Der Einfluß früher Komplementfaktoren auf die Apoptose von B

Aus dem Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. H. Kirchner
Der Einfluß früher Komplementfaktoren
auf die Apoptose von B-Zellen
im Rahmen der peripheren Toleranzinduktion
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- aus der medizinischen Fakultät Vorgelegt von
Kirstin Faust, geb. Lüddecke
aus Ludwigshafen am Rhein
Lübeck 2005
1. Berichterstatter:
Priv.-Doz. Dr. med. Siegfried Görg
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. univ. (Univ. Budapest) Tamás Laskay
Tag der mündlichen Prüfung:
13.7.2007
Zum Druck genehmigt Lübeck, den 13.7.2007
gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach
Dekan der Medizinischen Fakultät
2
für Dierk
3
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
6
1
Einleitung
8
1.1
Das Immunsystem und Autoimmunität
8
1.2
B-Lymphozyten
9
1.2.1 Entwicklung der B-Lymphozyten
1.2.2 Effektorfunktionen der B-Lymphozyten: die adaptive humorale Immunantwort
1.2.3 Produkte der B-Lymphozyten: Immunglobuline
1.3
Das Komplementsystem: Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver
Immunantwort
1.3.1
1.3.2
1.4
9
11
13
14
Allgemeine Funktionen des Komplementsystems
Frühe Komplementkomponenten: Funktionen im Rahmen der erworbenen
Immunität und der Toleranzinduktion
14
15
Toleranzentwicklung
19
1.4.1 Toleranzentwicklung der B-Zellen
1.4.2 Apoptose, ein Mechanismus der Toleranzinduktion
1.5
19
21
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
1.5.1
23
Theorien zur Entstehung des SLE
24
1.6
Zielsetzung, Begründung der Fragestellung
27
2
Material und Methoden
28
2.1
Material
28
2.1.1 Mäuse
2.1.2 Zellinien (der in vitro Experimente)
2.1.3 Antigen
2.1.4 Antikörper (Ak)
2.2
28
28
29
29
Methoden
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
2.2.8
2.2.9
2.2.10
31
Immunisierung der Mäuse und Alumpräzipitation des Antigens
Induktion von Apoptose
Isolierung von Milzlymphozyten
Durchflußfluoreszenzzytometrie
TUNEL (TdT mediated dUTP nick end labeling)
Immunhistochemie
Blutentnahme
ELISA zum Nachweis Np-spezifischer Antikörper
Kopplung von Antikörpern an Biotin
Statistik
31
31
32
34
35
36
39
39
42
42
4
3
Ergebnisse
43
3.1
Beeinflussung Antigeninduzierter Apoptose durch den Mangel früher
Komplementkomponenten: Versuche in vivo
43
3.1.1 Immunhistochemische Färbungen
3.1.2 Analyse am Durchflußfluoreszenzzytometer
3.1.3 Antikörperbestimmung mittels ELISA
3.1.4 Beeinflussung des immunologischen Gedächtnisses durch Komplementmangel
3.2
45
47
48
55
Beeinflussung der Fas (CD95)-induzierten Apoptose durch frühe
Komplementkomponenten: Versuche in vitro
61
3.2.1 Vorversuch 1: Phänotypische Eigenschaften der WEHI-Zellinien
3.2.2 Vorversuch 2: Apoptoseinduktion bei WEHI-Zellen
3.2.3 Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von
WEHI-Zellen
3.2.4 Vorversuch 3: Phänotypische Eigenschaften aufgereinigter Splenozyten
3.2.5 Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von BLymphozyten der Milz
61
63
65
66
69
4
Diskussion
73
4.1
Antigeninduzierte Apoptose: Versuche in vivo
74
4.1.1 Die Humorale Immunantwort gegen Np
4.1.2 Hochdosis-Toleranz
4.1.3 Die Antigeninduzierte Apoptose
4.1.4 Beeinflussung des immunologischen Gedächtnisses durch die Antigeninduzierte
Apoptose
4.2
74
77
78
84
Fas (CD95)-induzierte Apoptose: Versuche in vitro
89
4.2.1
Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von
Zellen der WEHI 231- und 279-Zellinien
4.2.2 Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von BLymphozyten der Milz
4.3
5
90
94
Bedeutung der Ergebnisse für die periphere Toleranzinduktion der BLymphozyten und für die Entwicklung der Autoimmunerkrankung
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
Zusammenfassung
99
102
Literatur
103
Danksagung
117
Kongressbeiträge und Veröffentlichungen
118
Lebenslauf
119
5
Abkürzungen
aqua dest.:
AEC:
Ag:
AI:
Ak:
Alum:
AP:
BE:
BSA:
BZR:
c:
C4:
C4-/-:
CD:
CGG:
CR2:
Cr2-/DMSO:
ELISA:
Fas:
FCS:
FDC:
Fitc:
FS:
GC
HRP:
IgG:
Inj:
i.p.:
IDC:
IL:
KLH:
Np:
PBS:
PE:
PNA
pNpP:
rpm:
destilliertes Wasser
3-Amino-9-Ethyl-Carbazole (Substrat für Immunhistochemie)
Antigen
Apoptoseinduzierende Injektion (Injektion einer hohen Dosis eines Antigens
in die etablierte Immunantwort gegen jenes Antigen hinein)
Antikörper
Aluminumkaliumsulphat
Alkaline Phosphatase (Enzym)
Blutentnahme
Bovines Serum Albumin (Trägerprotein)
B-Zell-Rezeptor
Konzentration
Komplementfaktor 4
Knock-out-Mäuse, denen das Gen für den Komplementfaktor 4 fehlt
Cluster of Differentiation (Oberflächenantigene)
Chicken Gamma Globulin (Immunglobulin vom Huhn, Trägerprotein)
Komplementrezeptor 2
Knock-out-Mäuse, denen das Gen für die Komplementrezeptoren 2/1 fehlt
Dimethylsulfoxid (C20H16N2OH)
Enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym-Immuno-Assay)
Apoptose induzierender Rezeptor (Apo-1, CD95), bindet TNF-ähnlichen FasLiganden (CD95L)
Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
Follikuläre Dendritische Zelle
Fluoresceinisothiocyanat (Fluoreszenzfarbstoff)
Forward Scatter (gebrochenes Licht im Durchflußfluoreszenzzytometer,
Maß für Größe der Zelle)
Germinal Centre (Keimzentrum)
Horse Radish Peroxidase (Enzym)
Immunglobulin der Klasse G
Injektion
intraperitoneal
Interdigitierende Retikuläre Zelle
Interleukin
Keyhole Limpets Hemocyanin (Trägerprotein)
4-Hydroxy-3-Nitrophenylacetyl (Antigen)
Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
Phycoerythrin (Fluoreszenzfarbstoff)
Peanut-Agglutinin (Selectin der Erdnuss)
p-Nitrophenyl Phosphat (Substrat der Alkaline Phosphatase)
Umdrehungen pro Minute
6
RT:
SLE:
SS:
TdT:
TNF:
Tnp:
TUNEL:
w:m:
wt:
Raumtemperatur, ca. 22°C
Systemischer Lupus Erythematodes (Autoimmunerkrankung)
Sideward Scatter (seitlich weggebrochenes Licht im
Durchflußfluoreszenzzytometer, Maß für Granularität der Zelle)
Terminale Desoxynukleotidyltransferase (Enzym)
Tumor Nekrose Faktor
2,4,6-Trinitrophenyl (Antigen)
TdT mediated dUTP nick end labeling (Verfahren zum Nachweis
apoptotischer Zellen)
Verhältnis der von einer bestimmten Krankheit befallenen weiblichen zu den
an der selben Erkrankung leidenden männlichen Patienten
Wildtypmäuse
7
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem und Autoimmunität
Das Immunsystem dient dem Schutz eines Körpers gegen fremde, potentiell schädigende
Reize von außen. Es muß in der Lage sein, Fremdes von eigenem zu unterscheiden und die
Reaktion daraufhin anzupassen, d.h. Körpereigenes zu tolerieren und Körperfremdes
wirksam zu bekämpfen1.
Das Immunsystem läßt sich einteilen in angeborene und erworbene Immunität. Die
Komponenten des angeborenen Immunsystems, wie z.B. die phagozytären Zellen, sind in
der Lage, eine große Gruppe eindringende Erreger anhand bestimmter, feststehender
Erkennungsmoleküle als fremd zu identifizieren und diese schnell unschädlich zu machen.
Die Komponenten des sog. erworbenen Immunsystems, deren Reaktion man auch als
adaptive („anpassungsfähige“) Immunantwort bezeichnet, sind in der Lage, neue
Strukturen auf potentiell schädlichen „Eindringlingen“ zu erkennen und zu bekämpfen.
Jede der Zellen des adaptiven Immunsystems (wie B- oder T-Lymphozyten) erwirbt
während ihrer Entwicklung die Fähigkeit eine definierte Struktur, das „Antigen“, mit Hilfe
bestimmter Rezeptoren (T-Zell-Rezeptor, Immunglobuline der B-Zellen) zu erkennen und
eine Immunantwort gegen diese einzuleiten. (Tab.1)
Merkmale der adaptiven (erworbenen) Immunantwort
Erkennungsmoleküle der Wirbeltiere werden in jedem Individuum neu entwickelt
Rezeptoren und Antikörper (Immunglobuline) haben eine hohe Variabilität (Diversität)
Verstärkung beim zweiten Kontakt
Gedächtnis
neuentwickelte Antikörper sind potentiell autoreaktiv
Tabelle 1:
Merkmale der adaptiven Immunantwort
Dabei besteht die Gefahr, daß Zellen entstehen, die körpereigene Antigene
fälschlicherweise als fremd erkennen und bekämpfen. Verschiedene Mechanismen, wie die
Induktion des Zelltods („Apoptose“) oder die Inaktivierung („Anergie“) solcher
autoreaktiver Zellen, sorgen physiologischerweise für die Toleranz des Immunsystems
dem eigenen Körper gegenüber. Diese Toleranzinduktion ist sehr effektiv und wird durch
ein komplexes System reguliert, das bis heute nicht ganz verstanden ist. Dennoch kommt
8
es immer wieder vor, daß Zellen des Immunsystems, deren Aufgabe es eigentlich ist, einen
Organismus schützen, diesen angreifen. Es kommt zur Autoimmunität.
Ein Beispiel für das Versagen der Toleranzerhaltung ist die Autoimmunerkrankung
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE), bei der antigenspezifische Proteine
(Antikörper) gegen körpereigene Antigene von autoreaktiven B-Lymphozyten (Zellen des
erworbenen Immunsystems) gebildet werden. Der wichtigste genetische Risikofaktor für
diese Erkrankung ist der Mangel an frühen Komplementkomponenten (C1, C4 und C2).
Das Komplementsystem besteht aus einer Gruppe von Serumproteinen, die verschiedene
Funktionen sowohl in der angeborenen als auch in der erworbenen Immunität erfüllen.
In dieser Arbeit möchte ich auf den Zusammenhang zwischen dem Mangel an frühen
Komplementkomponenten und der Entstehung von autoreaktiven B-Lymphozyten, deren
Produkte dann pathogenetisch für die Autoimmunerkrankung SLE bedeutsam sind,
eingehen. Dazu wird der Einfluß des Komplementmangels auf einen bestimmten Schritt
der peripheren Toleranzentwicklung untersucht: die Apoptose von potentiell autoreaktiven
B-Zellen im Keimzentrum.
1.2 B-Lymphozyten
1.2.1
Entwicklung der B-Lymphozyten
Die Bildung der B-Lymphozyten beginnt bei Säugetieren in der fetalen Leber. Nach der
Geburt setzt sich dieser Prozeß im Knochenmark fort. (Abb.1, S.10) Dort entwickeln sie
sich von frühen Pro-B-Zellen (Vorläuferzellen, die von pluripotenten hämatopoetischen
Stammzellen abstammen) über verschiedene weitere Stadien zu naiven B-Zellen, die das
Knochenmark verlassen und in die peripheren Lymphorgane auswandern. Zu diesem
Zeitpunkt tragen die B-Lymphozyten schon charakteristische Merkmale: sie exprimieren
auf ihrer Oberfläche den B-Zell-Rezeptor (ein membranständiges Immunglobulin der
Klasse M) und den noch unvollständigen Korezeptorkomplex bestehend aus CD19 und
TAPA-1 (CD81). (Abb.2, S.10) Außerdem tragen sie weitere Rezeptoren, wie CD45R
(B220), CD40, CD20 und MHC-Moleküle der Klasse II.
9
Zentral:
Knochenmark
Entwicklung
Stammzelle Pro-
Prä-
Peripher:
Milz, Lymphknoten, ...
unreife
reife/
Zentroblast Zentrozyt Plasmazelle
naive
m-IgM,
s-IgM,
s-IgG, ss-IgM
m-IgD
s-IgG
IgA, s-IgE
vollständiger Korezeptorkomplex
(CD19, CD21/35, CD81...)
Keimzentrum: Proliferation/
somatische Mutation/IgKlassenwechsel
m-µm-IgM
Kette
wenig
CD19
Korezeptoren
CD19
Rekombination unterschiedlicher
Immunität/
V-D-J Kopplung schwerer und
Diversität
leichter Ketten
Antigeninduzierte Apoptose (jedes
follikuläre
Antigen), Anergie, RezeptorToleranzinduktion
Exklusion
Editierung
Immunglobuline
Abbildung 1:
Antigeninduzierte Apoptose (hohe
Konz.), Fas-induzierte Apoptose
Entwicklung der B-Lymphozyten2
Nachdem die B-Zellen das Knochenmark verlassen haben, zirkulieren sie mit dem Blut
und der Lymphe durch die sekundären lymphatischen Organe des Körpers, wie Milz,
Lymphknoten, oder die lymphatischen Gewebe der Schleimhäute. Dort findet man die BZellen vor allem in abgegrenzten Regionen, den Follikeln. Ruhende reife B-Zellen
scheinen das spezielle Mikromilieu, das von den dortigen Stromazellen und den
Follikulären Dendritischen Zellen (FDC) gebildet wird, zum Überleben zu benötigen3-5.
Diese reifen B-Zellen unterscheiden sich von den unreifen B-Zellen des Knochenmarkes
durch einige Oberflächenmoleküle. Sie exprimieren zusätzlich zu dem Immunglobulin der
Klasse M eines der Klasse D (IgD), sowie einen vollständigen Korezeptorkomplex inkl.
des Komplementrezeptors 2 (CD21)6. (Abb.2)
Abbildung 2:
B-Zellrezeptor (BZR) und Korezeptorkomplex
(CD81/TAPA,CD19,CD21/CR2)
(Quelle:www.immunology.klimov.tom.ru/fig35.gif)
10
1.2.2
Effektorfunktionen der B-Lymphozyten: die adaptive humorale
Immunantwort
Ein wichtiger Bestandteil der adaptiven humoralen Immunantwort (humoral von lat.
humor, Flüssigkeit, d.h. den nicht zellulären Anteilen) sind die Antikörper oder
Immunglobuline, welche von den B-Lymphozyten produziert werden. Um Antikörper
gegen ein bestimmtes Antigen produzieren zu können, muß die reife, für das spezielle
Antigen spezifische B-Zelle aktiviert werden. Bei der Immunantwort gegen T-Zellabhängige Antigene, wie z.B. Proteinstrukturen auf Bakterien, geschieht dies durch
Interaktion der B-Zellen mit anderen Zellen des Immunsystems, wie beispielsweise
antigenpräsentierenden Zellen oder T-Lymphozten, die für das gleiche Antigen spezifisch
sind7.
Dringt ein Antigen in den Körper ein, so wird es von Zellen des phagozytären Systems
aufgenommen und in die T-Zell-Zone der sekundären lymphatischen Organe transportiert4.
Dort wird es von Interdigitierenden Retikulären Zellen (IDC) festgehalten, verarbeitet, und
zirkulierenden B- und T-Lymphozyten präsentiert. Zellen mit für dieses Antigen
spezifischen Rezeptoren werden in dieser Zone festgehalten und können interagieren und
proliferieren8. T-Helferzellen, eine Unterart der T-Lymphozyten, regen B-Zellen
wahrscheinlich über Interaktion mit dem Rezeptor CD40 der B-Zellen und eine Reihe von
Zytokinen wie IL-4, 5 und 6 zur Proliferation an9-11 und bilden zusammen mit diesen sog.
primäre oder extrafollikuläre Foci12. In diesen Foci reifen einige der B-Zellen weiter aus8
und beginnen die Produktion erster Antikörper gegen das Antigen8 noch mit niedriger
Affiniät13. Die Foci in der T-Zell-Zone bleiben bis ca. zum zehnten Tag nach dem ersten
Kontakt mit dem Antigen bestehen. Sie sind verantwortlich für den ersten Teil der
adaptiven Immunantwort.
Etwa vier Tage nach Kontakt mit dem Antigen wandern einige der aktivierten, aber noch
nicht ausgereiften B-Zellen zusammen mit den T-Zellen, von denen sie aktiviert wurden, in
die Follikel der B-Zell-Zone der lymphatischen Organe aus8,14,15. Dort bilden sie
zusammen mit den dort ansässigen FDCs sog. Keimzentren (GC), hochkomplexe
Strukturen weiterer Reifung und Proliferation von B-Lymphozyten8. (Abb.3, S.12)
11
Abbildung 3:
Schematischer Aufbau eines Keimzentrums im lymphatischen
Gewebe umgeben von ruhenden Lymphozyten der Follikel
In der „dunklen“ Zone des Keimzentrum machen die B-Zellen, nun Zentroblasten genannt,
eine Phase intensiver Proliferation durch. Dabei kommt es verstärkt zu Punktmutationen
innerhalb der Gene für die Immunglobuline16. Durch diesen Prozeß, der als Somatische
Hypermutation bezeichnet wird, entstehen B-Zell-Klone mit leicht modifizierten
Rezeptoren17. Diese Klone können das zu bekämpfende Antigen entweder mit höherer,
niedrigerer oder derselben Affinität erkennen als der Ausgangsklon. In der „hellen“ Zone
des Keimzentrums konkurrieren die so entstandenen B-Zellen, Zentrozyten, untereinander
um das auf den dortigen FDCs in Form von Antikörper-Antigen-Komplement-Komplexen
gebundene Antigen8. Nur Zellen, die das Antigen mit höherer Affinität binden, erhalten
kostimulatorische Signale, die für Ihr Überleben notwendig sind18. Die anderen sterben ab
oder werden anergisch15. Durch diesen Selektionsprozeß, den man auch als
Affinitätsreifung bezeichnet, wird sichergestellt, daß B-Zellen mit immer höherer
Spezifität für das Antigen entstehen8,9.
Diese hochaffinen Zentrozyten reifen unter dem Einfluß von T-Helferzellen19 weiter aus
und wechseln die Immunglobulinklasse20, wobei sich ein Teil von ihnen zu langlebigen BGedächtniszellen differenziert, und der Großteil als antikörpersezernierende Plasmazellen
ins Knochenmark wandert21-23.
Die Gedächtniszellen (erkennbar an einigen Oberflächenmarkern wie CD3824, CD4425 und
IgD20) sorgen im Rahmen einer zweiten Immunreaktion gegen das gleiche Antigen für eine
schnellere und gerichtetere Immunantwort26.
12
1.2.3
Produkte der B-Lymphozyten: Immunglobuline
Immunglobuline sind die antigenspezifischen Produkte von B-Lymphozyten. Sezerniert
tragen sie als Antikörper entscheidend zum Erfolg der adaptiven Immunantwort bei,
membranständig beeinflussen sie als B-Zell-Rezeptor (oder Antigenrezeptor) das Schicksal
der Zelle. Alle von einer bestimmten Zelle produzierten Antikörper (membrangebunden
oder in löslicher Form) weisen dieselbe Struktur ihrer variablen Region auf, d.h. sie sind
zunächst für dasselbe Antigen spezifisch. (Abb.4) Beispielhaft seien hier einige der
Funktionen von Antikörpern genannt: Markierung von Fremdkörper wie Bakterien für das
Immunsystem („Opsonisierung“), Neutralisation von Toxinen oder Viren, und das
Auslösen der Komplementkaskade.
Abbildung 4: Aufbau eines Immunglobulins
Das Antikörpermolekül selbst besteht aus vier
Aminosäureketten, zwei schweren (H) und zwei
leichten (L), die jeweils aus zwei Teilen bestehen:
der antigenbindenden Region, die von
Antikörper zu Antikörper sehr unterschiedlich
ist, und deshalb als variable Region bezeichnet
wird, und der konstanten Region, die die
Effektormechanismen
des
Immunsystems
auslöst, von der es nur fünf Hauptformen oder
Isotypen gibt. Dabei kann eine variable Region
zusammen mit jeder beliebigen konstanten
Region exprimiert werden, dies erfolgt durch
den Klassenwechsel.
Die fünf Hauptformen oder Isotypen der Immunglobuline sind IgM, IgG, IgD, IgA und
IgE, wobei beim Menschen noch die Unterklassen IgA1 und IgA2 sowie IgG1-4
unterschieden werden. Bei Mäusen werden die Unterklassen IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3
unterschieden27.
Unreife B-Zellen exprimieren zunächst IgM, nach Ausreifung auch IgD. Nach ihrer
vollständigen Reifung zu Plasmazellen sezernieren sie zunächst auch nur Antikörper der
Klasse IgM. Somit sind die ersten Antikörper, die im Laufe einer Immunantwort gegen ein
Antigen gebildet werden, IgM-Antikörper. Erst später, nach weiterer Aktivierung der
Zellen in Keimzentren, erfolgt der Klassenwechsel zu einem der anderen Isotypen. Je nach
Art der Infektion bilden die Zellen dann IgG-, IgA- oder IgE-Antikörper. Dabei kommt
beispielsweise IgA beim Schutz der Schleimhäute, IgE bei der Mastzellaktivierung zur
Abwehr parasitärer Infektionen, IgG1 und IgG3 (IgG2b bei der Maus) in der Abwehr
13
bakterieller7 und IgG2 (IgG2a bei der Maus) in der Abwehr viraler Infektionen7,28
besondere Bedeutung zu. Über die Funktion des IgG4 (IgG3 der Maus) ist noch wenig
bekannt. Diese unterschiedliche Differenzierung der B-Lymphozyten wird durch
verschiedene Zytokine, die von zwei unterschiedliche Untergruppen der T-Helferzellen
(TH-1- und TH-2-Zellen) sezerniert werden, induziert. So wird die Immunantwort gegen
eine Proteinantigen oder ein proteingebundenes Hapten über die Ausschüttung von IL-4
durch TH-1-Zellen ebenfalls IgG1-dominiert7.
1.3 Das Komplementsystem: Bindeglied zwischen angeborener und
adaptiver Immunantwort
1.3.1
Allgemeine Funktionen des Komplementsystems
Eine Gruppe von ca. 30 verschiedenen Plasmaproteinen, die nach der Reihenfolge ihrer
Entdeckung mit C1-9 sowie einigen Buchstabenkombinationen benannt werden, wird als
Komplementsystem bezeichnet29,30. Komplement spielt eine zentrale Rolle in vielen
Bereichen des Immunsystems wie bei der Abwehr von bakteriellen Erregern, bei der
Modulation von Entzündungsreaktionen, bei der Eliminierung von Immunkomplexen und
bei der Regulation der Antikörperproduktion.
Derzeit sind drei Möglichkeiten zur Aktivierung der Effektorfunktionen von Komplement
bekannt: der klassische, der alternative und der Mannose-bindendes-Lektin (MBL)-Weg.
Beim klassischen Weg erfolgt die Komplementaktivierung durch Immunkomplexe,
bestehend aus Antigenen (z.B. Epitopen auf Krankheitserregern) und Antikörpern wie IgM
und IgG. Über die Komplementfaktoren C1q, r und s wird C4 gespalten und damit
aktiviert. Das größere Spaltprodukt von C4, C4b (das kleinere wird als C4a bezeichnet)
bindet an eine Zieloberfläche und bildet gemeinsam mit C2 eine C3-Konvertase. Beim
alternativen Weg wird die spontan aktivierte Komplementkomponente C3 direkt an die
Pathogenoberfläche gebunden und bildet mit weiteren Faktoren ebenfalls eine C3Konvertase. Ein relativ neu entdeckter weiterer Aktivierungsweg erfolgt über MBL, eine
Serumkomponente, welche an Mannose- oder N-acetylglukosaminhaltige Proteine oder
Kohlenhydrate
auf
teilweise
verkapselten
Bakterien
bindet
und
dort
eine
Komplementaktivierung ermöglicht.
Die gemeinsame Endstrecke aller drei Wege verläuft über die C3-Konvertase, die in der
Lage ist, C3 zu spalten und so zu aktivieren. C3b induziert dann die Aktivierung weiterer
14
Komplementfaktoren wie C5-C9. Diese bilden den Membranangriffskomplex (MAC),
einen Komplex aus mehreren Proteinen, der eine Pore in der Membran bildet. (Abb.5) Das
Durchbrechen der Membran führt dann zu Verlust der zellulären Homöostase und
schließlich zur Zerstörung der Zelle /des Pathogens.
Abbildung 5:
Funktionen der verschiedenen Komplementspaltprodukte
Komplementspaltprodukte wie C3b, C3a, C4a oder C5a haben noch weitere Funktionen im
Rahmen
der
angeborenen
31
Analphylatoxine ,
d.h.
Immunität:
sie
wirken
Entzündungsmediatoren,
die
auch
als
u.a.
Opsonine
oder
Vasopermeabilität,
Mastzelldegranulation und Leukozytenchemotaxis beeinflussen. (Abb.5)
Des weiteren spielen Komplementfaktoren in der Beseitigung von zirkulierenden
Immunkomplexen sowie von apoptotischem Zellmaterial eine Rolle32,33. C1, C4 und C3
binden an die Immunkomplexe, wobei C1q die Löslichkeit von solchen zirkulierenden
Komplexen erhöht, und deren Präzipitation in Geweben verhindert34. C3b und C4d fördern
wahrscheinlich die Aufnahme der Immunkomplexe über zugehörige Rezeptoren auf Zellen
des phagozytären Systems35. (Abb.5)
1.3.2
Frühe Komplementkomponenten: Funktionen im Rahmen der erworbenen
Immunität und der Toleranzinduktion
Die Bedeutung des Komplementsystems für die adaptive humorale Immunantwort konnte
bereits 1972 durch die Anwendung des Cobra Venum Factor (Dekomplementierung)
gezeigt werden36. Seitdem wurde diese Beobachtung in verschiedenen Modellen bestätigt
(Übersicht37-39). In späteren Arbeiten konnte unter Verwendung von Knock-out-Mäusen
15
die Bedeutung einzelner Komponenten des klassischen Aktivierungsweges (C1q40, C2,
C336,39 und C439) für die humorale Immunantwort präzisiert werden.
Vor allem diese „frühen“ Komponenten des klassischen Aktivierungsweges beeinflussen
die Antikörperbildung. Im Verlauf der Komplementaktivierung kommt es dabei zur
Integration von C3d in Immunkomplexe41. (Abb.5, S.15)
Ihre Wirkung auf die humorale Immunantwort entfalten die Komplementkomponenten
über die spezifische Bindung an Komplementrezeptoren42-44. (Tab.2) In der vorliegenden
Arbeit wird vor allem auf die Bedeutung des für die B-Zell-Funktion wichtigen
Komplementrezeptors 2 (CR2, CD21) eingegangen. Dieser Rezeptor wird bei Mäusen auf
dem gleichen Gen codiert wie der Komplementrezeptor 1 (CR1, CD35). Durch alternatives
„Splicen“ entstehen die beiden Rezeptoren, die einen sehr ähnlichen Aufbau haben. Vor
allem im murinen System ist es bis jetzt nicht möglich, alle Funktionen der beiden
Rezeptoren klar zu unterscheiden45, weshalb diese in vielen Veröffentlichungen zu
CD21/35 (CR2/1) zusammengefaßt werden.
Name
Liganden
Vorkommen
Auswahl von bekannten /
vermuteten Funktionen
stimuliert Phagozytose,
CR1
(CD35)
C3b, C4b,
B-Zellen, FDCs, Granulozyten,
Transport von Immunkomplexen
C3d, iC3b,
Monozyten/ Makrophagen,
durch Erythrozyten46
C3dg, C4d
Erythrozyten
Verstärkung der Immunantwort
Toleranzentwicklung?
CR2
(CD21)
C3dg,C4d,
iC3b
CD18)
CR4
(CD11c/
CD18)
Tabelle 2:
reife B-Zellen, FDCs
CD23
CR3
(CD11b/
Teil des B-Zell-
C3d, iC3b,
C3dg,
iC3b
Korezeptorkomplexes
Verstärkung der Immunantwort
Toleranzentwicklung?
Monozyten /Makrophagen, NKZellen, Granulozyten
stimuliert Phagozytose
Monozyten /Makrophagen,
aktivierte B-Zellen, Granulozyten,
stimuliert Phagozytose
Thrombozyten
Komplementrezeptoren, deren Nomenklatur und Liganden im murinen System10,47-49
(Die kleinen Buchstaben kennzeichnen die unterschiedlichen Spaltprodukte der
Komplementkomponenten)
16
Ein Fehlen der Rezeptoren (CR2/1, CD21/35) wie bei Knock-out-Mäusen (Cr2-/-) macht
sich in einer reduzierten Antikörperantwort auf T-Zell-abhängige Antigene bemerkbar43,5054
. Vor allem die Bildung von Keimzentren zur Produktion hochaffiner Antikörper und
Gedächtniszellen scheint durch den Mangel oder die Blockade von Komplement oder
Komplementrezeptoren gestört39,55-57. Die Immunantwort gegen T-Zell-unabhängige
Antigene und bekapselte Bakterien ist bei Cr2-/-Mäusen ebenfalls stark eingeschränkt54.
Man findet diese Rezeptoren vor allem auf zwei für die Etablierung der Antikörperantwort
wichtigen Zellpopulationen: auf den B-Lymphozyten, wobei der Komplementrezeptor 2
(CD21) Teil des Korezeptorkomplexes ist58,59 (im Gegensatz zu CD3553), und auf den
Follikulären Dendritischen Zellen (FDC) der B-Zell-Zonen in den peripheren
lymphatischen Organen58. Auf beiden Zellpopulationen hat eine Stimulation von CD21/35
Auswirkungen
auf
den
Verlauf
einer
Immunantwort.
Dabei
können
frühe
Komplementkomponenten direkt oder indirekt über C3 (klassischer Aktivierungsweg) als
Liganden der Rezeptoren CD21 oder der alternativen Spliceform CD35 wirken.
