Schwere RSV-Infektion und reduzierte Interferon
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. C. Rieger Schwere RSV-Infektion und reduzierte Interferon-γ Produktion in vitro Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Susanne König aus Frankfurt am Main 2006 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Köller Tag der Mündlichen Prüfung: 25.01.2007 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS.................................................................................... 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .......................................................................... 3 1. EINLEITUNG.................................................................................................. 4 1.1 DAS KRANKHEITSBILD............................................................................................................ 4 1.2 NAIVE T-ZELLEN UND DENDRITISCHE ZELLEN .......................................................................... 6 1.3 DER EINSATZ VON TSST ........................................................................................................ 9 1.4 INTERFERON-γ UND INTERLEUKIN-4 ...................................................................................... 10 1.5 FRAGESTELLUNG ................................................................................................................. 12 2. PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN .............................................. 13 2.1 DAS PATIENTEN UND KONTROLLKOLLEKTIV........................................................................... 13 2.2 ZELLSEPARATION UND ANZUCHT DER DENDRITISCHEN ZELLEN .............................................. 15 2.3 AUFTAUEN DER CD 14 NEGATIVEN ZELLEN UND DER MONOZYTÄREN DENDRITISCHEN ZELLEN, ANLEGEN EINER MATERIAL KOKULTUR, SORTIERUNG DER CD45+RA-ZELLEN UND INTRAZELLULÄRE FÄRBUNG.................................................................................................. 18 2.4 AUTOMACS UND FACS-MESSUNG ....................................................................................... 23 2.5 FRAGEBOGEN...................................................................................................................... 24 2.6 STATISTIK ........................................................................................................................... 25 2.7 AUFLISTUNG DER VERWENDETEN MATERIALIEN..................................................................... 25 3. ERGEBNISSE .............................................................................................. 28 3.1 IN VITRO KORRELAT DER PRIMÄREN REAKTION IN VERSCHIEDENEN LEBENSALTERN ............... 28 3.1.1 DIE PATIENTEN ................................................................................................................. 28 3.1.2 DIE RSV-INDUZIERTE INHIBITION DER INTERFERON-γ PRODUKTION IM NABELSCHNURBLUT KORRELIERT MIT DER INHIBITION DER INTERFERON-γ PRODUKTION IM ALTER VON EINEM JAHR UND VIER JAHREN................................................................................................................ 28 3.2.3 DIE AN DREI ZEITPUNKTEN (GEBURT, 1 JAHR, 4 JAHRE) ERMITTELTEN RATEN INTERFERON-γ PRODUZIERENDER ZELLEN KORRELIEREN MITEINANDER......................................................... 29 3.2 IN VITRO KORRELAT DER PRIMÄREN REAKTION BEI KINDERN MIT SCHWERER RSV-INFEKTION .. 32 3.2.1 DIE PATIENTEN ................................................................................................................. 32 3.2.2 DIE RATE INTERFERON-γ PRODUZIERENDER ZELLEN IST REDUZIERT BEI KINDERN MIT BRONCHIOLITIS, NICHT ABER BEI KINDERN MIT MILDER INFEKTION .......................................... 33 3.2.3 INTERFERON-γ PRODUKTION NACH STIMULATION MIT POLYIC UND RESTIMULATION MIT PMA 35 3.2.4 AUSWERTUNG DES SERUM IGE-TESTS .............................................................................. 37 4. DISKUSSION ............................................................................................... 38 4.1 DIE PRIMÄRE IMMUNANTWORT IN VITRO ................................................................................ 38 4.2 DIE INTERFERON-γ FREISETZUNG IST REDUZIERT BEI KINDERN MIT RSV-BRONCHIOLITIS ........ 40 4.3 DIE INTERFERON-γ PRODUKTION DER NICHT-INFIZIERTEN KONTROLLGRUPPE ......................... 43 4.4 REDUZIERTE INTERFERON-γ PRODUKTION BEI ANDEREN VIRUSINFEKTIONEN UND BEI DOPPELINFEKTIONEN MIT RSV-BETEILIGUNG ....................................................................... 44 4.5 STIMULATION DER ZELLKULTUREN MIT POLYIC UND PMA...................................................... 45 4.6 KLINIK DER RSV-INFEKTION ................................................................................................. 46 4.7 INTERFERON-γ UND ASTHMA BRONCHIALE ............................................................................. 47 INHALTSVERZEICHNIS 4.8 INTERFERON-γ UND DIE ENTWICKLUNG VON ALLERGIEN ......................................................... 49 4.9 ERHÖHTE IGE-W ERTE BEI 6 KINDERN MIT BRONCHIOLITIS ..................................................... 50 4.10 DER EINFLUSS VON VIREN AUF DIE ENTSTEHUNG VON ASTHMA UND ALLERGIEN ................... 51 4.11 BEDEUTUNG DER GESCHWISTERZAHL IN BEZUG AUF EINE RSV-INFEKTION UND DIE ENTWICKLUNG EINES ASTHMA BRONCHIALES ........................................................................ 52 4.12 DER EINFLUSS WEITERER UMGEBUNGSFAKTOREN AUF DIE RSV-INFEKTION.......................... 53 4.13 DIE INTERLEUKIN-4 PRODUKTION ....................................................................................... 54 5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................... 55 6. LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... 58 DANKSAGUNG ............................................................................................... 70 LEBENSLAUF ................................................................................................. 71 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abb. Abbildung C Celsius CD Cluster Determinants o. Cluster of differentiation DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA Enzym-Linked Immuno Sorbent Assay FCS fetal calf serum (Fötales Kälber Serum) FITC Fluorescence iso thiocyanat GM-CSF Granulozyten-Makrophagen Colonie stimulierender Faktor HLA Human Leukocyte Antigen IE Internationale Einheiten IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin MHC Major Histocompatibility Complex min. Minuten ml Milliliter ng Nanogramm NK-Zellen Natürliche Killerzellen PBS Phosphate Buffered Saline PE Phycoerythrin Pen/Strep Penicillin/Streptomycin PMA Phorbol-Myristate-Acetat RPMI Rothwell Pork Memorial Institute – Zellkultur Medium RSV Respiratory Syncytial Virus TLR Toll Like Receptor TSST Toxic Shock Syndrom Toxin µl Microliter 3 1. EINLEITUNG 1. EINLEITUNG 1.1 Das Krankheitsbild Das Respiratory Syncytial Virus (RS-Virus) ist die häufigste Ursache respiratorischer Erkrankungen aller Altersstufen. Es handelt sich um ein großes RNA-Virus aus der Gruppe der Paramyxoviren. Der Mensch ist das einzige Erregerreservoir. Die Übertragung erfolgt über Tröpfchenund Schmierinfektion mit einer Inkubationszeit von drei bis fünf Tagen. Im Erwachsenenalter ruft eine RS-Virusinfektion eine leichte Erkältung hervor, Schulkinder erleiden meist eine Infektion der oberen Luftwege, Kleinkinder und Säuglinge können an einer obstruktiven Bronchitis oder an einer Bronchiolitis erkranken. Die Bronchiolitis gilt als schwerste Form der akuten obstruktiven Bronchitis. 