Dendritische Zellen im Verlauf der RSV Infektion - Ruhr

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital Bochum – Universitätsklinik –
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger
Dendritische Zellen im Verlauf der RSV Infektion.
Untersuchungen in einem Mausmodell.
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Katharina Philippson
aus Karaganda
2004
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
PD. Dr. med. J. Schwarze
Koreferent: PD Dr. med. H.-W. Duchna
Tag der mündlichen Prüfung: 30. November 2004
Lernen ist wie Rudern gegen den Strom.
Hört man damit auf, treibt man zurück.
Lao-Tse
Inhalt
Verzeichnis der Abkürzungen ............................................................................ 5
1.
Einleitung............................................................................................. 7
1.1.
Die Rolle viraler Atemwegsinfektionen bei der Entstehung von
allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale ........................... 7
1.2
Dendritische Zellen als Initiatoren der spezifischen
Immunantwort……………………….....................................................12
1.3
Rolle dendritischer Zellen bei Virusinfektion und allergischer
Sensibilisierung……………………………………………………………14
1.4
2
Arbeitshypothese und Zielsetzung ..................................................... 16
Tiere, Material und Methoden............................................................ 17
2.1
Tiere................................................................................................... 17
2.2
Virus................................................................................................... 17
2.3
Materialien ......................................................................................... 17
2.3.1
Labormaterialien und Geräte ...................................................... 17
2.3.2
Reagenzien ................................................................................ 18
2.3.3
Antikörper ................................................................................... 20
2.4
PC-Software ...................................................................................... 20
2.5
Methoden........................................................................................... 20
2.5.1
Allergische Sensibilisierung der Mäuse ...................................... 20
2.5.2
RSV Infektion der Mäuse............................................................ 21
2.5.3
Gewinnung von Mononukleären Zellen ...................................... 21
2.5.4
Isolierung CD11c positiver Zellen nach dem Prinzip der
magnetischen Zellsortierung....................................................... 22
2.5.5
Analytische Durchflußzytometrie ............................................... 24
2.5.6
Gemischte Lymphozytenreaktion................................................ 28
3
Ergebnisse ........................................................................................ 29
3.1
Durchflußzytometrische Untersuchung dendritischer Zellen im Verlauf
der RSV Infektion............................................................................... 29
3.1.1
Während der RSV Infektion kommt es zur Zunahme von CD11c
positiven, hoch MHC-II und CD86 exprimierenden Zellen in der
Lunge.......................................................................................... 29
3
3.1.2
Die RSV Infektion führt nicht zu Veränderungen dendritischer
Zellen in der Milz......................................................................... 30
3.2
Isolierung dendritischer Zellen nach dem Prinzip der magnetischen
Zellsortierung über CD11c im AutoMacs ........................................... 33
3.2.1.
Durch die AutoMacs Sortierung können dendritische Zellen von
hoher Reinheit und Viabilität isoliert werden............................... 33
3.2.2
Die im AutoMacs isolierten dendritischen Zellen exprimieren
CD11c, MHC II und CD86 auf ihrer Oberfläche. ........................ 35
3.2.3
Die im AutoMacs isolierten dendritischen Zellen sind potente TZell Stimulatoren......................................................................... 37
3.3
Phänotypischer und funktioneller Vergleich dendritischer Zellen der
Lunge und Milz RSV infizierter BALB/c Mäuse .................................. 39
3.3.1
Dendritische Zellen der Lunge, nicht aber der Milz, zeigen eine
hohe Expression von MHC-II und CD86 nach RSV Infektion ..... 40
3.3.2
Dendritische Zellen der Lunge haben nach RSV Infektion eine
gesteigerte Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren ............................ 43
4.
Diskussion ......................................................................................... 46
4.1
Phänotyp dendritischer Zellen im Verlauf der RSV Infektion ............. 47
4.2
Automatische magnetassoziierte Isolierung von dendritischen Zellen49
4.3
Dendritische Zellen aus Lunge und Milz RSV infizierter BALB/c Mäuse
als Antigen präsentierende Zellen ..................................................... 53
4.4
Schlussfolgerungen ........................................................................... 54
5.
Zusammenfassung............................................................................ 55
6.
Literaturverzeichnis ........................................................................... 57
4
Verzeichnis der Abkürzungen:
Abb.
Abbildung
APZ
Antigen präsentierende Zelle(n)
CD-
Cluster of differentiation
cpm
counts per minute
DZ
dendritische Zelle(n)
FACS
Fluoreszent activated cell sorter
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein- isothiocyanat
FSC
Forward scatter
g
Gravitationskonstante
GM-CSF
Granulocyte macrophage colony stimulating factor
h
Stunde
HBSS
Hanks balanced salt solution, steril
Ig
Immunglobulin
IL-
Interleukin
IFN
Interferon
MCh
Metacholin
MHC
Major histocompatibility complex
MIP
macrophage inflammatory protein
MLR
mixed lymphocyte reaction
MNZ
Mononukleäre Zelle(n)
NK
Natürliche Killerzelle(n)
NO
Stickstoffmonoxid
OVA
Ovalbumin
PBS
Phosphate buffered saline
PHA
Phytohaemagglutinin
PE
Phycoerythrin
PFU
Plaque forming unit
PG
Prostaglandin
PI
Propidiumjodid
RSV
Respiratory syncytial virus
SSC
Sideward scatter
5
Tab.
Tabelle
Tc
zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten
Th
CD4+ T-Helfer-Lymphozyten
TNF
Tumor Nekrose Faktor
VLA
Very late antigen
6
1. Einleitung
1.1.
Die Rolle viraler Atemwegsinfektionen bei der Entstehung von
allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale
Virale Infektionen der Atemwege können bei Kindern wie bei Erwachsenen
akute obstruktive Atemwegssymptome und Asthmaexazerbationen auslösen
(Busse 1990, Cypcar 1992). Darüber hinaus werden Virusinfektionen im
Kindesalter, besonders die RSV Bronchiolitis, als eine mögliche Ursache bei
der Entstehung allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale diskutiert
(Sigurs et al 2000, Schauer et al 2002).
Etwa 80% der Asthmaepisoden im Schulalter sind mit Virusinfektionen der oberen Atemwege assoziiert (Johnston et al 1995). Dabei sind Rhinoviren mit
einem Anteil von 60% der häufigste Erreger in dieser Altersgruppe (Johnston et
al 1996). Bei Säuglingen und Kleinkindern unter 2 Jahren sind Infektionen mit
RSV mit einem Anteil von 50-60% am häufigsten mit obstruktiven Atemwegserkrankungen wie obstruktive Bronchitis und Bronchiolitis assoziiert (Johnston
1999, McIntosh et al 1973). Andere Viren, die zu diesen Symptomen führen
können sind Enteroviren, Coronaviren, Parainfluenza Viren und Adenoviren
(Johnston et al 1996). Das Risiko, bei viralen Atemwegsinfektionen obstruktive
Atemwegssymptome zu entwickeln, ist erhöht für tabakrauchexponierte Kinder,
die kleine Atemwege mit verminderter Lungenfunktion haben und für Kinder mit
Atopie (Duff et al 1993, Martinez et al. 1988, Martinez et al 1991, Martinez et al
1995, Martinez et al 1998).
Epidemiologische Beobachtungen zeigen, dass Virusinfektionen der Atemwege
nicht nur akute obstruktive Atemwegssymptome auslösen, sondern auch zum
Auftreten allergischer Sensibilisierung und zur Entstehung von Asthma beitragen können. Bei Kindern aus Atopikerfamilien konnten 1-2 Monate nach einer
viralen Atemwegsinfektion erhöhte IgE Spiegel als Ausdruck einer stattgefundenen allergischen Sensibilisierung gemessen werden (Frick et al 1979). Der
Zusammenhang besonders zwischen der RSV Bronchiolitis und dem Auftreten
von Asthma bronchiale im Kindesalter konnte in mehreren kontrollierten Längsschnittstudien gezeigt werden (Hall et al 1984, Pullan et al 1982, Sims et al
7
1978). In einer prospektiven Kohortenstudie waren zur Hospitalisierung führende RSV Infektionen im Säuglingsalter der wichtigste Risikofaktor für das
Auftreten von Asthma bronchiale und für die Entstehung einer allergischen
Sensibilisierung in den ersten 3 Lebensjahren (Sigurs et al 1995). 23% der
Kinder, die mit durchschnittlich 3,5 Monaten eine RSV Bronchiolitis hatten, entwickelten Asthma, verglichen mit 1% der Kinder aus der Kontrollgruppe. Bei
32% der an RSV Bronchiolitis erkrankten Kinder wurden spezifische IgE Antikörper im Serum als Ausdruck einer allergischen Sensibilisierung gegen Inhalationsantigene gemessen. Dies war nur bei 9% der Kinder aus der
Kontrollgruppe der Fall. Das Risiko für die Entstehung von Asthma bronchiale
und für die Entstehung einer allergischen Sensibilisierung war weiter erhöht für
Kinder mit einer Familienanamnese mit Asthma oder Atopie. Auch bei einer
Nachuntersuchung im 7. Lebensjahr war die Diagnose Asthma bronchiale
signifikant häufiger in der Gruppe der Kinder, die als Säuglinge eine RSV Bronchiolitis durchgemacht hatten, als in der Kontrollgruppe (Sigurs et al 2000). Zu
bemerken ist, dass in dieser Studie durch die Untersuchung von Kindern mit
schweren RSV Infektionen, die zu einer Hospitalisierung führten, eine Selektion
vorgenommen wurde. Ergebnisse aus der Tuscon Children´s Respiratory Study
(Stein et al 1997), einer prospektiven Studie einer Geburtskohorte ohne diese
Selektion zeigen, dass im Alter von 6 Jahren ein erhöhtes Risiko für obstruktive
Atemwegssymptome besteht, wenn es in den ersten 3 Lebensjahren zu einer
RSV Infektion gekommen ist. Zwar war die RSV Infektion in dieser Studie nicht
mit einem erhöhten Risiko einer allergischen Sensibilisierung assoziiert, doch
ist diese möglicherweise durch eine ungewöhnlich hohe Rate allergischer
Sensibilisierung in dieser Kohorte unentdeckt geblieben.
Insgesamt betrachtet sprechen die epidemiologischen Untersuchungen dafür,
dass ein Zusammenhang zwischen Virusinfektion der Atemwege, der allergischen Sensibilisierung über die Atemwege und der Entstehung von Asthma
bronchiale besteht. Um die zugrunde liegenden Mechanismen des Zusammenwirkens
zwischen
Virusinfektion,
allergischer
Sensibilisierung
und
Asthmaentstehung zu untersuchen, werden Tiermodelle herangezogen.
In der Maus führt die akute RSV Infektion zu Atemwegshyperreaktivität nach
MCh Provokation und zu einer Atemwegsentzündung, die mit einem Einstrom
neutrophiler und eosinophiler Granulozyten einhergeht. Die MNZ der peribron8
chialen Lymphknoten produzieren vermehrt IFN-γ. Gleichzeitig ist die Produktion von IL-4 und IL-5 vermindert, was einer Th1-Immunreaktion entspricht
(Schwarze et al 1997). Diese Veränderungen bilden sich, nachdem sie ihr Maximum am Tag 6 erreicht haben, wieder vollständig zurück. Am Tag 21 nach
Infektion sind sie nicht mehr nachweisbar. Die durch RSV induzierte eosinophile
Atemwegsentzündung und Atemwegshyperreaktivität wird von der Anwesenheit
von IL-5 bestimmt. So bleibt bei IL-5-defizienten Mäusen die eosinophile Entzündung und Atemwegshyperreaktivität durch RSV aus. (Schwarze et al 1999).
Zudem verhindert die Blockade der Einwanderung der eosinophilen Granulozyten durch anti-VLA-4 Antikörper die Entstehung von Atemwegshyperreaktivität. Dies läßt auf einen direkten Zusammenhang zwischen Eosinophilie und
Atemwegshyperreaktivität schließen. Bei der Abwehr von Virusinfektionen sind
T-Lymphozyten, insbesondere CD8+ Zellen, beteiligt. Ihre Rolle wurde in
Depletionsversuchen untersucht (Schwarze et al 1999). Nach Depletion von
CD8+ T-Lymphozyten kam es nicht zur Entstehung von Atemwegshyperreaktivität und Eosinophilie während der akuten RSV Infektion und die IL-5 und IFN-γ
Produktion in den Atemwegen blieb aus. Gab man den CD8+ depletierten Mäusen IL-5, so stellten sich diese Folgen der akuten RSV Infektion wieder ein.
Eine Depletion von CD4+ T-Lymphozyten hatte keinen Einfluss auf diese Konsequenzen der RSV Infektion. Diese Versuche zeigen, dass CD8+ T-Lymphozyten, ebenso wie IL-5, entscheidend sind für die Veränderungen in der Lunge
während der akuten RSV Infektion. Welche Auswirkungen die RSV Infektion auf
eine nachfolgende allergische Sensibilisierung und Atemwegsreaktivität hat,
wurde von Schwarze und Mitarbeitern (Schwarze et al 1997) untersucht. Mäuse
wurden nach der Akutphase der RSV Infektion (Tag 11) oder nach völligem
Abklingen der Infektion (Tag 21) über 10 Tage einem OVA-Aerosol als Allergen
ausgesetzt. In beiden Fällen kam es zu einer verstärkten Atemwegsreaktivität
nach MCh Provokation sowie zu einer eosinophilen Entzündung in der Lunge.
