Gliom-assoziiertes Antigen 2 (GLEA2) als Immunogen

Aus dem Institut für Humanmedizin
der Medizinischen Fakultät
der Universität des Saarlandes, Homburg/Saar
Gliom-assoziiertes Antigen 2 (GLEA2) als Immunogen:
Aspekte der humoralen und zellulären Immunantwort
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der UNIVERSITÄT DES SAARLANDES
2006
vorgelegt von Agata Mikolajewska
geb. am 16. Mai 1977 in Poznan, Polen
Aber man verlangt vom Forscher, dass er Beweise liefert,
wenn es sich zum Beispiel um die Entdeckung eines großen Berges handelt,
verlangt man, dass er große Steine mitbringt.
Antoine de Saint-Exupéry (1900-1944), frz. Flieger und Schriftsteller
INHALTSVERZEICHNIS
Zusammenfassung
1
Summary
3
I. EINLEITUNG
5
1. Gliome
5
1.1.WHO-Klassifikation und histopathologische Einteilung der Gliome
5
1.2.Klinische Symptome und Prognose bei Patienten mit Gliomen
7
2. Therapeutische Optionen bei Gliomen
8
3. Immunologie der Gliome
9
3.1.Besonderheiten des Immunsystems im zentralen Nervensystem (ZNS)
9
3.2.Tumor-escape Mechanismen bei Gliomen
10
3.3.Tumor assoziierte Antigne (TAAs) bei Gliomen
10
3.4.GLEA 2 Antigen
11
4.Zielsetzung
12
II. MATERIAL UND METHODEN
13
1. Patienten
13
2. Heterologes Immunoscreening (SEREX)
13
2.1. Phagentiterbestimmung
13
2.2. Serumpräabsorption
14
2.2.1. Herstellung einer lytischen Säule
15
2.2.2. Herstellung einer mechanischen Säule
15
2.2.3. Serumaufreinigung
16
2.3. Immunoscreening
16
3. ELISA (nach Qiagen-Expressionist, Quiaexpress detection and assay Protokol)
18
3.1. Herstellung des Proteins aus Baculovirus Expression System
19
3.1.1. Herstellung des Large Scale Titer Virus Stocks
19
3.1.2. GLEA 2 Proteinexpression
20
3.1.3. GLEA 2 Proteinaufreinigung über Ni-NTA-Agarose-Säulen
20
3.1.4. GLEA2 Protein Konzentrationsbestimmung mit Roti-Nanoquant
21
3.1.5. SDS-PAGE und Western-Blot Analyse des rekombinanten Proteions GLEA2
22
3.1.5.1. SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese)
22
3.1.5.2. Nachweis von Proteinen mit Comassie-Blau
24
3.1.5.3. Spezifischer Nachweis von Proteinen im Western-Blot
24
3.1.5.3.1. Western-Blot
24
3.1.5.3.2. Detektion mit GLEA2 spezifischen Antikörpern GLEA2-AK455
25
3.2. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
26
4. Isolierung von PBMC (peripheral blood mononuclear cells) über
Dichtegradientenzentrifugation
28
4.1. Dichtegradientenzentrifugation
28
4.2. Zellzahlbestimmung
29
4.3. Kryopräservation von PBMC-Zellen
30
4.4. Auftauen von kryopräservierten PBMCs
31
5. PBMC (peripheral blood mononuclear cells)-Kultur und Stimulationsvorgang
31
5.1. Stimulation durch eine direkte Antigenzugabe ins Kulturmedium
32
5.2. Stimulation durch Zugabe der antigenbeladenen APCs (antigen presenting cells)
33
6. Proliferationsmessung der stimulierten PBLs (peripheral blood lymphocytes)
6.1. Ansätze
34
34
6.2. WST-Proliferationsassay (gemäß WST-Proliferationsprotokoll, Roche GmbH,
Germany)
35
7. Durchflusszytometrie
36
7.1. Fluoreszenzmarkierte Antikörper und Leukozytenoberflächenantigene
36
7.2. Durchführung der Fluoreszenzfärbung
38
7.2.1. Verteilen und waschen der Zellen
38
7.2.2. Antikörperinkubation
38
7.2.3. Vorbereitung der Zellen zur Messung
39
7.3. FACS-Messung
39
8. Intrazelluläre Zytokindetektion nach FastImmune Assay (Becton Dickinson)
40
8.1. Antigenspezifische Stimulation und Fixierung der Zellen
41
8.2. Immunofluoreszenzfärbung und FACS-Analyse
42
9. Detektion der Zytokinproduktion durch aktivierte T-Zellen mittels ELISA
43
9.1. IL-4 ELISA (nach BD OptEIA™ Human IL-4 ELISA Kit II)
43
9.2. IFNγ und TNFα ELISA
47
10. Migrationsassay
10.1. 4-stündiger Migrationsassay
10.2. Über-Nacht Migrationsassay und die FACS-Analyse der migrierten
50
50
Zellpopulationen
52
III. ERGEBNISSE
53
1. Patienten
53
2. Humorale Immunantwort auf Gliom assoziiertes Antigen GLEA2 bei Patienten
mit Gliomen
56
2.1. Heterologes Immunoscreening (SEREX)
56
2.2. Antikörperdetektion mittels ELISA
57
2.3. Vergleich von SEREX und ELISA
59
2.4. Anti-GLEA2 Antikörper in Seren von Patienten mit Tumorrezidiven
60
3. WST-Proliferationsassay
61
3.1. Proliferative Antwort der PBLs (peripheral blood lymphocytes) auf die
Stimulation mit GLEA2 Protein
61
3.2. Proliferationsrate der PBLs im Vergleich zu anti-GLEA2 Antikörperstatus in
entsprechenden Patientenseren
64
3.3. Proliferationsrate der PBLs und eine durchflußzytometrische Analyse der PBLs
nach einer Stimulation mit GLEA2-Protein
65
4. Immunophenotypische Charakterisierung der mit GLEA2-Protein stimulierten
PBLs (peripheral blood lymphocytes) mittels Durchflußzytometrie
5. Kurzzeitstimulation mit GLEA2 Protein
68
77
5.1. IFNgamma- Freisetzung durch CD4+ Lymphozyten nach Kurzzeitstimulation mit
GLEA2 Protein
5.2. Expression von dem frühen Aktivierungsmarker CD69 nach der
77
84
Kurzzeitstimulation mit dem GLEA2 Protein
5.3. IFNgamma Produktion und CD69 Expression durch gesamte PBLs im Vergleich
zu CD4+ T-Lymphozyten
6. Zytokinproduktion durch stimulierte PBLs
87
91
6.1. IL-4 ELISA
92
6.2. IFNγ ELISA
96
6.3. TNFα ELISA
100
6.4. Zytokinproduktion und Charakteristik der PBLs Populationen
103
7. Migrationsassay
104
7.1. Migration von PBLs gegen aufgelöstes GLEA2 Protein
104
7.2. Migration von PBLs gegen Zellkulturüberstände
110
IV. DISKUSSION
1. Humorale Immunantwort bei Patienten mit Gliomen
115
115
1.1. Anti-GLEA2 Antikörperpräsenz in Abhängigkeit von der histopathologischen Diagnose
115
1.2.Primäre und sekundäre Glioblastome vs. Glioblastom-Rezidive
118
2. Proliferation von PBLs (peripheral blood lymphocytes) als Antwort auf
Stimulierung mit GLEA2-Protein
119
2.1. WST-Proliferationsassay
2.2. Immunophenotypische Charakterisierung der proliferierenden PBLs
120
3. Veränderungen innerhalb der PBLs-Subpopulationen im Laufe der
Restimulationen mit GLEA2-Protein
122
3.1. CD3+/CD16-56- T-Zellen
122
3.2. CD3-/CD16+56+ NK- und CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen
123
4. Funktionelle Fähigkeiten der mit GLEA2-Protein stimulierten PBMCs (peripheral blood
mononuclear cells)
125
4.1.Die frühe Interferon-gamma (IFNγ)-Produktion nach einmaliger Stimulation mit GLEA2-Protein
125
4.2.Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 nach de Stimulation mittels GLEA2-Protein
126
4.3.Interferon-gamma (IFNγ)-, Tumor necrosis factor alpha (TNFα)- und Interleukin 4 (IL-4)Produktion in Laufe der wiederholten Stimulationen mit GLEA2-Protein
4.4.Migrationfähigkeit der stimulierten PBMCs gegen das aufgelöste GLEA2-Protein
127
128
4.5.Migrationfähigkeit der stimulierten PBMCs gegen Zellkulturüberstände der autologen GBMZellkulturen
130
5. Schlussfolgerungen
133
6. Ausblick
134
ANHANG
135
LITERATURVERZEICHNIS
139
DANKSAGUNG
150
LEBENSLAUF
152
Zusammenfassung
Glioblastoma multiforme (GBM) ist das maligneste und häufigste astrozytäre Gliom im
Erwachsenenalter und gleichzeitig der häufigste zerebrale Tumor dieser Altersgruppe. Trotz
multimodaler therapeutischer Ansätze, bleibt die Prognose für die betroffenen Patienten
infaust. Umso wichtiger ist deshalb, eine genaue Kenntnis der Immunologie dieser
Tumorgruppe zu gewinnen, um die immunologischen Prozesse, die als Reaktion auf die
Tumorentstehung stattfinden, im Rahmen einer Immuntherapie zu nutzen.
Obwohl die Anzahl der Gliom-assoziierten Antigene relativ groß ist, wurden bis jetzt nur
wenige immunogene Epitope entdeckt, die die in vitro Sensibilisierung der T-Zellen erlauben
und ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen fördern würden. Die Grundlagen für die
vorliegende Doktorarbeit stellen die Ergebnisse über die häufige Serumaktivität gegen das
Gliom-assoziierte Antigen GLEA2 bei Gliompatienten dar (Fischer et al., 2001; Pallasch et
al., 2004), sowie die von Pallasch et al. beschriebene Korrelation zwischen Antikörperpräsenz
und Überlebenszeit der Patienten. Diese klinische Relevanz der anti-GLEA2 Antikörper führt
zur Frage nach den protektiven Mechanismen dieser Antikörper und der Rolle der eventuellen
zellulären Immunantwort gegen das GLEA2- Antigen.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Spezifität einer möglichen zellulären
Immunantwort gegen das GLEA2 Antigen zu überprüfen und die beteiligten PBLSubpopulationen (peripheral blood lymphocytes) näher zu charakterisieren.
Das in den durchgeführten Experimenten verwendete GLEA2 Protein wurde mit Hilfe des
Baculovirus Expression System synthetisiert. Das rekombinante GLEA2 Protein diente zum
einen zur Entwicklung eines ELISA- gestützten Systems zum Nachweis von GLEA2
Antikörpern im Patientenserum, zum anderen als Stimulus für die aus dem Blut der
Gliompatienten isolierten PBLs. Die Ergebnisse dieser Stimulation wurden mittels WSTProliferationsassays
sowie
in
funktionellen
Assays,
wie
FastImmune
Kurzzeitstimulationsassay, Zytokin- ELISA und Migrationsassay, untersucht. Die spezifisch
aktivierten PBL- Subpopulationen wurden mittels durchflußzytometrischer Analyse näher
charakterisiert.
Der GLEA2- ELISA bestätigte die zuvor erhobenen Daten zur humoralen Immunantwort
gegen das GLEA2 Protein. Die Häufigkeit der Seroreaktivität für GLEA2 war für Patienten
mit astrozytären Tumoren höheren Tumorgrades gegenüber denjenigen mit astrozytären
Tumoren niedrigeren Tumorgrades erhöht. Das Auftreten von Rezidiven ging mit einer
Verlust der humoralen Immunantwort gegen GLEA2 einher.
1
Der proliferative Einfluss des GLEA2-Proteins auf PBLs war unabhängig von der
histopathologischen Diagnose und dem Tumorstadium. Die Proliferationsrate korrelierte nicht
mit dem Nachweis von Antikörpern in den entsprechenden Seren. Die proliferierenden PBLs
hatten überwiegend NK- und NKT-Zell- Merkmale.
Die Aktivierung der stimulierten PBLs wurde mittels FastImmun- Assays überprüft. Diese
Methode dient zur Messung der Freisetzung von IFNγ durch PBLs nach einer
Kurzzeitstimulation. Die stimulierten Zellen zeigten eine erhöhte CD69-Expression, jedoch
keine IFNγ-Produktion. Die wiederholten Stimulationen führten allerdings zu einer deutlichen
IL-4-Produktion, was mittels Zytokin- ELISA nachgewiesen wurde.
Um die Spezifität der Stimulierung mit GLEA2-Protein zu überprüfen, wurde der
Migrationsassay durchgeführt. In diesem Experiment konnte eine spezifische Migration der
stimulierten PBLs in Richtung des GLEA2 Proteins, sowie in Richtung der GliomzellkulturÜberstände gezeigt werden. Die migrierten PBLs konnten durchflußzytometrisch als
aktivierte NK-Zellen charakterisiert werden.
Die in der vorliegenden Dissertation erhobenen Daten deuten auf eine Stimulierbarkeit der
PBLs durch das Gliom-assoziierte Antigen GLEA2. Zu den am stärksten interagierenden
PBL- Subpopulationen gehören NK und NKT- Zellen. Diese Beobachtung legt eine
experimentelle Untersuchung der potentiellen zytotoxischen Eigenschaften der GLEA2stimulierten NK-Zellen gegen Gliome nahe. Eine erhöhte Zytotoxizität nach in vitro
Stimulation mit GLEA2 würde sich gegebenenfalls anbieten, um die Wirksamkeit der NKZellen unter den Gliom-infiltrierenden Lymphozyten zu verstärken.
2
Summary
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most malignant and the most frequent astrocytic glial
tumour in adults and the most frequent cerebral malignancy in this age group. Despite the
multimodal therapy, the prognosis of the glioblastoma patients is being still unfavorable.
Therefore a very important factor is the exact knowledge of the immunology of this tumour
group, which can bring benefit for the glioma- immunotherapy.
Despite the large number of the known glioma- associated antigens, there are to date only a
few immunogenic epitops discovered, which lead to the in vitro sensibilisation of T- cells and
promote their cytotoxic effects on the tumour cells.
The background of this dissertation are the results of research about the frequency of
serological reaction against glioma associated antigen GLEA2 in patients with glioma
(Fischer et al., 2001; Pallasch et al., 2004), as well as the correlation between the antibody
presence in serum and the patients survival (Pallasch et al., 2004). This clinical relevance of
the anti- GLEA2- antibodies was a basis for further search for protective mechanisms of these
antibodies and their possible role in the cellular immunity against GLEA2- antigen.
The aim of this dissertation was to reveal the possible specifity of the cellular immune
response against GLEA2 antigen and to characterize the PBLs (peripheral blood lymphocytes)
involved in this immunological reaction.
The GLEA2 protein, used in the experiments, has been synthesized by Baculovirus
Expression Systhem. The recombinant GLEA2 protein was used to develope an ELISA to
determine the presence of anti-GLEA2 antibodies it the patients serum as well as a stimulus
for the isolated patients PBLs. The results of this stimulation were examined in the
proliferation assay as well as in functional assays like FastImmune short time stimulation
assay, cytokine-ELISA and migration assay. The specifically activated PBLs were analysed
by flow cytometry.
The GLEA2- ELISA confirmed the previous data about the humoral immune response against
the GLEA2 protein. The frequency of the seroreaction was higher in patients with high grade
astrocytic tumours than in patients with lower tumour grades. The recurrances were associated
with loss of the humoral immunity against the GLEA2 protein.
The proliferative response of PBLs on stimulation with GLEA2- protein was independent of
histopathological diagnosis or tumour stage. The rate of PBLs proliferation did not correlate
with the evidence of antibodies in the sera. The proliferated PBLs revealed mostly NK- and
NKT-cell characteristics.
3
The activation of the stimulated PBLs was proved in FastImmun assay. This method is being
used for measurement of the IFNγ release through the PBLs after short time stimulation. The
stimulated cells showed a high expression level of CD69 but no production of IFNγ.
However, repeated stimulations led to relevant production of IL-4, which has been proved in
the cytokine ELISA.
The migration assay has been performed to determine the specifity of the stimulation with
GLEA2 protein. The specific migration towards GLEA2 protein and towards glioma cell
culture supernatants has been shown in this experiment. The migrated PBLs had features of
activated NK cells, as shown by flow cytometry.
The data revealed in this dissertation indicate the stimulative properities of the GLEA2
antigen onto the PBLs. The mostly interacted cell populations are NK and NKT cells. This
observation suggests the search for potential cytotoxic properities of GLEA2 stimulated NK
cells against glioma. The supposed cytotoxicity after in vitro stimulation with GLEA2 could
be used to increase the efficiency of NK cells among the lymphocytes, which infiltrate glial
tumours.
4
Einleitung
EINLEITUNG
1. Gliome
1.1. WHO-Klassifikation und histopathologische Einteilung der Gliome
Tumoren neuroepithelialen Ursprungs bilden die größte Gruppe hirneigener Neoplasien. Laut
der dritten Auflage der histologischen Klassifikation der Tumoren des zentralen
Nervensystems (ZNS) der Weltgesundheitsorganisation (WHO) werden sie in die folgenden
Gruppen unterteilt (Kleihues et al., 2000):
1) Gliom des WHO-Grads I
-
pilozytisches Astrozytom
- pilomyxoides Astrozytom
2) Gliome des WHO-Grades II
-
diffuse Astrozytome
(fibrilläre, gemistozytische, protoplasmatische)
-
Oligodendrogliome
-
Oligoastrozytome
3) Gliome des WHO-Grades III
-
anaplastische Astrozytome
-
anaplastische Oligodendrogliome
-
anaplastische Oligoastrozytome
4) Gliome des WHO-Grades IV
-
Glioblastoma multiforme
- giant cell
- gliosarcoma
Die Klassifikation ordnet die Tumoren den Zelltypen zu, aus denen sie hervorgegangen sind
(Astrozyten oder Oligodendrozyten). Die sogenannten Mischgliome (Oligoastrozytome)
weisen sowohl einen astrozytär als auch einen oligodendroglial differenzierten Anteil auf. Die
histopathologischen Merkmale, die auf den Entartungsgrad hindeuten, sind nukleäre Atypie
(z.B. nukleäres Polymorphism, mehrere Nuklei), mitotische Aktivität, atypische Mitosen,
5
Einleitung
erhöhte Zelldichte, vaskuläre Proliferation und Nekrosen. Hierbei entspricht die Anzahl der
Kriterien dem Malignitätsgrad.
Die gemeinsamen charakteristischen Merkmale der gesamten Gliomgruppe umfassen
infiltratives Wachstum in allen ZNS-Arealen, vor allem in den Hemisphären, klinische
Manifestation überwiegend im Erwachsenenalter, vielfältige histopathologische sowie
biologische Merkmale und die Tendenz zur malignen Progression.
Das pilozytische Astrozytom (WHO-Grad I) stellt eine eigene Entität dar. Es tritt
überwiegend im Kindesalter auf, und zwar sowohl supra-, als auch infratentoriell und entartet
selten
zu
höheren
Malignitätsgraden.
Auch
aufgrund
histopathologischer,
molekulargenetischer und anderer klinischer Merkmale grenzt sich das pilozytische
Astrozytom von anderen Gliomen ab. Die übrigen Gliome können aufgrund der pathologischanatomischen,
als
auch
genetischen
Befunde
in
gemeinsame
kontinuierliche
Tumorprogressionreihen eingeordnet werden.
Diffuse Astrozytome machen ca. 10-15 % von allen astrozytären Tumoren aus und zeigen
eine Inzidenz von 1,4/1.000.000 / Jahr. Das mittlere Alter beim Auftreten von diffusen
Astrozytomen beträgt 34 Jahre. Männer sind mit einem Verhältnis von 1,18:1 häufiger
betroffen als Frauen. Die typischen histologischen Merkmale dieser Gliomgruppe sind hohe
Zelldichte und nukleäre Atypie.
Die anaplastischen Astrozytome zeichnen sich durch fokale oder diffuse Anaplasie und
gesteigerte proliferative Potenz aus. Diese wird durch eine sehr hohe mitotische Aktivität und
durch eine hohe immunhistochemische Markierungsrate mit Ki-67/MIB-1 Antikörpern
angezeigt. Sowohl vom klinischen, als auch vom morphologischen und genetischen
Gesichtspunkt, bilden anaplastische Astrozytome eine Vorstufe zum Glioblastom. Das
mittlere Alter der erkrankten Personen beträgt 41 Jahre, die Geschlechterverteilung entspricht
der des Astrozytoms WHO Grad II.
Das Glioblastoma multiforme (GBM) tritt mit Inzidenz 2-3/100.000 / Jahr und ist das
maligneste und häufigste astrozytäre Gliom (> 50% im Erwachsenenalter) und gleichzeitig
der häufigste aller zerebralen Tumoren dieser Altergruppe (12-15%). Das mittlere Alter der
Patienten mit GBM beträgt 53 Jahre und das Verhältnis von Männern zu Frauen beträgt
1,5:1.
6
Einleitung
Die typische Lokalisation ist subkortikal fronto-temporal, die Tumore können jedoch an allen
Stellen des ZNS auftreten. Das infiltrative Wachstum führt oft zu einer Tumorausbreitung im
Kortex, den Basalganglien und der kontralateralen Hemisphäre, was zum typischen Bild des
„Schmetterlingsgliomas“
führt.
Die
exzessive
Endothelproliferation
und
zahlreiche
Einblutungen und Nekrosen, stellen essentiellen diagnostische Merkmale dar, die bereits
makroskopisch in Form einer inhomogenen Tumormasse sichtbar sind und
ein extrem
vielfältiges histologisches Bild verursachen.
Die Glioblastome (GBM) unterteilen sich in mindestens zwei genetische Subtypen nämlich
die primären (de-novo) und die sekundären Glioblastome. Das de-novo-GBM entsteht bei
älteren Patienten, bei denen ein Astrozytom niedrigeren Grades zuvor nicht vorhanden war.
Im Gegensatz dazu, entsteht das sekundäre GBM meistens bei jüngeren Patienten durch
Progression aus Astrozytomen des WHO-Grad II oder III. Analoge Entwicklungen von
Oligoastrozytomen und Oligodendrogliomen zum GBM Grad IV sind beschrieben.
Es gibt zunehmend Beweise dafür, dass die primären und sekundären GBM zwei separate
Entitäten darstellen. Dies spiegelt sich auch im unterschiedlichen Ansprechen auf Therapien
wider (Louis, D.N., 1997).
1.2. Klinische Symptome und Prognose bei Patienten mit Gliomen
Klinische Verdachtssymptome für eine intrakranielle Raumforderung treten relativ spät auf
und meistens erst dann, wenn wegen der Tumorgröße eine totale Resektion nicht mehr
durchführbar ist.
Zu diesen klinischen Zeichen gehören vor allem neu auftretende fokale oder generalisierte
zerebralorganische Krampfanfälle sowie neurologische Herdsymptome. Oftmals sind
unspezifische Kopfschmerzen oder unterschätze Persönlichkeitsveränderungen das einzige
frühe Zeichen dieser bösartigen Erkrankung.
Aufgrund der kurzen symptomatischen Vorgeschichte, die eine frühe Diagnostik und
effektive
Therapieeinleitung
erschwert,
sowie
der
malignen
Merkmalen
des
Tumorwachstums, bleibt die Prognose der an Gliomen erkrankten Patienten infaust. Patienten
mit malignen Gliomen haben ohne jegliche therapeutische Intervention eine mittlere
Überlebenszeit von 3-4 Monaten mit einer raschen Verschlechterung des allgemeinen und
zerebralen Zustands. Sogar bei unmittelbarer Therapie nach Diagnosestellung liegt die
7
Einleitung
mittlere Überlebenszeit bei 3,7-8 Jahren bei Patienten mit diffusen Astrozytomen und nur bei
ca. 12 Monaten bei Patienten mit GBM (Kleihues et al., 2000).
Zu den wenigen prognostischen Faktoren eines günstigeren Krankheitsverlaufes gehören ein
junges Alter bei Diagnosestellung, ein guter Karnofsky-Index, low-grade Histologie, Fehlen
von neurologischen Defiziten, sowie eine längere symptomatische Vorgeschichte, die eine
frühere Tumordiagnostik und damit die rechtzeitige Therapie erleichtert. Eine bessere
Prognose besteht oft auch für das sekundäre GBM. Dies ist zum einen durch die längere
Vorgeschichte,
zum
anderen
auch
durch
das
niedrigere
Patientenalter
bedingt.
Histopathologische Malignitätskriterien, die mit der Überlebenszeit korrelieren sind
Zellkernatypie, mitotische Aktivität, vaskuläre Proliferation und Nekrosen (Review:
Gudinaviciene et al., 2004). Bis heute sind jedoch keine sicheren genetischen,
molekularbiologischen oder immunologischen Prognosefaktoren beschrieben worden.
2. Therapeutische Optionen bei Gliomen.
Die operative Tumorentfernung bleibt die therapeutische Hauptoption, die in der Regel jedoch
nicht
kurativ,
sondern
symptommildernd
und
progressionsverzögernd
wirkt.
Die
Tumorresektion dient vor allem der Reduktion der Tumormasse, der Entlastung des
Hirndrucks sowie der Wiederherstellung neurologischer Funktionen. Die Tatsache, dass die
Tumorzellinfiltration im allgemeinen deutlich über den makroskopisch erkennbaren Tumor
hinausreicht, bedeutet eine wesentliche Einschränkung der Möglichkeiten den Tumor radikal
zu entfernen. Trotz der geringen Strahlenempfindlichkeit der Gliome, gehört die postoperative
Radiotherapie mit der Gesamtdosis von 60 Gy in 6 Wochen zu den Standardmaßnahmen aller
WHO- und histologischen Gliomgruppen. Aufgrund der niedrigen Chemosensitivität besitzt
die Chemotherapie einen geringeren Stellenwert in der Therapie maligner Gliome. Eine
Ausnahme hiervon stellen die Oligoastrozytome und Oligodendrogliome dar, die im
Vergleich zu rein astrozytären Tumoren gleichen Malignitätsgrads deutlich stärker auf
Chemotherapie ansprechen. Als Basischemotherapeutika werden die Nitrosoharnstoffe
(ACNU, BCNU, CCNU) in Kombination mit anderen Substanzen verwendet. Das geläufigste
Therapieschema beruht auf der Gabe von Procarbazin, CCNU und Vincristin (PCV-Schema).
Beim Auftreten eines Rezidivs wird die Temozolomid (Temodal) Therapie eingesetzt, die
derzeit auch als Primärtherapie des Glioblastoms getestet wird.
8
Einleitung
Außer dem etablierten Standardverfahren konzentrieren sich die Bemühungen auf die
Etablierung von neuen Therapieformen, welche die biologische Vielfältigkeit der
Tumorgruppe berücksichtigen und an spezifischen Ansatzpunkten der zellulären Onkogenese
angreifen. Dazu gehören neue Chemotherapeutika, wie Topotecan oder Mafosfamid, die
Verwendung der Farnesyltransferaseinhibitoren, welche gezielt Ras-regulierte Prozesse
hemmen sollen, die lokale Gabe von BCNU, hochdosierte Chemotherapie mit nachfolgender
Stammzelltransplantation,
und
eine
modifizierte
Bestrahlung
einschließlich
Hyperfraktionierung oder Neutronenbestrahlung. Weitere Ansätze umfassen Gentherapie,
Differenzierungsunterstützung, Antiangiogenese sowie die Anwendung von Retroviren. Alle
diese Modalitäten sind jedoch erst in der Studienphase und werden als lediglich
experimentelle Therapieoptionen betrachtet.
Zu diesen experimentellen Therapieformen gehören auch Versuche, die immunologischen
Prozesse, die als Reaktion auf die Tumorentstehung stattfinden, im Rahmen einer
Immuntherapie zu nutzen (Khan-Farooqi et al., 2005; Sikorski et al., 2005, Yamanaka 2006).
3. Immunologie der Gliome
3.1. Besonderheiten des Immunsystems im zentralen Nervensystem (ZNS)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) wurde lange Zeit als immunpriviligiertes Organ gesehen.
Diese These basierte zum einen darauf, dass die Blut-Hirn-Schranke nur selektiv die Passage
von Zellen und Makromolekülen zum Gehirnparenchym erlaubt, zum anderen auf dem Fehlen
eines drainierenden lymphatischen Systems und immunkompetenten antigenpräsentierenden
Zellen (Nathanson et al., 1989).
Die tiefen zervikalen Lymphknoten ermöglichen jedoch den freien Transfer der
immunkompetenten Zellen in das ZNS und Mikroglia und perivaskuläre Zellen üben die
Funktion von Antigen präsentierenden Zellen aus. (Hart et al., 1995; Angelov et al., 1989,
Aloisi, 2001). Außerdem stellt die bei Tumorerkrankungen geschädigte Blut-Hirn-Schranke
keine Barriere mehr dar (Sehgal et al., 2000), so dass die komplexen immunologischen
Prozesse in Gang gesetzt werden können (Streit, W.J. et al., 1995).
9
Einleitung
3.2. Tumor-escape Mechanismen bei Gliomen
Schon in den 70er und 80er Jahren wurden die ersten Beweise erbracht, dass die zelluläre
Immunität bei Patienten mit Gliomen stark eingeschränkt ist (Brooks et al., 1972; Young et al,
1976; Roszman et al., 1991). Die von Gliom-Patienten stammende PBLs proliferieren in vitro
unter dem Einfluss bestimmter Mitogene, wie beispielsweise Concavalin A (ConA),
Phytohemagglutinin (PHA), pokeweed mitogen (PWM) sehr schwach (Elliot et al., 1987;
Morford et al., 1999). Darüber hinaus zeigen diese PBLs verminderte Antikörpersekretion
(Roszman et al., 1991). Obwohl die Prozentzahl der B-Zellen unverändert bleibt,
beeinträchtigt die herabgesetzte T-Helfer-Funktion die humorale Immunantwort (Roszman et
al., 1991).
Die Mengenverhältnisse der einzelnen PBL-Subpopulationen sind im ZNS verändert. Infolge
einer verminderten Anzahl von CD4+ T-Zellen unter den Tumorinfiltrerenden Lymphozyten
ist
eine
effektive
Immunantwort
aufgrund
des
dadurch
bedingten
Mangels
an
kostimulatorischen Signalen beeinträchtigt. (Elliot et al., 1987). Die Sezernierung von
Zytokinen (PGE2, IL-10, TGFβ) in Gliomzellen fördert eine Differenzierung von CD4+ TZellen zu Th2. Dies fördert zwar einerseits die humorale Immunantwort, schränkt aber
andererseits die unter normalen Bedingungen effektivere zelluläre Abwehr ein (Huettner et
al., 1997). Über die Veränderungen in der Anzahl bzw. Funktion der CD3-/CD16+56+ NKZellen bei Gliom-Patienten liegen widersprüchliche Ergebnisse vor. Einige Arbeitsgruppen
identifizierten eine reduzierte Anzahl von NK-Zellen mit verminderter zytotoxischer
Funktion, andere Arbeitsgruppen dagegen eine erhöhte Menge von CD3+/CD16+56+ NKTZellen. (Lisianyi et al., 1988; Dix et al., 1999).
Außer den suppressorischen Eigenschaften der von Gliomen freigesetzten Moleküle, gibt es
Hinweise für die Induktion von T-Zell Apoptose (Morford et al., 1999; Whiteside et al., 2002,
Wischhusen et al., 2002). Die beobachtete gleichzeitige Expression von Fas und FasL auf den
Gliomzellen schützt die Tumoren vor einer Fas-induziierten Apoptose (Husain et al., 1998).
3.3. Tumor assoziierte Antigne (TAAs) bei Gliomen
Man unterscheidet zwischen den sogenannten allgemeinen und den spezifischen TAAs. Die
Gruppe der allgemeinen Antigene umfasst solche Antigene, die in Tumoren unterschiedlichen
10
Einleitung
Typs bei unterschiedlichen Patienten gefunden werden. Die Gruppe der spezifischen TAAs
umfasst solche Antigene, die sowohl für den jeweiligen Tumortyp, als auch für den Patienten
spezifisch sind. Die TAAs können auch nach ihrer Tumor- oder Gewebespezifität unterteilt
werden. Eine Zusammenfassung dieser Unterteilung ist im Anhang (Tabelle 1) gegeben.
Es wurde nachgewiesen, dass Gliome die sogenannten Cancer Testis Antigene im
vergleichbaren Ausmaß wie Melanome exprimieren (Sahin et al., 2000) und manche von den
für Melanome beschriebenen Antigenen kommen auch bei Gliomen vor, z.B. MAGE-E1
(Sasaki et al., 2001). Der Nachweis entsprechender Antigene erfolgte unter anderem durch
vergleichende Proteinexpressionsanalysen des Tumorgewebes und des normalen Gewebes
(Debinski et al., 2000) und durch serologische Analysen unter Einsatz rekombinant
exprimierter Tumor-cDNAs (Sahin et al. 2000, Schmits et al., 2002).
Die bis heute für Gliome beschriebenen TAAs sind in Tabelle 2 des Anhangs
zusammengefasst. Obwohl die Anzahl der Gliom-assoziierten Antigene relativ groß ist,
wurden bis jetzt nur wenige immunogene Epitope entdeckt, die die in vitro Sensibilisierung
der T-Zellen erlauben und ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen fördern würden. Solche in
vitro Versuche wurden für die IL-13 Rezeptor α2 Kette (Okano et al., 2002) und für TRP-2
durchgeführt (Liu et al., 2003) durchgeführt. Allerdings ist nicht bekannt, ob solche Prozesse
auch in vivo effektiv ablaufen können. Die ersten in vivo Experimente wurden an
Tiermodellen oder als Phase I klinische Studien durchgeführt. Die Immunisierung war aber
jeweils unspezifisch und beruhte entweder auf einer Immunisierung mit bestrahlten
Tumorzellen (Holladay et al., 1993) oder auf dendritischen Zellen, die mit gesamten aus der
Tumorzelloberfläche eluierten Peptiden (Yu et al., 2001, Yamanaka 2006) und gesamten
Tumor mRNAs (Kobayashi et al., 2003) beladen worden waren.
Anhand der SEREX-Methode ist es möglich die Antigene zu charakterisieren, die in vivo die
humorale Immunantwort hervorrufen. Nach der Identifizierung stellt die genaue
Charakterisierung dieser Antigene eine zentrale Aufgabe dar, um die Bedeutung der gegen die
Antigene gerichteten humoralen Immunantwort besser zu verstehen.
3.4. GLEA2 Antigen
Die Anwendung der SEREX-Methode führte unter anderem zur Isolierung des Gliomaexpressed Antigene 2 (GLEA2) aus einer Glioblastom cDNA-Expressionbank (Fischer et al.,
2001).
11
Einleitung
Das Gen für GLEA2 wurde auf dem Chromosom 20 lokalisiert (Fischer et al., 2001). Die
Sequenzanalyse zeigt eine hohe Homologie zum HCA58 Antigen (hepatocellular carcinoma
associated antigen 58) (Fischer et al., 2001). Mit Hilfe der Immunofluoreszenz und
Immunohistochemie wurde GLEA2 Protein im Zellkern nachgewiesen. Dieser Nachweis steht
in Einklang mit einer möglichen Rolle als Transkriptionsfaktor (Pallasch, 2004). Die GLEA2
Expressionsanalyse zeigte eine GLEA2 mRNA Expression (7.0 kb) sowohl im Tumor-, als
auch im gesunden Gewebe (Fischer et al., 2001). Diese Expressionsanalysen wurden durch
eine Western-Blot Analyse mit polyklonalem anti-GLEA2 Antikörper bestätigt. Es wurden
die GLEA2-Antkörper überwiegend in Seren von Gliompatienten gefunden. Während über
43% der Seren von Gliompatienten für GLEA2 positiv waren, fand sich eine entsprechende
Autokörperantwort nur in 14 % der Seren von gesunden Probanden (Fischer et al. 2001).
Darüber hinaus, konnte eine Korrelation zwischen Antikörperpräsenz und Überlebenszeit der
Patienten nachgewiesen werden. Die Überlebenszeit betrug bei GLEA2 positiven Patienten
17,4 Monate gegenüber 7,2 Monaten bei GLEA 2 negativen Patienten (Pallasch, 2004).
4. Zielsetzung
Die Grundlagen für die vorliegende Arbeit stellen die Ergebnisse über das Gliom-assoziierte
Antigen GLEA2 und die häufige Serumaktivität dieses Antigens bei Gliompatienten dar
(Fischer et al., 2001; Pallasch et al., 2004). Die von Pallasch et al. nachgewiesene
Korrelation von Seroreaktivität und verlängerter Überlebenszeit wirft die Frage nach
möglichen protektiven Mechanismen und der Rolle der zellulären Immunantwort gegen
GLEA 2 auf. Ziel der Arbeit war es deshalb weitergehende Untersuchungen zur
Immunogenität von GLEA 2 durchzuführen und hierbei insbesondere die Spezifität einer
möglichen zellulären Immunantwort zu überprüfen, die beteiligten PBL-Subpopulationen
näher zu charakterisieren und ein ELISA- gestütztes System zum Nachweis von GLEA 2
Antikörpern im Patientenserum zu etablieren.
12
Material und Methoden
MATERIAL UND METHODEN
1. Patienten
Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente wurden PBMCs (peripheral
blood mononuclear cells) und Seren von Patienten mit Gliomen verwendet, die in den Jahren
2002-2004 in der Neurochirurgischen Klinik der Universitätskliniken des Saarlandes in
Homburg operiert wurden. Die Blutentnahme erfolgte mit dem Einverständnis der Patienten,
die über das Ziel der Studie aufgeklärt wurden.
2. Heterologes Immunoscreening (SEREX)
SEREX (Serological Identification of Recombinantly Expressed Antigens), beschrieben von
Sahin et al. 1995, wurde zur Identifizierung tumorassoziierter Antigene angewandt. Das
Prinzip der Methode beruht auf der Expression rekombinanter Proteine in E. coli- Bakterien,
die mit einer Phagen-cDNA-Bank transfiziert worden sind. Die exprimierten Proteine werden
in Form von lytischen Plaques auf einer Agarplatte hochangereichert und auf
Nitrozellulosefilter geblottet, mit Patientenserum inkubiert und die spezifisch gebundene IgGAntikörper mittels eines sekundären Antikörpers und einer Farbreaktion detektiert. Die
Plaques, die dem positiven Signal entsprechen, werden anschließend zur Identifizierung des
detektierten Antigens isoliert und sequenziert.
Der verwendete immunogene Klon GLEA2/58 25-2 wurde an unserem Institut von Frau Dr.
Fischer in einem SEREX-Screening mit autologem Patientenserum (Archivnummer H58)
identifiziert und isoliert.