Die Stimulation des Korezeptorkomplexes, zu dem auch CD21 gehört, zusammen mit der
Stimulation des B-Zell-Rezeptors verstärkt dessen Signal innerhalb der B-Zelle60,61, sodaß
man, falls das Antigen mit Komplement (C3d) besetzt ist, eine geringere Dosis des
Antigens benötigt, um eine humorale Immunantwort auszulösen62. (Abb.5, S.15) Die
Stimulation des Korezeptorkomplexes zusammen mit dem B-Zellrezeptor scheint die
Schwelle, die für die Reaktion der Zelle auf den Stimulus „Antigen“ notwendig ist, zu
senken59.
Die Funktion von CD21 auf B-Zellen ist nicht auf die Aufgaben als Teil des
Korezeptorkomplexes beschränkt43,62,63. Die alleinige Kreuzvernetzung von CD21/35 kann
B-Zellen aktivieren61,64. Um innerhalb eines Keimzentrums zu überleben benötigt eine BZelle die Stimulation von CD21/35, z.B. über die Bindung von CD23, einem sowohl
löslich als auch membranös vorliegendem Liganden von CR2/158,65. B-Zellen von
Komplementrezeptor-Knock-out-Mäuse (Cr2-/-) verlieren den Konkurrenzkampf mit
normalen B-Zellen um follikuläre Retention und damit um das Überleben im
Keimzentrum66.
Die Bedeutung von CD21/35 für die humorale Immunantwort liegt nicht nur in dessen
Präsenz auf B-Zellen, sondern begründet sich auch in seiner Funktion auf Follikulären
Dendritischen Zellen (FDC) des Keimzentrums. Dort kann der Komplementrezeptor 2/1
komplementbehaftete Immunkomplexe festhalten, und damit den proliferierenden B-Zellen
17
das Antigen wirksamer präsentieren43,67,68. Dies scheint insbesondere für die Entwicklung
einer Gedächtniszellfunktion vonnöten zu sein69.
Neben der Bedeutung des Komplementsystems für die humorale Immunantwort (positive
Regulation von B-Zellen) gibt es viele Hinweise darauf, daß auch die Toleranzinduktion
(negative B-Zell-Regulation, Kapitel 1.4.1) von Komplement beeinflußt wird54,70,71.
Es konnte gezeigt werden, daß CD21 und CD35 (CD21/35) einen Einfluß auf die
Toleranzinduktion von B-Zellen haben70,72,73. Zudem gibt es Hinweise auf einen
Zusammenhang von CD21/35-Defizienz und der Autoimmunerkrankung SLE45,48,63,70.
(Kapitel 1.5.1)
Auch
eine
CD21/35-unabhängige
Regulation
der
Toleranzentwicklung
durch
Komplementfaktoren ist denkbar. Verschiedene Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der
frühen Komplementkomponenten C1q und C4 für die Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz
unabhängig von C3 und den bekannten Komplementrezeptoren4,58,74. Auf welche
Strukturen C1q und C4 direkt wirken sollen, und über welche Mechanismen eine Reaktion
ausgelöst wird, ist jedoch noch nicht bekannt, und wird in dieser Arbeit diskutiert.
Komplement in der erworbenen Immunität
Komplementrezeptoren auf reifen naiven (ruhenden) B-Zellen ermöglichen das
Überleben im Follikel
Komplementrezeptoren auf reifen B-Zellen reduzieren den für deren Aktivierung
nötigen Schwellenwert und erleichtern damit eine Immunantwort bei suboptimalen
Antigenkonzentrationen43
Komplementrezeptoren auf Follikulären Dendritischen Zellen (FDC) im Keimzentrum
werden für die effektive Präsentation des Antigens benötigt
Bedeutung in der Toleranzinduktion von B-Zellen
Tabelle 3:
Funktionen früher Komplementkomponenten im Rahmen der adaptiven
(erworbenen) Immunantwort
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß vor allem frühe Komplementkomponenten wie C1,
C2, C3 und C4 eine wichtige Rolle im Ablauf der adaptiven Immunantwort sowie der
Toleranzinduktion spielen. (Tab.3)
18
1.4 Toleranzentwicklung
1.4.1
Toleranzentwicklung der B-Zellen
Bei der Entwicklung der B-Lymphozyten entstehen Zellen, von denen jede ein bestimmtes
Antigen aus einer Vielzahl von möglichen Antigenen erkennt. Darunter können auch
Selbstantigene, d.h. Merkmale körpereigener Zellen, sein. Um solche selbstreaktiven
Zellen zu identifizieren und unschädlich zu machen, haben sich im Laufe der Evolution
verschiedene Mechanismen herausgebildet, deren Gesamtheit als Toleranzentwicklung
bezeichnet wird. Nach dem Ort, an dem sich diese Selektion abspielt, unterscheidet man
zentrale und periphere Toleranzinduktion75.
Da im Knochenmark, dem Ort der zentralen Toleranzentwicklung, in der Regel nur
körpereigene Antigene präsent sind, werden bei der zentralen Toleranzentwicklung alle
Zellen, die im Knochenmark Antigen binden, in ihrer Entwicklung unterdrückt76. So
können unreife B-Lymphozyten, deren Immunglobulingene zu einem autoreaktiven IgMRezeptor rekombiniert wurden, entweder absterben77, inaktiviert überleben („anergisch“
werden)77,78 oder ihre Immunglobulingene neu arrangieren79. Ziel ist es, nur selbsttolerante Zellen in die Peripherie zu entlassen. (Tab.4)
Zentrale Toleranz von B-Zellen
negative Selektion: jedes Antigen im Knochenmark induziert in unreifen B-Zellen
Toleranz:
hohe Affinität des B-Zell-Rezeptors zu dem präsentierten Antigen/
membrangebundenes Antigen:
Rezeptoreditierung (Austausch eines Teiles des
Rezeptors, „zweite Chance“) oder Apoptose (programmierter Zelltod)
niedrige Affinität des B-Zell-Rezeptors zu dem präsentierten Antigen/ lösliches
Antigen: Anergie (Reduzierte Lebensdauer, reduzierte Aktivierbarkeit)
Tabelle 4:
Mechanismen der zentralen Toleranzentwicklung von B-Zellen6
Autoreaktive Zellen, die den zentralen Selektionsprozeß überlebt haben (anergische Zellen
oder Zellen, die einen Rezeptor für ein nicht im Knochenmark präsentes Selbstantigen
tragen), können auch später noch im Rahmen der peripheren Toleranzinduktion8,76 durch
mangelnde Aktivierung in den peripheren lymphatischen Geweben (follikuläre
Exklusion)3,5,78 oder direkt über zytotoxische T-Lymphozyten78 abgetötet werden.
19
Auch bei dem Prozeß der somatischen Hypermutation der B-Zellen in den Keimzentren
der peripheren lymphatischen Gewebe können autoreaktive B-Zellen entstehen8,17,80. Die
Elimination dieser Zellen ist ebenfalls ein Teil der peripheren Toleranzinduktion81. (Tab.5)
Periphere Toleranz von B-Zellen im Keimzentrum
Überleben im Keimzentrum nur mit Hilfe kostimulatorischer Signale, bei fehlender
Stimulation =>Apoptose der B-Zelle
Keine T-Zelle mit einem für das Autoantigen passenden Rezeptor => keine
Kostimulation der autoreaktiven B-Zelle =>Apoptose der autoreaktiven B-Zelle
Antigeninduzierte Apoptose durch hohe Konzentrationen an Antigen (Besetzung der
B-Zell-Rezeptoren mit Antigen => dadurch keine kostimulatorischen Signale von FDC
=> Apoptose der B-Zellen)
Fas (CD95)-induzierte Apoptose durch zytotoxische T-Zellen
verschiedene Einflußfaktoren auf die Apoptose im Keimzentrum
Einfluß von Komplement?
Tabelle 5:
Modell der peripheren Toleranzinduktion
Ein Teil der so entstandenen autoreaktiven B-Zellen wird durch fehlende Kostimulation
eliminiert: die im Keimzentrum proliferierenden B-Zellen (Zentrozyten) können nur mit
Hilfe
kostimulatorischer
Signale
von
T-Lymphozyten
(CD
154/CD40)
oder
antigenpräsentierenden FDC (B-Zell-Rezeptor) überleben82. Es sollte aufgrund der
Toleranzinduktion in der Entwicklung der T-Lymphozyten keine T-Helferzelle geben, die
dasselbe Antigen wie eine potentiell autoreaktive B-Zelle erkennt und die weitere
Entwicklung dieser Zelle fördert9,83. Einer solchen B-Zelle fehlt somit die Stimulation von
CD40 durch T-Zellen. Dazu kommt, daß eine B-Zelle, die in der somatischen
Hypermutation ihren Rezeptor so verändert, daß dieser nun Selbstantigen erkennt, das auf
den FDCs präsentierte Fremdantigen wahrscheinlich schlechter als konkurrierende
Zentrozyten erkennt. Diese autoreaktive Zelle erhält somit keine kostimulatorischen
Signale von den FDCs9. Da die Signale von FDCs und T-Helferzellen für das Überleben
der B-Lymphozyten im Keimzentrum notwendig sind, wird eine solche B-Zelle in den
meisten Fällen apoptotisch13,76, d.h. sie stirbt ab und wird von umliegenden Makrophagen
phagozytiert.
Ein weiterer Mechanismus der Selektion soll den Körper wahrscheinlich vor der
Entstehung von Autoantikörpern gegen lösliche, in den Keimzentren in großer Zahl
20
vorhandenen Antigenen -wie beispielsweise den Serumproteinen- schützen: eine extrem
hohe Konzentration an löslichem Antigen in einem Keimzentrum löst in einer für dieses
Antigen spezifischen B-Zelle Apoptose aus (Antigeninduzierte Apoptose). (Tab.5, S.20)
Auch im Keimzentrum töten zytotoxische T-Lymphozyten autoreaktive B-Zellen über
Stimulation von deren Fas-Rezeptors (CD95)8,47,78,84,85. Auf welche Signale hin diese
Selektion geschieht, ist nicht abschließend geklärt. Sicher ist, daß eine Vielzahl
regulierender Faktoren (z.B. IL-4) einen Einfluß auf das Schicksal einer potentiell
autoreaktiven B-Zellen hat86.
Ob Komplementkomponenten die Apoptose von potentiell autoreaktiven B-Zellen im
Keimzentrum beeinflussen können, wird in dieser Arbeit untersucht.
Obwohl verschiedene Mechanismen der peripheren Toleranzinduktion bekannt sind, ist
bislang nicht erforscht, welche bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen versagen,
oder ob möglicherweise noch unbekannte Toleranzmechanismen einer Rolle spielen.
1.4.2
Apoptose, ein Mechanismus der Toleranzinduktion
Apoptose, eine Form des programmierten Zelltodes87, ist einer der wichtigsten
Mechanismen der Toleranzinduktion. Man beschreibt seit 1972 mit diesem Begriff ein
Programm von aktiven Vorgängen in einer Zelle, die letztendlich zum Tod derselben
führen. Verantwortlich für diesen Prozeß sind eine Reihe von intrazellulären Enzymen wie
die Caspasen, die für den korrekten Ablauf der Apoptose sorgen76.
Apoptose im Rahmen der B-Zellentwicklung
Im Knochenmark:
Apoptose von unreifen B-Lymphozyten, die Selbstantigen erkennen
oder einen inaktiven B-Zell-Rezeptor präsentieren
In der Peripherie:
Apoptose bei follikulärer Exklusion
Im Keimzentrum:
vermutlich Apoptose von B-Zellen mit autoreaktiven und
niedrigaffinen Rezeptoren
Nach abgelaufener Immunantwort:
Apoptose der nicht mehr benötigten antikörpersezernierenden Zellen
vermutlich Regulation der B-Gedächtniszellen und Plasmazellen
Tabelle 6:
Beispiele für Apoptose im Rahmen der B-Zellentwicklung6
21
Ein funktionsfähiger Apoptosemechanismus ist für den physiologischen Ablauf der
Immunantwort und vor allem für die Entwicklung der Selbsttoleranz von großer
Bedeutung. Dies zeigt sich eindrücklich an transgenen Tiermodellen, die Defekte in
verschiedenen für die Apoptose wichtigen Proteinen haben76. So entwickeln beispielsweise
lpr-Mäuse, denen ein funktionsfähiger Fas-Rezeptor (CD95) fehlt, oder gld-Mäuse, die den
dazugehörigen
Liganden
Fas-L
(CD95L)
nicht
exprimieren,
Zeichen
der
Autoimmunerkrankung SLE76,88,89. (Tab.6, S.21)
Es können zwei verschiedene Formen der Apoptose unterschieden werden, die durch
unterschiedliche
Faktoren
induziert
werden.
Auch
regulieren
unterschiedliche
intrazelluläre Proteine (u.a. bcl-2, bax) den Ablauf der beiden Apoptoseformen76,90,91.
Eine Form der Apoptose (intrinsische oder mitochondriale Apoptose), wird bei BLymphozyten durch Zellgifte, ionisierende Strahlung, Nährstoffmangel oder ein starkes
Signal des Antigenrezeptors ohne gleichzeitige T-Zell-Hilfe92-94 ausgelöst, und beginnt mit
dem Abfall des transmembranen Potentials der Mitochondrien. Dadurch werden
verschiedene Moleküle wie Cytochrom C freigesetzt, die ihrerseits über intrazelluläre
Proteine (z.B. der bcl-2-Familie) die Bildung der Caspasen induzieren6,76.
Die zweite Form der Apoptose (extrinsische oder TNF-Rezeptor-assoziierte Apoptose)
wird durch die Stimulation von Oberflächenrezeptoren ansonsten intakter Zellen ausgelöst.
Diese Rezeptoren, wie der Fas-Rezeptor (CD95), aktivieren die Caspasen direkt6,76.
Sind die Caspasen aktiviert, so ist bei beiden Formen der weitere Ablauf sehr ähnlich. Eine
Zelle, die über einen der auslösenden Faktoren ein Signal zur Einleitung der Apoptose
erhalten hat, zeigt deutliche Zeichen der Dehydratation: sie wird kleiner und schmaler und
intrazelluläres Kalzium wird mobilisiert95. Zusätzlich wird der Zellkerninhalt kondensiert
und die nukleäre DNA durch endogene Nukleasen fragmentiert, während der Zellkern und
mikrotubuläre Strukturen aufgelöst werden. Obwohl das transmembrane Potential der
Mitochondrien dabei deutlich erniedrigt ist, bleiben diese und andere Zellorganellen
zunächst intakt und funktionsfähig96.
Gegen Ende des apoptotischen Programms werden Teile des Zytoplasmas zusammen mit
den Zellorganellen und den DNA-Stücken in Vesikel „verpackt“ und ausgeschleust. In vivo
werden diese sog. apoptotische Körperchen dann von umliegenden Makrophagen an
Oberflächenstrukturveränderungen (z.B. dem Erscheinen von Phosphatidylserin33) erkannt
und
phagozytiert,
ohne
daß
entzündungserregende
Zellbestandteile
in
den
Extrazellulärraum dringen können97. Dies unterscheidet die aktiv ablaufende Apoptose
22
normalerweise von anderen, passiven Formen des Zelltodes wie der Nekrose98. Dennoch
kann auch bei dem Prozeß der Apoptose eine Immunreaktion gegen Zellbestandteile
ausgelöst werden99.
Das schematisiert ablaufende Programm des aktiven Zelltodes ermöglicht es, apoptotische
Zellen mittels verschiedene Testverfahren kenntlich zu machen, was teilweise auch in
dieser Arbeit genutzt wurde. (Tab.7)
Merkmal
Testverfahren
Schrumpfung der Zelle
Lichtmikroskopische Auszählung
DNA-Fragmentierung (sog. Laddering) PCR, TUNEL-Test
Oberflächenstrukturveränderung,
Phosphatidylserin auf Zellmembran
Aktivierung von Enzymen
Zellkernkondensation
Nachweis mittels Annexin V in der
Fluoreszenzmikroskopie
/Durchflußfluoreszenzzytometrie
Caspasen-Nachweis (z.B. mittels
Durchflußfluoreszenzzytometrie)
Propidiumiodid u. a. Zellkernfarbstoffe
Tabelle 7: Auswahl von Testverfahren zur Erkennung apoptotischer Zellen
zusammen mit dem Merkmal, auf dem das Testverfahren beruht
1.5 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
Der Systemische Lupus Erythematodes ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die
Ablagerung von Immunkomplexen im Bindegewebe von Haut und Gefäßen verschiedener
Organe mit konsekutiver chronischer Entzündung der Gefäßwände charakterisiert wird.
Es erkranken überwiegend Frauen im gebärfähigen Alter (w:m = 10:1), wobei das
klinische Bild in Abhängigkeit von der Organbeteiligung wechselt, und von Patient zu
Patient sehr unterschiedlich ist. Die Erkrankung kann plötzlich beginnen, sie kann sich
aber auch schleichend über einen Zeitraum von Monaten bis Jahren entwickeln. Prinzipiell
kann jedes Organsystem Krankheitsmanifestationen aufweisen. Typischerweise findet man
die Beteiligung von Haut, Gelenken, Muskeln, Nieren, der Lunge, dem Zentralen
Nervensystem und serösem Gewebe (Pleura und Perikard)100. Häufige Symptome sind,
neben unspezifischen Allgemeinbeschwerden wie Fieber, Schwäche und Gewichtsverlust,
23
Muskel-
und
Gelenkbeschwerden,
charakteristische Hautveränderungen wie das
schmetterlingsförmige Erythem an Wangen und Nasenrücken, oronasale Ulzerationen oder
die erhöhte Photosensibilität der Haut.
Die Klassifikation der Krankheit erfolgt anhand der ACR-Kriterien (American College of
Rheumatology)101 bei denen auch bestimmte Marker im Serum Beachtung finden. So kann
man
im
Serum
von
Patienten
mit
SLE
Autoantikörper
gegen
verschiedene
Zellkernantigene102 (Antinukleäre Antikörper, ANA) wie doppelsträngige DNA, Sm, Ro,
La, Jo-1 oder Histone, sowie gegen diverse andere zytoplasmatische Antigene102, gegen
den Komplementfaktor C1q103, gegen Phospholipide102 und gegen verschiedene Blutzellen
nachweisen102. Zudem sind im entzündlichen Schub die Komplementfaktoren meist
erniedrigt102.
1.5.1 Theorien zur Entstehung des SLE
Der pathophysiologische Entstehungsmechanismus des SLE ist bis heute nicht endgültig
verstanden. Sicher ist, daß es zur Bildung von Autoantikörpern kommt, die zusammen mit
dem komplementären Antigenen Immunkomplexe bilden. Diese Immunkomplexe bestehen
zumeist aus DNA als Antigen, Anti-DNA Antikörper, Komplement und Fibrin41. Sie
lagern sich im Gewebe ab und lösen dort, u.a. über den klassischen Weg der
Komplementaktivierung46, eine Entzündungsreaktion aus78,104.
Man nimmt an, das sowohl genetische und hormonelle als auch Umweltfaktoren bei der
Entstehung der Krankheit eine Rolle spielen105.
Ein Zusammenhang zwischen SLE und dem Komplementsystem wurde erstmals
identifiziert, als Untersuchungen den reaktiv erniedrigte Komplementspiegel bei SLEPatienten nachwiesen. Später konnte wiederholt gezeigt werden, daß der häufigste
genetisch bedingte Risikofaktor für die Entstehung des SLE beim Menschen die Defizienz
einer frühen Komplementkomponente (C1, C4 und C2) ist37,106-112. Dabei ist die
Assoziation zwischen C1- oder C4-Defizienz und dem Auftreten von SLE besonders
stark113,114. Auch erworbene Komplementdefizienz begünstigt die Entwicklung von
SLE37,115,116.
Dieser
Zusammenhang
zwischen
dem
Mangel
an
frühen
Komplementkomponenten und dem Auftreten von SLE konnte auch im Tiermodell
nachgewiesen werden. So wurden bei C1q- und C4-Knock-Out Mäusen117,118 als auch bei
C2- bzw. C4-defizienten Meerschweinchen119 Zeichen eine Immunkomplexerkrankung
wie erhöhte Autoantikörper oder Glomerulonephritiden festgestellt. Nach neuen
24
Ergebnissen läßt sich auch eine Beteiligung der Komplementrezeptoren (CR2/1) über eine
direkte Interaktion von C4 mit CD21/35 (unabhängig von C3) in der Pathogenese des SLE
nicht mehr ausschließen48,63.
Im Gegensatz dazu sind beim Menschen wie auch bei der Maus C3-Defizienz und der
Mangel an Komplementkomponenten des Membranangriffskomplexes (C5-9) nicht mit
dem Auftreten von SLE assoziiert43,118. Zudem spielt die aktivierte Komplementkaskade in
der Entzündungsvermittlung und Verstärkung der Antikörperproduktion eine bedeutende
Rolle und wirkt dadurch krankheitsverstärkend120. Der protektive Effekt einiger früher
Komplementkomponenten scheint somit unabhängig von C3 und dessen Rolle in der
Entzündungsvermittlung zu sein118.
Es werden verschiedene Hypothesen für den pathogenetischen Wirkmechanismus der
Entstehung des SLE beim Mangel an frühen Komplementkomponenten postuliert.
Die erste Theorie geht von der Beobachtung aus, daß der B-Zell-abhängige Teil der
Immunantwort, der ja zur Produktion der für die Entwicklung des SLE pathogenetisch
wichtigen Antikörpern führt, über verschiedene Komplementkomponenten reguliert
wird36,58. Ein Komplementmangel könnte somit über eine gestörte Toleranzentwicklung
der B-Zellen die Krankheit initiieren46,58,71. Dabei können sowohl die zentrale als auch die
periphere Toleranzentwicklung betroffen sein. Da es vor allem zur Bildung von
Immunglobulinen der Klasse G kommt, die größtenteils erst nach dem Prozeß der
somatischen Hypermutation von B-Zellen im Keimzentrum gebildet werden, ist es
wahrscheinlich, daß die periphere Toleranzentwicklung betroffen ist47,121-123. Auch läuft
die bisher bekannte Regulation der B-Zellen über den Komplementrezeptor 2 (CD21),
(Kapitel 1.3.2) der erst auf reifen B-Zellen in der Peripherie des Immunsystems exprimiert
wird. (Kapitel 1.2.1) Somit könnte eine durch Komplementmangel bedingte Störung der
peripheren Toleranzentwicklung eine Ursache für die Entwicklung des SLE sein.
Als Folge des Komplementmangels könnte ein Apoptosedefekt die periphere
Toleranzentwicklung stören, da auch Mäuse, die einen defekten Fas-Rezeptors (CD95)
aufweisen (lpr/lpr-Mäuse), zu einer SLE-ähnlichen Erkrankung neigen, und dies bei
zusätzlicher Defizienz von Komplement C4 verstärkt wird47,70,124. Wenngleich
naheliegend, so wurde dieser Zusammenhang (Apoptosedefekt durch C4-Defizienz)
bislang allerdings nicht hinreichend untersucht. Dies soll deshalb Ziel dieser Arbeit sein.
25
Die zweite bedeutende Hypothese über die Entstehung des SLE basiert auf den
Beobachtungen, dass intraperitoneal (i.p.) applizierte apoptotische Körperchen als Quelle
für lupustypische Autoantigene weniger gut phagozytiert werden können, wenn C1q103,125
oder C4A35 fehlt47, und daß nicht phagozytierte apoptotische Zellen immunogen wirken
können99,126,127. Der Komplementmangel könnte somit durch Beeinflussung der
Phagozytose die Krankheit initiieren33,47,128. Dafür spricht auch, daß in Patienten mit SLE
die Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen im Germinalen Zentrum gestört
ist129. Allerdings spricht gegen diese Theorie, daß die komplementvermittelte Phagozytose
zumindest teilweise auch C3b benötigt, der Mangel an C3 allerdings nicht mit einem SLE
assoziiert ist.
26
1.6 Zielsetzung, Begründung der Fragestellung
Die Hauptaufgabe des Immunsystem ist es, effektiv körperfremde, potentiell gefährliche
Infektionserreger zu bekämpfen. Gleichzeitig muß es sicherstellen, daß körpereigene
Substanzen toleriert werden. Versagt diese Diskriminierung, kommt es zur Autoimmunität.
Ein wichtiger Bestandteil der erworbenen Immunabwehr sind die B-Lymphozyten, die
Antikörper produzieren. Ihre Entwicklung unterliegt einer strengen Regulation, um die
Entstehung von autoreaktiven Zellen und damit von Autoimmunerkrankungen zu
vermeiden. Dieser Prozeß wird auch als Toleranzinduktion bezeichnet. Ein bedeutender
Mechanismus zur Erhaltung der Selbsttoleranz während der Reifung der B-Lymphozyten
ist der programmierte Zelltod, der auch als Apoptose bezeichnet wird.
Dennoch kommt es bei manchen Menschen zum Verlust der Toleranz und zur Ausprägung
von Autoimmunerkrankungen. Ein besonderes Beispiel hierfür stellt der Systemische
Lupus Erythematodes (SLE) dar, eine Krankheit, bei der es zur Bildung von hochaffinen
Autoantikörpern gegen nukleäre Antigene durch B-Lymphozyten kommt. Diese
Antikörper werden als Auslöser von Entzündungsreaktionen in diversen Organen
angesehen. Ursächlich für die Entstehung der Erkrankung könnte somit eine Störung in der
Toleranzentwicklung von B-Lymphozyten sein. Autoreaktive B-Zellen, die eigentlich
absterben sollten, könnten dann überleben und ein Reaktion gegen körpereigene Antigene
auslösen. Der genaue pathophysiologische Entstehungsmechanismus des SLE ist aber bis
heute nicht endgültig verstanden.
Bekannt ist, daß ein Mangel an frühen Komplementkomponenten wie C1q, C2 oder C4 die
Entstehung des SLE begünstigt, und daß diese Komplementkomponenten einen
regulierenden Einfluß auf die B-Zell-Immunität über den Komplementrezeptor CD21
entfalten. In dieser Arbeit wurde daher die Hypothese untersucht, ob der Mangel an frühen
Komplementkomponenten über einen veränderten Apoptosemechanismus die periphere
Toleranzentwicklung der B-Zellen stört, und damit die Entstehung eines SLE begünstigt.
Diese Hypothese sollte in zwei unabhängigen Verfahren überprüft werden.
Zum einen wurde in vivo die Antigeninduzierte Apoptose in Abhängigkeit von
Komplement C4 unter Verwendung von C4-defizenten Knock-out-Mäusen mit Hilfe der
TUNEL-Methode und der spezifischen Antikörperproduktion untersucht. Zum anderen
wurde in vitro die Fas (CD95)-induzierte Apoptose in Abhängigkeit von der Stimulation
des Komplementrezeptors CD21 durchflußfluoreszenzzytometrisch analysiert.
27
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1
Mäuse
Als Wildtypkontrolle wurden Mäuse vom Stamm C57BL/6 (Charles River Laboratories,
Wilmington, USA) verwendet. Als komplementdefiziente Mäuse wurden C4-/-Mäuse vom
Stamm C57BL/6 eingesetzt (freundlicherweise von Prof. Michael C. Carroll [Harvard
Medical School Boston, USA] zur Verfügung gestellt).
Für die Versuche wurden zwischen 6 und zehn Wochen alte Weibchen verwendet.
Der Tierversuchsantrag für dieses Projekt vom 28.08.1998 wurde durch das Ministerium
für Natur und Umwelt des Landes Schleswig-Holstein bis zum 31.12.2000 bewilligt und
bis
zum
31.03.2004
verlängert
(Kennziffer
29/b/99).
Die
Einwilligung
der
Ethikkommission der Universität zu Lübeck liegt ebenfalls vor.
2.1.2
Zellinien (der in vitro Experimente)
WEHI 231:
Zellen eines B-Zell-Lymphoms der Maus [(BALB/c xNZB) F1], induziert
durch Mineralölinjektion, lymphoblastische Morphologie
Center for applied Microbiology& research (CAMR, ECACC, Salisbury,
UK)
WEHI 279:
Zellen eines B-Zell-Lymphoms der Maus [NZC], induziert durch
Bestrahlung, lymphoblastische Morphologie
Center for applied Microbiology & research (CAMR, ECACC, Salisbury,
UK)
Beide Zellinien wurden in einem miniPERM-Bioreaktor (Heraeus Instruments IN VITRO
Systems & Services GmbH, Osterode) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
Das Nährmedium bestand aus IMDM (BioWittaker, Cambrex, Belgien) dem 10% FCS
(PAA Laboratories GmbH, Österreich), 1% L-Glutamin (Biochrom, Berlin), 1% essentielle
Aminosäuren (BioWittaker, Cambrex, Belgien), 1% Natrium-Pyruvat (BioWittaker,
Cambrex, Belgien), 1% Penicillin-Streptomycin (Biochrom, Berlin) und 2µl 2Mercaptoethanol (Sigma, Steinheim) pro 500ml zugefügt wurden. Zwei mal pro Woche
wurden die Zellen im Verhältnis 1:2 mit frischem Medium versetzt, und die Zellinien
wurden nie länger als sechs Monate in Kultur gehalten.
28
2.1.3
Antigen
Np-(36)-CGG (Biosearch Technologies, Novato, USA)
Np-(24)-BSA (Biosearch Technologies, Novato, USA)
Np-(29)-KLH (Biosearch Technologies, Novato, USA)
Np-(24)-Ficoll (Biosearch Technologies, Novato, USA)
Bei dem für die Versuche verwendeten Antigen handelt es sich um 4-Hydroxy-3Nitrophenylacetyl (Np). Es ist ein Hapten und demzufolge nicht ausreichend immunogen,
deshalb wurde es an Trägerproteine (BSA [Bovines Serumalbumin], KLH [Keyhole
Limpets Hemocyanin] und CGG [Chicken Gamma Globulin]) gekoppelt verwendet. Es
wirkt so als T-Zell-abhängiges Antigen. Wird Np an den Zucker Ficoll gekoppelt, wirkt es
als T-Zell unabhängiges Antigen.
Um eine Np-spezifische Antikörperantwort zu induzieren und zu messen (unabhängig von
der Immunantwort gegen Strukturen der Trägerproteine) wurden verschiedene
Trägerproteine verwendet.
Das Hapten Np ist über eine Amidbindung mit dem Trägerprotein konjugiert, hierbei
liegen soviele Np-Gruppen pro Proteinmolekül vor, wie die Zahl in der Klammer angibt
(z.B. 24 Np-Gruppen pro Molekül BSA bei Np-(24)-BSA).
