 580xg wurde den Proben der nach Herstellerangaben erstellte Permeabilisierungspuffer hinzugefügt. Nach 2-maligem Waschen der Proben mit Perm Puffer bei 200xg für 5 Minuten wurden die Zellen durch Zugabe von 2 µl Rattenserum (2%) geblockt und anschließend bei 4°C für 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Diese Blockierung diente zur Stabilisierung der Zellstruktur und verhinderte damit eine unspezifische Bindung des FOXP3-Antikörpers. Zu einer Probe wurden anschließend 20 µl des PE-conjugated anti-human FoxP3 hinzugegeben. Zur anderen Probe wurden 20 µl des Kontrollantikörpers PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control pipettiertet. 28 Abbildung 5: FOXP3 Antigen-Antikörperbindung. (Lopes, 2006) Bindung des FOXP3 spezifischen Antikörpers an den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3. FOXP3 mit Exon 2, Zinkfinger (ZN finger), Leucin Zipper (LZ) und Forkhead-Domain (FH). Darauf folgte die Inkubation der Proben für 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank. Den Abschluss der Färbungen bildete das einmalige Waschen mit 2 ml Perm Puffer. Zusammenfassend wurde durch diese Färbereihe die Fluoreszenzmarkierung der Oberflächenproteine CD4, CD25 und des intranukleären Proteins FOXP3 erreicht. Es konnte die Anzahl der CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt werden. 3.3.3.2 Markierung von CD4, CD25, CD45RA Die zweite Messreihe diente der Färbung der Oberflächenmarker CD4, CD25 und CD45RA. Hieraus konnte die Anzahl CD4+ T-Zellen, der so genannten THelferzellen, der CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- der so genannten naiven und Memory T-Zellen, der CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA-, der so genannten naive-like und memory-like regulatorischen T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt werden. 29 Abbildung 6: Immunfluoreszenz. (Jacobs, 1996) Markierung von oberflächlichen Proteinen (CD4, CD25, CD45RA) mit direkt Fluoreszenzfarbstoffmarkierten Antikörpern. Zur Färbung der letzt genannten Oberflächenproteine wurden zwei Proben à 100 µl aus der geeichten PBMC-Zellsuspension mit einem jeweiligen Inhalt von 105 Zellen entnommen. Zu der ersten Probe wurden jeweils 5 µl des PerCP labeled anti-human CD4, des FITC labeled anti-human CD45RA und des PE anti-human CD25 hinzugegeben. Die Kontrollprobe erhielt jeweils 5 µl der Kontrollantikörper Mouse IgG2a PerCP, Mouse γ1 FITC und Mouse γ1 PE. Die Proben wurden für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert und anschließend mit 1 ml PBS-Acid bei 200xg für 5 Minuten in der Zentrifuge gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 200 µl PBSAcid resupendiert. Die Anwendung von PBS-Acid diente zur Stabilisierung der Zellen. Abschließend konnten die Proben durchflusszytometrisch gemessen werden. Es wurde die Anzahl der CD4+, der CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, der CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA- T-Zellen bestimmt. Diese zwei Färbereihen wurden zur Erfassung der vier Parameter CD4, CD25, CD45RA und FOXP3 in dem drei-kanaligen Durchflusszytometer des Studienlabors durchgeführt. 30 3.3.4 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Verschiedene physikalische und chemische Zelleigenschaften werden simultan auf der Einzelzellebene gemessen. Relative Zellgröße, Granularität sowie bis zu 12 verschiedene Fluoreszenzfarben (je nach Geräteausstattung) können für viele tausend Zellen umgehend ermittelt werden. Der Zellsuspension werden Antikörper-Fluorochrom-Konjugate zugesetzt. Die Antikörper sind gegen spezifische Antigene der Zellen gerichtet (s. Abbildung 6, Seite 30). Dadurch können beispielsweise Subpopulationen von Zellen unterschieden werden. Monoklonale fluoreszenzmarkierte Antikörper sind mittlerweile in großer Auswahl kommerziell erhältlich, sodass breite Anwendungsmöglichkeiten in der Klinik als auch in der Grundlagenforschung bestehen. Zur Analyse wird die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Messküvette werden die Zellen stark beschleunigt, wodurch sich Aggregate auftrennen. Umgeben von Trägerflüssigkeit erreichen die Zellen so den Analysepunkt, einen Argonlaser mit 488nm Wellenlänge, aufgereiht wie an einer Perlenschnur. Dieses Phänomen wird als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet. 31 Abbildung 7: Schematische Darstellung des Durchflusszytometers. (Jacobs, 1996) Druckluftabhängige Wanderung der Einzelzellsuspension über eine Stahlkapillare in die Messküvette. Nach hydrodynamischer Fokussierung Laserbestrahlung und Analyse der Streueigenschaften und der Fluoreszenz der Zellen. Das Licht des Lasers wird durch die Zellen gestreut. Die Streuung des Lichtes wird durch die Zellgröße, die Struktur der Zellmembran sowie den Zellkern und die intrazellulären Bestandteile beeinflusst. Beim Streulicht unterscheidet man den sogenannten forward scatter, das Streulicht längs zum Anregungslichtstrahl, und den sogenannten side scatter, das Streulicht im rechten Winkel zu dieser Achse. Der forward scatter ist dabei in erster Linie ein Maß für die Zellgröße (kleine Zellen streuen weniger), während der side scatter vor allem die intrazelluläre Granularität misst (Granulozyten streuen mehr als Leukozyten). 32 Abbildung 8: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung. (Shapiro, 2003) Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle, kommt es zu zelltypischen Streulichtphänomenen, durch die die Zelle hinsichtlich Zellgröße, Granularität und Fluoreszenz charakterisiert werden kann. Das Vorwärtsstreulicht gilt als Maß der Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht gilt als Maß der Zellgranularität. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt entlang der Laserachse im 90°-Winkel. Die fluoreszierenden Farbstoffe absorbieren Licht über einen weiten, für sie charakteristischen Wellenlängenbereich. Dadurch werden Elektronen der äußeren Schalen auf ein höheres Energieniveau gehoben. Mit dem Rücksprung auf das ursprüngliche Niveau wird ein Photon abgegeben. Dieser Strahlungsübergang wird als Fluoreszenz bezeichnet. Bei diesem Vorgang geht Schwingungs-Rotations-Energie verloren. Daher hat das emittierte Licht eine größere Wellenlänge (energieärmer) als das anregende Licht. Unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe haben unterschiedliche Exzitations- und Emissionsspektren. Die Emissionsspektren der Farbstoffe bestimmen nachfolgend die Kombinierbarkeit der Fluorochrome. Sie sollten sich in ihren Wellenlängenbereichen möglichst wenig überschneiden, um sie trennscharf auswerten zu können. Durch Mehrfarbenfluoreszenz wird die Korrelation mehrerer Zelleigenschaften ermöglicht. In Tabelle 1 sind verschiedene Farbstoffe zusammen mit ihrem Exzitationsmaximum (der Wellenlänge, bei der sie am besten angeregt werden) und Emissionsmaximum (der Wellenlänge, bei der das meiste Licht emittiert wird) aufgeführt. 