Zelluläre Rezeptoren des Kaposi-Sarkom assoziierten Herpesvirus
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Zelluläre Rezeptoren des Kaposi-Sarkom assoziierten Herpesvirus Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Alexander Hahn aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 11. November 2009 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Uwe Sonnewald I Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung...........................................................................................................................1 2 Summary..........................................................................................................................................2 3 Einleitung.........................................................................................................................................3 3.1. Kaposi-Sarkom assoziiertes Herpesvirus / KSHV / Humanes Herpesvirus 8..........................3 3.2. KSHV-assoziierte Pathogenese.................................................................................................3 3.3. KSHV-Entry in die Wirtszelle..................................................................................................4 3.4. KSHV Hüllproteine – Ein Überblick........................................................................................7 3.5. Zielsetzung dieser Dissertation.................................................................................................8 4 Material und Methoden..................................................................................................................9 4.1. Rekombinante DNA-Methoden................................................................................................9 4.2. Zellkulturmethoden.................................................................................................................12 4.3. Rekombinante Proteine und Reinigung..................................................................................13 4.4. Proteinnachweistechniken......................................................................................................14 4.5. Affinitätstechniken..................................................................................................................16 4.6. Massenspektrometrie..............................................................................................................17 4.7. Virologische Methoden...........................................................................................................17 5 Ergebnisse......................................................................................................................................20 5.1. FLJ40722 ist ein neuartiger zellulärer Rezeptor für das KSHV Glykoprotein K8.1..............20 5.1.1. Identifikation von FLJ40722 als zellulärer Interaktionspartner von K8.1......................20 5.1.2. Funktionelle Bedeutung von FLJ40722 bei der KSHV-Infektion..................................23 5.1.3. FLJ40722 wird auf der Zelloberfläche exprimiert..........................................................26 5.1.4. Expressionsmuster von FLJ40722 in verschiedenen Zelllinien......................................27 5.2. Glykoproteine gH und gL: Glykoproteinreifung und Rezeptorbindung................................28 5.2.1. Prozessierung, Interaktion und Lokalisation von Glykoprotein H und L.......................28 5.2.2. KSHV gH und gH/gL interagieren mit Heparansulfat....................................................33 5.2.3. Heparansulfat-Proteoglykane der Syndekanfamilie fungieren als zelluläre Rezeptoren für KSHV gH und gH/gL..........................................................................................................35 5.2.4. Expression von gH und gL in Zielzellen interferiert mit nachfolgender KSHV-Infektion ...................................................................................................................................................37 5.2.5. Existenz weiterer zellulärer Rezeptoren für KSHV gH/gL.............................................37 5.3. Die Ephrin A2 Rezeptor-Tyrosinkinase ist ein Rezeptor für KSHV gH/gL...........................38 5.3.1. Der KSHV gH/gL Komplex interagiert mit der Ektodomäne von EphA2.....................41 5.3.2. Überexpression von EphA2 verstärkt die KSHV-Infektion............................................43 5.3.3. Lösliches EphA2 inhibiert die KSHV-Infektion.............................................................44 5.3.4. KSHV Bindung erhöht den Phosphorylierungsstatus von EphA2..................................46 5.4. Ausblick: PML-Komponenten beeinflussen die Etablierung der KSHV Infektion................48 6 Diskussion.......................................................................................................................................50 6.1. Allgemein................................................................................................................................50 6.2. FLJ40722................................................................................................................................51 6.3. gH/gL......................................................................................................................................52 6.4. Heparansulfat-Proteoglykanbindung......................................................................................53 6.5. EphA2.....................................................................................................................................55 6.6. Abschließende Betrachtung....................................................................................................57 7 Anhang............................................................................................................................................64 7.1. Puffer und Lösungen...............................................................................................................64 7.2. Antikörper, Peptide und Sekundärdetektionsreagenzien........................................................64 II 7.3. Plasmide..................................................................................................................................66 7.4. Oligonukleotide......................................................................................................................69 7.5. Zelllinien.................................................................................................................................70 7.5.1. Zellkulturmedien.............................................................................................................72 8 Lebenslauf......................................................................................................................................73 9 Eigene Veröffentlichungen............................................................................................................74 10 Danksagung..................................................................................................................................75 1 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Das Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist ein humanpathogenes Gammaherpesvirus. Es ist mit dem Kaposi-Sarkom sowie mit zwei proliferativen B-Zellerkrankungen assoziiert, dem Primären Effusionslymphom (PEL) und der multizentrischen Castleman Erkrankung. Der Eintritt von KSHV in Wirtszellen ist bisher nur teilweise aufgeklärt und verstanden. Einigen zellulären Proteinen (xCT, Integrine, Heparansulfat-Proteoglykane, DC-SIGN) wurde bereits eine Rolle als Rezeptor bei der KSHV-Infektion zugeschrieben. Diese scheinen aber weder zwingend notwendig noch alleine ausreichend für die Infizierbarkeit von Zellen zu sein. Mit Ausnahme der Heparansulfat-Bindung, vor allem durch die Glykoproteine K8.1 und gB, sowie der Integrin-bindenden RGD-Sequenz in gB, ist wenig bekannt über die Interaktion der viralen Glykoproteine mit zellulären Rezeptoren. In dieser Dissertation wurden die Glykoproteine K8.1 sowie gH und gL näher untersucht, vor allem im Hinblick auf ihre Interaktion mit zellulären Rezeptoren und deren Einfluss auf die KSHV-Infektion. Mit dem in dieser Arbeit erstmals beschriebenen und als Membranprotein charakterisierten Protein FLJ40722 wurde für K8.1 durch Immunpräzipitation und Peptidmassenfingerabdruck ein zellulärer Rezeptor identifiziert. Überexpression von FLJ40722 erhöhte die Permissivität von murinen Fibroblasten für KSHV, während siRNAvermittelter Knock-Down der FLJ40722-Expression ebenso wie anti-FLJ40722-Seren die KSHV-Infektion negativ beeinflussten. Für die Glykoproteine H und L konnte gezeigt werden, dass gL ein durch gH peripher an der Membran verankertes Protein ist, das durch gH auf die Außenseite der Membran exportiert wird. Für gH wiederum konnte neben der Exportfunktion für gL noch eine von gL unabhängige, starke Interaktion mit HeparansulfatProteoglykanen, insbesondere aus der Familie der Syndekane, nachgewiesen werden. Expression von Syndekanen erhöhte dementsprechend auch die Permissivität für KSHV. Ebenfalls über Immunpräzipitation und Massenspektrometrie wurde für den Komplex aus gH und gL ein mit hoher Affinität erkannter Rezeptor identifiziert, die Ephrin Rezeptor-Tyrosinkinase A2 (EphA2). Überexpression von EphA2 steigerte die Permissivität für KSHV deutlich. Zudem konnte gezeigt werden, dass KSHV innerhalb weniger Minuten die Phosphorylierung von EphA2 induziert. Lösliches EphA2-Fc Fusionsprotein wurde als Rezeptor-Analogon rekombinant hergestellt und gereinigt. Dieses lösliche Rezeptorprotein inhibierte die KSHV-Infektion mit einer wirksamen Konzentration im sub-nanomolaren Bereich, ebenso wie die damit verbundene Phosphorylierung von EphA2. 2 Summary 2 Summary Kaposi's Sarcoma associated Herpesvirus (KSHV) is a human gamma-herpesvirus. It is causally associated with Kaposi's sarcoma and two B-cell proliferative disorders, Primary Effusion Lymphoma (PEL) and Multicentric Castleman Disease. KSHV entry into host cells is only partially understood. A number of receptors have been implicated (xCT, integrins, heparan sulfate proteoglycans, DC-SIGN), but these receptors are neither necessary nor sufficient for infection of most cells. With the exception of heparan sulfate binding by the glycoproteins K8.1, gB and KCP, as well as the integrin-binding RGD-motif in gB, little is known about the interaction of individual glycoproteins with cellular receptors. The previously uncharacterised protein FLJ40722, which was described in this work for the first time, was identified as a cellular receptor of K8.1 by immunoprecipitation and peptide mass fingerprinting. FLJ40722 was experimentally characterised as a membrane protein. Overexpression of FLJ40722 enhanced KSHV infection, whereas infection was inhibited by siRNA-mediated knock-down of FLJ40722 expression. Similar inhibition was observed with anti-sera directed against FLJ40722. For glycoproteins H and L, it could be shown that gL is a peripheral membrane protein that is exported and then tethered to the cell surface by gH. For gH, apart from the export of gL, a strong interaction with heparan sulfate proteoglycans, especially from the syndecan family, could be demonstrated. Correspondingly, expression of syndecans enhanced permissivity for KSHV. In addition, Ephrin A2 receptor tyrosine kinase (EphA2) was identified as a high-affinity receptor for the gH/gL complex, again by immunoprecipitation and mass spectrometry. Overexpression of EphA2 enhanced the permissivity for KSHV infection. Furthermore, KSHV was shown to induce phosphorylation of EphA2 within the first minutes of infection. Soluble EphA2-Fc fusion protein was recombinantly produced and purified. This soluble EphA2 receptor protein inhibited KSHV infection with high efficiency at an effective concentration in the subnanomolar range and KSHV-mediated activation of EphA2 was reverted by soluble EphA2-Fc. 3 Einleitung 3 Einleitung 3.1. Kaposi-Sarkom assoziiertes Herpesvirus / KSHV / Humanes Herpesvirus 8 Das humane Herpesvirus 8 wurde 1994 in Biopsien des Kaposi-Sarkoms (KS) entdeckt (1), nachdem schon im Jahr 1972 auf herpesvirusartige Partikel in KS-Proben hingewiesen worden war (2). Daher rührt auch der Name KSHV (Kaposi-Sarkom assoziiertes Herpesvirus), der im folgenden verwendet wird. KSHV ordnet sich verwandtschaftlich bezogen auf seine Nukleotidsequenz in die Familie der Gammaherpesviren ein. Die „nächstverwandten“ Viren sind das Rhesusrhadinovirus (RRV) und Herpesvirus saimiri (HVS), das am nächsten verwandte humane Virus ist das Epstein-Barr Virus (EBV) (3). KSHV hat im Laufe seiner Evolution eine relativ große Anzahl an Genen aus dem Wirtsgenom übernommen. Zudem besitzt es noch weitere Gene, die keine erkennbare Homologie zu Genen anderer Herpesviren aufweisen. Diese Gene werden in der gängigen Nomenklatur im Gegensatz zu den übrigen offenen Leserahmen als K-Gene geführt. Hierzu zählen sowohl offensichtlich aus dem Wirtsgenom stammende Gene (z.B. K2: virales Interleukin-6 Homolog, K13: virales FLIP Homolog) als auch solche, die einzigartig für KSHV sind (z.B. K8.1: virales Hüllprotein). Nach bisherigem Stand des Wissens kann davon ausgegangen werden, dass KSHV – wie alle anderen Herpesviren auch – nach der Primärinfektion eine lebenslange Latenz etabliert. Die Prävalenz von KSHV in der Bevölkerung scheint in den Industrienationen relativ niedrig zu sein. Je nach Methodik der Untersuchung werden oft unterschiedliche Ergebnisse publiziert. Es dürfte jedoch als sicher gelten, dass die Durchseuchung in den Industrienationen bei deutlich unter 10 % liegt (4). Ganz im Gegensatz hierzu ist KSHV auf dem afrikanischen Kontinent endemisch verbreitet (4). Die Seroprävalenz schwankt je nach Studie, liegt aber im Erwachsenenalter zumindest in Südafrika wohl im Bereich von knapp 50 % (5). Der Übertragungsweg für KSHV ist nach wie vor nicht vollständig geklärt (5). 3.2. KSHV-assoziierte Pathogenese Ähnlich wie EBV ist auch KSHV sowohl mit soliden Tumoren, dem KS, wie auch mit proliferativen B-Zell-Erkrankungen assoziiert. Im Unterschied zu EBV ist es mit KSHV bisher nicht gelungen, kultivierte B-Zellen zu transformieren. Eine direkte Transformation von Zellen in Kultur durch KSHV konnte bisher nicht gezeigt werden, allerdings können transformierende Effekte einzelner Gene (6) oder des ganzen Virus (7) auf Endothelzellen beob- 4 Einleitung achtet werden und es konnte in Tierversuchen durch Expression des vGPCR-Gens ein KS-artiger Phänotyp erzeugt werden (8). Auch treten KSHV-assoziierte Tumoren zumindest bei im genetischen Sinne kaukasischen Infizierten fast nur unter Immunsuppression (z.B. im Rahmen einer HIV-Infektion) oder sehr selten im fortgeschrittenen Lebensalter auf und dies wesentlich häufiger bei Männern (9). Eine Ausnahme stellt hier Afrika, aber auch der südliche Mittelmeerraum dar, da hier KS häufiger auch bei normalgesunden Individuen auftritt, sich im Mittelmeerraum aber im Allgemeinen als gutartiger Tumor darstellt (4). Die endemische Variante des KS hingegegen, die fast ausschließlich in Afrika vorkommt, ist eine aggressiv verlaufende Tumorerkrankung, die auch bei Kindern auftritt (9). Der kausale Zusammenhang zwischen KSHV-Infektion und dem Kaposi-Sarkom kann als gesichert gelten (10). Des Weiteren besteht eine eindeutige Assoziation von KSHV mit dem primären Effusionslymphom (11)(12), einer B-Zellerkrankung. Eine weitere mit KSHV assoziierte proliferative B-Zellerkrankung ist die Multizentrische Castleman Erkrankung (13). 