Gewinnung eines Fusionsproteins von Glutathion S

4. Diskussion
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Das Thema dieser Arbeit war die Gewinnung eines rekombinanten Fusionsproteins von
PEX14. Dafür sollte es in einer möglichst großen Menge und “sauber” isoliert werden.
Durch die Transformation in Escherichia coli-Stämme mit einem geeigneten Konstrukt,
konnte das Fusionsprotein GST-Pex14p rekombinant exprimiert werden. Nach der
Isolierung des Proteins wurde diese zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.
Anschließend konnte von diesen Kaninchen Antiseren gewonnen werden.
4.1. Überexpression von Proteinen in E. coli
Bei der heterologen Expression von Genen in E. coli nehmen verschiedene Faktoren
Einfluß auf die Menge und Eigenschaften des gebildeten Proteins. Über die
Induktionszeit,
Anzuchttemperatur,
IPTG-Konzentration
und
die
Wahl
des
Bakterienstammes lassen sich unter anderem die Expressionsrate des Gens sowie die
Löslichkeit und die Stabilität des Translationsproduktes beeinflussen. Auf die
Bedeutung dieser Faktoren soll nachfolgend näher eingegangen werden.
4.1.1 Expressionsrate
Die Expressionsrate rekombinanter Gene läßt sich über die Promotoren der Vektoren
regeln. Die Induktionszeit hat Einfluß auf die synthetisierte Proteinmenge und sollte
optimiert werden, um die größtmögliche Menge eines Proteins gewinnen zu können. Es
wird zunächst angenommen, daß mit längerer Induktionszeit auch die gebildete Menge
des Genprodukts steigt. Dies gilt jedoch nur, wenn dieses Protein nicht toxisch für das
Wachstum des Bakteriums ist und nicht proteolytisch vom Wirtsorganismus abgebaut
werden. Wird das Protein nicht vertragen, muß die Induktion frühzeitig abgebrochen
werden. Mithilfe einer Expressionskinetik kann die Induktionszeit optimiert werden
(siehe Kap. 3.2.1, Abb. 3.11).
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Bei dem verwendeten GST-Expressionssystem der FA. Pharmacia, Freiburg (BRD)
wird eine Induktionszeit von 3-5 Stunden nach Erreichen einer Zelldichte mit einer OD
von 0.6-1 (bei einer Wellenlänge von 600 nm) empfohlen.
4.1.2 Löslichkeit
Es gibt verschiedene Methoden, um bakteriell überexprimierte Proteine zu reinigen.
Hierbei spielt das Löslichkeitsverhalten der zu reinigenden Proteine eine entscheidende
Rolle. Heterolog in Bakterien exprimierte Proteine werden häufig in Form von
unlöslichen, amorphen Aggregaten, sog. `inclusions bodies´, abgelagert (Marston et al.,
1986; Hartley und Kane, 1988; Mitraki et al., 1991). Innerhalb der Zelle stellen diese
`inclusion bodies´ Proteindepots dar, in denen anomale, d.h. beschädigte z.B. Proteine
vor ihrem Abbau (Prouty und Goldberg, 1972), aber auch normale Proteine des
Bakteriums bei gesteigerter Expression abgelagert werden (Bottermann und Zabeau,
1985). `Inclusion bodies´ erscheinen als amorphe Proteinaggregate, die ohne
umgebende Membran aufgrund ihrer Unlöslichkeit vom übrigen Cytoplasma getrennt
sind (Schoemaker et al., 1985).
Es wird vermutet, daß bei einer hohen Proteinbildungsrate wegen des überlasteten
Chaperonsystems die wachsende Polypeptidkette nicht exakt gefaltet werden kann und
die wasserabweisenden (hydrophoben) Zwischenprodukte im Cytoplasma Präzipitate
erzeugen. Solche Chaperone-Systeme sind DnaK/DnaJ und GroEL/GroES. (Gragerov et
al., 1992). Es erscheint daher sinnvoll, die Synthesegeschwindigkeit des zu
exprimierenden Proteins zu verringern, damit das entstehende Protein Zeit zum
korrekten Falten hat.
Experimentelle Möglichkeiten zur Verlangsamung der Genexpression gibt es mehrere:
Durch die Anzuchttemperatur werden die beschriebenen Proteinaggregate zum Teil
beeinflußt. Bei einigen Proteinen, die bei 37°C sich in `inclusion bodies´ ansammeln,
konnte gezeigt werden, daß bei Herabsetzung der Temperatur auf zwischen 20° und
30°C, diese Proteine zu einem großen Teil löslich im Cytoplasma vorliegen (Schein und
Noteborn, 1988). Bei niedriger Temperatur werden alle Schritte der Genexpression
langsamer verrichtet. Dadurch haben die Proteine länger Zeit sich zu entfalten.
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Auch die Verringerung der IPTG-Konzentration zur Induktion der Proteinexpression hat
Einfluß auf die Löslichkeit der gebildeten Proteine. Denn dadurch erfolgt eine
langsamere Proteinbiosynthese und dies bedeutet eine bessere Löslichkeit (Tagaki et al.,
1988). Dies konnte in dieser Arbeit auch bestätigt werden (siehe Kap.3.1.2, Abb.
3.2a/3.2b).
Die in der Literatur vorliegenden und die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, daß
die Bildung von `inclusion bodies´ vor allem durch eine geringere Expressionsrate
verhindert werden kann.