Anders als in der akuten Phase der RSV Infektion produzierten MNZ der peripheren Bronchiallymphknoten am Tag 21 Zytokine vom Th-2 Typ mit reduziertem IFN-γ und erhöhtem IL-4 Spiegel. Die OVA spezifischen IgE und IgG1
Spiegel im Serum waren im Vergleich zur Sensibilisierung ohne vorherige RSV
Infektion nicht erhöht. Wurden Mäuse dagegen während der akuten Phase der
RSV
Infektion
OVA
ausgesetzt,
führte
dies
zu
einem
Anstieg
des
9
allergenspezifischen IgE Spiegels (Freihorst et al 1988, Leibovitz et al 1988).
RSV schädigt während der akuten Infektion das Epithel der Atemwege. Das
gleichzeitig über die Atemwege angebotene Allergen kann dann vermehrt
resorbiert werden und zu einer stärkeren Sensibilisierung mit einem Anstieg des
allergenspezifischen IgE Spiegels führen. Eine solche Epithelschädigung ist bei
einer Sensibilisierung nach der Akutphase der RSV Infektion nicht mehr nachzuweisen. Hier kann also nicht von einer erhöhten Allergenabsorption als Ursache für die erfolgte höhere Sensibilisierung ausgegangen werden. Es ist viel
mehr anzunehmen, dass durch die RSV Infektion eine Immunantwort ausgelöst
wird, die auch zu einem späteren Zeitpunkt eine allergische Sensibilisierung mit
allergischer Entzündung der Atemwege begünstigt. Die verstärkte Atemwegsreaktivität und Eosinophilie als Ausdruck einer gesteigerten allergischen Sensibilisierung nach RSV Infektion lassen sich in IL-5 defizienten Mäusen nicht
beobachten. Substitution dieser Mäuse mit IL-5 allein während der akuten RSV
Infektion führt zum Auftreten von Eosinophilie und Atemwegshyperreaktivität bei
nachfolgender Sensibilisierung. Eine IL-5 Substitution allein während der Sensibilisierungsphase hat keine Auswirkung auf die Atemwegsreaktivität. Diese
Erkenntnisse zeigen, dass IL-5 und möglicherweise eosinophile Granulozyten
während der akuten RSV Infektion wegbereitend sind für die allergische Entzündung und Atemwegshyperreaktivität bei der nachfolgenden Sensibilisierung.
Transferversuche haben gezeigt, dass CD8+ T-Lymphozyten für die Auswirkungen der RSV Infektion auf eine nachfolgende allergische Sensibilisierung
und Atemwegsreaktivität entscheidend sind. (Schwarze et al 1999). CD8+ TZellen wurden aus peribronchialen Lymphknoten RSV infizierter Mäuse gewonnen und auf nicht infizierte Tiere übertragen. Nach der darauf folgenden Sensibilisierung entwickelten sich Atemwegshyperreaktivität und Lungeneosinophilie
mit erhöhter IL-5 Konzentration. Ein Transfer von CD4+ T-Zellen führte nicht zu
diesen Veränderungen. Das Ergebnis des Transfers war von dem Zeitpunkt
nach RSV Infektion abhängig, an dem er durchgeführt wurde. Ein Transfer von
T-Zellen 14 Tage nach RSV Infektion führte zu den beschriebenen Konsequenzen, wohingegen es bei einem T-Zell Transfer 7 Tage nach Infektion weder zu
Atemwegshyperreaktivität, noch zu Lungeneosinophilie noch zu einem Anstieg
der IL-5 Produktion nach allergischer Sensibilisierung kam. Diese Beobachtung
legt nahe, dass während der akuten Infektion (Tag 7) eine Th-1 Immunantwort
10
überwiegt und IFN-γ produzierende, zytotoxische CD8+ T-Zellen übertragen
werden, während nach Abklingen der Infektion (Tag 14) eine Th-2 Immunreaktion in den Vordergrund rückt und der Transfer von nicht zytotoxischen, IL-5
produzierenden CD8+ T-Zellen eine allergische Sensibilisierung mit eosinophiler Entzündung begünstigt.
Aus den Untersuchungen an Tiermodellen lässt sich zusammenfassend festhalten, dass die RSV Infektion im Mausmodell die Auswirkungen einer allergischen Sensibilisierung über die Atemwege begünstigen kann. Dies geschieht
durch eine durch RSV induzierte CD8+ T-Zellantwort mit vermehrter IL-5 Bildung, die zu einer eosinophilen Entzündung und Atemwegs-hyperreaktivität
führt (Abb.1).
Abb. 1:
Immunologische Interaktionen zwischen RSV Infektion und allergischer
Sensibilisierung bei der Entstehung von Atemwegshyperreaktivität - eine
Hypothese (Schwarze et al 2002)
Andere Untersuchungen an Meerschweinchen und Mäusen haben gezeigt,
dass nicht nur eine Virusinfektion der Atemwege die Auswirkungen einer nachfolgenden allergischen Sensibilisierung verstärken kann, sondern, dass auch
eine allergische Entzündung der Atemwege die Folgen einer anschließenden
Virusinfektion verstärkt (Robinson et al 1997, Peebles et al 2001).
11
1.2
Dendritische Zellen als Initiatoren der spezifischen Immunantwort
Tiermodelle haben gezeigt, dass für die Folgen der RSV Infektion T-Lymphozyten verantwortlich sind. T-Zellen bedürfen zur Entfaltung ihrer Funktion einer
Aktivierung durch Antigen präsentierende Zellen. Nur DZ sind als hochspezialisierte APZ in der Lage, mit naiven T-Zellen in Kontakt zu treten und deren Differenzierung auszulösen. DZ kommen in fast allen lymphoiden und nicht
lymphoiden Organen vor und besitzen als professionelle APZ im Gegensatz zu
anderen APZ (B-Zellen und Makrophagen) die einzigartige Fähigkeit, naive TZellen zu aktivieren. Diese Aktivierung naiver antigenspezifischer T-Zellen
durch DZ ist der entscheidende erste Schritt der spezifischen Immunantwort.
DZ sind in fast allen Geweben und Organen vorhanden und liegen dort als unreife Zellen vor. (Steinmann 1991). Diese unreifen Zellen haben nur eine
schwache T-Zell stimulierende Aktivität, verfügen aber über eine hohe Phagozytosekapazität und sind auf Antigenaufnahme und –verarbeitung spezialisiert.
Sie exprimieren verschiedene Rezeptoren zur Antigenaufnahme, z.B. Mannoserezeptor, Immunglobulin-rezeptoren und Complementrezeptoren (Sallusto et al
1995). Die Antigenaufnahme kann über Endozytose, Makropinozytose und
Phagozytose erfolgen. Verglichen mit anderen APZ wie B-Zellen und
Makrophagen sind DZ die effizientesten APZ (Masten et al 1999).
Erst nach Antigenaufnahme oder Stimulation durch das umliegende Zytokinmilieu des jeweiligen infizierten Gewebes oder Organs reifen sie aus und sind
dann in der Lage, T-Zellen optimal zu aktivieren und zur Proliferation anzuregen, wobei eine einzige DZ hunderte von naiven T-Zellen stimulieren kann.
Dies geschieht in den T-Zell Regionen der Lymphknoten, wohin DZ über das
afferente Lymphsystem nach Stimulation einwandern (Steinmann 1991, Banchereau et al 2000). Nach antigener Stimulation vermehren und differenzieren
sich die T-Zellen unter Einfluss von IL-2. Die durch APZ aktivierten und differenzierten T-Effektorzellen verlassen die Lymphknoten über die efferente
Lymphbahn und wandern zurück zum Ort der Entzündung. Reife DZ unterscheiden sich von unreifen durch spezifische Oberflächenmoleküle, die für die
T-Zell Aktivierung notwendig sind (Cella et al 1997). Wichtig für die T-Zell Stimulierung ist die Präsentation von Antigenen auf MHC-I und MHC-II Molekülen,
über die die Erkennung durch den spezifischen T-Zellrezeptor verläuft. Ausge12
reifte DZ exprimieren diese Moleküle vermehrt auf ihrer Oberfläche. Neben der
T-Zellrezeptor-MHC Bindung muss die T-Zelle über weitere Signale, sog.
costimulierende Moleküle aktiviert werden. Dazu gehören u. a. CD80 und
CD86, die mit CD28 auf den T-Zellen interagieren. Man kann zwei T-Effektorzellgruppen unterscheiden. CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten. Sowohl naive
CD4+ als auch naive CD8+ Zellen erfahren bei ihrer Aktivierung auch eine Differenzierung. CD8+ Zellen entwickeln sich überwiegend zu IFN-γ produzierenden, zytotoxischen Tc1-Zellen, aber es treten auch IL-4 und IL-5 bildende, nicht
zytotoxische Tc2- Zellen auf. Naive CD4+ Zellen können zu Th1, Th2- oder regulatorischen T-Zellen differenzieren. Diese sezernieren unterschiedliche Zytokine und induzieren damit unterschiedliche immunologische Prozesse. Th1
Zellen produzieren überwiegend IL-2, IFN-γ und TNF-β, um Makrophagen und
zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. Th2 Lymphozyten sezernieren IL-4, IL-5, IL6, IL-9, IL-10 und IL-13 und induzieren damit eine überwiegend humorale Immunantwort. Regulatorische T-Zellen bilden überwiegend IL-10 und hemmen
Immunantworten. Die Entscheidung, was aus einer naiven CD4+ Zelle wird, fällt
vermutlich bei ihrem ersten Kontakt mit dem Antigen, das von DZ präsentiert
wird. Die Differenzierung ist abhängig vom Zytokinmilieu. Während IL-12, IFN-γ
und IL-18 zur Th1 Differenzierung führen, induzieren IL-4 zusammen mit IL-6
eine Th2 Differenzierung. IL-10 bildende DZ induzieren regulatorische T-Zellen.
Neuere Daten weisen auf eine Plastizität der DZ hin, die durch mikrobielle Signale (z.B. LPS über den Toll-like-Rezeptor 4) dazu gebracht werden, eine T-Zell
Differenzierung auszulösen (Boonstra et al 2003).
In der Lunge kommen DZ in großer Zahl vor, wo sie als unreife Zellen ihre
Funktion als Wächter (sentinels) ausüben. Hier exprimieren sie MHC-II auf intermediärem Niveau und besitzen kaum costimulierende Moleküle. Funktionell
sind sie darauf spezialisiert, Antigen aufzunehmen und sind nur in geringem
Maße dazu in der Lage, naive T-Zellen zu aktivieren (Schon-Hegard et al 1991,
Holt et al 1990). Ihr unreifer Zustand wird wahrscheinlich durch Mediatoren der
Umgebung aufrechterhalten, wie (PG)E2, IL-10, und NO oder durch membranöse Liganden (Cadherin), die von Epithelzellen exprimiert werden (Stumbles et
al 1998).
Unter inflammatorischen Bedingungen ändert sich die Funktion der DZ dramatisch. Virale und bakterielle Antigene sowie Allergene führen zu einem Anstieg
13
der Anzahl DZ in der Lunge (Mc William et al 1995, Mc William et al 1996, Mc
William et al 1998, Hamilton-Easton et al 1995). Gleichzeitig induzieren sie eine
Aktivierung der DZ. Wahrscheinlich werden DZ durch verschiedene Chemokine
ins Entzündungsgebiet „gelockt“, wobei MIP 3-α das wichtigste Chemokin zu
sein scheint (Power et al 1997).
Im Blut zirkulierende monozytäre Vorläufer der DZ wandern daraufhin ins Entzündungsgebiet, wo sie nach transepithelialer Migration den Phänotyp unreifer
DZ annehmen. Durch Antigenaufnahme wird die Wanderung der DZ zu den peribronchialen Lymphknoten induziert und es kommt zur Expression costimulierender Faktoren wie CD80, CD86, die die Kontaktaufnahme zu T-Zellen und
deren Aktivierung ermöglicht. Die Migration der DZ nach Antigenaufnahme erfolgt schnell. Innerhalb von 12 Stunden können DZ der Lunge in den T-Zell
abhängigen Zonen der drainierenden Lymphknoten nachgewiesen werden
(Lambrecht et al 2000a, Lambrecht et al 2000b, Havenith et al 1993). 3-4 Tage
später verlassen antigenspezifische CD4+ und CD8+ Lymphozyten auf efferentem Weg die Lymphknoten, um über den Blutkreislauf an den Ort des
Geschehens zu gelangen (Lambrecht et al 2000a, Hamilton-Easton et al 1995).
1.3
Rolle Dendritischer Zellen bei Virusinfektion und allergischer
Sensibilisierung
Dem Organismus stehen zur Abwehr von Krankheitserregern zwei sich einander ergänzende Systeme zur Verfügung: das unspezifische angeborene
Immunsystem und das spezifische erworbene Immunsystem. Zum unspezifischen Immunsystem gehören phagozytierende Zellen, Natürliche Killerzellen,
Komplement und Interferone. Diese sind in der Lage, eingedrungene Pathogene rasch zu erkennen, zu bekämpfen und körpereigene Immunzellen der
erworbenen Abwehr zu aktivieren. Zellen des spezifischen Immunsystems sind
Lymphozyten. Diese reagieren auf Pathogene mit der Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen und von Th- Zellen. Letztere fördern die Bildung von
spezifischen Antikörpern durch B-Zellen. Ein weiteres Kennzeichen dieses
Systems ist das immunologische Gedächtnis. Beide Systeme sind durch komplexe
Regulationsmechanismen
eng
miteinander
verknüpft.
