Promotion 061207BL - Deutsche Digitale Bibliothek

Inhaltsverzeichnis
1
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis....................................................................................................................... 1
Zusammenfassung...................................................................................................................... 4
Summary .................................................................................................................................... 6
1
2
Einleitung ........................................................................................................................... 7
1.1.
Das Humane Herpesvirus 8........................................................................................ 7
1.2.
HHV-8-assoziierte Krankheiten ................................................................................. 8
1.3.
Infektionszyklus ......................................................................................................... 9
1.4.
Immunantwort auf virale Infektionen ...................................................................... 10
1.5.
Immunsuppression ................................................................................................... 12
1.6.
HHV-8 Transmission ............................................................................................... 13
1.7.
Diagnostik und Epidemiologie................................................................................. 14
1.8.
HHV-8-Infektion und Organtransplantation ............................................................ 17
1.9.
Ziel der Arbeit .......................................................................................................... 18
Material und Methoden .................................................................................................... 19
2.1
Materialien ............................................................................................................... 19
2.1.1
Geräte ............................................................................................................... 19
2.1.2
Substanzen........................................................................................................ 20
2.1.3
Antikörper ........................................................................................................ 22
2.1.4
Stimulantien ..................................................................................................... 23
2.1.5
Zelllinien .......................................................................................................... 23
2.2
Patienten- und Probandenkollektiv .......................................................................... 24
2.3
Methoden.................................................................................................................. 25
2.3.1
Zellkulturen ...................................................................................................... 25
2.3.2
Messung
der
Antigenexpression
mittels
Durchflusszytometrie
und
Fluoreszenzmikroskopie................................................................................................... 26
Inhaltsverzeichnis
3
2
2.3.3
Gewinnung von Antigenlysat aus Zellkulturen................................................ 28
2.3.4
Proteinbestimmung nach Bradford................................................................... 29
2.3.5
Quantifizierung antigenspezifischer T-Zellen im Durchflusszytometer .......... 29
2.3.6
HHV-8-Serologie ............................................................................................. 31
2.3.7
Computerprogramme und Statistik .................................................................. 34
Resultate ........................................................................................................................... 35
3.1
3.1.1
Etablierung einer Methode zur Herstellung von Virusantigen................................. 35
Kontrolle
der
pp65-Expression
mittels
indirekter
Immunfluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie ............................................. 35
3.1.2
Proteinkonzentrationsbestimmung der 293-/293pp65-Lysate ......................... 36
3.1.3
Ausschluss einer unspezifischen Stimulation durch Glycinpuffer................... 37
3.1.4
Eignung des 293pp65-Lysats zur HCMV-spezifischen T-Zellstimulation...... 38
3.2
HHV-8 spezifische T-Zellmessung.......................................................................... 40
3.2.1
HHV-8-spezifische Zellen sind durchflusszytometrisch nachweisbar............. 41
3.2.2
Vergleich antigenspezifischer CD8 T-Zellfrequenzen: Kontrollantigen vs.
HHV-8-Antigen................................................................................................................ 43
3.2.3
In Risiko- und Kontrollgruppen überwiegt die messbare CD8 Immunantwort
gegenüber der CD4 Antwort ............................................................................................ 45
3.2.4
HHV-8-spezifische CD8-T-Zellen produzieren TNF-α................................... 46
3.3
Korrelation der HHV-8 spezifischen zellulären mit der humoralen Immunantwort 49
3.4
Beurteilung
der
Evidenz
für
eine
HHV-8-Infektion
nach
verschiedenen
Testverfahren........................................................................................................................ 52
3.5
Serokonversion nach Organtransplantation ............................................................. 54
3.6
Entwicklung einer Methode zur serologischen Bestimmung von HHV-8-
Antikörpern im Durchflusszytometer................................................................................... 56
3.7
Vergleich eines HHV-8-ELISA mit dem Immunfluoreszenztest ............................ 59
4
Diskussion ........................................................................................................................ 60
5
Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 67
Inhaltsverzeichnis
3
6
Danksagung...................................................................................................................... 76
7
Curriculum vitae............................................................................................................... 77
Zusammenfassung
4
ZUSAMMENFASSUNG
Das humane Herpesvirus 8 stellt als infektiöses Agens für eine Reihe humaner Malignome
wie dem Kaposi Sarkom, der multizentrischen Castleman-Krankheit und dem primären
Effusionslymphom hinsichtlich seiner Diagnostik eine stete Herausforderung dar. Zu den
Risikogruppen für eine Infektion mit HHV-8 gehören Menschen aus endemischen Gebieten
wie
den
afrikanischen
Ländern
und
dem
Mittelmeerraum
sowie
Patienten
mit
Immunschwäche wie sie bei terminaler Niereninsuffizienz, nach Organtransplantation oder
HIV-Infektion auftritt.
In epidemiologischen Studien wird die Prävalenz einer viralen Infektion hauptsächlich über
den Nachweis von IgG gegen spezifisches Antigen bestimmt. Im Falle von HHV-8 führt die
Vielzahl bislang nicht standardisierter serologischer Tests zu einer erheblichen Varianz in der
Schätzung der HHV-8-Prävalenz, was die Frage nach einer neuen Methode zur Bestimmung
des individuellen HHV-8-Status aufwirft.
In dieser Arbeit wurde eine routinetaugliche Methode zur Messung der zellulären
Immunantwort auf HHV-8 etabliert, bei der CD4 und CD8 T-Zellen nach Stimulation mit
einem
Antigenlysat
aus
einer
HHV-8-positiven
Zelllinie
durchflusszytometrisch
nachgewiesen wurden. Diese Methode wurde anhand von 129 Immungesunden, 70
Dialysepatienten, 68 Transplantierten und 72 HIV-Patienten im Vergleich mit 2 serologischen
Testverfahren evaluiert.
Die Studie zeigte, dass der isolierte Antikörpernachweis im Vergleich mit der kombinierten
Analyse aus zellulärer und humoraler Immunität die HHV-8-Prävalenz sowohl bei Gesunden
wie auch bei den immundefizienten Patienten unter Dialyse, nach Transplantation oder HIVInfektion deutlich unterschätzt. Trotz der Varianz in der relativen Dominanz der humoralen
und zellulären Immunität zwischen den Gruppen war die Prävalenz nach kombinierter
Analyse bei den immungeschwächten Patienten ungeachtet der Ursache ihrer Immundefizienz
ähnlich hoch.
Neben einer genaueren Einschätzung des individuellen HHV-8-Infektionsstatus gaben die
Daten neue Einblicke in die relative Beteiligung der humoralen und zellulären Immunität zur
Kontrolle einer HHV-8-Infektion unter verschiedenen immunsuppressiven Bedingungen.
Zusammenfassend konnte diese Arbeit eine deutliche Unterschätzung der HHV-8-Prävalenz
durch alleinige Anwendung serologischer Methoden nachweisen. Die kombinierte
Zusammenfassung
5
Quantifizierung humoraler und zellulärer Immunität könnte in Zukunft die überlegenere
Methode zur Bestimmung des individuellen HHV-8-Status werden.
Summary 6
SUMMARY
Human herpesvirus 8 as etiological agent of several human malignancies including Kaposi
sarcoma, multicentric Castleman’s disease and primary effusion lymphoma constantly
challenges diagnostic strategies towards the identification of infected individuals. Risk groups
for HHV-8 infection comprise individuals from endemic areas such as Africa and the
Mediterranean as well as immunocompromised individuals such as patients with end-stage
renal disease, transplant recipients and HIV infected patients.
In epidemiological studies, the prevalence of a viral infection is mainly determined by
detection of IgG against the specific virus. In the case of an infection with HHV-8, serological
assays are not standardised and differ greatly. As a consequence, estimations on the actual
HHV-8 prevalence vary considerably.
In this study we established a flow cytometry-based method to measure the cellular immune
response to HHV-8 suitable for use in a clinical setting. In a whole blood assay HHV-8
antigen lysates derived from HHV-8 positive cell lines specifically stimulated CD4 and CD8
T cells to produce IFN-γ. This method was evaluated in comparison with two serological
assays in 129 healthy individuals, 70 patients on dialysis, 68 organ transplant recipients and
72 HIV positive patients.
The study showed that serotesting alone considerably underestimates the prevalence of HHV8 infection in both healthy controls as well as in immunocompromised patients on dialysis,
after transplantation or with HIV infection as compared to the combined analysis of humoral
and cellular immune response. Interestingly, although the relative dominance of humoral and
cellular immunity varied between the groups, the combined prevalence among
immunocompromised patients was similarly high irrespective of the underlying cause of
immunodeficiency.
Although humoral and cellular immunity were primarily used as a measure to more accurately
assign the individual infection status with HHV-8, our data may in addition provide some
novel insights into the relative contribution of humoral and cellular immunity for the control
of HHV-8 in various conditions of immunodeficiency.
In conclusion, our data suggest a considerable underestimation in the prevalence of HHV-8
infection, when serology is considered alone. The combined quantitation of both humoral and
cellular immunity may instead be superior to assign the individual HHV-8 status.
Einleitung 7
1 EINLEITUNG
1.1
Das Humane Herpesvirus 8
1994 gelang es Yuan Chang und Patrick Moore bei der gezielten Suche nach einem
übertragbaren Erreger in einem AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkom, DNA eines neuen
humanen Herpesvirus mit Hilfe der so genannten „representional difference analysis“ (RDA)
nachzuweisen (CHANG et al., 1994). Wegen seiner Erstentdeckung in einem Kaposi-Sarkom
wurde es zunächst Kaposisarkom-assoziiertes Herpesvirus genannt (KSHV), als achtes
humanpathogenes Herpesvirus trägt es jedoch auch die heute gängigere taxonomische
Bezeichnung Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) (LEVY, 1995). Bereits im Jahre 1972
konnten typische virusinduzierte morphologische Veränderungen in Kaposisarkomzellen
nachgewiesen werden. Mittels Elektronenmikroskopie konnten Viruspartikeleinschlüsse von
Herpesviren in diesen Zellen sichtbar gemacht werden, die seinerzeit aber nicht richtig
interpretiert werden konnten (GIRALDO et al., 1972).
Die Familie der Herpesviren gehört zu den komplexen DNA-Viren, die aufgrund ihrer Größe
von ca. 100-200nm und ihrer morphologischen Ähnlichkeit elektronenmikroskopisch nicht
voneinander zu unterscheiden sind. Nach verschiedenen Kriterien wie Kulturhaltung und
Wachstumseigenschaften werden die Herpesviren in die drei Unterfamilien der Alpha-, Betaund Gammaherpesviridae eingeteilt. Die Unterfamilie der Gammaherpesviridae wiederum
wird unterteilt in die Gattungen Rhadinovirus [Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) und z.B. die
nicht-humanpathogenen Herpesviren Ateles und Saimiri (HVS)] und Lymphocryptovirus, zu
dem z.B. das Epstein-Barr-Virus (EBV) zählt. Gammaherpesviren sind wie alle Herpesviren
endemisch in allen Primaten der Alten Welt.
HHV-8 wurde als erstes humanpathogenes Rhadinovirus identifiziert, ein Gammaherpesvirus
mit Sequenzähnlichkeiten zu anderen onkogenen Herpesviren, wie dem Epstein-Barr-Virus,
dem Herpesvirus Saimiri und dem Murinen Herpesvirus 68 (MHV 68). Diese dem HHV-8
verwandten Gammaherpesviren sind fähig, in ihrem jeweiligen Wirt oder im Tierversuch
Tumoren hervorzurufen. Darüber hinaus existieren bei Altweltprimaten weitere erst kürzlich
entdeckte nicht-humanpathogene Rhadinoviren (GREENSILL et al., 2000; EPSTEIN, 2001).
Einleitung 8
1.2
HHV-8-assoziierte Krankheiten
Es ist zu vermuten, dass die HHV-8-Infektion überwiegend asymptomatisch verläuft. Wie
andere Viren der Herpesgruppe kann HHV-8 jedoch lebenslang im Organismus seines Wirts
persistieren und unter bestimmten Konditionen die für das Virus charakteristischen
Krankheitsbilder verursachen.
Das häufigste mit HHV-8 assoziierte Krankheitsbild ist das Kaposi-Sarkom. In den nach
seiner
Entdeckung
folgenden
molekularbiologischen
und
seroepidemiologischen
Untersuchungen wurde HHV-8 zweifelsfrei in allen Formen und klinischen Stadien des
Kaposi-Sarkoms als auslösendes Agens nachgewiesen (CHANG et al., 1994; BOSHOFF et
al., 1995; DUPIN et al., 1995; MOORE, CHANG, 1995; BUONAGURO et al., 1996;
CHANG et al., 1996; CHUCK et al., 1996; LUPPI et al., 1996). Bei dem 1872 erstmals von
dem ungarischen Arzt Moriz Kaposi beschriebenen Kaposi-Sarkom handelt es sich um einen
Tumor vaskulären Ursprungs, der sich in Form multipler, voneinander unabhängiger
Läsionen, hauptsächlich der Haut, äußert. Sowohl Endothelzellen wie auch die
tumortypischen Spindelzellen des Kaposi-Sarkoms sind zum Großteil mit HHV-8 latent
infiziert, zu einem geringen Ausmaß findet man auch lytische Replikation (STASKUS et al.,
1997). Die Begriffe des latenten und lytischen Zyklus im Laufe einer Virusinfektion werden
in einem späteren Abschnitt besprochen.
Verschiedene klinische und epidemiologische Formen des Kaposi-Sarkoms sind bekannt.
Zum einen das klassische Kaposi-Sarkom, eine indolente Form, die sich bei älteren Männern
aus dem Mittelmeerraum bzw. Osteuropa findet, bei denen sich der Tumor hauptsächlich an
den unteren Extremitäten und nur selten mit Organbefall zeigt (GEDDES et al., 1994). Das
Posttransplantations-Kaposi-Sarkom, eine ebenfalls relativ blande Form, tritt bei Patienten
unter immunsuppressiver Therapie nach Transplantation auf. Dieses zeigt eine regional
verschiedene Ausprägung und ist häufiger in Regionen mit höherer Kaposi-Sarkom-Prävalenz
wie z.B. Italien und Saudi-Arabien zu finden (PENN, 1979; TRATTNER et al., 1993). Das
endemische oder afrikanische Kaposi-Sarkom, eine aggressivere endemische Form, die auch
viszerale und lymphatische Organe mit befällt, ist bei jungen Erwachsenen und Kindern aus
dem sub-äquatorialen Afrika bekannt (SLAVIN et al., 1969; TAYLOR et al., 1972).
Ein weitaus größeres Augenmerk fiel erst im Rahmen der AIDS-Epidemie auf diesen in der
Normalbevölkerung Mitteleuropas und Nordamerikas eher seltenen Tumor. Bei HIV-1infizierten Personen tritt das Kaposi-Sarkom in seiner aggressivsten Form mit einem
disseminierten
Befall
der
Haut
und
der
Viszeralorgane
auf,
einschließlich
des
Einleitung 9
Gastrointestinaltrakts und der Lunge (FRIEDMAN-KIEN, 1981; HAVERKOS, DROTMAN,
1985).
Neben dem Kaposi-Sarkom konnte HHV-8 auch bei der multizentrischen Castleman
Krankheit (MCD) (SOULIER et al., 1995) und primären Effusionslymphomen (PEL)
(CESARMAN
et
al.,
1995a)
nachgewiesen
werden.
MCD
ist
eine
lokalisierte
lymphoproliferative Erkrankung, die als plasmazelluläre Form hauptsächlich in HIVpositiven Individuen auftritt und bei der in dieser Form HHV-8 nachgewiesen werden kann.
Die wenigen HIV-negativen Patienten mit multizentrischer Castleman Krankheit sind jedoch
nicht
zwangsläufig
an
eine
HHV-8-Infektion
geknüpft.
Bei
den
Primären
Effusionslymphomen handelt es sich um selten auftretende HIV-assoziierte Lymphome, die
sich vorrangig auf die serösen Körperhöhlen beschränken, weswegen sie auch den Namen
„body cavity-based lymphoma“ (BC-BL) tragen.
1.3
Infektionszyklus
Aus dem „body cavity-based lymphoma“ ist es nach vielen vergeblichen Versuchen, HHV-8
in Zellkulturen zu isolieren, gelungen, verschiedene latent mit HHV-8 infizierte Zelllinien zu
etablieren (CESARMAN et al., 1995b; ARVANITAKIS et al., 1996; GAIDANO et al., 1996;
RENNE et al., 1996; SAID et al., 1996), die meist jedoch gleichzeitig mit EBV infiziert
waren. Erst Renne et al. (RENNE et al., 1996), Gao et al. (GAO et al., 1998), Said (SAID et
al., 1996) und Boshoff (BOSHOFF et al., 1998) gelang es, aus Material von PEL-Patienten
HHV-8-positive und zugleich EBV-negative Zelllinien zu kultivieren (z.B. BC-BL-1).
Latenter und lytischer Zyklus
In latent infizierten Zellen wird das virale Genom unter strikter Kontrolle der zellulären
Replikationsmaschinerie episomal aufrechterhalten und als quasi-zelluläre DNA mit der
chromosomalen DNA vermehrt, ohne dass eine Virusproduktion stattfindet. Man geht davon
aus, dass das Umschalten in den lytischen Zyklus in vivo als seltenes Ereignis spontan oder
als Reaktion auf physiologischen Stress oder Immunsuppression erfolgt. Während dieser Zeit
kommt es zur Virusvermehrung mit Virionenproduktion und folglich auch der Expression von
lytischen Virusproteinen.
Einleitung 10
Nur ein geringer Prozentsatz an Zellen innerhalb dieser HHV-8-positiven Zelllinien ist fähig,
spontan die lytische Replikation zu durchlaufen. Erst durch Behandlung mit Phorbolestern
(z.B. TPA) oder Natriumbutyrat (MILLER et al., 1996) in vitro konnte die lytische
Replikation von HHV-8 in BC-BL/PEL-Zellen effektiv angeregt werden, was für die spätere
Entwicklung serologischer Nachweisverfahren auf der Basis immunogener lytischer Proteine
von entscheidender Bedeutung war (LENNETTE et al., 1996).
1.4
Immunantwort auf virale Infektionen
Bei der Immunantwort im Laufe einer viralen Infektion werden zwei Abwehrsysteme
unterschieden: die angeborene/unspezifische Immunabwehr und die erworbene/spezifische
Immunabwehr. In der frühen Phase der Infektion stehen die Mechanismen der unspezifischen
Abwehr sofort zur Verfügung. Eine Hauptrolle spielen dabei Zellen wie die Makrophagen
und Neutrophile, die als Phagozyten Krankheitserreger mit Hilfe von Oberflächenrezeptoren
erkennen und phagozytieren. Zudem existieren lösliche Mediatoren, z.B. Komponenten des
Komplementsystems, die entweder selbst bakterizid wirken oder zelluläre Funktionen zur
Elimination der Pathogene aktivieren. Natürliche Killerzellen als Teil der unspezifischen
Immunantwort wirken über Zytolyse und Induktion von Apoptose in infizierten Zellen. Die
angeborene Immunantwort bietet jedoch keine schützende, langanhaltende Immunität,
sondern verhindert lediglich die Virusausbreitung, bis nach wenigen Tagen die Mechanismen
des erworbenen Immunsystems greifen.
Die spezifische Immunantwort ist notwendig, sobald die Erreger die Mechanismen des
unspezifischen Immunsystems umgangen oder überwunden haben. Sie umfasst zelluläre wie
auch humorale Elemente. Die zelluläre Immunantwort wird über im Thymus gebildete TLymphozyten
vermittelt.
