Dissertation_Allgäuer_15_Bib.
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Modulation der immunsuppressiven Funktion von humanen T-Zell-Rezeptor-αβ+ CD4- CD8doppelt-negativen T-Zellen Modulation of the immunosuppressive function of human T-cell-receptor-αβ+ CD4- CD8- double-negative T cells Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Andrea Allgäuer aus München 2015 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 07. Oktober 2015 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Gutachter: Prof. Dr. Lars Nitschke Prof. Dr. Andreas Mackensen Kurzzusammenfassung Die Population der TZRαβ+ CD4- CD8- doppelt-negativen (DN) T-Zellen übt eine starke suppressive Funktion gegenüber T-Zellantworten aus und ist damit an der Regulation des Gleichgewichts zwischen Immunreaktivität und Immuntoleranz beteiligt. So kann ein adoptiver Transfer muriner DN T-Zellen allogene CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten spezifisch unterdrücken und dadurch die Entwicklung einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD) nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) verhindern. In Hinblick auf einen angestrebten therapeutischen Einsatz der DN T-Zellen wurden in dieser Arbeit potentielle Modulatoren der suppressiven Aktivität von humanen DN T-Zellen charakterisiert. Als Modulatoren wurden homöostatische und proinflammatorische Zytokine untersucht, die nach HSZT erhöhte Serumspiegel aufweisen. Insbesondere Interleukin (IL)-7 stand aufgrund beschriebener Assoziationen mit der Pathogenese der GvHD im Zentrum der Untersuchung. Interessanterweise zeigte sich in dieser Arbeit, dass IL-7 die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber Effektor T-ZellAntworten entscheidend beeinträchtigt. Der Verlust der DN T-Zell-Funktion konnte auf die Aktivierung eines spezifischen Signalweges – dem Akt/mTOR Signalweg – in den DN T-Zellen zurückgeführt werden. Weitere Untersuchungen an dem zugrundeliegenden Mechanismus ergaben, dass das durch IL-7 amplifizierte Akt/mTOR Signal einen Anergie-ähnlichen Phänotyp der DN T-Zellen aufhebt. Die daraus resultierende gesteigerte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen führte zu einer Reduktion der suppressiven Aktivität. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe weiterer Zytokine, die mit der GvHD assoziiert sind, die Funktionalität der DN T-Zellen nicht beeinflussen. Das Th2 Zytokin IL-4 hingegen konnte als weiterer Modulator der DN T-ZellSuppression identifiziert werden. IL-4 und IL-7/Akt/mTOR stellen somit Einflussfaktoren der Funktionalität von DN TZellen dar, die als neue Angriffspunkte zur therapeutischen Modulation der immunregulatorischen Aktivität humaner DN T-Zellen für die Vermeidung der GvHD dienen können. Abstract TCRαβ+ CD4- CD8- double-negative (DN) T cells have been described to effectively suppress immune responses in both mice and humans. In the context of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) the adoptive transfer of murine DN T cells specifically suppressed alloreactive T cells and prevented development of graftversus-host disease (GvHD). Recently, clinical studies have demonstrated an inverse correlation between the frequency of DN T cells and the severity of acute GvHD after HSCT, indicating a therapeutic potential of human DN T cells in HSCT. So far no study has considered modulation of DN T cell functionality. After HSCT the concentration of certain homeostatic and proinflammatory cytokines has been shown to be increased. Thus, this work aimed to elucidate the effect of these cytokines on the functionality of human DN T cells. Since Interleukin (IL)-7 has been described to interfere with T-cell function and increased IL-7 serum levels have been associated with the incidence of GvHD, we first focused on the influence of IL-7 on regulatory function of DN T cells. Intriguingly, we could demonstrate that IL-7 abrogates the suppressive activity of DN T cells towards allogeneic effector T cells by amplifying the Akt/mTOR pathway. Importantly, selective inhibition of the protein kinases Akt or mTOR in human DN T cells was able to reverse the effect of IL-7 thereby restoring the functionality of DN T cells, whereas inhibition of other central T cell signaling pathways did not. Our analysis on the underlying mechanism suggested that the IL-7/Akt/mTOR signaling cascade reverses an anergy-like status of the DN T cells. Coincidently, the activation and proliferation of the DN T cells were shown to be increased and associated with the loss of their suppressive activity. Of interest, other cytokines associated with GvHD could not impair DN T-cell functionality. However the Th2 cytokine IL-4 influenced DN T-cell mediated suppression similar to IL-7. Together, the present study uncovered that the IL-7/Akt/mTOR network and potentially IL-4 are critical factors for the suppressive capacity of human DN T cells. Targeting of these pathways by pharmacological agents may re-establish and enhance the regulatory function of human DN T cells in GvHD. Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .................................................................................. I Abkürzungsverzeichnis ........................................................................V 1 Einleitung ......................................................................................... 8 1.1 Immunregulation ......................................................................................... 8 1.1.1 Immunreaktivität und -toleranz ......................................................... 8 1.1.2 Immunantwort nach allogener Stammzelltransplantation............... 10 1.2 DN T-Zellen .............................................................................................. 14 1.2.1 Charakterisierung der DN T-Zellen ................................................ 14 1.2.2 Immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen ............................ 16 1.2.3 Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression .................. 18 1.3 Interleukin-7 .............................................................................................. 21 1.3.1 Rolle von IL-7 im Immunsystem ..................................................... 21 1.3.2 Signaltransduktion von IL-7............................................................ 22 1.3.3 Regulation von IL-7 bei Immunkrankheiten .................................... 24 1.4 Zielsetzung ............................................................................................... 27 2 Material und Methoden.................................................................. 29 2.1 Material ..................................................................................................... 29 2.1.1 Medien, Puffer, Lösungen .............................................................. 29 2.1.2 Zytokine und Stimulatoren ............................................................. 30 2.1.3 Inhibitoren ...................................................................................... 31 2.1.4 Magnetische Aufreinigungs-Kits ..................................................... 31 2.1.5 Farbstoffe ....................................................................................... 32 2.1.6 Antikörper ....................................................................................... 32 2.1.7 Molekularbiologische Kits, Primer und Enzyme ............................. 34 Inhaltsverzeichnis II 2.1.8 Verbrauchsmaterialien ................................................................... 34 2.1.9 Software und Datenbanken ........................................................... 35 2.2 Methoden.................................................................................................. 35 2.2.1 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau Ausschlussfärbung ....... 35 2.2.2 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen ................................. 36 2.2.3 Dichtegradientenzentrifugation ...................................................... 36 2.2.4 Elutriation zur Monozyten-Isolation ................................................ 36 2.2.5 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten .................. 37 2.2.6 Magnetische Zellseparation ........................................................... 37 2.2.7 Kultivierung von DN T-Zellen ......................................................... 38 2.2.8 CFSE/ CPD/ VPD -Färbung ........................................................... 38 2.2.9 Suppressionstest ........................................................................... 39 2.2.10 Inhibition von Signaltransduktionswegen ....................................... 40 2.2.11 Durchflusszytometrie...................................................................... 40 2.2.11.1 Oberflächenfärbung .................................................................. 41 2.2.11.2 Intrazellulärfärbung ................................................................... 41 2.2.11.3 FoxP3-Färbung ......................................................................... 42 2.2.11.4 PhosFlow-Färbung ................................................................... 42 2.2.12 Zellviabilitäts-Bestimmung ............................................................. 43 2.2.13 RNA-Isolation ................................................................................. 44 2.2.14 RNA-Sequenzierung ...................................................................... 44 2.2.15 Reverse Transkription .................................................................... 45 2.2.16 Quantitative Polymerase Kettenreaktion ........................................ 46 3 Ergebnisse ..................................................................................... 47 3.1 Messmethoden zur Bestimmung der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen .............................................................................................. 47 3.2 Untersuchung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 ............................................................................ 52 3.2.1 Expression und Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors................. 52 3.2.2 Charakterisierung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 .................................................................. 56 3.2.3 Einfluss von IL-7 auf die Zell-Viabilität ........................................... 60 Inhaltsverzeichnis III 3.2.4 Untersuchung der IL-7 Signaltransduktion in DN T-Zellen ............. 62 3.2.5 Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges durch IL-7 ...................... 64 3.2.6 Die Rolle des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression ............................................... 66 3.2.7 Die Rolle weiterer IL-7 induzierter Signalwege bei der Modulation der Suppression .......................................................... 67 3.2.8 Transkriptom-Analyse zur Charakterisierung des molekularen Wirkmechanismus von IL-7/Akt/mTOR in DN T-Zellen .................. 69 3.2.9 Korrelation des Aktivierungs- und Proliferationszustandes von DN T-Zellen mit der suppressiven Funktion ................................... 77 3.2.10 Modell: Mechanismus zur Modulation der suppressiven Fähigkeit von humanen DN T-Zellen ............................................. 81 3.3 Charakterisierung weiterer Modulatoren der Suppression ........................ 82 3.3.1 Akt/mTOR als Angriffspunkt zur Modulation der Suppression ....... 82 3.3.2 Modulation der Suppression durch proinflammatorische Zytokine ......................................................................................... 83 3.3.3 Modulation der Suppression durch γ-Ketten-Zytokine ................... 84 4 Diskussion ..................................................................................... 86 4.1 Modulation der humanen DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7…………………………………………………………………… .............. 86 4.1.1 Einfluss von IL-7 auf die suppressive Aktivität humaner DN TZellen ............................................................................................. 86 4.1.2 Signaltransduktion in den DN T-Zellen .......................................... 91 4.1.3 Molekularer Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR ............... 97 4.2 Charakterisierung weiterer Modulatoren der DN T-Zell-Suppression ..... 101 4.3 Zusammenfassung und Ausblick ............................................................ 104 5 Verzeichnisse............................................................................... 107 5.1 Abbildungsverzeichnis ............................................................................ 107 5.2 Literaturverzeichnis................................................................................. 109 Inhaltsverzeichnis IV 6 Anhang ......................................................................................... 130 6.1 Veröffentlichungen.................................................................................. 130 6.2 Danksagung ........................................................................................... 131 Abkürzungsverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Beschreibung 7-AAD 7-Aminoactinomycin (Avitalfarbstoff) αCD3/28 Anti-CD3/CD28 gekoppelte Beads γc γ-chain (γ-Untereinheit bestimmter Zytokinrezeptoren) Akt Alternative Bezeichnung: Proteinkinase B ALPS Autoimmun Lmyphoproliferatives Syndrom AML Akute Myeloische Leukämie AMPK AMP-aktivierte Proteinkinase AxV Annexin-V APZ Antigen-präsentierende Zelle/n Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (Transkriptionsfaktor) CBL Casitas B-lineage Lymphoma (E3 Ubiquitin-Protein Ligase) CD Cluster of Differentiation (Gruppen von Oberflächenproteinen zur Immunphänotypisierung von Zellen) cDNA Komplementäre Desoxyribonukleinsäure CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester (fluoreszierender Zellfarbstoff) CPD Cell Proliferation Dye eFluor 670 (Zellfarbstoff) CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CD152 DMSO Dimethylsulfoxid (Lösungsmittel) DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate DN T-Zelle Doppelt-negative T-Zelle DZ Dendritische Zelle/n EGR Early growth response proteine (Transkriptionsfaktor) Erk Extracellular-signal regulated kinase FACS Fluorescence-activated cell sorting (zytometrisches Messverfahren) FasL Fas Ligand FCS Fötales Kälberserum FoxO Forkhead-Box-Protein O (Transkriptionsfaktor) FoxP3 Forkhead-Box-Protein P3 (Transkriptionsfaktor) GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (Zytokin) Abkürzungsverzeichnis VI Abkürzung Beschreibung GSK-3β Glykogensynthase-Kinase 3β GvHD Graft-versus-Host-Disease GvL Graft-versus-Leukämie HIF Hypoxie-induzierter Faktor (Transkriptionsfaktor) HLA Humane Leukozytenantigene HSZT Hämatopoetische Stammzelltransplantation IFN Interferon IGF-1 Insulin-like growth factor 1 IL Interleukin IL-7R Interleukin-7 Rezeptor IPA Ingenuity Pathway Analysis (Software zur Auswertung von Transkriptom-Daten) IRF4 Interferon regulatory factor 4 (Transkriptionsfaktor) JAK Januskinase JNK c-Jun N-terminale Kinase Ki-67 Zellproliferationsmarker-Protein KLF4 Kruppel-like factor 4 (Transkriptionsfaktor) lpr lymphoproliferativ LPS Lipopolysaccharid Ly-6A Lymphocyte antigen 6 complex, locus A MAPK Mitogen-aktivierte Protein Kinase MFI Mittlere Fluoreszenzintensität MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätsantigene) MLR Mixed Lymphocyte Reaction mTOR mechanistic Target of Rapamycin n Anzahl an durchgeführten Experimenten NFAT Nuclear factor of activated T cells (Transkriptionsfaktor) NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (Transkriptionsfaktor) NK-Zellen Natürliche Killerzellen p27 kip1 Alternative Bezeichnung: Cyclin-abhängiger Kinase-Inhibitor 1B Abkürzungsverzeichnis VII Abkürzung Beschreibung PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell (Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PGE2 Prostaglandin E2 PI3K Phosphoinositid-3-Kinase PTEN Phosphatase und Tensin Homolog qPCR Quantitative Polymerase-Kettenreaktion RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur S6 Ribosomales Protein S6 SC-79 Akt Aktivator (C17H17CIN2O5) SH2 Src Homology 2 –Domäne (vermittelt Interaktion mit phosphorylierten Proteinen) SLE Systemischer Lupus Erythematodes STAT Signal Transducers and Activators of Transcription T-bet T-Box Transkriptionsfaktor TGF-β Transforming growth factor β Th3 Typ 3 T-Helferzelle/n TNF Tumornekrosefaktor Tr1 Regulatorische T-Zelle Typ 1 Treg-Zelle Regulatorische T-Zelle (CD4+ FoxP3+ CD25+) TZR T-Zell-Rezeptor VPD Violet Proliferation Dye 450 (Zellfarbstoff) 8 1 1 Einleitung 1.1 Immunregulation 1.1.1 Immunreaktivität und -toleranz Einleitung Das Immunsystem bezeichnet das Organsystem höherer Lebewesen, welches dem Schutz vor Krankheitserregern dient. Es ist für die Beseitigung von Pathogenen und für die Elimination von entarteten körpereigenen Zellen verantwortlich. Die Immunabwehr teilt sich auf zwei miteinander interagierende Systeme, dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem, auf. Das angeborene Immunsystem stellt die erste Verteidigungslinie des Körpers dar und ist in der Lage, Pathogene unspezifisch zu erkennen und abzuwehren. Das adaptive Immunsystem hingegen zeichnet sich durch hohe Spezifität und die Fähigkeit zur Gedächtnisausbildung aus. Die Zellen des adaptiven Immunsystems, die Lymphozyten, tragen einzigartige Rezeptoren, mit denen sie spezifische Strukturen der Krankheitserreger, die sogenannten Antigene, erkennen können. Hat ein Lymphozyt sein spezifisches Antigen erkannt, kann dieser zu Effektor-Lymphozyten klonalen Ursprungs differenzieren und diverse Mechanismen zur Beseitigung des Erregers in Gang setzen. Extrazelluläre Erreger werden dabei vor allem durch B-Lymphozyten erkannt, die nach Aktivierung lösliche Antikörper zu dessen Abwehr sekretieren. Intrazellulär infizierte Zellen sowie entartete körpereigene Zellen werden von T-Lymphozyten erkannt und durch unterschiedliche Effektormechanismen eliminiert: zytotoxische TLymphozyten, die durch den CD8-Rezeptor charakterisiert sind, lysieren und zerstören die Zielzelle direkt; CD4+ Helfer T-Lymphozyten produzieren bestimmte Zytokine, die eine Reihe weiterer Effektorzellen, darunter B-Zellen und phagozytierende Makrophagen, aktivieren und kontrollieren können [1, 2]. Zur Induktion einer adaptiven Immunantwort werden Antigen-präsentierende Zellen (APZ) benötigt, die pathogenes Material prozessieren und die resultierenden Peptide über MHC-Moleküle (von engl. Major Histocompatibility Complex, Haupthistokompatibilitätskomplexe) als Antigen präsentieren. Anschließend können naive TLymphozyten über ihren T-Zell-Rezeptor (TZR) diese Antigene erkennen. Zudem präsentieren APZ kostimulatorische Moleküle, welche an spezielle Rezeptoren der T- 9 1 Einleitung Zellen binden und hierdurch die vollständige Aktivierung der T-Lymphozyten induzieren. Abhängig vom jeweiligen Zytokinmilieu reifen die aktivierten T-Zellen zu Zellen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen heran, um letztlich das Pathogen zu eliminieren [3-5]. Die Aktivierung einer Immunantwort muss streng reguliert werden, damit keine Gewebsschäden im Körper entstehen. Damit körpereigene Substanzen (Selbstantigene) keine Immunantwort auslösen, wird über verschiedene Mechanismen die immunologische Selbsttoleranz geregelt. Ein zentraler Toleranzmechanismus findet bereits während der T-Zell-Entwicklung im Thymus statt, indem neugebildete Lymphozyten, die eine starke Autoreaktivität aufweisen, über Apoptoseinduktion klonal deletiert werden. Wie die Nobelpreisträger Medawar und Burnet erstmals zeigten, findet diese Toleranzinduktion bereits im Embryo statt [6-8]. Darüber hinaus existieren außerhalb des Thymus weitere periphere Toleranzmechanismen, die die Selbsttoleranz reifer Lymphozyten gewährleisten. Diese beruhen auf Anergie, Deletion und Suppression mit Hilfe regulatorischer T-Zellen [9]. Anergie bezeichnet das Abschalten einer funktionellen Immunantwort aufgrund fehlender Reaktion auf ein Antigen. Diese zelluläre Inaktivierung kann infolge eines fehlenden oder eines negativen kostimulatorischen Signales bei der T-Zell-Rezeptor-Stimulation erfolgen und führt zur Tolerierung des Selbstantigens. Intensive Untersuchungen der letzten Jahre an anergen Zellen haben gezeigt, dass bestimmte hemmende Faktoren durch unvollständige Stimulationssignale induziert werden und diese Faktoren aktiv einen anergen Zustand herbeiführen [10]. Reaktive Zellen können außerdem über Aktivierungs-induzierten Zelltod deletiert werden. Über Todesrezeptoren wie dem Fas-Rezeptor oder TRAIL (von engl. TNF-related apoptosis-inducing ligand) kann dabei in der Zielzelle Apoptose induziert werden [11]. Des Weiteren spielen regulatorische T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz. Verschiedene immunregulatorische T-Zell-Subpopulationen können dabei mit unterschiedlichen Mechanismen Immunantworten kontrollieren. Die derzeit am Intensivsten untersuchte Population von regulatorischen T-Zellen sind CD4+ TZellen, deren Entwicklung und Funktion von der konstitutiven Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 (Forkhead box P3) sowie der α-Kette des Interleu- 10 1 Einleitung kin(IL)-2 Rezeptors (CD25) abhängt [12-14]. Die CD4+ FoxP3+ CD25+ T-Zellen (Treg-Zellen) machen im Mensch circa 2% aller T-Lymphozyten aus. Ihrer immunregulatorischen Funktion kommt bei der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz und Vermeidung von Autoimmunkrankheiten eine entscheidende Bedeutung zu [1520]. So führt beim Mensch ein Verlust der Treg-Zellen durch Mutationen im FoxP3Gen zur Autoimmunkrankheit IPEX (immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) [21, 22]. Außerdem spielen die Treg-Zellen eine Rolle bei der Regulation von Immunreaktionen gegen Infektionen, Tumore, Transplantate und Allergene [18, 23-26]. Innerhalb der CD4+ T-Zell-Population stehen darüber hinaus noch zwei weitere Subpopulationen, die Typ 3 T-Helferzellen (Th3) und die regulatorischen T-Zellen Typ 1 (Tr1) aufgrund ihrer suppressiven Aktivität im Fokus vieler Forschungsarbeiten [27-30]. Zudem konnten auch innerhalb der CD8+ Population T-Zellen mit immunregulatorischer Funktion identifiziert werden, welche durch die Marker CD103+ oder CD28- charakterisiert wurden [31-33]. Die doppelt-negativen T-Zellen, die im Rahmen dieser Doktorarbeit im Detail analysiert werden, tragen weder den CD4 noch den CD8 Korezeptor und bilden eine weitere interessante Untergruppe der immunregulatorischen T-Zellen. Dem Gleichgewicht zwischen Immunreaktivität und Immuntoleranz kommt insofern eine entscheidende Bedeutung zu, da eine Reaktion des Immunsystems gegen Krankheitserreger und Tumore essentiell für die Gesundheit ist, jedoch eine zu starke Reaktion beziehungsweise fehlende Toleranz gegenüber Selbstantigenen Autoimmunkrankheiten auslösen kann. Insbesondere nach Transplantationen liegt in dem Einstellen dieser Balance eine große therapeutische Herausforderung, um eine Transplantatabstoßung durch reaktive Immunzellen zu verhindern. 1.1.2 Immunantwort nach allogener Stammzelltransplantation Die Transplantation von allogenen hämatopoetischen Stammzellen (HSZT) stellt ein wichtiges kuratives Therapieverfahren bei verschiedenen Formen der Leukämie und malignen Lymphomen sowie bei manchen angeborenen Immunschwächekrankhei- 11 1 Einleitung ten dar. Zur Behandlung des erkrankten blutbildenden oder lymphatischen Systems werden dabei hämatopoetische Stammzellen von einem gesunden Spender auf den Patient übertragen. Zur Vorbereitung auf eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation wird der Patient einer Konditionierungstherapie unterzogen. In der Regel wird das kranke Knochenmark hierbei durch eine Kombination aus Chemotherapie und Bestrahlung zerstört, um die bösartigen Zellen abzutöten und das Immunsystem vor der Transplantation zu unterdrücken. Die Blutstammzellen eines gesunden Spenders werden auf den Patient übertragen und rekonstituieren dessen Hämatopoese [34]. Für den Erfolg der Stammzelltransplantation spielen T-Zellen eine bedeutende Rolle. Die transplantierten T-Zellen können einerseits residuelle Tumorzellen des Empfängers erkennen und eliminieren. Dieser erwünschte Graft-versus-Leukämie (GvL)-Effekt ist für die Erreichung einer kompletten Remission und Vermeidung eines Rezidives der Erkrankung von großer therapeutischer Bedeutung [35, 36]. Zudem werden die T-Zellen zur Bekämpfung von opportunistischen Infektionen benötigt. Wenn die T-Zellen des Spenders anderseits auch das Gewebe des Empfängers als fremd erkennen und angreifen, verursachen sie die Hauptkomplikation der HSZT, die Graft-versus-Host-Disease (GvHD). Auslöser dieser Gewebeunverträglichkeit sind die polymorphen Gene des MHC – im Menschen HLA (Humane Leukozytenantigene), die sich zwischen Spender und Empfänger außer bei syngenen eineiigen Zwillingen unterscheiden. Diese nicht-identischen MHC-Moleküle können von alloreaktiven T-Zellen des Transplantats erkannt werden und eine Immunreaktion gegen das Empfängergewebe induzieren. Die Ausgangsfrequenz von T-Zellen, die auf allogene HLA-Moleküle reagieren, kann bis zu 10% betragen [37, 38]. Man unterscheidet zwischen der direkten und der indirekten Allogen-Erkennung [39]. Bei der direkten Erkennung reagiert der TZR der Spender T-Zelle mit dem allogenen MHC-Komplex einer Empfänger-APZ. Bei der indirekten Erkennung werden fremde MHC-Moleküle von Spender-APZ aufgenommen, prozessiert und an Spender-T-Zellen präsentiert. Die Beobachtung, dass GvH-Reaktionen auch in HLAidentischen Zwillingspaaren ausgelöst werden können, führte zu der Entdeckung der Minor-Histokompatibilitätsantigene (mHA) [40, 41]. mHA sind polymorphe Proteine, 12 1 Einleitung die in Spender und Empfänger unterschiedlich exprimiert werden und nach Prozessierung in APZ ebenso über MHC-Moleküle präsentiert werden. Um die Entwicklung einer GvHD zu vermeiden, werden die MHC-Typen von Spender und Empfänger zur Minimierung der Alloreaktivität aufeinander abgestimmt [42]. Da jedoch selbst bei einer MHC-Übereinstimmung die mHA eine Immunreaktion hervorrufen können, kommt es bis heute häufig zum Auftreten einer akuten oder chronischen GvHD. Die akute GvHD kann bereits einige Tage nach Transplantation auftreten und wird durch alloreaktive T-Zellen des Transplantats vermittelt, die das Empfänger-Gewebe schädigen, indem sie selbst zytotoxische Effektormoleküle produzieren oder inflammatorische Zytokine zur Aktivierung weiterer Effektorzellen sekretieren. Insbesondere die Haut, die Leber und der Gastrointestinaltrakt werden dadurch angegriffen und zerstört. Abbildung 1-1 zeigt schematisch die zugrundeliegenden Mechanismen der GvHD-Induktion. 13 1 Einleitung Abbildung 1-1: Pathophysiologie der akuten GvHD (modifiziert nach [43]). Durch die Konditionierungstherapie vor HSZT werden im Patienten Gewebeschäden hervorgerufen, die zur Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin (IL)-1 und Tumor Nekrose Faktor (TNF) führen. Empfänger-APZ werden infolgedessen aktiviert und exprimieren verstärkt kostimulatorische Moleküle sowie MHC- und Adhäsions-Moleküle. Schädigungen an der Mukosa des Darmtraktes führen zum Eintritt von gramnegativen Bakterien in die Blutbahn und nachfolgend zur Ausschüttung von Lipopolysacchariden (LPS). Diese inflammatorischen Stimuli fördern die Aktivierung der APZ. Transplantierte Spender-T-Zellen migrieren in sekundäre lymphatische Organe und werden durch die APZ aktiviert. Die aktivierten T-Zellen expandieren, differenzieren zu Effektorzellen und verlassen das lymphatische Gewebe, um in typische Zielorgane wie Darm, Haut und Leber zu migrieren. In dieser Effektor-Phase kommt es zu einer komplexen Kaskade aus zellulären und inflammatorischen Prozessen. Die von aktivierten T-Zellen sezernierten Zytokine (zum Beispiel IL-2 und Interferon (IFN)-γ) aktivieren hierbei weitere Zellen des adaptiven und angeborenen Immunsystems, wodurch die Gewebeinflammation Gewebeschädigung weiter vorangetrieben wird. [44, 45] und zytotoxische 14 1 Einleitung Die chronische GvHD ist durch eine langsamere Gewebsschädigung gekennzeichnet, die frühestens 100 Tage nach HSZT auftritt. Sie wird sowohl durch T- und BZellen vermittelt und geht mit pathologischen Veränderungen der Blutgefäße einher. Trotz stetiger Fortschritte im immunologischen Verständnis der GvHD sowie ihrer Prävention und Behandlung erkrankt gegenwärtig die Mehrheit der Patienten nach HSZT an einer GvHD. Die GvHD-bedingte Mortalitätsrate liegt zwischen 15-19% [4648]. Zur Behandlung der akuten und chronischen GvHD werden standardmäßig immunsuppressive Kortikosteroide eingesetzt, um die T-Zell-Immunantwort sowie die Inflammation systemisch zu unterdrücken [49, 50]. Diese Therapie birgt jedoch die Gefahr eines Rezidivs der Grunderkrankung und einer erhöhten Anfälligkeit für opportunistische Infektionen. Da die GvHD bei einigen Patienten Steroid-refraktär ist, werden derzeit diverse neue Therapieansätze erarbeitet beziehungsweise evaluiert [51]. Als eine neuartige und vielversprechende Strategie zeichnet sich dabei die spezifische Regulation der alloreaktiven T-Zellen mittels zellulärer Toleranzinduktion ab. Für diesen zelltherapeutischen Ansatz kommen experimentell verschiedene regulatorische Zellpopulationen in Frage. Diverse Modellsysteme zeigten, dass der adoptive Transfer von Treg-Zellen eine Linderung und/oder Schutz der GvHD vermitteln kann [52, 53]. Ein therapeutischer Einsatz der Treg-Zellen gegen humane GvHD wird derzeit in klinischen Studien geprüft. 