70% aller Kinder im Alter von bis zu einem Jahr erleiden eine RSVInfektion, die allerdings in mehr als zwei Dritteln der Fälle nicht ärztlich behandelt wird, da in diesen Fällen nur eine leichte Erkrankung der oberen Atemwege vorliegt. Ein Drittel der Kinder leidet an einer leichten unteren Atemwegsinfektion, doch bei etwa 1% der Kinder führt die Infektion zu einer Bronchiolitis, die stationär behandelt werden muss [26,45]. Bis zum Ende des zweiten Lebensjahres sind nahezu alle Kinder durchseucht. Die Infektion hinterlässt keine andauernde Immunität, so dass wiederholte Infektionen, sogar im gleichen Jahr, bei Patienten aller Altersstufen keine Seltenheit sind. Die obstruktive Bronchitis, eine schwere Entzündung der kleinen Bronchien und Bronchiolen, die vor allem bei Kindern im Alter zwischen sechs Wochen und sechs Monaten auftritt [65], geht einher mit Schleimhautschwellung, Hyper- und Dyskrinie und unterschiedlich stark ausgeprägtem Bronchospasmus. Sie ist einer der häufigsten Gründe für eine stationäre Behandlung von Kindern dieser Altersklasse zwischen Okto4 1. EINLEITUNG ber/November und April/Mai, der so genannten RSV-Saison [65]. Die Viren vermehren sich zuerst in den Epithelien des Nasopharynx und breiten sich im Laufe von ein bis drei Tagen in den unteren Respirationstrakt aus. Charakteristische Veränderungen sind hier Epithelnekrosen, Schleimhautödem, Eosinophileninfiltration und vermehrte Schleimproduktion, welche letztendlich die Obstruktion der kleinen Bronchien und Bronchioli verursachen. Die an Bronchiolitis erkrankten Kinder weisen als Folge der Veränderungen neben hypersonorem Klopfschall, feinblasigen Rasselgeräuschen und interkostalen Einziehungen auch einen insgesamt schlechten Allgemeinzustand mit febrilen Temperaturen, Nasenflügeln und wegen der oft schweren Bronchusobstruktion und der dadurch erniedrigten Sauerstoffsättigung eine Zyanose auf. Außerdem beobachtet man zuweilen eine Tachy- bzw. Dyspnoe, sowie ein mehr oder weniger ausgeprägtes Giemen [65]. Behandelt wird die obstruktive Bronchitis meist symptomatisch mit Sauerstoffgabe, ß2-Mimetika, Nasentropfen und dem Einsatz von Steroiden, obwohl Studien ergaben, dass nur Sauerstoffgabe und der Einsatz von ß2-Mimetika tatsächlich eine wirkungsvolle Behandlung darstellen [65]. Bei Verdacht auf bakterielle Superinfektion kommen auch Antibiotika zum Einsatz. Es hat sich gezeigt, dass eine RSV-Infektion im ersten Lebensjahr das Risiko erhöht, im frühen Kindesalter ein Asthma bronchiale zu entwickeln [43,51]. Die oben aufgeführte Klinik der obstruktiven RSVBronchitis ist von der des Asthma bronchiales kaum zu unterscheiden und auch histopathologisch lassen sich durchaus Gemeinsamkeiten wie beipielsweise Eosinophileninfiltration und vermehrte Schleimproduktion nachweisen [28]. Das Asthma bronchiale des Kindesalters tritt selten als primär allergisches Asthma auf, sondern ist vor allem in den ersten drei Lebensjahren mit viralen Atemwegsinfektionen assoziiert. 40 – 50% der Kinder, die an einer obstruktiven Bronchitis erkranken, leiden auch da- 5 1. EINLEITUNG nach noch an persistierendem Giemen, einem Symptom, das das Asthma bronchiale des Kindesalters und auch des Erwachsenen charakterisiert. Rund ein Drittel der Kinder, die in den ersten zehn Lebensjahren Asthma entwickelten, wiesen in den ersten beiden Lebensjahren rezidivierende obstruktive Atemwegserkrankungen, vorwiegend hervorgerufen durch RSV, auf [43] und fast alle Asthmatiker litten schon im Kindesalter an Giemen. Daneben besteht ein Zusammenhang zwischen RSV-Infektion und allergischer Sensibilisierung [61]. Es ergibt sich für uns die Frage, ob das RS-Virus das Immunsystem der Kinder unterschiedlich beeinflusst, so dass einige Kinder schwere RSVInfektionen durchmachen und andere nur an leichten Atemwegsinfekten erkranken. Auch bezüglich der Allergieentstehung scheint die Beeinflussung des Immmunsystems eine Rolle zu spielen. 1.2 Naive T-Zellen und dendritische Zellen Lymphozyten entstehen aus pluripotenten Stammzellen im Knochenmark. Zur Differenzierung in reife T-Lymphozyten wandern die im Knochenmark gebildeten Zellen in den Thymus ein. Hier teilen sich die unreifen T-Zellen, durchwandern das Thymusgewebe von der Rinde her ins Mark, wo sie sich zu reifen T-Lymphozyten differenzieren. Die meisten Zellen sterben ab (90%), der Rest verlässt den Thymus als reife, immunologisch kompetente T-Zelle. Reife T-Zellen, die bei ihrer Wanderung zwischen Thymus, Blut und peripheren lymphatischen Organen noch nicht auf Antigene gestoßen sind, bezeichnet man als naive T-Zellen. Ihre Aufgabe besteht darin, Fremdantigene zu erkennen, die ihnen von antigenpräsentierenden Zellen, den dendritischen Zellen, präsentiert werden. Die dendritischen Zellen neh- 6 1. EINLEITUNG men das Antigen in der Peripherie auf und wandern in die peripheren lymphatischen Organe zu den T-Zellen. Die anschließende Proliferation und Differenzierung der T-Zelle bildet den letzten Schritt der primären Immunantwort [35] und ist die Voraussetzung dafür, dass die T-Zelle an einer adaptiven Immunantwort teilnehmen kann. Ob die von der naiven T-Zelle ausgehende Proliferation von T-Zellklonen nun zytotoxische CD8-Zellen oder Helfer CD4-Zellen 1 (TH1) oder Helfer CD4-Zellen 2 (TH2) hervorbringen, hängt von dem präsentierten Antigen und der damit verbundenen Zytokinfreisetzung ab. Die entstandenen zytotoxischen bzw. Helferzellen, die so genannten Effektorzellen, gehen größtenteils nach Elimination des Antigens zu Grunde, nur ein Teil bleibt als Gedächtniszellen zurück. So entstehen im Rahmen der primären Immunantwort Effektorzellen und ein immunologisches Gedächtnis. Auf ein erneutes Auftreten des gleichen Antigens kann der Organismus nun, durch Aktivierung der vorhandenen Gedächtniszellen, mit einer Sekundärantwort reagieren [72]. Die dendritischen Zellen sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen. Sie stammen von myeloiden Vorläuferzellen des Knochenmarks ab und werden nach ihrer Bildung im Knochenmark zu peripheren Geweben transportiert. Dort sind sie als unreife dendritische Zellen in der Lage, Erreger zu phagozytieren. Sie nehmen, dank ihrer Rezeptoren chemotaktisch in entzündetes Gebiet gelockt, Antigen auf und wandern in lymphatisches Gewebe ein. Sie ändern ihren Phänotyp, verlieren die Rezeptoren, die es ihnen ermöglichen, zu den entzündeten Gebieten der Peripherie zu gelangen und exprimieren nun unter anderem MajorHistocompatibility-Complex Klasse I Moleküle (MHC Klasse I) und MHCKlasse-II-Moleküle zur Präsentation, sowie Adhäsionsmoleküle und Chemokine zur Anlockung der naiven T-Zellen. Dieser Reifungsvorgang lässt die unreifen dendritischen Zellen zu reifen dendritischen Zellen werden [36]. Dendritische Zellen induzieren auf diese Weise eine primä- 7 1. EINLEITUNG re T-Zell-Immunantwort und viele Viren greifen in diesen Mechanismus ein, um einer Immunantwort zu entgehen [40,69]. Voraussetzung dafür, dass die T-Zelle das Antigen erkennt, ist, dass die dendritische Zelle das phagozytierte Material im Zellinneren prozessiert und es in Form eines Peptid:MHC-Komplexes dem T-Lymphozyten präsentiert. Stammt das Peptid von intrazellulären Pathogenen ab, die sich im Zytoplasma vermehren, so werden sie an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden, an die Zelloberfläche transportiert und den Lymphozyten präsentiert. Dies hat eine Differenzierung zu zytotoxischen T-Zellen zur Folge, deren Aufgabe nun darin besteht, die infizierten Zellen zu eliminieren. Befinden sich die Erreger in intrazellulären Vesikeln, so werden ihre Peptidantigene an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden und an die Zelloberfläche transportiert. Ihre Präsentation bewirkt eine Differenzierung der naiven T-Lymphozyten in entweder Interferon-γ produzierende TH1 oder Interleukin-4 produzierende TH2-Zellen. Aktiviert wird die T-Zelle nicht nur durch den Peptid:MHC-Komplex allein. Es bedarf hierfür noch einer Reihe costimulierender Moleküle, die die dendritischen Zellen exprimieren. Zu diesen Molekülen gehören zum Beispiel (z.B.) die Oberflächenmoleküle Cluster of Differentiation 80 (CD80) und CD86. Je nach Beschaffenheit des phagozytierten Antigens werden verschiedene Rezeptoren der dendritischen Zelle aktiviert, die so genannten Toll Like Receptors (TLR), die Zytokinproduktion und Expression der costimulierenden Oberflächenmoleküle induzieren. Interessant ist, dass bei der Bindung eines körpereigenen Antigens die Expression der costimulierenden Moleküle und damit eine Immunantwort ausbleiben, was daran liegen mag, dass die TLR das Antigen als Eigenantigen erkannt haben [60]. Eine RSV-Infektion führt dazu, dass dendritische Zellen costimulierende Moleküle und MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren und eine entsprechende Aktivierung der T-Zellen im Sinne einer primären Immunantwort hervorrufen [7,13]. Nach Infektion mit dem Virus zeigen Kinder mit ge- 8 1. EINLEITUNG sundem Immunsystem eine Proliferation von T-Helferzellen, während die Elimination des Virus beim Erwachsenen durch zytotoxische TZellen die größere Rolle spielt [61]. Um die Interaktion zwischen dem RS-Virus und den dendritischen Zellen in vitro zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Studie ein Modell der primären Immunantwort verwendet, bestehend aus naiven T-Zellen, dendritischen Zellen und dem Superantigen Toxic-Shock-SyndromToxin 1 (TSST 1) [8]. Das Protokoll existierte bereits für Zellen aus Nabelschnurblut. Zunächst musste in der vorliegenden Studie überprüft werden, ob es gelingt, das Versuchsprotokoll auf Zellen aus peripherem Blut zu übertragen. 