3.3. KSHV-Entry in die Wirtszelle Entry von Herpesviren Am Beginn einer jeden Virusinfektion steht der Eintritt des Virus in die Wirtszelle, ein Prozess für den sich das englische Wort „Entry“ als Synonym durchgesetzt hat. Man kann diesen Prozess grob in zwei Teilabschnitte zerlegen, nämlich das Binden des Viruspartikels an die Zellmembran, englisch „Attachment“, und die darauf folgende Fusion (bei umhüllten Viren) der Virusmembran mit der Wirtszellmembran. Oft ist, so auch bei KSHV, dem Fusionsereignis noch ein endozytotischer Prozess vorangestellt (14), der aber wiederum nicht zwingend bei jedem Zelltyp notwendig ist. Beim prototypischen Herpesvirus, Herpes simplex (HSV), ist relativ viel über diese Prozesse bekannt, so erfolgt hier erst eine reversible Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (Attachment), gefolgt von Membranfusion nach Interaktion von zellulären Rezeptoren mit Glykoprotein D (gD) und B (gB) (15), was die Fusion einleitet (16). Auch hier ist wohl teilweise noch ein endozytotischer Schritt zwischengeschaltet (17). Nach derzeitigem Stand des Wissens sind bei HSV gD und gB entscheidend für die Bindung der Fusionsrezeptoren. Darauf folgend werden die bei allen Herpesviren konservierten Glykoproteine gB, gH und gL von gD rekrutiert und leiten die Fusion der Membranen ein, teilweise noch unter Beteiligung weiterer Rezeptoren, zum Beispiel für gB (15). Bei dieser rein mechanistischen Betrachtung darf nicht vergessen werden, dass die Membran einer Zelle das wohl wichtigste Kompartiment für das Übertra- 5 Einleitung gen und Integrieren von Informationen darstellt. Ein Großteil aller zellulären Signalkaskaden nimmt hier ihren Anfang und das Membranpotential ist eine der wichtigsten „Stellgrößen“ einer Zelle. Es ist somit nicht verwunderlich, dass zunehmend auch diese Signalprozesse in den Fokus der Forschung geraten. Es zeigt sich mehr und mehr, dass Viren hier durch das Anstoßen zellulärer Signalkaskaden die Zelle in eine für das Virus günstige Richtung lenken und eventuell auf den Replikationszyklus vorbereiten, so auch bei KSHV (18)(19). Entry von KSHV Für KSHV ist nicht wirklich bekannt, welche Zellen das Virus im Rahmen einer natürlichen Infektion im immunkompetenten Menschen befällt und in welchen Geweben und Zellen es Latenz etabliert. Das KSHV-Genom lässt sich in Leukozyten aus Blutproben nachweisen, und es können infizierte B-Zellen gefunden werden wie auch latent infizierte Zellen aus primären Effusionslymphomen (PEL-Zellen) einen von B-Zellen abstammenden Plasmazellphänotyp zeigen (20). Ebenso scheint festzustehen, dass die infizierten Zellen des KS endothelialen Ursprungs sind (21). Aufgrund dieser Befunde kann man festhalten, dass BLymphozyten und Endothelzellen zum Spektrum der KSHV infizierten Zellen gehören – ob diese wirklich das Hauptvirusreservoir und den Replikationsschwerpunkt darstellen, kann nur vermutet werden. Da eine Übertragung im Kindesalter über Speichel als wahrscheinlich gilt (4), liegt der Verdacht nahe, dass evtl. Speicheldrüsen oder die Mundschleimhaut für die Virusdissemination von Bedeutung sind. Die primäre Infektion des nächsten Wirts läuft dann vermutlich über ein Epithel, höchstwahrscheinlich die Mundschleimhaut, ab, während im Erwachsenenalter eventuell auch die Genital- und Analschleimhäute von Bedeutung sein dürften. Während Endothelzellen sich tatsächlich in Kultur sehr gut infizieren lassen und auch eine latente Infektion erlauben, sind alle bisher getesteten B-Zelllinien nur sehr ineffizient infizierbar. KSHV infiziert die meisten adhärenten Zelllinien hingegen deutlich effizienter (22). Bei der Definition des Zielzellspektrums spielen die von den viralen Oberflächenproteinen erkannten zellulären Rezeptoren eine herausragende Rolle. KSHV interagiert in der Attachment-Phase und vielleicht auch noch später mit Heparansulfat-Molekülen (23)(24). Ebenso werden virale Oberflächenproteine von C-Typ Lektinen erkannt (25). Eine prominente Rolle spielt auch eine Interaktion mit RGD-Motiv-bindenden Integrinen (26)(27). Als möglicher Fusionsrezeptor wurde CD98-xCT, ein Aminosäuretransportprotein, beschrieben (28). All diese bisher genannten Rezeptoren sind einerseits auf ei- 6 Einleitung nem sehr breiten Zellspektrum exprimiert und fehlen andererseits auf manchen infizierbaren Zellen (28)(22). Sie erklären den Zelltropismus von KSHV nur sehr unzureichend. Interessant ist auch, dass die viralen Oberflächenproteine wohl Membranfusion auslösen können (28), aber zum Beispiel Fibroblasten durch Endozytose infiziert werden (29). Bisher konnte noch von keinem dieser möglichen Rezeptoren gezeigt werden, dass er essentiell ist. Abbildung 1: Vereinfachtes Übersichtsschema zum Entry von KSHV. KSHV interagiert zunächst mit Heparansulfat-Proteoglykanen (HSPGs), gefolgt von Integrinen. Auf den ersten Attachment-Schritt und die Interaktion mit Integrinen folgt entweder direkte Membranfusion, vermutlich unter Beteiligung von xCT, oder ein endozytotischer Schritt und Membranfusion nach Ansäuerung des endozytotischen Vesikels. Beides hat dann die Freisetzung von Tegument und Kapsid ins Zytoplasma zur Folge. Das Schema ist in einigen Punkten vereinfacht. Der Aminosäuretransporter xCT ist in Wirklichkeit ein Dimer aus xCT und CD98. Ein mögliches Attachment über DC-SIGN ist hier nicht dargestellt. 3.4. KSHV Hüllproteine – Ein Überblick KSHV inkorporiert in seine Membranhülle eine Reihe von Glykoproteinen. Neben den durch die Familie der Herpesviren konservierten Glykoproteinen gB und gH/gL werden bei KSHV noch das Komplementkontrollprotein KCP und das für KSHV einzigartige Glykoprotein K8.1 in die Hülle eingebaut. KCP schützt das Virion wahrscheinlich vor komplement- 7 Einleitung vermittelter Lyse; zusätzlich bindet es Heparansulfat und ist so vermutlich am AttachmentProzess beteiligt (30). Glykoprotein B bindet ebenfalls Heparansulfat (31) und enthält ein RGD-Motiv, das eindeutig wichtig für die Infektion ist (26). Es interagiert mit verschiedenen RGD-bindenden Integrinen (27)(18). Des Weiteren darf aufgrund seiner Konserviertheit und dem Vorhandensein potentieller sogenannter fusogener Sequenzen angenommen werden, dass gB auch eine Rolle bei der Fusion spielt. Der beschriebene Fusionsrezeptor xCT kolokalisiert nach der Virusbindung mit gB und Integrinen und trägt hier möglicherweise zur virusinduzierten Signaltransduktion bei (32). K8.1 Glykoprotein K8.1 ist für KSHV einzigartig, da es keinerlei erkennbare Homologie zu anderen herpesviralen Glykoproteinen aufweist. Allerdings besteht eine gewisse Analogie zu HSV gD oder mehr noch zu EBV gp42, sowohl bezüglich der Größe als auch der Position im Genom. K8.1 ist das immunologisch dominante Antigen der KSHV-Hülle (33). Es ist außerdem auffällig stark glykosyliert. Es bindet mit einer Affinität im mikromolaren Bereich an Heparansulfat und ist so am Attachment beteiligt (24). Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass K8.1 zudem in der Lage ist, mit FLJ40722 zu interagieren. Es handelt sich hierbei um ein zelluläres Membranprotein, das bei der KSHV-Infektion verschiedener Zellen eine Rolle spielt. gH und gL Die Glykoproteine H und L sind bei allen Herpesviren konserviert. Erforscht sind sie bisher am besten bei HSV. Glykoprotein H bildet hier einen Komplex mit gL, wobei gL bei HSV sowohl für die korrekte Faltung wie auch die Oberflächenexpression von gH verantwortlich ist (34). Zudem wurde gezeigt, dass gH und gL Membranfusion bewirken können (35). Interessanterweise scheint bei HHV-6 gH/gL zusammen mit gQ bei der Bindung des Rezeptors CD46 beteiligt zu sein (36). In dieser Dissertation konnte nun gezeigt werden, dass KSHV gH unabhängig von gL mit Heparansulfat interagiert und des Weiteren zusammen mit gL den neuen zellulären KSHV-Rezeptor Ephrin Rezeptor-Tyrosinkinase A2 bindet. 8 Einleitung 3.5. Zielsetzung dieser Dissertation Über die ersten Schritte der Infektion mit KSHV ist noch wenig bekannt. Bei besser erforschten Herpesviren, vor allem Herpes simplex Virus, zeigte sich, dass eine ganze Reihe zellulärer Rezeptoren für die Infektion genutzt werden kann. Bei KSHV ist dagegen bisher nur bekannt, dass mehrere virale Glykoproteine an Glykosaminoglykane binden. Außerdem ist die Interaktion des Glykoproteins B mit Integrinen relativ gut belegt. Für den möglichen Fusionsrezeptor xCT fehlt noch der virale Bindungspartner. Bei Herpes simplex bindet z.B. alleine Glykoprotein D drei verschiedene Rezeptoren (37). Es ist daher zu vermuten, dass ein Großteil der zellulären Rezeptoren für KSHV noch nicht identifiziert worden ist. Zelluläre Rezeptoren eines Virus sind nicht nur von großem Interesse für die Biologie des Virus, da über die Rezeptoren zu einem großen Teil der Zelltropismus determiniert wird. Rezeptoren bilden auch einen Ansatzpunkt für therapeutische Intervention. Darüber hinaus zeigte sich gerade in letzter Zeit, dass bereits bei der Bindung eines Virus an dessen Rezeptor oft zelluläre Signalkaskaden beeinflusst werden, die für die Replikation und damit Pathogenese von Bedeutung sind. Bei dieser Arbeit steht daher die Identifikation zellulärer Interaktionspartner viraler Glykoproteine im Vordergrund. Diesbezüglich wurden die Glykoproteine K8.1 und gH/gL untersucht. Von K8.1 war lediglich bekannt, dass es eines der mit Heparansulfat interagierenden Proteine der Virushülle ist. Bindungspartner des konservierten Proteinkomplexes gH/gL oder von gH alleine sind bei KSHV und nahezu allen anderen Herpesviren nicht bekannt. Es war eine zentrale Hypothese dieser Arbeit, dass gH/gL im Unterschied zur gängigen Lehrmeinung an der Bindung zellulärer Rezeptoren beteiligt ist. 9 Material und Methoden 4 Material und Methoden 4.1. Rekombinante DNA-Methoden Isolierung von DNA DNA im größeren Maßstab wurde mit Hilfe des „High Pure Maxi“ (Invitrogen) Kits nach Angaben des Herstellers isoliert. DNA im analytischen Maßstab wurde nach der Methode der alkalischen Lyse (ohne Lysozym) mit anschließender Isopropanolfällung gewonnen (38). Isolierung von RNA Gesamtzelluläre RNA für Klonierungen oder Expressionsnachweis wurde mit Hilfe des „Nucleo Spin“ (Macherey und Nagel) Kits gewonnen. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Falls nicht gesondert beschrieben, wurden DNA-Fragmente durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mit dem „Expand High Fidelity“ PCR-System (Roche) gemäß den Angaben des Herstellers erzeugt. Analytische PCRs wurden mit dem „AmpliTaq“ System (New England Biolabs) gemäß den Angaben der Herstellers durchgeführt. Die Annealing-Temperatur wurde standardmäßig auf 58 °C gelegt. Wo dies keine zufriedenstellenden Resultate brachte oder die Sensitivität erhöht werden sollte, wurde die optimale Annealing-Temperatur mittels Temparaturgradient bestimmt. Es wurde ein Px2 Thermal Cycler der Firma ThermoElectron verwendet. Reverse Transkription cDNA wurde aus gesamtzellulärer RNA mittels reverser Transkription unter Zuhilfenahme des „SuperscriptII“ Kits von Invitrogen gewonnen. Die Reaktion wurde mit Hexanukleotiden zufälliger Sequenz nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Semiquantitative RT-PCR Die semiquantitative RT-PCR wurde in zwei Stufen durchgeführt. Zuerst wurde cDNA aus gesamtzellulärer RNA mittels reverser Transkription (SuperscriptII Kit; Invitrogen) gewonnen. Die Reaktion wurde mit Hexanukleotiden zufälliger Sequenzen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Anschließend erfolgte die Amplifikation der cDNA in einer semiquantitativen PCR. Hierbei wurden für jedes Primerpaar (Oligonukleotidpaar) die PCR-Be- 10 Material und Methoden dingungen so bestimmt, dass die cDNA noch im linearen Bereich der PCR Kurve amplifiziert wurde. Die PCR wurde wie oben beschrieben in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Quantitative RT-PCR Zur Quantifizierung von DNA wurde eine qRT-PCR unter Verwendung genspezifischer Primer und dem DNA-Farbstoff SYBR Green in einem ABI7500 Thermocycler (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Reaktion wurde wie folgt angesetzt: Rox-k Puffer (Invitrogen) 2 µl 10x Puffer II 3 µl MgCl2 (25 mM) 3 µl dNTP (2,5 mM, Bioline) 1 µl SYBR green (Invitrogen) 1 µl Oligonukleotid FW (20 µM) 0,5 µl Oligonukleotid Rev (20 µM) 0,5 µl Taq (NEB) 0,25 µl H2O Auffüllen auf 40 µl Tabelle 1: Zusammensetzung Quantitative PCR Zu dem Reaktionsmix wurden jeweils 10 µl der verdünnten DNA oder cDNA bzw. 10 µl der entsprechenden Standardverdünnung gegeben. Es wurden jeweils Zweifachbestimmungen der cDNA- und Standard-PCR-Produkte durchgeführt. 1x 95 °C 15 sec 45x 95 °C 10 sec 60 °C 35 sec 72 °C 30 sec 95 °C 15 sec 60 °C 20 sec 95 °C 15 sec 1x Tabelle 2: Programm Quantitative PCR Die Auswertung der qRT-PCT erfolgte mit Hilfe der 7000 System SDS Software (Applied Biosystems). 11 Material und Methoden Sequenzierung Sequenzierungen nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode nach Sanger wurden mit Vektor-spezifischen Oligonukleotiden oder bei längeren Insertionsfragmenten mit zusätzlichen internen Oligonukleotiden und dem „BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing“ Kit (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Bearbeitung der Sequenzrohdaten und Sequenzvergleich erfolgte mittels Phred Phrap Consed und Vector NTI (Informax). Restriktionsverdau Alle Restriktionsverdaue erfolgten mit Restriktionsendonukleasen der Hersteller New England Biolabs, Roche und Fermentas gemäß deren Angaben. Klonierungen Es wurde stets der zu exprimierende offene Leserahmen oder das gewünschte DNA-Fragment mittels PCR aus cDNA, genomischer DNA oder schon vorhandenen Plasmiden amplifiziert oder aus einem anderen Plasmid per Restriktionsverdau ausgeschnitten. Über die 5'-Enden der PCR-Primer wurden passende Restriktionsschnittstellen eingefügt wo nötig, zudem wurden stets zwei Nukleotide 5' der Schnittstellen angehängt, um optimale Aktivität der Restriktionsenzyme zu gewährleisten. Die Zielvektoren wurden ebenfalls mit den passenden Enzymen geschnitten. Beide Fragmente wurden präparativ über ein Agarosegel gereinigt („Pure Link“ Kit, Invitrogen), standardmäßig wurden hier ca. 5 µg eines Plasmids verdaut und eingesetzt oder ein PCR-Produkt. Es wurden dann jeweils zehnfacher molarer Überschuss an zu insertierendem DNA-Fragment mit ca. 200 ng Zielvektor (das resistenztragende Plasmid) gemeinsam durch Zugabe des mindestens fünffachen Volumens an kalten Ethanol gefällt (mindestens 30 min bei -80 °C gefolgt von 20 min Zentrifugation bei 4 °C und maximaler Umdrehungszahl). Ligation der Fragmente erfolgte 30 min bei Raumtemperatur mittels Takara Mix I (Takara) gemäß den Angaben des Herstellers. Das ligierte Plasmid wurde in CaCl2-kompetente E. coli der Stämme XL-1 blue oder DH5alpha transformiert (30 min Inkubation mit 50 µl Bakteriensuspension auf Eis, 2 min 42 °C, 30 min Schütteln bei 37° C nach Zugabe von 1 ml SOC-Medium). Selektion positiver Klone erfolgte durch Ausstreichen auf LB(Luria-Broth)-Agarplatten mit mit den entsprechenden Selektionsantibiotika. 12 Material und Methoden 4.2. Zellkulturmethoden Zellkultur Alle Zellen wurden bei 37 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit und 7 % CO2 gehalten. Suspensionszellen wurden durch Verdünnen in frischem Medium propagiert, typischerweise im Verhältnis 1:5 alle zwei Tage. 293T- und 293-Zellen wurden durch Abschütteln abgelöst, sedimentiert und anschließend im Verhältnis 1:3 bis 1:10 bezogen auf die Kulturfläche in frischem Medium neu ausgesät. Alle anderen adhärenten Zellen wurden durch kurze Behandlung mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und dann ebenso sedimentiert und neu ausgesät. HUVEC-TI wurden in speziellem EBM2-Medium (Lonza) auf zuvor mit 0,1 % Gelatinelösung für zwei Stunden beschichteten Schalen kultiviert. Transfektion Transfektionen wurden im kleinen Maßstab mit Lipofectamin und Plus-Reagenz (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierzu wurden 2 µg der jeweiligen DNA mit 2 µg Plus-Reagenz und 50 µl Optimem (Invitrogen) gemischt. Nach 15 min erfolgte Zugabe von 50 µl Optimem und 2 µl Lipofectamin. Nach weiteren 15 min wurden weitere 300 µl Optimem zugegeben. Der gesamte Ansatz wurde dann zu vorher in 600 µl Optimem gewaschenen Zellen in einer 12-Lochplatte gegeben. Die Zellen wurden über Nacht im Transfektionsmedium belassen; am nächsten Morgen erfolgte ein Medienwechsel auf das jeweiligen Zellkulturmedium. Stabil mit pEphA2mychis transfizierte Zellpopulationen wurden nach Transfektion durch dauerhafte Selektion mit 100 µg/ml Zeozin (Invitrogen) generiert. Für Transfektionen im großen Maßstab nach der Kalziumphosphatmethode wurden pro 10cm-Zellkulturschale jeweils 10 µg DNA vorgelegt und anschließend mit 500 µl 250 mM CaCl2 gemischt. Dann erfolgte Zugabe von 500 µl HBS-Puffer und erneutes Mischen. Der Transfektionsansatz wurde nach fünf Minuten Inkubation in die Kulturschale gegeben. In dieser wurde unmittelbar zuvor das Kulturmedium gegen 9 ml 293T-Medium mit 0,15 mM Chloroquin (Sigma) ausgetauscht. Nach 4 bis 14 Stunden wurde das Medium gegen normales Zellkulturmedium gewechselt. Die Transfektion von synthetischen siRNAs (gekauft bei Biomers.net oder erhalten von IBA) erfolgte ebenfalls mit Lipofectamin und Plus Reagenz (Invitrogen) wie auch die oben beschriebene Transfektion von DNA. Hierzu wurden 2,6 µg siRNA eingesetzt. 13 Material und Methoden 4.3. Rekombinante Proteine und Reinigung Fc-Fusionsproteine Offene Leserahmen viraler oder zellulärer Glykoproteine wurden ohne Signalpeptid und Transmembrananteil in den Ausgangsvektor pAB61 kloniert, der 5' der Insertionsstelle bereits für ein Signalpeptid und an 3' für das Fc Stück des humanen IgG1 kodiert (24). Expression und Reinigung von Fc-Fusionsproteinen und Antikörpern 293T-Zellen wurden mittels der Kalziumphosphatmethode mit den entsprechenden Expressionsplasmiden transfiziert. Nach Medienwechsel wurde der Zellkulturüberstand zweimal nach jeweils zwei Tagen gesammelt und bei 4 °C gelagert. Der Überstand wurde vor der Reinigung zellfrei zentrifugiert und durch einen 0,22 µm Filter (Millipore) filtriert. Die Reinigung erfolgte auf einem Äkta Purifier FPLC System (GE Healthcare). Der Kulturüberstand wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min über eine 1 ml Protein-A-HP Säule (GE Healthcare) gepumpt. Die Säule wurde anschließend mit 50 Säulenvolumina PBSo gewaschen, gefolgt von fünf Säulenvolumina 100 mM Zitratpuffer pH 5. Gebundene Fc-Fusionsproteine wurden schließlich mit 5 Säulenvolumina 100 mM Zitratpuffer pH 4 und pH 3 eluiert und in Fraktionen zu je 500 µl gesammelt. Das Eluat wurde sofort mit 175 µl 1 M Tris pH 9 neutralisiert. Den Proteinlösungen wurde 33 % Glyzerin zugesetzt, wenn sie längere Zeit bei -20 °C flüssig gelagert werden sollten (langfristig bei -80 °C, kurz und mittelfristig bei -20 °C). Affinitätsreinigung von Antikörpern Das jeweilige Peptid (das auch zur Immunisierung durch die Firma Eurogentec verwendet wurde) wurde zu 10 mg/ml in 1 ml Wasser gelöst und mittels einer Spritze auf eine mit 5 ml 1 mM HCl aktivierte 1 ml NHS-Sepharose-Säule (GE Healthcare) gegeben. Die Kopplungsreaktion an die NHS-Matrix erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur gemäß den Angaben des Säulenherstellers. Inaktivierung von unverbrauchter Matrix (mittels 0,5 M Ethanolamin 0,5 M NaCl pH 8,3) und Auswaschen des Peptids (mittels 0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl pH 4) erfolgte ebenfalls gemäß den Angaben des Herstellers. Zur Affinitätsreinigung der Antikörper wurde die fertige Säule auf einem Äkta Purifier FPLC System (GE Healthcare) mit 15 ml Serum verdünnt in 50 ml PBSo mit einer Flussrate von 1 ml/min beladen. 