1.2 DN T-Zellen 1.2.1 Charakterisierung der DN T-Zellen Neben den eben erwähnten Treg-Zellen weisen auch die TZRαβ+ CD4- CD8(doppelt-negativen, DN) T-Zellen eine immunsuppressive Funktion und damit einhergehend das Potential zur therapeutischen Regulation der Immuntoleranz auf. Sowohl in der Maus als auch beim Menschen wurde die Existenz von T-Zellen mit diesem spezifischen Phänotyp in lymphoiden und nicht-lymphoiden Geweben beobachtet [54]. Neue Studien zeigten, dass die DN T-Zell-Population 1-5% aller im Blut zirkulierenden TZRαβ+ T-Zellen ausmacht [55, 56]. DN T-Zellen sind durch ein 15 1 Einleitung besonderes Expressionsprofil an Oberflächenmolekülen und Zytokinen sowie durch ein spezifisches epigenetisches Muster charakterisiert [56, 57]. So exprimieren DN T-Zellen den TZRαβ in Kombination mit dem CD3 Rezeptor, allerdings weder den CD4 noch den CD8 Korezeptor. In Gegensatz zu CD4- CD8- invarianten NK-T-Zellen tragen die DN T-Zellen ein polyklonales Repertoire an TZR und keine NK-Zellmarker wie CD16 oder CD56 [56]. Außerdem zeigen DN T-Zellen weder eine Expression des Treg-assoziierten Transkriptionsfaktors FoxP3 noch des koinhibitorischen CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CD152). Die Expression von CD25 kann durch Stimulation induziert werden. Im ruhendem Zustand findet man DN TZellen sowohl mit naiven Phänotyp als auch mit antigenerfahrenen Effektor- und Gedächtnis-Phänotyp [56, 58]. Eine weitere Charakterisierung der DN T-Zellen kann anhand deren Zytokinproduktion erfolgen. Nach Aktivierung sind die DN T-Zellen durch eine überwiegende Interferon-γ (IFN-γ) Produktion gekennzeichnet [55, 56]. Die hohe IFN-γ Expression scheint durch eine im Vergleich zu CD4+ und CD8+ T-Zellen starke Demethylierung des IFN-γ-Gens in DN T-Zellen ermöglicht zu werden [57]. Die Beobachtung einer erhöhten Transkription von IFN-γ-regulierten Genen in murinen DN T-Zellen lässt weiterhin vermuten, dass DN T-Zellen das produzierte IFN-γ auch autokrin nutzen [59]. Neben IFN-γ wurde in murinen DN T-Zellen die Sekretion der Zytokine TNF (Tumornekrosefaktor) und TGF-β (von engl. transforming growth factor β) nachgewiesen [55]. Die Zytokine IL-2, IL-4 und IL-10 werden von DN T-Zellen nicht oder nur in sehr geringfügigen Mengen produziert [56]. Das Methylierungsprofil humaner DN T-Zellen weist darauf hin, dass die für IL-17 und IL-18 codierenden Gene in den DN T-Zellen gut zugänglich sind [57]. Bisher wurden diese proinflammatorischen Zytokine in DN T-Zellen nicht nachgewiesen, jedoch wäre eine Produktion unter pathologischen Bedingungen denkbar. Hinweise auf proinflammatorische DN T-Zellen, die IL-17 produzieren, gibt es aus Infektionsmodellen mit Francisella tularensis und Listeria monocytogenes sowie von Patienten mit der Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) [60-62]. 16 1.2.2 1 Einleitung Immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen Ein zentrales Charakteristikum der DN T-Zellen liegt in ihrer Funktion, verschiedene Immunantworten regulieren zu können. Eine suppressive Aktivität von DN T-Zellen, die eindeutig durch den TZRαβ definiert und somit von TZRγδ+ T-Zellen abgegrenzt wurden, wurde erstmals von Strober et al. beschrieben [63]. So zeigte sich, dass DN T-Zellen in der Lage sind, immunologische Toleranz gegenüber Selbst- und AlloAntigenen zu kontrollieren. Die Rolle der DN T-Zellen zur Erhaltung der Selbsttoleranz wurde in unterschiedlichen Diabetes mellitus Typ I in vivo Studien nachgewiesen. Die autoreaktiven TZellen, die die Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas angreifen und dadurch die autoimmune Stoffwechselkrankheit verursachen, können durch murine DN TZellen unterdrückt werden. Durch die Gabe oder Anreicherung autologer DN TZellen kann so eine Ausbildung des Diabetes mellitus verhindert werden [64-67]. Eine ungewöhnlich hohe Frequenz an DN T-Zellen findet man in Mäusen mit Defekten in der Fas/FasLigand-vermittelten Apoptose [54, 68]. Diese lpr (lymphoproliferativen) oder gld (von engl. generalized lymphoproliferative disease) Mäuse entwickeln eine lymphoproliferative Autoimmunkrankheit, die dem menschlichen Autoimmunen Lymphoproliferativen Syndrom (ALPS) sehr ähneln [69]. Die aktivierten DN T-Zellen von lpr-Mäusen können in vitro und in vivo die Proliferation von Effektor-T-Zellen supprimieren, wenn diese einen funktionellen Fas-Rezeptor exprimieren. Aus diesen Studien kann geschlossen werden, dass lpr Mäuse eine Autoimmunkrankheit entwickeln, weil DN T-Zellen ohne Fas Rezeptor keine zytotoxische Aktivität mehr ausüben können. Die erhöhte Anzahl an DN T-Zellen könnte daher teilweise aus einem fehlgeschlagenem Versuch zur Kompensation der defekten Suppression resultieren [70, 71]. Patienten mit ALPS und SLE weisen ebenfalls eine erhöhte Frequenz an DN T-Zellen auf [72-74]. Inwieweit diese DN TZellen noch über eine immunregulatorische Funktion verfügen oder deren defekte Funktionalität mit der Krankheitsentstehung in Zusammenhang steht, ist Bestandteil laufender Forschungsarbeiten. 17 1 Einleitung Über die Regulation von Autoimmunantworten hinaus sind DN T-Zellen auch bei der Regulation allogener Immunreaktionen beteiligt. Zhang et al. zeigten erstmals, dass murine DN T-Zellen Antigen-spezifisch Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten vermitteln können, indem sie CD8+ T-Zellen, welche die gleiche TZR-Spezifität aufweisen, spezifisch eliminieren. Durch diese suppressive Aktivität der DN T-Zellen konnte die Abstoßung von allogenen Hauttransplantaten verhindert werden [55]. Wie Untersuchungen an weiteren Mausmodellen zeigten, konnten DN T-Zellen nicht nur + + CD8 T-Zellen sondern auch CD4 T-Zellen unterdrücken [70]. Dadurch konnten die DN T-Zellen beispielsweise auch bei xenogenen Herztransplantaten eine Immuntoleranz induzieren [75, 76]. Die Bedeutung der DN T-Zell-vermittelten Suppression gegenüber alloreaktiven Effektor-T-Zellen nach HSZT wurde in verschiedenen Untersuchungen belegt. In einem transgenen Mausmodell von Young et al. wurde durch Injektion von CD8+ TZellen in eine bestrahlte Maus mit einem nichtübereinstimmenden MHC eine GvHD ausgelöst [77]. Wurden dagegen DN T-Zellen zusammen mit den dazu syngenen CD8+ T-Zellen transplantiert, konnte die Ausbildung der GvHD unterdrückt werden. Bei Knochenmarkstransplantationen von nicht-transgenen + MHC-nichtidenten + Mäusen zeigte sich, dass im Gegensatz zu CD4 oder CD8 T-Zellen durch die Übertragung von DN T-Zellen keine GvHD verursacht wird [78, 79]. Vielmehr vermittelten die murinen DN T-Zellen Spender-spezifische Allo-Toleranz nach HSZT. Diese Ergebnisse konnten in neueren Studien, welche zeigten, dass murine DN TZellen alloreaktive Effektor-T-Zellen und auch NK-Zellen supprimieren und hierdurch die GvHD verhindern, bestätigt werden [79, 80]. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass humane DN T-Zellen ebenfalls eine starke immunregulatorische Funktion aufweisen. So konnten DN T-Zellen die Proliferation und Effektorfunktion von alloreaktiven CD4+ und CD8+ T-Zellen unabhängig von deren Differenzierungsstadium unterdrücken [81]. Erste klinische Studien zeigten das Potenzial der humanen DN T-Zellen bei der Toleranzinduktion nach HSZT auf. So wurde bei Patienten nach HSZT eine inverse Korrelation zwischen der Frequenz zirkulierender DN T-Zellen und der Schwere der GvHD festgestellt. Je mehr DN T-Zellen vorhanden waren, desto wenig GvHD wurde 18 1 Einleitung beobachtet, wobei keiner der Patienten mit mehr als 1% DN T-Zellen eine schwere GvHD (Grad 2-4) entwickelte. Eine geringe Anzahl an DN T-Zellen konnte dagegen mit einer Expansion an alloreaktiven Effektor T-Zellen assoziiert werden [82]. In Patienten mit akuter GvHD konnte im Vergleich zu Patienten ohne GvHD eine langsamere Rekonstitution an DN T-Zellen beobachtet werden. Generell rekonstituierten sich die DN T-Zellen deutlich zügiger als die Treg-Zellen. Die absolute DN TZellzahl an Tag 60 und 90 nach allogener HSZT korrelierte dabei invers mit dem Auftreten einer akuten GvHD [83]. Daher liegt die Vermutung nahe, dass auch humane DN T-Zellen vor dem Auftreten einer GvHD schützen können. Interessanterweise sind die DN T-Zellen nicht nur in der Lage, eine GvHD zu verhindern, sondern außerdem lymphatische Tumorzellen anzugreifen. So konnte eine Injektion von murinen DN T-Zellen das Auswachsen eines Tumors verhindern und somit einen GvL-Effekt erzielen. In vitro ließ sich eine starke zytotoxische Aktivität der murinen DN T-Zellen gegen Lymphomzellen nachweisen [84, 85]. In einer prä-klinischen Studie bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) wurden DN T-Zellen isoliert und nach ihrer Expansion analysiert. Bei sechs von sieben Patienten zeigten die DN T-Zellen eine lytische Aktivität gegen autologe Leukämiezellen [86]. Die Identifizierung von DN T-Zellen, die ein spezifisches Melanom-Antigen erkennen, verstärkt die potentielle Rolle der DN T-Zellen bei der Tumorbekämpfung [87]. Aufgrund der immunregulatorischen Funktion der DN T-Zellen und ihrer Auswirkung auf sowohl die GvHD-Regulation als auch den GvL-Effekt kommen die DN T-Zellen für innovative Zell-basierte Immuntherapien in Frage. 1.2.3 Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression Im Gegensatz zu Treg-Zellen, die ihre suppressive Aktivität unabhängig vom Antigen vermitteln, können murine DN T-Zellen Immunreaktionen Antigen-spezifisch unterdrücken. DN T-Zellen sind zur Trogozytose befähigt, was bedeutet, dass allogene MHC-Peptide über den TZR von der DN T-Zelle aufgenommen und präsentiert werden [88]. Dadurch können syngene CD8+ T-Zellen, die die gleiche 19 1 Einleitung Antigenspezifität aufweisen, unterdrückt werden [56, 89]. Die spezifische CD8+ TZelle wird durch die DN T-Zelle über einen Zellkontakt-abhängigen Mechanismus eliminiert, indem über eine Fas/FasL-Interaktion ein Todessignal induziert wird [55]. So zeigten murine DN T-Zellen mit einem blockierten oder defekten FasL-Rezeptor eine stark verminderte suppressive Aktivität gegenüber CD8+ T-Zellen [55, 70]. Abbildung 1-2 zeigt auf, mit Hilfe welcher Mechanismen DN T-Zellen in der Maus andere Immunzellen unterdrücken können. Neben der Fas/FasL-basierenden Suppression können DN T-Zellen allo- oder autoreaktiven Effektor T-Zellen auch über einen weiteren Mechanismus eliminieren. DN T-Zellen schütten dabei die zytolytischen Proteine Perforin und Granzym B aus, die in der Zielzelle Apoptose induzieren [90]. Da bei einem Fehlen von Ly-6A (von engl. lymphocyte antigen 6 complex, locus A) die Suppression der DN T-Zellen beeinträchtigt wird, scheint dieses Oberflächenprotein ebenso an der Regulation von T-Zellantworten beteiligt zu sein [91]. Der genaue Mechanismus und der Ligand von Ly-6A sind jedoch noch unklar. Bemerkenswerterweise kann die zytotoxische Aktivität der DN T-Zellen durch IL-10 beeinträchtigt werden [92]. Inwieweit weitere Zytokine die Funktionalität der DN T-Zellen beeinflussen können, wurde dagegen noch nicht untersucht. Murine DN T-Zellen sind dazu in der Lage, nicht nur T-Zellantworten zu unterbinden, sondern auch weitere Immunzellen zu supprimieren. Bislang konnte gezeigt werden, dass DN T-Zellen auch B-Zellen, NK-Zellen und DZ durch Fas/FasL-Interaktion oder über Perforin/Granzym B regulieren können [78, 90, 93]. Zudem konnten DN TZellen eine verminderte Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 auf DZ induzieren und dadurch eine Immunreaktion unterdrücken [93]. 20 1 Einleitung Abbildung 1-2: Mechanismus der murinen DN T-Zell-vermittelten Suppression (modifiziert nach [94]) Während mit Hilfe verschiedener Mausmodelle der molekulare Mechanismus der DN T-Zell-Funktion charakterisiert werden konnte, liegen von den entsprechenden humanen Zellen wenige Daten vor. Völkl et al. zeigten, dass humane DN T-Zellen über ihren TZR aktiviert werden müssen, um ihre suppressive Funktion gegenüber TZellantworten ausüben zu können. Nach Aktivierung konnten die DN T-Zellen die Proliferation sowie die Produktion von Effektormolekülen der alloreaktiven T-Zellen effektiv und dosisabhängig unterdrücken. Im Gegensatz zum Mausmodell wurden die Effektor T-Zellen dabei nicht über Fas/FasL oder Perforin/Granzym B eliminiert. Statt die Effektor T-Zellen abzutöten, wurden diese durch einen aktiven Suppressionsmechanismus der DN T-Zellen gehemmt. Die suppressive Aktivität der DN TZellen wurde dabei weder durch eine indirekte Modulation der APZ noch durch eine Kompetition um Wachstumsfaktoren wie IL-2 oder noch durch immunsuppressive Zytokine vermittelt. Vielmehr nutzten die DN T-Zellen einen Zell-Zell-Kontaktabhängigen Mechanismus, der aktiv den Zellzyklus in der Zielzelle hemmt. Da Blockadeexperimente zeigten, dass die DN T-Zellen nach TZR-Stimulation für ihre suppressive Aktivität auf die Synthese und Translokation von Proteinen angewiesen sind, wäre ein Zellkontakt-abhängiger Mechanismus über inhibitorische Rezeptoren 21 1 Einleitung denkbar. [81] Welche Signalwege von der TZR-Aktivierung bis hin zur Proteinsynthese von Bedeutung sind, ist bisher unbekannt. 1.3 Interleukin-7 1.3.1 Rolle von IL-7 im Immunsystem Zytokine werden eine Gruppe von Proteinen bezeichnet, die zur Kommunikation und Koordination der Immunzellen untereinander dienen. Ein insbesondere für TLymphozyten bedeutsames Zytokin stellt Interleukin-7 (IL-7) dar. Neben Keratinozyten und intestinalen Endothelzellen produzieren hauptsächlich nicht- hämatopoetische Stromazellen im Thymus, Knochenmark und weiteren lymphoiden Organen dieses Zytokin [95, 96]. Weiterhin können DZ geringe Mengen an IL-7 sezernieren, während T- und B-Zellen kein IL-7 produzieren [97]. IL-7 bindet an den IL-7 Rezeptor (IL-7R), welcher aus der α-Untereinheit CD127 und der γ-Untereinheit CD132 (γc von engl. γ-chain) zu einem Heterodimer zusammengesetzt ist. CD132 bildet nicht nur einen Teil des IL-7R, sondern ist ebenso Bestandteil der Zytokinrezeptoren von IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 und IL-21 [98, 99]. Der IL-7R wird auf DZ und Monozyten, sowie auf nahezu alle reifen T-Zellen exprimiert [100, 101]. Während CD132 relativ konstant auf den T-Zellen unterschiedlicher Differenzierungsstadien exprimiert wird, wird CD127 in Folge von IL-7 Signalen und in Folge von T-Zell-Aktivierung herunterreguliert. Durch diese Feedback-Regulation des IL-7R können T-Zell-Immunantworten feinmoduliert werden. [96] Treg-Zellen sind dagegen durch eine geringe Expression von CD127, die invers mit der FoxP3 Expression korreliert, charakterisiert [102, 103]. IL-7 spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von T-Lymphozyten im Thymus. Diese absolute Notwendigkeit von IL-7 zeigt sich eindrucksvoll bei Menschen mit Mutationen im IL-7R, die aufgrund des defekten IL-7 Signales keine T-Lymphozyten entwickeln und durch diesen Mangel an T-Zellen eine als schwerer kombinierter Immundefekt (SCID, von engl. severe combined immunodeficiency) bezeichnete Krankheit aufweisen [104, 105]. Da in diesen Patienten B-Zellen 22 1 Einleitung nachweisbar sind, scheint IL-7 für B-Lymphozyten eine nicht so essentielle Bedeutung zuzukommen wie für T-Lymphozyten. Nichtsdestotrotz ist IL-7 an der BZell-Entwicklung beteiligt, indem es bestimmte Transkriptionsfaktoren induziert und somit zur Expansion unreifer B-Zellen und zur Generierung des B-Zell-Repertoires beiträgt [106-109]. Während der T-Zell-Entwicklung nimmt IL-7 in den verschiedenen Entwicklungsstufen unterschiedliche Funktionen ein. IL-7 steuert dabei benötigte Überlebens- und Proliferationssignale in den Thymozyten [110, 111]. Zudem ist IL-7 an der genetischen Rekombination der γ-Kette und der β-Kette des TZR beteiligt [112, 113]. Außerhalb des Thymus nimmt IL-7 eine wichtige Rolle bei der Homöostase der peripheren T-Zellen ein. So kontrolliert IL-7 durch anti-apoptotische und kostimulatorische Signale das Überleben und die Proliferation von naiven CD4 + und CD8+ TZellen [114-116]. Während der T-Zell-Effektorphase spielt IL-7 eine untergeordnete Rolle. CD127 wird infolge der TZR-Aktivierung und der kostimulatorischen Signale herunterreguliert und andere Zytokine, die im Gegensatz zu IL-7 nur während einer aktiven Immunantwort produziert werden, wirken auf die aktivierten T-Zellen ein [117]. Bei der anschließenden Differenzierung der Effektor T-Zellen zu Gedächtnis T-Zellen ist IL-7 wiederum wesentlich beteiligt [118, 119]. So ergaben Studien, dass sich bei fehlendem IL-7 keine Gedächtnis-T-Zellpopulation nach erfolgter Immunantwort ausbilden konnten [116, 118, 120]. Des Weiteren zeigte sich, dass ein basaler IL-7 Spiegel für das Überleben und die Aufrechterhaltung von Gedächtnis-TZellen nötig war [121-123]. 1.3.2 Signaltransduktion von IL-7 IL-7 kann über unterschiedliche Signalwege das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung von T-Zellen steuern. In Abbildung 1-3 sind die zentralen Signaltransduktionswege von IL-7 schematisch dargestellt. Bindet IL-7 an den heterodimeren IL-7R, wird zunächst die CD127-assoziierte Januskinase (JAK)-1 und die CD132-assoziierte JAK3 aktiviert. Die aktivierten JAK phosphorylieren spezifische Tyrosinreste in der Src-homology 2 (SH2)-Domände von STAT5 (von engl. Signal 23 1 Einleitung transducers and activators of transciption 5). Phosphoryliertes STAT5 kann dimerisieren, in den Zellkern translozieren und dort für eine Reihe an Genen als Transkriptionsfaktor fungieren [124]. Wie in Abbildung 1-3 angedeutet, werden dadurch beispielsweise pro-Survival-Gene wie Bcl-2 (von engl. B-cell lymphoma 2) oder Mcl-1 (von engl. Myeloid cell leukemia 1) hochreguliert und pro-apoptotische Gene herunterreguliert. Neben dem JAK-STAT-Signalweg transduziert der IL-7R außerdem wichtige Signale über den Akt-Signalweg. So kann die durch IL-7 aktivierte Phosphoinositid-3-Kinase (PtdIns(4,5)P2) zu (PI3K) Phophatidylinositol-4,5-bisphosphat Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PtdIns(3,4,5)P3) umwandeln. PtdIns(3,4,5)P3 dient als Andockstelle für die Pyruvat-DehydrogenaseKinase 1 (PDK1) und die Proteinkinase Akt (alternativ als Proteinkinase B bezeichnet), wodurch letztlich Akt phosphoryliert wird. Ein bedeutender Gegenspieler dieses Signalweges ist die Phosphatase PTEN (Phosphatase und Tensin Homolog), die PtdIns(3,4,5)P3 dephosphorylieren und somit eine Signalweiterleitung unterbinden kann. Der Serin-/Threoninkinase Akt kommt eine Schlüsselfunktion zu, da sie eine Vielzahl an Proteinen reguliert. So wird unter anderem das Enzym mTOR (von engl. mechanistic Target of Rapamycin) aktiviert, welches eine bedeutende regulatorische Funktion auf den Metabolismus von Zellen und somit auf deren Überleben und Wachstum ausübt (zusammengefasst in [125]). Weitere zentrale Proteine, die von Akt gesteuert werden, sind FoxO (Forkhead-Box-Protein O) oder GSK-3β (Glykogensynthase-Kinase 3β). Durch diese Faktoren werden verschiedene für den Zellzyklus benötigte Cycline beziehungsweise Zellzyklusinhibitoren wie p27kip1 kontrolliert. [126-128] 24 1 Einleitung Abbildung 1-3: IL-7 Signaltransduktion für die T-Zell-Homöostase [127] 1.3.3 Regulation von IL-7 bei Immunkrankheiten IL-7 nimmt eine wichtige Funktion bei der Lymphopoese sowie bei der Homöostase von T-Zellen außerhalb des Thymus ein. Aus diesem Grund kommt IL-7 eine große Bedeutung bei Patienten mit einem Mangel an Lymphozyten, einer sogenannten Lymphopenie, zu. Lymphopenien können bei Virus-Infektionen, Autoimmun- oder Immundefizienz- sowie bei Blutkrebserkrankungen auftreten. Außerdem werden Lymphopenien häufig durch T-Zell-depletierende Behandlungen wie Bestrahlung, 25 1 Einleitung Zytostatika oder immunsuppressive Medikamente ausgelöst. Die Konditionierung vor HSZT verursacht daher ebenso eine Lymphopenie. Verschiedene Studien zeigten, dass T-Zell-Lymphopenien mit einem erhöhten IL-7 Spiegel einhergehen [129]. So konnten hohe IL-7 Konzentrationen unter anderem bei Patienten mit erworbenem Immundefektsyndrom (AIDS von engl. acquired immunodeficiency syndrome), mit idiopathischer CD4+ Lymphopenie oder mit lymphopenischer Multipler Sklerose beobachtet werden [130-132]. Des Weiteren wurde auch nach Chemotherapie ein hoher IL-7 Spiegel festgestellt [133]. Bolotin et al. zeigten, dass Kinder nach allogener HSZT einen erhöhten IL-7 Spiegel aufwiesen [134]. Folgestudien an Erwachsenen ergaben ebenso eine inverse Beziehung zwischen der Anzahl an peripheren T-Zellen nach HSZT und dem systemischen IL-7 Spiegel [135]. Andere Zytokine, welche ebenfalls über die γc-Kette ihr Signal weiterleiten, zeigten dagegen keine Korrelation mit der T-Zellzahl [133]. Wodurch die erhöhten IL-7 Spiegel unter lymphopenischen Bedingungen entstehen, ist nicht vollständig geklärt. Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, dass erhöhte IL-7 Spiegel aus einem verringerten Verbrauch des Zytokins aufgrund des T-Zell-Mangels resultieren [97]. Eine erhöhte IL-7 Konzentration kann das Immunsystem auf mehrere Arten beeinflussen. IL-7 induziert ab einer gewissen Dosis die Proliferation von naiven und Gedächtnis-T-Zellen [121, 136]. Dadurch kann IL-7 entscheidend zur peripheren Expansion der T-Lymphozytenpopulation und zur Immunrekonstitution beitragen [137, 138]. Zahlreiche Studien zeigten, dass eine zusätzliche pharmakologische Gabe von IL-7 die Immunrekonstitution insbesondere nach Chemotherapie und nach HSZT verbessert [138-140]. Mittels rekombinantem humanem IL-7 (CYT107) konnten die CD4+ und CD8+ T-Zellen nach HSZT stark expandiert und damit eine zügige Regeneration des T-Zell-basierten Immunsystems erreicht werden [141, 142]. Nachdem erste klinische Daten ein interessantes therapeutisches Potential aufzeigten, werden zurzeit mehrere klinische Studien durchgeführt, welche den Nutzen von IL-7 bei verschiedenen lymphopenen Grunderkrankungen untersuchen [126, 143]. Interessanterweise scheinen durch IL-7 hauptsächlich naive T-Zellen zu 26 1 Einleitung proliferieren, wodurch T-Zellen mit einer breiten Diversität im TZR-Repertoire hervorgebracht werden [144-146]. Ebenso bemerkenswert ist der Befund, dass TregZellen im Vergleich zu den anderen T-Zellpopulationen mittels IL-7 nicht oder nur geringfügig expandiert werden [141, 146]. Ein erhöhter IL-7 Spiegel kann für die Regeneration der T-Zell-Aktivität nach einer Lymphopenie von großem Vorteil sein. Allerdings muss auch beachtet werden, dass eine steigende Reaktivität der Immunzellen meist auf Kosten von immunologischen Toleranzmechanismen erfolgt. Hinweise auf eine Beeinträchtigung der immunologischen Toleranz aufgrund von IL-7 gibt es unter anderem durch Studien an Autoimmunerkrankungen. Zum Beispiel führt der Lymphopenie-assoziierte IL-7 Anstieg oder exogene Gabe von IL-7 in Diabetes Typ I Mäusen zur Expansion von selbstreaktiven T-Zellen [147]. Durch eine Blockade des IL-7R konnte die Aktivität der Effektor T-Zellen inhibiert und entscheidende inhibitorische Signalwege wiederhergestellt werden, wodurch die Ausbildung des Typ I Diabetes verhindert wurde [148, 149]. Ein weiteres Beispiel für die Bedeutung von IL-7 bei der Beeinträchtigung der Immuntoleranz zeigte sich bei Arthritis-Patienten. Erhöhte IL-7 Spiegel konnten bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis sowohl systemisch als auch in der Synovialflüssigkeit im Gelenk nachgewiesen werden und damit zur Pathophysiologie beitragen [150-153]. Interessanterweise zeigte sich bei Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis, dass IL-7 die suppressive Funktion von TregZellen außer Kraft setzt [154, 155]. Eine exogene Zugabe von IL-7 inhibierte ebenso die suppressive Aktivität der Treg-Zellen gegenüber Effektor T-Zellen [156]. Weitere Untersuchungen an Treg-Zellen aus gesunden Spendern zeigten, dass die Beeinträchtigung der Funktionalität der Treg-Zellen nach dem Entfernen von IL-7 reversibel ist. Da durch eine Blockade des IL-7R auf Treg-Zellen die suppressive Aktivität der Treg-Zellen wiederhergestellt werden konnte, wird vermutet, dass IL-7 eine direkte Wirkung auf die Treg-Zellen hat und dadurch die Toleranz gegenüber Autoantigenen brechen kann [157, 158]. Im Falle der HSZT wird durch die Konditionierungstherapie eine systemische Lymphopenie ausgelöst, die mit erhöhten IL-7 Spiegeln einhergeht [159]. Mehrere 27 1 Einleitung Studien deuten darauf hin, dass hohe IL-7 Konzentrationen eine verstärkte Immunreaktivität induzieren. So konnte in Mausmodellen gezeigt werden, dass IL-7 an der Entwicklung von akuter GvHD beteiligt ist und deren Krankheitsverlauf verschlechtert [160-162]. Durch eine IL-7R Blockade konnte die Ausbildung einer GvHD verhindert werden [163]. Dean et al. konnten in einer klinischen Studie beobachten, dass nach allogener HSZT hohe IL-7 Spiegel sowohl mit der Entwicklung als auch der Schwere einer akuten GvHD assoziiert sind [135]. Kürzlich veröffentlichte Studien bestätigen, dass hohe IL-7 Spiegel kurz nach der HSZT einen prognostischen Marker für das Auftreten und den Grad an akuter GvHD darstellen und darüber hinaus mit einer ansteigenden Mortalitätsrate assoziiert sind [164-166]. Weitere Belege des Zusammenhangs zwischen IL-7 Signalen und der Alloreaktivität nach HSZT liefern Untersuchungen, die Änderungen im IL-7R mit der Entwicklung von GvHD und einem höheren Mortalitätsrisiko assoziieren [167-171]. Der zugrundeliegende Mechanismus, wie IL-7 möglicherweise über bestimmte TZellpopulationen letztlich die Entwicklung einer GvHD beeinflusst, ist weitgehend unbekannt. 1.4 Zielsetzung Im Fokus dieser Arbeit steht die noch weitgehend unbekannte Population regulatorischer T-Zellen, die DN T-Zellen, welche Immunantworten effektiv supprimieren können. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung, ob und wie die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-ZellAntworten moduliert werden kann. Da unsere Arbeit das langfristige Ziel verfolgt, humane DN T-Zellen therapeutisch zur Vermeidung oder Behandlung der GvHD einzusetzen, sollten als potentielle Modulatoren Zytokine untersucht werden, die nach allogener HSZT erhöhte Serumspiegel aufweisen. Im Zentrum unserer Untersuchung steht das Zytokin IL-7, welches unter anderem mit der Pathogenese der GvHD assoziiert ist. Der Einfluss von weiteren γc- sowie proinflammatorischen Zytokinen sollte ebenso untersucht werden. 