1.3 Der Einsatz von TSST Das Toxic-Shock-Syndrom Toxin (TSST) gehört zur Klasse der Superantigene. Superantigene provozieren durch direkte Bindung an den TZellrezeptor eine T-Zellreaktion, die einer durch Peptid:MHC-Komplexe der dendritischen Zellen hervorgerufenen Reaktion ähnelt. Das TSST bindet einerseits an MHC-Klasse-II-Moleküle der dendritischen Zellen, andererseits bindet das Toxin an die Vß2-Kette des T-Zellrezeptors und löst damit eine massive Produktion von Zytokinen aus, zu denen auch Interferon-γ und Interleukin-4 gehören. Messungen von Zytokinkonzentrationen wurden in der vorliegenden Studie ausschließlich an Vß2-positiven T-Lymphozyten vorgenommen. Hierzu gehören etwa 10% der naiven T-Zellen. So wurde sichergestellt, dass das Toxin an die T-Zellen bindet und eine ausreichende und effektive Zytokinproduktion hervorruft, die mittels Durchflusszytometer gemessen werden konnte. 9 1. EINLEITUNG 1.4 Interferon-γγ und Interleukin-4 Interferon-γ gehört zur Gruppe der Zytokine. Zytokine sind hormonähnliche Substanzen, die auf Zellen mit entsprechenden Rezeptoren verschiedene biologische Effekte haben [44]. Es wurden verschiedene Interferonarten identifiziert, wobei Interferon-α Interferon-β und Interferon-ο als Typ 1-Interferone bezeichnet werden. Sie greifen am gleichen Rezeptor an. Daneben gibt es Interferon-γ, das unter anderem von T-Lymphozyten produziert wird und in der Literatur auch Interferon Typ 2 oder Immun-Interferon genannt wird. Interferon-γ wirkt antiinfektiös und antiproliferativ. Es hat eine Molekularmasse von 20000 bis 25000 Dalton und besitzt die Fähigkeit, in verschiedenen Zellen die Expression von Klasse I und Klasse II Molekülen zu induzieren. Es steigert ebenso die Aktivität von NatürlichenKillerzellen (NK-Zellen) und ist, da es in Makrophagen eine gesteigerte Leistung bei der Zerstörung von Tumorzellen und intrazellulären Erregern bewirkt, der wichtigste Makrophagen aktivierende Faktor. Antiviral wirkt Interferon-γ nicht nur durch die Hemmung der intrazellulären Virusreplikation, sondern auch über die Aktivierung der Makrophagen und über eine Hemmung der Makrophagenmigration [16,37]. Daneben hat es auch eine allergiesupprimierende Wirkung [24,37]. Als Gegenspieler von Interleukin-4 bewirkt es eine Hemmung des Immunglobulin-Klassenwechsels zu IgE und eine stärker ausgeprägte TH1-Zellantwort. Interleukin-4, das auch zur Gruppe der Zytokine gehört, ist ein ca. 20 kiloDalton (kD) schweres homodimeres Glykoprotein. Es wird vor allem von T-Zellen, Basophilen und Eosinophilen produziert. Zielzellen sind neben B-Zellen, Monozyten und Makrophagen die T-Zellen. In B-Zellen bewirkt Interleukin-4 einen Isotypen-Wechsel zu IgE, es hemmt die Aktivierung von Monozyten und Makrophagen und regt das Wachstum der T-Zellen und eine Differenzierung dieser zu TH2-Zellen an. 10 1. EINLEITUNG Nach Aktivierung der naiven T-Zellen durch die antigenpräsentierenden Zellen entscheidet die Zytokinproduktion darüber, ob nun im Sinne einer TH1 oder TH2-Antwort reagiert wird. Setzt die naive T-Zelle z.B. Interleukin-12 frei, so kommt es zu einer Proliferation von TH1-Zellklonen, deren Zytokinproduktion, vor allem die von Interferon-γ , die Differenzierung zu TH2-Zellklonen inhibiert. Produziert die aktivierte naive T-Zelle aber Interleukin-4, verhält es sich genau umgekehrt, die TH2 Zellantwort überwiegt. Die überwiegende Interferon-γ Produktion der TH1-Zellen führt nun zu einer Aktivierung der Makrophagen und zu einer Elimination intrazellulärer Pathogene, während die durch Interleukin-4 Freisetzung charakterisierte TH2-Zellantwort zu einer Aktivierung der B-Zellen mit IgEInduktion führt. Für uns stellte sich die Frage, ob das RS-Virus die Interferon-γ und Interleukin-4 Produktion der Kinder beeinflusst und ob sich bezüglich der Zytokinkonzentrationen Unterschiede zwischen den Kindern mit schwerer und milder Infektion zeigen lassen. Eine Dysbalance der beiden Zytokine und der mit ihnen assoziierten THelferzellantworten steht zudem in Zusammenhang mit der Entstehung von Asthma bronchiale und Allergien. Der Begriff „Allergie“ wurde 1906 von Pirquet das erste Mal verwendet, als er erkannte, dass sowohl bei der protektiven Immunantwort als auch bei der Hypersensitivitätsreaktion Antigene eine entscheidende Rolle spielen [39]. Man hat herausgefunden, dass TH2-Zellen, die nicht oder nur schwach unter dem Einfluss von Interferon-γ stehen, eine Atemwegsveränderung im Sinne eines Asthmas begünstigen, sowie die Produktion von IgE anregen [16,39,63]. Das Immunsystem von Patienten, die an allergischen Erkrankungen leiden, reagiert auf Allergenkontakt in vitro mit einer TH2Zell-Produktion. Im Gegensatz dazu scheinen Personen, die nicht an allergischen Erkrankungen leiden, mit einer moderaten Proliferation von TH1-Zellen zu reagieren. Die TH2-Zellantwort führt unter anderem zu 11 1. EINLEITUNG einer Produktion von Interleukin-4, was nachweislich einen Immunglobulin-Klassen-wechsel zu IgE bewirkt [24,37,63], während Interferon-γ die IgE-Produktion inhibiert [58]. Neben der Interferon-γ und Interleukin-4 Konzentration wurde in dieser Studie auch das Gesamt-IgE bestimmt, da sich die Frage stellte, ob sich sowohl reduzierte Interferon-γ Konzentrationen als auch eine damit in Zusammenhang stehende Erhöhung des Gesamt-IgE im Rahmen einer schweren RS-Virusinfektion nachweisen lassen. 1.5 Fragestellung Zusammengefasst ergaben sich folgenden Fragestellungen: Kann die primäre Immunantwort in vitro aus Zellen, die aus peripherem Blut isoliert wurden, nachgestellt werden? Besteht ein Zusammenhang zwischen der Interferon-γ und Interleukin-4 Produktion und der Schwere der RSV-Infektion? Können bei an Bronchiolitis erkrankten Kindern erhöhte Gesamt IgEWerte im Serum gemessen werden? 12 2. MATERIAL UND METHODEN 2. PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Das Patienten- und Kontrollkollektiv Für den ersten Teil der Studie wurden 13 Kinder untersucht die von Geburt an bis zu ihrem vierten Lebensjahr beobachtet wurden. Es wurde Nabelschnurblut und peripheres Blut im ersten und vierten Lebensjahr gewonnen. Keines dieser Kinder zeigte respiratorische Auffälligkeiten in der Neonatalzeit oder wurde bis zu seinem vierten Lebensjahr stationär behandelt. Mit einem Jahr war bei sieben Kindern der durchgeführte RSV-Anti-IgG-ELISA-Test positiv, mit vier Jahren war bei allen Kindern der Test zum Nachweis einer stattgehabten RSV-Infektion positiv. Das Patientenkollektiv für den zweiten Teil der Studie umfasste 27 Kinder, die zwischen November 2000 und April 2002 aufgrund einer RSVBronchiolitis im St. Josef-Hospital Bochum stationär behandelt wurden. Die Kinder waren zum Zeitpunkt ihres Krankenhausaufenthaltes unter einem Jahr alt. Es wurde bei der Auswahl der Kinder darauf geachtet, dass keines unter chronischen Atemwegserkrankungen, Herzerkrankungen oder sonstigen Erkrankungen litt. Die Diagnose der RSV-Infektion wurde während des stationären Aufenthalts mittels ABBOTT-TestpackRSV aus Nasen-Rachen-Sekret gestellt. Die klinischen Zeichen einer Bronchiolitis (Tachypnoe, verlängertes Exspirium, Rasselgeräusche u. a., s. o.) waren ebenfalls bei allen Kindern vorhanden. Zusätzlich wurde dokumentiert, ob die Patienten Sauerstoff erhielten, Schwächen bei der Nahrungsaufnahme zeigten und interkostale Einziehungen beim Atmen beobachtet werden konnten. Daneben wurden zur Kontrolle 41 Kinder aus einem Kollektiv ausgewählt, das seit Geburt der Kinder begleitet wurde. Sie alle lebten im Einzugsbereich der Klinik. Keines von ihnen war im ersten Lebensjahr wegen einer Atemwegserkrankung stationär behandelt worden und auch 13 2. MATERIAL UND METHODEN während der Neonatal-Periode zeigten sich bei keinem der Kinder respiratorische Defizite. Bei einem Kind konnten Symptome einer atopischen Dermatitis vor RSV-Infektion festgestellt werden. Während der RSVSaison wurden die Eltern der Kinder des Kontrollkollektivs telefonisch kontaktiert. Man befragte sie, ob ihre Kinder Symptome einer RSVInfektion (Tachypnoe, Husten, Trinkschwäche, interkostale Einziehungen beim Atmen) zeigten. Im Mittel unterschieden sich die Geburtsdaten der Kinder aus dem Patienten- und Kontrollkollektiv um 23 Tage (7-45 Tage). Sowohl die Kinder der Patientengruppe als auch die der Kontrollgruppe wurden fünf bis neun Monate nach der RSV-Saison in die Ambulanz einbestellt. Bei diesem Termin beantworteten die Eltern einen Fragebogen und sie wurden über die Forschungsabsichten aufgeklärt. Es erfolgte die schriftliche Zustimmung der Eltern. Ihren Kindern wurde Blut entnommen, das zum Anlegen der Zellkulturen und für einen RSV-Anti-IgGELISA-Test verwendet wurde, sowie für eine Gesamt-IgE-Bestimmung. Nach Auswertung des nach der Blutentnahme durchgeführten RSV-AntiIgG-ELISA-Tests (siehe unten) wurden die Kinder des Kontrollkollektivs in die Gruppen „milde RSV-Infektion“, das heißt serologisch nachweisbarer RSV-Kontakt ohne schwere Atemwegsinfektion, und „keine RSVInfektion“ eingeteilt. 