Eine
Schlüsselfunktion bei der Integration beider Systeme kommt den DZ zu.
14
Eine Virusinfektion setzt beide Systeme der Immunabwehr in Gang: virusinfizierte Epithelzellen und Fibroblasten produzieren IFN-α/β. Dieses stört die
Virusreplikation, aktiviert die NK und induziert die Synthese von MHC-I. IFN-α/β
wird nicht nur von virusinfizierten Zellen produziert. Es gibt in der Blutbahn
einen Pool an IFN produzierenden Zellen, die an Orte viraler Replikation und
inflammatorische Lymphknoten rekrutiert werden können (Kadowaki et al 2000).
Diese sind in der Lage, T Zellen zur Produktion von IFN-γ und IL-10 anzuregen.
Über ihre hohe IFN-α Produktion tragen sie zur Reifung und Migration der gewebsständigen DZ sowie zur Bildung antiviraler Effektor T-Zellen bei.
Untersuchungen in der Maus haben gezeigt, dass DZ die zytotoxischen NK
direkt aktivieren können. Dies geschieht durch Rezeptorinteraktionen (CD80,
CD40L) und durch IFNα, IL-12, IL-15 und IL-18 Produktion.
Zur spezifischen Abwehr viraler Infektionen sind zytotoxische CD8+ Lymphozyten und CD4+ Th-Zellen notwendig, deren T-Zellrezeptoren die auf MHC-I
beziehungsweise MHC-II Molekülen präsentierten viralen Peptide erkennen.
Allein DZ exprimieren die costimulierenden Moleküle, die zur Aktivierung naiver
CD8+ und CD4+ T- Zellen notwendig sind.
Für eine Reihe von Viren, darunter auch RSV, konnte gezeigt werden, dass sie
DZ in vitro infizieren können. Eine Infektion der DZ selbst ist eine Möglichkeit,
aber keine Voraussetzung für die DZ, virale Antigene auf MHC-I Molekülen zu
präsentieren. Findet die Virusreplikation außerhalb der DZ statt, können diese
Zellen Viruspartikel oder virusinfizierte apoptotische Zellen phagozytieren und
diese exogenen Antigene durch Kreuzpräsentation (Albert et al 1998) auch über
den MHC-I Weg und nicht nur auf MHC-II Molekülen präsentieren. DZ können
auch Inhalationsantigene aufnehmen und den T Lymphozyten in dem drainierenden Lymphknoten präsentieren (Abbas et al 1996). Die über die Atemwege
kommenden exogenen Allergene werden von APZ aufgenommen, verarbeitet
und auf MHC-II Molekülen den CD4+ T-Zellen präsentiert.
Eine Reihe von Untersuchungen in Tiermodellen hat gezeigt, dass DZ eine
Allergensensibilisierung induzieren. So führen in vitro mit OVA gepulste DZ der
Lunge nach intravenösem adaptiven Transfer zur Blildung von Th2 abhängigen
Antikörpern gegen OVA (IgG1, IgE). Pulst man myloide DZ mit OVA und instilliert sie in die Trachea naiver Mäuse, so kommt es nach einer Aerosolexposition
mit OVA Antigen 10-14 Tage später zu perivasculärer und peribronchialer eosi15
nophiler Entzündung (Lambrecht et al 2000). Eine alleinige kurze OVA-Inhalation bewirkt keine Sensibilisierung.
DZ spielen als APZ bei der Induktion einer allergischen Immunreaktion eine
zentrale Rolle. Ihr Funktionszustand wird durch Virusinfektionen beeinflusst. 2-5
Tage nach einer Influenzainfektion der Maus ließ sich ein nur kurz andauernder
Einstrom von DZ in die Atemwege beobachten (Yamamoto et al, 2000). Bei
gleichzeitiger Allergenexposition, die zu einer verstärkten Sensibilisierung und
Atemwegshyperreaktivität führte, konnten MHC-II exprimierende DZ 5 Wochen
lang in den Atemwegen nachgewiesen werden. Nach Allergenexposition ohne
Virusinfektion war dies nicht der Fall. Es ist also möglich, dass die Virusinfektion
den Einstrom von DZ in die Atemwege auslöst und ihre antigenpräsentierende
Funktion, durch MHC-II Expression gekennzeichnet, hoch reguliert. So kann
gleichzeitig vorhandenes Allergen effektiv präsentiert werden und z.B. eine Th2
Immunantwort auslösen, wie es bei der allergischen Sensibilisierung geschieht.
1.4
Arbeitshypothese und Zielsetzung
DZ der Atemwege sind als APZ entscheidend an der Auslösung von Immunantworten gegen virale Atemwegsinfektionen sowie an der Induktion einer allergischen
Sensibilisierung
über
die
Atemwege
beteiligt.
Die
verstärkte
Atemwegssensibilisierung infolge einer RSV Infektion ist wahrscheinlich durch
DZ ermöglicht, die während der RSV Infektion in die Lunge rekrutiert werden
und T-Zellen zu Th2 Immunreaktion anregen.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von DZ während der RSV Infektion im
Mausmodell im Hinblick auf deren Zahl und Lokalisation, auf die Expression von
MHC-II und costimulierenden Molekülen und insbesondere auf ihr Vermögen,
T-Zellen zu aktivieren. Dazu wurden Mäuse intranasal mit RSV infiziert. MNZ
aus Lunge und Milz infizierter Mäuse wurden auf die Expression von CD11c,
MHC-II und CD86 untersucht. Um einen funktionellen Vergleich von DZ durchführen zu können, wurde eine Methode zur direkten Isolierung dieser Zellen aus
Lunge und Milz etabliert. Die direkt isolierten DZ wurden in einer gemischten
Lymphozytenkultur auf ihre T-Zell aktivierende Fähigkeit hin überprüft.
16
2
Tiere, Material und Methoden
2.1
Tiere
BALB/c Mäuse, 15-17 g, weiblich H2 Haplotyp d
Charles River
C57/BL6, 15-17 g, weiblich H2 Haplotyp b
Charles River
Die Mäuse waren frei von spezifischen Pathogenen und wurden unter
konstanten Bedingungen bei allergenfreier Kost in Mikroisolatoren
gehalten. Es lag eine Tierversuchsgenehmigung des RegierungsPräsidiums Arnsberg vor.
2.2
Virus
Humanes RSV Typ A (Long Strain) aus
Ruhr-Universität Bochum
HEp-2-Zellkulturen (Titer: 5x10^6 PFU/ml)
Abteilung für Mol.& Med.
Virologie
2.3
Materialien
2.3.1
Labormaterialien und Geräte
Materialien
1 ml Feindosierungsspritze
Alk Scherax, Hamburg
5 ml Rundbodenröhrchen, Polystyrol
Falcon/BD, Heidelberg
10 ml serologische Pipette, steril
Falcon/BD, Heidelberg
10 ml Einmalspritze
B.Braun, Melsungen
20 ml Einmalspritze
B.Braun, Melsungen
15 ml konische Röhrchen (Blue MaxTM Jr.)
Falcon/BD, Heidelberg
50 ml konische Röhrchen (Blue MaxTM Jr.)
Falcon/BD, Heidelberg
G20-Nadel
BD, Heidelberg
G21-Nadel
BD, Heidelberg
G22-Nadel
BD, Heidelberg
17
G23-Nadel
BD, Heidelberg
Glasstab
Sigma-Aldrich GmbH
Taufkirchen
Metallnetz (100µm)
Sigma-Aldrich-GmbH,
Taufkirchen
Petrischale 100x200mm
Sigma-Aldrich GmbH
Taufkirchen
Pinzetten gerade, spitz, 115mm
Oehmen, Essen
Pinzetten gebogen, 115mm
Oehmen, Essen
Probenbehälter (Sample Chamber)
Shandon Inc., Pittsburgh
Scheren
Oehmen, Essen
Gerade, 105mm
Gebogen, 105 mm
Zählkammer nach Neubauer
BD, Heidelberg
Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal
BD, Heidelberg
Zellkulturplatte (MICROTESTTM )
Falcon/BD, Heidelberg
96 Vertiefungen, Flachboden, mit Deckel
Zellsieb 40µm
BD, Heidelberg
Geräte
Auflichtmikroskop
OLYMPUS, Japan
(Umkehrmikroskop) CK2
AutoMacs
Miltenyi
Biotec
GmbH,
Bergisch-Gladbach
2.3.2
Beta-Counter (Liquid Scintillation)
LKB-Wallak, Freiburg
Brutschrank (CO2-Inkubator)
Heraeus, Düsseldorf
Durchflusszytometer FACScan®
BD, Heidelberg
Durchlichtmikroskop
Zeiss, Jena
Zellerntegerät (cell Harvester)
Titertek, Oslo, Norwegen
Zentrifuge (Omnifuge 2.0RS)
Heraeus, Düsseldorf
Reagenzien
Albumin, Chicken egg (Reinheitsgrad V)
Sigma-Aldrich GmbH,
18
Taufkirchen
AlumInject
Pierce Chemical,
Rockford, IL
β-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich GmbH,
Taufkirchen
Collagenase Typ IA-S
Sigma-Aldrich GmbH,
Taufkirchen
Ethanol absolut
Merck, Darmstadt
FCS Fetales Kälberserum
Biochrom KG, Berlin
Ficoll-Trennlösung (Dichte 1.090 g/ml)
Biochrom KG, Berlin
Hanks balanced salts (HBSS)
Sigma-Aldrich GmbH,
Taufkirchen
³H-Thymidin
Amersham Pharmacia
Biotec, Buckinghamshire,
UK
L-Glutamin
Biochrom KG, Berlin
PBS, steril
Biochrom KG, Berlin
Penicillin/Streptomycin
Biochrom KG, Berlin
Phytohaemagglutinin (PHA)
Sigma-Aldrich GmbH,
Taufkirchen
Propidiumiodid (PI)
Sigma-Aldrich GmbH
Taufkirchen
RPMI 1640-Flüssigmedium
Biochrom KG, Berlin
Türk´sche Lösung
Fluka Chemie, Buchs, CH
Kulturmedium:
RPMI
440 ml
FCS
50 ml
L-Glutamin
5,0 ml
Penicillin/Streptomycin
5,0 ml
ß-Mercaptoethanol-Ausgangslösung
0,168 µl
19
2.3.3
Antikörper
Anti-CD11c MicroBeads
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach
Anti-Maus CD11c FITC (HL3)
BD, Heidelberg
Anti-Maus CD3ε PE (CD3ε chain)
BD, Heidelberg
Anti-Maus CD86 PE (GL1)
BD, Heidelberg
Anti-Maus I-Ad PE (AMS-32.1)
BD, Heidelberg
Anti-Maus IgG 2b κ PE isotyp control
BD, Heidelberg
FcR-Blocking-Reagenz
Miltenyi Biotec GmbH,
Bergisch-Gladbach
Hamster IgG 1, κ FITC isotyp control
BD, Heidelberg
(anti-TNP)
2.4
PC-Software
PC-Software „GraphPad Prism“
GraphPad Software
Incorporated,
San Diego, USA
PC-Software “SPSS”
Regionales
Rechenzentrum Köln
FACS-Software Cellquest
2.5
Methoden
2.5.1
Allergische Sensibilisierung der Mäuse
BD, Heidelberg
Mäusen wurde 20µg OVA, in 2 mg Aluminiumhydroxid-Emulsion, in einem Gesamtvolumen von 100µl am Tag 0 und Tag 10 intraperitoneal injiziert.
An den Tagen 21, 22 und 23 wurden sie für jeweils 20 min einem OVA Aerosol
(1% in PBS) ausgesetzt (Airway Challenge).
20
2.5.2
RSV Infektion der Mäuse
BALB/c Mäuse wurden mit 2,5%-iger Avertinlösung (0,015 ml/g Körpergewicht)
intraperitoneal narkotisiert. Dann wurde 3x10^5 PFU RSV in 60µl PBS intranasal verabreicht.
2.5.3
Gewinnung von Mononukleären Zellen
Zur Etablierung der Methode wurden MNZ aus der Milz sensibilisierter Tiere
verwendet. Im Rahmen der Hauptversuche wurden MNZ aus Milz und Lunge
RSV infizierter bzw. nicht infizierter Kontrolltiere an den Tagen 4, 6, 10, 14 und
21 gewonnen. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet. Nach Entnahme
der Organe wurden diese unter sterilen Bedingungen verarbeitet.
Die Milz wurde mit einer Schere grob zerschnitten und über ein mit 5 ml PBS
angefeuchtetes Metallnetz (100 µm) mit einem Glasstab vorsichtig gerieben und
mit weiteren 5 ml PBS aufgenommen. Die so gewonnene Zellsuspension (10ml)
wurde auf 50 ml Falcon Röhrchen (pro Milz 2 Röhrchen) verteilt, mit sterilem
PBS im Verhältnis 1:3 verdünnt und mit 10 ml Ficoll (Dichte 1.090 g/ml) unterschichtet.
Die Lunge wurde in einer Petrischale fein zerschnitten und in 5 ml Kollagenaselösung (1,75 mg Kollagenase + 4,5 ml HBSS + 0,5 ml FCS) und weiteren 5
ml PBS aufgenommen. Die Zellen wurden dann 1 h im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Es folgte eine erneute mechanische Zerkleinerung der Lungenpartikel
mit einer Spritze. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 350 g wurde das Pellet
mit 35 ml PBS resuspendiert und mit 10 ml Ficoll unterschichtet. Im Weiteren
wurde für alle Organe gleich verfahren.