28 1 Einleitung Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit sollte der zugrundeliegende Mechanismus aufgeklärt werden, wie die DN T-Zell-vermittelte suppressive Aktivität durch die identifizierten Faktoren modifiziert wird. Hierfür sollten erstmals zentrale Signalwege in den DN T-Zellen und ihre Bedeutung auf die Funktionalität der DN T-Zellen analysiert werden. Zudem sollte untersucht werden, welche Veränderungen im Transkriptom mit einer Modulation der DN T-Zell-Funktion assoziiert sind. 29 2 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Medien, Puffer, Lösungen Material und Methoden Reagenz Hersteller oder Rezeptur AB-Serum, human PAN Biotech, Aidenbach AnnexinV-Puffer BD, Heidelberg β-Mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA Cellfix BD, Heidelberg DTT (Dithiothreitol) Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, München Dynal-Puffer PBS + 2% FCS EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Sigma, München Einfriermedium 10% FCS+ 10% DMSO Ethanol Th.Geyer, Renningen FACS Clean, Flow, Rinse BD, Heidelberg FCS (Fötales Kälberserum) PAN Biotech, Aidenbach FCS-haltiges Medium Standardmedium + 10% FCS Fixation/Permeabilization Solution BD, Heidelberg Fixierlösung PBS + 10% Cellfix (10x) Hanks‘-Puffer Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA HSA (Humanes Serumalbumin) Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA L-Glutamin Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA Lymphozytenseparationslösung (Pancoll) PAN Biotech, Aidenbach MACS-Puffer PBS + 2mM EDTA + 0,5% HSA MEM NEAA PAN Biotech, Aidenbach Natriumpyruvat PAN Biotech, Aidenbach PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA Penicillin/ Streptomycin Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA 30 2 Material und Methoden Reagenz Hersteller oder Rezeptur Perm/Wash Puffer BD, Heidelberg PhosFlow Perm Puffer III BD, Heidelberg PhosFlow Waschpuffer PBS + 2% FCS RPMI 1640 Medium PAN Biotech, Aidenbach Standardmedium (serumfrei) 500ml RPMI mit 200 mmol/l L-Glutamin, 5ml Vitamine (100x), 5ml MEM NEAA (100x), 1mM Pyruvat, 5ml Penicillin/ Streptomycin (100x), 50 μmol/l β-Mercaptoethanol TE Puffer Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA Trypanblau Gibco/ Life Technologies, Carlsbad, USA T-Zell-Medium Standardmedium + 10% humanes AB-Serum T-Zell-Stimulationsmedium T-Zell-Medium + 100 U/ml IL-2 Vitamine PAN Biotech, Aidenbach Wasserstoffperoxid Merck Millipore, Billerica, USA 2.1.2 Zytokine und Stimulatoren Reagenz Hersteller α-CD3/CD28 Dynabeads, human Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA Granulocyte macrophage colonystimulating factor (GM-CSF) CellGenix, Freiburg Insulin growth factor 1 (IGF-1) PeproTech, Hamburg Interferon-γ (IFN-γ) PeproTech, Hamburg Interleukin-1β PromoCell, Heidelberg Interleukin-2 Novartis, Nürnberg Interleukin-4 PromoCell, Heidelberg Interleukin-6 CellGenix, Freiburg Interleukin-7 CellGenix, Freiburg Interleukin-9 Miltenyi, Bergisch-Gladbach Interleukin-12 Miltenyi, Bergisch-Gladbach Interleukin-15 CellGenix, Freiburg 31 2 Material und Methoden Reagenz Hersteller Interleukin-21 PromoKine, Heidelberg Prostaglandin E2 (PGE2) Enzo Life Sciences, Lörrach Tumornekrosefaktor (TNF) PromoCell, Heidelberg 2.1.3 Inhibitoren Inhibitor Eingesetzte Hersteller Konzentration Akt Inhibitor IV 2 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA Erk Activation Inhibitor Peptide I 10 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA JAK Inhibitor I (PAN) 1 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA JNK Inhibitor SP600125 10 μM Tocris, Bristol, UK mTOR Inhibitor IV Ku63794 2,5 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA IKK (NF-κB) Inhibitor II 10 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA p38 Inhibitor SB203580 2 μM Tocris, Bristol, UK PI3K/mTOR Inhibitor III PKI-179 2,5 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA SC-79 20 μg/ml Tocris, Bristol, UK STAT5 Inhibitor 100 μM Calbiochem/ Merck Millipore, Billerica, USA 2.1.4 Magnetische Aufreinigungs-Kits Kit Hersteller CD4+ T cell isolation kit, human Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach CD4 Microbeads Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach CD8 Microbeads Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach DN T cell isolation kit, human Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach 32 2.1.5 2 Material und Methoden Farbstoffe Farbstoff Hersteller 7-AAD (7-Aminoactinomycin) BD, Heidelberg AnnexinV FITC BD, Heidelberg Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD) eBioscience, Frankfurt CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester) Sigma, München TF2-VAD-FMK im Cell Meter generic fluorometric caspase activity assay kit AAT Bioquest, Sunnyvale, USA Violet Proliferation Dye 450 (VPD) BD, Heidelberg 2.1.6 Antikörper Spezifität Isotyp Klon Herkunft Konjugation Hersteller CD1a IgG1 HI149 Maus FITC BD CD3 IgG1, ĸ UCHT1 Maus Alexa647 BD CD3 IgG1, ĸ SK7 Maus APC-H7 BD CD3 IgG1, ĸ UCHT1 Maus BV510 BD CD4 IgG1 SK3 Maus FITC BD CD4 IgG1 13B8.2 Maus APC Beckman Coulter CD4 IgG1, ĸ RPA-T4 Maus APC-Cy7 BD CD8 IgG1 RPA-T8 Maus APC BD CD8 IgG1, ĸ RPA-T8 Maus BV421 BD CD11c IgG2b S-HCL-3 Maus APC BD CD14 IgG2b MOP9 Maus PerCP BD CD25 IgG1, ĸ 2A3 Maus PE-Cy7 BD CD25 IgG1, ĸ M-A251 Maus APC-H7 BD CD80 IgG1 L307.4 Maus PE BD CD83 IgG1, ĸ HB15e Maus APC BD CD86 IgG1, ĸ B70/B7-2 Maus PE BD CD127 IgG1 M21 Maus PE BD 33 2 Material und Methoden Spezifität Isotyp Klon Herkunft Konjugation Hersteller CD132 IgG2b, κ TUGh4 Ratte APC BioLegend CD154 IgG1 24-31 Maus APC BioLegend CyclinA IgE BF683 Maus PE BD CyclinE IgG2b HE12 Maus FITC SantaCruz FoxP3 IgG1 236A/E7 Maus APC eBioscience HIF-1α IgG2b, κ 546-16 Maus PE BioLegend HLA-ABC IgG1 G46-2.6 Maus FITC BD HLA-DR IgG2a L243 Maus PerCP BD IgG1 IgG1 X40 Maus PE BD IgG2b IgG2b MOPC-195 Maus APC BD IRF4 IgG1, ĸ 3E4 Ratte FITC eBioscience Ki-67 IgG1 B56 Maus FITC BD Ki-67 IgG1 B56 Maus PE BD KLF4 IgG IC3640A Ziege APC R&D Systems p-GSK3β (S9) IgG D85E12 Kaninchen PE CellSignaling p-S6 (S235/236) IgG1, ĸ N7-548 Maus V450 BD p-S6 (240) IgG1, ĸ N4-41 Maus PE BD p-STAT5 (Y694) IgG1, ĸ 47 Maus PE BD T-bet IgG1, ĸ 4B10 Maus PE eBioscience TZRαβ IgG2b BW242/412 Maus PE Miltenyi TZRαβ IgG1, ĸ IP26 Maus BV421 BioLegend 34 2.1.7 2 Material und Methoden Molekularbiologische Kits, Primer und Enzyme Reagenz Hersteller dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate) Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA Hs_B2M_1_SG (QT00088935) Qiagen, Hilden Hs_CBL_1_SG (QT 00070301) Qiagen, Hilden Hs_EGR2_1_SG (QT00000924) Qiagen, Hilden Hs_EGR3_1_SG (QT00246498) Qiagen, Hilden Hs_FOXO4_1_SG (QT00029141) Qiagen, Hilden Hs_NFATC3_1_SG (QT00052185) Qiagen, Hilden QuantiTect SYBR Green PCR Kit Qiagen, Hilden Random Decamers Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA RNaseOut rekombinanter Ribonuklease Inhibitor Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA RNeasy Micro Kit Qiagen, Hilden SuperScript II Reverse Transkriptase Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, USA 2.1.8 Verbrauchsmaterialien Gegenstand Hersteller 2ml Schraubröhrchen Sarstedt, Nürnbrecht 24-well Platten Corning/ Costar, New York, USA 96-well Rundbodenplatten Corning/ Costar, New York, USA Einfrierröhrchen Greiner, Frickenhausen Eppendorf Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht FACS-Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht Falcons Corning/ Costar, New York, USA Kulturflaschen Greiner, Frickenhausen Pipetten Corning/ Costar, New York, USA Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg pPCR-Platten und -Röhrchen Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, USA 35 2.1.9 2 Material und Methoden Software und Datenbanken Software Verwendung Anbieter EndNote X7 Literaturverwaltung Thomson Reuters FACSDiva Durchflusszytometrie BD FlowJo V10 Analyse von FACS-Daten Celeza Ingenuity Pathway Analysis TranskriptomdatenAnalyse Qiagen Prism 5.03 Datenvisualisierung und Statistik-Berechnung GraphPad NCBI Literaturrecherche http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ StepOne V2.2.2 qPCR-Daten-Analyse Applied Biosystems Mit Hilfe des GraphPad Prism Programms wurde die statistische Signifikanz von den erhaltenen Datensätzen analysiert. Wenn nicht anderweitig angegeben, wurde der Mann-Whitney-Test aufgrund des Vorliegens von nicht-normal verteilten Messwerten angewandt. Die p-Werte wurden in den Ergebnissen folgendermaßen markiert: * p<0,05, ** p<0,001, *** p<0,005. 2.2 Methoden 2.2.1 Ermittlung der Zellzahl durch Trypanblau Ausschlussfärbung Zur Ermittlung der Zellzahl wurden Zellen in einer Lösung von 0,4% Trypanblau in PBS verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer mit Hilfe eines Zeiss PrimoStar Mikroskops ausgezählt. Da abgestorbene Zellen aufgrund ihrer fehlenden Membranintegrität eine starke Blaufärbung aufweisen, können diese von lebenden Zellen unterschieden werden. Die Zellzahl pro ml wurde mit folgender Formel berechnet: 36 2.2.2 2 Material und Methoden Kryokonservierung und Auftauen von Zellen Vor dem Einfrieren wurden Zellen in PBS gewaschen und in 1 – 1,5ml 4°C kaltem Einfriermedium pro Einfrierröhrchen aufgenommen. Die Zellzahl betrug maximal 100 x 106 Zellen/ Einfrierröhrchen. Die befüllten Einfrierröhrchen wurden in einer mit Isopropanol gefüllten Kryobox von Nalgene Nunc, die ein definiertes Abkühlen der Zellen um -1°C/ ml pro Minute gewährleistet, in den -80°C Gefrierschrank gestellt und dort gelagert. Zum Auftauen von Zellen wurde diesen sukzessiv Standardmedium, welches zuvor auf Raumtemperatur gebracht wurde, zugeführt. Aufgetaute Zellsuspension wurde zügig in ein Falcon mit Medium überführt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und in frischem serumhaltigen Medium resuspendiert. Wenn nicht anders angegeben wurde Zellen stets in der Megafuge 16R (Thermo Scientific) bei 317 x g für 7 Minuten bei 4°C zentrifugiert. 2.2.3 Dichtegradientenzentrifugation Die für die Dichtegradientenzentrifugation verwendeten Zellen wurden aus gesunden Spendern mittels Leukapherese gewonnen. Dabei wurden aus dem Blut die Leukozyten abgetrennt und das übrige Erythrozyten-reiche Blut dem Spender zurückgegeben. Das Leukapherisat wurde 1:1 in PBS verdünnt, auf Lymphozytenseparationslösung aufgetragen und für 20 Minuten bei 800 x g und 20°C zentrifugiert. Die Dichtegradientenzentrifugation führt zur Auftrennung einer schweren Erythrozyten-reichen Fraktion, der Interphase mit PBMC und dem Überstand mit Thrombozyten und Plasma. Die Interphase wurde mit einer Pipette gesammelt und zweimal gewaschen. Die gewonnen PBMC wurden gezählt und direkt verwendet oder bei -80°C eingelagert. 2.2.4 Elutriation zur Monozyten-Isolation Unter Verwendung der Gegenstrom-Elutriation wurden aus den gewonnenen PBMC in einer J6-M/E Zentrifuge (Beckman) Monozyten isoliert. Bei dieser Methode werden 37 2 Material und Methoden die PBMC nicht nur nach Ihrer Dichte, sondern auch nach ihrer Größe aufgetrennt. Vor der Elutriation wurde das System mit einer 30%-igen H2O2-Lösung sterilisiert, mit PBS gewaschen und der Pumpdruck mit Hanks‘-Puffer geeicht. Für die Elutriation wurden die Zellen mit 6% autologem Plasma in Hanks‘-Puffer in das System eingebracht. Die Auftrennung und Sammlung der einzelnen Zellfraktionen erfolgte durch die kontinuierliche Erhöhung der Durchflussrate bei konstanter Umdrehungszahl der Zentrifuge. Bei einer Durchflussrate von 111 ml/Min wurde die letzte Fraktion gesammelt, in der sich die Monozyten befinden. Die gewonnenen Monozyten wurden gewaschen, resuspendiert und gezählt. 2.2.5 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten Die durch Elutriation gewonnenen Monozyten wurden in FCS-haltigem Medium (106 Zellen/ml) mit den Zytokinen IL-4 (5ng/ml), GM-CSF (500U/ml) und TGF-β (5ng/ml) in einer Kulturflasche über 5 Tage zu unreifen DZ differenziert. Durch Zugabe folgender Zytokine wurden die DZ nach Jonuleit et al. [172] über 2 weitere Tage ausgereift: IL-4 (2,5ng/ml), GM-CSF (250U/ml), IL-1β (10ng/ml), IL-6 (1000U/ml), PGE2 (1μg/ml) und TNF (10ng/ml). Die Zellsuspension der reifen DZ wurde geerntet und die Ausdifferenzierung mittels einer FACS-Färbung auf folgende Marker hin überprüft: CD14-, CD1a+, CD11c+, CD80+, CD83+, CD86+, HLA-ABC+, HLA-DR+. Die reifen DZ wurden entweder direkt in den Versuchen verwendet oder eingefroren. 2.2.6 Magnetische Zellseparation Die magnetische Zellseparation dient der Aufreinigung von definierten Zellpopulationen und wurde mit Hilfe von Miltenyi Kits nach dem jeweiligen Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Methode beruht auf der Bindung von Antikörperbeschichteten Eisenpartikel („Microbeads“) an die Zellen. Durch die Adhäsion der somit markierten Zellen an einen Magneten können dadurch die aufzureinigenden Zellen von den unbenötigten Zellen separiert werden. Die Anreicherung kann dabei auf zwei unterschiedlichen Prinzipien beruhen: während bei der positiven 38 2 Material und Methoden Anreicherung die Microbeads an die gewünschte Zellpopulation gebunden werden, werden bei der negativen Anreicherung die zu depletierenden Zellpopulationen markiert. CD4+ T-Zellen wurden stets durch die schonendere negative Selektion aus PBMC isoliert - das heißt, sämtliche Zellen mit unerwünschtem Phänotyp werden durch Antikörper gebunden und bleiben an dem Magneten haften. Für die Isolation von DN T-Zellen wurden zunächst CD4+, CD8+, CD11b+, CD16+, CD19+ CD20+ und CD56+ Zellen depletiert und in einem zweiten Schritt durch eine positive Selektion anhand von TZRαβ die DN T-Zellen aufgereingt. Wenn eine DN T-Zell-Kultur eine Verunreinigung von mehr als 5% an CD4+ oder CD8+ T-Zellen aufwies, wurden die CD4+ und CD8+ T-Zellen mittels anti-CD4 und anti-CD8 Microbeads depletiert. 2.2.7 Kultivierung von DN T-Zellen DN T-Zellen wurden in T-Zell-Stimulationsmedium (enthält 100U/ml IL-2) in 96-well Rundbodenplatten kultiviert und wöchentlich mit allogenen reifen DZ stimuliert. Pro well wurden dabei 100.000 T-Zellen mit 25.000 DZ in einem Gesamtvolumen von 225μl eingesetzt. Alle 2-3 Tage wurde ein Mediumwechsel vorgenommen und die DN T-Zellen bei einer hohen Zelldichte 1:1 gesplittet. Die Reinheit der DN T-ZellKultur wurde jede Woche durchflusszytometrisch analysiert und im Falle einer Verunreinigung mit anderen T-Zellen (DN T-Zell-Population < 95%) durch eine magnetische Nachreinigung wiederhergestellt. Für sämtliche Experimente wurden DN T-Zellen eingesetzt, deren letzte Restimulation mindestens 5 Tage zurücklag. 2.2.8 CFSE/ CPD/ VPD -Färbung Zur Untersuchung der Proliferation von Zellen oder der Markierung gewisser Zellpopulationen zu Gating-Zwecken wurden die fluoreszierenden Farbstoffe CFSE, CPD oder VPD verwendet. Diese Farbstoffe emittieren in unterschiedlichen Wellenlängen (siehe Tabelle) und unterliegen einem ähnlichen Wirkprinzip. CFSE, VPD und CPD können durch die Zellmembran diffundieren und an zytoplasmatische Proteine binden. Teilt sich die Zelle, wird der Farbstoff gleichmäßig auf die beiden 39 2 Material und Methoden Tochterzellen verteilt. Dadurch können proliferierende Zellen anhand der Abnahme ihrer Fluoreszenz erkannt werden. Für die Färbung der Zellen mit einem der Farbstoffe wurden maximal 10 x 106 Zellen in ein 50ml Falcon überführt und in PBS gewaschen. Bei einer Zellzahl ≤ 106 wurden die Färbung in einem 2ml Schraubröhrchen durchgeführt, um den Zellverlust während der Waschvorgänge zu reduzieren. Die Färbung erfolgte nach dem in der Tabelle angegebenen Protokoll. Im Anschluss wurde der Färbeprozess mit PBS, welches 10% FCS enthielt, abgestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Zellen noch einmal in PBS gewaschen und in T-Zell-Medium resuspendiert sowie ausgezählt. CFSE CPD VPD Färbelösung 5nM in PBS (stets frisch angesetzt) 5mM in DMSO 1mM in DMSO Färbevolumen 200μl PBS + 500μl Färbelösung 1ml PBS + 0,5μl CPD 1ml PBS + 1μl VPD ~ 2nM ~ 2,5μM ~ 1μM 4 Min, RT(dunkel) 7 Min, 37°C 10 Min, 37°C 521nm 670nm 450nm Färbekonzentration Färbedauer Emission 2.2.9 Suppressionstest Die DN T-Zell-vermittelte Suppression von allogenen T-Zell-Antworten wurde entweder mittels der Messung der CFSE-Fluoreszenz oder der intrazellulären Expression des Zellzyklusproteins Ki-67 untersucht. Dafür wurden CD4+ T-Zellen aus PBMC isoliert und bei Bedarf CFSE gefärbt. Zur Stimulation der T-Zellen wurden in einer modifizierten „Mixed lymphocyte reaction“ (MLR) allogene reife DZ verwendet. Als alternative T-Zell-Stimulation kamen anti-CD3/CD28 gekoppelte (αCD3/28) Beads, die nach dem Protokoll des Herstellers zuvor im Dynalpuffer gewaschen wurden, zum Einsatz. Als Suppressor-Zellen dienten DN T-Zellen, die zuvor über 40 2 Material und Methoden mehrere Wochen expandiert worden waren und zur einfachen Unterscheidung von anderen Zellen im FACS-Gating teilweise mit VPD angefärbt wurden. In den Versuchen wurden pro well 50.000 CD4+ T-Zellen zusammen mit 50.000 DN TZellen und 25.000 DZ oder αCD3/28 Beads im Verhältnis 1:50 zu den T-Zellen in 225μl T-Zell-Medium eingesetzt. Die Ki-67 Messungen erfolgten nach einer Inkubation von 2 Tagen, die CFSE-Messung nach 5 Tagen. Die Zellen wurden abgeerntet und αCD3/28 Beads dabei über einen Magneten entfernt. Die Zellen wurden mit unterschiedlich konjugierten Antikörpern gefärbt und die Proliferation der CD4+ T-Zellen im FACS analysiert. Als Kontrolle dienten Ansätze, bei denen die CD4+ T-Zellen nicht stimuliert oder ohne die Suppressor-Zellen inkubiert wurden. Die Zytokine, die in einigen Experimenten zum Einsatz kamen, wurden - wenn nicht anderweitig angegeben - mit einer Konzentration von 20 ng/ml direkt in den Ansatz des Suppressionstests zugegeben. 2.2.10 Inhibition von Signaltransduktionswegen Um zu untersuchen, inwieweit bestimmte Signaltransduktionswege Einfluss auf die suppressive Funktion der DN T-Zellen nehmen, wurden in den DN T-Zellen vor ihrem Einsatz in den MLRs definierte Signalmoleküle inhibiert. Für die Blockade wurden 200.000-300.000 DN T-Zellen in 375μl T-Zell-Medium in ein 2ml Schraubröhrchen überführt und der jeweilige Inhibitor (siehe Kapitel 0) zugegeben. Die Zellen wurden für 2 Stunden bei 37°C mit dem Inhibitor inkubiert und schließlich zweimal mit T-ZellMedium gewaschen, um ungebundene Inhibitoren wegzuwaschen. Unbehandelte DN T-Zellen wurden als Kontrolle ebenso inkubiert und gewaschen. Die somit blockierten DN T-Zellen wurden nach ihrer Resuspension in den Suppressionstest eingesetzt. 2.2.11 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie dient der phänotypischen Analyse von Zellen, indem die Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner Zellen gemessen werden. Die zu untersuchenden Zellen werden dabei mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern oder 41 2 Material und Methoden bestimmten Farbstoffen wie CFSE markiert und in einer Trägerflüssigkeit an einem Laserstrahl vorbeigeführt. Im verwendeten Gerät FACSCanto II (BD) standen drei Laser für die Anregung der Fluoreszenz zur Verfügung. Als Fluorochromkonjugate wurden FITC (Fluorothioisocyanat), PE (Phycoerythrin), PerCP (Peridinin- Chlorophyll-Protein), APC (Allophycocyanin), PE-Cy7 (PE-Cyanin-Konjugat), APCH7 (APC-Cyanin-Konjugat), V450, BV (Brilliant Violet) 421 oder BV510 verwendet. Die Wellenlänge des emittierten Lichtes ist abhängig vom Farbstoff und wurde in der vorliegenden Arbeit in 8 Kanälen detektiert. Des Weiteren wird die Lichtstreuung jeder Zelle gemessen, um zusätzliche Informationen zur Beschaffenheit der Zellen zu erhalten. Das Vorwärts-Streulicht gibt Auskunft über die Größe der Zelle. Das Seitwärts-Streulicht, welches im 90° Winkel zum einfallenden Licht gemessen wird, vermittelt Informationen über die intrazelluläre Granularität. 2.2.11.1 Oberflächenfärbung Zur Untersuchung bestimmter Oberflächenproteine im Durchflusszytometer wurden Zellen mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern angefärbt. Die zu analysierenden Zellen wurden in FACS-Röhrchen geerntet und in PBS gewaschen. Sämtliche Zentrifugationsschritte mit FACS-Röhrchen erfolgten bei 500 x g und 4°C für 4 Minuten. Auf das gelöste Zellpellet wurde die vom Hersteller angegebene Menge an Antikörper pipettiert und diese für 10 Minuten bei 4°C mit den Zellen inkubiert. Nach Zugabe von PBS und erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 200-350μl PBS oder Fixierlösung aufgenommen und am FACS vermessen. 2.2.11.2 Intrazellulärfärbung Für die durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären Molekülen wurden die Zellen geerntet, in PBS gewaschen und der oben beschriebenen Oberflächenfärbung unterzogen. Im Anschluss wurden die Zellen mit 250μl der BD Fixation/Permeabilisation-Lösung für 20 Minuten bei 4°C fixiert und permeabilisiert. Nach zwei Waschschritten mit BD Perm/Wash Puffer folgte die Inkubation der Zellen mit den gegen intrazelluläre Proteine gerichteten Antiköpern für 30 Minuten bei 4°C. Die 42 2 Material und Methoden Zellen wurden anschließend erneut zweimal mit Perm/Wash Puffer gewaschen, in Fixierlösung resuspendiert und am FACS analysiert. 2.2.11.3 FoxP3-Färbung Für die durchflusszytometrische Untersuchung des Transkriptionsfaktors FoxP3 wurden die Lösungen des FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set von eBioscience nach dem Protokoll der Herstellers verwendet. Die Fixierung/ Permeabilisierung erfolgte für 40 Minuten, die Inkubation mit dem anti-FoxP3 Antikörper für 30 Minuten. 2.2.11.4 PhosFlow-Färbung Über die Phosphorylierung von Tyrosin-, Serin-, oder Threoninresten wird die Aktivität von Signalproteinen wie Kinasen oder Phosphatasen und somit die zelluläre Signaltransduktion gesteuert. Mit Hilfe von Fluorochrom-markierten Antikörpern, die an spezifische Phosphogruppenreste in einem Protein binden, kann der Phosphorylierungsstatus eines Signalproteins nachgewiesen werden. Für die Analyse von Phosphoproteinen wurden die zu untersuchenden Zellen in 15ml Falcons geerntet und in PBS gewaschen. Die Oberfläche der Zellen wurde mit FITC-, Alexa647-, oder BV-konjugierten Antiköpern 15 Minuten auf Eis im Dunkeln angefärbt. Nach einmaligem Waschen der Zellen mit PBS wurden 500μl der vorgewärmten BD Fixation/Permeabilisation-Lösung zugegeben und die Zellen für 10 Minuten im 37°C warmen Wasserbad fixiert. Es folgten zwei PBS-Waschschritte. Unter kontinuierlichem Vortexen wurde 1ml des PhosFlow Perm Puffers III zugetropft und die Ansätze 30 Minuten auf Eis bei Dunkelheit inkubiert. Im Anschluss wurde der Methanol-haltige Permeabilisierungs-Puffer durch drei Waschvorgänge mit dem PhosFlow Waschpuffer entfernt. Aufgrund des lockeren Zellpellets wurde die Zellen ab diesem Waschschritt mit 600 x g für 7 Minuten zentrifugiert. Die PE- oder V450konjugierten Phospho-Antikörper wurden für 35 Minuten bei RT im Dunkeln mit den Zellen inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PhosFlow Waschpuffer wurden die 43 2 Material und Methoden Zellen in 350μl Fixierlösung aufgenommen, in FACS-Röhrchen überführt und am FACSCanto II analysiert. 2.2.12 Zellviabilitäts-Bestimmung Für die Untersuchung der Zellviabilität der CD4+ und DN T-Zellen wurde der Suppressionstest wie beschrieben angesetzt und für 1 bis 3 Tage inkubiert. Um apoptotische Zellen zu identifizieren, erfolgten zum einen Messungen der Aktivität von Caspasen, welche den programmierten Zelltod induzieren. Dafür wurde der Cell Meter Generic Fluorometric Caspase Activity Assay Kit verwendet. Das darin enthaltene Färbereagenz TF2-VAD-FMK (Tide fluor 2- Valyl-Alanyl-Aspartyl-[OMethyl]- Fluoromethylketon) ist Zell-permeabel und bindet irreversibel an die katalytische Domäne der aktivierten Caspasen-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 und -9. Durch die Extinktion des gekoppelten Farbstoffs bei 488nm und dessen Emission bei 520nm können apoptotische Zellen im Durchflusszytometer analysiert werden. Zur Anfärbung der Zellen wurde der Indikator TF2-VAD-FMK wie im Protokoll des Herstellers AAT Bioquest angegeben, für eine Stunde mit den Zellen in der MLR inkubiert, weggewaschen und die Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Zur Bestimmung der Zellviabilität wurden die Zellen zum anderen mit AnnexinV und 7-AAD (7-Aminoactinomycin) angefärbt. AnnexinV bindet an Phosphatidylserin, welches an der Oberfläche von apoptotischen Zellen gefunden werden kann. 7-AAD interkaliert in doppelsträngige DNA und markiert somit spät-apoptotische und nekrotische Zellen. Für die Messung wurden die Zellen der MLR geernet und im Anschluss an eine Oberflächenfärbung in 150μl Annexin-Puffer aufgenommen und mit 5μl AnnexinV-FITC für 10 Minuten bei Dunkelheit gefärbt. Nach der Zugabe von 5μl 7-AAD wurden die Zellen für weitere 5 Minuten inkubiert und unverzüglich im FACS analysiert. 44 2 Material und Methoden 2.2.13 RNA-Isolation Gesamt-RNA wurde aus Zellen mit Hilfe des RNeasy Micro Kit nach dem Protokoll des Herstellers Qiagen isoliert. Die Konzentration der RNA wurde am Nanodrop 2000c Spektrometer (Thermo Scientific) vermessen. 2.2.14 RNA-Sequenzierung Für die Transkriptomanalyse wurden DN T-Zellen von 4 verschiedenen Spendern zunächst in An- oder Abwesenheit von IL-7 in eine MLR mit CD4+ T-Zellen und αCD3/28 Beads eingesetzt. Nach 12 Stunden wurden die Zellen geerntet und die αCD3/28 Beads dabei über einen Magneten entfernt. Im Anschluss wurden die DN T-Zellen mit Hilfe der FACS-basierten Zellsortierung mit einer Reinheit von > 99,6% von den CD4+ T-Zellen abgetrennt. Diese Aufreinigung erfolgte am MoFlow Zellsortierer (Beckman Coulter) in der Core Unit Cell Sorting Erlangen. Die erhaltenen DN T-Zellen wurden lysiert und aus den Zelllysaten Gesamt-RNA isoliert. Die weiteren Schritte wurden in Kooperation mit dem Institut für Humangenetik in Erlangen durchgeführt. Die Qualität der RNA wurde zunächst anhand des 2100 Bioanalyzer Systems (Agilent Technologies) verifiziert. Aus 100ng Gesamt-RNA wurden mit Hilfe des ovation human FFPE RNA-Seq systems (Nugen) barkodierte RNA Sequenz Bibliotheken nach dem Protokoll des Herstellers für geringe RNAMengen erstellt. Zur selektiven Depletion von ribosomaler RNA wurde dabei die InDA-C (Insert Dependent Adapter Cleavage) Methode von Nugen vor der cDNA Synthese angewandt. Um auftretende Varianzen während der Proben- und Datenverarbeitung zuordnen zu können, wurden RNA spike-in Kontrollen von Ambion eingesetzt, welche von dem external RNA control consortium (ERCC) entwickelt wurden. Die anschließende paired-end Sequenzierung (2 x 101bp) der generierten Bibliotheken erfolgte an der HighSeq-2500 Plattform von Illumina. Die rohen Sequenzdaten wurden mittels des STAR aligner Version 2.3.0 [173] mit dem humanen Referenzgenom hg19 abgeglichen. 85% der Daten konnten im Durch- 45 2 Material und Methoden schnitt eindeutig zugeordnet werden. Absolute read counts pro Gen wurden mit dem Subread’s featureCounts Programm [174] berechnet und das gtf Annotationsfile mit Ensembl erstellt. Alle weiteren Analysen wurden mit R Version 3.1.2 durchgeführt [175]. Die differenzielle Expression wurde dabei mit Hilfe des DESeq2 package, dessen statistische Testung auf einer negativen binomialen Verteilung beruht, ermittelt [176]. Signifikant differenziell exprimierte Gene wurde mit der IPA Datenbank abgeglichen und kanonischen Signalwegen sowie funktionellen Gruppen zugeordnet. 2.2.15 Reverse Transkription Für die Synthese von Einzelstrang-cDNA wurden 100ng der isolierten Gesamt-RNA verwendet. Die reverse Transkription erfolgte in Ansätzen von 20μl Gesamtvolumen in einem MasterCycler (Eppendorf). In den Tabellen sind der Reaktionsansatz und der Programmverlauf am Cycler aufgelistet. Nur Mix 1 wurde auf 65°C erhitzt und im Anschluss Mix 2 zugegeben. Die cDNA wurde direkt zur Amplifizierung eingesetzt oder auf -20°C gelagert. Reaktionsansatz: Reagenz Cylcer-Programm: Volumen Temperatur Zeit 1 μl 65°C 5 Min dNTPs 10mM 1 μl 4°C bis Zugabe USB Wasser 12 – x μl RNA-Probe x = 100ng Mix 1: Random Decamers Mix 2 25°C 10 Min 42°C 50 Min 4 μl 70°C 15 Min Dithiothreitol 100mM 2 μl 4°C bis Ende RNase Out 1 μl Reverse Transkriptase 1 μl Mix 2: First Strand Buffer (5x) 46 2 Material und Methoden 2.2.16 Quantitative Polymerase Kettenreaktion Die quantitative Polymerase Kettenreaktion wurde mit dem RotorGene SYBR Green PCR Mastermix in dem StepOnePlus Cycler (Applied Biosystems) durchgeführt. Sämtliche Primer wurden von Qiagen bezogen, nach den Angaben des Herstellers in TE-Puffer gelöst und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Die cDNA-Proben wurden vor dem ersten Einsatz 1:1 in H2O verdünnt und in einem Reaktionsvolumen von 10μl, bestehend aus 1μl cDNA, 5μl SYBR Green, 1μl Primer und 3μl H2O in Duplikaten vermessen. Als Standard wurde pro Primer eine 1:10 und 1:100 verdünnte cDNA-Probe und als Kontrolle ein well mit H2O statt cDNA mit angesetzt. Die Tabelle zeigt das Protokoll der Amplifikation und der anschließenden Messung des Schmelzverhaltens. Die Fluoreszenzmessung erfolgte nach jedem Amplifikationszyklus und kontinuierlich während der Schmelzphase. Phase Temperatur Zeit Aktivierung 95°C 5 Min Denaturierung 95°C 5 Sek Annealing und Elongation 60°C 10 Sek Schmelzkurve 60°C bis 90°C 0,1°C/ Sek 30-40 Amplifikationszyklen: Mit Hilfe der StepOne Software wurde der Ct-Wert, der angibt, bei welchem Zyklus die Fluoreszenz erstmals exponentielle wächst, jeder Probe berechnet und der Mittelwert von den gemessenen Duplikaten gebildet. Die Expression des Zielgens wurde relativ zu dem konstant exprimierten β-2-Mikrogobulin-Referenzgen bestimmt [177]. 