2.1.4
Antikörper (Ak)
Antikörper
gegen (Anti-)
Maus IgM
Maus IgG2a
Gekoppelt Hersteller Konzentramit
tion
Alkalischer Sigma
4,2mg/ml
Phosphatase (AP)
AP
Pharmingen,
San Diego
AP
Pharmingen
Maus IgG2b
AP
Pharmingen
Maus IgG3
AP
Pharmingen
Isotyp
Fluorescein Pharmingen
isothiocyanat (Fitc)
Fitc
Pharmingen
Maus IgG1
Maus CR1/ CR2
(CD21/35)
0,5mg/ml
0,5mg/ml
Art des Antikörpers
IgM der Ziege
IgG1 der Ratte
(kappa)
IgG1 der Ratte
(kappa)
IgG2a der Ratte
(kappa)
IgG2a der Ratte
(kappa)
IgG2a der Ratte
IgG2b der Ratte
(kappa)
29
Antikörper
gegen (Anti-)
Maus B220
(CD45)
Maus CD19
Gekoppelt Hersteller
mit
Fitc
Pharmingen
Fitc
Pharmingen
Maus Fas
(CD95)
Maus IgD
Fitc
Pharmingen
Konzentra- Art des Antikörpers
tion
0,5mg/ml
IgG2a der Ratte
(kappa)
0,5mg/ml
IgG2a der Ratte
(kappa)
0,5mg/ml
IgG2 des Hamsters
Fitc
eBioscience
0,5mg/ml
Maus CD3
Fitc
Pharmingen
0,5mg/ml
IgG2a der Ratte
(kappa)
IgG2 des Hamsters
Maus CD90.2
(Thy1.2)
Maus Gr1
(LY 6G)
Isotyp
Fitc
Pharmingen
0,5mg/ml
IgG2a der Ratte
Fitc
Pharmingen
0,5mg/ml
IgG2b der Ratte
Phycoerythrin (PE)
PE
Pharmingen
0,2mg/ml
IgG2a der Ratte
Pharmingen
0,2mg/ml
IgG2 des Hamsters
PE
eBioscience
0,2mg/ml
-
Pharmingen
1mg/ml
-
Pharmingen
0,5mg/ml
-
Pharmingen
1mg/ml
IgG2a der Ratte
(kappa)
IgG2 des Hamsters
(kappa)
IgG2b der Ratte
(kappa)
IgG2 des Hamsters
-
Pharmingen
0,5mg/ml
IgM des Hamsters
Maus Fas
(CD95)
Maus IgM
Isotyp
(anti-KLH)
Maus CR1/ CR2
(CD21/35)
Maus Fas
(CD95)
Maus CD40
Tabelle 8:
Im Rahmen dieser Arbeit verwendete Antikörper
30
2.2 Methoden
2.2.1
Immunisierung der Mäuse und Alumpräzipitation des Antigens
Die Applikation des Antignes erfolgte im Rahmen dieser Arbeit ausschließlich
intraperitoneal. Dazu wurde die zu injizierende Dosis des Antigens in ca. 200µl sterilem
„Phosphate Buffered Saline“ (PBS) gelöst und mit einer spitzen Kanüle direkt in den
Bauchraum der Mäuse gespritzt. Dieses Verfahren traumatisierte die Mäuse relativ wenig.
Wird ein Antigen in den Intraperitonealraum injiziert, so läuft ein Großteil der so
induzierten Immunantwort in der Milz und den Lymphknoten des Bauchraumes ab. In
dieser Arbeit wurden die so induzierten Vorgänge in der Milz und im Serum untersucht.
Um die Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen zu steigern kann man dieses vor
intraperitonealer Injektion in die Mäuse in Alum [Aluminiumkaliumsulphat, AlK(SO4)2]
präzipitieren. Das so im Intraperitonealraum gebundene Antigen bildet dort eine Art Depot
von dem ein starker Entzündungsreiz ausgeht.
Dazu wird 1mg des Antigens in 2ml sterilem PBS gelöst (c=0,5mg/ml) und mit 4ml
10%Alum [1g AlK(SO4)2 in 10ml aqua dest.] vermischt. Durch tropfenweise Zugabe von
1M Kaliumhydroxidlösung (5,61g KOH in 100ml aqua dest.) wird der pH-Wert der
Lösung von 3 auf 6,5 angehoben. Dabei bildet sich ein milchiger Niederschlag, der sich bei
zu starker Alkalisierung der Suspension gelblich verfärbt. Nach Zentrifugation der
weißlichen Suspension (Zentrifuge: CentrikonT-324, Kontron Instruments) über 15min bei
2500rpm und 4°C und dreimaligem Waschen des Niederschlages in sterilem PBS wird das
präzipitierte Antigen in 3ml sterilem PBS resuspendiert.
2.2.2
Induktion von Apoptose
In vitro wurden verschiedene Verfahren zur Induktion von Apoptose verwendet:
Nährstoffentzug (Inkubation von 4*106 Zellen in 1ml PBS über 20h bei 37°C im
Brutschrank),
Inkubation mit dem Zellgift Camptothecin (4*106Zellen in 1ml DMSO (Merck,
Darmstadt) mit 8µl 1mM Camptothecin in DMSO 4h bei RT),
und Stimulation des Fas-Rezeptors (CD95) (4*106Zellen in 1ml Medium mit 5µg AntiMaus CD95 über 10h bei 37°C im Brutschrank).
31
Um eine größere Menge an apopotischen Zellen in vivo untersuchen zu können, wurde in
dieser Arbeit eine bereits etablierte Methode gewählt: die Antigeninduzierte Apoptose92.
Die Injektion einer großen Dosis löslichen Antigens in eine etablierte Immunantwort
hinein läßt eine große Menge vorher gebildeter antigenspezifischer B-Zellen apoptotisch
werden92-94. Aufgrund der großen Zahl an apoptotische Zellen wird dieser Versuchsaufbau
auch als „Suicide-Versuch“ (engl. suicide, Selbstmord) bezeichnet. Wird das Antigen den
Versuchtieren intraperitoeal injiziert, so läuft ein Großteil der so ausgelösten Prozesse
intraperitoneal ab.
In dieser Arbeit wurde als Antigen das Hapten Np (4-Hydroxy-3-Nitrophenylacetyl) an
CGG oder BSA gekoppelt verwendet. Zur Etablierung der Immunantwort gegen Np wurde
den Versuchstieren 50µg in Alum präzipitiertes Np-CGG zusammen mit 150µg
Isoprotenerolhydrochlorid intraperitoneal (i.p.) gespritzt. Neun Tage danach wurde ihnen
als zweite Injektion erneut Np, um Einflüsse des Trägerproteins auszuschließen diesmal an
BSA gekoppelt (Np-BSA), in einer Dosis von 4mg i.p. injiziert92.
2.2.3
Isolierung von Milzlymphozyten
2.2.3.1 1. Schritt: Extraktion der Splenozyten
Die in einem festen Gewebe wie der Milz enthaltenen Lymphozyten wurden mit Hilfe
eines Dichtegradienten isoliert. Das Prinzip dieser Aufreinigung besteht in der
Zentrifugation der Zellsuspension auf einer Lösung, welche dieselbe Dichte hat wie die zu
isolierende Zellart, in diesem Fall Lymphozyten. Dichtere Zellen wie Erythrozyten und
große Bindegewebspartikel sinken beim Zentrifugieren ab, die Lymphozyten dagegen
sammeln sich am Übergang Zellsuspension - Isolierungslösung an. Beim nachfolgenden
Waschen der gewonnenen Zellen lassen sich weniger dichte Zellen wie Thrombozyten
größtenteils entfernen.
Puffer und Lösungen:
Waschpuffer:
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
Lymphozytenseparationsmedium:
PAA Laboratories, Pasching, Österreich
Protokoll:
Milz der Maus vorsichtig zwischen zwei Objektträgern zerreiben, in 5ml PBS
suspendieren,
Suspension filtern (Cellstainer 40µm BD Bioscience, Belgien)
32
5ml Lymphozytenseparationsmedium in ein Falcon-Tube (BD Bioscience, Belgien)
füllen, vorsichtig mit derselben Menge an Zellsuspension überschichten
in einer auf 15°C vorgekühlter Zentrifuge (Varifuge3.2RS, Heraeus, Osterode)
20min bei 600g zentrifugieren, dabei auf langsames Beschleunigen und Bremsen der
Zentrifuge achten
von den drei voneinander abgrenzbaren Schichten die mittlere (Interphase) großzügig
abnehmen, Rest verwerfen
so gewonnene Zellen in PBS bei RT waschen 1210rpm, 10min
2.2.3.2 2.Schritt: Isolierung von B-Lymphozyten
Zur spezifischen Isolierung von B-Lymphozyten wurden mittels eines weiteren
Isolierungsverfahrens T-Lymphozyten sowie eventuell noch in der Suspension enthaltene
Makrophagen und dendritische Zellen anhand ihrer spezifischen Oberflächenmarker
entfernt. Dazu wurden zu den Zellen mit magnetischen Partikeln (sog. „Beads“)
gekoppelte Antikörper gegeben, welche spezifisch Antigene auf T-Zellen und
Makrophagen erkennen. Die wie oben beschrieben gewonnenen Zellen wurden dann über
eine Säule gegeben, die mit einem starken Magneten gekoppelt war, wodurch mit
Antikörpern behaftete Zellen in der Säule festgehalten wurden.
Puffer und Lösungen:
Waschpuffer:
1% humanes Albumin (DRK, Deutschland)
mit 0,4% Natriumzitrat (Baxter, Frankreich) in 500ml PBS
MicroBeads:
Anti-CD11b, Anti-CD90 (Tyh1.2), Anti-CD11c (Miltenyi Biotec)
Nährmedium:
RPMI (BioWittaker, Cambrex, Belgien) je 500ml versetzt mit:
5% FCS (PAA Laboratories GmbH, Österreich)
1% L-Glutamin (Biochrom, Berlin)
1% Penicillin-Streptomycin (Biochrom, Berlin)
2µl 2-Mercaptoethanol (Sigma, Steinheim)
Protokoll:
Zellen waschen: Zellen in Waschpuffer suspendieren, bei 1600rpm 10min
zentrifugieren, Überstand verwerfen
33
Zellen in 100µl Waschpuffer suspendieren und mit pro 107Zellen je 10µl der
verschiedenen „Beads“ 15min bei 10°C inkubieren
Zellen in Waschpuffer bei RT waschen
Zellen in 500µl Waschpuffer aufnehmen und Suspension auf eine mit 500µl
Waschpuffer gespülte Säule (SuperMACS, Milteny Biotec, Bergisch-Gladbach)
geben
Säule mit 1ml Waschpuffer nachspülen, Eluat auffangen
so gewonnene Zellen über eine zweite Säule geben, erneut mit 1ml Waschpuffer
nachspülen, Eluat auffangen („Positivfraktion“),
beide Säulen aus dem Magneten entfernen, mit 1ml Waschpuffer spülen, Eluat
auffangen („Negativfraktion“)
Kontrolle der Reinheit der Zellen am Durchflußfluoreszenzzytometer
4*106Zellen der Positivfraktion in 1ml Nährmedium aufnehmen, bei 37°C und
5%CO2 kultivieren im Brutschrank (miniPERM-Bioreaktor, Heraeus Instruments IN
VITRO Systems & Services GmbH, Osterode) kultivieren
2.2.4
Durchflußfluoreszenzzytometrie
Am Durchflußfluoreszenzzytometer können durch Fluoreszenzfarbstoffe markierte
Antigene, die sich auf oder in einzelnen Zellen befinden nachgewiesen werden. Dazu
werden diese Antigene mit Antikörpern markiert, an welche ein Fluoreszenzfarbstoff
gekoppelt ist. Fällt ein Laserstrahl auf die zu untersuchende Zelle, so wird das
Farbstoffmolekül angeregt und emmitiert Licht einer bestimmten, vom Laserstrahl
unterscheidbaren Wellenlänge, welches vom Durchflußfluoreszenzzytometer analysiert
wird. Zusätzlich können anhand von zwei weiteren optischen Parametern, Forward Scatter
(FS) und Sideward Scatter (SS) (die Brechung des Laserstrahles durch die Zelle), die
Größe (FS) und die intra- bzw. extrazellulären Bestandteile der Zelle (Granularität, SS)
abgeschätzt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Coulter EPICSXL verwendet, welches mit einem
Laser der Wellenlänge 488nm arbeitet, und Messungen mit bis zu vier Farbstoffen
34
gleichzeitig erlaubt. In den hier beschriebenen Untersuchungen wurden nur die Farbstoffe
Fluoresceinisothiocyanat
(Fitc,
Fluoreszenz:
575nm)
und
Phycoerythrin
(R-PE,
Fluoreszenz: 525nm) verwendet.
2.2.4.1 Untersuchung des Phänotypes von Zellen
Zur Darstellung verschiedener Antigene auf der Zelloberfläche der verwendeten Zellinien
und Milzlymphozyten wurden je 1*106 Zellen mit 0,5µg des betreffenden Antikörpers in
einem Volumen von ca. 100µl PBS für 10-15min bei RT inkubiert. Danach wurden die
Zellen in 1ml PBS gewaschen, und im Durchflußzytometer untersucht.
Um nur die spezifisch an die zu untersuchenden Rezeptoren gebundenen Antikörper zu
messen wurden alle Messungen mit einer sog. Isotypkontrolle (ein Kontrollantikörper des
selben Isotyps, der keine der auf der Zelle verfügbaren Strukturen spezifisch bindet)
verglichen.
2.2.5 TUNEL (TdT mediated dUTP nick end labeling)
In dieser Arbeit erfolgte der Nachweis apoptotischer Zellen mittels eines Testverfahrens
der Firma Boehringer Mannheim. Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von durch
Strangbrüche
entstandenen
freien
DNA-Enden.
Ein
Enzym,
Terminale
Desoxynukleotidyltransferase (TdT), markiert diese freien 3’OH-Enden mit an dUTP
(Desoxyuridintriphosphat)
gekoppeltem
Durchflußfluoreszenzzytometer
direkt
Markierungsschrittes
mit
gemessen,
Alkalischer
Flourescein,
oder
Phosphatase
mit
(AP)
welches
im
eines
zweiten
Hilfe
und
Substrat
für
die
Lichtmikroskopie sichtbar gemacht wurde.
Für die Negativkontrolle wurde das spezifisch koppelnde Enzym (TdT) weggelassen, um
unspezifisch gebundenes Flourescein darstellen zu können.
In dieser Arbeit wurde das Protokoll des Herstellers leicht verändert für Zellsuspensionen
und Gewebeschnitte verwendet.
Puffer und Lösungen:
4% PFA:
4mg Paraformaldehyd in 100ml PBS
Triton X 100:
1g Natriumcitrat + 1ml Triton X 100 in 1l aqua dest.
TUNEL Boehringer Kit; Enzym : Labelsolution = 1:9
35
Protokoll:
Zellen in PBS waschen. Pellet von ca. 4*106 Zellen in einem EppendorffReaktionsgefäß in 1ml PBS suspendieren, 10min bei 4000 Umdrehungen pro min
(rpm) zentrifugieren, Überstand verwerfen
oder Gewebeschnitt (s.u.) 15min an der Luft trocknen lassen, mit PAP-Pen (Ted
Pella Inc., USA) Gewebe umfahren, erneut ca. 15min trocknen lassen
zur Fixierung Zellen in 1ml 4% PFA suspendieren /Gewebeschnitt mit 1ml 4% PFA
überschichten und bei Raumtemperatur 10min einwirken lassen
Zellen /Gewebe zwei mal je 10min mit 1ml PBS waschen
Zellen /Gewebe 2min auf Eis mit je 100µl Triton X 100 behandeln (Pellet in
angegebenem Volumen suspendieren /Gewebe mit Lösung überschichten)
Zellen /Gewebe erst einmal 5min, danach 10min mit 1ml PBS waschen
Zellen /Gewebe bei 37°C 1h mit Boehringer TUNEL-Reagenz inkubieren
Analyse der Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer
oder Gegenfärbung des Gewebes mit weiteren Markern (s.u.)
2.2.6
Immunhistochemie
Zur Darstellung von Antigenen auf Gewebeschnitten können verschiedene Methoden
angewendet werden. In dieser Arbeit wurden Antigene direkt und indirekt nachgewiesen.
Beim direkten Nachweis bindet ein enzymgekoppelter Antikörper/ Marker (Horseradish
Peroxidase (HRP) oder Alkalische Phosphatase (AP)) unmittelbar an das Antigen, beim
indirekten Nachweis ist erst ein Sekundärantikörper, der den Primärantikörper/ -marker auf
dem Antigen erkennt, an ein Enzym gekoppelt. Bei beiden Arten des Nachweises setzt das
Enzym ein Substrat zu einem farbigen und damit meßbaren Endprodukt um.
Werden für eine Zweifarbenfärbung zwei verschiedene Enzyme verwendet, so ist immer
das AP – abhängige Substrat vor dem HRP – abhängigen Substrat zu entwickeln.
36
Objektträger beschichten
Die Objektträger (Super Fast, Menzel) wurden vor Gebrauch 10min bei RT in 4°C
kaltes Aceton getaucht, 10min an der Luft getrocknet, und schließlich 10min bei RT
in ebenfalls 4°C kaltem 0,01% Poly-L-Lysin (in aqua dest.) getaucht. Danach wurden
sie über Nacht bei RT getrocknet.
Gewebe vorbereiten
Das frisch aus der Maus entnommene Gewebe wurde in Einbettmedium (Jung Tissue
medium, Leica, Nusslach) eingebettet, und bei -80°C eingefroren.
Vor dem Färben wurde das gefrorene Gewebe bei -20°C mittels des Mikrotoms
(LEICA CM 1850, Leica) in einer Schichtdicke von 5-8µm geschnitten und auf die
beschichteten Objektträger aufgebracht. Anschließend wurden die Schnitte 1h
luftgetrocknet, 10min in 4°C kaltem Aceton dehydriert und wiederum 1h
luftgetrocknet. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
Zweifarben-Färbung: TUNEL-PNA
Puffer und Lösungen:
Waschpuffer:
PBS
Einbettmedium: Crystal/Mount (Biomeda Corp., USA)
Marker I:
dUTP-Fitc (Boehringer TUNEL-Reagenz) (s.o.)
Sekundärantikörper I: anti-Fluorescein Antikörper gekoppelt an AP
(Boehringer Converter AP )
Substrat I:
Fast Blue BB Base (Detektion von AP, Farbe: blau):
Naphthol AS-MX Phosphate (Sigma-Aldrich, Steinheim)
N,N-Dimethylformamid (Sigma-Aldrich, Steinheim)
Tris-Puffer (0,1 M): 12,1 g Tris-[hydroxymethyl]aminomethan in 1l aqua dest., pH=8,5
Fast Blue BB Base (Sigma-Aldrich, Steinheim)
2 M HCl
4% Natriumnitrat
Levamisole (Sigma-Aldrich, Steinheim)
Marker II:
PNA gekoppelt an HRP (Lectin from Arachis Hypogaea
(Erdnuss), Peroxidase labeled, Sigma-Aldrich, Steinheim)
37
Substrat II:
AEC (Detektion von HRP, Farbe: rotbraun):
AEC-Lösung: 400 mg 3-Amino-9-Ethyl-Carbazole
(Sigma-Aldrich, Steinheim) in 25 ml N,N
Dimethylformamid (lichtgeschützt aufbewahren!)
Natriumacetat-Puffer (0,05 M): 3,4 g Natriumacetat in
500 ml aqua dest.; pH 5,0
Hydrogenperoxid, 30% (w/v)(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Protokoll:
Gewebeschnitte 15min an der Luft trocknen lassen, mit PAP-Pen (Ted Pella Inc.,
USA) Gewebe umfahren, erneut ca. 15min trocknen lassen
nach dem TUNEL-Protokoll (2.2.5.) als ersten Antikörper (I) Boehringer TUNELReagenz einwirken lassen
mit Waschpuffer abspülen
als zweiten Antikörper 2,5µl PNA-HRP, und als Sekundärantikörper I 37,5µl
Converter AP zusammen mit 10µl PBS über jeden Schnitt schichten,
bei 37°C abgedunkelt in einer feuchten Kammer 1h inkubieren
mit Waschpuffer abspülen
als Substrat der Alkalischen Phosphatase (AP) 5mg Naphthol AS-MX Phosphate bei
RT in 250µl N,N-Dimethylformamid lösen, und dazu 40ml Tris Puffer geben
10mg Fast BB Blue base bei RT in 250µl 4°C kalte HCl (2M) geben, danach 250µl
4°C kaltes Natriumnitrit dazugeben, und diese Lösung tropfenweise zu dem TrisPuffer hinzufügen
schließlich 10mg Levamisole bei RT dazugeben, um die endogene Alkalische
Phosphatase-Aktivität zu inhibieren
die Lösung filtern (Filter mit 0,45 µm Porengröße, Schleicher & Schuell, Dassel) und
über die Schnitte schichten
bei RT abgedunkelt in einer feuchten Kammer 1-2h inkubieren
mit Waschpuffer abspülen
38
als Substrat der Horseradish Peroxidase (HRP) 250µl AEC-Lösung zu 9,75ml
Natriumacetat-Puffer geben, und die Lösung filtern (Filter mit 0,45 µm Porengröße,
Schleicher & Schuell, Dassel), vor Licht schützen!
5µl Hydrogenperoxid dazugeben, gut mischen und über die Schnitte schichten
bei RT in einer dunklen und feuchten Kammer ca.1h inkubieren, bis die Schnitte
makroskopisch eine deutliche rotbraune Färbung zeigen
mit Waschpuffer abspülen
mit
3-5
Tropfen
Einbettmedium (Crystal/Mount,
Biomeda,
Forster
City)
überschichten, über Nacht bei RT trocknen
2.2.7
Blutentnahme
Zur Serumgewinnung wurde aus der Schwanzvenen der Maus mittels einer Kanüle 100400µl Blut entnommen. Dieses wurde bei RT ca. 1h in einem Eppendorff-Reaktionsgefäß
ruhen gelassen und danach 10min mit 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen und bei -80°C gelagert.
2.2.8
ELISA zum Nachweis Np-spezifischer Antikörper
Mit diesem Verfahren können im Mausserum enthaltene Antigen (Np)-spezifische
Antikörper
halbquantitativ
gemessen
werden.
Die
verschiedenen
Immunglobulinsubklassen wurden unabhängig von einander bestimmt. Als Standard wurde
aus mit 200µg Np-BSA oder mit 50µg Tnp-Ficoll (jeweils in Alum präzipitiert)
immunisierten Mäusen gewonnenes Serum verwendet, welches als Verdünnungsreihe mit
Waschpuffer im Verhältnis 1:1 drei mal weiterverdünnt wurde. Der Korrelationskoeffizient
des Standards lag bei allen Messungen zwischen 0,997 und 0,999. Da die genaue
Konzentration der Np-spezifischen Antikörper im Standardserum nicht bekannt ist, können
die Immunglobulinsubklassen untereinander nicht verglichen werden. Alle Proben und
Standards wurden im Doppelansatz gemessen.
39
2.2.8.1 ELISA zum Nachweis von Np-spezifischem IgM
Puffer und Lösungen:
Waschpuffer:
19,1g Dulbecco’s + 1ml Tween 20 in 2l aqua dest.
Block-Puffer:
1mg Cytochrom C in 1ml Waschpuffer (s.o.)
Coating-Puffer: 1 Karbonat-Bikarbonatpuffer-Kapsel (Sigma-Aldrich, Steinheim) in
100ml aqua dest.
Antigen:
Np-(29)-KLH
Standard:
Poly-IgM-Serum (B1-8), erste Verdünnung: 10µl auf 190µl
Waschpuffer
Sekundärantikörper:
Substrat:
anti-Maus IgM-AP 1:2500
pNpP (SIGMA FASTTM pNpP-Substrattabletten (Sigma-Aldrich,
Steinheim)
Stopp-Puffer:
3M NaOH
Protokoll:
Mikrotiterplatte (Costar® 96 well EIA/RIA plate, (no lid, medium binding,
Polystyrene) Corning Incoperated Nr.9017) mit je 100µl Np-(29)-KLH in einer
Konzentration von 5µg pro ml Coating-Puffer pro Vertiefung beschichten,
bei 4°C über Nacht inkubieren
drei mal mit je 300µl Waschpuffer pro Vertiefung waschen, Platte ausklopfen
zum Blocken mit je 100µl Block-Puffer pro Vertiefung, 1h bei 37°C inkubieren
drei mal waschen (s.o.)
Proben und Standard in verschiedenen Verdünnungen pipettieren, jeweils 100µl pro
Vertiefung,
bei 4°C über Nacht, danach 1h bei 37°C inkubieren
drei mal waschen (s.o.)
je 100µl Sekundärantikörper in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettieren,
1h bei 37°C inkubieren
drei mal waschen (s.o.)
40
in jede Vertiefung 200µl Substrat geben, 30 min im Dunkeln bei RT inkubieren
pro Vertiefung 50µl Stopp-Puffer dazugeben, kurz auf dem Schüttler mischen
bei 405nm (Referenz 620nm) im Spektralphotometer (Hitachi U-3000, Hitachi,
Tokyo/Japan) die Extinktion messen
2.2.8.2 ELISA zum Nachweis von Np-spezifischem IgG
Für diese Messungen wurden bis auf die unten genannten Unterschiede die gleichen Puffer
und Lösungen verwendet, und auch der Ablauf unterschied sich nur in den unten
aufgeführten Punkten.
Es gelang nicht, einen Standard zur Messung der IgG2a-Subklasse zu etablieren, was
höchst wahrscheinlich auf den verwendeten Sekundärantikörper (Anti-Maus IgG2a-AP,
Pharmingen, SanDiego) zurückzuführen ist130.
Puffer und Lösungen:
Standard:
IgG1: poly-Np IgG-Serum,
erste Verdünnung: von einer 1:100 Vorverdünnung 10µl auf
190µl Waschpuffer
IgG2b: poly-Np IgG-Serum,
erste Verdünnung: von einer 1:100 Vorverdünnung 100µl auf
100µl Waschpuffer
IgG3: poly-Tnp-Serum,
erste Verdünnung: 10µl auf 190µl Waschpuffer
Sekundärantikörper:
IgG1: anti-Maus IgG1-AP, Verdünnung: 1:10 000
IgG2b: anti-Maus IgG2b-AP, Verdünnung: 1:5 000
IgG3: anti-Maus IgG3-AP, Verdünnung: 1:2 500
Protokoll:
Inkubationszeit des Substrates (pNpP, s.o.): IgG1: 50min
IgG2b: 50min
IgG3: 4h
41
2.2.9
Kopplung von Antikörpern an Biotin
Da Antikörper gegen CD21/35 (CR2/1) der Maus im Handel nicht an Biotin gekoppelt
verfügbar sind, wurde dieser Schritt mit aufgereinigtem Anti-CD21/35 nachvollzogen.
Puffer und Lösungen:
Borat-Puffer:
1,24g Borsäure + 7,62g Di-Natriumtetraborat in 200ml aqua dest.
Waschpuffer: PBS
Biotin:
10mg Biotin-amidocoproatanhydroxysuccinidester in 1ml DMSO
(c=10mg/ml)
Antikörper:
purified Anti-Maus-CD21/35 (Pharmingen), c=0,5mg/ml
Stoppreagenz: 1M Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Salzsäure (HCl), Natriumhydroxid (NaOH)
Protokoll:
0,5mg (1ml) Antikörper mit 1ml Borat-Puffer vermischen, und 50µg (5µl)
Biotinester dazugeben. Die Lösung bei RT inkubieren.
nach 2h 10µl Stoppreagenz hinzupipettieren und 10min bei RT inkubieren
Lösung
auf
vier
Eppendorff-Reaktionsgefäße
verteilen
(je
500ml
pro
Reaktionsgefäß), diese mit Dialyseschlauch (Sigma, Steinheim) verschließen und
drei Tage im Waschpuffer bei 4°C dialysieren. Täglich den Waschpuffer wechseln.
2.2.10 Statistik
Die statistische Analyse der Ergebnisse sowie die Berechnungen der Mittelwerte und
Standardabweichungen wurden mit Excel−Analyse-it für Windows durchgeführt. Die
Signifikanzen wurden mit dem nicht parametrischen Mann-Withney-Test für zwei
unabhängige Stichproben ermittelt. α wurde kleiner als 0,05 gewählt. Statistisch
signifikante Unterschiede (p<0,05) zwischen den einzelnen Versuchsgruppen wurden in
den Abbildungen mit einem Stern (*) gekennzeichnet.
42
3 Ergebnisse
3.1 Beeinflussung Antigeninduzierter Apoptose durch den Mangel
früher Komplementkomponenten: Versuche in vivo
Das hier verwendete Modell zur Untersuchung der peripheren Toleranzentwicklung in vivo
basiert auf der Erkenntnis, daß die Injektion einer großen Dosis löslichen Antigens in eine
etablierte Immunantwort hinein eine große Menge vorher gebildeter antigenspezifischer BZellen apoptotisch werden läßt. Aufgrund der großen Zahl apoptotischer Zellen wird dieser
Versuchsaufbau auch als „Suicide-Versuch“ (engl. suicide, Selbstmord) bezeichnet.
In diesem Versuch sollte der Einfluß von C4 auf die Antigeninduzierte Apoptose von BZellen in vivo untersucht werden. Dazu wurde in den Versuchstieren (Mäusen) zunächst
eine Immunantwort gegen ein Antigen, 4-Hydroxy-3-Nitrophenylacetyl (Np), ausgelöst.
Die Injektion des Antigens intraperitoneal (i.p.) hat zur Folge, daß der Hauptteil der
Immunantwort gegen dieses Antigen in der Milz abläuft. Durch die zusätzliche Injektion
einer großen Dosis des Antigens wurde dann bei den für dieses Antigen spezifischen BLymphozyten Apoptose induziert. (Abb.6)
Mit Hilfe verschiedener Methoden wurde untersucht, ob die C4-Defizienz der
Versuchstiere einen Einfluß auf die Apoptose der Zellen oder auf die weitere Entwicklung
der antigenspezifischen Immunantwort hat.
Abbildung 6:Versuchsaufbau zur Untersuchung der Antigeninduzierten Apoptose
(BE:Blutentnahme)
43
Einer Gruppe von Wildtyp (wt)- (Gruppe A) und C4-/-Mäusen (Gruppe E) wurden
entsprechend der Abb.6 (S.43) zunächst 50µg des in Alum präzipitierten Haptens Np an
CGG gekoppelt (Np-CGG) intraperitoneal (i.p.) injiziert. Neun Tage später, nach
Etablierung der Immunantwort, wurde ihnen als zweite Injektion erneut Np, diesmal an
BSA gekoppelt (Np-BSA), in einer Dosis von 4mg zusammen mit 150µg/kg KG
Isoprotenerolhydrochlorid (zur Vermeidung eines anaphylaktischen Schocks) i.p. gespritzt.
(Das Trägerprotein wurde gewechselt, um nur die Np-spezifische Immunantwort und nicht
die gegen das Trägerprotein (CGG) zu beeinflussen.)