Treffen
naive
T-Zellen
auf
der
Oberfläche
einer
antigenpräsentierenden Zelle (APC) auf ein spezifisches Antigen, so kommt es im
Zusammenspiel mit kostimulatorischen Molekülen zur Induktion einer spezifischen
Immunantwort (JANEWAY et al., 2001).
Die Haupthistokompatibilitätsantigene der Klasse I, auch MHC (major histocompatibility)Klasse-I-Moleküle genannt, auf APC präsentieren den antigenspezifischen Rezeptoren auf
CD8 positiven (cluster of differentiation 8) zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) in der Regel
zytosolische Peptide. Neben der Präsentation von endogenen Peptiden, die aus in der Zelle
selbst synthetisierten Proteinen stammen, können jedoch auch Peptide aus exogenen
Einleitung 11
Proteinen über MHC-Klasse-I-Moleküle präsentiert werden (ROCK, 1996). MHC-Klasse-IMoleküle sind im Gegensatz zu MHC-Klasse-II-Molekülen als Oberflächenmarker auf
nahezu allen Zellen exprimiert.
Exogene virale Genprodukte gelangen hingegen über den endosomal/lysosomalen
Transportweg zu MHC-Molekülen der Klasse II, welche Peptide binden und auf der
Zelloberfläche den CD4 positiven T-Helfer-Zellen präsentieren. T-Helfer-Zellen können je
nach weiterer Differenzierung zu Th1 bzw. Th2-Zellen durch Ausschüttung unterschiedlicher
Zytokine entweder Makrophagen aktivieren (Th1) oder die humorale Immunantwort
stimulieren (Th2) (DELVES, ROITT, 2000b, a; O'GARRA, ARAI, 2000; JANEWAY et al.,
2001).
Die humorale Immunantwort wird durch im Knochenmark gebildete B-Lymphozyten
vermittelt. Im Zusammenspiel mit für ein bestimmtes Peptidfragment eines Antigens
spezifischen T-Zellen proliferieren B-Zellen und differenzieren sich im Weiteren zu
Plasmazellen. Diese sind zur Produktion von antigenspezifischen Antikörpern fähig, die mit
hoher Affinität an den Erreger binden und diesen entweder direkt neutralisieren, meist jedoch
den Erreger umhüllen und, indem sie an einen Fc-Rezeptor der Phagozyten binden, zur
Aufnahme und Zerstörung des Pathogens führen (JANEWAY et al., 2001).
Die erworbene Immunantwort führt im Idealfall zur Beseitigung des Erregers und zu einem
Zustand der schützenden Immunität, dem immunologischen Gedächtnis, einer Funktion, die
die angeborene Immunantwort nicht bietet. Durch diesen Schutz kann eine Reinfektion mit
demselben Erreger verhindert oder zumindest abgeschwächt werden.
Immunevasionsmechanismen
Im Laufe der Evolution haben Viren verschiedenste Mechanismen entwickelt, sich der
Immunantwort ihres Wirts zu entziehen. Dazu gehört z.B. der dynamische Mechanismus der
Antigenvariation, der vor allem bei Grippeviren bekannt ist (SHU et al., 1993). Sie sind
schnell replizierende Viren, die ständig Proteine produzieren und dadurch leicht von TLymphozyten erkannt werden. Einige Viren, unter ihnen die Herpesviren, weisen jedoch eine
Strategie auf, die es ihnen ermöglicht, in vivo zu persistieren, indem sie sich so lange nicht
vermehren, bis die Immunantwort ihres Wirts nachlässt (JANEWAY et al., 2001). Diese
replikationslose Phase, in der das Virus keine Viruspartikel bildet, jedoch auch nicht vom
Immunsystem beseitigt werden kann, nennt sich Latenz. In dieser Phase werden lediglich
Einleitung 12
latente Antigene wie das latenz-assoziierte nukleäre Antigen (LANA) freigesetzt. Das
Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und zellulärer Immunantwort kann durch
physiologischen Stress oder Immunsuppression durchbrochen werden. Wegen der
Assoziation der ständigen Antigenpräsenz mit einer kontinuierlichen spezifischen T-ZellAntwort, wie sie in unserer Arbeitsgruppe vor allem anhand der im Rahmen der
Immunsuppression bei Transplantierten häufigen Infektion durch ein humanes Herpesvirus,
nämlich das Cytomegalievirus (CMV), untersucht wurde, kann die Präsenz virusspezifischer
T-Zellen als Maß für die Fähigkeit des Wirtsorganismus genommen werden, die Infektion zu
kontrollieren (VARGA, WELSH, 1998; SELIN et al., 1999; SESTER et al., 2000; GIRNDT
et al., 2001; VARGA et al., 2001). Eine fehlende zelluläre Immunantwort spricht dabei
entweder für die Abwesenheit des Erregers oder für einen Defekt in der Kontrolle der
Virusreplikation durch die Immunantwort des Wirts.
1.5
Immunsuppression
Immunsupprimierte Patienten sind Hochrisikogruppen für jegliche Form von Infektionen,
darunter auch die Infektion mit HHV-8 und die damit assoziierten Neoplasien. Verschiedene
Gruppen sind bekannt, deren Immunsuppression auf unterschiedlichen Ursachen beruht. Für
diese
Arbeit
sind
vor
allem
der
urämische
Immundefekt,
die
medikamentöse
Immunsuppression bei Transplantierten und die Immundefizienz bei HIV-Patienten als
Formen des Immundefekts relevant.
Der bei terminal Niereninsuffizienten und Dialysepatienten beobachtete urämische
Immundefekt zeigt eine multiple Genese, die sowohl auf der urämischen Intoxikation wie
auch auf Veränderungen im renalen Metabolismus immunologisch aktiver Proteine beruht.
Dieser Immundefekt äußert sich bei betroffenen Patienten durch eine hohe Inzidenz an
Infektionen, der zweithäufigsten Todesursache bei Dialysepatienten (GIRNDT et al., 1999).
Die auffällig häufigen Infektionen wie auch die Beobachtung, dass sich die Impfantwort bei
Dialysepatienten bei einem Großteil der durchgeführten Impfungen als ineffizient
herausstellte (KÖHLER et al., 1984; GIRNDT et al., 1995; KREFT et al., 1997), haben nach
Untersuchungen vor allem auf Ebene der T-Zellfunktion gezeigt, dass der Hauptdefekt bei der
Antigenpräsentation zu suchen ist. Die daraus resultierende mangelhafte T-Zellaktivierung
wird zum einen mit einem direkten Einfluss der Urämie auf die antigenpräsentierenden Zellen
in Zusammenhang gebracht. Zum anderen macht man die Entzündungsreaktion mit gestörter
Einleitung 13
Produktion pro- und antiinflammatorischer Zytokine für den urämischen Immundefekt
verantwortlich (GIRNDT et al., 2001). Dementsprechend ist auch der andere Arm der
spezifischen Immunantwort, die humorale Antwort, aufgrund mangelnder Aktivierung in
ihrer Funktion inhibiert, was die geringe Antikörperbildung im Verlauf einer Impfantwort
erklärt.
Im Rahmen von Transplantationen ist es trotz immer größerer Fortschritte, die Kompatibilität
eines Transplantats mit dem Empfänger im Voraus über eine Typisierung der
Haupthistokompatibilitätsantigene abzustimmen, nach wie vor nicht möglich, eine
Abstoßungsreaktion gegen das Transplantat auszuschließen. Daher ist eine lebenslange
medikamentöse Immunsuppression nach einer Organtransplantation unerlässlich. Die dazu
angewandten Immunsuppressiva haben trotz unterschiedlicher Wirkmechanismen alle
gemeinsam, dass sie den zellulären Arm der adaptiven Immunantwort inhibieren und damit
das Risiko für die Reaktivierung bestehender Infektionen mit persistierenden Erregern
erhöhen.
Der Immundefekt bei HIV-infizierten Patienten beruht auf einer drastischen Verminderung
der durch das Virus befallenen T-Helferzellen. Dies wird einerseits durch die Vorstellung,
dass das Virus durch die Virusreplikation die Zelle lysiert, zum anderen durch die leichtere
Auslösung des programmierten Zelltods (Apoptose) in infizierten Zellen erklärt. Nicht zuletzt
wird die Zahl der CD4-positiven T-Zellen auch dadurch reduziert, dass zytotoxische CD8positive T-Zellen infizierte Helferzellen erkennen und töten. Ist die Zahl der CD4-T-Zellen
einmal unter einen kritischen Wert gesunken, steigt auch bei dieser Patientengruppe das
Risiko für opportunistische Infektionen und Neoplasien. Unter ihnen ist bei AIDS-Patienten
das Kaposi-Sarkom sicher das bekannteste.
1.6
HHV-8 Transmission
Die genauen Übertragungswege von HHV-8 sind bis heute unklar. Ein sexueller
Übertragungsweg kann jedoch aufgrund von zahlreichen Studien zur HHV-8-Prävalenz bei
Homosexuellen und Patienten mit sexuell übertragbaren Krankheiten nicht ausgeschlossen
werden (GREENSILL, SCHULZ, 2000; CHALLINE et al., 2001; HENKE-GENDO,
SCHULZ, 2004; GRULICH et al., 2005). Dabei gibt es Hinweise für einen hauptsächlich orogenitalen Übertragungsweg (DUKERS et al., 2000). Nach Untersuchungen an Kindern und
sexuell nicht aktiven Personen scheint es darüber hinaus jedoch vor allem in Ländern mit
Einleitung 14
hoher HHV-8-Prävalenz und familiärer Häufung von Kaposisarkom auch einen nichtsexuellen Übertragungsweg zu geben (ANGELONI et al., 1998; PLANCOULAINE et al.,
2000; WHITBY et al., 2000; DAVIDOVICI et al., 2001). Ein perinataler Übertragungsweg ist
zwar nicht ausgeschlossen, wurde jedoch nur selten beobachtet (VITALE et al., 2000)
(MANTINA et al., 2001), so dass bei Kindern vorwiegend von einer horizontalen und
weniger einer vertikalen Transmission auszugehen ist (LYALL et al., 1999; CALABRO et al.,
2000). Der PCR-Nachweis von Virus-DNA im Speichel weist um so mehr auf einen
möglichen oralen Übertragungsweg hin (VIEIRA et al., 1997; MARCELIN et al., 2004;
MBULAITEYE et al., 2004) als gezeigt werden konnte, dass die Viruslast im Speichel viel
höher ist als in anderen Körperflüssigkeiten (PAUK et al., 2000). Desweiteren wurde ein
niedriges Übertragungsrisiko über Blutkonserven nicht ausgeschlossen (MBULAITEYE et
al., 2003). Auf die mögliche Transmission über Transplantate wird in einem späteren
Abschnitt eingegangen.
1.7
Diagnostik und Epidemiologie
In Ermangelung von Nachweisverfahren für HHV-8 mittels Zellkulturen konzentrierte sich
die HHV-8-Labordiagnostik bisher auf serologische und molekularbiologische Methoden, mit
deren Hilfe zahlreiche Studien die Virusprävalenz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen
und
bei
zahlreichen
Erkrankungen
untersucht
haben.
Die
Interpretation
dieser
epidemiologischen Daten erwies sich jedoch wegen unzulänglicher Vergleichbarkeit der
verschiedenen Testverfahren als schwierig, zumal bislang keine zuverlässige Methode, die als
Goldstandard dienen könnte, gefunden wurde.
Die molekularbiologischen Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zeigten sich
hauptsächlich für den Beweis eines kausalen Zusammenhangs von HHV-8 mit dem KaposiSarkom, PEL und anderen HHV-8-assoziierten Krankheiten von Nutzen (LOCK et al., 1997;
BOIVIN et al., 1999; LALLEMAND et al., 2000; WHITE, CAMPBELL, 2000; TEDESCHI
et al., 2001). An Biopsiematerial aus Kaposi-Sarkom-Läsionen gelingt der Virusnachweis
mittels PCR fast immer. Aus peripherem Blut konnte zwar ebenfalls Virus-DNA im Plasma
oder in peripheren mononukleären Zellen (PBMC) mittels der kontaminationsempfindlichen
Nested-PCR nachgewiesen werden, jedoch trat diese Virämie bei Untersuchungen an HIVpositiven Patienten nur intermittierend auf und konnte bei Kollektiven außerhalb der
Hochrisikogruppen überhaupt nicht nachgewiesen werden. Die Virämie ist vor allem ein Maß
Einleitung 15
für die Replikation eines Virus. Jedoch liefert die Bestimmung der Viruslast keine direkte
Aussage über die Fähigkeit des Organismus, eine zelluläre oder humorale Immunantwort
gegen das Virus auszubilden. Diese Eigenschaften der PCR-Analyse prädestinieren die
Methode daher eher zum Nachweis von HHV-8-DNA in Kaposi-Sarkom-Läsionen oder zum
Einsatz in der Verlaufskontrolle eines Kaposi-Sarkoms.
Im Gegensatz zur PCR erwiesen sich die serologischen Nachweisverfahren als geeigneter für
eine Beurteilung einer asymptomatischen Infektion mit HHV-8 sowie für Aussagen über die
Epidemiologie des Virus. Der Nachweis virusspezifischer Antikörper kann eine Aussage über
die Fähigkeit des Wirts, eine gegen das Virus gerichtete Immunantwort auszubilden, treffen
und ist damit eher für die individuelle Beurteilung des Abwehrstatus geeignet. Diese
individuelle Beurteilung ist jedoch bisher aufgrund wenig reproduzierbarer Testergebnisse bei
den
verschiedenen
angewandten
serologischen
Methoden
nur bedingt
zuverlässig
durchführbar.
Die bisher von einer ganzen Reihe an Arbeitsgruppen veröffentlichten Daten zu HHV-8Prävalenzen haben bislang zu keinem Konsens geführt. Obwohl unterschiedliche
Seroprävalenzen in verschiedenen Regionen teilweise auf ethnische oder geographische
Unterschiede zurückzuführen sein mögen, scheinen einige der Differenzen jedoch auf der
Verwendung von serologischen Tests mit stark voneinander abweichenden Sensitivitäten und
Spezifitäten zu beruhen. Verschiedenste serologische Testverfahren, die sich entweder im
verwendeten Antigen oder im Testprinzip (indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie, ELISA
oder Immunoblotting) unterscheiden, wurden bislang etabliert. Eine Übersicht über diese
Methoden und die damit erfassten epidemiologischen Daten gibt Tabelle 1 (KEDES et al.,
1996; LENNETTE et al., 1996; MILLER et al., 1996; SIMPSON et al., 1996; ANDRE et al.,
1997; DAVIS et al., 1997; LIN et al., 1997; SMITH et al., 1997; CALABRO et al., 1998;
SITAS et al., 1999; GÄRTNER et al., 2003; PIERROTTI et al., 2005).
Als Antigene für die serologischen Testverfahren finden entweder latente Antigene wie das
latente nukleäre Antigen (LNA) aus isolierten Zellnuclei bzw. intakte Zellen uninduzierter
HHV-8 positiver Zelllinien oder lytische Antigene wie TPA-induzierte HHV-8-positive
Zelllinien (LENNETTE et al., 1996) oder rekombinante immunogene Proteine [z.B. ORF
(open reading frame) 65 oder K8.1] Anwendung (SIMPSON et al., 1996; ANDRE et al.,
1997). Dem Auftreten von Antikörpern gegen latente Antigene geht fast immer die
Nachweisbarkeit von Antikörpern gegen lytische Antigene voraus, weshalb zu vermuten ist,
dass erstere die Prävalenz von HHV-8 vor allem in der Normalbevölkerung unterschätzen.
Einleitung 16
Tab.1 : HHV-8 Antikörperdetektion mittels verschiedener serologischer Methoden (verändert und aktualisiert
nach Th. Schulz (SCHULZ, 1998).
Antikörperdetektionsrate in %
Antigen
Methode
Klassisches
AIDS
HIV
Homosexuelle
KS
KS
ohne
Männer
Blutspender
Andere
Referenz
Kontrollgruppen
KS
Latente
Antigene
‘LANA’
IFT
85-94
71-88
18-30
0-3
(UK/USA)
12-21
(Griechenland)
4-21 (Italien)
51 (Uganda)
Simpson, 1996
Kedes, 1996
Simpson, 1996
Calabro ,1998
Lennette, 1996
IFT
‘LNA’
WB
13,9
100
80
37,5
18
Pierrotti, 2005
0 (USA)
IFT
IFT
31,6
4,7
(Homburg)
62 (Uganda)
Simpson, 1996
32 (South Africa)
Sitas, 1999
29 (Transplantatempfänger)
Gärtner, 2003
Lytische
Antigene
40
kDa
protein
WB
vp19
(orf65)
ELISA/
WB
86-94
67
13
75-84
31
Miller, 1996
1,7-5
(UK/USA)
12
(Griechenland)
9-22 (Italien)
35 (Uganda)
Simpson, 1996
Lin, 1997
Calabro ,1998
vp23
(orf26)
Nicht
definiert
(Zelllinien)
ELISA
~ 40
~11
(Deutschland)
Andre, 1997
~ 60
~20 (USA)
Davis, 1997
IFT
96-100
IFT
100
90-100
20-25 (USA)
0 (USA)
32-100 (Africa)
Lennette, 1996
Smith, 1997
*
LANA, latenz-assoziiertes nukleäres Antigen; LNA, latentes nukleäres Antigen; IFT, Immunfluoreszenztest;
WB, Western Blot; ELISA, Enzyme-linked immuno sorbent assay
Konsens gibt es unabhängig von den angewandten Methoden lediglich über die höhere
Seroprävalenz bestimmter Risikogruppen und über die Existenz einiger endemischer Gebiete
(hauptsächlich große Teile Afrikas, Norditalien und Saudi-Arabien). Als Hochrisikogruppen
gelten HIV-Infizierte, homosexuelle Männer mit und ohne HIV-1-Infektion und
Einleitung 17
Transplantatempfänger
aufgrund
ihrer
iatrogenen
Immunsuppression
(REGAMEY,
CATHOMAS, 2000; CANNON et al., 2001; CHALLINE et al., 2001; GREENBLATT et al.,
2001). Wie auch in Tabelle 1 beschrieben, schwanken die HHV-8-Prävalenzen in der
Normalbevölkerung der USA beispielsweise je nach Testverfahren zwischen 0 und 25 %, was
sich in anderen Industrieländern, in denen HHV-8 nicht endemisch vorkommt, in einer
ähnlichen Schwankungsbreite bestätigt.
1.8
HHV-8-Infektion und Organtransplantation
Es ist bekannt, dass iatrogene
Immunsuppression vor allem im Rahmen von
Organtransplantationen zur Reaktivierung latenter viraler Infektionen wie EBV und CMV mit
konsekutiv erhöhten Antikörpertitern und Virämie führen kann (FISHMAN, RUBIN, 1998).
Auch für HHV-8 hat man erhöhte Seroprävalenzen bei Organtransplantierten finden können
(HUDNALL et al., 1998; GÄRTNER et al., 2003). Nicht erst seit der Entdeckung von HHV-8
ist das Kaposi-Sarkom als maligne Neubildung vor allem nach Nierentransplantationen
bekannt (PENN, 1979) und stellt in Industrieländern immerhin 6% der malignen
Neubildungen nach Transplantationen dar. In manchen endemischen Gebieten steht es gar an
erster Stelle bei nach Transplantation auftretenden Tumoren (MOOSA, 2005). Gerade mit der
fortschreitenden Entwicklung neuer Immunsuppressiva und dem Einsatz von Cyclosporin ist
die Inzidenz des Kaposi-Sarkoms bei Nierentransplantierten in den letzten 15 Jahren
gestiegen.