47 3 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Messmethoden zur Bestimmung der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen Ein Charakteristikum von humanen DN T-Zellen ist ihre immunregulatorische Aktivität. Um diese Funktion nachweisen zu können, wurde folgendes Modellsystem angewandt und weiterentwickelt: zunächst wurden humane DN T-Zellen von Spender A isoliert und durch Stimulation mit allogenen DZ eines Spenders B für zwei bis fünf Wochen expandiert. Für anschließende Experimente wurden stets DN TZellen verwendet, deren letzte Restimulation mindestens fünf Tage zurück und deren Reinheit über 95% lag. Am Tag des Versuchsansatzes wurden CD4 + T-Zellen des Spenders A isoliert und mit CFSE gefärbt. Die CD4 + T-Lymphozyten wurden schließlich in einer sogenannten „Mixed lymphocyte reaction“ (MLR) mit allogenen DZ des Spenders B und den kultivierten DN T-Zellen im Verhältnis 2 : 1 : 2 inkubiert. Nach fünf Tagen wurde die Proliferation der CD4 + T-Zellen bestimmt, indem deren CFSE-Abnahme durchflusszytometrisch analysiert wurde. Wie in Abbildung 3-1 dargestellt, zeigen unstimulierte CD4+ T-Zellen keine Abnahme von CFSE. Dagegen proliferieren die alloreaktiven CD4+ T-Zellen nach Kokultur mit allogenen DZ sehr stark. Durch Zugabe der DN T-Zellen konnte diese Proliferation fast vollständig supprimiert werden. Die Reduktion der Proliferation von 74% auf 11,7% mit DN TZellen entspricht einer Suppression von 84,2%. Diese Berechnung ergibt sich aus folgender Formel: 48 3 Ergebnisse Abbildung 3-1: Messung von CFSE in CD4+ T-Zellen an Tag 5 der MLR zur Bestimmung der suppressiven Aktivität von DN T-Zellen. Frisch isolierte CD4+ T-Zellen wurden mit dem Farbstoff CFSE gefärbt und zusammen mit vorkultivierten DN T-Zellen desselben Spenders sowie APZ eines allogenen Spenders inkubiert. Nach 5 Tagen wurde die CFSE Abnahme durchflusszytometrisch analysiert. Es wurde auf vitale Lymphozyten, Singuletts und CD4+ Zellen gegated. Dargestellt sind repräsentative Histogramme einer MLR. In Abbildung 3-2 sind 14 unabhängige Experimente zusammengefasst. Nach der fünftägigen Kokultur mit allogenen DZ liegt die durchschnittliche Proliferationsrate der Effektor T-Zellen bei 60%. Durch Zugabe der DN T-Zellen konnte diese auf 24% reduziert werden. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die DN T-Zellvermittelte Suppression unabhängig davon ist, ob die TZR-Stimulation der Zellen in der MLR über allogene DZ oder durch artifizielle anti-CD3/CD28 gekoppelte Beads 49 3 Ergebnisse (αCD3/28) erfolgt [81]. Um einen potentiellen Einfluss der DZ-Population auf die DN T-Zell-Suppression auszuschließen, wurden in nachfolgenden Experimenten teilweise αCD3/28 Beads eingesetzt. Das bisher verwendete Verhältnis von αCD3/28 Beads zu T-Zellen lag bei 1:2 und resultierte in einer Proliferationsrate um 90% ohne DN T-Zellen [81]. Da diese Stimulation außerordentlich stark war, wurde in der folgenden Arbeit ein Verhältnis von 1:50 angewandt. Aus Abbildung 3-2 lässt sich erkennen, dass mit dieser schwächeren αCD3/28 –Stimulation durchschnittlich 70% + der CD4 T-Zellen proliferierten. Außerdem waren die DN T-Zellen ähnlich wie mit DZ-Stimulation in der Lage, diese Proliferation effektiv zu unterdrücken. ** *** 80 % Proliferation DZ aCD3/28 60 40 20 0 +DN +DN + Abbildung 3-2: Vergleich der Proliferation von konventionellen CD4 T-Zellen nach Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads. CD4+ T-Zellen wurden für 5 Tage mit allogenen DZ (weiß) oder mit αCD3/28 (schwarz) in An- oder Abwesenheit von DN T-Zellen kultiviert. Die % Proliferation der CD4+ T-Zellen wurde anhand der CFSE-Messung bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte von 14 unabhängigen Experimenten. Die Bestimmung der Proliferation mittels CFSE kann erst nach einer fünftägigen Kokultivierung durchgeführt werden. Das Readout der MLR sollte daher weiterentwickelt und eine frühzeitigere Bestimmung der suppressiven Funktion ermöglicht werden. 50 3 Ergebnisse Damit Zellen in den Zellzyklus eintreten können, werden von der Zelle zeitlich befristet eine Reihe spezifischer Proteine produziert. Eine Schlüsselrolle kommt dabei den Cyclinen zu, deren Expression im Laufe des Zellzyklus streng reguliert wird [178]. Wie in Abbildung 3-3A skizziert, wird Cyclin E für den Übergang in die SPhase hochreguliert, wohingegen Cyclin A zur Einleitung der G2-Phase benötigt wird. Das Protein Ki-67 wird während aller Phasen des Zellzyklus exprimiert (modifiziert nach [179-181]). Um die Proliferation der CD4+ T-Zellen in der MLR zu ermitteln, wurde die Expression von Cyclin E, Cyclin A und Ki-67 nach 2 Tagen bestimmt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass diese Zellzyklusproteine nach Stimulation in den Effektor T-Zellen hochreguliert werden (Abbildung 3-3B). Durch Zugabe von DN T-Zellen konnte diese Expression unterdrückt werden. Die Bestimmung der Proliferation mit Hilfe der Ki-67-Färbung zeigte die größten Unterschiede zwischen den stimulierten und unstimulierten beziehungsweise supprimierten CD4+ T-Zellen. Im Gegensatz hierzu fielen die messbaren Unterschiede unter Verwendung von Cyclin E wesentlich geringer aus. Die Analyse der Cyclin A Expression ergab ein ähnliches Bild, wobei die Schwankungen zwischen verschiedenen Ansätzen deutlich höher ausfielen. Im Weiteren wurde daher die Proliferationsmessung mit Hilfe von Ki-67 durchgeführt, sofern eine frühe Bestimmung der suppressiven Aktivität notwendig war. 51 3 Ergebnisse Abbildung 3-3: Messung von Zellzyklusmarkern in CD4+ T-Zellen an Tag 2 der MLR (A) Schematisches Modell zur Expression von Zellzyklusproteinen im Verlauf des Zellzyklus. + (B) Die Expression von Cyclin E, Cyclin A und Ki-67 wurde in CD4 T-Zellen an Tag 2 der MLR durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4. 52 3.2 3 Ergebnisse Untersuchung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 3.2.1 Expression und Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors Der IL-7R setzt sich aus einer α-Kette (CD127) und einer γ-Kette (CD132) zu einem Heterodimer zusammen und wird von CD4+ und CD8+ T-Zellen exprimiert [182]. Nachdem bislang unbekannt war, inwieweit DN T-Zellen einen funktionellen IL-7 Rezeptor exprimieren, wurde dessen Expression auf DN T-Zellen im Vergleich zu anderen T-Zellpopulationen durchflusszytometrisch analysiert. Während Treg-Zellen durch eine geringe Expression der α-Kette charakterisiert sind, konnte beobachtet werden, dass humane DN T-Zellen beide Rezeptor-Untereinheiten auf vergleichbarem Niveau zu CD4+ und CD8+ T-Zellen exprimieren (Abbildung 3-4). MFI CD127 1500 Abbildung 3-4: des 1000 IL-7 Expression Rezeptors auf humanen T-Zellpopulationen. PBMC wurden mit CD127 und 500 CD132 angefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Es wurde auf vitale 0 CD4 Treg CD8 DN CD3+ TZRαβ+ T-Lymphozyten MFI CD132 gegated und die angezeigten T5000 Zell-populationen mittels CD4+ 4000 FoxP3- (CD4), CD4+ FoxP3+ CD25+ (Treg), CD8+ (CD8) oder 3000 CD4- CD8- (DN) unterschieden. 2000 Dargestellt ist der Mittelwert der 1000 mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) 0 CD4 Treg CD8 DN von Spendern. 4 analysierten 53 3 Ergebnisse Um die Funktionalität des IL-7R zu überprüfen, wurde die Phosphorylierung von STAT5 mittels PhosFlow-Färbungen durchflusszytometrisch bestimmt. Abbil- dung 3-5A zeigt den durch IL-7 vermittelten Anstieg von phosphorylierten STAT5 auf frisch isolierten CD4+ T-Zellen. Da bekannt ist, dass die Transduktion des IL-7 Signales über einen negativen Feedback-Mechanismus die Herrunterregulation von CD127 induziert, wurde des Weiteren die Expression von CD127 in der MLR untersucht. Dabei konnte eine verminderte Expression von CD127 nach Zugabe von IL-7 festgestellt werden, welche durch die DN T-Zellen nicht beeinflusst wurde (Abbildung 3-5B). 54 3 Ergebnisse + Abbildung 3-5: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in CD4 T-Zellen. (A) Frisch isolierte CD4+ T-Zellen wurden 20 Min. mit IL-7 inkubiert. Phosphoryliertes STAT5 wurde mittels PhosFlow-Färbungen nachgewiesen. Dargestellt ist ein repräsentatives Histogramm sowie der MFI von 3 unabhängigen Experimenten. (B) CD4+ T-Zellen wurden in MLRs in Anoder Abwesenheit von DN T-Zellen und/oder IL-7 eingesetzt und ihre jeweilige Expression von CD127 nach 24 Std. durchflusszytometrisch analysiert. Die relative Expression bezieht + sich auf unstimulierte CD4 T-Zellen. Für sämtliche funktionellen Assays der DN T-Zell-vermittelten Suppression wurden DN T-Zellen verwendet, die zuvor (wie in Kapitel 2.2.7 beschrieben) kultiviert und somit voraktiviert waren. Aus diesem Grund wurde die Expression und Funktionalität des IL-7R auf vorkultivierten DN T-Zellen bestimmt. Die durchflusszytometrischen Messungen ergaben, dass die kultivierten DN T-Zellen ebenfalls den IL-7R 55 3 Ergebnisse exprimieren (Abbildung 3-6A). Die Funktionalität des IL-7R auf den kultivierten DN TZellen zeigte sich durch die Induktion der STAT5-Phosphorylierung (Abbildung 3-6B). Zudem konnte in der MLR eine Herunterregulation von CD127 auf den DN T-Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 3-6C). Abbildung 3-6: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in DN T-Zellen. (A) CD127 und CD132 wurde auf vorkultivierten DN T-Zellen vor ihrem Einsatz in Suppressionsassays angefärbt. Ein repräsentatives Experiment ist dargestellt. (B) Vorkultivierte DN T-Zellen wurden 20 Min. mit IL-7 inkubiert und der Phosphorylierungsstatus von STAT5 durchflusszytometrisch untersucht. Dargestellt ist ein repräsentatives Histogramm sowie der MFI von 5 unabhängigen Experimenten. (C) Die Expression von CD127 wurde auf DN T-Zellen in der MLR ± IL-7 nach 24 Std. durchflusszytometrisch analysiert und relativ zur unbehandelten Kontrollgruppe dargestellt. n=5. 56 3.2.2 3 Ergebnisse Charakterisierung der Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 Nachdem sowohl CD4+ als auch DN T-Zellen als sensitiv gegenüber IL-7 charakterisiert wurden, sollte ermittelt werden, ob IL-7 die immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen beeinflussen kann. Zu diesem Zweck wurde IL-7 direkt in die MLR gegeben. Abbildung 3-7A zeigt anhand eines repräsentativen Experimentes die Wirkung von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression. CD4+ T-Zellen wurden durch die Stimulation mit allogenen DZ zu einer starken Proliferation angeregt, welche durch DN T-Zellen effektiv inhibiert werden konnte. Die Zugabe von IL-7 beeinflusste die proliferative Antwort der stimulierten CD4 + T-Zellen nicht. Allerdings schwächte IL-7 die DN T-Zell-vermittelte Suppression deutlich ab. Wie in Abbildung 3-7B zusammengefasst, wurde durch Zugabe von IL-7 die Suppression der DN T-Zellen auf durchschnittlich nur noch 25% vermindert. Eine signifikante Beeinträchtigung der DN T-Zell-vermittelten Suppression konnte unabhängig von der Art der Stimulation nachgewiesen werden. 57 3 Ergebnisse Abbildung 3-7: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Proliferation von konventionellen CD4+ T-Zellen. CFSE gefärbte CD4+ T-Zellen wurden mit DZ oder αCD3/28 stimuliert und in An- oder Abwesenheit von DN T-Zellen und/oder IL-7 für 5 Tage kokultiviert. In (A) ist die CFSE-Messung der CD4 + T-Zellen von einem repräsentativen Spender abgebildet. In (B) ist die prozentuale Suppression von ≥10 unabhängigen Ansätzen zusammengefasst. Eine Titration der in der MLR eingesetzten IL-7 Konzentration ergab, dass die suppressive Kapazität der DN T-Zellen bereits bei einer Konzentration von 2 ng/ml vermindert wird und dieser Effekt mit 20 ng/ml IL-7 tendenziell verstärkt werden kann (Abbildung 3-8). Außerdem zeigten PhosFlow-Messungen, bei denen unterschiedliche Konzentrationen von IL-7 zugegeben wurden, ein maximales p-STAT5-Signal bei 20 ng/ml. Übereinstimmend ließen die Daten der p-STAT5 und Suppressions- 58 3 Ergebnisse messung erkennen, dass mit einer weiteren Konzentrationserhöhung von IL-7 auf 200 ng/ml keine entscheidende Signalverstärkung und kein Einfluss auf die Suppression erzielt werden kann. Aus diesen Gründen wurde eine IL-7 Konzentration von 20 ng/ml für alle weiteren Versuche verwendet. Abbildung 3-8: Titration der modulatorischen Aktivität von IL-7 auf DN T-Zellen. (A) CD4+ T-Zellen, DZ und DN T-Zellen wurden mit unterschiedlichen IL-7 Konzentrationen + kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die proliferative Antwort der CD4 T-Zellen mittels CFSEMessung bestimmt. Die % Suppression bezieht sich jeweils auf Kontrollansätze, bei denen die CD4+ T-Zellen mit der angegebenen IL-7 Konzentration ohne DN T-Zellen kultiviert wurden. (B) DN T-Zellen wurden für 20 Min. mit unterschiedlichen IL-7 Konzentrationen inkubiert und die STAT5 Phosphorylierung analysiert. Die Histogramme sind repräsentativ für 3 durchgeführte Experimente. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass DN T-Zellen nicht nur die Proliferation sondern auch die Aktivierung und Effektorfunktion von CD4+ T-Zellen inhibieren [81]. Daher wurde untersucht, ob IL-7 diese suppressive Aktivität von DN T-Zellen ebenfalls beeinflusst. Wie in Abbildung 3-9 dargestellt, wurde die Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD154 auf CD4+ T-Zellen durch DN T-Zellen deutlich unterdrückt. Nach Zugabe von IL-7 wurde dieser inhibitorische Effekt signifikant 59 3 Ergebnisse vermindert, so dass die mit IL-7 kultivierten CD4+ T-Zellen trotz Anwesenheit von DN T-Zellen eine starke Expression der Aktivierungsmarker aufwiesen. * 25 ns * 20 15 10 5 N 3/ 28 +I L7 3/ 28 +D N +I L7 3/ 28 +D 3/ 28 0 % CD154+ CD4+ T-Zellen ns ** ns 25000 ns ** CD25 MFI 20000 15000 10000 5000 3/ 28 +I L7 3/ 28 +D N +I L7 N 3/ 28 +D 3/ 28 0 Abbildung 3-9: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Aktivierung von CD4+ T-Zellen. CD4+ T-Zellen wurden mit αCD3/28 Beads, DN T-Zellen und/oder IL-7 kokultiviert und nach 2 Tagen die Expression von CD154 und CD25 auf ihrer Oberfläche durchflusszytometrisch bestimmt. n=7. 60 3.2.3 3 Ergebnisse Einfluss von IL-7 auf die Zell-Viabilität In der Literatur wurde IL-7 als Überlebensfaktor für T-Zellen beschrieben, welcher die starke Expression von anti-apoptotischen Molekülen induziert [183]. Aus diesem Grund stellte sich die Frage, ob eine verbesserte Viabilität der CD4+ T-Zellen die Ursache für die IL-7-vermittelte Inhibition der suppressiven Funktion der DN T-Zellen darstellt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Frequenz apoptotischer CD4+ T-Zellen (Annexin-V+ (AxV+) /7-AAD+) in der MLR bestimmt. Wie in Abbildung 3-10 dargestellt, zeigten die CD4+ T-Zellen in der MLR eine stabile Überlebensfähigkeit. Unabhängig von der Stimulation und der Anwesenheit von DN T-Zellen waren in sämtlichen Ansätzen etwa 10% AxV+ 7-AAD+ CD4+ T-Zellen zu verzeichnen. Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurde die Zellviabilität mittels Caspase-AktivitätsMessungen überprüft. Dazu wurden die Zellen mit einem Substrat, welches von aktiven Caspasen gespalten wird, gefärbt. Die anschließenden durchflusszytometrischen Messungen ergaben, dass IL-7 wiederum keinen Einfluss auf die Viabilität von CD4+ T-Zellen in der MLR ausübte. 61 3 Ergebnisse Abbildung 3-10: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von CD4+ T-Zellen in der MLR. Die Abbildungen zeigen durchflusszytometrische Messungen von MLR-Ansätzen in An- oder + + Abwesenheit von IL-7, bei denen auf CD4 T-Zellen gegated wurde. n≥4. (A) AxV und 7+ + AAD CD4 T-Zellen wurden in der MLR nach 20 Std. bestimmt. (B-C) Die Caspase-Aktivität der CD4+ T-Zellen wurde mittels TF2-VAD-FMK-Färbung nach 2-tägiger MLR analysiert. 62 3 Ergebnisse Damit ein negativer Einfluss auf das Überleben der DN T-Zellen durch IL-7 ausgeschlossen werden kann, wurden in den AnnexinV/7-AAD und den CaspaseAktivitäts-Messungen ebenso die DN T-Zellen analysiert. Wie in Abbildung 3-11 dargestellt, konnte IL-7 in den DN T-Zellen eine geringfügige Verbesserung ihres Überlebens induzieren. Letztlich lässt sich festhalten, dass die Beeinträchtigung der Suppression weder durch eine Änderung der Viabilität von CD4 + T-Zellen noch durch einen Zytokin-induzierten Zelltod der DN T-Zellen zu erklären war. Abbildung 3-11: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von DN T-Zellen in der MLR. Der Prozentsatz an AxV+ 7-AAD+ und Caspase-aktiven DN T-Zellen wurde in MLRs ± IL-7 durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4. 3.2.4 Untersuchung der IL-7 Signaltransduktion in DN T-Zellen Um den zugrundeliegenden Mechanismus der durch IL-7 induzierten Modulation der DN T-Zell-vermittelten Suppression weiter aufzuklären, wurde im Folgenden die zelluläre Signalübertragung von IL-7 untersucht. Zunächst stellte sich die Frage, ob IL-7 einen direkten Effekt auf die DN T-Zellen ausübt und dabei deren suppressive Funktion blockiert oder ob IL-7 über einen indirekten Mechanismus die CD4+ TZellen resistent gegenüber der DN T-Zell-vermittelten Suppression macht. Zur Überprüfung der ersten Hypothese eines direkten IL-7 Effektes auf DN T-Zellen wurde die Signalübertragung von IL-7 in DN T-Zellen durch Verwendung eines pan- 63 3 Ergebnisse JAK-Inhibitors blockiert. Wie im Kapitel 2.2.10 beschrieben, wurden die DN T-Zellen hierfür mit dem Inhibitor vorinkubiert und nach 2-maligem Waschen als SuppressorZellen in der MLR in An- oder Abwesenheit von IL-7 eingesetzt. Wie in Abbildung 3-12 gezeigt, konnte in den DN T-Zellen nach Blockade der JAK-Kinasen keine Verminderung der Suppression festgestellt werden. Die Blockade des IL-7 Signales in DN T-Zellen schien den IL-7 Effekt vollständig zu revidieren. % Suppression 60 40 20 0 DN() IL-7 - + DN(JAK) - + Abbildung 3-12: Blockade der JAK-abhängigen Signaltransduktion in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit einem pan-JAK-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 5 Tagen mittels CFSE-Messung ermittelt. n=4. Da die Daten der JAK-Inhibition darauf hinwiesen, dass IL-7 einen direkten Einfluss auf die Funktion der DN T-Zellen hat, konzentrierten sich weitere Versuche auf die Charakterisierung des IL-7 Signales in den DN T-Zellen. Zunächst wurde der Einfluss des STAT5 Signalweges untersucht. Die STAT5-Inhibition führte allerdings zu keiner Aufhebung des IL-7-vermittelten Effektes auf die Suppression (Abbildung 3-13). Die Suppression wurde hierbei sowohl an Tag 5 mittels CFSE als auch mittels Ki-67 an Tag 2 bestimmt. In Abbildung 3-13 und den nachfolgenden Experimenten sind die Ergebnisse des früheren Messzeitpunktes dargestellt, da die 64 3 Ergebnisse DN T-Zellen mit dem Inhibitor nur vorbehandelt werden und daher eine Revision der Signalinhibition im Laufe mehrerer Tage nicht ausgeschlossen werden kann. % Suppression 100 ** ** 80 60 40 20 0 DN( ) IL-7 - + DN(STAT5) - + Abbildung 3-13: Blockade der STAT5 Signaltransduktion in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit einem STAT5-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n=6. 3.2.5 Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges durch IL-7 Wie in der Einleitung beschrieben, können die IL-7 Rezeptor-assoziierten JAK nicht nur STAT5, sondern auch PI3K phosphorylieren. PI3K katalysiert wiederum die Phosphorylierung von Akt, wodurch GSK-3β sowie mTOR und S6 phosphoryliert werden. Letztlich führt diese Signaltransduktion zur Aktivierung gewisser Transkriptionsfaktoren und einem veränderten Genexpressionsmuster. Nachdem die bisherigen Ergebnisse auf eine Rolle der JAK Signalübertragung bei der Modulation der DN T-Zell-Suppression hindeuteten, die Inhibition von STAT5 jedoch keine Wirkung erzielte, stellten wir die Hypothese auf, dass diese Modulation über den Akt/mTOR Signalweg erfolgen könnte. Es wurde untersucht, inwieweit IL-7 diesen Signalweg in den DN T-Zellen aktiviert. Diese Analysen erfolgten mit Hilfe von PhosFlow-Färbungen der nachgeschalteten Signalmoleküle GSK-3β und S6. Es 65 3 Ergebnisse zeigte sich dabei, dass eine Stimulation der DN T-Zellen mit DZ sowohl die Phosphorylierung von GSK-3β als auch der beiden Phosphorylierungsstellen von S6 am Serin 235/236 und 240 induziert (Abbildung 3-14). Insbesondere wurde diese Phosphorylierung durch Zugabe von IL-7 verstärkt. In unstimulierten Kontrollansätzen konnte durch IL-7 alleine keine Phosphorylierung der Akt/mTOR Kinasen nachgewiesen werden. Demnach steigerte IL-7 die TZR-induzierte Aktivierung der Akt/mTOR Signalkaskade in DN T-Zellen. Abbildung 3-14: Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen durch IL-7. DN T-Zellen wurden VPD gefärbt, über Nacht ohne IL-2 kultiviert und schließlich für 40 Min. mit DZ oder mit DZ und IL-7 stimuliert. Unstimulierte DN T-Zellen dienten als Kontrolle. Der Phosphorylierungsstatus von GSK3β und S6 (an S235/236 und S240) in den VPD+ DN TZellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt. In (A) sind Histogramme eines repräsentativen Experiments abgebildet. (B) zeigt die MFI der phosphorylierten Signalmoleküle von ≥ 6 unabhängigen Experimenten. 66 3 Ergebnisse Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die Amplifikation der Akt/mTOR Signalkaskade mittels IL-7 bis auf die Transkriptionsebene der DN T-Zellen auswirkt. Wie in Abbildung 3-15 dargestellt, wurden in den DN T-Zellen wichtige Transkriptionsfaktoren, die von Akt/mTOR reguliert werden, in Anwesenheit von IL-7 vermehrt exprimiert. x-fache Expression durch IL-7 1.5 ** * ** * 1.0 LF 4 K F4 IR 1 IF H Tbe t 0.5 Abbildung 3-15: Hochregulation von Akt-kontrollierten Transkriptionsfaktoren in DN + T-Zellen durch IL-7. DN T-Zellen wurden in An- oder Abwesenheit von IL-7 mit CD4 TZellen und αCD3/28 Beads kokultiviert. Nach 2 Tagen wurde die intrazelluläre Expression von T-bet, HIF-1α, IRF4 und KLF4 in den DN T-Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die x-fache Expression durch IL-7 wurde in Bezug auf die DN T-Zellen aus den MLR-Ansätzen ohne IL-7 ermittelt. n≥4. 3.2.6 Die Rolle des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation der DN T-Zellvermittelten Suppression Als nächstes stellte sich für uns die Frage, inwieweit der Akt/mTOR Signalweg eine relevante Rolle bei der Modulation der Funktionalität von DN T-Zellen spielt. Hierfür wurde jener Signalweg in den DN T-Zellen blockiert und anschließend ihr suppressives Potential bestimmt. Zum Einsatz kamen dabei drei Inhibitoren mit unterschiedlichen Angriffspunkten an den Kinasen PI3K, Akt und mTOR. Abbildung 3-16 zeigt die suppressive Kapazität der DN T-Zellen in An- oder 67 3 Ergebnisse Abwesenheit von IL-7. Die blockierten DN T-Zellen wiesen trotz IL-7 eine suppressive Aktivität auf, die vergleichbar stark wie die der DN T-Zellen im Kontrollansatz war. Somit konnte mit dem Einsatz der PI3K/Akt/mTOR Inhibitoren die IL-7 vermittelte Modulation der DN T-Zell-Suppression vollständig aufgehoben werden. % Suppression 100 *** ns ns ns DN( ) DN(PI3K) DN(Akt) DN(mTOR) 80 60 40 20 0 IL-7 - + - + - + - + Abbildung 3-16: Blockade des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen. DN TZellen wurden mit einem PI3K-, Akt- oder mTOR-Inhibitor vorbehandelt und als SuppressorZellen in MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n≥6. 3.2.7 Die Rolle weiterer IL-7 induzierter Signalwege bei der Modulation der Suppression Neben STAT5 und Akt/mTOR können auch Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) durch IL-7 aktiviert werden [184]. Inwieweit den MAPK p38, Erk und Jnk bei der Modulation der DN T-Zell-Funktion eine Bedeutung zukommt, wurde mit Hilfe weiterer Blockierungsexperimente untersucht. Im Gegensatz zu den PI3K-, Akt-, mTOR-Blockaden konnte die Inhibition von p38, Erk und Jnk in DN T-Zellen den IL-7 Effekt nicht aufheben (Abbildung 3-17). Bei sämtlichen getesteten MAPK Inhibitionen wurde bei den Ansätzen mit IL-7 eine signifikante Reduktion der suppressiven DN TZell-Aktivität gemessen. 68 3 % Suppression 100 * * ** DN( ) DN(JNK) DN(Erk) DN(p38) - - - - *** Ergebnisse 80 60 40 20 0 IL-7 + + + + Abbildung 3-17: Blockade der MAPK Signalwege in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit einem JNK-, Erk- oder p38-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7 eingesetzt. Die Suppression der CD4+ T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n≥6. Die Signalkaskade der MAPK ist in der Lage, weitere zentrale Signalmoleküle wie das NF-κB zu aktivieren [185]. Da der NF-κB Signalweg einen wichtigen Regulator kritischer T-Zell-Funktionen darstellt, wurde auch dessen Rolle bei der Modulation der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen untersucht. Die Blockade des NF-κB Signalweges hatte allerdings weder einen Einfluss auf die Suppression der DN TZellen noch einen Einfluss auf deren IL-7-vermittelte Modulation (Abbildung 3-18). 69 3 % Suppression 100 ** * DN( ) DN(NFB) Ergebnisse 80 60 40 20 0 IL-7 - + - + Abbildung 3-18: Blockade des NF-κB Signalweges in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit einem NF-κB-Inhibitor vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs ± IL-7 + eingesetzt. Die Suppression der CD4 T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n=7. 3.2.8 Transkriptom-Analyse zur Charakterisierung des molekularen Wirkmechanismus von IL-7/Akt/mTOR in DN T-Zellen Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, dass IL-7 die TZR-induzierte Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges amplifiziert und dadurch die Funktionalität der DN TZellen beeinträchtigt. Akt/mTOR kann eine Reihe von nachgeschalteten Proteinen und zelluläre Prozesse beeinflussen [186-188]. Um den zugrundeliegenden Mechanismus der Modulation der Suppression noch weiter zu charakterisieren, wurde das gesamte Transkriptom von IL-7 behandelten DN T-Zellen analysiert und mit unbehandelten DN T-Zellen verglichen. Abbildung 3-19 stellt das Vorgehen der Transkriptom-Analyse schematisch dar. Es wurde eine MLR bestehend aus CD4 + TZellen, αCD3/28 Beads und DN T-Zellen mit oder ohne IL-7 angesetzt. Nach zwölf Stunden wurden die DN T-Zellen mittels eines Zell-Sorters isoliert und lysiert. Die suppressive Funktion der DN T-Zellen sowie deren Modulation durch IL-7 wurde in einem parallelen MLR-Kontrollansatz durchflusszytometrisch überprüft. Aus den DN 70 3 Ergebnisse T-Zellen 4 unterschiedlicher Spender wurde RNA isoliert und deren Qualität überprüft. Anschließend wurde die RNA in Kooperation mit Prof. Arif Ekici sequenziert und analysiert. Abbildung 3-19: Schema der RNA Sequenzierung von DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden in MLR-Ansätzen in An- oder Abwesenheit von IL-7 eingesetzt. Nach 12 Std. wurden die DN T-Zellen mittels durchflusszytometrischer Zellsortierung abgetrennt. Aus den DN T-Zellen wurde Gesamt-RNA isoliert und diese sequenziert. Differentiell exprimierte Gene wurden mittels DESeq2 ermittelt und mit Hilfe der Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software funktionell annotiert. 71 3 Ergebnisse Die Auswertung der Daten ergab, dass über alle Spender gemittelt und bezogen auf die Kontroll-Zellen in den IL-7 behandelten DN T-Zellen 1301 Gene unterschiedlich exprimiert wurden (p-Wert <0,05). Wie im Genexpressionsprofil (Abbildung 3-20) rot illustriert, wurden 485 Gene in den DN T-Zellen durch IL-7 verstärkt und 816 Gene vermindert exprimiert. Die starke Herrunterregulation der IL-7R α-Kette (log2-fache Veränderung = -0,86) belegt ein funktionelles IL-7 Signal auf die DN T-Zellen im Experiment. Abbildung 3-20: Differentielle Expression von IL-7 behandelten gegenüber unbehandelten DN T-Zellen. Der dargestellte MA Plot zeigt die log2-fache Veränderung der Expression in den IL-7 behandelten DN T-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Gene, die mit p<0,05 differentiell exprimiert wurden, sind rot gekennzeichnet. Das am stärksten regulierte Gen CD127 wurde markiert. Die differentiell exprimierten Gene wurden mit Hilfe der IPA Software weiter analysiert und kanonischen Signalwegen zugeordnet. Die Aufstellung in Abbildung 3-21 zeigt, welche Signalwege durch IL-7 in den DN T-Zellen am stärksten beeinflusst wurden. Darunter befanden sich sowohl JAK/STAT Zytokin-Signalwege, als auch die PI3K/Akt, p70S6K und mTOR Signalwege. Außerdem wurde die Herunterregulation von PTEN, eines zentralen Inhibitors des Akt/mTOR Signalweges, beobachtet. Im Gegensatz zu Akt/mTOR wurden unter den meist-veränderten Signalwegen weder MAPK oder NF-κB Signalwege annotiert. 72 3 Ergebnisse Abbildung 3-21: Zuordnung der differentiell exprimierten Gene kanonischen zu Signalwegen mit IPA Software. Die aus der RNA Sequenzierung ermittelten differentiell exprimierten Gene zwischen IL-7 behandelten und unbehandeten DN T-Zellen wurden mit der „IPA Pathway Analysis“ Funktion analysiert. Die differenziell exprimierten Gene wurden dabei mit der IPA Datenbank abgeglichen und kanonischen Signalwegen zugeordnet. Abgebildet sind die 15 Signalwege, die durch IL-7 in den DN T-Zellen am Signifikantesten verändert wurden. Die markierte „Ratio“ gibt das Verhältnis der Anzahl der Gene unseres Daten- satzes geteilt durch die Anzahl aller annotierter Gene einem Signalweg an. zu 73 3 Ergebnisse Ein Abgleich der differentiell exprimierten Gene mit der IPA Datenbank ergab zudem, dass eine Vielzahl an Genen, die laut Annotation von Akt kontrolliert werden, in den DN T-Zellen verändert exprimiert werden und der Akt Signalweg daher als „Top upstream regulator network“ vorhergesagt wird (p=5,27E-06). Eine Auflistung der Gene, welche durch Akt hoch- beziehungsweise runterreguliert werden, befindet sich in Abbildung 3-22. Differently-expressed genes annotated to Akt regulation log2 fold change AR ATP5A1 BCL2 BCL2A1 BMF CDKN1A CDKN1B COX4I1 CXCR4 E2F2 EGR2 EPAS1 FAS FBXO32 FN1 IER3 IL13 IL1B IL22 IL7R LEF1 MCL1 MUC1 PTGER4 SLC8A1 SOCS3 0,31263 -0,17832 0,21395 -0,28861 -0,3296 0,23649 -0,34280 -0,16922 0,19557 0,21030 -0,21491 0,22374 -0,18201 -0,25099 0,22882 -0,26835 0,24408 0,20133 0,23538 -0,86067 -0,30648 -0,19540 0,37288 -0,17861 0,42967 0,24417 Abbildung 3-22: Annotation des Akt Signalweges als „Top upstream regulator network“. Die Tabelle basiert auf der IPA-Auswertung und zeigt Gene an, welche durch Akt reguliert werden und deren Expression in den DN T-Zellen durch IL-7 signifikant hoch- oder herunterreguliert wurden. 