Zusätzlich wurden verschiedene Gruppen von Mäusen (wt und C4-/-) als Kontrollen
mitgeführt. Einige Mäuse bekamen nur am Tag 0 die erste Injektion [Gruppen B (wt) und
F (C4-/-)], einige nur am Tag 9 die zweite Injektion [Gruppen C (wt) und G (C4-/-)]. Die
letzten Gruppen von Mäusen erhielten keinerlei Injektionen [Gruppen D (wt) und H (C4-/)]. (Tab.8)
Tabelle 8:
Einteilung der verschiedenen Versuchsgruppen
(zur Untersuchung der Antigeninduzierte Apoptose)
Vor der ersten Injektion am Tag 0 wurde allen Mäusen Blut abgenommen, ebenso am Tag
8, am Tag 9 acht Stunden nach der zweiten Injektion, und an den Tagen 16, 23 und 30
nach der ersten Injektion. In den gewonnenen Seren wurde der Titer Np-spezifischer
Antikörper mittels ELISA bestimmt, um den Verlauf der Immunantwort gegen Np zu
untersuchen. (Kapitel 3.1.3) Acht Stunden nach der zweiten Injektion wurden aus jeder der
Gruppen einige Mäuse getötet, deren Milzen entnommen und mit Hilfe eines scharfen
Skalpells geteilt. Für die spätere immunhistochemische Aufarbeitung wurde ein Teil
44
eingebettet und bei -80°C eingefroren. (Kapitel 3.1.1) Aus dem kleineren Teil der Milz
wurden die Lymphozyten isoliert und im Durchflußfluoreszenzzytometer analysiert.
(Kapitel 3.1.2)
3.1.1
Immunhistochemische Färbungen
Die immunhistochemischen Färbungen der Milzgefrierschnitte erfolgten mit PNA (PeanutAgglutinin), einem Marker zur Darstellung der Keimzentren, sowie der TUNEL-Methode
zur Markierung der apoptotischen Zellen.
Abbildung 7:
Immunhistochemische Färbungen von Milzgefrierschnitten
PNA (GC-Marker, braun) / TUNEL (Apoptose-Markierung, blau)
A,B,C: Wildtypmäuse
E,F,G: C4-/-Mäuse
A,E:
Erstinjektion (50µg Np-CGG) und Zweitinjektion (4mg Np-BSA)
B,F:
nur Erstinjektion (50µgNp-CGG)
C,G: nur Zweitinjektion (4mg Np-BSA)
45
Bei allen Mäusen, die eine niedrige Dosis Np-CGG erhalten hatten (Gruppen A, B, E und
F), ließen sich PNA pos. Keimzentren in der weißen Pulpa der Milz nachweisen, nicht
dagegen bei Mäusen, die keine oder nur eine hohe Dosis des Antigens 8h vor Entnahme
der Milzen erhalten hatten. Die absolute oder relative Anzahl der Keimzentren in den
Milzen waren schlecht vergleichbar, da zur Analyse nur ein Teil der Milz zur Verfügung
stand. Dabei muß bemerkt werden, daß aufgrund der recht aggressiven Schritte zur
intrazellulären Darstellung der DNA-Strangbrüche (TUNEL-Test) die Oberflächenfärbung
PNA schwach, aber doch erkennbar ausfiel. (Abb.7, S.45)
Antigeninduzierte Apoptose
Anzahl apoptotischer Zellen in der Milz
(Immunhisochemische Analyse)
A: Wt, beide Inj. (n=8)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
B: Wt, nur 1.Inj. (n=4)
C: Wt, nur 2. Inj. (n=4)
D: Wt, keine Inj. (n=2)
E: C4-/-, beide Inj. (n=8)
F: C4-/-, nur 1. Inj. (n=4)
Anzahl der TUNEL pos.
Zellnester pro GC
Anzahl der TUNEL pos.
Zellen in weißer Pulpa pro
Gesichtsfeld
G: C4-/-, nur 2. Inj. (n=4)
H: C4-/-, keine Inj. (n=2)
Abbildung 8: Anzahl apoptotischer Zellen in der Milz, Analyse Immunhistochemischer Färbungen von Milzgefrierschnitten: TUNEL/PNA (mit
Standardabweichung, Gruppen A vs. E und C vs. G: *p<0,05)
Bei den Mäusen, die beide Injektionen erhalten hatten (A und E), fanden sich innerhalb der
Keimzentren gehäuft apoptotische Zellen, die in Gruppen von fünf bis zehn TUNEL pos.
Zellen zusammenlagen. Diese „Zellnester“ waren sowohl bei Wildtypmäusen (Gruppe A),
als auch bei deren C4-/-Pendant (Gruppe E) zu erkennen. Dabei fand sich kein
signifikanter Unterschied in der Frequenz oder der Größe der Zellnester pro Keimzentrum
zwischen den beiden Gruppen. Subjektiv scheinen C4-/-Mäusen jedoch etwas mehr
apoptotische Zellgrüppchen pro Keimzentrum zu haben. (Abb.7, S.45 und Abb.8)
Bei den Mäusen, die lediglich mit 50µg des Antigens (1.Inj.) immunisiert worden waren
(Gruppen B und F), fanden sich ebenfalls solche „Zellnester“ apoptotischer Zellen in den
Keimzentren, allerdings waren diese deutlich kleiner und seltener. Auch hier war kein
Unterschied zwischen Wildtyp- und C4-/-Mäusen nachweisbar.
46
In den Milzen der Kontrollmäuse, die keinerlei Injektion erhalten hatten, fanden sich nur
vereinzelt apoptotische Zellen.
Auffällig waren die Färbungen der Mäuse, die nur eine hohe Dosis des Antigens injiziert
bekommen hatten: hier fanden sich wenige Keimzentren, aber über die gesamte Milz
verstreut einzelne TUNEL pos. Zellen. Dieser Befund war bei den Wildtypmäusen
(Gruppe C) weniger stark ausgeprägt (nicht signifikant) als bei den C4-/-Mäusen (Gruppe
G). (Abb.8, S.46)
3.1.2
Analyse am Durchflußfluoreszenzzytometer
Ein Teil der Milzen der Wildtyp- und C4-/-Mäuse wurde zerrieben, und die Splenozyten
wurden isoliert. (Kapitel 2.2.3) Die nach dem ersten Schritt der Lymphozytenaufreinigung
gewonnenen Zellen (Kapitel 2.2.3.1) wurden im Durchflußfluoreszenzzytometer
analysiert. Dabei zeigte sich, daß diese Splenozyten zu ca. 67% (+/-10%) B-Lymphozyten
waren, erkennbar an den Oberflächenmarkern B220 (CD45) und CD19. Die restliche
Zellpopulation setzte sich überwiegend aus T-Lymphozyten und Makrophagen zusammen.
Diese Verteilung war für alle Versuchsgruppen gleich.
Ohne weitere Aufreinigung (d.h. ohne spezifische Isolierung der B-Lymphozyten) wurden
die Zellen auf das Vorhandensein von apoptotischen Merkmalen hin untersucht. Die
Gesamtzahl apoptotischer, d.h. TUNEL pos. Zellen war allerdings sehr klein (um 1% der
untersuchten Zellen), so daß sich mit dieser Methode keine signifikanten Unterschiede
zwischen den einzelnen Versuchsgruppen feststellen ließ. (Abb.9)
Antigeninduzierte Apoptose
Anzahl apoptotischer Zellen in der Milz
(Durchflußfluoreszenzzytometrische Analyse)
Prozent TUNEL pos.
Zellen
8
A: Wt, beide Inj. (n=8)
7
B: Wt, nur 1.Inj. (n=4)
6
C: Wt, nur 2. Inj. (n=4)
5
4
D: Wt, keine Inj. (n=2)
3
E: C4-/-, beide Inj. (n=8)
Abbildung 9:
2
F: C4-/-, nur 1. Inj. (n=4)
1
G: C4-/-, nur 2. Inj. (n=4)
Anzahl apoptotischer Zellen in der
Milz (mit Standardabweichung)
0
Versuchsgruppe
H: C4-/-, keine Inj. (n=2)
Analyse aufgereinigter Splenozyten
im Durchflußfluoreszenzzytometer
47
3.1.3
Antikörperbestimmung mittels ELISA
Um eine Aussage über die Stärke der Immunantwort der Mäuse gegen Np, und damit
indirekt über die Aktivität der spezifischen B-Lymphozyten, treffen zu können, wurde der
Titer Np-spezifischer Antikörper im Serum mittels ELISA bestimmt.
Betrachtet man den Verlauf der Immunantwort, so war in allen behandelten
Versuchsgruppen (Gruppen A und E) nach Injektion der ersten Dosis von 50µg des
Antigens ein unterschiedlich starker Anstieg der Np-spezifischen Antikörper zu
beobachten. Mit Injektion der hohen Dosis, 4mg des Antigens, fiel der Antikörperspiegel
wieder ab, um danach langsam wieder anzusteigen. Blieb diese Injektion aus (Gruppen B
und F), so sank der Antikörperspiegel auch nicht ab. Unbehandelte Mäuse (Gruppen D und
H) oder Mäuse, die nur am Tag 9 4mg des Antigens injiziert bekommen hatten (Gruppen C
und G), zeigten keinen Anstieg Np-spezifischer Antikörper. (Abb.10a, S.49)
Im
einzelnen
variierten
die
Antikörperantworten
in
den
verschiedenen
Immunglobulinsubklassen jedoch deutlich, und wichen teilweise auch von dem oben
zusammengefaßt wiedergegebenen Ablauf ab. Auf diese individuellen Unterschiede wird
in den Unterkapiteln der Subklassen näher eingegangen werden.
Des weiteren fiel auf, daß vor allem unter den C4-/-Mäusen einige Mäuse nicht in allen
Subklassen eine Immunantwort entwickelten. Da bekannt ist, daß C4-/-Mäuse im Schnitt
eine schwächere Immunantwort ausprägen, wurden diese Mäuse nicht aus der Wertung
genommen.
Allgemein läßt sich zusammenfassen, daß die einzelnen Mäuse sehr unterschiedlich auf
das injizierte Antigen reagierten, d.h. verschieden hohe Antikörperspiegel entwickelten,
und somit der Standardfehler oft groß war. Aufgrund der begrenzten Anzahl an zur
Verfügung stehenden Versuchstieren wurde nur die Unterschiede zwischen den
eigentlichen Versuchsgruppen (A vs. E) statistisch ausgewertet. Somit läßt sich über die
Signifikanz der in den Kontrollgruppen (B, C, D, F, G, und H) gefundenen Trends nur
begrenzt eine Aussage treffen.
3.1.3.1 IgM
Alle Mäuse, die am Tag 0 50µg des Antigens injiziert bekommen hatten (Gruppen
A,B,E,F) zeigten am Tag 8 nach dieser Injektion eine IgM-Antwort gegen selbiges. In
dieser primären Immunantwort zeigte sich zu Beginn (Tag8) kein signifikanter Unterschied
48
zwischen C4-/- (Gruppen E und F) und Wildtypmäusen (Gruppen A und B), und auch im
weiteren Verlauf der unbeeinflußten Immunantwort bis zum Tag 30 (Gruppen B und F)
unterschieden sich Wildtyp- und C4-/-Mäuse nicht. (Abb.10c)
Eine einzelne Dosis von 4mg Np löste bei beiden Mausstämmen keinen Anstieg der Anti-
300
350
250
300
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
Np IgM-Antikörper im Serum aus (Gruppen C und G). (Abb.10a und b)
200
150
100
50
250
200
150
100
50
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: beide Inj. (n=12)
C: nur zweite Inj. (n=5)
0
30
4
6
B: nur erste Inj. (n=5)
D: keine Inj. (n=3)
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
b: C4-/-
E: beide Inj. (n=12)
G: nur zweite Inj. (n=4)
F: nur erste Inj. (n=4)
H: keine Inj. (n=3)
150%
IgM-Spiegel
in Prozent des Wertes
von Tag 8
350
300
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
2
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
50%
0%
0
8
9
16
23
30
T age nach erster Injektion
d: Vergleich Wt mit C4-/-
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,beide Inj.(n=12)
B:wt,nur erste Inj.(n=5)
100%
E:C4-/-,beide Inj.(n=12)
F:C4-/-,nur erste Inj.(n=4)
A: wt, beide Inj. (n=12)
E: C4-/-, beide Inj. (n=12)
Abbildung 10: IgM-Immunantwort gegen Np
a: IgM im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen A-D), (Gruppe A mit Standardfehler)
b: IgM im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen E-H), (Gruppe E mit Standardfehler)
c: IgM im Serum von Wildtyp- und C4-/-Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F),
(A vs. E: *p<0,05)
d: IgM in Prozent des Serumspiegels von Tag 8 von Wildtyp- und C4-/-Mäusen
(Mittelwerte von Tag 8 der jeweiligen Versuchsgruppe sind auf 100% gesetzt),
(Gruppen A vs. E),
zur Darstellung des Wiederanstiegs nach dem Antigeninduzierten Abfall am Tag 9
(mit Standardfehler, *p<0,05)
Acht Stunden nach der 2. Injektion von 4mg des gleichen Antigens gekoppelt an ein
anderes Protein (BSA) war der IgM-Antikörperspiegel bei Wildtyp- (Gruppe A) und C4-/Mäusen (Gruppe E) bis auf das Ausgangsniveau abgefallen. Eine Woche später fanden
sich jedoch erneut spezifische IgM-Antikörper im Serum, bei den Wildtypmäusen etwa
49
50% einer normalen, ungestörten Immunantwort, bei den C4-/-Mäusen etwa 70%. Dieser
Antikörperspiegel blieb auch über die nächsten beiden Wochen konstant. (Abb.10c, S.49)
Vergleicht man den Wiederanstieg der Antikörper im Serum nach dem antigeninduzierten
Abfall am Tag 9 (Tage 16-30) mit den Antikörperspiegeln am Tag 8 (einem Maß für die
unbeeinflußte Immunantwort gegen Np), so zeigt sich, daß C4-/-Mäuse einen signifikant
stärkeren Wiederanstieg haben als Wildtypmäuse. (Abb.10d, S.49)
Interessanterweise zeigte ein Großteil der C4-/-Mäuse einen erhöhten Anti-Np IgMSpiegel im Blut, (Abb.10b, S.49) ohne vorher mit dem Antigen in Kontakt gekommen zu
sein (Gruppen F,G und H). Dieser erhöhte Grundtiter konnte bei Wildtypmäusen nicht
gefunden werden (Gruppen D).
3.1.3.2 IgG1
Auch die Immunantwort in der IgG1-Subklasse schien nach einer Woche schon voll
etabliert zu sein (Gruppen A und B (wt), E und F (C4-/-)). Allerdings zeigten die C4-/Mäuse der Gruppe F eine deutlich reduzierte Antwort gegenüber den am Tag 8 noch gleich
behandelten Mäusen der Gruppe E. Im Vergleich mit der IgG1-Immunantwort von
Wildtypmäusen (Gruppen A,B) war der IgG1-Spiegel im Serum der C4-/-Mäuse zu allen
Zeiten deutlich erniedrigt (Gruppen E,F), wobei der Unterschied nur an den Tagen 16-30
signifikant war. (Abb.11c, S.51)
Um den Wiederanstieg der Np-spezifischen IgG1-Antikörper im Serum nach Injektion der
zweiten, hohen, Dosis des Antigens trotz der unterschiedlich starken Immunantwort von
C4-/- und Wildtypmäusen vergleichen zu können, wurden die Werte wiederum zu dem
IgG1-Spiegel der jeweiligen Versuchsgruppe am Tag 8 in Bezug gesetzt. Dabei zeigte sich,
daß sich bei Wildtypmäusen schon am Tag 16, also eine Woche nach der zweiten
Injektion, 85% des IgG1-Spiegels der unbeeinflußten Immunantwort finden, wogegen C4/-Mäuse nach dem antigeninduzierten Abfall des Antikörperspiegels nur bis zu 44% des
am Tag 8 gemessenen IgG1-Spiegels wieder produzieren können. Dieser Unterschied ist
am Tag 16 signifikant, scheint sich aber bis zum Tag 30 abzuschwächen. (Abb.11d, S.51)
50
2.500
1.400
1.200
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
2.000
1.500
1.000
1.000
800
600
400
500
200
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: beide Inj. (n=12)
C: nur zweite Inj. (n=5)
0
B: nur erste Inj. (n=5)
D: keine Inj. (n=3)
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
1.400
1.200
1.000
800
600
400
200
0
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,beide Inj.(n=12)
B:wt,nur erste Inj.(n=5)
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
E: beide Inj. (n=12)
G: nur zweite Inj. (n=4)
IgG1-Spiegel
in Prozent des Wertes
von Tag 8
1.600
2
4
b: C4-/-
1.800
0
2
F: nur erste Inj. (n=4)
H: keine Inj. (n=3)
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
8
9
16
23
30
T age nach erster Injektion
d: Vergleich Wt mit C4-/E:C4-/-,beide Inj.(n=12)
F:C4-/-,nur erste Inj.(n=4)
A: wt, beide Inj. (n=12)
E: C4-/-, beide Inj. (n=12)
Abbildung 11: IgG1-Immunantwort gegen Np
a:IgG1 im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen A-D), (Gruppe A mit Standardfehler)
b: IgG1 im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen E-H), (Gruppe E mit Standardfehler)
c: IgG1 im Serum von Wildtyp- und C4-/-Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F),
(A vs. E: *p<0,05)
d: IgG1 in Prozent des Serumspiegels von Tag 8 von Wildtyp- und C4-/-Mäusen
(Mittelwerte von Tag 8 der jeweiligen Versuchsgruppe sind auf 100% gesetzt),
(Gruppen A vs. E),
zur Darstellung des Wiederanstiegs nach dem Antigeninduzierten Abfall am Tag 9
(mit Standardfehler, *p<0,05)
3.1.3.3 IgG2a
Ein Standard zur Messung der Immunantwort in der IgG2a-Subklasse ließ sich nicht
etablieren, und eine Immunantwort in dieser Subklasse ließ sich somit nicht messen. Die
Ursachen und Konsequenzen werden im Kapitel 4.1.1.1 abgehandelt.
3.1.3.4 IgG2b
Die Injektion von 50µg Np-CGG in Alum löste auch die Bildung von Anti-NpAntikörpern der IgG2b-Subklasse aus: an den Tagen 8, 9 und 16 nach der Injektion finden
sich in Wildtyp- (Gruppe B) und C4-/-Mäusen (Gruppe F) deutlich erhöhte IgG2b-Titer.
Diese sind bei den Wildtypmäusen noch ca. viermal höher als bei den C4-/-Mäusen, wobei
51
dieser Unterschied zwischen den Gruppen A (wt) und E (C4-/-) auch signifikant ist.
Interessanterweise beginnt der Antikörperspiegel bei beiden Mausstämmen nach 2 Wochen
wieder abzufallen bis er am Tag 30 fast das Ursprungsniveau erreicht. (Abb.12c)
Auch in dieser Subklasse werden eine Woche nach dem antigeninduzierten Abfall des
IgG2b-Spiegels (Gruppen A und E), am Tag 16, wieder Antikörper im Serum gefunden.
Bei den Wildtypmäusen (Gruppe A) ist die Antikörperantwort im Vergleich zu Tag 8 um
etwa 50% reduziert, bei den C4-/-Mäusen um etwa 60% (Gruppe E). In beiden Gruppen ist
die Relation des weiteren Anstiegs schlecht zu beurteilen, da ab dem Tage 16 auch die
unbeeinflußte Immunantwort stark zurückgeht. Es läßt sich jedoch zu keinem Zeitpunkt ein
signifikanter Unterschied zwischen der Stärke des Wiederanstiegs der C4-/-(E) und
Wildtypgruppe (A) zeigen. (Abb.12d)
300
90
80
250
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
70
200
150
100
50
60
50
40
30
20
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: beide Inj. (n=12)
C: nur zweite Inj. (n=5)
0
30
2
4
6
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
b: C4-/-
B: nur erste Inj. (n=5)
D: keine Inj. (n=3)
8
E: beide Inj. (n=12)
G: nur zweite Inj. (n=4)
F: nur erste Inj. (n=4)
H: keine Inj. (n=3)
IgG2b-Spiegel
in Prozent des Wertes
von Tag 8
300
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
250
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,beide Inj.(n=12)
B:wt,nur erste Inj.(n=5)
140%
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
8
9
16
23
30
T age nach erster Injektion
d: Vergleich Wt mit C4-/E:C4-/-,beide Inj.(n=12)
F:C4-/-,nur erste Inj.(n=4)
A: wt, beide Inj. (n=12)
E: C4-/-, beide Inj. (n=12)
Abbildung 12: IgG2b-Immunantwort gegen Np
a: IgG2b im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen A-D), (Gruppe A mit Standardfehler)
b: IgG2b im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen E-H), (Gruppe E mit Standardfehler)
c: IgG2b im Serum von Wildtyp- und C4-/-Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F),
(A vs. E: *p<0,05)
d: IgG2b in Prozent des Serumspiegels von Tag 8 von Wildtyp- und C4-/-Mäusen
(Gruppen A vs. E), (mit Standardfehler, *p<0,05)
(Mittelwerte von Tag 8 der jeweiligen Versuchsgruppe sind auf 100% gesetzt)
zur Darstellung des Wiederanstiegs nach dem Antigeninduzierten Abfall am Tag 9
52
3.1.3.5 IgG3
Bei der Beurteilung der IgG3-Immunantwort ist zu beachten, daß die Kontrollgruppen (BD, F-H) in diesem Fall mangels auswertbarem Untersuchungsmaterial aus nur sehr
wenigen Mäusen (z.T.n=2) bestanden und somit Ausreißer stärker ins Gewicht fallen.
(Abb.13a und b, S.54)
Dementsprechend
ist
der
Verlauf
der
unbeeinflußten
IgG3-Immunantwort
der
Wildtypmäuse gegen Np (Gruppe B) nicht sicher aus den Daten zu bestimmen. Es scheint,
daß der IgG3-Spiegel bei Wildtypmäusen erst nach einer Woche zu steigen beginnt, um am
Tag 16 seinen Höhepunkt zu erreichen und dann wieder abzufallen. Dagegen zeigten die
Mäuse der Gruppe A, die am Tag 0 ebenfalls eine Injektion von 50µg des Antigens
erhalten hatten, also bis dahin gleich behandelt worden waren, schon nach einer Woche
einen deutlichen Anstieg des IgG3-Spiegels im Serum. (Abb.13a, S.54)
Auch bei den C4-/-Tieren zeigen sich am Tag 8 zwischen den bis dahin eigentlich gleich
behandelten Gruppen E und F ein Unterschied, nur daß in diesem Fall mehr IgG3Antikörper im Serum der Mäuse der Kontrollgruppe (F) zu finden war. Die Mäuse der
Gruppe E zeigten nur einen sehr schwachen Anstieg der Anti-Np IgG3-Antikörper, sowohl
am Tag 8 nach der ersten Immunisierung als auch an den Tagen 16-30, nach der zweiten
Injektion von 4mg des Antigens. (Abb.13b, S.54)
Bei dem Vergleich der unbeeinflußt ablaufenden Immunantwort von C4-/-Mäusen (Gruppe
E) mit der der Wildtypmäuse (Gruppe A) scheint die der C4-defizienten Tiere wesentlich
geringer auszufallen. Dieser Unterschied war jedoch zu keinem Zeitpunkt signifikant.
(Abb.13c, S.54)
Bei den Wildtypmäusen (Gruppe A) fallen die Antikörper nach der zweiten Injektion des
Antigens bis auf das Ausgangsniveau ab, und steigen eine Woche später wieder an, ohne
jedoch den Höchstwert wieder zu erreichen. (Abb.13a, S.54)
Da bei den C4-/-Mäusen die Immunantwort sehr schwach und uneinheitlich auszufallen
scheint, wurde auf eine weitere Analyse der Daten (Analyse des Wiederanstiegs der
Antikörperspiegel nach Tag 9) verzichtet.
53
100
16
90
14
70
IgG3-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG3-Spiegel
(1000 arb. U)
80
60
50
40
30
20
12
10
8
6
4
2
10
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: beide Inj. (n=6)
C: nur zweite Inj. (n=3)
0
b: C4-/-
B: nur erste Inj. (n=2)
D: keine Inj. (n=2)
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
T age nach erster Injektion
E: beide Inj. (n=6)
G: nur zweite Inj. (n=3)
F: nur erste Inj. (n=3)
H: keine Inj. (n=2)
50
45
IgG3-Spiegel
(1000 arb. U)
40
35
30
Abbildung 13: IgG3-Immunantwort gegen Np
25
20
a: IgG3 im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen
A-D), (Gruppe A mit Standardfehler)
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,beide Inj.(n=6)
B:wt,nur erste Inj.(n=2)
E:C4-/-,beide Inj.(n=6)
F:C4-/-,nur erste Inj.(n=3)
30
b: IgG3 im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen EH), (Gruppe E mit Standardfehler)
c: IgG3 im Serum von Wildtyp- und C4-/Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F), (A vs. E:
*p<0,05)
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die normale Immunantwort gegen Np in allen
untersuchten IgG-Subklassen bei C4-/-Mäusen signifikant geringer ausfällt als bei
Wildtypmäusen, die IgM-Produktion nach Immunisierung der Mäuse durch C4-Mangel
jedoch unbeeinflußt scheint.
Auch der Wiederanstieg der Antikörperspiegel nach dem durch die zweite, hohe Dosis an
injiziertem Antigen provozierten Abfall des Antikörperspiegels fällt, soweit beurteilbar, in
den IgG-Subklassen bei C4-/-Mäusen schwächer aus als in der vergleichbaren Gruppe von
Wildtypmäusen. Dieser Unterschied ist jedoch nur in einer Subklasse signifikant.
Der Wiederanstieg des IgM-Antikörperspiegels ist dagegen bei C4-/-Mäusen signifikant
stärker ausgeprägt als bei Wildtypmäusen.
54
3.1.4
Beeinflussung des immunologischen Gedächtnisses durch Komplementmangel
Auch die Funktion des immunologischen Gedächtnisses kann einen Hinweis auf die
Effektivität der Apoptose im Rahmen der Keimzentrumsreaktion geben. Sollten durch
Injektion einer hohen Dosis des Antigens in eine etablierte Immunantwort hinein ein
Großteil der im Keimzentrum befindlichen B-Zellen absterben, so wäre die Bildung der
Gedächtniszellen gestört und der Ablauf einer zweiten Immunantwort gegen das Antigen
verändert. Um zu überprüfen, ob die Gedächtniszellbildung durch Komplementmangel
beeinflußt wird, wurde Mäusen aller Versuchsgruppen sechs Monate nach den oben
beschriebenen Versuchen (am Tag 180) erneut eine niedrige Dosis des Antigens an ein
anderes Protein gebunden (100µg Np-BSA) ohne weitere Adjuvantien intraperitoneal
appliziert. (Tab.9) Im Verlauf wurde den Mäusen an den Tagen 183,187,194 und 201 Blut
entnommen, und in dem daraus gewonnenen Serum wurden mittels ELISA die
Konzentration der Np-spezifischen Antikörper bestimmt.
Ein Vorversuch hatte gezeigt, daß diese Dosis des Antigens ohne weitere Adjuvantien bei
vorher unbehandelten Mäusen die Bildung von Immunglobulinen der Klasse M (IgM),
aber nicht von Immunglobulinen der Klasse G (IgG) induziert. Somit konnte anhand der
Bildung von Immunglobulinen der Klasse G bei den unterschiedlich vorbehandelten
Mäusen des Suicide-Versuches eine primäre von einer sekundären Immunantwort gegen
Np unterschieden werden.
Tabelle 9: Übersicht über den Versuchsaufbau zur Untersuchung
immunologischen Gedächtnisses bei Komplementmangel
des
55
3.1.4.1 Antikörperbestimmung mittels ELISA
Auch in diesem Versuch wurde wieder deutlich, daß die einzelnen Werte der
Immunglobulinkonzentrationen innerhalb der einzelnen Versuchsgruppen zum Teil sehr
stark differierten. Der Standardfehler war dementsprechend z.T. sehr groß. (Abb.16b, S.59)
Außerdem ist festzustellen, daß zwei der C4-/-Mäuse der Versuchsgruppe F noch am Tag
180 einen vergleichsweise hohen Spiegel an Np-spezifischen IgM- und IgG1-Antikörpern
aufwiesen, obwohl in allen andern Mäusen die primäre Immunantwort schon wieder
abgeklungen war. Diese Mäuse wurden nicht aus der Wertung genommen.
3.1.4.2 IgM
Alle Mäuse zeigten am siebten Tag nach der erneuten Injektion des Antigens (Tag 187)
eine spezifische IgM-Produktion.
Innerhalb der Gruppe der Wildtypmäuse war der IgM-Spiegel im Serum in den Gruppen A
(alle drei Injektion) und B (nur erste und dritte Injektion), bei denen 6 Monate zuvor schon
eine Np-spezifische Immunantwort abgelaufen war, etwa doppelt so hoch wie in den
Kontrollgruppen C (nur zweite und dritte Injektion) und D (nur dritte Injektion). Nach zwei
Wochen begann dieser Titer wieder abzufallen. (Abb.14a, S.57)
Auch die C4-/-Mäuse entwickelten nach einer Woche Np-spezifische IgM-Antikörper, die
in den Versuchsgruppen E, G und H auch ähnlich hohe Titer erreichten wie die der
Wildtypmäuse. (Abb.14b, S.57) Auffällig ist, daß in der Gruppe F, d.h. der C4-defizienten
Tiere, die 6 Monate zuvor nur einmal mit 50µg Np-CGG in Alum immunisiert worden
waren, zwei Mäuse schon am Tag 180 einen hohen Antikörperspiegel hatten, der 7 Tage
nach der erneuten Injektion von 100µg Np-BSA noch weiter anstieg. Da diese Mäuse nicht
aus der Wertung genommen wurden, lag der IgM-Spiegel in dieser Versuchsgruppe
deutlich höher als in den anderen Gruppen C4-/-Mäuse. (Abb.14b, S.57)
Zwischen den Wildtypmäusen der Gruppe A und den C4-/-Mäusen der Gruppe E ließ sich
kein signifikanter Unterschied in der Stärke dieser zweiten Immunreaktion feststellen.