Während die HHV-8-Seroprävalenz unter gesunden Individuen aus nicht-endemischen
Gebieten im Durchschnitt unter 5% liegt (GÄRTNER et al., 2003), variiert sie unter
Transplantatempfängern zwischen 18-50% (HUDNALL et al., 1998; DIOCIAIUTI et al.,
2000; CATTANI et al., 2001; ALZAHRANI et al., 2005). Es ist jedoch bislang unklar, ob
diese Differenz zwischen Immungesunden und Transplantatempfängern ausschließlich über
die Übertragung via Transplantat oder Bluttransfusionen erklärt werden kann. Dies erscheint
eher unwahrscheinlich, da selbst in endemischen Gebieten nur eine relativ geringe
Übertragungsrate von 2,6% über Bluttransfusionen berichtet wurde (MBULAITEYE et al.,
2003) und auch Übertragungen via Transplantat nur selten nachgewiesen werden konnten.
Selbst bei einer nur theoretisch denkbaren Übertragungsrate von 100% sollte das Maximum
an HHV-8-positiven Individuen nach Transplantation bei angenommener HHV-8Seroprävalenz von 15% unter Dialysepatienten vor Transplantation und einer maximalen
Einleitung 18
Transplantatübertragung von 5% nicht 20 % überschreiten. Die gemessenen Prävalenzen von
bis zu 50% gehen jedoch weit darüber hinaus (HUDNALL et al., 1998; DIOCIAIUTI et al.,
2000; CATTANI et al., 2001), was auf das Vorhandensein anderer Mechanismen für die
überproportionalen Serokonversionen schließen lässt. In diesem Zusammenhang scheinen vor
allem zwei Mechanismen wahrscheinlich: zum einen die Reaktivierung von serologisch nicht
nachweisbaren Infektionen vor Transplantation, zum anderen eine höhere Übertragungsrate
bei einer durch serologische Methoden unterschätzten HHV-8-Prävalenz in der gesunden
Bevölkerung.
1.9
Ziel der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es, eine routinetaugliche Methode zum Nachweis der zellulären
Immunantwort gegen HHV-8 zu etablieren. Mit dieser Methode sollten folgende
Fragestellungen bearbeitet werden:
1. Wie hoch ist die HHV-8-Prävalenz gemessen anhand der zellulären Immunantwort bei
Hämodialysepatienten, Organtransplantierten, HIV-Infizierten und immungesunden
Probanden?
2. Korreliert die Detektion einer zellulären Immunantwort mit der einer humoralen
Immunantwort?
3. Welche Rückschlüsse auf die Epidemiologie des Virus können aufgrund einer
kombinierten Analyse der zellulären Immunantwort und der Antikörperproduktion
gezogen werden?
4. Inwiefern spielt die Art des Immundefekts eine Rolle für die HHV-8-spezifische
Immunantwort?
5. Kann die Messung der zellulären Immunantwort eine Erklärung für die nach
Organtransplantationen auftretenden Serokonversionen geben?
6. Lässt sich der mikroskopische Immunfluoreszenztest zum Nachweis HHV-8spezifischer
Antikörper
durch
Durchflusszytometer optimieren?
die
Variation
seiner
Anwendung
im
Material und Methoden 19
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Materialien
2.1.1
Geräte
Becton Dickinson Biosciences,
Heidelberg
Durchflusszytometer (FACScalibur)
FACS-Röhrchen
Behring, Schwalbach
Photometer BEP
Brand, Wertheim
1,5ml Reaktionsgefäße
Pasteur-Pipetten
Präzisions Dispenserdips (5ml, 1,25ml)
Brenson Sonifier W-250
Clean Air Techniek bv,
Woerden, NL
Sterile Werkbank,
("Clean Air" Typ DLF BSS4)
Corning Costar, Bodenheim
Einmal-Plastikpipetten (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml)
Dynatech, Chantilly, USA
Mikrotiterplatten-Photometer (Dynatech MR5000)
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (1,5ml, 2,0ml)
Kolbenhubpipetten (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl)
Eppendorfzentrifuge, Minifuge
Fisher Scientific,
Heizplatte
Loughborough, UK
Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen für Kolbenhubpipetten
Kulturplatten (96-Wellplatten)
Kolbenhubpipetten (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl)
15ml-Röhrchen
Material und Methoden 20
50ml-Röhrchen
Heraeus, Hamburg
Brutschrank
Zentrifuge, Megafuge
Zentrifuge, Labofuge
Integra Biosciences, Fernwald
Pipettierhilfe (Pipetboy acu)
Sterile Werkbank, Tecnoflow
Leitz, Wetzlar
Mikroskop Leitz Aristoplan
Machery-Nagel, Düren
Faltenfilter
Neubauer Zählkammer
Millipore, Schwalbach
Miliquo Plus
NeoLab Migge Laborbedarf,
Vortex-Mixer (Reagenzglasmixer)
Heidelberg
Nikon, Düsseldorf
Mikroskop
Ohaus, Giessen
Waage, Portable advanced
Zapf, Sarstedt
Sterile Werkbank, Viro
GFL, Burgwedel
Schüttler GFL 3015, Viro
2.1.2
Substanzen
Aldrich-Chemie, Steinheim
Paraformaldehyd
Becton Dickinson Biosciences,
Heidelberg
Facs Flow
Facs Rinse
Facs Clean
Lysingsolution
Biochrom AG, Berlin
RPMI 1640 Medium
DMEM Medium
Material und Methoden 21
Hygromycin
Moronal
Neomycin
Penicillin
Streptomycin
BioWhittaker, Verviers
RPMI 1640 Medium
Dupont de Nemours,
Wilmington, USA
Polyvinylalkohol 71-30
Fluka, Buchs, Schweiz
NaN3
Linaris, Bettingen
PBS
Menzel-Gläser, Braunschweig
Deckgläser
Elvanol
Objektträger
Merck, Darmstadt
Natriumhydroxidplätzchen M=40g/mol
Coomassie Blau G 250
Ethanol 95%
PAA, Cölbe
Penicillin
Streptomycin
L-Glutamin
FCS (fötales Kälberserum) Charge A 01127-118 (für BC-BL-1-Zellkultur)
Roth, Karlsruhe
Phosphorsäure (85%)
Stammlösung Albumin 8076.3
Serva, Heidelberg
DMSO= Dimethylsulfoxid
BSA= Rinderserumalbumin
Seromed; Biochrom, Berlin
Trypsin/EDTA
Sigma, Deisenhofen
Brefeldin A (BFA)
Mercaptoethanol
Saponin
Triton-X-100
Starnberger, Landsberg
PTFE Spray 650
Vector Laboratories,
Burlingame, USA
Vectashield Mounting Medium
Material und Methoden 22
2.1.3
Antikörper
Alle Antikörper wurden in den in unserem Labor austitrierten Sättigungskonzentrationen
eingesetzt (s. Tab. 2). Die Angaben beziehen sich auf ein Färbeansatzvolumen von 50µl, das
sich
aus
eingesetztem
Antikörpervolumen,
FACS-Puffer
und
Saponin
in
einer
Endkonzentration von 0,1% zusammensetzte.
Tab. 2: Zur Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz verwendete Antikörper
Gerichtet gegen
AntikörperHerkunft
Konjugat
Klon
Volumen/
50µl Firma
Färbeansatz
CD4
Maus
APC
SK3
0,5µl
Becton
Dickinson
(BD), Heidelberg
CD8
Maus
PerCP
SK1
4µl
BD, Heidelberg
CD69
Maus
PE
L92
2µl
BD, Heidelberg
IFN-γ
Maus
FITC
4S B3
0,5µl
BD, Heidelberg
IL-4
Maus
PE
8D4-8
1µl
BD, Heidelberg
Human-IgG
Maus
FITC
polyclonal
0,25 µl
Jackson,
Immunoresearch
Human-IgG (H+L)
Ziege
Cy3
polyclonal
0,25 µl
Jackson,
Immunoresearch
Human IgG (Fcγ)
Ziege
FITC
polyclonal
0,25 µl
Jackson,
Immunoresearch
Maus-IgG (H+L)
Ziege
FITC
polyclonal
1µl
Dianova, Hamburg
Maus-IgG (H+L)
Ziege
PE
polyclonal
1µl
Dianova, Hamburg
Maus-IgG (H+L)
Ziege
Cy3
polyclonal
1µl
Dianova, Hamburg
pp65
Maus
unkonjugiert
1C3+AYM-1
2µl
Argene
Material und Methoden 23
2.1.4
Stimulantien
Zur antigenspezifischen T-Zellstimulation wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Stimulantien
bzw. Costimulantien verwendet.
Tab. 3: Reagenzien zur Stimulation antigenspezifischer T Zellen
Stimulans
Klon
Konzentration
Hersteller
αCD28
L293
1µg/ml
BD Biosciences, Heidelberg
αCD49d
9F10
1µg/ml
BD Biosciences, Heidelberg
32µl/ml
Eigene Herstellung
32µl/ml
Eigene Herstellung
32µl/ml
Eigene Herstellung
32µl/ml
Eigene Herstellung
CMV Antigen
32µl/ml
Bio Whittaker, Verviers
SEB
2,5µg/ml
Sigma, Deisenhofen
HHV-8- Antigen
(BC-BL-1-Lysat)
HHV-8-Kontrollantigen
(BJAB-Lysat)
293-Lysat
293pp65-Lysat
(HCMV-
Antigen)
(Staphylokokkenenterotoxin)
2.1.5
Zelllinien
Folgende Zelllinien wurden zur indirekten Immunfluoreszenzmessung, Lysatherstellung und
zur Verwendung als Antigen in serologischen Nachweisverfahren eingesetzt:
293:
humane, primäre embryonale Nierenzellen, adhärent wachsend (GRAHAM et
al., 1977)
Material und Methoden 24
293pp65:
mit dem für das CMV-Antigen pp65 kodierende Gen transfizierte embryonale
Nierenzelllinie (Sester, unveröffentlicht), adhärent wachsend
BJAB:
Zelllinie aus einem EBV-negativen Burkitt-Lymphom (KLEIN et al., 1974),
Suspensionszellen
BC-BL-1:
HHV-8-positive Zelllinie aus einem body cavity-based lymphoma (RENNE et
al., 1996), Suspensionszellen
Die beiden Zelllinien BJAB und BC-BL-1 wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt
vom Institut für Virologie der Universität des Saarlandes (Prof. Dr. N. Müller-Lantzsch).
Tab. 4: Zur Haltung der Zellkulturen verwendete Medien und ihre Zusätze.
RPMI-Medium für BJAB
40U/ml Penicillin, 10 U/ml Moronal
Supplementiert
10µg/ml Neomycin
50µg/ml Streptomycin
0,29 mg/ml L-Glutamin
10% (v/v) FCS
RPMI-Medium für BC-BL-1
10µl/l Mercaptoethanol
Supplementiert
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
0,29 mg/ml L-Glutamin
10% (v/v) FCS (Fa. PAA, Charge A 01127-118
DMEM-Medium (Dulbecco`s modified Eagle
Medium) für 293/293pp65
Supplementiert
100 γg/ml Hygromycin
0,29 mg/ml L-Glutamin
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
10 % (v/v) FCS
Das fötale Kälberserum (FCS) wurde zuvor 30 min bei 56°C im Wasserbad inkubiert, um
Komplement zu inaktivieren.
2.2 Patienten- und Probandenkollektiv
In dieser Arbeit wurden 129 immunkompetente Individuen im Alter von 51,6±13,8 Jahren
(22,8 bis 87,3), 70 Hämodialysepatienten im Alter von 63,4±15,5 Jahren (19,4 bis 94,6), 68
Material und Methoden 25
Organtransplantierte, davon 66 Nieren- und 2 Lungentransplantierte im Alter von 51,7±14,8
Jahren (18,3 bis 77,9) und 72 HIV-positive Patienten im Alter von 42,7±10,8 Jahren (21,3 bis
72,0) untersucht.
2.3 Methoden
2.3.1
Zellkulturen
Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Die zuvor
in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Zellen wurden unter Zugabe von Kulturmedium, um das
toxische Einfriermedium DMSO (Dimethylsulfoxid) zu verdünnen, in einem 37°C
temperierten Wasserbad aufgetaut und bei 240g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen, die Zellen in 37°C warmem Vollmedium resuspendiert und in einer Kulturflasche
entsprechender Größe ausgesät.
Alle Zellen wurden in Kunststoffkulturgefäßen in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 einer
Luftfeuchtigkeit von ca. 90% mit leicht angeschraubten Deckeln kultiviert.
Adhärente Zellen
Zur Vermehrung und kontinuierlichen Kultur von adhärenten Zellen wurden konfluente
Zellkulturen mit auf 37°C vorgewärmten PBS vorsichtig gewaschen und durch kurzzeitige
Behandlung mit geringen Mengen (1ml/25cm2) von Trypsinlösung vom Gefäßboden abgelöst.
Danach wurden die abgelösten Zellen in neuen Kulturflaschen in einem Verhältnis zwischen
1:2 und 1:10 je nach ihrer Wachstumsgeschwindigkeit und ihrer Verwendung in
vorgewärmtes Medium aufgenommen. Das Passagieren der Zellen erfolgte alle 2-4 Tage.
Suspensionszellen
Zweimal pro Woche wurden die Zellen, wenn sie dicht gewachsen waren (etwa 106
Zellen/ml), im Verhältnis 1:10 durch Zugabe von frischem Medium gesplittet und in neue
Kulturflaschen überführt.
Alle Arbeiten mit der BC-BL1-Zellkultur wurden im S3-Labor des virologischen Instituts
durchgeführt.
Material und Methoden 26
Zellzählung
PBS (Phosphatgepufferte
Salzlösung)
Trypsinlösung:
0,5 g/l Trypsin, 0,2 g/l EDTA, 0,85 g/l NaCl
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer (0,0025mm2x0,1mm),
auf die ein geschliffenes Deckglas aufgebracht wurde. Die Neubauer-Kammer ist in 16
Kleinstquadrate aufgeteilt, die in 4 Quadranten angeordnet sind. Zur Zählung wurden 10µl
Zellsuspension in die Kammer eingebracht und mindestens zwei sich gegenüberliegende
Quadranten im Lichtmikroskop ausgezählt. Die Zellzahl pro ml Zellsuspension errechnet sich
aus dem Mittelwert an Zellen pro Quadrant, multipliziert mit dem Kammerfaktor 10.000.
Einfrieren und Auftauen von Zellen
Einfriermedium 10%(v/v) DMSO
10%(v/v) FCS in Kulturmedium
Die einzufrierenden Zellen wurden durch Trypsin-Behandlung von der Kulturschale gelöst,
bei 240g zentrifugiert und in einem solchen Volumen kaltem Einfriermedium resuspendiert,
dass sich eine Zellzahl von 105/ml bis 106/ml ergab. Die Zellsuspension wurde in Portionen
von 1 ml in vorgekühlte Einfrierröhrchen gefüllt, langsam auf -70°C abgekühlt und 2 bis 3
Tage später zur längerfristigen Lagerung in einen Tank mit flüssigem Stickstoff überführt.
Das Auftauen der Zellen erfolgte im 37°C-Wasserbad. Sobald das letzte Eiskristall
geschmolzen war, wurden 2 bis 3 ml frisches, den Zellen entsprechendes Medium mit FCS
zugegeben, um das toxische DMSO zu verdünnen. Nach dem Zentrifugieren wurden die
Zellen in frischem Medium resuspendiert und je nach Bedarf und Zelltyp in einer Zellzahl
von etwa 105/ml in Kulturschalen ausgesät.
2.3.2
Messung
der
Antigenexpression
Fluoreszenzmikroskopie
FACS-Puffer:
PBS 5% FCS, 0,5% BSA, 0,07% NaN3
Saponinpuffer:
FACS-Puffer/0,1% Saponin
mittels
Durchflusszytometrie
und
Material und Methoden 27
Isolierung der Zellen
Nach Absaugen des Kulturmediums wurden die Zellen mit PBS gewaschen, mit 1ml/25cm2
Trypsinlösung vom Boden der Zellkulturflasche gelöst und in Kulturmedium des gleichen
Volumens wie zur Zellhaltung resuspendiert. Das Medium wurde 10 min bei 240g
abzentrifugiert und die Zellen einmal in PBS gewaschen. Dazu wurden die Zellen in 15ml
PBS aufgenommen, bei 240g 10 min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Die
gewaschenen Zellen wurden in 5ml PBS resuspendiert.
Färbung der Zellen mit einem Fluorochrom-konjugierten Antikörper
Jeweils 3x106 Zellen wurden auf FACS-Röhrchen verteilt und 5 min mit 1000µl 37°C
warmem 4% PFA (Paraformaldehyd) fixiert. Die Fixierung wurde mit 3000µl FACS-Puffer
angehalten und diese Zellsuspension 8 min bei 240g zentrifugiert. Nach Abnahme des
Überstands wurden die Zellen mit 3 ml PBS gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet
mit 0,5% Triton-X-100 5 min (alternativ: 0,1% Saponinpuffer, 10min) permeabilisiert und
erneut mit je 3 ml PBS gewaschen.
Danach wurden die Proben mit einem gegen das jeweils nachzuweisende Antigen gerichteten
Erstantikörper in einem Färbeansatz à 100µl Volumen und einer Saponinkonzentration von
0,1% für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach 1 Stunde wurden die Proben erneut zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und mit
einem Fluorochrom-konjugierten, gegen den Erstantikörper gerichteten Zweitantikörper
(FITC-, PE- oder Cy3-konjugiert) für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Waschschritte erfolgten wie bei dem Erstantikörper. Am Ende wurden die Zellen in 100 µl
PBS aufgenommen. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden 50 µl in einem Eppendorfgefäß
bei 4°C bis zu Analyse gelagert. Die restlichen Zellen wurden mit 150 µl 1% PFA versetzt
und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Fluoreszenzmikroskopie
Die für die Fluoreszenzmikroskopie entnommenen Proben wurden vor der Betrachtung bei
10000g in einer Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert, um die Zelldichte zu erhöhen. Danach
wurden sie auf Objektträger aufgetragen, mit Vectashield-Mounting-Medium eingedeckt und
Material und Methoden 28
mit einem Deckglas versehen. Die Betrachtung der Proben erfolgte mit einem 40er Objektiv
mit dem jeweils für die Wellenlänge des verwendeten Fluorochroms geeigneten Filter.
Durchflusszytometrische Messung
Die Proben wurden im Durchflusszytometer untersucht. In einem Durchflusszytometer
werden die mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff angefärbten Zellen kontinuierlich
hintereinander an einer Lichtquelle vorbeigeführt. Das Vorwärtsstreulicht (Forward scatter,
FSC) liefert eine Information über die Zellgröße, das totale Seitwärtsstreulicht (Side scatter,
SCC) über die Granularität. Die antigengebundenen Fluorochrome werden vom Laserstrahl in
einer für das Fluorochrom spezifischen Wellenlänge angeregt und emittieren daraufhin Licht
einer höheren Wellenlänge, die im Seitwärtsstreulicht des Durchflusszytometers anhand
spezifischer Detektoren erfasst wird.