14 2. MATERIAL UND METHODEN Tabelle 1: Anti-RSV-IgG im Alter von einem Jahr und klinische Symptome während der RSV-Saison Milde RSV RSV Nicht infiziert Infektion Bronchiolitis (n=26) (n=15) (n=27) 2,8 22,4 17,3 (1 – 6) (14 – 30) (6 – 30) Giemen** 0 8 12 Husten** 10 12 24 Tachypnoe** 0 0 27 Trinkschwäche** 0 0 23 Intercostale Einziehungen 0 0 22 0 0 20 Anti – RSV IgG (units)* (Min – Max) beim Atmen** Sauerstoffgabe** * angegeben als Median (Min – Max) ** Zahl der Patienten 2.2 Zellseparation und Anzucht der dendritischen Zellen Zum Anlegen der Zellkulturen wurde das Blut in einem Zentrifugenröhrchen, in dem sich 10 IE Heparin/ml Blut (Hep-Flush) befanden, gewonnen. Zunächst wurde das Blut in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit PBS/EDTA (0,2 molar) soweit verdünnt, dass das Röhrchen 35 ml enthielt und anschließend mit 15 ml Biocoll Separation Solution unterschichtet. Nun zentrifugierte man das Röhrchen bei 4°C und 400 x g 35 Minuten lang ohne Bremsung. Es stellten sich 4 Schichten dar, Erythrozyten und neutrophile Granulozyten am Boden, darüber Biocoll Separation Solution, dann die Interphase bestehend unter anderem (u.a.) aus Lymphozyten, Monozyten, und NK-Zellen, den Abschluss bildete ver15 2. MATERIAL UND METHODEN dünntes Plasma. Von den Schichten wurde die Interphase vorsichtig abpipettiert, in ein frisches Zentrifugenröhrchen gegeben, mit PBS/EDTA (0,2 molar) auf 50 ml aufgefüllt und bei 4°C und 30 0 x g 10 Minuten lang zentrifugiert. Die Zellen wurden danach noch einmal gewaschen, das heißt, dass der Überstand verworfen, das Pellet aufgeschüttelt und mit frischem PBS/EDTA (0,2 molar, 30 ml) aufgefüllt wurde. Nach einer weiteren Zentrifugation von 10 Minuten, diesmal bei 4°C und 200 x g, erfolgte erneut ein Verwerfen des Überstandes. Dann wurden ca. 9,5 ml PBS/EDTA hinzugegeben, so dass im Röhrchen ein Volumen von 10 ml war. Hiervon nahm man, nachdem das Pellet gut in dem Puffer gelöst wurde, 10 µl heraus und gab es in ein Eppendorf-Röhrchen, das bereits 90 µl Türckslösung zum Anfärben enthielt (Verhältnis: 1:9), um die Zellen in der Neubauer Zählkammer zählen zu können. Das Röhrchen mit 10 ml PBS/EDTA + gelöster Zellen wurde abermals zentrifugiert, wieder 10 Minuten bei 4°C und 300 x g. Nach Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren des Pellet gab man zunächst das FcRezeptor-Blocking-Reagenz und danach die CD14 microbeads (jeweils 20 µl pro 107 Zellen), sowie soviel PBS/EDTA dazu, dass ein Endvolumen von 100 µl pro 1 x 107 Zellen entstand. Dies wurde dann 15 Minuten bei 4°C inkubiert, danach mit PBS/EDTA aufgef üllt (Verhältnis: mind. 1:10) und wiederum 10 Minuten lang bei 4°C un d 300 x g zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes resuspendierte man das Pellet in 500 µl PBS/EDTA, um es in den AutoMacs geben zu können, der mit Hilfe einer Positivseparation (Possel) zwei Fraktionen trennte und man ein Röhrchen mit CD14-positiven (2 ml) und eines mit CD14-negativen (2,5 ml) Zellen erhielt. Beide Fraktionen wurden in der Neubauer Zählkammer nach Anfärben mit Türcklösung wie oben beschrieben gezählt. Nach einer weiteren Zentrifugation (10 min, 4°C, 30 0 x g) konnte man die CD14 negativen Zellen mit Einfriermedium (1% Pen/Strep, 10% DMSO, 44% RPMI, 45% FCS) resuspendieren und bei –85°C einfrieren. Die CD14-positiven Zellen wurden mit einem Nährmedium resuspendiert (pro 5x105 Zellen 1 ml: 80% RPMI, 1% Pen/Strep, 1% L16 2. MATERIAL UND METHODEN Glutamine, 1% non-essential Amino-acids, 1% Sodium-Pyruvat, 10% FCS). Zusätzlich erhielten die Zellen noch 10 µl/ml IL4 (250 U/ml) und 5 µl/ml GM-CSF (50 ng/ml) und wurden, aufgeteilt in Wells zu jeweils 1 ml, 7 Tage lang im Brutschrank bei 37°C, begast mit 5% CO2, inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen geerntet. Nach Kaltstellen der Lochplatte (circa 15 Min) und Mischen der Wells, konnte man diese abnehmen, in ein Zentrifugenröhrchen geben und nach Färbung mit Türckslösung in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer zählen. Auch die monozytären dendritischen Zellen wurde mit o.g. Einfrieremedium (1% Pen/Strep, 10% DMSO, 44% RPMI, 45% FCS) resuspendiert und zunächst bei -85°C eingefroren. Sowohl die CD14-negativen, als a uch die monozytären dendritischen Zellen (MODC) wurden nach 24-stündiger Lagerung bei -85°C zur längerfristigen Aufbewahrung in flüss igem Stickstoff gelagert. Aus dem Nabelschnurblut wurden hämatopoetische Stammzellen mittels anti-CD34 microbeads Markierung und anschließender Separation im MiniMacs isoliert. Die so gewonnenen Zellen wurden bei 37°C und mit 5% CO2-Gehalt in der Inkubatoratmosphäre 12 Tage lang inkubiert. Zu den Zellkulturen wurde 10 ng/ml GM-CSF, 2,5 ng/ml Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α) und 100 ng/ml rh Stamm-Zell-Faktor (SCF) in RPMI1640 gegeben. Dendritische Zellen wurden nach Markierung mit antiCD1a microbeads im AutoMACS isoliert, anschließend eingefroren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahrt (siehe oben). 17 2. MATERIAL UND METHODEN 2.3 Auftauen der CD 14 negativen Zellen und der monozytären dendritischen Zellen, Anlegen einer Material KoKultur, Sortierung der CD45+RA-Zellen und intrazelluläre Färbung Die folgenden Messungen wurden an fünf aufeinander folgenden Tagen durchgeführt, wobei als Tag 0 der Tag bestimmt wurde, an dem die KoKultur angelegt werden konnten. Da hierfür aber bereits ein Tag verwendet wurde, begann die Versuchsreihe am Tag –1 mit dem Auftauen und Infizieren der Zellen und endete nach Durchlaufen von Tag 0,1 und 2 an Tag 3 mit der Messung der intrazellulären Interferon-γ (IFN-γ) Konzentration. TAG –1: Die Zellen wurden in zwei verschiedene Ansätze geteilt: Ansatz 1: Patientengruppe (27 Proben) Ansatz 2: Kontrollgruppe (41 Proben) Es wurden stets ein Ansatz der Patientengruppe und einer der Kontrollgruppe parallel bearbeitet. Zunächst wurden die monozytären dendritischen Zellen (MODC) beider Ansätze durch aufpipettieren mit warmem PBS aufgetaut und 3 Mal gewaschen. Hierzu wurde das Röhrchen, in dem sich die Zellen + 40 ml warmes PBS befanden zentrifugiert (10 Minuten bei 4°C und 300 x g) und der Überstand verworfen, dann das Pellet mit PBS resuspendiert und erneut, wie oben beschrieben, zentrifugiert. Nach drei Durchläufen waren die Zellen gewaschen. Anschließend wurden die Zellen gezählt, nachdem 10 µl der Zellsuspension zu 90 µl Türckslösung und dann in die Fuchs-Rosenthal-Kammer gegeben wurden. Pro 2,5 x 104 Zellen wurden nun 500 µl RPMI verwendet, um 6 Wells auszusäen. In jedem Well befanden sich nun 500 µl RPMI mit 2,5 x 104 Zellen. Zu der einen Hälfte der Wells wurde RSV mit einer MOI von 10 gegeben. Das bedeutet, dass auf eine monozytäre dendritische Zelle 10 infektiöse Viren kommen. 