Nach 20-minütiger Zentrifugation, ohne Bremse, bei 660g, hatten sich drei Phasen gebildet. Unten im Pellet die Erythrozyten, oben die Thrombozyten und
schließlich die mittlere Schicht, die so genannte Interphase, in der die MNZ liegen. Diese Interphase wurde vorsichtig mit einer 10ml sterilen Pipette abgenommen und mit sterilem PBS 10 min lang bei 350g, dann 15 min lang bei 300g
gewaschen. Es folgte eine Zellzahlbestimmung nach Anfärbung der Zellen mit
Türk´scher Lösung (Verdünnungsfaktor: 10) in der Zählkammer nach Neubauer.
Die so gewonnenen MNZ wurden dann für weitere Schritte verwendet.
21
2.5.4
Isolierung CD11c positiver Zellen nach dem Prinzip der
magnetischen Zellsortierung
Die automatische, Magnet assoziierte Zellsortierung (AutoMacs) ist eine computer-unterstützte Technik zur Zellisolierung, mit der schon kleinste Zellmengen
aus heterogenen Zellpopulationen isoliert werden können. Die Oberflächenantigene
der
zu
selektionierenden
Zellen
werden
mit
hochspezifischen
paramagnetischen Antikörpern, so genannten Macs MicroBeads, markiert. Die
MacsMicroBeads sind sehr kleine (Durchmesser ca. 50 nm) Molekülkomplexe
aus Eisenoxid und Polysacchariden. Sie zersetzen sich in Kultur und beeinflussen weder Funktion noch Überlebensfähigkeit der Zellen. Auch deren
Erscheinungsbild im Licht- und Fluoreszenzmikroskop bleiben unbeeinflusst.
Die mit den MicroBeads markierten Zellen passieren eine Separierungssäule,
die sich in einem starken, permanenten Magnetfeld befindet. Nur die magnetisch markierten Zellen bleiben an der Säule haften. Unmarkierte Zellen
verlassen als negative Fraktion die Säule. Nach Abschalten des magnetischen
Feldes werden die in der Säule verbliebenen Zellen als positive Fraktion eluiert.
Abb. 2 Prinzip der Magnetischen Zellsortierung (AutoMacs, Benutzerhandbuch). Mit
MicroBeads markierte Zellen bleiben an der Separierungssäule durch Wirkung
des elektrischen Magnetfeldes haften und werden nach Abschalten desselben
eluiert.
22
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die mittels Dichtezentrifugation über Ficoll®
isolierten MNZ in Puffer aufgenommen. Auf 1x10^8 Zellen wurden 100 µl Blockingreagenz (humanes IgG) zur Blockade von Fc-Rezeptoren und 100 µl antiCD11c-MicroBeads gegeben und die Zellen wurden in einem Gesamtinkubationsvolumen von 500 µl 15 min lang bei 4°-6°C inkubiert. Nach Zugabe der
10fachen Menge des Inkubationsvolumens an PBS wurde 10 min bei 350g
zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet in mindestens 500 µl auf 1x10^7 Zellen PBS resuspendiert. Um die Vitalität der Zellen
möglichst zu erhalten, wurde mit eisgekühlten Medien gearbeitet.
Das AutoMacs-Gerät bietet verschiedene Sortierungsprogramme, die je nach
zu selektierenden Zielzellen gewählt werden. Prinzipiell kann eine Sortierung
über eine oder zwei Separierungssäulen mit variabler Geschwindigkeit laufen.
Da es sich bei den CD11c positiven Zellen um sehr rare Zellen handelt, wurden
die markierten Zellen im Programm der doppel-positiven Selektion (POSSELD)
sortiert, um einen möglichst hohen Reinheitsgrad der markierten Zellen zu
erreichen. Hierbei erfolgte die Sortierung über zwei Säulen. Markierte Zielzellen
verblieben nach dem Durchlauf über die erste Selektionssäule im Gerät. Sie
wurden zunächst in ein Reservoir eluiert und anschließend über eine zweite im
Gerät befindliche Säule geleitet. Erst dann wurde die positive Fraktion eluiert.
Die CD11c positiven und CD11c negativen Fraktionen wurden getrennt in zwei
15 ml Röhrchen aufgefangen. Die Zellzahl der positiven Fraktion wurde nach
Anfärbung der Zellen mit Türk´scher Lösung in der Zählkammer nach FuchsRosenthal (für geringe Zellzahlen) bestimmt. Die Zellzahl der negativen Fraktion
wurde nach Anfärbung der Zellen mit Türk´scher Lösung in der Zählkammer
nach Neubauer bestimmt. Beide Fraktionen wurden in Kulturmedium aufgenommen.
Die durch die AutoMacs Sortierung gewonnen Zellen wurden auf Reinheit und
Viabilität geprüft. Die Reinheit wurde im Durchflußzytometer untersucht und als
prozentueller Anteil positiver bzw. negativer Zellen in der positiven bzw.
negativen Fraktion angegeben. Die Viabilität der Zellen wurde ebenfalls im
Durchflußzytometer nach Markierung der Zellen mit PI untersucht.
23
2.5.5
Analytische Durchflußzytometrie (FACS)
Das Durchflußzytometer dient der Analyse von Zellen über gleichzeitige Messung von Fluoreszenz- und Streulichtsignalen an einzelnen Zellen. Relative
Zellgröße, Granularität, sowie drei verschiedene Fluoreszenzintensitäten
können für mehrere tausend Zellen in weniger als einer Minute ermittelt werden.
Über eine angeschlossene Datenauswertung werden die erhobenen Daten verarbeitet und die Ergebnisse ausgegeben.
Die Probe – eine Zellsuspension in einer Konzentration von 0,5 bis 20 Millionen
Zellen pro Milliliter – wird aus einem Reagenzröhrchen (Abb.3) über eine
Stahlkapillare durch Überdruck in die Messküvette eingeführt. Die Messküvette
besteht aus Quarzglas. Während die Zellen den Analysepunkt passieren, sind
sie von einem Hüllstrom umgeben. Dieser dient dazu, den Probenstrom im
Zentrum der Messküvette zu stabilisieren und so zu verengen, dass die Zellen
hintereinander im „Gänsemarsch“ einzeln zum Analysepunkt gelangen (hydrodynamische Fokussierung). Der Analysepunkt ist die wichtigste Stelle im
gesamten System. Er ist definiert als der Ort, an dem der Lichtstrahl (Laser)
den Flüssigkeitsstrahl kreuzt.
24
Abb. 3 Prinzip der Durchflußzytometrie (Bedienungsanleitung des FACScan®). Zu
analysierende Zellen werden durch Trägerflüssigkeit stabilisiert und gelangen
zum
Analysepunkt,
wo
Licht-
und
Flüssigkeitsstrahl
sich
kreuzen
(hydrodynamische Fokussierung).
Messung der Lichtstreuung
Die Lichtstreuung ist definiert als ein physikalischer Prozess, bei dem ein Partikel (eine Zelle) mit dem einfallenden Lichtstrahl interagiert. Bei dieser Interaktion wird nur die Richtung, nicht die Wellenlänge des Lichts verändert.
Zur Lichtstreuung tragen Zelleigenschaften bei wie
-
Zellgröße
-
Zellmembran
-
Zellkern und
-
Intrazelluläre granuläre Bestandteile.
Darüber hinaus sind daran die Struktur der Membranoberfläche (rau oder glatt)
und die Zellform beteiligt.
Der größte Anteil des Lichtes wird in die Vorwärtsrichtung (d.h. entlang des
einfallenden Lichtstrahles) gestreut. Dieses Licht wird Vorwärtsstreulicht (FSC)
25
bezeichnet. Es ist ein Maß hauptsächlich für die Zellgröße. Das im rechten
Winkel zum einfallenden Lichtstrahl gestreute Licht hängt von der Zelldichte und
der Granularität und nur zum geringen Teil von der Zellgröße ab. Dieses Licht
wird als Rechtwinkelstreulicht (SSC) bezeichnet.
Messung der Fluoreszenz
Die Fluoreszenz ist definiert als das durch Strahlung angeregte Leuchten eines
Stoffes. Und beruht auf Wechselwirkungsprozessen der Elektronen fluoreszierender Verbindungen mit (Laser)Lichtenergie. Als Anregungsquelle im FACScan dient ein Argon-Laser. Das von ihm emittierte Licht hat eine Wellenlänge
von 488 nm. Eingesetzte Fluoreszenzfarbstoffe FITC und PE können einzeln
eingesetzt oder aber auch gleichzeitig bei einer einzigen Wellenlänge angeregt
werden. Grund ist die sich deutlich von einander unterscheidenden Gipfel der
Emissionsmaxima bei sich überlappenden Absorptionsspektren.
Signalverarbeitung
Alle Signale werden mittels elektronischer Schaltungen gemessen und quantifiziert, die die Pulshöhe (Amplitude) bestimmen. Das bedeutet, dass die Signale
in ihrer Höhe klassifiziert werden. Passiert eine Zelle den Analysepunkt, werden
Signale vom FSC, SSC und Fluoreszenz(en) gemessen. Dies geschieht durch
eine Kombination von Signalmessung und –verstärkung. Dabei werden Lichtsignale von Photodetektoren erfasst und in diesem proportionalen elektronischen Signale umgewandelt. Die Pulshöhe des gemessenen und verstärkten
Signals, die analog zur Signalstärke ist, wird im Analog-Digital-Wandler in ein
digitales und computergerechtes Signal umgewandelt.
Datenauswertung
In dieser Arbeit wurden die Daten mit dem Analyseprogramm Cellquest, aufgetragen als korrelierte Zweiparameterdarstellung (Dot Plot), ausgewertet (Abb.4).
In dieser Darstellung wird ein Signalpaar (z.B. FSC und Fluoreszenz) gleichzeitig gezeigt. Die Intensitätsachsen der beiden Parameter werden gegeneinander
aufgetragen. In der so gebildeten Matrix steht ein Punkt für eine bestimmte
Zelle und zeigt deren Größe sowie deren assoziierte Fluoreszenz.
26
a)
b)
Abb. 4 Zweiparameterdarstellung im Durchflußzytometer (Dot Plot) am Beispiel einer
CD11c Sortierung aus MNZ der Milz von Balb/c Mäusen vor Sortierung (a) und
nach Sortierung im AutoMacs.
Autofluoreszenz und Qualitätskontrolle
Viele Zellen zeigen bei der Anregung mit 488 nm auch ohne Anfärbung eine
gewisse Fluoreszenz. Dieses Phänomen wird als Autofluoreszenz bezeichnet.
Dieses Fluoreszenzlicht emittieren ungefärbte Zellen aufgrund ihrer eigenen
chemischen Zusammensetzung. Zur Qualitätssicherung wurde eine Probe mit
einem unspezifischen Antikörper und entsprechendem Fluoreszenzfarbstoff
(Autofluoreszenz und unspezifische Bindung) gemessen und als „negative
Kontrolle“ bestimmt. Messungen, deren Intensität über den Werten der Kontrollmessung lag, galten als positiv. In dieser Arbeit wurden pro Probe 1x10^5 –
2x10^5 Zellen in 100 µl azidhaltigem PBS in ein Reagenzglas (FACS-Röhrchen) gegeben und mit den Fluoreszenzantikörpern für 15 Minuten bei 4°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Probe mit 2 ml PBS aufgefüllt und
dann für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 250 µl azidhaltigem PBS
aufgenommen und weiter im Durchflußzytometer analysiert.
27
Die Antikörper wurden wie folgt dosiert:
FITC
PE
CD11c
3 µl
CD I-A
1,5µl
CD3
1,5 µl
CD 86
1,5 µl
PI wurde unmittelbar vor der Messung der Probe hinzu gegeben.
2.5.6 Gemischte Lymphozytenreaktion
Bei der allogenen gemischten Lymphozytenreaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) werden T-Zellen (Responderzellen) mit so genannten stimulierenden
Zellen genetisch unterschiedlicher Individuen in vitro kultiviert. Das unterschiedliche MHC Muster wird von T-Zellen als andersartig erkannt. Die T-Zellen
werden dazu angeregt zu proliferieren und zu Effektorzellen zu differenzieren.
Als Ausdruck dieser Reaktion bilden sich mikroskopisch sichtbare, so genannte
Cluster. Diese sind Ansammlungen von proliferierten T-Zellen, die sich um die
stimulierende Zelle gruppieren.
Stimulierende Zellen in dieser Arbeit waren isolierte CD11c positive Zellen aus
BALB/c Mäusen. Als Responderzellen wurden MNZ aus C57/BL6 Mäusen eingesetzt. Die Responder- und Stimulatorzellen wurden in verschiedenen Mengen
miteinander in einem Brutschrank mit 8% CO2 4 Tage kultiviert. Die Kultivierung
erfolgte in dem beschriebenen Kulturmedium. MNZ aus Milz der C57/BL6
Mäuse wurden in der Konzentration 3x10^5 pro well eingesetzt. CD11c positive
Zellen aus BALB/c-Mäusen wurden in den Konzentrationen 5x10^1, 5x10^2,
5x10^3 und 5x10^4 hinzugegeben. Um das spezifische Vermögen CD11c positiver Zellen, Lymphozyten zur Proliferation zu aktivieren, besser beurteilen zu
können, wurden Kontrolkulturen mit PHA (1µg/ml) als unspezifischem Lymphozytenstimulator in jedem Experiment mitgeführt.