2.1. Phagentiterbestimmung
SM-Puffer (1l)
5,8g NaCl
2g MgSO4 x 7H2O
50 ml 1M Tris-HCl (pH 7,5)
5 ml 2% (w/v) Gelatine
13
Material und Methoden
NZCYM-Medium (1l)
5g NaCl
2g MgSO4 x 7H2O
5g Hefe-Extrakt
10g NZ-Amine (Sigma)
NZCYM-Agar
1 l Medium + 15g Agar
Top-Agar
100 ml Medium + 0,75g Agar
10 mM MgSO4
Zur Gewährleistung gleicher Plaquedichten für die Auswertung wurde der Phagentiter der
identifizierten Klone und der Bank bestimmt. 1 μl Phagensuspension in der Verdünnung
1:100, 1:1000 und 1:10.000 wurde mit 200 μl E. coli XL1-Blue MRF’ Zellen (verdünnt
mit 10mM MgSO4 bei einer optischen Dichte OD600= 0,5) 15 min bei 37°C inkubiert,
anschließend in Top-Agar aufgenommen und auf Tetrazyklin-NZCYM-Agarplatten
ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C. Anhand der Anzahl der
erhaltenen Plaques wurde der Phagentiter der Stammlösung in pfu (plaque forming units)
errechnet.
2.2. Serumpräabsorption
LB-Medium (1,5 l)
5g Trypton
2,5g Hefe-Extrakt
5g NaCl
SM-Puffer (1l)
pH 7,5
5,8g NaCl
2g MgSO4 x 7H2O
50 ml 1M Tris-HCl (pH 7,5)
5 ml 2% (w/v) Gelatine
14
Material und Methoden
TBS-Puffer
0,2 M Tris-HCl
1,5 M NaCl
pH 7,5
10 mM MgSO4
Säulen
Polypropylene Columns, Quiagen, Deutschland
Um unspezifische Kreuzreaktionen antiviraler oder antibakterieller Antikörper, welche in
Patientenseren enthalten sind, zu vermeiden, wurden diese durch Präadsorption über
sogenannte lytische und mechanische Säulen aufgereinigt.
2.2.1. Herstellung einer lytischen Säule
Eine dicht bewachsene 25 ml LB-Kultur von E. coli XL1-Blue MRF’-Zellen wurde
zentrifugiert und das Pellet in 2 ml 10 mM MgSO4 resuspendiert. Zu der Bakteriensuspension
wurden 500 μl nichtrekombinante Phagen gegeben und von diesem Ansatz 200 μl in 4,8 ml
LB-Medium überführt. Diese Bakterien-Phagen Suspension wurde 2 Stunden bei 37°C im
Schüttler (225 rpm) inkubiert. Anschließend wurde der restliche Ansatz sowie 5 ml LBMedium zugegeben und die Inkubation über die weitere 2 Stunden fortgesetzt.
Nach dem Ablauf der Inkubationszeit wurde der Ansatz 5 mal 5 Sekunden mit Ultraschall
behandelt und danach die sich in der Suspension befindenden Phagenproteine sowie Proteine
aus lysierten Bakterienzellen an eine Säulenmatrix durch die Zugabe von 3,6g Affinity
Absorbent, Glutardialdehyd activated (Boehringer Mannheim/Roche) gebunden. Die
Inkubation der Säule erfolgte ü.N. bei 4°C auf dem Überkopfrotator.
Aus diesem Ansatz wurden 8 lytischen Säulen beladen. Vor der Aufreinigung wurde jede
Säule dreimal mit einem Säulenvolumen TBS- Puffer gewaschen, um die nicht gebundenen
Proteine zu entfernen.
2.2.2. Herstellung einer mechanischen Säule
Das E. coli XL1-Blue MRF’- Zellpellet einer 25 ml LB-Übernacht-Kultur wurde in 5 ml TBSPuffer aufgenommen und 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach der Zugabe von zusätzlichen 5
15
Material und Methoden
ml TBS- Puffer wurde der Ansatz ähnlich, wie schon für die lytischen Säulen beschrieben,
mit Ultraschall behandelt und zur Herstellung von 8 mechanischen Säulen verwendet (s.o.).
2.2.3. Serumaufreinigung
TBS+ Puffer
1l TBS- Puffer
5g Magermilchpulver
0,1g Thimerosal
1ml Breitbandantibiotikum
Die aufzureinigenden Seren wurden im Verhältnis 1:10 in TBS+ Puffer verdünnt und 5 mal
über die lytische und 5 mal über die mechanische Säule gegeben, wodurch antivirale und
antibakterielle Antikörper an die Säulenmatrix gekoppelt wurden. Anschließend wurde der
Durchfluß erneut im Verhältnis 1:10 mit TBS+ verdünnt, um die im Immunoscreening
verwendete Verdünnung von 1:100 zu erhalten.
2.3. Immunoscreening
Tetrazyklin-NZCYM-Agarplatten
Top Agar
10 mM MgSO4
1 M IPTG
TBS- Puffer
siehe: 1.2
TBST- Puffer
TBS- Puffer + 0,5% (v/v) Tween 20
Blocking-Lösung
5% Magermilchpulver in 1xTBS-Puffer
CDS-Puffer
100 mM Tris-HCl
100 mM NaCl
5 mM MgCl2
16
Material und Methoden
Detektionslösung
1xCDS
0,005% BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indyl phosphate ptoluidine salt; AppliChem GmbH, Deutschland)
0,01% NBT (Nitrotetrazolium-Blauchlorid; AppliChem
GmbH, Deutschland)
sekundärer Antikörper
Goat Anti Human IgG, Fc-Fragment, alkalische
Phosphatase konjugiert; Dianova, Deutschland
Zum Screening wurden 600 μl E. coli XL1-Blue MRF’ Bakteriensuspension (OD600= 0,5) in
10 mM MgSO4 mit der durch den Titerbestimmung vorgesetzten Menge (s.o.) der GLEA2Phagensuspension, sowie mit der Bank, durch 20-minutige Inkubation bei 37° transfiziert.
Anschließend wurde zur Bakteriensuspension der vorgewärmte Top-Agar (42-45°C)
zugegeben und jeder Ansatz wurde auf die Tetrazyklin-NZCYM-Agarplatte gegossen.
Nachdem der Topagar fest geworden war, wurden die Platten 4 Stunden bei 42°C inkubiert.
Bei dieser Temperatur ist der λ-Repressor der Bakterien inaktiv und die Phagen können sofort
in die lytische Phase eintreten.
Nach dieser Inkubationszeit wurden auf die Platten die mit 10 mM IPTG getränkten und
getrockneten Nitrozellulosemembranen aufgelegt und die Platten wurden anschließend
weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. IPTG bewirkt die Induktion des Lac-Promotors im λZAP-Express-Vektor, was zur Expression des Fusionsproteins aus dem 32 AS langen
terminalen Abschnitt der β-Galaktosidase und des einklonierten cDNA-Produkts führt. In
dieser Inkubationsphase wurden die Fusionsproteine synthetisiert und zugleich auf die
Membran geblottet.
Die weitere Inkubation erfolgte ü.N. bei 4°C, was das Aushärten des Topagars bewirkte und
dadurch die Proteine auf der Membran immobilisierte.
Am folgenden Tag wurde die Membran vorsichtig von der Agarplatte abgezogen, die
Topagarreste wurden durch vorsichtiges Abreiben entfernt und die Membran 3 mal in 1x
TBST-Puffer (jeweils 15 min) gewaschen.
Nach den Waschschritten wurden die Membranen 1 Stunde in der Blockinglösung auf dem
Schüttler inkubiert, was dazu diente, die unspezifischen Bindungsstellen abzusättigen. Im
Anschluß daran folgten 3 Waschschritte in TBS-Puffer (jeweils 15 min). Die Membranen
17
Material und Methoden
wurden danach mit den präabsorbierten Seren ca. 3,5 Stunden bei RT auf einem Schüttler
inkubiert. In dieser Zeit konnten die gegen GLEA2 gerichteten, spezifischen Antikörper an
dieses Protein auf der Membran binden. Nichtgebundene Antikörper wurden in den folgenden
3 Waschschritten (jeweils 15 min, 1xTBS-Puffer) ausgewaschen. Zur Detektion der
gebundenen Antikörper wurde ein mit alkalischer Phosphatase-gekoppelter, sekundärer
Antikörper in einer 1:5000 Verdünnung in 1xTBS/0,5% Milchpulver eingesetzt und die
Membranen 1 Stunde mit dieser Lösung bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Nach 3 10minütigen
Waschschritten
(1xTBS-Puffer)
erfolgte
die
Farbreaktion
mittels
der
Detektionslösung (1xCDS, 0,005% BCIP, 0,01% NBT), mit der die Membranen im Dunkeln
ca. 15-30 min überschichtet wurden. Die Reaktion wurde durch das Abspülen mit dem
Wasser abgebrochen und die Membranen getrocknet.
Die Auswertung erfolgte durch Vergleich der Farbintensität der Phagenplaques des
Gliomantigens GLEA2 gegenüber der cDNA-Expressionsbank. Im Falle einer dunkleren,
intensiveren Färbung wurde das entsprechende Serum als GLEA2-Antikörper positiv
bewertet.
3. ELISA (nach Qiagen-Expressionist, Quiaexpress detection and assay Protokol)
Mit
Hilfe
des
enzymgekoppelten
Immunadsorptionstests
ELISA
(enzyme-linked
immunosorbent assay) lässt sich das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern in Seren
nachweisen.
Das Prinzip des Tests beruht auf der spezifischen Bindung der spezifischen Antikörper an die
entsprechenden Antigene, mit denen vorher die Böden einer 96-Well Platte beschichtet
worden sind, sowie auf ihrer Detektion durch eine Farbreaktion mittels des enzymgekoppelten
sekundären Antikörpers.
Das Verfahren wurde nach dem Qiagen-Expressionist, Quiaexpress detection and assay
Protokol durchgeführt.
18
Material und Methoden
3.1. Herstellung des Proteins aus Baculovirus Expression System
Insektenzellen Spodoptera frugiperda SF 158
Invitrogen Corporation, USA
Kulturmedium
TC 100
10% FCS
1% P/S
Zur Herstellung des rekombinanten Proteins GLEA2 wurden Insektenzellen Spodoptera
frugiperda SF 158 in 75ml Zellkulturflaschen in 20 ml TC 100 Zellkulturmedium (10% FCS,
1% P/S) im Brutschrank bei 27°C kultiviert. Das Medium wurde alle 3-4 Tage gewechselt.
Nach dem Erreichen der Konfluenz wurde das Medium mit der Vakuumpumpe abgesaugt,
neues Medium in entsprechender Menge zugegeben. Die Zellen wurden mit Hilfe eines
Zellschabers vom Boden der Kulturflasche gelöst, vorsichtig mit einer Pipette resuspendiert
und in neue Zellkulturflaschen mit entsprechendem Medium ausgesät.
3.1.1. Herstellung des Large Scale Titer Virus Stocks
Die SF 158 Zellen aus der konfluenten Zellkultur (75 ml Zellkulturflasche) wurden im
Verhältnis 1:2 passagiert, indem sie in 6 25ml-Zellkulturflaschen aufgeteilt wurden (siehe:
Material und Methoden, Kap.3.1.). Die passagierten Zellen wurden zum Anheften ca. 1
Stunde im Brutschrank bei 27°C kultiviert. Anschließend wurde das Medium vollständig
abgenommen und durch 5 ml neuen Mediums ersetzt. Dazu wurde 100 μl des zuvor im Labor
generierten GLEA 2- Virusstocks pro Zellkulturflasche zugegeben. Die Zellen wurden
weitere 4-5 Tage im Brutschrank bei 27°C (5% CO2) kultiviert. Nach dieser Zeit wurden ca.
90% der SF 158 Insektenzellen lysiert. Das Medium aus je 2 25 ml-Zellkulturflaschen wurde
in ein 50 ml Falkon überführt. Die Ansätze wurden 15 min bei 3000 rpm zentrifugiert, die
Überstände in neue Falkons überführt und bis zur weiteren Bearbeitung bei 4°C aufbewahrt.
19
Material und Methoden
3.1.2. GLEA 2 Proteinexpression
Die SF 158 Insektenzellen wurden aus jeder 75 ml Zellkulturflasche im Verhältnis 1:2
passagiert (siehe: Material und Methoden, Kap.3.1.). Nach 1-stündiger Inkubationszeit im
Brutschrank bei 27°C (5% CO2), in der sich die Zellen an den Boden der Kulturflasche
angeheftet haben, wurde das Medium vollständig abgenommen und pro Flasche 3 ml
Virusstock hinzugefügt. Daraufhin folgte eine weitere Inkubation für 1 Stunde bei 27°C (5%
CO2). Anschließend wurde pro Zellkulturflasche 17 ml frisches Medium zugegeben und die
Zellen wurden 46 Stunden im Brutschrank bei 27°C (5% CO2) weiter kultiviert. In dieser Zeit
wurde das GLEA 2 Protein in Insektzellen exprimiert.
Nach 46 Stunden wurden die Insektzellen mit einem Zellkulturschaber vom Boden gelöst, in
Falkons überführt und bei 3000 rpm 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Pellet zur Proteinaufreinigung verwendet.
3.1.3. GLEA 2 Proteinaufreinigung über Ni-NTA-Agarose-Säulen
Lysis-Puffer
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
5 mM Imidazol
pH 8,0
1% NP40 Protease-Inhibitor EDTA free
Wasch-Puffer I
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM Imidazol
Wasch-Puffer II
pH 8,0
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
20 mM Imidazol
Elutionspuffer
pH 8,0
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
200 mM Imidazol
20
pH 8,0
Material und Methoden
Ni-NTA-Agarose
PBS Puffer (1L)
8g NaCl
0,2g KCl
1,44g Na2HPO4
0,24g KH2PO4
pH 7,4
Ethanol
Das aus einer 75 ml Zellkulturflasche gewonnene Zellpellet wurde in 2 ml Lysis-Puffer
resuspendiert, in 2 ml-Eppendorf-Gefäße überführt und 20 min auf Eis lysiert. Danach folgte
eine 30-minütige Zentrifugation in der Ultrazentrifuge bei 40.000 rpm bei 4°C.
Während dessen wurde Ni-NTA-Agarose durch starkes Mischen aufgequirlt, 200 μl in
Eppendorf Röhrchen überführt und 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde die
so vorbereitete Agarose zu dem Proteinüberstand, der nach der Ultrazentrifugation gewonnen
worden ist, zugegeben und zum Säulenaufbau verwendet. Die Agarose-Protein-Mischung
wurde 2 Stunden auf einem Überkopfrotator bei 4°C inkubiert und danach 5 min bei 3000
rpm zentrifugiert. 20μl des Überstands wurden für die Western-Blot Analyse abgenommen,
der Rest wurde in die Bio-Rad Micro-Bio-Spin Chromatography Columns überführt. Die
Säulen wurden 30 sek bei 5000 rpm zentrifugiert und danach wie folgt gewaschen: 2 mal mit
Wasch Puffer I (jeweils 800 μl), 2 mal mit Wasch Puffer II (jeweils 800 μl) und 4 mal mit
Elutionspuffer (jeweils 200 μl). Nach jedem Waschschritt wurden 20 μl des Durchflusses für
die Western Blot Analyse abgenommen. Nach dem letzten Waschschritt mit Elutionspuffer
wurde der Durchfluß aufbewahrt und auf die Präsenz von GLEA2 Protein im Western Blot,
sowie für die eigentlichen Experimente verwendet.
3.1.4. GLEA2 Protein Konzentrationsbestimmung mit Roti-Nanoquant
Roti-Nanoquant
Roth, Deutschland
BSA
Sigma - Aldrich, UK
Die Konzentrationsbestimmung nach Roti-Nanoquant beruht auf einer Modifikation der
Proteinbestimmung nach Bradford. Mit der darauf genau abgestimmten Färbelösung können
21
Material und Methoden
Proteinmengen ab 200 ng in wässrigen Lösungen bestimmt werden. Jede Probe wird im
Photometer bei 590 nm und 450 nm vermessen. Die Linearität ergibt sich aus dem Quotienten
OD590/450. Die Roti-nanoquant Arbeitslösung wurde durch Verdünnen der Stocklösung im
Verhältnis 1:5 mit H2Odd vorbereitet.
Für die Eichreihe wurde BSA in Konzentrationen 1 μg/ml bis 100 μg/ml angesetzt. Danach
wurden jeweils 50 μl Standards mit 750 μl H2Odd und 200 μl Roti-Nanoquant gemischt. Für
die eigentliche Messung wurden je 20 μl Proteinlösung mit 780 μl H2Odd und 200 μl RotiNanoquant angesetzt. Als Referenz wurde OD590/450 vom H2Odd verwendet.
Nach den Messungen wurde die OD-Ratio der Standards, sowie der gemessenen Proben
berechnet. Aus den Standardmessungen wurde eine Eichkurve erstellt, anhand derer die
Proteinkonzentration der Proben bestimmt werden konnte.
3.1.5. SDS-PAGE und Western-Blot Analyse des rekombinanten Proteins GLEA2
Alle während der Proteinaufreinigung gewonnenen Proben wurden mit Hilfe von SDS-PAGE
und Western-Blot analysiert.
3.1.5.1. SDS-PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese)
Trenngelstock
1,5 M Tris
0,4% (v/v) SDS
Sammelgelstock
0,5 M Tris
0,4% (v/v) SDS
Laufpuffer (1 l)
pH 8,8
3g Tris
14,4g Glycin
10 ml 10% SDS
10% APS-Lösung (Ammoniumpersulfat)
99% TEMED (Roth)
30% gasstabilisierte, wässrige
Acrylamidlösung (Roth)
22
pH 6,8
Material und Methoden
2% gasstabilisierte Bisacrylamidlösung
(Roth)
Das 10% Trenngel wurde zwischen zwei mit Isopropanol gereinigte und abgedichtete
vertikale Glasplatten gegossen, mit 70% Isopropanol überschichtet, um glatte Ränder zu
erhalten, und anschließend mindestens 45 min zum Polymerisieren bei RT inkubiert. Danach
wurde das Isopropanol abgenommen und das Sammelgel auf das Trenngel gegossen. In das
Sammelgel wurde ein PVC-Kamm zur Aussparung von Taschen für die Proben eingeführt.
Das Gel polymerisierte mindestens 45 min aus, bevor der Kamm vorsichtig entfernt wurde.
Die Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels:
Trenngel 10%
Sammelgel
Sammelgelstock
-
1,25 ml
Trenngelstock
4 ml
-
30% Acrylamid
5,3 ml
750 μl
2% Bisacrylamid
2,12 ml
300 μl
H2Odd
4,58 ml
2,7 ml
10% APS
140 μl
50 μl
TEMED
14 μl
10 μl
Das SDS-Gel wurde vertikal in eine Gelkammer gespannt, die mit Laufpuffer gefüllt wurde.
Die Proben wurden in die Taschen aufgetragen. Als Längestandard diente der „Full range
Rainbow protein marker“ (RPN 800, Amersham Life Science). Der Gellauf erfolgte mit 25
mA/Gel.
23
Material und Methoden
3.1.5.2. Nachweis von Proteinen mit Comassie-Blau
Färbelösung
25% Isopropanol
10% Essigsäure
+ eine Spatelspitze Comassie Brilliant Blue
R250
Entfärber
10% Isopropanol
10% Essigsäure
Die Färbung des SDS-Gels in Färbelösung erfolgte mindestens 1-2 Stunden oder ü.N.
Während des häufigen Wechsels der Entfärberlösung wird die Farbe aus der Gelmatrix
ausgewaschen und nur die Färbung der aufgetrennten Proteine bleibt erhalten.
3.1.5.3. Spezifischer Nachweis von Proteinen im Western-Blot
3.1.5.3.1. Western-Blot
Transferpuffer (1 l)
14,4 g Glycin
3 g Tris
200 ml methanol
5 ml 10% SDS
Mittels Western-Blot wurden die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf eine PVDFMembran ( „Hybond-P“, Amersahm pharmacia Biotech) übertragen. Die Membran wurde
exakt an die Gelgröße angepasst und mit Methanol befeuchtet. Gel und Filter wurden in
Transferpuffer äquilibriert.
Der Blot erfolgte mit einer Apparatur der Firma Sigma Aldrich Techware und wurde nach
dem „Sandwichprinzip“ aufgebaut. Auf die Kathodenplatte wurden zunächst zwei mit
Transferpuffer getränkte Schwämme, ein Flies und zwei 3 mm Whatmanpapiere aufgelegt.
Danach folgte das SDS-Gel, auf das die angefeuchtete Membran aufgelegt wurde. Es folgten
zwei weitere puffergetränkte Papiere, ein Flies und ein Schwamm. Den Abschluß bildete die
24
Material und Methoden
Anodenplatte. Die Luftblasen wurden sorgfältig entfernt, die Kassete geschlossen und vertikal
in die mit Transferpuffer gefüllte Blottingapparatur eingehängt. Der Blot wurde auf 500 mA
für 2 h und anschließend über Nacht bei 160 mA optimiert. Durch die angelegte Spannung
wanderten die durch das SDS negativ geladenen Proteine zum Pluspol und wurden dabei vom
SDS-Polyacrylamidgel auf die Membran übertragen.
3.1.5.3.2. Detektion mit GLEA2 spezifischen Antikörpern GLEA2-AK455
Inkubationslösung
1x TBS
2% Magermilchpulver
Blockinglösung
1x TBS
5% Magermilchpulver
Waschlösung
1x TBS
0,5% Tween 20
0,5% Magermilchpulver
Der spezifische Nachweis des geblotteten GLEA2 Proteins erfolgte mit einem spezifischen
GLEA2-AK455 Antikörper, der in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Nastainczyk aus dem
Institut für Medizinische Biochemie, Universität Homburg, von Dr. Christian Pallasch
hergestellt worden war.
Die PVDF-Membran mit den geblotteten Proteinen wurde 30 min bei RT mit Blockinglösung
inkubiert, um unspezifische Bindestellen auf der Membran abzusättigen. Überschüssige
Blockinglösung wurde danach durch dreimaliges Waschen in Waschlösung entfernt. Die
Bindung des primären Antikörpers GLEA2-AK455, der zuvor in Verdünnung 1:5000 in
Inkubationslösung angesetzt wurde, an das GLEA2-Protein auf der Membran, erfolgte auf
einem Schüttler für 3-4 h bei RT. Nach der primären Antikörperreaktion wurde erneut dreimal
je 10 min gewaschen. Danach folgte die 1-stündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper
(HRP-gekoppelter goat anti-rabbit Antikörper, Dianova), der in der Verdünnung 1:2500
angesetzt wurde. Anschließend wurde die Membran dreimal in Waschlösung gewaschen.
25
Material und Methoden
Die Visualisierung durch Chemilumineszenz wurde mit dem ECL-System (Amersham
Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Signale wurden mit ECLHyperfilm der gleichen Firma detektiert.
3.2. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Waschpuffer
0,055 Tween20 in 1x PBS
Verdünnungspuffer
PBS/ 1% BSA
PBS
s.a. 3.1.3.
Sekundärantikörper
Sheep Anti-human IgG, Meerettichperoxidase
konjugiert, Amersham Biosciences, England
Substratlösung
TMB (Tetramethylbenzidin), MP Biomedicals Inc.,
Deutschland
Abstopplösung
2 mol/l H2SO4
ELISA-Reader
Universal Microplate Reader ELx800, Bio-Tek
Instruments. Inc.
Der ELISA wurde auf den Ni-NTA HisSorb Streifen der Firma Quiagen durchgeführt.
Zunächst wurde das Protein GLEA2 an die Oberflächen der Ni-NTA HisSorb Streifen
gebunden, indem das Protein in der Konzentration 1 μg/ml (ggf. mit PBS/BSA verdünnt) in
die Vertiefungen des Streifens eingebracht wurde. Zusätzlich wurde die Kontrolle in der Form
von BSA (Bovine Serum Albumin) in der Konzentration 1 μg/ml eingesetzt, was die
unspezifisch gebundenen Antikörper detektieren soll, sowie die Negativkontrolle, bei der
keine Proteine eingesetzt worden sind. Als weitere Negativkontrolle wurde eine
Vertiefungsreihe verwendet, in der zwar Proteine gebunden worden sind, aber zu ihrer
Detektion kein Serum verwendet wurde.
26
Material und Methoden
SERUM
1:10
∅
PROTEIN
GLEA2 1 μg/ml
BSA μg/ml
∅
Abb. 3.2.1.
Pipettierschema für ELISA
Die Streifen wurden dann bei 4°C ü.N. auf einem Schüttler inkubiert.
Am nächsten Tag wurde der Überstand entfernt und die Wells 4 mal je 10-60 Sekunden mit
Waschpuffer gewaschen, bevor die Streifen zum Trocknen auf dem Papiertuch abgeklopft
wurden.
Anschließend wurden die Seren mit PBS/BSA 1:10 verdünnt und in jede Vertiefung (außer
Negativkontrolle, die ohne Serum bearbeitet wurde) 200 μl dieser Verdünnung zugegeben.
Die Inkubation erfolgte bei 4°C ü.N. auf dem Schüttler.
Am nächsten Tag wurde erneut 4 Mal mit Waschpuffer gewaschen und danach je 200 μl
Sekundärantikörper zugegeben (1: 20.000verdünnt). Die Streifen wurden dann 45 min bei RT
auf einem Schüttler inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wurde der Überschuss an Antikörper durch 2-maliges Waschen mit
Waschpuffer und 2-maliges Abspülen mit PBS entfernt und die frisch angesetzte
Substratlösung (200 μl pro Well) zugegeben.
Die Farbreaktion wurde nach ca. 30 min durch Zugabe von 50 μl 2 mol/l H2SO4 pro Well
abgestoppt. Die kolorimetrische Messung wurde mittels ELISA-Reader bei der Wellenlänge
450 nm durchgeführt.
27
Material und Methoden
Als Antikörper positive Wells wurden diese beurteilt, bei denen der Unterschied zwischen den
Wells mit GLEA2 (spezifische Bindung) und den Wells mit BSA (unspezifische Bindung)
mehr als 100 betrug.
4. Isolierung von PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) über
Dichtegradientenzentrifugation
Die Dichtegradientenseparation basiert auf der unterschiedlichen Dichte der Lymphozyten im
Vergleich zu den anderen Blutzellen (Erythrozyten und PMN). Dieser Unterschied erlaubt,
die Populationen in einem Dichtegradient durch Zentrifugation voneinander zu trennen.
4.1. Dichtegradientenzentrifugation
Heparinblut
Blutverdünnungspuffer
1x PBS (s.a. 3.1.3)
Separationsmedium
Lymphozytenseparationsmedium LSM 1077
auf Basis von Ficoll und Natriumdiatrizoat
(PAA, Deutschland)
PBMC-Kulturmedium
RPMI 1640 (Gibco, Deutschland)
10% FCS (foetal calf serum, PAA,
Deutschland)
1% Penicillin/Streptomycin (Gibco,
Deutschland)
1% NEA (non essential aminoacids, Gibco,
Deutschland)
Das Heparinblut wurde zunächst in einem Falkon zu gleichen Teilen mit 1x PBS verdünnt
und gut gemischt. In einem anderen Falkon wurde das Lymphozytentrennmedium vorgelegt
(im Verhältnis 2:3 zum verdünnten Blut) und das verdünnte Blut vorsichtig darauf
aufgebracht, ohne dass eine Vermischung stattfindet.
28
Material und Methoden
Anschließend folgte die Zentrifugation über 20 min bei RT und 2200 rpm, die langsam (ohne
Bremse) gestoppt wurde. Bei der Zentrifugation verbleiben die leichten Thrombozyten in der
Plasmaphase, die Erythrozyten und Granulozyten wandern durch das Separationsmedium und
setzen sich am Boden des Röhrchens ab, während sich die Lymphozyten und Monozyten in
einer weißlich erscheinenden Schicht anreichern (Interphase), die zwischen Medium und
Plasma zu liegen kommt.
Plasma, Thrombozyten
PBMC
Ficoll
Erythrozyten,
Granulozyten
Abb.4.1.
Verteilung der Zellen nach Dichtegradientenzentrifugation
Nach dieser Trennung wurde die Interphase vorsichtig abgenommen, in ein neues Falkon
überführt und mit mindestens 3 Volumen 1x PBS gewaschen (2000 rpm, 8 min, RT), um das
Ficollmedium zu entfernen. Diese und die weiteren Zentrifugationsschritten wurden wieder
unter normalen Zentrifugationsbedingungen abgebremst.
Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und der Waschschritt mindestens
einmal wiederholt (1800 rpm, 8 min, RT), bis im Pellet keine Verunreinigung von
Erythrozyten mehr vorhanden waren.
Anschließend wurde das Pellet in Kulturmedium (10% RPMI, komplett) resuspendiert und
die Zahl der isolierten Zellen bestimmt.
4.2. Zellzahlbestimmung
Je nach vermuteter Zellkonzentration wurde eine Verdünnungsreihe von isolierten PBMC und
Trypan-Blau (Sigma-Aldrich, UK) vorbereitet (von 1:2 bis 1:8) und ca. 10 μl dieser
Zellsuspension wurde in die Neubaukammer einpipettiert. Trypan-Blau kann die beschädigte
Zellmembran der toten Zellen durchdringen und sie auf diese Weise blau anfärben, wobei die
29
Material und Methoden
lebenden Zellen ungefärbt bleiben. Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden alle ungefärbten
Zellen aus den vier großen Quadraten gezählt und aus dem Durchschnittswert wurde die
Zellkonzentration pro Milliliter nach der Formel berechnet:
X/4 x n x 104 = Zellzahl /ml,
x= Zellzahl aus den 4 großen Quadraten
n= Verdünnungsfaktor
Die Gesamtzellzahl der isolierten PBMC wurde durch Multiplizieren mit der Mediummenge
in Milliliter berechnet, in der die Zellen resuspendiert wurden.
4.3. Kryopräservation von PBMC-Zellen
Einfriermedium
RPMI 1640
10% FCS
1% Penicillin/Streptomycin
1% NEA
DMSO
Sigma-Aldrich, UK
Die isolierten PBMCs wurden in der Konzentration 1 bis 10 Mio Zellen /ml in 10% RPMIMedium aufgenommen, resuspendiert und mit 10% DMSO supplementiert. DMSO verhindert
die Beschädigung der Zellmembran durch die niedrige Einfriertemperatur. Unverzüglich
wurden die Zellen in Kryoröhrchen bei -70°C eingefroren, wobei die Einfriertemperatur
allmählich gesenkt wurde (4°C pro Minute), indem eine mit Isopropanol isolierte Einfrierbox
verwendet wurde. Zur Langzeitlagerung wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff
überführt.
30
Material und Methoden
4.4. Auftauen von kryopräservierten PBMCs
Die bei -70°C bzw. in flüssigem Stickstoff eingefrorenen PBMCs wurden in einem auf 37°C
vorgewärmte Wasserbad unter ständigem, leichtem Schütteln aufgetaut. Anschließend wurden
die Zellen in 12 ml Falkons mit 6 ml Kulturmedium überführt und anschließend bei 2000 rpm
8 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand
abgenommen und das Zellpellet in 1 ml Zellkulturmedium resuspendiert. Die Zellzahl wurde
wie oben beschrieben bestimmt (siehe: Material und Methoden, Kapitel 4.2). Je nach Zellzahl
wurde zu der PBMC-Suspension entsprechende Menge von Zellkulturmedium zugegeben, um
eine Konzentration von 106 Zellen pro Stimulationsansatz zu erzielen.
5. PBMC (peripheral blood mononuclear cells)- Kultur und Stimulationsvorgang
Die mittels Dichtegradientenzentrifugation isolierten PBMCs wurden entweder unmittelbar
oder nach dem Auftauen (siehe: Material und Methoden, Kapitel 4.3, 4.4) in die Zellkultur in
24-Well-Platten (106 Zellen/Well) überführt. Die Bestandteile des Zellkulturmediums werden
im Folgenden aufgelistet:
Zellkulturmedium RPMI-1640
Antigene
Gibco, Deutschland
10% FCS
foetal calf serum (PAA, Deutschland)
1% P/S
Gibco, Deutschland
1% NEA
nicht-essentielle Aminosäuren (Gibco, Deutschland)
150 U/ml IL-2
Interleukin 2 Strathmann Biotec AG, Deutschland
GLEA 2 Protein siehe: Kapitel 3.1
SEB
Staphylococcus Enterotoxin B (Sigma Aldrich GmbH),
1 μg/ml
Von jeder PBMC-Probe wurden je nach Experiment entsprechende Ansätze vorbereitet. In
den meisten Experimenten wurde neben einer mit GLEA 2 stimulierten Probe parallel eine
Negativ- und eine Positivkontrolle angelegt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen nur in
31
Material und Methoden
Präsenz von IL-2 kultiviert, ohne Zugabe von jeglichen Antigenen. Als Positivkontrolle
wurden die Zellen mit SEB (bzw. PHA) in vorgelegenen Konzentrationen stimuliert. Die
GLEA2-Konzentrationen waren je nach vorgesehenem Experiment unterschiedlich, meistens
1 μg/ml.
5.1. Stimulation durch direkte Antigenzugabe ins Kulturmedium
Der Stimulationsvorgang verlief generell durch eine direkte Antigenzugabe ins PBMCKulturmedium. Zu diesem Zweck wurde jeweils eine entsprechende Menge des GLEA2
Proteins bzw. SEB und IL-2 in jede Vertiefung der 24-Well-Platte zugegeben, damit die
vorbestimmte Konzentration erhalten blieb.
Die PBMC-Kulturen wurden danach im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Der
Mediumwechsel erfolgte je nach Verbrauch, in der Regel alle 2-3 Tage. Zu diesem Zweck
wurden die Zellen vorsichtig mit einer Pipette resuspendiert, in ein 15ml Falkon überführt und
ca. 8 Minuten bei 2000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Hälfte des
Mediums durch neues ersetzt und die Zellsuspension vorsichtig in die Zellkulturplatte zur
weiteren Kultivierung zurückgegeben. Die Zugabe von Stimulanzien erfolgte am Tag 0 und
dann in wöchentlichen Abständen. Die stimulierten Zellen wurden je nach Verwendungsziel
an Tag 3, 10, 17, 24 und bzw. 31 in weiteren Experimenten eingesetzt.
Die schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Stimulierung bzw. durchgeführter
Experimente wurde in der Abbildung 5.1.1. dargestellt.
32
Material und Methoden
Stimulation ( GLEA2, SEB, IL-2)
Tag 0
Tag 3
Tag 7
Tag 10
Tag 14
Tag 17
Tag 21
Tag 24
Proliferationsassay / funktionelle Experimente
Abb. 5.1.1.
Zeitlicher Verlauf der Stimulation und des Proliferationsassays bzw. funktioneller Experimente.
5.2. Stimulation durch Zugabe der antigenpräsentierenden APCs (antigen
presenting cells)
Für
einige
Experimente
wurden
PBMCs
verwendet,
die
durch
Zugabe
von
antigenpräsentierenden Zellen (APCs: antigen presenting cells) stimuliert wurden (G77). Als
APCs wurden EBV (Ebstein-Barr Virus) transformierte allogene B-Lymphozyten (BLCLs)
verwendet. Die B-Lymphozyten sind neben den dendritischen Zellen hoch potente APCs, die
in der Lage sind, die Antigene zu erkennen, zu verarbeiten und diese auf ihrer Oberfläche den
T-Lymphozyten zu präsentieren. Durch die Transformation mit EBV erwerben diese Zellen
ein uneingeschränktes Proliferationspotential, was das Herstellen von BLCL-Klonen und ihre
mehrfache Verwendung ermöglicht. Die BLCLs wurden mit freundlicher Hilfe von
Mitarbeitern des immunologischen Forschungslabors der Universitätsklinik in Regensburg
zur Verfügung gestellt.
Die BLCL wurden ebenfalls in dem Medium kultiviert, wie es für PBMCs zuvor beschrieben
wurde (10% FCS / RPMI-1640, jedoch ohne Zugabe von IL-2).
Die Antigenbeladung der BLCL erfolgte nach ihrer Bestrahlung mit 30 Gy Gamma-Strahlen.
Die Bestrahlung dient zur Aufhebung des proliferativen Potentials der BLCL, jedoch ohne
Verlust ihrer antigenpräsentierenden Funktion. Nach der Bestrahlung wurden die BLCL in
33
Material und Methoden
RPMI-Medium gewaschen, gezählt und in die Vertiefungen der 24-Well-Platte verteilt.
Danach wurden die Stimulanzien (GLEA2-Protein bzw. SEB) in der vorgeschriebenen
Konzentration zugegeben. Daraufhin folgte eine 2-stündige Inkubation im Brutschrank bei
37°C und 5% CO2. Während dieser Zeit sollten die Proteine aufgenommen, prozessiert und
durch entsprechende MHC-Moleküle präsentiert werden. Nach Ablauf der Inkubationszeit
wurden die antigenbeladenen BLCLs
zu den PBLs im Verhältnis 1:20 zugegeben.
Anschließend wurde IL-2 dem Kulturmedium zugesetzt.
Dieser Stimulationsvorgang wurde in den gleichen Zeitabständen durchgeführt, wie es zuvor
für die direkte Antigenstimulation beschrieben wurde.
6. Proliferationsmessung der stimulierten PBLs
Als Standardmethode zum Test der Zellproliferation und -vitalität gilt der [3H]-Thymidin
Assay, in dem der Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin in die DNA proliferierender
Zellen gemessen wird, oder auch der alternativ benutzten 5-Bromo-2’- Deoxyuridin (BrdUAssay). Eine Alternative zu diesen radioaktiven Methoden stellen kolorimetrische Assays dar,
die auf der Messung des Umsatzes eines zugegebenen Reagenzes durch die zellulären
Enzyme der proliferierenden Zellen beruhen.
Zu diesen nicht-radioaktiven Methoden gehört der WST-Assay, in dem der Umsatz von
Tetrazoliumsalz (WST) zum Formazan durch die mitochondriale Succinat-TetrazoliumReduktase gemessen wird, wobei die Aktivität dieser Enzyme mit der Vitalität und dem
Proliferationsvermögen der Zellen positiv korreliert. Die Farbänderung, die dabei zu
beobachten ist, wird durch Absorbtionsmessung bei einer vorgegebenen Wellenlänge im
Spektralphotometer (ELISA-Reader) quantitativ gemessen und entspricht einer Zunahme der
vorhandenen stoffwechselaktiven Zellen.
6.1. Ansätze
PBMCs (3-5 x 104/Well)
siehe: Material und Methoden, Kap. 5
RPMI 1640- Kulturmedium
RPMI 1640
10% FCS
34
Material und Methoden
1% Penicillin/Streptomycin
1% NEA
IL-2 (150 U/ml)
Strathmann Biotec AG, Deutschland
Antigene:
GLEA2-Protein
SEB (Staphylococcus Enterotoxin B), Sigma
Aldrich GmbH
Die Absorbtionsmessung im ELISA-Reader bei der Wellenlänge 450 und 630 nm erfolgte
jeweils nach 3- und 5-stündigen Inkubation mit dem WST-Reagenzen (bei 37°C, 5% CO2 ).