74 3 Ergebnisse Im Folgenden wurde analysiert, welche molekularen und zellulären Funktionen in den DN T-Zellen durch IL-7 beeinflusst werden. Das Clustering der differentiell exprimierten Gene zu funktionellen Gruppen ergab, dass 350 Gene der Funktion „Zellwachstum/-proliferation“ zugeordnet werden (Abbildung 3-23 oben). Um das Clustering für DN T-Zellen zu präzisieren, wurde im nächsten Schritt nach Funktionen gefiltert, die spezifisch für T-Zellen annotiert sind. Wie in Abbildung 3-23 unten zu sehen, wirkte IL-7 auf Funktionen wie T-Zell-Homöostase, Proliferation, Differenzierung und Aktivierung am signifikantesten ein. Most affected molecular and cellular functions p-value # Molecules Cell growth and proliferation 5,81E-21 – 5,53E-05 350 Cell death and survival 1,77E-19 – 5,38E-05 337 Cellular function and maintenance 7,63E-19 – 5,76E-05 284 Functional T-cell annotations p-value # Molecules T cell homeostasis 2,42E-18 86 Quantity of T lymphocytes 5,19E-18 89 T cell development 5,93E-18 84 Proliferation of T lymphocytes 9,23E-17 92 Differentiation of T lymphocytes 1,42E-16 66 Function of T lymphocytes 8,51E-15 51 Cell movement of T lymphocytes 2,12E-14 45 Apoptosis of T lymphocytes 1,86E-13 51 Cell death of T lymphocytes 2,17E-13 55 Activation of T lymphocytes 7,92E-13 58 Abbildung 3-23: Einordnung der differentiell exprimierten Gene zu funktionellen Gruppen. Die durch IL-7 in den DN T-Zellen differentiell exprimierten Gene wurden mit Hilfe der IPA Software zu funktionellen Gruppen geclustert. Oben dargestellt sind die 3 funktionellen Gruppen mit höchster Signifikanz. Unten wurden diese Cluster durch einen Filter spezifiziert, so dass nur die Annotationen, die T-Zell-Funktionen betreffen, angezeigt werden. 75 3 Ergebnisse In Abbildung 3-24 werden ausgewählte differentiell exprimierte Gene aufgezeigt, die mit der Aktivierung, Proliferation und Homöostase von T-Lymphozyten assoziiert wurden. Interessanterweise ergab sich bei der Aufstellung und dem Abgleich mit der Literatur [189-192], dass diverse Anergie-assoziierten Gene in den DN T-Zellen infolge von IL-7 herunterreguliert wurden. Faktoren, die für die Aufrechterhaltung eines anergen Zustandes wichtig sind und in den DN T-Zellen vermindert exprimiert wurden, sind zum Beispiel FoxO, NFAT, p27kip1, NDFIP, EGR2, EGR3, SMAD3, TSC1 und CBL. Abbildung 3-24: Differentielle Expression signifikanter Gene, die mit Aktivierung, Proliferation, Homöostase, Anergie und suppressiver Funktion assoziiert sind. Dargestellt ist die differenzielle Expression von einer Auswahl an Genen, die mit der Aktivierung, Proliferation, Homöostase und Anergie assoziiert worden waren und in den DN T-Zellen durch IL-7 signifikante Expressionsänderungen zeigten. Zur Verifizierung der Transkriptomanalyse wurde die Auswirkung von IL-7 auf die Expression ausgewählter Gene mittels qPCR untersucht. Dazu wurden DN T-Zellen anderer Spender mit αCD3/28 Beads in An- oder Abwesenheit von IL-7 über Nacht kokultiviert. Nach erfolgter RNA-Isolation und Transkription in cDNA wurde die Expression bestimmter Anergie-assoziierter Gene relativ zu einem Housekeeping- 76 3 Ergebnisse Gen quantifiziert. Abbildung 3-25 zeigt die relative Genexpression in IL-7 behandelten DN T-Zellen normiert auf die ohne IL-7 stimulierten DN T-Zellen. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten, dass FoxO4, NFAT, EGR2, EGR3 und CBL durch IL-7 in den DN T-Zellen vermindert exprimiert wurden. Abbildung 3-25: Verifizierung der Expression Anergie-assoziierter Gene in DN TZellen. DN T-Zellen, die aus anderen Spendern als die der Transkriptomanalyse stammten, wurden in An- oder Abwesenheit von IL-7 stimuliert. Nach 16 Std. wurden aus den DN TZellen RNA isoliert und qPCRs durchgeführt. Die Expression von FoxO4, NFAT, EGR2, EGR3 und CBL wurde anhand der δδct-Werte quantifiziert. Die % relative Expression, die sich auf die jeweilige Genexpression der IL-7 unbehandelten Kontroll-DN T-Zellen bezieht, ist von 4 unabhängigen Versuchsansätzen dargestellt. 77 3.2.9 3 Ergebnisse Korrelation des Aktivierungs- und Proliferationszustandes von DN TZellen mit der suppressiven Funktion Die Daten der RNA Sequenzierung deuteten darauf hin, dass IL-7 insbesondere die Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen verstärkt und die Expression von Anergie-assoziierten Genen aufhebt. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Expression von Aktivierungs- und Proliferationsmarkern auf den DN T-Zellen nach IL-7 Stimulation durchflusszytometrisch analysiert. Abbildung 3-26A zeigt den Aktivierungszustand der DN T-Zellen anhand der CD25 und CD154 Expression, die durch IL-7 sichtlich verstärkt wurde im Vergleich zu einer Stimulation mit DZ alleine. In Abbildung 3-26B ist die Messung der Zellzyklusmarker Ki-67 und Cyclin A dargestellt. Wie auch bei der Aktivierung zeigte sich, dass IL-7 die Proliferation der stimulierten DN T-Zellen signifikant steigert. 78 3 Ergebnisse Abbildung 3-26: Verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen durch IL-7. DN T-Zellen wurden in MLRs mit oder ohne IL-7 eingesetzt und ihr Aktivierungs- und Proliferationszustand nach 2 Tagen durchflusszytometrisch analysiert. (A) zeigt die relative Expression von CD25 und CD154 auf IL-7 behandelten DN T-Zellen im Vergleich zu DN TZellen aus MLR-Ansätzen ohne IL-7. (B) zeigt die intrazelluläre Expression von Ki-67 und CyclinA in DN T-Zellen. Die Histogramme zeigen eine repräsentative Messung. Die Daten aus ≥7 unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst und die relative Expression von Ki-67 oder CyclinA in den mit IL-7 kultivierten DN T-Zellen dargestellt. Als Referenz dienten DN T-Zellen, die ohne IL-7 stimuliert worden waren. 79 3 Ergebnisse Im Weiteren wurde untersucht, ob die verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen ihre suppressive Funktion beeinflusst. Hierfür wurden die Datensätze von unabhängigen Experimenten gegeneinander aufgetragen (Abbildung 3-27). Interessanterweise zeigte sich, dass DN T-Zellen umso stärker supprimieren je weniger aktiviert sie sind. Eine ähnliche negative Korrelation zeigte sich auch in der stärkeren Suppression der DN T-Zellen bei geringerer Proliferation. Die durch IL-7 gesteigerte Aktivierung und Proliferation ging mit einer geringeren suppressiven Aktivität einher und korrelierte signifikant. 80 3 Ergebnisse Abbildung 3-27: Korrelation von Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen mit deren suppressiven Funktion. In der MLR ± IL-7 wurde nach 2 Tagen die DN T-Zell+ vermittelte Suppression der CD4 T-Zell-Proliferation ermittelt. Zudem wurde die Expression von CD25 und Ki-67 in den DN T-Zellen ermittelt und die gewonnen Werte gegen die % Suppression aufgetragen. Die negativen Korrelationen wurden mittels der SpearmanAnalyse berechnet. 81 3 Ergebnisse 3.2.10 Modell: Mechanismus zur Modulation der suppressiven Fähigkeit von humanen DN T-Zellen Aus den Ergebnissen der vorliegenden Promotionsarbeit wurde ein Modell zum Mechanismus der Modulation des suppressiven Potentials von DN T-Zellen aufgestellt (Abbildung 3-28). Abbildung 3-28: Schematisches Modell der IL-7 vermittelten Modulation der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen Die Stimulation des TZR induziert in den DN T-Zellen eine Phosphorylierung von Akt, welche durch IL-7 verstärkt wird. Das amplifizierte Akt Signal setzt eine zelluläre Signalkaskade in Gang, die in einem gesteigerten mTOR Signal resultiert. Dadurch 82 3 Ergebnisse werden zentrale Regulatoren wie die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) sowie der Transkriptionsfaktor FoxO gehemmt. Die durch IL-7 veränderten Signalwege führen zu einer gesteigerten Aktivierung der DN T-Zellen. Anergie-assoziierte Gene werden herunterreguliert, wodurch DN TZellen vermehrt in den Zellzyklus eintreten können und proliferieren. Der Zugewinn an Aktivierung und Zellwachstum korreliert allerdings mit einem Verlust an immunregulatorischer Funktion der DN T-Zellen. Somit kann IL-7 über eine kritische Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges die Funktionalität der DN T-Zellen beeinträchtigen. 3.3 Charakterisierung weiterer Modulatoren der Suppression 3.3.1 Akt/mTOR als Angriffspunkt zur Modulation der Suppression Die bisher beschriebenen Ergebnisse ergaben, dass IL-7 die suppressive Funktion der DN T-Zellen beeinträchtigt, indem der Akt/mTOR Signalweg amplifiziert wird. In der Literatur wurde beschrieben, dass bei einer Hyperaktivierung von Akt oder mTOR in Treg Zellen deren immunregulatorischen Funktion verloren gehen kann [193, 194]. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob sich eine Hyperaktivierung von Akt/mTOR in DN T-Zellen in ähnlicher Weise auf deren immunregulatorische Aktivität auswirkt. Zur Aktivierung von Akt wurde das neuartige „small molecule“ SC79 eingesetzt, welches spezifisch an Akt binden und dabei dessen Konformation so ändern kann, dass die Phosphorylierung von Akt durch vorgeschaltete Kinasen erleichtert wird [195]. DN T-Zellen wurden mit SC79 vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in eine MLR eingesetzt. Durch die Überaktivierung von Akt konnte eine signifikante Verminderung der Suppression beobachtet werden (Abbildung 3-29). Da IGF-1 (von engl. insulin-like growth factor 1) als starker natürlicher Akt–Aktivator gilt, wurde weiterhin dieses Hormon zur Überprüfung verwendet [196]. Die mit IGF-1 behandelten DN T-Zellen erwiesen sich ebenso als schlechte Suppressor-Zellen. 83 3 Ergebnisse Abbildung 3-29: Akt-Hyperaktivierung in DN T-Zellen. DN T-Zellen wurden mit den AktAktivatoren SC-79 oder IGF-1 vorbehandelt und als Suppressor-Zellen in MLRs eingesetzt. + Die Suppression der CD4 T-Zellen wurde nach 2 Tagen mittels Ki-67 Messungen ermittelt. n≥6. 3.3.2 Modulation der Suppression durch proinflammatorische Zytokine Der Akt/mTOR Signalweg stellt ein zentrales und komplex vernetztes Element in der T-Zell-Signaltransduktion dar und kann durch eine Reihe von Zytokinen angesteuert werden. Daher wurden abschließend Untersuchungen dazu angestellt, inwieweit Zytokine, die mit GvHD und inflammatorischen Bedingungen assoziiert sind, ebenso einen Einfluss auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber Effektor T-Zellen ausüben können. Dabei wurden die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ und TNF in einer Konzentration von 20 ng/ml in die MLR zugegeben. Die in Abbildung 3-30 dargestellten Messergebnisse zeigen, dass diese Zytokine die suppressive Funktion der DN T-Zellen nicht beeinflussten. 84 3 Ergebnisse Abbildung 3-30: Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression. CFSE gefärbte CD4+ T-Zellen wurden mit DZ und/oder DN T-Zellen und den Zytokinen IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ oder TNF kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die + Proliferation der CD4 T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. n=3. 3.3.3 Modulation der Suppression durch γ-Ketten-Zytokine Darüber hinaus wurden Zytokine, welche für ihre Signaltransduktion die common γKette (CD132) nutzen, auf ihren Einfluss auf die suppressive Kapazität der DN TZellen getestet. Die Experimente ergaben, dass IL-9 und IL-21 keinen Einfluss auf die Funktionalität der DN T-Zellen aufweisen (Abbildung 3-31). Das homöostatische Zytokin IL-15 zeigte im Gegensatz zum verwandten IL-7 ebenso keinen Effekt. Allerdings konnte durch Anwesenheit von IL-4 eine Beeinträchtigung der DN T-Zellvermittelten Suppression beobachtet werden. 85 3 Ergebnisse Abbildung 3-31: Einfluss von y-Ketten-Zytokinen auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression. CFSE gefärbte CD4+ T-Zellen wurden mit DZ und/oder DN T-Zellen und den Zytokinen IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 oder IL-21 kokultiviert. Nach 5 Tagen wurde die Proliferation + der CD4 T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. n≥4. 86 4 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Modulation der humanen DN T-Zell-vermittelten Suppression durch IL-7 Humane DN T-Zellen weisen eine starke suppressive Funktion gegenüber TZellantworten auf und sind damit an der Regulation des Gleichgewichtes zwischen Immunreaktivität und Immuntoleranz beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte aufgeklärt werden, ob die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber alloreaktiven T-Zell-Antworten moduliert werden kann. Im Fokus der Untersuchung stand dabei das Zytokin IL-7, welches einen bedeutenden Überlebens- und Proliferationsfaktor für T-Zellen darstellt und in zahlreichen Studien mit dem Auftreten einer GvHD assoziiert worden war. 4.1.1 Einfluss von IL-7 auf die suppressive Aktivität humaner DN T-Zellen Um den Einfluss von IL-7 auf humane immunregulatorische DN T-Zellen zu charakterisieren, wurde zunächst die Expression des IL-7R untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die humanen DN T-Zellen beide Rezeptoruntereinheiten CD127 und CD132 - auf einem vergleichbaren Niveau wie CD4+ und CD8+ T-Zellen exprimieren. Im Gegensatz dazu exprimieren natürliche Treg-Zellen CD127 nur gering [102, 103]. DN T-Zellen sind im Vergleich zu Treg-Zellen somit vermutlich sensitiver gegenüber geringeren IL-7 Konzentrationen. Da in unseren Versuchsansätzen expandierte DN T-Zellen eingesetzt wurden und die Untereinheit CD127 in Folge einer TZR-Stimulation herunterreguliert werden kann [197], wurde die Expression des IL-7R auf den kultivierten DN T-Zellen überprüft. Die wöchentliche Stimulation der DN T-Zellen unter Kulturbedingen führte jedoch zu keinem anhaltenden Mangel der CD127 Expression. Die vorkultivierten DN T-Zellen, die fünf bis sieben Tage nach der letzten Restimulation in die Proliferationsassays eingesetzt wurden, zeigten vor Versuchsansatz ebenso eine stabile CD127 Expression. Die Funktionalität des IL-7R konnte durch die nachgewiesene Phosphorylierung von STAT5 nach Stimulation mit IL-7 belegt werden. 87 4 Diskussion Zur Bestimmung der suppressiven Aktivität von humanen DN T-Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit die proliferative Antwort von in der MLR stimulierten CD4+ TZellen analysiert. Um die Frage zu beantworten, ob IL-7 einen Einfluss auf die DN TZell-vermittelte Suppression von T-Zell-Antworten hat, wurde exogenes IL-7 zu der MLR zugegeben. Interessanterweise konnte in den vorliegenden Untersuchungen dokumentiert werden, dass die suppressive Funktion der DN T-Zellen durch IL-7 deutlich eingeschränkt wird. So wurde die Proliferation der Effektor T-Zellen durch die DN T-Zellen bei Anwesenheit von IL-7 nicht mehr effektiv unterdrückt und darüber hinaus die DN T-Zell-vermittelte Suppression der T-Zell-Aktivierung signifikant beeinträchtigt. Da IL-7 über einen negativen Feedback-Mechanismus CD127 herunterreguliert und nach Zugabe von IL-7 in die MLR eine verminderte Expression von CD127 sowohl auf den DN als auch auf den CD4+ T-Zellen beobachtet wurde, konnte hiermit nachgewiesen werden, dass sowohl die Suppressor- als auch die Responder-Zellen in der MLR ein IL-7 Signal erhalten. Aus diesem Grund stellte sich die Frage, durch welche T-Zellpopulationen die beeinträchtige DN T-Zell-vermittelte Suppression vermittelt wird. Ein Effekt von IL-7 auf DZ konnte ausgeschlossen werden, da unter Verwendung von αCD3/28 Beads in der MLR vergleichbare Resultate erzielt wurden. Weiterhin könnte IL-7 direkt auf die CD4+ T-Zellen wirken und damit eine Resistenz gegenüber der Suppression induzieren. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass eine Hyperaktivierung des Akt Signalweges in Effektor T-Zellen deren Sensitivität gegenüber der Suppression von Treg-Zellen mindert [198, 199]. Ferner wurde beschrieben, dass γc-Zytokine eine Resistenz gegen die immunregulatorische Aktivität von Treg-Zellen auslösen können. So war IL-15 in der Lage, in CD4+ und CD8+ T-Zellen Resistenz gegenüber der Suppression von Treg-Zellen zu induzieren [200]. Außerdem konnte IL-21 der regulatorischen Aktivität von Treg-Zellen entgegenwirken, indem die Proliferation der Effektor T-Zellen gesteigert wurde [201]. Da IL-7 das Überleben und die Proliferation von CD4 + T-Zellen beeinflussen kann [202], wäre eine direkte Beeinflussung der CD4+ T-Zellen in unseren Versuchsansätzen möglich gewesen. Die Kontrollansätze ohne DN T-Zellen zeigten jedoch, dass IL-7 die Aktivierung oder Proliferation der CD4+ T-Zellen nicht signifikant steigert. Der ausbleibende Effekt von IL-7 auf die CD4+ T-Zellen liegt vermutlich in der relativ 88 4 Diskussion starken Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads begründet. Die Quantifizierung der apoptotischen Zellen mittels AxV/7AAD- oder Caspase-Färbung zeigte ferner keinen Überlebensvorteil der CD4+ T-Zellen durch IL-7. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-7 keine Resistenz der CD4+ T-Zellen gegenüber der DN T-Zell-vermittelten Suppression induziert. Aus den Zytotoxizitätsmessungen lassen sich zudem weitere Schlussfolgerungen ziehen: zum einen zeigte sich bei den Ansätzen mit DN T-Zellen kein Anstieg an toten CD4+ T-Zellen, sondern tendenziell eher ein Rückgang. Da DN T-Zellen die Aktivierung der CD4+ T-Zellen unterdrücken, mindern sie vermutlich eher den Aktivierungs-induzierten Zelltod von Effektor T-Zellen [11]. Zum anderen bestätigten die Daten vorangegangene Arbeiten, dass humane DN T-Zellen, im Gegensatz zu ihrer murinen Entsprechung, die Suppression gegenüber T-Zellen nicht durch die Induktion von Zelltod vermitteln [55, 81]. Die einzige Studie, die sich bislang mit einer Modulation der DN T-Zell-Funktion beschäftigt hat, stellte im Mausmodell fest, dass IL-10 die DN T-Zellen anfällig gegenüber Apoptose werden lässt und somit die suppressive Aktivität mindert [92]. Unsere Daten zeigten, dass IL-7 das Überleben der DN T-Zellen in der Kokultur geringfügig verbessert. Folglich liegt der Beeinträchtigung der DN T-Zell-vermittelten Suppression keine Abnahme der DN T-Zellzahl durch IL-7 zu Grunde. Die später diskutierten Untersuchungen ergaben vielmehr, dass IL-7 einen direkten Einfluss auf die Funktionalität der DN T-Zellen ausübt. Der Befund, dass IL-7 die immunregulatorische Funktion der DN T-Zellen signifikant minderte, zeigt einen neuen und vielversprechenden Angriffspunkt zur Modulation der peripheren Immuntoleranz auf. Diese Modulation könnte insbesondere nach allogener HSZT im Spannungsfeld zwischen einerseits der Rekonstitution des Immunsystems und andererseits der Vermeidung einer GvHD eine entscheidende Rolle spielen. Wie unterschiedliche Studien darlegten, kommt den DN T-Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, alloreaktive Effektor T-Zellen zu unterdrücken, ein interessantes therapeutisches Potential zu. So wurde für murine DN T-Zellen nachgewiesen, dass sie in der Lage sind, die Schwere einer GvHD zu mindern oder 89 4 Diskussion deren Entwicklung ganz zu verhindern und dabei trotzdem den notwendigen GvLEffekt zur Tumorbekämpfung aufrecht zu erhalten [55, 77, 84, 85]. Klinische Studien bei Patienten nach allogener HSZT wiesen auf einen ähnlichen therapeutischen Nutzen der DN T-Zellen hin, nachdem das Auftreten und die Schwere der GvHD nach HSZT mit der Frequenz an DN T-Zellen invers korreliert [82, 83]. Hinsichtlich des therapeutischen Ziels, eine GvHD mittels DN T-Zellen zu verhindern, ist die Charakterisierung von Einflussfaktoren auf die suppressive Aktivität von DN T-Zellen von großem Interesse. In dieser Arbeit konnte in IL-7 erstmals ein Modulator der Funktionalität von humanen DN T-Zellen identifiziert werden, der den Erfolg einer HSZT beeinflussen könnte. IL-7 spielt eine entscheidende Rolle nach HSZT, indem es die T-Zell-Entwicklung und die Expansion von peripheren T-Zellen fördert [122]. Ein erhöhter IL-7 Spiegel, wie er unter lymphopenischen Bedingungen nach HSZT zu finden ist, kann daher auf der einen Seite die Immunrekonstitution fördern [137, 159]. Auf der anderen Seite zeigten diverse Untersuchungen auf, dass IL-7 an der Entwicklung einer GvHD beteiligt ist und dass eine hohe IL-7 Konzentration nach HSZT somit einen prädiktiven Biomarker der GvHD darstellt [160, 161, 165, 166]. Warum IL-7 die Inflammation und Gewebeschäden nach HSZT begünstigt, ist bislang unklar. In der Literatur wurde diskutiert, ob IL-7 die Aktivierung und Proliferation von alloreaktiven T-Zellen und daher die GvHD fördert [162]. Die hier vorliegenden Daten konnten diese Hypothese zumindest für CD4 + T-Zellen nicht bestätigen. Inwieweit die Immunreaktion von alloreaktiven CD8+ T-Zellen möglicherweise durch IL-7 beeinflusst wird, bleibt aufzuklären. Unsere Ergebnisse deuten an, dass IL-7 unter anderem die suppressive Funktion der DN T-Zellen beeinträchtigt, und dadurch die GvHD-auslösenden Effektor T-Zellen von den DN T-Zellen nicht mehr unter Kontrolle gebracht werden können. Insofern setzt IL-7 durch den Einfluss auf die DN T-Zellen zelluläre immunregulatorische Mechanismen außer Kraft. Damit übereinstimmend wäre denkbar, dass eine IL-7R Blockade die DN T-Zell-Funktion wiederherstellt. Im murinen Modell konnte das Auftreten einer GvHD mit Hilfe einer Blockade der IL-7R α-Kette vermieden werden [163]. Unsere Daten stellen diese Beobachtungen in einen neuen Zusammenhang, da die Auswirkungen von IL-7 bisher nur auf Effektor T-Zellen analysiert wurden, die Effekte auf DN T-Zellen bisher jedoch unberücksichtigt blieben. Wie wir zeigen konnten, exprimieren DN T-Zellen 90 4 Diskussion beide IL-7R-Ketten. Eine Blockade des IL-7R hat somit vermutlich einen beachtenswerten Einfluss auf die DN T-Zellen und ihre Funktion. Obwohl Treg-Zellen eine geringe Expression der IL-7R α-Kette aufweisen, zeigten Studien, dass hohe IL-7 Konzentrationen ihre suppressive Aktivität beeinflussen können [156-158]. Der Effekt von IL-7 auf die Funktion von Treg-Zellen und weitere immunregulatorische Zellen nach HSZT wurde bislang nicht untersucht. Möglicherweise werden nicht nur die DN T-Zellen sondern auch andere immunregulatorische T-Zellen in ihrer Funktion beeinträchtigt, was letztlich im Zusammenspiel die Immuntoleranz bricht und die Entwicklung einer schweren GvHD begünstigt. In verschiedenen präklinischen und klinischen Studien wurde versucht, mit Hilfe von rekombinantem humanem IL-7 (CYT107) die Rekonstitution des T-Zell- Kompartiments zu verbessern [96, 142]. Während rekombinantes IL-7 in der Lage ist, CD4+ und CD8+ T-Zellen zu expandieren, scheint IL-7 die Expansion von TregZellen nur in einem geringeren Ausmaß zu fördern [141, 142]. Es wäre interessant aufzuklären, inwieweit IL-7 die Rekonstitution von DN T-Zellen nach HSZT beeinflusst. Der Einsatz von rekombinantem IL-7 wird sehr kontrovers diskutiert und viele Studien mahnen zum vorsichtigen Gebrauch, da sie das Risiko einer GvHDEntstehung oder Exazerbation sehen [126, 135, 203]. Unsere Ergebnisse unterstützen diese Bedenken, da die IL-7-vermittelte Einschränkung der DN T-ZellSuppression in einer Zunahme an alloreaktiven T-Zell-Antworten resultieren könnte. Wie in der Einleitung erläutert, gibt es viele Hinweise darauf, dass IL-7 ebenso bei bestimmten Autoimmunerkrankungen eine entscheidende Rolle als Modulator des Gleichgewichts zwischen T-Zell-Reaktivität und Immuntoleranz spielt. Bei Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis zeigte sich zum Beispiel, dass IL-7 die suppressive Funktion von Treg-Zellen aufhebt [154, 155]. Unsere Ergebnisse zeigen auf, dass diese Beeinträchtigung der Immuntoleranz durch IL-7 möglicherweise noch schwerer ausfällt, da IL-7 zusätzlich auch noch die suppressive Aktivität der DN TZellen brechen kann. Dieses Resultat mag auch im Kontext von Diabetes Typ I relevant sein. Untersuchungen an Diabetes mellitus ergaben, dass der Lymphopenie-assoziierte Anstieg der IL-7 Spiegel zur Expansion von selbstreaktiven T-Zellen 91 4 Diskussion führt [147]. Wie Blockaden des IL-7 Signalweges eindrücklich zeigten, ist IL-7 durch seine Wirkung auf T-Zellen an dem Auftreten der Stoffwechselkrankheit beteiligt [148, 149]. Andere Studien stellten fest, dass DN T-Zellen die Fähigkeit besitzen, die autoreaktiven T-Zellen, die die Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas angreifen, effektiv zu unterdrücken und dadurch die Ausbildung der Autoimmunkrankheit zu verhindern [64-67]. Aus diesen Befunden kann geschlussfolgert werden, dass der Funktion von DN T-Zellen eine kritische Bedeutung zum Schutz vor Diabetes mellitus zukommt. Unsere Daten lassen vermuten, dass die Expansion der selbstreaktiven T-Zellen bei höheren IL-7 Spiegeln unter Anderem in einem Verlust der DN T-Zell-Funktionalität begründet sein könnten. In einem autologen Proliferationsassay könnte überprüft werden, inwieweit IL-7 die DN T-Zell-Suppression gegenüber selbstreaktiven T-Zellen beeinflusst. Für zukünftige therapeutische Ansätze, die die Immuntoleranz bei Autoimmunerkrankungen erhöhen sollen, könnte nicht nur der Einsatz von DN T-Zellen, sondern auch eine Inhibition des IL-7 Signales Potential tragen. 4.1.2 Signaltransduktion in den DN T-Zellen Nachdem unsere Ergebnisse aufzeigten, dass IL-7 die DN T-Zell-vermittelte Suppression moduliert, wurde durch Blockade bestimmter IL-7 Signaltransduktionswege analysiert, inwieweit IL-7 einen direkten Effekt auf die DN T-Zellen ausübt. Damit die Inhibition des IL-7 Signales spezifisch in den DN T-Zellen und nicht in den CD4+ T-Zellen erfolgt, wurden die DN T-Zellen mit dem Inhibitor vorbehandelt. Als erster Versuch erfolgte eine Blockade der IL-7R α-Kette auf DN T-Zellen mit einem inhibierenden anti-CD127 Antikörper nach der Beschreibung von Heninger et al. [157]. Dieser Ansatz erwies sich jedoch als problematisch und brachte keine konsistenten Messdaten hervor. Methodisch könnte dies darin begründet sein, dass die Bindung des Antikörpers unspezifisch oder nicht langanhaltend stabil an CD127 erfolgt. Zudem konnte nicht ausgeschlossen werden, dass der Antikörper ausschließlich eine blockierende Wirkung und keine aktivierende oder zytotoxische Wirkung auf die T-Zellen hat. Weiterhin konnte eine mögliche Interaktion des 92 4 Diskussion Antikörpers mit den Serumkomponenten im Kulturmedium nicht ausgeschlossen werden. Die in dieser Arbeit etablierte Ki-67-Messung ermöglichte eine frühe Bestimmung der Suppression nach nur zweitätiger Kokultur, wodurch die Problematik einer Abnahme der Blockade im Laufe der Zeit weitgehend umgangen werden konnte. Die Methode wurde außerdem dahingehend optimiert, dass statt eine Blockade über Antikörper chemische Substanzen zur Inhibition verwendet wurden. Diese ausgewählten Inhibitoren sind durch eine hohe Spezifität sowie definierte Blockadeeigenschaften charakterisiert, die in diversen Studien bereits erfolgreich nachgewiesen wurden (siehe Material und Methoden für konkrete Literaturangaben). Mittels einer pan-JAKInhibition konnte dadurch ein aussagekräftiges Ergebnis erzielt werden. Hierbei führte die Blockade der IL-7 Signaltransduktion in den DN T-Zellen zu einer vollständigen Aufhebung der IL-7-vermittelten Beeinträchtigung der Suppression. Da die Literatur darlegt, dass IL-7 über JAK den STAT5 Signalweg aktivieren kann, wurde zunächst erwartet, dass die STAT5-Inhibition zu einem ähnlichen Ergebnis wie eine pan-JAK-Inhibition führt. Das STAT5 Signal erwies sich jedoch für den IL-7 Effekt als irrelevant. Dieser Befund lässt darauf schließen, dass andere Signalmoleküle, die von JAK aktiviert werden, für die Modulation der Suppression verantwortlich sind. STAT5 wird zwar durch IL-7 in den DN T-Zellen phosphoryliert, spielt aber keine Rolle bei der Suppression. Als potentielles Signalmolekül, welches durch JAK ebenso aktiviert werden kann, kommt PI3K in Frage. Die Kinase PI3K setzt sich aus unterschiedlichen Untereinheiten zusammen. Die Untereinheit p85 beinhaltet SH2Domänen und kann an phosphoryliertes Tyrosin-449 im zytoplasmatischen Teil der IL-7R α-Kette binden [204, 205]. Dadurch kann IL-7 über JAK die PI3K aktivieren und weiterhin den Akt Signalweg in T-Zellen anschalten [206]. Wie die Ergebnisse unserer PhosFlow-Analysen ergaben, wird der Akt Signalweg - vermutlich über Jak/PI3K - in den DN T-Zellen durch IL-7 amplifiziert. Obwohl in der Literatur auf den Zusammenhang von JAK/PI3K/Akt im Gegensatz zu JAK/STAT seltener eingegangen wird, zeigte sich in dieser Arbeit, dass dem JAK/PI3K/Akt Signalweg bei der IL-7 Signaltransduktion in die DN T-Zellen eine entscheidendere Bedeutung zukommt. Wie die Ergebnisse zeigten, konnte die Beeinträchtigung der suppressiven Funktion 93 4 Diskussion durch die Blockade der PI3K vollständig revidiert werden. In der Literatur wurde beschrieben, dass IL-7 über STAT5 und PI3K unterschiedliche Funktionen beeinflussen kann [207]. Während STAT5 beispielsweise für die T-Zell- Differenzierung notwendig zu sein scheint, zeigte sich für die PI3K eine essentielle Rolle für das Überleben und die Proliferation von T-Lymphozyten [208]. In CD8+ TZellen zeigte sich, dass STAT5 und PI3K abhängig vom Differenzierungsstatus die Expression von unterschiedlichen Genen induzieren beziehungsweise kontrollieren [209]. Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Beobachtungen überein. So konnte ausschließlich PI3K und nicht STAT5 die suppressive Funktion der DN T-Zellen modulieren. Neben STAT5 und PI3K/Akt gibt es noch einen weiteren Signalweg über MAPK, der im Diskurs steht, durch IL-7 aktiviert werden zu können. Verschiedene Studien zeigten, dass IL-7 die zentralen MAPK p38, Erk und JNK aktivieren und dadurch unter anderem das T-Zell-Wachstum fördern kann [184, 210, 211]. Weitere Untersuchungen legten jedoch kontrovers dar, dass IL-7 die Aktivität der MAPK nicht beeinflusst [207, 212]. Möglicherweise sind nur bestimmte MAPK für spezifische durch IL-7-modulierbare T-Zell-Funktionen relevant. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob MAPK an der IL-7-induzierten Modulation der DN T-Zell-Suppression beteiligt sind. Bei den Blockadeexperimenten konnte keine Relevanz der MAPK auf die IL-7-vermittelte Modulation der DN T-ZellFunktionalität nachgewiesen werden. Zusätzlich zeigte sich, dass weder eine Blockade von p38, noch von JNK oder Erk eine Auswirkung auf die Funktion von unbehandelten DN T-Zellen hat. Diese Beobachtung lässt Rückschlüsse auf den Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression zu, bei dem die MAPK keine bedeutsame Rolle zu spielen scheinen. Im Gegensatz zu den hier untersuchten DN T-Zellen wurden bei anderen regulatorischen T-Zellenpopulationen eine Verknüpfung des p38 Signalweges mit der suppressiven Funktion beschrieben [213, 214]. Allerdings ist der p38 Signalweg bei diesen regulatorischen T-Zellen vermutlich mit einem anderen Mechanismus zur Vermittlung der Suppression assoziiert als im Falle der DN T-Zellen. 94 4 Diskussion NF-kB ist ein zentraler Transkriptionsfaktor in Lymphozyten und kann durch eine Reihe von Signalwegen, unter anderem auch von IL-7 sowie von MAPK und PI3K, angesteuert werden [185, 215]. Unsere Daten weisen darauf hin, dass dieser Transkriptionsfaktor jedoch an der suppressiven Funktion der DN T-Zellen und deren Modulation nicht beteiligt ist. Bei der Analyse des zugrundeliegenden Mechanismus, wie IL-7 die Funktionalität der DN T-Zellen mindert, konnte in dieser Arbeit ein spezifischer Signalweg identifiziert werden, der für die Modulation verantwortlich ist. Der Akt/mTOR Signalweg spielt bei der Regulation von Überleben, Proliferation, Differenzierung und dem Metabolismus von T-Zellen eine zentrale Rolle [125, 216]. Die Aktivierung des Signalweges kann in CD4+ und CD8+ T-Zellen über den TZR und kostimulatorische Rezeptoren erfolgen [217, 218]. Darüber hinaus können Wachstumsfaktoren wie IL7 oder IGF-1 den Signalweg ebenso induzieren [196, 206, 219]. Inwieweit die Signaltransduktion in den DN T-Zellen ihre Funktionalität steuert, wurde vor dieser Arbeit weder im murinen noch humanen System untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Stimulation des TZR mittels allogenen DZ oder αCD3/28 Beads zu einer Induktion des Akt/mTOR Signalweges führt und dieses Signal durch IL-7 deutlich amplifiziert wird. Die durchflusszytometrischen Messungen ergaben, dass IL-7 nicht nur zentrale Signalproteine in den DN T-Zellen verstärkt aktiviert, sondern auch die Genexpression von Akt/mTOR-regulierten Transkriptionsfaktoren signifikant ändert. Die Daten der Transkriptomanalyse bestätigten, dass durch IL-7 in den DN T-Zellen insbesondere der JAK und PI3K/Akt/mTOR Signalweg amplifiziert wird und andere Signalwege wie die der MAPK nicht oder nur sehr geringfügig beeinflusst werden. Der starke Einfluss von IL-7 auf den EIF2 (von engl. Eukaryotic Initiation Factor 2) Signalweg, welcher für die Translationsinitiation verantwortlich ist, lässt auf Änderungen in der ribosomalen Proteinsynthese schließen. Der Befund der vollständigen Aufhebung des IL-7 vermittelten Effektes mittels der Akt/mTOR Blockade unterstützt die These, dass ein Einfluss von IL-7 auf die CD4+ T-Zellen oder auf andere Signalwege in den DN T-Zellen vernachlässigbar ist. Außerdem lässt sich daraus auf eine kritische Funktion des Akt/mTOR Signalweges 95 4 Diskussion in DN T-Zellen schließen. Die Daten der Hyperaktivierung des Signalweges mit Substanzen wie SC-79 anstatt von IL-7, welche ebenso eine Beeinträchtigung der DN T-Zell-Suppression auslöste, bekräftigen diese Schlussfolgerung. Die Bedeutsamkeit von Akt/mTOR bei Treg-Zellen wurde bereits in verschiedenen Studien untersucht. So führte die Hyperaktivierung von Akt zu einem Verlust der suppressiven Funktion von Treg-Zellen [193, 220]. Eine Deletion des Proteins PTEN, welches den Akt/mTOR Signalweg spezifisch inhibiert, schränkte die Treg-vermittelte Suppression gegenüber T-Zellen ebenso stark ein [194]. Das Aktivierungslevel von Akt/mTOR scheint demnach für die immunregulatorische Funktion von Treg-Zellen entscheidend zu sein. Nachdem die Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges auch für die Funktionalität von DN T-Zellen bedeutend ist, könnte vermutet werden, dass Akt/mTOR grundsätzlich eine wichtige Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des immunregulatorischen Potentials von T-Zellen hat. Ob der Verlust der immunregulatorischen Funktion von Treg-Zellen, der durch IL-7 in den bereits erwähnten Studien beobachtet wurde, wie bei DN T-Zellen mit einer spezifischen Amplifikation des Akt/mTOR Signalweges zusammenhängt, wäre für folgende Untersuchungen interessant. Wie vorangegangene Arbeiten unserer Gruppe zeigten, brauchen DN T-Zellen ein TZR-Signal, um ihre suppressive Aktivität zu erlangen [81]. Aufgrund von Beobachtungen an Treg-Zellen liegt die Hypothese nahe, dass das TZR-induzierte Akt/mTOR Signal in DN T-Zellen fein gesteuert wird. Die Intensität des Akt Signales hat dabei ausschlaggebenden Einfluss darauf, ob T-Zellen eine regulatorische Funktion oder vielmehr einen Effektor-Phänotyp bekommen [221, 222]. Verschiedene Studien zeigten, dass eine gemäßigte Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges für die suppressive Funktion von Treg-Zellen eine Notwendigkeit darstellt [223, 224]. Diese kann dadurch erzielt werden, dass Treg-Zellen spezifische Phosphatasen wie PTEN und PHLPP1 (von engl. PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatase) konstitutiv hoch exprimieren [221, 225]. PTEN gilt als dominierender negativer Regulator von Akt, dem daher eine zentrale Bedeutung bei der Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz zukommt [226]. Unsere RNA- Sequenzierungsdaten zeigten eine durch IL-7 vermittelte Herunterregulation von 96 4 Diskussion PTEN in DN T-Zellen sowie eine verminderte Expression zahlreicher Zielproteine, die zufolge der IPA Datenbank durch PTEN reguliert werden. Inwieweit sich die PTEN-Expression in DN T-Zellen von anderen T-Zellen unterscheidet und dadurch möglicherweise einen Einfluss auf die Funktionalität der DN T-Zellen ausübt, muss in zukünftigen Experimenten untersucht werden. Der Akt/mTOR Signalweg kann in CD4+ T-Zellen die Expression von FoxP3 regulieren [224]. Durch die Aktivierung des Akt Signales wurde eine Schwächung der transkriptionellen „Signatur“ von Treg-Zellen (nach [227]) beobachtet, die teilweise auf FoxP3 und teilweise auf unbekannte Faktoren zurückzuführen war [223]. Da sich DN T-Zellen durch eine fehlende Expression von FoxP3 auszeichnen, müssen andere Faktoren unterhalb des Akt Signales die Reduktion ihrer suppressiven Funktion verursachen. Die zahlreichen Studien, die eine entscheidende Bedeutung des Akt/mTOR Signalweges bei Treg-Zellen aufzeigten, unterstützen das aus unseren Daten generierte Modell, dass der Aktivierungszustand des Akt/mTOR Signalweges eine große Relevanz bei der immunologischen Toleranz haben kann. In der vorliegenden Arbeit beeinträchtigte die Hyperaktivierung von Akt/mTOR mittels IL-7 und zudem mittels IGF-1, SC-79 und möglicherweise auch IL-4 die immunregulatorische Funktion von DN T-Zellen. Das Aktivierungslevel von Akt/mTOR scheint demnach das suppressive Potential der DN T-Zellen und die Immuntoleranz kritisch zu beeinflussen. Dieser Befund ist hinsichtlich der therapeutischen Modulation der Immuntoleranz interessant. Da der Akt/mTOR Signalweg ein zentraler Regulator von einer Vielzahl an Funktionen von T-Zellen und mit diversen Krankheitsbildern assoziiert ist, konzentrieren sich unterschiedliche Forschungsarbeiten darauf, wie auf den Signalweg bestmöglich Einfluss genommen werden kann. Eine Reihe von spezifischen Inhibitoren dieses Signalweges findet bereits in der Klinik Verwendung. mTOR-Inhibitoren wie Rapamycin (oder Sirolimus), Everolimus oder Temsirolimus werden standardmäßig in der Transplantationsmedizin als Immunsuppressiva oder bei Autoimmunerscheinungen zur Minderung der Inflammation eingesetzt [228]. Zur Vorbeugung der GvHD kommen diese Inhibitoren auch bei der Konditionierung vor HSZT zum Einsatz. Bereits über 1000 klinische Studien wurden zur Evaluation 97 4 Diskussion vielfältiger Therapieoptionen, die allesamt im mTOR Signalweg eingreifen, durchgeführt [229, 230]. Analog zu mTOR-Inhibitoren werden Akt-Inhibitoren wie Perifosin, MK-2206 oder GSK-2141795 aufgrund ihrer anti-proliferativen Wirkung im Besonderen zur Tumortherapie verwendet [231, 232]. Eine Reihe an PI3KInhibitoren finden sich im klinischen Zulassungsprozess, während das bereits zugelassene Idelalisib zur Behandlung der chronisch lymphatischen Leukämie und bei B-Zell-Lymphomen eingesetzt wird [233, 234]. Wie Ahmad et al. kürzlich zeigten, kann eine PI3K Blockade unterschiedliche Auswirkungen auf Effektor T-Zellen und Treg-Zellen haben, je nachdem welche PI3K Isoform selektiv inhibiert wird [235]. Auf die Treg-Zellen hatte dabei nur die pharmakologische Inhibition der PI3Kδ, weder aber der α- oder β-Isoform einen Effekt. Der in der vorliegenden Arbeit ausgewählte Inhibitor sämtlicher PI3K-Isoformen zeigte, ebenso wie der Akt- oder mTOR-Inhibitor, einen Effekt auf die DN T-Zellen, indem er die IL-7-vermittelte Beeinträchtigung der Suppression revidierte. Dieser Befund lässt vermuten, dass die therapeutisch häufig verwendete pharmakologische Inhibition des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in die immunregulatorischen Funktion der DN T-Zellen eingreift und dabei möglicherweise eine beeinträchtige Immuntoleranz verbessern oder wiederherstellen kann. Eine Hyperaktivierung des Akt/mTOR Signalweges, wie mit dem small molecule SC-79, hat hingegen das Potential die Immunregulation einzuschränken und somit proinflammatorische Immunantworten zu fördern. Letztlich verstärken die erhaltenen Ergebnisse die enorme Relevanz des Akt/mTOR Signalweges bei der Modulation der Immuntoleranz und zeigen eine neue und selektive Bedeutung dieses Signalweges für die Funktionalität der DN T-Zellen auf. Je nachdem, ob eine Stärkung der Immuntoleranz oder der Immunreaktivität durch DN T-Zellen erwünscht ist, konnten in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Intervention am Akt/mTOR Signalweg dargelegt werden. 4.1.3 Molekularer Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR Um den molekularen Wirkmechanismus von IL-7 und Akt/mTOR auf die Funktion der DN T-Zellen zu charakterisieren, wurde eine Transkriptom-Analyse durchgeführt. Hierbei konnten 1301 Gene identifiziert werden, die gemittelt über alle Spender 98 4 Diskussion signifikant differentiell exprimiert wurden. Der Abgleich mit der IPA Datenbank zeigte einige Proteine auf, die von Akt gesteuert werden und in den IL-7 behandelten DN TZellen signifikant hoch- oder herunterreguliert wurden. Zudem wurden Hinweise dazu gewonnen, welche Funktionen in den DN T-Zellen aufgrund der Änderungen im Genexpressionsprofil entscheidend betroffen wurden. Unter Anderem wurden 92 Gene, die mit der Proliferation von T-Lymphozyten assoziiert sind – darunter zum Beispiel Cyclin E oder p27kip1 – in den IL-7 behandelten DN T-Zellen differenziell exprimiert. Ebenso wurde die Expression von einer Reihe von Genen, die mit dem Überleben von T-Zellen zusammenhängen, verändert. Übereinstimmend mit der Literatur zeigte sich in den DN T-Zellen zum Beispiel die Hochregulation von Bcl-2, dessen Expression laut anderen Arbeitsgruppen durch IL-7 Signale über den Akt Signalweg gesteigert wird [98, 202]. Neben dem Einfluss von IL-7 auf die Homöostase der DN T-Zellen wurden weitere Funktionen wie die Differenzierung, die Migration oder die Aktivierung moduliert. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit publizierten Studien zur zellbiologischen Funktion von IL-7 (siehe Kapitel 1.3.1). In der Literatur wird der Akt/mTOR Signalweg mit einem anergen Phänotyp von TZellen in Verbindung gebracht [236-239]. Der anerge Phänotyp zeichnet sich durch eine Hyporesponsivität gegenüber stimulatorischen Signalen aus und kann durch die Inhibition von mTOR induziert werden. Für die Aufrechterhaltung eines anergen Zustandes bedarf es der Expression von Anergie-induzierenden Faktoren [189, 190, 192]. Die Expression dieser Faktoren kann durch mTOR unterbunden werden [237]. Bei der genaueren Betrachtung der Gene, die durch IL-7 in den DN T-Zellen differentiell exprimiert wurden, fiel auf, dass eine Reihe von Anergie-assoziierten Genen herunterreguliert wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Reduktion eines Anergie-ähnlichen Zustandes der DN T-Zellen hin, der durch IL-7 und Akt/mTOR Signale möglicherweise aufgeboben werden kann. Inwieweit DN T-Zellen einen anergen Phänotyp für ihre immunregulatorische Funktion benötigen, ist bislang unbekannt. In älteren Publikationen konnten Hinweise auf einen anergen Zustand der DN T-Zellen gefunden werden [240, 241]. Da für andere regulatorische T-Zell-Populationen eine funktionelle Relevanz von anergen Eigenschaften aufgezeigt wurde, wäre dies auch für DN T-Zellen denkbar. So stellt 99 4 Diskussion ein anerger Phänotyp ein Charakteristikum von sowohl Treg-Zellen als auch von Tr1Zellen und eine Notwendigkeit für ihre suppressive Aktivität dar [189, 242, 243]. Im Rahmen weiterer Studien wurde beobachtet, dass anerge Treg-Zellen einen höheren Schwellenwert zur Aktivierung benötigen und sich durch eine verminderte Proliferation in Folge von Stimulation auszeichnen [244]. Bestimmte Transkriptionsfaktoren der FoxO-Familie wurden als Anergie-induzierende Faktoren beschrieben, die für die Funktion von Treg-Zellen relevant sind [245]. FoxO kann den Zellzyklus aktiv inhibieren und den Metabolismus verändern [246]. Interessanterweise wird FoxO von Akt/mTOR gehemmt und kann die immunregulatorische Funktion von Treg-Zellen modulieren [247]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass FoxO in den DN TZellen aufgrund von IL-7 herunterreguliert wird. Eine molekulare Begründung, wie IL7 zur Beeinträchtigung der DN T-Zell-Suppression beiträgt, könnte daher in der über IL-7/Akt/mTOR Signale vermittelte Blockade von FoxO liegen. Diese Schwächung eines Anergie-ähnlichen Zustandes führt möglicherweise zum Verlust des suppressiven Potentials der DN T-Zellen. Ein weiterer zentraler Anergie-induzierender Faktor, der in DN T-Zellen durch IL-7 vermindert exprimiert wurde, ist NFAT. NFAT reguliert diverse Gene, darunter auch CBL-b, EGR2 und EGR3 [10, 190]. Wie sowohl die Transkriptomanalyse ergab und die qPCR-Daten bestätigten, wird diese Anergie-assoziierte Signalkaskade in DN TZellen durch IL-7 herunterreguliert. Sowohl CBL-b als auch EGR2 und EGR3 sind laut anderen Studien in der Lage, bestimmte Immuntoleranz-Mechanismen in TZellen zu modulieren [244, 248]. Die Vermutung, dass diese Faktoren in DN T-Zellen eine ähnliche Wirkung haben, ist daher naheliegend. Unser Modell eines Verlustes der suppressiven Funktion von DN T-Zellen aufgrund eines Bruchs in einem Anergie-ähnlichen Phänotyp wird durch einen interessanten Befund einer anderen Arbeitsgruppe im Weiteren unterstützt. Dabei zeigte sich, dass IL-7 den anergen Phänotyp von Treg-Zellen aufheben kann [201]. Die damit einhergehende Proliferation war bei den Treg-Zellen ebenso mit einer Beeinträchtigung ihrer Funktion assoziiert. Da das IL-7/Akt/mTOR Signal Anergie-induzierende Gene in DN T-Zellen herunterreguliert, ist zu erwarten, dass die DN T-Zellen eine gesteigerte Aktivierung 100 4 Diskussion und Proliferation nach Stimulation aufweisen. Die RNA-Sequenzierung zeigte, dass Gene, welche mit der Zellaktivierung und -teilung assoziiert sind, verstärkt reguliert wurden. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Messungen konnte auch auf Proteinebene bestätigt werden, dass Proliferations- und Aktivierungsmarker auf den DN T-Zellen durch IL-7 signifikant hochreguliert wurden. Die Korrelationen mit dem suppressiven Potential zeigten darüber hinaus, dass die gesteigerte Aktivierung und Proliferation einen signifikanten Einfluss auf die Funktion der DN T-Zellen hat. Je aktivierter die DN T-Zellen waren und umso mehr sie proliferierten, desto geringer fiel ihre suppressive Aktivität gegenüber den CD4+ Effektor T-Zellen aus. Die negative Korrelation zwischen der Aktivierung und der Suppression konnte sowohl in der Kultur mit IL-7 als auch in der Kontroll-MLR beobachtet werden. Dieser Befund könnte auch für die in vitro-Kulturbedingungen der DN T-Zellen relevant sein. Nachdem das Aktivierungslevel des Akt/mTOR Signalweges sowie der Aktivierungsund Proliferationszustand der DN T-Zellen mit der suppressiven Funktion eng verknüpft zu sein scheint, sind die Kulturbedingungen sorgfältig zu wählen. Bedingungen, die zu einer extremen Expansion der DN T-Zellen führen und für therapeutische Einsätze eventuell angestrebt werden, sollten aufgrund möglicher Funktionsbeeinträchtigungen achtsam behandelt werden. In vivo ist ebenso zu beachten, dass das vorliegende Zytokinmilieu einen potentiellen Einfluss auf den Aktivierungs- und Proliferationszustand und somit auf das immunregulatorische Potential der DN T-Zellen haben könnte. In der Literatur weisen viele Untersuchungen darauf hin, dass die Entscheidung zwischen einem hyporesponsiven anergen oder einem aktivierten und proliferierenden Phänotyp von T-Zellen eng mit deren zellulärem Metabolismus verknüpft ist [249]. Der Glukose-Stoffwechsel von T-Zellen wird von dem Akt/mTOR Signalweg gesteuert und hat einen beträchtlichen Einfluss auf die Funktionalität von unterschiedlich differenzierten T-Zellen [250, 251]. Neuere Studien zeigten, dass mTOR durch die definierte Modulation des Metabolismus insbesondere die Funktion von Treg-Zellen steuert [252-254]. Im Gegensatz zu Effektor T-Zellen beruht die Energiegewinnung der Treg-Zellen nicht auf der aeroben Glykolyse sondern auf der AMPK-vermittelten Fettsäureoxidation [255]. mTOR reguliert zentrale Faktoren im 101 4 Diskussion Stoffwechsel wie HIF-1α und ist dadurch von großer Bedeutung für die immunregulatorische Funktion von Treg-Zellen [256-258]. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass IL-7/Akt/mTOR den wichtigen Transkriptionsfaktor HIF-1α in den DN T-Zellen hochreguliert und die Proliferation steigert. Es kann daher spekuliert werden, dass der Glukose-Stoffwechsel in DN T-Zellen durch das IL-7/Akt/mTOR Signal verändert wird und diese metabolischen Veränderungen die suppressive Funktion modulieren. Die Untersuchung von metabolischen Vorgängen in DN T-Zellen könnte daher für die Zukunft von großem Interesse sein. 4.2 Charakterisierung weiterer Modulatoren der DN T-Zell-Suppression Bei der Entwicklung der GvHD nach allogener HSZT können verschiedene Zytokine eine wichtige Rolle spielen. Die Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ oder TNF, die auf das Immunsystem proinflammatorisch wirken, können nach HSZT erhöhte Serumspiegel aufweisen und Gewebeschäden auslösen, welche die Pathogenese der GvHD entscheidend fördern [45, 259-261]. Die genannten proinflammatorischen Zytokine finden daher als spezifische Biomarker der GvHD sowie als therapeutische Angriffspunkte Verwendung [262-265]. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ und TNF einen Einfluss auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-Zell-Antworten ausüben. Dabei zeigte sich keine Modulation der suppressiven Aktivität durch jene Zytokine. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass DN T-Zellen unter diesen proinflammatorischen Bedingungen ihre immunregulatorische Funktion beibehalten. Ob DN T-Zellen die jeweiligen Zytokinrezeptoren exprimieren oder das Signal dieser Zytokine keine Bedeutung auf die Funktionalität der DN T-Zellen hat, wurde nicht weiter analysiert. Eine robuste suppressive Funktion der DN T-Zellen trotz proinflammatorischen Milieus könnte für einen therapeutischen Einsatz der DN TZellen von Vorteil sein. Abschließend wurde in dieser Arbeit untersucht, inwieweit neben IL-7 andere γcZytokine die DN T-Zell-Suppression modulieren können. Die Familie der γc-Zytokine ist bekannt dafür, als Überlebens- und Wachstumsfaktor für T-Zellen zu 102 4 Diskussion fungieren [266]. Wie eine kürzlich veröffentlichte Studie zeigte, spielt diese Zytokinfamilie daher nach HSZT eine wichtige Rolle [267]. Eine Blockade der IL-7R γc-Kette konnte dabei die GvHD mildern. Es besteht die Möglichkeit, dass diese GvHD-Minderung vor allem auf der Inhibition der IL-7 Effekte beruht. Des Weiteren könnte die CD132-Blockade auch das Signaling von IL-2, IL-15 und/oder IL-21 unterbinden. Ähnlich zu IL-7 wurde auch für diese drei Zytokine beschrieben, dass deren Serumspiegel mit dem Auftreten einer GvHD assoziiert sein kann [165, 268271]. Da sich alle γc-Zytokine ähnliche Signaltransduktionswege teilen, hätte erwartet werden können, dass auch diese Zytokine zu einer Beeinträchtigung der DN T-Zellvermittelten Suppression führen. Interessanterweise ergaben unsere Versuche jedoch, dass weder IL-9 noch IL-15 oder IL-21 die Suppression vermindert. IL-2 wurde nicht untersucht, nachdem unsere Arbeitsgruppe 2011 bereits zeigte, dass die Anwesenheit von IL-2 die Funktionalität der DN T-Zellen nicht beeinflusst [81]. Der Befund, dass die Suppression der DN T-Zellen nur spezifisch durch IL-7 und nicht durch alle anderen γc-Zytokine moduliert werden kann, ist aus mehrerlei Gesichtspunkten interessant. Zunächst weisen die Ergebnisse darauf hin, dass IL-7 und den anderen γc-Zytokinen unterschiedliche Funktionen bei der Regulation von Immuntoleranz zukommen. Dass γc-Zytokine trotz ihrer teils überschneidenden Funktion auch jeweils einzigartige biologische Effekte vermitteln können, konnten andere Studien ebenso aufzeigen (zusammengefasst in [272, 273]). So können IL-2, IL-7 und IL-15 durch opponierende Wirkung auf verschiedene LymphozytenPopulationen Immunantworten unterschiedlich regulieren. Während beispielsweise ausschließlich IL-2 für die Homöostase von Treg-Zellen benötigt wird, spielt IL-15 eine einzigartige Rolle bei der Gedächtnisausbildung von T-Zellen [272]. Obwohl sämtliche γc-Zytokinrezeptoren die Induktion des Signales über JAK1 und JAK3 zu initiieren scheinen, müssen gewisse Unterschiede in der jeweiligen Signalkaskade demnach für eine Regulation der verschiedenen biologischen Effekte verantwortlich sein. Eine Möglichkeit, wie die Signaltransduktion feingesteuert werden kann, liegt in der spezifischen Zusammensetzung aus unterschiedlichen Untereinheiten eines jeden Rezeptors. Die spezifischen γc-Zytokinrezeptor-Untereinheiten werden womöglich auf den T-Zellen differentiell exprimiert. Dadurch können letztendlich entscheidende Unterschiede in der Dichte der jeweiligen Rezeptorexpression auf der 103 4 Diskussion Zelloberfläche resultieren. Differenzen in der Signalweiterleitung können sich auch aus verschiedenen Signalstärken ergeben, die je nach Bindungsaffinität eines γcZytokins mit seinem Rezeptor oder der Rezeptorkomponenten untereinander und zudem je nach Bindungsdauer und -kinetik abweichen [274]. Diese Bindungseigenschaften können damit über die Aktivierung von Signalmolekülen entscheiden [275277]. Nur der IL-7R weist die α-Kette CD127 auf. Es wurde gezeigt, dass die PI3K direkt an CD127 binden kann [204]. Möglicherweise kann IL-7 auch dadurch den Akt/mTOR Signalweg in besonderer Weise in den DN T-Zellen aktivieren. Aus unseren Daten kann geschlossen werden, dass IL-7 den Akt Signalweg in den DN TZellen funktionell entscheidend modifiziert. IL-2, IL-9, IL-15 und IL-21 aktivieren den Akt Signalweg in den DN T-Zellen möglicherweise ebenso, jedoch entweder nicht über ein gewisses kritisches Aktivierungslevel oder unter Beteiligung anderer Faktoren, die letztlich im Zusammenspiel für die suppressive Funktion der DN TZellen nicht relevant sind. Im Gegensatz zu IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 scheint IL-4 eine untergeordnete Rolle nach HSZT zu spielen. Eine Assoziation von IL-4 Spiegeln und einer GvHDEntwicklung ist nicht beschrieben worden. Vereinzelte Studien geben einen Hinweis darauf, dass eine Verschiebung eines T-Helfer-Zellen Typ 1 Phänotyps zu einem THelfer-Zelltyp 2, welche unter anderem die Zytokine IL-4 und IL-10 sezernieren, von Vorteil sein könnte [260, 268, 278]. Studien an spezifischen Autoimmunerkrankungen konnten zeigen, dass IL-4 sowohl antientzündliche (im Beispiel von Psoriasis) als aber auch proinflammatorische Effekte (im Beispiel von Diabetes) ausüben kann [279-281]. IL-4 kann von aktivierten CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 2 sowie von einigen Zellen des angeboren Immunsystems, zum Beispiel von Mastzellen, produziert werden [282]. Unsere Ergebnisse ergaben, dass IL-4 die DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-Zell-Antworten beeinträchtigt. Eine Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus steht noch aus. Es wäre möglich, dass der Verlust der Suppression eine andere Ursache als der IL-7-vermittelte Signalweg hat. Pace et al. zeigten, dass IL-4 in CD4+ T-Zellen Resistenz gegenüber der Suppression von Treg-Zellen induzieren können [283]. Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche mit IL-7 sollten daher wiederholt werden, um aufzuklären, ob IL-4 eine 104 4 Diskussion entscheidende Wirkung auf die CD4+ T-Zellen hat. Im Gegensatz zu IL-7 transduziert IL-4 Signale über STAT6 in die Zelle, wodurch IL-4 ein verändertes Genexpressionsmuster als IL-7 in den CD4+ und DN T-Zellen hervorrufen dürfte. Falls IL-4 eine direkte Modulation der suppressiven Funktion der DN T-Zellen bewirkt, wäre interessant, inwieweit diese über ähnliche Signalwege und Transkriptionsregulatoren verläuft. Da IL-4 den Akt/mTOR Signalweg aktivieren und beispielsweise die Proliferation von Treg-Zellen steigern kann, könnte auch vermutet werden, dass IL-4 und IL-7 die Funktionalität der DN T-Zellen durch einen ähnlichen molekularen Mechanismus vermindern [284, 285]. Falls der Akt/mTOR Signalweg sich wiederum als spezifischer kritischer Signalweg herausstellen sollte, wäre zu untersuchen, welche zentrale Regulatoren, wie zum Beispiel Anergie-assoziierte Proteine sowohl durch IL-7 als auch durch IL-4 in DN T-Zellen entscheidend verändert werden und für die suppressive Funktion der DN T-Zellen große Relevanz haben. 