Zur Quantifizierung der Responderzellproliferation wurde am Tag 4 der Inkubation 10 µCi/ml ³H-Thymidin (37 mbq, entsprechend 1 mCi/ml) in die Lymphozytenkultur gegeben. Diese radioaktive Base wird von den T-Zellen aufgenommen
und für die DNA-Synthese bei der Zellteilung verwendet. 18 Stunden nach
Gabe von ³H-Thymidin wurden die Zellen mit einem Zellerntegerät auf Filterpapier transferiert und in einem Beta-Counter analysiert. Die Radioaktivität, dargestellt als radioaktive Zerfallsereignisse pro Minute (cpm), wurde als Maß der
Proliferation benutzt.
28
3
Ergebnisse
3.1
Durchflußzytometrische Untersuchung Dendritischer Zellen im
Verlauf der RSV Infektion
Ziel dieser Arbeit war es, das Verhalten Dendritischer Zellen während der RSV
Infektion in der Maus zu untersuchen. Dazu wurden BALB/c Mäuse mit 3x10^5
PFU RSV intranasal infiziert. An den Tagen 4, 6, 10, 14 und 21 nach Infektion
wurden MNZ aus Lunge und Milz gewonnen und durchflußzytometrisch auf die
Expression von CD11c, MHC-II und CD86 untersucht. CD11c und MHC-II werden als Oberflächenmarker auf DZ gefunden. Zellen, die beide Molekule coexprimieren werden im folgenden als DZ bezeichnet. Reife DZ exprimieren
MHC-II in hohem Maße und zusätzlich das costimulatorische Molekül CD86.
Beide Moleküle sind für die Antigenpräsentation und Stimulation von T-Helfer
Zellen wesentlich.
3.1.1
Während der RSV Infektion kommt es zur Zunahme von CD11c
positiven, hoch MHC-II und CD86 exprimierenden Zellen in der Lunge
Bei nicht infizierten Kontrolltieren machten CD11c+ Zellen 5,58±6,3% der MNZ
der Lunge aus. Dieser Anteil blieb im Zeitverlauf unverändert. Bei RSV infizierten Tieren kam es zu einer signifikanten Zunahme der Zahl CD11c+ Zellen an
den Tagen 10 und 14 (Abb.5). Der maximale Anstieg war am Tag 10 nach der
Infektion zu verzeichnen. 13,97±1,5% der MNZ der Lunge waren CD11c positiv,
etwa drei Mal so viel wie bei nicht infizierten Kontrolltieren. Auch nach Ablauf
der Infektion, am Tag 21, war die Zahl CD11c+ Zellen gegenüber Kontrollen
immer noch erhöht, erreichte aber nicht mehr das statistische Signifikanzniveau.
Ähnlich verhielt es sich mit der Expression von MHC-II und CD86. In der Lunge
nicht infizierter Kontrollmäuse trugen 31,8±2,1% aller CD11c+ Zellen MHC-II
auf ihrer Oberfläche. Die Expression unterlag keinen signifikanten Schwankungen während des gesamten untersuchten Zeitraums.
29
An den Tagen 6, 10 und 14 nach RSV Infektion kam es zu einer signifikanten
Zunahme der Zahl MHC-II exprimierender CD11c+ Zellen in der Lunge. Am
Tag 6 nach Infektion war die MHC-II Expression auf 46,0±4,7% gestiegen. Am
Tag 10 nach Infektion, an dem die maximale Zunahme von CD11c + Zellen in
der Lunge beobachtet wurde, war auch der Anteil der MHC-II exprimierenden
CD11c+ Zellen mit 49,7±1,9% am höchsten und blieb auch am Tag 14 nach
Infektion signifikant erhöht. Bei nicht infizierten Kontrolltieren exprimierten
17,56±4,0% der CD11c positiven Zellen der Lunge CD86 auf ihrer Oberfläche,
ohne Veränderungen im Zeitverlauf. Bei RSV infizierten Tieren kam es im Verlauf der Infektion zu einer statistisch signifikanten (p<0,05) Zunahme der CD86
Expression an den Tagen 6, 10 und 14. Am Tag 6 nach Infektion war der Anteil
CD86 exprimierender CD11c+ Zellen 37,60±4,8%, steigerte sich dann auf sein
Maximum am Tag 10 mit 59,01±2,2%, um am Tag 14 noch signifikant erhöht zu
bleiben. Auch am Tag 21 nach Infektion blieb die Expression von MHC-II und
CD86 erhöht, auch wenn dieser Unterschied keine statistische Signifikanz mehr
erreichte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es während der RSV Infektion zu einem Anstieg der Zahl CD11c positiver Zellen in der Lunge kommt, der am Tag
10 maximal ist. Ein großer Teil der CD11c+ Zellen zeigt zu diesem Zeitpunkt
eine hohe Expression von MHC-II und von CD86, was dafür spricht, daß es sich
um ausgereifte DZ handelt.
3.1.2
Die RSV Infektion führt nicht zu Veränderungen Dendritischer Zellen in
der Milz
Die MNZ der Milz nicht infizierter Mäuse hatten einen Anteil von 3,97±1,0% an
CD11c+ Zellen. Dieser Anteil blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum
unverändert. Auch in den Milzen RSV infizierter Mäuse kam es zu keinem Zeitpunkt der Infektion zu Veränderungen der Zahl CD11c+ Zellen (Abb.6) und die
Expression von MHC II und CD86 auf CD11c+ Zellen blieb auf dem Niveau
nicht infizierter Kontrollen (46,6±0,3% für MHC II und 22,67±0,6% für CD86).
30
25
CD11c+ gesamt
%
20
*
15
*
10
5
0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infektion
15
CD11c+ MHC-II+
%
10
*
*
*
5
0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infektion
15
CD11c+ CD86+
10
%
*
*
*
5
0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infektion
Abb. 5 Expression von CD11c, MHC-II und CD86 auf MNZ der Lunge während der
RSV Infektion in der Maus. Dargestellt
sind
Mittelwerte
±
Standardab-
weichung des Prozentsatzes positiver Zellen aus 3 Versuchen mit je 4
Mäusen.* p<0,05 versus Tag 0 (nicht infizierte Kontrolltiere)
31
7.5
CD11c+ gesamt
%
5.0
2.5
0.0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infetktion
7.5
CD11c+ MHC-II+
%
5.0
2.5
0.0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infektion
7.5
CD11c+ CD86+
%
5.0
2.5
0.0
0
4
6
10
14
21
Tag nach der RSV Infektion
Abb. 6 Expression von CD11c, MHC-II und CD86 auf MNZ der Milz während der
RSV Infektion in der Maus. Dargestellt
sind
Mittelwerte
±
Standardab-
weichung des Prozentsatzes positiver Zellen aus 3 Versuchen mit je 4 Mäusen.
Tag 0 stellt nicht infizierte Kontrolltiere dar.
32
3.2
Isolierung Dendritischer Zellen nach dem Prinzip der
magnetischen Zellsortierung über CD11c im AutoMacs
Um ihre Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren, im Verlauf der RSV Infektion untersuchen zu können, mussten DZ isoliert werden. Zur Etablierung der Methode
der Isolierung von DZ wurden Milzen sensibilisierter BALB/c Mäuse verwendet,
da sie eine grössere Anzahl von DZ enthalten als Milzen von naiven oder RSV
infizierten Tieren. Die Mäuse wurden zunächst systemisch mit OVA sensibilisiert und nach drei Wochen an drei aufeinander folgenden Tagen einem OVA
Aerosol, als „challenge“ ausgesetzt.
Aus der Milz sensibilisierter Tiere wurden MNZ gewonnen und nach dem
Prinzip der magnetischen Zellsortierung über CD11c im AutoMacs sortiert.
Zur Beurteilung der Qualität dieser Isolierungsmethode wurden verschiedene
Kriterien herangezogen. Zellzahlbestimmungen (eingesetzte Zellen, Ausbeute,
Zellverlust) dienten der Beschreibung der Effektivität des Sortierungsvorgangs.
Der Reinheitsgrad der Sortierung wurde mit Hilfe durchflußzytometrischer Darstellung CD11c positiver Zellen in der isolierten Fraktion bestimmt. Der Anteil
vitaler
Zellen
unter
den
isolierten
Zellen
wurde
durch
Anfärbung
untergegangener Zellen mit PI bestimmt. Des Weiteren wurde die Expression
von MHC II und CD86 auf den isolierten Zellen durchflußzytometrisch bestimmt.
Die Funktion der isolierten Zellen als T-Zell Stimulatoren wurde in gemischten
Lymphozytenkulturen überprüft.
3.2.1.
Durch die AutoMacs Sortierung können Dendritische Zellen von hoher
Reinheit und Viabilität isoliert werden
Aus einer Milz sensibilisierter BALB/c Mäuse wurden durchschnittlich 8,9±2,9
x10^7 MNZ gewonnen. 1,94±0,9 x10^8 MNZ wurden mit den para-magnetischen CD11c Antikörpern inkubiert und für die Sortierung im AutoMacs
eingesetzt (Tab.1). Die Anzahl der Zellen, die in der positiven Fraktion nach
dem Sortierungsvorgang aufgefangen wurden, betrug 1,33±0,5 x10^6. Dies
entsprach einer Ausbeute von 0,73±0,2% der eingesetzten MNZ. In der
negativen Fraktion wurden 79,43±17,3% der eingesetzten Zellen aufgefangen.
Die Differenz zwischen der Anzahl eingesetzter MNZ und der Summe der Zel33
len in der positiven und der negativen Fraktion wurde als Zellverlust während
des Sortierungsvorganges berechnet. Dieser betrug 19,84±17,4% der zur
Sortierung eingesetzten Zellen. Der Reinheitsgrad der isolierten Zellen, definiert
als Prozentsatz CD11c+ Zellen in der positiven Fraktion, nahm von Versuch zu
Versuch zu und erreichte ein Maximum von 90% - 97%. Die Untersuchung mit
PI, welches nur Zellkerne abgestorbener Zellen im Durchflußzytometer sichtbar
macht, ergab, dass 82,54 ±1,3% der isolierten CD11c+ Zellen den
Sortierungsvorgang unbeschadet überstanden hatten.
Tab.1 Zellzahlen während des Sortierungsvorgangs dendritischer Zellen im AutoMacs
Versuchn
Einge-
Zellen in der
Zellen in
setzte
positiven
der
% CD11c +
MNZ
Fraktion An-
negativen
Zellen in
Anzahl
zahl
Fraktion
der
(Ausbeute)
Anzahl
positiven
Zellverlust Reinheit:
Fraktion
1
2
3
4
5
1,8x10^
8,7x10^5
1,4x10^8
3,9x10^7
8
(0,48%)
(77,77%)
(21,75%)
3,1x10^
1,9x10^6
1,6x10^8
1,5x10^8
8
(0,61%)
(51,61%)
(47,78%)
1,2x10^
1,0x10^6
1,1x10^8
9,0x10^6
8
(0,83%)
(91,60%)
(07,57%)
2,6x10^
1,9x10^6
2,5x10^8
8,1x10^6
8
(0,73%)
(96,15%)
(03,12%)
1,0x10^
1,0x10^6
8,0x10^7
1,9x10^7
8
(1,00%)
(80,00%)
(19,00%)
1,33±0,5
1,48±0,5
0,45±0,6
x10^8
x10^6
x10^8
x10^8
100%
(0,73±0,2%)
(79,4±17,3
(19,8±17,4
%)
%)
Mittelwert 1,94±0,9
67%
78%
90%
96%
97%
85,6±12,9%
34
3.2.2 Die im AutoMacs isolierten Dendritischen Zellen exprimieren CD11c,
MHC II und CD86 auf ihrer Oberfläche.
Die im AutoMacs nach dem Prinzip der magnetischen Zellsortierung isolierten
CD11c+ Zellen aus MNZ der Milz sensibilisierter BALB/c Mäuse wurden im
Durchflußzytometer auf Größe, Granularität und auf die Expression von Oberflächenmolekülen MHC II, CD86 untersucht und mit unsortierten MNZ
verglichen.
In der gezeigten Untersuchung, die repräsentativ für alle anderen durchgeführten FACS Analysen ist, waren 97,0% aller isolierten Zellen CD11c positiv
(Abb.7). Untersucht wurde die in Abb 7A eingezeichnete Population. Die Quadranten wurden so gesetzt, dass in der Isotypkontrolle 99% der Zellen sich im
unteren linken Quadranten befanden. 70,77% der Zellen trugen neben dem
CD11c auch das MHC-II (I-A) Antigen auf ihrer Oberfläche (Abb.7Bb). 13,39%
der CD11c+ Zellen exprimierten CD86 auf ihrer Oberfläche (Abb.7Cb).
Die Prüfung der isolierten Zellen auf die Expression von T- und B-Zell-Oberflächenmarker ergab keine nennenswerte Verunreinigung durch T- oder B-Zellen
(nicht gezeigt).
35
Abb. 7 Durchflußzytometrische Analyse von DZ aus der Milz sensibilisierter BALB/c
Mäuse vor (a) und nach (b) Sortierung. Größe, Granularität (A), Expression
von MHC II (B), und CD86 (C).