Die Datenerfassung und –auswertung erfolgte mit Hilfe der Software Cell Quest Pro von
Becton Dickinson.
2.3.3
Gewinnung von Antigenlysat aus Zellkulturen
Glycin-Puffer: 0,15 M Glycin in PBS, pH 8,5 bzw. 0,5 M Glycin in PBS, pH 8,5
Die Gewinnung von Antigenlysat aus Zellkulturen wurde nach dem Prinzip der GlycinExtraktion wie von Waner et al. zuvor beschrieben durchgeführt (WANER, BUDNICK,
1977).
Im Fall der adhärenten Zellen wurden zunächst die Überstände aus den Zellkulturflaschen
abgenommen, die Zellen mit jeweils 10 ml PBS gewaschen und mit 3,5 ml Trypsinlösung
vom Flaschenboden abgelöst. Dieser Vorgang wurde durch Zugabe von 10 ml Kulturmedium
abgestoppt.
Der Inhalt von je 3 Zellkulturflaschen wurde in ein 50 ml Falcon-Röhrchen und jede Flasche
mit je 5 ml 0,15 M Glycin-Puffer nachgespült. Die Falcon-Röhrchen wurden mit 0,15M
Glycin-Puffer aufgefüllt und bei 290g 10 min bei 10°C zentrifugiert. Die Überstände wurden
verworfen und das Pellet nochmals mit Glycin-Puffer resuspendiert und zentrifugiert. Nach
Verwerfen dieses Überstands wurde das Pellet in je 10 ml 0,5 M Glycin-Puffer aufgenommen
und auf Eis gestellt.
Material und Methoden 29
Mit den Suspensionszellen wurde bis auf den Schritt der Abtrypsinisierung ebenso verfahren.
Mit einer Spezial-Ultraschalleinrichtung wurden die Lysate 3 mal 15 Sekunden sonifiziert.
Zwischen den Sonifizierungsvorgängen wurde das Lysat 10 Sekunden auf Eis gestellt. Zur
Glycinextraktion wurden die Lysate dann über Nacht im Kühlraum bei 4°C stehengelassen,
um am nächsten Tag nochmals bei 500g zentrifugiert zu werden. Die Überstände wurden
dann in Aliquots 30 min bei 56°C hitzeinaktiviert und bei -70°C eingefroren.
2.3.4
Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf der Beobachtung, dass sich das
Absorptionsmaximum des Farbstoffs Coomassie Blau G 250 im sauren Milieu durch
Proteinbindung von 465 nm nach 595 nm verlagert. Die Absorptionszunahme bei 595nm ist
hierbei ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Für die Stammlösung für den
Bradfordversuch wurden 100mg Coomassie Blau G 250 in 25ml Ethanol (95%) und 200ml
Phosphorsäure (85%) gelöst, auf 500ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt, über einen
Faltenfilter filtriert und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt. Vor Gebrauch wurde die
Lösung 1:3 mit destilliertem Wasser verdünnt und nochmals filtriert. Aus einer 10 mg/ml
Stammlösung Albumin in H2O wurden die Verdünnungen 200, 100, 50, 25 und 0 µg/ml
hergestellt. In einer 24-Well-Platte wurden zunächst 30µl 0,02N NaOH pro Well vorgelegt
und mit 30µl Probenlösung unverdünnt und in den Verdünnungen 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16- bzw.
Standardlösung oder destilliertem Wasser versetzt. Vermischt mit 300µl Stammreagenz
wurden die Proben dann 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und deren Extinktion bei
570nm photometrisch bestimmt. Von jeder Probe wurden Dreifachbestimmungen
durchgeführt und aus den Mittelwerten der Standardlösungen eine Eichkurve erstellt, von der
die Proteinkonzentrationen der Proben abgelesen werden konnten.
2.3.5
Quantifizierung antigenspezifischer T-Zellen im Durchflusszytometer
In vitro wurden antigenspezifische CD4-und CD8-T-Zellen im Vollblut anhand ihrer
Aktivierung und ihrer antigenspezifischen Zytokinproduktion mittels Durchflusszytometrie
nachgewiesen (SUNI et al., 1998).
Material und Methoden 30
Vollblutstimulation
Jeweils 450 µl heparinisiertes Vollblut pro Stimulationsansatz wurden in Anwesenheit der
Costimulantien αCD28 und αCD49d (je 1µg/ml) in 15 ml Polypropylen-Röhrchen mit den
jeweiligen Antigenen in den in Tab.2 angegebenen Konzentrationen versetzt und mittels
Vortex gut durchmischt. Insgesamt wurden die Stimulationsansätze für eine Dauer von 6
Stunden im Brutschrank bei 37°C und 6% CO2 mit leicht angeschraubtem Deckel inkubiert.
In dieser Zeit wurden CD4- und CD8- T-Zellen spezifisch zur Hochregulierung von CD69
und zur Zytokinproduktion stimuliert. Während der letzten 4 Stunden wurden 10µg/ml
Brefeldin A hinzugefügt, um den Transport von Zytokinen in den Extrazellulärraum zu
verhindern.
Fixierung der Zellen
Nach 6 Stunden Stimulation wurden die Ansätze mit 100µl/ml 20mM EDTA versetzt, gut
durchmischt, um die Zell-Zell-Interaktionen zu lösen, und für 15 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Daraufhin wurden die Erythrozyten unter Verwendung von 9ml Becton Dickinson
Lysingsolution pro ml Vollblut lysiert. Nach 10-minütigem Abzentrifugieren des
Erythrozytenlysats bei 340g wurden die Leukozyten mit 2ml FACS-Puffer pro Probe
gewaschen und das Zellpellet in 400µl FACS-Puffer aufgenommen. Die Proben konnten dann
entweder sofort gefärbt werden oder bis zur Färbung bei 4°C über Nacht aufbewahrt werden.
Färbung mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern
Pro Färbeansatz kamen fixierte Leukozyten aus ca. 200-225µl Vollblut zum Einsatz. Zur
Blockierung unspezifischer Bindungsstellen und zur Permeabilisierung der Zellmembranen
wurden die Zellen mit 2 ml Saponinpuffer für 10 min bei Raumtemperatur in FACSRöhrchen inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren des Saponinpuffers wurden die Proben mit
Fluorochrom-konjugierten, gegen bestimmte Oberflächenantigene und Zytokine gerichteten
Antikörpern 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Alle Färbungen wurden bei
den entsprechenden Sättigungskonzentrationen der Antikörper (s. Tab. 1) und einer SaponinKonzentration von 0,1% in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt. Nach der Färbung
wurden die Zellen nochmals mit 3ml FACS-Puffer gewaschen und am Ende in 200 µl 1%
PFA aufgenommen. Die Proben wurden bis zur durchflusszytometrischen Messung bei 4°C
aufbewahrt.
Material und Methoden 31
Durchflusszytometrische Messung
Mindestens 10.000 CD4- bzw. CD8-positive Lymphozyten wurden im Durchflusszytometer
auf ihre Aktivierung und ihre Zytokinproduktion hin mit Hilfe der Software CellQuest Pro
(BD) analysiert. Das Prinzip der durchflusszytometrischen Messung wurde unter Punkt 2.3.2
erklärt. Aufgrund der hier angewandten Vierfachfärbung kam zusätzlich ein zweiter Laser als
emittierende Lichtquelle zum Einsatz, der ein zweites Spektrum an Wellenlängen erfasst, in
dem
das
Fluorochrom
APC
zur
Fluoreszenz
angeregt
wird.
Der
Prozentsatz
antigenspezifischer T-Zellen wurde berechnet, indem die Frequenzen der jeweiligen
Kontrollstimulationen von der Frequenz der nach Antigenstimulation zytokinproduzierenden
T-Zellen subtrahiert wurden.
2.3.6
HHV-8-Serologie
Der Nachweis HHV-8-spezifischer Antikörper wurde mittels indirekter Immunfluoreszenz
(mikroskopische oder durchflusszytometrische Analyse) oder mittels ELISA durchgeführt.
Indirekter Immunfluoreszenztest
Bei einem indirekten Immunfluoreszenztest werden antigenspezifische Antikörper mit Hilfe
eines gegen diesen Erstantikörper gerichteten Fluorochrom-konjugierten Zweitantikörper
sichtbar gemacht. Die in dieser Arbeit im indirekten Immunfluoreszenztest zur Detektion
HHV-8-spezifischer Antikörper als Antigen benötigten HHV-8-positiven BC-BL-1-Zellen
wurden unter den in 2.3.1 beschriebenen Bedingungen im S3-Bereich gehalten.
Herstellung von BC-BL-1-beschichteten Objektträgern
Zunächst wurden die Zellen 1:2 gesplittet und dann durch Induktion mit 20ng/ml
Tetraphorbolacetat über 48 Stunden zur Produktion lytischer Proteine angeregt. Die zu
untersuchenden Zellen wurden daraufhin bei 240g abzentrifugiert und zweimal in PBS
gewaschen. Unter mikroskopischer Kontrolle wurde die Zellsuspension mit PBS auf eine
geeignete Zelldichte verdünnt und à 10 µl auf gefelderte Objektträger aufgetropft. Die
Objektträger wurden an der Luft getrocknet, 5 min bei -20°C in vorgekühltem Aceton 50%
fixiert und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C aufbewahrt.
Material und Methoden 32
Mikroskopischer Nachweis HHV-8-spezifischer Antikörper
Die Objektträger wurden kurz bei Raumtemperatur aufgetaut. Pro Feld wurden 50µl Serum
jeweils in den Verdünnungen 1:16 und 1:64 aufgetropft und der Objektträger 60 min bei 37°C
in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach 10-minütigem Waschen in einer mit PBS gefüllten
Schale wurden 400µl eines in PBS 1:200 verdünnten, FITC-markierten Sekundärantikörpers
aufgetragen und der Objektträger weitere 60 min inkubiert. Nach nochmaligem Waschen in
PBS wurde der Objektträger mit Elvanol überschichtet und mit einem Deckglas abgedeckt.
Die Auswertung erfolgte mit einem 40-er Objektiv an einem Leitz Aristoplan Mikroskop bei
einer Anregungswellenlänge von 518 nm. Serumproben wurden positiv gewertet, wenn bei
einer Verdünnung von 1:16 eine spezifische Fluoreszenz zu erkennen war.
Durchflusszytometrie
Nach dem Prinzip der indirekten Immunfluoreszenz wurde in dieser Arbeit eine Methode zum
Nachweis HHV-8-spezifischer Antikörper im Durchflusszytometer etabliert. Als Antigen
diente hierfür wiederum die HHV-8-positive B-Zelllinie BC-BL-1, die unter den oben
beschriebenen Bedingungen im S3-Bereich gehalten wurden. Als Kontrollantigen diente die
EBV-negative Zelllinie BJAB.
Zellfixierung
Verwendete Zelllinien: BJAB
BC-BL-1 und
48 Stunden mit TPA induzierte BC-BL1
Der Inhalt der Kulturflaschen wurde in 50ml Reaktionsgefäße (à ca. 20Mio Zellen) umgefüllt
und bei 240g 8 min abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde daraufhin mit 300µl/1Mio Zellen
37°C warmem 4% Paraformaldehyd 5 min fixiert, die Fixierung mit 1ml/1Mio Zellen FACSPuffer abgestoppt und die Zellen erneut 8 min bei 240g abzentrifugiert. Anschließend wurden
die Zellen einmal mit 30ml FACS-Puffer gewaschen und am Ende in einer Zellkonzentration
von ca. 1 Mio. Zellen pro ml in FACS-Puffer aufgenommen. Die Arbeiten mit BC-BL-1
wurden bis zum Ende des Fixierungsvorganges im S3-Bereich durchgeführt. Die fixierten
Zellen wurden mit Einfriermedium (10% DMSO und 10 % FCS in Kulturmedium) versetzt
und bis zur Verwendung bei -70°C eingefroren.
Material und Methoden 33
Durchflusszytometrischer Nachweis HHV-8-spezifischer Antikörper
Pro Ansatz wurden ca. 500.000 fixierte Zellen der Reihen BJAB (Negativkontrolle), BC-BL-1
(Nachweis von Antikörpern gegen latente Proteine) und TPA-induzierte BC-BL-1 (Nachweis
von Antikörpern gegen lytische Proteine) eingesetzt. Um das toxische Einfriermedium zu
entfernen, wurden die Zellen zunächst bei 240g abzentrifugiert und der Überstand verworfen.
Das Zellpellet wurde mit 2ml Saponinpuffer für 10 min permeabilisiert und daraufhin mit
verdünntem Serum in einem Ansatzvolumen von 100µl und einer Konzentration von 0,1%
Saponin 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit 2ml FACS-Puffer gewaschen und mit
einem FITC-konjugierten Maus-anti-Human-Antikörper (entspricht Zweitantikörper aus dem
Immunfluoreszenztest) in der Verdünnung 1:200 in einem Ansatzvolumen von 100µl (0,1%
Saponin) eine weitere halbe Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wurde
noch zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und die Zellen am Ende in 100µl FACS-Puffer
aufgenommen. 50µl wurden zur Kontrollanalyse im Mikroskop entnommen. Der Rest wurde,
mit 150µl % PFA versetzt, im Durchflusszytometer analysiert.
Um die für diese Zelllinien geeigneten Einstellungen am Durchflusszytometer vornehmen zu
können, wurde als Positivkontrolle eine Färbung mit einem Maus-Antikörper gegen das auf
jeder menschlichen Zelle exprimierte MHC-Klasse-I-Molekül vorgenommen. Dessen
Bindung wurde mittels eines FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers nachgewiesen.
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der serologische Nachweis HHV-8-spezifischer Antikörper erfolgte mit Hilfe eines ELISAKits der Firma Diavir. Die Testplatten als feste Phase sind mit einer Mixtur synthetisch
hergestellter HHV-8-Peptide als Antigen beschichtet. Sind in den zu messenden Serumproben
HHV-8-spezifische Antikörper anwesend, so binden diese an das immobilisierte Antigen. Ein
anschließend hinzugefügter, mit dem Enzym Peroxidase markierter Zweitantikörper bindet
daraufhin an humanes IgG. Nach Substratzugabe von Tetramethylbenzidin ist die
Konzentration des entstandenen farbigen Produkts der Antikörper-Konzentration in der Probe
direkt proportional.
Die Durchführung des Tests erfolgte laut Anweisungen des Herstellers. Vor der
Durchführung des Tests wurden alle Testkomponenten auf Raumtemperatur gebracht und die
Seren abzentrifugiert, um eventuelle Protein- oder Lipidpartikel zu entfernen. Test- und
Material und Methoden 34
Kontrollseren wurden in einer Verdünnung von 1:100 in der vom Hersteller mitgelieferten
Verdünnungslösung angesetzt. Von der Negativkontrolle wurde eine Doppelbestimmung
durchgeführt. 200µl Serumverdünnung wurden jeweils in eine antigenbeschichtete und in eine
unbeschichtete Kavität einer 96-Wellplatte gegeben, abgedeckt 1 Stunde leicht schüttelnd bei
Raumtemperatur inkubiert und danach 5 Mal mit 300µl der im Testkit enthaltenen
Waschlösung gewaschen. Nach Zugabe von 200µl Konjugat als Zweitantikörper wurde für
eine weitere Stunde inkubiert und erneut 5 Mal gewaschen. Nach der Zugabe von 200µl
Substratlösung wurde die Platte 30 min im Dunkeln leicht schüttelnd inkubiert. Abschließend
wurde die optische Dichte als Maß für die Reaktion mittels Photometer bei einer Wellenlänge
von 405nm gegen eine Referenzwellenlänge von 492nm abgelesen.
Zur Auswertung wurde zunächst die gemessene optische Dichte der unbeschichteten Platten
von der der korrespondierenden beschichteten Platte subtrahiert. Die mittlere optische Dichte
der Negativkontrollen sollte unter 0,200 liegen, die der Positivkontrolle über 1,000. Seren
wurden als positiv gewertet, wenn die optische Dichte um mindestens 0,300 größer war als
der Mittelwert der Negativkontrollen.
2.3.7
Computerprogramme und Statistik
Zur Erstellung dieser Arbeit wurden die in Tab. 5 aufgelisteten Computerprogramme
verwendet.
Tab. 5: Computerprogramme, die im Rahmen dieser Arbeit angewandt wurden.
Programm
Anwendung
Microsoft Access
Datenverwaltung
CellQuest
Messung und Auswertung der durchflusszytometrischen Daten
Microsoft Excel
Datenverarbeitung
Graphpad Prism
Grafik und Statistik
Microsoft Word
Textverarbeitung
Resultate 35
3 RESULTATE
3.1 Etablierung einer Methode zur Herstellung von Virusantigen
Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung war kein käufliches HHV-8-Antigen erhältlich, das
für die in dieser Arbeit verwendete T-Zellstimulation im Vollblut zur Messung von HHV-8spezifischen CD4 bzw. CD8 T-Zellen geeignet gewesen wäre. Um eine Methode für die
Herstellung eines geeigneten HHV-8-Antigens zu etablieren, wurden anhand bekannter
CMV-Antigene einige Vorversuche durchgeführt, in denen die Möglichkeit einer
Virusantigenherstellung aus viruspositiven Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Dazu
wurde eine mit dem für das CMV-Antigen pp65 kodierenden Gen transfizierte embryonale
Nierenzelllinie (293) verwendet, aus der ein Antigenlysat zur Stimulation von T-Zellen
bereitet wurde, das bei bekannt CMV-positiven Individuen auf seine Eignung als Stimulus
untersucht wurde.
3.1.1
Kontrolle der pp65-Expression mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie
und Durchflusszytometrie
Um die Expression des pp65-Proteins in der 293 pp65-Zelllinie zu überprüfen, wurde eine
intrazelluläre indirekte Immunfluoreszenzfärbung der transfizierten wie auch der nichttransfizierten Zellen zur Kontrolle durchgeführt. Dazu wurden die Zellen nach der
Permeabilisierung mit Saponin jeweils in drei Subproben unterteilt, von denen nur eine mit
einem gegen pp65 gerichteten Mausantikörper versetzt wurde und zwei zur Kontrolle ohne
Erstantikörper blieben. Die Bindung der Antikörper an das pp65-Peptid wurde dann indirekt
mittels eines zweiten gegen Maus-IgG gerichteten FITC-konjugierten Ziegenantikörpers im
Immunfluoreszenzmikroskop bzw. im Durchflusszytometer sichtbar gemacht. Eine der
Kontrollproben ohne Erstantikörper wurde zur Kontrolle auch ohne Zweitantikörper belassen.
Zuvor war die Expressionskontrolle mit Triton-X-100 zur Permeabilisierung und
verschiedenen fluorochrom-konjugierten Anti-Maus-Antikörpern (Cy3- und PE-konjugiert)
durchgeführt worden. Die beste Darstellung der Expression gelang jedoch nach
Permeabilisierung mit Saponinpuffer und Färbung mit einem FITC-konjugierten Ziege-antiMaus-Antikörper. Die Zugabe von Ziegennormalserum zur Sättigung unspezifischer
Resultate 36
Bindungsstellen
konnte
keine
zusätzliche
Verbesserung
dieses
indirekten
Immunfluoreszenztests bewirken.