18 2. MATERIAL UND METHODEN Nach drei Stunden wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und 500 µl RPMI mit Zusätzen (80% PRMI, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutamine, 1% non-essential Amino-acids, 1% Sodium-Pyruvat, 10% FCS) dazugegeben. Außerdem wurden noch weitere dendritische Zellen mit 10 µg/ml polyIC 24 h lang inkubiert. TAG 0: Gewinnung von naiven T-Zellen An diesem Tag wurden die CD 14 negativen Zellen aufgetaut und in der Neubauer-Zählkammer nach Anfärben mit Türckslösung im Verhältnis 1 Teil CD14-negative Zellen zu 9 Teilen Türckslösung gezählt. Anschließend wurden pro 1 x 107 Zellen jeweils 15 µl HLA-DR, anti CD45R0 und anti CD56 beads zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten bei 4°C wurden die Zellen gewaschen (Zentrifuge: 10 Min, 4°C, 300 x g) und nach Verwerfen des Überstand es und Resuspendieren des Pellet mit 500 µl PBS über den AutoMacs sortiert. Diesmal wurde eine Negativsortierung vorgenommen (Depletion). Die negative Fraktion konnte dann nach Anfärben mit Türckslösung gezählt werden. Diese wurde danach auf 2,5x105 Zellen in 500 µl RPMI+Zusätze (80% PRMI, 1% Pen/Strep, 1% L-Glutamine, 1% non-essential Aminoacids, 1% Sodium-Pyruvat, 10% FCS) eingestellt. In jedes der oben beschriebenen Wells wurden 500 µl der Zellsuspension und 10 ng/ml TSST gegeben. Die Lochplatten wurden bis zum Tag 2 im Brutschrank aufbewahrt. Ebensoviel TSST erhielten auch die Zellsuspensionen, die am Tag zuvor mit polyIC stimuliert wurden. TAG 1: Hier fanden keine Versuche statt. 19 2. MATERIAL UND METHODEN TAG 2: Am Tag 2 wurden in die Wells, sowie zu der polyIC stimulierten Suspension, 10 µg/ml Brefeldin A für maximal 18 Stunden hinzugegeben, um die Ausschleusung intrazellulär produzierter Zytokine zu stoppen. TAG 3: Am Morgen des Tag 3 wurden die Zellen auf Eis gestellt, geerntet, in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und abzentrifugiert (10 Min, 4°C, 300 x g). Der Überstand konnte verworfen werden. Nun wurden die Zellen für die Facs-Messung eingesetzt. Hierzu musste zunächst eine intrazelluläre Färbung des IFN-γ vorgenommen werden. Eine solche Färbung besteht aus 3 Schritten, dem Fixieren, dem Permeabilisieren und dem Färben. Fixieren: Die geernteten und abzentrifugierten Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Hierfür wurden die Zellen resuspendiert und gründlich auf dem Vortex gemischt. Die Fixierung erfolgte für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Permeabilisieren: Nach diesen 10 Minuten konnten die Röhrchen mit PBS/Acid (0,1% NaAcid) aufgefüllt, mit Parafilm verschlossen und durch Hin- und Herschwenken gründlich durchmischt werden. Anschließend folgte eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 4°C u nd 580 x g. Nach dem folgenden Verwerfen des Überstandes, der Zugabe von 1 ml Saponinpuffer und einer weiteren Zentrifugation (5 Min, 4°C, 200 x g) und erneutem Verwerfen des Überstandes, waren die Zellen durch Resuspensation mit 200 µl Saponinpuffer permeabilisiert. Färbung: Die 200 µl Zellen + Saponinpuffer wurden zu 2 x 100 µl geteilt, so dass zu den einen 100 µl 5 µl Vβ2 FITC + 1 µl IFN-γ PE und zu den zweiten 100 µl 5 µl Vβ2 FITC + 0,5 µl MsIgG1 PE gegeben werden konnten. Dies wurde dann 15 Minuten bei 4°C inkubie rt. 20 2. MATERIAL UND METHODEN Dann wurden die Zellen mit 1 ml Saponinpuffer gewaschen (Zentrifuge: 5Min, 4°C, 200 x g), der Überstand verworfen und di e Zellen mit 250 µl PBS/Acid resuspendiert. Anschließend konnte die FACS-Messung vorgenommen werden. Eine weitere Versuchsreihe wurde mit Kokulturen vorgenommen, die drei Tage lang mit TSST stimuliert worden waren. Hier wurde 10 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin für 5 Stunden hinzugegeben und die Zytokinproduktion anschließend mit 2,5 µM Monensin inhibiert. Dann wurde auch hier die FACS-Messung wie oben beschrieben durchgeführt. 21 2. MATERIAL UND METHODEN Abbildung 1: Stufen zur Messung der Konzentration einzelner Zytokine in TCR-Vß2+ Zellen mit FACS: a) Alle Lymphozyten wurden anhand morphologischer Kriterien identifiziert. b) Die Zellen wurden mit FITC und PE markierten Isotypenkontrollen gefärbt. c) Die Zellen wurden mit FITC, anti-TCR-Vß2 und PE markiert. d) Nach Markierung mit FITC, anti-TCR-Vß2, PE und anti-Interferon-γ konnten Interferon-γ produzierende Zellen von nicht-produzierenden Zellen getrennt werden. e) Prozentualer Anteil der produzierenden- und nicht-produzierenden Zellen (siehe d). 22 2. MATERIAL UND METHODEN 2.4 AutoMacs und FACS-Messung Im folgenden Abschnitt soll die Funktionsweise des AutoMacs und die der FACS-Messung kurz erläutert werden. Zellseparation mit MACS: Die Zellen, die benötigt werden, werden mit supermagnetischen MACS MicroBeads markiert. Die Zellen werden über eine Säule geschickt, die in einem starken Magneten platziert ist. Die magnetisch markierten Zellen bleiben an der Säule hängen, die unmarkierten Zellen verlassen die Säule sofort. Die zurückgebliebene Fraktion kann dann ausgewaschen werden. Bei der so genannten positiven Selektion (Possel) bilden die markierten Zellen die positive Fraktion und die unmarkierten die negative Fraktion. Bei der negativen Selektion (Depletion) verhält es sich genau umgekehrt. Mit Hilfe dieser beiden Verfahren wurden in den Versuchen einmal die CD14 positiven von den CD14 negativen Zellen getrennt (Possel), sowie später auch noch die HLA-DR, CD45R0 und CD56 negativen von den positiven (Depletion). FACS - Messung: Das FACscan Gerät ist ein Durchflußzytometer, dessen Prinzip es ist, simultane Messungen verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften einzelner Zellen oder Partikel vorzunehmen, die in einem Flüssigkeitsstrom einzeln angeordnet sind. Die zu messenden Substanzen werden vorher angefärbt, anschließend wird anhand der Stärke des emittierten Lichts eine Konzentrationsbestimmung vorgenommen. 23 2. MATERIAL UND METHODEN ELISA - Test: Es wurden ELISA-Testungen vorgenommen, die nach der klassischen Sandwich-Methode funktionierten. Es wurde ein RSV-ELISA der Firma virotech verwendet, wobei hier einmal das IgG und einmal das IgM gegen RSV gemessen wurde, um eine durchgemachte RSV-Infektion objektiv nachzuweisen bzw. auszuschließen. Serum – IgE – Test Zudem wurde in allen Blutproben das Gesamt-IgE gemessen. Hierfür wurde ein ELISA-Test der Firma Pharmacia Freiburg verwendet und nach Herstellerempfehlungen ausgewertet. 2.5 Fragebogen Der Fragebogen, den die Eltern der Probanden des zweiten Teils unserer Studie vor der Blutentnahme beantworten sollten, enthielt folgende Kriterien und Fragen: 1. Beschwerden der Lunge oder der Atmung seit Geburt: - Husten - Stridor - Giemen - Luftnot bzw. Tachypnoe (>55 Atemzüge/Minute) - Interkostale Einziehungen bei der Atmung 2. Anamnese der Eltern: - Alter der Mutter und des Vaters - Anzahl der Geschwister - Befragung der Eltern und der Geschwister nach: -Allergischer Rhinitis, Asthma, Neurodermitis 24 2. MATERIAL UND METHODEN 3. Anamnese der Umgebungsbedingungen: - Haustiere in der Wohnung - Rauchen in der Wohnung 4. Fragen zu Schwangerschaft und Geburt - Wie viele Schwangerschaftswochen wurde das Kind ausgetragen? - Hat die Mutter während der Schwangerschaft geraucht? - Geburtsgewicht 2.6 Statistik Verglichen wurde die Korrelation der Ergebnisse in verschiedenen Lebensaltern mittels des Spearman Tests. Zum Vergleich kontinuierlicher Variablen zwischen den verschiedenen Gruppen wurde der KruskalWallis-Test mit dem sich anschließenden Test nach Dunns verwendet. Für diskrete Variablen wurde der χ2-Test benutzt. Als signifikanter Unterschied wurde ein Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 angenommen. 2.7 Auflistung der verwendeten Materialien Geräte: Omnifuge 2,0 RS von Heraeus Auto-Macs von Miltenyi-Biotec FACS-can von Becton-Dickinson 25 2. MATERIAL UND METHODEN Reagenzien zur Aufbereitung des Blutes und zur Zellseparation: PBS-Dulbeco (1x), Biochrom AG, Berlin, L-1825 Biocoll Separation Solution: L-6115; Biochrom AG, Berlin Türcksche Lösung: 93770, Fluca, Steinheim FcR-Blocking Reagenz: 130-059-901, Miltenyi-Biotec, Bergisch- Gladbach CD14, antiCD34, antiCD1a MicroBeads, human: 130-050-201, MiltenyiBiotec, Bergisch-Gladbach EDTA: 03609, Fluca, Steinheim GM-CSF: Leukomax, Novartis, Nürnberg, Deutschland IL 4: 200-04, opro-tech/tebu GmbH, Offenbach DMSO (Dimethylsulfoxid): D-5879, Sigma, Deisenhofen VLE-RPMI 1640 Medium (1x): F-1415, Biochrom AG, Berlin Penicillin/Streptomycin 10.000U/ml: A-2213, Biochrom AG, Berlin Fetal Calf Serum (FCS): S-0115, Biochrom AG, Berlin L-Glutamine (200mM): K-0282, Biochrom AG, Berlin Sodium Pyruvat: L-0473, Biochrom AG, Berlin Hep-Flush(100U/ml): 009850-04, POM/Leo, U.K. TNFα: Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA SCF: Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA Reagenzien für das Anlegen der KoKultur RSV: Long strain; ATCC Anti IFN gamma: 500-P32, Pepro-Tech, Rocky Hill Brefeldin A: 91K4025, Sigma, Deisenhofen VLE RPMI 