14 Material und Methoden Anschließend wurde mit 20 ml PBSo und 20 ml 0,3 M NaCl in PBSo gewaschen. Eluiert wurde schließlich mit je 5 ml 200 mM NaCl 100 mM Glyzin pH 2,5 und pH 10,5. Es wurden Fraktionen zu je 500 µl gesammelt und sofort mit 150 µl 1 M Tris pH 8 neutralisiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden anschließend wieder vereinigt. Das Hauptziel liegt hier nicht in der Konzentration spezifischer sondern in der Abtrennung unspezifischer Antikörper. In dieser Arbeit verwendet wurde der so gereinigte polyklonale Antikörper gegen das Peptid FLJ-1, gereinigt aus Serum 5529GP. 4.4. Proteinnachweistechniken Western-Blot Polyacrylamidgelelektrophorese wurde nach Lämmli durchgeführt (39). Der anschließende Übertrag auf eine Nitrozellulosemembran erfolgte in Western-Blot-Transferpuffer mit ca. 1 mA pro Quadratzentimeter für eine Stunde. Die Membran wurde für mindestens 20 min in Western-Blot-Blockpuffer inkubiert und anschließend mit den entspechenden Erst- und Zweitantikörpern inkubiert. Erstantikörper wurden entweder in Western-Blot-Blockpuffer oder in NET-Puffer verwendet. Alle Zweitantikörper wurden 1:1000 in Western-Blot-Blockpuffer verwendet. Für den Nachweis von Biotin mittels Meerrettichperoxidase-gekoppeltem Streptavidin (Invitrogen) wurden alle Inkubationsschritte in 2 % BSA 0,3 % Tween in PBSo durchgeführt. Detektion der gebundenen Sekundärreagenzien erfolgte mittels Elektrochemilumineszenz (ECL) digital in einem LAS-1000 Bildgebungssystem (Kodak). Proteinfärbungen Zur direkten Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen wurde entweder eine mit Massenspektrometrie kompatible Silberfärbung (40) oder eine speziell abgewandelte, hochsensible kolloidale Coomassiefärbung mit Zusatz von Aluminiumsulfat (41) verwendet. Glykosidaseverdau Proben für den Glykosidaseverdau wurden mit PNGase F oder EndoH (Promega) gemäß den Angaben des Herstellers 10 min bei 95 °C denaturiert und in einem Volumen von 50 µl für 4 h bei 37 °C verdaut. 15 Material und Methoden Immunfluoreszenz Für die Darstellung mittels Immunfluoreszenz wurden Zellen auf 12x12 mm Glasdeckgläschen (Hartenstein) in einer 12-Lochplatte ausgesät und gegebenenfalls auch transfiziert. Die Zellen wurden zunächst einmal kurz mit PBSo gewaschen. Anschließend wurden die Proteinstrukturen durch zehnminütige Inkubation mit 3 % Paraformaldehyd (PFA) in PBSo fixiert. Die Reaktivität des PFA wurde dann durch Waschen mit 0,1 M Glyzin in PBSo unterdrückt, gefolgt von zwei Waschschritten mit PBSo. Falls nötig wurden die Zellen dann mit 0,1 % (w/v) NP40 in PBSo permeabilisiert. Zum Absättigen unspezifischer Proteinbindungsstellen wurden die Präparate dann für mindestens 30 min in 5 % fötales Kälberserum (FKS) 1 % BSA in PBSo (Immunfluoreszenzblockpuffer) inkubiert. Alle Erst- und Zweitantikörper wurden dann in diesem Blockpuffer in entsprechender Verdünnung verwendet, gefolgt von jeweils drei mindestens fünfminütigen Waschschritten in PBSo. Zum Eindeckeln auf Glasobjektträgern bei gleichzeitigem Gegenfärben der Kerne wurde „Vectashield Mounting Medium“ mit DAPI (Vector) verwendet. Die Deckgläschen wurden abschließend mit gewöhnlichem Nagellack versiegelt. Die Aufnahme erfolgte auf einem Zeiss Axioplan Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss) gekoppelt mit einer „Spot“ Diagnostikkamera (Diagnostic Instruments). Konfokale Rasterlasermikroskopieaufnahmen (LSM) wurden auf einem Leica TCS SP5 (Leica) angefertigt. Bestimmung des Phosphorylierungsstatus von EphA2 Zur Bestimmung der Phosphorylierung von EphA2 wurde ein kommerzieller ELISA der Firma R&D gemäß den Angaben des Herstellers eingesetzt (Duo Set IC, Human PhosphoEphA2). Es wurde jeweils eine Vertiefung einer 12-Loch-Zellkulturplatte stimuliert und für einen Ansatz geerntet. Alternativ wurde aus stabil EphA2mychis exprimierenden Zellen eine Immunpräzipitation mit 9E10 anti-myc monoklonalem Antikörper gekoppelt an Protein-G-Sepharose (GE Healthcare) durchgeführt. Die präzipitierten Proben wurden anschließend per Western-Blot sowohl auf Phosphotyrosin mit dem monoklonalen Antikörper 4G10 (Maus) detektiert wie auch auf EphA2 mittels eines polyklonalen anti-EphA2-Antikörpers aus Kaninchen (Acris-Antikörper). 16 Material und Methoden 4.5. Affinitätstechniken Immunpräzipitation Immunpräzipitationen (IPs) wurden, falls nicht gesondert beschrieben, nach dem folgenden Schema durchgeführt. Zunächst wurden die Zellen lysiert. Für alle Lysispuffer wurde als Ausgangsbasis HP Puffer (25 mM HEPES 2,5 mM EDTA/EGTA) mit 150 mM NaCl verwendet. Detergenz wurde nach Bedarf zugesetzt (1 % NP40 für alle IPs mit gH/gL, 1 % NP40 0,25 % Natriumdesoxycholat für alle IPs mit FLJ40722). Lyse erfolgte für 30 min auf Eis. Anschließend wurde das Lysat bei 20000 g in einer gekühlten Zentrifuge für mindestens 1 h geklärt. Der Überstand wurde aufgeteilt und für die eigentliche IP verwendet. Für Fc-Fusionsproteine und Kaninchenseren wurde Protein-A-Sepharose (GE Healthcare) verwendet, für Antikörper aus der Maus Protein-G-Sepharose (GE Healthcare). Für die Inkubation wurde (je nach Versuch) eine Dauer von 4 h bis über Nacht gewählt. Anschließend wurden die Proben dreimal mit Lysispuffer gewaschen und je nach Bedarf mit SDS-Probenpuffer versehen, denaturiert und entsprechend analysiert. Immunfluoreszenzbindungstest Immunfluoreszenzbindungstests wurden genauso durchgeführt wie normale Immunfluoreszenzen, außer dass anstelle eines Primärantikörpers die jeweiligen Fc-Fusionsproteine (2-10 µg/ml) benutzt wurden. Wo angegeben, wurde dieser Schritt noch mit einer weiteren Inkubation mit dem gegen ein myc-Epitop gerichteten monoklonalen Antikörper 9E10 (aus Maus) gekoppelt. Die Detektion erfolgte anschließend mit polyklonalem, Cy3-gekoppeltem Sekundärantikörper gegen humanes Fc oder gegen den murinen 9E10 Antikörper 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer. Durchflusszytometrie(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting)-Bindungstest Die Zellen wurden entweder mechanisch (293T) oder durch kurze Trypsinbehandlung (Vero, sog9, HFF) abgelöst und sedimentiert. Anschließend wurden die Zellen entweder 2 h auf Eis mit Zellkulturüberständen, welche Fc-Fusionsproteine enthielten, oder gereinigten Fc-Fusionsproteinen in FACS-Puffer inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in FACS-Puffer wurden die Zellen 1 h mit FITC-gekoppeltem anti-human Sekundärantikörper inkubiert (1:100, Dako). Für die Detektion des Strep-Tags wurde Strep-Tactin-PE Konjugat 17 Material und Methoden (1:100, IBA) verwendet. Nach zwei Waschschritten wurden die Zellen auf einem FACSCalibur (BecktonDickenson) auf die Fluoreszenz des gebundenen Sekundärantikörpers hin analysiert. Zellbasierter Enzym-gekoppelter Immunosubstrattest (CELISA) Der CELISA stellt eine weitere Methode dar, Bindung an Zellen zu quantifizieren. Hierzu wurden zunächst sog9 Zellen in gleicher Anzahl in 12-Lochplatten ausgesät. Die Zellen wurden nach 2 Tagen wie für eine Immunfluoreszenz fixiert und gewaschen. Anschließend wurden die fixierten Zellen mit Glykoprotein-haltigen Überständen 2 h inkubiert (die Überstände wurden durch Zugabe von HEPES pH 7,3 aus einer 1 M Stocklösung auf 25 mM gepuffert), dreimal mit PBSo gewaschen und anschießend mit anti-human-Fc-HRP 1:1000 in Immunfluoreszenzblockpuffer inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten wurde 1 ml ECL-Entwicklungslösung in jedes Töpfchen gegeben und die gesamte Platte in einem LAS-1000 Bildgebungssystem auf Lumineszenz detektiert. Anschließend wurde das Ergebnis densitometrisch ausgewertet (AIDA Image Analyzer v3.1 Software). 4.6. Massenspektrometrie Proteine aus silber- oder coomassiegefärbten Gelen wurden zur Identifikation mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF und/oder LC/MS(42)) ans IZKF Münster versandt. Kolloidal-Coomassie gefärbte Proben wurden mit einem sauberen Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und direkt in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß verschickt. Silbergefärbte Proben wurden erst entfärbt. Hierzu wurden ausgeschnittene Banden kurz (1-2 min) in einer gleichteiligen Mischung aus 100 mM Thiosulfat und 30 mM Kaliumferrizyanid inkubiert, bis die braune Silberfärbung verblichen war. Anschließend wurde die Probe einmal kurz und viermal acht Minuten mit Wasser gewaschen und dann verschickt. 4.7. Virologische Methoden Herstellung VSV-G-pseudotypisierter Lentiviren Als Kontrollvirus wurde ein GFP-kodierendes Lentivirus benutzt, das normalerweise zur Tetrazyklin-induzierbaren Expression von „small hairpin“ RNAs (shRNAs) dient. Ohne Zugabe von Tetrazyklin erfolgt keine shRNA-Expression (43). Zur Herstellung des Lentivirushaltigen Überstands wurden 293T-Zellen nach der Calziumphosphat-Methode mit den folgenden Plasmiden transfiziert: 18 Material und Methoden pVSV-G 5 µg pCMVrev 5 µg pTIG 10 µg pCHGP 10 µg Nach Medienwechsel wurde der Viruspartikel-haltige Überstand zwei Tage lang gesammelt. Der Zellkulturüberstand wurde durch einen 0,22 µm Filter gefiltert und anschließend in einer Ultrazentrifuge bei 76 000 g für 2h konzentriert. Der Überstand wurde abgenommen und das Sediment wurde über Nacht im „letzten Tropfen“ (ca. 300 µl) resuspendiert und dann mit 293T-Medium auf das 30fache der Ausgangskonzentration eingestellt. Vor Benutzung wurde die Viruslösung erneut 5 min bei 2000 g zentrifugiert, um Schwebstoffe zu entfernen. KSHV-Viruspräparation Das rekombinante Virus rKSHV.219 (44) wurde latent in 293-Zellen propagiert. Zur Induktion des lytischen Replikationszyklus wurden die Zellen zwei Tage in Medium mit Zusatz von 3 mM Natriumbutyrat kultiviert. Anschließend wurde das Medium gegen solches ohne Natriumbutyrat getauscht. Nach weiteren vier Tagen wurde der Zellkulturüberstand geerntet und 5 min bei 2000 g zentrifugiert, um verbleibende Zellen und größere Partikel zu entfernen. Der Zentrifugationsüberstand wurde anschließend bei 2000 g über Nacht für mindestens 14 h bei 4 °C zentrifugiert. Nun wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt bis auf einen verbleibenden „letzten Tropfen“ (ca. 300 µl). In diesem wurde das sedimentierte Virus resuspendiert und anschließend gesammelt. Die Virusstammlösung wurde dann so eingestellt, dass eine 30fache Konzentration der ursprünglichen Viruslösung erreicht wurde. Vor Benutzung wurde die Viruslösung erneut 5 min bei 2000 g zentrifugiert, um Schwebstoffe zu entfernen. Infektionen Falls nicht anders beschrieben, wurde die rKSHV.219 Virusstammlösung 1:5 in Medium verdünnt und anschließend über Nacht auf die Zellen gegeben. Diese Vorgehensweise resultierte im Allgemeinen in Infektionsraten von ~1 % in 293T-Zellen. Die Infektionsrate kann über die Expression des GFP-Reportergens unter Kontrolle eines EF1alpha-Promotors in rKSHV.219 bestimmt werden. Zur Auswertung der Infektionseffizienz wurden die in- 19 Material und Methoden fizierten Zellen nach drei Tagen in PBSo aufgenommen und es wurde mittels Durchflusszytometrie die Zahl der grün fluoreszierenden Zellen bestimmt. Hierzu wurden jeweils 100 000 Zellen auf einem FACSCalibur (BecktonDickenson) gezählt. 20 Ergebnisse 5 Ergebnisse 5.1. FLJ40722 ist ein neuartiger zellulärer Rezeptor für das KSHV Glykoprotein K8.1 5.1.1. Identifikation von FLJ40722 als zellulärer Interaktionspartner von K8.1 Es ist bereits bekannt, dass Glykoprotein K8.1 mit Heparansulfat interagiert (24). Die Affinität liegt dabei im mikromolaren Bereich. Ausgehend von einer gewissen funktionellen Analogie zu z.B. Glykoprotein D von HSV wurde vermutet, dass K8.1 auch noch weitere zelluläre Rezeptoren erkennen könnte. Zur Identifikation dieser hypothetischen Rezeptoren wurde zunächst K8.1ΔTM-Fc löslich in 293T-Zellen exprimiert und mittels Protein-A-Affinitätschromatographie aus dem Überstand gereinigt. Anschließend wurde das FcFusionsprotein (und ein Kontrollprotein, SARS-RBD-Fc) an Protein-A-Sepharose gekoppelt und mit Lysaten verschiedener Zelllinien inkubiert. Präzipitierte Proteine wurden nach Waschen auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt und mittels Silberfärbung oder Coomassiefärbung visualisiert (siehe Abb. 2). Es zeigte sich hier eine charakteristische Bande oder manchmal Doppelbande bei Präzipitation aus 293T- und Jsc-1-Lysaten. Diese Bande wurde nach Immunpräzipitation (IP) aus 293T-Zellen ausgeschnitten, mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF) nach tryptischem Verdau analysiert und als hypothetisches Protein FLJ40722 (GenBank: EAL23793.1) identifiziert (Abb. 2 B). Die Identifikation war sofort auch ohne manuelle Editierung der Ergebnisse möglich (Algorithmen: Mascot, Profound, Aldente). Da K8.1ΔTM-Fc als Köderprotein aufgrund der relativ hohen eingesetzten Menge und seines glykosylierungsbedingt diffusen Molekulargewichts auch noch bis ca. 100 kDa auf dem Gel zu erkennen war, wurden die erhaltenen Fragmente noch von Hand editiert. Um die Möglichkeit eines falsch-positiven Treffers zu minimieren, wurden tryptische Fragmente, die zu K8.1ΔTM-Fc gehören, manuell aus der Liste der Fragmente entfernt (Abb. 2 B, vorletzte Spalte). Dies hatte zur Folge, dass sich die Fehlerwahrscheinlichkeit für die Identifikation von FLJ40722 noch weiter verringerte (nicht gezeigt). Es handelt sich auch um keine Falschbestimmung durch Fragmente des Köderproteins, da sich die hypothetisch aus K8.1ΔTM-Fc zu erhaltenden Ionen nicht mit dem für FLJ40722 zu erwartenden Spektrum überschneiden. 21 Ergebnisse Abbildung 2: Identifikation von FLJ40722 nach Präzipitation mit K8.1ΔTM-Fc. A) Jsc-1-Zellen wurden in 2 % Triton 0,5 % Natriumdeoxycholat 150 mM NaCl in HP-Puffer lysiert. Aus dem Lysat wurde mit 10 µg Fc-Fusionsprotein präzipitiert. Das Präzipitat wurde auf einem 8 % Polyacrylamidgel aufgetrennt und anschließend silbergefärbt. Pfeile zeigen spezifisch mit K8.1ΔTM-Fc präzipitierte Proteine an. B) Ionenliste nach tryptischem Verdau. Nach einer Immunpräzipitation aus 293T-Zellen wurden die analog zu A erscheinenden Banden aus einem kolloidal Coomassie-gefärbten Gel ausgeschnitten, tryptisch verdaut und per MALDI-TOF analysiert. Anschließend wurden eindeutig zu K8.1ΔTM-Fc gehörige tryptische Fragmente aus der Ionenliste gestrichen. Ein Expressionsplasmid mit der cDNA des hypothetischen Proteins FLJ40722 und einem C-terminalen Flag-Epitop wurde generiert und zur Verifizierung der Interaktion benutzt. Das Flag-Epitop markierte FLJ40722 wurde in 293T-Zellen durch Transfektion überexprimiert. Diese Zellen wurden lysiert und das Lysat mit an Protein-A immobilisiertem K8.1ΔTM-Fc inkubiert. FLJ40722 wurde hier klar durch K8.1ΔTM-Fc präzipitiert (Abb. 3). 22 Ergebnisse Abbildung 3: K8.1ΔTM-Fc bindet rekombinantes FLJ40722. 293T-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid für FLJ40722-Flag transfiziert. Das Lysat der Zellen wurde mit 10 µg K8.1ΔTM-Fc oder SARS-S(318-523)-Fc (Kontrolle) präzipitiert. Anschließend wurde ein Western-Blot mit anti-Flag monoklonalem Antikörper durchgeführt. Ein Peptid-Antiserum gegen FLJ40722 aus immunisierten Kaninchen zeigte ebenfalls eine eindeutige Reaktivität mit von K8.1ΔTM-Fc präzipitierten Proteinen aus 293T- und Jsc-1Zellen (Abb. 4 A). Da die Avidität und Spezifität des Serums nicht für eine eindeutige Detektion von endogenem FLJ40722 im Lysat genügte, wurde zu Kontrolle in Abb. 4 noch eine Immunpräzipitation mit affinitätsgereinigtem anti-FLJ40722 polyklonalem Antikörper durchgeführt (Abb. 4 B). Der anti-FLJ40722 Antikörper präzipitierte aus Jsc-1-Zellen ein Protein mit identischem Molekulargewicht und gleicher Reaktivität im Western-Blot wie das von K8.1ΔTM-Fc präzipitierte Protein. Nach IP mit dem polyklonalen Antikörper gegen FLJ40722 zeigte sich klar eine Bande bei ca. 100 kDa, die im Lysat nur schwer zu erkennen war. Dies liegt vor allem an dem sehr starken Signal bei ca. 130 kDa, das wahrscheinlich ein von dem Antikörper auf der Membran unspezifisch erkanntes Protein oder evtl. auch eine langsamer migrierende Form von FLJ40722 darstellt. FLJ40722 verfügt über 23 Ergebnisse sechs stark hydrophobe Abschnitte und einen hohen Cysteinanteil. Nach elektrophoretischer Auftrennung von Gesamtzelllysat wurden im Western-Blot oft keine eindeutige Bande oder Mehrfachbanden detektiert (vgl. Abb 3, letzte Spur). Abbildung 4: K8.1ΔTM-Fc präzipitiert FLJ40722 aus 293T- und Jsc-1-Zellen. A) Aus einem Lysat von 293T-Zellen wurde mit 5 µg K8.1ΔTM-Fc oder SARS-S(318-523)-Fc (Kontrolle) präzipitiert. Anschließend wurde ein Western-Blot mit anti-FLJ40722 Kaninchenserum (5529GP) durchgeführt. B) Aus dem Lysat von Jsc-1-Zellen wurde als Positivkontrolle mit anti-FLJ40722 polyklonalem Antikörper oder mit K8.1ΔTM-Fc präzipitiert. Anschließend wurde ein Western-Blot mit gereinigtem antiFLJ40722 polyklonalem Antikörper durchgeführt. Es zeigte sich bei beiden Präzipitationen eine charakteristische Bande von etwa 100 kDa, die nicht nach Präzipitation mit dem als Kontrolle verwendeten SARS-S(318-523)-Fc erscheint. Nach Behandlung der Positivkontrolle mit der Glykosidase PNGase F war keine Verringerung des Molekulargewichts von FLJ40722 erkennbar. 5.1.2. Funktionelle Bedeutung von FLJ40722 bei der KSHV-Infektion Um die funktionelle Bedeutung von FLJ40722 für die KSHV-Infektion zu untersuchen, wurden verschiedene Ansätze gewählt. Zunächst wurde FLJ40722 durch Transfektion transient überexprimiert. Dies führte in 293T-Zellen zu keiner klaren Veränderung der Permissivität für KSHV (nicht gezeigt). In murinen Fibroblasten jedoch zeigte sich ein eindeutiger Effekt (Abb. 5). Sowohl in mouseL-Zellen wie auch in der Heparansulfat-defizienten Zelllinie sog9 war eine klare Verstärkung der KSHV-Infektion durch Überexpression von humanem FLJ40722 feststellbar. Diese Verstärkung war bei Infektion mit geringer Virusmenge (Abb. 5 A) ausgeprägter als bei höherer Infektionsdosis (Abb. 5 B). 24 Ergebnisse Abbildung 5: Überexpression von humanem FLJ40722 in murinen Fibroblasten verstärkt die Infektion mit KSHV. A) sog9- und mouseL-Zellen wurden mit Kontrollvektor oder einem Expressionsplasmid für FLJ40722 transfiziert und nach zwei Tagen mit rKSHV BAC36 infiziert. Es handelt sich um eine Infektion mit sehr niedrig konzentriertem Virus. Die Infektionsrate wurde 10 Tage nach Infektion per Durchflusszytometrie bestimmt. Fehlerbalken repräsentieren Minimum und Maximum (n=2). Die Unterscheide sind jeweils signifikant (t-Test, p<0,05). B) mouseL-Zellen wurden erst transfiziert wie in A und anschließend mit rKSHV.219 in sehr hoher Konzentration infiziert. Nach sieben Tagen wurde wie in A die Infektionsrate bestimmt. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=4). Die Unterschiide sind jeweils signifikant (t-Test, p<0,05). Die gegen FLJ40722 gerichteten Kaninchenseren zeigten ebenfalls einen eindeutigen Effekt auf die Infektion mit rKSHV.219. Vorinkubation von 293T- oder HUVEC-TI-Zellen (Abb. 6) mit gegen FLJ40722 gerichteten Seren zeigte einen klar inhibitorischen Effekt auf die KSHV-Infektion. Abbildung 6: Anti-FLJ40722-Seren inhibieren die Infektion mit KSHV. 293T- und HUVEC-TI-Zellen wurden für 30 min mit anti-FLJ40722 Kaninchenserum (5529PP) oder Präimmunserum (5529PPI) inkubiert. Anschließend wurde rKSHV.219 zugegeben. Nach 3 (293T) bzw. 5 (HUVEC-TI) Tagen wurde die Infektionsrate über Durchflusszytometrie quantifiziert. Es zeigt sich eine deutliche Inhibition durch das anti-FLJ40722 Serum. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=4). Die Unterschiede sind jeweils signifikant (t-Test, p<0,05). 25 Ergebnisse Abschließend wurde noch die Expression von FLJ40722 mittels RNA Interferenz unterdrückt. Abbildung 7 A zeigt eine siRNA, welche die Expression von FLJ40722 von einem Expressionsplasmid bis zur Nachweisgrenze unterdrückt. Die siRNA wurde in 293T-Zellen transfiziert, und diese zwei Tage später mit rKSHV.219 infiziert. Auch hier zeigte sich wieder eine deutliche Inhibition der rKSHV.219 Infektion, gemessen an der Expression des GFP-Reportergens (Abb. 7 B). Die zur Kontrolle analysierte GFP-Reportergenexpression nach Infektion mit einem VSV-pseudotypisierten GFP-kodierenden Lentivirus ín ebenso siRNA-transfizierten Zellen wurde nicht durch die siRNAs gegen FLJ40722 beeinflusst. Auch zwei weitere siRNAs gegen FLJ40722 hatten einen ähnlich ausgeprägten Effekt auf die KSHV-Infektion (Abb. 7 C). Abbildung 7: siRNA vermittelter Knock-Down von FLJ40722 inhibiert die Infektion mit KSHV. A) siRNA 476 gegen FLJ40722 reduziert die Expression des Proteins von einem Plasmid unter die Nachweisgrenze. B) Transfektion von si476 in 293T-Zellen vor Infektion mit rKSHV.219 inhibiert die KSHV-Infektion. Ein GFP-kodierendes, mit VSV-G pseudotypisiertes Lentivirus wird im Gegensatz zu rKSHV.219 nicht durch die siRNA gegen FLJ40722 inhibiert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). Die Inhibition durch si476 ist signifikant (t-Test, p<0,05). C) Zwei weitere siRNAs gegen FLJ40722 haben einen ähnlich inhibitorischen Effekt auf die KSHV-Infektion. Der Versuch wurde wie in B durchgeführt (n=3). 26 Ergebnisse 5.1.3. FLJ40722 wird auf der Zelloberfläche exprimiert Nachdem gezeigt wurde, dass FLJ40722 offenbar eine wichtige Rolle bei der Infektion spielt, sollte noch geklärt werden, ob FLJ40722 auch auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Hierzu wurden Zellen mit dem Expressionsplasmid pcDNA4-FLJ40722-mychis transfiziert und anschließend per Durchflusszytometrie auf Oberflächenexpression von FLJ40722 analysiert. Es wurde sowohl mit einem gegen FLJ40722 gerichteten Kaninchenserum markiert (Abb. 8 A) wie auch mit einem monoklonalen Antikörper gegen das mycEpitop. Das Protein war bei Überexpression klar auf der Oberfläche nachweisbar (Abb. 8 A und B). Es ließ sich das C-terminale myc-Epitop und damit der C-Terminus von FLJ40722 auf der Außenseite der Membran detektieren (Abb. 8 B). Abbildung 8: FLJ40722 ist ein oberflächenexprimiertes Protein. 293T-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid für FLJ40722-mychis (schwarze Histogramme) oder pcDNA (graue Histogramme) transfiziert. Anschließend wurde die Oberflächenexpression des Proteins mittels FACS untersucht. Die Zellen wurden nicht permeabilisiert. A) Die transfizierten Zellen wurden mit anti-FLJ40722 Kaninchenserum (5529PP) markiert. Als Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet. Sekundärdetektion erfolgte mittels anti-Kaninchen-FITC Sekundärantikörper. B) Die transfizierten Zellen wurden mit anti-myc 9E10 (gegen FLJ40722-mychis) oder V5 monoklonalem Antikörper aus der Maus gefärbt. Sekundärdetektion erfolgte mit anti-Maus-Cy5 Sekundärantikörper. 27 Ergebnisse 5.1.4. Expressionsmuster von FLJ40722 in verschiedenen Zelllinien Um die biologische Bedeutung von FLJ40722 für die KSHV-Infektion besser einschätzen zu können, wurde das Expressionsmuster des Proteins in verschiedenen Zelllinien untersucht. Da die zur Verfügung stehenden Antikörper für eine Detektion im Western-Blot nicht geeignet waren, wurde die Expression semiquantitativ mittels RT-PCR analysiert. Hierbei wurde ein Fragment amplifiziert, das sich über das erste Intron des Gens erstreckt (Abb. 9). Es zeigte sich, dass FLJ40722 breit exprimiert wird, allerdings in den meisten Zelllinien lymphoiden Ursprungs nur sehr schwach. Im Kontrast hierzu wird FLJ40722 in KSHV-positiven PEL-Zellen (Jsc-1, BCBL-1 und BC-3) sehr stark exprimiert. FLJ40722mRNA war in allen adhärenten Zellen zu finden, so auch in 293T-Zellen, aus denen es ursprünglich durch Peptidmassenfingerabdruck identifiziert worden war. Sehr stark exprimiert wird es aber überraschenderweise in Telomerase-immortalisierten humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECT-TI), der einzigen untersuchten Zelllinie endothelialen Ursprungs. Abbildung 9: Expression von FLJ40722 mRNA in verschiedenen Zelltypen. Aus der RNA der gezeigten Zelllinien wurde mittels reverser Transkription mit zufälligen Hexameren cDNA hergestellt. Aktin-mRNA wurde zunächst per Real-Time-PCR bestimmt und die cDNA dementsprechend verdünnt. Mit dieser wurde dann eine analytische PCR mit Primern spezifisch für FLJ40722 oder Aktin als Kontrollgen durchgeführt und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Expression von FLJ40722-mRNA relativ zu Aktin wurde daraufhin durch densitometrische Auswertung semiquantitativ bestimmt. 28 Ergebnisse 5.2. Glykoproteine gH und gL: Glykoproteinreifung und Rezeptorbindung Im Unterschied zu K8.1 sind die Glykoproteine gH und gL bei allen Herpesviren konserviert. Soweit untersucht, werden diese Proteine zumindest bei Herpesvirus simplex nur als Komplex zur Zytoplasmamembran bzw. in die Virionhülle transportiert (34). Über die genaue Funktion der beiden Proteine ist dabei noch wenig bekannt. Die meisten Autoren sind der Ansicht, dass gH/gL eine Rolle bei der Fusion von Virionhülle und Zellmembran spielen, ohne selbst einen Rezeptor zu binden (45). Hier wurde hingegen die Hypothese verfolgt, dass gH oder gH/gL selbstständig auch an der Bindung zellulärer Rezeptoren beteiligt sind. Zunächst sollte aber untersucht werden, ob der Export und die Prozessierung von gH und gL ähnlich wie bei Herpesvirus simplex oder anders verlaufen. 5.2.1. Prozessierung, Interaktion und Lokalisation von Glykoprotein H und L Interessanterweise war es problemlos möglich, KSHV gH als lösliches Fc-Fusionsprotein zu exprimieren (Abb. 11). Da der Export löslicher Glykoproteine dem membrangebundener gleichen sollte, steht dies zu der weit verbreiteten Meinung im Widerspruch, dass gH nur zusammen mit gL in der Lage ist, die Zelloberfläche zu erreichen. Da keine Antikörper gegen das native Protein zur Verfügung standen, wurde an Position 32 ein Flag Epitop in den offenen Leserahmen insertiert (pAB34Flag). Dieses Konstrukt wurde nun zusammen mit einem Expressionsplasmid für gL (mit C-terminalem myc-Epitop, pcORF47) oder alleine sowohl in 293T-Zellen wie auch in Hela-Zellen transfiziert. Die Hela-Zellen wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz auf Expression jeweils eines der beiden Glykoproteine analysiert. Für Abb. 10 A I wurden die Zellen nicht permeabilisiert, sodass also nur Epitope auf der Außenseite für die Markierung zugänglich sind. gH konnte so unabhängig von gL auf der Zelloberfläche gefunden werden, während gL nur bei Koexpression von gH dort zu detektieren war. Zusätzlich wurde in permeabilisierten Zellen das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels eines anti-Calreticulin Antikörpers gegengefärbt (Abb. 10 A II). Wie in den konfokalen Rasterlasermikroskopaufnahmen ersichtlich wurde, war gL alleine fast ausschließlich im ER lokalisiert, während es bei Koexpression von gH auch an die Ränder der Zelle lokalisierte. gH hingegen änderte seine Lokalisation kaum, es akkumulierte eventuell in Gegenwart von gL etwas stärker im ER. Als zweiter experimenteller Ansatz wurden noch ebenso transfizierte 293T-Zellen mittels Antikörpermarkierung und Durchflusszytometrie 29 Ergebnisse auf Oberflächenexpression von gH und gL untersucht (Abb. 10 B). Hierbei zeigte sich ebenfalls, dass gH unabhängig von gL auf der Membran exprimiert wird (Abb. 10 B I), während gL nur bei gleichzeitiger Expression von gH detektierbar war (Abb. 10 B II). Abbildung 10: Die Oberflächenexpression von gH ist unabhängig von gL. A) I) Hela-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden für gH (Flag-Epitop) und gL (myc-Epitop) in den jeweils gezeigten Kombinationen transfiziert. Die Proteine wurden durch indirekte Immunfluoreszenz über einen Cy3-gekoppelten anti-Maus Sekundärantikörper detektiert. Es zeigt sich klar, dass gH alleine auf der Zelloberfläche exprimiert wird, gL dagegen nur bei Koexpression von gH. II) Hela-Zellen wurden transfiziert wie in I, aber zusätzlich permeabilisiert. Außerdem wurde das ER durch einen CalreticulinAntikörper (polyklonal, Kaninchen) gefärbt (anti-Kaninchen-FITC, grüne Fluoreszenz). gL lokalisiert bei Koexpression von gH eindeutig hin zur Membran. B) 293T-Zellen wurden transfiziert wie in A. Oberflächenexpression von gH wurde mittels Durchflusszytometrie und Antikörperfärbung gegen das Flag-Epitop (I) bestimmt, Oberflächenexpression von gL über Detektion des myc-Epitops (II). Zur Detektion der gebundenen Erstantikörper wurde jeweils ein FITCgekoppelter anti-Maus-Antikörper benutzt. Gezeigt ist ein repräsentatives Experiment aus dreien. 30 Ergebnisse Da die gL-unabhängige Oberflächenexpression von gH im Widerspruch zur bisherigen Literatur stand (46), sollte diesem Phänomen weiter auf den Grund gegangen werden. Auch sollte die Frage geklärt werden, ob gL nun ein Membranprotein oder ein lösliches Protein ist, das ohne gH einfach in den extrazellulären Raum sezerniert wird. Es wurden Expressionsplasmide für drei N-terminale und drei C-terminale Deletionsmutanten des extrazellulären Teils von gH als Fc-Fusionsproteine kloniert (Schema siehe Abb. 11 oben). Diese sowie Volllängen-gHΔTM-Fc oder nur Fc wurden nun zusammen mit einem Expressionskonstrukt für gL mit einem C-terminalen Flag-Epitop in 293T-Zellen exprimiert. Anschließend wurden sowohl die Lysate dieser Zellen wie auch die Zellkulturüberstände auf Expression der jeweiligen Proteine analysiert. Hierbei zeigte sich, dass gL nur bei Koexpression des vollständigen extrazellulären Teils von gH löslich in den Überstand sezerniert wird. Deletionen sowohl am N-terminalen Ende wie auch am C-terminalen Ende der Ektodomäne von gH verhinderten die Sekretion von gL. Interessanterweise war eine ganz leichte, kaum noch detektierbare Restsekretion von gL bei Koexpression der C-terminalen Hälfte der gH-Ektodomäne feststellbar (Abb. 11, Sternchen). Der N-terminale Teil von gH ist scheinbar für die Bindung von gL verantwortlich, da die C-terminal trunkierten gHΔTMFc Varianten sehr effizient gL aus den zellulären Lysaten präzipitieren (Abb. 11 unten). Erstaunlicherweise waren diese Varianten aber – obwohl sie gL stark binden und selbst sezerniert werden – nicht in der Lage, gL zu exportieren. Während der N-Terminus also gL bindet, ist der gesamte extrazelluläre Teil von gH inklusive der C-terminalen Anteile für den Export von gL verantwortlich. 31 Ergebnisse Abbildung 11: gL und die Ektodomäne von gH bilden einen löslichen Komplex. N- und C-terminale Deletionsmutanten der Ektodomäne von gH wurden als Fc-Fusionsproteine zusammen mit gL in 293T-Zellen exprimiert. Die Expression der Proteine wurde mittels Western-Blot sowohl im Lysat der Zellen wie auch im Zellkulturüberstand überprüft. Während die gH-Mutanten alle zumindest schwach sezerniert wurden (oberste Membran), wurde gL zwar durchgängig exprimiert und war im Zelllysat zu finden, wurde aber nur in Gegenwart der gesamten Ektodomäne von gH effizient sezerniert (Spur 1). Spuren 3 und 4 (Sternchen) zeigen eine ganz schwache residuale Sekretion. Nach Immunpräzipitation der gHΔTM-Fc Mutanten mit Protein-A-Sepharose aus dem Zelllysat und Western-Blot Detektion auf gL zeigte sich klar, dass C-terminale Deletionsmutanten der gH Ektodomäne immer noch mit gL interagieren können (Spuren 5 bis 7). Deletionen vom N-Terminus her verhinderten hingegen eine Interaktion mit gL (Spuren 2 bis 4). na = nicht analysierbar. 32 Ergebnisse Allgemein wird angenommen, dass Glykoproteine, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, das ER wie auch den Golgi-Apparat durchlaufen haben. Die gängige Meinung ist, dass ER-lokalisierte Proteine eine mannosereiche Glykosylierung aufweisen, während fertig prozessierte Proteine nach Durchlaufen des Golgi-Apparats eine komplexe Glykosylierung aufweisen. Die mannosereiche Glykosylierung der Proteine aus dem ER ist sensitiv gegenüber Verdau mit dem Enzym Endoglykosidase H (EndoH), die komplexe Glykosylierung nach Durchlaufen des Golgi dagegen nur gegenüber Verdau mit der Glykosidase PNGase F (47). Eine frühere Veröffentlichung beschreibt eine Veränderung der Glykosylierung von gH weg vom mannosereichen hin zum komplexen Typ durch Koexpression von gL (46). Um dies zu überprüfen wurde gH (N-terminales Flag-Epitop) immunpräzipitiert, sowohl mit wie auch ohne gleichzeitige Expression von gL (Abb. 12). Es zeigte sich deutlich, dass gH – wenn alleine exprimiert – vollständig EndoH-sensitiv ist, zu erkennen am kleineren Molekulargewicht nach Verdau. Durch Vergleich der Intensitäten dieser kleineren, vollständig deglykosylierten Form im Western-Blot kann der Anteil an EndoH-sensitiver Glykosylierung abgeschätzt werden, da PNGase F immer maximal deglykosyliert. Zu beachten ist, dass ein Großteil der Glykoformen von gH auf dem Western-Blot überhaupt nicht detektierbar sind, man sieht also die EndoH-resistenten Formen nicht bzw. kaum direkt, sondern nur durch Vergleich der vollständig deglykosylierten Proteine. Bei gleichzeitiger Expression von gL dominierte hingegen eine EndoH-resistente Form von gH. gL beeinflusst also eindeutig die Glykosylierung von gH, paradoxerweise aber nicht dessen Transport auf die Zelloberfläche. 33 Ergebnisse Abbildung 12: gL verändert die Glykosylierung von gH. 293T-Zellen wurden mit gH-Expressionsplasmid (pAB34Flag) alleine oder zusammen mit einem Expressionsplasmid für gL transfiziert. Aus den zellulären Lysaten wurde gH über das Flag-Epitop immunpräzipitiert, gleichmäßig aufgeteilt und anschließend mit den Glykosidasen PNGase F oder EndoH verdaut. Anschließend wurden die Proben mittels Gelelektrophorese und Western-Blot auf gH detektiert. Die Zahlen geben das Intensitätsverhältnis der Banden nach densitometrischer Auswertung wieder. Die komplexen Glykoformen von gH sind ohne vorherige Deglykosylierung nur zu einem Bruchteil im Western-Blot detektierbar. 5.2.2. KSHV gH und gH/gL interagieren mit Heparansulfat Bereits zu Beginn dieser Arbeit lagen durch Vorarbeiten von Alexander Birkmann Hinweise auf eine Interaktion von gH mit Heparansulfat vor. Diese Beobachtung konnte hier noch weiter bestätigt werden (Abb. 13). Es wurde dazu mit dem löslichem Fusionsprotein aus der Ektodomäne von gH und Fc ein Immunfluoreszenzbindungstest auf humanen Vorhautfibroblasten oder Vero-Zellen durchgeführt (Abb. 13 A, B), ebenso ein FACS-Bindungstest auf Vero-Zellen (Abb. 13 C). Die Bindung war hier klar durch Vorinkubation des Fusionsproteins mit Heparin blockierbar (Abb. 13 A, C). Zudem konnte die Bindung von gHΔTMFc an Vero-Zellen durch Behandlung der Zellen mit Heparinase III verhindert werden (Abb. 13 B). Dies zeigt eindeutig, dass Heparansulfat bzw. Heparinase-sensitive Glykosaminoglykane für die Bindung von gH verantwortlich sind. Für diese Bindung reicht gH alleine aus und gL ist nicht erforderlich, jedoch bindet auch der Komplex aus löslichem gHΔTM-Fc/gL an Zellen (gezeigt sind 293T, Abb. 13 D). Auch diese Bindung ist weitgehend durch Heparin blockierbar. 34 Ergebnisse Abbildung 13: gHΔTM-Fc bindet durch einen Heparansulfat-abhängigen Mechanismus an Zellen. A) Humane Vorhautfibroblasten wurden fixiert und mit gHΔTM-Fc oder Fc inkubiert (2 µg/ml). Zudem wurde mit Heparin vorinkubiertes gHΔTM-Fc mitgeführt. Gebundenes Protein wurde über anti-myc (Maus) und anti-Maus-Cy3 Sekundärantikörper detektiert. Es zeigte sich eine klar detektierbare Bindung von gHΔTM-Fc, die mit Heparin blockierbar war. B) Vero-Zellen wurden mit gHΔTM-Fc oder Fc inkubiert. Gebundenes Proteine wurde über einen antihuman-Cy3 Sekundärantikörper detektiert. In einem Ansatz wurden die Zellen zuvor mit Heparinase III behandelt. Bindung von gHΔTM-Fc konnte durch den Heparinaseverdau verhindert werden. C) Ein FACS-Bindungstest mit gHΔTM-Fc oder Fc (10 µg/ml) und mit Heparin-behandeltem gHΔTM-Fc wurde auf Vero-Zellen durchgeführt. Es zeigte sich eine deutlich heparinblockierbare Bindung. D) 293T-Zellen wurden mit gHΔTM-Fc/gL inkubiert und anschließend gebundenes Protein detektiert wie in C. Es zeigt sich eine heparinblockierbare Bindung im FACS-Bindungstest. 35 Ergebnisse 5.2.3. Heparansulfat-Proteoglykane der Syndekanfamilie fungieren als zelluläre Rezeptoren für KSHV gH und gH/gL Glykosaminoglykane sind normalerweise an der Zelloberfläche als Seitenketten sogenannter Proteoglykane verankert (48). Diese Glykosaminoglykane unterteilen sich wiederum in solche, die über eine Transmembrandomäne in der Membran verankert sind, und solche, die über einen GPI-Anker daran binden. Die abundantesten Vertreter der ersten Gattung stellen die Syndekane, die der zweiten Gattung die Glypikane (48). Da nach einem Verdau mit Phospholipase C keine Änderung an der Bindung von gHΔTM-Fc auf Vero-Zellen feststellbar war (nicht gezeigt), wurde der Fokus im Folgenden auf die Syndekane, einer Familie aus vier homologen Proteoglykanen, gelegt. Aus gesamtzellulärer RNA von Jsc-1- und 293T-Zellen wurden die Syndekane 1, 2 und 4 kloniert. Syndekan 3 wird laut Literatur vor allem in neuronalen Geweben (49) und bei der Chondrogenese (50) exprimiert. Es wurde daher nicht berücksichtigt. Mittels Durchflusszytometrie wurde untersucht, ob Überexpression von Syndekanen in 293T-Zellen die Bindung von gHΔTMFc sowie gHΔTM-Fc/gL verstärkt. Man erkennt für beide klar einen Anstieg der Bindung (Abb. 14 I und III) auf Zellen, die Syndekane überexprimieren. Eine Bindung der Glykoproteine H und L legt natürlich den Verdacht nahe, dass Syndekane auch bei der KSHV-Infektion eine Rolle spielen. Um dies zu überprüfen, wurden Syndekane wie oben in 293TZellen überexprimiert und anschließend mit rKSHV.219 infiziert. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg der KSHV-Infektion bei Syndekan-(Über-)Expression (Abb. 14 B I und II). Dieser relative Anstieg konnte durch Vorinkubation des Virus mit Heparin revertiert werden (Abb. 14 B II). Unabhängig von Syndekan-Überexpression inhibiert Heparin die Infektion zu etwa 80 %. 36 Ergebnisse Abbildung 14: gH bindet Syndekane und Syndekanexpression verstärkt die Infektion durch KSHV. A) I) 293T-Zellen wurden mit Expressionsplasmiden für Syndekan 1, 2 und 4 transfiziert. Anschließend wurde ein FACS-Bindungstest mit gereinigtem gHΔTM-Fc, gHΔTM-Fc - vorinkubiert mit Heparin - und K14-Fc als Kontrollprotein durchgeführt. Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz an Zellen, die eine gewisse Signalstärke bei der Detektion der gebundenen Proteine übersteigen. Alle getesteten Syndekane erhöhten eindeutig die Bindung von gHΔTM-Fc. II) SDS-Polyacrylamidgel mit Silberfärbung der für die Bindungsstudie verwendeten Proteine. III) 293T-Zellen wurden transfiziert wie in I. Anschließend wurde ein FACS-Bindungstest mit Überstand, der lösliches gHΔTM-Fc/gL enthält, wie in I durchgeführt. Gezeigt ist in I und III je ein exemplarisches Experiment aus dreien. B) I) 293T-Zellen wurden transfiziert wie in A und anschließend mit rKSHV.219 infiziert. Nach drei Tagen wurde die Infektion mittels Durchflusszytometrie und Detektion des GFP-Reportergens von rKSHV.219 detektiert. II) Reversion des Syndekan-vermittelten Effekts durch Heparin. 293T-Zellen wurden mit einem Expressionskonstrukt für Syndekan 1 transfiziert und anschließend mit rKSHV.219 infiziert. Der schattierte Balken zeigt die Infektionsrate nach Vorinkubation des Virus mit Heparin, was sowohl zu einer Reversion des verstärkenden Effekts der Syndekanexpression führte als auch zu einer allgemeinen Inhibition der KSHV-Infektion. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). 37 Ergebnisse 5.2.4. Expression von gH und gL in Zielzellen interferiert mit nachfolgender KSHV-Infektion Um die Relevanz der gH/gL Interaktion mit zellulären Rezeptoren zu verdeutlichen, wurde untersucht, ob Expression von gH und gL in 293T-Zellen mit nachfolgender KSHV-Infektion interferiert. Die Zielzellen wurden zwei Tage vor der Infektion mit Expressionsplasmiden für gH und gL transfiziert. Wie sich zeigte, hemmt Expression von gL kaum merklich und die von gH leicht die Infektion. Wurden allerdings beide Moleküle in den Zielzellen exprimiert, fiel die Infektionsrate deutlich ab (Abb. 15). Abbildung 15: Expression von gH/gL auf Zielzellen interferiert mit der KSHV-Infektion. 293T-Zellen wurden zwei Tage vor Infektion mit Expressionsplasmiden für gH, gL oder beide Proteine transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurde die Infektionseffizienz über das GFP-Reportergen mittels Durchflusszytometrie ermittelt. Expression von gH und gL zusammen führte zu einem signifikanten Abfall (t-Test, p<0,05) der KSHV-Infektion. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). 5.2.5. Existenz weiterer zellulärer Rezeptoren für KSHV gH/gL Es zeigte sich schon bei Bindungsversuchen auf 293T-Zellen eine gewisse residuale Bindung von gHΔTM-Fc/gL trotz Vorinkubation der Glykoproteine mit Heparin (Abb. 13 D). Um die Hypothese zu überprüfen, dass Proteoglykane nicht die einzigen zellulären Rezeptoren für gH/gL sind, wurden Immunfluoreszenzbindungstests, zellbasierte Enzym-gekoppelte Immunosubstrattests (CELISA) und auch FACS-Bindungstests auf Heparansulfat- 38 Ergebnisse defizienten sog9-Mausfibroblasten durchgeführt. Es war im Gegensatz zu gHΔTM-Fc alleine – welches nicht an diese Heparansulfat-negative Zellen bindet – mit löslichem gHΔTM-Fc/gL eine auffallend deutliche Bindung an sog9-Zellen zu beobachten (Abb. 16). Zudem war diese Bindung auch mit hohen Heparinkonzentrationen nicht blockierbar (Abb. 16 A, C). Abbildung 16: gH/gL bindet auch unabhängig von Heparansulfat an Zelloberflächen. A) Heparansulfat-negative sog9-Mausfibroblasten wurden mit gHΔTM-Fc/gL, gHΔTM-Fc oder Fc inkubiert und anschießend durch indirekte Immunfluoreszenz auf gebundenes Protein detektiert. Es zeigte sich klar eine Bindung von gHΔTM-Fc/gL, die auch durch Vorinkubation mit Heparin nicht blockiert werden konnte. Wie in den vergrößerten Ausschnitten zu erkennen, bindet gHΔTM-Fc/gL vor allem an Lamellipodium-artigen Strukturen. B) gHΔTM-Fc/gL bindet auch in einem zellbasierten ELISA deutlich detektierbar an sog9-Zellen, gHΔTM-Fc alleine nicht. C) gHΔTM-Fc/gL (schwarze Linie) bindet im FACS-Bindungstest an sog9-Zellen, auch bei Vorinkubation mit Heparin (graue Linie). gHΔTM-Fc alleine (gestrichelte Linie) bindet nicht an diese Zellen. 5.3. Die Ephrin A2 Rezeptor-Tyrosinkinase ist ein Rezeptor für KSHV gH/gL Da eindeutig auf sog9-Zellen eine starke Bindung von gHΔTM-Fc/gL festgestellt werden konnte, sollte nun versucht werden, den zellulären Interaktionspartner zu identifizieren. In einem ersten Experiment wurde erst eine Oberflächenbiotinylierung und dann eine Immunpräzipitation mit gHΔTM-Fc/gL durchgeführt. Hierbei wurden Proteine auf der Außenseite der Membran mittels Sulfo-NHS-Biotin (Pierce) an Aminoresten kovalent mit Biotin gekoppelt. Bei einer späteren Detektion mittels Streptavidin konnten so membranständige Proteine selektiv detektiert werden. Es zeigte sich klar, dass mit gHΔTM-Fc/gL, aber nicht mit gHΔTM-Fc alleine ein Membranprotein von ca. 110 kDa präzipitiert (Abb. 17). 39 Ergebnisse Abbildung 17: Der gH/gL-Komplex bindet ein Membranprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 110 kDa. sog9-Zellen wurden Oberflächen-biotinyliert und mit 1 % NP40 150 mM NaCl 2,5 mM EDTA/EGTA 25 mM HEPES lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt und anschließend mit Protein-ASepharose - vorgekoppelt mit Fc, gHΔTM-Fc oder gHΔTM-Fc/gL - inkubiert. Die gewaschenen Präzipitate wurden daraufhin im Western-Blot auf Biotin analysiert. Es zeigt sich eine deutliche Bande bei ca. 110 kDa nach Präzipitation mit gHΔTM-Fc/gL. Zur Identifizierung des an gH/gL bindenden Proteins über Massenspektrometrie wird eine wesentlich höhere Proteinmenge benötigt als für den Nachweis des biotinylierten Proteins. Folglich wurde das Experiment hochskaliert, sodass schließlich pro Probe aus dem Lysat dreier dicht bewachsener 10-cm-Zellkulturschalen präzipitiert wurde (~60 Mill. Zellen). Das Gel wurde anschließend mit kolloidalem Coomassie gefärbt. Zwei bei ca. 110 kDa erscheinende Banden wurden ausgeschnitten und zur Identifikation der Arbeitsgruppe von Simone König (IZKF Münster) zugesandt. Aus beiden Proben wurde nach tryptischem Verdau sowohl über MALDI-TOF als auch LC-MS/MS eindeutig die murine Ephrin RezeptorTyrosinkinase A2 identifiziert (Tabelle 3). 40 Ergebnisse Peptid Masse IAYSLLGLK NGVSGLVTSR FADIVSILDK TVSEWLESIK WTAPEAISYR EVVLLDFAAMK VWKYEVTYR VIGAGEFGEVYK YLANMNYVHR VVQMSNEDIKR WTAPEAISYRK LPSTSGSEGVPFR GELGWLTHPYGK FTTEIHPSCVAR TASVSINQTEPPK TNWVYREEAER FADIVSILDKLIR.A DGEFSVLQLVGMLR TASVSINQTEPPKVR VIGAGEFGEVYKGTLK VLEDDPEATYTTSGGK VSIRLPSTSGSEGVPFR EKDGEFSVLQLVGMLR STTSLSVTWSIPVSQQSR IDTIAPDEITVSSDFEAR TYVDPHTYEDPNQAVLK IAYSLLGLKDQVNTVGIPI YKPMMIITEYMENGALDK VLEDDPEATYTTSGGKIPIR QFTKIDTIAPDEITVSSDFEAR 976.60 988.53 1119.62 1190.62 1192.59 1234.66 1242.64 1267.64 1279.61 1317.67 1320.68 1332.67 1356.68 1359.66 1370.70 1451.68 1501.89 1562.81 1625.87 1666.89 1681.77 1787.95 1819.95 1963.00 1977.95 1988.95 2013.15 2146.01 2161.09 2482.22 Untere Bande MALDILCTOF MS/MS X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Obere Bande MALDILCTOF MS/MS X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Tabelle 3: Muriner EphA2 zugehörige Peptide nach tryptischem Verdau zweier aus dem Gel nach Immunpräzipitation ausgeschnittener Proben. Aus dem mit kolloidalem Coomassie gefärbten Polyacrylamidgel wurden zwei Banden bei ca. 110-130 kDa ausgeschnitten und nach Extraktion und tryptischem Verdau mittels MALDI-TOF und LC-MS/MS auf Peptidfragmente analysiert. Die Tabelle zeigt alle in den Proben gefundenen zu muEphA2 gehörigen Fragmente. MS/MS-Fragmente wurden eindeutig sequenziert, was die Identität des Proteins bestätigt. 41 Ergebnisse 5.3.1. Der KSHV gH/gL Komplex interagiert mit der Ektodomäne von EphA2 Die durch die Identifikation von EphA2 nach Immunpräzipitation mit gHΔTM-Fc/gL bereits implizierte Interaktion der beiden Moleküle sollte weiter verifiziert werden. Hierzu wurden Expressionsplasmide für humane EphA2 sowie für den extrazellulären Teil plus Transmembrandomäne von humaner und muriner EphA2 hergestellt. Diese wurden in 293T-Zellen transfiziert. Bei Immunpräzipitation mit löslichem gHΔTM-Fc/gL aus 293T-Zellen, die mit einem Expressionskonstrukt für EphA2 ohne intrazelluläre Domäne transfiziert worden waren, konnte eine starke Interaktion mit der extrazellulären Domäne der humanen EphA2 beobachtet werden (Abb. 18 A). Außerdem wurde untersucht, ob sich die Bindung von gHΔTM-Fc/gL auf Zellen durch EphA2-Überexpression im FACS-Bindungstest verändert. Es zeigte sich hierbei deutlich eine verstärkte Bindung von gHΔTM-Fc/gL an EphA2 exprimierende Zellen sowohl mit Volllängen-EphA2 als auch mit intrazellulär deletierter humaner oder muriner EphA2 (Abb. 18, B). Umgekehrt bindet lösliches solEphA2-Fc an Zellen, die KSHV gH/gL exprimieren (Abb. 18 C). Das solEphA2-Fc-Fusionsprotein wurde hierzu analog zu den anderen Fc-Fusionsproteinen aus der Ektodomäne von EphA2 und humanem IgG1-Fc konstruiert und gereinigt. Es war zudem möglich, mit löslichem EphA2-FcFusionsprotein die Bindung von gHΔTM-Fc/gL an Zellen zu kompetitieren (Abb. 18 D). Die Intensität der gemessenen Bindung konnte dabei ungefähr auf die Hälfte reduziert werden, die residuale Bindung (vermutlich an Heparansulfat-Proteoglykane) konnte nicht weiter inhibiert werden. Bereits Konzentrationen von weniger als 1 µg/ml (also kleiner 6 nM für solEphA2-Fc) waren dabei voll inhibitorisch. 42 Ergebnisse Abbildung 18: Physische Interaktion von KSHV gH/gL mit EphA2. A) Der extrazelluläre Teil von EphA2 interagiert mit gH/gL. 293T-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid für EphA2 (direkt C-terminal der Transmembrandomäne trunkiert, mit myc-Epitop, pEphA2ΔICmyc) transfiziert. Aus dem Lysat dieser Zellen wurde mit gHΔTM-Fc, gHΔTM-Fc/gL oder Fc als Kontrolle präzipitiert. B) Lösliches gHΔTM-Fc/gL bindet an EphA2. 293T-Zellen wurden mit Expressionskonstrukten für humane EphA2, humane EphA2 ohne intrazellulären Teil (ΔIC) oder murine EphA2 ohne intrazellulären (ΔIC) Teil transfiziert. Anschließend wurde ein FACS-Bindungstest mit gHΔTM-FcStrep/gL- oder FcStrep-haltigen Überständen durchgeführt (Detektion über Strep-Tactin-PE, FL-2). Es zeigte sich eine eindeutig verstärkte Bindung von gHΔTM-FcStrep/gL auf den EphA2 exprimierenden Zellen. C) Lösliche EphA2 (solEphA2-Fc) bindet an membranständiges gH/gL. 293T-Zellen wurden mit pcDNA oder Expressionsplasmiden für gH und gL transfiziert. Anschließend wurde mit diesen Zellen ein FACSBindungstest mit Fc oder solEphA2-Fc durchgeführt (Detektion über anti-human-FITC, FL-1). D) Lösliche EphA2-Fc blockiert spezifisch die Bindung von gHΔTM-Fc/gL an 293T-Zellen. Es wurde ein FACS-Bindungstest mit gHΔTM-FcStrep/gL auf 293T-Zellen durchgeführt. Zuvor wurde der gHΔTMFcStrep/gL-haltige Überstand entweder mit solEphA2-Fc oder Fc vorinkubiert. Detektion erfolgte in diesem Fall über gegen das Strep-Tag gerichtetes Strep-Tactin-PE-Konjugat, um zwischen gHΔTMFcStrep/gL und Kompetitor zu unterscheiden. solEphA2-Fc inhibierte die Bindung von gHΔTM-FcStrep/ gL halbmaximal bereits im Konzentrationsbereich unter 1 µg/ml, also unter etwa 6 nM. 43 Ergebnisse 5.3.2. Überexpression von EphA2 verstärkt die KSHV-Infektion Um den Einfluss von EphA2 auf die KSHV Infektion weiter zu untersuchen, wurden 293Tund H1299-Zellen mit dem Expressionsplasmid pEphA2mychis stabil transfiziert und anschließend mit rKSHV.219 infiziert. Die Infektion von 293T- und H1299-Zellen mit rKSHV.219 führt zur Etablierung der Latenz und nicht zur lytischen Replikation. Die Infektionsrate mit diesem konstitutiv GFP-exprimierenden Virus konnte daher drei Tage nach der Infektion mittels FACS-Analyse gemessen werden. Es zeigte sich klar ein Anstieg der KSHV-Infektionsrate durch Überexpression von EphA2. Die Effizienz der KSHV-Infektion korreliert also mit der Expression von EphA2. Ein ebensolcher Effekt kann bei transienter Überexpression von EphA2 in 293T-Zellen beobachtet werden (nicht gezeigt). Abbildung 19: Überexpression von EphA2 verstärkt die KSHV Infektion. 293T- und H1299-Zellen wurden mit einem Expressionsplasmid für EphA2 transfiziert und anschließend mit Zeozin selektioniert. Die resultierenden, EphA2-überexprimierenden Zellen wurden mit rKSHV.219 infiziert und nach drei Tagen mittels FACS auf Expression des GFP-Reportergens untersucht. Es zeigte sich ein signifikanter (t-Test) Anstieg der KSHV Infektion in den EphA2-überexprimierenden Zellen. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung aus drei Experimenten. 44 Ergebnisse 5.3.3. Lösliches EphA2 inhibiert die KSHV-Infektion Um die Bedeutung der Interaktion von EphA2 mit gH/gL weiter zu charakterisieren, wurde versucht, das zelluläre, membranständige EphA2 bei der Bindung von gHgL auf der Virusoberfläche im Kontext der Infektion mit rekombinantem, löslichem EphA2 zu kompetitieren. Hierzu wurde solEphA2-Fc benutzt, das lösliche Fc-Fusionsprotein der Ektodomäne von EphA2. Vorinkubation von rKSHV.219 mit diesem löslichen Rezeptor resultierte in einer deutlichen Inhibition der KSHV-Infektion (Abb. 20 A, linkes Diagramm). Diese Inhibition war konzentrationsabhängig mit einer sehr steil verlaufenden Hemmkurve. Die Inhibition war zudem spezifisch für KSHV, ein Kontrollvirus (Herpesvirus saimiri, Mutante M45; kodiert ebenfalls für GFP) wurde nicht gehemmt (Abb. 20 A, rechtes Diagramm). Es ergab sich ein IC50-Wert (halbmaximal-inhibitorische Konzentration) von ca. 0,1 µg/ml oder 0,5 nM für lösliches, dimeres solEphA2-Fc. Gleichartige Versuche (hier wurden allerdings die Zellen, nicht das Virus mit dem Protein vorinkubiert) mit einem natürlichen Liganden von EphA2, Ephrin A1/EFNA1, fusioniert an Fc (EFNA1-Fc) zeigten keinerlei Inhibition der KSHV-Infektion durch EFNA1-Fc (Abb. 20 B). Die Hemmung der KSHV-Infektion durch lösliches EphA2 war bei einer Reihe weiterer Zelllinien möglich (Abb. 20 C). Interessanterweise war die Inhibition durch lösliches solEphA2-Fc auf Vero-Zellen am stärksten ausgeprägt. Hier scheint die Infektion tatsächlich fast ausschließlich über EphA2 abzulaufen und diese Zellen exprimieren auch mit Abstand am meisten EphA2 mRNA, wie durch quantitative RT-PCR bestimmt wurde (Abb. 20 C, unteres Diagramm). Trägt man das Ausmaß der Hemmung durch lösliche EphA2 gegen die logarithmierte Expression der EphA2 mRNA auf, so erhält man eine sehr gute Korrelation mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,82 (Abb. 20 D). Einfach ausgedrückt lässt sich die KSHV-Infektion um so besser durch lösliche EphA2 hemmen, je stärker EphA2 auf den Zielzellen exprimiert wird. 45 Ergebnisse Abbildung 20: Lösliches EphA2-Fc blockiert die KSHV Infektion. A) 293T-Zellen wurden mit rKSHV.219 infiziert. Das Virus wurde zuvor für 30 Minuten mit den angegeben Konzentrationen an löslichem EphA2-Fc (schwarze Kreise) oder Fc (leere Rechtecke) vorinkubiert. Die Infektion wurde nach vier Tagen mittels FACS quantifiziert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). Rechts dargestellt ist eine Kontrollinfektion mit Herpesvirus saimiri M45. B) EFNA1-Fc hat keinen Einfluss auf die KSHV-Infektion. 293T-Zellen wurden genauso wie in A infiziert, jedoch wurden diesmal die Zellen 30 min mit EFNA1-Fc (schwarze Kreise) vorinkubiert. C) Verschiedene Zelllinien wurden mit rKSHV.219 infiziert wie in A. Das Virus wurde jeweils mit 5 µg/ml Fc oder solEphA2-Fc für 30 min vorinkubiert. Die Infektion mit Fc (Kontrolle) ist in der Darstellung auf 100 % gesetzt und die Zelllinien wurden sortiert nach dem Ausmaß der Inhibition durch solEphA2-Fc. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). Darunter dargestellt ist das Ergebnis einer quantitativen RealTime PCR auf EphA2 mRNA Expression in den jeweiligen Zelllinien, normiert auf Aktin mRNA Expression. D) Die Hemmbarkeit der Infektion durch solEphA2-Fc (x-Achse) korreliert mit dem Expressionsniveau der EphA2 mRNA (y-Achse, logarithmische Darstellung). Korrelationskoeffizient: 0,82. 46 Ergebnisse 5.3.4. KSHV Bindung erhöht den Phosphorylierungsstatus von EphA2 Der Phosphorylierungsstatus von EphA2 ist ein wichtiges Kriterium für die Lokalisation des Proteins sowie die Substratspezifität von EphA2. Auch wenn die Kinaseaktivität von EphA2 wenigstens teilweise unabhängig von Ligandenbindung und dem Phosphorylierungsstatus von EphA2 zu sein scheint (51), so entscheidet die Phosphorylierung von EphA2 aber über die Fähigkeit, weitere Signaltransduktionsmoleküle zu rekrutieren (52). Aus diesem Grund wurde untersucht, ob KSHV in der Lage ist, den Phosphorylierungsstatus von EphA2 zu beeinflussen. 