33 Tabelle 1: Exzitations- und Emissonsmaxima verschiedener Fluorochrome. (Shapiro, 2003) Farbstoff Fluorescein Isothiocyanat (FITC) Phycoerythrin (PE) Peridinin Chlorophyll-a (PerCP) Exmax (nm) Emmax (nm) 495 520 480, 545, 564 575 490 675 Auf einem Monitor eines an das Durchflußzytometer angeschlossenen Computers werden die Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften der Zellen graphisch dargestellt. Dot Plot Graphiken sowie Histogramme der Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften der Zellen wurden in der vorliegenden Studie mittels der CELLQuest Software erstellt. Eine Dot Plot Graphik von Scattereigenschaften aller Zellen einer Vollblutprobe, die auf der x-Achse die Zellgröße (forward scatter) und auf der y-Achse die Zellgranularität (side scatter) repräsentiert verdeutlicht nachfolgend, dass sich spezifische Zellpopulationen durch charakteristische Punktwolken darstellen lassen. 34 Abbildung 9: Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut. (Jacobs, 1996) Die x-Achse repräsentiert mit dem forward scatter (FSC) die Zellgröße, die y-Achse mit dem side scatter (SSC) die Zellgranularität. Punktwolken stellen spezifische Zellpopulationen dar, die sich in ihren Streulichteigenschaften ähneln. Ein gating, d.h. die Eingrenzung einer Zellpopulation mit Hilfe des Computerprogrammes ermöglicht die genauere Betrachtung einer einzelnen Zellpopulation. In der vorliegenden Studie wurde die Population von Lymphozyten genauer untersucht. Dazu erfolgte ein gating jener Zellpopulation. 35 Abbildung 10: Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von Lymphozyten. Eingrenzung der Zellpopulation von Lymphozyten in die Region1 (R1) für die detailliertere Analyse von Zelleigenschaften. Neben der Streulichtdetektion erlaubte das zur Verfügung stehende FACScanTM die Erfassung dreier Fluoreszenzfarbstoffe. Die Fluoreszenzintensität der Zellen nach Antikörpermarkierung konnte mit Hilfe des Computerprogrammes CELLQuest unspezifische graphisch Bindung verdeutlicht von werden. Die fluoreszierenden Autofluoreszenz Antikörpern, die und durch Negativkontrollen bestimmt werden konnte, ließ sich bei der Auswertung am Computer diskriminieren. Zweifarbenfluoreszenzen wurden in Dot Plot Graphiken, Einfarbenfluoreszenzen in Histogrammen dargestellt. Zunächst erfolgte die Messung der CD4+CD25+ Zellen aus der Population von Lymphozyten. Anschließend wurde die Anzahl der CD4+CD25+FOXP3+ Zellen aus der Population der CD4+CD25+ Zellen bestimmt. 36 Abbildung 11: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ CD25+ Lymphozyten, die als Population der regulatorischen T-Zellen definiert ist. Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, FITC. Abbildung 12: Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 11). Marker1 (M1) beschreibt die Population der FOXP3+ CD4+ CD25+ Lymphozyten, die der Population der + FOXP3 regulatorischen T-Zellen entspricht. Fluoreszenzfarbstoff: PE. 37 Darauf folgend wurden die Populationen: CD4+CD45RA+ (naive) T-Zellen und CD4+CD45RA- (Memory) T-Zellen analysiert. Abschließend erfolgte die Detektion der CD4+CD25+CD45RA+ (naive-like) sowie der CD4+CD25+CD45RA(memory-like) regulatorischen T-Zellen aus der Lymphozytenpopulation. Abbildung 13: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ Lymphozyten, der T-Helferzellen, R3 (Region3) beschreibt die Population der + + CD4 CD25 Lymphozyten, der regulatorischen T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, PE. Abbildung 14: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+, der naiven T-Zellen; Marker2 (M2) beschreibt die Population der CD45RA- CD4+, der Memory T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC. Links: Ergebnisse eines 8 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl naiver T-Zellen. Rechts: Ergebnisse eines 8 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von Memory T-Zellen. 38 Abbildung 15: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region3 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+ CD25+, der naive-like regulatorischen TZellen; Marker2 (M2) beschreibt die Population der CD45RA - CD4+ CD25+, der memory-like regulatorischen T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC. Links: Ergebnisse eines 6 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl von naive-like regulatorischen TZellen. Rechts: Ergebnisse eines 14 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von memory-like regulatorischen T-Zellen. 3.3.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der orientierenden Pilotstudie wurde mit Hilfe der GraphPad PRISM Software vorgenommen. Die Analyse der Daten erfolgte durch einfache lineare Regression. Der Vergleich der Daten der Patienten- und Kontrollgruppe wurde mit Hilfe des tTests durchgeführt. Die Darstellung der Daten erfolgte in Scatterdiagrammen mit Hilfe von Regressionsgeraden und Mittelwertlinien. Für die Ergebnisse wurde ein Signifikanzniveau von p = 0,05 festgelegt. p ≤ 0,05 gilt als schwach signifikantes, p ≤ 0,01 als signifikantes und p ≤ 0,001 als hoch signifikantes Ergebnis. p > 0,05 gilt als nicht signifikant. 39 4 Ergebnisse Im Sinne einer vergleichenden Querschnittsstudie wurden absolute Zellzahlen regulatorischer T-Zellen verschiedenaltriger gesunder und an atopischer Dermatitis erkrankter Probanden durchflusszytometrisch bestimmt und altersabhängige Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen analysiert. Hierbei wurden folgende Populationen regulatorischer T-Zellen berücksichtigt: CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische TZellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische TZellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like regulatorische T-Zellen. Zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und Interpretation der absoluten sowie altersabhängigen Anzahl regulatorischer T-Zellen wurden verschiedene Leukozytensubpopulationen per Differentialblutbild und Durchflusszytometrie bestimmt. Diese werden in 4.3 beschrieben. 