6.2. WST-Proliferationsassay (gemäß WST-Proliferationsprotokoll, Roche
GmbH, Germany)
stimulierte/unstimulierte PBLs in 10%-FCS RPMI1640- siehe: Material und Methoden,
Kulturmedium
Kap. 5.1.
WST-Reagenz
Roche Diagnostics GmbH,
Deutschland
ELISA-Reader
Universal Microplate reader
ELx800 Bio-Tek Instruments, Inc.,
Deutschland
Die PBMCs wurden 72 Stunden mit bzw. ohne Zugabe der stimulierenden Antigene in
Präsenz von IL-2 (150U/ml) in RPMI-Medium in 24-Wellplatten bzw. 25-Kulturflaschen bei
37°C (5% CO2) inkubiert. In dieser Zeit wird für die PBMCs der Höhepunkt der Proliferation
erreicht (WST-Proliferationsprotokoll, Roche GmbH ).
Nach Ablauf der Inkubationt wurden die Zellen geerntet und in eine 96-Wellplatte in der
Konzentration 3-5 x 104 / Well (100μl) in Duplikaten überführt. In zwei zusätzliche Wells
35
Material und Methoden
wurde die entsprechende Menge Kulturmedium gegeben, welches die Hintergrundabsorption
des Mediums messen soll. Zu diesen Ansätzen wurde jeweils 10μl WST-Reagenz zugegeben
und die Platte anschließend bei 37°C (5% CO2) inkubiert.
Unmittelbar vor der Messung wurde die Platte vorsichtig 1 min auf dem Schüttler geschüttelt.
Die erste Messung im ELISA-Reader bei 450 nm (Referenz 630 nm) erfolgte nach 3 Stunden,
die zweite nach 5 Stunden.
Zur Auswertung wurde aus den doppelten Ansätzen der Mittelwert errechnet und der
Mittelwert der Hintergrundsabsorption subtrahiert.
7. Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Differenzierung suspendierter Einzelzellen nach
morphologischen Eigenschaften (Zellgröße und Granularität), sowie nach der spezifischen
Bindung von Fluorochrom-markierten, monoklonalen Antikörpern (AK) gegen definierte
Zell-assoziierte Antigene.
Das Prinzip der Methode beruht auf dem Durchfluß der Einzelzellen durch einen Kanal, in
dem sie an einem Messpunkt in einem Winkel von 90° von einem fokussierten Argon-IonenLaser bestrahlt werden. Die Zellen streuen den Laserstrahl in Abhängigkeit von der Grösse
(Vorwärtsstreulicht, FSC = forward scanner detector) und Granularität (Seitwertsstreulicht,
SSC = side scanner detector), was erlaubt, die Populationen nach diesen Parametern
abzugrenzen. Die an die Zellen gebundenen spezifischen Fluoreszenz-markierten Antikörper
werden durch den Laserstrahl zur Emission definierter Fluoreszenzstrahlung angeregt, die
über einen Bandpassfilter in separate Farben aufgetrennt und ausgewertet wird.
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) emmitiert Licht im grünen (525 nm) und R-Phytoerythrin
(PE) im orangen (575 nm) Wellenlängenbereich.
7.1. Fluoreszenzmarkierte Antikörper und Leukozytenoberflächeantigene
CD3/CD16 + CD56 Simultest
IgG1-FITC/IgG1-PE, Becton Dickinson,
Deutschland
36
Material und Methoden
CD25
IgG1-PE, Becton Dickinson, Deutschland
CD94
IgG1-PE, Ancell, USA
CD56
IgG1-FITC, Becton Dickinson, Deutschland
Mouse anti-human IgG1-FITC Isotype
Becton Dickinson, Deutschland
Control
Mouse anti-human IgG1-PE Isotype Control Becton Dickinson, Deutschland
Simultest CD3/CD16 + CD56 ist ein Reagenz für die direkte Zweifarbenimmunfluoreszenz
zur Bestimmung des prozentualen Anteils reifer humaner natürlicher Killerzellen (NK), die
CD3 negativ, CD16 und CD56 positiv sind, sowie der CD3 positiven Lymphozyten, die
entweder CD16+CD56 negativ sind (T-Zellen), oder diese Moleküle co-exprimieren (NKTZellen).
Das CD3-Antigen ist ein Bestandteil des CD3/T-Zellrezeptor-Komplexes (TCR), der sowohl
in den Naiven-, als auch in den Gedächtnis-T-Zellen exprimiert ist.
Das CD16 ist ein Antigen, das mit dem IgG Fc III-Rezeptor auf NK-Lymphozyten und
Neutrophilen identisch ist und an der antikörperabhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität
(ADCC) der NK-Zellen beteiligt ist.
Das CD56 ist auf praktisch allen CD16+ NK-Lymphozyten und auf ca. 5% der CD3+
Lymphozyten des peripheren Blutes vorhanden. Während der NK-Aktivierung nimmt die
Dichte des CD56-Antigens zu.
CD3+CD56+ T-Lymphozyten bilden eine Subpopulation der zytotoxischen T-Lymphozyten,
welche die nicht-MHC-beschränkte Zytotoxizität vermitteln.
Das CD25-Antigen ist auf einer Subpopulation der Lymphozyten des peripheren Blutes
vorhanden und entspricht der Interleukin-2-Rezeptor-α-Kette. Die Antigendichte steigt
deutlich bei den aktivierten T-Lymphozyten.
37
Material und Methoden
Das CD94-Antigen ist ein C-Lektin Zelloberflächenrezeptor, der auf der Zellmembran von
aktivierten NK-Zellen lokalisiert ist. Dieser Rezeptor erlaubt den Zellen die Unterscheidung
zwischen gesunden und infizierten Zellen bzw. Tumorzellen durch Bindung an MHC I und
Kontrolle der Menge dieser Komplexe an Targetzellen (Boyington et al., 1999).
Die IgG1-FITC und –PE Isotypkontrollen werden verwendet, um das Ausmaß der
nichtspezifischen Antikörperbindung an die Zelloberfläche zu messen.
7.2. Durchführung der Fluoreszenzfärbung
PBMC-Zellen im Kulturmedium (RPMI-1640, 10% FCS, 1% NEA,
siehe: Material und
1% P/S)
Methoden, Kap. 5
FACS-Puffer
1 x PBS
10% FCS
fluoreszenzmarkierte spezifische Antikörper
siehe: Material und
Methoden, Kap.7.1.
7.2.1. Verteilen und waschen der Zellen
Die PBMC Zellen wurden in der Neubauer-Kammer gezählt und ein entsprechendes
Volumen, welches von ca. 50.000 Zellen enthält, wurde in die beschrifteten EppendorfRöhrchen überführt. Die Röhrchen wurden anschließend 5 min. bei 1200 rpm in RT
zentrifugiert, der Überstand vollständig abgenommen und die Zellpellets vom Boden des Re
ktionsgefäßes gelockert. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt, um die
Phagozytose der Antikörper während der Inkubationszeit zu unterbinden.
7.2.2. Antikörperinkubation
Zu den Ansätzen wurden gemäß nachfolgender Tabelle Antikörper zugegeben:
38
Material und Methoden
Röhrchen/Antikörper
Volumen Antikörper-Suspension
IgG1-FITC + IgG1-PE-Isotypkontrollen
je 5μl
CD3/CD16 + CD56
5μl
CD25
10μl
CD56 + CD94
5μl + 20μl
Nach der Antikörperzugabe wurden die Ansätze für wenige Sekunden stark gemischt und auf
Eis im Dunkeln ca. 30 min. inkubiert.
7.2.3. Vorbereitung der Zellen zur Messung
Nach der Inkubationszeit wurden die Röhrchen mit FACS-Puffer aufgefüllt und 5 min. bei
1200 rpm und 4°C zentrifugiert, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Nach der
Zentrifugation wurde der Überstand möglichst vollständig abgenommen, das Zellpellet vom
Boden des Reaktionsgefäßes abgelöst und wieder auf Eis gestellt. Pro Röhrchen wurden
400μl FACS-Puffer zugesetzt. Die gefärbten Zellsuspensionen wurden bis zur Messung (nicht
länger als 8 Stunden) im Dunkeln auf Eis gelagert.
7.3. FACS-Messung
Die Messung wurde am FACSCalibur und FACScan-Durchflusszytometer der Firma Becton
Dickinson (Deutschland) durchgeführt und mit Hilfe von Software CellQuest ausgewertet.
Für die Meßmaske wurden folgende Fenster erstellt:
•
DotPlot FSC (forward scanner detector) gegen SSC (side scanner detector)
(Zellgröße gegen Granularität)
•
EinDotPlot FL1 gegen FL3 (Fluoreszenzkanäle für verschiedene Fluoreszenzspektren)
•
Histogram-Plot FL3
Nachdem die Geräteeinstellungen für die PBL Zellen richtig konfiguriert worden waren,
wurde die untersuchte Zellpopulation im FSC/SSC-Plot „gegated“ (G1). Die Auswertung aller
weiteren Messungen wurde auf diesen „Gate“ eingestellt.
39
Material und Methoden
Als erstes wurde die Probe mit Isotypkontrolle im FSC gegen SSC DotPlot und FL3
Histogram-Plot gemessen. Dabei wurden im DotPlot die Quadranten und im Histogram-Plot
der Marker so plaziert, dass sich im DotPlot alle markierten Zellen im unteren, linken Bereich
und im Histogram-Plot links von dem Marker befinden.
Diese Quadrant- und Markerplazierung wurde für die weiteren Messungen verwendet, um die
unspezifische Antikörperbindung während der Auswertung auszuschließen.
Nach der Isotypkontrolle wurden die spezifisch gefärbten Zellsuspensionen gemessen,
ausgewertet und statistisch bearbeitet.
8. Intrazelluläre Zytokindetektion mit Hilfe des FastImmune Assays (Becton
Dickinson)
BD FastImmune anti-IFNγ-FITC/CD69-PE/CD4 PerCP-Cy5.5
BD FastImmune γ2aFITC/γ1PE/CD4PerCP-Cy.5.5
Isotypkontrolle
BD FastImmune CD28/CD49d kostimulatorische Antikörper
BD FastImmune Brefeldin A Lösung (BFA)
BD FastImmune EDTA Lösung
BD FACS Lysing Lösung (10x)
BD FACS Permeabilizing Lösung 2 (10x)
Waschpuffer
1xPBS
0,1% NaN3
0,5% BSA (bovine serum albumin)
Fixativ
1xPBS
1% PFA (Paraformaldehyd)
0,1% NaN3
Der FastImmune Assay stellt eine Methode dar, die erlaubt, die funktionelle Aktivität der
aktivierten T-Lymphozyten in den ersten Stunden nach dem Antigenkontakt zu messen. Dabei
wird mittels Durchflußzytometrie die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69
bestimmt, sowie die der in der ersten Phase synthetisierten Zytokine (im verwendeten Assay:
40
Material und Methoden
Interferon-gamma IFNγ). Der intrazelluläre Zytokinnachweis wird durch Zugabe von
Brefeldin A nach den ersten 2 Aktivierungsstunden ermöglicht. Diese aus Penicillium
brefeldianum gewonnene Substanz führt zur Zerstörung der Struktur und Funktion des GolgiApparates und somit Hemmung der Zytokinsekretion. Gleichzeitig kann man durch die
Dreifarbenfluoreszenzfärbung die Subpopulationen der aktivierten Zellen bestimmen. Als
Untersuchungsmaterial können sowohl isolierte PBMCs (peripherial blood mononuclear
cells), als auch heparinisiertes Vollblut verwendet werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde der FastImmune Intracellular Staining Kit der Firma Becton
Dickinson verwendet, welcher neben der CD4+ Zellfraktion und der CD69 Expression auch
die intrazelluläre Synthese von IFNγ misst.
CD4PerCP-Cy5.5 erlaubt gezieltes Anfärben der T-Helfer-Zell-Population, die vermutlich an
der Erkennung des untersuchten Antigens GLEA2 beteiligt ist.
Die CD69-PE-Färbung erlaubt eine Bestimmung des Anteils der aktivierten Zellen in der
gemessenen CD4+ Population. CD69 wird in den ersten Stunden nach der Stimulation
exprimiert und bleibt nur kurzfristig an der Zelloberfläche erhalten, weswegen dieser Marker
nur für die kürzlich aktivierten Immunzellen charakteristisch ist.
Die IFNγ-FITC Färbung erlaubt die Betsimmung der Anzahl CD69 exprimierenden CD4+
Zellen, die nach der spezifischen Stimulation dieses Zytokin synthetisieren. Das durch CD4+
Zellen sezernierte IFNγ ist für die TH1 Subpopulation charakteristisch und dirigiert die
weitere Immunantwort in Richtung zellulärer zytotoxischer Immunität.
8.1. Antigenspezifische Stimulation und Fixierung der Zellen
Tab. 8.1.1
Die in den Stimulationsexperimenten verwendete Antigene
Antigen
Konzentration
Hersteller
GLEA2
1 μg/ml
eigene Herstellung
SEB
1 μg/ml
Sigma, Deutschland
41
Material und Methoden
Als Material für die Stimulierung wurde entweder heparinisiertes Vollblut oder durch FicollGradientenzentrifugation isolierte PBMCs (siehe: Material und Methoden, Kap. 4.) in RPMI
1640-Kulturmedium (10% FCS, 1% P/S, 1% NEA) verwendet.
In 3 15 ml Falkons (Negativ- und Positivkontrolle, sowie getestetes Antigen GLEA2) wurde
jeweils 0,5 ml Vollblut bzw. 0,5 ml PBMC in Kulturmedium (mindestens 2 x 106 Zellen pro
Ansatz) vorgelegt. Zu den Ansätzen (Positivkontrolle und Testprobe) wurden in die
Stimulation verwendete Antigene in vorgeschriebener Konzentration zugegeben (siehe: Tab.
8.1.1): Staphylococcus Enterotoxin B für die Positivkontrolle (1 μg/ml) und GLEA2 für die
Testprobe (1 μg/ml). Zu allen Ansätzen wurde jeweils 5 μl kostimulatorischer Antikörper
CD28/CD49d zugegeben.
Die Ansätze wurden insgesamt 6 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, wobei nach 2
Stunden 10 μl Brefeldin A zugegeben wurde.
Anschließend wurden die Zellen fixiert, indem zu allen Ansätzen 50 μl EDTA in PBS
zugegeben, kräftig durchmischt und 15 Minuten bei RT inkubiert wurde.
Während der darauffolgenden 10-minütigen Inkubation bei RT in 5 ml 1x BD FACS Lysing
Solution pro Ansatz, wurden die Erythrozyten lysiert und die Leukozyten gleichzeitig fixiert.
Nach dem Waschen in Waschpuffer wurden die Zellen aus jedem Ansatz im 0,5 ml
Waschpuffer resuspendiert und für die Immunfluoreszenzfärbung in Ansätze geteilt.
8.2. Immunofluoreszenzfärbung und FACS-Analyse
Aus jedem Ansatz (Positiv-, Negativkontrolle, Testprobe) wurden jeweils 100 μl für die
γ2aFITC/γ1PE/CD4PerCP-Cy.5.5 Isotypkontroll-Färbung und 100 μl für die anti-IFNγFITC/CD69-PE/CD4 PerCP-Cy5.5 Färbung in 5 ml Polystyren-FACS Röhrchen vorgelegt.
Zu jedem Röhrchen wurde 0,5 ml 1x BD FACS Permeabilising Solution 2 zugegeben. Die
Ansätze wurden 10 Minuten bei RT inkubiert und bei 500 x g 5 Minuten bei RT in
Waschpuffer gewaschen. Der Überstand wurde abgenommen und jeweils 20 μl der oben
genannten
Antikörperlösunge
zur
Isotypkontrolle
bzw.
zur
Testprobe
zugegeben.
Anschließend folgte eine Inkubation für 30 Minuten bei RT im Dunkeln.
Nach der Inkubationszeit wurden die Ansätze in Waschpuffer gewaschen (500g, RT, 5
Minuten) und die Pellets in 200 μl 1% PFA/0,1% NaN3/PBS resuspendiert.
42
Material und Methoden
Daraufhin folgte die durchflußzytometrische Messung im BD-FACScan Gerät der Firma
Becton Dickinson und die Auswertung mittels CellQuest Software.
Für die Auswertung und statistische Analyse wurde zuerst die CD4 positive Zellpopulation im
Dot Plot SSC gegen CD4 PerCP-Cy.5.5 „gegatet“ und danach in Dot Plots CD69-PE gegen
IFNγ-FITC dargestellt.
9. Detektion der Zytokinproduktion durch aktivierte T-Zellen mittels
ELISA
Mit
Hilfe
des
enzymgekoppelten
Immunadsorptionstests
ELISA
(enzyme-linked
immunosorbent assay) kann man die Zytokine im Zellkulturüberstand messen und dadurch
ihre Produktion und Freisetzung durch aktivierte T-Zellen nachweisen. Das Prinzip des Tests
beruht auf der Bindung von Zytokinen an spezifische Antikörper, mit denen vorher die
Plastikvertiefungen einer 96-Well Platte beschichtet wurden, und auf ihrer Detektion mittels
des enzymgekoppelten, sekundären Antikörpers, welcher erlaubt, die gebundenen Zytokine
durch einen enzymabhängigen Farbwechsel nachzuweisen.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurde die IL-4 (Interleukin 4), IFN-γ (Interferon gamma)
und TNF-α (tumor necrosis factor alpha) Freisetzung in das Kulturmedium durch mit
GLEA2-Protein stimulierte PBLs (peripheral blood lymphocytes) gemessen. Die PBLIsolierung, sowie der Stimulationsvorgang wurden in Material und Methoden, Kap. 4 und 5
beschrieben. Die Zellkulturüberstände wurden jeweils nach 1, 2, 3, 4 und ggf. 5 Stimulationen
(d3, d10, d17, d24, d31) gesammelt, indem die Zellsuspension zentrifugiert, der Überstand
abgenommen und bis zur Messung bei –20 Grad eingefroren wurden. Das Zellpellet wurde in
Zellkulturmedium resuspendiert und unter gleichen Bedingungen weiter inkubiert (siehe auch:
Material und Methoden, Kap. 5).
9.1. IL-4 ELISA (nach BD OptEIA™ Human IL-4 :ELISA Kit II)
IL-4 (Interleukin 4) ist ein 14 kD großes Protein, das durch aktivierte CD4+ Th2 T-Zellen,
Mastzellen und Basophile produziert wird. Es stimuliert Wachstum und Differenzierung und
beeinflusst die Vitalität von bestimmten B- und T-Zell Subtypen. IL-4 erhöht unter anderem
43
Material und Methoden
die MHC II Expression auf der B-Zell-Oberfläche und stimuliert B-Zellen zur Bildung von
Antikörpern, sowie IL-2 Produktion und IL-2-Rezeptor Expression auf T-Zellen, was zu ihrer
erhöhten Proliferation führt. Darüber hinaus aktiviert IL-4 Granulozyten, Makrophagen,
Megakariozyten, Thymozyten und Mastzellen. IL-4 kann auch unterschiedliche biologische
Effekte auf viele nicht-lymphoide Zellen ausüben, wie z.B. auf endotheliale Zellen und
Fibroblasten.
Die Messung der IL-4 Konzentration in Zellkulturüberständen von stimulierten PBLs wurde
mittels Human IL-4 ELISA Kit II durchgeführt. Die im Kit beigefügte 96-Well Platte wurde
mit monoklonalen anti-human IL-4 Antikörper beschichtet. Die verwendeten Reagenzien
wurden in der Tabelle 9.1.1. zusammengestellt.
Tab.9.1.1
Reagenzien für IL-4 ELISA
Detektionsantikörper
biotinylierter monoklonaler anti-human IL-4
Antikörper
Standards
lyophilisiertes rekombinantes humanes IL-4
(500 pg/ml)
Detektionsenzym
Avidin-Meerrettich Peroxidase (250 x
konzentriert)
Standard/Probe- Dilutent
FCS (fötales Kälberserum)
ELISA-Dilutent
basisches Proteinpuffer
Waschpuffer
Detergentlösung
TMB Reagenz
gepufferte 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine
(TMB)
Stopp-Lösung
1 M Phosphorsäure
Um die IL-4 Konzentrationen in den gemessenen Proben zu bestimmen, wurde eine IL-4
Standardlösung
in
unterschiedlichen
Konzentrationen
eingesetzt,
indem
eine
Verdünnungsreihe des konzentrierten Standards (Ausgangskonzentration 500 pg/ml) im
Standard/Probe-Verdünner hergestellt wurde (Abb. 9.1.1). Dank diesem Vorgehen konnte
44
Material und Methoden
man 6 unterschiedliche Standardkonzentrationen vorbereiten, was auf der Abb.9.1.1.
schematisch dargestellt wurde.
300 μl
300 μl
300 μl
300 μl
300 μl
300 μl
250 pg/ml
125 pg/ml
62,5 pg/ml
31,3 pg/ml
15,6 pg/ml
7,8 pg/ml
500 pg/ml
Abb.9.1.1
Herstellung einer Verdünnungsreihe aus einer IL-4 Standardlösung.
In 6 Gefäße wurde jeweils 300 μl Standard/Probe-Verdünner vorgelegt und 300 μl des konzentrierten
Standards zum ersten Röhrchen zugegeben. Nach dem sorgfältigen Mischen wurde 300 μl in das
nächste Gefäß übertragen bis der Vorgang insgesamt 5 mal wiederholt wurde. Dadurch konnte eine
Verdünnungsreihe von 250 bis 7,8 pg/ml hergestellt werden.
45
Material und Methoden
Das weitere Vorgehen wurde nach beigefügtem Protokoll durchgeführt. In jede Vertiefung
der 96-Well-Platte wurde jeweils 50 μl ELISA-Diluent gegeben, sowie vorbereitete Standards
7,8 pg/ml
15,6 pg/ml
31,3 pg/ml
62,5 pg/ml
125 pg/ml
250 pg/ml
Probe
pos.
Kontrolle
neg.
Kontrolle
bzw. Proben nach folgendem Pipettierschema zugegeben (Abb. 9.1.2).
d3
d10-d31
PBLs-Kulturüberstände
Standardlösungen
Abb.9.1.2
Pipettierschema. In die Vertiefungen der 96-Wellplatte wurden jeweils in Duplikaten die Proben
(PBL-Kulturüberstände) und Standardslösungen gegeben.
Nach sorgfältigem Durchmischen auf dem Schüttler wurde die Platte 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit bindet das im Kulturmedium, sowie in den
Standardlösungen vorhandene IL-4 an der Platte. Danach wurde die Suspension aus der 96Well Platte dekantiert und die Platte insgesamt 5 Mal mit Waschpuffer (jeweils 300 μl /
Vertiefung) gewaschen.
Der Nachweis von gebundenem Zytokin erfolgte mittels Detektionslösung, die durch Zugabe
des Detektionsenzyms zu dem Detektionsantikörper hergestellt wurde. In jedes Well wurde
jeweils 100 μl der Detektionslösung gegeben, gefolgt durch eine 1-stündige Inkubation bei
46
Material und Methoden
Raumtemperatur. Danach wurde die Platte in Waschpuffer 7 Mal gewaschen. Anschließend
wurde in jede Vertiefung 100 μl des TMB-Reagenzes gegeben und die Platte bei
Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten inkubiert. In dieser Zeit lief die Farbreaktion ab,
die durch Zugabe von jeweils 50 μl Stopp-Lösung unterbrochen wurde.
Die Farbintensität, welche proportional zum Anteil des gebundenen Zytokins ist, wurde
kolorimetrisch mittels ELISA-Reader als Absorbtion bei der Wellenlänge 450 nm gemessen.
Aus den Dupplikaten wurde jeweils die mittlere Absorption berechnet. Die Absorption der
Standardlösungen diente zur Herstellung einer Standardkurve, indem auf der x Achse die IL-4
Konzentration und auf der y Achse die gemessene Absorption bei 450 nm aufgetragen wurde.
Von der auf diese Weise aufgezeichneten Standardkurve wurde die IL-4 Konzentration in den
gemessenen Proben abgelesen.
9.2. IFNγ und TNFα ELISA
IFNγ (Interferon gamma) ist ein ca. 17 kDa großes Protein, das hauptsächlich durch
stimulierte CD4+ Th1 T-Zellen und NK Zellen produziert wird. Dieses Zytokin führt unter
anderem zur erhöhten MHC-Klasse-I-Expression auf antigenpräsentierenden Zellen
(dendritische Zellen, Makrophagen und B-Lymphozyten), was die Proliferation von CD8+ TZellen beeinflußt, sowie die Expression anderer Molekülen, wie z.B. MHC-Klasse-II und
ICAM-1. IFNγ ist dadurch vor allem an dem zellulären Arm der Immunantwort beteiligt.
Darüber hinaus aktiviert IFNγ Endothelzellen, fördert Differenzierung von T- und B-Zellen
und erhöht die Synthese von TNFα, IL-1, IL-2 und freien Radikalen. Im Gegensatz zu IL-4
hemmt es IgE, IgG1, IgG2b und IgG3 Produktion und unterstützt IgG2a Synthese.
TNFα (tumor necrosis factor alpha) ist ein 17 kDa großes Protein, das vor allem an der
Entstehung eines septischen Schocks beteiligt ist. Dieses Zytokin wird sowohl durch
mononukleäre Phagozyten produziert (Monocyten und Makrophagen), als auch durch
Neutrophile, T- und NK-Zellen, welche durch Immunkomplexe, Bakterien und ihre
Bestandteile, wie z.B. LPS (Lipopolisacharid) stimuliert werden.
Die Auswirkungen von TNFα sind vielfältig und umfassen unter anderem zahlreiche AntiTumor Effekte, Aktivierung von Monozyten, LAK- und NK- Zellen, Neutrophilen, B- und T-
47
Material und Methoden
Lymphozyten, Auswirkungen auf Endothelium und Fibroblasten, sowie eine systemische
Wirkung.
Tab. 9.2.1
Reagenzien für IFNγ und TNFα ELISA
Coating Puffer
PBS (s.a. 3.1.3)
Capture Antibody
IgG1 mouse anti-human IFNγ, bzw. IgG1
mouse anti-human TNFα (BioSource,
Deutschland)
Waschpuffer
PBS 0,05% Tween 20
Assay Diluent
PBS 10% FCS
Standards
TNFα (129 ng/ml) bzw. IFNγ (100 ng/ml),
(BioSource, Deutschland)
Detektionsantikörper
biotinyliertes IgG1 mouse anti-human TNFα
bzw. biotinyliertes IgG1 mouse anti-human
IFNγ (BioSource, Deutschland)
Detektionsenzym
Avidin-Meerrettich Peroxidase (Santa Cruiz,
USA)
Farbreagenzen
gepufferte 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine
(TMB) (Santa Cruiz, USA)
Stopp-Lösung
1 M H2SO4
Die Bestimmung von IFNγ (Interferon gamma) und TNFα (tumor necrosis factor alpha) in
den Überständen von PBL-Kulturen erfolgte auf 96-Well Immunplatten (Costar), die zunächst
mit monoklonalen Antikörpern (mouse anti-human IFNγ und mouse anti-human TNFα)
beschichtet wurden. Dafür wurde 48 μl Capture Antibody (anti-IFNγ) bzw. 24 μl Capture
Antibody (anti-TNFα) in 12 ml Coatting Puffer gelöst und 100 μl dieser Lösung in jede
Vertiefung der Immunplatten gegeben. Die Immunplatten wurden anschließend über Nacht
bei 4°C inkubiert.
48
Material und Methoden
Am folgenden Tag wurden die nicht gebundenen Antikörper abgenommen und die Platten 3
Mal in Waschpuffer gewaschen. Danach wurden die Platten in Assay Diluent (200 μl pro
Well) 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Danach folgten 3 weitere Waschschritte.
Nach dem Waschen wurden die Standards bzw. Proben in die Vertiefungen der Immunplatte
gegeben (je 50 μl pro Well), wobei die Standards in einer definierten Verdünnungsreihe
zugegeben wurden. Die Herstellung der Verdünnungsreihe, sowie das Pipettierschema
wurden analog zu dem im Kapitel 9.1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt (Tab.
9.2.2, siehe auch: Material und Methoden Abb. 9.1.1, Abb. 9.1.2).
Tab.9.2.2
Herstellung von IFNγ und TNFα Standard-Verdünnungsreihe.
Mischverhältnisse
Lösung A
10 μl IFNγ (bzw.5 μl TNFα) Aliquot + 1 ml
Assay Diluent
IFNγ/ TNFα
StandardsKonzentrationen
1000 pg/ml
Lösung B
300 μl Lösung A + 300 μl Assay Diluent
500 pg/ml
Lösung C
300 μl Lösung B + 300 μl Assay Diluent
250 pg/ml
Lösung D
300 μl Lösung C + 300 μl Assay Diluent
125 pg/ml
Lösung E
300 μl Lösung D + 300 μl Assay Diluent
63 pg/ml
Die Immunplatten mit den vorgelegten Standardlösungen bzw. Proben wurden 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Platten 3 Mal mit
Waschpuffer gewaschen.
Anschließend wurde die Detektion durchgeführt. Nach sorgfältigem, starken Durchmischen
von 12 ml Assay Diluent und 48 μl Detektionsantikörper (für IFNγ) bzw. 24 μl
Detektionsantikörper (für TNFα) wurde je 48 μl Detektionsenzym zugegeben und die Lösung
49
Material und Methoden
erneut stark gemischt. Danach wurde in jede Vertiefung der Immunplatte je 100 μl der auf
diese Weise vorbereiteten Detektionslösung gegeben und die Platte 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation folgten 7 Waschschritte. Nach dem letzten
Waschschritt
wurde
die
Farbreaktion
durchgeführt,
indem
man
100
μl/Well
Farbreagenzmischung (je 6 ml Reagenz A und Reagenz B) zugab. Nach der30-minütiger
Inkubation im Dunkeln wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 1M H2SO4 gestoppt.
Die Absorptionsmessung erfolgte mittels ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm.
Herstellung der Standardkurve, sowie Datenanalyse wurden analog zu Kapitel 9.1
durchgeführt.
10. Migrationsassay
Der durchgeführte Migrationsassay ermittelte die Migrationsfähigkeit der GLEA2stimulierten PBLs gegen aufgelöstes GLEA2-Protein, sowie gegen Zellkulturüberstände von
entsprechenden Gliom-Zellkulturen der autologen Tumore.
10.1. 4-stündiger Migrationsassay
stimulierte/unstimulierte PBLs
siehe: Material und Methoden, Kap. 5
GLEA2-Protein
1μg / ml RPMI-1640 Kulturmedium
Zellkulturüberstände
DMEM-Zellkulturmedium:
DMEM (Dulbecco’s Modified eagle’s medium,
Cambrex, Deutschland)
10% FCS (foetal calf serum, PAA, Deutschland)
1% NEA (Gibco, Deutschland)
1% P/S (Gibco, Deutschland)
24-Wellplatten
Corning Incorporated, USA
Transwell Inserts, 6.5 mm Diameter, 5.0 μm Corning Incorporated, USA
Porengröße
50
Material und Methoden
Die peripheren Blut Lymphozyten (PBLs) wurden 3 Tage nach der Stimulation (ggf.
Restimulation mit 1 μg/ml GLEA2-Protein) geerntet, gewaschen und in der Konzentration 5
Mio Zellen /ml im RPMI-Kulturmedium resuspendiert. Für die Migration gegen
Zellkulturüberstände wurden die Zellen zusätzlich nochmals gewaschen, um die RPMI-Reste
abzutrennen und in der selben Konzentration in DMEM-Medium resuspendiert.
Das gleiche Vorgehen wurde bei den als Negativkontrolle verwendeten unstimulierten PBLs
durchgeführt.
Es wurden 3 Ansätze in den Vertiefungen einer 24-Wellplatte wie folgt hergestellt:
1) maximale Migration: 500 μl RPMI (ggf. DMEM) Medium
2) spontane Migration: 600 μl RPMI (ggf. DMEM) Medium
3) getestete Migration: GLEA2 1 μg/ml (aufgelöst in 600 μl RPMI-Medium) oder 600 μl
Zellkulturüberstand
Der Ansatz für die spontane Migration diente zur Ermittlung der PBL-Migration gegen das
Medium und erlaubte bei der Auswertung die spezifische Migration gegen die verwendeten
Stimuli zu erfassen.
Anschließend wurden in die Transwell-Einsätze die resuspendierten PBLs in der Menge 100
μl pipettiert (Zellzahl: 5 x 105) und in die Vertiefungen für die spontane und die getestete
Migration vorsichtig platziert. Für die Erfassung der maximalen Migration wurde 100 μl der
PBL-Suspension direkt in das Well zum Medium pipettiert.
Die Platte wurde 4h bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
Nach dem Ablauf dieser Zeit wurden die Einsätze entfernt, die Zellsuspension aus dem
unteren Kompartiment mit der Pasteurpipette gut gemischt und die Zellen mehrfach in der
Neubauer-Kammer gezählt.
Die spezifische Migration wurde nach der Formel bestimmt:
% spezifische Migration = (test – spontan) / (max – spontan) x 100%
51
Material und Methoden
10.2. Über-Nacht Migrationsassay und die FACS-Analyse der migrierten
Zellpopulationen
CD3/CD16 + CD56 Simultest
IgG1-FITC/IgG1-PE, Becton Dickinson,
Deutschland
CD94
IgG1-PE, Ancell, USA
CD56
IgG1-FITC, Becton Dickinson, Deutschland
Mouse anti-human IgG1-FITC Isotype
Becton Dickinson, Deutschland
Control
Mouse anti-human IgG1-PE Isotype Control
Becton Dickinson, Deutschland
FACS-Puffer
PBS
10% FCS
Die Ansätze für den Über-Nacht-Assay wurden vorbereitet, wie im 7.2. beschrieben, (jedoch
ohne Ansätze für die spontane Migration) und bei 37°C, 5% CO2 , über Nacht inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Zellsuspensionen sowohl aus den oberen, als auch aus den
unteren Kompartimenten gesammelt und die Zellen für die FACS-Analyse gefärbt. Die
Färbung und Messung wurden entsprechend der Beschreibung im Kap.6.2. durchgeführt.
Die Auswertung der FACS-Analyse erlaubte die nähere Charakterisierung der migrierten
Zellsubpopulationen.
52
Ergebnisse
ERGEBNISSE
1. Patienten
Für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente wurden PBMCs (peripheral
blood mononuclear cells) und Seren von insgesamt 93 Patienten mit Gliomen verwendet. Von
9 Patienten wurde Blut 2 mal und von einem Patienten 3 mal abgenommen (jeweils beim
Auftreten eines Rezidives bzw. bei Progression), was insgesamt eine Gruppe von 104
Blutproben ergab.
In dieser Gruppe befanden sich 45 Frauen und 59 Männer (M:F 1,3:1). Das mittlere Alter der
Patienten betrug 39,4 Jahre, wobei eine weiterführende Aufgliederung der Patienten in
Abhängigkeit von der histopathologischen Diagnose und vom Geschlecht in Tabelle 1.1,
sowie in den Abbildungen 1.1., 1.2 und 1.3 dargestellt ist.
Tab.1.1
Alters- und Geschlechterverteilung der betrachteten Gliom-Patienten in Abhängigkeit von der
histopathologischen Diagnose.
Diagnose
Anzahl Patienten
Geschlecht
mittleres Alter
primäres GBM
53
28 w / 25 m
sekundäres GBM
6
1w/5m
Gliosarcom
GBM-Rezidiv
1
10
1w
5w/5m
sekundäres GBMRezidiv
anaplastisches
Astrozytom WHO
III°
diffuses Astrozytom
WHO II°
Astrozytom WHO
I°*
Oligoastrozytom
WHO III°
Oligoastrozytom
WHO II°
3
2w/1m
3
1w/2m
58,13 Jahre
(w: 57,8 J; m: 58,4 J)
42,3 Jahre
(w: 38 J; m: 43,2 J)
41 Jahre
53,5 Jahre
(w: 55,4 J; m: 51,6 J)
45 Jahre
(w: 48 J; m: 39 J)
50,6 Jahre
(w: 57 J; m: 47,5 J)
6
3w/3m
38,1 Jahre
4
3w/1m
22,1 Jahre
4
4m
40 Jahre
6
1w/5m
39,5 Jahre
(w: 66 J; m: 34,2 J)
53
Ergebnisse
Oligoastrozytom
WHO III°- Rezidiv
Oligoastrozytom
WHO II°-Rezidiv
Oligodendrogliom
WHO II°
Oligodendrogliom
WHO III°-Rezidiv
atypisches Gliom
nach akuter
lymphatischer
Leukämie
atypisches Gliom
nach akuter
lymphatischer
Leukämie – Rezidiv
Ependymom
2
2m
32 Jahre
1
1m
35 Jahre
1
1m
60 Jahre
1
1m
51 Jahre
1
1m
15 Jahre
1
1m
15 Jahre
1
1m
31 Jahre
*die Gruppe der Astrozytomen WHO I° umfasste 1 pilozytisches und 3 pilomyxoide Astrozytome
m: männlich
w: weiblich
Das mittlere Alter, in dem die untersuchten Patienten an einem primären Glioblastom (de
novo GBM) erkrankten, betrug 58,13 Jahre (Spanne: 17-76 Jahre) während es bei der Gruppe
mit sekundären Glioblastomen (definiert als Progression der Tumore von niedrigeren WHOGrade) 42,3 Jahre (Spanne: 16-69 Jahre) betrug (Abb. 1.1.). Die Geschlechterverteilung in
der Gruppe der primären Glioblastome war nahe 1:1, in der Gruppe der sekundären
Glioblastome betrug sie 5:1(M:F).
58,13
42,3
60
50
40
Alter 30
20
10
0
primäre GBM
sekundäre GBM
Abb.1.1
Das mittlere Alter innerhalb der GBM-Patienten: primäre vs. sekundäre GBM.
54
Ergebnisse
Ein Vergleich der Patienten mit Astrozytomen (inkl. pilomyxoide Astrozytome, die als
Subtyp der pilozytischen Astrozytome klassifiziert sind) und Mischgliomen (klassische
Gliome
mit
oligodendrozytischer
Komponente,
wie
Oligoastrozytome
und
Oligodendrogliome, sowie 1 Gliosarcom) ergab ein mittleres Alter von 44,2 Jahren (Spanne:
7-76 Jahre) in der Gruppe der astrozytären Gliome und von 42,6 Jahren (Spanne: 25-66 Jahre)
in der Gruppe der Mischgliome. Allerdings, nach dem Ausschließen der pilozytischen und
pilomyxoiden Astrozytome, die aufgrund eines differenten biologischen Verhaltens oft als
eine eigene Entität betrachtet werden (siehe: Einleitung, Kap. 1.1.), aus der Gruppe der rein
astrozytären Gliome, stieg das mittlere Patientenalter auf 48 Jahre (Spanne: 16-76 Jahre). Die
Geschlechterverteilung zeigte für astrozytäre Gliome ein Verhältnis nahe M:F 1:1 und für die
Mischgliome M:F 7:1.