(Abb.14c, S.57)
56
400
700
600
300
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
350
250
200
150
100
500
400
300
200
100
50
0
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
180
200
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: alle drei Inj. (n=9)
C: nur 2. und 3. Inj. (n=3)
182
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
b: C4-/-
B: nur 1. und 3. Inj. (n=4)
D: nur 3. Inj. (n=3)
184
E: alle drei Inj. (n=9)
G: nur 2. und 3. Inj. (n=4)
F: nur 1. und 3. Inj. (n=3)
H: nur 3. Inj. (n=3)
700
IgM-Spiegel
(1000 arb. U)
600
500
Abbildung 14:
400
IgM-Produktion im Rahmen einer sekundären
Immunantwort gegen Np
300
200
a: IgM im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen
A-D), (Gruppe A mit Standardfehler)
100
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
b: IgM im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen EH), (Gruppe E mit Standardfehler)
200
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,alle drei Inj. (n=9)
B:wt, nur 1.u.3.Inj. (n=4)
E:C4-/-,alle drei Inj. (n=9)
F:C4-/-nur 1.u.3.Inj. (n=3)
c: IgM im Serum von Wildtyp- und C4-/Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F), (A vs. E:
*p<0,05)
3.1.4.3 IgG
Die Mäuse, die vorher noch keine Immunantwort gegen Np entwickelt hatten, produzierten
nach der Injektion von 100µg Np-BSA i.p. keine Antikörper der IgG-Subklassen. Dabei
machte es keinen Unterschied, ob die Mäuse noch nie mit dem Antigen in Berührung
gekommen waren (Gruppen D und H) oder aber 6 Monate zuvor die hohe Dosis Np (4mg)
injiziert bekommen hatten, und daraufhin keine Immunantwort entwickelt hatten (Gruppen
C und G). (Abb.15a und b, S.58)
Die
jeweilige
Immunantwort
in
den
einzelnen
IgG-Subklassen
der
anderen
Versuchsgruppen (Gruppen A, B, E und F) wird im Folgenden dargestellt.
3.1.4.3.1 IgG1
Die Titer der Np-spezifischen IgG1-Antikörper unterscheiden sich bei Wildtyp- und C4-/Mäusen nicht. Bei beiden Stämmen reagierten Mäuse, die sechs Monate zuvor mit 50µg
des Antigens in Alum immunisiert worden waren (Gruppen B und F), d.h. schon eine
57
normale Immunantwort gegen Np durchlaufen hatten, nach einer Woche mit der Bildung
von Np-spezifischen IgG1-Antikörpern. (Abb.15c)
Auch bei Mäusen, die in diese etablierte Immunantwort hinein zusätzliche 4mg des
Antigens injiziert bekommen hatten (Gruppen A und E), fanden sich ab dem Tag 187
IgG1-Antikörper im Serum. Allerdings war der IgG1-Titer im Serum dieser Mäuse
deutlich niedriger als der der Mäuse, die eine unbeeinflußte primäre Immunantwort
durchlaufen hatten (etwa 25% des IgG1-Spiegels der Gruppe B bei den Wildtypmäusen der
Gruppe A und ca. 35% des IgG1-Spiegels der Gruppe F bei den C4-defizienten Mäusen
der Gruppe E). Dieser Unterschied war bei den Wildtypmäusen ab dem Tag 187,
1.000
1.000
900
900
800
800
700
700
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
(Abb.15a) bei den C4-/-Mäusen erst am Tag 201 signifikant. (Abb.15b)
600
500
400
300
600
500
400
300
200
200
100
100
0
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: alle drei Inj. (n=9)
C: nur 2. und 3. Inj. (n=3)
180
182
184
b: C4-/-
B: nur 1. und 3. Inj. (n=4)
D: nur 3. Inj. (n=3)
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
E: alle drei Inj. (n=9)
G: nur 2. und 3. Inj. (n=4)
F: nur 1. und 3. Inj. (n=3)
H: nur 3. Inj. (n=3)
900
800
Abbildung 15:
IgG1-Spiegel
(1000 arb. U)
700
IgG1-Produktion im Rahmen einer sekundären
Immunantwort gegen Np
600
500
400
a: IgG1 im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen
A-D), (Gruppen A und B mit
Standardfehler, A vs. B: *p<0,05)
300
200
100
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,alle drei Inj. (n=9)
B:wt, nur 1.u.3.Inj. (n=4)
E:C4-/-,alle drei Inj. (n=9)
F:C4-/-nur 1.u.3.Inj. (n=3)
b: IgG1 im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen EH),
(Gruppen
E
und
F
mit
Standardfehler, E vs. F: *p<0,05)
c: IgG1 im Serum von Wildtyp- und C4-/Mäusen (Gruppen A,B vs. E,F), (A vs. E:
*p<0,05)
3.1.4.3.2 IgG2a
Ein Standard zur Messung der Immunantwort in der IgG2a-Subklasse ließ sich, wie schon
beim „Suicide-Versuch“ nicht etablieren, und eine Immunantwort in dieser Subklasse ließ
sich nicht messen. Dies wird in Kapitel 4.1.1.1 genauer erörtert.
58
3.1.4.3.3 IgG2b
In der IgG2b-Subklasse zeigte sich der Unterschied zwischen Mäusen, die 6 Monate zuvor
eine ungestörte Immunantwort gegen Np durchlaufen hatten, und den Mäusen, die am Tag
9 eine zusätzliche Injektion des Antigens (4mg NP-BSA) erhalten hatten, noch deutlicher.
Nur Mäuse der erstgenannten Gruppen (B und F) entwickelten nach der Injektion von
100µg Np-BSA eine nennenswerte IgG2b-Antwort. Bei den Wildtypmäusen war dieser
Unterschied (Gruppe A vs. Gruppe B) an den Tagen 194 bis 201 signifikant, (Abb.16a) im
Gegensatz zu den C4-/-Mäusen, bei denen keine signifikanten Unterschiede zwischen den
350
80
300
70
250
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
Gruppen E und F nachgewiesen werden konnten. (Abb.16b)
200
150
100
50
60
50
40
30
20
10
0
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
a: Wt
A: alle drei Inj. (n=9)
C: nur 2. und 3. Inj. (n=3)
180
182
184
188
190
192
194
196
198
200
T age erster nach Injektion
b: C4-/-
B: nur 1. und 3. Inj. (n=4)
D: nur 3. Inj. (n=3)
186
E: alle drei Inj. (n=9)
G: nur 2. und 3. Inj. (n=4)
F: nur 1. und 3. Inj. (n=3)
H: nur 3. Inj. (n=3)
18
350
16
300
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
IgG2b-Spiegel
(1000 arb. U)
14
250
200
150
100
50
12
10
8
6
4
2
0
0
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
c: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,alle drei Inj. (n=9)
B:wt, nur 1.u.3.Inj. (n=4)
E:C4-/-,alle drei Inj. (n=9)
F:C4-/-nur 1.u.3.Inj. (n=3)
180
182
184
186
188
190
192
194
196
198
200
T age nach erster Injektion
d: Vergleich Wt mit C4-/A:wt,alle drei Inj. (n=9)
E:C4-/-,alle drei Inj. (n=9)
Abbildung 16: IgG2b-Produktion im Rahmen einer sekundären Immunantwort
a: IgG2b im Serum der Wildtypmäuse (Gruppen A-D), (Gruppen A und B mit
Standardfehler, A vs. B: *p<0,05)
b: IgG2b im Serum der C4-/-Mäuse (Gruppen E-H), (Gruppen E und F mit
Standardfehler, E vs. F: *p<0,05)
c: IgG2b im Serum von Wildtyp- und C4-/-Mäusen, (Gruppen A,B vs. E,F), (Gruppen
B und F mit Standartfehler, B vs. F: *p<0,05)
d: IgG2b im Serum von Wildtyp- und C4-/-Mäusen, (Gruppe A vs. E), (mit
Standardfehler, *p<0,05)
59
Im Vergleich der C4-/-Mäuse mit den Wildtypmäusen fiel die „normale“ sekundäre
Immunantwort fiel bei den Wildtypmäusen (Gruppe B) signifikant stärker aus als bei den
C4-/-Mäusen (Gruppe F). (Abb.16c, S.59)
Vergleicht man die Versuchsgruppen der beiden Mausstämme, deren primäre
Immunantwort durch die Injektion von 4mg Np am Tag 9 unterbrochen wurde, so findet
sich auch hier einen signifikanter Unterschied: die C4-/-Mäuse (Gruppe E) haben ab Tag
187 signifikant weniger Antikörper im Serum als die Wildtypmäuse (Gruppe A) der
Vergleichsgruppe. (Abb.16d, S.59)
3.1.4.3.4 IgG3
Es konnte in dem untersuchten Zeitraum (Tag 180-201) in keiner der Versuchsgruppen ein
nennenswerter Anstieg von IgG3-Antikörpern gegen Np nachgewiesen werden.
Zusammenfassend kann man sagen, daß die IgM-Bildung einer sekundären Immunantwort
durch eine zweite, hohe Dosis des Antigens während der ersten Immunantwort bei
Wildtyp- und C4-/-Mäusen nicht verringert wird.
Die Bildung von Antikörpern der Klasse G (IgG1 und IgG2b) im Rahmen einer
sekundären Immunantwort wird dagegen bei beiden Mausstämmen durch eine Störung des
Ablaufes der primären Immunantwort wie die Injektion von 4mg des Antigens stark
abgeschwächt. Diese Verringerung des Antikörperspiegels war jedoch nur bei
Wildtypmäusen signifikant.
Unterschiede in der Stärke der sekundären IgG-Immunantwort zwischen Wildtyp- und C4defizienten Mäusen konnten bei den Mäusen des Suicide-Versuches (als Maß für die
Effektivität der Antigeninduzierten Apoptose in diesem Versuch) nur in einer Subklasse
gefunden werden. Die C4-defizienten Mäuse der Gruppe E wiesen signifikant niedrigere
IgG2b-Spiegel als deren Wildtyp-Vergleichsgruppe A auf.
60
3.2 Beeinflussung der Fas (CD95)-induzierten Apoptose durch frühe
Komplementkomponenten: Versuche in vitro
Mit Hilfe dieser Versuchsreihe sollte der Einfluß früher Komplementfaktoren vermittelt
über den Komplementrezeptors 2/1 (CD21/35) auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose
von B-Lymphozyten untersucht werden. Dazu wurde zum einen mit aus der Milz von
Wildtypmäusen isolierten B-Lymphozyten, und zum anderen mit zwei murinen BZellinien (WEHI 231 und 279) gearbeitet. Apoptotische Zellen wurden mit Hilfe des
TUNEL-Verfahrens nachgewiesen.
3.2.1
Vorversuch 1: Phänotypische Eigenschaften der WEHI-Zellinien
Die beiden murinen Zellinien WEHI 231 und 279 wurden über mehrere Wochen mit Hilfe
des
Durchflußfluoreszenzzytometer
auf
das
Vorhandensein
verschiedener
Oberflächenmoleküle hin untersucht.
Abstammend von B-Lymphozyten der Maus sollten beide Zellinien CD45R (B220) sowie
CD19, Teil des B-Zell-Korezeptorkomplexes, exprimieren. Um das Entwicklungsstadium
der Zellen abschätzen zu können, wurden sie außerdem auf das Vorhandensein von
membranständigem IgD, IgM und Peanut-Agglutinin (PNA) untersucht. (Abb.17)
Auch der Prozentsatz CD95 (Fas)- und CD21/35 (CR2/1)-tragender Zellen wurde über
mehrere Monate hin bestimmt. (Abb.17)
Oberflächenstruktur der WEHI-Zelllinien
Prozent pos. Zellen
100
80
60
WEHI 231
40
WEHI 279
20
0
Isotyp
(1)
B220 (2) CD19 (3) FAS (4) CR2/1 (5) IgM (7)
IgD (6)
Oberflächenmarker
Abbildung 17: Expression von Oberflächenmarkern der beiden Zellinien WEHI 231 und 279
gemessen im Durchflußfluoreszenzzytometer
angegeben mit der Standardabweichung (n=9)
61
Am deutlichsten unterscheiden sich die beiden Zellinien in der CD19-Expression: ca. 95%
aller lebenden WEHI 231-Zellen tragen CD19, im Gegensatz zu ca. 41% der lebenden
WEHI 279-Zellen. Auch Immunglobulin der Klasse D (IgD) findet sich bei der WEHI
231-Zellinie in ausgeprägterem Maße. 40% der WEHI 231-Zellen tragen IgD, bei den
WEHI 279-Zellen ist es dagegen nur bei ca.10% zu finden. (Abb.17, S.61)
Die restlichen Oberflächenmarker sind bei beiden Zellinien in ähnlichem Maße ausgeprägt.
So tragen fast alle Zellen beider Zellinien membranständiges IgM, 26% der lebenden
WEHI 231-Zellen (36% der lebenden WEHI 279-Zellen) sind für CD45R (B220), positiv,
42% der lebenden WEHI 231-Zellen (51% der lebenden WEHI 279-Zellen) exprimieren
die Komplementrezeptoren 2 und 1 (CD21/35) und 68% der WEHI 231-Zellen (79% der
lebenden WEHI 279-Zellen) tragen den Fas-Rezeptor (CD95). (Abb.17, S.61)
Beide Zellinien tragen kein Peanut-Agglutinin (PNA), ein Oberflächenmerkmal von BZellen des Keimzentrums.
Abbildung 18: Darstellung von Größe und
Granularität (FS/SS) der WEHI 231Zellinie als Densitogramm im
Durchflußfluoreszenzzytometer
Abbildung 19: Darstellung von Größe und
Granularität (FS/SS) der WEHI 231Zellinie im Durchflußfluoreszenzzytometer
braun: apoptotische Zellen
(TUNEL pos.)
grau: lebendige Zellen
(TUNEL neg.)
Bei allen Messungen fanden sich in der Darstellung der Größe und Granularität (FS/SS)
zwei verschiedene, deutlich voneinander getrennte Populationen, die hier beispielhaft für
die Zellinie WEHI 231 mit A und B bezeichnet werden. (Abb.18) Sie scheinen sich
deutlich im Oberflächenmolekülmuster zu unterscheiden. (Abb.20, S.63) Die Zellen der
Population B sind zum größten Teil TUNEL pos., also tote oder sterbende Zellen. (Abb.19)
Daher beziehen sich die Angaben in Abbildung 17 auf die Population A.
62
Prozent der für den Marker pos.
Zellen
Oberflächenstruktur der WEHI-Zelllinien
Population A vs. B
100
80
60
40
20
0
Isotyp
CD19
FAS
WEHI 231
Population
A
WEHI 231
Population
B
WEHI 279
Population
A
WEHI 279
Population
Abbildung 20: Expression der Oberflächenmarker CD19 und Fas (CD95)
in den beiden verschiedenen Zellpopulationen von WEHI 231 und 279
(Population A und B), angegeben mit der Standardabweichung (n=9)
3.2.2
Vorversuch 2: Apoptoseinduktion bei WEHI-Zellen
Um in den beiden Zellinien Apoptose zu induzieren, wurden verschiedene Verfahren
getestet: Entzug des Mediums durch Inkubation in PBS über 20h, Behandlung mit dem
Zellgift Camptothecin (Sigma) über 4h, und Stimulation des Fas-Rezeptors (CD95) mit
Anti-Maus CD95 (Pharmingen) über 10h. Danach wurde jeweils der Prozentsatz
apoptotischer, d.h. TUNEL pos. Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer bestimmt.
(Abb.21)
Abbildung 21: Darstellung von apoptotischen
Zellen mit Hilfe des TUNEL-Testes
(Histogramm des
Durchflußfluoreszenzzytometers)
dunkelblau: neg. Kontrolle
violett: WEHI 231 20h Mediumsentzug
Dabei zeigte sich, daß in beiden Zellinien schon unter normalen Kulturbedingungen ein
bestimmter Prozentsatz apoptotischer, d.h. TUNEL pos. Zellen vorlag, der leicht, aber
63
nicht signifikant unterschiedlich war (5% der WEHI 231-Zellen, 14% der WEHI 279Zellen). Dies waren zum größten Teil Zellen der Population B. (Abb.22)
Nach Entzug des Nährmediums über 20h zeigten fast alle WEHI 231-Zellen (95%)
apoptotisch fragmentierte DNA, im Gegensatz zu den Zellen der WEHI 279-Zellinie, von
denen nur 23% pos. für TUNEL wurden. (Abb.22) Nach Behandlung mit Camptothecin
wurden von beiden Zellinien ca. 80% der Zellen apoptotisch. (Abb.22)
Obwohl beide Zellinien Fas (CD95) exprimieren, ließen sich nur WEHI 279-, nicht aber
WEHI 231-Zellen durch Stimulation des Rezeptors zur Apoptose anregen. Nach
Behandlung mit 5µg Anti-Maus CD95 über 10h waren nur 2% der WEHI 231-, aber 56%
der WEHI 279-Zellen apoptotisch. Auch der Versuch das Signal durch Kreuzvernetzung
der an CD95 (Fas) gebundenen Antikörper mittels Protein G (Sigma) zu verstärken,
mißlang. Wurde zu den über Fas stimulierten Zellen zusätzlich Protein G dazugegeben
(1µg pro 4*106 Zellen in 1ml Medium), zeigten sich nur 2% der WEHI 231-Zellen und
44% der untersuchten WEHI 279-Zellen positiv im TUNEL-Test. (Abb.22)
Prozent TUNEL pos. Zellen
Apoptoseinduktion bei WEHI-Zellen
100%
80%
60%
WEHI 231
40%
WEHI 279
20%
0%
neg.Kontrolle
Mediumsentzug
Campthotecin
Anti-FAS Ak
Anti-FAS Ak
und Prot.G
Isotyp Ha 4/8
Abbildung 22: Apoptoseinduktion mittels verschiedener Methoden bei zwei WEHI-Zellinien
Prozent TUNEL pos. Zellen, angegeben mit der Standardabweichung (n=8)
neg. Kontrolle: Zellen 20h in Medium bei 37°C
Mediumsentzug: Zellen 20h in PBS bei 37°C
Campthothecin: Zellen 4h in DMSO mit Campthothecin bei RT
Fas:
Zellen 10h in Medium mit 5µg Anti-Maus CD95 bei 37°C (Brutschrank)
Fas+Prot.G:
Zellen 10h in Medium mit Anti-Maus CD95 und Prot.G bei 37°C
In den weiteren Versuchen wurde die WEHI 231-Zellinie nur noch für die Positiv- und
Negativkontrolle des Apoptosenachweises verwendet, alle anderen Versuche wurden mit
der Fas (CD95)-sensiblen Zellinie WEHI 279 durchgeführt.
64
3.2.3
Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von
WEHI-Zellen
Um den Einfluß von Komplement auf die Fas-induzierte Apoptose zu untersuchen, wurden
die Zellen wie im vorigen Absatz beschrieben 10h mit 5µg Anti-Fas (CD95) Antikörper
stimuliert und dann im Durchflußfluoreszenzzytometer auf das Vorhandensein von
charakteristischen Merkmalen der Apoptose hin untersucht.
Je nach Versuchsgruppe waren die Zellen vorher 10h mit Anti-Maus CD21/35, einem
Antikörper gegen die Komplementrezeptoren 2 und 1 der Maus oder N1G9 (ein IgG der
Maus gegen ein künstliches Antigen, Np) als Kontrolle behandelt worden. (Tab.10)
Dafür wurden jeweils 4*106 Zellen in 1ml Medium aufgenommen, und mit 2µg des mit
Biotin gekoppelten Antikörpers bei 37°C im Brutschrank 1h inkubiert. Nach Zugabe von je
ca. 0,02µg ExtrAvidin (Sigma) zum Kreuzvernetzen der Antikörper wurden die Zellen
nochmals 10h bei 37°C inkubiert. Vor der Induktion der Apoptose mittels Anti-Fas (CD95)
Antikörper wurden die Zellen zwei mal in PBS gewaschen.
Zusätzlich wurden WEHI 231-Zellen, die 20h in PBS inkubiert hatten, als Positivkontrolle,
und gleichbehandelte WEHI 231-Zellen ohne spezifisch koppelndes Enzym (TdT des
TUNEL-Testes) als Negativkontrolle mitgeführt. (Abb.23, S.66)
Eine weitere Gruppe wurde 11h mit rekombinanten IL-4 (300 Units) (Pharmingen,
Nr.550067) stimuliert. (Tab.10)
Schließlich wurde die Anzahl apoptotischer Zellen mittels des TUNEL-Testes und der
Durchflußfluoreszenzzytometrie bestimmt.
Tabelle 10: Übersicht über den Versuchsaufbau zur Untersuchung der Fas
(CD95)-induzierten Apoptose an WEHI-Zellen
65
FAS-induzierte Apoptose
von WEHI 279-Zellen
Prozent TUNEL pos. Zellen
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Versuchsgruppen
pos. Kontrolle
(Gruppe 1)
neg. Kontrolle
(Gruppe 2)
unstimulierte Zellen
(Gruppe 3)
Anti-CD21/35 Ak (ohne
Anti-Fas Ak) (Gruppe 4)
Anti-Fas Ak
(Gruppe 5)
Anti-Fas Ak und N1G9
(Gruppe 6)
Anti-Fas Ak und AntiCD21/35 Ak (Gruppe 7)
Anti-Fas Ak und IL-4
(Gruppe 8)
Abbildung 23: Fas (CD95)-induzierte Apoptose an WEHI-Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer
Prozent TUNEL pos. Zellen, (mit Standardabweichung (n=3))
pos. Kontrolle (Gruppe 1): 20h in PBS Mediumsentzug (WEHI 231)
neg. Kontrolle (Gruppe 2): 20h in PBS Mediumsentzug, TUNEL Boehringer Kit ohne
spezifisch Koppelndes Enzym verwendet (WEHI 231)
Wie man auf obenstehender Grafik (Abb.23) erkennen kann, überleben ein Großteil aller
unstimulierten oder nur mit Anti-CD21/35 Antikörper behandelten Zellen. Nur 14% der
Zellen unter Kulturbedingungen (Gruppe3) und 12% der Zellen die mit Anti-CR2/1
(CD21/35) Antikörper behandelt worden waren (Gruppe 4), zeigten Zeichen der Apoptose.
Von den Zellen, die mit Fas (CD95) stimuliert worden waren (Gruppe5) starben. Durch
vorhergehende Stimulation mit Anti-CD21/35 Antikörper (Gruppe 7) oder dem
unspezifischen Antikörper N1G9 (Gruppe 6) ließ sich die Rate TUNEL pos. Zellen nicht
senken, sie blieb mit 57% bei der Gruppe 7 und 61% der Gruppe 6 praktisch unverändert.
Auch die vorhergehende Stimulation mit IL-4 (Gruppe 8) „rettete“ die Zellen nicht vor der
Fas (CD95)-induzierten Apoptose (58% TUNEL pos. Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer). (Abb.23)
3.2.4
Vorversuch 3: Phänotypische Eigenschaften aufgereinigter Splenozyten
Aus den Milzen von pro Versuch je drei Wildtypmäusen wurden zunächst Splenozyten
über einen Dichtegradienten isoliert. (Kapitel 2.2.3.1) Die so gewonnenen Zellen wurden
dann anhand spezifischer Oberflächenmarker weiter aufgereinigt. (Kapitel 2.2.3.2) Dies
erfolgte mit Antikörpern, an welche sogenannte magnetische Beads gekoppelt sind und die
verschiedene Epitope auf T-Lymphozyten oder Makrophagen wie CD11b, CD90 (Tyh1.2)
66
und CD11c erkennen. Mittels eines Magneten wurden dann die mit Beads behafteten
Zellen (die Negativfraktion) entfernt.
Die Reinheit der so gewonnenen Zellen (Positivfraktion) wurde dann zusammen mit dem
Profil der Oberflächenmarkern der Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer untersucht.
Dabei zeigte sich, daß diese Zellen („Positivfraktion“) im Durchschnitt zu ca. 80% B220
(CD45) und CD19, beides Marker von B-Zellen trugen. Allerdings wurde B220 wesentlich
stärker exprimiert als CD19, d.h. die durchschnittliche Fluoreszenzintensität, ein Maß für
die Ausprägung eines Merkmals auf einer einzelnen Zelle, lag für B220 deutlich höher (20
vs. 4). (Abb.24)
Auch waren die Zellen fast vollständig für membranständiges IgM und IgD, (Abb.25)
sowie für den Komplementrezeptor 2/1 (CD21/35) positiv.
Abbildung 24: Darstellung der Expression verschiedener
Oberflächenmoleküle aufgereinigter Splenozyten
im Durchflußfluoreszenzzytometer
(Histogramm des Durchflußfluoreszenzzytometers)
dunkelblau:
violett:
Isotypkontrolle,
B220, türkis: CD19
Abbildung 25: Darstellung
der
Expression von IgD auf isolierten
Splenozyten
(Histogramm des Durchflußfluoreszenzzytometers)
dunkelblau: Isotypkontrolle,
violett:
IgD
Wurden im Durchflußfluoreszenzzytometer nur die der Größe und Granularität von
Lymphozyten entsprechenden Zellen (FS/SS) untersucht („gegatet“), so zeigte diese
Untergruppe der Positivfraktion eine B-Zell-Reinheit von über 90%, d.h. über 90% der
Zellen exprimierten B220, CD19, CD21/35, IgM und IgD. (Abb.26, S.68)
67
Oberflächenstruktur aufgereinigter Splenozyten
"Positivfraktion"
Prozent der für den
untersuchten Marker
pos. Zellen
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Isotyp
B220
CD19
CR2/1
IgD
IgM
FAS
CD3
CD90.2
Gr-1
F4/80
untersuchter Oberflächenmarker
Abbildung 26:
Expression von Oberflächenmarkern auf aufgereinigten Splenozyten
(der „Positivfraktion“) gemessen im Durchflußfluoreszenzzytometer, mit
Standardabweichung (n=4)
Nur 60% der aufgereinigten B-Lymphozyten trugen den Fas-Rezeptor (CD95). (Abb.26)
Dieser Prozentsatz ließ sich nicht durch Stimulation der Zellen mit Anti-CD40 oder AntiCD40 und Anti-CD8α über 48h variieren. (Kapitel 3.2.5) Die Zellen, die Fas exprimierten,
trugen zu ca. 90% auch den Komplementrezeptor 2/1.
Die mit Anti-CD40 stimulierten Zellen veränderten sich jedoch phänotypisch: sie wurden,
erkennbar im Durchflußfluoreszenzzytometer, etwas größer und zeigten eine veränderte
Granularität. (Abb.27)
Abbildung 27: Größe (FS) und Granularität (SS)
aufgereinigter Lymphozyten im Durchflußfluoreszenzzytometer nach Stimulation mit
Anti-CD40 Antikörper über 49h
Population B: B-Lymphozyten,
die
durch
Stimulation des CD40-Rezeptors Größe und
Granularität veränderten
BL: größtenteils lebendige B-Zellen
BT: apoptotische (TUNEL pos. B-Zellen)
Population T: T-Lymphozyten
(Größe
und
Granularität unstimulierter Lymphozyten)
Die im zweiten Schritt der Aufreinigung (Kapitel 2.2.3.2) herausgefilterten Zellen der
Negativfraktion, die für die Versuche nicht verwendet wurden, trugen zu 60% CD3 und
68
CD90.2, beides Marker von T-Lymphozyten, und zu 15% B220 und CD19. Zusätzlich
fanden sich Zellen, die Gr-1 (ein Oberflächenmolekül von Granulozyten) oder F4/80 (ein
Oberflächenmolekül von Makrophagen) exprimierten. (Abb.28)
In einem anderen Versuchsansatz wurde auf den zweiten Schrittes der Aufreinigung, die
Negativselektion anhand spezifischer Oberflächenmarker verzichtet und lediglich über
einen Dichtegradienten aufgereinigt. In diesem Versuchsansatz lag der Prozentsatz der TLymphozyten, erkennbar an den Markern CD3 und CD90.2 (Thy-1) bei ca. 25%. Die
restlichen Zellen waren zu 65% B220 pos., also wahrscheinlich B-Zellen, und weniger als
3% trugen Gr-1 oder F4/80. (Abb.29)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
untersuchter Oberflächenmarker
Oberflächenstruktur aufgereinigter Splenozyten
mit T-Zellen
Isotyp
B220
CD19
CD3
CD90.2
CD8
Gr1
F4/80
Abbildung 28: Oberflächestruktur der im Zuge
der Aufreinigung herausgefilterten
Zellen („Negativfraktion“)
3.2.5
Prozent der für den
untersuchten Marker pos.
Zellen
Prozent der für den
untersuchten Marker pos.
Zellen
Oberflächenstruktur aufgereinigter Splenozyten
Negativfraktion
100%
80%
Isotyp
60%
B220
40%
CD3
20%
Gr1
0%
untersuchter Oberflächenmarker
F4/80
Abbildung 29: Oberflächestruktur
aufgereinigter Splenozyten
ohne Entfernung der T-Zellen
Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von BLymphozyten der Milz
Um an den aus der Milz isolierten B-Lymphozyten den Einfluß von Komplement zu
untersuchen, wurden die Zellen in Nährmedium (Kapitel 2.2.3.2) bei 37°C und 5% CO2
kultiviert.
Nach 5h wurde der schon mit WEHI 279-Zellen durchgeführte Versuch (Kapitel 3.2.3)
wiederholt. Je 4*106 isolierte B-Zellen wurden über 10h mit 300 Units IL-4, 2µg AntiCD21/35 Antikörper oder 2µg des unspezifischen Antikörpers (N1G9) und 0,02µg
ExtrAvidin inkubiert, um dann über 10h mit 5µg Anti-Fas Antikörper stimuliert zu
werden.
Danach
wurden
sie
im
Durchflußfluoreszenzzytometer
bezüglich
der
Apoptoserate untersucht.
69
Dabei zeigte sich, daß schon unstimulierte Kontrollzellen zu ca. 30% apoptotisch waren.
Eine Stimulation des Fas-Rezeptors (CD95) konnte diese Rate weder mit noch ohne
vorhergehende IL-4 oder Anti-CD21/35 Behandlung signifikant erhöhen. Die Applikation
von IL-4 schien die Apoptoserate leicht, allerdings nicht signifikant zu erniedrigen.
(Abb.30)
Fas-induzierte Apoptose
von aufgereinigten B-Zellen der Milz
pos. Kontrolle
neg. Kontrolle
Prozent TUNEL pos.