40 4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit atopischer Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als Gesunde Der Vergleich beider Probandengruppen ergab in jeder Subpopulation regulatorischer T-Zellen eine höhere Anzahl Zellen bei den an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen. Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren wurde eine deutlich höhere Zellzahl bei Probanden mit atopischer Dermatitis beobachtet (vgl. Abbildung 18, Seite 49). Besonders hervorzuheben ist der anzählige Unterschied in der Population der CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen. Hier liegt die Anzahl jener Zellen von Patienten mit atopischer Dermatitis mit einem Signifikanzniveau von 0.0014 signifikant höher als die der gesunden Kontrollgruppe. Schwach signifikant mit einem Signifkanzniveau von 0.0207 stellt sich der Unterschied in der Anzahl der CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorischen T-Zellen zwischen den Probandengruppen dar. Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen beider Probandengruppen wurde mit Hilfe des t-Tests durchgeführt. Waagerechte Linien in nachfolgenden Diagrammen stellen den Mittelwert der Zellzahl jener Probandengruppe dar. 41 Abbildung 16: Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen (CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+ naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like) regulatorischer T-Zellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen jeweils höhere Anzahlen regulatorischer T-Zellen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem Zellzahlniveau. 42 4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen: Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like regulatorischen TZellen Die Subpopulationen regulatorischer T-Zellen Gesunder und an atopischer Dermatitis erkrankter Patienten zeigen keinen signifikanten Unterschied in der altersabhängigen Veränderung der Zellzahl. Die nahezu gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen werden mit Hilfe von Regressionsgeraden Insbesondere im in nachfolgenden Altersintervall 0-10 Scatterdiagrammen Jahre sind verdeutlicht. verhältnismäßige Übereinstimmungen zu entdecken. CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische TZellen sowie CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorische T-Zellen weisen in beiden Probandengruppen einen Abfall der Zellzahl im Laufe des Alters auf. Statistisch signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0011 bei Gesunden und von 0.0086 bei an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden ist hierbei der Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen. CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorische T-Zellen unterliegen in beiden Probandengruppen einem Anstieg (nicht signifikant) der Zellzahl im Laufe des Alters. 43 AD Kontrollen Abbildung 17: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen. Verringerung der Anzahl von CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+ und CD4+CD25+CD45RA+ naive-like + + regulatorischen T-Zellen; Zuwachs von CD4 CD25 CD45RA memory-like regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen (Links: Gruppe atopischer Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe). Zusatzbeobachtung: In den ersten vier Lebensjahren weisen Patienten mit atopischer Dermatitis deutlich höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf. 44 4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer Dermatitis erkrankter Kinder Das vorliegende Kapitel beschreibt Ergebnisse von Leukozyten- subpopulationen, die zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und Interpretation der Ergebnisse regulatorischer T-Zellen genutzt wurden. Die Ergebnisse der Leukozytensubpopulationen stimmen mit bestehenden Normwerten überein (Plenert W. et Heine W., 1984; Comans-Bitter W.M. et al., 1997; Shearer W.T. et al., 2003; Vitelli-Avelar D.M. et al., 2005; Schauer U. et al., 1991; Sullivan K.E. et al., 2002). 4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten In der gesunden Kontrollgruppe sowie in der Gruppe der Patienten mit atopischer Dermatitis ist ein Abfall der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären Zellen sowie von Lymphozyten im Laufe des Alters zu verzeichnen. Statistisch hoch signifikant mit einem Signifikanzniveau < 0.0001 verringert sich die Anzahl der mononukleären Zellen und der Lymphozyten altersabhängig in der Gruppe der gesunden Probanden. 45 AD Kontrollen Abbildung 18: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten in beiden Probandengruppen. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe 46 Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der Leukozyten, der mononukleären Zellen und der Lymphozyten minimal höhere Zellzahlen (nicht signifikant) gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf. Abbildung 19: Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem Zellzahlniveau. 47 4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen Im direkten Vergleich beider Probandengruppen ist ein Abfall der Zellzahl von CD4+ T-Helferzellen und von CD4+CD45RA+ naiven T-Helferzellen in beiden Probandengruppen zu verzeichnen. Der Abfall der naiven T-Helferzellen stellt sich hierbei bei Gesunden mit einem Signifikanzniveau von 0.0036 und bei an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden mit einem Signifikanzniveau von 0.0017 statistisch signifikant dar. Die CD4+CD45RA- Memory T-Zellen folgen in der gesunden Kontollgruppe signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0038 einer altersabhängigen Zunahme der Zellzahl. In der Gruppe der an atopischer Dermatitis leidenden Patienten ist ein Abfall der Zellzahl zu beobachten. Dieser ist jedoch mit einem Signifikanzniveau von 0.3582 statistisch nicht signifikant. 48 AD Kontrollen Abbildung 20: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von CD4+ T-Helferzellen und CD4+CD45RA+ naiven T+ Helferzellen. Zunahme der CD4 CD45RA Memory T-Zellen bei Gesunden, Abnahme bei Patienten mit atopischer Dermatitis. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe 49 Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der CD4+, der CD4+CD45RA+ (naiven) und der CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen höhere Zellzahlen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf. Statistisch schwach signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0274 stellt sich der Unterschied in der Population der naiven T-Helferzellen dar. Abbildung 21: Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+, CD4+CD45RA+ (naiven) und CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem Zellzahlniveau. 50 5 Diskussion Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die absolute Anzahl regulatorischer TZellen mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zu bestimmen und die altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen in beiden Probandengruppen vergleichend zu analysieren. Dabei wurden folgende Populationen berücksichtigt: CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische TZellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische TZellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like regulatorische T-Zellen. In Bezug auf die altersabhängigen Veränderungen wurde der Schwerpunkt besonders auf die Populationen der naive-like und der memory-like regulatorischen T-Zellen gelegt. 5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis: geringere Funktion - kompensatorische Erhöhung der Zellzahl?! Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen ergab in jedem Fall eine höhere Zellzahl regulatorischer T-Zellen bei den an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden. Für das Kindesalter werden mit der vorliegenden Studie erstmalig höhere Zellzahlergebnisse regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis veröffentlicht. An Erwachsenen wurde die Anzahl CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis erstmalig von Ou et al. im Jahr 2004 untersucht. Auch hier fand sich bei Patienten mit atopischer Dematitis im 51 Gegensatz zu den gesunden Kontrollen eine signifikant höhere Anzahl von regulatorischen T-Zellen (Ou L.S. et al., 2004). Die atopische Dermatitis als eine Erkrankung mit autoimmunen Reaktionen würde jedoch primär niedrigere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen erwarten lassen, durch die es zu einer Störung der Immunhomöostase und damit zu einem Ausbruch der atopischen Dermatitis kommt. So wie bei Patienten mit dem Krankheitsbild IPEX, bei denen aufgrund eines Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine natürlich vorkommenden regulatorischen T-Zellen zu finden sind und die daraus folgend an einer schweren Immundefizienz, begleitet von einer atopischen Dermatitis, leiden (Ochs H.D. et al., 2005 ;Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006), könnte bei Patienten mit einer atopischen Dermatits die atopische Dermatitis als ein Ausdruck der gestörten Immunhomöostase verstanden werden. Unsere Ergebnisse, die bei Patienten mit atopischer Dermatitis höhere Anzahlen regulatorischer T-Zellen beschreiben, widersprechen der Erwartung primär niedrigerer Zellzahlen. Als ein Interpretationsansatz der höheren Zellzahlergebnisse kann die Funktion der regulatorischen T-Zellen in Frage gestellt werden. Eine verminderte Funktion regulatorischer T-Zellen könnte erstens zu einer kompensatorischen Erhöhung der Zellzahl führen und würde zweitens eine Möglichkeit der Entstehung bzw. des Ausbruchs einer atopischen Dermatitis bei Kindern und Jugendlichen erklären. Erstmalig 2008 konnten Smith et al. bei Kindern mit einer Hühnereiallergie, die in 80% der Fälle von einer atopischen Dermatitis begleitet wurde, eine verminderte Funktion von regulatorischen T-Zellen nachweisen. Der Nachweis erfolgte durch die verminderte Unterdrückung von Zytokinantworten bei Atopikern im Gegensatz zu Gesunden nach Kokultivierung von Effektorzellen mit regulatorischen T-Zellen (Smith M. et al., 2008). 52 Mit diesem Beweis der verminderten Funktion regulatorischer T-Zellen bei atopischen Dermatitikern stellt sich die Frage, wie diese Funktionsminderung ausgeglichen werden kann, um insgesamt ein hohes Funktionsniveau der Zellen zu erreichen. Eine Antwort könnte die kompensatorische Erhöhung der Zellzahl sein. Der oben beschriebene Zusammenhang zwischen höheren Zellzahlen und verminderter Funktion regulatorischer T-Zellen kann auch noch anhand einer anderen Beobachtung diskutiert werden: Bei älteren Menschen (70.-90. Lebensjahr) wurden höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen beschrieben als bei jungen Menschen (20.-30. Lebensjahr) (Gregg R. et al., 2005). Angenommen diese Zellen seien in ihrer Funktion unbeeinträchtigt, so könnten regulatorische T-Zellen gemäß ihrer normalen Funktion hoch effektiv autoimmune Prozesse unterdrücken und immunologische Reaktionen kontrollieren. Hieraus wäre auf eine hoch effektive Kontrolle prinzipiell immunologischer Reaktionen und damit auf eine erfolgreiche Prävention von Autoimmunkrankheiten zu schließen. Entgegen dieser Schlussfolgerung erkranken ältere Menschen jedoch häufiger an Autoimmunkrankheiten, chronischen Infektionen und Tumoren (Dejaco C. et al., 2006). Es ist daher anzunehmen, dass regulatorische T-Zellen auch bei älteren Menschen weniger funktional sind. Die Funktionsminderung führt zu der Notwendigkeit einer erhöhten Prävalenz von regulatorischen T-Zellen, d.h. zu einer kompensatorischen Zellzahlerhöhung, um das immunologische System auf einem entsprechendem Funktionsniveau aufrecht zu erhalten (Dejaco C. et al., 2006). Kombiniert aus den Beobachtungen von Smith et al. und Dejaco et al. kann parallel in der vorliegenden Studie für Patienten mit einer atopischen Dermatitis eine verminderte Funktion regulatorischer T-Zellen und eine daraus folgende Zellzahlerhöhung angenommen werden. Die kompensatorische Hyperplasie der Anzahl regulatorischer T-Zellen könnte als Ausdruck des Versuchs der Aufrechterhaltung eines hohen Funktionsniveaus der immunologischen Kontrolle bei Patienten mit atopischer Dermatitis verstanden werden. 53 Wie genau allerdings regulatorische T-Zellen an der immunologischen Kontrolle der atopischen Dermatitis beteiligt sind, ist bisher noch nicht erforscht. Bekannte Effektormechanismen, wie die Interleukin-10 Produktion, die TGF-β Produktion und der Zell-Zell Kontakt (Bacchetta R. et al., 2007; Buckner J.H. et al., 2004) sind von zunehmendem Interesse. Die Entdeckung, dass zum Beispiel die IL-10 Produktion regulatorischer T-Zellen allergenspezifische Effektorzellen unterdrückt (Verhagen J. et al., 2006), stellt nur den Anfangspunkt der Quantifizierung regulatorischer Funktionen dar. Eine weitere Aufklärung wird die Entwicklung von Immuntherapien ermöglichen. 