36
3.2.3 Die im AutoMacs isolierten Dendritischen Zellen sind potente T-Zell
Stimulatoren
DZ sind definiert durch ihre einzigartige Fähigkeit, naive T-Zellen zu stimulieren
und zur Proliferation anzuregen. In wieweit die im AutoMacs isolierten CD11c+
Zellen diese Fähigkeit besitzen, wurde in einer gemischten Lymphozytenkultur
überprüft.
CD11c+ Zellen wurden in steigender Konzentration zu je 3x10^5 Splenozyten
aus C57/BL6 Mäusen gegeben und 4 Tage bei 37°C inkubiert. Als Kontrolle
wurden CD11c negative Zellen als APZ in die allogene Lymphozytenkultur gegeben oder es wurde auf den Zusatz von APZ verzichtet. Als positive Kontrolle
wurde PHA als unspezifisches T-Zell Stimulans eingesetzt. Die Proliferationsrate von T-Zellen wurde durch den Einbau von ³H-Thymidin quantifiziert. Nur in
den Lymphozytenkulturen mit CD11c+ Zellen als APZ konnte bereits nach 12
Stunden Inkubationszeit die Anlagerung von Zellen (vermutlich T-Zellen) an die
APZ beobachtet werden (Abb.8a). Nach 24 h bildeten diese als Ausdruck von
Aktivierung und Proliferation mikroskopisch sichtbare, wolkenartige Komplexe,
so genannte Cluster, aus (Abb.8b). Clusterfrei blieben dagegen die Lymphozytenkulturen mit CD11c negativen Zellen als APZ oder Kulturen, die völlig frei
von APZ waren. Sehr ausgeprägte Clusterbildung konnte auch in den Lymphozytenkulturen nach Stimulation mit PHA beobachtet werden. Auch quantitativ
konnte in Lymphozytenkulturen mit CD11c negativen Zellen als APZ nur eine
sehr geringe Proliferationsaktivität gemessen werden (Abb.9). Diese war
vergleichbar mit der Proliferationsrate der Kulturen ohne Zusatz von APZ
(Medium). Im Gegensatz dazu führte die Zugabe des unspezifischen Stimulans
PHA zu einer signifikanten Proliferation der T-Zellen (p<0,05). Auch in Kulturen
mit CD11c + Zellen als APZ, wurde eine signifikante (p<0,05) Proliferationssteigerung gemessen, verglichen mit Kulturen ohne APZ. Das Ausmaß der Proliferation war abhängig von der eingesetzten Anzahl von APZ und war für 5x10^4
APZ höher als die durch das PHA ausgelöste Proliferation.
37
a)
b)
Abb. 8 Clusterbildung als Ausdruck für Kontaktaufnahme von Dendritischen Zellen
³H-Thymidininkorporation in
cpm
mit T-Zellen nach 12 Stunden (a) und nach 24 Stunden (b).
30000
*
Medium
PHA
CD11c pos
20000
CD11c neg
*
10000
0
0
*
*
5x10^1
5x10^2
*
5x10^3
5x10^4
Anzahl APZ
Abb. 9 T-Zell stimulierende Aktivität CD11c positiver Zellen in einer MLR.
Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardabweichung der cpm aus 4 Versuchen
mit je 2 Mäusen. * p<0,05 versus CD11c negativ und Medium.
Die Abhängigkeit der T-Zell Proliferation von der Zahl der eingesetzten DZ
zeigte sich auch bei dem Vergleich des Reinheitsgrades der APZ. 5x10^4 APZ
aus Isolierungen unterschiedlichen Reinheitsgrades wurden in der MLR mit
jeweils 3x10^5 Splenozyten der C57/BL6 Mäuse 4 Tage lang bei 37°C
inkubiert. Je höher der Reinheitsgrad einer Sortierung war, und damit der Anteil
der CD11c+ Zellen unter den zugegebenen APZ, desto stärker war die
messbare T-Zell Proliferation in der MLR (Abb.10).
38
³H-Thymidininkorporation
in cpm
30000
*
*
20000
*
Reinheit 30%
Reinheit 90%
Reinheit 96
Reinheit 97%
10000
*
0
R30
R90
R96
R97
Grad der Reinheit
Abb. 10
Stimulatorische Aktivität Dendritischer Zellen in Abhängigkeit vom
Reinheitsgrad der Sortierung. * p<0,05
3.3
Phänotypischer und funktioneller Vergleich Dendritischer Zellen der
Lunge und Milz RSV infizierter BALB/c Mäuse
Erste Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass es während der RSV Infektion zu einem Anstieg der Zahl von DZ in der Lunge, nicht aber in der Milz
kommt. In der Lunge exprimieren DZ MHC-II und CD86 in hohem Maße,
während es in der Milz nicht zu Änderungen der Expression dieser Moleküle
kommt. Um den Einfluss der RSV Infektion auf die Fähigkeit pulmonaler APZ,
T-Zellen zu stimulieren, zu untersuchen, wurden CD11c+ Zellen aus Lunge und
zum Vergleich aus Milz RSV infizierter bzw. nicht infizierter BALB/c Mäuse am
Tag 10 nach Infektion isoliert. Tag 10 nach Infektion wurde gewählt, weil zu
diesem Zeitpunkt die höchste Zahl von DZ mit reifem Phänotyp (hohe MHC-II
und CD86 Expression) in der Lunge beobachtet wurde. Die Isolierung erfolgte
nach der etablierten Methode über CD11c im AutoMacs. Die isolierten Zellen
wurden im Durchflußzytometer auf die Expression von CD11c, MHC-II und
CD86 untersucht. Die Fähigkeit dieser APZ, T-Zellen zu stimulieren, wurde in
gemischten Lymphozytenkulturen überprüft.
39
3.3.1 Dendritische Zellen der Lunge, nicht aber der Milz, zeigen eine hohe
Expression von MHC-II und CD86 nach RSV Infektion
CD11c+ Zellen der Lunge nicht infizierter BALB/c Mäuse zeigten sich im
Durchflußzytometer als große Zellen mit hoher Granularität. 21,75% von Ihnen
trugen MHC II auf ihrer Oberfläche, 11,76% CD86 (Abb.11). Auch pulmonale
CD11c+ Zellen RSV infizierter BALB/c Mäuse, isoliert am Tag 10 nach Infektion, zeigten sich im Durchflußzytometer als große Zellen hoher Granularität.
60,73% von ihnen trugen MHC-II (I-A) auf ihrer Oberfläche. Das entsprach einer
Verdreifachung des Prozentsatzes MHC-II positiver pulmonaler DZ nach RSV
Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen. Der Prozentsatz an CD86
positiven Zellen steigerte sich um das 4-fache auf 49,42%.
Die aus der Milz nicht infizierter BALB/c Mäuse isolierten DZ trugen in 70,96%
MHC-II auf ihrer Oberfläche (Abb.12). 15,71% von ihnen exprimierten CD86.
Diese Prozentsätze änderten sich nicht signifikant nach RSV Infektion (MHC II:
75,04%, CD86: 10,79%).
Diese Ergebnisse entsprachen den Untersuchungen an MNZ im Verlauf der
RSV Infektion (vgl. 3.1).
40
Abb. 11: Durchflußzytometrische Analyse dendritischer Zellen der Lunge am Tag 10
nach RSV Infektion (b) im Vergleich zu nicht infizierten Tieren (a). Größe,
Granularität (A), Expression von MHC II (B) und CD86 (C).
41
Abb. 12
Durchflußzytometrische Analyse dendritischer Zellen der Milz am Tag 10
nach RSV Infektion (b) gegenüber nicht infizierten Tieren (a). Größe,
Granularität (A), Expression von MHC II (B) und CD86 (C).
42
3.3.2 Dendritische Zellen der Lunge haben nach RSV Infektion eine
gesteigerte Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren
Zur Überprüfung ihrer T-Zell stimulierenden Funktion wurden die isolierten
CD11c+ Zellen der Lunge und der Milz RSV infizierter und nicht infizierter
BALB/c Mäuse in steigender Konzentration zu 3x10^5 Splenozyten allogener
C57/BL6 Mäuse gegeben und über 4 Tage bei 37°C inkubiert. 18 Stunden nach
Zugabe des ³H-Thymidins wurde die Radioaktivität der Zellen, die das ³HThymidin in ihre DNA eingebaut hatten, als Proliferationsrate in cpm gemessen.
Kontrollansätze hatten CD11c negative Zellen als APZ, waren frei von APZ
oder enthielten PHA.
CD11c+ Zellen der Lunge nicht infizierter BALB/c Mäuse hatten die Fähigkeit, in
Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration, eine deutliche Proliferation
der T-Zellen in der MLR zu initiieren. Kulturen mit CD11c negativen Zellen als
APZ oder Kulturen ohne jeglichen Zusatz von APZ zeigten kaum Proliferation.
CD11c+ Zellen der Lunge RSV infizierter Tiere, isoliert am Tag 10 nach Infektion, waren ebenso in der Lage, T-Zellen in allogenen Lymphozytenkulturen zur
Proliferation anzuregen. Auch hier ließ sich die Proliferation von den Kontrollen
ohne APZ, mit CD11c negativen Zellen als APZ oder PHA als Stimulans
abgrenzen (nicht gezeigt). Im direkten Vergleich von pulmonalen CD11c+ Zellen infizierter BALB/c Mäuse mit denen nicht infizierter Kontrollen, zeigten sich
die CD11c+ Zellen infizierter Tiere als potentere T-Zell Stimulatoren (p<0,05). In
einer Konzentration von 5x10^4 APZ pro Ansatz vermochten sie die
Proliferation der allogenen T-Zellen um das Dreifache zu steigern (Abb.13).
CD11c+ Zellen der Milz vermochten T-Zellen in erheblich höherem Maße zur
Proliferation anzuregen als die CD11c+ Zellen der Lunge. Es bestand jedoch
kein Unterschied zwischen CD11c+ Zellen RSV infizierter Tiere und nicht
infizierter Kontrollen (Abb.14). In Kontrollkulturen ohne APZ oder mit CD11c
negativen Zellen als APZ konnte kaum Proliferation gemessen werden (nicht
gezeigt).
43
³H-Thymidininkorporation in
cpm
3000
*
Lunge, nicht
infizierte Kontrolle
Lunge, RSV
2000
1000
0
5x10^2
5x10^3
5x10^4
Anzahl von CD11c+ Zellen
Abb. 13 Allostimulatorische Kapazität der CD11c+ Zellen der Lunge am Tag 10 nach
RSV Infektion gegenüber nicht infizierten Kontrollen in Abhängigkeit von der
Zahl
der eingesetzten APZ. * p<0,05.
³H-Thymidininkorporation in
cpm
50000
Milz, nicht infizierte
Kontrolle
40000
Milz, RSV
30000
20000
10000
0
5x10^2
5x10^3
5x10^4
Anzahl von CD11c+ Zellen
Abb. 14 Allostimulatorische Kapazität der CD11c+ Zellen der Milz am Tag 10 nach
RSV Infektion gegenüber nicht infizierten Kontrollen in Abhängigkeit von der
Zahl der eingesetzten APZ.
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass es während der RSV
Infektion in der Maus zu einem Anstieg der Zahl von CD11c+ Zellen in der
Lunge, nicht aber in der Milz, kommt. Am Tag 10 nach Infektion ist dieser
Anstieg maximal. Neben ihrer Anzahl verändert sich auch ihre Expression von
44
Oberflächenantigenen. Der Prozentsatz MHC-II und CD86 exprimierender DZ
ist um ein Vielfaches erhöht. Auch in ihrer Funktion unterscheiden sich die
CD11c+ Zellen der Lunge infizierter Tiere von denen nicht infizierter Kontrollen.
Ihre Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren, ist um ein Vielfaches gesteigert. Bei
CD11c+ Zellen der Milz sind entsprechende Unterschiede nicht zu beobachten.
45
4.
Diskussion
Viren, und insbesondere RSV, sind nicht nur wichtige Auslöser obstruktiver
Atemwegserkrankungen im Säuglingsalter wie der obstruktiven Bronchitis und
Bronchiolitis (Johnston 1999, McIntosh et al 1973), sie können auch bei Kindern
wie bei Erwachsenen akute obstruktive Atemwegssymptome und Asthmaexazerbationen verursachen (Busse et al 1990, Cypcar et al 1992).
Aus epidemiologischen Studien ist bekannt, dass Kinder in Folge einer RSV
Bronchiolitis ein erhöhtes Risiko für eine allergische Sensibilisierung (Sigurs et
al., 2000, Schauer et al. 2002) und für die Entstehung von Asthma bronchiale
tragen (Hall et al 1984, Pullan et al 1982, Frick et al 1979).
Tierexperimente stützen die Hypothese, dass ein kausaler Zusammenhang
zwischen viraler Atemwegsinfektion und Asthma bronchiale existiert und tragen
wesentlich zur Klärung der zugrunde liegenden immunologischen Pathomechanismen bei. Von zentraler Bedeutung in diesem Zusammenhang
scheinen die CD8+ T-Lymphozyten zu sein. Wahrscheinlich wird durch die RSV
Infektion eine Immunreaktion ausgelöst, die IL-5 produzierende CD8+ T-Lymphozyten aktiviert, was zu einer eosinophilen Entzündungsreaktion der Atemwege und zu verstärkter Atemwegshyperreaktivität führt (Schwarze et al 1999,
Schwarze et al 2000, Schwarze et al 2002).
Bei der Induktion einer allergischen T-Zell Immunreaktion spielen DZ als APZ
eine zentrale Rolle (Steinmann 1991). DZ leiten sich von Vorläuferzellen im
Knochenmark ab und kommen in fast allen Organen vor (Steinmann, 1991).