Sowohl
bei
der
Betrachtung
im
Immunfluoreszenzmikroskop
wie
auch
in
der
durchflusszytometrischen Analyse bestätigte sich eindeutig die Expression des pp65-Peptids
bei den mit Erst- und Zweitantikörper versetzten pp65-transfizierten Zellen anhand einer
Fluoreszenz im Wellenlängenbereich der verwendeten Fluorochrome (Abb.1). Diese war am
deutlichsten bei der Permeabilisierung mit Saponinpuffer und der Färbung mit FITCkonjugiertem Zweitantikörper im Durchflusszytometer abgrenzbar. Keine der Kontrollproben
hingegen wies diese spezifische Fluoreszenz auf.
293
293pp65
Abb. 1: pp65-Expressionskontrolle. 293pp65-Transfektanten (rechts) sowie Kontrolltransfektanten 293 (links)
wurden auf die intrazelluläre Expression im Durchflusszytometer analysiert. Gezeigt ist die Fluoreszenzintensität
des spezifischen Antikörpers für pp65 Transfektanten im Vergleich zu Kontrollen.
3.1.2
Proteinkonzentrationsbestimmung der 293-/293pp65-Lysate
Um bei der späteren T-Zellstimulation mittels der hergestellten Lysate eine unterschiedliche
Proteinkonzentration als Fehlerquelle auszuschließen, wurden die gewonnenen Antigene
anhand
ihrer
Proteinkonzentration
aufeinander
abgestimmt.
Dazu
wurde
eine
Proteinkonzentrationsbestimmung der Zelllysate durchgeführt. Obwohl gleiche Zellzahlen
eingesetzt worden waren, betrug die Proteinkonzentration des 293pp65-Lysats nach der
Lysatherstellung das Vierfache der bei dem 293-Lysat gemessenen Konzentration. Vor der
Resultate 37
Aliquotierung wurde das 293pp65-Zelllysat durch Verdünnung mit 0,5M Glycinpuffer der
Konzentration des 293-Lysats angepasst.
3.1.3
Ausschluss einer unspezifischen Stimulation durch Glycinpuffer
Vor der Durchführung der T-Zellstimulation im Vollblut mit Virusantigen wurde zunächst
überprüft, ob der zur Virusantigenherstellung verwendete Glycinpuffer selbst zu einer
Aktivierung von T-Zellen und deren Produktion von Zytokinen führen kann. Dazu wurden
450µl heparinisierten Vollbluts einer gesunden Kontrollperson mit 0,5M Glycinpuffer in den
Konzentrationen 8, 16, 32 und 64µl/ml Vollblut auf eine T-Zellstimulierung mit
Hochregulierung von CD69 und IFN-γ-Produktion im Durchflusszytometer untersucht. Als
Positivkontrolle diente eine Stimulation mit dem polyklonalen Stimulus Staphylococcus
aureus Enterotoxin B, einem Superantigen, das bei Immungesunden mit hoher Potenz eine TZellreaktion hervorruft. Es wirkt über Bindung an antigenpräsentierende MHC-Moleküle der
CD4 Glycin
A
CD4 SEB
B
CD8 Glycin
C
CD8 SEB
D
Abb. 2: Ausschluss einer T-Zellstimulation durch Glycin. A und B zeigen das Messergebnis nach der
Stimulation von CD4 und CD8 T-Zellen mit 32µl/ml Glycin. Im Gegensatz zu der mit SEB stimulierten Probe
(B und D) fanden sich keine spezifischen reaktiven Zellen mit IFN-γ-Produktion bei Hochregulierung von CD69
(oberer rechter Quadrant).
Resultate 38
Klasse II und an einen T-Zell-Rezeptor außerhalb der normalen Antigenbindungsstelle und
stimuliert dadurch unspezifisch eine ungleich größere Anzahl an T-Zellen als ein übliches
Antigen. Zusätzlich wurde noch eine Stimulation mit SEB unter Zugabe von Glycin in den
oben genannten Konzentrationen durchgeführt, um zu überprüfen, ob sich die T-Zellreaktion
durch Zugabe von Glycin verändert. Keine der ausschließlich mit Glycinpuffer stimulierten
Proben zeigte eine Hochregulation von CD69 oder eine Zytokinproduktion (Abb. 2, A und C).
Im Gegensatz dazu reagierten in der Positivkontrolle mit SEB 10,08% der CD4 (Abb. 2 B)
und 9,27% der CD8-Zellen mit IFN-γ-Bildung (Abb. 2 D), was sich auch durch Zugabe von
Glycin in keiner der Konzentrationen signifikant änderte (Daten nicht gezeigt). Der
Glycinpuffer wurde somit als möglicher unspezifischer Stimulus oder Störfaktor einer
Stimulation ausgeschlossen.
3.1.4
Die
Eignung des 293pp65-Lysats zur HCMV-spezifischen T-Zellstimulation
Überprüfung
der
Eignung
des
293pp65-Lysats
zur
Quantifizierung
pp65-
antigenspezifischer T-Zellen erfolgte anhand eines Vollblutassays, mit dessen Hilfe
antigenspezifische Zellen durchflusszytometrisch nachgewiesen werden können. Jeweils
450µl heparinisiertes Vollblut dreier Individuen mit bekanntem positivem CMV-Status und
dem HLA-Typus HLA-0201 und einer CMV-negativen Kontrollperson wurden in
Anwesenheit der costimulatorisch wirkenden Antikörper αCD28 und αCD49d mit dem
Antigenlysat aus 293pp65 in den Konzentrationen 16, 32, 64 und 128 µl/ml Vollblut
stimuliert. Als Negativkontrollen wurden Proben in den gleichen Konzentrationen mit dem
Lysat nicht-transfizierter 293-Zellen stimuliert und eine Leerprobe ohne Stimulus belassen.
Als Positivkontrolle wurde eine Stimulation mit dem HLA-0201-bindenden rekombinanten
HCMV-Peptid pp65 durchgeführt. Während der Stimulationszeit von 6 Stunden wurden dabei
die zugeführten Antigene von antigenpräsentierenden Zellen endosomal prozessiert und an
MHC-Klasse-II-Moleküle, zu einem geringen Anteil auch MHC-Klasse-I-Moleküle,
gebunden CD4- und CD8 T-Zellen präsentiert. CMV-antigenspezifische CD4 bzw. CD8-TZellen werden daraufhin durch das erkannte Antigen aktiviert und zur Produktion von
inflammatorischen Zytokinen wie IFN-γ und TNF-α stimuliert. Bei der in dieser
Vollblutstimulation angewandten Färbung wurden CD4, CD8 und CD69 an der
Zelloberfläche und IFN-γ intrazellulär im Durchflusszytometer gemessen.
Resultate 39
Anhand dieses Versuchs konnte nachgewiesen werden, dass das mittels Glycin hergestellte
293pp65-Lysat als Stimulus für eine für das HCMV-Antigen pp65 spezifische CD4 und CD8
T-Zellreaktion geeignet ist. Zwei der drei CMV-positiven Probanden zeigten bei allen
eingesetzten Antigenkonzentrationen des 293pp65-Lysats eine Hochregulierung von CD69
und Produktion von IFN-γ der CD4 T-Zellen. Abb. 3 zeigt anhand eines Beispielprobanden
Ergebnisse wie sie nach Stimulation mit 293-, 293pp65-Lysat und HLA-0201-bindendem
pp65-Peptid im Durchflusszytometer gemessen wurden. Auf die Positivkontrolle mit dem
HLA-0201-bindenden Peptid pp65, das lediglich über den MHC-Klasse-I-Weg präsentiert
werden kann, zeigte jeder der Probanden eine antigenspezifische CD8 T-Zellreaktion. Im
Stimulationsansatz mit 293-Lysat wie auch in der Leerprobe ohne Stimulus trat bei keinem
der Probanden eine spezifische Reaktion auf. Ebenso wenig konnte bei dem CMV-negativen
Probanden eine spezifische T-Zellreaktion gemessen werden (nicht gezeigt). Eine CD8
Antwort war auf den Stimulus mit dem Zelllysat bei keinem der Probanden messbar, was zum
A
293
B
293pp65
C
pp65
CD4
D
E
F
CD8
Abb. 3: T-Zellstimulation einer CMV-positiven Person mit 293pp65-Lysat. Weder CD4 noch CD8 Zellen
reagierten auf das Lysat aus nicht transfizierten 293-Zellen (A und D), während auf den Stimulus mit dem Lysat
aus pp65-transfizierten 293-Zellen CD4 T-Zellen CD69 hochregulierten und IFN-γ produzierten (B), nicht jedoch
CD8 Zellen (E). Das über den MHC-Klasse-I-Komplex präsentierte HLA-0201-bindende pp65-Peptid stimulierte
CD8 Zellen des Probanden zu einer spezifischen Reaktion (F), erwartungsgemäß aber nicht die CD4 Zellen (C).
Resultate 40
einen mit der Stimulation durch nur ein einziges Peptid, zum anderen mit der allgemein
geringeren Reaktion von CD8 T-Zellen auf CMV-Antigen bis unter die Detektionsgrenze zu
erklären ist (SESTER et al., 2001).
Damit konnte nachgewiesen werden, dass mit Hilfe der oben beschriebenen Methode zur
Lysatherstellung aus viruspositiven Zelllinien ein zur T-Zellstimulation mittels Vollblutassay
geeignetes virusspezifisches Antigen gewonnen werden kann.
3.2 HHV-8 spezifische T-Zellmessung
Nach dem Nachweis der Eignung eines mittels Glycinextraktion hergestellten Zelllysats zur
Stimulation von T-Zellen galt es, diese Methode auf HHV-8 positive Zellen anzuwenden. Im
Gegensatz zu den 293pp65-Zellen konnte bei den HHV-8 positiven BC-BL-1-Zellen jedoch
keine Expressionskontrolle der Antigene mittels indirekter Immunfluoreszenz durchgeführt
werden, da zu dem Zeitpunkt der Versuchsdurchführung keine monoklonalen, gegen HHV-8Antigen gerichteten Antikörper käuflich erhältlich waren. Die HHV-8-Positivität dieser
Zelllinie ist jedoch durch zahlreiche Untersuchungen gesichert (RENNE et al., 1996).
Eine weitere Schwierigkeit bestand darin, dass es keinen Goldstandard gibt, anhand dessen
eine ideale Antigenkonzentration zur Stimulation HHV-8 spezifischer T-Zellen hätte
bestimmt werden können. Bislang ist keine zuverlässige routinetaugliche Methode entwickelt
worden, die als Referenz hätte dienen können. Zum anderen mangelte es an einer sicheren
Negativkontrolle. In dieser Arbeit wurde als Negativkontrolle ein Lysat aus einer HHV-8und EBV-negativen B-Zelllinie BJAB gewählt, da diese, aus einem B-Zelllymphom
stammend, große Ähnlichkeit mit den Zellen aus dem HHV-8-positiven body cavity-based
lymphoma aufweist. Damit sollten Reaktionen gegen andere Oberflächenantigene der
Lymphomzellen erfasst werden, die fälschlicherweise als Reaktionen gegen HHV-8-Antigene
in den Zellen ausgelegt hätten werden können.
Das BC-BL-1-Lysat als HHV-8-Antigen und das BJAB-Lysat als Kontrollantigen wurden
freundlicherweise von der Abteilung für Virologie des Universitätsklinikums Homburg zur
Verfügung gestellt.
Resultate 41
3.2.1
HHV-8-spezifische Zellen sind durchflusszytometrisch nachweisbar
Zunächst wurden Blutproben von Probanden aus verschiedenen Risikogruppen im
Vollblutassay auf eine HHV-8-spezifische Reaktion bei einer Antigenkonzentration von
32µl/ml Vollblut getestet, bis Proben gefunden wurden, bei denen eine Hochregulierung von
CD69 und eine IFN-γ-Produktion nach Stimulus mit HHV-8-Antigen, jedoch nicht mit
Kontrollantigen, im Durchflusszytometer gemessen werden konnte. Es wurden solche Proben
als positiv gewertet, die nach Abzug der bei der Kontrollstimulation gemessenen Frequenz
CD69 positiver, IFN-γ-produzierender CD4 oder CD8 Zellen von der bei der HHV-8Stimulation gemessenen Frequenz einen Anteil von mehr als 0,05% IFN-γ-produzierender
CD4 oder CD8 T-Zellen an der Gesamtpopulation aufweisen konnten. Als Positivkontrolle
diente wie im Vorversuch SEB.
Um die für diese Methode ideale Konzentration an HHV-8-Antigen zu ermitteln, bei der noch
eine spezifische Reaktion messbar war, jedoch nicht die Gefahr einer unspezifischen
Überstimulation bestand, wurde eine Titrationsreihe durchgeführt. Dazu wurden drei der bis
dahin getesteten Proben mit messbarer T-zellulärer Immunantwort und eine Probe, die zuvor
keine HHV-8 spezifische T-Zellreaktion gezeigt hatte, mit HHV-8-Antigen und mit
Kontrollantigen in den Konzentrationen 8, 16, 32, 64 und 128µl/ml Vollblut stimuliert. Von
jeder Blutprobe wurde zusätzlich eine Leerprobe ohne Agens gemessen. Dabei zeigte sich,
dass die bereits zuvor eingesetzte Konzentration von 32µl/ml Vollblut für die Messung der
HHV-8-spezifischen T-Zellreaktion im Durchflusszytometer am besten geeignet ist. Die bei
der Titration verwendeten Kontrollproben ohne Agens bzw. mit Kontrollantigen zeigten bei
Konzentrationen bis zu 64µl/ml keine Reaktion im Sinne einer Hochregulierung von CD69
und einer Zytokinproduktion (Daten nicht gezeigt). Bei einer Konzentration von 128µl/ml
wurden jedoch auch Zeichen einer unspezifischen Reaktion bei einer Kontrollperson
beobachtet. Alle weiteren Versuche wurden deswegen mit einer Antigenkonzentration von
32µl/ml fortgeführt, da diese Konzentration noch ausreichend war, eine antigenspezifische
Antwort hervorzurufen, jedoch niedrig genug gewählt war, um mögliche Unspezifitäten zu
vermeiden. Abb. 4 zeigt charakteristische Punktwolken, wie sie nach der Stimulation eines
Probanden mit Kontrollantigen (links) und HHV-8-Antigen (rechts) durch Messung im
Durchflusszytometer dargestellt werden. Während einer Messung wurden sowohl CD4 wie
auch
CD8
T-Zellen
erfasst
und
jeweils
bezüglich
ihres
Aktivierungszustandes
(Hochregulierung von CD69, oberer linker Quadrant) und der IFN-γ-Produktion analysiert.
Resultate 42
Kontrollantigen
A
HHV-8-Antigen
B
CD4
C
D
CD8
Abb. 4: HHV-8-T-Zellstimulation. Links abgebildet ist die Stimulation eines Probanden mit Kontrollantigen,
rechts mit HHV-8-Antigen. Im rechten oberen Quadranten der HHV-8-Stimulationen B und D zeigen sich CD69
positive IFN-γ-produzierende HHV-8-spezifische CD4 bzw. CD8 Zellen.
Die Punkte, die im oberen rechten Quadranten zu liegen kommen, stehen für CD69 positive
IFN-γ-produzierende CD4 (A und B) bzw. CD8 (C und D) Zellen.
Abb. 5 zeigt die Frequenzverteilung HHV-8-antigenspezifischer CD4 und CD8 T-Zellen
oberhalb der Detektionsgrenze von 0,05% CD69 hochregulierender, zytokinproduzierender TZellen bei den untersuchten Kollektiven. Die mittleren Frequenzen reagibler T-Zellen zeigten
keinen signifikanten Unterschied zwischen den untersuchten Gruppen.
CD4
3
CD8
2
1
se
p
llg
ru
H
äm
od
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rt
e
H
IV
-I
nf
iz
ier
te
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
pp
e
Frequenz HHV-8 spezifischer T Zellen in %
Resultate 43
Abb. 5: Frequenzverteilung HHV-8-antigenspezifischer T-Zellen. Dargestellt ist die Frequenzverteilung HHV8-antigenspezifischer CD4 und CD8 Zellen oberhalb der Detektionsgrenze von 0,05% innerhalb der untersuchten
Gruppen. Die Unterschiede der mittleren Frequenzen (Querstrich) zwischen den Gruppen, Kontrollgruppe (grün),
Hämodialysepatienten (blau), Organtransplantierte (rot) und HIV-Infizierte (schwarz), waren nicht signifikant
(One-way ANOVA : p>0,05).
3.2.2
Vergleich antigenspezifischer CD8 T-Zellfrequenzen: Kontrollantigen vs. HHV8-Antigen
Bei einem Teil der Probanden, bei denen eine zelluläre Immunantwort auf das HHV-8Antigen messbar war, reagierte ein geringer Prozentsatz an T-Zellen auch auf das
Kontrollantigen mit einer Frequenz über dem Detektionslimit. Nach Subtraktion dieser bei
dem Kontrollantigen gemessenen Frequenz von der Frequenz, die nach Stimulation der
gleichen Probe mit HHV-8-Antigen gemessen wurde, wurden bei einer Differenz über dem
Detektionslimit von ≥0,05% reaktiver Zellen auch solche Proben als positiv gewertet, bei
denen eine solche geringgradige Mitreaktion der Kontrollen auftauchte.
In Abb. 6 ist exemplarisch an HHV-8-reaktiven CD8 Zellen die mittlere gemessene Frequenz
auf Stimulus mit HHV-8-Antigen im Vergleich zu der auf das Kontrollantigen hin
gemessenen Frequenz dargestellt.
Resultate 44
Im Falle der als positiv gewerteten Proben lag die mittlere Frequenz antigenreaktiver CD8 TZellen auf das Kontrollantigen mit 0,12% zwar über der Detektionsgrenze (gestrichelte Linie),
jedoch weit unter der mittleren Frequenz HHV-8-antigenreaktiver CD8 T-Zellen von 0,31%
(Abb. 6 A). Im Gegensatz dazu befand sich die mittlere Frequenz der als negativ gewerteten
Proben sowohl in der Kontrollstimulation wie auch in der HHV-8-Stimulation mit 0,02%
unter der Detektionsgrenze (Abb. 6 B) Die Messung von antigenreaktiven T-Zellen in der
Kontrolle könnte ein Hinweis auf eine Kreuzreaktivität bestimmter Antigene der BZelllymphomzellen BJAB mit HHV-8-Antigenen sein oder aber mit einer unspezifischen
Hochregulierung der Zytokinproduktion von CD8 Zellen bei einigen der Probanden
zusammenhängen. Dieses Phänomen der unspezifischen IFN-γ-Produktion bei CD8 Zellen
war in unserer Arbeitsgruppe auch schon bei der Untersuchung von CMV-Kontroll-Antigen,
aber auch als antigenunabhängiger Effekt aufgefallen.
Um jedoch eventuelle Proteinkonzentrationsunterschiede bei den verwendeten Antigenlysaten
als Ursache für die Messung von antigenspezifischen T-Zellen oberhalb des Detektionslimits
in
der
A
Stimulation
mit
Kontrollantigen
Frequenz HHV-8-spezifischer CD8 Zellen ≥ 0,05%
B
wurde
eine
Frequenz HHV-8-spezifischer CD8 Zellen < 0,05%
0.50
Frequenz antigenspezifischer T-Zellen (%)
Frequenz antigenspezifischer T-Zellen (%)
0.50
auszuschließen,
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Kontrolle
HHV8
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Kontrolle
HHV-8
Abb. 6 Vergleich mittlerer Frequenzen antigenspezifischer CD8 T-Zellen. A: Die mittlere Frequenz
antigenspezifischer CD8 T-Zellen bei HHV-8-positiven Probanden lag nach Stimulation mit Kontrollantigen
mit 0,12% (SEM: 0,04) über der Detektionsgrenze (0,05%), jedoch signifikant (Mann-Whitney-Test:
p<0,0001) unter der mittleren auf HHV-8-Antigen gemessenen Frequenz (0,31%, SEM: 0,07). B: In der
Gruppe der als HHV-8-negativ gewerteten Probanden lag die mittlere Frequenz antigenspezifischer CD8 TZellen sowohl in der Kontroll- wie auch in der HHV-8-Stimulation mit 0,02% (SEM: 0,004 und 0,003)
unterhalb des Detektionslimits ohne signifikanten Unterschied zwischen den eingesetzten Antigenen.
