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Genklonierung
Hinweis: Im Atelier finden Sie die CD "Gentechnik, interaktiv experimentieren". Sie betreten
(vituell) das Biozentrum Basel und führen dort ein Klonierungsexperiment durch.
Die Schritte der Genklonierung
DNA kann leicht aus eukaryotischen und prokaryotischen Zellen isoliert werden. Die Isolierung
von DNA stellt den ersten Schritt im Arbeitsprozess einer Gen-Klonierung dar. Die Klonierung
eines Gens wiederum ist die Voraussetzung für dessen weitere Analyse, denn durch Klonieren
kann eine DNA in reiner Form gewonnen und vermehrt werden.
Die Schritte der Genklonierung im Ueberblick:
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Isolation von DNA (genomisch oder cDNA) und Plasmid-DNA
Schneiden der DNA und des Plasmids mit einem Restriktionsenzym
Ligation von DNA-Fragmenten mit der Plasmid-DNA
Transformation von Bakterien mit rekombinantem Plasmid
Selektion von Bakterienklonen, welche ein Plasmid aufgenommen haben
Isolierung des Klons mit dem gesuchten DNA-Fragment
Hinweis: Sehen Sie sich den Film „Prinzip der Genklonierung“ in der Video-Ecke an.
Die einzelnen Schritte werden unten ausführlich beschrieben:
1. DNA Klonierung: Warum?
Klonierung von genomischer DNA
Die totale DNA von Zellen der selben Art wird in Stücke geschnitten und jedes Stück kloniert. Es
resultiert eine Sammlung von DNA-Fragmenten, welche das ganze Genom dieser Zellen
repräsentieren: die genomische DNA-Bank. Sie eignet sich zur Isolation von Genen (mit
Promoter, Introns etc.) und intergenischen DNA-Sequenzen.
Klonierung von cDNA
Die totale mRNA von Zellen der selben Art wird isoliert, in cDNA umgeschrieben und jede
cDNA kloniert. Es resultiert eine Sammlung von cDNA-Fragmenten, welche die gesamte mRNA
dieser Zellen repräsentieren: die cDNA-Bank. Sie eignet sich zur Isolation von DNAAbschnitten, welche für Eiweisse kodieren. Da die kodierenden Sequenzen eines Genoms in der
Regel nur wenige Prozente der gesamten DNA einer Zelle darstellen, sind cDNA-Banken viel
kleiner (weniger Klone) als genomische Banken und eine gewünschte (für Eiweiss kodierende)
DNA-Sequenz kann daher mit weniger Aufwand gefunden werden.
2. DNA-Isolierung
Genomische DNA
Die wichtigsten Schritte:
• Zellen aufbrechen. Physikalisch: z.B. zerstossen der gefrorenen Zellen im Mörser. Chemisch:
z.B. Zell-Lyse mit Detergenzien
• Abzentrifugieren von unlöslichen Zelltrümmern
• Reinigen der DNA. Abbau von Proteinen mit Proteasen. Denaturieren und Ausfällen der
Proteine mit Phenol. Die Nukleinsäuren bleiben in Lösung. Auftrennen von unlöslicher und
löslicher Fraktion durch Zentrifugation. Ribonuclease-Behandlung zum Abbau von RNA.
• Anreichern der DNA mittels Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation
Hinweis: Sehen Sie sich den Film „DNA-Isolation“ in der Video-Ecke an. Details zur DNAIsolation finden Sie in der aufgelegten Broschüre.
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cDNA
cDNA (komplementäre DNA) ist ein "Abdruck" der mRNA und entspricht der DNA, welche für
eine gesuchte mRNA codiert.
Die wichtigsten Schritte:
• Isolation aller RNAs einer Zelle, in der das gesuchte Gen exprimiert, d.h. das Protein
synthetisiert wird.