Die Altersverteilung der Astrozytome in Abhängigkeit vom WHO-Grad zeigte ein mittleres
Alter von 58,13 Jahren (Spanne: 17-76 Jahre) in der Gruppe der GBM WHO IV° (nur de novo
GBM), von 50,6 Jahren (Spanne: 38-58 Jahre) für anaplastische Astrozytome WHO III°, von
38,1 Jahren (Spanne: 30-54 Jahre) für diffuse Astrozytome WHO II° und 22,1 Jahre (Spanne:
7-35 Jahre) für Astrozytome WHO I° (pilozytische und pilomyxoide Astrozytome). Diese
Analyse wurde in der Abbildung 1.2. dargestellt.
58,13
50,6
60
50
38,1
40
22,1
Alter 30
20
10
0
WHO IV*
WHOIII WHO II WHO I
Abb. 1.2.
Mittleres Alter der Astrozytom-Patienten (A) in Abhängigkeit vom WHO-Grad.
* nur primäre GBM
55
Ergebnisse
2. Humorale Immunantwort auf das Gliom- assoziierte Antigen GLEA2 bei
Patienten mit Gliomen
2.1. Heterologes Immunoscreening (SEREX)
Die präabsorbierten Seren von insgesamt 44 Patienten mit Gliomen unterschiedlichen
histologischen Ursprungs, sowie WHO-Grades, wurden mit den Nitrozellulosemembranen
inkubiert, auf denen zuvor das in E. coli XL1-Blue MRF’ exprimierte GLEA 2 Protein
geblottet wurde. Nach der Inkubation mit dem an Alkalische Phosphatase gekoppelten
sekundären Antikörper wurden die an GLEA 2 gebundenen IgG Antikörper aus dem
Patientenserum mittels Farbreaktion detektiert und die Intensität des Plaques im Vergleich
zur cDNA-Expressionbank abgeschätzt (siehe: Material und Methoden, Kap. 2.3). Ein
Beispiel der entwickelten Membran wurde in der Abbildung 2.1.1 dargestellt.
GLEA 2 positives Serum
cDNA- Expressionsbank
Abb.2.1.1
Plaques, welche von GLEA 2 Protein enthalten, das anti-GLEA 2 Antikörper aus Patientenserum
gebunden hat (GLEA 2 positives Serum) im Vergleich zu GLEA 2 Plaques von GLEA 2
negativem Serum und cDNA-Expressionsbank. Die positiven Plaques weisen eine deutlich
intensivere Färbung auf.
Insgesamt wurden Antikörper gegen das GLEA 2 Antigen in Seren von 11 Patienten
detektiert (25%), darunter 5 Seren von Patienten mit Astrozytomen und 6 Seren von Patienten
mit Oligodendrogliomen, Oligoastrozytomen und anderen Gliomen (Tab.2.1.1) Die Gruppe
der Glioblastome (GBM, WHO° IV) umfasste 19 primäre Glioblastome, 3 GBM-Rezidive
56
Ergebnisse
und 4 sekundäre GBM. Anti-GLEA 2 Antikörper wurden in 2 Seren von Patienten mit
primären GBM und in einem Serum von einem Patienten mit Rezidiv eines sekundären
Glioblastoms detektiert.
Tab.2.1.1
Anti-GLEA 2 Antikörperpräsenz im Serum von Patienten mit Gliomen, nachgewiesen mittels SEREX.
A. Astrozytome unterschiedlichen WHO-Grades. B. Andere Gliome
A.
Astrozytäre Tumore
WHO-Grad
Anzahl
getesteter
Seren
26
anti-GLEA 2 Antikörper im
Patientenserum
anaplastisches Astrozytom
WHO° III
1
0/1
diffuses Astrozytom
WHO° II
3
0/3
pilomyxoides Astrozytom
WHO°I
2
2/2
Oligodendrogliome und
Mischgliome
WHO-Grad
Oligoastrozytom WHO° III
Anzahl
getesteter
Seren
4
anti-GLEA 2 Antikörper im
Patientenserum
Oligoastrozytom WHO° II
5
2/5
Oligodendrogliom WHO° II
1
1/1
atypisches Gliom
2
1/2
GBM WHO° IV
3/26
B.
2/4
2.2. Antikörperdetektion mittels ELISA
Seren von insgesamt 101 Patienten mit Gliomen unterschiedlicher Histologie und WHOGrades wurden auf Präsenz von GLEA 2- spezifischen Antikörpern im enzymgekoppelten
Immunadsorptionstest ELISA getestet. Antikörper gegen GLEA 2 Antigen wurden in Seren
von 34 Patienten detektiert (34/101, 33,66%): 25 von 83 Seren von Patienten mit
57
Ergebnisse
Astrozytomen, in 8 von 14 Seren von Patienten mit Oligodendrogliomen und Mischgliomen
(Oligoastrozytomen) und in einem Serum in der Gruppe der anderen Gliome, die 2 atypische
Gliome nach ALL, sowie ein Ependymom und ein Gliosarkom umfasste (1/4). Die Gruppe
der Glioblastome (GBM, WHO° IV) umfasste 51 primäre Gliome, 10 GBM-Rezidive, 6
sekundäre GBM und 3 sekundär-GBM-Rezidive. Anti-GLEA 2 Antikörper wurden in 22
Seren von Patienten mit primären GBM gefunden (22/51, 43,13%) und nur in einem Serum
von einem Patienten mit GBM-Rezidiv. Dieses Serum stammte von einem Patienten mit
Rezidiv eines sekundären GBM, welches einen großen nekrotischen Anteil aufwies.
Die Ergebnisse der ELISA-Analyse sind in Tab.2.2.1 zusammengefasst.
Tab. 2.2.1
Anti-GLEA 2 Antikörperpräsenz im Serum von Patienten mit Gliomen, detektiert mit ELISA
Anzahl
% positive
positive Seren /
Seren
getestete Seren
Alle Gliome
34/101
33,66%
22/51
0/10
0/6
1/3
43,13%
GBM
WHO-IV
Astrozytome
23/70
32,85%
GBM
GBM-Rez.
Sek. GBM
Sek. GBMRezidiv
1/3
0/6
1/4
A III
A II
AI
OA III
Oligodendrogliome, OA III-Rez.
Oligoastrozytome
OA II
OAII-Rez.
3/3
0/2
3/6
1/1
OD III-Rez.
OD II
1/1
0/1
58
Ergebnisse
andere Gliome
0/1
Atypisches
Gliom nach
ALL
Atypisches
Gliom nach
ALL-Rez.
Ependymom
Gliosarkom
1/1
0/1
0/1
2.3.Vergleich der Ergebnisse von SEREX und ELISA
Seren von 43 Patienten mit Gliomen unterschiedlicher Histologie und WHO- Grades wurden
auf Präsenz von GLEA 2 spezifischen Antikörpern mittels beider beschriebener Methoden
(SEREX und ELISA) getestet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten eine höhere Anzahl von
positiven Seren beim Anwenden von ELISA: 14/43 GLEA2-positive Seren von allen GliomPatienten und 5/26 GLEA2-positive Seren von GBM-Patienten wurden mit ELISA detektiert
(in SEREX entsprechend 11/43 und 3/26 GLEA2-positive Seren). 10/11 Seren, die mittels
SEREX als positiv beurteilt wurden, waren auch positiv im ELISA. In 4 Seren, die anhand
SEREX-Methode als negativ beurteilt wurden, konnten mittels ELISA anti-GLEA2
Antikörper nachgewiesen werden. 4 Seren, die in SEREX positiv waren, erwiesen sich im
ELISA anti-GLEA2 negativ (Tab.2.3.1). Zusammenfassend kann man sagen, dass der ELISA
eine höhere Sensitivität in der Detektion von anti-GLEA2 spezifischen Antikörpern in
Patientenseren zeigte.
Tab.2.3.1
Vergleich der anti-GLEA2-Antikörperdetektion mittels SEREX und ELISA.
DIAGNOSE
SEREX
ELISA
alle Gliome
(positive/ getestete Seren, %)
11/43
25,58%
(positive/ getestete Seren, %)
14/43
32,55%
GBM WHO-IV
A III
A II
AI
3/26
0/1
0/3
2/2
OA III
OA II
OD III-Rezidiv
atypisches Gliom nach ALL
Atypisches Gliom nach
ALL-Rez.
2/3
2/5
1/1
0/1
1/1
11,53%
5/26
1/1
0/3
0/2
1/3
3/5
0/1
0/1
1/1
59
19,23%
Ergebnisse
2.4. Anti-GLEA2 Antikörper in Seren von Patienten mit Tumorrezidiven
Unter den Seren, die auf Präsenz von anti-GLEA2 Antikörpern mithilfe des ELISA Assays
getestet wurden, befanden sich unter anderem auch Seren von Patienten mit den
Tumorrezidiven. 14 Seren von Patienten mit einem ersten und 4 Seren von Patienten mit
einem zweiten Tumorrezidiv wurden auf Präsenz von anti-GLEA2 Antikörpern getestet. Bei 9
dieser 14 Patienten war der anti-GLEA2 Immunstatus zum Zeitpunkt der ersten Operation
bekannt (3 anti-GLEA2 positive und 6 anti-GLEA2 negative Seren). 2 von 3 GLEA2
positiven Patientenseren wurden im zweiten Screening (nach dem Rezidiv) als anti-GLEA 2
negativ identifiziert, während in einem Serum die anti-GLEA2 Antikörper erhalten geblieben
sind (Serum des Patienten mit OA II Rezidiv). Lediglich in einem Serum, welches im
Primärscreening negativ war, hat im Rezidiv eine Serokonversion stattgefunden (Serum des
Patienten mit atypischem Gliom nach ALL). Bei 5 Patienten war der Immunstatus bei der
Erstdiagnose nicht bekannt, jedoch waren zum Zeitpunkt des Rezidives 4 dieser Seren antiGLEA2 negativ und lediglich 1 (Patient mit OD III Rezidiv) anti-GLEA2 positiv. Insgesamt
waren 11/14 Seren von Patienten mit dem 1.Rezidiv anti-GLEA2 negativ (78,57%). Die zum
Zeitpunkt des Rezidives positiven Seren stammten von einem Patienten mit Oligoastrozytom
Grad II, einem Patienten mit Oligodendrogliom Grad III und einem Patienten mit atypischem
Gliom nach ALL (in diesem Fall hat die Serokonversion stattgefunden). Keines der ersten
GBM-Rezidive (sowohl in der Gruppe der primären als auch der sekundären Glioblastome)
war anti-GLEA2 positiv, ebenso waren im Serum des Patienten mit 2. Rezidiv eines primären
GBM keine anti-GLEA2 Antikörper nachweisbar. Bei einem Patienten mit 2. Rezidiv eines
sekundären
GBM
hat
eine
Serokonversion
stattgefunden.
Die
histopathologische
Untersuchung dieses Tumors hat einen großen nekrotischen Anteil aufgezeigt.
Der anti-GLEA2 Antikörperstatus der untersuchten Seren von Patienten mit Rezidiven, sowie
die histopathologischen Diagnosen und progressionsfreie Zeit wurden in Tabelle 2.4.1
dargestellt (Tab. 2.4.1)
60
Ergebnisse
Tab.2.4.1
Anti-GLEA2 Antikörperstatus bei Patienten mit Gliom-Rezidiven.
ED Erstdiagnose
# Serum-Nr. nicht bekannt
n.b. anti-GLEA2 Antikörperstatus nicht bekannt
Serum
No.
ED
1.Rezidiv
GLEA2
G2
H882
G19
G20
G30
G42
H1095
#
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
+
+
n.b.
n.b.
G36
G3
G68
G63
G83
G69
G5
#
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
GBM-Rez.
n.b.
8 Mo
20 Mo
12 Mo
13 Mo
12 Mo
6 Mo
7 Mo
2 Mo.
#
GBM
n.b.
G75
GBM-Rez.
-
72 Mo
#
n.b.
G39
sek.GBM-Rez.
-
15 Mo
-
G41
sek.GBM-Rez.
-
9 Mo
-
G46
atyp.Gliom
nach ALLRez.
+
4 Mo
#
sek.
GBM
sek.
GBM
atyp.
Gliom
nach
ALL
OA III
n.b.
#
OA III-Rez.
n.b.
12 Mo
#
OA III
n.b.
G22
OA III-Rez.
-
18 Mo
#
OD III
n.b.
G16
OD III-Rez.
+
72 Mo
G6
OA II
+
G52
OA II-Rez.
+
12 Mo
G8
G31
GLEA2 Serum
No.
Progressionsfreie
Zeit (in Monaten)
Serum
No.
2.Rezidiv
GLEA2
Zeit
nach 2.OP
(in
Monaten)
G66
GBM-Rez.
-
3 Mo
GBM-Rez.
-
30 Mo
sek.
GBM-Rez.
+
11 Mo
OA IIIRez.
-
20 Mo
G56
G95
G13
3. WST-Proliferationsassay
3. 1. Proliferative Antwort der PBLs auf die Stimulation mit GLEA2 Protein
Die proliferative Antwort der PBLs, die mit rekombinant exprimiertem GLEA2-Protein
stimuliert wurden, wurde mittels WST-Assay 72 Stunden nach der ersten Stimulation getestet.
Die Konzentration von GLEA2 Antigen, die in dieser Versuchsreihe eingesetzt wurde, wurde
in Vorversuchen bestimmt, indem man eine PBLs-Probe mit unterschiedlichen GLEA2Protein-Konzentrationen (von 0.1 μg/ml bis 10 μg/ml) in Anwesenheit von IL-2 (150 U/ml)
stimulierte. Die proliferative Antwort der stimulierten Lymphozyten zeigte sich
61
Ergebnisse
dosisabhängig und erreichte das höchste Niveau bei einer GLEA2 Konzentration von 1 μg/ml,
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,186
0,1435
0,0825
0,0515
0,0295
l
l
ug
/
10
ug
/
5
m
m
l
0,
1
5
ug
/
ug
/
m
m
l
0,
1
ug
/
m
ll e
ro
nt
ko
at
iv
l
0,0035
N
eg
Absorption bei 450 nm
wie in Abb.3.1.1. dargestellt.
GLEA 2-Kontentrationsreihe
Abb. 3.1.1.
WST Proliferationsassay mit PBLs, die mit unterschiedlichen Konzentrationen GLEA 2 Protein
stimuliert werden. Die proliferative Antwort wurde als Funktion von Absorbtion bei der Wellenlänge
450 nm in Abhängigkeit von der GLEA2 Konzentration dargestellt. Als Negativkontrolle wurde die
Absorbtion der PBLs dargestellt, die ohne Zugabe von Antigenen kultiviert wurden.
Tabelle 3.1.1. enthält eine nähere Charakterisierung der im WST-Assay eingesetzten PBLProben.
Tab. 3.1.1.
Charakteristika der in den Stimulationsexperimenten verwendeten PBLs.
OA- Oligoastrozytom, OD- Oligodendrogliom, GBM- Glioblastoma multiforme, A- pilozytisches
Astrozytom
PBLs Nr.
Histopathologie des
Anti-GLEA2-
Tumors (WHO°)
Antikörperstatus
G52
OA (II) - Rezidiv
+
136
G64
GBM (IV)
-
-
62
ELISA*
Ergebnisse
G74
OD (II)
-
-
G77
GBM (IV)
+
262
G78
GBM (IV)
+
159
G79
A (I)
+
294
G81
GBM (IV)
-
-
G85
GBM (IV)
-
-
G87
GBM (IV)
+
512
*Absorbtion von Wells mit GLEA2 – Absorption der Wells mit BSA, siehe Material und Methoden, Kap. 6.2.
In Abbildung 3.1.2. wurde die proliferative Antwort der mit GLEA2 stimulierten PBLs von 9
Gliom-Patienten dargestellt. Als Positivkontrolle wurde eine Stimulation von PBLs mit
Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) in der Konzentration 1 μg/ml verwendet. Für dieses
Superantigen wurde eine starke proliferative Induktion von humanen PBLs beschrieben
(Janeway, „Immunologie“). Als Negativkontrolle wurden die PBLs nur in Präsenz von
niedrig dosiertem IL-2 (150 U/ml) kultiviert.
In 7 von 9 getesteten PBL-Proben (77,7%) konnte eine Änderung der Proliferation als
Antwort auf die Stimulation mit GLEA2 Protein beobachtet werden, in 2 von diesen 7 Proben
(28,57%) war die Proliferationsrate höher als in der Positivkontrolle.
0,8
G 52
Absorption bei 450 nm
0,7
G 64
0,6
G 77
0,5
G 85
0,4
G 87
0,3
G78
G79
0,2
G81
0,1
G74
0
neg.
pos.
GLEA 2
Abb. 3.1.2.
Proliferation von PBLs, gemessen mittels WST-Proliferationsassay 72 Stunden nach der ersten
Stimulation mit GLEA2 (1 μg/ml) und SEB (1 μg/ml) als Positivkontrolle.
63
Ergebnisse
In Tabelle 3.1.2. wurde der Proliferationsstatus der einzelnen PBL-Proben in Abhängigkeit
zur Histopathologie und zum WHO-Stadium des Tumors dargestellt. Die Proben, für die eine
starke PBL-Proliferation (stärkere als in der Positivkontrolle, hier gekennzeichnet als ++)
beobachtet wurde, stammen von einem OD II-Patienten und von einem GBM-Patienten. Die
Proben, in denen 72 Stunden nach Stimulation kein signifikanter Proliferationsgrad
beobachtet wurde, stammen von einem Astrozytom I° und von einem GBM (WHO IV°).
Zusammenfassend konnte mittels WST-Proliferationsassay 72 Stunden nach Stimulation mit
GLEA2-Protein
eine
PBL-Proliferation
in
fast
allen
Proben
unabhängig
von
histopathologischer Diagnose und Tumorstadium gemessen werden.
Tab. 3.1.2.
Proliferation der mit GLEA2 (1 μg/ml) und IL-2 (150 U/ml) stimulierten PBLs in Bezug zu
Histopathologie und das WHO-Stadium des Tumors.
- keine Proliferation
+ Proliferation schwächer als Positivkontrolle
++ Proliferation stärker als Positivkontrolle
PBLs Nr.
G52
G74
G64
G77
G78
G81
G85
G87
G79
Proliferation nach 72 Std.
Histopathologie des
Tumors und WHO°
OA II - Rezidiv
OD II
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
AI
+
++
+
+
+
+
++
-
3.2. Proliferationsrate der PBLs im Vergleich zu anti-GLEA2 Antikörperstatus
in entsprechenden Patientenseren
Für 4 von 7 Proben mit einer positiven proliferativen Antwort (57,14%) konnten in den
Patientenseren anti-GLEA2 Antikörper nachgewiesen werden. Die übrigen 3 Proben
(42,85%) waren anti-GLEA2 Antikörper negativ. Von zwei PBL Proben, für die keine
proliferative Antwort auf Stimulation mit GLEA2-Antigen nachweisbar war, stammte eine
von einem Patienten mit positivem (G79) und eine von einem Patienten mit negativem (G81)
anti-GLEA2 Antikörperstatus. Insgesamt zeigten die PBLs von anti-GLEA2 positiven
Patienten eine erhöhte Proliferation nach einer Stimulation mit GLEA2 Protein in 4 von 5
64
Ergebnisse
Fällen (80%). Allerdings konnte keine Korrelation zwischen der Reaktivität von Seren und
der Proliferationsrate nachgewiesen werden, denn PBLs von einem anti-GLEA2 negativen
Patienten(G74) proliferierten stärker als die Positivkontrolle und PBLs von einem antiGLEA2 positiven Patienten (G79) zeigten keine proliferative Antwort auf die Stimulation mit
GLEA2 Protein.
Eine tabellarische Zusammenfassung von Proliferationsrate der getesteten PBLs und antiGLEA2 Antikörperstatus in entsprechenden Patientenseren wurde in der Tabelle 3.2.1.
dargestellt.
Tab. 3.2.1.
Proliferation von PBLs 72 Stunden nach einer Stimulation mit GLEA2-Protein (1 μg/ml) im Vergleich
zum anti-GLEA2 Antikörperstatus in autologem Patientenserum.
+ positive Proliferation bzw. Antikörperstatus
- negative Proliferation bzw. Antikörperstatus
++ Proliferation höher als in Positivkontrollen (Stimulation mit SEB)
* Absorption in ELISA
PBLs
Proliferation
G52
G64
G74
G77
G78
G79
G81
G85
G87
+
+
++
+
+
+
++
anti-GLEA 2
Antikörperstatus
+
+
+
+
+
ELISA *
136
-13
16
262
159
294
49
-2
512
*Absorbtion von Wells mit GLEA2 – Absorbtion von Wells mit BSA, siehe Material und Methoden, Kap. 6.2.
3.3. Proliferationsrate der PBLs und durchflußzytometrische Analyse der PBLs
nach Stimulation mit GLEA2-Protein
Die im WST-Proliferationsassay verwendeten PBLs wurden nach Stimulation mit GLEA2Protein (1 μg/ml) in Präsenz von IL-2 (150 U/ml) mittels durchflußzytometrischer Analyse
(siehe Material und Methoden, Kap. 7.) charakterisiert. Die genaue Beschreibung der
erhaltenen Ergbnisse wird in Ergebnisse, Kap. 4. dargestellt.
65
Ergebnisse
Abbildung
3.3.1.
zeigt
die
repräsentativen
Veränderungen
innerhalb
der
PBL-
Subpopulationen nach Stimulation mit GLEA2-Protein für eine PBL-Probe, für die mittels
WST-Assays eine Proliferation nachgewiesen werden konnte (G77).
A.
G77: CD3+/CD16-56100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Negativkontrolle
Positivkontrolle
GLEA2
unstimuliert
1.Stimulation
B.
G77: CD3-/CD16+56+
7,00%
6,00%
5,00%
Negativkontrolle
4,00%
Positivkontrolle
3,00%
GLEA2
2,00%
1,00%
0,00%
unstimuliert
1.Stimulation
C.
G77: CD3+/CD16+56+
3,00%
2,50%
2,00%
Negativkontrolle
1,50%
Positivkontrolle
GLEA2
1,00%
0,50%
0,00%
unstimuliert
1.Stimulation
66
Ergebnisse
Abb. 3.3.1.
Veränderungen innerhalb der PBL-Subpopulationen nach einer Stimulation (d3) mit GLEA2-Protein
(gelbe Linie), SEB (rosa Linie, Positivkontrolle) und nach Inkubation ohne Zugabe von Antigenen
(blaue Linie, Negativkontrolle). A. CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten; B. CD3-/CD16+56+ NKZellen; C. CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen.
Die Veränderungen innerhalb der PBL-Subpopulationen nach Stimulation mit GLEA2Protein wurden jeweils mit der Positiv- und Negativkontrolle verglichen. Als relevanter
Anstieg innerhalb einer der drei gemessenen Subpopulationen (T-Lymphozyten, NK-Zellen
und NKT-Zellen) wurde nur ein solcher bezeichnet, für den ein deutlicher Unterschied zur
Negativkontrolle nachgewiesen werden konnte. Für die Probe G77 konnte z.B. ein relevanter
Anstieg im Prozentsatz der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen (Abb. 3.3.1.B) und der
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen (Abb. 3.3.1.C) beobachtet werden (im weiteren als „↑“
markiert), die Veränderungen innerhalb der CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten (Abb. 3.3.1.A)
wurden als nicht relevant im Vergleich zur Negativkontrolle betrachtet (im weiteren als „−“
markiert).
In Tabelle 3.3.1. wurde die im WST-Assay nachgewiesene Proliferationsrate stimulierter
PBLs
mit
einer
immunphänotypischen
Charakteristik
der
PBL-Subpopulationen
zusammengestellt.
Tab. 3.3.1.
Proliferationsrate von PBLs 72 Stunden nach Stimulation mit GLEA2-Protein (1 μg/ml) (ermittelt in
WST-Proliferationsassay) sowie Veränderungen innerhalb der PBL-Subpopulationen zu diesem
Zeitpunkt, definiert durch eine durchflußzytometrische Analyse der PBLs.
+ Proliferation höher als Negativkontrolle, geringer verglichen mit Positivkontrolle
++ Proliferation höher als Positivkontrolle
↑ Anstieg des Prozentsatzes der Subpopulation (grösser als in der Negativkontrolle)
↓ Abnahme des Prozentsatzes der Subpopulation
⎯ keine (bzw. nicht relevante) Veränderung im Vergleich zur Negativkontrolle.
PBLs-Subpopulationen
PBLs
Proliferation
CD3+/CD16-56- T-Zellen
CD3-/CD16+56+ NK-Zellen
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen
G52
G64
G74
G77
G78
G79
G81
G85
G87
+
+
++
+
+
+
++
↑
-
↓
↓
↑
↑
↓
↓
↓
-
↑
↑
↑
-
67
Ergebnisse
Nach einer Stimulation mit GLEA2-Protein konnte eine erhöhte Proliferationsrate (verglichen
mit Negativkontrolle) in 7 von 9 Proben nachgewiesen werden. Die immunphänotypische
Analyse der PBLs zeigte, dass die wesentlich an der Proliferation beteiligten Subpopulationen
Merkmale der NKT-Zellen tragen (CD3, CD16, CD56 positive Zellen: G64, G74 und G77).
In 2 Proben (G74, G77) konnte eine Proliferation von CD3-/CD16+56+ NK-Zellen
nachgewiesen werden und in einer (G64) eine Proliferation von CD3+/CD16-56- T-Zellen.
Die Proliferationsrate in 2 dieser 3 Proben (G64, G77) war geringer als die der
Positivkontrolle. Allerdings konnte ein relevanter Anstieg des Prozentsatzes von
CD3+/CD16+56+
NKT-Zellen
und
CD3+/CD16-56-
T-Lymphozyten
(G64)
bzw.
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen und CD3-/CD16+56+ NK-Zellen (G77) nachgewiesen
werden. In einer Probe (G74) war die Proliferationsrate höher als in der Positivkontrolle (als
„++“ bezeichnet). Für diese Probe konnte ein relevanter Anstieg von CD3+/CD16+56+ NKTZellen, sowie CD3-/CD16+56+ NK-Zellen beobachtet werden. Andere PBL-Proben, für die
eine positive Proliferationsrate nach einer Stimulation mit GLEA2 Protein mittels WSTAssay nachgewiesen werden konnte, zeigten keine relevante, qualitativen Veränderungen
innerhalb der durchflußzytometrisch charakterisierten PBL-Subpopulationen. In 2 Proben, für
die keine gesteigerte Proliferation nachweisbar war (G79, G81), konnte ebenso keine
relevante Veränderung innerhalb der PBL-Subpopulationen beobachtet werden.
4. Immunphänotypische Charakterisierung der mit GLEA2-Protein stimulierten
PBLs mittels Durchflußzytometrie
Um den Phänotyp der mit GLEA2-Protein und IL-2 stimulierten PBLs zu bestimmen, wurde
eine durchflußzytometrische Analyse vor und nach der Koinkubation mit den entsprechenden
Stimuli durchgeführt. Der Phänotyp der spezifisch stimulierten PBLs wurde mit dem
Phänotyp der PBLs verglichen, die mit SEB und IL-2 (Positivkontrolle), sowie mit dem
Phänotyp der PBLs, die nur in Präsenz von IL-2 kultiviert wurden (Negativkontrolle). Die
Charakteristika der PBLs, die in der vorgestellten Experimentenreihe verwendet wurden,
wurden in Tabelle 4.1 und repräsentative Ergebnisse dieser Analyse in Abbildung 4.1.
dargestellt.
68
Ergebnisse
Tab. 4.1.
Charakteristika der in den Stimulationsexperimenten verwendeten PBLs.
OA- Oligoastrozytom, OD- Oligodendrogliom, GBM- Glioblastoma multiforme, A- pilozytisches
Astrozytom
Der anti-GLEA2-Antikörperstatus wurde mittels ELISA bestimmt.
PBLs Nr.
Histopathologie des
Anti-GLEA2-
ELISA*
Tumors und WHO°
Antikörperstatus
G52
OA II - Rezidiv
+
136
G63
GBM - Rezidiv
-
-
G64
GBM
-
-
G74
OD II
-
-
G77
GBM
+
262
G78
GBM
+
159
G79
AI
+
294
G81
GBM
-
-
G85
GBM
-
-
G87
GBM
+
512
*Absorbtion von Wells mit GLEA2 – Absorbtion von Wells mit BSA, siehe Material und Methoden,Kap.3.
CD3+/CD16-56-
A.
120,00%
100,00%
80,00%
60,00%
40,00%
20,00%
0,00%
d0
d3
Negativkontrolle
d10
d17
d24
Positivkontrolle
d31
GLEA2
69
Ergebnisse
CD3-/CD16+56+
B.
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
d0
d3
d10
Negativkontrolle
d17
d24
Positivkontrolle
d31
GLEA2
CD3+/CD16+56+
C.
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
d0
d3
d10
Negativkontrolle
d17
d24
Positivkontrolle
d31
GLEA2
CD25+
D.
100,00%
80,00%
60,00%
40,00%
20,00%
0,00%
d0
d3
d10
Negativkontrolle
d17
d24
Positivkontrolle
d31
GLEA2
CD25 mittlere Fluoreszenz
E.
4000,00%
3000,00%
2000,00%
1000,00%
0,00%
d0
d3
Negativkontrolle
d10
d17
d24
Positivkontrolle
70
d31
GLEA2
Ergebnisse
Abb.4.1.
Kinetik der Phänotypänderung innerhalb der PBLs am Beispiel der Probe G52 (Patient mit positivem
anti-GLEA2 Antikörperstatus) während 5 Stimulationszyklen. Die mit GLEA2-Protein und IL-2
kultivierte Probe wurde in gelb, die Negativkontrolle (kultiviert ohne Antigenzugabe) in blau und die
Positivkontrolle (mit SEB stimuliert) in rosa dargestellt.
A. CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten. B. CD3-/CD16+56+ NK-Zellen. C. CD3+/CD16+56+ NKTZellen. D. Expression von CD25 (IL-2 Receptor). E. Mean Expression von CD25 IL-2 Rezeptor.
Am Tag 0 (d0) repräsentierten CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten 73,11% der PBLSubpopulationen und CD3-/CD16+56+ NK-Zellen 11,54%. CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen
konnten mit 1,04% fast nicht detektiert werden. Der IL-2 Rezeptor CD25, der infolge einer
effektiven Stimulation von T-Lymphozyten verstärkt exprimiert wird, konnte in 14,42% der
Zellen nachgewiesen werden, mit einer durchschnittlichen Fluoreszenz („mean fluorescence”)
einer einzelnen Zelle von 58,71.
Nach der ersten Stimulation (d3) konnte in allen PBL-Proben (GLEA2-stimulierten Probe,
sowie der Negativ- und Positivkontrolle) ein geringfügiger Anstieg von CD3+/CD16-56- TLymphozyten beobachtet werden. Die Expression des IL-2 Rezeptors CD25 war in geringem
Ausmaß in der Negativkontrolle gestiegen (von 14,42 auf 16,68%), begleitet durch einen
Anstieg der mittleren Fluoreszenz von 58,71 auf 297,63 aufgrund der Kultivierung in Präsenz
von IL-2, sowie relevant gestiegen in der Positivkontrolle (von 14,42 auf 45,76%, mittlere
Fluoreszenz von 58,71 auf 926,07). In der PBL-Probe, die mit GLEA2-Protein und IL-2
inkubiert wurde, konnte eine signifikante Abnahme der CD25-Expression von 14,42 auf
8,08% beobachtet werden. Allerdings ist die durchschnittliche Fluoreszenz einer einzelnen
Zelle um das 6-Fache von 58,71 auf 346,83 gestiegen. Zu diesem Zeitpunkt (d3) ist der
Prozentsatz der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen in allen untersuchten Proben gesunken: von
11,54 auf 5,42% in der Negativkontrolle, von 11,54 auf 10,79% in der Positivkontrolle und
von 11,54 auf 7,49% in der GLEA 2 Probe. Am Tag 3 (d3) konnte keine wesentliche
Veränderung des Prozentsatzes der CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen beobachtet werden.
Während der darauf folgenden Stimulationszyklen konnte ein weiterer Anstieg des Anteils an
CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten nur in der mit SEB stimulierten Positivkontrolle
nachgewiesen werden. Dieser erreichte nach der dritten Stimulation (d17) 97,3%.
Desweiteren wurde ein Anstieg in der CD25 Expression auf 80,31% (mittlere Fluoreszenz:
3637,96) gefunden. In der Negativkontrolle konnte ein leichter Anstieg der CD3+/CD16-56T-Lymphozyten nach der zweiten Stimulation (d10) erreicht werden, danach wurde jedoch
eine kontinuierliche Abnahme in der CD3+/CD16-56- PBL-Subpopulation beobachtet, deren
71
Ergebnisse
Anteil am Tag 17 (d17) auf Ausgangsniveau zurückgegangen ist (79,13%). Bezüglich der IL2 Rezeptor-Expression, sowie der mittleren Fluoreszenz des CD25, sind während der
Stimulationszyklen keine wesentlichen Veränderungen eingetreten (die Expression in der
GLEA 2 Probe war vergleichbar mit der Expression in der Negativkontrolle, was auf einen
autoregulatorischen Einfluss von IL-2 zurückzuführen ist). Der Prozentsatz von
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen in der Positivkontrolle blieb nach der Stimulation auf
Ausgangsniveau, während er in der Negativkontrolle kontinuierlich bis auf 35% anstieg. In
der GLEA 2 Probe wurde ein ähnlicher Anstieg bis zu Tag 17 (d17) beobachtet (17,36%), die
folgenden Stimulationen hatten jedoch zu keiner weiteren Veränderung innerhalb dieser PBLSubpopulation geführt.
Die
deutlichen
Veränderungen
konnten
innerhalb
der
CD3-/CD16+56+
NK-Zell-
Subpopulation beobachtet werden. Der Anteil der NK-Zellen hat sich in der mit SEB
stimulierten Positivkontrolle vermindert (bis auf 0,58% nach der dritten Stimulation, d17). Es
wurde auch keine Veränderung in der Negativkontrolle beobachtet (7,79% CD3-/CD16+56+
NK-Zellen am Tag 17). Allerdings hat sich der Prozentsatz der CD3-/CD16+56+ NK Zellen
in der GLEA 2 Probe nach 3 Stimulationszyklen um das 3-Fache auf 31,77% am Tag 17
erhöht.
Die Kinetik der Veränderungen innerhalb der PBLs Subpopulationen infolge der Zugabe der
entsprechenden Stimuli wurde in der Abb.4.1. dargestellt. Repräsentativen Dot Plots, die
anhand der durchflußzytometrischen Analyse am Tag 17 (d17) erstellt wurden, sind in der
Abb. 4.2. dargestellt.
72
Ergebnisse
d0
d17
IL-2, 150 U/ml
CD16+56+
d17
SEB 1 μ/ml + IL-2 150 U/ml
d17
GLEA 2 1 μg/ml + IL-2 150 U/ml
11.54%
1.04%
14.31%
73.11%
7.79%
12.81%
0.08%
79.13%
0.19%
0.51%
0.18%
97.3%
31.77%
17.36%
2.03%
48.84%
CD3+
Abb. 4.2.
Durchflußzytometrische Analyse der PBL-Probe G52, dargestellt als Dot Plot vor (d 0) und nach 3
Stimulationen (d 17) mit SEB bzw. GLEA 2, sowie nach der Kultivierung ohne Zugabe von
Antigenen. Alle PBL-Proben wurden in Präsenz von IL-2 kultiviert. Die Zellen wurden mit FITCkonjugierten anti-CD3 und PE-konjugierten anti-CD16+56 Antikörpern inkubiert. Die Zahlen in den
rechts aufgezeichneten Quadranten zeigen den Prozentsatz der jeweiligen PBL-Subpopulationen in
getesteten Proben.
73
Ergebnisse
Diese Ergebnisse suggerieren, dass innerhalb der GLEA 2 Probe die CD3-/CD16+56+ NKZellen die prädominante Subpopulation darstellen. Dieser Effekt kann jedoch erst nach
wiederholten Stimulationen mit dem GLEA2-Protein erreicht werden. Nach einer in vitro
Stimulation mit GLEA2-Protein wurde kein Anstieg der NK-Zell-Subpopulation beobachtet
und eine geringe Erhöhung des Prozentsatzes der CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten (nicht
relevant).
Ähnliche Stimulationsexperimente und darauf folgende durchfußzytometrischen Analysen
wurden für die PBL-Proben von anderen Gliom-Patienten durchgeführt. Die Ergebnisse
wurden in der Tabelle 4.2. zusammengefasst.
Tab. 4.2.
Veränderungen innerhalb der PBL-Subpopulationen nach wiederholten Stimulationen mit GLEA 2,
definiert durch durchflußzytometrische Analyse der PBLs.
A.Veränderungen nach einer Stimulation B. Veränderungen nach drei Stimulationen.
↑ Anstieg des Prozentsatzes der PBL-Subpopulation, der wesentlich größer ist als in der
Negativkontrolle;
↓ Abnahme des Prozentsatzes der PBL-Subpopulation;
⎯ keine (nicht relevante) Veränderung im Vergleich zur Negativkontrolle.
Die unterste Zeile jeder Tabelle zeigt die Anzahl der PBL-Proben mit einer simultanen Anreicherung
von NK- und NKT-Zellen in der PBL-Kultur zum Zeitpunkt der Analyse.
A.
d3
PBLs-Nummer
Diagnose
CD3+
T-Lymphozyten
CD3-/CD16+56+
NK-Zellen
CD3+/CD16+56+
NKT-Zellen
G52
G74
G63
G64
G77
G78
G81
G85
G87
G79
OA II Rezidiv
OD II
GBM-Rezidiv
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
GBM
AI
−
−
↑
↑
−
−
−
−
−
−
2/10 ↑
8/10 −
0/10 ↓
↓
↑
↑
↓
↑
−
↓
↓
−
↓
3/10 ↑
2/10 −
5/10 ↓
−
↑
↑
−
↑
−
−
−
−
−
3/10 ↑
7/10 −
0/10 ↓
NKT/T 1/2
NKT/NK 3/3
74
Ergebnisse
B.
d17
PBLs-Nummer
G52
G74
G64
G78
G81
G85
G87
Diagnose
CD3+
CD3-/CD16+56+
T-Lymphozyten
NK-Zellen
OA II Rezidiv
↓
↑
OD II
−
↑
GBM
−
↓
GBM
−
−
GBM
−
↑
GBM
−
↓
GBM
−
−
0/7 ↑
3/7 ↑
6/7 −
2/7 −
1/7 ↓
2/7 ↓
CD3+/CD16+56+
NKT-Zellen
−
↑
−
−
↑
−
−
2/7 ↑
5/7 −
0/7 ↓
NKT/NK 2/3
Nach einer Stimulation mit GLEA 2 konnte ein relevanter Anstieg des Prozentsatzes der
CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten in 2 von 10 getesteten PBL-Proben nachgewiesen werden,
während in den anderen 8 Proben keine Veränderung beobachtet wurde. In 50% (5 von 10
Proben) wurde eine Verminderung der CD3-/CD16+56+NK-Zell-Population beobachtet,
allerdings konnte in 30% (3 von 10 Proben) ein wesentlicher Anstieg dieser Subpopulation zu
diesem Zeitpunkt nachgewiesen werden.