Resultate 45
Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford durchgeführt. Dabei zeigte sich eine doppelt
so hohe Proteinkonzentration im Kontrolllysat gegenüber dem HHV-8-Antigenlysat, so dass
die auf den Kontrollstimulus hin gemessenen Frequenzen eventuell auf die im Kontrolllysat
höhere Proteinkonzentration zurückführbar sein könnten. Zudem ist dieser Befund als
weiterer Hinweis dafür zu werten, dass die auf das HHV-8-Antigenlysat gemessenen
reaktiven T-Zellen tatsächlich antigenspezifisch sind, da selbst eine geringere Konzentration
als die des Kontrollantigens vor allem in den untersuchten Risikogruppen eine T-Zellreaktion
hervorzurufen vermochte.
3.2.3
In Risiko- und Kontrollgruppen überwiegt die messbare CD8 Immunantwort
gegenüber der CD4 Antwort
Nachdem gezeigt wurde, dass mittels des oben beschriebenen Vollblutassays HHV-8spezifische T-Zellen durchflusszytometrisch gemessen werden können, wurde die Methode
bei verschiedenen Risikogruppen und bei Kontrollpersonen zur individuellen Bestimmung der
zellulären Immunantwort und zur epidemiologischen Analyse angewandt. Insgesamt wurden
129 immunkompetente Individuen als Kontrollgruppe, 70 Patienten mit terminaler
Niereninsuffizienz unter Hämodialyse, 68 Organtransplantierte und 72 HIV-infizierte
Personen auf ihre zelluläre Immunantwort gegen HHV-8 untersucht. Tab. 5 zeigt die
Häufigkeiten, mit denen HHV-8-spezifische CD4 und CD8 T-Zellreaktionen bei
immunkompetenten
Kontrollpersonen
und
immungeschwächten
Individuen
Tab. 5: Häufigkeiten HHV-8-spezifischer T-Zellantworten. CD8 T-Zellreaktionen zeigten sich bei
Kontrollpersonen und immundefizienten Risikopersonen (Hämodialysepatienten, Organtransplantierte, HIVPositive) häufiger als CD4 T-Zellreaktionen.
Frequenz HHV-8spezifischer TZellen
Kontrollen
(129)
HämodialysePatienten
Organtransplantierte
HIV-Infizierte
(68)
(72)
(70)
CD4 ≥ 0,05 %
4,7 % (6)
14,3 % (10)
10,3 % (7)
15,3 % (11)
CD4 < 0,05 %
95,3 % (123)
85,7 % (60)
89,7 % (61)
84,7 % (61)
CD8 ≥ 0,05 %
11,6 % (15)
37,1 % (26)
17,6 % (12)
19,4 % (14)
CD8 < 0,05 %
88,4 % (114)
62,9 % (44)
82,4 % (56)
80,6 % (58)
Resultate 46
(Hämodialysepatienten, Organtransplantierte, HIV-Infizierte) auftraten.
In allen untersuchten Populationen fanden sich HHV-8-spezifische CD8 T-Zellreaktionen
häufiger als solche CD4 positiver Zellen. Unter den an einem urämischen Immundefekt
leidenden Hämodialysepatienten wurde eine zelluläre Immunantwort mit einem Anteil von
über 0,05% IFN-γ-produzierender CD8-T-Zellen bei 37,1% der Probanden gegenüber 11,6%
bei den Kontrollpersonen, 17,6% bei den Organtransplantierten und 19,4% bei den HIVInfizierten am häufigsten beobachtet.
Die interindividuelle Varianz der über der Detektionsgrenze von 0,05% antigenspezifischer TZellen gemessenen CD4 und CD8 zellulären Immunantworten ist bereits in Abb. 5 dargestellt.
Sie reichte bei Kontrollpersonen von 0,07%-0,26% (Median: 0,14%) HHV-8-reaktiver CD4
Zellen und von 0,05%-1,24% (0,19%) CD8 Zellen, bei Hämodialysepatienten von 0,05%0,63% (0,09%) für CD4 und von 0,05%-2,1% (0,12%) für CD8, bei Organtransplantierten
von 0,05%-0,14% (0,08%) für CD4 und von 0,06%-0,92% (0,15%) für CD8 und bei HIVInfizierten von 0,06%-2,06% (0,29%) für CD4 und von 0,06%-0,64% (0,15%) für CD8. Die
mittlere Frequenz sowohl CD4-positiver wie auch CD8-positiver HHV-8-reaktiver Zellen
unterschied sich nicht signifikant zwischen den verschiedenen Gruppen. Ebenso wenig
unterschieden sich die Frequenzen HHV-8-positiver CD4 Zellen innerhalb einer untersuchten
Gruppe signifikant von der CD8-Frequenz.
3.2.4
HHV-8-spezifische CD8-T-Zellen produzieren TNF-α
Im folgenden wurden 8 Hämodialysepatienten, die eine HHV-8-spezifische CD8 zelluläre
Immunantwort mit Hochregulierung von CD69 und Produktion von IFN-γ aufgewiesen
hatten, auf die Bildung zweier weiterer Zytokine, IL-4 und TNF-α, als Folge der Induktion
durch HHV-8 untersucht. Dazu wurde wie zuvor eine Stimulation im Vollblut durchgeführt.
Die intrazelluläre Zytokinfärbung erfolgte jedoch mittels der Antikörper IL-4-PE und TNF-αFITC.
In Abb. 7 ist exemplarisch eine charakteristische Punktwolke TNF-α-produzierender T-Zellen
im Vergleich mit IFN-γ-produzierenden T-Zellen gezeigt, wie sie sich nach Messung im
Durchflusszytometer darstellten. Keiner der Probanden konnte eine antigenspezifische
Produktion von IL-4 durch CD4 oder CD8 T-Zellen auf die HHV-8-Stimulation hin
aufweisen (Daten nicht gezeigt). Dahingegen traten bei 7 der 8 IFN-γ-produzierenden
Probanden auch HHV-8-spezifische TNF-α-produzierende CD8 Zellen auf, deren Frequenzen
Resultate 47
Kontrollantigen
HHV-8-Antigen
A
B
C
D
Abb. 7: TNF-α- und IFN-γ-bildende CD8 T-Zellen im Vergleich. Anhand eines Beispielprobanden (Proband
1 aus Abb. 8) ist eine im Durchflusszytometer gemessene HHV-8-spezifische T-Zellantwort mit der
Produktion unterschiedlicher Zytokine gezeigt. CD8 T-Zellen dieses Probanden produzierten sowohl IFN-γ
(D, oberer rechter Quadrant), wie auch TNF-α (B, unterer rechter Quadrant). Eine antigenspezifische IL-4Produktion ist hingegen nicht messbar gewesen (B, oberer linker Quadrant). Die in den Kontrollen A und C im
rechten oberen Quadranten linear angesiedelten Punktwolken wurden als Messungsartefakt nicht in die
Auswertung mit einbezogen.
nach Subtraktion der Kontrollstimulation mit 0,17%-2,08% über der Detektionsgrenze
(0,05%) lagen. Abb. 8 zeigt lediglich einen Probanden, der bereits in der vorausgegangenen
Messung mit 0,10% eine relativ geringe Zahl an HHV-8-spezifischen IFN-γ-produzierenden
CD8 T-Zellen aufwies, ohne TNF-α-Produktion. Zudem zeigt sich in dieser Abbildung ein
Resultate 48
Überwiegen der Frequenz TNF-α-produzierender Zellen gegenüber IFN-γ-produzierender
Zellen bei einer Mehrzahl der Probanden. Beim direkten Vergleich beider Zytokine zeigte
sich eine signifikante Korrelation in der Frequenz reaktiver T Zellen. Dieser lineare
Zusammenhang der TNF-α-Produktion mit der IFN-γ-Produktion ist in Abb. 9 dargestellt.
CD4 Zellen jedoch zeigten keine HHV-8-spezifische Produktion von TNF-α (Daten nicht
α produzierender CD8 Zellen
Frequenz IFN- γ bzw.TNF-α
gezeigt).
CD8 IFNg
2.00
CD8 TNFa
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0,05
0.00
1
2
3
4
Probanden
5
6
7
8
Abb. 8: Frequenz IFN-γ- respektive TNF-α-produzierender CD8 Zellen. Bei 5 der 7 Probanden mit messbarer
TNF-α-Produktion als Zeichen einer Induktion HHV-8-spezifischer CD8 T-Zellen überwog die Frequenz TNFα-produzierender Zellen gegenüber der IFN-γ-Produktion.Nur einer der Probanden mit der geringsten Frequenz
HHV-8-spezifischer IFN-γ-produzierender Zellen wies keine TNF-α-Produktion durch CD8 T-Zellen auf
(Proband 8).
α -produzierender CD8 (%)
Frequenz TNF-α
Resultate 49
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Frequenz IFN-γγ -produzierender CD8 (%)
Abb. 9: Zusammenhang der TNF-α-Produktion mit der IFN-γ-Produktion. Es besteht ein linearer
Zusammenhang der TNF-α-Produktion mit der IFN-γ-Produktion. Die Frequenzhöhe IFN-γ-produzierender
CD8 T-Zellen auf HHV-8-Stimulus korreliert signifikant (r=0,857, p=0,011, Korrelation nach Spearman) mit
der Frequenz TNF-α-produzierender CD8 positiven T-Zellen.
3.3 Korrelation der HHV-8 spezifischen zellulären mit der humoralen
Immunantwort
Um eine vergleichende Aussage über die im Vollblutassay gemessene HHV-8-spezifische TZellantwort mit der im Routinelabor bislang gebräuchlichen Methode der serologischen
Antikörperbestimmung machen zu können, wurde von allen Proben ein indirekter
Immunfluoreszenztest zur Evaluierung der
humoralen
Immunantwort
auf HHV-8
durchgeführt. Aus den verschiedenen bislang entwickelten Nachweismethoden für HHV-8spezifische Antikörper wurde ein indirekter Immunfluoreszenztest, der eine durch TPA zur
Lyse induzierte HHV-8-positive B-Zelllinie BC-BL-1 als Antigen verwendet, für diese Arbeit
ausgewählt, da dieser in bisherigen Untersuchungen die höchsten Seroprävalenzen
nachweisen konnte. Dieser Vergleichstest war nötig, um eine eventuell noch höhere
Durchseuchung mit HHV-8 mittels Messung spezifischer T-Zellen nachweisen zu können.
Zur serologischen Bestimmung wurden zur besseren Vergleichbarkeit Plasmen desselben
Entnahmedatums wie dem der zur Vollblutanalyse verwendeten Blutproben eingesetzt. Diese
Proben wurden bis zur Versuchsdurchführung bei -20° gelagert. Die Durchführung erfolgte in
Resultate 50
Positivkontolle
Positivkontolle
Negative Probe
Abb.
10:
Immunfluoreszenzaufnahmen
Positive Probe
positiver
und
negativer
Proben
im
indirekten
Immunfluoreszenzassay. Die Positivkontrolle (oben links und oben rechts stärker vergrößert) wie auch die als
positiv gewertete Probe eines HIV-Patienten (unten rechts) zeigen die typische Verteilung der
fluoreszenzmarkierten Antikörper sowohl am Zellkern wie auch im Cytoplasma im Vergleich zu einer negativen
Probe (unten links). Als Positivkontrolle diente ein Serum eines HIV-positiven Patienten, das in Vorversuchen
eindeutige Positivreaktionen gezeigt hatte.
den Plasmaverdünnungen 1:16 und 1:64, wobei solche Proben als positiv gewertet wurden,
die bei einer Verdünnung von 1:16 eine spezifische Fluoreszenz aufwiesen (RABKIN et al.,
1998; GÄRTNER et al., 2003).
Resultate 51
Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung wurde jeweils von einer zweiten Person
unabhängig kontrolliert und im Falle einer nicht übereinstimmenden Auswertung der
Immunfluoreszenztest wiederholt. Abb. 10 zeigt ein typisches Muster, wie es sich bei der
Betrachtung
einer
Probe
Immunfluoreszenzmikroskop
mit
darstellt.
FITC-gefärbten
Einige
Proben
HHV-8-Antikörpern
konnten
jedoch
auch
im
nach
Versuchswiederholung nicht eindeutig als positiv oder negativ bewertet werden und sind im
Folgenden als nicht bestimmbar bezeichnet. Dazu gehörten zum einen solche Proben, deren
Fluoreszenz entweder sehr schwach oder übermäßig stark ausgebildet war, zum anderen
Proben mit einer diffusen Zytoplasmafluoreszenz in allen Zellen.
Die HHV-8-Prävalenzen, die sich nach der Bestimmung HHV-8-spezifischer Antikörper bei
den Probanden der verschiedenen Risikogruppen und der Kontrollgruppe ergaben, bestätigten
Tab. 6 : Vergleich der humoralen Immunantwort mit der CD8 zellulären Immunantwort auf HHV-8.
Frequenzen HHV-8-spezifischer CD8 T-Zellen (Detektionslimit 0,05%) bei Kontrollpersonen (n=129),
Hämodialysepatienten (n=70), Organtransplantierten (n=68) und HIV-Infizierten (n=72) in Vergleich mit ihrem
serologischen Status. Die Mehrzahl der Individuen aller vier Gruppen war in beiden Tests negativ. Abhängig von
den verschiedenen immundefizienten Gruppen gab es einige Probanden, die entweder seropositiv im
Immunfluoreszenztest waren oder eine HHV-8-spezifische T-zelluläre Immunreaktivität zeigten. Allen Gruppen
war gemein, dass CD8 T-Zellantworten und Antikörperbildung selten gleichzeitig bei einem Probanden auftraten.
Gesamt
Seropositiv
Seronegativ
Nicht bestimmbar
129
3,9% (5)
94,6% (122)
1,6 (2)
≥ 0.05 %
11,6% (15)
0,8% (1)
10,9 % (14)
—
< 0.05 %
88,4% (114)
3,1% (4)
83,7% (108)
1,6 (2)
70
14,3% (10)
85,7% (60)
—
≥ 0.05 %
37,1% (26)
5,7% (4)
31,4% (22)
—
< 0.05 %
62,9% (44)
8,6% (6)
54,3% (38)
—
68
22,1% (15)
72,1% (49)
5,9 (4)
≥ 0.05 %
17,6% (12)
1,5% (1)
16,2% (11)
—
< 0.05 %
82,4% (56)
20,6% (14)
55,9% (38)
5,9 (4)
72
43,1% (31)
50,0% (36)
6,9 (5)
≥ 0.05 %
19,4% (14)
11,1% (8)
6,9% (5)
1,4 (1)
< 0.05 %
80,6% (58)
31,9% (23)
43,1 %(31)
5,6 (4)
Kontrollpersonen, n
Hämodialysepatienten, n
Organtransplantierte, n
HIV-Infizierte, n
Resultate 52
weitestgehend die Ergebnisse einer anderen an der Universität Homburg dazu durchgeführten
Studie (GÄRTNER et al., 2003).
Die Seroprävalenz bei der immunkompetenten Kontrollgruppe lag mit 3,9% unter den
Prävalenzen der drei Risikogruppen. Unter Hämodialyse zeigten 14,3% der Patienten im
Vergleich zu 22,1% in der Gruppe der Organtransplantierten HHV-8-spezifische Antikörper.
Erwartungsgemäß war mit 43,1% die höchste Seroprävalenz in der HIV-positiven Population
zu finden.
Tab. 6 vergleicht den Serostatus der einzelnen Probanden innerhalb der Kontrollgruppe und
der drei Gruppen mit immundefizienten Probanden mit dem Auftreten HHV-8-spezifischer
CD8
T-Zellen.
Dabei
wird
deutlich,
dass
die
Mehrzahl
der
Probanden
im
Immunfluoreszenztest wie auch im T-Zelltest nicht auf HHV-8 reagierte, während abhängig
von der Zugehörigkeit zu den verschiedenen Risikogruppen jeweils einige in einem der Tests
positiv waren. Durch alle untersuchten Gruppen hindurch trat die humorale Immunantwort
nur selten gemeinsam mit der CD8 T-Zellantwort auf. Es ist daher zu vermuten, dass ein
Individuum unterschiedlich stark mittels Antikörperbildung und mit Hilfe der zellulären
Immunabwehr auf dieses Virus reagiert. Lediglich bei den HIV-Infizierten, die insgesamt eine
höhere Durchseuchung mit HHV-8 unabhängig vom Testverfahren aufwiesen, traten bei
immerhin 11,1% gleichzeitig HHV-8 spezifische Antikörper und T-Zellen auf.
3.4 Beurteilung der Evidenz für eine HHV-8-Infektion nach verschiedenen
Testverfahren
In dieser Arbeit galt es auch, die Evidenz einer HHV-8-Infektion bei immunkompetenten
Kontrollpersonen und innerhalb der genannten Risikogruppen anhand verschiedener
Testverfahren zu vergleichen und über die T-Zellantwort eventuelle Neuaussagen über die
Epidemiologie dieses Virus machen zu können. Damit ließe sich möglicherweise auch
abschätzen, ob die gerade bei Transplantierten höhere HHV-8-Prävalenz im Vergleich zu
gesunden Kontrollpersonen ihre Ursache in einer Neuinfektion oder eher in einer
Reaktivierung einer latenten, zuvor auch nicht nachweisbaren Infektion mit HHV-8 haben
könnte. Evidenz für eine HHV-8-Infektion wurde definiert als positive Reaktion in
mindestens einem Test: a) Antikörper, b) CD4 T-Zellen, c) CD8 T-Zellen.
Resultate 53
Abb. 11 stellt die nach der durchflusszytometrischen T-Zellmessung und der serologischen
Bestimmung mittels indirekter Immunfluoreszenz berechnete Evidenz für eine HHV-8Infektion im Vergleich zwischen den untersuchten Gruppen und den eingesetzten Methoden
dar.
Wie bereits in Punkt 3.2.2 beschrieben, zeigt Abb. 11 nochmals, dass in allen untersuchten
Gruppen der Prozentsatz der Probanden mit einer HHV-8-spezifischen CD8-Antwort über
dem der CD4-Antwort lag. Die T-Zellprävalenz, d.h. Existenz von HHV-8 spezifischen CD4
und/ oder CD8 T-Zellen, war bei den Hämodialysepatienten mit 42,9% am höchsten und fiel
bei den Transplantatierten vermutlich aufgrund der stärkeren T-Zellsuppression mit 21,4%
geringer aus. Dahingegen zeigten innerhalb der drei Risikogruppen Organtransplantierte und
HIV-Patienten mit ihrem vorwiegend T-zellulären Immundefekt mit jeweils 22,1% uns 43,1%
Abb.11: Evidenz für eine HHV-8-Infektion bei Analyse HHV-8-spezifischer Antikörper und/oder T-Zellen. In
allen Gruppen ist der Prozentsatz an Individuen mit messbarer HHV-8 spezifischer CD8 T-Zellantwort
verglichen mit der CD4-Antwort. Die höchste T-Zellprävalenz wurde bei Hämodialysepatienten gefunden mit
42,9% reaktiven CD4 und/oder CD8 Zellen. Im Gegensatz zur zellulären Immunantwort finden sich bei
Transplantierten (22,1%) und HIV-Infizierten (43,1%) höhere Seroprävalenzen als bei Hämodialysepatienten
(14,3%). In der Kontrollgruppe lag die T-Zellprävalenz mit 13,2% höher als die Seroprävalenz (3,9%). Die
Evidenz (Positivität in mindestens einem der Tests) ist in allen drei Risikogruppen mit Immundefekt ähnlich
hoch.