Zellen
100%
unstimulierte
Zellen
Anti-Fas Ak
80%
60%
40%
20%
0%
Versuchsgruppe
Abbildung 30:
N1G9 und AntiFas Ak
Anti-CD21/35 Ak
und Anti-Fas Ak
IL-4 und Anti-Fas
Ak
Fas (CD95)-induzierte Apoptose an aufgereinigten B-Zellen der Milz im
Durchflußfluoreszenzzytometer
in Prozent TUNEL pos. Zellen, (mit Standardabweichung (n=3))
pos. Kontrolle: 20h in PBS Mediumsentzug (WEHI 231-Zellen)
neg. Kontrolle: 20h in PBS Mediumsentzug, TUNEL Boehringer Kit
ohne spezifisch Koppelndes Enzym verwendet (WEHI 231-Zellen)
3.2.5.1 Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von
vorstimulierten B-Lymphozyten der Milz
Um eine gesteigerte Sensitivität der Zellen für Fas zu erreichen wurden in einem neuen
Versuchsansatz nach der Aufreinigung je 2*106 Zellen 48h lang mit 10µg Anti-CD40
Antikörper, 10µg Anti-CD40 Antikörper zusammen mit 10µg Anti-CD8α Antikörper oder
10µg Anti-CD40 Antikörper zusammen mit isolierten T-Zellen der Milz bei 37°C im
Brutschrank inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen, die entsprechenden Mengen
IL-4 (300Units bzw. 1200Units) oder CD21/35 (2µg) dazugegeben, erneut 1h inkubiert,
und 0,02µg ExtrAvidin hinzugefügt. Nach weiteren 9h im Brutschrank wurden die Zellen
gewaschen, in neuem Nährmedium gelöst und mit 5µg Anti-Fas Antikörper versetzt,
woraufhin sie wiederum 10h bei 37°C im Brutschrank inkubierten. Auch hier wurde die
Rate apoptotischer Zellen nach Behandlung und diversen Kontrollen mit Hilfe des
TUNEL-Testes im Durchflußfluoreszenzzytometer bestimmt. (Abb.31, S.71)
70
Abbildung 31: Übersicht über den Versuchsaufbau zur Untersuchung des Einflusses von
frühen Komplementfaktoren auf die Fas-induzierte Apoptose aufgereinigter Splenozyten
Dabei zeigte sich, daß alle Zellen, die keine CD40-Stimulation erhalten hatten nach 3
Tagen im Nährmedium zu ca. 90% abgestorben waren. (Abb.32, S.72, Gruppe0)
Wurden die Zellen mit Anti-CD40 Antikörper stimuliert, so veränderten sie Größe und
Granularität (Abb.27, S.68) und nur ca. 40% wurden TUNEL pos. (Abb.32, S.72, Gruppe1)
Die Gabe von Anti-CD8α Antikörper oder isolierten T-Lymphozyten zum Nährmedium
zusätzlich zu Anti-CD40 Antikörper änderte nichts am Aussehen oder der Überlebensrate
der Zellen. Nach 3 Tagen waren in diesen Versuchsgruppen ebenfalls etwa 40% der Zellen
TUNEL pos..
Die Zellen, die zusätzlich zu der Vorbehandlung mittels des Anti-CD40 Antikörper über
den Fas-Rezeptor (CD95) stimuliert worden waren, zeigten zu 95% Zeichen der Apoptose.
(Abb.32, S.72, Gruppe2) Auch in diesem Versuchsaufbau änderte die Zugabe von AntiCD8α Antikörper oder isolierten T-Lymphozyten zum Nährmedium die Apoptoserate
nicht.
In diesem Modell der durch Anti-CD40, Anti-CD40 und Anti-CD8α oder Anti-CD40 und
T-Zellen vorstimulierten B-Lymphozyten veränderte die Behandlung der Zellen mit IL-4
(Abb.32, S.72, Gruppen 4, 7 und 9) oder Anti-CD21/35 Antikörper (Abb.32, S.72, Gruppen
3, 6 und 8) die Rate der Fas-induzierten Apoptose nicht signifikant. Ein Trend zu weniger
TUNEL pos. Zellen ließ sich nur bei hoher IL-4 (1200 Units) Dosierung feststellen.
(Abb.32, S.72, Gruppe5)
71
Prozent TUNEL pos. B-Zellen
Fas-induzierte Apoptose von
vorstimulierten B-Zellen der Milz
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Versuchsgruppe
pos. Kontrolle
neg. Kontrolle
Gruppe 0: keine Stimulation
Gruppe 1: nur Anti-CD40 Ak
Gruppe 2: Anti-CD40 Ak und Anti-Fas Ak
Gruppe 3: Anti-CD40 Ak, Anti-CD21/35-Ak und Anti-Fas Ak
Gruppe 4: Anti-CD40 Ak, IL-4 (300U) und Anti-Fas Ak
Gruppe 5: Anti-CD40 Ak, IL-4 (1200U) und Anti-Fas Ak
Gruppe 6: Anti-CD40+Anti-CD8 Ak, Anti-CD21/35 Ak und Anti-Fas Ak
Gruppe 7: Anti-CD40+Anti-CD8 Ak, IL-4 (300U) und Anti-Fas Ak
Gruppe 8: Anti-CD40 Ak+T-Zellen Anti-CD21/35 Ak und Anti-Fas Ak
Gruppe 9: Anti-CD40 Ak+T-Zellen, IL-4 (300U) und Anti-Fas Ak
Abbildung 32:
Einfluß der CD40-Vorstimulation und früher Komplementfaktoren
auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von aufgereinigten Splenozyten
Prozent TUNEL pos. Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer
mit Standardabweichung (n=3)
pos. Kontrolle: 20h in PBS Mediumsentzug, (WEHI 231)
neg. Kontrolle : 20h in PBS Mediumsentzug,
TUNEL-Boehringer-Kit ohne spezifisch koppelndes Enzym
verwendet (WEHI 231)
72
4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit sollte die Bedeutung früher Komplementkomponenten für die
Apoptose von B-Zellen im Rahmen der peripheren Toleranzentwicklung im Keimzentrum
untersucht werden.
Ausgangspunkt war die Erkenntnis, daß die Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus
Erythematodes, bei der autoreaktive B-Lymphozyten Antikörper gegen körpereigene
Antigene produzieren, mit Defizienz der frühen Komplementfaktoren assoziiert ist. Wie es
bei Komplementmangel zur Entstehung der Autoantikörper kommt, ist bis heute nicht
abschließend geklärt, wenngleich verschiedene Erklärungsansätze postuliert worden sind.
Eine dieser Erklärungen basiert auf der gestörten Elimination apoptotischer Zellen und
Immunkomplexen bei Komplementmangel35,125,131.
Eine andere Theorie geht von der Erkenntnis aus, daß die Entwicklung und Ausreifung der
B-Zellen, die die für die Entwicklung des SLE pathogenetisch wichtigen Antikörper
produzieren, über verschiedene Komplementkomponenten und -rezeptoren reguliert
wird46,58,63. Dieser Theorie zufolge würde ein Komplementmangel die Krankheit über eine
gestörte periphere Toleranzentwicklung der B-Zellen initiieren47,58,121,122,132.
Ein wichtiger Mechanismus zur Toleranzinduktion von B-Zellen ist neben der Anergie78
die
Apoptose133,
der
„induzierte
Selbstmord“
von
Zellen.
Ein
defekter
Apoptosemechanismus hat eine mangelhafte Toleranzentwicklung zur Folge76,88,124,134.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob die frühen Komplementkomponenten, die
mit der Entstehung eins SLE assoziiert sind, einen Einfluß auf die Apoptose von BLymphozyten haben. Dazu wurden verschieden Experimente durchgeführt, die zeigen
sollten, ob der Komplementmangel von C4-/-Mäusen, welche spontan Zeichen der
Autoimmunerkrankung SLE entwickeln, einen gestörten Apoptosemechanismus zur Folge
hat, und ob die Fas-induzierte Apoptose von B-Zellinien und isolierten B-Zellen der Milz
durch Stimulation des Komplementrezeptors beeinflußbar ist.
73
4.1 Antigeninduzierte Apoptose: Versuche in vivo
Versuche am lebenden Organismus zeichnen sich dadurch aus, daß Zusammenhänge in
einem komplexen System untersucht werden. Es ist nicht leicht, ein relativ kurzes Ereignis
wie die Apoptose von B-Zellen im Keimzentrum auf Einflußgrößen hin zu untersuchen, da
apoptotische Zellen innerhalb des Keimzentrums nur selten nachzuweisen sind92. Sie
werden in der Regel von Makrophagen schnell phagozytiert. Eine Möglichkeit, die Rate
apoptotischer Zellen in den Keimzentren der Milz zu erhöhen, und damit sie für eine
Untersuchung faßbar zu machen, ist die Antigeninduzierte Apoptose. Die Injektion einer
großen Dosis löslichen Antigens in die etablierte Immunantwort eines Versuchstieres
hinein läßt viele, während der Immunantwort gebildete antigenspezifische B-Zellen
absterben92,93,94. Aufgrund der großen Zahl an apoptotischen Zellen wird dieser
Versuchsaufbau auch als „Suicide-Versuch“ bezeichnet.
4.1.1
Die Humorale Immunantwort gegen Np
4.1.1.1 Die Humorale Immunantwort von Wildtypmäusen gegen Np
Um die Antigeninduzierte Apoptose untersuchen zu können, wurde zunächst eine
Immunantwort gegen ein Antigen, Np, induziert. Da Np ein Hapten ist, also isoliert keine
Immunantwort auslöst, wurde es an ein Trägerprotein, CGG, gebunden injiziert. Dabei
konnte bestätigt werden, daß die Injektion von 50µg Np-CGG eine Np-spezifische
Immunantwort auslöst7,12,135,136. Am Tag 8 nach Injektion des Antigens fanden sich im
Serum Np-spezifische Antikörper (Abb.10c, S.49) und PNA pos. Keimzentren in der
weißen Pulpa der Milz. (Abb.7, S.45, Gruppe B)
Die Np-spezifische Immunantwort von C57BL/6 Mäusen, der Stamm, der in dieser Arbeit
sowohl als Wildtypkontrolle, als auch als genetisch veränderte Variante (C4-/-) verwendet
wurde, besteht zum größten Teil aus Antikörpern der Klassen IgM, IgG1 und zum Teil
auch IgG2b7,135. Antikörper dieser Klassen konnten auch in den Versuchen, die dieser
Arbeit zugrunde liegen gefunden werden. Die Antikörpertiter stiegen erwartungsgemäß
einige Tage nach der Immunisierung der Mäuse an und erreichten nach ein bis zwei
Wochen (je nach Subklasse) ein Plateau, das sich über mehrere Wochen hielt. (Abb.10a,
S.49 und 11a, S.51, Gruppe B) Aufgrund der nur halbquantitativen Meßmethoden
(Vergleich der Proben mittels ELISA mit einem Standardserum, dessen exakter Gehalt an
74
Antikörpern nicht bekannt ist) konnte in dieser Arbeit kein Vergleich zwischen der Höhe
der Serumtiter der verschiedenen Subklassen gezogen werden.
Die Immunantwort der Antikörper der Klasse M (Anstieg der Serumtiter nach einigen
Tagen bis zum Erreiche eines Plateau-Wertes nach etwa einer Woche) (Abb.10a, S.49,
Gruppe B) warf zunächst Fragen auf. Anstatt wie beschrieben12 ca. 8-10 Tage nach der
Injektion des Antigens, zum Zeitpunkt des Klassenwechsels der Immunantwort, wieder
abzufallen blieb der IgM-Spiegel von Wildtyp- und C4-/-Mäusen auf erhöhtem Niveau.
Dies läßt sich jedoch durch den Umstand erklären, daß das Antigen in einem Adjuvans,
Alum, präzipitiert injiziert wurde. Dieses wirkt als Entzündungsreiz und Depot im
Bauchraum, von dem aus Np über längere Zeit in den Kreislauf penetrieren, und somit die
IgM-Bildung in Gang halten könnte.
Der zeitliche Verlauf des IgG1-Spiegels verhielt sich dem des IgM-Spiegels ähnlich. Er
stieg einige Tage nach Injektion des Antigens an, um dann, wie in dieser Subklasse zu
erwarten, über mehrere Wochen konstant zu bleiben7,136. (Abb.11a, S.51, Gruppe B)
In der IgG2b-Subklasse stiegen Konzentrationen Np-spezifischen Antikörper bis zum Tag
16 deutlich an. Eine Ursache für das frühe Absinken des IgG2b-Titers ab Tag 16 der
Immunantwort (Abb.12a, S.52, Gruppe B) konnte nicht gefunden werden. Die Bedeutung
dieser Immunglobulinsubklasse für die Immunantwort gegen Np wird allerdings
kontrovers beurteilt7,135.
In der Literatur ist keine Bildung von Immunglobulinen der Klasse G3 (IgG3) in der
Immunantwort gegen Np beschrieben7,135. Dennoch wurden in dieser Arbeit Npspezifische IgG3-Antikörper im Serum der Mäuse bestimmt. Dabei ist zu beachten, daß für
die Bestimmung dieser Antikörpersubklasse nur noch Seren weniger Mäuse (n=2) zur
Verfügung standen, (Abb.13a, S.54, Gruppe B) und dementsprechend der Verlauf der
unbeeinflußten IgG3-Immunantwort der Wildtypmäuse gegen Np nicht sicher aus den
Daten zu bestimmen war. Es scheint aber, obwohl in der Literatur nicht erwähnt135, einen
Anstieg der IgG3-Antikörper nach zwei Wochen zu geben, der sehr schnell wieder abfällt.
Aufgrund der geringen Relevanz der Ergebnisse dieses Teilversuches für die Fragestellung
wurde auf die Verwendung weiterer Tiere zur Wiederholung verzichtet.
Es wurden keine Np-spezifischen IgG2a-Antikörper im Serum der Mäuse gemessen. Seit
kurzem ist bekannt, daß verschiedene Mausstämme, darunter auch die hier verwendeten
C57BL/6-Mäuse, nicht über die Subklasse IgG2a verfügen, sondern über eine andere,
IgG2c130. Die hier verwendeten Antikörper sind gegen IgG2a gerichtet, und erkennen
75
folglich die ev. gebildeten IgG2c-Immunglobuline nicht. Da diese Subklasse in der
Immunantwort gegen proteingebundene Haptene nicht bedeutend ist7,135,136, ist sie doch
vor allem in der Antwort gegen virale Antigene von Bedeutung7,28,137, wurde auf die Suche
nach einem IgG2c-Antikörper verzichtet.
4.1.1.2 Der Einfluß von C4 auf die humorale Immunantwort gegen Np
Die humorale Immunantwort der C4-/-Mäuse war in den IgG-Subklassen gegenüber den
Wildtypmäusen signifikant verringert, Antikörper der IgM-Subklasse wurde dagegen in
ähnlichem Maße produziert. (Abb.10c, S.49 und 11c, S.51, Gruppen B und F) Dabei
variierte die Immunantwort der einzelnen C4-/-Mäuse stark untereinander.
Diese reduzierte humorale Immunantwort in C4-defizienten Tieren ist, wie schon in der
Einleitung beschrieben, bekannt. Verschiedene Arbeiten beschreiben eine deutliche
Reduktion derjenigen Antikörperklassen, die nach dem Klassenwechsel einer B-Zelle
gebildet werden, wie IgG2a, IgG2b und IgG310,39,53,113,138, sowie die Reduktion der Zahl
und Größe von Keimzentren in Milzen von C4-/-Mäusen10,39. Unterschiedlich wird
dagegen die IgM- und IgG1-Bildung während der Immunantwort gegen T-Zell-abhängige
Antigene von C4-/-Mäusen beurteilt. So ist die antigenspezifische IgM-Produktion
während der Immunantwort gegen einen Bakteriophagen bei C4-/-Mäusen signifikant
geringer als bei der Wildtypvergleichsgruppe39, während der Immunantwort gegen das
Hapten Np, wie auch in dieser Arbeit jedoch gleich41. Dieser Unterschied in der Bedeutung
von C4 für die IgM-Produktion könnte durch die verschiedenen Versuchsmodelle
begründet sein. Die oligoklonale Immunantwort gegen ein Hapten (wie das hier
verwendete Np) unterscheidet sich deutlich von der polyklonalen Antwort gegen einen
Virus mit vielen verschiedenen antigenen Epitopen7. Zudem ist bekannt, daß die Defizienz
des Komplementrezeptors 2 (CD21) bei größeren Antigendosen54,139 oder starker Affinität
der B-Zellen zu dem Antigen10,139 eine geringere Rolle spielt. Die in der jeweiligen Arbeit
verwendete Dosis wäre somit ein weiterer Faktor, der die Immunantwort beeinflussen
könnte.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß in dieser Arbeit die Bedeutung von C4 für die
Bildung von IgG-Antikörpern während der humorale Immunantwort gegen eine
Proteinantigen bestätigt werden konnte.
76
4.1.1.3 Apoptose im Rahmen der normalen Immunantwort gegen Np
Im Laufe einer normal ablaufenden Immunantwort sind apoptotische Zellen innerhalb des
Keimzentrums nur selten nachzuweisen92. Sie werden in der Regel von Makrophagen
schnell phagozytiert. Auch in dem in dieser Arbeit gewählten Versuchsaufbau konnte dies
bestätigt werden: unbehandelte Wildtypmäuse und Wildtypmäuse, die eine normale
Immunantwort gegen Np etabliert hatten, zeigten nur eine geringe Anzahl apoptotischer
Zellen in der Milz. (Abb.8, S.46, Gruppen B und D) Diese könnten B-Zellen des
Keimzentrums sein, die bei der physiologischen Selektion durch mangelnde Kostimulation
absterben8.
Auch in C4-/-Mäusen konnten apoptotische Zellen nachgewiesen werden, woraus folgt,
daß ohne den Komplementfaktor 4 Apoptose im Keimzentrum möglich ist. (Abb.8, S.46,
Gruppe F) Interessanterweise war die Anzahl der apoptotischen Zellen in unbehandelten
C4-/-Mäusen oder C4-/-Mäusen, die eine weitgehend intakte Immunantwort gegen Np
etabliert hatten, im Vergleich Wildtypmäusen nicht signifikant erhöht, (Abb.8, S.46,
Gruppen B und F) ein möglicher Hinweis auf einen intakten Abräummechanismus bei
Komplementdefizienz. Solange apoptotische Zellen nicht gehäuft in der Milz C4-/-Mäuse
anfallen, könnte deren Clearence dort ungestört sein. Fallen apoptotische Körperchen
dagegen gehäuft an, so scheint in anderen Organen die Abräumfunktion apoptotischer
Zellen Komplement zu benötigen125,140. So wurden apoptotische Zellen, die in den
Peritonealraum C4-/-Mäuse
injiziert
wurden,
dort
langsamer
beseitigt
als
im
Peritonealraum der Wt-Vergleichsgruppe32. Geht man davon aus, daß die Clearence
apoptotische Zellen auch in der Milz Komplement benötigt, so könnte die nicht erhöhte
Anzahl apoptotischer Zellen in C4-/-Mäusen gegenüber Wildtypmäusen auch durch das
verminderte Anfallen apoptotischer Zellen zu erklären sein. Es würden somit weniger
Zellen apoptotisch, diese wären aber, da sie aber schlechter phagozytiert würden, besser
nachweisbar. Falls diese Hypothese korrekt ist, sollten in den Experimenten dieser Arbeit
weitere Anzeichen für eine mangelhaft ablaufende Apoptose bei C4-defizienten Mäusen
gefunden werden.
4.1.2
Hochdosis-Toleranz
Eine sehr hohe Dosis an Antigen löst in der Regel keine Immunantwort aus141. Dieses
Phänomen wurde früher als „High-zone-tolerance“ (Hochdosis-Toleranz) bezeichnet und
konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden: die alleinige Injektion von 4mg des Haptens
77
Np gekoppelt an ein Trägerprotein löste, im Gegensatz zu der wesentlich kleineren Dosis
von 50µg sowohl bei Wildtyp- als auch bei C4-/-Mäusen keine Np-spezifische
Immunantwort aus. (Abb.10a und b, S.49, und 11a und b, S.51, Gruppen C und G)
In den Milzen der Mäuse, die nur diese hohe Dosis des Antigens (4mg Np-BSA i.p.)
injiziert bekommen hatten, zeigten sich 8h nach der Injektion zahlreiche apoptotische
Zellen wahllos über rote und weiße Pulpa verteilt. (Abb.7, S.45, Gruppen C und G) Da die
Mäuse vorher nicht mit dem Antigen in Berührung gekommen waren, ist es
unwahrscheinlich, daß all diese sterbenden Zellen Np-spezifische Lymphozyten sind. Es
scheint sich somit um ein unspezifisches Phänomen zu handeln. Um es aber genau erklären
zu können, müßten weitere Versuche durchgeführt und der apoptotische Zelltyp näher
bestimmt werden. Bei den C4-/-Mäusen fanden sich vergleichsweise mehr apoptotische
Zellen pro Gesichtsfeld als bei der Wildtypvergleichsgruppe. (Abb.8, S.46, Gruppen C und
G) Dies könnte wiederum auf einen Abräumdefekt apoptotischer Zellen bei
Komplementmangel hinweisen.
Werden die Mäuse, die nur eine hohe Dosis Np-BSA (4mg) i.p. injiziert bekommen hatten,
6 Monate später (am Tag 180) mit einer kleinen Dosis Np-BSA (100µg i.p.) ohne weiteren
Adjuvantien behandelt, so bilden sie nur wenige IgM-Antikörper und keine IgGAntikörper. (Abb.14a und b, S.57 und 15a und b, S.58, Gruppen C und G) Dies ist das
typische Bild einer ohne Adjuvantien induzierten primären Immunantwort gegen Np. Im
Gegensatz dazu würden bei einer sekundären Immunantwort hohe Spiegel Np-spezifischer
Antikörper der IgG-Subklassen nachweisbar sein. (Kapitel 4.1.4.1)
Daraus kann geschlossen werden, daß die Injektion von 4mg Np-BSA nicht nur keine
direkte Antikörperproduktion auslöst, sondern auch keine Bildung von B-Gedächtniszellen
induziert.
4.1.3
Die Antigeninduzierte Apoptose
Eine der Vorraussetzungen für die Antigeninduzierte Apoptose ist die Erkenntnis, daß sich
die Immunantwort gegen ein bestimmtes Antigen durch eine hohe Dosis der löslichen
Form desselben unterbinden, oder, wenn bereits etabliert, unterbrechen läßt. Dabei spielt es
offenbar keine Rolle, ob die hohe Dosis des Antigens vor142 oder nach der Etablierung
einer Immunantwort injiziert wird143-146. Später konnte gezeigt werden, daß sich bei der
Injektion einer hohen Dosis des Antigens in eine etablierte Immunantwort hinein
78
(apoptoseinduzierende Injektion, AI, (Abb.33)) viele apoptotischen Zellen lokalisiert in
Clustern in den Keimzentren finden92-94.
Abbildung 33: Schematischer Versuchsaufbau zur Untersuchung
der Antigeninduzierten Apoptose
Im Gegensatz zu der im vorangehenden Abschnitt diskutierten, wahrscheinlich
unspezifischen Apoptose nach alleiniger Injektion einer hohe Dosis des Antigens, werden
in diesem Fall spezifisch B-Zellen des Keimzentrums apoptotisch92-94. Eine extrem hohe
Konzentration an löslichem Antigen in einem Keimzentrum löst in einer für dieses Antigen
spezifischen B-Zelle Apoptose aus (Antigeninduzierte Apoptose)92-94. Dies könnte
entweder durch den Entzug kostimulatorischer Signale der Follikulären Dendritischen
Zellen (FDC), durch eine Abtötung mittels zytotoxischer T-Zellen oder durch
Überschreitung eines Schwellenwertes der B-Zell-Stimulation geschehen, und wird
kontrovers diskutiert. So vermutet M. Karvelas eine potentielle Rolle von T-Zellen in der
Induktion dieser Form der Apoptose147. G. Nossal argumentiert dagegen mit ähnlichen
Ergebnissen für einen direkten Effekt auf die B-Zellen, und gegen die Mitwirkung von TZellen146. Sicher scheint jedoch zu sein, daß diese Form der Apoptose unabhängig von dem
Fas/Fas-L System induziert wird92-94, und auch nicht durch den Verlust der Stimulierung
via CD40/CD40L begründet ist92.
S. Han konnte zeigen, daß die wiederholte oder verlängerte Exposition der Keimzentren
mit hohen Dosen des löslichen Antigens den strukturellen Aufbau der Keimzentren
vollkommen auflöste92. Eine wahrscheinliche Erklärung hierfür wäre die Besetzung der BZellrezeptoren mit löslichem Antigen, so daß die B-Lymphozyten nicht mehr in der Lage
sind das auf den Follikulären Dendritischen Zellen in Form von Antigen-AntikörperKomplement-Komplexen gebunden Antigen zu erkennen. Dadurch könnte den B-Zellen
ein zum Überleben notwendiger Faktor verloren gehen, so daß sie absterben und von
Makrophagen aufgenommen würden148.
Diese verschiedenen Ergebnisse zeigen, daß der pathophysiologische Mechanismus der
Antigeninduzierten Apoptose und die Einflüsse auf diese noch immer nicht geklärt sind.
79
Um die Abhängigkeit der Antigeninduzierte Apoptose von Komplement C4 zu
untersuchen, wurde auch in dieser Arbeit in die etablierte Immunantwort gegen Np hinein
eine hohe Dosis Np injiziert (Apoptoseinduzierende Injektion). (Abb.6, S.43 und Tab.8,
S.44) Dann wurde die Apoptose der B-Zellen in Wildtyp- und C4-/-Mäusen zum einen
direkt mittels Immunhistochemie, zum anderen indirekt über den Serumspiegel der Npspezifischen Antikörper bestimmt. Der Einfluß von C4 auf die Antigeninduzierte Apoptose
wird im Kapitel 4.1.3.2 diskutiert.
4.1.3.1 Die Antigeninduzierte Apoptose bei Wildtypmäusen
Bei Wildtypmäusen fiel der Spiegel Np-spezifischer Antikörper nach der Injektion von
zusätzlichen 4mg Np am Tag 9 nach Etablierung einer Np-spezifischen Immunantwort
innerhalb von Stunden ab. (Abb.10a, S.49 und 11a, S.51, Gruppe A) Zu diesem Zeitpunkt
ließen sich immunhistochemisch eine Vielzahl apoptotischer Zellen in den Keimzentren
der Milz nachweisen. (Abb.7, S.45, Gruppe A) Eine Woche nach der zweiten, hohen Dosis
des Antigens beginnt der Antikörpertiter dann wieder anzusteigen, erreicht jedoch das
Niveau einer ungestörten Immunantwort nicht mehr. (Abb.10a, S.49 und 11a, S.51, Gruppe
A)
Daraus läßt sich schließen, das zwar einige, aber nicht alle Antikörperproduzieren Zellen
absterben, oder aber noch an Alum gebundenes Antigen vorhanden ist, welches erneut eine
Antikörperproduktion induziert. Das Versuchstier ist in jedem Fall nicht vollkommen
tolerant gegen das verwendete Antigen.
Der steile Abfall der Antikörper direkt nach der Injektion der hohen Dosis an Antigen ist
wahrscheinlich auf die Bindung der Antikörper an das zirkulierende Antigen
zurückzuführen. Die Antikörper würden so als Teil der Immunkomplexe aus dem Kreislauf
entfernt werden und mittels ELISA nicht mehr meßbar sein.
Damit konnte in dieser Arbeit erstmals eine Antikörperproduktion nach dem Abbruch der
Immunantwort gegen Np durch eine apoptoseinduzierende Injektion (AI) nachgewiesen
werden. Zuvor hatten jedoch schon andere Arbeiten Hinweise auf einen inkompletten
Abbruch der Immunreaktion gegeben.
So beschreibt B.Pulendran, daß die Injektion von einer hohen Dosis löslichem Np-HSA in
eine etablierte Immunantwort hinein zwar die Anzahl der Antikörperproduzierenden Zellen
des Keimzentrums sowie die Zahl der Keimzentren stark reduziert, die Zahl der
Antikörperproduzierenden Zellen in der weißen Pulpa, aber erhöht148. Diese Zellen der
80
sog. extrafollikulären Foci produzieren vor allem Antikörper mit niedriger Affinität für das
Antigen12. In den Foci finden sich auch nur wenige apoptotische Zellen93. K.Shokat
beschreibt zusätzlich eine „zweite Welle“ absterbender Zellen etwa 12h nach Injektion des
löslichen Antigens, bei der sich auch apoptotische Zellen in der T-Zell-Zone der weißen
Pulpa finden94. Doch auch er geht nicht davon aus daß diese apoptotischen Zellen die
Antikörperproduzierenden Zellen der extrafollikulären Foci sind, sondern eher ausgereifte
B-Zellen, die das Keimzentrum schon verlassen haben.
Somit könnten die Antikörper, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit einige Wochen
nach der Injektion der hohen Dosis des Antigens im Serum gemessen wurden, von Zellen
der extrafollikulären Foci produziert worden sein. Durch die Injektion des Antigens
zusammen mit Alum58, welches eine Depotfunktion2 hat, könnte die Antikörperproduktion
in den extrafollikulären Foci in Gang gehalten werden, da dort wahrscheinlich noch keine
Selektion mittels Apoptose stattfindet. Die so entstehenden Antikörper wären damit
größtenteils IgM-Antikörper niedriger Affinität, da die Affinitätsreifung und der
Klassenwechsel ja erst im Keimzentrum stattfinden15,148. Entstehen durch das
Antigendepot im Bauchraum nach einigen Tagen neue Keimzentren in der Milz, so wäre
keinerlei Toleranz induziert worden, die Antigeninduzierte Apoptose wäre demnach in
diesem Modell kein Mechanismus der peripheren Toleranzinduktion.
Eine andere Theorie als Erklärung für die Tatsache weshalb die Mäuse im Rahmen der
Antigeninduzierten Apoptose nicht vollkommen tolerant geworden waren, geht davon aus,
daß sich die B-Zellen zwar zum Teil im Keimzentrum ausreifen, dort aber nicht ihre
Effektorfunktion ausüben, d.h. Antikörper produzieren8. Da die Apoptose auf das
Keimzentrum beschränkt bleibt, (Abb.7, S.45, Gruppe A) ist es möglich, daß durch die
hohe Dosis an löslichem Antigen nur „der Nachschub“ antigenproduzierender Zellen
vernichtet wird. Die Zellen, die bereits aus dem Keimzentrum ausgewandert sind, könnten
dann für die später nachweisbare Antigenproduktion verantwortlich sein. Dies würde auch
die Persistenz von Antikörpern der Klasse IgG erklären.
Falls diese Theorie zuträfe, wäre dies für die Toleranzentwicklung von B-Zellen von
besonderer Bedeutung. Wenn ein Großteil der B-Zellen, die sich zu dem Zeitpunkt der
Injektion von löslichem Antigen im Keimzentrum in der Proliferations- oder
Selektionsphase befinden, als Folge dieser Injektion absterben94, dann ist es sehr
wahrscheinlich, daß dies ein physiologischer Prozeß zur Toleranzerhaltung während der
somatischen Hypermutation ist. Eine B-Zelle, die ihren Rezeptor während der
81
Hypermutation im Rahmen einer Immunantwort so verändert, daß er jetzt (in großen
Mengen löslich verfügbares) Selbstantigen wie Serumproteine erkennt, würde apoptotisch
werden und absterben8,92,94.