4.1.3 Wahl des E. coli-Stammes
Die Wahl des E. coli-Stammes, der für die Expression der Konstrukte verwendet wird,
kann einen Einfluß auf die Stabilität des Translationsproduktes haben. Für das
Fusionsprotein konnte mit einem GST-Expressionssystem gezeigt werden, daß im
Vergleich zu den E. coli-Stämmen TG1 und BL21, bei dem proteasefreien Stamm BL21
(DE3) der Abbau des gebildeten Fusionsproteins deutlich verringert ist. Die Bedeutung
der verwendeten E. coli-Stämme für die Stabilität der Genprodukte ist im Kapitel 4.3.1
beschrieben.
4.2 Genprodukt Pex14p
4.2.1 Heterologe Expression
Wie schon in Kapitel 3.1 dargelegt, konnte in Lysaten IPTG-induzierter Bakterienzellen
im Coomassie-gefärbten Gel außer der erwarteten Bande mit einem Molekulargewicht
von 64 kDa eine zusätzliche verstärkte Polypeptidbande mit einer relativen molaren
Masse von 26 kDa identifiziert werden. Dies ließ vermuten, daß es sich bei der 64 kDaBande um das Fusionsprotein GST-Pex14p und bei der 26 kDa-Bande um das GST
alleine handelt. Eine mögliche Schlußfolgerung ist, daß die 26 kDa-Bande durch
Proteolyse aus dem Fusionsprotein entstanden ist.
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Die Überprüfung der Löslichkeit des GST-PEX14 ergab, daß sowohl die 64 kDa- als
auch die 26 kDa-Bande überwiegend in löslicher Form im Überstand und zu einem
kleinen Anteil im Sediment (`inclusion bodies´) identifiziert werden konnte (Kap. 3.1.3;
Abb. 3.4).
Es wurden 2 Möglichkeiten zur Gewinnung von Protein für die Antikörperproduktion
im Kaninchen verwendet:
1.
Trennung
des
Fusionsproteins
in
denaturierter
Form
von
seinen
Abbauprodukten durch präparative SDS-Gelelektrophorese
Da die heterologe Expression des GST-Pex14-Fusionsproteins nicht ohne Proteolyse
ablief und trotz Gabe von Protease-Inhibitoren das Ergebnis unzureichend blieb, galt es,
das
Fusionsprotein
von
seinen
Abbauprodukten
durch
präparative
SDS-
Gelelektrophorese unter denaturierter Bedingung zu trennen. Hierdurch wurde
sichergestellt, daß das als Antigen verwendete Fusionsprotein mit einer molaren Masse
von 64kDa frei von anderen Polypeptidbanden war.
Das Protein wurde aus dem Acrylamid elektroeluiert und zur Immunisierung eines
Kaninchens eingesetzt
2. Gewinnung des Fusionsproteins in nativer Form aus einem proteasearmen E.
coli-Stamm BL21 (DE)
Das zu Beginn dieser Arbeit bereits vorgelegene Konstrukt ScPEX14 (M.Albertini,
1997) wurde sowohl in Zellen des E. coli-Stammes TG1 als auch des Stammes BL21
(DE3) transformiert. Beide Transformanten wurden für Expressionsstudien eingesetzt
(3.1 und 3.2). Dabei stellte sich heraus, daß bei beiden Stämmen das gebildete
rekombinante Fusionsprotein zum überwiegenden Teil löslich in der Zelle vorlag
(3.1.3). Die Expressionskinetik des Fusionsproteins im E. coli-Stamm BL21 zeigte, daß
die Expressionsrate, unter gleichen Anzuchtbedingungen, bei dem Stamm BL21 (DE3)
höher war als beim TG1 (3.2.1, Abb. 3.11).
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Das Fusionsprotein wurde chromatographisch aufgetrennt und mittels einer
Glutathionsäule aufgereinigt. Anschließend wurde die Elutationsfraktionen der Säule
zusammengegeben und mit Centriprep-Membranen eingeengt. So wurden zusätzlich
auch Degradationsprodukte zwischen 30 und 50 kDa abgetrennt. Mit dem so isolierten
nativen Fusionsprotein, das nun in ausreichender Menge vorlag, wurden Antikörper im
Kaninchen produziert.
4.3 Entwicklung eines Antiserums gegen Pex14p
Dieses Kapitel beschäftigt sich mit der Expression des GST-Pex14-Fusionsproteins und
der Qualität des erzeugten Antikörpers.
Das gegen das Fusionsprotein GST-Pex14p gewonnene Antiserum erkennt schon im
Wildtyp eindeutig das endogene Pex14p. Dies zeigt, daß das Antiserum auch ohne
Aufreinigung sowohl einen ausreichenden Titer, als auch die erhoffte eindeutige
Spezifität besitzt. Bei den im Zellextrakt des Überproduzenten pex14∆(YEpPEX14)
unerwartet gefundenen höheren Banden könnte es sich um das Dimer von Pex14p mit
zwei Abbaubanden handeln. Eine Dimerisierung von Pex14p aus der Hefe
Saccharomyces cerevisiae wurde aufgrund von Ergebnissen mit der Two-HybridTechnik postuliert. Warum das Dimer jedoch durch SDS nicht völlig dissoziiert werden
konnte, ist zur Zeit ungeklärt. Vergleichbare Fälle sind jedoch in der Literatur bekannt.
Unerwartet war auch die Tatsache, daß das Fusionsprotein Pex14p- ProteinA eine
intensivere Bande ergab, als das Wildtyp Pex14p selbst. Beide Proteine wurden von
Genen exprimiert, die unter der Kontrolle des identischen Pex14p-Promotors im
genomischen Kontext stand.
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