• Reinigung von mRNA (d.h. Abtrennen von tRNA und rRNA) durch
Affinitätschromatographie
• Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der mRNA-Matrize: -> RNA-DNADoppelstrang
• Abbau des RNA-Stranges
• Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der DNA-Matrize: -> cDNA (DNADoppelstrang)
Vorgehen:
• Isolierung der gesamten zellulären RNA (80% rRNA, 15% tRNA, 5% mRNA)
• Abtrennen einer Fraktion, die hauptsächlich mRNA enthält. Praktisch jedes mRNA-Molekül
hat an seinem 3'-Ende eine Abfolge von Adenin-Nucleotiden = Poly (A)-Schwanz. Dieser
eröffnet einen sehr bequemen Weg, mRNA von der restlichen Zell-RNA zu trennen. Man
bindet Desoxythymidin-Oligonucleotide ("Oligo(dT)") an Zellulose und füllt diese in eine
Säule. Lässt man die gesamte Zell-RNA durch diese Säule laufen, bleiben die mRNAs mit
ihren Poly (A)-Schwänzen an den Oligonucleotiden "hängen" (Bildung von A-TBasenpaaren), während die übrigen RNAs die Säule passieren. Nun lässt man einen Puffer
niedriger Ionenstärke durch die Säule laufen. Dadurch lösen sich die Poly(A)-Oligo(dT)Hybride auf, und die gereinigte mRNA fliesst aus der Säule ab.
• cDNA-Synthese. Man gibt kurze Desoxythymidin-Oligonukleotide zu der gereinigten
mRNA. Diese hybridisieren mit den Poly (A)-Schwänzen und wirken dann als Primer für die
Reverse Transcriptase, ein Enzym aus Retroviren. Mit Hilfe dieses Enzyms werden mRNAs
über RNA-DNA-Doppelstränge zuerst in einzelsträngige DNAs und darauf in
doppelsträngige DNAs überschrieben. cDNAs enthalten, wie Gene, die Information zur
Bildung von Proteinen, haben aber im Gegensatz zu Genen keine Introns.
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3. Plasmid-Isolierung
Plasmide sind sich autonom vermehrende bakterielle Minichromosomen. Sie werden als
Vektoren beim Klonieren benutzt.
Vorgehen:
• Plasmidhaltige Bakterien in einem Flüssig-Medium züchten.
• Bakterien mit Lysozym behandeln, um die Zellwand zu destabilisieren.
• Bakterien mit Detergens lysieren und im alkalischen pH bakterielle DNA und Proteine
denaturieren.
• Das Homogenat neutralisieren. Dabei fallen Proteine und bakterielle genomische DNA aus
und die Plasmide bleiben in Lösung.
• Durch Zentrifugation Plasmide vom ausgefällten Material trennen.
• Die Plasmide mit organischen Lösungsmitteln extrahieren und mit Alkohol ausfällen.
Hinweis: Sehen Sie sich den Film „Plasmid-Isolierung im Labor“ in der Video-Ecke an.
Aufgabe: Warum wird die bakterielle genomische DNA denaturiert und die Plasmide bleiben in
Lösung?
Lösung: S. 11
Hinweis: Im Atelier gibt es ein Modell, an welchem diese Vorgänge veranschaulicht werden.
4. Restriktionsendonucleasen
Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, welche DNA sequenzspezifisch spalten:
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Restriktionsenzyme werden benötigt, um DNA an bestimmten Stellen zu zerschneiden. Sie
erkennen spezifische Sequenzen von 4 bis 6 Nucleotiden und spalten dort die
Phosphodiesterbrücken. Sie können DNA glatt inmitten ihrer Erkennungsstelle spalten und so
stumpf endende Fragmente erzeugen. Andere schneiden den Doppelstrang versetzt, so dass kurze
Einzelstrang-Schwänze mit spezifischer Sequenz entstehen ("klebrige" Enden). Durch Ligation
können die einzelnen Fragmente untereinander verbunden werden.
Heute kennt man über 800 verschiedene Restriktionsenzyme mit unterschiedlichen
Erkennungssequenzen. Diese Enzyme können je nach Bedarf bei entsprechenden Firmen
eingekauft werden. Restriktionsenzyme werden aus Mikroorganismen gewonnen.