4.1.3.2
Der Einfluß von C4 auf die Antigeninduzierte Apoptose
In dieser Arbeit sollte der Einfluß von C4 auf die Antigeninduzierte Apoptose untersucht
werden. Dabei konnten sowohl in Wildtypmäusen als auch in C4-/-Mäusen nach der
Injektion von 4mg Np in eine etablierte Immunantwort hinein viele apoptotische Zellen in
Keimzentren der Milz nachgewiesen werden. (Abb.7, S.45, Gruppen A und E) Die
Antigeninduzierte Apoptose im Keimzentrum ist somit ohne C4 möglich.
Die direkte quantitative Analyse der apoptotischen Zellen im Keimzentrum konnte keinen
signifikanten Unterschied zwischen Wildtyp- und C4-/-Mäusen zeigen. Bei den C4-/Mäusen ist zeigte sich jedoch ein Trend zu mehr apoptotische Zellen in den Keimzentren.
(Abb.8, S.46, Gruppen A und E) Dieses Ergebnis zeigt, daß durch den Mangel der
Komplementkomponente C4 die Apoptose von antigenspezifischen B-Zellen im
Keimzentrum offenbar nicht beeinträchtigt ist. Eventuell sind bei Komplementmangel
sogar mehr apoptotische Zellen im Keimzentrum zu finden, entweder, weil mehr B-Zellen
absterben, oder weil die apoptotischen Zellen durch einen Phagozytosedefekt schlechter
abgeräumt werden können.
Der obengenannte Trend (mehr apoptotische Zellen bei C4-/-Mäusen) könnte allerdings
auch durch ein Artfakt der Methodik verursacht worden sein. So könnte die Auszählung
TUNEL pos. Zellen im immunhistochemisch gefärbten Schnitt fehlerbehaftet sein, da
jeweils nur eine Hälfte der Milz mit Hilfe dieser Methode analysiert wurde, und aus der
jeweils anderen Hälfte eine Zellsuspension zur Analyse im Durchflußfluoreszenzzytometer
gewonnen wurde. Doch auch diese zweite Methode stößt bei der quantitativen Auswertung
sehr kleiner Teilmengen von Zellen an ihre Grenzen. Durch die relativ geringe Anzahl an
apoptotischen Zellen verglichen mit der Gesamtzahl der B-Zellen der Milz erwies sich die
Analyse im Durchflußfluoreszenzzytometer als ungeeignet, so daß kein Unterschied
zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen festgestellt werden konnte. (Abb.9, S.47)
Um methodische Fehler auszuschließen wurde der Einfluß von C4 auf die
Antigeninduzierte Apoptose mit Hilfe eines weiteren Analyseverfahrens untersucht.
Um eine quantitative Aussage über die Antigeninduzierte Apoptose im Keimzentrum zu
treffen, lassen sich auch indirekte Methoden wie die Analyse der Antikörperspiegel im
82
Serum mittels ELISA verwenden: je kleiner die Antikörperantwort nach der Injektion einer
zweiten, hohen Dosis des Antigens ist, desto mehr spezifische B-Lymphozyten sollten
abgestorben sein.
Bei der Analyse der Serumtiter der Np-spezifischen Antikörper in C4-/-Mäusen ließ sich
folgendes zeigen. Nach der Injektion von 50µg Np-CGG entwickelt sich auch bei C4-/Mäusen eine, wenn auch in den IgG-Subklassen im Vergleich zu Wildtypmäusen
signifikant schwächere Np-spezifische Immunantwort. (Kapitel 4.1.1.2) Wie bei den
Wildtyp-Kontrollmäusen fällt nach Injektion einer hohen Dosis des Antigens (4mg Np) am
Tag 8 der Immunantwort der Antikörperspiegel zunächst steil ab, um nach einer Woche
erneut anzusteigen. Der Antikörpertiter erreicht im weiteren Verlauf der Immunantwort
nicht mehr das Niveau einer ungestörten Immunantwort. (Abb.10b, S.49, und 11b, S.51,
Gruppe E)
Im quantitativen Vergleich mit Wildtypmäusen fällt der Wiederanstieg des Npspezifischen IgG-Titers im Serum von C4-/-Mäusen nach dem antigeninduziertem Abfall
am Tag 8 signifikant schwächer aus. (Abb.11d, S.51, und 12d, S.52) Wäre die Apoptose
durch den Komplementmangel beeinträchtigt, so müßten mehr Zellen überleben und damit
der Antikörperspiegel höher sein als bei Wildtypmäusen. Der geringere Wiederanstieg der
IgG-Antikörper nach Apoptoseinduktion in C4-defizienten Tieren könnte somit erklärbar
sein durch eine effektivere Apoptoseinduktion. Eine weitere Erklärung wäre allerdings
auch eine vergleichbare Anzahl absterbender Zellen bei Wildtyp- und C4-/-Mäusen in
Kombination mit einer geringeren Neuproduktion von Antikörpern aufgrund des C4Mangels.
Der
IgM-Spiegel
im
Serum
C4defizeinter
Mäuse
nahm
dagegen
nach
dem
antigeninduzierten Abfall signifikant stärker zu als bei Wildtypmäusen. (Abb.10d, S.49)
Der Großteil der IgM-Antikörper und nur ein Teil der IgG-Antikörper wird jedoch in den
extrafollikulären Foci, den Orten der ersten Antikörperproduktion produziert, und nicht im
Keimzentrum von Zellen die die Affinitätsreifung durchlaufen haben14,15,82. Solche Foci
finden sich typischerweise in der T-Zell-Zone der Milz, ein Bereich in dem ein dieser
Arbeit übereinstimmend mit der Literatur148 keine apoptotischen Zellen gefunden wurden.
(Abb.8, S.46, Gruppen A und E) Die dort produzierten Antikörper sind daher
möglicherweise von geringerer Bedeutung für die Beurteilung der Effektivität der
Apoptose. Ein erhöhter IgM-Spiegel erlaubt somit keinen Rückschluß auf die Effektivität
der Apoptose von B-Zellen im Keimzentrum.
83
In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, daß Apoptose im Keimzentrum ohne C4
möglich ist, und die Antigeninduzierte Apoptose im Keimzentrum durch C4-Defizienz
auch quantitativ nicht beeinträchtigt wird. Es konnten Hinweise auf eine möglicherweise
höhere Apoptoserate bei C4-/-Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen gefunden werden.
4.1.4
Beeinflussung des immunologischen Gedächtnisses durch die
Antigeninduzierte Apoptose
Neben der Affinitätsreifung ist die Reifung von B-Zellen zu B-Gedächtniszellen eine
wichtige Funktion des Keimzentrums. Diese Zellen ermöglichen im Rahmen einer zweiten
Immunisierung mit dem gleichen Antigen eine schnellere Produktion von Antikörpern
höherer Affinität. Da die B-Gedächtniszellen den Klassenwechsel bereits während der
ersten
Immunantwort
vollzogen
haben,
wird
die
zweite
Immunantwort
von
Immunglobulinen der Klasse G (IgG) dominiert149,150.
Sollten durch Injektion einer hohen Dosis des Antigens in eine etablierte Immunantwort
hinein ein Großteil der im Keimzentrum befindlichen B-Zellen absterben, so wäre die
Bildung dieser Gedächtniszellen gestört, und der Ablauf einer zweiten Immunantwort
gegen das Antigen verändert. Im Umkehrschluß ist die Untersuchung der BGedächtniszellfunktion in einer sekundären Immunantwort im Suicide-Modell eine
Möglichkeit, die Effektivität der Apoptose im Keimzentrum unter verschiedenen
Einflußfaktoren, z.B. Komplementmangel, zu untersuchen. (Tab.9, S.55)
Vorher unbehandelte Wildtypmäuse bilden nach der Injektion von 100µg Np-BSA i.p.
ohne weitere Adjuvantien nur wenige Np-spezifische IgM-Antikörper und keine IgGAntikörper. (Abb.14a, S.57 und 15a, S.58, Gruppe D) Die Dosis ist, wenn sie ohne Alum
i.p. injiziert wird, offenbar zu klein um eine volle primäre Immunantwort gegen Np
hervorzurufen. Eine Bildung von Antikörpern der Klasse IgG nach der Injektion von
100µg Np-BSA ohne weiteren Adjuvantien ist somit sehr wahrscheinlich auf BGedächtniszellen zurückzuführen, und kann als Kennzeichen einer sekundären
Immunantwort gewertet werden.
84
4.1.4.1 Der Einfluß der Antigeninduzierten Apoptose auf das immunologische
Gedächtnis von Wildtypmäusen
In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, daß die sekundäre Immunantwort von
Wildtypmäusen gegen Np von Antikörpern der Subklassen IgG1 und IgG2b dominiert
wird136. (Abb.15a, S.58, und 16a, S.59, Gruppe B) Diese Antikörper werden in erster Linie
von B-Gedächtniszellen produziert136. Vor allen in den ersten Tagen der Sekundärantwort
kommt es zusätzlich zur Produktion von Antikörpern der Klasse M. (Abb.14a, S.57,
Gruppe B) Dies geschieht wahrscheinlich durch neue Np-spezifische B-Lymphozyten, die
zum ersten Mal mit dem Antigen in Kontakt kommen, und nicht durch B-Gedächtniszellen
nach einem zweiten Antigenkontakt.
Daher kann der Serumspiegel von IgM-Antikörpern der zweiten Immunantwort für die
Untersuchung der Gedächtniszellfunktion vernachlässigt werden. In der Tat zeigte sich
zwischen der normalen sekundären Immunantwort in der IgM-Antikörperklasse von
Wildtypmäusen und der sekundären Immunantwort von Mäusen, deren erste
Immunantwort durch die Injektion einer hohen Dosis des Antigens gestört wurde
(Apoptoseinduzierende Injektion), kein signifikanter Unterschied. (Abb.14a, S.57,
Gruppen A und B)
Dagegen
beeinflußt
die
Injektion
einer
hohen
Dosis
löslichen
Antigens
(Apoptoseinduzierende Injektion) während der ersten Immunantwort gegen Np die
Produktion von IgG-Antikörpern während einer zweiten Immunreaktion 6 Monate später
entscheidend. Im Vergleich zur physiologisch ablaufenden sekundären Immunantwort
werden signifikant weniger IgG1- und IgG2b-Antikörper gebildet. (Abb.15a, S.58, und
16a, S.59, Gruppen A und B) In dieser Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, daß
durch die Antigeninduzierte Apoptose die Funktion der B-Gedächtniszellen während einer
sekundären Immunantwort empfindlich gestört, aber nicht vollkommen aufgehoben wird.
Schon früher gab es in verschiedenen Veröffentlichungen, die den Einfluß des „SuicideVersuches“ auf Bildung von sog. Vorläufern antikörperbildender Zellen (Frühform von BGedächtnis-Zellen151) untersuchten147,152, Hinweise auf eine solche Störung. Dort konnte
gezeigt werden, daß nach Injektion einer hohen Dosis löslichen Antigens vor oder nach der
Induktion einer Immunantwort gegen die präzipitierte Form des Antigens signifikant
weniger solcher Vorläuferzellen gebildet werden152. Transferiert man diese Zellen in
Mäuse, die keine eigenen Immunzellen haben, so werden dort weniger B-Gedächtniszellen
gebildet147. Ob eine sekundäre Immunantwort noch nach Monaten gestört ist, wurde in
diesen Arbeiten allerdings nicht untersucht. Aus diesen und den in dieser Arbeit gezeigten
85
Ergebnissen kann man schließen daß die Bildung der B-Gedächtniszellen durch den
„Suicide-Versuch“ empfindlich gestört ist.
Die Ergebnisse der Untersuchung der Gedächtniszellfunktion stützen außerdem die
Vermutung, daß in diesem Modell durch die Antigeninduzierte Apoptose nur die im
Keimzentrum befindlichen, noch nicht ausgereiften B-Zellen absterben. Da in einem
Keimzentrum in
den
ersten
Tagen
vor
allem antikörperproduzierende
Zellen
(Plasmazellen) gebildet werden, und üblicherweise erst später (nach ca. 14 Tagen) BGedächtniszellen das Keimzentrum verlassen21, sind am Tag 9 nach Beginn der primären
Immunantwort, zum Zeitpunkt der Injektion des löslichen Antigens, offenbar noch nicht
viele Gedächtniszellen gebildet. Durch das Absterben der im Keimzentrum befindlichen BZellen sistiert die Np-spezifische Antikörperproduktion zwar nicht vollständig, die
Gedächtniszellfunktion dagegen ist stark eingeschränkt.
4.1.4.2 Der Einfluß von C4 auf das Immunologische Gedächtnis
Die ungestörte sekundäre Immunantwort von C4-/-Mäusen ist der von Wildtypmäusen sehr
ähnlich: beide werden von den Immunglobulinklassen IgG1, IgG2b und zum Teil auch
IgM dominiert. Dabei werden vor allem die Antikörper der beiden IgG-Subklassen von
Memoryzellen produziert.
Obwohl in der Literatur bei C4-Defizienz eine Reduktion der sekundären Immunantwort
gegen virale Antigene beschrieben wird50,153, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß
sich im Verlauf der sekundären Immunantwort gegen ein Proteinantigen in der Höhe des
Serumtiters der IgG1-Antikörper bei C4-/-Mäusen kein Unterschied zu Wildtypmäusen
findet. (Abb.15c, S.58, Gruppen B und F) Die sekundäre Immunantwort gegen ein
Proteinantigen in der IgG2b-Subklasse fiel dagegen bei C4-/-Tieren signifikant schwächer
aus als die der Wildtypvergleichsgruppe. (Abb.16c, S.59, Gruppen B und F) Diese
Ergebnisse scheinen paradox, erklären sich jedoch durch die unterschiedliche Bedeutung
der Subklassen in der Immunantwort gegen verschiedene Antigene. Im Rahmen einer
Immunantwort gegen ein Proteinantigen ist die IgG1-Produktion ist von Bedeutung136,
gegen ein virales Antigen eher andere IgG-Subklassen. C4 scheint somit für die
Entwicklung einer sekundären Immunantwort gegen Np nicht absolut notwendig zu sein.
Fehlt dagegen der Komplementrezeptor (CD21/35), wie bei Cr-/-Mäusen, so entwickeln
die Tiere eine deutlich reduzierte sekundäre Immunantwort50,54.
86
Antikörper der Klasse M (IgM) werden zwar auch im Rahmen einer sekundären
Immunantwort gebildet, erlauben aber keinen Rückschluß auf die Funktion des
immunologischen Gedächtnisses, da B-Gedächtniszellen vor allem Immunglobuline der
Klasse G (IgG) bilden, und Immunglobuline der Klasse M (IgM) im Rahmen einer
sekundären Immunantwort wahrscheinlich durch neue Np-spezifische B-Lymphozyten
produziert wird. Eine Verringerung dieser Antikörperspiegel durch Komplementmangel
konnte nicht gezeigt werden, da zwei der drei C4-/-Mäuse vor Beginn der zweiten
Immunisierung, also 6 Monate nach dem letzten Kontakt mit dem Antigen, noch stark
erhöhte Anti-Np IgM-Titer im Serum hatten. Die folgende zweite Immunisierung mit dem
Antigen zum Auslösen der sekundären Immunantwort steigerte diesen noch deutlich, so
daß dieser dann deutlich über dem der entsprechenden Wildtypgruppe lag. (Abb.14b und c,
S.57, Gruppe F) Die durchschnittliche Überlebenszeit von antikörperproduzierenden
Plasmazellen liegt bei 3-6 Wochen23, und eine Immunantwort wird nach Elimination des
Antigens schnell herunterreguliert15,76. 6 Monate nach einer Antigengabe sollten somit nur
noch wenige Antikörper im Serum der Mäuse nachweisbar sein. Es ist bekannt, daß es
langlebige Plasmazellen gibt, die noch Jahre nach dem Antigenkontakt Antikörper
sezernieren6. Weshalb diese jedoch nur in dieser Subgruppe einen vergleichsweise sehr
hohen Antikörperspiegel hervorrufen, konnte nicht geklärt werden. Eine Erklärung wäre
die Persistenz des Antigens aufgrund eines Abräumdefektes35,58 in diesen Mäusen, wobei
nicht erklärt wäre, warum nach so langer Zeit nur IgM-Antikörper, die den Beginn einer
Immunantwort dominieren, gebildet werden.
4.1.4.3 Der Einfluß von C4 auf das Immunologische Gedächtnis im „SuicideVersuch“
Vergleicht man die B-Gedächtniszellfunktion von C4-/-Mäusen im „Suicide-Versuch“,
d.h. nach Unterbrechung der primären Immunantwort durch eine hohe Dosis lösliches
Antigen, mit der einer Wildtypvergleichsgruppe, so konnte gezeigt werden, daß bei C4-/Mäusen diese gleichermaßen (IgG1) oder sogar signifikant stärker (IgG2b) beeinträchtigt
ist als die gleich behandelter Wildtypmäuse. (Abb.15b und c, S.58, und 16d, c und d, S.59,
Gruppen A und E) Die Apoptose in Keimzentren einer primären Immunantwort beim
Mangel an C4 scheint also durchaus effizient zu sein.
Ein zweiter Hinweis auf die effektive Apoptose bei C4-/-Mäusen ist die Tatsache, daß bei
den Mäusen, bei denen bereits die Primärantwort durch den „Suicide-Versuch“
unterbrochen wurde, im Gegensatz zu den C4-/-Mäusen, die eine Primärantwort
87
entwickeln konnten, 6 Monate später kein erhöhter IgM-Spiegel gefunden wurde.
(Abb.14b, S.57, Gruppe E)
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß weder im direkten Nachweis der Apoptose durch
Immunhistochemische Färbungen und Analysen im Durchflußfluoreszenzzytometer, noch
mit Hilfe verschiedener indirekter Methoden wie der Messung der produzierten Antikörper
und
der
B-Gedächtniszellfunktion
in
vivo
ein
Hinweis
auf
einen
gestörten
Apoptosemechanismus bei C4-Defizienz gefunden werden konnte. Zudem konnte gezeigt
werden, daß die sekundäre Immunantwort gegen ein Proteinantigen bei Mangel der frühe
Komplementkomponente C4 nicht signifikant beeinträchtigt ist.
Dennoch scheint C4 eine Rolle in der Toleranzinduktion von B-Zellen zu spielen. In C4defizienten Versuchstieren ließ sich im Rahmen der Antigeninduzierten Apoptose ein
Trend zu mehr apoptotischen Zellen im Vergleich zu Wildtyptieren erkennen.
88
4.2 Fas (CD95)-induzierte Apoptose: Versuche in vitro
Bei der Toleranzentwicklung spielt neben der Antigeninduzierte Apoptose auch die über
den Fas-Rezeptor (CD95) induzierte Apoptose eine wichtige Rolle47,84,124,154,155. Diese
Form der Apoptose kann insbesondere durch Fas-Ligand (CD95L), einen Liganden des
Fas- Rezeptors (CD95) der auf T-Lymphozyten oder Follikulären Dendritischen Zellen des
Keimzentrums exprimiert wird, ausgelöst werden9,86.
Die physiologische Bedeutung dieses Rezeptors zeigt sich in Mäusen, die keinen
funktionsfähigen Fas-Rezeptor (sog. lpr-Mäuse) exprimieren können, oder die dessen
Liganden (sog. gld-Mäuse) nicht bilden können. Sie entwickeln autoreaktive B-Zellen und
Zeichen der Autoimmunerkrankung SLE47,89,124. Das Fas/Fas-Ligand Systems scheint
somit eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz zu spielen.
Es gibt Hinweise auf eine Bedeutung dieses Systems speziell in der Aufrechterhaltung der
Homöostase der Keimzentrumsreaktion. So konnte gezeigt werden, daß in lpr-Mäusen
während der späten Phase der Keimzentrumsreaktion einer Immunantwort autoreaktive BZellen entstehen156, und daß die Auflösung der während dieser Immunantwort gebildeten
Keimzentren bei Fas-defizienten Tieren nach Ende der Immunantwort beeinträchtigt ist151.
Ob nun die Ursache der Autoimmunität bei Fas-defizienten Tieren in einer gestörten
Keimzentrumsreaktion liegt, ist allerdings umstritten76,86. So konnte von anderen
Arbeitsgruppen bei Fas-defizienten Mäusen keine Einschränkung der Elimination von BZellen des Keimzentrums mit niedrigaffinen157 oder autoreaktiven154 Rezeptoren
beobachtete werden. Eine mögliche Erklärung dieser widersprüchlichen Ergebnisse wäre,
daß die Toleranzinduktion im Keimzentrum durch das Fehlen von Fas zwar beeinträchtigt,
aber nicht vollkommen aufgehoben wird6.
Unabhängig von der Bedeutung des Fas/Fas-Ligand Systems in der Keimzentrumsreaktion
ist
doch
unumstritten,
daß
die
Fas-induzierte
Apoptose
in
der
peripheren
Toleranzentwicklung eine wichtige Rolle spielt.
Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit mittels zweier muriner B-Zellinien und aus der
Milz
von
Wildtypmäusen
isolierten
B-Lymphozyten
der
Einfluß
früher
Komplementkomponenten auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose untersucht. Nach
einem Versuchsaufbau von L.Foote158, der die „Rettung“ von B-Zellen vor Fas-induzierter
Apoptose mit IL-4 gelang, wurde untersucht, ob auch die Stimulation des
Komplementrezeptors (CD21/35) die Zellen vor der Fas-induzierten Apoptose schützen
89
kann. Dies schien möglich zu sein, weil offenbar isolierte B-Zellen aus den Tonsillen, die
ohne weiter Stimulation rasch absterben, durch die Stimulation des CR2 (CD21) am Leben
erhalten werden können65, und weil Zellen der WEHI 231-Zellinie durch Kreuzvernetzung
von CD21 mit dem Antigenrezeptor vor Antigenrezeptor induzierter Apoptose geschützt
werden können159.
4.2.1
Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von
Zellen der WEHI 231- und 279-Zellinien
In vitro Versuche mit Zellinien haben gegenüber in vivo Versuchen verschiedene Vorteile:
die Anzahl der Einflußgrößen ist überschaubar, die Versuche sind aufgrund der großen
Menge an verfügbaren Zellen beliebig oft wiederholbar und die Anzahl von Tierversuchen
kann reduziert werden. Ein großer Nachteil ist dagegen möglicherweise die eingeschränkte
Relevanz der in diesem Modell erbrachten Ergebnisse in Bezug auf den wirklichen Ablauf
in vivo.
Um beurteilen zu können, in wieweit dieses Modell die zu untersuchende Wirklichkeit
abbildet, muß man die Eigenschaften der verwendeten Zellen mit denen der in vivo
korrespondierenden Zellen vergleichen, und die Frage stellen, in wieweit die Apoptose in
Tumorzellinien, zu denen die WEHI-Zellen gehören, schon per se gestört sein könnte.
4.2.1.1 Phänotypische Eigenschaften der WEHI 231- und 279-Zellen
Zunächst wurde versucht, den in der Literatur berichteten Phänotyp der Zellen zu
bestätigen.
Laut der Produktbeschreibung des CAMR (Centre for applied Microbiology and Research,
UK) sind WEHI 231-Zellen eines B-Zell-Lymphoms der Maus mit lymphoblastischer
Morphologie, die membranständiges IgM tragen aber kein Immunglobulin sezernieren.
Trotz dieser Charakterisierung als B-Lymphozyten der Maus wird nur wenig CD45R
(B220, ein wichtiger B-Zell-Marker) auf den Zellen gefunden160. Vielfach wird jedoch
bestätigt, daß diese Zellinie membranständiges IgM, ein Reifezeichen von B-Zellen
trägt159-161. Über weitere Marker, die einen Hinweis auf den Reifegrad der Zellen geben
können, wie membranständiges IgD und den Komplementrezeptor 2 (CD21) existieren
unterschiedliche Angaben 159,160,162-164. (Abb.34, S.91)
Einen Hinweis auf das Entwicklungsstadium von B-Zellen erbringt ihre Reaktion auf die
kurzzeitige Stimulation des B-Zell-Rezeptors53: reife B-Zellen proliferieren daraufhin,
90
unreife sterben ab6,163. WEHI231-Zellen scheinen durch Antigenrezeptorstimulation
apoptotisch zu werden159,161,162,165,166, und somit Zellen eines unreifen Stadiums zu sein.
Auch über die WEHI 279-Zellinie existieren unterschiedliche Angaben. Ebenfalls als ein
morphologisch den Lymphoblasten ähnliches B-Zell-Lymphom vertrieben, scheint es IgM
oder IL-6167,168 sezernierende Subtypen zu geben. Wiederum besteht Einigkeit über die
Tatsache, daß diese Zellen membranständigem IgM exprimieren169,170, aber keine
Immunglobuline anderer Klassen170.
Diese unterschiedlichen Angaben über die Eigenschaften der WEHI-Zellinien sind
möglicherweise auf das Auftreten unterschiedlicher Subtypen in den verschiedenen
Laboren zurückzuführen160,165. Deshalb wurde in dieser Arbeit versucht, die von uns
verwendeten Zellinien näher zu charakterisieren, und so ihre Bedeutung als Modell der
peripheren Toleranzentwicklung näher einzugrenzen.
Abbildung 34: Schematische Übersicht über die Entwicklungsstufen der verwendeten Zellen
Es konnte bestätigt werden, daß beide hier verwendeten Zellinien ein Immunglobulin der
Klasse M exprimieren. (Abb.17, S.61) Da der zum Nachweis des IgM verwendete
Antikörper die schwere Kette µ des Rezeptors erkennt, kann die Differenzierung zwischen
unreifen B-Lymphozyten, die ein vollständiges membranständiges IgM exprimieren, und
Prä- oder Pro-B-Zellen des Knochenmarkes, die nur die schwere Kette des Rezeptors auf
ihrer Oberfläche tragen, so nicht getroffen werden. Da die Zellen der WEHI 231-Zellinie
zu über 90% CD19 trugen, (Abb.17, S.61) ein Oberflächenmolekül welches bei murinen BLymphozyten erst von unreifen B-Zellen vollständig exprimiert wird, konnte
ausgeschlossen werden, daß die hier verwendeten WEHI 231-Zellen Pro- oder Prä-BZellen sind.
91
Die
Unterscheidung
zwischen
reifen
und
unreifen
B-Zellen
der
Maus,
die
physiologischerweise beide in der Peripherie anzutreffen sind, kann mit Hilfe weiterer
Rezeptoren getroffen werden. Reife B-Zellen exprimieren zusätzlich membranständiges
IgD sowie einen vollständigen Korezeptorkomplex mit dem Komplementrezeptor 2
(CD21). Die Zellen der WEHI 231-Zellinie exprimierten membranständiges IgD nur zu ca.
50%, und den Komplementrezeptor 2/1 (CD21/35) nur zu ca. 40%. (Abb.17, S.61) Dies
läßt die Vermutung zu, daß der von uns benutze WEHI 231-Klon aus Zellen einer
Zwischenstufe, späten unreifen B-Zellen (transitional71), besteht. (Abb.34, S.91)
Transitionalzellen exprimieren viel IgM, wenig IgD und teilweise auch den
Komplementrezeptor54. Diese Zellen eignen sich also nur teilweise zur Simulation der
peripheren Toleranzentwicklung von reifen B-Zellen im Keimzentrum. Zwar regeln auch
reife B-Zellen im Keimzentrum ihre IgD-Expression herunter171, doch in Hinblick auf die
ebenfalls
schwache
CD21/35-Expression
und
verschiedene
Literatur-
hinweise161,162,165,166,172 scheint die Annahme, WEHI 231-Zellen entsprächen eher unreifen
B-Zellen, richtig.
Die Zellen der zweiten Zellinie, WEHI 279, exprimierten den Komplementrezeptor zu ca.
50%, CD19 jedoch nur zu 40% und IgD fast gar nicht (10%). (Abb.17, S.61) Sie scheinen
daher Zellen eines noch unreiferen Stadiums zu sein. (Abb.34, S.91)
4.2.1.2 Fas-Expression und Einflüsse auf die Fas-induzierte Apoptose von Zellen der
WEHI 231- und 279-Zellinien
Reife B-Zellen können, falls sie den Fas (CD95)-Rezeptor tragen, den apoptotischen
Prozeß nach Stimulation des Rezeptors beginnen. Obwohl naive B-Zellen wenig CD95
exprimieren, wird dieses in Interaktion mit spezifischen T-Zellen über das CD40/CD40LSystem hochgeregelt173. Dies geschieht in besonderem Maße im Keimzentrum, wo die
durch Zellteilung und somatische Hypermutation entstandenen Zentrozyten besonders
empfindlich für Apoptoseinduktion sind86.
Die in dieser Arbeit verwendeten Zellinien tragen beide CD95 schon ohne Stimulation mit
CD40 zu ca.70%. (Abb.17, S.61) Dennoch waren nur die Zellen der unreiferen WEHI 279Zellinie für Fas-induzierte Apoptose sensibel, (Abb.22, S.64) ein Befund, der sich durch
die Literatur bestätigen läßt170,174. Auch die Resistenz der anderen Zellinie findet sich in
der Literatur wieder: sie wird teils mit der Expression eines inhibitorischen Proteins, cFlipL, im intrazellulären Signalweg des Rezeptors161, teils mit mangelnder Expression des
92
Fas-Rezeptors175 (CD95) erklärt. Da letzteres für die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse
(Fas-Resistenz trotz Fas-Expression) nicht als Erklärung zutreffen kann, scheint die
Existenz eines inhibitorischen Proteins76 die Erklärung für die Resistenz von WEHI 231 zu
sein. Dieses Protein, c-FlipL, ist auch in vivo in B-Zellen des Keimzentrums aktiv6.
Auch andere Veröffentlichungen konnten in verschiedenen murinen Zellinien (u.a. auch
WEHI-Zellen) zeigen, daß die Fas-Expression per se nicht mit Fas-Sensibilität
gleichzusetzen ist76,176. Auch scheint die Stimulation des CD40-Rezeptors von WEHI 279
zwar die Expression von Fas, doch nicht deren Sensitivität auf Fas-induzierte Apoptose zu
erhöhen161, so daß in dieser Arbeit auf einen Stimulationsversuch mit CD40 an WEHIZellen verzichtet wurde.
Im weiteren wurde untersucht, ob sich die Fas-induzierte Apoptose der WEHI 279-Zellen
durch Zugabe von Anti-CD21/35 oder IL-4 beeinflussen ließ. Dabei konnte gezeigt
werden, daß nach Stimulation des CD95 (Fas)-Rezeptors über 10h ca. 60% der Zellen
apoptotisch wurden. Weder die vorherige Stimulation des Komplementrezeptors
(CD21/35) noch die Inkubation mit dem Zytokin IL-4 konnte dieses Ergebnis signifikant
verändern. (Abb.23, S.66)
WEHI 279-Zellen lassen sich somit durch die Stimulation von CD21/35 nicht vor Fasinduzierter Apoptose schützen. Für dieses Ergebnis gibt es zwei Erklärungen. Entweder hat
CD21/35 keinen Einfluß auf die Fas-induzierte Apoptose von B-Zellen im Keimzentrum,
oder das Modell (Zellen der WEHI-Zellinie) ist nicht geeignet diese Frage zu beantworten.