1640 + Penicillin/Streptomycin + Fetal Calf Serum + L-Glutamine + Sodium-Pyruvat + DMSO TSST-1 (highly purified): TX-TT606, Alexis Deutschland GmbH, Grünberg 26 2. MATERIAL UND METHODEN poly IC: Sigma, Taufkirchen, Germany PMA: Sigma, Taufkirchen, Germany Ionomycin: Sigma, Taufkirchen, Germany Monensin: Sigma, Taufkirchen, Germany Reagenzien zur Sortierung der RA-Zellen PBS (s.o.) EDTA (s.o.) Anti HLA-DR micro beads: 130-046-101, Miltenyi-Biotec, BergischGladbach Anti-CD56 micro beads: 130-050-401, Miltenyi Biotec, BergischGladbach Anti-CD45 R0 micro beads: 130-046-001, Miltenyi- Biotec, BergischGladbach Reagenzien zur intrazellulären Färbung Paraformaldehyd 4%: 16005, Riedel de Haen, Seelze PBS (s.o.) NaAcid: 1066880100, Merck, Darmstadt Saponinpuffer: PBS (s.o.) 0,01M Hepes: L1613, Biochrom, Berlin 0,1% Saponin: 16109, Riedel de Haen, Seelze Anti IFNγ-PE: 18904A, Pharmingen, Heidelberg IsotypKontrolle: MouseIgG1, 20604A, Pharmingen, Heidelberg Vβ2 FITC: 2407, Beckmann Coulter, Krefeld ELISA RSV-ELISA: EC107.00, Genzyme Virotech GmbH, Rüsselsheim 27 3. ERGEBNISSE 3. ERGEBNISSE 3.1 In vitro Korrelat der primären Reaktion in verschiedenen Lebensaltern 3.1.1 Die Patienten Für den ersten Teil der Studie wurde von 13 Kindern Serum gewonnen (siehe Kapitel 2.1). Das Serum jedes einzelnen Kindes wurde mit einem ELISA-Test untersucht. Der Test zeigt anhand einer anti RSV-IgG bzw. IgM-Erhöhung an, ob eine RSV-Infektion stattgefunden hat. Mit einem Jahr waren sieben der 13 Kinder und nach vier Jahren alle 13 Kinder des Kollektivs für den ersten Teil der Studie seropositiv für RSV. 3.1.2 Die RSV-induzierte Inhibition der Interferon-γγ Produktion im Nabelschnurblut korreliert mit der Inhibition der Interferon-γγ Produktion im Alter von einem Jahr und vier Jahren. Dieser Versuch diente zur Prüfung, ob die primäre Immunantwort in vitro nachgestellt werden kann. Dendritische Zellen aus Nabelschnurblut wurden wie die dendritischen Zellen, die im Alter von einem und vier Jahren gewonnen wurden, mit RSV infiziert, mit naiven T-Zellen ko-kultiviert und mit TSST-1 stimuliert. Nach drei Tagen wurde die Rate Interferon-γ produzierender Vß2+ TZellen bestimmt. Die Abbildungen (Abb. 2) zeigen, dass die Interferon-γ Produktion der T-Zellen nach RSV-Infektion reduziert ist, unabhängig vom Alter der Kinder, in dem die Zellen gewonnen wurden. Zudem konn28 3. ERGEBNISSE te beobachtet werden, dass sich der Anteil der Interferon-γ produzierenden Zellen nicht signifikant ändert: Abbildung 2: Das RS-Virus reduziert die Interferon-γ Produktion der Vß2+ Zellen im Nabelschnurblut, im Blut einjähriger und vierjähriger Kinder. Die Box stellt den Median dar, sowie das obere und untere Viertel, die Linien die Verteilung. Die Kreise stellen die Werte der für RSV seronegativen Kinder dar, die Punkte entsprechen den Werten der für RSV seropositiven Kinder. 3.2.3 Die an drei Zeitpunkten (Geburt, 1 Jahr, 4 Jahre) ermittelten Raten Interferon-γγ produzierender Zellen korrelieren miteinander Es konnte eine signifikante Korrelation des Anteils Interferon-γ produzierender Zellen im Nabelschnurblut und im Blut der gleichen Kinder mit einem und vier Jahren gezeigt werden. Abbildung 3 zeigt die Korrelation in Diagrammform, in Abbildung 4 werden die Originaldaten eines Kindes als typisches Beispiel gezeigt: 29 3. ERGEBNISSE Abbildung 3: Korrelation der Rate Interferon-γ produzierender Zellen im Nabelschnurblut und im Alter von einem Jahr und vier Jahren im Diagramm. 30 3. ERGEBNISSE Abbildung 4: Beispiel für ein typisches Messergebnis eines Kindes. 31 3. ERGEBNISSE 3.2 In vitro Korrelat der primären Reaktion bei Kindern mit schwerer RSV-Infektion 3.2.1 Die Patienten Auch das Serum der Kinder, die stationär wegen einer Bronchiolitis behandelt wurden, wurde mit einem ELISA-Test auf RSV-IgG bzw. IgM untersucht. Positiv war dieser Test bei allen 27 Kindern. Bei den Kontrollkindern waren 15 Proben positiv. Anhand der IgM bzw. IgG Bestimmung wurden die Kinder der letzten beiden Gruppen für den zweiten Teil der Studie in drei verschiedene Gruppen eingeteilt. Die Gruppe „Bronchiolitis“ wurde aus den Kindern gebildet, die stationär wegen einer RSV-Bronchiolitis behandelt worden waren (27 Kinder). Der zweiten Gruppe „milde Infektion“ wurden die Kinder zugeordnet, die anamnestisch keine RSV-Infektion vorwiesen, bei deren ELISA-Test man aber ein erhöhtes anti RSV-IgG bzw. IgM feststellen konnte (15 Kinder). Die Kinder, die der dritten Gruppe, „nichtinfiziert“, angehörten, wiesen weder anamnestisch noch diagnostisch eine RSV-Infektion auf (26 Kinder). Die Eltern beantworteten vor Blutentnahme zudem einen Fragebogen. Hierbei wurde nach den in der Tabelle (Tabelle 2) aufgeführten Gegebenheiten gefragt. Die anschließende Auswertung ergab, dass sich die Kinder nur hinsichtlich der Anzahl der Geschwister signifikant unterscheiden (p< 0,071). 32 3. ERGEBNISSE Tabelle 2: Evaluation der Umgebungsfaktoren im ersten Lebensjahr* Nicht infiziert (n = 26) Milde RSV Infektion (n = 15) RSV Bronchiolitis (n = 27) p - Wert fam. Belastung: Atopie 9 8 9 0.4516 fam. Belastung: Asthma 3 2 7 0.3031 männliches Geschlecht 17 8 13 0.4389 Rauchen: Vater 19 10 13 0.1587 Mutter 17 8 14 0.5715 während der Schwangerschaft 9 4 11 0.6555 4 4 9 0.2416 0.50±0.51 † 0.75±0.45 1.53±1.40 0.0071 39.9 ± 0.8 39.8 ± 0.9 39.3 ± 1.2 0.221 mittleres Geburtsgewicht kg 3.6 ±0.3 3.6 ± 0.4 3.4 ± 0.6 0.2320 Stillen (Monate) 3.2 ± 2.7 2.5 ±1.8 1.8 ± 2.0 0.2435 Umgebungsfaktor In der Wohnung gehaltene Tiere Anzahl der Geschwister Mittlere Schwangerschaftsdauer (Wochen) *Daten angegeben als n oder Mittelwert ± Standardabweichung † p=0.0022 gilt für nicht infizierte Kinder im Vergleich zu an Bronchiolitis erkrankten Kindern 3.2.2 Die Rate Interferon-γγ produzierender Zellen ist reduziert bei Kindern mit Bronchiolitis, nicht aber bei Kindern mit milder Infektion Die durchgeführten Untersuchungen an den drei Vergleichsgruppen ergaben folgendes: Die Interferon-γ Freisetzung nach RSV-Infektion in vitro war signifikant geringer (p<0,001) bei Kindern, die an einer RSVBronchiolitis im ersten Lebensjahr erkrankt waren, als bei den Kindern, die eine milde Infektion durchgemacht haben. Die Gruppe der nicht infi- 33 3. ERGEBNISSE zierten Kinder zeigte sowohl hohe als auch niedrige Anteile Interferon-γ produzierender Zellen (siehe Abb. 5a). Im Gegensatz dazu konnte man keinen Unterschied in der Produktion von Interleukin-4 zwischen den Gruppen feststellen (siehe Abb.5b). Abbildung 5: a) Interferon-γ Produktion der T-Zellen nach RSV-Infektion in vitro. Signifikanter Unterschied (p<0,001) zwischen den Gruppen „milde Infektion“ und „Bronchiolitis“. b) Interleukin-4 Produktion der T-Zellen nach RSV-Infektion in vitro. Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen zu erkennen. Die horizontalen Linien bezeichnen den Median. 34 3. ERGEBNISSE 3.2.3 Interferon-γγ Produktion nach Stimulation mit PolyIC und Restimulation mit PMA Um herauszufinden, ob die RSV-Infektion die gefundenen Unterschiede hinsichtlich der Rate Interferon-γ produzierender Zellen verursacht hat, wurden die Zellkulturen aller drei Gruppen teils mit PolyIC stimuliert und teils mit Phorbolester/Ionomycin restimuliert. Je eine Kontrollgruppe wurde ohne Zusätze inkubiert. PolyIC und PMA gelten als Interferon-γ stimulierende Substanzen. Unter diesen Bedingungen zeigten sich keine Unterschiede hinsichtlich der Interferon-γ Freisetzung der drei Gruppen (s. Abb. 6). Abbildung 6 a): Interferon-γ Produktion der T-Zellen ohne RSV-Infektion in vitro. Die horizontalen Linien bezeichnen den Median. 35 3. ERGEBNISSE Abbildung 6 b) und c): b) Interferon-γ Produktion der T-Zellen nach Stimulation mit PolyIC. c) Interferon-γ Produktion der T-Zellen nach Restimulation mit PMA/Ionomycin. Die horizontalen Linien bezeichnen den Median. 