Beispiele einiger häufig benutzter Restriktionsenzyme und ihre Erkennungssequenzen:
Enzym
Pvul
Pvull
EcoRl
BamHl
Hinfl
Sau3A
HaeIII
Erkennungssequenz
CGATCG
CAGCTG
GAATTC
GGATCC
GANTC
GATC
GGCC
Organismus
Proteus vulgaris
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Haemophilus aegyptius
Form der Enden
klebrig
glatt
klebrig
klebrig
klebrig
klebrig
glatt
Die angegebene Sequenz entspricht der eines Stranges in der 5'-3'-Richtung. Bemerkenswert ist,
dass fast alle Erkennungssequenzen Palindrome sind: Wenn man beide Stränge betrachtet, lesen
sie sich in beiden Richtungen gleich, zum Beispiel:
Biologische Bedeutung der Restriktionsenzyme
Mikroorganismen benutzen Restriktionsenzyme als "Abwehrmechanismus", um sich vor dem
Eindringen fremder DNA zu schützen. Gelangt fremde DNA, beispielsweise durch eine PhagenInfektion, in ein Bakterium, wird diese durch die Restriktionsenzyme der Zelle in kleine,
funktionslose Fragmente zerlegt.
Hinweis: Informationen über Bakteriophagen und Viren eukaryotischer Zellen finden Sie am
Ende dieses Dokumentes.
Die verschiedenen Typen von Restriktionsenzymen
Es gibt drei Typen von Restriktionsendonucleasen, die man mit I, II und III kennzeichnet. Die
Typen I und III sind im allgemeinen grosse Enzym-Komplexe aus vielen Untereinheiten mit
sowohl Endonuclease- als auch Methylase-Aktivität. Restriktionsendonucleasen des Typ I spalten
die DNA an zufälligen Stellen, die sich 1000 Basenpaare oder weiter von der Erkennungssequenz
entfernt befinden können. Die Enzyme des Typs III spalten die DNA etwa 25 Basenpaare von der
Erkennungssequenz entfernt. Beide Enzymtypen bewegen sich in einer Reaktion, die ATPEnergie verbraucht, an der DNA entlang. Die Restriktionsenzyme des Typs II, die zuerst von
Hamilton Smith isoliert wurden, sind einfacher, erfordern kein ATP und spalten die DNA
innerhalb der Erkennungssequenz.
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Die aussergewöhnliche Nützlichkeit der Typ-II-Enzyme wurde zuerst von Daniel Nathans
aufgezeigt. Sie sind die bei Arbeiten mit rekombinierter DNA am häufigsten verwendeten
Enzyme.
Nomenklatur der Restriktionsenzyme
Die ersten Buchstaben stehen für den Namen des Organismus, aus welchem das Enzym isoliert
wird. Die vierte Ziffer gibt an, um welchen Stamm es sich handelt. Dort, wo mehr als ein
Restriktionsenzym in einem Stamm gefunden wurde, werden diese mit römischen Zahlen
numeriert.
Bsp. Eco RI ist das erste Restriktionsenzym, das in E. coli aus dem Stamm R isoliert wurde.
Hinweis: Am Geschichtsposten im Atelier finden Sie Originaldokumente zu Restriktion und
Modifikation.
5. Ligation
Unter Ligation versteht man das Verknüpfen von DNA-Fragmenten mit dem Enzym DNALigase:
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DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können über diese Basenpaarung eingehen.
Sie werden deshalb als kohäsiv oder klebrig bezeichnet. Ueber diese Enden können DNAs durch
die DNA-Ligase fest verbunden werden. Die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer
Phosphodiesterbrücken.
Da Basenpaarung nur zwischen komplementären Sequenzen möglich ist, können von einem
Restriktionsenzym erzeugte kohäsive Enden nicht mit den von einem anderen Enzym erzeugten
Enden paaren, es sei denn, dieses andere Enzym erzeugt die gleichen klebrigen Enden. Doch zwei
beliebige, von demselben Enzym erzeugte Fragmente können, ungeachtet ihrer unterschiedlichen
Herkunft, miteinander "verkleben".