Im Verlauf der weiteren Stimulierungen konnte der andauernde Anstieg des Prozentsatzes an
NK-Zellen für die G74 PBLs nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Erhöhung des
Anteils an CD3-/CD16+56+ NK-Zellen in zwei Proben (G52, G81) beobachtet, bei denen
nach einer Stimulation eine Abnahme des NK-Zell-Prozentsatzes beschrieben wurde. In zwei
weiteren PBL-Proben (G64, G85) wurde eine weitere Verminderung der NK-Zellen
beobachtet. Eine weitere Analyse der Probe G63, G77 und G79 konnte aufgrund fehlendem
Materials nicht durchgeführt werden (für die Probe G63 und G77 wurde ein primärer Anstieg
von NK-Zellen nach einer Stimulation mit GLEA2 beschrieben).
Für 1 von 2 Proben mit einem Anstieg von CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten nach einer
Stimulation (G63) war diese Veränderung mit dem Anstieg von CD3+/CD16+56+ NKTZellen verbunden. Alle PBL-Proben mit ansteigendem Anteil von CD3-/CD16+56+ NKZellen zeigten eine simultane Erhöhung des Prozentsatzes der CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen.
Ähnliche Beobachtungen konnten nach der dritten oder vierten Stimulation gemacht werden
75
Ergebnisse
(2 von 3 Proben mit Erhöhung des NK-Zell-Anteils zeigten einen relevanten Anstieg der
NKT-Zell-Subpopulation). Jede Erhöhung des Anteils der CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen hat
parallel zum Anstieg von CD3-/CD16+56+ NK-Zellen stattgefunden.
Die Analyse der CD25 (IL-2R) Expression, sowie seine Dichte auf der Zelloberfläche
(mittlere
Fluoreszenz)
zeigte
bei
allen
untersuchten
Proben
keine
wesentliche
Expressionserhöhung im Vergleich zur Negativkontrolle sowohl nach einer (d3), als auch
nach 3 Stimulationen (d17). In 5 Proben wurde bei gleich gebliebener mittleren Fluoreszenz
von CD25 eine erniedrigte CD25 Expression nach einer Stimulation (d3) beobachtet. Diese
Ergebnisse wurden in der Tabelle 4.3. zusammengestellt.
Tab. 4.3.
CD25 Expression und mittlere Fluoreszenz von CD25 nach einer (d3) bzw. 3 (d17) Stimulationen mit
GLEA2 und IL-2.
↓ verminderte Expression;
⎯ keine wesentliche Veränderung im Vergleich zur Negativkontrolle
PBL-Nr.
G52
Diagnose
G64
G77
OA II
Rezidiv
OD II
GBMRezidiv
GBM
GBM
G78
G81
G85
G87
G79
GBM
GBM
GBM
GBM
AI
G74
G63
d3
d17
CD25 mean
⎯
CD25
↓
CD25 mean
⎯
CD25
⎯
↓
⎯
⎯
⎯
⎯
keine
Messung
⎯
keine
Messung
⎯
↓
⎯
⎯
⎯
⎯
↓
⎯
↓
⎯
⎯
⎯
⎯
⎯
keine
Messung
⎯
⎯
⎯
⎯
keine
Messung
keine
Messung
⎯
⎯
⎯
⎯
keine
Messung
Ein Vergleich der humoralen Immunantwort in vivo und der zellulären Immunantwort in vitro
hat keine Korrelation zwischen dem mittels ELISA im Patientenserum festgestellten antiGLEA2 Immunstatus und der in vitro Stimulierbarkeit von isolierten PBLs mit dem GLEA2Protein erbracht, was auf die komplexen Mechanismen des Immunsystems in vivo hindeutet.
Die Analyse des histopathologischen Tumorstadiums und des WHO-Stadiums zeigte nach der
ersten Stimulation (d3) Veränderungen (definiert als Anstieg des Prozentsatzes innerhalb der
76
Ergebnisse
PBL-Subpopulationen) in PBLs von 3 GBM-Patienten (2 primäre GBM und ein GBMRezidiv) und von einem Patienten mit OD II°-WHO. Der Anstieg von CD3+/CD16-56- TLymphozyten wurde nur bei 2 von 3 GBM-Patienten beobachtet und nicht bei dem OD IIPatienten. Die dritte analysierte PBL- Probe des GBM-Patienten zeigte einen Anstieg
innerhalb der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen, sowie der CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen. Die
PBL-Probe des OD II- Patienten zeigte einen NK- und NKT-Zellanstieg, aber keinen Anstieg
innerhalb der T-Zellen. Nach 3 Stimulationen (d17) konnten wesentliche Veränderungen nur
innerhalb der NK- bzw. NKT-Zellen festgestellt werden. Die PBL-Proben mit dieser
Charakteristik stammen von 2 OD II-Patienten und von einem GBM-Patienten.
Aufgrund der begrenzten Anzahl der untersuchten PBL-Proben lässt sich zusammenfassend
keine
Schlussfolgerung
bezüglich
Korrelation
zwischen
PBL-Subpopulationen
und
histologischen Tumormerkmalen ziehen. Allerdings konnte im Laufe der wiederholten
Restimulationen ein wesentlicher Anstieg nur innerhalb der NK- bzw. NKT-Zellen beobachtet
werden. Darüber hinaus wurden diese Veränderungen in einer OA- und einer OD-Probe und
nur in einer GBM-Probe beobachtet. Der anfängliche Anstieg der CD3+/CD16-56- T-Zellen
nach einer Stimulation hat im Laufe der PBL-Zellkultur nicht angehalten.
5. Kurzzeitstimulation mit GLEA2
5.1. IFNγ- Freisetzung durch CD4+ Lymphozyten nach Kurzzeitstimulation mit
GLEA2
Um die Fähigkeit der GLEA2 stimulierten PBLs zur endogenen Interferon-gamma Produktion
und Freisetzung zu untersuchen, wurde ein Vollblutassay durchgeführt. Dieser Assay erlaubt
die Messung einer frühen endogenen Zytokinproduktion. Nach einer kurzen Stimulationszeit
(6 Stunden) wird zunächst die Freisetzung der Zytokine aus der Zelle verhindert.
Anschließend wird die Zellmembran permeabilisiert und die Zellen mit Fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert. Nach den darauf folgenden Wasch- und Fixationsschritten
wird mittels Durchflußzytometrie die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69,
sowie die in der ersten Phase synthetisierten Zytokine (im verwendeten Assay: Interferongamma IFNγ) bestimmt.
77
Ergebnisse
In
den
durchgeführten
Experimenten
wurden
entweder
die
mittels
Dichtegradientenzentrifugation isolierten PBLs oder heparinisiertes Blut verwendet. Die
Diagnose der Patienten, deren Blut verwendtet wurde, der zuvor mittels ELISA bestimmte
anti-GLEA2 Antikörperstatus, sowie die verwendeten GLEA2-Proteinkonzentrationen
wurden in der Tab. 5.1.1. zusammengefasst.
Tab. 5.1.1
Charakteristika der im Vollblutassay verwendeten Proben.
PatientNr.
Diagnose
anti-GLEA 2
Antikörperstatus
ELISA
Vollblut
/isolierte
PBLs
G46
atypisches
Gliom-Rezidiv
OA III
GBM
GBM
GBM
Gliosarcom
GBM
gesund
+
132
PBLs
verwendete
GLEA2
Konzentrationen
μg/ml
10
+
+
+
+
-
143
262
156
156
-
PBLs
Vollblut
PBLs
Vollblut
Vollblut
Vollblut
Vollblut
10
1
10
1
1, 10
10
5, 10, 20
G53
G77
G90
G97
G101
G104
N*
*als N wurde Vollblut von einer gesunden Kontrollperson bezeichnet
Insgesamt wurden PBLs von 7 Gliom-Patienten (4 mit GBM, 1 mit Rezidiv eines atypischen
Glioms, 1 mit Gliosarkom und 1 mit OAIII) und einer gesunden Kontrollperson getestet. In
Seren von 5 Patienten wurden zuvor mittels ELISA anti-GLEA2 Antikörper nachgewiesen,
die gesunde Kontrolle war anti-GLEA2 negativ.
Das Vollblut bzw. die vorher isolierten PBLs wurden mit 1 μg/ml GLEA2, was in den
früheren Experimenten am effektivsten die PBLs zur Proliferation stimuliert hat (siehe auch:
Ergebnisse, Kap.6.), bzw. 10 μg/ml GLEA2 stimuliert. Für die gesunde Kontrolle wurden
Konzentrationen von 5, 10 und 20 μg/ml gewählt.
In der durchflußzytometrischen Analyse wurde auf CD4+ Population „gegatet“ und die
CD69-Expression, sowie IFNgamma-Produktion wurden in diesem „Gate“ dargestellt. Die
„Gating“-Strategie wurde auf der Abbildung 5.1.1. dargestellt.
78
Ergebnisse
A.
CD4+
PBLs
B.
Granulozyten
CD4+
PBLs
Abb.5.1.1.
„Gating“-Strategie. Dot-Plots links: SCC (Granularität, y-Achse) gegen CD4-Expression (x-Achse),
rechts: SCC (Granularität, y-Achse) gegen FSC (Zellgrösse, x-Achse). Die „gegatete“ Population
wurde jeweils rot umkreist. Im weiteren wurden die gleichzeitig in den beiden Gates aufgenommenen
PBLs (CD4+ PBLs) auf CD69-Expression und IFNγ-Produktion getestet. A. durch
Dichtegradientenzentrifugation isolierte PBLs, B. Vollblut
In allen getesteten PBL-Proben, die mit SEB stimuliert wurden, konnte eine erhöhte
Produktion von IFNgamma durch aktivierte (CD69-exprimierende) CD4+ Lymphozyten
beobachtet werden. Die IFNγ-Produktion war signifikant höher als nach alleiniger Zugabe
von kostimulatorischen Antikörpern CD28 und CD49d, sowie nach der Zugabe von GLEA2
Protein. In keiner der mit GLEA2 stimulierten Proben konnte eine erhöhte IFNγ-Produktion
nachgewiesen werden, unabhängig von der verwendeten Konzentration. Auch der antiGLEA2 Antikörperstatus der Patienten, von denen die PBLs gewonnen wurden spielte keine
Rolle. Repräsentativen Dot Plots nach durchflußzytometrischer Messung von IFNγProduktion durch G101 CD4+ Lymphozyten nach der Stimulierung mit GLEA2, sowie mit
79
Ergebnisse
SEB und ohne Zugabe von Antigenen, wurde in Abbildung 5.1.2. dargestellt. Die graphische
Darstellung der IFNγ-Produktion durch CD4+ Lymphozyten der getesteten PBL-Proben ist in
Abbildung 5.1.3. gezeigt.
A.
IFNgamma
B.
IFNgamma
C.
IFNgamma
80
Ergebnisse
D.
IFNgamma
Abb.5.1.2.
Durchflußzytometrische Analyse der IFNγ Produktion durch CD4+ Lymphozyten aus der Probe G101
(Patient mit Gliosarkom, anti-GLEA2 negativ) ohne Zugabe von Antigenen (A), nach der
Stimulierung mit SEB (B), sowie mit GLEA2 in der Konzentration 1 μg/ml (C), bzw. 10 μg/ml (D).
Die IFNγ-Produktion durch CD69 positive CD4+ Zellen ist im oberen, rechten Quadranten der Dot
Plots dargestellt und zeigt keine Erhöhung der IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit GLEA2,
unabhängig von der verwendeten Proteinkonzentration. Hingegen konnte nach der Stimulation mit
SEB eine deutliche IFNγ-Produktion nachgewiesen werden.
A.
0,35%
0,30%
G46
Negativkontrolle
0,25%
0,20%
G46
Positivkontrolle
0,15%
G46 GLEA2
10ug/ml
0,10%
0,05%
0,00%
IFNgamma + CD69
B.
0%
0%
G53
Negativkontrolle
0%
G53
Positivkontrolle
0%
0%
G53 GLEA2
10ug/ml
0%
0%
0%
IFNgamma + CD69
81
Ergebnisse
C.
4,00%
3,50%
G77
Negativkontrolle
3,00%
2,50%
2,00%
G77
Positivkontrolle
1,50%
G77 GLEA2
1,00%
0,50%
0,00%
IFNgamma+CD69
D.
3,50%
3,00%
G90
Negativkontrolle
2,50%
2,00%
G90
Positivkontrolle
1,50%
1,00%
G90 GLEA2
10ug/m l
0,50%
0,00%
IFNgam m a + CD69
E.
5,00%
4,00%
G97
Negativkontrolle
3,00%
G97
Positivkontrolle
2,00%
G97 GLEA2 1ug/ml
1,00%
0,00%
IFNgamma+CD69
82
Ergebnisse
F.
2,50%
G101Negativkontrolle
2,00%
G101Positivkontrolle
1,50%
1,00%
G101GLEA2 1ug/ml
0,50%
0,00%
IFNgamma+CD69
G101GLEA2 10ug/ml
G.
5%
4%
G104
Negativkontrolle
3%
G104
Positivkontrolle
2%
G104 GLEA2
10ug/ml
1%
0%
IFNgamma+CD69
H.
6%
5%
N Negativkontrolle
4%
N Positivkontrolle
3%
N GLEA2 5ug/ml
2%
N GLEA2 10ug/ml
N GLEA2 20ug/ml
1%
0%
IFNgamma + CD69
Abb.5.1.3.
Graphische Darstellung der IFNγ-Produktion durch CD4+ Lymphozyten in getesteten PBLs von
Gliom-Patienten (A-G): ohne Zugabe von Antigenen (blau), nach Stimulation mit SEB (lila) und
GLEA2 (gelb bzw. grün). H zeigt die IFNγ-Produktion durch die CD4+ Lymphozyten der gesunden
Kontrollperson (violett: IFNγ-Produktion nach Inkubation mit GLEA2 Protein, 20 μg/ml).
83
Ergebnisse
Ebenso konnte die IFNγ-Produktion durch CD4+ Lymphozyten der gesunden Kontrollperson
erst nach Inkubation mit dem GLEA2 Protein in den Konzentrationen 10 und 20 μg/ml
nachgewiesen werden, allerdings war die Menge des IFNγ, das durch die CD4+ TLymphozyten produziert wurde, wesentlich geringer als nach Stimulation mit SEB.
Zusammenfassend kann man sagen, dass die PBL-Stimulation mit GLEA2 nicht zu einer
wesentlichen IFNγ-Produktion durch aktivierte CD4+ T-Lymphozyten geführt hat.
5.2. Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 nach Kurzzeitstimulation
mit GLEA2 Protein
Eine genaue Analyse der erhaltenen Daten zeigte, dass die Expression des frühen
Aktivierungsmarkers CD69 unterschiedlich ausgeprägt war, je nach Stimulationsansatz. In 3
von 5 Proben (G90, G101, G104), die mit GLEA2 (10 μg/ml) inkubiert wurden, war sie
wesentlich höher als in der jeweiligen Positivkontrolle. In den 2 übrigen Proben (G46 und
G53) war die CD69 Expression kleiner als in der Negativkontrolle, ebenso in 2 Proben, die
mit GLEA2 in der Konzentration 1 μg/ml inkubiert wurden (G97, G101). In einer Probe
(G77) konnte eine hohe CD69 Expression schon nach der Stimulation mit GLEA2 Protein in
der Konzentration 1 μg/ml nachgewiesen werden. Die CD69 Expression war unabhängig von
dem anti-GLEA2 Antikörperstatus der Patienten, der zuvor mittels ELISA bestimmt wurde. In
der gesunden Kontrollperson (N) konnte die CD69 Expression nach der Inkubation mit dem
GLEA2 Protein in vergleichbaren Konzentrationen (5 und 10 μg/ml) nicht nachgewiesen
werden, erst nach der Inkubation mit dem GLEA2 Protein in der Konzentration 20 μg/ml
konnte eine erhöhte CD69 Expression erreicht werden.
Die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 in den getesteten CD4+ TLymphozyten wurde in Abbildung 5.2.1. dargestellt.
84
Ergebnisse
A.
45,00%
40,00%
35,00%
30,00%
G46 Negativkontrolle
25,00%
G46 Positivkontrolle
20,00%
15,00%
G46 GLEA2 10ug/ml
10,00%
5,00%
0,00%
CD69
B.
40,00%
30,00%
G53
Negativkontrolle
20,00%
G53
Positivkontrolle
10,00%
G53 GLEA2
10ug/m l
0,00%
CD69
C.
60,00%
50,00%
G77
Negativkontrolle
40,00%
G77
Positivkontrolle
30,00%
20,00%
G77 GLEA2
10,00%
0,00%
CD69
85
Ergebnisse
D.
80,00%
70,00%
60,00%
G90
Negativkontrolle
50,00%
G90
Positivkontrolle
40,00%
30,00%
G90 GLEA2
10ug/ml
20,00%
10,00%
0,00%
CD69
E.
60,00%
50,00%
G97
Negativkontrolle
40,00%
G97
Positivkontrolle
30,00%
20,00%
G97 GLEA2 1ug/ml
10,00%
0,00%
CD69
F.
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
G101
Negativkontrolle
G101
Positivkontrolle
G101 GLEA2
1ug/ml
G101 GLEA2
10ug/ml
CD69
86
Ergebnisse
G.
60,00%
50,00%
G104
Negativkontrolle
40,00%
30,00%
G104
Positivkontrolle
20,00%
G104 GLEA2
10ug/ml
10,00%
0,00%
CD69
H.
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
N Negativkontrolle
N Positivkontrolle
N GLEA2 5ug/ml
N GLEA2 10ug/ml
N GLEA2 20ug/ml
CD69
Abb. 5.2.1.
Graphische Darstellung der CD69 Expression durch CD4+ Lymphozyten in getesteten PBLs von
Gliom-Patienten (A-G): ohne Zugabe von Antigenen (blau), nach Stimulation mit SEB (lila) und
GLEA2 (gelb bzw. grün). H zeigt die CD69 Expression durch CD4+ Lymphozyten der gesunden
Kontrollperson (violett: CD69 Expression nach der Inkubation mit 20 μg/ml GLEA2).
Für die PBL-Proben G77, G90 und G104 konnte nach Stimulation mit GLEA2 eine erhöhte CD69Expression nachgewiesen werden. Für die Proben G90 und G104 war diese Expression deutlich höher
als in der Positivkontrolle.
Diese Daten zeigen erste Hinweise für die GLEA2-abhängige Aktivierung von CD4+ TLymphozyten (erhöhte CD69-Expression) und deuten gleichzeitig darauf hin, dass die
aktivierten Zellen kein IFNγ produzieren.
5.3. IFNγ Produktion und CD69 Expression durch die PBL-Gesamtpopulation im
Vergleich zu CD4+ T-Lymphozyten
Da IFNγ auch durch andere PBL-Subpopulationen produziert und freigesetzt wird (z.B.
CD3+CD8+ T-Lymphozyten, CD3-CD16+56+ NK-Zellen), wurde im weiteren die FACS87
Ergebnisse
Messung wiederholt, indem die gesamte PBL-Population in Betracht gezogen wurde.
Dadurch konnte eine mögliche IFNγ -Produktion durch die anderen PBL-Subpopulationen
erfasst werden. Anschließend wurde die IFNγ-Produktion und die CD69-Expression in
diesem neuen „Gate“ analysiert.
Es wurden keine Unterschiede in der IFNγ-Produktion beobachtet. Allerdings konnte in 3
PBL-Proben (G90, G101 und G104) eine wesentlich erhöhte CD69-Expression in der PBLGesamtpopulation nach Stimulation mit GLEA2 im Vergleich zu CD4+ Lymphozyten
nachgewiesen werden. Diese vom „Gating“ abhängige CD69-Expressionserhöhung wurde in
diesen Proben weder in der Negativ-, noch in der Positivkontrolle beobachtet (Abb. 5.3.1., A).
In 2 Proben (G53 und G97) wurden „Gating“-abhängige Unterschiede in den getesteten
Proben, sowie in den Kontrollen nachgewiesen und in 2 (G46 und G97) hat sich die CD69
Expression nach der neuen Messungsart nicht verändert (Abb. 5.3.1., B und C). Diese, sowie
früher beschriebene Beobachtungen zur IFNγ-Produktion, waren mit dem anti-GLEA2
Antikörperstatus nicht korreliert.
A.
G90 GLEA2(-)
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
CD4+ gating
30,00%
PBLs gating
20,00%
10,00%
0,00%
G90neg.
G90pos.
G90 GLEA2
10ug/ml
G101 GLEA2(-)
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
CD4+ gating
30,00%
20,00%
PBLs gating
10,00%
0,00%
G101neg.
G101pos.
G101 GLEA2 G101 GLEA2
1ug/ml
10ug/ml
88
Ergebnisse
G104 GLEA2(+)
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
CD4+ gating
PBLs gating
G104neg. G104pos.
G104
GLEA2
10ug/ml
B.
G53 GLEA2 (+)
50,00%
40,00%
30,00%
CD4+
20,00%
PBLs
10,00%
0,00%
G53neg.
G53pos.
G53 GLEA2
10ug/ml
G77 GLEA(+)
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
CD4+
20,00%
PBLs
10,00%
0,00%
G77neg.
G77pos.
G77 GLEA2
1ug/ml
89
Ergebnisse
C.
G46 GLEA(+)
50,00%
40,00%
30,00%
CD4+
20,00%
PBLs
10,00%
0,00%
G46neg.
G46pos.
G46 GLEA2
10ug/ml
G97 GLEA2(+)
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
CD4+gating
20,00%
PBLs gating
10,00%
0,00%
G97neg.
G97pos.
G97 GLEA2
1ug/ml
Abb. 5.3.1.
CD69 Expression der CD4+ T-Zellpopulation, sowie der PBL-Gesamtpopulation. A. In den Proben
G90, G101 und G104 wurde eine wesentliche CD69 Expressionserhöhung nach der Stimulation mit
GLEA2 im Vergleich zu den Kontrollproben beobachtet, B. CD69-Expressionserhöhung unabhängig
von dem Stimulus (Proben G53 und G77), C. Keine Unterschiede in der CD69-Expression durch die
mit GLEA2 stimulierten Lymphozyten nach der Änderung der durch die Messung erfassten
Population. Neben der Probe-Nummer steht in Klammern der GLEA2-Antikörperstatus.
Zusammenfassend konnte in den durchgeführten Experimenten keine wesentliche IFNγProduktion nach Stimulation mit GLEA2 weder durch CD4+ T-Lymphozyten, noch durch die
PBL-Gesamtpopulation
nachgewiesen
werden,
unabhängig
von
der
verwendeten
Proteinkonzentration. Es konnte jedoch eine konzentrationsabhängige Expression des frühen
Aktivierungsmarkers CD69 durch die mit GLEA2 stimulierten CD4+ T-Lymphozyten
nachgewiesen werden. Die CD69-Expression war in 3 Proben (G90, G101 und G104) nach
der Stimulierung mit GLEA2 (Konzentration 10 μg/ml) größer als in der Positivkontrolle. In
den selben Proben konnte eine CD69-Expressionserhöhung der Gesamtpopulation beobachtet
90
Ergebnisse
werden. Dies könnte auf die Aktivierung von anderen PBL-Subpopulationen als CD4+ TLymphozyten hindeuten.
6. Zytokinproduktion durch stimulierte PBLs
Die Zytokinproduktion (IL-4, IFNγ und TNFα) durch GLEA2 bzw. SEB stimulierte PBLs
wurde indirekt anhand ihrer Freisetzung ins Kulturmedium mittels ELISA gemessen. Die in
diesem Experiment eingesetzten PBL-Proben, sowie der Zeitpunkt der Messung der
Zytokinfreisetzung wurden in Tabelle 6.1 zusammengefasst.
Tab. 6.1
Zusammenstellung der für den ELISA verwendeten PBL-Proben.
GBM Glioblastoma multiforme
OA II Oligoastrozytom Grad II WHO
Zeitpunkt der
Messung
gemessene
Zytokine
PBLs Probe
Diagnose
anti-GLEA2
Antikörperstatus*
G52
OA II-Rezidiv
+
G63
G64
GBM-Rezidiv
GBM
-
G77
GBM
+
d3, d10, d17,
d24, d31
d3
d3, d10, d17,
d24, d31
d3
G77(stimuliert
durch APCs)
G85
GBM
+
d3
IL-4, IFNγ,
TNFα
IL-4
IL-4, IFNγ,
TNFα
IL-4, IFNγ,
TNFα
IL-4, TNFα
GBM
-
G87
GBM
+
d3, d10, d17,
d24
d3, d10, d17,
d24
IL-4, IFNγ,
TNFα
IL-4, IFNγ,
TNFα
* anti-GLEA2 Antikörperstatus bestimmt mittels ELISA, siehe Ergebnisse, Kap. 1.
Die Bestimmung der IL-4, sowie TNFα Freisetzung in das Kulturmedium wurde für alle in
Tabelle 6.1. dargestellten Proben durchgeführt. Die Menge der freigesetzten Zytokine wurde
für G52 und G64 jeweils 72 Stunden nach jeder der 5 durchgeführten Stimulationen
gemessen. Für G85 und G87 wurde die Zytokinmenge jeweils 72 Stunden nach jeder der 4
Stimulationen und für G77 und G63 72 Stunden nach einer Stimulation gemessen. Das
gleiche Schema wurde zur Messung von IFNγ verwendet, in diesem Fall wurde jedoch die
Menge der Zytokine für die Probe G63 wegen Materialmangels nicht bestimmt. G77 wurde
91
Ergebnisse
auf unterschiedlichem Weg stimuliert: entweder durch direkte Antigenzugabe in das
Kulturmedium (G77) oder über Zugabe der mit Antigenen beladenen antigenpräsentierenden
Zellen (G77b). Für jede Probe (PBLs stimuliert mit GLEA2, 1 μg/ml) wurde die Menge des
sezernierten
Zytokins
zusätzlich
in
der
Negativ-
und
Positivkontrolle
bestimmt
(Negativkontrolle: PBLs ohne Zugabe von Antigenen, Positivkontrolle: PBLs stimulierte mit
SEB, 1 μg/ml).
6.1. IL-4 ELISA
Die Bestimmung der IL-4 Menge in den PBL-Kulturüberständen mittels ELISA erfolgte wie
in Material und Methoden, Kapitel 9, beschrieben.
Zur Analyse der erhaltenen Ergebnisse und zur IL-4 Konzentrationsbestimmung in den
gemessenen Proben wurde zunächst jeweils eine Eichgerade als Standard erstellt (getrennt für
jede bearbeitete 96-Well-Platte). Diese wurden auf Abbildung 6.1.1 dargestellt.
IL-4 Konzentration (pg/ml, X) gegen Absotption der
Standards (Y)
2
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
200
G52 und G64
92
250
300
Ergebnisse
IL-4 Konzentration (pg/ml, X) gegen Absotption der
Standards (Y)
2
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
200
250
300
G63, G77, G85, G87
Abb. 6.1.1
Eichgeraden für IL-4 ELISA (getrennt für Proben G52 und G64, sowie G63, G77, G85 und G87).
Abbildung 6.1.2. zeigt die IL-4-Konzentration im Kulturüberstand verschiedener PBL Proben
nach Stimulation im zeitlichen Verlauf, welche durch Vergleich der Absorption der Probe mit
einer IL-4-Eichgerade errechnet wurde. Da für G63 und G77 die Messung nur nach einer
Stimulation durchgeführt wurde, zeigt die Abbildung 6.1.3. nur einen graphischen Vergleich
zwischen GLEA2-stimulierten Proben und den Kontrollen. In Abbildung 6.1.3. B wurde die
mittels ELISA gemessene IL-4 Konzentration in Abhängigkeit von der Stimulationsart der
G77 Probe dargestellt.
G52
IL4-Konzentration
250
200
Negativkontrolle
150
Positivkontrolle
100
GLEA2
50
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
93
Ergebnisse
G64
IL-4 Konzentration
200
150
Negativkontrolle
100
Positivkontrolle
GLEA2
50
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
G85
IL-4 Konzentration
50
40
Negativkontrolle
30
Positivkontrolle
20
GLEA2
10
0
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
IL-4 Konzentration
G87
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
GLEA2
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
Abb. 6.1.2
IL-4 Konzentration (y) in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der durchgeführten Messung (x). Ergebnisse
für die PBL-Kulturüberstände G52, G64, G85, G87.
94
Ergebnisse
A.
IL-4
Konzentration
G63
120
100
80
60
Negativkontrolle
40
Positivkontrolle
20
GLEA2
0
d3
Tag der Messung
B.
G77 und G77b
G77
Negativkontrolle
IL-4
Kontzantration
250
200
G77b
Negativkontrolle
150
G77 Positivkontrolle
100
G77b
Positivkontrolle
50
0
d3
Tag der Messung
G77 GLEA2
G77b GLEA2
Abb. 6.1.3.
Die im ELISA gemessene IL-4 Konzentration (y) für G63 und G77 PBLs. Die Messung wurde am
Tag 3 (d3, nach 1 Stimulation) durchgeführt. A. IL-4 Freisetzung durch die mit GLEA2 stimulierte
G63 Probe im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle. B. IL-4 Freisetzung durch die GLEA2
stimulierte G77 und G77b Probe (als G77b wurden G77 PBLs bezeichnet, die mit Hilfe von APCs
stimuliert wurden).
In Tabelle 6.1.1 wurden die maximale errechnete IL-4 Konzentration sowie Tag ihrer
Messung dargestellt. Die IL-4 Konzentration war in allen 4 Proben, für die wiederholte
Restimulationen durchgeführt wurden, bis zur dritten Stimulation im Vergleich zur
Negativkontrolle stärker gestiegen. Für die Proben G64 und G85 wurde das Maximum an Tag
24 (nach 4 Stimulationen) erreicht und für die Probe G52 wurde ein weiterer Anstieg bis zum
Ende der PBL-Zellkultur (d31) beobachtet.
95
Ergebnisse
Tab. 6.1.1
Maximal erreichte IL-4 Konzentrationen nach Stimulation mit GLEA2-Protein und Zeitpunkt der
Konzentrationsmessung.
PBLs-
Tag
max. IL-4 Konzentration von der mit GLEA2 stimulierten Probe
Nummer
(pg/ml)
Negativkontrolle
Probe
Positivkontrolle
G 52
31
< 0,7825
107,5
> 217
G 64
24
9,39
57,5
100
G 85
24
4,1
35,23
37,69
G 87
17
3,1
41
18
6.2. IFNγ ELISA
Bestimmung der IFNγ Menge in den PBL-Kulturüberständen mittels ELISA erfolgte wie es in
Material und Methoden, Kapitel 9, beschrieben wurde.
Zur Analyse der erhaltenen Ergebnisse und zur IL-4 Konzentrationsbestimmung in den
gemessenen Proben wurde zunächst eine Eichgerade als Standard erstellt. Diese wurde auf
Abbildung 6.2.1 dargestellt.
96
Ergebnisse
IFNgamma Konzentration (pg/ml, X) gegen
Absorption (Y) der Standarts
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Abb. 6.2.1
Eichgerade für IFNγ-ELISA.
Abbildung 6.2.2. zeigt die IFNγ-Konzentration im Kulturüberstand verschiedener PBL Proben
nach Stimulation im zeitlichen Verlauf, welche durch Vergleich der Absorption der Probe mit
einer IFNγ-Eichgerade errechnet wurde. Da für G63 und G77 die Messung nur nach einer
Stimulation durchgeführt wurde, zeigt die Abbildung 6.2.3. nur einen graphischen Vergleich
zwischen GLEA2-stimulierten Proben und den Kontrollen. In Abbildung 6.2.3. B wurde die
mittels ELISA gemessene IFNγ-Konzentration in Abhängigkeit von der Stimulationsart der
G77 Probe dargestellt.
IFNgamma Konzentration
G52
1400
1200
1000
Negativkontrolle
800
Positivkontrolle
600
GLEA2
400
200
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
97
Ergebnisse
IFNgamma Konzentration
G64
1400
1200
1000
Negativkontrolle
800
Positivkontrolle
600
GLEA2
400
200
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
IFNgamma Konzentration
G85
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
GLEA2
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
IFNgamma Konzentration
G87
1400
1200
1000
Negativkontrolle
800
Positivkontrolle
600
GLEA2
400
200
0
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
Abb. 6.2.2
IFNγ-Konzentration (y) in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der durchgeführten Messung (x). Ergebnisse
für die PBL-Kulturüberstände G52, G64, G85, G87.
98
Ergebnisse
IFNgammaKonzentration
G77
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
GLEA2
d3
Tag der Messung
Abb. 6.2.3.
Die im ELISA gemessene IFNγ-Konzentration (y) für die GLEA2 stimulierte G77 PBLs im Vergleich
zu den Negativ- und Positivkontrollen. Die Messung wurde am Tag 3 (d3, nach 1 Stimulation)
durchgeführt.
In Tabelle 6.2.1 wurden die maximale errechnete IFNγ Konzentration sowie Tag ihrer
Messung dargestellt. Für die IFNγ-Konzentration im PBL-Zellkulturüberstand wurde eine
Dynamik mit einem maximalen Konzentrationsanstieg am Tag 10 (G64, G85, G87) bzw. am
Tag 24 (G52) beobachtet, die jedoch im Vergleich zur Negativkontrolle nicht signifikant war.
Tab. 6.2.1
Maximal erreichte IFNγ Konzentrationen nach Stimulation mit GLEA2-Protein und Zeit der
Konzentrationsmessung.
PBL-
Tag
max. IFNγ Konzentration der mit GLEA2 stimulierten Probe
Nummer
(pg/ml)
Negativkontrolle
Probe
Positivkontrolle
G 52
24*
1292
1220
1303
G 64
10*
1297
1285
1301
G 85
10*
1384,3
1123
1306
G 87
10*
1299,4
1292,7
1307
*Der maximale Konzentrationsanstieg war nicht relevant, d.h. nicht wesentlich unterschiedlich von der IFNγKonzentration in der Negativkontrolle
99
Ergebnisse
6.3. TNFα ELISA
Bestimmung der TNFα Menge in den PBL-Kulturüberständen mittels ELISA erfolgte wie es
in Material und Methoden, Kapitel 9, beschrieben wurde.
Zur Analyse der erhaltenen Ergebnisse und zur TNFα Konzentrationsbestimmung in den
gemessenen Proben wurde zunächst eine Eichgerade als Standard erstellt. Diese wurden auf
Abbildung 6.3.1 dargestellt.
TNFalpha-Kon zentration (pg/ml, X) gegen Absorption (Y)
der Standarts
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Abb. 6.3.1
Eichgerade für TNFα ELISA
Die Abbildung 6.3.2. zeigt die TNFα- Konzentration in verschiedenen stimulierter PBLProben im zeitlichem Verlauf, welche durch ELISA bestimmt wurde. Da für G63 und G77 die
Messung nur nach einer Stimulation durchgeführt wurde, zeigt die Abbildung 6.3.3. nur einen
graphischen Vergleich zwischen GLEA2-stimulierten Proben und den Kontrollen. In
Abbildung 6.1.3. B wurde die mittels ELISA gemessene TNFα- Konzentration in
Abhängigkeit von der Stimulationsart der G77 Probe dargestellt.
100
Ergebnisse
TNFalpha Konzentration
G52
3000
2500
2000
Negativkontrolle
1500
Positivkontrolle
1000
GLEA2
500
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
TNFalpha Konzentration
G64
3000
2500
2000
Negativkontrolle
1500
Positivkontrolle
1000
GLEA2
500
0
d3
d10
d17
d24
d31
Tag der Messung
TNFalpha Konzentration
G87
3000
2500
2000
Negativkontrolle
1500
Positivkontrolle
1000
GLEA2
500
0
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
101
Ergebnisse
TNFalpha Konzentration
G85
3000
2500
2000
Negativkontrolle
1500
Positivkontrolle
1000
GLEA2
500
0
d3
d10
d17
d24
Tag der Messung
Abb. 6.3.1
TNFα Konzentration (y) in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der durchgeführten Messung (x). Ergebnisse
für die PBL-Kulturüberstände G52, G64, G85, G87.
G63
A.
TNFalpha
Konzentration
2500
2000
1500
Negativkontrolle
1000
Positivkontrolle
500
GLEA2
0
d3
Tag der Messung
G77 und G77b
B.
TNFalpha
Konzentration
3000
2500
G77 Negativkontrolle
2000
G77b Negativkontrolle
1500
G77 Positivkontrolle
1000
G77b Positivkontrolle
500
G77 GLEA2
0
G77b GLEA2
d3
Tag der Messung
Abb. 6.3.3.
Die im ELISA gemessene TNFα Konzentration (y) für G63 und G77 PBLs. Die Messung wurde am
Tag 3 (d3, nach 1 Stimulation) durchgeführt. A. TNFα Freisetzung durch die mit GLEA2 stimulierte
G63 Probe im Vergleich zur Negativ- und Positivkontrolle. B. TNFα Freisetzung durch die GLEA2
stimulierte G77 und G77b Probe (als G77b wurden G77 PBLs bezeichnet, die mit Hilfe von APCs
stimuliert wurden).
102
Ergebnisse
In Tabelle 6.3.1 wurden die maximale errechnete TNFα Konzentration sowie Tag ihrer
Messung dargestellt. Für 3 von 4 Proben konnte keine TNFα Produktion nachgewiesen
werden, in einer Probe (G85) konnte ein TNFα-Konzentrationsanstieg im PBLZellkulturüberstand nach 2 Stimulationen (Tag 10) beobachtet werden. Er verlief zwar
parallel zum Konzentrationsanstieg der Negativkontrolle, war jedoch wesentlich stärker
ausgeprägt, was auf einen GLEA2-Einfluss hindeuten könnte.
Tab. 6.3.1
Maximal erreichte TNFα Konzentrationen nach Stimulation mit GLEA2-Protein und Zeit der
Konzentrationsmessung.
PBL-
Tag
Nummer
max. TNFα Konzentration der mit GLEA2 stimulierten Probe
(pg/ml)
Negativkontrolle
Probe
Positivkontrolle
G 52
↓
-
-
-
G 64
↓
-
-
-
G 85
10
1441
1975
2484
G 87
↓
-
-
-
↓ Kein TNF Konzentrationsanstieg
6.4. Zytokinproduktion und Charakteristik der PBL Populationen
Am Tag der mittels ELISA gemessenen maximalen Zytokinkonzentration wurden die PBL
Subpopulationen im PBL- Zellkulturmedium bestimmt. Die Ergebnisse wurden in Tabelle
6.4.1. dargestellt.