4.3 Zusammenfassung und Ausblick Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass murine und humane DN T-Zellen Immunantworten effektiv supprimieren können und dadurch eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz spielen. So wurde beschrieben, dass DN T-Zellen allogene CD4+ und CD8+ T-Zell-Antworten spezifisch unterdrücken und dadurch die Entwicklung einer GvHD nach allogener HSZT verhindern können. Ziel dieser Arbeit war es aufzuklären, ob die humane DN T-Zell-vermittelte Suppression gegenüber allogenen T-Zell-Antworten moduliert werden kann. Als Modulatoren wurden Zytokine untersucht, die nach HSZT hohe Serumspiegel zeigen und/oder mit der Pathogenese der GvHD assoziiert sind. Insbesondere IL-7 war aufgrund beschriebener Korrelationen mit der GvHD und der Bedeutung auf andere immunregulatorische T-Zellen von Interesse. In dieser Arbeit konnte IL-7 als potenter Modulator der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen identifiziert werden. IL-7 induzierte sowohl in die CD4+ als auch in die DN T-Zellen ein Signal, welches die Viabilität der Zellen allerdings nicht bedeutsam beeinflusste. Wie Blockadeexperimente von zentralen Signalwegen ergaben, führt IL-7 zu einem direkten Verlust der Funktionalität in DN T-Zellen, indem spezifisch der Akt/mTOR Signalweg amplifiziert 105 4 Diskussion wird. In weiteren Analysen konnte nachgewiesen werden, dass IL-7 die Proliferation und Aktivierung der DN T-Zellen steigert und dieser Phänotyp negativ mit der suppressiven Aktivität der DN T-Zellen korreliert. Die gesteigerte Proliferation und Aktivierung der DN T-Zellen scheint mit einem Verlust der Expression Anergieassoziierter Gene einherzugehen. Für nachfolgende Studien wäre die Beantwortung der Frage interessant, ob und inwieweit in DN T-Zellen ein Anergie-ähnlicher Zustand für die Vermittlung der suppressiven Funktion benötigt wird. Potentielle Kandidaten, die diesen Phänotyp beeinflussen können, wurden in dieser Arbeit aufgezeigt und könnten in zukünftigen Experimenten noch detaillierter auf ihre jeweilige Bedeutung hin charakterisiert werden. Möglicherweise ließen sich innerhalb der durch IL-7/Akt/mTOR veränderten Genexpression auch weitere Proteine finden, die an der Suppression beteiligt sind. Regulatoren des Stoffwechsels könnten dabei insbesondere von Relevanz sein, nachdem zahlreiche neue Studien beschrieben, dass metabolische Vorgänge maßgeblich über T-Zell-Funktionen entscheiden können. Aus dieser Arbeit kann festgehalten werden, dass der IL-7 und der Akt/mTOR Signalweg die immunregulatorische Funktion der humanen DN T-Zellen gegenüber allogenen CD4+ T-Zell-Antworten wesentlich beeinflusst. Eine Übertragung dieses Befundes auf autologe sowie auf CD8+ T-Zell-Antworten wäre denkbar und sollte in Zukunft noch untersucht werden. Ob humane DN T-Zellen wie murine DN T-Zellen auch andere Zellen wie NK- und B-Zellen supprimieren und ob IL-7 und der Akt/mTOR Signalweg darauf Einfluss nehmen, bleibt ebenso aufzuklären. Die Bedeutung des Akt/mTOR Signalweges zeigte sich nicht nur durch dessen Blockade, mit der eine vollständige Revision des IL-7 Effektes erzielt wurde, sondern auch durch die pharmakologische Hyperaktivierung, welche das suppressive Potential der DN T-Zellen einschränkte. Eine therapeutische Modulation des IL-7 oder des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen könnte daher für eine Regulation der Immuntoleranz von zentraler Bedeutung sein. Wenn der Mechanismus der Beeinträchtigung der Suppression durch IL-4 aufgeklärt ist, kann zukünftig eventuell auch im IL-4 Signalweg eine weitere Möglichkeit nachgewiesen werden, wie die Funktionalität der DN T-Zellen reguliert werden kann. 106 4 Diskussion Das suppressive Potential der DN T-Zellen zeigte sich dagegen als unempfindsam gegenüber einer Reihe von proinflammatorischen Zytokinen. Die suppressive Aktivität scheint nur durch ganz spezifische Signalwege überkommen zu werden. Eine weitere Charakterisierung der Rolle dieser Signalwege für DN T-Zellen in in vivo Modellen und klinischen Untersuchungen würde die Relevanz der hier gewonnenen Erkenntnisse noch erweitern. Eine Reduktion des IL-7 oder Akt/mTOR Signales bei Patienten nach HSZT kann womöglich die erwünschte suppressive Aktivität der DN T-Zellen zur Vermeidung der GvHD verbessern. Ebenso mag die Immuntoleranz bei anderen autoimmunen oder malignen Erkrankungen dadurch therapeutisch gesteigert oder vermindert werden. Weitere Charakterisierungen der Modulation und des Mechanismus der DN T-Zell-vermittelten Suppression unterstützen das langfristige Ziel, DN T-Zellen als neuartige Zelltherapie gegen Immunerkrankungen wie der GvHD einzusetzen. 107 5 5 Verzeichnisse 5.1 Abbildungsverzeichnis Verzeichnisse Abbildung 1-1: Pathophysiologie der akuten GvHD. ............................................ 13 Abbildung 1-2: Mechanismus der murinen DN T-Zell-vermittelten Suppression ................................................................................. 20 Abbildung 1-3: IL-7 Signaltransduktion für die T-Zell-Homöostase ...................... 24 Abbildung 3-1: Messung von CFSE in CD4+ T-Zellen an Tag 5 der MLR zur Bestimmung der suppressiven Aktivität von DN T-Zellen.. .......... 48 Abbildung 3-2: Vergleich der Proliferation von konventionellen CD4+ TZellen nach Stimulation mit allogenen DZ oder αCD3/28 Beads ........................................................................................... 49 Abbildung 3-3: Messung von Zellzyklusmarkern in CD4+ T-Zellen an Tag 2 der MLR ....................................................................................... 51 Abbildung 3-4: Expression des IL-7 Rezeptors auf humanen TZellpopulationen........................................................................... 52 Abbildung 3-5: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in CD4+ T-Zellen. ............ 54 Abbildung 3-6: Signaltransduktion des IL-7 Rezeptors in DN T-Zellen ................ 55 Abbildung 3-7: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Proliferation von konventionellen CD4+ T-Zellen ................... 57 Abbildung 3-8: Titration der modulatorischen Aktivität von IL-7 auf DN TZellen ........................................................................................... 58 Abbildung 3-9: Einfluss von IL-7 auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression der Aktivierung von CD4+ T-Zellen ............................................... 59 Abbildung 3-10: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von CD4 T-Zellen in der MLR ............................................................................................. 61 Abbildung 3-11: Einfluss von IL-7 auf die Viabilität von DN T-Zellen in der MLR. ............................................................................................ 62 Abbildung 3-12: Blockade der JAK-abhängigen Signaltransduktion in DN TZellen ........................................................................................... 63 Abbildung 3-13: Blockade der STAT5 Signaltransduktion in DN T-Zellen ............. 64 + 108 5 Verzeichnisse Abbildung 3-14: Aktivierung des Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen durch IL-7 ..................................................................................... 65 Abbildung 3-15: Hochregulation von Akt-kontrollierten Transkriptionsfaktoren in DN T-Zellen durch IL-7 ............................................................. 66 Abbildung 3-16: Blockade des PI3K/Akt/mTOR Signalweges in DN T-Zellen........ 67 Abbildung 3-17: Blockade der MAPK Signalwege in DN T-Zellen. ........................ 68 Abbildung 3-18: Blockade des NF-κB Signalweges in DN T-Zellen ....................... 69 Abbildung 3-19: Schema der RNA Sequenzierung von DN T-Zellen ..................... 70 Abbildung 3-20: Differentielle Expression von IL-7 behandelten gegenüber unbehandelten DN T-Zellen ......................................................... 71 Abbildung 3-21: Zuordnung der differentiell exprimierten Gene zu kanonischen Signalwegen mit IPA Software………………. ......... 72 Abbildung 3-22: Annotation des Akt Signalweges als „Top upstream regulator network“. ...................................................................................... 73 Abbildung 3-23: Einordnung der differentiell exprimierten Gene zu funktionellen Gruppen. ................................................................. 74 Abbildung 3-24: Differentielle Expression signifikanter Gene, die mit Aktivierung, Proliferation, Homöostase, Anergie und suppressiver Funktion assoziiert sind .......................................... 75 Abbildung 3-25: Verifizierung der Expression Anergie-assoziierter Gene in DN T-Zellen.................................................................................. 76 Abbildung 3-26: Verstärkte Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen durch IL-7 ..................................................................................... 78 Abbildung 3-27: Korrelation von Aktivierung und Proliferation der DN T-Zellen mit deren suppressiven Funktion ................................................. 80 Abbildung 3-28: Schematisches Modell der IL-7 vermittelten Modulation der suppressiven Aktivität humaner DN T-Zellen ............................... 81 Abbildung 3-29: Akt-Hyperaktivierung in DN T-Zellen ............................................ 83 Abbildung 3-30: Einfluss proinflammatorischer Zytokine auf die DN T-Zellvermittelte Suppression ............................................................... 84 Abbildung 3-31: Einfluss von y-Ketten-Zytokinen auf die DN T-Zell-vermittelte Suppression ................................................................................. 85 109 5 Verzeichnisse 5.2 Literaturverzeichnis 1. Murphy, K., P. Travers, and M. Walport, Janeway's Immunobiology. 2008. 2. Abbas, A.K., A.H. Lichtman, and S. Pillai, Cellular and molecular immunology. 2010. 6th edition. 3. Appay, V., et al., Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: consensus and issues. Cytometry A, 2008. 73(11): p. 975-83. 4. Deborah, A.L., C.G. Marielle, and M.L. David, Views of immunology: effector T cells. Immunological Reviews, 2011. 240(1): p. 25-39. 5. Neefjes, J., et al., Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation. Nat Rev Immunol, 2011. 11(12): p. 82336. 6. Medawar, P.B., Immunity to homologous grafted skin; the suppression of cell division in grafts transplanted to immunized animals. Br J Exp Pathol, 1946. 27: p. 9-14. 7. Burnet, F.M., The clonal selection theory of acquired immunity. Cambridge University Press, 1959. 8. Hogquist, K.A., T.A. Baldwin, and S.C. Jameson, Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat Rev Immunol, 2005. 5(10): p. 772-82. 9. Xing, Y. and K.A. Hogquist, T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012. 4(6). 10. Nurieva, R.I., X. Liu, and C. Dong, Molecular mechanisms of T-cell tolerance. Immunological Reviews, 2011. 241(1): p. 133-144. 11. Green, D.R., N. Droin, and M. Pinkoski, Activation-induced cell death in T cells. Immunol Rev, 2003. 193: p. 70-81. 12. Takahashi, T., et al., Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells: induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state. Int Immunol, 1998. 10(12): p. 1969-80. 13. Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi, Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science, 2003. 299(5609): p. 1057-61. 14. Sakaguchi, S., Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol, 2005. 6(4): p. 345-52. 110 5 Verzeichnisse 15. Baecher-Allan, C., et al., CD4+CD25high Regulatory Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology, 2001. 167(3): p. 1245-1253. 16. Sakaguchi, S., Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic selftolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol, 2004. 22: p. 531-62. 17. Sakaguchi, S., et al., Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunol Rev, 2006. 212: p. 8-27. 18. Sakaguchi, S., et al., Immunologic tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance. Immunol Rev, 2001. 182: p. 18-32. 19. Wing, K. and S. Sakaguchi, Regulatory T cells exert checks and balances on self tolerance and autoimmunity. Nat Immunol, 2010. 11(1): p. 7-13. 20. Shevach, E.M., Regulatory T cells in autoimmmunity*. Annu Rev Immunol, 2000. 18: p. 423-49. 21. Wildin, R.S., et al., X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy. Nat Genet, 2001. 27(1): p. 18-20. 22. Bennett, C.L., et al., The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nat Genet, 2001. 27(1): p. 20-1. 23. Baecher-Allan, C. and D.A. Hafler, Suppressor T cells in human diseases. J Exp Med, 2004. 200(3): p. 273-6. 24. Baecher-Allan, C. and D.E. Anderson, Regulatory cells and human cancer. Semin Cancer Biol, 2006. 16(2): p. 98-105. 25. Wood, K.J. and S. Sakaguchi, Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat Rev Immunol, 2003. 3(3): p. 199-210. 26. Pellerin, L., et al., Regulatory T cells and their roles in immune dysregulation and allergy. Immunol Res, 2014. 58(2-3): p. 358-68. 27. Roncarolo, M.G., et al., Type 1 T regulatory cells. Immunol Rev, 2001. 182: p. 68-79. 28. Levings, M.K. and M.G. Roncarolo, T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD4 T cells with immunoregulatory properties. J Allergy Clin Immunol, 2000. 106(1 Pt 2): p. S109-12. 111 5 Verzeichnisse 29. Fantini, M.C., et al., Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5149-53. 30. Weiner, H.L., Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-beta-secreting regulatory cells. Microbes Infect, 2001. 3(11): p. 947-54. 31. Ciubotariu, R., et al., Specific suppression of human CD4+ Th cell responses to pig MHC antigens by CD8+CD28- regulatory T cells. J Immunol, 1998. 161(10): p. 5193-202. 32. Jiang, H., The Qa-1 dependent CD8+ T cell mediated regulatory pathway. Cell Mol Immunol, 2005. 2(3): p. 161-7. 33. Liu, Y., et al., Phenotypic and functional characteristic of a newly identified CD8+ Foxp3- CD103+ regulatory T cells. J Mol Cell Biol, 2014. 6(1): p. 8192. 34. Peter, H.-H., W.J. Pichler, and U. Müller-Ladner, Klinische Immunologie. Elsevier, 2012. 3. Auflage. 35. Kolb, H.-J., Graft-versus-leukemia effects of transplantation and donor lymphocytes. Vol. 112. 2008. 4371-4383. 36. Porter, D.L. and J.H. Antin, The graft-versus-leukemia effects of allogeneic cell therapy. Annu Rev Med, 1999. 50: p. 369-86. 37. Suchin, E.J., et al., Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol, 2001. 166(2): p. 973-81. 38. Sherman, L.A. and S. Chattopadhyay, The molecular allorecognition. Annu Rev Immunol, 1993. 11: p. 385-402. 39. Gould, D.S. and H. Auchincloss, Jr., Direct and indirect recognition: the role of MHC antigens in graft rejection. Immunol Today, 1999. 20(2): p. 77-82. 40. Barth, R., et al., Strong and weak histocompatibility gene differences in mice and their role in the rejection of homografts of tumors and skin. Ann Surg, 1956. 144(2): p. 198-204. 41. Goulmy, E., et al., Mismatches of minor histocompatibility antigens between HLA-identical donors and recipients and the development of graft-versushost disease after bone marrow transplantation. N Engl J Med, 1996. 334(5): p. 281-5. 42. Kekre, N. and J.H. Antin, Hematopoietic stem cell transplantation donor sources in the 21st century: choosing the ideal donor when a perfect match does not exist. Blood, 2014. 124(3): p. 334-43. basis of 112 5 Verzeichnisse 43. Hill, G.R. and J.L. Ferrara, The primacy of the gastrointestinal tract as a target organ of acute graft-versus-host disease: rationale for the use of cytokine shields in allogeneic bone marrow transplantation. Blood, 2000. 95(9): p. 2754-9. 44. Böld, T., Immunregulation durch adoptiven Transfer humaner CD4+CD25+ regulatorischer T-Zelln im xenogenen GvHD-Modell. UK Regensburg, 2009. 45. Ferrara, J.L., et al., Graft-versus-host disease. Lancet, 2009. 373(9674): p. 1550-61. 46. Markey, K.A., K.P. MacDonald, and G.R. Hill, The biology of graft-versushost disease: experimental systems instructing clinical practice. Blood, 2014. 124(3): p. 354-62. 47. Pasquini, M., et al., 2013 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clin Transpl, 2013: p. 187-97. 48. Gooley, T.A., et al., Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine, 2010. 363(22): p. 20912101. 49. Rhen, T. and J.A. Cidlowski, Antiinflammatory Action of Glucocorticoids — New Mechanisms for Old Drugs. New England Journal of Medicine, 2005. 353(16): p. 1711-1723. 50. Garnett, C., J.F. Apperley, and J. Pavlu, Treatment and management of graft-versus-host disease: improving response and survival. Ther Adv Hematol, 2013. 4(6): p. 366-78. 51. Blazar, B.R., W.J. Murphy, and M. Abedi, Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nat Rev Immunol, 2012. 12(6): p. 443-58. 52. Hoffmann, P. and M. Edinger, CD4+CD25+ regulatory T cells and graftversus-host disease. Semin Hematol, 2006. 43(1): p. 62-9. 53. Waldmann, H., et al., Harnessing FOXP3+ regulatory T cells for transplantation tolerance. J Clin Invest, 2014. 124(4): p. 1439-45. 54. Reimann, J., Double-negative (CD4-CD8-), TCR alpha beta-expressing, peripheral T cells. Scand J Immunol, 1991. 34(6): p. 679-88. 55. Zhang, Z.X., et al., Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med, 2000. 6(7): p. 782-9. 113 5 Verzeichnisse 56. Fischer, K., et al., Isolation and characterization of human antigen-specific TCR alpha beta+ CD4(-)CD8- double-negative regulatory T cells. Blood, 2005. 105(7): p. 2828-35. 57. Renauer, P.A., P. Coit, and A.H. Sawalha, The DNA methylation signature of human TCRalphabeta+CD4-CD8- double negative T cells reveals CG demethylation and a unique epigenetic architecture permissive to a broad stimulatory immune response. Clin Immunol, 2015. 156(1): p. 19-27. 58. Sallusto, F., et al., Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature, 1999. 401(6754): p. 708712. 59. Lee, B.P., et al., Expression profiling of murine double-negative regulatory T cells suggest mechanisms for prolonged cardiac allograft survival. J Immunol, 2005. 174(8): p. 4535-44. 60. Crispin, J.C., et al., Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol, 2008. 181(12): p. 8761-6. 61. Cowley, S.C., et al., Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. J Immunol, 2010. 184(10): p. 5791-801. 62. Riol-Blanco, L., et al., IL-23 receptor regulates unconventional IL-17producing T cells that control bacterial infections. J Immunol, 2010. 184(4): p. 1710-20. 63. Strober, S., et al., Cloned natural suppressor cell lines express the CD3+CD4-CD8- surface phenotype and the alpha, beta heterodimer of the T cell antigen receptor. J Immunol, 1989. 143(4): p. 1118-22. 64. Ford, M.S., et al., Peptide-activated double-negative T cells can prevent autoimmune type-1 diabetes development. Eur J Immunol, 2007. 37(8): p. 2234-41. 65. Duncan, B., et al., Double negative (CD3+ 4- 8-) TCR alphabeta splenic cells from young NOD mice provide long-lasting protection against type 1 diabetes. PLoS One, 2010. 5(7): p. e11427. 66. Collin, R., et al., The mouse idd2 locus is linked to the proportion of immunoregulatory double-negative T cells, a trait associated with autoimmune diabetes resistance. J Immunol, 2014. 193(7): p. 3503-12. 67. Zhang, D., et al., Adoptive cell therapy using antigen-specific CD4(-)CD8(-)T regulatory cells to prevent autoimmune diabetes and promote islet allograft survival in NOD mice. Diabetologia, 2011. 54(8): p. 2082-92. 114 5 Verzeichnisse 68. Theofilopoulos, A.N., et al., Molecular genetics of murine lupus models. Adv Immunol, 1989. 46: p. 61-109. 69. Sneller, M.C., et al., A novel lymphoproliferative/autoimmune syndrome resembling murine lpr/gld disease. J Clin Invest, 1992. 90(2): p. 334-41. 70. Ford, M.S., et al., The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med, 2002. 196(2): p. 2617. 71. Juvet, S.C., et al., FcRgamma controls the fas-dependent regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells. PLoS One, 2013. 8(6): p. e65253. 72. Anand, A., et al., Characterization of CD3+ CD4- CD8- (double negative) T cells in patients with systemic lupus erythematosus: activation markers. Lupus, 2002. 11(8): p. 493-500. 73. Le Deist, F., et al., Clinical, immunological, and pathological consequences of Fas-deficient conditions. Lancet, 1996. 348(9029): p. 719-23. 74. Rieux-Laucat, F., et al., Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science, 1995. 268(5215): p. 1347-9. 75. Chen, W., et al., Role of double-negative regulatory T cells in long-term cardiac xenograft survival. J Immunol, 2003. 170(4): p. 1846-53. 76. Chen, W., et al., Donor lymphocyte infusion induces long-term donor-specific cardiac xenograft survival through activation of recipient double-negative regulatory T cells. J Immunol, 2005. 175(5): p. 3409-16. 77. Young, K.J., et al., Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol, 2003. 171(1): p. 134-41. 78. He, K.M., et al., Donor double-negative Treg promote allogeneic mixed chimerism and tolerance. Eur J Immunol, 2007. 37(12): p. 3455-66. 79. Su, Y., et al., Double negative Treg cells promote nonmyeloablative bone marrow chimerism by inducing T-cell clonal deletion and suppressing NK cell function. Eur J Immunol, 2012. 42(5): p. 1216-25. 80. Miyagawa, F., et al., Identification of CD3+CD4-CD8- T cells as potential regulatory cells in an experimental murine model of graft-versus-host skin disease (GVHD). J Invest Dermatol, 2013. 133(11): p. 2538-45. 81. Voelkl, S., R. Gary, and A. Mackensen, Characterization of the immunoregulatory function of human TCR-alphabeta+ CD4- CD8- doublenegative T cells. Eur J Immunol, 2011. 41(3): p. 739-48. 115 5 Verzeichnisse 82. McIver, Z., et al., Double-negative regulatory T cells induce allotolerance when expanded after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. Br J Haematol, 2008. 141(2): p. 170-8. 83. Ye, H., et al., Characterization of CD3+CD4-CD8- (double negative) T cells reconstitution in patients following hematopoietic stem-cell transplantation. Transpl Immunol, 2011. 25(4): p. 180-6. 84. Young, K.J., et al., CD4(-)CD8(-) regulatory T cells implicated in preventing graft-versus-host and promoting graft-versus-leukemia responses. Transplant Proc, 2001. 33(1-2): p. 1762-3. 85. Young, K.J., et al., Antitumor activity mediated by double-negative T cells. Cancer Res, 2003. 63(22): p. 8014-21. 86. Merims, S., et al., Anti-leukemia effect of ex vivo expanded DNT cells from AML patients: a potential novel autologous T-cell adoptive immunotherapy. Leukemia, 2011. 25(9): p. 1415-22. 87. Voelkl, S., et al., Characterization of MHC class-I restricted TCRalphabeta+ CD4- CD8- double negative T cells recognizing the gp100 antigen from a melanoma patient after gp100 vaccination. Cancer Immunol Immunother, 2009. 58(5): p. 709-18. 88. Nakayama, M., Antigen Presentation by MHC-Dressed Cells. Front Immunol, 2014. 5: p. 672. 89. Ford McIntyre, M.S., et al., Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol, 2008. 181(4): p. 2271-5. 90. Zhang, Z.X., et al., Double-negative T cells, activated by xenoantigen, lyse autologous B and T cells using a perforin/granzyme-dependent, Fas-Fas ligand-independent pathway. J Immunol, 2006. 177(10): p. 6920-9. 91. Zhang, Z.X., W.L. Stanford, and L. Zhang, Ly-6A is critical for the function of double negative regulatory T cells. Eur J Immunol, 2002. 32(6): p. 1584-92. 92. Marra, L.E., et al., IL-10 induces regulatory T cell apoptosis by up-regulation of the membrane form of TNF-alpha. J Immunol, 2004. 172(2): p. 1028-35. 93. Gao, J.F., et al., Regulation of antigen-expressing dendritic cells by double negative regulatory T cells. Eur J Immunol, 2011. 41(9): p. 2699-708. 94. Hillhouse, E.E. and S. Lesage, A comprehensive review of the phenotype and function of antigen-specific immunoregulatory double negative T cells. J Autoimmun, 2013. 40: p. 58-65. 116 5 Verzeichnisse 95. Goodwin, R.G., et al., Human interleukin 7: molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(1): p. 302-6. 96. Capitini, C.M., A.A. Chisti, and C.L. Mackall, Modulating T-cell homeostasis with IL-7: preclinical and clinical studies. J Intern Med, 2009. 266(2): p. 14153. 97. Guimond, M., et al., Interleukin 7 signaling in dendritic cells regulates the homeostatic proliferation and niche size of CD4+ T cells. Nat Immunol, 2009. 10(2): p. 149-57. 98. Rochman, Y., R. Spolski, and W.J. Leonard, New insights into the regulation of T cells by gamma(c) family cytokines. Nat Rev Immunol, 2009. 9(7): p. 480-90. 99. Goodwin, R.G., et al., Cloning of the human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell, 1990. 60(6): p. 941-51. 100. Mazzucchelli, R. and S.K. Durum, Interleukin-7 receptor expression: intelligent design. Nat Rev Immunol, 2007. 7(2): p. 144-54. 101. Fry, T.J. and C.L. Mackall, Interleukin-7: from bench to clinic. Blood, 2002. 99(11): p. 3892-904. 102. Seddiki, N., et al., Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med, 2006. 203(7): p. 1693-700. 103. Liu, W., et al., CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med, 2006. 203(7): p. 1701-11. 104. Puel, A., et al., Defective IL7R expression in T(-)B(+)NK(+) severe combined immunodeficiency. Nat Genet, 1998. 20(4): p. 394-7. 105. Cunningham-Rundles, C. and P.P. Ponda, Molecular defects in T- and B-cell primary immunodeficiency diseases. Nat Rev Immunol, 2005. 5(11): p. 88092. 106. Bertolino, E., et al., Regulation of interleukin 7-dependent immunoglobulin heavy-chain variable gene rearrangements by transcription factor STAT5. Nat Immunol, 2005. 6(8): p. 836-43. 107. Kikuchi, K., et al., IL-7 receptor signaling is necessary for stage transition in adult B cell development through up-regulation of EBF. J Exp Med, 2005. 201(8): p. 1197-203. 117 5 Verzeichnisse 108. Corcoran, A.E., et al., Impaired immunoglobulin gene rearrangement in mice lacking the IL-7 receptor. Nature, 1998. 391(6670): p. 904-7. 109. Johnson, K., et al., Regulation of immunoglobulin light-chain recombination by the transcription factor IRF-4 and the attenuation of interleukin-7 signaling. Immunity, 2008. 28(3): p. 335-45. 110. Akashi, K., et al., Bcl-2 rescues T lymphopoiesis in interleukin-7 receptordeficient mice. Cell, 1997. 89(7): p. 1033-41. 111. Trigueros, C., et al., Pre-TCR signaling regulates IL-7 receptor alpha expression promoting thymocyte survival at the transition from the doublenegative to double-positive stage. Eur J Immunol, 2003. 33(7): p. 1968-77. 112. Muegge, K., M.P. Vila, and S.K. Durum, Interleukin-7: a cofactor for V(D)J rearrangement of the T cell receptor beta gene. Science, 1993. 261(5117): p. 93-5. 113. Schlissel, M.S., S.D. Durum, and K. Muegge, The interleukin 7 receptor is required for T cell receptor gamma locus accessibility to the V(D)J recombinase. J Exp Med, 2000. 191(6): p. 1045-50. 114. Tan, J.T., et al., IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(15): p. 8732-7. 115. Vivien, L., C. Benoist, and D. Mathis, T lymphocytes need IL-7 but not IL-4 or IL-6 to survive in vivo. Int Immunol, 2001. 13(6): p. 763-8. 116. Schluns, K.S., et al., Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol, 2000. 1(5): p. 426-32. 117. Xue, H.H., et al., IL-2 negatively regulates IL-7 receptor alpha chain expression in activated T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(21): p. 13759-64. 118. Li, J., G. Huston, and S.L. Swain, IL-7 promotes the transition of CD4 effectors to persistent memory cells. J Exp Med, 2003. 198(12): p. 1807-15. 119. Hu, H., et al., CD4(+) T cell effectors can become memory cells with high efficiency and without further division. Nat Immunol, 2001. 2(8): p. 705-10. 120. Kondrack, R.M., et al., Interleukin 7 regulates the survival and generation of memory CD4 cells. J Exp Med, 2003. 198(12): p. 1797-806. 121. Bradley, L.M., L. Haynes, and S.L. Swain, IL-7: maintaining T-cell memory and achieving homeostasis. Trends Immunol, 2005. 26(3): p. 172-6. 122. Fry, T.J. and C.L. Mackall, The many faces of IL-7: from lymphopoiesis to peripheral T cell maintenance. J Immunol, 2005. 174(11): p. 6571-6. 118 5 Verzeichnisse 123. Prlic, M., L. Lefrancois, and S.C. Jameson, Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL15. J Exp Med, 2002. 195(12): p. F49-52. 124. Leonard, W.J., et al., Signaling via the IL-2 and IL-7 receptors from the membrane to the nucleus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1999. 64: p. 417-24. 125. Cobbold, S.P., The mTOR pathway and integrating immune regulation. Immunology, 2013. 140(4): p. 391-8. 126. Mackall, C.L., T.J. Fry, and R.E. Gress, Harnessing the biology of IL-7 for therapeutic application. Nat Rev Immunol, 2011. 11(5): p. 330-42. 127. Takada, K. and S.C. Jameson, Naive T cell homeostasis: from awareness of space to a sense of place. Nat Rev Immunol, 2009. 9(12): p. 823-32. 128. Kittipatarin, C. and A.R. Khaled, Interlinking interleukin-7. Cytokine, 2007. 39(1): p. 75-83. 129. Ponchel, F., R.J. Cuthbert, and V. Goeb, IL-7 and lymphopenia. Clin Chim Acta, 2011. 412(1-2): p. 7-16. 130. Napolitano, L.A., et al., Increased production of IL-7 accompanies HIV-1mediated T-cell depletion: implications for T-cell homeostasis. Nat Med, 2001. 7(1): p. 73-9. 131. Malaspina, A., et al., Idiopathic CD4+ T lymphocytopenia is associated with increases in immature/transitional B cells and serum levels of IL-7. Blood, 2007. 109(5): p. 2086-8. 132. Cox, A.L., et al., Lymphocyte homeostasis following therapeutic lymphocyte depletion in multiple sclerosis. Eur J Immunol, 2005. 35(11): p. 3332-42. 133. Fry, T.J., et al., A potential role for interleukin-7 in T-cell homeostasis. Blood, 2001. 97(10): p. 2983-90. 134. Bolotin, E., et al., Serum levels of IL-7 in bone marrow transplant recipients: relationship to clinical characteristics and lymphocyte count. Bone Marrow Transplant, 1999. 23(8): p. 783-8. 