Die Ligation wird bei 10 bis 15 oC durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist
gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym
(Ligase) noch arbeitet.
Vorbereitung von cDNA für die Ligation
Weil die doppelsträngige cDNA stumpfe Enden hat, muss auch das Plasmid stumpf geschnitten
und cDNA und Plasmid stumpf ligiert werden. Da dies nicht sehr effizient geht, werden oft
Linker verwendet.
Linker sind kleine doppelsträngige DNA-Stücke mit bekannter Sequenz (RestriktionsSchnittstellen), die man im Reagenzglas synthetisiert hat. Die Linker werden mit Hilfe der DNALigase an die doppelsträngige cDNA geknüpft und mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die
cDNA, die nun klebrige Enden hat, baut man in einen Vektor ein, der zuvor mit demselben
Enzym geschnitten wurde:
6. Transformation
Unter Transformation, im Zusammenhang mit rekombinanter DNA, versteht man das Einbringen
von DNA in eine Zelle.
Hinweis: Hier werden nur Bakterien betrachtet. Für höhere Zellen, siehe Methoden des
Gentransfers beim Menschen.
Wie bringt man DNA in lebende Zellen?
Kompetente Bakterien
Die meisten Bakterien, darunter auch E.coli, nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in
begrenztem Umfang auf. Um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen
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physikalisch und/oder chemisch behandeln. So wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen.
Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetent.
Transformation von Bakterien
Um DNA in E.coli-Zellen einzubringen, muss die Zellmembran für Makromoleküle permeabel
gemacht werden. Dazu inkubiert man die Bakterienzellen mit Kalziumchlorid (CaCl2) bei 0 oC.
Aus nicht vollständig bekannten Gründen werden die so behandelten Zellen "kompetent", d.h. sie
nehmen bei 0 oC DNA auf. Dieser Vorgang ist sehr ineffizient, denn nur jede tausendste Zelle
wird transformiert. Durch einen Hitzeschock bei 37 bis 43 oC wird die Aufnahme von DNA
gestoppt.
7. DNA-Banken
Genomische Banken
Nun werden die transformierten Zellen auf einem mit Antibiotika behandelten Nährmedium
ausgestrichen und mittels Inkubation bei 37 oC vermehrt. Auf diesem Nährmedium können nur
diejenigen Bakterien überleben, die das Resistenzgen für das Antibiotikum besitzen und somit ein
Plasmid aufgenommen haben. Aus jedem Bakterium entsteht so ein Klon.
Merke:
• Ein Klon ist eine Gruppe oder Kolonie von genetisch identischen Organismen.
• Eine Genbank ist eine Sammlung von Klonen, die mit grosser Wahrscheinlichkeit jedes Gen
eines bestimmten Organismus enthalten.
Wenn die DNA von einem Säugetier mit einem Genom aus 3 x 109 Basenpaaren stammt und
Plasmide als Klonierungsvektoren verwendet werden, muss die Bibliothek etwa 3 500 000
rekombinierte Plasmide enthalten, die jeweils einen anderen Einschub aus 3500 bis 4500
Basenpaaren enthalten, damit ein gewünschtes Gen mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 % in der
Bibliothek vertreten ist.
Die Fragmente in der genomischen Bank eines höheren Eukaryoten enthalten nicht nur Gene,
sondern auch die nichtcodierende DNA, die einen grossen Teil vieler eukaryotischer Genome
ausmacht.
cDNA-Banken
Eine cDNA-Bank ist eine Sammlung von Klonen, die für jede mRNA-Sequenz kodieren, die in
der Zelle, aus der die mRNA isoliert wurde, exprimiert werden.
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Isolierung von Genen
Methoden zur Isolation eines Klons
Nukleinsäure-Hybridisierung
Prinzip:
Zwei Nukleotidstränge, welche komplementäre Basen tragen, können sich zusammenlagern und
einen Doppelstrang bilden. Diese Hybride können auch dann stabil sein, wenn einzelne
Nukleotide nicht zusammenpassen. Es spielt keine Rolle, ob es sich bei den Strängen um RNA
oder DNA handelt.