293T-Zellen wurden mit rKSHV.219 oder einer Kontrollpräparation stimuliert. Anschließend wurde ein ELISA durchgeführt, der semiquantitativ die Phosphorylierung von EphA2 misst. Es zeigte sich hierbei klar ein Anstieg nach Stimulation mit rKSHV.219 oder EFNA1-Fc, nicht aber mit hitzeinaktiviertem rKSHV.219 (Abb. 21 A). Die Aktivierung von EphA2 durch den natürlichen dimerisierten Liganden EFNA1-Fc war ähnlich stark wie die durch KSHV. In einer weiteren Versuchsreihe wurde das Virus oder die Kontrollpräparation jeweils mit Fc, solEphA2-Fc oder EFNA1-Fc vorinkubiert (Abb. 21 B). Bei Zugabe des Kontrollproteins Fc war wieder eine Stimulation der EphA2Phosphorylierung durch KSHV zu beobachten (Abb. 21 B, erstes Säulenpaar). Zugabe von solEphA2-Fc verhinderte diese Induktion der Phosphorylierung durch KSHV (Abb. 21 B, mittleres Säulenpaar). Zugabe von EFNA1-Fc (Abb. 21 B, rechtes Säulenpaar) zeigte wieder, dass die Phosphorylierung von EphA2 durch den dimerisierten natürlichen Liganden induzierbar ist. Die Aktivierung wurde durch KSHV noch etwas weiter verstärkt. Dies passt zu dem Befund, dass sich die KSHV Infektion auch nicht durch EFNA1-Fc hemmen lässt (Abb. 20 B). Stimulation von stabil EphA2-myc exprimierenden Zellen mit rKSHV.219 und anschließende Immunpräzipitation von EphA2-myc mit dem monoklonalen gegen das myc-Epitop gerichteten Antikörper 9E10 gefolgt von Western-Blot-Analyse mit einem antiPhosphotyrosin-Antikörper zeigten ebenfalls eine verstärkte Phosphorylierung von EphA2 nach Stimulation mit KSHV. Dies gilt auch nach Normalisierung der Signalintensität des Phosphotyrosin-Signals auf das EphA2-Signal. Die Immunpräzipitation von EphA2 scheint in Anwesenheit von rKSHV.219 etwas effizienter zu funktionieren, was vermutlich auf die KSHV-vermittelte Kreuzvernetzung zurückzuführen ist. 47 Ergebnisse Abbildung 21: KSHV induziert Phosphorylierung von EphA2. A) 293T-Zellen wurden für 10 min mit rKSHV.219 stimuliert. Als Negativkontrolle wurde sowohl hitzeinaktiviertes rKSHV.219 als auch konzentrierter Überstand von chemisch induzierten, KSHV-negativen 293-Zellen benutzt. Als Positivkontrolle wurde der dimerisierte natürliche Ligand als Fc-Fusionsprotein in einer Konzentration von 5 µg/ml eingesetzt (EFNA1-Fc). Es zeigt sich eine mit der Positivkontrolle vergleichbare Erhöhung der EphA2-Phosphorylierung durch Stimulation mit KSHV. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=5 für Kontrolle, rKSHV.219 und EFNA1-Fc; n=2 für hitzeinaktiviertes rKSHV.219). B) 293T-Zellen wurden ebenso wie in A stimuliert, allerdings wurde die Viruspräparation 30 min zuvor mit 5 µg/ml Fc, EFNA1-Fc oder solEphA2-Fc vorinkubiert. Man erkennt deutlich, dass lösliche EphA2 in der Lage ist, die Aktivierung von EphA2 durch KSHV zu revertieren. EFNA1-Fc hingegen hat keinen negativen Effekt, sondern aktiviert EphA2 sowohl in Abwesenheit als auch zusammen mit KSHV. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n=3). C) 293T-Zellen wurden zunächst mit pEphA2mychis transfiziert und mit Zeozin selektioniert. Die resultierenden, stabil EphA2 exprimierenden Zellen wurden daraufhin wie in A mit rKSHV.219 oder einer Kontrollpräparation stimuliert. Anschließend wurde Lyse und Immunpräzipitation gegen das myc-Epitop durchgeführt. Die Proben wurden mittels Western-Blot sowohl auf Phosphotyrosin (oben) wie auch nach Entfernen der ersten Markierung auf EphA2 detektiert (unten). Die Signale wurden densitometrisch quantifiziert und anschließend aufeinander bezogen. Das Signalverhältnis der ersten Kontrollprobe wurde dabei auf 100 % gesetzt. 48 Ergebnisse 5.4. Ausblick: PML-Komponenten beeinflussen die Etablierung der KSHV Infektion Bei der Etablierung der Virusinfektion ist nicht nur der Eintritt in die Zielzelle von Bedeutung. Direkt im Anschluss muss das Herpesvirus sein Nukleokapsid vom Eintrittsort zu einer Kernpore und letztendlich das Genom in den Kern transportieren (53)(54). Nach Freisetzung des Genoms in den Zellkern muss das Genom zirkularisieren, Transkription muss initiiert werden und das Genom muss so im Kern verankert werden, dass es beispielsweise bei Teilungen nicht verloren geht. Für HSV und CMV wurde gezeigt, dass in dieser Phase der Infektion, nach dem Eintritt in die Zelle, offenbar Komponenten der so genannten PML-Körper eine Rolle spielen (55)(56)(57)(58). Es sollte nun untersucht werden, ob diese Faktoren auch für KSHV von Bedeutung sind. Hierzu wurden HFF-Zellen benutzt, die stabil mit einer lentiviralen Expressionskassette für shRNAs gegen Komponenten der PML-Körper transduziert waren und diese so nicht mehr exprimieren. Diese Zellen wurden von Nina Tavalai im Rahmen einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Stamminger bereitgestellt. Diese für hDaxx (58), SP100 (55) und PML (58) defizienten Zellen wurden mit rKSHV.219 infiziert und auf Expression des GFP Reportergens von rKSHV.219 untersucht (Abb. 22). Abbildung 22: PML reprimiert die Etablierung einer latenten KSHV-Infektion. HFF-Zellen wurden mit sh-RNA kodierenden Lentiviren transduziert und selektioniert. Es handelt sich dabei entweder um eine Kontroll-shRNA oder um solche, die gegen die genannten Proteine gerichtet sind. Diese Zellen wurden mit rKSHV.219 infiziert und nach 12 Tagen mittels FACS auf Expression des grünen Reportergens von rKSHV.219 analysiert. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung wo möglich (Anzahl Experimente: n=1 für kein Virus, n=2 für Vektor, sonst n=3). 49 Ergebnisse Es zeigte sich eine deutlicher Anstieg der KSHV-Infektion bei Zellen mit gestörter PML-Expression. Ein weniger deutlicher Anstieg war bei für SP100 defizienten Zellen zu verzeichnen; Fehlen von hDaxx schien hingegen keine Auswirkung zu haben. Diese Versuche zeigen eindeutig, dass weitere dem Zelleintritt nachfolgende Ereignisse im Kontext der PMLKörper einen starken Einfluss auf die Etablierung der KSHV-Infektion nehmen und legen den Schluss nahe, dass PML ein zellulärer Restriktionsfaktor für KSHV ist. 50 Diskussion 6 Diskussion 6.1. Allgemein Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Proteine entdeckt, die mit KSHV-Hüllproteinen interagieren. Des weiteren konnte die Bedeutung von Heparansulfat-Proteoglykanen, besonders in Bezug auf die Interaktion mit gH und gL, weiter untermauert werden. Zusammen mit den bereits bekannten Rezeptoren und Eintrittsmechanismen ergibt sich so ein zunehmend komplexeres Bild der KSHV Infektion. Ging man früher meist davon aus, dass die Infektion von Herpesviren wie die einfacher aufgebauter Viren weitgehend nach dem Schema „Bindung auf der Zelloberfläche → Rezeptorinteraktion → Fusion“ abläuft, scheint diese einfache Betrachtungsweise zumindest bei KSHV nicht länger gerechtfertigt. Die Vielzahl an zellulären Rezeptormolekülen legt den Verdacht nahe, dass gerade KSHV diese vielleicht weniger zum ausschließlichen Zweck der Zielzellerkennung und des Zelleintritts nutzt, sondern noch andere, bisher unverstandene Mechanismen in Gang gesetzt werden – wie beispielsweise die Induktion zellulärer Signalkaskaden. Zudem ermöglicht das Verwenden mehrerer verschiedener obligater Rezeptoren dem Virus, sein Wirtszellspektrum genauer zu definieren, nämlich auf Zellen die alle diese Rezeptoren tragen. Dies kann vor allem für ein Virus, das im immungesunden Wirt apathogen ist, von herausragender Wichtigkeit sein. Indem sich das Virus selbst auf klar definierte Zielzellen beschränkt, kann es die negativen Auswirkungen der Infektion für den Wirt klein halten. Auch können in unterschiedlichen Infektionsphasen unterschiedliche Rezeptoren von Bedeutung sein. Als fast sicher kann gelten, dass KSHV bei der Primärinfektion ein Epithel überwinden muss. Dies ist mechanistisch stark verschieden von der Infektion von Makrophagen oder dendritischen Zellen, die das Virus aktiv phagozytieren und zudem mit Lektinen die Bindung von KSHV fördern (25). Die Infektion von B-Zellen verlangt eventuell wieder nach einer anderen Strategie. Für das im Vergleich zu KSHV relativ gut erforschte EBV wurde bereits gezeigt, dass verschiedene Glykoproteinkomplexe an der Infektion von B-Zellen und Epithelien beteiligt sind (59). Die Glykoproteine stellen für das Virus den ersten Kontakt mit der Zelle her, sie sind daher auch die allererste Möglichkeit, zelluläre Prozesse über das Anstoßen von Signalkaskaden zu beeinflussen, noch bevor das Tegument freigesetzt wird oder gar Genexpression stattfindet. Dies scheint auch bei KSHV ausgenutzt zu werden. Zudem ist dieser Weg unab- 51 Diskussion hängig davon, ob überhaupt Infektion oder auch nur der Eintritt in die Zielzelle stattfindet, und kann so auch auf nicht-permissive Zellen wirken und ein „infektionsfreundliches“ Milieu fördern. Abbildung 23: Erweitertes Schema zum Entry von KSHV. Durch die zwei neu definierten Rezeptoren entsteht ein deutlich komplexeres Bild. Mit EphA2 ist ein potentes Signaltransduktionsmolekül hinzugekommen. KSHV assembliert mit EphA2, Integrinen und Mitgliedern der Syndekanfamilie Proteine, die teils überlappende Signalkaskaden beeinflussen können (Focal-Adhesion-Kinase, MAP-Kinase, PI-3-Kinase, Proteinkinase C) und für die jeweils gesondert Beteiligung an endozytotischen Prozessen beschrieben wurde. Mögliche Funktionen von FLJ40722 sind derzeit noch völlig unbekannt. 6.2. FLJ40722 Das in dieser Arbeit als Interaktionspartner von K8.1 entdeckte und erstmals beschriebene Protein FLJ40722 ist ein auf der Zellmembran exprimiertes Protein mit vermutlich zwei bis sechs Transmembrandomänen und höchstens minimaler Glykosylierung (vgl. Abb. 4). Bioinformatisch gesehen scheint FLJ40722 eine eigene Proteinfamilie darzustellen, da es von keinem der gängigen Algorithmen in eine bekannte Proteinfamilie einsortiert wird. Obwohl FLJ40722 bei allen Wirbeltieren sehr gut konserviert ist, was auf eine essentielle Funktion hinweist, ist dieses Protein bisher vollständig unerforscht. Über die physiologische Bedeutung dieses Proteins kann daher nur spekuliert werden. Interessant ist hier die Tatsache, dass es in Zellen endothelialen Ursprungs (HUVEC-TI) sowie in drei getesteten PEL-Zelllinien hoch exprimiert ist (Abb. 9). Dieser Befund passt gut zu der Tatsache, dass endotheliale Zellen von KSHV infiziert werden und an der KS-Entstehung beteiligt sind (21). Das 52 Diskussion Expressionsmuster von FLJ40722 entspricht damit den nachgewiesenen Zielgeweben von KSHV in vivo, nämlich PEL-Zellen und Endothel. Da Knock-Down von FLJ40722 (Abb. 7) wie auch Blockade mit Antiseren (Abb. 6) die KSHV-Infektion in humanen Zellen inhibieren, liegt der Schluss nahe, dass KSHV FLJ40722 als Rezeptor beim Zielzelleintritt nutzt. Auch die Steigerung der KSHV-Permissivität bei Überexpression in murinen Zellen untermauert diese Hypothese. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass FLJ40722 in seiner hier verwendeten Form nicht die einzige Spleißvariante dieses hier erstmalig beschriebenen Gens darstellt. Eine mögliche Rolle weiterer Spleißvarianten ist denkbar. So ist in Jsc-1-Zellen noch eine Variante mit alternativem C-Terminus zu finden (nicht gezeigt). Erschwert wird eine eindeutige Analyse durch das generell niedrige Expressionsniveau der FLJ40722-mRNA. Es ist zwar leicht möglich, nach reverser Transkription und 30-35 Zyklen PCR Existenz von cDNA über relativ kurze Amplifikate nachzuweisen, allerdings war es nicht möglich, die vollständige cDNA zu amplifizieren. In den Datenbanken des NCBI erscheinen laufend neue Varianten von FLJ40722 mit leichten Sequenzvariationen aufgrund unterschiedlichen Spleißverhaltens, es bedarf hier noch genauerer Expressionsanalysen. Erstaunlich ist, dass sowohl FLJ40722 als auch K8.1 für sich einzigartige Proteine sind, die keiner bekannten Familie angehören. 6.3. gH/gL Auch gH und gL sind in gewisser Hinsicht ungewöhnliche Glykoproteine. Sie kommen in allen Herpesviren als Heterodimer vor, mit gH als Transmembranprotein und dem etwa vier mal kleineren gL auf der Außenseite der Membran. Der Aufbau erinnert insgesamt entfernt an zelluläre Integrine. Die Konserviertheit dieser eigentümlichen Paarung deutet wahrscheinlich auf einen konservierten Mechanismus bei der Infektion hin. Während die Dimerisierung in einigen Herpesviren obligat für die Expression von gH auf der Membran zu sein scheint, ist dies nach den Ergebnissen dieser Arbeit (Abb. 10 und 11) bei KSHV nicht so, ähnlich der Situation bei MHV-68 (60) oder RRV (Ron Desrosiers, persönliche Kommunikation). Die hier gezeigten Ergebnisse sind somit analog zu Befunden bei anderen Rhadinoviren und widersprechen damit direkt einer früheren Veröffentlichung aus der Gruppe von Bala Chandran (46). Interessanterweise wird gH alleine auf der Zelloberfläche exprimiert, obwohl es vollständig EndoH sensitiv ist (Abb. 12). Dies steht im Widerspruch zur biochemischen Lehrmeinung. 53 Diskussion Ein leider notwendiger technischer Kunstgriff war die Insertion eines Flag-Epitops hinter dem Signalpeptid in die Aminosäuresequenz von gH, die mangels guter Antikörper gegen das native Protein nötig war. Die Funktionalität und korrekte Faltung des verwendeten, Nterminal Flag-Epitop-markierten gH-Konstrukts pAB34Flag darf allerdings mit hoher Sicherheit angenommen werden. Zudem wurden noch eine Reihe hier nicht gezeigter Kontrollen durchgeführt: pAB34Flag relokalisierte gL im gleichen Ausmaß wie Wildtyp-gH auf die Zelloberfläche und es war in der Lage sowohl mit gL wie auch im Beisein von gL mit EphA2 zu interagieren. Eine gH-Mutante mit Insertion des Flag-Epitops an Aminosäure-Position 559 wurde analog unabhängig von gL auf der Zelloberfläche exprimiert, es handelt sich hierbei also um kein Artefakt durch die N-terminale Insertion des FlagEpitops. Zumindest eine Funktionalität von gH, nämlich die Interaktion mit Heparansulfat-Proteoglykanen, ist ohne gL vorhanden (Abb. 13 und 14). Wahrscheinlich ist die Situation hier ähnlich der bei MHV-68. Auch bei diesem murinen Rhadinovirus gelangt gH ohne gL an die Zytoplasmamembran, nimmt dann aber eine andere Konformation ein (60). Ob die Variante ohne gL auch bei KSHV schneller zur Membranfusion führt, bedarf weiterer Untersuchungen. Denkbar ist sicher auch, dass gH ohne gL beim Egress und den damit verbundenen Fusionsereignissen an der Kernmembran und dem ER eine Rolle spielt. Wie in den konfokalen Immunfluoreszenzen klar erkennbar ist, lokalisiert gH auch in erheblichem Ausmaß in einer Art Ring um den Kern (Abb. 10). Dass gL tatsächlich „ein Chaperon“, also lediglich eine Faltungshilfe für gH, darstellt, wie oft in der Literatur zu Herpes Simplex beschrieben, darf bezweifelt werden. Die hier gezeigten Daten stützen die Hypothese, dass sowohl gH alleine wie auch gL und gH/gL als Komplex funktionell relevant sind. 6.4. Heparansulfat-Proteoglykanbindung Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane ist ein bei Pathogenen weit verbreiteter Mechanismus. Das sollte allerdings nicht zu der Annahme verleiten, dass dieser Mechanismus unspezifisch und damit unwichtig ist. Vielmehr weisen eine Vielzahl physiologisch bedeutsamer Proteine von den Blutgerinnungsfaktoren über Gewebshormone ebenso wie Pathogene Bindungsstellen für Heparansulfat auf. Heparin ist ein seit fast 100 Jahren bekannter Wirkstoff mit großem pharmazeutischem Potenzial und breiter klinischer Anwendung. Trotz der offensichtlich immensen physiologischen Bedeutung von Heparansulfat-Interaktionen ist eigentlich relativ wenig über Letztere bekannt. Die vereinfachte Annahme, es handele 54 Diskussion sich hierbei weitgehend um elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den negativ geladenen Sulfat-Resten und positiv geladenen Bindungspartnern ohne größere strukturelle Anforderungen, stimmt dabei oft nicht. Auch aufgrund struktureller Ähnlichkeiten der Polymere handelt sich wohl vielmehr um Interaktionen, die so ähnlich auch bei DNA- und RNAbindenden Proteinen vorkommen – teilweise sicher elektrostatisch, aber dennoch hochselektiv. Viele Heparinliganden unterscheiden sehr wohl zwischen geringfügigen Modifikationen, so erkennt zum Beispiel Herpes Simplex Glykoprotein D selektiv 3-O-sulfatiertes Heparansulfat und nutzt dieses Molekül als Rezeptor für die Infektion der Hornhaut des Auges (61). Die starke Interaktion auch selektiver Glykosaminoglykanliganden mit Heparin liegt lediglich daran, dass Heparin ein Gemisch aus vielen verschiedenen Glykosaminoglykanuntereinheiten mit einer Vielzahl von Modifikationen darstellt (62), sodass die Spezifitäten vieler heparinbindender Moleküle darin enthalten sind. Analog sind auch die Heparansulfat-Proteoglykane verschiedener Zellen und die der extrazellulären Matrix verschiedenartig modifiziert, was bereits am Beispiel von Syndekan-1 gezeigt wurde (63). Die sich daraus mit Sicherheit ergebenden Implikationen für den Gewebs- und Zelltropismus von Pathogenen sind leider noch weitgehend unerforscht, mit einigen wenigen Ausnahmen (wie oben erwähnt für HSV). Die in dieser Arbeit untersuchten Moleküle der Syndekanfamilie sind evolutionär hochkonserviert. Auch sind die vier Mitglieder der Syndekanfamilie untereinander sehr ähnlich. Es erscheint daher legitim zu vermuten, dass sich auch die Funktionen stark gleichen; lediglich das Expressionsmuster unterscheidet sich. Demnach war es auch logisch, dass alle untersuchten Syndekane bei Überexpression sowohl die Bindung von gH bzw. gH/gL als auch die KSHV-Infektion in einem vergleichbaren Ausmaß verstärkten (Abb. 14). Bemerkenswert ist, dass Syndekane an einer ganzen Reihe von Prozessen beteiligt sind, die für ein Virus beim Zelleintritt relevant sein können. So vermitteln Syndekane Endozytose (64). Sie sind in der Lage, durch Aggregation die Phosphatidylinositol-3-Kinase (65) zu rekrutieren oder die Proteinkinase C zu aktivieren (66) und so Signaltransduktion zu ermöglichen. Auch sind sie zusammen mit Integrinen an der Bildung von Fokalkontakten beteiligt und stellen eine Hauptkomponente dieser zellulären Ankerpunkte dar (67)(68). Fokalkontakte werden wiederum von KSHV und auch anderen Pathogenen für den Zelleintritt genutzt (69)(70). Eine einleuchtende Strategie, wenn man sich vor Augen hält, dass eine Zelle an einem Fokalkontakt „zieht“. Ist dieser Fokalkontakt nun nicht die extrazelluläre Matrix, sondern fälschlicherweise ein Pathogen, so wird dieses vermutlich aktiv an die Zelle heran ge- 55 Diskussion zogen. Auch muss ein solcher Fokalkontakt irgendwann wiederverwertet oder abgebaut werden (71). Dabei ohnehin auftretende endozytotische Ereignisse können von Pathogenen leicht missbraucht werden. 