5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von memory-like regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und periphere Expansion In der vorliegenden Studie wurde in den Populationen der CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen, der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen und der CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen bei Gesunden sowie bei Patienten mit atopischer Dermatitis ein altersabhängiger Abfall der Zellzahl beobachtet. Insbesondere die Abnahme der Anzahl von naive-like regulatorischen T-Zellen stellte sich hierbei als statistisch signifikant heraus. Umgekehrt konnte in der Population der CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen ein Anstieg der Zellzahl im Laufe des Alters beobachtet werden. Bei gesunden Erwachsenen wurde die altersabhängige Veränderung der Anzahl naive-like und memory-like regulatorischer T-Zellen erstmals 2005 von Seddiki et al. und Valmori et al. untersucht und prozentual beschrieben. In ihren Studien nahm parallel zur Abnahme der CD4+ Zellen die Anzahl der naive-like CD4+CD25+CD45RA+ regulatorischen T-Zellen statistisch signifikant mit dem Alter ab (Seddiki N. et al., 2006; Valmori D. et al., 2005). Umgekehrt nahm gleichzeitig die Anzahl der memory-like CD4+CD25+CD45RA- regulatorischen T-Zellen zu (Valmori D. et al., 2005). 54 Erstmals für gesunde Kinder und Jugendliche konnten mit der vorliegenden Studie Veränderungen der Zellzahlen naiver und memory-like regulatorischer TZellen beschrieben werden. Diese Ergebnisse stimmen in der Beobachtung der altersabhängigen Abnahme der Zellzahl naive-like regulatorischer T-Zellen und der Zunahme memory-like regulatorischer T-Zellen mit den Studien von Seddiki et al. und Valmori et al. überein. Die vorliegende Studie kann demnach mit ihren Ergebnissen an die Studien von Seddki et al. und Valmori et al. anknüpfen, die Studien um Ergebnisse altersabhängiger Zellzahlveränderungen naiver und memory-like regulatorischer T-Zellen im Zeitraum der Geburt bis zum 18. Lebensjahr ergänzen und darüberhinaus Auskunft über absolute Zellzahlen der Subpopulationen regulatorischer T-Zellen geben. Sie kann zusammen mit den Studien von Seddiki et al. und Valmori et al. als Ausgangspunkt für die Erstellung von Normwerten für Subpopulationen regulatorischer T-Zellen genutzt werden. Im Rahmen der vorliegenden Studie dienen unsere Ergebnisse der altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen gesunder Probanden als Vergleichsgrundlage für gewonnene Ergebnisse der Patienten mit atopischer Dermatitis. Die hier erstmalig beschriebenen altersabhängigen Veränderungen der Anzahl naive-like und der memory-like regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis verlaufen gerade in den ersten zehn Lebensjahren identisch mit den Veränderungen der Zellzahlen in der gesunden Kontrollgruppe, d.h. der Abnahme der naive-like und der Zunahme der memorylike regulatorischen T-Zellen. Diese gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen verweisen auf einen übergeordneten Zusammenhang, der für Gesunde sowie Patienten mit atopischer Dermatitis gleichermaßen Ausschlag gebend zu sein scheint: die Thymusinvolution und periphere Expansion. 55 Das Altern ist verbunden mit der progressiven Involution des Thymus. Diese äußert sich in einem signifikanten Verlust der Fähigkeit des Thymus, neue TZellen zu generieren und zu exportieren. Begleitend zur reduzierten Produktion naiver nicht-regulatorischer T-Zellen ist anzunehmen, dass sich auch der thymische Output an naiven regulatorischen T-Zellen verringert (Dejaco C. et al., 2006; Gregg R. et al., 2005). Der signifikante altersabhängige Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen kann demnach in Beziehung zur Thymusinvolution gesetzt werden. Um den thymischen Ausfall zu kompensieren, müssten frühzeitig alternative Wege der Generierung regulatorischer T-Zellen zur Aufrechterhaltung eines suffizienten Pools von regulatorischen T-Zellen initiiert werden (Dejaco C., 2006). Lange war nicht klar, wie der Pool regulatorischer T-Zellen mit der Tendenz der Zellen zu Inaktivität, geringer Proliferationskapazität und zu Apoptose effizient aufrechterhalten werden konnte. Akbar et al. entwarfen erstmals ein Modell der peripheren Entstehung regulatorischer T-Zellen. Die regulatorischen T-Zellen schienen sich demnach in der Peripherie aus dem Memory T-Zell-Pool zu entwickeln (Akbar A.N. et al., 2003). Dieses Modell konnte von Vukmanovic-Stejic et al. bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich eine gewisse Anzahl von regulatorischen TZellen, die phänotypisch mit den memory-like regulatorischen T-Zellen übereinstimmt, aus schnell-teilenden, hochdifferenzierten Memory CD4+ TZellen entwickelt (Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006). Memory CD4+ T-Zellen weisen eine periphere Expansion der Zellzahl im Laufe des Alters auf (Gregg R. et al., 2005). Da sich memory-like regulatorische TZellen wie oben beschrieben aus Memory CD4+ T-Zellen entwickeln (Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006), ist auch im Pool der memory-like regulatorischen T-Zellen eine Expansion und damit altersabhängigen Zunahme der Zellzahl denkbar. Diese Theorie erklärt die Zunahme der memory-like regulatorischen T-Zellen in der vorliegenden Studie. 56 Es kann daher angenommen werden, dass die memory-like regulatorischen TZellen den suffizienten Pool regulatorischer T-Zellen im Alter nach der Thymusinvolution und damit die periphere Immuntoleranz aufrechterhalten. Memory-like regulatorische T-Zellen sind vermutlich, genau wie Memory TZellen in der Lage, antigenspezifische Immunantworten gegen ein bekanntes Antigen auch nach Jahren abzurufen und damit vor Autoimmunität und immunologischen Fehlregulationen zu schützen. 