Tab. 6.4.1.
Zytokinproduktion und PBL-Populationen am Tag der maximalen Zytokinfreisetzung, die mittels
ELISA gemessen wurde.
+: eine stärker ausgeprägte Zytokinproduktion im Vergleich zu Negativkontrolle;
-: keine stärkere Zytokinproduktion im Vergleich zu Negativkontrolle bzw. keine deutliche
Veränderung innerhalb der PBL-Populationen;
↑: Anstieg einer bestimmten PBL- Subpopulation; ↓: Verminderung des prozentuellen Anteils einer
bestimmten PBL- Subpopulation.
103
Ergebnisse
Zytokine
PBLs-Populationen
IL-4
IFNγ TNFα CD3+/CD16-56- CD3-/CD16+56+ CD3+/CD16+56+
T-Zellen
NK-Zellen
NKT-Zellen
+
↓
↑
+
↓
+
+
+
-
PBLs
G52
G64
G85
G87
Eine stärkere im Vergleich zu Negativkontrolle
IL-4 Produktion fand entweder ohne
wesentliche Veränderung des prozentualen Anteils einer bestimmten PBL- Subpopulation
oder mit einem deutlichem Anstieg innerhalb der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen statt. Die in
einem Fall beobachtete TNFα Produktion war mit keiner wesentlichen Veränderung des
prozentualen Anteils einer bestimmten PBL-Population verbunden.
7. Migrationsassay
7.1. Migration von PBLs gegen gelöstes GLEA2 Protein
Seren von Gliom-Patienten wurden auf ihre Reaktivität gegen rekombinantes GLEA2 Protein
getestet, das zuvor in einem Baculovirus-System exprimiert wurde. Der Immunstatus der
Patienten bezüglich der anti-GLEA2 Antikörper wurde mittels ELISA bestimmt. Die
Charakteristika der Patienten, deren PBLs im Migrationsassay verwendet wurden, wurden in
Tab.7.1.1. zusammengefasst.
Tab. 7.1.1.
Charakteristika des im Migrationsassay eingesetzten Materials
PBLs Nr.
G6
G52
G78
G87
Histopathologische Diagnose
und WHO Stadium
Oligoastrozytom, WHO°II
Anti-GLEA 2
Antikörperstatus
+
ELISA*
Oligoastrozytom, Rezidiv,
WHO°II
Glioblastoma multiforme,
WHO°IV
Glioblastoma multiforme,
WHO°IV
+
136
+
159
+
512
177
*Absorption von Wells mit GLEA2 – Absorption von Wells mit BSA, siehe Material und Methoden, Kap. 3.2
Der Phänotyp der PBLs, die mit GLEA2 (1µg/ml) und IL-2 (150 U/ml) stimuliert wurden,
wurde mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Als Positivkontrolle wurden PBLs, welche mit
Staphylococcus Enterotoxin B (SEB; 1 µg/ml) und IL-2 (150 U/ml) stimuliert wurden,
104
Ergebnisse
verwendet, als Negativkontrolle PBLs, die nur in Anwesenheit von IL-2 (150 U/ml) kultiviert
wurden, ohne Zugabe von sonstigen Antigenen (siehe Material und Methoden, Kap.5.). Der
Migrationsassay wurde entweder vor der Stimulation (G6, G78) oder nach 3 bzw. 4
Stimulationen (G6, G52, G78, G87) durchgeführt. Die immunphänotypischen Charakteristika
der PBLs vor und nach Stimulation mit GLEA2 (an Tag 0, 17 bzw.24) wurden in Tabelle
7.1.2. dargestellt.
Tab. 7.1.2.
Die immunphänotypischen Charakteristika der PBLs vor und nach Stimulation mit GLEA2 (d0 vs.
d17 bzw. d24).
Probe
G6
G52
G78
G87
Tag
CD3+/CD16-56T Zellen
CD3-/CD16+56+
NK Zellen
CD3+/CD16+56+
NKT Zellen
0
17
0
17
0
24
0
17
70.52%
66.28%
73.11%
48.84%
59.52%
80.77%
31.47%
75.97%
4.74%
25.76%
11.54%
31.77%
8.26%
5.9%
18.88%
14.12%
1.97%
6.1%
1.04%
17.36%
7.44%
5.59%
0.9%
9.32%
Die migratorische Kapazität der PBLs gegen das GLEA2 Protein wurde mit Hilfe des
Transwell cell culture systems bestimmt. Die Konzentration des GLEA2-Proteins im unteren
Komparitment war dieselbe mit der die PBLs stimuliert wurden (1 µg/ml).
Im ersten Experiment wurden die PBLs G6 angesetzt, die von einem Patienten mit einem
Oligoastrozytom (WHO°II) stammen. Als Negativkontrolle wurden unstimulierte PBLs des
selben Patienten verwendet (Tag 0). Nach 4 Std. der Koinkubation wurden die migrierten
Zellen des unteren Kompartiments gesammelt und dreifach gezählt.
Die spezifische
Migration wurde anhand folgender Formel bestimmt:
% spezifische Migration = (test – spontan) / (max – spontan) x 100%
Unstimulierte G6 PBLs zeigten eine spezifische Migration von 1.23 %. Nach 3 Stimulationen
stieg der Prozentsatz der gegen GLEA2 spezifisch migrierten Zellen auf 8,81 % an.
105
Ergebnisse
Ähnliche Ergebnisse wurden für PBLs G78 (GBM, WHO°IV) erhalten. Bei den
unstimulierten G78 PBLs konnte keine spezifische Migration gegen das GLEA2 Protein
nachgewiesen werden, nach 3 Stimulationen zeigte sich jedoch eine spezifische Migration
von 8,67 %. Die Ergebnisse dieses Experiments wurden in Abb. 7.1.1. dargestellt und legen
ein Einfluss der Stimulation von PBLs mit GLEA2 Protein auf die migratorische Kapazität
der PBLs nahe.
8,81%
8,67%
9,00%
% spezifische Migration
8,00%
7,00%
6,00%
5,00%
G6
4,00%
G78
3,00%
1,23%
2,00%
0%
1,00%
0,00%
unstimuliert
nach 3 Stimulationen
Abb. 7.1.1.
4-Stunden Migrationsassay von G6 und G78 PBLs gegen gelöstes GLEA 2 Protein (1 μg/ml) vor und
nach 3 Stimulationen mit GLEA 2 Protein (1 μg/ml) und IL-2 (150 U/ml).
Um den Immunphänotyp der migrierten bzw. nicht migrierten PBLs näher zu
charakterisieren, wurde ein Über-Nacht-Migrationsassay mit GLEA2-prä-stimulierten PBLs
für die Proben G6, G52, G78 und G87 durchgeführt. Die Versuchsbedingungen waren die
selben wie im 4-stündigen Migrationsassay. Nach Koinkubation über Nacht wurden die
Zellen aus beiden Kompartimenten gesammelt, zur Bestimmung der spezifische Migration
gezählt und anschließend mit Fluorochrom-markierten Antikörpern inkubiert (anti-CD3FITC, anti-CD16/56-PE, anti-CD56-FITC, anti-CD94-PE). Die PBL-Subpopulationen
wurden mittels Durchflußzytometrie charakterisiert.
Die Ergebnisse dieser FACS-Analyse wurden in Tabelle 7.1.3. zusamengestellt und als Grafik
in Abb. 7.1.2. gezeigt.
106
Ergebnisse
Tab. 7.1.3.
Ergebnisse der durchflußzytometrischen Analyse der PBL-Subpopulationen vor und nach der ÜberNacht-Migration von GLEA2 stimulierten PBLs (G6, G52, G78, G87).
A = Ausgangpopulation
N = nicht migrierte Zellen
M = migrierte Zellen
V = Veränderung innerhalb der Subpopulationen der migrierten Zellen
Probe
G6
G52
% spezifischer
Migration nach 3
Stimulationszyklen
8.81%
CD3/CD16+56+
NK Zellen
CD3+/CD16+56+
NKT Zellen
A
N
M
75.35%
83.13%
66.41%
16.8%
10.5%
22.29%
2.4%
2.41%
2.06%
V
11.8% ↓
32.67% ↑
-
A
N
M
60.95%
70.76%
48.48%
20.07%
8.64%
27.82%
8.7%
8.84%
15.92%
V
20.45% ↓
38.6% ↑
82.89% ↑
A
N
M
84.44%
77.87%
90.08%
3.8%
1.35%
4.88%
4.52%
3.82%
4.8%
V
6.67% ↑
28.42% ↑
6.19% ↑
A
N
M
87.84%
79.74%
79.77%
6.05%
3.26%
9.94%
5.52%
2.85%
10.14%
V
9.18% ↓
64.29% ↑
83.69% ↑
Phänotyp
Probe
9.51%
G78
8.67%
G87
CD3+/CD1656-T Zellen
1.41%
107
Ergebnisse
CD3+/CD16-56-
A.
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
vor
Migrationsassay
migrierte Zellen
G6
G52
G78
G87
B.
CD3-/CD16+56+
30,00%
25,00%
20,00%
vor
Migrationsassay
15,00%
migrierte Zellen
10,00%
5,00%
0,00%
G6
G52 G78 G87
CD3+/CD16+56+
C.
16,00%
14,00%
12,00%
10,00%
8,00%
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
vor
Migrationsassay
migrierte Zellen
G6
G52
G78
G87
Abb.7.1.2.
PBL Subpopulationen, bestimmt mittels Durchflußzytometrie vor und nach dem Migrationsassay A.
CD3+/CD16-56- T Zellen, B. CD3-/CD16+56+ NK Zellen, C. CD3+/CD16+56+ NKT Zellen.
Die repräsentativen Ergebnisse der FACS-Analyse von
Abbildung 7.1.3. zusammengefasst.
108
PBLs der Probe G6 sind in
Ergebnisse
A.
Ausgangssubpopulationen
16.8%
nicht-migrierte
Zellen
migrierte Zellen
22,9%
CD16+56
10.5%
B.
CD3
CD3 FITC
CD94 Expression vor
dem Migrationsexperiment
CD94
18,59%
nicht-migrierte
Zellen
12,25%
migrierte
Zellen
CD56
109
24,88%
Ergebnisse
Abb.7.1.3.
Über-Nacht-Migrationsassay von G6- PBLs gegen GLEA 2 Protein (1μg/ml). Das Experiment wurde
nach 3 Stimulationen durchgeführt. A. Dot Plots der G6 PBLs, markiert mit FITC-konjugiertem antiCD3 bzw. PE-konjugiertem anti-CD16+56 vor und nach der spezifischen Migration. Die Zahlen
beziehen sich auf den Prozentsatz von CD3-/CD16+56+NK Zellen in jedem Kompartiment. B. Dot
Plots der G6 PBLs, markiert mit FITC-konjugiertem anti-CD56 bzw. PE-konjugiertem anti-CD94. Die
Zahlen beziehen sich auf den Prozentsatz der aktivierten CD56+CD94+ NK Zellen in jedem
Kompartiment.
Die Ausgangspopulation G6 bestand aus 75.35 % CD3+/CD16-56-T Zellen, 16.8% CD3/CD16+56+ NK Zellen und 2.4% CD3+/CD16+56+ NKT Zellen. Nicht-migrierte Zellen aus
dem oberen Kompartiment zeigten eine leichte Anreicherung von CD3+/CD16-56- T Zellen
(83.13 %) und keinen signifikanten Unterschied im Prozentsatz von CD3+/CD16+56+ NKT
Zellen (2.41 %). Der Prozentsatz der nicht-migrierten CD3-/CD16+56+ NK Zellen ist von
16.8 % auf 10.5 % gesunken. Die migrierten PBLs, die aus dem unteren Kompartiment
gesammelt wurden, zeigten eine Anreicherung von CD3-/CD16+56+ NK Zellen (22.29%),
eine Senkung von CD3+/CD16-56-T Zellen (66.41 %) und keinen Unterschied in
CD3+/CD16+56+ NKT Zellen (2.06 %). Die migrierten CD3-/CD16+56+ NK Zellen zeigten
zusätzlich eine Anreicherung von CD94-Rezeptor-exprimierenden Zellen, was ein Indikator
für die aktivierten NK Zellen ist.
Zusammenfassend deutet der durchgeführte Migrationsassay darauf hin, dass die GLEA2prästimulierten PBLs spezifisch gegen gelöstes GLEA2 Protein migrieren und die
vorherrschend migrierende Subpopulation aus CD3-CD16+/CD56+ NK Zellen mit hoch
exprimierten CD94 NK-Zell-Rezeptoren besteht, während die T-Zellen auf den Stimulus in
Form von gelöstem Protein nicht ansprechen.
7.2. Migration von PBLs gegen Zellkulturüberstände
Die migratorische Kapazität der GLEA2-stimulierten PBLs wurde im weiteren im
Migrationsassay gegen Überstände von Gliom-Zellkulturen geprüft. Die für die Zellkulturen
eingesetzten Tumorzellsuspensionen stammen von denselben Patienten, von denen auch die
PBLs isoliert wurden, so dass das Experiment im autologen System durchgeführt werden
konnte. Die verwendeten PBLs, die entsprechenden Zellkulturen, histopathologischen
Diagnosen, sowie der anti-GLEA2 Immunstatus der Patienten wurde in Tab. 7.2.1.
zusammengefasst.
110
Ergebnisse
Tab. 7.2.1.
Charakteristika des im Migrationsassay eingesetzten Materials
PBLs Nr.
Zellkultur Nr.
Histopathologische
anti-GLEA2
Diagnose und
Antikörperstatus
ELISA*
WHO Stadium
G77
T6143
GBM °IV
+
262
G78
T6144
GBM °IV
+
159
G85
T6161
GBM °IV
-
-
* Absorbtion von Wells mit GLEA2 – Absorbtion von Wells mit BSA
Der Migrationsassay gegen Zellkulturüberstände wurde nach einer Stimulation mit GLEA2
Protein (1 μg/ml) und IL-2 (150 U/ml) analog zum Migrationsassay gegen das aufgelöste
GLEA2 Protein durchgeführt. Statt des aufgelösten GLEA2-Proteins wurden hier jedoch die
Mediumüberstände von den Zellkulturen aus den autologen Gliomen verwendet
(freundlicherweise von Frau Ulrike Lindemann als adhärente Zellkulturen gezüchtet). Im
ersten, 4-stündigen Assay, wurde der Prozentsatz der spezifischen Migration von G77, G78
und G85 PBLs bestimmt. Im über-Nacht-Migrationsassay (G85) wurden die spezifisch
migrierten Subpopulationen näher charakterisiert.
Als Negativkontrolle wurden jeweils PBLs angesetzt, die nur in Präsenz von IL-2 (150 U/ml)
kultiviert wurden.
Der Prozentsatz der spezifisch migrierten PBLs wurde in der Abb.7.2.1. graphisch dargestellt.
A.
18,25%
18,50%
18,00%
17,50%
17,00%
16,00%
16,50%
G77 stimuliert mit
GLEA2 und IL-2
G77 stimuliert mit IL2
16,00%
15,50%
15,00%
14,50%
% spezifische Migration
111
Ergebnisse
B.
39,68%
40,00%
35,00%
24,70%
30,00%
25,00%
G78 stimuliert mit
GLEA2 und IL-2
20,00%
15,00%
G78 stimuliert mit IL2
10,00%
5,00%
0,00%
% spezifische Migration
C.
32,24%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
25,18%
G85 restimuliert mit
GLEA2 und IL-2
G85 restimuliert mit
IL-2
% spezifische Migration
Abb.7.2.1.
Spezifische Migration von PBLs gegen den Zellkulturüberstand der autologen Tumore.
A. G77 Migration gegen T6143 Zellkulturüberstand, B. G78 Migration gegen T6144
Zellkulturüberstand, C. G85 Migration gegen T6161 Zellkulturüberstand
In allen getesteten Proben konnte nach 4-stündiger Koinkubation eine spezifische Migration
gegen den entsprechenden Zellkulturüberstand erreicht werden. In 2 Proben (G77 und G78)
war der Prozentsatz der spezifisch migrierten PBLs größer nach Stimulation mit GLEA2 und
IL-2 als nach der Inkubation nur mit IL-2. In einer Probe (G85) war die spezifische Migration
der GLEA2-prästimulierten PBLs geringer als ohne Prästimulation.
In einem darauf folgenden Über-Nacht-Migrationsassay wurden die migrierten PBLSubpopulationen der Probe G85 (GLEA2-prästimuliert und nicht-stimuliert) mittels
Durchflusszytometrie näher charakterisiert. Die verwendeten Fluorochrom-markierten
Antikörper wurden angesetzt, wie es in Material und Methoden, Kap. 10.2. beschrieben
wurde.
112
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Eperimentes wurden in der Abb.7.2.2. dargestellt.
nicht-stimulierte PBLs
GLEA2-prästimulierte PBLs
Ausgangspopulationen
A.
45%
49%
CD3+/CD16-56-
41%
CD3+/CD16-56-
CD3-/CD16+56+
CD3-/CD16+56+
53%
CD3+/CD16+56+
6%
CD3+/CD16+56+
6%
nicht-migrierte PBLs
B.
40%
21%
2%
CD3+/CD16-56-
CD3+/CD16-56-
CD3-/CD16+56+
55%
CD3-/CD16+56+
CD3+/CD16+56+
CD3+/CD16+56+
5%
77%
migrierte PBLs
C.
35%
CD3+/ CD16-56-
42%
CD3-/ CD16+56+
59%
CD3-/ CD16+56+
52%
CD3+/ CD16+56+
6%
CD3+/ CD16-56-
CD3+/ CD16+56+
6%
Abb. 7.2.2.
Subpopulationen der G85-PBLs abhängig von der Stimulation und Migrationskapazität. Links nicht
prästimulierte, rechts GLEA2-prästimulierte PBLs. A. Ausgangssituation nach 4 Stimulationen. B.
Nicht-migrierte PBLs. C. Migrierte PBLs.
113
Ergebnisse
Die Ausgangspopulationen der nicht prästimulierten und prästimulierten G85 PBLs zeigten
nach 4 Stimulationen im wesentlichen nur im Anteil von CD3+ T-Zellen Unterschiede (45%
respektive 53%) , wobei in diesem Fall die Stimulation mit GLEA2 eine geringe
Anreicherung von CD3+ T-Zellen verursacht hat. Allerdings wurde in beiden Proben, sowohl
in den GLEA2-prästimulierten PBLs, als auch in der unstimulierten Negativkontrolle keine
Anreicherung der CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten im unteren Kompartiment erreicht. Der
Anteil der CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen ist sowohl in der Negativkontrolle als auch in der
prästimulierten Probe gestiegen (von 49% auf 59%, respektive von 41% auf 52%). Der Anteil
der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen ist in beiden Proben gleich geblieben.
114
Diskussion
IV. DISKUSSION
1. Humorale Immunantwort bei Patienten mit Gliomen
Aus der Gruppe der durch SEREX entdeckten Antigene, führen nur wenige zur
Antikörperantwort bei Patienten mit astrozytären Tumoren (Schmits et al., 2002; Struss et al.,
2001; Fischer et al., 2001). Pallasch et al. (2004) haben Hinweise auf eine klinische Relevanz
der anti-GLEA2 Autoantikörper bei Patienten mit GBM gefunden. Anti GLEA 2 positive
Patienten zeigen eine signifikant verlängerte Überlebenszeit (17,4 Monate vs. 7,2 Monate bei
anti-GLEA2 negativen Patienten).
1.1.Anti-GLEA2 Antikörperpräsenz in Abhängigkeit von der histopathologischen
Diagnose
Der durchgeführte Nachweis von Antikörpern mittels ELISA bestätigt die von Fischer et al.
(2001) publizierten Ergebnisse. In der Gruppe der primären GBM konnten die anti-GLEA2
Antikörper im Serum von 43,13% Patienten nachgewiesen werden. Bei Fischer et al.(2001)
wurden GLEA 2 Antikörper in 43% aller Seren von Glioblastompatienten nachgewiesen. Da
astrozytäre Gliome anderer WHO-Stadien nur in geringer Zahl repräsentiert waren, war keine
Vergleichsanalyse möglich. Unter Einbezug der sekundären GBMs und der Rezidive (WHO
IV) verminderte sich der Prozentsatz der GLEA 2 positiven Seren bei Glioblastompatienten
auf 32,85%. Unter Einbezug der Astrozytome anderer WHO-Stadien fanden sich 30,12%
GLEA 2 positive Seren (siehe: Ergebnisse, Tab. 2.2.1). Dies weist darauf hin, dass die
humorale Immunantwort gegen das GLEA2-Antigen häufiger bei primären GBM auftritt und
dass die Häufigkeit der Immunantwort gegen GLEA 2 für Patienten mit astrozytären Tumoren
mit dem Tumorgrad steigt. In der Gruppe der Oligodendrogliome und der Mischgliome, die
im Allgemeinen als weniger aggressiv gelten als Glioblastome, war der Prozentsatz der antiGLEA2 positiven Seren allerdings mit 57.14 % höher als im Fall der GBMs.
Bei Analyse dieser Daten müssen zwei wesentlichen Aspekte berücksichtigt werden, nämlich
einerseits die Antigenpräsenz bzw. die Antigenpräsentation und andererseits die Fähigkeit des
Immunsystems das präsentierte Antigen zu erkennen und auf diesen Stimulus zu reagieren.
Untersuchungen zum GLEA2-Antigen von Fischer et al. (2001) und Pallasch et al. (2004)
zeigen eine GLEA2 mRNA von gleicher Größe (7.0 kb) im Tumor-, als auch im gesunden
115
Diskussion
Gewebe. Auch das 115kDa große GLEA 2 Protein wurde nicht nur im Tumorgewebe,
sondern auch in Proteinlysaten aus Hoden, Haut, Plazenta, Dura mater, Muskeln und Niere
nachgewiesen (Pallasch, 2004). Hieraus resultiert die Frage, warum die anti-GLEA2
Antikörper hauptsächlich in Seren von Tumorpatienten und in nur zwei Kontrollen gesunder
Personen nachgewiesen wurden (Fischer et al., 2001; Pallasch et al., 2004). Da in früheren
Untersuchungen die Präsenz von GLEA 2 Protein im Zellkern nachgewiesen wurde
(Pallasch, 2004), stellt sich auch die Frage, wie die nukleären Autoantigene, die
normalerweise als vom Immunsystem geschützt gelten, für diesen System erkennbar werden.
Untersuchungen
zur
Entstehung
von
Autoantikörpern
bei
autoimmunologischen
Erkrankungen zeigen, dass nukleäre Antigene vom Immunsystem nicht vollständig
sequestriert werden, sondern dass beim gesunden Individuum Mechanismen existieren, die
die Entstehung von solchen autoreaktiver Antikörper verhindert (Nakken et al., 2003).
Die intrazellulären Proteine können entweder durch konventionelle Proteosome, die in
meisten Zellen gefunden werden können, oder durch Immunoproteosome, die in reifen, durch
IFNγ-stimulierten dendritischen Zellen vorhanden sind, zu immunogenen Peptiden prozessiert
werden. Über die Antigen-Präsentation an MHC I-Komplexen werden zytotoxische CD8+ TLymphozyten aktiviert. Die Effizienz dieser Antigenpräsentation ist vom Weg abhängig, auf
dem die Proteine prozessiert werden. Konventionelle Proteosome prozessieren beispielsweise
Melan-AMART1 und gp100 und Immunoproteosomen prozessieren MAGE-3 (Van den Eynde,
B. et al, 2001). Voraussetzung für eine effektive Antikörperbildung durch B-Lymphozyten ist
eine CD4+ T-Zellen-Aktivierung. Diese erfolgt über den MHC-II-Komplex auf dem externe
Proteine nach Endozytose, aber auch zelleigene Membran-assoziierte- oder sezernierte
Proteine präsentiert werden. Somit können auch eigene Proteine immunogene Eigenschaften
erwerben (Van der Bruggen et al., 2002). Ob einer dieser Wege für das intranukleare GLEA2Protein genutzt wird, ist jedoch noch zu klären.
In den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimenten wurden Seren von zwei
Patienten untersucht, die mit Verdacht auf GBM operiert wurden, bei denen jedoch nach einer
genauen histopathologischen Untersuchung ein Abszess (G27) und eine Karzinommetastase
(G29) diagnostiziert wurden. Beide Seren waren im ELISA für GLEA2 positiv. Das einzige
Serum in der Gruppe der GBM-Rezidive, dass für GLEA2 positiv war, stammte von einem
Patienten, dessen Tumor in der histologischen Untersuchung einen sehr großen Nekroseanteil
aufwies (G95). Da ausgedehnte Nekrosen zu den wichtigsten morphologischen
116
Diskussion
Charakteristika der Glioblastome zählen, könnte man die Hypothese aufstellen, dass das in
intakten Zellen im nuklearen Kompartment vorhandene GLEA2 Protein durch einen
nekrotischen Prozess den tumor-infiltrierenden Lymphozyten zugänglich wird. Daten von
Zitvogel et al. (1998) sprechen für einen Antigentransfer in den apoptotischen Körperchen zu
den Antigen-präsentierenden Zellen. Zusätzlich könnte das GLEA2 Protein in die zahlreichen
Blutgefässe der Glioblastome gelangen und auf diesem Weg den peripheren Zellen des
Immunsystems präsentiert werden. Nygren et al. konnten erhöhte Antikörpertiter gegen
Myelin Glycolipidsulfat in Seren von Patienten mit Hirntumoren nachweisen (Nygren et al.,
2001). Myelin Glycolipidsulfat ist ein normaler Bestandteil des Myelins des zentralen
Nervensystems
und
erwirbt
seine
immunogenen
Eigenschaften
erst
infolge
von
Gewebsschädigungen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Annahme eines
Antikörperanstiegs nach chirurgischen Eingriffen. Eine ähnliche Hypothese könnte die
Antikörperentstehung gegen auch im gesunden Gewebe vorhandenes GLEA2-Protein
erklären.
In den hier durchgeführten Experimenten konnte ein hoher Prozentsatz an anti-GLEA2
Antikörpern in den Seren von Patienten mit Oligodendrogliomen und Mischgliomen
nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass diese Tumore, trotz einer etwas günstigeren
Prognose, auch zu regressiven Veränderungen in Form von Gefässwucherungen, Blutungen,
Zysten, Nekrosen und Verkalkungen neigen. Dies ist vor allem für anaplastische
Oligodendrogliome charakteristisch (Kleihues et al., 2000).
Eine adäquate Immunantwort wird von zahlreichen lymphozytären Faktoren beeinflusst, wie
einem
Mangel
oder
einer
verminderten
Anzahl
von
T-Helfer
Zellen,
einer
Toleranzentwicklung der T-Zellen gegenüber tumor-assoziierten Antigenen, DownRegulation der Lymphozyten- Aktivierungskaskade, inadäquater Lymphozytenfunktion (v.a.
in Bezug auf Zytokinesis und Lysis, sowie Zytokinproduktion) und aktiver Suppression durch
Suppressor-T-Zellen. Darüber hinaus, kann die Immunantwort von suppressiven Faktoren, die
durch den Tumor produziert sind, wesentlich gehemmt werden (Rosenberg, 2001). Alle diese
Faktoren wurden für astrozytäre Tumore (v.a. für GBM) beschrieben (Didenko et al., 2002;
Dix et al., 1999; Whiteside T., 2002; Morford et al., 1999; Parney et al., 2000) und können in
der adäquaten Immunantwort eine Rolle spielen. Allerdings fand sich gerade bei Patienten mit
hochgradigen Gliomen (GBM WHO Grad IV), der höchste Anteil an GLEA2-positiven Seren.
117
Diskussion
Dies könnte bedeuten, dass im Falle der anti-GLEA2-Antikörper die Antigenquelle und die
Präsentation eine zentrale Rolle spielen.
1.2.Primäre und sekundäre Glioblastome vs. Glioblastom-Rezidive
Das Auftreten von Rezidiven stellt bei Gliomen immer einen ungünstigen prognostischen
Faktor dar und ist mit einem beschleunigten Krankheitsprogress sowie einer verkürzten
Überlebenszeit assoziiert.
Unter den mittels ELISA untersuchten Seren befanden sich 18 Seren von Patienten mit
Tumorrezidiven. Über 78% dieser Seren waren anti-GLEA2 negativ. Die Seren von Patienten
mit Rezidiven primärer GBMs waren immer anti-GLEA2 negativ. Das eine GLEA 2-positive
Serum stammte von einem Patienten mit einem Rezidiv eines sekundären Glioblastoms, das
einen großen Nekroseanteil aufwies (G95). Die anderen anti-GLEA2 positiven Seren
stammten von Patienten mit Rezidiven von Oligodendrogliomen und Oligoastrozytomen
sowie von einem Patienten mit einem atypischem Gliom nach ALL. Nur bei diesem Patienten,
sowie im Fall des nekrosereichen Tumors G95 hat eine sichere Serokonversion stattgefunden.
Das Fehlen einer humoralen Immunantwort gegen GLEA 2 bei Rezidiven könnte entweder
mit Antigenverlust während der Tumorprogression oder mit einer progredienten Insuffizienz
des Immunsystems in Hinsicht auf die Antigenpräsentation- und erkennung assoziiert sein.
Eine alternative Hypothese postuliert, dass der Abfall von freien Antikörper parallel zum
Anstieg der Antigenlast verläuft. In diesem Fall werden die Antikörper in Immunkomplexe
gebunden und können nicht mehr durch die verwendeten Methoden erfasst werden (Vlock et
al., 1985). Diese Hypothese könnte unter anderem einen Abfall der anti-GLEA2
Antikörperfrequenz bei Patienten mit Glioblastom-Rezidiven erklären.
Zahlreiche Untersuchungen befassen sich mit der prognostischen Bedeutung der gegen
Tumorantigene gerichteten Antikörper. Für Melanoma- assoziierte Antigene konnte bereits
eine Korrelation zwischen zirkulierenden Antigen-Antikörper Immunkomplexen und
Tumorprogression bzw. Rezidiven nachgewiesen werden. Die Präsenz von Antikörpern
wurde als hochsensitiver Marker für eine Residualerkrankung beschrieben (Vlock et al.,
1986). Bei Patienten mit Ösophaguskarzinomen wurde anti-p53 Antikörper mit einem
erhöhten Rezidivrisiko und einer schlechten Prognose assoziiert (Shimada et al., 2002). In
diesem Fall wurde eine postoperative Antikörperpersistenz oder eine später Serokonversion
118
Diskussion
mit dem Auftreten von Rezidiven korreliert. Martin-Achard et al. haben Seren von Patienten
mit Gliomen und anderen Hirntumoren auf die Präsenz von Immunkomplexen untersucht und
letztere mit einer schlechteren Prognose korreliert (Martin-Achard et al., 1980). Ähnliche
Korrelationen wurden für andere maligne Erkrankungen wie Leukämien, Mamma- und
Bronchialkarzinome beschrieben (Carpentier et al., 1977; Hoffken et al., 1977; Rossen et al.,
1977).
Allerdings gibt es auch Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen zirkulierenden
Antikörpern und einem günstigen Verlauf der Tumorerkrankung. Ein solcher Zusammenhang
konnte unter anderem für anti-MUC1 IgG Antikörper in Pankreastumoren, sowie in
Mammakarzinomen nachgewiesen werden (Hamanaka, Y. et al., 2003). Ein entsprechender
Zusammenhang wurde darüber hinausfür das in der vorliegenden Dissertation untersuchte
GLEA2-Protein festgestellt (Pallasch et al., 2004). Mechanismen für einen möglichen
protektiven Charakter der humoralen Immunantwort bei Tumorerkrankungen sind jedoch
nicht bekannt. Es ist unwahrscheinlich, dass die Antikörper selbst an der aktiven
Tumorbekämpfung beteiligt sind. Sie stellen wahrscheinlich eher einen messbaren Ausdruck
anderer immunologischer Prozesse dar, in denen zelluläre Abwehrmechanismen involviert
sind.
2. Proliferation von PBLs (peripheral blood lymphocytes) als Antwort auf die
Stimulierung mit GLEA2-Protein
PBLs (peripheral blood lymphocytes) von Patienten mit Gliomen unterschiedlichen
histologischen-
und
WHO-Grades,
sowie
mit
unterschiedlichem
anti-GLEA2
Antikörperstatus, wurden mit GLEA2-Protein (1 μg/ml) und niedrigdosiertem IL-2 (150
U/ml) stimuliert. Die Antwort der PBLs wurde mittels kolorimetrischen WST-Assay
gemessen
und
die
Veränderungen
innerhalb
der
PBLs-Subpopulationen
mittels
Durchflusszytometrie überprüft.
2.1. WST-Proliferationsassay
Die durchgeführten Experimente zeigen eine Proliferation in über 77% der stimulierten
Proben. Dieses Ergebnis könnte auf das Vorhandensein einer Prä-Immunität gegen GLEA2119
Diskussion
Antigen, welche durch sogenannte Gedächtnis-T-Zellen vermittelt wird, hinweisen. Diese
Subgruppe der CD4+ oder CD8+ T-Zellen ist zur Expansion direkt nach einem erneuten
Kontakt mit einem immunogenen Protein fähig. Sie zeigt eine höhere Zellteilungs- und
geringere Apoptoserate sowie eine schnellere und effizientere Differenzierung zu aktivierten
Effektoren (Janeway, C.A., Immunologie; Lalvani, B.a. et al., 1997).
Die in der vorliegenden Arbeit erbrachten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PBLs in der
Mehrzahl der untersuchten Fälle zuvor einen Kontakt zu GLEA2 oder seinen Epitopen in vivo
hatten, was eine sofortige verstärkte proliferative Bereitschaft bereits nach einer in vitro
Stimulation ermöglichte. In zwei Fällen war der Proliferationsgrad bei Stimulation durch
GLEA 2 höher als nach der Stimulation mit Staphylokokkus Enterotoxin B (SEB), das für
seine starke Aktivierungspotenz bei einem breiten Spektrum von PBLs bekannt ist (Janeway,
C.A., Immunologie). In zwei weiteren Fällen fand sich ein vergleichbarer Proliferationsgrad
bei Stimulation mit GLEA 2 und bei den mit SEB stimulierten Positivkontrollen.
Möglicherweise wird GLEA 2 durch ähnliche Mechanismen, wie SEB am MHC II-Komplex
präsentiert. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass die SEB-Präsentation
keine intrazelluläre Prozessierung erfordert und auch die PBLs-Stimulation im durchgeführten
WST-Assay ohne vorherige spezifische Antigenbeladung von APCs und nur durch eine
einfache Antigenzugabe in das Kulturmedium erfolgte.
Eine erhöhte Proliferation wurde in 80% der PBL-Proben nachgewiesen, für die anti-GLEA2Antikörper in Patientenserum vorhanden waren. Allerdings, nicht für alle Proben mit einer
proliferativen Antwort auf GLEA2-Antigen konnten gleichzeitig anti-GLEA2-Antikörper
nachgewiesen werden. Diese Beobachtung könnte suggerieren, dass die Stimulation nicht nur
die humorale Immunantwort hervorruft, sondern auch die anderen Komponenten der
Immunantwort einbezieht.
2.2.Immunophenotypische Charakterisierung der proliferierenden PBLs
Um die proliferierenden PBL-Subpopulationen näher zu charakterisieren, wurde eine
durchflusszytometrische Charakterisierung durchgeführt. Diese Analyse zeigte, dass eine in
vitro Stimulation mit GLEA2-Protein zu keiner wesentlichenAktivierung von CD3+ T-Zellen
führte. Allerdings konnten Expansionen für CD3-/CD16+56+ NK und CD3+/CD16+56+
NKT-Zellen beobachtet werden.
120
Diskussion
Offen bleibt in dem Zusammenhang die Frage nach den Mechanismen der Antigenerkennung
durch NK- bzw. NKT-Zellen. Bis heute wurden zwar zahlreiche NK-Zellrezeptoren
beschrieben (Moretta et al., 2001; Multhoff, 2002), es liegen aber keine ausreichenden
Informationen über Liganden, die mit diesen Rezeptoren interagieren, vor. Zahlreiche in vitro
Experimente konnten eine Aktivierung von NK-Zellen, sowie eine Expansion und starke
lytische Eigenschaften nach Inkubation mit hochdosiertem IL-2, sowie IL-12 und IL-15
zeigen (Lehmann et al., 2001). Darüber hinaus wurden mittels IL-2 stimulierten NK-Zellen in
den experimentellen und in den ersten klinischen Versuchen zur adoptiven Immunotherapie
eingesetzt (Friese et al., 2003, Rosenberg et al., 1985; Rosenberg et al., 1987). Aufgrund der
erhobenen Daten wurden die NK-Zellen als Komponente der unspezifischen zellulären
Immunantwort eingestuft. Erste Ansätze zu einer anderen Klassifizierung ergaben sich durch
die Entdeckung einer spezifischen NK-Zell-Aktivierung durch das zellmembranspezifische
Hitze Schock Protein Hsp70, sowie das immunogene Peptid TKD (Multhoff, 2002; Multhoff
et al., 2001; Multhoff et al., 1999, Multhoff et al.,1997). Die in der vorliegenden Dissertation
dargestellten Daten liefern Hinweise, dass das GLEA2-Protein einen Stimulus für CD3/CD16+56+ NK-Zellen darstellen könnte.
Nach Stimulierung mit GLEA 2 wurde eine erhöhte Proliferation der CD3+/CD16+56+ NKTZellsubpopulationen in 3 PBL-Proben gefunden. Es ist bekannt, dass die NKT-Zellen auf die
Aktivierung durch auf dem atypischen MHC-I Molekül CD1d präsentierte Lipide,
Glykolipide und hoch hydrophobe Peptide reagieren (Porcelli et al., 1999; Park et al., 2000).
Die bisher publizierten Daten konzentrieren sich hauptsächlich auf den Mechanismus der
Aktivierung durch α- und β-Galaktoceramide (Ortaldo et al., 2004; Fujii et al., 2003; Rogers
et al., 2004). Hoch glykosiliertes MUC1 Mucin kann eine ex vivo Expansion der
CD8+CD56+ und CD8+CD56- NKT-Zellen hervorrufen (Wajchman et al., 2004). Bei der
beobachteten
NKT-Zell-Expansion
nach
Stimulation
mit
GLEA2-Protein
spielt
möglicherweise die Struktur des GLEA2- Proteins eine zentrale Rolle.
Es ist zusammenfassend festzuhalten, dass die meisten PBLs wahrscheinlich schon in vivo
einen Kontakt mit dem GLEA2 Protein hatten, was die und deutliche Expansion nach einer in
vitro Stimulation erklären würde. Die am stärksten proliferierenden Zellen wiesen NK- und
NKT-Zell-Merkmale auf.