Resultate 54
eine höhere Seroprävalenz im Vergleich zu den Hämodialysepatienten (14,3%). Für die
Theorie einer Reaktivierung einer zuvor serologisch nicht messbaren latenten Infektion mit
HHV-8 durch die Immunsuppression post transplantationem spricht vor allem die höhere
mittels T-Zellmessung ermittelte HHV-8-Prävalenz (13,2%) in der immungesunden
Kontrollgruppe verglichen mit deren Seroprävalenz (3,9%), die eine höhere als bisher
angenommene HHV-8-Durchseuchung in der Normalbevölkerung vermuten lässt. Die
Evidenz für eine HHV-8-Infektion war innerhalb der drei Risikogruppen jedoch, wenn alle
Teste zur Ermittlung dieses Wertes mit herangezogen wurden, ähnlich hoch.
3.5 Serokonversion nach Organtransplantation
Nachdem die Verteilung der HHV-8-Prävalenzen in den untersuchten Gruppen mittels der TZellmessung und der Serologie bestimmt worden waren, wurde anhand einiger archivierter
Seren von HHV-8-seropositiven Transplantierten deren Serostatus im Verlauf vor und nach
Transplantation beurteilt. Von 11 organtransplantierten Probanden mit positivem HHV-8Serostatus waren Seren aus der Zeit vor Transplantation bzw. aus dem Zeitraum um die
Transplantation archiviert. Zehn dieser Probanden waren vor Transplantation seronegativ,
lediglich ein Empfänger eines Lungentransplantats wies bereits vor der Transplantation HHV8-spezifische Antikörper auf (Tab. 7). Vier weitere Nierentransplantierte, von denen keine
Seren vom Zeitpunkt vor Transplantation archiviert waren, erwiesen sich jedoch im Verlauf
nach Transplantation als dauerhaft seropositiv. Desweiteren wurden noch 5 seronegative
Transplantatempfänger auf ihren Serostatus vor Transplantation untersucht, bei denen
erwartungsgemäß auch zu jenem Zeitpunkt keine HHV-8-Antikörper im Serum nachweisbar
waren (Daten nicht gezeigt).
Resultate 55
Tab. 7: Serokonversionen bei Organtransplantierten. 10 der 11 Probanden mit positivem HHV-8-Status
nach Transplantatempfang waren vor Transplantation (Tx) negativ für HHV-8-spezifische Antikörper. Solche,
deren Serostatus im Verlauf nochmals kontrolliert wurde, blieben HHV-8-positiv.
Proband
Transplantat
Serostatus vor Tx
1. Serostatus (Zeit
2. Serostatus (Zeit
nach Tx)
nach Tx)
1
Lunge
Positiv
Positiv (12 Mon.)
Positiv (50 Mon.)
2
Lunge
Negativ
Positiv (26 d)
Positiv (36 Mon)
3
Niere
Negativ
Positiv (7 Mon.)
Positiv (45 Mon.)
4
Niere
Negativ
Positiv (75 Mon.)
Positiv (113 Mon.)
5
Niere
Negativ
Positiv (76 Mon.)
Positiv (115 Mon.)
6
Niere
Negativ
Positiv (94 Mon.)
Positiv (132 Mon.)
7
Niere
Negativ
Positiv (3 Mon.)
-
8
Niere
Negativ
Positiv (9 Mon.)
-
9
Niere
Negativ
Positiv (15 Mon.)
-
10
Niere
Negativ
Positiv (17 Mon.)
-
11
Niere
Negativ
Positiv (41 Mon.)
-
In Ermangelung von Material der jeweiligen Organspender, konnte deren Serostatus nicht
ermittelt werden und somit auch keine Aussage bezüglich der Ursache der Serokonversion
oder
der
Übertragungswahrscheinlichkeit
mittels
Transplantat
statuiert
werden.
Zusammenfassend konnte das in der Literatur häufig beschriebene Phänomen von HHV-8Serokonversionen auch anhand dieser relativ geringen Fallzahlen auch in unserem Kollektiv
bestätigt werden (PARRAVICINI et al., 1997; REGAMEY et al., 1998; MILLIANCOURT et
al., 2001).
Resultate 56
3.6 Entwicklung einer Methode zur serologischen Bestimmung von HHV8-Antikörpern im Durchflusszytometer
Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Prinzip der indirekten Immunfluoreszenz zur
Etablierung
einer
serologischen
Antikörperbestimmung
gegen
HHV-8
im
Durchflusszytometer von dem mikroskopischen Immunfluoreszenztest (IFT) übernommen.
Ziel war es, eine Optimierung dieses Immunfluoreszenztests durch die Messung im
Durchflusszytometer und eine eventuell bessere Quantifizierung als im mikroskopischen IFT,
der nur semiquantitative Informationen zum Antikörpertiter über eine Austitration der zu
testenden Seren gibt, zu erreichen. Als Antigen diente auch bei der durchflusszytometrischen
Antikörperbestimmung die HHV-8-positive B-Zelllinie BC-BL-1, die zum Nachweis latenter
Antigene im uninduzierten Zustand und zum Nachweis lytischer Antigene TPA-induziert
eingesetzt wurde. Als Negativkontrolle wurde jeweils eine Probe ohne Erst- und
Zweitantikörper belassen und jeweils eine ausschließlich mit dem fluoreszenzkonjugierten
BC-BL-1 induziert
ohne Erstantikörper
BC-BL-1 induziert mit
fluoreszenzmarkiertem αMHCI-Antikörper
Abb. 12: Nachweis von MHC-Klasse-I-Komplex auf BC-BL-1 als Positivkontrolle für die Anfärbung von
HHV-8-Antikörpern aus Humanseren auf BC-BL-1-Zellen. Links ist die Negativkontrolle ohne Zugabe von
Anti-MHCI-Antikörpern dargestellt, rechts ist deutlich die Verschiebung der Punktwolke in den
Wellenlängenbereich des Fluoreszenzfarbstoffes FITC zu sehen.
Resultate 57
Zweitantikörper versetzt. Zur zusätzlichen Negativkontrolle fanden die HHV-8-negativen BZelllymphomzellen
BJAB
als
Antigen
Anwendung.
Zur
Einstellung
des
Durchflusszytometers und zur allgemeinen Positivkontrolle diente eine Färbung des MHCKlasse-I-Moleküls, das auf jeder dieser eingesetzten Zellen exprimiert wird, was sich im
Durchflusszytometer als Verschiebung der kompletten Zellwolke in den Wellenlängenbereich
des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffes zeigte (Abb. 12).
In einem Vorversuch wurde anhand eines mittels Immunfluoreszenztest eindeutig positiv
vorgetesteten Serums eine Titrationsreihe mit Serum (1:8 bis 1:8192) und Zweitantikörper
(1:50 bis 1:800) durchgeführt, bei dem sich eine Serumverdünnung von 1:128 bzw. 1:512 und
eine Zweitantikörperverdünnung von 1:200 als am besten geeignet erwiesen. Im Laufe der
Testung der Seren zeigte sich, dass mit der Verdünnung 1:512 alle auch mit der Verdünnung
1:128 positiven Seren erfasst werden konnten, so dass sich die im Folgenden dargestellten
Ergebnisse auf eine Serumverdünnung von 1:512 beziehen. In keiner der Negativkontrollen
mit BJAB als Antigen konnte spezifische Antikörper nachgewiesen werden.
Zur Berechnung eines Grenzwertes für die Beurteilung der Positivität einer Probe wurde der
Mittelwert der gemessenen fluoreszierenden Zellen in der nur mit Zweitantikörper versetzten
Negativkontrolle ermittelt und dessen doppelte Standardabweichung addiert. Aufgrund der
HHV-8 seronegativ
HHV-8 seropositiv
Abb. 13: Durchflusszytometrische Darstellung einer HHV-8-seronegativen respektive –positiven Probe.
Dargestellt ist links eine Punktwolke einer Serumprobe, die als HHV-8-seronegativ gewertet wurde, rechts
einer seropositiven Probe. Als Antigen dienten TPA-induzierte BC-BL-1-Zellen, die mit Serum in einer
Verdünnung von 1:512 versetzt wurden.
Resultate 58
relativ hohen Varianz unspezifisch fluoreszierender Zellen in den Negativkontrollen ergab
sich ein Grenzwert von 0,19% Zellen mit Fluoreszenz im Wellenlängenbereich des
konjugierten Antikörpers an der Gesamtzahl gemessener Zellen. Die Methode wurde
exemplarisch an Plasmen von 68 Hämodialysepatienten, 67 Organtransplantierten und 1 HIVPatientin getestet und als Referenz mit dem Serostatus aus dem Immunfluoreszenztest
verglichen. Wie in verschiedenen anderen Studien, die den serologischen Antikörpernachweis
mittels IFT an latenten und lytischen Antigenen im Vergleich durchführten, zeigte sich auch
im Durchflusszytometer, dass eine Seropositivität, die an latenten Antigenen nachgewiesen
werden konnte, immer auch mit einer Seropositivität auf lytische Antigene einhergeht. Der
folgenden Beurteilung liegen bei beiden Methoden lytische Antigene zu Grunde. In Abb. 13
ist jeweils ein Beispiel einer als positiv und einer als negativ gewerteten Probe bei einer
Serumverdünnung von 1:512 abgebildet.
Tab. 8: Korrelation des mittels Immunfluoreszenztest (IFT) mit dem mittels Durchflusszytometrie
ermittelten
Serostatus.
Insgesamt
wurden
durch
die
serologische
Bestimmung
mittels
FACS
(Durchflusszytometer) 5,9% der Proben als falsch negativ und 8,1% als falsch positiv erfasst. 13,2% waren in
beiden Tests positiv.
Gruppe
Serostatus
IFT seropositiv
IFT seronegativ
HD
FACS seropositiv
8,8% (6)
10,3% (7)
(68)
FACS seronegativ
5,9% (4)
75,0% (51)
Tx
FACS seropositiv
16,4% (11)
6,0% (4)
(67)
FACS seronegativ
6,0% (4)
71,6% (48)
HIV
FACS seropositiv
100% (1)
-
(1)
FACS seronegativ
-
-
Gesamt
FACS seropositiv
13,2% (18)
8,1% (11)
(136)
FACS seronegativ
5,9% (8)
72,8% (99)
Resultate 59
Tab. 8 gibt einen Überblick über die je nach Verfahren ermittelten Seroprävalenzen und ihre
Korrelation. Insgesamt wurden von den 138 Proben 8 über das durchflusszytometrische
Verfahren falsch negativ und 11 Proben als falsch positiv bewertet. Bei den
Organtransplantierten
war
die
Kongruenz
der
beiden
Verfahren
mit
11
im
Durchflusszytometer positiv erfassten Proben von 15 im IFT positiv vorgetesteten am
größten.
Solche Proben, die im Durchflusszytometer als falsch positiv erfasst wurden, zeigten bis auf
eine Ausnahme entweder eine unspezifische Zytoplasmafluoreszenz im IFT oder waren in der
durchflusszytometrischen Auswertung nicht klar abgrenzbar, so dass die HHV-8-Serologie
mittels Durchflusszytometrie sich als wenig geeignet für die Unterscheidung unspezifischer
von spezifischen Fluoreszenzen zeigte. Die Zahl der falsch negativen lässt sich am ehesten
durch die Schwäche der durchflusszytometrischen Methode erklären, Proben, die im IFT
wenig Kontrast zeigten, zu erfassen. In seiner Praktikabilität der Methode und seiner
Spezifität erwies sich der durchflusszytometrische HHV-8-Antikörpernachweis dem
mikroskopischen gegenüber folglich eher im Nachteil. Zudem konnte die Qualität der
Fluoreszenz in Bezug auf Lokalisation und eventuelle Artefakte vom Durchflusszytometer
nicht ausreichend unterschieden werden. Bei eindeutig positiven Proben konnte mit der
durchflusszytometrischen Methode jedoch eine einfachere Antikörperquantifizierung ohne
Austitration des Serums erreicht werden.
3.7 Vergleich eines HHV-8-ELISA mit dem Immunfluoreszenztest
Abschließend wurde zum Vergleich der Sensitivität verschiedener serologischer Methoden
ein HHV-8-ELISA der Firma DIAVIR durchgeführt, der als HHV-8-Antigen zwei Peptide,
ORF (open reading frame) 65 x und K8.1, welche beides lytische Antigene sind, verwendet
und laut Literatur eine hohe Sensitivität bei der Detektion klinisch verlaufender HHV-8Infektionen hat (SCHATZ et al., 2001). In dieser Arbeit zur Erfassung klinisch nicht
apparenter HHV-8-Infektionen lag die Sensitivität weit unter der des IFT mit lytischem
Antigen. Von 90 für diese Methode ausgewählten Seren aus verschiedenen Risikogruppen
wiesen nur 4 der im IFT positiven 17 Serumproben Antikörper gegen die im ELISA
eingesetzten Peptide auf. Keine der zuvor im IFT negativ getesteten Proben hingegen wies
spezifische Antikörper auf, so dass dieser Peptid-ELISA bei mangelnder Sensitivität eine gute
Spezifität zu haben schien.
Diskussion 60
4 DISKUSSION
In epidemiologischen Studien wird die Prävalenz einer Virusinfektion üblicherweise über den
Nachweis von virusspezifischen IgG-Antikörpern bestimmt. Für das Humane Herpesvirus 8
sind die serologischen Nachweisverfahren bislang nicht ausreichend standardisiert und weisen
erhebliche Differenzen je nach Verfahren auf, so dass Schätzungen über die Prävalenz von
HHV-8 weit auseinander gehen (SCHULZ, 1998; SPIRA et al., 2000; SCHATZ et al., 2001;
SERGERIE et al., 2004). Kürzlich konnte anhand von CMV-infizierten Personen gezeigt
werden, dass virusspezifische T-Zellen ebenso geeignet sind, den individuellen CMV-Status
zu bestimmen, wie positive Titer virusspezifischer IgG (SESTER et al., 2003).
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Test zur Bestimmung HHV-8 spezifischer T-Zellen
eine genauere Methode zur Bestimmung des individuellen HHV-8-Status würde darstellen
können. Dazu wurde eine routinetaugliche Methode zur Bestimmung HHV-8-spezifischer TZellen etabliert und im Vergleich mit zwei gängigen serologischen Nachweisverfahren
evaluiert. Mittels einer sechsstündigen Vollblutstimulation in vitro ließen sich HHV-8spezifische CD4 und CD8 T-Zellen durchflusszytometrisch anhand ihrer Zytokinproduktion
nachweisen. Um in Ermangelung eines vergleichenden Goldstandards Hinweise auf die
Spezifität der Methode zu erhalten, wurde zunächst anhand eines Vorversuchs mit einer pp65
transfizierten Zelllinie die Eignung eines Zelllysats aus einer Virusantigen enthaltenden
Zelllinie als spezifisches Stimulans für den Vollblutassay bei bekannt CMV-positiven
Individuen nachgewiesen. Analog zum CMV-Antigen kann von einer Spezifität des HHV-8Antigens, das nach gleichem Verfahren hergestellt wurde, ausgegangen werden. Die
Verwendung einer HHV-8-negativen verwandten B-Zelllinie als Kontrollantigen ergab im
Vergleich mit der HHV-8-Antigenstimulation eine weitere Bestätigung für die Spezifität des
Assays. Die Tatsache, dass in der immungesunden Kontrollgruppe die mittels Vollblutassay
gemessene HHV-8-Prävalenz signifikant niedriger lag als in den immundefizienten
Risikogruppen der Hämodialysepatienten, der Organtransplantierten und der HIV-positiven
Patienten - demnach also keine Zufallsverteilung vorlag - zeigte ebenso die Spezifität des
Assays.
Sowohl in der immungesunden Kontrollgruppe wie auch in den Risikogruppen überwog die
CD8 Antwort gegenüber der CD4 Antwort. Von den CD8 Zellen wurden in Reaktion auf das
Antigen sowohl IFN-γ wie auch TNF-α gebildet, während bei den CD4 Zellen lediglich IFN-γ
nachweisbar war. Bei dem Vergleich der zellulären und der humoralen Immunantwort fiel
Diskussion 61
auf, dass die serologischen Nachweismethoden die HHV-8-Prävalenz sowohl unter
Immungesunden wie auch unter immungeschwächten Patienten unter Hämodialyse, nach
Transplantation oder im Rahmen einer HIV-Infektion deutlich unterschätzten.
Problematisch bei der Beurteilung der Resultate war das Fehlen einer Goldstandardmethode
in der HHV-8-Diagnostik. Bei der Evaluation des T-Zelltests im Vergleich mit dem
routinemäßig in der Diagnostik angewandten Immunfluoreszenztest zum serologischen
Antikörpernachweis auf der Basis einer HHV-8-positiven B-Zelllinie (LENNETTE et al.,
1996) konnte keine strikte Korrelation der zellulären mit der humoralen Immunantwort
festgestellt werden. Hinweise dafür, dass das Vorhandensein reaktiver T-Zellen nicht mit
einer Antikörperproduktion einhergehen muss wird in einer Arbeit von Woodberry et al.
Bestätigt (WOODBERRY et al., 2005). Entgegengesetzt der Erwartung, dass ein positiver
HHV-8-Serostatus auch mit einer zellulären Immunantwort einhergehen würde und eventuell
noch einige HHV-8-Infizierte darüber hinaus erfassen könnte, schlossen sich die beiden Arten
der Immunantwort auf dieses Virus bei einigen Probanden sogar aus. Das Fehlen einer klaren
Korrelation zwischen serologischer und zellulärer Immunität bei einem einzelnen Individuum
grenzt sich deutlich von der Situation bei CMV-Infektion ab (SESTER et al., 2003), könnte
jedoch eine Erklärung für das Vorliegen einer serologisch stillen HHV-8-Infektion bei
Individuen geben, bei denen klare Beweise in Form von nachweisbaren HHV-8-Sequenzen
im Knochenmarksstroma für eine Infektion vorliegen (CHAUHAN et al., 1999). Zumindest
erscheint es nahe liegend, darüber zu spekulieren, ob der Nachweis HHV-8-spezifischer TZellen als alternatives Nachweisverfahren für eine serologisch nicht messbare HHV-8Infektion dienen könnte.