Gen-Sonden:
Eine Sonde ist eine Nukleotid-Sequenz, die für eine Hybridisierung, d.h. zum Nachweis einer
komplementären Sequenz in einer Nukleinsäureprobe eingesetzt wird.
• Es kann eine klonierte cDNA zur Isolierung des Gens eingesetzt werden.
• Ist die Aminosäuresequenz des Proteins, das vom gesuchten Gen codiert wird, bekannt, kann
man anhand des genetischen Codes die Nucleotidsequenz des dazugehörigen Gens ableiten.
Das künstliche Gen, das so synthetisiert wird, ist nur teilweise komplementär zur gesuchten
DNA, da eine Aminosäure oft von mehreren Codons bestimmt wird. Bsp: Die Codons für die
Aminosäure Alanin sind GCA, GCT, GCG und GCC. Zwei der drei Nukleotide im Codon für
Alanin können mit Sicherheit vorhergesagt werden. Ein künstlich erzeugtes Gen hat in der
Regel genügend Aehnlichkeit, um als Sonde eingesetzt werden zu können:
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•
Gehört das gesuchte Gen zu einer Genfamilie, kann ein anderes Gen aus dieser Familie als
Sonde verwendet werden, da diese Gene oft genügend Sequenzidentität haben.
Vorgehen:
Die Klone werden auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran aufgetragen und dort lysiert. Die
DNA wird auf der Membran denaturiert, d.h. es entstehen DNA-Einzelstränge. Diese werden mit
ihrem Zucker-Phosphat-Rückgrat fest an die Membran gebunden. Die markierten Sonden werden
zugegeben. Sie hybridisieren mit den DNA-Einzelsträngen. Die Membran wird gewaschen, um
die nichtgebundenen Sonden zu entfernen. Die Lage der gebundenen Sonden wird nachgewiesen.
Markierung der Sonden:
• Einbau von radioaktiven Nukleotiden. Die Bindung der Nukleotide an die Sonde kann durch
Autoradiographie nachgewiesen werden.
• Einbau von Nucleotiden, an welche Biotin gekoppelt wurde. Biotin hat eine hohe Affinität
zum Protein Avidin. Nach dem Hybridisieren mit der biotinylierten Nukleotidsonde wird die
Membran mit Avidin gewaschen. Avidin wird zuvor mit einem Fluoreszenz-Marker
gekoppelt und kann so sichtbar gemacht werden.
Hinweis: Sehen Sie sich den Film „Prinzip der Hybridisierung“ in der Video-Ecke an.
Immunscreening
Man identifiziert mit Antikörpern das Protein, das vom gesuchten Gen codiert wird.
Voraussetzung: das Gen muss von der transformierten Zelle exprimiert werden:
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Hinweis: In der „Lese-Ecke“ stehen Ihnen Lehrbücher zum vertieften Studium zur Verfügung
Lösung
•
Warum wird die bakterielle genomische DNA denaturiert und die Plasmide bleiben in
Lösung?
Sowohl die bakterielle genomische DNA wie auch die Plasmid-DNA sind ringförmig,
unterscheiden sich aber in ihrer Grösse. Bei der Zelllyse wird die bakterielle genomische DNA
aufgebrochen respektive linearisiert. Bei der Denaturierung wird die lineare DNA in
Einzelstränge aufgetrennt. Die wesentlich kleinere Plasmid-DNA bleibt ringförmig und kann
somit nicht denaturiert werden.
Hinweis: Sehen Sie sich den Film „Plasmid-DNA trennen“ in der Video-Ecke an.
Uebungsaufgaben mit Lösungen
finden Sie in der Internetversion des Ateliers!
Hinweis: Das „Repetitorium Molekularbiologie“ definiert den Stoff, welcher in den Prüfungen
verlangt wird. Wegen seiner Kürze eignet es sich allerdings nicht als primäre Informationsquelle!