Dort haben sie ihre Funktion als Wächter (sentinels) des Immunsystems mit
hoher Phagozytosekapazität. Exogene Faktoren, wie z.B. Pathogene und das
umgebende Zytokinmilieu können ihre Funktion beeinflussen und lassen sie zu
hochspezialisierten APZ ausreifen, die in der Lage sind, T-Zellen zur Aktivierung und Proliferation anzuregen. DZ in solcher Funktion exprimieren die für die
T-Zell Aktivierung notwendigen Moleküle (Cella et al 1997): MHC-I und MHC-II,
sowie CD80 und CD86. Im Gegensatz zu anderen APZ, wie B-Zellen und
Makrophagen, verfügen allein DZ über die einzigartige Fähigkeit, naive T-Zellen
zu stimulieren und zugleich die Immunreaktion durch Induktion von Th1, Th2
46
oder regulatorische T-Zellen zu lenken. Die Aktivierung der T-Zellen durch DZ
findet in den T-Zell Regionen der Lymphknoten statt.
Um die Rolle von DZ während der RSV Infektion zu verstehen, wurden sie in
dieser Arbeit im Verlauf der Infektion charakterisiert. Im Rahmen der phänotypischen Untersuchung wurden MNZ aus Lunge und Milz von Mäusen gewonnen
und durchflußzytometrisch auf die Expression von CD11c, einem Oberflächenmarker für murine DZ, und von MHC-II und CD86 untersucht. Eine funktionelle
Charakterisierung der DZ ist nur mit isolierten Zellen möglich. Dazu wurde eine
Isolierungsmethode durch magnetische Zellsortierung über paramagnetische
Antikörper gegen das Oberflächenmolekül CD11c der DZ im AutoMacs etabliert. Die so isolierten DZ wurden in gemischten Lymphozytenkulturen, auf ihre
T-Zell stimulierende Funktion hin überprüft.
4.1
Phänotyp dendritischer Zellen im Verlauf der RSV Infektion
Um die Expression der Oberflächenantigene der DZ im Verlauf der RSV Infektion zu untersuchen, wurden MNZ an den Tagen 4, 6, 10, 14 und 21 nach Infektion aus Lunge und Milz der Tiere gewonnen. Die durchflußzytometrische
Analyse zeigte, dass es im Verlauf der RSV Infektion zu einem Anstieg der Zahl
CD11c positiver Zellen in der Lunge kam. Nach einem geringen, aber nicht signifikanten Anstieg CD11c positiver Zellen während der akuten Phase der Infektion (an den Tagen 4 und 6 nach Infektion) erreichte deren Zahl ein Maximum
am Tag 10 nach Abklingen der akuten Infektion, zu Beginn der Genesungsphase. Dieser signifikante Anstieg war auch am Tag 14 nach Infektion noch zu
beobachten, als klinische Zeichen einer Infektion nicht mehr vorhanden waren.
Zu diesem Zeitpunkt ist auch keine RSV Replikation mehr messbar (Anderson,
1990). CD11c ist in MNZ ein Marker für DZ und Makrophagen. Sein Anstieg
impliziert, dass es im Verlauf der RSV Infektion zu einem Einstrom oder zu
einer lokalen Proliferation dieser Zellen in der Lunge gekommen ist.
Während der RSV Infektion nimmt nicht nur die Zahl CD11c positiver Zellen zu,
sondern es kommt parallel dazu auch zu einem Anstieg der Expression von
MHC-II und CD86 auf der Oberfläche dieser Zellen. Hohe MHC-II Konzentrationen werden auf der Oberfläche von DZ gefunden (Cella et al 1997), wo MHC-II
47
für die Antigenpräsentation erforderlich ist und seine Expression mit der antigenpräsentierenden Funktion der DZ korreliert (Janeway et al 1997, Holt et al
1994, Inaba et al 1992, Masten and Limpscamp 1999). Die Zunahme von
CD11c-MHC-II doppelt positiven Zellen in der Lunge nach RSV Infektion weist
auf einen Anstieg der Zahl pulmonaler DZ hin . Ein weiteres, für die Kontaktaufnahme mit T-Zellen wichtiges Molekül ist das costimulierende CD 86. Auch für
dieses Molekül wurde in dieser Arbeit ein signifikanter Anstieg von Tag 6 bis 14,
parallel zum Anstieg der CD11c und der MHC-II Expression beobachtet. Die
Expression von CD86 in dieser Zellpopulation lässt eine Ausreifung der pulmonalen DZ vermuten. Anstiege der Zahl CD86 exprimierender Zellen in der
Lunge wurden zuvor bei Mäusen beobachtet, die nach systemischer Sensibilisierung dem spezifischen Allergen als Aerosol ausgesetzt waren (Gajewska et
al 2001). Wahrscheinlich hat CD86 unter anderen akzessorischen Molekülen
einen besonderen Stellenwert, da es richtungsweisend für die Polarisierung von
T-Zellreaktionen zu sein scheint. In einer gemischten Lymphozytenkultur führt
die Stimulierung der T-Zellen durch DZ, die nur CD86 als akzessorisches Molekül auf ihrer Oberfläche tragen (nach Blockade anderer costimulatorischer
Moleküle durch Antikörper) zur Bildung von Th2 Zytokinen (Freeman et al
1995). Bei der RSV Infektion könnten CD86 tragende DZ die Aktivierung von
Th2 und Tc2 Zellen bedingen. Die hier vorgestellten Ergebnisse stehen im Einklang mit anderen Untersuchungen, die einen Anstieg von DZ als Folge einer
Infektion mit Sendai Virus bei Ratten (Mc William et al 1997), oder infolge
Influenza A Infektion bei der Maus (Yamomoto et al 2000) beobachtet haben.
Die Influenza A Infektion zog einen Anstieg von DZ während der akuten Phase
der Infektion von Tag 2 bis Tag 7 mit einem Maximum am Tag 3 nach sich.
Doch anders als bei der Influenza Infektion, ging in den hier vorliegenden Versuchsreihen die Zahl CD11c positiver Zellen in der Lunge bis zum Tag 21 nach
der RSV Infektion nicht vollständig zurück.
Über welche Mechanismen DZ bei RSV Infektion in die Lunge gelangen, wird
nur zum Teil verstanden. Bisherige Untersuchungen weisen dem Zytokin GMCSF in diesem Zusammenhang eine große Bedeutung zu. Das Wissen über
GM-CSF als einem wichtigen Wachstums- und Differenzierungsfaktor für DZ
wird bei der Generierung von DZ aus dem Knochenmark genutzt (Inaba et al
1992). Noah et al (1993) konnten zeigen, dass es im Rahmen der RSV Infektion
48
zur Ausschüttung von GM-CSF durch infizierte Epithelzellen kommt. Eine Überexpression von GM-CSF in der Lunge nach Gentransfer durch Adenoviren bei
BALB/c Mäusen führt zu einem bemerkenswerten Anstieg der Zahl von DZ in
der Lunge (Stämpfli et al 1998). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sowie
die genannten Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass RSV über die
Ausschüttung inflammatorischer Zytokine durch infizierte Zellen zu einem Anstieg der Zahl an DZ in der Lunge führt. Ob es sich dabei um eine Vermehrung
und Ausreifung ortsständiger Vorläuferzellen handelt oder ob es zu einer Einwanderung von APZ aus anderen peripheren Lymphorganen kommt, ist nicht
geklärt.
Anders als in der Lunge kommt es in der Milz während der RSV Infektion nicht
zu Veränderungen der DZ. Während der gesamten Infektion bleibt die Zahl der
DZ auf dem Niveau nicht infizierter Kontrollen. Auch die Expression von MHC-II
und CD86 auf der Oberfläche der DZ bleibt unverändert. Diese Befunde weisen
darauf hin, dass die RSV Infektion nur lokal in der Lunge zu Veränderungen in
der Zusammensetzung der APZ führt, ohne dass sich die systemische Zusammensetzung in den lymphatischen Organen wie der Milz ändert.
4.2
Automatische
magnetassoziierte
Isolierung
von
dendritischen
Zellen
DZ kommen in fast allen Geweben vor. Doch sind sie dort in einer so kleinen
Zahl vorhanden, dass lange Zeit der Zugang zu diesen Zellen und damit deren
Untersuchung nicht möglich waren. Eine weitere Schwierigkeit in der Erforschung der DZ stellt der Mangel an DZ spezifischen Oberflächenmarkern dar.
Aus dieser Problematik heraus ergab sich eine Definition für DZ, die sich aus
mehreren Kriterien zusammensetzt. Klassischer Weise werden DZ identifiziert
durch ihre ungewöhnliche Morphologie, gekennzeichnet durch große Zellen mit
dendritischen Ausläufern, die hohe Expression an MHC-II Molekülen an ihrer
Oberfläche, die hohe Expression des Integrins CD11c, aber vor allem durch
ihre Funktion, mit naiven T-Zellen in Kontakt zu treten und diese zu aktivieren
(Vremec and Shortman 1997, Inaba 1992, Bell et al 1999).
Lange Zeit konnten DZ nicht isoliert und nur mittels Histochemie dargestellt
werden. Für in vivo Untersuchungen bediente man sich der DZ, die aus Kno49
chenmarkzellen oder aus Monozyten des peripheren Blutes unter Zugabe von
GM-CSF angezüchtet wurden (Inaba et al 1992). GM-CSF ist ein Wachstumsfaktor nicht nur für DZ, sondern auch für Granulozyten und Makrophagen.
Deshalb müssen aus Knochenmarkzellen Lymphozyten und MHC-II tragende
Zellen über Antikörper gegen CD4, CD8, B21-2 (anti MHC-II), B220/CD45 aussortiert werden. Während der Inkubation mit GM-CSF bilden sich Zellaggregate,
die durch Zentrifugation von anderen Zellen wie Granulozyten und Makrophagen getrennt, die typische Morphologie und Phänotyp von DZ zeigen, die in
einer MLR T-Zellen mit hoher Potenz stimulieren können. Durch diese aufwendige Methode gelingt eine Anreicherung von DZ mit einer Reinheit von 60-70%.
Ungewiss bleibt, ob diese in vitro kultivierten Zellen in Morphologie, Phänotyp
und Funktion den DZ in unterschiedlichen Organen in vivo entsprechen. Aufschluss darüber kann nur die Isolation von DZ direkt aus den Organen geben.
In dieser Arbeit wurde die magnetische Zellisolierung mit dem AutoMacs etabliert. Die automatische Sortierung Dendritischer Zellen über CD11c mittels
paramagnetischer Antikörper mit dem AutoMacs ist eine sehr schnelle Methode
der Zellisolierung. Sie bedarf keiner Zugabe zellmanipulierender Antikörper,
Zytokine oder langer Inkubationszeiten. Der automatische Ablauf garantiert eine
standardisierte Zellisolation, bei der hohe Reinheitsgrade bis zu 97% erreicht
werden. Die Zellen sind zu über 80% vital und können direkt für weitere Untersuchungen eingesetzt werden.
Das Prinzip der magnetischen Zellsortierung existiert schon länger. Vremec und
Mitarbeiter beschrieben eine Methode zur negativen Selektion von DZ aus MNZ
der Milz. Über einen Dichtegradienten wurden Zellen geringer Dichte (3-5%)
gewonnen. Diese wurden mit einem Depletions-Kit inkubiert. Über spezifische
Antikörper (anti-CD3, anti-Thy-1.2, anti-CD4, anti F4/80) wurden T-, B- Zellen
sowie Makrophagen gebunden und über magnetische Antikörper mit einem
Magneten aussortiert (Vremec and Shortman 1997). Als Ergebnis blieben Zellen übrig, die morphologisch, phänotypisch und funktionell den DZ entsprachen
mit einer Reinheit von 65% bis 95%.
Eine direkte positive Selektion von DZ über magnetische Beads gegen CD11c
gelang Gonzalez-Juarrero et al (2001). Die Sortierung erfolgte manuell über
magnetische SuperMacs® Säulen. Ein weiterer Adhärenzschritt in einer 24Stunden-Kultur mit GM-CSF wurde dazwischengeschaltet, um die Makropha50
gen aus der gewonnenen Zellpopulation zu entfernen und DZ mit einer Reinheit
von 80%-90% zu erhalten. Diese Methode eignete sich auch zur Isolierung von
DZ aus der Lunge, hat aber den Nachteil der langen Inkubation. Schon eine
Kultur über Nacht führt zur Ausreifung von DZ (Stumbles et al. 1998).
Da es sich bei DZ um sehr rare Zellen handelt, wurden in dieser Arbeit für die
Etablierung der Isolierungsmethode Mäuse sensibilisiert, um DZ in der Milz
anzureichern. Eine allergische Sensibilisierung führt zur Einwanderung von DZ
in die Milz (Steinman 1991). Aus zwei Milzen wurden 1,94 ±0,9x10^8 MNZ gewonnen und für die Sortierung eingesetzt. 0,73±0,2% dieser Zellen konnten als
CD11c positive Zellen im AutoMacs isoliert werden. Während des Sortierungsvorgangs gingen 19,84±17,4% der Zellen verloren. Der Grund für die große
Variabilität ist unklar. Zum einen wurde die Zellzählung in Zählkammern nach
Neubauer und Fuchs-Rosenthal unter dem Mikroskop manuell durchgeführt.