6.5. EphA2 Die Interaktion von gH/gL mit EphA2 ist in vielerlei Hinsicht bemerkenswert. Zunächst ist rein mechanistisch betrachtet die Existenz eines hochaffinen zellulären Rezeptors für gH/gL interessant. Gerade von Herpesvirologen aus dem Bereich der Alphaherpesviren wird oft die Ansicht vertreten, dass es sich bei gH/gL um einen „Executor of Fusion“ handele, ein Molekül, das nach erfolgter Rezeptorbindung durch gD - oder ein funktionell homologes Protein - rekrutiert wird, um die Membranen von Virus und Wirtszelle zu verschmelzen. Wenn der gH/gL-Komplex nun aber einen eigenen Rezeptor erkennt, deutet dies zumindest bei KSHV auf einen völlig anderen Mechanismus hin. Interessant ist, dass EphA2 durch Liganden-vermittelte Aktivierung aktiv endozytiert wird (72). Wahrscheinlich wird dieser zusätzliche endozytotische Stimulus ebenfalls durch KSHV ausgenutzt, auch in Verbindung mit Syndekanen und Integrinen, die ebenfalls Endozytose auslösen können. Interessanterweise interagiert EphA2 mit der Focal-Adhesion-Kinase und somit funktionell mit Integrinen (73), so dass ein kooperativer Effekt der Integrinbindung durch gB und der durch gH/gL vermittelten EphA2-Aktivierung bei der KSHV-Infektion nicht auszuschließen ist. Für EphA2 ist auch noch eine über das rein Mechanistische hinausgehende Bedeutung für die KSHV-Infektion und die KSHV-assoziierte Pathogenese denkbar. EphA2 gehört zur Proteinfamilie der Rezeptorproteinkinasen, die durch Ligandenbindung und Kreuzvernetzung aktiviert werden. Allerdings existieren Hinweise, dass für die Kinaseaktivität von EphA2 keine Ligandenbindung vonnöten ist. Vielmehr ist die Kinasedomäne wohl eher konstitutiv aktiv, es wird aber durch Ligandenbindung Kreuzvernetzung und Transphosphorylierung (evtl. auch Autophosphorylierung) ausgelöst, so der Ligand multimer ist. Zudem wird die Kinaseaktivität durch den Liganden an den Ort der Bindung rekrutiert. Das eigentliche Signal ist somit nicht die Kinaseaktivität selbst, sondern der Grad der EphA2Transphosphorylierung, der auch in in Abb. 21 gemessen wurde. Der Phosphorylierungsstatus entscheidet dann über die Rekrutierung weiterer Proteine (74). Durch die EphA2Proteinkinase werden so vielfältige Prozesse angestoßen wie Axonwachstum (75) oder Angiogenese (76). Zudem erhöht EphA2-Aktivierung die Permeabilität von Epithelien (77). 56 Diskussion EphA2 ist überdies ein Onkogen und Überexpression von EphA2 wirkt transformierend (78). EphA2 ist in vielen Tumoren überexprimiert (79) und hohe Expression von EphA2 korreliert im Allgemeinen mit schlechter Prognose und erhöhter Malignität; wohl auch, weil sie einen wichtigen Faktor bei der Tumorvaskularisierung darstellt (80)(81). EphA2 ist in der Lage, die mitogene Signalkaskade anzustoßen, die zur Aktivierung der MAP-Kinase führt (52). Aktivierung der MAP-Kinase könnte dazu dienen, die Zelle eher in einen mitogen aktivierten Zustand zu versetzen, der bei vielen DNA-Viren für die Replikation günstiger zu sein scheint. Allerdings ist bei dieser Schlussfolgerung Vorsicht angebracht, da teilweise auch gegenteilige Meinungen in der Literatur zu finden sind (82). Wahrscheinlich sind diese Mechanismen abhängig vom jeweiligen Zelltyp. In welchem Ausmaß die Kinaseaktivität von EphA2 bei der Etablierung der Infektion eine Rolle spielt, muss noch detailliert untersucht werden. Erste Versuche weisen darauf hin, dass es sowohl einen Kinase-abhängigen Effekt als auch einen rein über die Ektodomäne vermittelten Kinase-unabhängigen verstärkenden Effekt auf die KSHV-Infektion gibt (nicht gezeigt). Eine abschließende Beantwortung dieser Frage bedarf aber noch weiterer experimenteller Ausarbeitung. Es stellt sich nun die Frage, inwieweit die von KSHV vermittelte Aktivierung oder Rekrutierung von EphA2 einen Einfluss auf die KSHV-assoziierte Pathogenese hat. Es sind prinzipiell zwei Szenarien denkbar. Das erste und einfachste wäre, dass EphA2 lediglich als weit verbreiteter Rezeptor dient und nicht weiter mit der Pathogenese assoziiert ist. Die zweite Möglichkeit wäre, dass Aktivierung von EphA2 tatsächlich auch die Pathogenese beeinflusst. Der Befund, dass lösliches EphA2-Fc das Wachstum von KS allerdings auch das anderer Tumoren - im Mausmodell inhibiert (83), lässt diese Möglichkeit zumindest nicht unwahrscheinlich erscheinen. EphA2 wird in KS-Tumoren exprimiert und ist dort auch phosphoryliert (80). Die Vermutung, dass dies durch freie KSHV-Virionen oder gH/gL auf infizierten Zellen vermittelt wird, ist zumindest naheliegend. Wie in Abb. 21 gezeigt, induziert KSHV die Phosphorylierung von EphA2. Der hier festgestellte Anstieg der EphA2-Phosphorylierung ist zwar mit ungefähr 40 % (Abb. 21) eher mäßig, wirkt aber bei konstanter Virusfreisetzung, wie im KS, eventuell über viele Jahre. Über solche Zeiträume kann auch ein ursprünglich schwacher Effekt drastische Folgen haben. Die Tatsache, dass KSHV mit EphA2 ein Molekül als Rezeptor benutzt, das in vielen transformierten Zellen überexprimiert ist, lässt auch noch andere Vermutungen zu. So könnte KSHV durch EphA2 bevorzugt bereits transformierte Zellen infizieren. In einem immungeschwächten Individuum wäre das Immunsystem nicht in der Lage, diese dann auch noch 57 Diskussion KSHV-positiven Zellen effizient zu eliminieren. KSHV könnte so durch Infektion maligner oder prä-maligner Zellen noch weiter zur Tumorpromotion beitragen, entweder durch eine Entzündungsreaktion oder durch die KSHV eigenen vielfältigen parakrinen Effektoren, beispielsweise die zahlreichen viralen Zytokine. Die hochaffine Interaktion von gH/gL mit EphA2 eröffnet möglicherweise auch einen neuen therapeutischen Weg bei KSHV-assoziierten Erkrankungen und vor allem KS. Lösliches EphA2-Fc war in der Lage, bereits im sub-nanomolaren Konzentrationsbereich die KSHVInfektion deutlich zu inhibieren (Abb. 20). Da von anderen Gruppen bereits gezeigt wurde, dass lösliche EphA2 Tumorvaskularisation verhindert, könnten gerade bei der Behandlung des hochgradig vaskularisierten KS deutliche Synergien zwischen der Hemmung der KSHV-Infektion, der Hemmung der EphA2-Transphosphorylierung und der Hemmung der Tumorangiogenese auftreten. Dies um so mehr, als es zahlreiche Hinweise darauf gibt, dass kontinuierlich lytische Genexpression und Produktion von Viruspartikeln bei der Entstehung des KS stattfinden (84)(85)(86). 6.6. Abschließende Betrachtung Durch die im Rahmen dieser Arbeit als zelluläre Rezeptoren für KSHV identifizierten Proteine, FLJ40722 und Ephrin A2 Rezeptor-Tyrosinkinase sowie die ebenfalls in dieser Arbeit als wichtig für die KSHV-Infektion identifizierten Mitglieder der Syndekanfamilie, erweitert sich das Spektrum der Rezeptoren für KSHV deutlich. Diese Moleküle unterscheiden sich stark, auch in ihrer Interaktion mit KSHV. Während die Bindung an HeparansulfatProteoglykane durch deren Seitenketten vermittelt werden, sind die beiden anderen Rezeptoren „richtige“ Proteine. EphA2 erscheint vielleicht auf den ersten Blick als der „potentere“ Rezeptor. Allerdings kann dies täuschen. So war es bei FLJ40722 wahrscheinlich aufgrund der vielen hydrophoben Bereiche nicht möglich, löslichen Rezeptor auch nur fragmentweise rekombinant herzustellen. EphA2 war hier einer experimentellen Analyse deutlich einfacher zugänglich. Eine Beobachtung, die sich im Laufe dieser Dissertation aufgedrängt hat, ist folgende: Die meisten adhärenten Zelllinien lassen ohne weiteres eine latente KSHV-Infektion zu. Alle getesteten B-Zelllinien taten dies nicht (nicht gezeigt). Es lässt sich KSHV zumindest über PCR in B-Zellen seropositiver Individuen nachweisen und das primäre Effusionslymphom ist ein klarer Beweis für latente KSHV-Infektion in Zellen, die zumindest aus der B-Zelllinie (20) hervorgegangen sind. Eventuell sollte man Anstrengungen unternehmen, die für 58 Diskussion KSHV permissive B-Zell-Subpopulation zu finden. Ein Abgleich der Expressionsmuster von Syndekanen, FLJ40722 und EphA2 wäre hier vielleicht ein guter Startpunkt. Es fällt zudem auf, dass KSHV fast alle adhärenten Zelllinien epithelialen Ursprungs vergleichsweise effizient latent infiziert und auch die beschriebenen Rezeptoren EphA2 und FLJ40722 auf diesen Zelllinien exprimiert waren. Die Rolle epithelialer Zellen bei der KSHV-Infektion sollte daher näher untersucht werden, auch wenn die pathologischen Manifestationen sich auf B-Zellen und das Endothel beschränken. Der Begriff „Rezeptor“ ist bei KSHV und Herpesviren im Allgemeinen sicher nicht so eng zu fassen wie bei einfach aufgebauten Viren. Alle hier und auch bisher von anderen Gruppen beschriebenen Proteine sind isoliert betrachtet und in Zellkultur nicht absolut essentiell für die KSHV-Infektion. In vivo kann sich dies allerdings völlig anders darstellen. Natürlicherweise werden sicher keine Viruskonzentrationen erreicht wie sie typischerweise hier in Zellkulturexperimenten verwendet wurden. So wurde z.B. auch K8.1 als nicht essentiell für die Infektion beschrieben (87). Allerdings wurde hier auch der Attachment-Schritt und die Membranfusion einfach durch Zugabe des kationischen Tensids Polybren umgangen und das Virus hoch konzentriert. Der Zelleintritt von KSHV ist in vivo wahrscheinlich vielmehr als multifaktorielles Ereignis zu betrachten, bei dem einzelne Rezeptoren verschieden gewichtete Rollen spielen können, möglicherweise auch in verschiedenen oder redundanten Infektionsrouten (direkte Fusion vs. Endozytose). Über die letztendliche Permissivität für eine latente Infektion (diese Art der Infektion lässt sich zumindest relativ sicher nachweisen) entscheiden dann vermutlich auch noch dem Zelleintritt nachgeschaltete Prozesse, die z.B. PML-Komponenten involvieren (Abb. 22). Viral induzierte Signaltransduktion - beispielsweise durch gH/gL aktivierte EphA2 - könnte eine wichtige Rolle bei der Umgehung dieser nachgeschalteten Restriktionsfaktoren spielen und die Zelle im Moment des ersten Kontakts bereits auf die Replikation des Virus vorbereiten. 59 Bibliographie 7 Bibliographie 1. Y. Chang et al., Science. 266, 1865-1869 (1994). 2. G. Giraldo, E. Beth, F. Haguenau, Journal of the National Cancer Institute. 49, 1509-26 (1972). 3. B. Damania, R. C. Desrosiers, Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 356, 535–543 (2001). 4. T. Simonart, Cancer Letters. 244, 1-7 (2006). 5. B. I. Malope et al., AIDS (London, England). 22, 519-26 (2008). 6. T. Watanabe et al., J. Virol. 77, 6188-6196 (2003). 7. H. Pan, F. Zhou, S. Gao, Cancer Res. 64, 4064-4068 (2004). 8. T. Y. Yang et al., The Journal of Experimental Medicine. 191, 445-454 (2000). 9. J. Iscovich, P. Boffetta, S. Franceschi, E. Azizi, R. Sarid, Cancer. 88, 500-17 (2000). 10. P. S. Moore et al., The Journal of Virology. 70, 549-558 (1996). 11. W. Said et al., Blood. 87, 4937-4943 (1996). 12. M. Q. Ansari et al., American Journal of Clinical Pathology. 105, 221-9 (1996). 13. J. Soulier et al., Blood. 86, 1276-1280 (1995). 14. S. M. Akula et al., The Journal of Virology. 77, 7978-90 (2003). 15. T. Satoh et al., Cell. 132, 935-44 (2008). 16. P. G. Spear, Cellular Microbiology. 6, 401-10 (2004). 17. A. V. Nicola, J. Hou, E. O. Major, S. E. Straus, The Journal of Virology. 79, 7609-16 (2005). 18. N. Sharma-Walia, P. Naranatt, H. Krishnan, L. Zeng, B. Chandran, The Journal of Virology. 78, 4207-4223 (2004). 19. P. Naranatt, S. Akula, C. Zien, H. Krishnan, B. Chandran, The Journal of Virology. 77, 1524-1539 (2003). 20. G. Gaidano et al., Blood. 90, 4894-900 (1997). 21. C. Boshoff et al., Nature Medicine. 1, 1274-8 (1995). 22. J. Kaleeba, E. Berger, Virology. 354, 7-14 (2006). 60 Bibliographie 23. N. Inoue, J. Winter, R. Lal, M. Offermann, S. Koyano, The Journal of Virology. 77, 8147-8152 (2003). 24. A. Birkmann et al., The Journal of Virology. 75, 11583-11593 (2001). 25. G. Rappocciolo et al., J Immunol. 176, 1741-1749 (2006). 26. S. Akula, N. Pramod, F. Wang, B. Chandran, Cell. 108, 407-419 (2002). 27. H. Garrigues, Y. Rubinchikova, C. Dipersio, T. Rose, The Journal of Virology. 82, 1570-1580 (2008). 28. J. Kaleeba, E. Berger, Science. 311, 1921-1924 (2006). 29. S. M. Akula et al., The Journal of Virology. 77, 7978-7990 (2003). 30. O. Spiller et al., The Journal of Virology. 80, 4068-4078 (2006). 31. S. M. Akula, N. P. Pramod, F. Z. Wang, B. Chandran, Virology. 284, 235-249 (2001). 32. M. V. Veettil et al., The Journal of Virology. 82, 12126-44 (2008). 33. M. Raab et al., The Journal of Virology. 72, 6725-6731 (1998). 34. L. Hutchinson et al., The Journal of Virology. 66, 2240-2250 (1992). 35. P. E. Pertel, The Journal of Virology. 76, 4390-4400 (2002). 36. Y. Mori, X. Yang, P. Akkapaiboon, T. Okuno, K. Yamanishi, The Journal of Virology. 77, 4992-4999 (2003). 37. G. Campadelli-Fiume et al., Reviews in Medical Virology. 17, 313-326 (2007). 38. H. C. Birnboim, J. Doly, Nucleic Acids Research. 7, 1513-23 (1979). 39. U. K. LAEMMLI, Nature. 227, 680-685 (1970). 40. J. Yan et al., Electrophoresis. 21, 3666-3672 (2000). 41. D. Kang, Y. Gho, M. Suh, C. Kang, BULLETIN OF THE KOREAN CHEMICAL SOCIETY. 23, 1511-1512 (2002). 42. S. König et al., Electrophoresis. 24, 751-6 (2003). 43. L. Aagaard et al., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 938-945 (2007). 44. J. Vieira, P. O'Hearn, Virology. 325, 225-240 (2004). 45. R. Subramanian, R. Geraghty, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United 61 Bibliographie States of America. 104, 2903-2908 (2007). 46. P. Naranatt, S. Akula, B. Chandran, Arch.Virol. 147, 1349-1370 (2002). 47. F. Maley, R. B. Trimble, A. L. Tarentino, T. H. Plummer, Analytical Biochemistry. 180, 195-204 (1989). 48. S. Tumova, A. Woods, J. R. Couchman, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 32, 269-288 (2000). 49. E. Raulo, M. A. Chernousov, D. J. Carey, R. Nolo, H. Rauvala, The Journal of Biological Chemistry. 269, 12999-3004 (1994). 50. T. Kirsch, E. Koyama, M. Liu, E. E. Golub, M. Pacifici, The Journal of Biological Chemistry. 277, 42171-7 (2002). 51. N. D. Zantek et al., Cell Growth Differ. 10, 629-638 (1999). 52. R. L. Pratt, M. S. Kinch, Oncogene. 21, 7690-7699 (2002). 53. B. Sodeik, M. W. Ebersold, A. Helenius, The Journal of Cell Biology. 136, 1007-21 (1997). 54. P. M. Ojala, B. Sodeik, M. W. Ebersold, U. Kutay, A. Helenius, Molecular and Cellular Biology. 20, 4922-31 (2000). 55. R. D. Everett, C. Parada, P. Gripon, H. Sirma, A. Orr, The Journal of Virology. 82, 2661-72 (2008). 56. R. D. Everett et al., The Journal of Virology. 80, 7995-8005 (2006). 57. N. Tavalai, P. Papior, S. Rechter, M. Leis, T. Stamminger, The Journal of Virology. 80, 8006-18 (2006). 58. N. Tavalai, P. Papior, S. Rechter, T. Stamminger, The Journal of Virology. 82, 126-37 (2008). 59. X. Wang, W. J. Kenyon, Q. Li, J. Mullberg, L. M. Hutt-Fletcher, The Journal of Virology. 72, 5552-5558 (1998). 60. L. Gillet, J. May, S. Colaco, P. Stevenson, The Journal of Virology. (2006) PM:17050601. 61. V. Tiwari et al., The Journal of Virology. 80, 8970-8980 (2006). 62. R. Sasisekharan, G. Venkataraman, Current Opinion in Chemical Biology. 4, 626-631 (2000). 63. M. Kato, H. Wang, M. Bernfield, J. Gallagher, J. Turnbull, Journal of Biological Chemistry. 269, 18881-18890 (1994). 64. E. Tkachenko, E. Lutgens, R. Stan, M. Simons, J Cell Sci. 117, 3189-3199 (2004). 65. S. Lim, R. Longley, J. Couchman, A. Woods, J Biol Chem. 278, 13795-13802 (2003). 62 Bibliographie 66. E. Oh, A. Woods, J. Couchman, J Biol Chem. 272, 11805-11811 (1997). 67. A. Woods, J. Couchman, Mol Biol Cell. 5, 183-192 (1994). 68. S. Saoncella et al., Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 2805-2810 (1999). 69. H. H. Krishnan, N. Sharma-Walia, D. N. Streblow, P. P. Naranatt, B. Chandran, The Journal of Virology. 80, 1167-80 (2006). 70. J. J. Chu, M. Ng, J. Biol. Chem. 279, 54533-54541 (2004). 71. W. Chao, J. Kunz, FEBS Letters. 583, 1337-1343 (2009). 72. J. Walker-Daniels, D. J. Riese, M. S. Kinch, Molecular Cancer Research: MCR. 1, 79-87 (2002). 73. H. Miao, E. Burnett, M. Kinch, E. Simon, B. Wang, Nature Cell Biology. 2, 62-9 (2000). 74. J. Walker-Daniels, A. R. Hess, M. J. C. Hendrix, M. S. Kinch, Am J Pathol. 162, 1037-1042 (2003). 75. M. Tanaka et al., The EMBO Journal. 23, 1075-88 (2004). 76. N. Cheng et al., Molecular Cancer Research: MCR. 1, 2-11 (2002). 77. J. Larson, S. Schomberg, W. Schroeder, T. C. Carpenter, American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L431-9 (2008). 78. D. P. Zelinski, N. D. Zantek, J. C. Stewart, A. R. Irizarry, M. S. Kinch, Cancer Res. 61, 2301-2306 (2001). 79. S. Abraham et al., Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 12, 353-60 (2006). 80. K. Ogawa et al., Oncogene. 19, 6043-52 (2000). 81. Y. G. Lin et al., Cancer. 109, 332-40 (2007). 82. H. Miao et al., Nature Cell Biology. 3, 527-530 (2001). 83. D. M. Brantley et al., Oncogene. 21, 7011-26 (2002). 84. A. Grundhoff, D. Ganem, The Journal of Clinical Investigation. 113, 124-136 (2004). 85. J. M. Orenstein et al., AIDS (London, England). 11, F35-45 (1997). 86. K. A. Staskus et al., Journal of Virology. 71, 715-719 (1997). 87. R. E. Luna et al., Journal of Virology. 78, 6389-6398 (2004). 