VIREN
Viren sind infektiöse Partikel, die sich in eukaryotischen Zellen vermehren. Viele von ihnen sind
als Krankheitserreger bei Menschen, Tieren und Pflanzen medizinisch und ökonomisch von
Bedeutung.
BAKTERIOPHAGEN
Bakterien können von einer Vielzahl von bakteriellen Viren, den sogenannten Bakteriophagen
(kurz: Phagen) infiziert werden. Das genetische Material (Genom) dieser Phagen ist entweder
doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA oder RNA. Das Genom ist in eine mehr oder
weniger kompliziert gebaute Proteinhülle verpackt. Diese Proteinhülle dient zusätzlich der
Selektion der geeigneten Wirtszellen und häufig der Injektion des Phagengenoms in die
Wirtszelle. Phagen sind für ihre Vermehrung immer auf lebende Zellen angewiesen. Sie haben als
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experimentelle Systeme in der Molekularbiologie und als Vektoren in der Gentechnologie grosse
Bedeutung.
Vermehrung
Je nach Phagentyp kann die Infektion einer Wirtszelle lytisch verlaufen, oder die Wirtszelle kann
lysogenisiert werden.
Die lytische Infektion: Beispiel des Phagen T4:
Der Phage T4 hat eine komplexe Struktur, welche im wesentlichen aus Kopf (Proteinhülle mit
Doppelstrang-DNA-Genom) und Schwanz besteht:
Figur: Der Phage T4
T4-Phagen erkennen Wirtszellen (E. coli) an spezifischen Oberflächenproteinen, adsorbieren an
diese und injizieren die DNA ins Zellinnere. Die Phagen-DNA enthält alle Informationen, die für
die Replikation des Genoms und die Produktion neuer Phagen in der Wirtszelle notwendig sind.
In den ersten Minuten nach der Infektion führt die Transkription eines Teils der infizierenden
Phagen-DNA durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase der Wirtszelle zur Synthese phagenspezifischer mRNAs, welche durch den Proteinsyntheseapparat der Wirtszelle in Phagen-Enzyme
übersetzt werden. Kurz darauf beginnt die Replikation der Phagen-DNA mit Hilfe der
neusynthetisierten phagenspezifischen DNA-Polymerase. Noch während die DNA-Synthese
läuft, beginnt bereits die Synthese der Phagen-Hüllproteine und deren Zusammenbau zu
Phagenköpfen. In diese wird darauf die neusynthetisierte Phagen-DNA verpackt. Zuletzt werden
Phagen-köpfe und separat aufgebaute Schwanzstrukturen zu reifen Phagen verbunden. Zu den
spät in der Infektion exprimierten Genen des Phagengenoms gehört auch das Gen für ein
phagenspezifisches Lysozym. Dieses Enzym katalysiert den Abbau der Zellwand, was zur Lyse
der Wirtszelle und zur Freisetzung der Nachkommen-Phagen führt. Der ganze lytische
Infektionszyklus dauert etwa 30 Minuten.
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Die lysogene Infektion: Beispiel des Phagen Lambda:
Phagen, welche sowohl eine lytische als auch eine lysogene Infektion machen können, werden als
temperente Phagen bezeichnet. Bei der lysogenen Infektion, die nur bei bestimmten
Umweltbedingungen möglich ist, wird die infizierende Phagen-DNA ins Genom der Zelle
eingebaut. Der Einbau des Lambda-Genoms erfolgt immer an der gleichen Stelle des bakteriellen
Genoms, in der Nähe der Gene für Galaktoseverwertung. Es gibt aber auch Phagen, die irgendwo
ins Wirtszellgenom integrieren. Im lysogenen Zustand kann das Phagengenom über viele
Generationen im bakteriellen Genom integriert bleiben, und es wird als Bestandteil dieses
Genoms repliziert. Vom integrierten Lambda-Genom wird jedoch nur ein einziges Gen
transkribiert. Dieses Gen kodiert für ein Repressor-Protein (Lambda-Repressor), welches die
Transkription der übrigen Lambda-Gene und damit die Virus-Vermehrung unterdrückt. Wenn der
Lambda-Repressor inaktiviert wird (z.B. durch UV-Bestrahlung), beginnt die Transkription des
eingebauten Phagengenoms. Als Folge davon wird die integrierte Lambda-DNA aus dem
Wirtszellgenom herausgeschnitten, und es beginnt ein lytischer Zyklus.