36 3. ERGEBNISSE 3.2.4 Auswertung des Serum IgE-Tests Der Vergleich des Gesamt-IgE aus dem Serum zeigte erhöhte IgEWerte bei 6 der 27 Kinder, die im ersten Lebensjahr an Bronchiolitis erkrankt waren. Alle anderen Kinder wiesen normale Gesamt-IgE-Werte im Serum auf. 250 IgE U/ml 200 150 100 50 0 nicht infiziert mild Bronchiolitis RSV Infektion Abbildung 7 IgE-Werte der Kinder ohne, mit milder und schwerer RSV-Infektion 37 4. DISKUSSION 4. DISKUSSION Im ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass es gelang, die primäre Immunantwort in vitro nachzustellen. Hierfür wurden Zellen von einer Gruppe von 13 Kindern, die von Geburt an beobachtet wurden, gewonnen. Dendritische Zellen und Naive TZellen wurden aus Nabelschnurblut und aus peripherem Blut im Alter von einem Jahr und vier Jahren isoliert. Die Interferon-γ Produktion nach in vitro Infektion mit dem RS-Virus war erniedrigt und korrelierte zueinander bei allen drei Messungen. Die Interferon-γ Produktion zeigte keine Altersabhängigkeit und war unabhängig von der in vivo RSV-Infektion, die die Kinder im Laufe der Jahre durchmachten. Es konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die Interferon-γ Produktion naiver T-Lymphozyten in vitro bei den Kindern erniedrigt war, die wegen einer schweren RSV-Bronchiolitis im ersten Lebensjahr stationär behandelt wurden (27 Kinder). Die Rate Interferon-γ produzierender Zellen war signifikant geringer als bei den Kindern, die nur an einer milden RSV-Infektion im ersten Lebensjahr erkrankten (15 Kinder) oder nicht infiziert waren (26 Kinder). 4.1 Die primäre Immunantwort in vitro Die primäre Immunantwort konnte in vitro nachgestellt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob das Versuchsprotokoll zum Erstellen der primären Immunantwort in vitro, das ursprünglich für Nabelschnurzellen angefertigt wurde, auf Zellen aus peripherem Blut übertragbar ist. Hierfür wurden Zellen von 13 Kindern, die 38 4. DISKUSSION von Geburt bis ins vierte Lebensjahr beobachtet wurden, gewonnen. Die Zellen stammten aus Nabelschnurblut der Kinder sowie aus peripherem Blut im Alter von einem und vier Jahren. Neben der Zellisolation wurde ein RSV-Anti-IgG-ELISA-Test aus dem Serum durchgeführt. Mit einem Jahr konnte bei sieben Kindern ein Kontakt zu RS-Viren nachgewiesen werden, drei Jahre später waren alle Kinder seropositiv für RSV. Nach Isolation der naiven T-Zellen und der dendritischen Zellen konnte eine erniedrigte Interferon-γ Produktion nach in vitro Infektion mit RSV festgestellt werden. Der Anteil Interferon-γ produzierender Zellen korrelierte zueinander an allen drei Messzeitpunkten. Es zeigte sich keine Altersabhängigkeit. Auch die im Beobachtungszeitraum durchgemachte RSV-Infektion veränderte das Ergebnis nicht. Dies zeigt, dass es uns gelungen ist, ein Modell der primären Immunantwort in vitro zu schaffen und den Einfluss der RS-Viren auf das primäre Immunsystem darzustellen. Diese Aussage wird dadurch gestützt, dass die in unseren Experimenten verwendeten T-Zellen CD4+ CD45RA+ Zellen waren. Diese Zellen werden allgemein als naive T-Zellen angesehen [12]. Zwar wurden CD45RA+ Zellen in einzelnen Studien auch als Gedächtniszellen und damit als Zellen der sekundären Immunantwort identifiziert [10,23], doch hierbei handelte es sich jeweils um Zellen von Tieren und Erwachsenen nach Stammzelltransplantation ohne nennenswerte eigene Produktion naiver T-Zellen im Thymus. Da wir im ersten Teil unserer Studie das Blut von gesunden Kindern mit altersentsprechend hoher Thymusaktivität bis zum vierten Lebensjahr verwendeten, ist davon auszugehen, dass wir keine Gedächtniszellen sondern naive T-Zellen isolieren konnten. Mit diesen Zellen und den dendritischen Zellen konnte ein Modell der primären Immunantwort geschaffen und die Interferon-γ Produktion nach in vitro RSV-Infektion gemessen werden. 39 4. DISKUSSION 4.2 Die Interferon-γγ Freisetzung ist reduziert bei Kindern mit RSVBronchiolitis Die Interferon-γ Produktion naiver T-Zellen der an Bronchiolitis erkrankten Kinder unterschied sich signifikant von der Interferon-γ Konzentration der mild infizierten Kinder. Im zweiten Teil der Studie untersuchten wir die Interferon-γ Produktion naiver T-Zellen von an Bronchiolitis erkrankten, von mild und nicht infizierten Kindern nach in vitro Infektion mit dem RS-Virus. Es wurden hierfür Zellen von 68 Kindern gewonnen, die im Beobachtungszeitraum unter einem Jahr alt waren und in dieser Zeit an RSV-Bronchiolitis erkrankten oder gesund waren. Eine RSV-Infektion ist die häufigste Ursache einer Atemwegsinfektion in den ersten beiden Lebensjahren, mit einem Gipfel in den ersten sechs Lebenswochen bis sechs Lebensmonaten. Etwa 1% der Säuglinge erleidet eine Bronchiolitis. Bis zum dritten Lebensjahr sind nahezu alle Kinder durchseucht [45,65]. Die 68 Kinder waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme etwa ein Jahr alt (0,7-1,5 Jahre). Es zeigte sich, dass die Kinder, als sie wegen der RSVBronchiolitis stationär behandelt wurden, im Mittel 16 Wochen alt waren (5-42 Wochen). Damit lag das Alter der Kinder in dem für RSVBronchiolitis typischen Erkrankungszeitraum [28,65,45]. Die RSV-Infektion wurde während des stationären Aufenthalts mittels eines RSV-Schnelltests nachgewiesen. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme, die etwa fünf bis neun Monate nach der RSV-Saison stattfand, waren alle Kinder gesund. Die Interferon-γ Produktion der Zellen gesunder Kinder war, wie der erste Teil der Studie zeigte, stets gleich, unabhängig vom Alter und von ei- 40 4. DISKUSSION ner stattgehabten, serologisch nachweisbaren RSV-Infektion. Wir stellten im zweiten Teil der Studie eine signifikant niedrigere Interferon-γ Produktion bei Kindern mit Bronchiolitis fest. Andere Studien beschreiben bereits die signifikant verringerte Interferonγ Produktion naiver T-Zellen von an Bronchiolitis erkrankten Kindern [1,4,11,14,17,56]. Es kann allerdings nicht genau nachvollzogen werden, ob die in der Literatur beschriebenen unterschiedlichen Interferon-γ Produktionen auf einem Unterschied in der Immunantwort beruhen. Sie könnten auch Folge unterschiedlicher Virus-Konzentrationen sein, mit denen die Patienten konfrontiert wurden. Es ist ebenfalls nicht ersichtlich, ob verschiedene Behandlungsmethoden der Bronchiolitis die Immunantwort ausschlaggebend veränderten [28,46]. Bei der vorliegenden Studie wurde die primäre Immunantwort in vitro imitiert und bei jedem Ansatz die gleiche Virusmenge verwendet. Dadurch waren in dieser Studie die Umgebungsfaktoren kontrolliert. Das Ergebnis zeigt die Reaktion des Immunsystems auf eine RSVErstinfektion in vitro und spiegelt damit die Reaktion auf die RSVErstinfektion in vivo wieder, die die Kinder in ihrem ersten Lebensjahr erfuhren. Es gelang, den Einfluss der RS-Viren auf die Interferon-γ Produktion in vitro kontrolliert darzustellen. Durch die Reduktion der Interferon-γ Produktion beeinflusst das Virus die Immunantwort des menschlichen Organismus [48]. Interferon-γ spielt eine wichtige Rolle dabei, eine TH1-Antwort des Wirtes zu induzieren. Eine TH1-Antwort hat auf die RSV-Infektion einen limitierenden Effekt [22]. Die reduzierte Interferon-γ Produktion geht mit einer verminderten TH1Zellantwort einher. Es ist in der Literatur beschrieben, dass vor allem die RSV-Erstinfektion mit einer Reduktion der TH1-Zellantwort assoziiert sein kann [3,11,21,38]. Die RSV-Infektion geht stattdessen einher mit einer vermehrten TH2-Zell-Proliferation in der Akutphase einer RSVInfektion [42,59]. 41 4. DISKUSSION Die vorliegende Studie bestätigt die reduzierte Interferon-γ Produktion bei schwerer RSV-Infektion. Kinder mit milder Infektion zeigen eine hohe Anzahl Interferon-γ produzierender Zellen. Demnach können hohe Interferon-γ Konzentrationen vor einer schweren RSV-Infektion schützen. Studien zeigen, dass Interferon-γ nicht nur einen limitierenden, sondern auch einen prophylaktischen und therapeutischen Effekt bei einer RSVInfektion hat. In einer an Mäusen durchgeführten Studie wurde nachgewiesen, dass die prophylaktische Gabe von Interferon-γ eine Verminderung der Virusreplikation und Infektion zur Folge hat [41]. Eine an Kälbern durchgeführte Studie kam zu dem Ergebnis, dass eine Beeinflussung der Immunantwort in Richtung TH1-Zellproduktion einen therapeutischen und prophylaktischen Effekt auf die RSV-Infektion hat [25]. Hohe Interferon-γ Konzentrationen sollen einer schweren RSV-Infektion entgegenwirken [17]. Die Interferon-γ vermittelte Viruselimination erfolgt über die Beeinflussung des intrazellulären 2'-5' Oligoadenylate- synthetase-Signalwegs [9]. Interferon-γ nimmt eine Schlüsselrolle bei der RSV-induzierten Immunreaktion und der T-Zell-vermittelten Kontrolle der Infektion ein [52]. Gedächtniszellen von siebenjährigen Kindern reagieren mit einer nachweisbar hohen Interferon-γ Produktion auf inaktiviertes RS-Virus [71]. Dies liefert eine Erklärung dafür, dass RSV-Infektionen bei älteren Kindern und Erwachsenen milder verlaufen, schließlich ist Interferon-γ ein wichtiger Bestandteil der Inaktivierung der Virusreplikation und der Aktivierung dendritischer Zellen. Gerade deshalb war es wichtig, in der vorliegenden Studie den Effekt des RS-Virus auf die primäre Immunantwort unter Ausblendung der Gedächtniszellen zu untersuchen. Nachgewiesen werden sollte schließlich der Effekt, den das Virus bei der ersten Infektion des Kindes hat. Wie auf Sekundärinfektionen mit dem RS-Virus reagiert wird, wurde in dieser Studie nicht untersucht. 