TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Tierhygiene

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Tierhygiene
Untersuchungen der zellulären Mechanismen der
Prionstammreplikation
Gloria Vanessa Ingrid Lutzny
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des
akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender:
Univ.-Prof. Dr. S. Scherer
Prüfer der Dissertation:
1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. J. Bauer
2. Prof. Dr. H. M. Schätzl
(University of Calgary/Kanada)
Die Dissertation wurde am 01.10.2013 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und
Umwelt am 20.01.2014 angenommen.
http://d-nb.info/1056054808
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I-IV
1
Zusammenfassung
1
1.1
Deutsche Version
1
1.2
English version
3
2
Einleitung
6
2.1
Prionen und Prionerkrankungen
6
2.1.1 Das Prionprotein
7
2.1.2 Mechanismus der Prionprotein-Konversion
9
2.1.3 Ort der Konversion
11
2.1.4 Strukturelle und biochemische Eigenschaften von PrPc und PrPSc
14
2.1.5 Zellbiologie des Prionproteins
18
2.1.6 Prionerkrankungen von Tieren
20
2.1.7 Prionerkrankungen von Menschen
22
2.1.8 Prionstämme und Speziesbarriere
26
2.1.9 Rolle von PrP in Prionerkrankungen
31
Typen und Mechanismen der Endozytose
34
2.2.1 Rezeptor-vermittelte Endozytose
36
2.2.2 Caveolae
38
2.2.3 Intrazelluläre Transportwege endozytierter Substanzen
39
Rabproteine
41
2.3.1 Lokalisation und Regulierung der Rabproteine
42
2.3.2 Funktionen der Rabproteine
44
2.4
Synthese und Endozytose des Prionproteins PrPc
46
2.7
Zielsetzung
52
2.2
2.3
I
3
Material
53
3.1
Geräte
53
3.2
Chemikalien
54
3.3
Inhibitorische Substanzen und siRNAs
56
3.4
Antikörper
57
3.5
Puffer und Medien
58
3.6
Zellmedien, Zusätze und Antibiotika
60
3.7
Murine Zelllinien
61
4
Methoden
62
4.1
Quantitative Proteinbestimmung (Bradford)
62
4.2
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
62
4.2.1 Gelelektrophorese
64
4.2.2 Western Blot
64
4.2.3 Proteindetektion
64
4.3
Dot Blot
65
4.4
Zellbiologische Methoden
66
4.4.1 Kultivieren und Passagieren von Zellen
66
4.4.2 Kryokonservation und Auftauen von Zellen
66
4.4.3 Zelllyse und Proteinase K-Behandlung
67
4.4.4 Ultrazentrifugation
67
4.4.5 Transiente Transfektion von siRNA in Säugerzellen
68
4.4.6 Indirekte Immunfluoreszenz
69
4.4.7 FACS Analyse
70
4.4.8 Phosphoinositolphospholipase C (PIPL-C)-Verdau
71
4.4.9 Gradientenzentrifugation
72
4.4.10 Behandlung von Zellen mit chemischen Inhibitoren
72
4.4.11 Infektion von Säugerzellen mit verschiedenen Maus-adaptierten
Prionstämmen
4.5
73
Photodensitometrische Analyse und Statistik
II
74
4.6
5
5.1
Biologische Sicherheit
74
Ergebnisse
75
Identifizierung Zelltyp- und Prionstamm-spezifischer Charakteristika
während der akuten und persistenten Prioninfektion von Säugerzellen
75
5.1.1 Charakterisierung der murinen Zelllinie L929
76
5.1.2 Veränderungen des Cholesterolmetabolismus beeinflussen die
5.2
akute Infektion von verwendeten Säugerzellen
80
5.1.3 Einfluss der Inhibitoren auf die persistente Infektion
89
Charakterisierung endozytoseprotein-defizienter und rabproteindefizienter L929 Zellen während der akuten Infektion mit verschiedenen
Maus-adaptierten Prionstämmen
95
5.2.1 Wichtige Proteine der Internalisierungsprozesse und
intrazellulären Transportwege
95
5.2.2 Transiente Transfektion von L929 Zellen mittels siRNA gegen diverse
Endozytoseprotein- und Rabprotein-Gene
97
5.2.3 Akute Infektion der endozytoseprotein-defizienten und rabproteindefizienten L929 Zellen mit drei verschiedenen Maus-adaptierten
Prionstämmen
5.2.
104
Indirekte Immunfluoreszenz von PrPSc unterschiedlicher
Prionstämme während der akuten Infektion
117
6 Diskussion
126
6.1
Cholesterol und PrP-Metabolismus
126
6.2
Akute Infektion unterschiedlicher Zelllinien
127
6.3
Die Wirkung von Nystatin zeigt eine ausgeprägte
Prionstammspezifität
6.4
130
Progesteron wirkt in Abhängigkeit von Zelltypen sowie von
akuter und persistenter Infektion in L929 Zellen
III
132
6.5
Filipin inhibiert die PrPSc Akkumulierung nur in persistent infizierten
Zellen
6.6
133
Die Rolle der Rab-GTPasen in Bezug auf
PrPSc Akkumulierung
6.7
135
Führen unterschiedliche Transportwege zu einer stabilen Infektion
verschiedener Prionstämme ?
142
7
Literaturverzeichnis
146
8
Anhang
181
Abkürzungsverzeichnis
181
Publikationen
185
Danksagung
187
Lebenslauf
188
IV