Eine andere Arbeit konnte unter Verwendung der WEHI 231-Zellinie zeigen, daß die
Kreuzvernetzung des Komplementrezeptors mit dem B-Zell-Rezeptor die Zellen vor BZell-Rezeptor induzierter Apoptose schützt159. Ob dieser Ergebnisse allerdings für die
Apoptose im Rahmen der peripheren Toleranzinduktion relevant sind, ist zu bezweifeln,
weil die Stimulation des Antigenrezeptors des dort verwendeten Zellklons zur Apoptose
führt, was als ein Merkmal unreifer B-Zellen angesehen wird6. Möglicherweise wird durch
die Kreuzvernetzung des B-Zell-Rezeptors mit dem Komplementrezeptor in der genannten
Arbeit ersterer einfach blockiert, so daß eine Kreuzvernetzung der B-Zell-Rezeptoren
untereinander nicht mehr stattfinden kann.
In anderen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß aufgereinigte Splenozyten, also reife BZellen, durch IL-4 vor dem Fas-Tod geschützt werden86,158, und daß IL-4 auch in vivo FasResistenz und damit Autoimmunität induzieren kann86,177. In den im Rahmen dieser Arbeit
durchgeführten Versuchen hatte IL-4 dagegen keinen Einfluß auf die Fas-induzierte
93
Apoptose von WEHI 279-Zellen. Dies könnte ebenfalls daraufhindeuten, daß die hier
verwendeten Zellen B-Zellen eines unreifen Stadiums entsprechen, und sie nur begrenzt
zur Simulation der peripheren Toleranzentwicklung im Keimzentrum einsetzbar sind.
Somit scheint die Frage, ob der Komplementrezeptor auf B-Zellen im Keimzentrum deren
Apoptose beeinflußt, in diesem Modell (WEHI 231 und 279) nicht beantwortbar zu sein.
4.2.2
Der Einfluß von Komplement auf die Fas (CD95)-induzierte Apoptose von BLymphozyten der Milz
Unter der Verwendung der WEHI 231- und 279-Zellinien konnte kein Einfluß der
Stimulation von CD21/35 auf die Fas-induzierte Apoptose von B-Zellen gesehen werden.
Um zu entscheiden, ob CD21/35 keinen Einfluß auf die Fas-induzierte Apoptose von BZellen im Keimzentrum hat, oder das Modell (Zellen der WEHI-Zellinie) nicht geeignet ist
diese Frage zu beantworten, wurden die oben beschriebenen Versuche zusätzlich mit aus
der Milz aufgereinigten B-Zellen durchgeführt. Diese werden als reife B-Lymphozyten
beschrieben, sollten zunächst aber ebenfalls näher charakterisiert werden.
4.2.2.1 Charakterisierung der aufgereinigten Splenozyten
Die Reinheit der durch die Aufreinigung mittels Dichtegradient und Oberflächenstruktur
gewonnenen B-Zellen wurde anhand der B-Zell-Marker CD19 und B220 (CD45R) auf ca.
85% bestimmt. (Abb.26, S.68) Wurde im Durchflußfluoreszenzzytometer nur die der
Größe und Granularität von Lymphozyten entsprechenden Zellen (FS/SS) gemessen,
waren mehr als 90% der untersuchten Zellen B-Zellen. (Abb.24, S.67) Auch die Tatsache,
daß B220 etwas stärker exprimiert wird als CD19, wird als charakteristisch für reife BZellen der Maus angesehen. (Abb.24, S.67)
Es konnte gezeigt werden, daß ca. 90% der gewonnenen Zellen weitere Oberflächenmarker
reifer naiver B-Zellen wie IgM, IgD und den Komplementrezeptor 2/1 (CD21/35)
exprimieren. (Abb.26, S.68) Da die Milzen von unbehandelten Wildtypmäusen verwendet
wurden, und sich bei unbehandelten Mäusen in der Regel nur wenige Keimzentren in der
weißen Pulpa befinden, ist es sehr wahrscheinlich, daß die durch die Aufreinigung
gewonnenen Zellen zum größten Teil reife ruhende B-Zellen (sog. naive B-Zellen) waren.
(Abb.34, S.91) Die in den später beschriebenen Versuchen verwendeten und analysierten
Zellen waren somit zu 90% reife B-Zellen der Milz.
Die restlichen 10% Zellen der gewonnenen Zellen schienen vor allem T-Lymphozyten zu
sein (sie trugen entsprechende Oberflächenmarker, CD3 und CD90.2 (Thy-1)). (Abb.26,
94
S.68) Zusätzlich fanden sich einige Granulozyten und Makrophagen, die jedoch für die
Versuche von geringer Bedeutung waren.
4.2.2.2 Die Fas-induzierte Apoptose von B-Zellen der Milz
Nur ca. 60% der verwendeten B-Zellen exprimierten den Fas-Rezeptor (CD95), können
also auf dessen Stimulation reagieren. (Abb.26, S.68) Da bekannt ist, daß naive
Lymphozyten nach ihrem Eintritt in das Keimzentrum durch Interaktion der
CD40/CD40L-Rezeptoren zur Proliferation und zur weiteren Expression des Fas-Rezeptors
(CD95) angeregt werden173, wurden in einem weiteren Versuchsansatz die Zellen über 48h
mit Anti-CD40 Antikörper vorstimuliert. Eine solche Vorbehandlung sollte auch die FasSensibilität von reifen B-Zellen der Milz erhöhen25,84,178,179.
Als Zeichen der Aktivierung durch CD40 konnte in dieser Arbeit eine veränderte Größe
und optische Dichte der Zellen gesehen werden. (Abb.27, S.68) Obwohl die FasExpression durch diese Vorbehandlung nicht hochreguliert wurde, wurden die
verwendeten B-Zellen dennoch erst durch die Stimulation des CD40-Rezepors für die Fasinduzierte Apoptose sensibel. (Abb.30, S.70 und Abb.32, S.72) Dies zeigt nochmals, daß
die Fas-Expression per se nicht mit Fas-Sensibilität gleichzusetzen ist76.
Schon frisch aus der Milz isolierte B-Zellen zeigten zu 30-40% Zeichen der Apoptose, was
vermuten läßt, daß sie bereits bei dem Prozeß der Aufreinigung geschädigt wurden. Diese
Zellen wurden nicht entfernt, sie waren somit bei jeder Messung als „Hintergrund“
vorhanden. Wurden die Zellen einige Tage in Kultur gehalten um sie mit verschiedenen
Antikörpern oder Zytokinen zu stimulieren, so schien die Stimulation des CD40-Rezeptors
auch für das Überleben der B-Lymphozyten essentiell zu sein. Nach drei Tagen in Kultur
ohne Zugabe von Anti-CD40 Antikörper waren ca. 90% der Zellen apoptotisch. Dieses
Ergebnis findet sich auch in der Literatur wieder. So konnte gezeigt werden, daß ruhende
B-Zellen in Follikeln3 und aktivierte B-Zellen im Keimzentrum kostimulatorische Signale
zum Überleben benötigen76. Auch in vitro ist die Stimulation des CD40-Rezeptors für das
Überleben isolierte B-Lymphozyten erforderlich18,65, doch konnte gezeigt werden, daß
isolierte B-Zellen der Tonsillen auch unter Zugabe von CD23, einem Liganden des
Komplementrezeptors CD21 (oder einigen Antikörpern gegen diesen Rezeptor)
überleben65.
95
4.2.2.3 Der Einfluß von IL-4 auf die Fas-induzierte Apoptose von B-Zellen der Milz
Obwohl das in diesem Versuchsaufbau verwendete Modell (aufgereinigte Milzzellen) dem
zu untersuchenden Mechanismus (Fas-induzierte Apoptose im Keimzentrum) wesentlich
näher zu kommen schien, gelang es trotzdem nicht, mit IL-4 in den mit Anti-CD40
Antikörper vorbehandelten B-Zellen Resistenz gegen Fas-induzierte Apoptose zu
erzeugen. Nur bei sehr hoher Dosierung des IL-4, der vierfache Menge der Dosis, die in
anderen Arbeiten mit Erfolg verwendet wurde, zeigte sich ein Trend zu weniger
apoptotischen Zellen. (Abb.32, S.72, Gruppen 4 und 5)
Ein Grund für den mangelnden Erfolg, die IL-4 abhängige Apoptoseresistenz158 zu
reproduzieren, könnten unterschiedliche Versuchsaufbauten sein. (Abb.31, S.71) Obwohl
verschiedene Arten der Aufreinigung gewählt wurden, konnten in beiden Arbeiten die
Zellen im Durchflußfluoreszenzzytometer als B-Zellen der Milz charakterisiert werden.
Für die Dauer der CD40- oder IL-4-Stimulation wurden in dieser Arbeit die gleichen
Zeiten gewählt.
Ein Unterschied im Versuchsaufbau ließ sich jedoch bei der Vorstimulation der Zellen
finden. Die Arbeitsgruppe um L. Foote stimulierte die Zellen mit einem CD40-CD8αFusions-Protein, welches mit Anti-CD8 quervernetzt wurde
84,158,180
, in dieser Arbeit
wurden die B-Zellen dagegen mit Anti-CD40 Antikörper aktiviert. In der Literatur finden
sich noch weitere Möglichkeiten B-Zellen über den CD40-Rezeptor zu aktivieren, wie z.B.
mittels CD40L tragender L-Zellen181 oder Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO)
182
. Die Effektivität der in der in dieser Arbeit verwendeten Aktivierungsmethode konnte
zwar gezeigt werden183, (Abb.27, S.68) dennoch besteht die Möglichkeit, daß nur über das
Fusionsprotein aktivierte Zellen mit IL-4 vor Fas-induzierter Apoptose zu schützen sind.
Dies würde die Bedeutung von IL-4 im Schutz von B-Zellen des Keimzentrums insgesamt
in Frage stellen. Um eine veränderte Vorstimulation als Ursache der unterschiedlichen
Ergebnisse auszuschließen, wurde der Versuch noch einmal unter veränderten
Bedingungen wiederholt. Gleichzeitig mit den Anti-CD40 Antikörpern wurden Anti-CD8
Antikörper oder T-Zellen der Milz (die auch CD40L exprimieren) zum Medium
zugegeben. Doch auch in diesem Versuchsaufbau schützte IL-4 nicht vor Fas-induzierter
Apoptose. (Abb.32, S.72, Gruppe 7 und 9) Es ist somit möglich, daß die Stimulation mit
IL-4 alleine nicht ausreicht, um isolierte B-Zellen der Milz vor Fas-induzierter Apoptose
zu retten. Das von L.Foote verwendeten CD40-CD8α-Fusions-Protein könnte weitere
96
Signale liefern, die bei der Aktivierung durch Anti-CD40 Antikörper zusammen mit AntiCD8 Antikörper fehlen.
Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Versuchsaufbauten ist die Art
Apoptoseinduktion. Die Stimulation des Fas-Rezeptors mit Anti-Fas (CD95) Antikörper
induziert offenbar ein wesentlich stärkeres Signal als das, welches durch die Stimulation
des Rezeptors mit Fas-Ligand (löslich oder auf Th-1-Effektorzellen) induziert wird180.
Somit könnte das in dieser Arbeit durch Anti-Fas Antikörper induzierte Signal zu stark
sein, um signifikant durch IL-4 gehemmt zu werden. Diese Vermutung wird durch das
Ergebnis, daß der IL-4 abhängige Schutz vor Fas-induzierter Apoptose lediglich bei
unphysiologisch hohe Dosen zu erkennen war, (Abb.72, S.32, Gruppe5) untermauert.
4.2.2.4 Der Einfluß von Komplement auf die Fas-induzierte Apoptose von BLymphozyten der Milz
In dieser Arbeit sollte der Einfluß von CD21/35 (CR2/1) auf die Fas-induzierte
Apoptoserate von B-Lymphozyten untersucht werden. Dazu wurden aufgereinigte BZellen der Milz nach 48-stündiger Vorstimulation mit Anti-CD40 Antikörper über 10h mit
Anti-CD21/35-bio sowie Avidin zur Kreuzvernetzung der Komplementrezeptoren
inkubiert. (Abb.31, S.71) Danach wurden mittels Anti-Fas Antikörper Apoptose induziert.
Es konnte so gezeigt werden, daß die Kreuzvernetzung von CD21/35 (CR2/1) keinen
Einfluß auf die Fas-induzierte Apoptoserate von aufgereinigten Splenozyten hat. (Abb.32,
S.72, Gruppen 3, 6 und 8) Die Fas (CD95)-induzierte Apoptose könnte somit
komplementunabhängig sein.
Es existieren Ergebnisse, die den schützenden Effekt der Kreuzvernetzung der
Komplementrezeptoren (CD21/35) mit dem Antigenrezeptor zeigen159, doch sind diese in
einem Modell unreifer oder transitionaler B-Zellen (der murinen Zellinie WEHI 231)
gewonnen. Somit tragen sie damit nur begrenzt zur Diskussion um die Mechanismen der
Toleranzentwicklung im Keimzentrum bei. Diese transitionalen B-Zellen exprimieren
schon wie reife Zellen den Komplementrezeptor, können aber noch ähnlich wie unreife BZellen auf die Stimulation des Antigenrezeptors mit Apoptose reagieren71. (Abb.34, S.91)
Dagegen konnte an reifen, aus humanen Tonsillen isolierten B-Zellen gezeigt werden, daß
die Stimulation von CD21/35 mittels eines Liganden (CD23) oder eines Antikörpers vor
Apoptose durch Mangel an kostimulatorischen Signalen schützt65. Die Fas-induzierte
Apoptose wurde in diesem Rahmen nicht untersucht.
97
Die kurzzeitige Kreuzvernetzung des Antigenrezeptors von reifen B-Zellen in vitro schützt
diese vor Fas-induzierter Apoptose84,86,184. Dieser Faktor scheint auch in vivo für das
Überleben der Zentrozyten/Zentroblasten (B-Zellen im Keimzentrum) bedeutsam zu sein.
Die B-Zellen des Keimzentrums müssen das von FDCs präsentierte Antigen erkennen und
prozessieren können, um kostimulatorische Signale zu erhalten. Dennoch ist die
Stimulation des Antigenrezeptors ist alleine nicht ausreichend um das Überleben der
Zellen zu gewährleisten. So werden mit CD40L vorstimulierte humane, follikuläre BZellen
aus
Tonsillen,
durch
Kreuzvernetzung
des
Antigenrezeptor
mit
dem
Korezeptorkomplex (CD21, CD19, CD81) besser vor Fas-induzierter Apoptose geschützt
als durch Kreuzvernetzung des Antigenrezeptors alleine139. Dieser Effekt tritt offenbar vor
allem bei niedriger Affinität und kleiner Dosis des Antigens auf139.
Dieses Ergebnis könnte vermuten lassen, daß die Rolle des Komplementrezeptors in der
Beeinflussung der Fas-induzierten Apoptose eher in seiner Bedeutung als Teil des
Korezeptorkomplexes liegt, und damit in der Verstärkung des Signals des B-ZellRezeptors. Zieht man die in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse hinzu, läßt sich die
Hypothese aufstellen, daß die Kreuzvernetzung des CR2/1 (CD21/35) ohne Einbeziehung
des Antigenrezeptors keinen Einfluß auf die Fas-induzierte Apoptose von reifen,
aktivierten B-Zellen hat.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß in dieser Arbeit kein Hinweis auf einen Einfluß des
Komplementrezeptors CD21/35 auf die Fas-induzierte Apoptose von reifen BLymphozyten gefunden werden konnte. Dennoch ist eine solche Beteiligung aufgrund
einiger Besonderheiten des gewählten Versuchaufbaus (Kapitel 4.2.2.3) nicht vollkommen
auszuschließen.
98
4.3 Bedeutung der Ergebnisse für die periphere Toleranzinduktion der
B-Lymphozyten und für die Entwicklung der
Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
Der systemische Lupus Erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung, bei der es
zur Bildung von hochaffinen Autoantikörpern gegen Selbstantigene kommt. Diese
Antikörper werden von autoreaktiven B-Lymphozyten, die den Prozeß der Somatischen
Hypermutation
im
Keimzentrum
abgeschlossen
haben,
produziert47,121-123.
Physiologischerweise unterliegt die Entwicklung der B-Zellen einer strengen Regulation,
um die Entstehung von solchen autoreaktiven Zellen zu vermeiden. Auch im Keimzentrum
stellen verschiedene Mechanismen der Erhaltung der Selbsttoleranz sicher. Wird dieser
Prozeß der peripheren Toleranzinduktion gestört, könnten während der Somatischen
Hypermutation entstandene autoreaktive B-Zellen überleben und ein Reaktion gegen
körpereigene Antigene auslösen. Ein bedeutender Mechanismus zur Erhaltung der
Selbsttoleranz im Keimzentrum ist der programmierte Zelltod, der auch als Apoptose
bezeichnet wird. Es liegt daher nahe, daß eine Störung der Apoptose der B-Lymphozyten
im Keimzentrum zu Autoimmunität führen könnte.
Seit langem ist bekannt, daß ein Mangel an frühen Komplementkomponenten wie C1q, C2
oder
C4
die
Entstehung
des
SLE
begünstigt37,106-112,
und
daß
diese
Komplementkomponenten physiologischerweise einen regulierenden Einfluß auf die BZell-Immunität über den Komplementrezeptor CD21 entfalten42-44. Es wird postuliert, daß
der Komplementmangel eine Störung der Toleranzinduktion induziert46,58,71. In dieser
Arbeit
wurde
daher
die
Hypothese
untersucht,
ob
der
Mangel
an
frühen
Komplementkomponenten über einen veränderten Apoptosemechanismus die periphere
Toleranzentwicklung der B-Zellen stört, und damit die Entstehung eines SLE begünstigt.
Verschiedenen Faktoren können bei einer reifen, aktivierten B-Zelle im Keimzentrum
Apoptose induzieren, und somit verhindern, daß eine im Rahmen der Somatischen
Hypermutation entstandene autoreaktive B-Zelle proliferiert. So kann ein B-Lymphozyt im
Keimzentrum mangels kostimulatorischer Signale, durch die Stimulation des Fas (CD95)Rezeptors oder bei einer extrem hohen Antigendosis apoptotisch werden.
Die Apoptose aus Mangel stimulatorischer Signale dient der Selektion von höheraffinen BZellen und der Elimination niedrigaffiner B-Zellen im Rahmen der Immunantwort.
99
Sichergestellt wird dies durch ein inhibitorisches Protein welches als c-FLIP bezeichnet
wird. Dieses c-FLIP Protein ist intrazellulär mit einem vorgeformten CD95-Komplex
gekoppelt. Erfolgt im Keimzentrum keine weitere Stimulation, so dissoziiert dieses Protein
von dem Fas-Komplex, und die Apoptose wird eingeleitet6. Kostimulatorische Signale von
FDC oder T-Lymphozyten stabilisieren diesen Komplex, so daß die B-Zelle im
Keimzentrum überleben kann. Es konnte gezeigt werden, daß die Stimulation des CD40Rezeptors auf B-Zellen durch CD40L, der auf T-Lymphozyten exprimiert wird,
aktivierend und lebenserhaltend auf die B-Zellen wirkt. Da die Apoptose aus Mangel
stimulatorischer Signale mehr der Elimination niedrigaffiner B-Zellen im Rahmen der
Immunantwort gegen Fremdantigen dient, und eher weniger der Erhaltung der
Selbsttoleranz, wurde dieser Mechanismus in dieser Arbeit nicht näher untersucht.
Allerdings wurde die Stimulation des CD40-Rezeptors zur Aktivierung aufgereinigter BLymphozyten der Milz in einigen in vitro Experimenten verwendet.
Die Fas (CD95)-induzierte Apoptose durch Fas-Ligand tragende Zellen stellt einen
ubiquitären Mechanismus zur Regulation von Wachstum und Proliferation dar. Im
Keimzentrum scheint die durch T-Zellen über den Fas-Rezeptor induzierte Apoptose eine
wichtige Rolle bei der Abtötung autoreaktive B-Zellen zu spielen. Die Stimulation durch
IL-4 sowie die kurze Stimulation des Antigenrezeptors schützen die B-Zellen vor Fasinduzierter Apoptose, wirken dem Abtöten potentiell autoreaktiver Zellen also
entgegen86,177. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob auch die Stimulation
des Komplementrezeptors CR2 (CD21) vor Fas-induzierte Apoptose schützen kann. Dies
wurde sowohl an isolierten Maus B-Lymphozyten als auch an WEHI Zellinien analysiert.
Die Stimulation von CD21 scheint aber keinen Einfluß auf die Fas-induzierte Apoptose zu
haben und somit konnte keine Bedeutung des Komplementrezeptors in diesem Rahmen
gezeigt werden.
Die Antigeninduzierte Apoptose stellt wohl den wichtigsten Mechanismus zur Regulation
autoreaktiver B-Zellen im Keimzentrum dar. Während im Knochenmark jedes Antigen,
welches von unreifen B-Zellen erkannt wird, eine negative Regulation ausübt, gelingt dies
an reifen B-Zellen innerhalb des Keimzentrums (Zentrozyten) nur bei sehr hohen
Antigenkonzentrationen. Da man annimmt, daß Fremdantigene nur selten solch hohe
Antigenkonzentrationen in der Milz erreichen, könnte die Antigenkonzentration eine
wichtige Basis zur Unterscheidung zwischen Fremd und Selbst und somit zur
100
Toleranzerhaltung sein92-94. Die Antigeninduzierte Apoptose könnte durch den Entzug
kostimulatorischer Signale der Follikulären Dendritischen Zellen (FDC), durch
zytotoxische T-Zellen oder durch Überschreitung eines Schwellenwertes der B-ZellStimulation vermittelt werden.
In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob die antigeninduzierte Apoptose vom
Komplementsystem beeinflußt wird. Dabei konnte unter Verwendung von C4-/-Mäusen
erstmals in vivo gezeigt werden, daß die Antigeninduzierte Apoptose von B-Zellen
während der Keimzentrumsreaktion durch C4-Defizienz nicht beeinträchtigt wird. Es
scheinen bei Komplementdefizienz im Vergleich zu Wildtypmäusen sogar mehr
antigenspezifische
B-Zellen
abzusterben.
Darüber
hinaus
war
auch
die
Antikörperproduktion unmittelbar nach der Antigeninduzierten Apoptose vergleichbar, und
erreicht die Ausgangswerte unabhängig von Komplement C4. Weiterhin konnte gezeigt
werden, daß die Antigeninduzierte Apoptose insbesondere in der B-Gedächtniszellfunktion
eine reduzierte Immunglobulinproduktion bewirkt. Auch hier konnte keine Abhängigkeit
von Komplement C4 gezeigt werden.
In Betrachtung der hier gewonnen Ergebnisse scheint es wahrscheinlich, daß der
Zusammenhang
zwischen
Komplementdefizienz
und
dem
Entstehen
der
Autoimmunerkrankung SLE nicht in der Störung der Apoptose von autoreaktiven B-Zellen
liegt.
Statt dessen wird heute der sogenannte „Waste-disposal-defect“ als alternative Erklärung
für die Assoziation von SLE und Komplementmangel herangezogen.
Apoptotische Körperchen als Quelle für Lupus typische Autoantigene werden weniger gut
phagozytiert werden können, wenn C1q103,125 oder C432 fehlt35. Diese nicht phagozytierten
apoptotischen Zellen können immunogen wirken99,127,185, und eine Autoimmunreaktion
gegen darin enthaltene Antigene auslösen.
Die Rolle des Komplementdefektes im Zusammenhang mit Autoimmunität wird heute
daher weniger in der Beeinflussung der Apoptose an sich, als vielmehr in dem gestörten
Abräumen von apoptotischem Material gesehen.
101
5 Zusammenfassung
Der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung, bei der reife
B-Lymphozyten Antikörper gegen Selbstantigene produzieren. Ausgehend von der
Erkenntnis, daß diese Erkrankung mit der Defizienz früher Komplementkomponenten (C1,
C4 und C2) assoziiert ist, und daß die Apoptose ein wichtiger Mechanismus zum Schutz
vor solchen Autoimmunerkrankungen ist, wurde in dieser Arbeit der Einfluß von
Komplement auf die Apoptose von B-Zellen im Rahmen der peripheren Toleranzinduktion
untersucht. Dazu wurden Versuche in zwei verschiedenen Modellen durchgeführt. Zum
einen wurde die Antigeninduzierte Apoptose bei C4-Defizienz in vivo, zum anderen der
Einfluß des Komplementrezeptors (CR2/1, CD21/35) auf die Fas (Apo-1, CD95)induzierte Apoptose in vitro untersucht.
Es konnte gezeigt werden, daß die Antigeninduzierte Apoptose von B-Zellen im
Keimzentrum ohne C4 möglich ist, und daß sich in der Anzahl der apoptotischen Zellen im
Keimzentrum bei C4-/-Mäusen kein signifikanter Unterschied im Vergleich zu
Wildtypkontrollmäusen findet. Auch wenn die Antiköperproduktion in C4-/-Mäusen
geringer ist als in Wildtypmäusen, bleibt diese jedoch sowohl in C4-defizienten Tieren als
auch in deren Wildtyppendant im wesentlichen unbeeinflußt von der Antigeninduzierten
Apoptose. Die B-Gedächtniszellfunktion unterscheidet sich bei Wildtyp- und C4-/-Mäusen
in den für diese Immunantwort wichtigen Immunglobulinsubklassen nicht, wird allerdings
in beiden Mausstämmen durch die Antigeninduzierte Apoptose empfindlich gestört. Auch
dieses Phänomen scheint unabhängig von Komplement C4 zu sein, da hier insbesondere in
der für diese Immunantwort typischen Antikörpersubklasse IgG1 vergleichbare
Immunglobulinkonzentrationen gemessen wurden.
Auch im Rahmen der in vitro Experimente konnte in dieser Arbeit kein Hinweis auf einen
Einfluß des Komplementrezeptors CD21 auf die Fas-induzierte Apoptose von
aufgereinigten B-Zellen der Milz gefunden werden. Weiterhin konnte die Stimulation von
CD21/35 bei WEHI 279-Zellen diese nicht vor Fas-induzierter Apoptose schützen
In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, daß das Komplementsystem die
Apoptose von reifen B-Lymphozyten im Keimzentrum nicht beeinflußt, und daß die
Assoziation des Mangels früher Komplementkomponenten mit dem SLE folglich in einer
anderen Funktion des Komplementsystems zu suchen ist.
102
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Danksagung
Ich danke allen, die zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben.
Besonders danken möchte ich
meinem Doktorvater PD Dr. med. S. Görg für die Überlassung des Themas, die Ideen, den
Rückhalt und die Geduld,
Herrn Prof. Dr. med. H. Kirchner für die engagierte Förderung und die Möglichkeit, in
seinem Institut arbeiten zu können,
Frau Dr. rer. nat. D. Finke für die vielen Stunden im Tierstall, für die netten Sonntagnachmittage im Labor und vor allem für die immer zu erreichende Hilfe bei kleinen und großen
Problemen, mit der sie viele Versuche erst möglich machte,
Frau K. Klempt-Gießing für die geduldige Einführung in verschiedene Methoden und für
die immer wieder neue Etablierung der Standards der ELISA Messungen,
Herrn PD Dr. med. P. Schlenke für die Einführung und Unterstützung in der Methodik der
Durchflußfluoreszenzzytometrie,
Herrn Prof. Dr. med. H. C. Dominick, Frau Dr. rer. nat. D. Finke, Frau N. Marquardt und
meinen Eltern für die Korrekturvorschläge,
allen „Bewohnern“ des Biologenzimmers für die lange Aufnahme, und allen in den ZKLaboren des Institutes für Immunologie arbeitenden Menschen, durch die es für mich (fast)
immer eine Freude war, dort zu arbeiten,
meinem Vater für die Motivation diese Arbeit zu beginnen und Freude daran zu finden,
und meiner Mutter für das Durchhaltevermögen, mit dem ich diese Arbeit zu Ende bringen
konnte.
117
Kongreßbeiträge und Veröffentlichungen
Faust, K., Finke, D., Klempt-Giessing, K., Randers, K., Zachrau, B., Schlenke, P.,
Kirchner, H., Goerg, S.
“Antigen induced B-cell apoptosis is independent of complement C4”
Clinical and Experimental Immunology 2007, in press
Faust, K., Finke, D., Klempt-Giessing, K., Zachrau, B., Kirchner, H., Goerg, S.
„Antigen-induced apoptosis -an essential mechanism for maintaining self-tolerance?”
Poster, 16th European Congress of Immunology (1st Joint meeting of European Societies of
Immunology), Paris 2006
Finke, D., Kropf, K., Hennig, H., Hoerster, R., Lueddecke, K., Zawatzky, R., Goerg, S.
“Role of Interferon alpha for the Development of Systemic Lupus Erythematosus in
Complement C4 deficient Mice”
Poster, 34. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Berlin 2003
Lüddecke, K., Finke, D., Kropf, K., Zachrau, B., Schlenke, P., Kirchner, H., Goerg, S.
„Antigen-driven B-cell apoptosis in germinal centres does not abrogate antibody
production completely”
Poster, 34. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Berlin 2003
Finke, D., Kropf, K., Lüddecke, K., Zachrau, B., Schlenke, P., Kirchner, H., Goerg, S.
“The expression of follicular dendritic cell (FDC) specific markers is influenced by
complement C4”
Poster, 33. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, Marburg 2002
118
Lebenslauf
Name:
Kirstin Faust, geb. Lüddecke
Geburtsdatum:
27. Januar 1979
Geburtsort:
Ludwigshafen am Rhein
1985 - 1989
Grundschule im Mandelgraben, Mutterstadt
1989 - 1998
Geschwister-Scholl-Gymnasium, Ludwigshafen a. R.
26.Jun.1998
Abitur
1998 - 2005
Studium der Humanmedizin, Universität zu Lübeck
Sep.2000
Ärztliche Vorprüfung
Aug. 2001
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Mrz. 2004
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2004 - 2005
Praktisches Jahr:
Kinder- und Thoraxchirurgie, Universitätsklinikum Montpellier, Frankreich
Pädiatrie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
Innere Medizin, Sana - Kliniken Lübeck
Aug. 2005
Heirat mit dem Schiffahrtskaufmann Dierk Oliver Faust
Okt. 2005
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2000 - 2005
Doktorandin des Institutes für Immunologie und Transfusionsmedizin der
Universität Lübeck (Experimenteller Teil der Doktorarbeit 2000 - 2004)
119