5.3 Ausblick In der vorliegenden Pilotstudie wurde im Sinne der Grundlagenforschung erstmalig die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen vergleichend bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht. Für Patienten mit atopischer Dermatitis werden hier demnach erstmalig Ergebnisse über die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der absoluten Anzahl von regulatorischen T-Zellen im Kindes- und Jugendalter veröffentlicht. Diese Ergebnisse können, genau wie die erstmalig veröffentlichten Ergebnisse der regulatorischen T-Zellen bei Gesunden, als grundlegende Vergleichsdaten für nachfolgende Studien genutzt werden. Sie können zusammenfassend als orientierende Richtwerte in der Erstellung von Normwerten für Subpopulationen regulatorischer T-Zellen gelten. Als eine wertvolle Zusatzbeobachtung stellte sich in der vorliegenden Studie die deutlich höhere Anzahl regulatorischer T-Zellen von Patienten mit atopischer Dermatitis in den ersten vier Lebensjahren heraus. Als ein Interpretationsansatz dieser höheren Zellzahlen könnte eine reaktive Hochregulierung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei hoher entzündlicher Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten Lebensjahren gelten. 57 Diese Annahme stützt sich auf den durch Caramalho et al. erbrachten Beweis, dass die Proliferation regulatorischer T-Zellen durch Exposition der Zellen mit proinflammatorischen Bakterienprodukten hochreguliert wird. Durch Auslösung des Entzündungsreizes durch Interleukin-2 und Lipopolysachariden kam es hierbei außerdem zu einer 10fach erhöhten Supressoraktivität von regulatorischen T-Zellen (Caramalho I. et al., 2003). Parallel zu den Beobachtungen von Caramalho et al. kann in unserer Studie die gesicherte hohe entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten zwei Lebensjahren (Turner J.D. et al., 2006) als auslösender Reiz für die Proliferation regulatorischer T-Zellen verantwortlich gemacht werden. Die hohe entzündliche Aktivität wird durch verstärkte Infiltration von TEffektorzellen in die Epidermis aufrecht erhalten und weiter gesteigert (Verhagen J. et al., 2006), sodass angenommen werden, dass dieser Entzündungsreiz, verglichen mit der Stimulation mit proinflammatorischen Bakterienprodukten bei Caramalho et al., eine bis zu 10fach erhöhte Supressoraktivität regulatorischer T-Zellen auslöst. Hohe Anzahlen regulatorischer T-Zellen mit gesteigerter Suppressoraktivität (Caramalho I. et al., 2003) könnten zu einer effektiven Unterdrückung von Effektorzellen führen und damit die Inflammation eindämmen. Zusätzlich könnte eine Toleranzentwicklung von Effektorzellen gegenüber regulatorischen TZellen zu einer Abschwächung des Entzündungsreizes und einer vereinfachten Eindämmung der Inflammation führen. Die regulatorischen T-Zellen von Atopikern weisen zwar eine herabgesetzte Aktivität auf, aber ihre erhöhte Anzahl könnte sich klinisch in einer deutlichen Besserung der atopischen Dermatitis äußern. Diese Besserung der atopischen Dermatitis, die auch als Selbstheilungstendenz bei primär hoher Entzündungsaktivität im frühen Kindesalter beschrieben wird, ist aus klinischer Erfahrung gut belegt. 58 Es stellt sich nun die Frage: Könnte demnach sogar eine stark erhöhte Zellzahl regulatorischer T-Zellen im Säuglings- und Kleinkindesalter ein prognostisch günstiges Zeichen für die Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis darstellen und damit als klinischer Prognoseparameter angewandt werden? Die Antwort auf diese Frage stellt zusammen mit der genaueren Erforschung der Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter eine interessante Forschungsperspektive dar. Durch genauere Untersuchungen von Hautläsionen, in denen zum Beispiel höhere Anzahlen und erhöhte Suppressoraktivitäten regulatorischer T-Zellen nachweisbar sein könnten, und durch gleichzeitige Beobachtung der klinischen entzündlichen Aktivität der atopischen Dermatitis, könnte im Rahmen einer Längsschnittstudie dieser These nachgegangen werden. Bedeutsam wäre insgesamt die Identifikation von Interaktionsmechanismen regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis, um die Pathogenese der atopischen Dermatitis immunologisch genauer definieren zu können. Die vorliegende Studie stellt mit der selbsterstellten zusammenfassenden Übersicht regulatorischer T-Zellen (siehe Abbildung 1, Seite 14) und den Ergebnissen der Zellzahlbeobachtungen einen Ausgangspunkt für die Erforschung der Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis dar. 59 6 Literaturverzeichnis Akbar, A.N., Taams, L.S., Salmon, M., Vukmanovic-Stejic, M. (2003). 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Diabetes 53(7), 1911-1914 66 7 Anhang Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger Patienteninformation und Einwilligungserklärung zur Teilnahme an der klinischen Studie „Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern verschiedener Altersklassen“ Sehr geehrte Eltern! Neurodermitis, Allergien, Infektanfälligkeit und rheumatische Erkrankungen im Kindesalter stellen ein zunehmendes Problem dar. Die Universitäts-Kinderklinik Bochum beschäftigt sich intensiv mit diesen Erkrankungen und erforscht ihre Entstehungsweise. Grundlage ist die Kenntnis der normalen Reifung des Immunsystems. Sie können uns bei der weiteren Forschung helfen, indem Sie einwilligen, dass Ihrem Kind im Rahmen der Einleitung der Narkose einer geplanten Operation, im Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Vaterschaftstestung oder im Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Allergietestung bei der Neurodermitis zusätzlich 5 ml Blut für unsere Untersuchungen abgenommen werden. Die Teilnahme an dieser klinischen Studie ist freiwillig. Sie können die Teilnahme ablehnen, ohne dass Ihrem Kind hierdurch Nachteile in seiner medizinischen Betreuung entstehen. Klinische Studien sind notwendig, um verlässliche neue medizinische Forschungsergebnisse zu gewinnen. Unverzichtbare Voraussetzung für die Durchführung einer klinischen Studie ist jedoch, dass Sie Ihr Einverständnis zur Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie schriftlich erklären. Bitte 67 lesen Sie den folgenden Text als Ergänzung zum Informationsgespräch sorgfältig durch und zögern Sie nicht, Fragen zu stellen. Bitte unterschreiben Sie die Einwilligungserklärung nur - wenn Sie Art und Ablauf der klinischen Prüfung vollständig verstanden haben, - wenn Sie bereit sind, der Teilnahme Ihres Kindes zuzustimmen und - wenn Sie sich über Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Teilnehmers an dieser klinischen Studie im Klaren sind. 1. Was ist der Zweck der klinischen Studie? Von der Zusammensetzung der weißen Blutkörperchen hängt die Art der Immunantwort ab. Wir möchten untersuchen, wie die Zusammensetzung der weißen Blutkörperchen vom Alter und von einer bestehenden Erkrankung wie der Neurodermitis abhängt. Mit dieser klinischen Studie wird die Anzahl bestimmter Arten weißer Blutkörperchen, den sog. T-Regulatorzellen, den TMemoryzellen und den B-Zell Subpopulationen, Ihres Kindes bestimmt. Diese Arten weißer Blutkörperchen werden in einen Zusammenhang mit der Entstehung von Neurodermitis, Allergien und allgemeiner Abwehrschwäche gebracht. In dieser klinischen Studie werden Bezugswerte für diese Arten weißer Blutkörperchen erstellt. Dazu wird die Anzahl dieser Zellen im Blut gesunder Kinder untersucht. Des Weiteren wird die Anzahl der Zellen im Blut einer Vergleichsgruppe an Neurodermitis erkrankter Kinder untersucht. Diese Ergebnisse werden mit denen von gesunden Kindern verglichen. 