Figur: Lysogene Infektion
Transduktion: Wenn temperente Phagen aus dem Wirtszellgenom herausgeschnitten werden,
kann es vorkommen, dass ab und zu ein Wirtszell-Gen mit der Phagen-DNA herausgeschnitten
und in reife Phagenköpfe verpackt wird. Nach der Freisetzung gelangen diese Gene mit der
Phagen-DNA in andere Zellen und übertragen damit genetische Information ('horizontale'
Verbreitung von Genen in einer Bakterienpopulation).
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Restriktion und Modifikation
Bakterien haben Enzyme, welche die DNA an ganz bestimmten Stellen chemisch modifizieren,
meistens methylieren. Diese Enzyme und mit ihnen die Modifikationen sind von Stamm zu
Stamm verschieden. Daneben verfügen die gleichen Bakterien über Desoxyribonukleasen
(DNasen), welche DNA, die nicht die stammspezifischen Modifikationen aufweist, in Fragmente
zerschneiden. Diese Enzyme werden als Restriktionsenzyme bezeichnet. Einige dieser
Restriktionsenzyme schneiden DNA sequenz-spezifisch. Sie bilden, wie wir in der Vorlesung
sehen werden, die Grundlage für die Entwicklung der ganzen Gentechnologie.
Die biologische Bedeutung der Restriktions- und Modifikationsenzyme liegt darin, dass sie die
Zelle vor Fremd-DNA schützen und damit die unkontrollierte Verbreitung von genetischem
Material verhindern.
EUKARYOTISCHE VIREN
Aehnlich wie Bakteriophagen in prokaryotischen Zellen sind Viren in eukaryotischen Zellen
bedeutsame Modellsysteme für molekularbiologische Studien; einige von ihnen dienen zusätzlich
als Vektoren für Gentransferexperimente in eukaryotischen Systemen. Wie die Bakteriophagen
sind auch Viren zur Vermehrung auf eine lebende Wirtszelle angewiesen.
Strukturen
In Form, Grösse, Informationsgehalt des Genoms, Wirtspezifität etc. herrscht eine ungeheure
Vielfalt. Wir werden deshalb im folgenden nur einige grundlegende Eigenschaften besprechen
und dabei das eine oder andere Virus als Beispiel heranziehen (siehe Tabelle).
+ = positive Polarität; - = negative Polarität; ss = einzelsträngig (single-stranded); ds =
doppelsträngig.
Viren bestehen in der Regel aus folgenden Komponenten:
Figur: Schematische Darstellung einesVirus
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Genom
Virale Genome können aus doppelsträngiger (ds) DNA, einzelsträngiger (ss) DNA, dsRNA oder
RNA bestehen. Ihre Grössen variieren zwischen 103 (Parvovirus) bis mehr als 106 Nukleotide
(Poxvirus). Genome können als lineare, zirkuläre oder fragmentierte Nukleinsäure-Moleküle
vorliegen. Bei einzelsträngigen Nukleinsäuren kann der Strang mit positiver Polarität (gleiche
Sequenz wie mRNA) oder der Strang mit negativer Polarität als Genom dienen; für eine
bestimmte Virus-Art ist es aber stets derselbe Strang. Virale Genome kodieren für
Strukturproteine des Virus und für Enzyme, die für die Genom-Replikation benötigt werden.
Capsid
Eine Proteinhülle, das Capsid, umgibt das virale Genom. Das Capsid ist aus Struktureinheiten,
den Capsomeren, zusammengesetzt, die in der Regel aus einer grossen Zahl eines einzigen oder
ein paar wenigen Typen von Proteinen bestehen. Oft sind die Capsomere, wie in der Abbildung
dargestellt, als Icosaeder angeordnet (20 gleichseitige Dreiecke). Viele Viren, unter ihnen das
Poliovirus (siehe Tabelle), bestehen nur aus Genom und Capsid.