121
Diskussion
3. Veränderungen
innerhalb
der
PBL-Subpopulationen
im
Laufe
der
Restimulationen mit GLEA2-Protein
Die immunologische Stimulation ist von vielen Faktoren abhängig, die sich grob in 2
Gruppen unterteilen lassen. Die erste Gruppe stellt die Antigen-abhängigen Faktoren dar, die
durch die Art des Antigens und seine Präsentationsmöglichkeiten bestimmt sind. Zur zweiten
Gruppe gehören alle potentiellen Effektor-abhängigen Faktoren, die den Ablauf der
Stimulation beeinflussen.
In der vorliegenden Dissertation wurde das GLEA2-Protein auf seine Eigenschaften als
Immunogen untersucht. Um ein möglichst breites Spektrum der potentiellen Veränderungen
zu erfassen, wurde ein in vitro System ausgewählt, in dem die PBMCs (peripheral blood
mononuclear cells) direkt mit gelöstem GLEA2-Protein inkubiert wurden. Dieses Vorgehen
ermöglichte Bedingungen zu schaffen, unter denen alle Subpopulation erfasst werden, ohne
das eine besondere Subpopulation durch eine gezielte Antigenpräsentation favorisiert wäre.
Das einzige zum Kulturmedium zugegebene Zytokin war Interleukin-2, das für annähernd alle
PBLs-Subpopulationen zum Erhalten ihrer Vitalität und zur Ausübung ihrer Funktionen, vor
allem unter in vitro Bedingungen unentbehrlich ist.
3.1.
CD3+/CD16-56- T-Zellen
Für eine effiziente T-Zellstimulation ist eine Antigenpräsentation im Kontext der MHC-II
bzw. MHC-I Moleküle unentbehrlich. Das dem Kulturmedium zugeführte GLEA2-Protein
kann durch die MHC-II-exprimierenden antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen und
prozessiert werden. Dieser Prozess wird jedoch unter den ausgewählten experimentellen
Bedingungen durch die begrenzte Anzahl der APCs und dem relativen Mangel an zur
effektiven Antigenpräsentation notwendigen kostimulatorischen Zytokinen (Zhou et al., 2002,
Feuerstein et al., 2000) wesentlich erschwert. Eine effektive Stimulierung der CD8+ T-Zellen
durch die Antigene erfolgt im wesentlichen nach einer Antigenpräsentation über den
endogenen MHC-I-Präsentationsweg. Ein potentielles „cross-priming“ der CD8+ T-ZellAntwort ist zwar möglich, aber deutlich weniger effizient als eine direkte Antigenpräsentation
durch die Tumorzellen (Van der Bruggen et al., 2006; Groothuis et al., 2005; Rock et al.,
122
Diskussion
1990; Rock et al., 1993; Harding, 1996; Martinez-Kinader et al., 1995; Norbury et al., 1995,
Guilloux et al., 2001).
Die durchgeführten Experimente führten nur zu einer sehr geringen Erhöhung des
Prozentsatzes an CD3+/CD16-56- T-Lymphozyten. Der nach einer Stimulierung beobachtete
Anstieg der T-Zellen in 2 PBL-Proben ist nach Restimulationen nicht mehr beobachtet. PBLProbe G77 wurde mittels BLCL als antigenpräsentierende Zellen stimuliert. Auch in diesem
Fall wurde keine Immunantwort für die CD3+ T-Zellen nachgewiesen. Die mit
Staphylokokkus Enterotoxin B (SEB) stimulierten Positivkontrollen zeigten dagegen eine
deutliche Expansion der T-Zellen.
Die in vivo beobachtete und mittels ELISA gemessene anti-GLEA2 Antikörperpräsenz könnte
auf die Beteiligung der T-Lymphozyten und der durch sie sezernierten Lymphokine (v.a.IL-1,
IL-4, IL-5 und IL-6) an der Entstehung einer effektiven humoralen Immunantwort hindeuten.
Allerdings kann die B-Zell-Aktivierung auch in Abwesenheit von T-Zellen nach Kontakt mit
den sogenannten T-unabhängigen Antigenen stattfinden. Da die in vitro durchgeführten
Stimulierungsexperimente nur eine schwache T-Zell-Antwort zeigten und die mittels ELISA
gemessenen anti-GLEA2 Antikörpertiter relativ niedrig waren (die verwendete SerumKonzentration war 1:100), könnte man das GLEA2-Antigen als schwach immunogen
bezeichnen. Gleichzeitig wurde jedoch nach wiederholten Restimulationen eine deutliche
Immunantwort in Form von CD3-/CD16+56+ NK- und CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen
festgestellt.
3.2.
CD3-/CD16+56+ NK- und CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen
Die erhobenen Daten zeigen, dass innerhalb der mit GLEA2-stimulierten PBLs die CD3/CD16+56+ NK-Zellen die prädominante Subpopulation darstellen. Es liegen zahlreiche
Daten zu NK-Zell-induzierbaren Zytokinen, wie IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, jedoch
nur wenige Daten zu den NK-Zell-stimulierenden Antigenen (Multhoff et al., 1997; Multhoff
et al., 2001) vor. Die Aktivierung von NK-Zellen findet auf MHC-unabhängigen Weg statt
und kann durch eine eventuelle MHC-Expression unterdrückt werden (Borrego et al., 1998).
Die Stimulation und Aktivierung der NK-Zellen durch GLEA2 ist von MHC-I und –II
Präsentationen unabhängig, da gelöstes GLEA2-Protein als Stimulus verwendet wurde.
Unklar bleibt allerdings der Weg, auf dem das GLEA2-Protein durch die NK-Zellen erkannt
123
Diskussion
wird. Rezeptoren, die wie im Falle des Hsp70-Proteins das GLEA2-Protein erkennen würden,
sind bisher nicht bekannt (Multhoff et al., 2001; Multhoff, 2002). Überlegenswert ist die Rolle
des IL-2 Zytokins in der Stimulation. Die gut beschriebenen LAK (lymphokine activated
killer cells) stimulierenden Dosen von IL-2 betragen über 1000 U/ml (Quan et al., 2005;
Margolin, 2000; Rosenberg et al., 1985). Es wurden allerdings zwei Subpopulationen von
NK-Zellen beschrieben, nämlich die sogenannten CD56dim NK-Zellen, die IL-2R
(Interleukin 2-Rezeptoren) von mittleren Affinität exprimieren und zur effektiven Stimulation
hochdosiertes IL-2 benötigen, sowie die sogenannten CD56 bright NK-Zellen, die eine hohe
CD56 Expression und gleichzeitig eine hohen IL-2R (Interleukin 2-Rezeptor) Expression
aufweisen und bereits auf niedrige IL-2 Konzentrationen reagieren (Carson et al., 1995). Die
Analyse von CD25 (IL-2R) zeigte in der überwiegenden Anzahl der Proben keine
wesentlichen Unterschiede der IL-2R Expression (CD25 positive Zellen) und der IL-2R
Dichte auf der Zelloberfläche (CD25 mean) zwischen GLEA2-stimulierten Zellen und
Negativkontrollen (d.h. nur mit IL-2 stimulierten Zellen). Gleichzeitig konnte jedoch für 3
Proben ein erhöhter Prozentsatz an NK-Zellen gezeigt werden. Daraus könnte man schließen,
dass diese NK-Zellen eine geringe IL-2R-Expression aufweisen und nur auf hochdosiertes IL2 proliferativ antworten können. Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese über einen
stimulierenden Einfluss von GLEA2-Protein auf NK-Zellen.
IL-2 aktivierte NK-Zellen werden aufgrund ihrer zytotoxischen Eigenschaften gegenüber den
Tumorzellen als sogenannte Lymphokin-aktivierte NK-Zellen (LAK) beschrieben. Die auf
der Oberfläche von NK-Zellen vorhandenen FcγRIII-Rezeptoren (CD16 Molekül) binden die
IgG1 oder IgG3 Antikörper und lösen so eine zytotoxische Kaskade aus (Lannier et al., 1988).
Dies könnte auf eine Verknüpfung zwischen der beobachteten humoralen Immunantwort
gegen das GLEA2-Protein und der proliferativen Antwort der NK-Zellen hinweisen. Nach der
durchgeführten in vitro Stimulation von PBLs mit dem GLEA2-Protein konnte allerdings
keine Korrelation zwischen der Stimulierbarkeit der NK-Zellen und Antikörperpräsenz
beobachtet werden.
Unter den mit GLEA2-Protein stimulierten PBLs wurde ein wesentlicher Anteil an
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen gefunden. NKT-Zellen gehören zwar zu dem Zellrepertoir des
angeborenen Immunsystems, sie spielen aber auch eine wesentliche regulatorische Rolle für
124
Diskussion
die gesamte erworbene Immunität (Godfrey et al. 2000). Durch die Sezernierung von
zahlreichen Zytokinen (unter anderen IL-4, IL-10, IL-13, TGFβ und GM-CSF) beeinflussen
sie die Immunantwort der CD4+ und CD8+ T-Zellen. Abhängig von der Art der sezernierten
Zytokine erwerben die CD4+ T-Zellen einen Th1-Phenotyp, wie es unter anderem für IFNγ
bekannt ist bzw. durch die IL-4-Produktion einen Th2-Phenotyp. Da die Th2-Lymphozyten
für eine effektive humorale Immunität unentbehrlich sind, spielen die NKT-Zellen für eine
Antikörperbildung eine wichtige Rolle. Die Beeinflussbarkeit der NKT-Zellen durch GLEA2Protein ist insbesondere vor dem Hintergrund interessant, dass 30 % aller Gliompatienten
anti-GLEA2-Antikörper besitzen.
Die Zunahme von NKT-Zellen wird von einem Anstieg von NK-Zellen begleitet (siehe:
Ergebnisse, Kap.4.). Es gibt Hinweise, dass die NKT-Zellen auch Proliferation und
Zytotoxizität der aktivierten NK-Zellen positiv beeinflussen. Carnaud et al. haben nach in
vivo Injektion von NKT-stimulierenden α-GalCer eine signifikante NK-Zellen Aktivierung
beobachtet (Carnaud et al., 1999). Eberl et al. haben die Hypothese aufgestellt, dass durch
Pathogen-assoziierte Antigene oder durch Tumor-assoziierte Antigene stimulierte NKTZellen selektiv die Proliferation, Zytotoxizität und die IFNγ-Produktion von NK-Zellen
fördern können. In diesen Experimenten wurde nur eine geringe Stimulation der T- und BLymphozyten beobachtet (Eberl et al., 2000). In den für die vorliegende Dissertation
durchgeführten Experimenten wurde für keine der untersuchten Proben ein paralleler Anstieg
der NK und T-Zellen beschrieben.
4. Funktionelle
Fähigkeiten
der
mit
GLEA2-Protein
stimulierten
PBMCs
(peripheral blood mononuclear cells)
4.1. Die frühe Interferon-gamma (IFNγ)-Produktion nach einmaliger Stimulation
mit GLEA2-Protein
Mit den durchgeführten Experimenten sollte eine mögliche frühe IFNγ-Produktion der durch
GLEA2-stimulierten PBLs untersucht werden. Die durchflußzytometrischer Analyse der
doppelt-positiven IFNγ/CD69-Zellen zeigte nach Stimulierung keine wesentliche IFYγProduktion. Es ist bekannt, dass für die IFNγ-Produktion v.a. Th1-CD4- sowie zytotoxische
CD8-T-Zellen (CTLs) verantwortlich sind. Diese T-Zell-Subpopultionen reagieren auf die
125
Diskussion
Antigen-Präsentation in MHC Klasse I (CTLs) und Klasse II (Th1-T-Zellen) Komplexen. Die
Effektivität dieser Präsentation ist sowohl von der Antigenprozessierung durch die APCs als
auch von der Dichte der an ihrer Oberflächen präsentierten Peptide abhängig. Peptide, die in
einer hohen Dichte auf der Oberfläche der APCs präsentiert werden, stimulieren eher eine
Th1-Zell-Antwort, während eine niedrige Peptiddichte eher Th2-Zell-Antwort hervorruft. Die
weitere Differenzierung hängt von der Stärke der Antigenwechselwirkung mit dem T-ZellRezeptor ab. Eine starke Bindung führt zur Th1- und eine schwache zur Th2-T-ZellRekrutierung. Sowohl die niedrigen (1 und 5 μg/ml) als auch die höheren (10 und 20 μg/ml)
GLEA2-Protein-Konzentrationen bewirken allerdings keine IFNγ- Produktion durch die
gesamte T-Zell-Population.
IFNγ wird auch durch NK-Zellen produziert, unabhängig von der MHC Klasse I oder Klasse
II Antigenpräsentation. Eine weitere Analyse der IFNγ- Produktion durch die gesamte PBLs
erbrachte allerdings keinen Anstieg an gemessenem Zytokin. Eine effektive IFNγ- Produktion
durch NK-Zellen benötigt jedoch eine Unterstützung von weiteren Zytokinen wie IL-12,
TNFα, IFNα und IFNβ, die nach einer kurzen Stimulation in einem in vitro-System nicht
gewärleistet wurde.
4.2.
Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 nach der Stimulation
mittels GLEA2-Protein
Mittels Durchflusszytometrie wurde auch die CD69-Expression ohne Bezug auf die IFNγProduktion analysiert. CD69 wird in den ersten Stunden nach der Stimulation durch
unterschiedliche PBL-Subpopulationen exprimiert und bleibt nur kurzfristig an der
Zelloberfläche erhalten, Deswegen ist dieser Marker nur für die neu aktivierten Immunzellen
charakteristisch.
Nach Stimulierung konnte eine CD69-Expressionserhöhung in 4 PBLs-Proben von GliomPatienten und der PBLs-Probe eines gesunden Probanden nachgewiesen werden (siehe:
Ergebnisse, Kap.5.2.). Da diese CD69-exprimierenden Zellen kein oder nur eine geringe
Menge von IFNγ produzierten, kommen auch andere PBLs-Subpopulationen, die kein IFNγ
produzieren, als auf GLEA2-Protein reagierende Zellen in Betracht. Um die Auswahl der
Zellen auszuweiten, wurde in der folgenden Analyse statt eines PBL/CD4+ Gatings ein PBLsGating durchgeführt und der Anteil der CD69-exprimierenden PBLs mit dem Anteil der
126
Diskussion
CD69-exprimierenden CD4-Zellen verglichen. Bei drei getesteten Proben fanden sich
zwischen den 2 Arten von Gating Unterschiede in der CD69-Expression. Dies zeigt einen
Anteil an CD69+CD4-PBLs an, der NK oder doppelnegative (CD4-CD8-) NKT-Zellen
repräsentieren kann.
4.3.
Interferon-gamma (IFNγ)-, Tumor necrosis factor alpha (TNFα)- und
Interleukin 4 (IL-4)- Produktion im Laufe der wiederholten Stimulationen mit
GLEA2-Protein
Um die im Laufe der Stimulierung mit GLEA2-Protein aktivierten PBLs näher zu
charakterisieren, wurde die Produktion weiterer Zytokine, wie IL-4, TNFα und spät
sezerniertem IFNγ gemessen (siehe: Ergebnisse, Kap.6).
IL-4 (Interleukin 4) wird hauptsächlich durch aktivierte CD4+ Th2 T-Zellen, Mastzellen und
Basophile produziert. IL-4 stimuliert Wachstum und Differenzierung und beeinflusst die
Vitalität bestimmter B- und T-Zell-Subtypen. Das in der frühen Aktivierungsphase sezernierte
IL-4 fördert die Entwicklung des Th2-Subtyps aus den undifferenzierten CD4+-Zellen und
hemmt gleichzeitig die Differenzierung in Richtung auf Th1-Zellen. Dadurch wird die
humorale Immunantwort deutlich unterstützt und die zelluläre im gewissen Ausmaß
gehemmt. IL-4 erhöht unter anderem auch die MHC II Expression auf der B-Zell-Oberfläche
und
stimuliert
B-Zellen
zur
Bildung
von
Antikörpern.
Die
deutliche
IL-4
Produktionserhöhung in den gemessenen PBLs-Proben könnte auf eine Th2-Zellen
Aktivierung und somit eine Verschiebung der Immunantwort in Richtung der ebenso gegen
GLEA2-Antigen gerichteten humoralen Immunantwort hindeuten.
Das zur Bildung von Th2-Zellen benötigte IL-4 stammt möglicherweise von den
CD3+/CD16+56+ NKT-Zellen, die als eine der PBLs-Subpopulation in den durchgeführten
zytometrischen Analyse nachgewiesen wurden. Da die NKT-Zellen entweder CD4+ oder
auch CD4-/CD8- sein können, könnte dies die Ergebnisse des unterschiedlichen GatingVerfahren, wie z.B. den Anstieg der CD69-Expression nach Ausweitung des Gatings auf
CD4-negative Zellen erklären. Bis heute wurden nur wenige Antigene beschrieben, die mit
CD1d-Rezeptoren interagieren (Wajchman et al., 2004; Rogers et al., 2004) und die NKT-
127
Diskussion
Zellen in Richtung der Th2-Zytokine polarisieren (Burdin et al., 1999; Singh et al., 1999). Ob
GLEA2 ein solcher Antigene representieren könnte, benötigt weitere Abklärung.
4.4.
Migrationfähigkeit der stimulierten PBMCs gegen das aufgelöste GLEA2-
Protein
Die lange herrschende Theorie der Isolation des zentralen Nervensystems (ZNS) gegenüber
Immunzellen hat heutzutage ihre Geltung verloren (Parney et al., 2000; Streit et al., 1995;
siehe auch: Einleitung, Kap.3.1). Die Blut-Hirn-Schranke ist bei vielen pathologischen
Prozessen aufgehoben. Eine Verbindung zwischen zerebrospinaler Flüssigkeit und den
zervikalen Lymphknoten stellt eine unmittelbare Quelle für Lymphozyten dar. Darüber hinaus
sind viele Tumore des ZNS (v.a. Glioblastoma multiforme) durch eine vermehrte
Gefäßneubildung gekennzeichnet. Eine direkte Interaktion des Immunsystems mit dem
Hirngewebe, zeigen auch Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) an, die in der
unmittelbaren Nachbarschaft des Tumorgewebes mehrfach nachgewiesen wurden (Strik et al.,
2004; Sawamura, 1991; Bucciero et al., 1990;
Vakzinierungsexperimente
mit
Peptid-beladenen
Stevens et al., 1988). Auch die ersten
dendritischen
Zellen
führten
zur
intrakraniellen Infiltration durch die T-Zellen (Yu et al., 2001).
Zahlreiche Zytokine wie z.B. TNFα, IL-2, IL-8, IFNγ-induzierbares Protein 10 (IP-10), sowie
durch Gliom-Zellen exprimierte Chemokine (unter anderem LARC, TARC, SCM-1alpha,
RANTES, Fractalkine, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β) wurden als Migrations-induzierende
Stimuli für PBLs beschrieben (Janeway, „Immunologie“; Kimura et al., 2002; Gutman et al.,
2001; Oh et al., 1999; Taub et al., 1995; Desbaillets et al., 1994; Pleass et a., 1994;
Maghazaki, 1991). Sie werden in situ durch den Tumor sezerniert und besitzen außer
chemotaktischen Eigenschaften für die entsprechenden Leukozyten-Subpopulationen, auch
zahlreiche Wachstum-induzierende und T-Zell-aktivierende Funktionen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Fähigkeit der mittels GLEA2-Protein stimulierten PBLs
zur Migration in Richtung des gelösten GLEA2-Proteins untersucht (siehe auch Ergebnisse,
Kap.7).
Die durchgeführten Experimente zeigten, dass das gelöstes GLEA2-Protein ein Stimulus für
PBLs darstellen kann und dass die Migration mit der Prä-Stimulation der PBLs mit GLEA2128
Diskussion
Protein korreliert. Unter den unstimulierten Zellen konnte lediglich eine schwache Migration
gemessen werden. Es ist bekannt, dass zahlreiche Zytokine (unter anderen IL-2) die
Expression von Chemokin-Rezeptoren induzieren können. Dieser Effekt ist jedoch ohne
kostimulatorische Signale sehr schwach (Ward et al., 1998). Darüber hinaus ist eine
Chemokin-induzierte Mobilisation der NK-Zellen beinahe auszuschließen, da in den unteren
Teil der Transwell-Platte keine weiteren Stimuli außer GLEA2-Protein zugegeben wurden.
Die immunophenotypische Charakterisierung der migrierten Zellen zeigte einen großen Anteil
an CD3-/CD16+56+ NK-Zellen. Die NK-Zellen exprimieren CD94-Oberflächenmoleküle, die
nur auf aktivierten NK-Zellen vorhanden sind (Gross et al., 2003). Daraus lässt sich
schließen, dass die Stimulierung mit GLEA2-Protein und IL-2 zu einer spezifischen
Aktivierung der NK-Zellen führt. Interleukin-2 alleine konnte diesen Effekt nicht hervorrufen,
da dieses Zytokin nur in niedrigdosierten Konzentrationen (150 U/ml) verwendet wurde.
Der ausgeprägte Anteil spezifisch aktivierter NK-Zellen stehen im Widerspruch zu den bis
jetzt veröffentlichten Daten, nach denen sich unter den Gliom-infiltrierenden PBLs
hauptsächlich CD3+ T-Zellen (Sawamura, 1991) und nur in vereinzelten Fällen CD16+56+
NK-Zellen befinden (Sawamura, 1991; Vaquero et al., 1989; Stevens et al., 1988). Allerdings
wies eine andere Studie von Lisianyi et al. eine NK-Zell-Aktivität im peripherem Blut von
Patienten mit Hirntumoren nach (Lisianyi et al., 1988). Bucciero et al. konnten eine
signifikante Überlebenszeitverlängerung in der Gruppe der Gliom-Patienten nachweisen, bei
denen eine lymphozytäre Tumorinfiltration beobachtet worden war (Bucciero et al., 1990).
Vaquero et al. konnten zwar eine NK-Zellen Präsenz unter Glioblastom-infiltrierenden
Lymphozyten nachweisen, allerdings ohne Einfluss auf die Überlebenszeit der Patienten
(Vaquero et al., 1989). Für andere Tumorarten, wie z.B. Kolon- oder Lungenkarzinome sowie
für AML (akute myeloische Leukämie) wurde allerdings ein positiver Effekt der mit IL-2
oder Hitze-Schock-Protein 70 (Hsp-70) stimulierten NK-Zellen in einem in vitro System
beschrieben (Lehmann et al., 2001; Ruggeri et al., 2002; Gehrmann et al., 2003; Krause et
al., 2004). Durch Stimulation mittels eines Hsp-70 abgeleiteten Peptids wurden die
zytotoxischen Eigenschaften der NK-Zellen signifikant erhöht (Multhoff et al., 1999).
Es liegen zahlreiche Daten zu NK-Zell-induzierbaren Zytokinen, wie IL-2, IL-8, IFN-gamma
und TNF-alpha vor. Weniger ist über andere Stimuli, die eine Rekrutierung von NK-Zellen
fördern würden, bekannt. CC-Chemokin MIP-3alpha (macrophage inflammatory protein3alpha), MIP-3beta (macrophage inflammatory protein-3beta) und CX3C- Chemokin
129
Diskussion
Fractalkine induzieren die Chemotaxis der Interleukin-2 (IL-2)-aktivierten NK-Zellen (AlAoukaty et al., 1998). Andere Studien konnten eine Aktivierung und Rekrutierung der NKZellen durch Hsp70-abstammendes TKD-Peptid zeigen (Multhoff et al., 1997; Multhoff et al.,
2001). Die Spezifität dieser Aktivierung wurde von Gastpar et al. (2004) mit Migrationsassay
nachgewiesen.
Die Daten der vorliegenden Dissertation zeigen die Aktivierung von NK-Zellen und ihre
Migrationsinduktion durch das GLEA2-Antigen. Der Mechanismus dieser Aktivierung bleibt
unklar. Der Einfluss von GLEA2 auf die Stimulation und die Aktivierung der NK-Zellen
scheint unabhängig von MHC-I und –II Präsentation zu sein, da in den durchgeführten
Experimenten gelöstes GLEA2-Protein als Stimulus verwendet wurde. Da die malignen
Tumore oft eine verminderte MHC-I Expression zeigen (Gilboa, 1999), stellt ein MHCunabhängiger Aktivierungsweg der immunkompetenten Zellen ein mögliches Model für
weitere Untersuchungen dar.
4.5. Migrationfähigkeit der stimulierten PBMCs gegen Zellkulturüberstände der
autologen GBM-Zellkulturen
Es ist bekannt, dass Astrozyten die Hauptquelle der Chemokinproduktion in entzündlichen
oder neoplastischen Prozessen des ZNS bilden (Kielian et al., 2002; Sasaki et al., 2001; Oh et
al., 1999; Ishii et al., 1998; Desbaillets et al., 1994; Gauthier et al., 1993; Van Meir et al.,
1992; Van Meir et al., 1990). Chemokine wurden sowohl in vivo im Liquor als auch in vitro
im Zellkulturmedium nachgewiesen (Desbaillets et al., 1994). Auch die Freisetzung von
Zellmembran-gebundenen oder intraplasmatischen Proteinen, wie z.B. Hsp70, wurde
nachgewiesen (Evdonin et al., 2004; Guzhova et al., 2001).
Das in der vorliegenden Dissertation untersuchte GLEA2-Protein wurde bereits in den
Vorarbeiten auf die Expression sowohl im Hirngewebe als auch in den GBM-Zellkulturlinien
untersucht und in allen Proben nachgewiesen (Pallasch, 2004). Gastpar et al. haben bereits
die Migration der TKD-prestimulierten NK-Zellen sowohl gegen die Hsp-70 exprimierte
CX+-Zellkulturen als auch gegen die Zellkulturüberstände nachgewiesen und haben
unabhängig von dem verwendeten Stimulus (Zellkultur vs. Zellkulturüberstand) vergleichbare
Ergebnisse erhalten (Gastpar et al., 2004). Vorausgesetzt, dass das GLEA2-Protein in das
130
Diskussion
Zellkulturmedium sezerniert wird, wurde hierzu ein Migrationsassay der PBLs gegen die
Zellkulturüberstände der autologen GBM-Zellkulturen durchgeführt.
Für 2 PBLs-Proben war der Prozentsatz der spezifisch migrierten Zellen nach Stimulation mit
GLEA2 und IL2 größer als in der Negativkontrolle (siehe: Ergebnisse, Kapitel 7.2). Nach
einer
4-stündigen
Koinkubation
konnte
eine
spezifische
Migration
gegen
einen
Zellkulturüberstand festgestellt werden. Es ist bekannt, dass eine Stimulation mit IL-2 eine
Expression von unterschiedlichen Chemokin-Rezeptoren wie z.B. CCR1, CCR2, CCR5,
CXCR4 und CX3CR1 induzieren kann. Durch kostimulatorische Signale, wie GLEA2Protein, könnte eine Hochregulierung der Chemokin-Rezeptor-Expression verursacht werden.
Dies könnte die größere migratorische Kapazität in 2 der 3 GLEA2-prästimulierten PBLs
erklären (Ward et al., 1998). Beide Proben stammen von Patienten mit anti-GLEA2-positiven
Antikörperstatus. Für die PBLs-Probe eines Patienten mit negativem anti-GLEA2Antikörperstatus (G85) konnte keine Erhöhung der Migrationsrate gezeigt werden (siehe:
Ergebnisse, Kap. 7.2). Dies könnte bedeuten, dass eine effektive Antwort auf in vitro
Stimulation nur bei PBLs erreicht werden kann, die bereits in vivo Kontakt zum genannten
Antigen gehabt haben. Für eine der Proben (G78) wurde bereits nach 3 Stimulationen eine
spezifische Migration gegen das aufgelöste GLEA2-Protein nachgewiesen und die migrierte
Subpopulation als CD3-/CD16+56+ NK-Zellen charakterisiert (siehe: Ergebnisse, Kap. 7.1).
Für die G85-Probe wurde ebenso nach 4-maliger Stimulation mit GLEA2-Protein eine
geringe Anreicherung von CD3+ T-Zellen in der Ausgangspopulation gezeigt. FACSAnalysen dieser Proben nach 3 Stimulationen (d17) haben keine wesentliche Anreicherung
der T- und NKT-Zellen, sowie eine Verminderung der Prozenzsatzes der NK-Zellen gezeigt
(siehe: Ergebnisse, Kap. 4). Anreicherungen innerhalb der CD3+/CD16-56- T-Zellen waren
für alle drei Proben selten und traten nur bei PBLs von Patienten mit negativem GLEA2Antikörperstatus auf. Allerdings waren diese CD3+/CD16-56- T-Zellen durch die
Migrationsassays nicht aktivierbar.
Das GLEA2-Protein kann im geringen Ausmaß die T-Zell-Proliferation hervorrufen und im
Falle der CD3-/CD16+56+ NK-Zellen die Migration. Man weiß bereits, dass für eine
effektive Chemotaxis nicht nur Chemokine, sondern auch entsprechende Rezeptoren
unentbehrlich sind. Bis heute wurden allerdings über 40 unterschiedliche Chemokine (und
kostimulatorische Moleküle) und nur sehr wenige Chemokinrezeptoren der NK-Zellen
beschrieben (Ward et al., 1998). Einen der beschriebenen Rezeptoren stellt NKG2D-Rezeptor
131
Diskussion
dar, der die „Streß-Moleküle“ MICA/B (MHC class I chain-related proteins A and B) oder
ULBP1-4 (UL16-binding proteins) erkennt (Raulet, 2003). Zu den anderen in das Erkennen
der Streß-Signale beteiligten NK-Zell-Rezeptoren gehören NKp30, NKp44 und NKp46
(Moretta et al., 2001). Ob diese Rezeptore an den Interaktionen mit GLEA2-Protein beteiligt
sind, benötigt weitere Experimente.
Die Chemokine und ihre Rezeptoren sind Zell-spezifisch und können induzierbar sein. Die
Chemokine der CXC-Chemokinfamilie (z.B. IL-8) beeinflussen beispielsweise hauptsächlich
Neutrophile, Monozyten, Lymphozyten, Eosinophile und Basophile (Ward et al., 1998).
Wenn nicht nur eine PBL-Subpopulation rekrutiert wird, kann man hierbei jedoch nicht über
eine Restriktion im engeren Sinne sprechen. Ebenso beruht die Rolle der Chemokine nicht nur
auf der Chemotaxis. Das könnte unter anderen die Proliferation der CD3+/CD16-56- Zellen in
der G85-Probe erklären.
Unbeantwortet bleiben jedoch die Fragen nach dem GLEA2-Freisetzungsweg aus den
Tumorzellen. Die einem Streß ausgesetzten Zellen sezernieren die sogenannten „StreßMoleküle“, wie beispielweise Hsp70 oder Harnsäure, die ein Induktionssignal für das
Immunsystem darstellen (Shi et al., 2003). Möglicherweise wird auch GLEA2 durch
nekrotische oder apoptotische Prozesse, die ein charakteristisches Merkmal der Astrozytome
darstellen, freigesetzt und auf diesem Weg dem Immunsystem zugängig (Burger et al., 1994;
Brat et al., 2004).
Fraglich ist ebenso die Klassifizierung des GLEA2-Proteins als Chemokin, denn die bis jetzt
als solche klassifizierten Proteine sind wesentlich kleiner (4-16 kDa, Ward et al., 1998) als
das auf ca.115 kDa geschätzte GLEA2 (Pallasch, 2004). Die durch Pallasch durchgeführte
GLEA2-Expressionsanalysen haben eine Proteinbande eines Molekulargewichts von 65 kDa
in normalem Hirngewebe und eine Proteinbande von ca.40 kDa in GBM-Zellkulturlisaten
gezeigt (Pallasch, 2004). Diese unterschiedlichen Proteingrößen weisen auf mögliche
Spaltungsprozesse hin, im Zuge derer möglicherweise auch bisher nicht identifizierte
Produkte von sehr niedrigem molekularen Gewicht entstehen können. In diesem
Zusammenhang muss auch darauf hingewiesen werden, dass auch für größere Proteine, wie
ein
Hitze
Schock
Protein
mit
einem Molekulargewicht
von
70
kDa
migrationsförderende Eigenschaften nachgewiesen wurden (Gastpar et al., 2004).
132
(Hsp70)
Diskussion
5. Schlussfolgerungen
Die in der vorliegenden Dissertation erarbeiteten Ergebnisse unterstützen die zuvor erhobenen
Daten zur humoralen Immunantwort gegen das GLEA2-Protein (siehe: Ergebnisse, Kap. 2,
sowie Fischer et al., 2001 und Pallasch et al., 2004). Die Ergebnisse belegen weiterhin einen
proliferativen Einfluss des GLEA2-Proteins auf NK-Zellen (siehe: Ergebnisse, Kap.3 und
Kap.4). Die Spezifität dieser Stimulation wurde in den Kapiteln 5, 7 und 8 dargestellten
Experimenten überprüft.
Zusammenfassend kann man feststellen:
1. Das GLEA2-Antigen führt zur humoralen Immunantwort bei Patienten mit Tumoren
astrozytären und oligoastrozytären Ursprungs. Die Häufigkeit mit der Seroreaktivität
für GLEA 2 nachweisbar war, ist für Patienten mit astrozytären Tumoren höheren
Tumorgrades
gegenüber
denjenigen
mit
astrozytären
Tumoren
niedrigeren
Tumorgrades erhöht. Das Auftreten von Rezidiven geht mit einem Verlust der
humoralen Immunantwort gegen GLEA 2 einher. Die anti-GLEA2-Antikörper sind
sowohl mittels SEREX, als auch mittels ELISA detektierbar.
2. Die in vitro Kurzzeitstimulation mit GLEA2-Protein führt zur Proliferation und
Aktivierung von PBLs unabhängig von der histopathologischen Diagnose und dem
Tumorstadium. Die Proliferationsrate korreliert nicht mit dem Nachweis von
Antikörpern in den entsprechenden Seren. Die nach der Kurzzeitstimulation
proliferierenden PBLs haben überwiegend NK- und NKT-Zell-Merkmale. Die
Aktivierung der stimulierten PBLs äußert sich in einer erhöhten CD69-Expression,
jedoch nicht in einer IFNγ-Produktion.
3. Wiederholte Stimulationen der PBLs mit dem GLEA2-Protein führen unabhängig von
histologischen Tumormerkmalen zur Prädominanz der NK-Zellen, mit einem
deutlichen Anstieg der NKT-Zell-Subpopulation. Die wiederholten Stimulationen
führen
zu keiner signifikanten IFNγ- oder TNFα- Freisetzung, aber zu einer
deutlichen IL-4-Produktion.
133
Diskussion
4. Die Stimulierung mit GLEA2-Protein führt zur Induktion einer spezifischen Migration
von aktivierten NK-Zellen in Richtung auf das GLEA2-Protein, und in Richtung auf
Überstände von Gliom-Zellkulturen.
6. Ausblick
Die Ergebnisse legen nahe die potentiellen zytotoxischen Eigenschaften der GLEA2stimulierten NK-Zellen gegen Gliome experimentell zu überprüfen. Eine erhöhte
Zytotoxizität nach in vitro Stimulation mit GLEA2 würde sich gegebenenfalls anbieten, die
Wirksamkeit der NK-Zellen unter den Gliom-infiltrierenden Lymphozyten zu verstärken.
134
ANHANG
Tab.1
Tumor assoziierte Antigene: Unterteilung nach Tumor- oder Gewebespezifität
Antigene
Definition und Referenzen
Beispiele
Melanozyten-
normale Gene, deren
MART-1
Differenzierungsantigene
Expression gewebespezifisch
gp100
ist (bei Melanozyten und
Tyrosinase
Melanomen), Brichard et al.
Tyrosinase related protein-1, -2
(1993), Kawakami et
Melan A
al.(1994)
Cancer Testis Antigene
Gene, die in zahlreichen
MAGE-1, -2, -3, -12
Tumoren, aber nicht im
BAGE
normalen Gewebe außer
GAGE
Hoden exprimiert sind,
NY-ESO-1
Chen et al. (1997), Güre et al. SSX
(1997), Van der Bruggen et
al. (1991)
mutierte Antigene
überexprimierte Antigene
normale Gene, die im
β-catenin
Tumorgewebe Mutationen
MUM-1
aufweisen, die zur Folge
CDK-4
Expression von veränderten
Caspase-8
Proteinen haben
KIA 0205
Scanlan et al. (1998), Coulie
HLA-A2-R1701
et al. (1995)
p53
normale Gene, die im
α-Fetoprotein
Tumorgewebe überexprimiert Telomerase catalytic protein
sind
eIF-4gamma
Brass et al. (1997), Sahin et
G-250
al. (1995)
MUC-1
Carcinoenmbryonic antigen
p53
Her-2/neu
virale Antigene
virale Gene, die im
135
HBV, EBV Proteine
Tumorgewebe exprimiert sind HPV16 Proteine E6, E7
Lennette et al. (1995), Tindle
(1996)
136
Tab. 2
Tumor assoziierte Antigene bei Gliomen
Antigen
MAGE-E1
Beschreibung
Melanoma associated cancer testis
Referenz
Sasaki et al., 2001
antigen
EGFRvIII
Tumor associated variant of EGFR
Wikstrand et al., 1997
(epidermal growth factor receptor)
IL-13 Receptor α2 Kette
Glioma-associated variant of IL-13
Okano et al., 2002
receptor α2 chain isoform
GALT3
UDP-Gal: βGlcNAc β1, 3
Tsuda et al., 2002
galactosyltransferase, polypeptide 3
SART1
cytosol expressed tumor-rejection
Imaizumi et al., 1999
antigen (in epithelial tumors)
(SART1259) and nuclear antigen
(SART800), expressed in all
proliferative cells
SART3
cytosol and nukleus expressed
Murayama et al., 2000
tumor-rejection antigen (in epithelial
tumors)
ARF4L
ADP-ribosylation factor 4-like
Nonaka et al., 2002
protein
TRP-2
tyrosinase-related protein 2
Liu et al, 2003
Tenascin
extracellular matrix associated
Kurpad et al, 1995
antigen
gp-100
glycoprotein 100, Melanocyte-
Liu et al., 2004
differentiation antigen
HER-2
glycoprotein with tyrosine kinase
Liu et al., 2004
activity
GP 240
glycoprotein 240
Kurpad et al, 1995
son
DNA binding protein
Schmits et al., 2002
SP-40,40
complement inhibitory protein
Schmits et al., 2002
Bax-inhibitor 1
antiapoptotic protein bax-inhibitor 1
Schmits et al., 2002
137
HOM-GLIO-101
Schmits et al., 2002
2410004N1 1Rik homolog
Schmits et al., 2002
Chaperonin TCP1
Schmits et al., 2002
Calnexin
membranprotein of endoplasmatic
Schmits et al., 2002
reticulum
nm23-H2
nucleoside diphosphate kinase B
Schmits et al., 2002
GFAP
glial fibrilar acidic protein
Schmits et al., 2002
RanBP2
Ran-binding protein 2
Schmits et al., 2002
PHF3
PHD finger protein 3
Struss et al. 2001
GLEA2
Glioma-expressed antigen 2
Fischer et al., 2001
138
LITERATURVERZEICHNIS
1.