135. Dean, R.M., et al., Association of serum interleukin-7 levels with the development of acute graft-versus-host disease. J Clin Oncol, 2008. 26(35): p. 5735-41. 136. Goldrath, A.W. and M.J. Bevan, Low-affinity ligands for the TCR drive proliferation of mature CD8+ T cells in lymphopenic hosts. Immunity, 1999. 11(2): p. 183-90. 119 5 Verzeichnisse 137. Alpdogan, O., et al., IL-7 enhances peripheral T cell reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest, 2003. 112(7): p. 1095-107. 138. Mackall, C.L., et al., IL-7 increases both thymic-dependent and thymicindependent T-cell regeneration after bone marrow transplantation. Blood, 2001. 97(5): p. 1491-7. 139. Morrissey, P.J., et al., Administration of IL-7 to mice with cyclophosphamideinduced lymphopenia accelerates lymphocyte repopulation. J Immunol, 1991. 146(5): p. 1547-52. 140. Komschlies, K.L., K.J. Grzegorzewski, and R.H. Wiltrout, Diverse immunological and hematological effects of interleukin 7: implications for clinical application. J Leukoc Biol, 1995. 58(6): p. 623-33. 141. Rosenberg, S.A., et al., IL-7 administration to humans leads to expansion of CD8+ and CD4+ cells but a relative decrease of CD4+ T-regulatory cells. J Immunother, 2006. 29(3): p. 313-9. 142. Perales, M.A., et al., Recombinant human interleukin-7 (CYT107) promotes T-cell recovery after allogeneic stem cell transplantation. Blood, 2012. 120(24): p. 4882-91. 143. Lundstrom, W., N.M. Fewkes, and C.L. Mackall, IL-7 in human health and disease. Semin Immunol, 2012. 24(3): p. 218-24. 144. Sportes, C., R.E. Gress, and C.L. Mackall, Perspective on potential clinical applications of recombinant human interleukin-7. Ann N Y Acad Sci, 2009. 1182: p. 28-38. 145. Sportes, C., et al., Administration of rhIL-7 in humans increases in vivo TCR repertoire diversity by preferential expansion of naive T cell subsets. J Exp Med, 2008. 205(7): p. 1701-14. 146. Sereti, I., et al., IL-7 administration drives T cell-cycle entry and expansion in HIV-1 infection. Blood, 2009. 113(25): p. 6304-14. 147. Calzascia, T., et al., CD4 T cells, lymphopenia, and IL-7 in a multistep pathway to autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(8): p. 29993004. 148. Penaranda, C., et al., IL-7 receptor blockade reverses autoimmune diabetes by promoting inhibition of effector/memory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(31): p. 12668-73. 149. Lee, L.F., et al., Anti-IL-7 receptor-alpha reverses established type 1 diabetes in nonobese diabetic mice by modulating effector T-cell function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(31): p. 12674-9. 120 5 Verzeichnisse 150. De Benedetti, F., et al., Elevated circulating interleukin-7 levels in patients with systemic juvenile rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 1995. 22(8): p. 1581-5. 151. Churchman, S.M. and F. Ponchel, Interleukin-7 in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford), 2008. 47(6): p. 753-9. 152. Hartgring, S.A., et al., Interleukin-7 induced immunopathology in arthritis. Ann Rheum Dis, 2006. 65 Suppl 3: p. iii69-74. 153. Hartgring, S.A., et al., Interleukin-7-aggravated joint inflammation and tissue destruction in collagen-induced arthritis is associated with T-cell and B-cell activation. Arthritis Res Ther, 2012. 14(3): p. R137. 154. Ruprecht, C.R., et al., Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T cells in inflamed synovia. J Exp Med, 2005. 201(11): p. 1793803. 155. van Amelsfort, J.M., et al., Proinflammatory mediator-induced reversal of CD4+,CD25+ regulatory T cell-mediated suppression in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2007. 56(3): p. 732-42. 156. Vercoulen, Y., et al., Human regulatory T cell suppressive function is independent of apoptosis induction in activated effector T cells. PLoS One, 2009. 4(9): p. e7183. 157. Heninger, A.K., et al., IL-7 abrogates suppressive activity of human CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells and allows expansion of alloreactive and autoreactive T cells. J Immunol, 2012. 189(12): p. 5649-58. 158. Younas, M., et al., IL-7 modulates in vitro and in vivo human memory T regulatory cell functions through the CD39/ATP axis. J Immunol, 2013. 191(6): p. 3161-8. 159. Matsuoka, K., et al., Altered regulatory T cell homeostasis in patients with CD4+ lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest, 2010. 120(5): p. 1479-93. 160. Sinha, M.L., et al., Interleukin 7 worsens graft-versus-host disease. Blood, 2002. 100(7): p. 2642-9. 161. Gendelman, M., et al., Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. J Immunol, 2004. 172(5): p. 3328-36. 162. Chung, B., et al., Importance of interleukin-7 in the development of experimental graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 2008. 14(1): p. 16-27. 121 5 Verzeichnisse 163. Chung, B., et al., Prevention of graft-versus-host disease by anti IL-7Ralpha antibody. Blood, 2007. 110(8): p. 2803-10. 164. Thiant, S., et al., Plasma levels of IL-7 and IL-15 after reduced intensity conditioned allo-SCT and relationship to acute GVHD. Bone Marrow Transplant, 2011. 46(10): p. 1374-81. 165. Thiant, S., et al., Plasma levels of IL-7 and IL-15 in the first month after myeloablative BMT are predictive biomarkers of both acute GVHD and relapse. Bone Marrow Transplant, 2010. 45(10): p. 1546-52. 166. Kielsen, K., et al., T cell reconstitution in allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: prognostic significance of plasma interleukin-7. Scand J Immunol, 2015. 81(1): p. 72-80. 167. Poiret, T., et al., Reduced plasma levels of soluble interleukin-7 receptor during graft-versus-host disease (GVHD) in children and adults. BMC Immunol, 2014. 15: p. 25. 168. Shamim, Z., et al., Genetic polymorphisms in the genes encoding human interleukin-7 receptor-alpha: prognostic significance in allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant, 2006. 37(5): p. 485-91. 169. Shamim, Z., et al., Prognostic significance of interleukin-7 receptor-alpha gene polymorphisms in allogeneic stem-cell transplantation: a confirmatory study. Transplantation, 2011. 91(7): p. 731-6. 170. Shamim, Z., et al., Polymorphism in the interleukin-7 receptor-alpha and outcome after allogeneic hematopoietic cell transplantation with matched unrelated donor. Scand J Immunol, 2013. 78(2): p. 214-20. 171. Broux, B., et al., The influence of interleukin-7 receptor alpha-chain haplotypes on outcome after allogeneic hematopoietic cell transplantation. Int J Immunogenet, 2014. 41(6): p. 521-7. 172. Jonuleit, H., et al., Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol, 1997. 27(12): p. 3135-42. 173. Dobin, A., et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics, 2013. 29(1): p. 15-21. 174. Liao, Y., G.K. Smyth, and W. Shi, featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics, 2014. 30(7): p. 923-30. 175. RCoreTeam, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2014. 122 5 Verzeichnisse 176. Love, M.I., W. Huber, and S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol, 2014. 15(12): p. 550. 177. Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8. 178. Murray, A.W., Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell, 2004. 116(2): p. 221-34. 179. Galderisi, U., F.P. Jori, and A. Giordano, Cell cycle regulation and neural differentiation. Oncogene, 2003. 22(33): p. 5208-19. 180. Scholzen, T. and J. Gerdes, The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol, 2000. 182(3): p. 311-22. 181. http://de.wikipedia.org/wiki/Cyclin, Cycline. 02/2015. 182. Surh, C.D. and J. Sprent, Homeostasis of naive and memory T cells. Immunity, 2008. 29(6): p. 848-62. 183. Jiang, Q., et al., Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev, 2005. 16(4-5): p. 513-33. 184. Crawley, J.B., et al., T cell proliferation in response to interleukins 2 and 7 requires p38MAP kinase activation. J Biol Chem, 1997. 272(23): p. 15023-7. 185. Oeckinghaus, A., M.S. Hayden, and S. Ghosh, Crosstalk in NF-[kappa]B signaling pathways. Nat Immunol, 2011. 12(8): p. 695-708. 186. Benczik, M. and S.L. Gaffen, The interleukin (IL)-2 family cytokines: survival and proliferation signaling pathways in T lymphocytes. Immunol Invest, 2004. 33(2): p. 109-42. 187. Pollizzi, K.N. and J.D. Powell, Integrating canonical and metabolic signalling programmes in the regulation of T cell responses. Nat Rev Immunol, 2014. 14(7): p. 435-46. 188. Fayard, E., et al., Protein kinase B/Akt at a glance. J Cell Sci, 2005. 118(Pt 24): p. 5675-8. 189. Schwartz, R.H., T cell anergy. Annu Rev Immunol, 2003. 21: p. 305-34. 190. Fathman, C.G. and N.B. Lineberry, Molecular mechanisms of CD4+ T-cell anergy. Nat Rev Immunol, 2007. 7(8): p. 599-609. 191. Powell, J.D., The induction and maintenance of T cell anergy. Clin Immunol, 2006. 120(3): p. 239-46. 123 5 Verzeichnisse 192. Wells, A.D., New insights into the molecular basis of T cell anergy: anergy factors, avoidance sensors, and epigenetic imprinting. J Immunol, 2009. 182(12): p. 7331-41. 193. Crellin, N.K., R.V. Garcia, and M.K. Levings, Altered activation of AKT is required for the suppressive function of human CD4+CD25+ T regulatory cells. Blood, 2007. 109(5): p. 2014-22. 194. Shrestha, S., et al., T cells require the phosphatase PTEN to restrain T1 and T cell responses. Nat Immunol, 2015. 195. Jo, H., et al., Small molecule-induced cytosolic activation of protein kinase Akt rescues ischemia-elicited neuronal death. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(26): p. 10581-6. 196. Zheng, W.H., et al., Insulin-like growth factor-1 (IGF-1): a neuroprotective trophic factor acting via the Akt kinase pathway. J Neural Transm Suppl, 2000(60): p. 261-72. 197. Alves, N.L., et al., Differential regulation of human IL-7 receptor alpha expression by IL-7 and TCR signaling. J Immunol, 2008. 180(8): p. 5201-10. 198. Wohlfert, E.A. and R.B. Clark, 'Vive la Resistance!'--the PI3K-Akt pathway can determine target sensitivity to regulatory T cell suppression. Trends Immunol, 2007. 28(4): p. 154-60. 199. Sun, J., et al., T cells expressing constitutively active Akt resist multiple tumor-associated inhibitory mechanisms. Mol Ther, 2010. 18(11): p. 200617. 200. Ben Ahmed, M., et al., IL-15 renders conventional lymphocytes resistant to suppressive functions of regulatory T cells through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. J Immunol, 2009. 182(11): p. 676370. 201. Peluso, I., et al., IL-21 counteracts the regulatory T cell-mediated suppression of human CD4+ T lymphocytes. J Immunol, 2007. 178(2): p. 732-9. 202. Chetoui, N., et al., Interleukin-7 promotes the survival of human CD4+ effector/memory T cells by up-regulating Bcl-2 proteins and activating the JAK/STAT signalling pathway. Immunology, 2010. 130(3): p. 418-26. 203. Snyder, K.M., C.L. Mackall, and T.J. Fry, IL-7 in allogeneic transplant: clinical promise and potential pitfalls. Leuk Lymphoma, 2006. 47(7): p. 1222-8. 204. Venkitaraman, A.R. and R.J. Cowling, Interleukin-7 induces the association of phosphatidylinositol 3-kinase with the alpha chain of the interleukin-7 receptor. Eur J Immunol, 1994. 24(9): p. 2168-74. 124 5 Verzeichnisse 205. Dadi, H., S. Ke, and C.M. Roifman, Activation of phosphatidylinositol-3 kinase by ligation of the interleukin-7 receptor is dependent on protein tyrosine kinase activity. Blood, 1994. 84(5): p. 1579-86. 206. Johnson, S.E., et al., IL-7 activates the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in normal human thymocytes but not normal human B cell precursors. J Immunol, 2008. 180(12): p. 8109-17. 207. Crawley, A.M., et al., Jak/STAT and PI3K signaling pathways have both common and distinct roles in IL-7-mediated activities in human CD8+ T cells. J Leukoc Biol, 2014. 95(1): p. 117-27. 208. Pallard, C., et al., Distinct roles of the phosphatidylinositol 3-kinase and STAT5 pathways in IL-7-mediated development of human thymocyte precursors. Immunity, 1999. 10(5): p. 525-35. 209. Hand, T.W., et al., Differential effects of STAT5 and PI3K/AKT signaling on effector and memory CD8 T-cell survival. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(38): p. 16601-6. 210. Barata, J.T., et al., IL-7-dependent human leukemia T-cell line as a valuable tool for drug discovery in T-ALL. Blood, 2004. 103(5): p. 1891-900. 211. Ruppert, S.M., et al., JunD/AP-1-mediated gene expression promotes lymphocyte growth dependent on interleukin-7 signal transduction. PLoS One, 2012. 7(2): p. e32262. 212. Crawley, J.B., J. Willcocks, and B.M. Foxwell, Interleukin-7 induces T cell proliferation in the absence of Erk/MAP kinase activity. Eur J Immunol, 1996. 26(11): p. 2717-23. 213. Ellis, S.D., et al., Induced CD8+FoxP3+ Treg cells in rheumatoid arthritis are modulated by p38 phosphorylation and monocytes expressing membrane tumor necrosis factor alpha and CD86. Arthritis Rheumatol, 2014. 66(10): p. 2694-705. 214. Ohkusu-Tsukada, K., et al., Targeted inhibition of IL-10-secreting CD25Treg via p38 MAPK suppression in cancer immunotherapy. Eur J Immunol, 2010. 40(4): p. 1011-21. 215. Lamberti, A., et al., Activation of NF-kappaB/Rel transcription factors in human primary peripheral blood mononuclear cells by interleukin 7. Biol Chem, 2004. 385(5): p. 415-7. 216. Manning, B.D. and L.C. Cantley, AKT/PKB downstream. Cell, 2007. 129(7): p. 1261-74. 217. Smith-Garvin, J.E., G.A. Koretzky, and M.S. Jordan, T cell activation. Annu Rev Immunol, 2009. 27: p. 591-619. signaling: navigating 125 5 Verzeichnisse 218. Kannan, A., et al., Signal transduction via the T cell antigen receptor in naive and effector/memory T cells. Int J Biochem Cell Biol, 2012. 44(12): p. 212934. 219. Patel, E.S. and L.J. Chang, Synergistic effects of interleukin-7 and pre-T cell receptor signaling in human T cell development. J Biol Chem, 2012. 287(40): p. 33826-35. 220. Han, J.M., et al., Insulin inhibits IL-10-mediated regulatory T cell function: implications for obesity. J Immunol, 2014. 192(2): p. 623-9. 221. Etemire, E., et al., Transiently reduced PI3K/Akt activity drives the development of regulatory function in antigen-stimulated Naive T-cells. PLoS One, 2013. 8(7): p. e68378. 222. Liu, Y., et al., AKT hyperactivation confers a Th1 phenotype in thymic Treg cells deficient in TGF-beta receptor II signaling. Eur J Immunol, 2014. 44(2): p. 521-32. 223. Haxhinasto, S., D. Mathis, and C. Benoist, The AKT-mTOR axis regulates de novo differentiation of CD4+Foxp3+ cells. J Exp Med, 2008. 205(3): p. 56574. 224. Sauer, S., et al., T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(22): p. 7797802. 225. Bensinger, S.J., et al., Distinct IL-2 receptor signaling pattern in CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5287-96. 226. Huynh, A. and L.A. Turka, Control of T cell tolerance by phosphatase and tensin homolog. Ann N Y Acad Sci, 2013. 1280: p. 27-9. 227. Hill, J.A., et al., Foxp3 transcription-factor-dependent and -independent regulation of the regulatory T cell transcriptional signature. Immunity, 2007. 27(5): p. 786-800. 228. Bruno, L. and M. Merkenschlager, Directing T cell differentiation and function with small molecule inhibitors. Cell Cycle, 2008. 7(15): p. 2296-8. 229. Santulli, G. and H. Totary-Jain, Tailoring mTOR-based therapy: molecular evidence and clinical challenges. Pharmacogenomics, 2013. 14(12): p. 1517-26. 230. www.clinicaltrials.gov. 231. Keane, N.A., et al., AKT as a therapeutic target in multiple myeloma. Expert Opin Ther Targets, 2014. 18(8): p. 897-915. 126 5 Verzeichnisse 232. Alexander, W., Inhibiting the akt pathway in cancer treatment: three leading candidates. P T, 2011. 36(4): p. 225-7. 233. Kurtz, J.E. and I. Ray-Coquard, PI3 kinase inhibitors in the clinic: an update. Anticancer Res, 2012. 32(7): p. 2463-70. 234.http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm406387.h tm, FDA approves Zydelig for three types of blood cancers. FDA, Juli 2014. 235. Ahmad, S., et al., Functional redundancy of PI3K isoforms in conventional T cells provides a selective Treg-targeting strategy through inhibition of PI3Kdelta isoform. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2014. 2(Suppl 3): p. O4. 236. Zheng, Y., et al., A role for mammalian target of rapamycin in regulating T cell activation versus anergy. J Immunol, 2007. 178(4): p. 2163-70. 237. Dure, M. and F. Macian, IL-2 signaling prevents T cell anergy by inhibiting the expression of anergy-inducing genes. Mol Immunol, 2009. 46(5): p. 9991006. 238. Marcais, A., et al., microRNA-mediated regulation of mTOR complex components facilitates discrimination between activation and anergy in CD4 T cells. J Exp Med, 2014. 211(11): p. 2281-95. 239. Huynh, A., R. Zhang, and L.A. Turka, Signales and pathways controlling regulatory T cells. Immunol Rev, 2014. 258(1): p. 117-31. 240. Utting, O., S.-J. Teh, and H.-S. Teh, A Population of In Vivo Anergized T Cells with a Lower Activation Threshold for the Induction of CD25 Exhibit Differential Requirements in Mobilization of Intracellular Calcium and Mitogen-Activated Protein Kinase Activation. The Journal of Immunology, 2000. 164(6): p. 2881-2889. 241. Priatel, J.J., O. Utting, and H.S. Teh, TCR/self-antigen interactions drive double-negative T cell peripheral expansion and differentiation into suppressor cells. J Immunol, 2001. 167(11): p. 6188-94. 242. Lombardi, G., et al., Anergic T cells as suppressor cells in vitro. Science, 1994. 264(5165): p. 1587-9. 243. Lechler, R., et al., The contributions of T-cell anergy to peripheral T-cell tolerance. Immunology, 2001. 103(3): p. 262-9. 244. Qiao, G., et al., T cell activation threshold regulated by E3 ubiquitin ligase Cbl-b determines fate of inducible regulatory T cells. J Immunol, 2013. 191(2): p. 632-9. 127 5 Verzeichnisse 245. Ouyang, W. and M.O. Li, Foxo: in command of T lymphocyte homeostasis and tolerance. Trends Immunol, 2011. 32(1): p. 26-33. 246. Hedrick, S.M., et al., FOXO transcription factors throughout T cell biology. Nat Rev Immunol, 2012. 12(9): p. 649-61. 247. Kerdiles, Y.M., et al., Foxo transcription factors control regulatory T cell development and function. Immunity, 2010. 33(6): p. 890-904. 248. Safford, M., et al., Egr-2 and Egr-3 are negative regulators of T cell activation. Nat Immunol, 2005. 6(5): p. 472-80. 249. Palmer, C.S., et al., Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions. Front Immunol, 2015. 6: p. 1. 250. Finlay, D.K., Regulation of glucose metabolism in T cells: new insight into the role of Phosphoinositide 3-kinases. Front Immunol, 2012. 3: p. 247. 251. Pearce, E.L., et al., Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science, 2013. 342(6155): p. 1242454. 252. Procaccini, C., et al., An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity, 2010. 33(6): p. 929-41. 253. Zeng, H. and H. Chi, The interplay between regulatory T cells and metabolism in immune regulation. Oncoimmunology, 2013. 2(11): p. e26586. 254. Zeng, H., et al., mTORC1 couples immune Signales and metabolic programming to establish T(reg)-cell function. Nature, 2013. 499(7459): p. 485-90. 255. Michalek, R.D., et al., Cutting edge: distinct glycolytic and lipid oxidative metabolic programs are essential for effector and regulatory CD4+ T cell subsets. J Immunol, 2011. 186(6): p. 3299-303. 256. Dang, E.V., et al., Control of T(H)17/T(reg) balance by hypoxia-inducible factor 1. Cell, 2011. 146(5): p. 772-84. 257. Shi, L.Z., et al., HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells. J Exp Med, 2011. 208(7): p. 1367-76. 258. Oestreich, K.J., et al., Bcl-6 directly represses the gene program of the glycolysis pathway. Nat Immunol, 2014. 15(10): p. 957-64. 259. Toubai, T., et al., Role of cytokines in the pathophysiology of acute graftversus-host disease (GVHD): are serum/plasma cytokines potential biomarkers for diagnosis of acute GVHD following allogeneic hematopoietic 128 5 Verzeichnisse cell transplantation (Allo-HCT)? Curr Stem Cell Res Ther, 2012. 7(3): p. 22939. 260. Fujii, N., et al., Serum cytokine concentrations and acute graft-versus-host disease after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation: concurrent measurement of ten cytokines and their respective ratios using cytometric bead array. Int J Mol Med, 2006. 17(5): p. 881-5. 261. Hill, G.R., W. Krenger, and J.L. Ferrara, The role of cytokines in acute graftversus-host disease. Cytokines Cell Mol Ther, 1997. 3(4): p. 257-66. 262. Paczesny, S., et al., A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood, 2009. 113(2): p. 273-8. 263. Tawara, I., et al., Interleukin-6 modulates graft-versus-host responses after experimental allogeneic bone marrow transplantation. Clin Cancer Res, 2011. 17(1): p. 77-88. 264. Couriel, D.R., et al., A phase III study of infliximab and corticosteroids for the initial treatment of acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 2009. 15(12): p. 1555-62. 265. Korngold, R., et al., Role of tumor necrosis factor-alpha in graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia responses. Biol Blood Marrow Transplant, 2003. 9(5): p. 292-303. 266. Kovanen, P.E. and W.J. Leonard, Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the gamma(c)-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15, and 21, and their signaling pathways. Immunol Rev, 2004. 202: p. 67-83. 267. Hechinger, A.K., et al., Therapeutic activity of multiple common gammachain cytokine inhibition in acute and chronic GVHD. Blood, 2015. 125(3): p. 570-80. 268. Tanaka, J., et al., The important balance between cytokines derived from type 1 and type 2 helper T cells in the control of graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant, 1997. 19(6): p. 571-6. 269. Blaser, B.W., et al., Donor-derived IL-15 is critical for acute allogeneic graftversus-host disease. Blood, 2005. 105(2): p. 894-901. 270. Bucher, C., et al., IL-21 blockade reduces graft-versus-host disease mortality by supporting inducible T regulatory cell generation. Blood, 2009. 114(26): p. 5375-84. 271. Hippen, K.L., et al., Blocking IL-21 signaling ameliorates xenogeneic GVHD induced by human lymphocytes. Blood, 2012. 119(2): p. 619-28. 129 5 Verzeichnisse 272. Katzman, S.D., et al., Opposing functions of IL-2 and IL-7 in the regulation of immune responses. Cytokine, 2011. 56(1): p. 116-21. 273. Sim, G.C. and L. Radvanyi, The IL-2 cytokine family in cancer immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev, 2014. 25(4): p. 377-90. 274. Arneja, A., et al., Qualitatively Different T Cell Phenotypic Responses to IL-2 versus IL-15 Are Unified by Identical Dependences on Receptor Signal Strength and Duration. The Journal of Immunology, 2014. 192(1): p. 123135. 275. Ring, A.M., et al., Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2 and IL-15. Nat Immunol, 2012. 13(12): p. 1187-95. 276. Ikemizu, S., M. Chirifu, and S.J. Davis, IL-2 and IL-15 signaling complexes: different but the same. Nat Immunol, 2012. 13(12): p. 1141-2. 277. Palmer, M.J., et al., Interleukin-7 receptor signaling network: an integrated systems perspective. Cell Mol Immunol, 2008. 5(2): p. 79-89. 278. Foley, J.E., et al., Th2 cell therapy of established acute graft-versus-host disease requires IL-4 and IL-10 and is abrogated by IL-2 or host-type antigen-presenting cells. Biol Blood Marrow Transplant, 2008. 14(9): p. 95972. 279. Falcone, M., et al., IL-4 triggers autoimmune diabetes by increasing selfantigen presentation within the pancreatic Islets. Clin Immunol, 2001. 98(2): p. 190-9. 280. Ghoreschi, K., U. Mrowietz, and M. Rocken, A molecule solves psoriasis? Systemic therapies for psoriasis inducing interleukin 4 and Th2 responses. J Mol Med (Berl), 2003. 81(8): p. 471-80. 281. Weigert, C., M. Rocken, and K. Ghoreschi, Interleukin 4 as a potential drug candidate for psoriasis. Expert Opin Drug Discov, 2008. 3(3): p. 357-68. 282. Nelms, K., et al., The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol, 1999. 17: p. 701-38. 283. Pace, L., et al., Cutting edge: IL-4-induced protection of CD4+CD25- Th cells from CD4+CD25+ regulatory T cell-mediated suppression. J Immunol, 2006. 176(7): p. 3900-4. 284. Pace, L., C. Pioli, and G. Doria, IL-4 modulation of CD4+CD25+ T regulatory cell-mediated suppression. J Immunol, 2005. 174(12): p. 7645-53. 285. Chatila, T.A., Interleukin-4 receptor signaling pathways pathogenesis. Trends Mol Med, 2004. 10(10): p. 493-9. in asthma 130 6 6 Anhang 6.1 Veröffentlichungen Anhang Völkl, S., Rensing-Ehl, A., Allgäuer, A., Kremer, A., Speckmann, C., Ehl, S., Mackensen, A., et al. (2015) Hyperactive mTOR pathway promotes lymphoproliferation and abnormal differentiation in autoimmune lymphoproliferative syndrome, in preparation Allgäuer, A., Schreiner, E., Ferrazi, F., Ekici, A., Mackensen, A., Völkl, S. (2015) Interleukin-7 abrogates the immunosuppressive function of human double-negative T cells by activating Akt/mTOR signaling, J Immunol. 2015 Oct 1;195(7):3139-48. Rensing-Ehl, A., Volkl, S., Speckmann, C., Lorenz, M. R., Ritter, J., Janda, A., Abinun, M., Pircher, H., Bengsch, B., Thimme, R., Fuchs, I., Ammann, S., Allgäuer, A., Kentouche, K., Cant, A., Hambleton, S., Bettoni da Cunha, C., Huetker, S., Kuhnle, I., Pekrun, A., Seidel, M. G., Hummel, M., Mackensen, A., Schwarz, K., and Ehl, S. (2014) Abnormally differentiated CD4+ or CD8+ T cells with phenotypic and genetic features of double negative T cells in human Fas deficiency, Blood 124, 851860. Kulzer, L., Rubner, Y., Deloch, L., Allgäuer, A., Frey, B., Fietkau, R., Dorrie, J., Schaft, N., and Gaipl, U. S. (2014) Norm- and hypo-fractionated radiotherapy is capable of activating human dendritic cells, J Immunotoxicol., 11(4):328-36 Filipovic, M. R., Miljkovic, J., Allgäuer, A., Chaurio, R., Shubina, T., Herrmann, M., and Ivanovic-Burmazovic, I. (2012) Biochemical insight into physiological effects of H(2)S: reaction with peroxynitrite and formation of a new nitric oxide donor, sulfinyl nitrite, Biochem J 441, 609-621. 131 6.2 6 Anhang Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen bedanken, die mir bei der Anfertigung dieser Doktorarbeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Mein besonderer Dank gebührt Prof. Andreas Mackensen für sein in mich gesetztes Vertrauen, die Aufnahme in die Med5-Familie und die Betreuung dieser Arbeit. Sein stetiges Interesse am Fortschritt dieser Arbeit und vielseitigen Anregungen waren eine großartige Unterstützung. Ebenso möchte ich mich bei Dr. Simon Völkl für seine kompetente und ausdauernde Beratung bei diversen fachlichen und Labor-praktischen Fragestellungen danken, die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Aus unserem Austausch habe ich viel Wissen und vor allem immer wieder aufs Neue große Motivation für unsere Forschung gezogen. Herzlichen Dank Sam! Ferner danke ich dir, liebste Thea, für die konstruktive Zusammenarbeit und Hilfsbereitschaft sowie insbesondere für deine unvergesslich herzliche Freundschaft und ansteckenden Frohsinn. Danke ebenso an Mike, Kerstin, Flo, Steff, Fred, Elisabeth, Caro der AG Mackensen sowie den Ehemaligen Regina und Luise für viele anregende Diskussionen und die super Zusammenarbeit. Ein herzliches Dankeschön gilt auch Anita, Anna, Armin, Barbara, Betty, Co, Heidi, Heiko, Johanna, Judith, Margarete, Martina, Regina, Sascha, Steffi und allen weiteren beteiligten Forschern und Ärzte der Med5. Prof. Falk Nimmerjahn möchte ich ein herzliches Dankeschön für die Betreuung dieser Arbeit und die fachliche Unterstützung in meiner jährlichen Betreuungskommission aussprechen. Ebenso möchte ich Dr. Stefan Wirtz für sein Engagement in meiner Betreuungskommission und für die Einweisung und der Lizenzbenutzung der IPA Software danken. Prof. Lars Nitschke gilt mein Dank für die Begutachtung meiner Arbeit und Prof. Dr. Andreas Burkovski für die Abnahme der mündlichen Prüfung. Für die Hilfe bei der RNA-Sequenzierung und dessen Auswertung danke ich Prof. Arif Ekici und Dr. Fulvia Ferrazzi aus der Humangenetik, Erlangen sowie Uwe Appelt von der FACS Core Unit, Erlangen für die vorrausgegangenen Zellsortierungen. 132 6 Anhang Prof. Hans-Martin Jäck danke ich für die Aufnahme in das Fast-Track-PhDProgramm und sein enormes Engagement für das Graduiertenkolleg GK1660, welches unzählige wertvolle Erfahrungen ermöglichte – sei es durch die Teilnahme an diversen Kongressen, Seminaren und Öffentlichkeitsveranstaltungen. Vielen Dank ebenso an Anja Glanz und allen beteiligten Projektleitern für den vielseitigen fruchtbaren Austausch und allen Kollegiaten beziehungsweise Freunden für die einmalige Zeit. Zu guter Letzt möchte ich von ganzem Herzen meiner Familie und meinem Freund danken, die mich allzeit wesentlich unterstützt und liebevoll begleitet haben. Ich bin äußerst glücklich, dass es euch gibt und ich immer auf Euch zählen kann!