Membran
Sie ist, wie vorher angedeutet, nicht bei allen Viren vorhanden. Die Membran stammt von der
Wirtszelle und wird vom Virus beim Austritt aus der Zelle mitgenommen (siehe unten). Sie
enthält in der Regel vom Wirtsgenom kodierte und eventuell zusätzlich virus-kodierte Proteine.
Beispiele von Viren mit einer Membran sind (in der Tabelle) Influenzavirus und die Retroviren.
Einteilung der Viren
Viren werden aufgrund ihrer Morphologie und der Grösse und Art ihres Genoms klassifiziert.
Vermehrung
Eintritt in die Zelle:
Viren adsorbieren an spezifische Oberflächen-Moleküle der Wirtszelle. Es ist somit die Oberflächenstruktur einer Zelle, die mitentscheidet, ob eine Infektion mit einem bestimmten Virus
möglich ist. Die Aufnahme eines adsorbierten Virus in die Zelle geschieht dann via Endocytose.
Der Inhalt des infizierenden Virus wird darauf in der Zelle entlassen.
Expression und Replikation des viralen Genoms:
Die meisten Viren, die dsDNA als Genom besitzen, replizieren und transkribieren die DNA im
Zellkern der Wirtszelle mit Hilfe wirts-spezifischer Enzyme. Eine Ausnahme bildet das Poxvirus,
das sich im Cytoplasma vermehrt und alle Enzyme für Replikation und Transkription mitbringt.
Viren mit RNA-Genomen von positiver Polarität (z.B. Polioviren) können direkt mit der
Proteinsynthese im Cytoplasma beginnen, da ihr Genom als mRNA dienen kann. Sie replizieren
ihr RNA-Genom mit Hilfe einer virus-spezifischen Replicase, welche zuerst eine RNA-Kopie mit
negativer Polarität synthetisiert und diese anschliessend in RNA-Genome mit positiver Polarität
kopiert. Alle diese Vorgänge finden im Cytoplasma statt.
Viren mit RNA-Genomen von negativer Polarität (z.B. Influenzavirus) oder dsRNA (z.B.
Reovirus) benötigen eine RNA-abhängige RNA-Polymerase für Transkription und Replikation
und müssen diese, da die Wirtszellen kein solches Enzym besitzen, im Viruspartikel mit in die
Zelle bringen.
Retroviren haben einen besonders interessanten Mechanismus der Replikation und Transkription
entwickelt. Sie überschreiben ihr RNA-Genom mit positiver Polarität mittels einer viruskodierten Reversetranskriptase in dsDNA. Diese dsDNA-Kopie des viralen Genoms wird in die
Wirtszell-DNA integriert und dort wie zelleigene Gene von wirts-spezifischen Enzymen
transkribiert.
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Synthese der viralen Proteine
Allen Viren ist gemeinsam, dass sie zur Uebersetzung ihrer mRNA vollständig auf den Proteinsyntheseapparat der Wirtszelle angewiesen sind. Diese Synthese findet daher immer im
Cytoplasma statt. Der darauffolgende Zusammenbau der Komponenten zum intakten
Nachkommenvirus findet, je nach Virusart, im Cytoplasma oder im Zellkern statt.
Freisetzung der Viren
Nachkommenviren können am Ort des Zusammenbaus riesige intrazelluläre Aggregate bilden,
welche nach dem Absterben und Lysieren der Wirtszelle freigesetzt werden. Gewisse Viren (z.B.
Influenzavirus) synthetisieren virus-spezifische Membranproteine, welche in die Plasmamembran
der Wirtszelle integrieren und später das Capsid binden. Das Nachkommenvirus tritt dann durch
die Membran aus, wobei es ein Stück dieser Membran mitnimmt:
Figur: Freisetzung der Viren
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