Al-Aoukaty A, Rolstad B, Giaid A, Maghazachi AA (1998) MIP-3alpha, MIP-3beta
and fractalkine induce the locomotion and the mobilization of intracellular calcium,
and activate the heterotrimeric G proteins in human natural killer cells. Immunol 95:
618-24;
2.
Aloisi F (2001) Immune function of microglia. Glia, 36: 165-79
3.
Angelov DN, Walther M, Streppel M, Guntinas-Lichius O, Neiss WF (1998) The
cerebral perivascular cells. Adv Anat Embryol Cell Biol 147:1-87;
4.
Borrego F, Ulbrecht M, Weiss M, Coligan JE, Brooks AG (1998) Recognition of
Human Histocompatibility Leukocyte Antigen (HLA)-E complexed with HLA class I
signal sequence –derived peptides by CD94/NKG2 confers protection from natural
killer cell-mediated lysis. J Exp Med 187: 813-8;
5.
Boyington JC, Riaz AN, Patamawenu A, Coligen JE, Brodus AG, Sun PD (1999)
Structure of CD94 reveals a novel C-type lectine fold: implications for the NK cellassociated CD94/NKG2 receptors. Immunity 10: 75-82;
6.
Brass N, Eckel D, Sahin U, Pfreundschuh M, Sybrecht GW, Meese E (1997)
Translation initiation factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces
an immune response in squamos cell lung cancer cells. Hum Mol Gen 6:33-9;
7.
Brat DJ, Van Meir EG (2004) Vaso-occlusive and prothrombotic mechanisms
associated with tumor hypoxia, necrosis, and accelerated growth in glioblastoma.
Laboratory Investigation 84: 397-405;
8.
Brichard V, van Pel A, Wölfel T, Wölfel C, Deplaen E, Lethe B, Coulie P, Boon T
(1993) The tyrosinase gene codes for an antigen recognized by autologous cytolytic T
lymphocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med 178:489-95;
9.
Burdin N, Brossay L, Kronenberg M (1999) Immunization with α-galactosylceramide
polarizes CD1-reaktive NKT cells towards Th2 cytokine synthesis. Eur J Immunol 29:
2014-25;
10.
Burger PC, Scheithauer BW (Eds) (1994) Atlas of Tumor Pathology, Tumors of the
Central Nervous System: Glioblastoma Multiforme. Armed Forces Institute of
Pathology, Bethesda, Maryland, 199: 49-77;
11.
Bucciero A, Vizioli L, Giamundo A, Villano M, Quaglietta P, Cerillo A (1990)
Prognostic significance of lymphoid infiltration in cerebral malignant gliomas. J.
Neurosurg Sci 34: 145-8;
139
12.
Carnaud C, Lee D, Donnars O, Park SH, Beavis A, Koezuka Y, Bendelac A (1999)
Cutting edge: cross-talk between cells of the innate immune system: NKT cells rapidly
activate NK cells. J Immunol 163: 4647-50;
13.
Carpentier NA, Lange GT, Fiere DM, Fournie GJ, Lambert PH, Miescher PA (1977)
The clinical relevance of circulating immune complexes in human leukemia. J Clin
Invest 60: 874-84;
14.
Carson WE, Lindemann MJ, Linett M, Tan JC, Chou CC, Narula S, Caligiuri MA
(1995) The functional charakterisation of interleukin-10 receptor expression on human
natural killer cells. Blood 85: 3577-85;
15.
Chen YT, Scalan MJ, Sahin U, Türeci Ö, Güre AO, Tsang S, Williamson B, Stockert
E, Pfreundschuh M, Old LJ (1997) A testicular antigen aberrantly expressed in human
cancers detected by autologous antibody screening. Proc Natl Acad Sci (Wash) 94:
1914-8;
16.
Coulie PG, Lehmann F, Lethe B, Herman J, Lurquin C, Andrawiss M, Boon T (1995)
A mutated intron sequence codes for an antigenic peptide recognized by cytolytic T
lymphocytes on a human melanoma. Proc Natl Acad Sci (Wash.) 92: 7976-80;
17.
Debinski W, Gibo DM (2000) Molecular expression analysis of restrictive receptor for
interleukin 13, a brain tumor-associated cancer/testis antigen. Mol Med 6: 440-9;
18.
Desbaillets I, Tada M, de Tribolet N, Diserens AC, Hamou MF, Van Meir EG (1994)
Human astrocytomas and glioblastomas express monocyte chemoattractant protein-1
(MCP-1) in vivo and in vitro. Int J Cancer 58: 240-7;
19.
Didenko VV, Ngo NH, Minchew C, Baskin DS (2002) Apoptosis of T lymphocytes
invading glioblastomas multiforme: a possible tumor defense mechanism. J Neurosurg
96: 580-4;
20.
Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morford LA (1999) Immune defects observed in
patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol 100: 216-32;
21.
Eberl G, MacDonald R (2000) Selective induction of NK cell proliferation and
cytotoxicity by activated NKT cells. Eur J Immunol 30: 985-992;
22.
Elliot L, Brooks WH, Roszman T (1987) Role of interleukin-2 and interleukin-2
receptor in the proliferative defect observed in mitogen stimulated lymphocytes from
patients with gliomas. J Natl Cancer Inst 78:919-22;
23.
Evdonin AL, Guzkova IV, Margulis BA, Medvedeva ND (2004) Phospholipase C
inhibitor, u73122, stimulates release of Hsp-70 stress protein from A431 human
carcinoma cells. Cancer Cell Inter 4:2;
140
24.
Feuerstein B, Berger TG, Maczek C, Röder C, Schreiner D, Hirsch U, Haendle I,
Leisgng W, Glaser A, Kuss O, Diepgen TL, Schuler G, Schuler-Thurner B (2000) A
method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature
dendritic cells ready for clinical use. J Immunol Methods 245: 15-29;
25.
Fischer U, Struss A-K, Hemmer D, Steudel W-I, Meese E (2001) Glioma-expressed
antigen 2 (GLEA2): a novel protein that can elicit immune responses in glioblastoma
patients and some controls. Clin Exp Immunol 126, 206-13;
26.
Friese MA; Platten M, Lutz SZ, Neumann U, Aulwurm S, Bischof F, Buhring HJ,
Dichgans J, Rammensee HG, Steinle A, Welter M (2003) MICA/NKG2D-mediated
immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Res 63: 8996-9006;
27.
Fujii S, Shimizu K, Steinman RM, Dhodapkar MV (2003) Detection and activation of
human Vα24+ natural killer T cells using α-galactosyl ceramide-pulsed dendritic cells.
J Immunol Meth 272: 147-59;
28.
Gastpar R, Gross C, Rossbacher L, Ellwart J, Riegger J, Multhoff G (2004) The cell
surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic
activity selectively in human NK cells. J Immunol 172: 972-80;
29.
Gauthier T, Hamou MF, Mond L, Gally P, Carrel S, de Tribolet N (1993) Expression
and release of interleukin-1 by human glioblastoma cells in vitro and in vivo. Acta
Neurochirur (Wien) 121: 199-205;
30.
Gehrmann M, Schmetzer H, Eissner G, Haferlach T, Hiddemann W, Multhoff G
(2003) Membrane-bound heat shock protein 70 in acute myeloid leukemia: a tumorspecific recognition structure for the cytolytic activity of autologous natural killer
cells. Haematologica / J Haematol 88: 474-6;
31.
Gilboa E (1999) How tumors escape immune destruction and what we can do about it.
Cancer Immunol Immunother 48: 382-5;
32.
Godfrey DI, Hammond KJ, Poulton LD, Smyth MJ, Baxter AG (2000) NKT cells:
facts, function and fallacies. Immunol Today 21: 535-62;
33.
Groothuis TA, Neefjes J (2005) The many roads to cross presentation, J Exp Med 202:
1313-8;
34.
Gross C, Hansch, D, Gastpar R, Multhoff G (2003) Interaction of heat shock protein
70 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94. Biol Chem 384:267;
35.
Gudinaviciene I, Pranys D, Juozaityte E (2004) Impact of morphology and biology on
the prognosis of patients with gliomas. Medicina 40:112-20;
141
36.
Guilloux Y, Bai X, Liu X, Zheng P, Liu Y (2001) Optimal induction of effector but
not memory antitumor cytotoxic T lymphocytes involves direct antigen presentation
by the tumor cells. Cancer Res 61: 1107-12;
37.
Gutman H, Laish-Farkash A, Risin D, Pellis NR (2001) Locomotion of lymphocytes
towards melanoma cells treated with tumor necrosis factor in a syngeneic in vitro
model. Int J Mol Med 8: 199-203;
38.
Guzhova I, Kislyakova K, Moskaliova O, Fridlanskaya I, Tytell M, Cheetham M,
Margulis (2001) In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that
exogenous Hsp70 can enhance neuronal stres tolerance. Brain Res 914: 66-73;
39.
Güre AO, Türeci Ö, Sahin U, Tsang S, Scalan MJ, Jäger D, Ilsemann C, Hagedorn M,
Oesch F, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT (1997) SSX: a multigene
family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int J
Cancer 72:965-71;
40.
Hamanaka Y, Suehiro Y, Fukui M, Shikichi K, Imai K, Hinoda Y (2003) Circulating
anti-MUC1 IgG antibodies as a favorable prognostic factor for pancreatic cancer. Int J
Cancer 103: 97-100;
41.
Harding CV (1996) Class I MHC presentation of exogenous antigens. J Clin Immunol
16: 90-6;
42.
Hart MN, Fabry Z (1995) CNS antigen presentation. Trends Neurosci, 18:475-81;
43.
Hoffken K, Priece MR, McLaughlin PJ, Moore VE, Baldwin RW (1977) Circulating
immune complexes in patients with breast cancer. Br Med J 2: 218-20;
44.
Holladay FP, Wood GW (1993) Generation of cellular immune responses against a
glioma-associated antigen(s). J Neuroimmunol 44: 27-32;
45.
Husain N, Chiocca EA, Rainov N, Louis DN, Zervas NT (1998) Co-expression of Fas
and Fas ligand in malignant glial tumors and cell lines. Acta Neuropathol 95: 287-90;
46.
Imaizumi T, Kuramoto T, Matsunaga K, Shichijo S, Yutani S, Shigemori M, Oizumi
K, Itoh K (1999) Expression of the tumor-rejection antigen SART1 in brain tumors.
Int J Cancer 83: 760-4;
47.
Ishii N, Tada M, Sakuma S, Sawamura Y, Shinoke Y, Abe H (1998) Human
astrocytoma cells are capable of producing macrophage inflammatory protein-1beta. J
Neurooncol 37: 17-23;
48.
Janeway CA, Travers P (Eds) (1997) Immunologie, 2.Auflage, Spektrum-Verlag;
49.
Kawakami Y, Eliyahu S, Delgado CH, Robbins PF, Rivoltini L, Topalian SL, Miki T,
Rosenberg SA (1994) Cloning of the gene coding for a shared human melanoma
142
antigen recognized by autologous T cells infiltrating into tumor. Proc Natl Acad Sci
91:3525-3519;
50.
Khan- Farooqi HR, Prins RM, Liau LM (2005) Tumor immunology, immunomics and
targeted immunotherapy for central nervous system malignancies. Neurol Res 27: 692702;
51.
Kielian T, von Rooijen N, Hickey WF (2002) MCP-1 expression in CNS-1
astrocytoma cells: implication for macrophage infiltration into tumors in vivo. J.
Neuro-Oncol 56: 1-12;
52.
Kimura T, Takeshima H, Nomiyama N, Nishi T, Kino T, Kochi M, Kuratsu JI, Ushio
Y (2002) Expression of lymphocytic-specific chemokines in human malignant glioma:
essential role of LARC in cellular immunity of malignant glioma. Int J Oncol 21: 70715;
53.
Kleihues P, Cavenee WK (Eds) (2000) Tumors of the nervous system. WHO
classification of tumours. IARC Press Lyon;
54.
Kobayashi T, Yamanaka R, Homma J, Tsuchiya N, Yajima N, Yoshida S, Tanaka R
(2003) Tumor mRNA loaded dendritic cells elicit tumor-specific CD8(+) cytotoxic T
cells in patients with malignant glioma. Cancer Immunol Immunother 52: 632-7;
55.
Krause SW, Gastpar R, Andreesen R, Gross C, Ullrich H, Thonigs G, Pfister K,
Multhoff G (2004) Treatment of colon and lung cancer patients with ex vivo heat
shock protein 70-peptide-activated, autologous natural killer cells: a clinical phase I
trial. Clin Cancer Res 10: 3699-707;
56.
Kurpad SN, Zhao XG, Wikstrand CJ, Batra SK, McLendon ME, Bigner DD (1995)
Tumor antigens in astrocytic gliomas. Glia 15:244-56;
57.
Lalvani BA, Brookes R, Hambleton S, Britton WJ, Hill AVS, McMichael AJ (1997)
Rapid effector function in CD8+ memory T-cells. J Exp Med 6: 859-65;
58.
Lannier LL, Ruitenberg JJ, Phillips JH (1988) Functional and biochemical analysis of
CD16 antigen on NK cells and granulocytes. J Immunol 141: 3478-85;
59.
Lehmann C, Zeis M, Uharek L (2001) Activation of natural killer cells with
interleukin 2 (IL-2) and IL-12 increases perforin binding and subsequent lysis of
tumour cells. Br J Haematol 114: 660-5;
60.
Lennete ET, Winberg G, Yadav M, Enbald G, Klein G (1995) Antibodies to
LMP2A/2B in EBV-carrying malignancies. Eur J Cancer 31:1875-8;
61.
Lisianyi NI, Markova OV, Zhmareva EN (1988) Activity of the natural killer cells in
the peripheral blood of patients with brain tumors. Eksp Onkol 10: 57-59;
143
62.
Liu G, Khong HT, Wheeler CJ, Yu JS, Black KL, Ying H (2003) Molecular and
functional analysis of tyrosinase-related protein (TRP)-2 as a cytotoxic T lymphocyte
target in patients with malignant glioma. J Immunother 26: 301-12;
63.
Liu G, Ying H, Zeng G, Wheeler CJ, Black KL, Yu JS (2004) HER-2, gp100 and
MAGE-1 are expressed in human gioblastoma and recognized by cytotoxic T cells.
Cancer Research 64: 4980-6;
64.
Louis DN (1997) A molecular genetic model of astrocytoma histopathology. Brain
Pathology 7: 755-64;
65.
Margolin KA (2000) Interleukin-2 in the treatment of renal cancer. Semin Oncol 27:
194-203;
66.
Maghazachi AA (1991) Tumor necrosis factor-α is chemokinetic for lymphokineactivated killer cells: regulation by cyclic adenosine monophosphat. J Leukocyte Biol
49: 302;
67.
Martin-Achard A, de Tribolet N, Louis MD, Zander E (1980) Immune complexes
associated with brain tumors: correlation with prognosis. Surg Neurol 13: 161-3;
68.
Martinez-Kinader B, Lipford GB, Wagner H, Heeg K (1995) Sensitization of MHC
class I-restricted T cells to exogenous proteins: evidence for an alternative class Irestricted antigen presentation pathway. Immunology 86: 287-95;
69.
Moretta A, Bottino C, Vitale M, Pende D, Cantoni C, Mingari MC, Biassoni R (2001)
Activating receptors and coreceptors involved in human NK cell mediated cytolysis.
Annu Rev Immunol 19: 197-223;
70.
Morford LA, Dix AR, Brooks WH, Roszman TL (1999) Apoptotic elimination of
peripheral T lymphocytes in patients with primary intracranial tumor. J Neurosurg 91:
935-46;
71.
Morford LA, Elliot LH, Carlson SL, Brooks WH, Roszman TL (1999) T cell receptormediated signalling is defective in T cells obtained from patients with primary
intracranial tumors. J Immunol 159:4415-25;
72.
Multhoff G, Boltzer C, Jennen L, Schmidt J, Ellwart J, Issels RD (1997) Heat shock
protein 72 on tumor cells: a recognition structure for natural killer cells. J Immunol
158: 4341;
73.
Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, Kampinga HH,
Laumbacher B, Johnson J (1999) Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates
proliferation and cytolytic activity of NK cells. Exp Hematol 27: 1627-36;
144
74.
Multhoff G, Pfister K, Gehrmann M, Hantschel M, Gross C, Hafner M, Hiddemann W
(2001) A 14-mer Hsp70 peptide stimulates natural killer (NK) cell activity. Cell Stress
Chaperones 6: 337;
75.
Multhoff G (2002) Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. Int. J.
Hyperthermia 18: 576-85;
76.
Murayama K (2000) Expression of the SART3 tumor-rejection antigen in brain tumors
and induction of cytotoxic T lymphocytes by ist peptides. J Immunother 23:511-18;
77.
Nakken B, Davis KE, Pan ZJ, Bachmann M, Farris AD (2003) T-Helper vell tolerance
to ubiquitous nuclear antigens. Scand J Immunol 58: 478-92;
78.
Nonaka Y (2002) Recognition of ADP-ribosylation factor 4-like by HLA-A2restricted and tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes from patients with brain
tumors. Tissue Antigens 60:319-27;
79.
Norbury C.C., Hewlett LJ, Prescott AR, Shastri N, Watts C (1995) Class I MHC
presentation of exogenous soluble antigen via macropinocytosis in bone marrow
macrophages. Immunity 3: 783-91;
80.
Nygren C, v. Holst H, Ericson K, Fredman P (2001) Patients with primary brain
tumors have elevated serum titers of antibodies to the myelin glycolipid sulphatide.
Eur Neurol 45:38-42;
81.
Oh JW, Schwiebert LM, Benveniste EN (1999) Expression of CC and CXC
chemokine by human astrocytes. J Neuroviral 5: 82;
82.
Okano F Strokus WJ, Chambers WH (2002) Identification of a novel HLA-A*0201restricted, cytotoxic T lymphocyte epitope in a human glioma-associated antigen
interleukin 13 receptor alpha2 chain. Clin Cancer Res 8:2851-5;
83.
Ortaldo JR, Young HA, Winkler-Pickett RT, Bere EW, Murphy WJ, Wiltrout RH
(2004) Dissociation of NKT stimulation, cytokine induction, and NK activation in
vivo by he use of distinct TCR-binding ceramides. J Immunol 172: 943-53;
84.
Pallasch CP (2004) Prognostische Bedeutung von Glioblastom-assoziierten
Autoantikörpern und Charakterisierung des immunogenen Antigens Glioma Expressed
Antigen 2. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der
Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes.
85.
Park SH, Bendelac A (2000) CD1-restricted T-cell responses and microbial infection.
Nature 406: 788-92;
86.
Parney IF, Hao C, Petruk KC (2000) Glioma immunology and immunotherapy.
Neurosurgery 46: 778-91;
145
87.
Pleass R, Camp R (1994) Cytokines induce lymphocyte migration in vitro by direkt,
receptor-specific mechanisms. Eur J Immunol 24: 273-6;
88.
Porcelli SA, Modlin RL (1999) The CD1 system: antigen-presenting molecules for T
cell recognition of lipids and glycolipids. Annu Rev Immunol 17: 297-329;
89.
Quan W, Ramirez M, Taylor C, Vinogradov M, Quan F, Khan N (2005) High-dose
continous infusion plus pulse interleukin-2 and famotidine in metastatic kidney cancer.
Cancer Biothe Radiopharm 20: 36-40;
90.
Raulet DH (2003) Role of NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol
3: 781-90;
91.
Rock KL, Gamble S, Rothstein L (1990) Presentation of exogenous antigen via class I
major histocompatibility complex molecules. Science 249: 918-21;
92.
Rock KL, Rothstein L, Gamble S, Fleischacker C (1993) Charakterization of antigenpresenting cells that present exogenous antigens in association with class I MHC
molecules. J Immunol 150: 438-46;
93.
Rogers PR, Matsumoto A, Naidenko O, Kronenberg M, Mikayama T, Kato S (2004)
Expansion of human Vα24+ NKT cells by repeated stimulation with KRN7000. J
Immunol Meth 285: 197-214;
94.
Rosenberg SA, Lotze MT, Muul LM, Leitman S, Chang AE, Ettinghausen SE, Matory
YL, Skibber JM, Shiloni E, Vetto JT (1985) Observation on the systemic
administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant
interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N Engl J Med 313: 1485-92;
95.
Rosenberg SA (1987) A progress report on the treatment of 157 patients with
advanced cancer using lymphokine activated killer cells and interleukin-2 or high dose
interleukin-2 alone. N Eng J Med 316:889-97;
96.
Rosenberg SA (2001) Progress in the development of immunotherapy for the
treatment of patients with cancer. J Int Med 250: 462-75;
97.
Rossen RD, Reisberg MA, Hersh EM, Guttermann JV (1977) The C1q binding test for
soluble immune complexes: clinical correlations obtained in patient with cancer. J
Natl Cancer Inst 58: 1205-15;
98.
Roszman T, Elliot L, Brooks W (1991) Modualtion of T-cell function by gliomas.
Immunol Today 12:370-4;
99.
Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, Perruccio K, Shlomchik WD, Tosti A (2002)
Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic
transplants. Science 295: 2097-100;
146
100.
Sahin U, Koslowski M, Türeci Ö (2000) Expression of cancer testis genes in human
brain tumors. Clin Cancer Res 6:3916-22;
101.
Sahin U, Türeci Ö, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, Stenner F, Luo
G, Schobert I, Pfreundschuh M (1995) Human neoplasms elicit multiple specific
immune responses in the autologous host. Proc Natl Acad Sci (Wash.) 92: 11810-13;
102.
Sasaki A, Ishiuchi S, Kanda T, Hasegawa M, Nakazato Y (2001) Analysis of
interleukin-6 gene expression in primary human gliomas, glioblastoma xenografts, and
glioblastoma cell lines. Brain Tumor Pathol 18: 13-21;
103.
Sasaki M, Nakahira K, Kawano Y, Katakura H, Yoshimine T, Shimizu K, Kim SU,
Ikenaka K (2001) MAGE-E1, a new member of the melanoma-associated antigen
gene family and ist expression in human glioma. Cancer Research 61: 4809-14;
104.
Sawamura Y (1991) Isolation and expansion of glioma-infiltrating lymphocytes in
vitro: an analysis of their surface phenotypes and antitumor activities. Hokkaido Igaku
Zasshi 66: 868-78;
105.
Scalan M, Chen YT, Williamson B, Güre A, Stockert E, Gordon J, Türeci Ö, Sahin U,
Pfreundschuh M, Old LJ (1998) Characterization of human colon cancer antigens
recognized by autologous antibodies. Int J Cancer 76:652-8;
106.
Schmits R, Cochlovius B, Treitz G, Regitz E, Ketter R, Preuss K, Romeike BFM,
Pfreundschuh M (2002) Analysis of the antibody repertoire of astrocytoma patients
against antigens expressed by gliomas. Int J Cancer 98: 73-77;
107.
Sehgal A, Berger MS (2000) Basic concepts of immunology and neuroimmunology.
Neurosurg Focus 9:e1;
108.
Shi Y, Evans JE, Rock KL (2003) Molecular identification of a danger signal that
alerts the immune system to dying cells. Nature, 425: 516-21;
109.
Shimada H, Nabeya Y, Okazumi S, Matsubara H, Funami Y, Shiratori T, Hayashi H,
Takeda A, Ochiai T (2002) Prognostic significance of serum p53 antibody in patients
with esophageal squamous cell carcinoma. Surgery 132: 41-7;
110.
Sikorski CW, Lesniak MS (2005) Immunotherapy for malignant glioma: current
approaches and future directions. Neurol Res 27: 703-16;
111.
Singh N, Hong S, Scherer DC, Serizawa I, Burdin N, Kronenberg M, Koezuka Y,
Kaer LV (1999) Cutting edge: activation of NKT cells by CD1d and αgalactosylceramide directs conventional T cells to the acquisition of Th2 phenotype. J
Immunol 163: 2373-77;
147
112.
Stevens A, Klotter I, Roggendorf W (1988) Inflammatory infiltrates and natural killer
cell presence in human brain tumors. Cancer 61: 738-43;
113.
Streit WJ, Kincaid-Colton CA (1995) The brain’s immune system Sci Am 273:54-61;
114.
Strick HM, Stoll M, Meyermann R (2004) Immune cell infiltration of intrinsic and
metastatic intracranial tumours. Anticancer Res 24: 37-42;
115.
Struss AK (2001) Entwicklung neuer prognostischen Faktoren für Glioblastoma
multiforme über einen kombinierten molekularbiologischen und immunologischen
Zugang. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin der
Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes.
116.
Taub DD, Sayers TJ, Carter CR, Ortaldo JR (1995) α and β chemokines induce NK
cell migration and enhance NK cell mediated cytolysis. J Immunol 155: 3877;
117.
Tindle RW (1996) Human papillomavirus vaccines for cervical cancer. Curr Opin
Immunol 8:643-50;
118.
Tsuda N (2002) UDP-Gal: betaGlcNAc beta1:3-galactoyltransferase, polypeptyde 3
(GALT3) is a tumour antigen recognised by HLA-A2-restricted cytotoxic T
lymphoctes from patients with brain tumour. Br J Cancer 87:1006-12;
119.
Van der Bruggen P, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES,
Chapiro J, Van den Eynde BJ, Brasseur F, Boon T (2002) Tumor specific shared
antigenic peptides recognized by human T cells. Immunological Reviews 188: 51-64;
120.
Van der Bruggen P, Van den Eynde BJ (2006) Processing and presentation of tumor
antigens and vaccination strategies. Curr Opin Immunol 18: 98-104;
121.
Van den Eynde BJ, Morel S (2001) Differential processing of class-I-restricted
epitopes by the standard proteasome and the immunoproteasome. Curr Opin Immunol
13: 147-53;
122.
Van Meir E, Ceska M, Effenberger F, Walz A, Grouzmann E, Desbaillets I, Frei K,
Fontana A, de Tribolet N (1992) „Interleukin-8 is produced in neoplastic and
infectious diseases of the human central nervous system“ Cancer Res 52: 4297-305;
123.
Van Meir E, Sawamura Y, Diserens AC, Hamou MF, de Tribolet N (1990) Human
glioblastoma cells release interleukin 6 in vivo and in vitro. Cancer Res 50: 6683-8;
124.
Vaquero J, Coca S, Oya S, Martinez R, Ramiro J, Salazar FG (1989) Presence and
significance of NK cells in glioblastomas. J Neurosurg 70: 728-31;
125.
Vlock DR, Kirkwood JM (1985) Serial studies of autologous antibody reactivity to
melanoma. J Clin Invest 76: 849-54;
148
126.
Vlock DR, Der Simonian R, Kirkwood JM (1986) Prognostic role of antibody
reactivity to melanoma. J Clin Invest 77: 1116-21;
127.
Wajchman HJ, Pierce CW, Varma VA, Issa MM, Petros J, Dombrowski KE (2004) Ex
vivo expansion of CD8+CD56+ and CD8+CD56- natural killer T cells specific for
MUC1 Mucin. Cancer Research 64: 1171-1180;
128.
Ward SG, Westwick J (1998) Chemokines: undertstanding their role in T-cell biology,
Biochem J 333: 457-70;
129.
Whiteside TL (2002) Tumor-induced death of immune cells: ist mechanism and
concequences. Cancer Biology 12: 43-50;
130.
Wikstrand CJ, McLendon RE, Friedman AH (1997) Cell surface localization and
density of the tumor-associated variant of the epidermal growth factor receptor,
EGFRvIII. Cancer Res 57:4130-40;
131.
Wischhusen J, Jung G, Radovanovic I, Beier C, Steinbach JP, Rimner A, Huang H,
Schulz JB, Ohgaki H, Aguzzi A, Rammensee HG, Weller M (2002) Identification of
CD70- mediated apoptosis of immune effector cells as a novel immune escape
pathway of human glioblastoma. Cancer Res 62: 2592-99;
132.
Yamanaka R (2006) Novel immunotherapeutic approaches to glioma. Curr Opin Mol
Ther 8: 46-51;
133.
Yu JS, Wheeler CJ, Zeltzer PM, Ying H, Finger DN, Lee PK, Yong WH, Incardona F,
Thompson RC, Riedinger MS, Zhang W, Prins RM, Black KL (2001) Vaccination of
malignant glioma patients with peptide-pulsed dendriic cells licits systemic
cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration. Cancer Research 61: 842-7;
134.
Zhou Y, Bosch ML, Salgaller ML (2002) Current methods for loading dendritic cells
with tumor antigen for the induction of antitumor immunity. J Immunol 25: 289-303;
135.
Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, RicciardiCastagnoli P, Raposo G, Amigorena S (1998) Eradication of established murine
tumors using a novel cell-free vaccine: Dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 4:
594-600;
149
DANKSAGUNG
Für den erfolgreichen Abschluss der vorliegenden Arbeit schulde ich vielen Menschen meinen
herzlichsten Dank.
An der ersten Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater, Herrn Professor Dr. Eckart
Meese, für die Betreuung der Doktorarbeit bedanken. Neben seinen Anregungen und Ideen
hat er mir viel Vertrauen und Diskussionsbereitschaft entgegengebracht und mir immer auf
dem holprigem Weg durch die Welt der Forschung mit Rat und Tat zur Seite stand und zum
Weitermachen motivierte. Dank seiner Unterstützung konnte ich meine Arbeit zuerst als
Graduiertenkolleg –Stipendiatin und später als wissenschaftliche Mitarbeiterin im Institut für
Humangenetik fortführten. Er hat mir auch ermöglicht, viele wertvolle Kontakte zu knüpfen
und bei etablierten immunologischen Arbeitsgruppen die notwendigen Techniken und
Methoden zu erlernen.
Ein sehr großes Dankeschön geht an Frau Doktor Ulrike Fischer, die die gesamte Arbeit mit
bewundernsvoller Geduld trotz meiner sprachlichen Ungeschicktheit innerhalb kurzer Zeit
korrigierte und mir aufzeigte, an welchen Stellen ich noch an inhaltlichen und sprachlichen
Problemen arbeiten musste.
Ein besonderer Dank gilt Frau Veronika Klein. Ich verdanke ihr nicht nur die Arbeiten an der
Proteinsynthese und am Etablieren von ELISA, sondern auch die große Unterstützung in
allen Problemen des Laboralltags. Durch ihre Gefühlswärme und Aufgeschlossenheit hat sie
eine unwiederholbare familiäre Arbeitsatmosphäre geschaffen und mich immer bestärkt,
wenn ich selbst an der erfolgreichen Fertigstellung meiner Doktorarbeit gezweifelt habe.
Frau Ulrike Lindemann bedanke ich mich für die Einführung in die faszinierende Welt der
Zellkulturen. Zwar haben sie in der vorliegenden Doktorarbeit leider keinen Platz gefunden,
diese Erfahrung wurde aber für mich zu einer der bedeutsamsten in meiner gesamten
Laborzeit. Auch für die wertvolle Zeit der Gespräche, die mir auf viele Seiten der Arbeit und
des Lebens einen neuen Blick verschafften.
Über die angeführten hinaus, bedanke ich mich vom ganzen Herzen bei allen meinen
Kolleginnen und Kollegen aus dem gesamten Institut für Humangenetik für die Einführung in
die für mich anfänglich geheimnisvolle und fremde Laborwelt. Sie haben mir mit großer
Geduld in kurzer Zeit die wichtigsten Labormethoden beigebracht und waren mir immer bei
den kleinsten Problemen zur Hilfe bereit.
150
Ein besonderes Dankeschön geht an die gesamte Arbeitsgruppe von Frau Professor Gabriele
Multhoff aus der Abteilung für Hämatologie und Onkologie der Universitätsklinik
Regensburg für die Gastfreundlichkeit, die ich in ihrem Labor erlebt habe und für die Zeit
und Geduld, die mir sie und ihre Kollegen entgegengebracht haben. Besonders möchte ich
mich beim Herrn Dr. Robert Gastpar, Frau Dr. Catharina Gross und Herrn Dr. Andreas
Wortmann bedanken, mit denen ich viele nicht nur wissenschaftliche, sondern auch private
Erinnerungen verbinde.
Meinen Homburger und gesamten „Exil-Homburger“ Freunden: Esther, Sonja, Nato, Tzu,
Andrea, Jumana, Adnan, Kamal, Louay, Kirsten, Isabel, Thomas, Dan, Beata, Nino, Peter
und vielen vielen anderen, danke ich dafür, dass sie in meiner Homburger Zeit zu meiner
Familie geworden sind. Sie werden immer in meinem Herzen warme Gefühle und
Erinnerungen erwecken.
Last but not least bedanke ich mich bei meiner Familie in Polen, die trotz der Entfernung
immer nah an mir war und mich in meinen gesamten beruflichen und wissenschaftlichen
Plänen jede Zeit unterstützte.
Ich hoffe, dass diese Arbeit, sogar wenn nur einen kleinen, doch einen wichtigen Beitrag zum
Kennenlernen der immunologischen Vorgänge geleistet hat.
Allen, die zur Entdeckung des großen Berges kleine Steine liefern, widme ich diese Arbeit.
Agata Mikolajewska
151
LEBENSLAUF :
Persönliche Daten :
Agata Mikolajewska
geb. am 16. Mai 1977 in Poznan, Polen
Korrespondenzanschrift :
Cöthner Str. 32
04155 Leipzig
E-mail :
[email protected]
Beruflicher Werdegang :
Seit Januar 2006 :
Arbeit als Ärztin in Weiterbildung in der Klinik für Innere
Medizin, Abteilung Hämatologie/Onkologie, Universitätsklinik
Leipzig
26.Oktober 2005:
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Oktober 2004-September
2005:
Praktisches Jahr (Medizinische Fakultät der Universität des
Saarlandes in Homburg):
4.10.04 - 31.01.05: Innere Medizin, Klinik für Hämatologie,
Inselspital Bern, Schweiz
1.02.05-28.02.05: Innere Medizin, Klinik für Onkologie,
Universitätsspital Zürich, Schweiz
1.03.05-5.06.05: Chirurgie, Inselspital Bern, Schweiz
6.06.05-25.09.2005: Gynäkologie und Geburtshilfe,
Universitätsklinik Homburg (Saar)
November 2002-September
2004:
Promotionsstudium an der Medizinischen Fakultät der Universität
des Saarlandes in Homburg (Saar) im Institut für Humangenetik
November 2002- Februar 2004: Stipendiatin des
Graduiertenkollegs „Zelluläre Regulation und Wachstum“ an der
Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes
März 2004- September 2004: Arbeit als Doktorandin im Institut
für Humangenetik, Universitätskliniken, Homburg (Saar)
152
Juni 2002
Abschluss des Medizinstudiums an der Medizinischen Akademie
in Wroclaw (Polen)
Oktober 1996 – Juni 2002
Medizinstudium an der Medizinischen Akademie in Wroclaw
(Polen)
Oktober 2000 – Juli 2001 Medizinstudium an der Medizinischen
Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin (Charite) im Rahmen
des Sokrates-Erasmus Programms
Mai 1996
Abitur
1992-1996
Algemeinbildende Oberschule in Wroclaw (Polen)
1984-1992
Grundschule in Wroclaw (Polen)
Praktika und Famulaturen
November 2003
Praktikum im onkologisch-hämatologischen Labor des
Universitätsklinikums in Regensburg (Deutschland)
September 2002
Praktikum im Institut für Humangenetik der Medizinischen
Fakultät der Universität in Thessaloniki (Griechenland)
Januar- Februar 2002
Famulatur in der Abteilung für Innere Medizin (Schwerpunkt
Gastroenterologie und Hepatologie) im Virchow-Klinikum der
Medizinischen Fakultät der Humboldt Universität zu Berlin
(Deutschland)
Dezember 2001
Famulatur in der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des
Lehrkrankenhauses am Urban in Berlin (Deutschland)
August 2001
Famulatur in der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des
Lehrkrankenhauses am Urban in Berlin (Deutschland)
April 2001
Famulatur in der Abteilung für Chirurgie im Virchow-Klinikum
der Medizinischen Fakultät der Humboldt Universität zu Berlin
(Deutschland)
September 2000
Famulatur in der Abteilung für Chirurgie in der Chirurgischen
Klinik der Medizinischen Akademie in Wroclaw (Polen)
Juli 2000
Famulatur in der Abteilung für Innere Medizin des
Universitätsklinikums Eselsberg in Ulm (Deutschland)
September 1999
Famulatur in der Abteilung für Innere Medizin an der Fakultät für
Klinische Medizin Mannheim der Ruprecht-Karls-Universität
Heidelberg (Deutschland)
Juli 1999
Famulatur in der Abteilung für Innere Medizin im Klinikum der
Medizinischen Akademie in Wroclaw (Polen)
153
September 1998
Famulatur in der Abteilung für Innere Medizin des
Universitätsklinikums Münster (Deutschland)
September 1997
Pflegepraktikum im Krankenhaus in Wroclaw (Polen)
Zusätzliche Aktivitäten:
November 2002-Februar
2004
Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG)
seit November 2002
Mitgliedschaft im Graduiertenkolleg „Zelluläre Regulation und
Wachstum“, Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes
Oktober 2001-Juni 2002
Arbeit als studentische Hilfskraft in der Klinik für
Gastroenterologie in Wroclaw (Polen)
Oktober 1998-Juni 2002
Arbeit als studentische Hilfskraft in der Klinik für
Kinderhämatologie und Onkologie in Wroclaw (Polen);
Bearbeitung der RMS-Patientendaten für das internationale CWSProgramm;
Zusammenarbeit an zahlreichen Publikationen für die
Konferenzen und Zeitschriften im Bereich der Hämatologie und
Kinderonkologie, sowie Übersetzungen der CWS-Protokolle
Teilnahme an Studentenkonferenzen
11-12.05.2001, Wroclaw
(Polen)
2.Preis für die Arbeit Bedeutung der Radiotherapie und des
chirurgischen Eingriffes für die Behandlung der RMS-Tumoren
22-23.11.2001, Lodz (Polen) 2.Preis für die Arbeit
Bedeutung der Radiotherapie und des chirurgischen Eingriffes für
die Behandlung der RMS-Tumoren
12-13.04.2002, Wroclaw
(Polen)
2.Preis für die Arbeit
Sensitivität und Spezifität der pankreatischen
Elastaseaktivitätsbestimmung;
Präsentationen:
Weichteilsarkome in der Kopf-Hals Lokalisation;
RMS der Harnblase und der Prostata. Behandlungsmöglichkeiten
und ihre Ergebnisse
12-13.04.2002, Krakau
(Polen)
Präsentation:
Weichteilsarkome in der Kopf-Hals Lokalisation
17-21.04.2002, Szklarska
Poreba (Polen)
Präsentation:
Epidemiologie der HBV-Infektion und ihre
Vorbeugungsmöglichkeiten
154
November 2000,
Internationale
Studentenkonferenz in der
Charite, Humboldt
Universität zu Berlin
(Deutschland)
Präsentation:
The valuation of rhabdomyosarcoma-treatment in children
treated with CWS-91 and SIOP-IV
155
156