63 Anhang 8 Anhang 8.1. Puffer und Lösungen Name Inhalt SDS-Probenpuffer 120 mM Tris/HCl pH 6,8; 20 % Glyzerin (w/v); 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS) (v/v); 10 % ß-ME (v/v); 0,1 mg/ml Bromphenolblau (für Massenspektrometrie ohne Glyzerin) PBSo 137 mM NaCl; 2,68 mM KCl; 7,3 mM Na2PO4; 1,47 KH2PO4 Proteingel-Laufpuffer 25 mM Tris; 250 mM Glyzin; 0,1 % SDS (v/v) Transferpuffer 25 mM Tris; 192 mM Glyzin; 20 % Methanol (v/v) Strip-Puffer 6,25 % Tris pH 6,6; 2 % SDS (v/v); 0,8 % ß-ME (v/v) Western-Blot Blocklösung 5 % Magermilchpulver (w/v); 0,3 % Tween20 (v/v); in PBSo Western-Blot Blocklösung für Streptavidindetektion 5 % BSA (w/v); 0,3 % Tween20 (v/v) in PBSo NET-Puffer (Blocklösung für Western-Blots und für Mehrfachverwendung von Antikörpern) 50 mM Tris; 5 mM EDTA; 150 mM NaCl; 0,05 % Triton X-100; 0,25 % Gelatine ECL-Lösung: SolA 0,1 M Tris pH 8,6; 25 % Luminol SolB 0,11 % Parahydroxycoumarinsäure H2O2 30 % H2O2 HBS-Puffer 50 mM HEPES; 1,5 mM Na2 HPO4; 280 mM NaCl ; pH 7,05 FACS-Bindungspuffer 10 % FKS in PBSo mit 0,05 % (w/v) Natriumazid Immunfluoreszenzblockpuffer 5 % FKS 1 % BSA in PBSo 5x HP 125 mM HEPES; 2,5 mM EDTA und EGTA; pH 7,4; Ausgangspuffer für Lysis- und Immunpräzipitationspuffer 8.2. Antikörper, Peptide und Sekundärdetektionsreagenzien Antikörper und Seren Antikörper Isotyp / Spezies Verdünnung / Puffer Herkunft anti-myc 9E10 Monoklonal, Maus IgG1 1:5000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer American Type Culture Collection (Manassas, USA), konzentriert über Protein-A anti-Flag M2 Monoklonal, Maus IgG1 1:5000 in NET, 1:1000 in Immunfluoreszenzblockpuffer Sigma 64 Anhang 4G10 antiPhosphotyrosin Monoklonal, Maus IgG1 1:500 in NET Brigitte Biesinger Anti-Calreticulin Polyklonal, Kaninchen 1:200 in Immunfluoreszenzblockpuffer Acris-Antikörper Anti-EphA2 Polyklonal, Kaninchen 1:1000 in NET Acris-Antikörper 5529PPI Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, Aderlass vor Immunisierung, Eurogentec 5529PP Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, Aderlass nach Immunisierung, Eurogentec 5529GP Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, zweiter Aderlass nach Immunisierung, Eurogentec 5530PPI Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, Aderlass vor Immunisierung, Eurogentec 5530PP Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, Aderlass nach Immunisierung, Eurogentec 5530GP Polyklonal, Kaninchen 1:10000 in Western-Blot Blocklösung, 1:100 in FACS-Bindungspuffer Kaninchen immunisiert mit FLJ40722 Peptiden 1 und 2, zweiter Aderlass nach Immunisierung, Eurogentec anti-FLJ-1 Polyklonal, Kaninchen 1:500 in Western-Blot Blocklösung Affinitätsgereinigt aus 15 ml 5529GP über NHSSepharose gekoppelt mit Peptid FLJ-1 Peptide Peptidname Sequenz Bemerkung FLJ-1 CSQHGPDKVLSRFPG AS 160-173 von FLJ40722 FLJ-2 QRHGWEFPPHTTEATC AS 764-779 von FLJ40722 65 Anhang Sekundäre Antikörper Antikörper Isotyp / Spezies Verdünnung / Puffer Herkunft anti-human-HRP Polyklonal, Kaninchen 1:1000 in Western-Blot Blocklösung DAKO anti-Maus-HRP Polyklonal, Ziege 1:1000 in Western-Blot Blocklösung DAKO anti-Kaninchen-HRP Polyklonal, Ziege 1:1000 in Western-Blot Blocklösung DAKO anti-human-Cy3 Polyklonal, Ziege 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer Sigma anti-human-Alexa488 Polyklonal, Ziege 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer / 1:100 in FACSBindungspuffer Molecular Probes anti-Maus-FITC Polyklonal, Ziege 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer / 1:50 in FACSBindungspuffer Dako anti-Maus-Cy3 Polyklonal, FabFragment, Esel 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer Jackson ImmunoResearch anti-Kaninchen-FITC Polyklonal, Schwein 1:100 in Immunfluoreszenzblockpuffer / 1:50 FACSBindungspuffer Dako Weitere Sekundärreagenzien Reagenz Isotyp / Spezies Herkunft Streptavidin-HRP 1:2000 in Western-Blot Blocklösung für Streptavidindetektion GE Healthcare Strep-Tactin-PE 1:100 in FACS-Bindungspuffer IBA 8.3. Plasmide Ausgangsvektoren pDNA3.1 Eukaryoter Expressionsvektor, Resistenz, Invitrogen CMV-IE Promotor, prokaryote Ampicilin- pcDNA4a Eukaryoter Expressionsvektor, CMV-IE Promotor, Resistenz, eukaryote Zeozin-Resistenz, Invitrogen prokaryote Ampicilin- pAB61 Auf pcDNA3.1 basierender Expressionsvektor mit Mehrfachschnittstelle zwischen einer Signalpeptidsequenz von murinem IgG kappa und dem offenem Leserahmen für den humanen Fc Teil von IgG1 plus C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Ausgangsvektor für die Klonierung von FcFusionsproteinen, Autor Alexander Birkmann pAB61Strep Abgewandelte Form von pAB61 mit einem OneStrepTag und sechs Histidinresten nach dem Fc Teil anstatt C-terminalem myc-Epitop, konstruiert über Einfügen eines doppelsträngigen Oligonukleotids, Autor Alexander Hahn Linker XhoI One-Strep His STOP for 66 Anhang TCGACCCAGCGCTTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAAGGCGGAGGCTCC GGAGGCGGATCCGGAGGCGGATCCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAAAAAG GCGGCCATCATCATCATCATCATTAA Linker XhoI One-Strep His STOP rev TCGATTAATGATGATGATGATGATGGCCGCCTTTTTCGAACTGGGGGTGGC TCCAGGATCCGCCTCCGGATCCGCCTCCGGAGCCTCCGCCTTTCTCGAAC TGGGGGTGGCTCCAAGCGCTGGG FLJ40722-Konstrukte pFLJ40722 1065 Teil der FLJ40722 cDNA amplifiziert mittels RT-PCR aus Jsc-1 RNA, über KpnI und PstI kloniert in pcDNA4a, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: FLJ40722bp1 Kpn AAGGTACCATGGCGACCATTGCTGCTGCTGCTGTTG Rückwärtsprimer: FLJ 1067r CCCCCACCCTCAGCCACAAA EX-T6764-M13 Partielle FLJ40722 cDNA (1695bp, vom 3' Ende her), rzpd pReciever-FLJ40722 FLJ40722 ORF in pReciever, C-terminales Flag-Epitop (DYKDDDDK ) pFLJ40722-mychis FLJ40722 ORF in pcDNA4a, C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Konstruiert aus pRecieverFLJ40722 über PCR, Restriktionsverdau und Ligation in pcDNA4a Vorwärtsprimer: FLJ40722bp1 Kpn AAGGTACCATGGCGACCATTGCTGCTGCTGCTGTTG Rückwärtsprimer:FLJ40722 XbaI rev TCTAGAATATCCCCTTCTCCCAGAATTTC gL-Expressionskonstrukte pcORF47 KSHV ORF47/gL in pcDNA4a, C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Autor Effi Wies pgL-FlagSTOP KSHV ORF47/gL in pcDNA4a, C-terminales Flag-Epitop, Autor Alexander Hahn Konstruiert über Einsetzen eines FlagSTOP-kodierenden Oligonukleotids in 5' HindIII Restriktionsstelle: Linker HindIII FlagSTOP for AGCT CGACTACAAGGACGACGATGACAAGTAA Linker HindIII FlagSTOP rev AGCT TTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCG Syndekan-Konstrukte pSDC1 Expressionsplasmid für SDC1 auf Basis von pcDNA4a, C-terminales mycEpitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: Synd-1 HindIIIf ATTAAGCTTGTCCGGGCAGCATGAG Rückwärtsprimer: Synd-1 XbaIr AATTCTAGAGGCATAGAATTCCTCC pSDC2 Expressionsplasmid für SDC2 auf Basis von pcDNA4a, C-terminales mycEpitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: Synd-2 EcoRIf AATGAATTCGGGGAATATGCGGCG Rückwärtsprimer: Synd-2 XbaIr ATTTCTAGACGCATAAAACTCCTTAGTAG pSDC4 Expressionsplasmid für SDC4 auf Basis von pcDNA4a, C-terminales mycEpitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: Synd-4 HindIIIf AATAAGCTTGCCTGCGCGCCTTCTCCAGTC Rückwärtsprimer: Synd-4 XhoI AATCTCGAGCGCGTAGAACTCATTGGTG 67 Anhang EphA2-Konstrukte psolEphA2-Fc Ektodomäne von EphA2 minus Signalpeptid (AS 25-534) in pAB61, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: EphA2ectoohneSP HindIII for AAAAGCTTGCGCAGGGCAAGGAAGTGGTACTGC Rückwärtsprimer: EphA2ecto KpnI rev AAGGTACCGTTGCCAGATCCCTCCGGG pEphA2 EphA2 ORF in pcDNA4a, C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: EphA2 KpnI for AAGGTACCATGGAGCTCCAGGCAGCCCGCG Rückwärtsprimer: EphA2 XbaI rev alternativ AATCTAGAGATGGGGATCCCCACAGTG pmuEphA2deltaIC Murine EphA2 AS(1-560) in pcDNA4a, C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: muEphA2 EcoRI for AAGAATTCATGGAGCTCCGGGCAGTC Rückwärtsprimer: muEphA2deltaIC XbaI rev AATCTAGAATGGATGAAGAGGCCAA pEphA2deltaIC EphA2 AS(1-560) in pcDNA4a, C-terminales myc-Epitop und sechs Histidinreste, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: EphA2 KpnI for AAGGTACCATGGAGCTCCAGGCAGCCCGCG Rückwärtsprimer: EphA2deltaIC XbaI rev AATCTAGAGCGGTGGATAAAGAAGCC Fc-Fusionskonstrukte für K8.1, K14, EFNA1 und SARS-S-Protein pAB68 Ektodomäne von K8.1 (AS 27-196) in pAB61; Autor Alexander Birkmann pAB67 Ektodomäne von ORF K14 (AS 27-230) in pAB61; Autor Alexander Birkmann pSARS-RBD-Fc Rezeptorbindende Domäne (AS 318-523) von SARS-Coronavirus S-Protein in pAB61, Autor Alexander Hahn pEFNA1-Fc Ektodomäne von EFNA1 minus Signalpeptid (AS 20-188) in pAB61, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: EFNA1 w/o SP HindIII for ATAAGCTTGATCGCCACACCGTCTTCTG Rückwärtsprimer: EFNA1 565 BamHI rev ATGGATCCGAAGAGGCGTGGGGCAGCAC gH-Expressionskonstrukte und Mutanten pgH-Flag (pAB34-Flag) KSHV ORF22/gH in pcDNA3.1, an Aminosäureposition 33 ein Flag-Epitop (DYKDDDDK ) eingeschoben, Autor Alexander Hahn Über HindIII und XhoI aus pAB83 und pAB34 konstruiert pAB74 Ektodomäne von KSHV gH minus Signalpeptid (AS 22-705) in pAB61, Autor Alexander Birkmann pAB74Strep Abgewandelte Form von pAB74 mit einem OneStrepTag und sechs Histidinresten nach dem Fc Teil anstatt C-terminalem myc-Epitop, analog zu pAB61Strep, Autor Alexander Hahn pAX4 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 207-705) in pAB61, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: pAB74 570 Bam f AAGGATCCAGGTCCAAAGAGGCTAACGAGACGGCGTC Rückwärtsprimer: pAB74 Not r TGTCACAGCGGCCGCCACTG pAX5 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 373-705) in pAB61, Autor Alexander 68 Anhang Hahn Vorwärtsprimer: pAB74 1113 BamHI f AAGGATCCTCTTCCCAGGAAACAGTGCT Rückwärtsprimer: pAB74 Not r TGTCACAGCGGCCGCCACTG pAX6 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 465-705) in pAB61, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: pAB74 1356 BamHI f AAGGATCCACATCAATGTGTACCAACAT Rückwärtsprimer: pAB74 Not r TGTCACAGCGGCCGCCACTG pAX7 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 22-509) in pAB61, konstruiert über BamHI und NotI, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: T7 sequencing Primer TTAATACGACTCACTATAGGG Rückwärtsprimer: pAB74 1469 NotI r TGCGGCCGCCATCGTACCTTAGTCCTA pAX8 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 22-399) in pAB61, konstruiert über BamHI und NotI, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: T7 sequencing Primer TTAATACGACTCACTATAGGG Rückwärtsprimer: pAB74 1139 NotI r TGCGGCCGCCCATGGCCAGCACTGTTT pAX9 Deletionsmutante der gH-Ektodomäne (AS 22-224) in pAB61, konstruiert über BamHI und NotI, Autor Alexander Hahn Vorwärtsprimer: T7 sequencing Primer TTAATACGACTCACTATAGGG Rückwärtsprimer: pAB74 614 NotI r TGCGGCCGCCACCGAACAGAAGATGGG Plasmide zur Herstellung von GFP-kodierenden Lentiviren pCHGP GagPol-Verpackungsplasmid, Autoren Aagaard et al. pVSVG VSV-G-Expressionsplasmid, Autoren Aagaard et al. pTIG Lentivirales Plasmid mit einer Expressionskassette nach dem Schema: CMV-IE-Promotor->Tet-Repressor->IRES->GFP ausserdem durch Tet-Repressor reprimierter U6-Promotor-shRNAExpressionskassette (hier nicht genutzt), Autoren Aagaard et al. pCMVrev rev-Expressionsplasmid, Autoren Aagaard et al. 8.4. Oligonukleotide Primer Name Sequenz Bemerkung homo sapiens epha A2 mRNA-1830F ATCCTGTGTCACTCGGCAGAAG Primer für quantitative PCR auf EphA2 homo sapiens epha A2 mRNA-2038R CCTCTAGGCGGATGATGTTGTG Primer für quantitative PCR auf EphA2 FLJ RT-PCR For CTGACAAGGTGCTCTCCAGGTT Primer für semiquantitative PCR C auf FLJ40722, geht über Intron FLJ RT-PCR Rev AGCAGTTGAGTGAGGCATCCAG Primer für semiquantitative PCR auf FLJ40722, geht über Intron 69 Anhang Beta-Aktin-FW CCATCTACGAGGGGTATCGC Primer für quantitative PCR auf Beta-Aktin Beta-Aktin-REV CGTGGCCATCTCTTGCTC Primer für quantitative PCR auf Beta-Aktin FLJ40722 621 for CCACTCCATGT CAGGTATGGGGAGGATGTCAG G Primer für Klonierung von FLJ40722, zweites Exon FLJ40722 625 Rev TCCCCAT Primer für Klonierung von ACCTGACATGGAGTGGGATCTT FLJ40722, erstes Exon GG FLJ 1191 HindIII f ATAAGCTTAAAGCAGGCTGCTT CCCCGTTCCCACCC Primer für fragmentarische Amplifikation von FLJ40722 FLJ 1421 f CTCCCAGCTGTGAGCCGGGAA AATCC Primer für Sequenzierung und zum Revertieren einer Punktmutation in FLJ40722 FLJ 1446r GGATTTTCCCGGCTCACAGCTG Primer für Sequenzierung und zum GGAG Revertieren einer Punktmutation in FLJ40722 FLJ 1567 HindIII f AATAAGCTTTACCCCTCAAAACA Primer für fragmentarische CCCCAT Amplifikation von FLJ40722 FLJ 1858 HindIIIf AATAAGCTTAAGGGCAGCCAAC Primer für fragmentarische TAGGCCC Amplifikation von FLJ40722 FLJ40722 1067r CCCCCACCCTCAGCCACAAA Primer für fragmentarische Amplifikation von FLJ40722 FLJ40722 Seq 1462f TATGAGGCTGCGGTGCTCTC Sequenzierprimer FLJ40722 Seq 1959f GATGCAGGAGAACCTGGCTC Sequenzierprimer siFLJ 476 sense CGCUGAUCCAGUUUGUGAATT siRNA gegen FLJ40722 siFLJ 476 antisense UUCACAAACUGGAUCAGCGTT siRNA gegen FLJ40722 siFLJ dh1 sense UGUCACUCCAUCCAUGAGGTT siRNA gegen FLJ40722 siFLJ dh1 antisense CCUCAUGGAUGGAGUGACATT siRNA gegen FLJ40722 siFLJ dh2 sense UUCUUAGAGACCUUGAACCTT siRNA gegen FLJ40722 siFLJ dh2 antisense GGUUCAAGGUCUCUAAGAATT siRNA gegen FLJ40722 siNonsense sense GACUACCGUUGUAUAGUAGTT Kontroll-siRNA siNonsense antisense CUACUAUACAACGGUAGUCTT Kontroll-siRNA siRNA-Oligonukleotide 8.5. Zelllinien Name Beschreibung Medium Herkunft 293 (HEK293) Humane embryonale Nierenepithel-Zelllinie, transformiert durch Adenovirus 5 293T ATCC, Graham, F.L. u. a. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 36, 59-74(1977) 293T (HEK293T) Derivat der 293-Zellen, exprimieren zusätzlich 293T ATCC 70 Anhang das große T-Antigen von SV40 293-rKSHV.219 (GABI) HEK293-Zellen, latent infiziert mit dem rekombinanten Virus rKSHV.219 293T Gaby Marquardt, Labor Michael Stürzl Vero Nierenepithel-Zelllinie aus 293T der Grünen Meerkatze zur Verfügung gestellt von K. Korn, Inst. für Virologie, Erlangen H1299 humane zur Verfügung gestellt von Michael Nevels, Virologie Regensburg, NCINavy Medical Oncology Branch cell line supplement. J Cell Biochem Suppl 24, 1-291(1996) Zelllinie aus 293T einem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom HeLa humane Zelllinie aus einem Zervix-Karzinom 293T zur Verfügung gestellt von K. Korn, Inst. für Virologie, Erlangen, SCHERER, W.F., SYVERTON, J.T. & GEY, G.O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. J Exp Med 97, 695-710(1953) HepG2 humane Zelllinie aus einem hepatozellulären Karzinom 293T zur Verfügung gestellt von K. Korn, Inst. für Virologie, Erlangen HFF humane VorhautFibroblasten 293T zur Verfügung gestellt von K. Korn, Inst. für Virologie, Erlangen RD10 humane Zelllinie aus einem Rhabdomyosarkom 293T zur Verfügung gestellt von K. Korn, Inst. für Virologie, Erlangen HUVEC-TI humane, Telomeraseimmortalisierte NabelschnurvenenEndothelzellen EBM-2 (Lonza) Michael Stürzl, Inst. für experimentelle Chirurgie, Erlangen Jsc-1 PEL-Zelllinie JSC Cannon, J.S. u. a. A new primary effusion lymphoma-derived cell line yields a highly infectious Kaposi's sarcoma herpesvirus-containing supernatant. J Virol 74, 10187-93(2000) BCBL-1 PEL-Zelllinie Bjab BC3 PEL-Zelllinie JSC Arvanitakis, L. u. a. Establishment and characterization of a primary effusion (body cavity-based) lymphoma cell line (BC-3) harboring kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV/HHV-8) in the absence of Epstein-Barr virus. Blood 88, 2648-54(1996) Bjab Burkitt-LymphomBjab Zelllinie, KSHV- und EBVnegativ Menezes, J. u. a. Establishment and characterization of an Epstein-Barr virus (EBC)-negative lymphoblastoid 71 Anhang B cell line (BJA-B) from an exceptional, EBV-genome-negative African Burkitt's lymphoma. Biomedicine 22, 276-84(1975) Jurkat T-Zelllinie, aus einem TZelllymphom Jurkat Labor Biesinger, Schneider U, Schwenk H, Bornkamm G (1977). "Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma". Int J Cancer 19 (5): 621–6 8.5.1. Zellkulturmedien Name Zusammensetzung 293T DMEM, 10 % FKS, Gentamyzin JSC RPMI 1640, 100 Units/ml Penicillin/Streptomyzin, 50 µM ß-Mercaptoethanol, Natrium-Pyruvat, 20 % FKS Bjab RPMI 1640, 100 Units/ml Penicillin/Streptomyzin, 50 µM ß-Mercaptoethanol, Natrium-Pyruvat, 10 % FKS Jurkat RPMI 1640, 50 µg/ml Gentamyzin, 50 µM Mercaptoethanol, Natrium-Pyruvat, 10 % FKS ß- 72 Lebenslauf 9 Lebenslauf Persönliche Daten Name Alexander Siegfried Hahn Geboren am 10.04.1979 Gerburtsort Nürnberg Beruflicher Werdegang Seit September 2005 Angestellt als wissenschaftlicher Angestellter im Rahmen der Promotion in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Frank Neipel am Virologischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg. Arbeit auf dem Gebiet des KaposiSarkom-assoziierten Herpesvirus. 2004 Anstellung als studentische Hilfskraft am Institut für Virologie Studium Oktober 1999 bis Juni 2004 Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Diplomstudiengang Molekulare Medizin Vordiplom im September 2002 Hauptstudium mit den Schwerpunkten Virologie, Pharmakologie, Architektur von Biopolymeren und Humangenetik Diplomarbeit im Fach Virologie von Januar bis Juni 2004 Abschluss als „Diplom-Molekularmediziner Univ.“ Schulbildung 1989-1998 Leibniz Gymnasium Altdorf, Neusprachlicher Zweig Allgemeine Hochschulreife mit den Leistungskursen Mathematik und Englisch 1985-1989 Grundschule Altdorf Sonstiges 1998-1999 Zivildienst im Mobilen sozialen Hilfsdienst und in der stationären Pflege, Diakonie Altdorf 73 Eigene Veröffentlichungen 10 Eigene Veröffentlichungen “The Ephrin Receptor Tyrosine Kinase A2 is a Cellular Receptor for Kaposi’s SarcomaAssociated Herpesvirus”; Hahn A, Kaufmann J, Wies E, Schmidt K, König S, Fleckenstein B and Neipel F; eingereicht bei Nature und im Review “The Kaposi's sarcoma associated herpesvirus encoded vIRF-3 binds and inhibits cellular IRF-5”; Wies E*, Hahn A*, Schmidt K, Rohland N, Viebahn C, Holzer A, Lux A, Jung J, Neipel F; Journal of Biological Chemistry; 2009 Mar 27;284(13):8525-38. Epub 2009 Jan 7 *gemeinsame Erstautorschaft “Kaposi's Sarcoma Associated Herpesvirus gH/gL: Glycoprotein Export and Interaction with Cellular Receptors.”; Hahn A, Birkmann A, Wies E, Dorer D, Mahr K, Stürzl M, Titgemeyer F, Neipel F; Journal of Virology, 2009 Jan;83(1):396-407. Epub 2008 Oct 22. “The viral interferon-regulatory factor-3 is required for the survival of KSHV-infected primary effusion lymphoma cells.”; Wies E, Mori Y, Hahn A, Kremmer E, Stürzl M, Fleckenstein B, Neipel F; Blood, 2008 Jan 1;111(1):320-7; “Mass Spectrometry Applications in Virology”; Hahn A, Neipel F; Biomacromolecular Mass Spectrometry; 2006; Übersichtsartikel 74 Danksagung 11 Danksagung Vielen Dank an Frank Neipel für die Überlassung dieses interessanten Themas und für die Möglichkeit, in seinem Labor promovieren zu dürfen. Vielen Dank an Prof. Sonnewald für die Übernahme der Zweitbegutachtung. Prof. Bernhard Fleckenstein möchte ich ganz herzlich für seine Unterstützung danken. Als sehr schön empfand ich die kollegiale, hilfsbereite und kooperative Atmosphäre im gesamten Institut. Ein großes Dankeschön hier an Nina Tavalai, Florian Full, Barbara Alberter, Armin Ensser, Thomas Stamminger, Doris Lengenfelder, Brigitte Biesinger, Michael Mach und Jens Albrecht. Ein Dankeschön auch an Ralf Grassmann. Bei „meinen“ beiden Diplomanden, Dominik Dorer und Johanna Kaufmann, möchte ich mich für die hervorragende und erfolgreiche Zusammenarbeit bedanken. Vielen Dank allen Mitgliedern des Labors Neipel für die gute Zusammenarbeit und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Besonders an Martin, Nadine, Angela und Kathi. Vielen Dank an Simone König für die nette, unkomplizierte und erfolgreiche Zusammenarbeit! Bei meinen Eltern möchte ich mich für die bedingungslose Unterstützung bedanken und dafür, dass ich stets auf sie zählen kann. Ganz besonders möchte ich mich bei Dir bedanken, Effi. Ich müsste hier soviel schreiben. Ich schreib einfach mal „ich liebe Dich“ und freue mich auf unsere gemeinsame Zukunft!