Bei Zellzählung mit dieser Methode ist eine Schwankungsbreite von bis zu 10%
möglich. Mit verantwortlich für den relativ hohen Zellverlust ist möglicherweise
der Sortierungsmodus, der einen Durchlauf der zu isolierenden Zellen über zwei
Säulen beinhaltete. Dies steigert vermutlich die mechanische Zerstörung der
Zellen.
Die Reinheit der Sortierung, definiert als der Anteil der CD11c positiven Zellen
an der positiven Fraktion, wurde durchflußzytometrisch bestimmt und lag bei
geübter Handhabung zwischen 90% und 97%. Damit erzielte die Isolierung im
AutoMacs ein besseres Reinheitsergebnis als die manuelle Sortierung über die
Macs Säulen mit maximal 90% Reinheit und war der Methode mit indirekter Isolierung DZ, wo Reinheiten von 60 bis 80% erreicht wurden, überlegen. Berücksichtigt man den zeitlichen und materiellen Aufwand, den die letztgenannten
Methoden erfordern, und durch Zusätze möglichen manipulierenden Einfluss
auf die DZ, so stellt die automatische Zellsortierung im AutoMacs eine schnelle
und qualitativ gute Alternative dar.
Ein weiteres wichtiges Qualitätskriterium der Sortierungsmethode, das hier
untersucht wurde, war die Viabilität der isolierten Zellen. Während der Anteil
toten Zellmaterials, dargestellt mit Propidiumjodid, in der Ausgangs-zellpopulation vor der Sortierung 6,6% betrug, war er nach Sortierung in der CD11c negativen Fraktion 2,1% und in der CD11c positiven Fraktion mit 17,5% relativ hoch.
Dieser vermehrte Zelluntergang in der CD11c positiven Fraktion lässt sich mög51
licherweise durch die Verwendung zweier Säulen bei der Sortierung erklären.
Nach dem Durchlauf über die erste Säule wird bereits der überwiegende Teil
der CD11c negativen Zellen eluiert, während CD11c positive Zellen zunächst in
einem Reservoir aufgehoben und dann über eine zweite Säule gegeben werden. Das bedeutet eine doppelte mechanische Belastung für CD11c positive
Zellen und damit einen höheren Grad an Zellschädigung bzw. Zelluntergang. Es
ist auch möglich, dass die Zunahme PI positiver Zellen in der positiven Fraktion
auf einer unspezifischen Bindung der MicroBeads an tote Zellen beruht, so
dass diese auch positiv selektioniert werden. Inwiefern die MicroBeads die Zellen direkt schädigen ist unklar.
Die im AutoMacs über CD11c isolierten DZ aus MNZ der Milz von sensibilisierten Mäusen sind CD11c positive, kleine Zellen mit geringer Granularität.
70,77% von ihnen exprimieren MHC II auf ihrer Oberfläche. MHC II wird in
hoher Konzentration auf reifen DZ exprimiert und ist wichtig bei der Antigenpräsentation gegenüber T-Zellen. Das Molekül CD86 wird von 13,39% der DZ
exprimiert. Die Prüfung der DZ auf die Expression von T- und B-Zellmarkern
ergab, dass die Isolate keine nennenswerte Verunreinigung durch T- oder BZellen hatten.
Neben ihrer typischen Morphologie und Expression bestimmter Oberflächenmarker werden DZ vor allem durch ihre Fähigkeit charakterisiert, in einer allogenen MLR als hochpotente APZ zu fungieren und naive T-Zellen zur Proliferation anzuregen. So wurden CD11c positive Zellen, nach Isolierung aus MNZ der
Milz sensibilisierter Mäuse, auf ihre T-Zell stimulierende Funktion hin untersucht
und mit CD11c negativen Zellen verglichen.
Als ein erstes Zeichen der T-Zell Aktivierung kam es in der MLR zur Ausbildung
sogenannter Cluster. Dabei handelt es sich um wolkenartige Komplexe, die
Anlagerungen proliferierter T-Zellen an DZ darstellen. Auch qualitativ konnte die
durch DZ induzierte Proliferation der T-Zellen durch die Messung des eingebauten ³H-Thymidins in die proliferierten T-Zellen erfasst werden. Schon in
geringen Konzentrationen zeigten CD11c positive Zellen eine ausgeprägte antigenpräsentierende Kapazität und stimulierten T-Zellen zur Proliferation. Im
Gegensatz dazu induzierten CD11c negative Zellen keine nennenswerte Proliferation von T-Zellen.
52
Eine mögliche Kritik an diesen Untersuchungen ist, dass in der MLR nicht isolierte naive T-Zellen, sondern MNZ der Milz eingesetzt wurden. Diese MNZ
stammen jedoch aus naiven Tieren und proliferierten nicht in Kultur ohne
Zugabe von APZ. Deshalb handelt es sich bei der beobachteten Proliferation
aller Wahrscheinlichkeit nach um eine durch DZ induzierte Proliferation naiver
allogener T-Zellen.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Sortierung von DZ über das
AutoMacs eine automatisierte und schnelle Methode der Zellisolation ist, die
hohe Reinheitsgrade erreicht. Durch automatische Zugabe von Puffern, konstante Flussgeschwindigkeit und konstanten Druck bei der Passage der Zellen
über die Sortierungssäulen ist die Methode standardisiert und verringert
Schwankungen und statistische Fehler. Die Zellen sind nach der Sortierung zu
80% vital und können sofort in Experimenten eingesetzt werden. Die isolierten
Zellen besitzen alle wichtigen Eigenschaften von DZ. Sie sind CD11c positiv,
hoch MHC-II und CD86 exprimierend und zeigen sich als potente T-Zell
Stimulatoren in der MLR.
4.3
Dendritische Zellen aus Lunge und Milz RSV infizierter BALB/c
Mäuse als APZ
Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass es am Tag 10 der RSV Infektion
in der Maus zu einem Einstrom DZ in die Lunge, nicht aber in die Milz kommt.
Zur Untersuchung ihrer Funktion wurden die DZ nach der in dieser Arbeit etablierten Methode isoliert. In einer gemischten Lymphozytenkultur wurden sie auf
ihre Kapazität, T-Zellen zu stimulieren, geprüft.
In einer gesunden Lunge finden sich vorwiegend unreife DZ. Dies sind CD11c
positive Zellen, die eine niedrige Expression von MHC-II und CD86 zeigen.
Über einen solchen DZ Typ in der Lunge naiver Mäuse berichteten auch andere
Autoren (Masten and Limpscamp 1999, Gonzalez et al 2001).
Am Tag 10 aus der Lunge RSV infizierter BALB/c Mäuse isolierte DZ zeigen
eine dreifach höhere Expression von MHC-II und eine vierfach höhere Expression von CD86 auf ihrer Oberfläche, verglichen mit nicht infizierten Kontrollen.
Dieser Phänotyp entspricht einem reifen DZ Typ. DZ, die am Tag 10 nach RSV
Infektion aus der Milz infizierter Tiere isoliert wurden, unterschieden sich phä53
notypisch nicht von DZ nicht infizierter Kontrollen. DZ, isoliert aus Lungen nicht
infizierter Tiere, zeigten eine schwache, im Vergleich zu CD11c negativen Zellen aber signifikante Stimulation der T-Zellen. DZ aus Lungen RSV infizierter
Tiere induzierten eine erheblich stärkere T-Zell Proliferation. Auch dieser funktionelle Befund weist auf eine Ansammlung reifer DZ in der Lunge nach RSV
Infektion hin. Ausschlaggebend für die verstärkte Fähigkeit pulmonaler DZ nach
RSV Infektion, T-Zellen zur Proliferation anzuregen, könnte wiederum GM-CSF
sein, das während der Infektion von den Epithelzellen sezerniert wird (Noah et
al 1993). Für DZ der Lunge ist vorbeschrieben, dass GM-CSF nicht nur zu einer
phänotypischen Ausreifung der DZ führt, sondern auch die T-Zell stimulierende
Kapazität der DZ erhöht (Stumbles et al 1998).
DZ aus der Milz führten zu einer T-Zell Proliferation, die unabhängig vom Infektionsstatus der Tiere war und die die Stimulation durch DZ der Lunge um das
zehnfache übertraf. Dies steht im Einklang mit dem hohen Reifegrad der DZ der
Milz.
4.4
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es in Folge der RSV Infektion zu
einem vorübergehenden Anstieg der Zahl von DZ in der Lunge kommt. Dabei
handelt es sich zu einem erheblichen Teil um ausgereifte DZ, die das Antigen
präsentierende MHC-II und costimulierende CD86 hoch exprimieren und die
über eine hohe T-Zell aktivierende Potenz verfügen. Bei diesen Veränderungen
der DZ Population handelt es sich um einen lokalen, auf die Lunge beschränkten Prozess ohne systemische Veränderungen, wie Untersuchungen an DZ der
Milz, einem Organ des zentralen lymphatischen Systems, gezeigt haben.
Ob die Zunahme reifer DZ durch die Expansion ortsansässiger Vorläuferzellen
oder durch Rekrutierung dieser Zellen, z.B. aus dem Knochenmark, bedingt ist,
und ob die DZ in der Lunge oder schon vorher ausreifen, ist nicht geklärt. Es
scheint möglich, dass es durch die Zunahme reifer pulmonaler DZ in Folge der
RSV Infektion zu einer lokalen Antigenpräsentation in der Lunge kommt, die TZellantworten und in der Konsequenz Entzündungsreaktionen verstärkt. Ein
solcher
Mechanismus
könnte
zum
einen
zu
überschießenden
Entzündungsreaktionen führen, wie bei der Bronchiolitis, zum anderen könnte
54
es die Entstehung von allergischer Sensibilisierung und von obstruktiven Atemwegsveränderungen einleiten und fördern.
5.
Zusammenfassung
Zahlreiche epidemiologische Studien und Untersuchungen an Tiermodellen
legen nahe, dass virale Infektionen der Atemwege nicht nur der wichtigste
Auslöser von obstruktiven Atemwegssymptomen und Exazerbationen bestehenden Asthmas sind, sondern auch an der Entstehung von allergischer
Sensibilisierung und Asthma bronchiale bei Kindern beteiligt sein können.
Ursächlich dafür dürften durch das Virus induzierte T-Zell vermittelte Immunantworten sein, die zu Atemwegsentzündung führen und mit der Bildung von
Th2 Zytokinen einhergehen. Entscheidend für die Auslösung von Immunantworten gegen Atemwegsviren sind dendritische Zellen, die als professionelle
APZ virales Antigen präsentieren und durch Stimulation naiver T-Zellen Immunantworten einleiten. Die gleichen DZ sind auch für die Induktion einer
allergischen Sensibilisierung wesentlich. Diese Arbeit untersucht deshalb, ob es
im Verlauf der RSV Infektion zu Veränderungen der DZ der Lunge kommt, die
Einfluss auf die Entstehung von allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale haben könnten. MNZ aus Lunge und Milz RSV infizierter BALB/c Mäuse
wurden im Durchflußzytometer auf die Expression von CD11c, einem DZ
Marker und von MHC-II und CD86 als wichtige Moleküle der T-Zell Aktivierung,
untersucht. Um DZ funktionell untersuchen zu können, wurde eine Methode der
automatischen, direkten Isolierung DZ nach dem Prinzip der magnetischen
Zellsortierung aus Milz und Lunge über CD11c etabliert.
In Folge der RSV Infektion kommt es zu einem vorübergehenden Anstieg der
Anzahl pulmonaler DZ. Diese haben zu einem grossen Teil einen reifen Phänotyp mit Expression von MHC-II und CD86 Molekülen. Die Fähigkeit dieser DZ
als Antigen präsentierende Zellen T-Zellen zu aktivieren, ist um ein Vielfaches
gesteigert. Bei diesen Veränderungen handelt es sich um einen lokalen, auf die
Lunge beschränkten Prozess ohne entsprechende Veränderungen in der Milz,
als einem Organ der systemischen Immunität. In wie weit die RSV induzierten
Veränderungen der DZ die Entstehung von allergischer Sensibilisierung und
55
obstruktiven Atemwegssymptomen begünstigen, muss in weiteren Studien geklärt werden.
56
6.
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Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn P.D. Dr. med. J. Schwarze danke ich für die Überlassung des interessanten Themas und für die begleitende Beratung und
Unterstützung sowie die kritische Korrektur der Dissertationsentwürfe.
Für die praktische Betreuung danke ich den Mitarbeitern des tierexperimentellen Labors und des immunologischen Labors der Klinik für Kinder- und
Jugendmedizin.
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Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Katharina Philippson, geb. Hörner
Geburtsdatum 13. Januar 1975
Geburtsort
Karaganda
Nationalität
Deutsch
Familienstand verheiratet
Allgemeine Ausbildung
1981-1987
Grund- und Mittelschule in Karaganda
1987-1995
Gnadenthal-Gymnasium der Franziskanerinnen in Ingolstadt
1995-1996
Europäischer Studiengang am Zentrum für Internationale
Bildung und Kulturaustausch in Bonn
Medizinischer Werdegang
1996–1998
Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm
1998-2000
Studium an der Ruhr-Universität Bochum
2000-2001
Studium an der National University of Ireland in Galway
2001-2003
Wiederaufnahme und Abschluss des Studiums in Bochum
Seit 08 2003
Ärztin im Praktikum in der Abteilung Geburtshilfe und
Gynäkologie am Prosper Hospital Recklinghausen,
Lehrkrankenhaus der Ruhr-Universität Bochum
Recklinghausen, den 4. Dezember 2004
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