Bei den in dieser Arbeit untersuchten Risikogruppen lagen unterschiedliche Formen des
Immundefekts vor. Während bei den Organtransplantierten und den HIV-Infizierten der Tzelluläre Immundefekt überwiegt, handelt es sich bei den Hämodialysepatienten um einen
kombinierten Immundefekt vor allem als Folge der Urämie. Anhand dieser Risikogruppen
sowie an einer immungesunden Kontrollgruppe wurde die zelluläre Immunantwort auf HHV8 mit der humoralen verglichen und anhand dieser Ergebnisse Rückschlüsse auf die HHV-8spezifische Immunantwort und die Epidemiologie des Virus gezogen. Vergleicht man die
Schätzungen über die HHV-8-Prävalenz aufgrund der kombinierten Analyse der zellulären
und der humoralen Immunantwort mit den ausschließlich über die Serologie erfassten Daten,
so zeigt sich durch alle untersuchten Gruppen eine höhere HHV-8-Prävalenz. Obwohl die
relative Dominanz der humoralen und der zellulären Immunantwort zwischen den einzelnen
Diskussion 62
Gruppen variierte, war nach kombinierter Bestimmung die Prävalenz an HHV-8 unter den
Immunsupprimierten ungeachtet der Ursache des Immundefekts ähnlich hoch (ca. 51% bei
Hämodialysepatienten, 44% bei Transplantierten und 58% bei HIV-Patienten). Die Evidenz
für eine HHV-8-Infektion bei der immungesunden Kontrollgruppe blieb bei jedem Verfahren
erwartungsgemäß weit unter der der Risikogruppen. Der Antikörpernachweis mittels
Immunfluoreszenz erfasste bei den Organtransplantierten und den HIV-Infizierten, deren
Immundefekt fast ausschließlich das T-zelluläre System betrifft, einen höheren Prozentsatz an
HHV-8-Positiven als bei den Hämodialysepatienten. Demgegenüber war die mit dem TZelltest ermittelte Prävalenz einer zellulären Immunantwort auf HHV-8 interessanterweise in
dem Kollektiv der Patienten unter Hämodialyse mit urämischem Immundefekt am höchsten
und
nahm
in
den
Gruppen
mit
stärkerer,
isolierter
T-Zellsuppression,
den
Organtransplantierten und den HIV-Infizierten, ab. Auch in der Kontrollgruppe wurden durch
den T-Zelltest fast dreimal mehr HHV-8-Positive (13,2%) erfasst als in der Serologie (3,9%),
was eine Bestätigung für die Hypothese einer bisher unterschätzten Durchseuchung mit HHV8 in der Normalbevölkerung sein könnte.
Aufgrund dieser Ergebnisse erschien es sinnvoll, für eine genauere Abschätzung des
individuellen HHV-8-Status das serologische Nachweisverfahren mit dem zellulären zu
kombinieren. Die auch bei kombinierter Analyse der zellulären und humoralen Immunantwort
immer noch vergleichsweise niedrigere Prävalenz von 16,5% unter den gesunden Personen
gibt Anzeichen dafür, dass die höhere Prävalenz unter den Immunschwachen nicht nur über
de novo Infektionen via Transplantat, Blutprodukte oder höheres Risikoverhalten zu erklären
ist. Vielmehr scheint zusätzlich auch die endogene Reaktivierung latenter HHV-8-Infektionen
eine Rolle zu spielen.
Obwohl primär die Zusammennahme der Bestimmung von zellulärer und humoraler
Immunantwort auf eine HHV-8-Infektion lediglich ein exakteres Maß für den individuellen
HHV-8-Status darstellen sollte, konnten die in dieser Arbeit gesammelten Daten zusätzlich
neue Einblicke in die relative Beteiligung der humoralen und zellulären Immunität bezüglich
der Kontrolle einer HHV-8-Infektion unter verschiedenen Konditionen der Immunschwäche
geben. Vergleicht man die HHV-8-Prävalenz der Kontrollen mit der der Dialysepatienten, so
lässt sich sowohl ein deutlicher Unterschied zwischen der spezifischen T-Zellantwort (13,2%
versus 42,9%) wie auch der Antikörperproduktion (3,9% versus 14,3%) finden. Da nach den
Untersuchungen dieser Arbeit von einer Spezifität des Vollblutassay ausgegangen werden
kann,
wurde
demnach
die
Inzidenz
einer
HHV-8-Infektion
in
diesem
für
Diskussion 63
Infektionskrankheiten aufgrund ihres urämischen Immundefekts anfälligen Kollektiv mit der
bisher verwendeten Serologie (in dieser Arbeit 12,9% Seropositive) weit unterschätzt (LUPPI
et al., 1999; ALMUNEEF et al., 2001). Da die Behandlung mit Hämodialyse regelmäßige
Aufenthalte auf Dialyseeinheiten erfordert, könnte diese erhöhte HHV-8-Prävalenz bei dieser
Patientengruppe in der erhöhten Zahl nosokomialer Infektionen begründet liegen. Eine
Übertragung innerhalb des Krankenhauses scheint nach einer Studie, in der bei Personal mit
Kontakt zu Hochrisikogruppen eine höhere HHV-8-Inzidenz auch mittels Antikörpernachweis
zu finden war, nicht ausgeschlossen (GÄRTNER et al., 2003). In diesem Kontext spielt der
mögliche Übertragungsweg über Speichel eine wichtige Rolle, da ein vor allem sexueller
Übertragungsweg diesen Zusammenhang nicht erklären würde. Zudem prädisponiert der
urämische Immundefekt eventuell zu einer erhöhten Rate an HHV-8-Reaktivierungen. Eine
Infektion über Transfusion von Blutprodukten ist zwar nicht ausgeschlossen, konnte in
bisherigen Studien jedoch nur selten und in geringem Ausmaß nachgewiesen werden
(OPERSKALSKI et al., 1997; ENGELS et al., 1999; PELLETT et al., 2003; DOLLARD et
al., 2005). Einen Hinweis auf eine mögliche parenterale Übertragung konnte jedoch eine
Studie geben, in der eine höhere HHV-8-Prävalenz unter Frauen, die intravenös Drogen
missbrauchen, gemessen wurde (CANNON et al., 2001). Andere Studien wiesen höhere
Prävalenzen in einigen Gruppen, die regelmäßige Bluttransfusionen erhielten, auf
(CHALLINE et al., 2001; MBULAITEYE et al., 2003). Als eine weitere Erklärung für die
hohe HHV-8-Prävalenz bei Hämodialysepatienten könnte auch der signifikant höhere
Altersdurchschnitt
der
Patienten
unter
Hämodialyse
dienen,
eine
signifikante
Altersabhängigkeit der HHV-8-Prävalenz konnte in dieser Arbeit aber nicht nachgewiesen
werden (Daten nicht gezeigt).
Auffallend war außerdem, dass die über T-Zellen gemessene Prävalenz unter den HIVPatienten und den Transplantatempfängern im Vergleich mit der Seroprävalenz eher niedrig
war. Dieses Phänomen ist insofern nachzuvollziehen, dass sowohl die HIV-Infektion wie
auch das immunsuppressive Regime der Transplantatempfänger hauptsächlich mit einer
Beeinträchtigung der T-Zellfunktion einhergehen. Der Prozentsatz an Personen mit
Antikörpertitern über der Detektionsgrenze war zudem höher unter HIV-Patienten und
Transplantatempfängern als unter Dialysepatienten. Wie bereits im Rahmen anderer
Infektionen wie CMV bekannt, kann ein T-Zelldefekt die periodische Reaktivierung viraler
Infektionen fördern und somit einen Boostereffekt auf die Antikörperproduktion ausüben
(Gärtner, persönliche Mitteilung). Diese Ansicht wird dadurch unterstützt, dass die meisten
Diskussion 64
im Rahmen von Transplantationen auftretenden Serokonversionen im Laufe des ersten Jahres
nach Transplantation auftreten (REGAMEY et al., 1998). Unter den Dialysepatienten, die
unter Zusammennahme der beiden Nachweisverfahren eine ebenso hohe HHV-8-Prävalenz
aufweisen wie die Hochrisikogruppen, könnte die im Vergleich eher niedrige Seroprävalenz
an geringeren, im Immunfluoreszenztest nicht fassbaren Antikörpertitern liegen, die erst
durch weitere Immunsuppression wie nach einer Transplantation in einen messbaren Bereich
verstärkt werden.
Diese Daten sprechen dafür, dass serologische Tests alleine die HHV-8-Prävalenz vor allem
bei gesunden Individuen und damit das Risiko einer Infektion mit HHV-8 durch ein
Transplantat unterschätzen. Ob diese Neuinfektion über ein Transplantat jedoch ein höheres
Risiko für eine Erkrankung mit Kaposi-Sarkom oder anderen HHV-8-assoziierten
Krankheiten als ein bereits vor Transplantation bestehender positiver HHV-8-Status birgt,
bleibt weiterhin zu klären. Die auf der Grundlage der serologischen Tests zu dieser Frage
durchgeführten Untersuchungen schienen bisher eher Hinweise auf ein höheres Risiko einer
klinischen Manifestation der HHV-8-Infektion bei vor Transplantation bereits bestehendem
positivem HHV-8-Serostatus zu geben (PARRAVICINI et al., 1997; DIOCIAIUTI et al.,
2000; FRANCES et al., 2000), obwohl es Studien zur Entwicklung eines Kaposi-Sarkoms
nach Transplantation auch bei negativem Serostatus des Spenders gab (MENDEZ et al.,
1998). Eine weitere Studie hingegen legte die Möglichkeit einer Übertragung von HHV-8
durch den Spender nahe, denn es konnten in Spindelzellen von Kaposi-Sarkom-Läsionen
mehrerer Transplantatempfänger sowohl genetische als auch Antigen-Marker der Donoren
nachgewiesen werden (BAROZZI et al., 2003). Bei einem Fall einer Transplantation zweier
Nieren eines seropositiven Spenders an zwei unterschiedliche Empfänger trat bei beiden in
einem ähnlichen Zeitabstand nach Transplantation ein Kaposi-Sarkom auf (BOTTALICO et
al., 1997; LUPPI et al., 2000). Auch geben andere Studien Hinweise darauf, dass klinisch
inapparente Serokonversionen direkt mit der Seropositivität des Spenders zusammenhängen
(NOCERA et al., 1998; REGAMEY et al., 1998; SHELDON et al., 2000). In dieser Arbeit
konnten durch longitudinale Messung von Serumproben vor und nach Transplantation
ebenfalls Serokonversionen bei einigen Organempfängern nachgewiesen werden. Ob diese
jedoch mit einem positiven Serostatus des Organspenders oder mit einer Reaktivierung einer
zuvor nicht messbaren latenten HHV-8-Infektion zusammenhängen, konnte mangels
Spendermaterials nicht abgeklärt werden. Die im T-Zelltest gemessene höhere HHV-8Prävalenz in der Normalbevölkerung lässt jedoch vermuten, dass ein höherer Anteil an
Diskussion 65
Serokonversionen als bisher vermutet auf Reaktivierungen zurückzuführen ist. Um genau
abzuklären, ob diese Serokonversionen tatsächlich auf einer latenten HHV-8-Infektion
beruhen, müssten Organtransplantierte im Verlauf vor und nach Transplantation sowohl auf
ihre zelluläre wie auch auf die humorale Immunantwort hin untersucht werden. Ebenso
müsste man mit Spendermaterial verfahren, um abzuschätzen, welche Konstellation das
höchste Risiko für eine HHV-8-Serokonversion und für das Risiko einer klinischen
Manifestation bietet, um somit in Zukunft die Gefahr für einen Organempfänger, ein KaposiSarkom auszubilden, schon durch die Auswahl des Transplantats zu reduzieren.
Obwohl durch die mittels T-Zelltest gefundene höhere HHV-8-Prävalenz in der
Normalbevölkerung die Hypothese einer Reaktivierung latent bestehender, serologisch nicht
nachweisbarer Infektionen als Ursache der Serokonversionen Bestätigung findet, so reicht
diese
mit
13,2%
dennoch
nicht
aus,
eine
Seroprävalenz
von
über
20%
bei
Organtransplantierten zu erklären. Eine bislang unterschätzte Rate an Übertragungen spielt
vermutlich auch eine Rolle. Eine Primärinfektion könnte möglicherweise auch von einem
seronegativen Spender ausgehen, dessen HHV-8-Infektion lediglich im T-Zelltest
nachweisbar war.
Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand in der Entwicklung einer Methode nach dem Prinzip der
indirekten Immunfluoreszenz, mit der HHV-8-spezifische Antikörper im Durchflusszytometer
nachgewiesen werden konnten. Diese böte die Vorteile einer schnellen und einfachen
Quantifizierung der bislang nur durch Austitration semiquantitativen Bestimmung der
Antikörpertiter.
Hierzu
wurden
Immunfluoreszenzmessung,
einem
Serumproben
ELISA
vergleichend
basierten
mit
der
Verfahren
etablierten
und
dem
durchflusszytometrischen Test untersucht. Große Übereinstimmungen fanden sich vor allem
bei deutlich positiven Proben. Jedoch wurden 8 aus 26 im IFT positiv gewerteten Proben im
Durchflusszytometer als negativ bestimmt und 11 von 29 im Durchflusszytometer positiven
Proben im IFT als negativ beurteilt. Problematisch dabei zeigten sich vor allem solche
Proben,
die
in
der
mikroskopischen
Immunfluoreszenzmethode
unspezifische
Zytoplasmafluoreszenzen aufwiesen, die vom Durchflusszytometer nicht von positiven
Proben differenziert werden konnten, so dass insgesamt 8,1% der Proben falsch positiv
gemessen wurden. Ein Vorteil der etablierten Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist die
Beurteilung
der
Zelle
mit
dem
eigenen
Auge,
wodurch
zwischen
Kern-
und
Zytoplasmafluoreszenten differenziert werden kann. Sie lässt die Interpretation offen, ob es
sich um spezifische oder unspezifische Fluoreszenzen handelt, eine Fähigkeit, die der Laser
Diskussion 66
des Durchflusszytometer nicht ersetzen kann. Wenngleich die Antikörpermessung im
Durchflusszytometer prinzipiell eine schnellere und genauere Quantifizierung von
Antikörpertitern in Serumproben ermöglichen könnte, so konnte diese Methode im Vergleich
zum etablierten Mikroskopie-Verfahren weder durch eine höhere Praktikabilität noch durch
eine höhere Spezifität überzeugen.
Auch
der
in
dieser
Arbeit
exemplarisch
verwendete
ELISA
zur
HHV-8-
Antikörperbestimmung zeigte keine relevanten von der Literatur abweichenden Ergebnisse
und bestätigte lediglich die bislang bekannten, sehr stark variierenden durch ELISA
gemessenen Seroprävalenzen (SIMPSON et al., 1996; DAVIS et al., 1997; ABLASHI et al.,
1999; CORCHERO et al., 2001).
Zusammenfassend stehen die in dieser Arbeit gefundenen Daten in Einklang mit der
Hypothese, dass die HHV-8-spezifische T-Zellimmunität effektiv die HHV-8-Replikation bis
zu einem gewissen Maß so weit hemmen kann, dass in gesunden Individuen mit bisherigen
Methoden keine humorale Immunantwort messbar ist. Unter verschiedenen Bedingungen der
Immunsuppression wie bei immunsuppressiver Medikation und bei HIV-Infizierten erlaubt
die eingeschränkte Funktion spezifischer T-Zellen eine häufigere Reaktivierung der HHV-8Replikation und bewirkt damit anscheinend einen Boostereffekt auf die humorale Immunität.
Die Antikörpertiter scheinen erst dann in den mit aktuellen serologischen Methoden
messbaren Bereich zu gelangen. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass die HHV-8Prävalenz vor allem in der Normalbevölkerung mit ausschließlicher Anwendung der
Serologie bislang unterschätzt wurde. Die kombinierte Quantifizierung der humoralen mit der
zellulären Immunantwort erscheint als eine geeignetere Methode für die Zukunft, den
individuellen HHV-8-Status einzuschätzen.
Literaturverzeichnis 67
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Woodberry T, Suscovich TJ, Henry LM, Martin JN, Dollard S, O'Connor PG, Davis
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and HIV coinfection on the detection of T cell responses to KSHV ORF73 and ORF65
proteins. J Infect Dis 192:622-629
Danksagung 76
6 DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich allen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Mein Dank gilt Herrn Professor Köhler und Herrn Professor Müller-Lantzsch, die es mir
ermöglicht haben, unter hervorragenden Rahmenbedingungen an ihren Instituten an einem
äußerst reizvollen Thema zu arbeiten.
Besonders möchte ich mich bei Frau Professor Barbara Gärtner, Frau PD Dr. rer. nat. Martina
Sester und Herrn Dr. med. Urban Sester bedanken, von deren fachlichem Wissen ich sehr
profitiert habe. Durch ihre zahlreichen Ideen, ihre ständige Diskussionsbereitschaft und ihre
experimentelle Unterstützung waren sie mir immer eine große Hilfe.
Bei den medizinisch technischen Assistentinnen Candida Guckelmus, Martina Wagner,
Daniela Sossong und Elke Vollmer möchte ich mich ganz herzlich für ihre Hilfe bei der
Einführung in die praktischen Labortätigkeiten und ihre ständige Hilfsbereitschaft bedanken.
Den Ambulanzschwestern der nephrologischen und hämatologischen Ambulanz, den
Mitarbeitern des Herzkatheterlabors und der Blutbank möchte ich für die Bereitstellung der
zahlreichen Blutproben danken. Ohne ihre Hilfe wäre ein solches Untersuchungskollektiv
nicht zustande gekommen.
Ein großer Dank gilt meiner Familie, die mit viel Geduld diese Arbeit Korrektur gelesen hat.
Zum Schluss möchte ich Stephan Thijssen und all den anderen danken, die mich immer
wieder motiviert haben und dafür gesorgt haben, dass ich die Zeit im Labor sehr genossen
habe.
Curriculum vitae 77
7 CURRICULUM VITAE
Persönliche Angaben
Name
Lönard
Vorname
Brigitta Michaela
Adresse
Häusserstr. 39, 69115 Heidelberg
Geburtsdatum
25.04.1979
Geburtsort
Saarbrücken
Staatsangehörigkeit
Deutsch
Schulische Ausbildung
1989-1998
Robert-Schuman-Gymnasium Saarlouis, Abschluss Allgemeine
Hochschulreife
1985-1989
Grundschule St.Oranna Berus
Studium
04/2005
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2004
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
09/2001- 03/2002
ERASMUS- Studienaufenthalt an der Université de Rennes, Frankreich
08/2001
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
09/2000
Ärztliche Vorprüfung
Praktisches Jahr
12/2004- 04/2005
Anästhesie und Intensivmedizin, Universitätsklinik Homburg
08/2004- 12/2004
Chirurgie, Manchester Royal Infirmary, UK
04/2004- 08/2004
Innere Medizin, Universitätsspital Zürich, Schweiz
Famulaturen
07/2003- 08/2003
Anästhesie, Missionsärztliches Krankenhaus Würzburg
02/2003- 03/2003
Radiologie, Universitätsklinik Homburg
Curriculum vitae 78
02/2001- 03/2001
Chirurgie, St.Elisabeth-Klinik Saarlouis
09/2000- 10/2000
Allgemeinmedizinische Praxis, Altforweiler
Studienbegleitende Tätigkeiten
04/2003- 07/2004
Studentische Hilfskraft am Institut für Physiologie der Universität
Homburg
10/2000- 02/2001
Studentische Hilfskraft am Institut für Anatomie der Universität Homburg
Dissertation
seit 07/2002
Experimentelle Arbeit zur Dissertation in der Klinik für Innere Medizin
IV, Nephrologie, und dem Institut für Virologie, Universitätskliniken
Homburg
Ärztliche Tätigkeit
Seit 07/2005
Assistenzärztin an der Klinik für Anästhesiologie, Universitätskliniken
Heidelberg