2. Wie läuft die klinische Studie ab? Diese klinische Studie wird ausgehend von der Kinderklinik Bochum in Zusammenarbeit mit der kinderchirurgischen Praxis Dr. med. Standke, der orthopädisch-unfallchirurgischen und anästhesiologischen Abteilung des St. Josef-Hospital Bochum, sowie der Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik und der Neurodermitissprechstunde von Herrn Prof. Dr. med. Schauer der Kinderklinik Bochum durchgeführt. Es werden insgesamt ungefähr 70 Kinder daran teilnehmen. 68 Im Rahmen dieser klinischen Studie werden Ihrem Kind vor der anstehenden Operation oder vor der anstehenden Blutentnahme im Rahmen einer Vaterschaftstestung oder einer Allergietestung bei der Neurodermitis zusätzlich 5 ml Blut abgenommen. Diese Abnahme erfolgt durch einen venösen Zugang, der Ihrem Kind standardmäßig im Rahmen der Operationsvorbereitung oder im Rahmen der geplanten Blutabnahme gelegt wird, was bedeutet, dass keine zusätzliche Blutentnahme nötig wird. Die Blutentnahme wird von Ihrem betreuenden Arzt durchgeführt, mit dem Sie zusammen an der Studie teilnehmen. Nach allen Erfahrungen ist die Blutentnahme von bis zu 10 ml für Ihr Kind ungefährlich und unbedenklich. Es kann allerdings sein, dass ihr Kind die Blutentnahme als unangenehm, vielleicht sogar schmerzhaft empfindet und sich deshalb etwas wehren wird. Wenn Ihr betreuender Arzt den Eindruck hat, dass das geschehen könnte, wird bei der Blutentnahme zunächst eine örtlich betäubende Creme aufgetragen, sodass die Abnahme schmerzlos erfolgen kann. In sehr seltenen Fällen kann sich nach der Blutentnahme ein kleines Hämatom, also ein Bluterguss bilden, der sich aber ohne Zutun wieder zurückbilden wird. Das abgenommene Blut wird laborchemisch untersucht und die Anzahl der vorhandenen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen wird bestimmt. Die Teilnahme an dieser klinischen Studie beschränkt sich auf die einmalige Abnahme von 5 ml Blut. 3. Worin liegt der Nutzen einer Teilnahme an der klinischen Studie? Ein Nutzen besteht darin, dass Sie uns helfen, Bezugswerte und Vergleichswerte für die Anzahl der T-Regulatorzellen, der T-Memoryzellen und der B-Zell Subpopulationen zu erstellen. Diese Werte könnten in Zukunft zu neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen auf dem Gebiet der Immunologie führen. Damit kann Kindern, die an Immundefektkrankheiten wie z.B. Neurodermitis, Allergien, allgemeiner Abwehrschwäche leiden, zu neuen Therapiemöglichkeiten verholfen werden. 69 Es ist nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser klinischen Studie einen Nachteil haben wird. Es ist auch nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser klinischen Studie einen direkten Nutzen haben wird. 4. Gibt es Risiken, Beschwerden und Begleiterscheinungen? Es bestehen keine zusätzlichen Risiken. 5. Zusätzliche Einnahme von Arzneimitteln? Es sollten keine Arzneimittel eingenommen werden, die positiv oder negativ auf die Stimulierung bzw. Unterdrückung des Immunsystems wirken. 6. In welcher Weise werden die im Rahmen dieser klinischen Prüfung gesammelten Daten verwendet? Sofern gesetzlich nicht etwas anderes vorgesehen ist, haben nur die Doktorandin, ihr Betreuer und deren Mitarbeiter Zugang zu den vertraulichen Daten, in denen Sie und Ihr Kind namentlich genannt werden. Diese Personen unterliegen der Schweigepflicht. 7. Entstehen für die Teilnehmer Kosten? Gibt es einen Kostenersatz oder eine Vergütung? Durch die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie entstehen für Sie keine zusätzlichen Kosten. Für die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie erhalten Sie keine Vergütung. 70 8. Möglichkeit zur Diskussion weiterer Fragen Für weitere Fragen im Zusammenhang mit dieser klinischen Studie stehen Ihnen Ihre Doktorandin und ihr Betreuer gern zur Verfügung. Auch Fragen, die Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Patienten und Teilnehmer an dieser klinischen Studie betreffen, werden Ihnen gerne beantwortet. Name der Kontaktperson: Herr Prof. Dr. med. U. Schauer - 0234 / 509-2660 Name der Kontaktperson: Caroline Schmitz (Doktorandin) - 0176 / 21936426 ...................................................................................................... (Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten) ...................................................................................................... (Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden) 71 Einverständniserklärung Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................ Geburtsdatum: ............................. Blutabnahmeindikation: ............................... Ich erkläre mich bereit, mein Kind an der klinischen Studie „Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern verschiedener Altersklassen“ teilnehmen zu lassen. Ich bin von ........................................................................ ausführlich und verständlich über die mit der klinischen Studie verbundene Blutentnahme, mögliche Belastungen und Risiken, sowie über Wesen, Bedeutung und Tragweite der klinischen Studie aufgeklärt worden. Aufgetretene Fragen wurden mir verständlich und genügend beantwortet. Ich hatte ausreichend Zeit, mich zu entscheiden. Ich habe zur Zeit keine weiteren Fragen mehr. Ich behalte mir jedoch das Recht vor, die freiwillige Mitwirkung meines Kindes jederzeit zu beenden, ohne dass meinem Kind daraus Nachteile für die weitere medizinische Betreuung entstehen. Ich bin zugleich damit einverstanden, dass die im Rahmen dieser klinischen Studie ermittelten Daten meines Kindes aufgezeichnet werden. Beim Umgang mit den Daten werden die Bestimmungen des Datenschutzgesetzes beachtet. Eine Kopie dieser Patienteninformation und Einwilligungserklärung habe ich erhalten. Das Original verbleibt beim Prüfarzt. ...................................................................................................... (Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten) ...................................................................................................... (Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden) 72 Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger Patienteninformation und Einwilligungserklärung für Kinder zur Teilnahme an der klinischen Studie „Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern verschiedener Altersklassen“ Hallo! Bevor Du Dich entschließt, bei dieser klinischen Studie mitzumachen, wird Dir Dein Doktor genau erklären, warum diese Studie gemacht wird. Er wird Dir erzählen, was mit Dir passieren wird und was die guten und die schlechten Dinge an der Studie sind. Bitte sei nicht zu schüchtern, Deinem Doktor Fragen zu stellen. Du kannst ihn alles fragen, was Du nicht verstehst und er wird es Dir erklären. Warum wird diese Studie gemacht? Diese Studie wird gemacht, um zu sehen, wie viele weiße Blutkörperchen von einer bestimmten Art in Deinem Blut sind. In Deinem Blut gibt es rote und weiße Blutkörperchen. Uns interessieren die weißen Blutkörperchen. Einige von denen heißen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen und nicht jedes Kind hat gleich viele von ihnen. Wir wollen untersuchen, ob Du genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast, wie ein anderes Kind, das eine Krankheit hat, die Neurodermitis heißt. Wenn Du Neurodermitis hast schauen wir, ob Du genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast wie ein ganz gesundes Kind. 73 Was wird Dir während der Studie passieren? Wenn Du einverstanden bist, nimmt der Doktor Dir ein bisschen Blut ab. Dazu muss er Dich mit einer dünnen Nadel einmal kurz pieksen. Wenn Du möchtest, kannst Du vorher ein Pflaster bekommen, dann spürst Du fast nichts von dem Pieks. Ganz selten mal kannst Du einen kleinen blauen Fleck an der Stelle bekommen, wo der Doktor das Blut abgenommen hat. Die Abnahme von bis zu 10 ml Blut ist ungefährlich für Dich. Was sind die schlechten Dinge an der Studie? Die Blutabnahme kann etwas weh tun, aber nur für eine kurze Zeit. Es kann auch passieren, dass Du einen Bluterguss bekommst oder eine Schwellung, die aber schnell wieder weg geht. Was sind die guten Dinge an der Studie? Gut ist, dass Du uns hilfst ein bisschen mehr über diese weißen Blutkörperchen zu erfahren. Vielleicht kann dann einmal Kindern, die diese Krankheit Neurodermitis haben, besser geholfen werden. Kannst Du selber entscheiden, ob Du an der Studie teilnimmst? Du musst nicht an der klinischen Studie teilnehmen, wenn Du das nicht möchtest. Selbst wenn Du jetzt ja sagst, kannst Du immer auch nachdem die Studie begonnen hat Deine Meinung ändern und aufhören. Niemand wird auf Dich böse sein und Dein Doktor würde sich auch dann noch weiter um Dich kümmern. 74 Einverständniserklärung Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................ Geburtsdatum: ........................ Blutabnahmegrund: ............................................. Ich war anwesend, als .…………………………………. dieses Formular gelesen hat oder vorgelesen bekam und seine / ihre mündliche Einwilligung gab. ...................................................................................................... (Datum, Name und Unterschrift des Kindes) ............................................................................................................................. (Datum, Name und Unterschrift der Person, die das Aufklärungsgespräch geführt hat) 75 Danksagung Mein Dank gilt... ... allen Patienten und gesunden Kindern, die an meiner Studie teilgenommen haben. ... im Besonderen meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. med. U. Schauer für die Ermöglichung und Betreuung dieser Arbeit. Er stand mir jederzeit mit Rat, konstruktiver Kritik und Geduld zur Seite. ... Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die Einführung in die Laborarbeit und den erheblichen Beitrag zum Gelingen meiner Doktorarbeit. ... Herrn Dr. med. M. Standke, Frau Wahlkamp, Herrn Professor Dr. med. Schleberger in Gedenken, Herrn Dr. med. J. Möllers und Mitwirkenden der Vaterschaftssprechstunde in der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum für die Unterstützung bei der Sammlung der Blutproben. … meinen lieben Eltern, die mir das Studium der Humanmedizin ermöglicht haben. … meiner Mama, die mir in jeder Hisicht den Rücken frei gehalten und die mich besonders in der Endphase meiner Arbeit liebevoll aufgemuntert und stets motiviert hat. ... meinem Papa und meiner Schwester Anne, die mit hohem Interesse vor allem meinem Diskussionsteil gefolgt sind und mich - obwohl fachfremd - sowohl gedanklich als auch tatkräftig durch geduldiges Zuhören und Korrekturen an meiner Arbeit unterstützt haben. ... meinem lieben Freund Stephan, der mir jederzeit zur Seite stand, mich stets mit wertvollen Ratschlägen unterstützt hat und mir immer wieder Kraft gegeben hat. … meinen Freunden, die mir durch liebevolle Nachfragen und gegenseitige Motivation halfen, das Ziel nicht aus dem Auge zu verlieren. LEBENSLAUF PERSÖNLICHE DATEN Name Caroline Doris Schmitz Geburtsort Emsbüren Familienstand ledig Konfession römisch-katholisch SCHULAUSBILDUNG 08/1988 – 06/1990 Keplerschule Korb, Grundschule 08/1990 – 06/1992 Gertrudenschule Rheine, Grundschule 08/1992 – 06/2001 Gymnasium Dionysianum Rheine 06/2001 Allgemeine Hochschulreife – Abitur STUDIUM 10/2001 – 08/2003 Vorklinisches Studium der Humanmedizin Ruhr-Universität Bochum 08/2003 Ärztliche Vorprüfung – Physikum 09/2003 – 08/2006 Klinisches Studium der Humanmedizin Ruhr-Universität Bochum 08/2006 – 07/2007 Praktisches Jahr 1.Tertial: Chirurgie, Kalix sjukhus, Lehrkrankenhaus der Universität Umeå, Schweden 2.Tertial: Innere Medizin, St. Josef-Hospital, Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum 3.Tertial: Pädiatrie, Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital, Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum 05/2008 2. Ärztliche Prüfung PROMOTION 06/2005 – 09/2008 „Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen“ Prof. Dr. med. Uwe Schauer Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital, Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