42 4. DISKUSSION 4.3 Die Interferon-γγ Produktion der nicht-infizierten Kontrollgruppe Anhand der Interferon-γ Produktion kann die Gruppe der „nichtinfizierten“ Kinder in zwei Gruppen unterteilt werden. Man kann ein Maximum etwa in Höhe des Medians der Gruppe der kranken Kinder erkennen und eine weiter vermehrte Sammlung etwa in Höhe des Medians der Gruppe der RSV-infizierten Kinder mit mildem Krankheitsverlauf (siehe Abb. 5a). Insgesamt zeigte sich eine niedrigere Rate Interferon-γ produzierender Zellen (p<0,05) als bei den Kindern mit milder RSV-Infektion. Dies könnte bedeuten, dass die Kinder, deren Zellen nach in vitro Infektion mit dem RS-Virus weniger Interferon-γ produzieren, bei einer RSVInfektion in vivo im ersten Lebensjahr ebenfalls an einer schweren Bronchiolitis erkrankt wären. Eine genetische Veranlagung könnte der Grund für die unterschiedliche Reaktion auf eine RS-Virus Infektion der einzelnen Kinder sein. In der Literatur sind Gen-Polymorphismen, die mit einer schweren RSVInfektion zusammenhängen, bereits für TGFß [30], IL4, den IL4 Rezeptor alpha [18] und IL10 [29] beschrieben worden. Zudem hat sich gezeigt, dass non-structual Proteine des RS-Virus, welche ausschließlich in der viralen Replikationsphase gebildet werden, die Interferon-α/ß Produktion der T-Zellen supprimieren [55,66]. Interferon-α/ß ist einer der wichtigsten Regulationsfaktoren der Interferon-γ Produktion. Diese Proteine könnten über einen bislang noch nicht näher bekannten genetisch determinierten Faktor mit der Zielzelle interagieren. Konsequenzen bezüglich der Klinik einer späteren RSV-Infektion oder bezüglich des Auftretens allergischer Erkrankungen können anhand unserer Studie nicht aufgedeckt werden. 43 4. DISKUSSION 4.4 Reduzierte Interferon-γγ Produktion bei anderen Virusinfektionen und bei Doppelinfektionen mit RSV-Beteiligung Die reduzierte Rate Interferon-γ produzierender Zellen ist nicht spezifisch für RSV-Infektionen. Eine Infektion mit Rhinoviren soll ebenfalls mit verminderter Interferon-γ Produktion einhergehen [54,15], obwohl andere Autoren beschreiben, dass Virusinfektionen, zum Beispiel Adenoviusund Rhinovirusinfektionen, im Gegensatz zur RS-Virusinfektion mit einer vermehrten TH1-Zellantwort einhergehen [3,21]. Eine Studie zeigt, dass bei Kindern, die stationäre Behandlung wegen einer Bronchiolitis erfahren, in vielen Fällen eine Doppelinfektion nachgewiesen werden kann [2]. So konnten bei den für diese Studie untersuchten Kindern neben RS-Viren auch Rhinoviren, Influenza- und Adenoviren während der Erkrankung isoliert werden. Einige Kinder wiesen die Kombination von RS-Viren und Rhino-, Adeno- bzw. Influenzaviren auf. Bei den doppelinfizierten Kindern mit RS-Virusbeteiligung wurde eine signifikant reduzierte Interferon-γ Konzentration nachgewiesen. Kinder, die an einer schwere Infektion des unteren Respirationstrakts erkrankten, die durch eine Erregerkombination aus Rhino-, Adeno- und Influenzaviren ohne RSV-Beteiligung hervorgerufen wurde, zeigten keine signifikant reduzierte Interferon-γ Konzentration. Auch diese Studie bestätigt den von uns gefundenen Zusammenhang zwischen Klinik der RS-Virusinfektion und Reduktion der Interferon-γ Konzentration. In der vorliegenden Studie wurde nur ein RSV-Schnelltest während der Erkrankung vorgenommen. Ob die kranken Kinder eine Doppelinfektion mit anderen Viren zeigten, wurde nicht untersucht. 44 4. DISKUSSION 4.5 Stimulation der Zellkulturen mit PolyIC und PMA Die Interferon-γ Produktion unterschied sich nach Stimulation mit polyIC oder Restimulation mit PMA nicht zwischen den drei Gruppen. Die Kapazität der Interferon-γ Produktion war bei allen untersuchten Zellkulturen gleich. PolyIC ist eine synthetische Doppelstrang-RNA, die aus einem Polymer aus jeweils einem Strang Inosin und einem Strang Cytidin besteht. Es bindet an den TLR 3 Rezeptor der dendritischen Zellen, einen Rezeptor, der auch bei Virusinfektionen aktiviert wird. PolyIC ist ein hochpotenter Induktor der Interferon-γ Produktion. Auch PMA (Phorbol-Myristate-Acetat) ist in der Lage, die Interferon-γ Produktion zu stimulieren. Allerdings wirkt es nicht wie PolyIC auf die dendritischen Zellen sondern induziert über die Aktivierung der Phosphokinase C eine maximale Interferon-γ Produktion der T-Zellen. PMA wurde erst zu der Zellkultur gegeben, nachdem die Zellen schon mit TSST stimuliert worden waren. Es fand also eine Restimulation statt. Betrachtet man nun die Interferon-γ Produktion nach Stimulation mit PolyIC oder Restimulation mit PMA, so zeigen sich keine Unterschiede zwischen den drei Probandengruppen (siehe Abb. 6a-c). Auch ohne RSV-Infektion konnten keine Unterschiede beobachtet werden. Die Ausgangssituation war bei allen Kindern gleich. Die reduzierte Interferon-γ Produktion ist demnach eine Folge der RS-Virusinfektion in vitro. Es bleibt festzuhalten, dass das RS-Virus die Interferon-γ Produktion reduziert. Dabei ist die Interferon-γ Konzentration bei an Bronchiolitis erkrankten Kindern signifikant niedriger als bei mild bzw. nicht-infizierten. Unter maximaler Stimulation und ohne Infektion mit dem RS-Virus ist die 45 4. DISKUSSION Interferon-γ Konzentration bei allen Kindern gleich hoch bzw. niedrig, so dass die Klinik der RS-Virusinfektion und Interferon-γ Konzentration eindeutig in Zusammenhang stehen. 4.6 Klinik der RSV-Infektion Wie in der Literatur beschrieben zeichnet sich die RSV-Bronchiolitis klinisch aus durch Tachy- bzw. Dyspnoe, interkostale Einziehungen beim Atmen, Trinkschwäche, Fieber, Husten, Rasselgeräusche, Giemen und ein verlängertes Exspirium [65]. Die mildere Form der RSV-Infektion wird meistens in Form einer Rhinitis, Bronchitis und manchmal Fieber, seltener auch als Otitis media klinisch manifest. Nach den oben genannten Symptomen wurden die Eltern befragt, noch bevor die Blutproben dem Anti-RSV-IgG-ELISA-Test unterzogen wurden. Bei Auswertung des Fragebogens stellte sich heraus, dass erwartungsgemäß fast alle Kinder, die an einer RSV-Bronchiolitis erkrankt waren, die Symptome Husten, Tachypnoe, Trinkschwäche und interkostale Einziehung, sowie das für RSV-Infektionen charakteristische Giemen zum Zeitpunkt ihres Krankenhausaufenthaltes aufwiesen. Das Giemen ist nicht nur mit der RSV-Bronchiolitis, sondern auch mit der milden Form der Erkrankung assoziiert [66]. Nach Auswertung der Fragebögen konnten wir diese Tatsache aufzeigen. Nahezu die Hälfte der Kinder mit einer milden Infektion wiesen Episoden von Giemen auf. Insgesamt aber zeigte sich, dass die mild-infizierten Kinder wenig Symptome zeigten, so dass die RS-Virusinfektion undiagnostiziert ablaufen konnte. Dies bestätigt, dass RS-Virusinfektionen in zwei Drittel der Fälle nur leichte Infekte der oberen Atemwege hervorrufen [65]. 46 4. DISKUSSION Die nicht-infizierten Kinder hatten bis zum Zeitpunkt der Blutentnahme weder gegiemt noch gehustet. Da hier tatsächlich noch kein Kontakt zu RS-Viren bestand, bestätigt sich, dass RS-Viren eine der häufigsten Erreger von Atemwegsinfektionen im Kindesalter sind [65]. Eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Klinik der Infektion liefert die reduzierte Interferon-γ Produktion. Die mild infizierten Kinder zeigten einen höheren Anteil Interferon-γ produzierender Zellen als die an Bronchiolitis erkrankten Kinder. Dies bestätigt die Annahme, dass Interferon-γ eine Schlüsselrolle bei der T-Zell-vermittelten Kontrolle einnimmt [52] und die Schwere der Erkrankung beeinflusst. Zudem gibt es einen bekannten Zusammenhang zwischen reduzierter Interferon-γ Produktion, RSV-Bronchiolitis und der Erkrankung an Asthma bronchiale und Allergien [6,39,62,64]. Asthma bronchiale ist klinisch von der Bronchiolitis kaum zu unterscheiden, auch hier steht die Atemwegsobstruktion im Vordergrund. Kinder, die im ersten Lebensjahr an Bronchiolitis erkrankten, leiden später gehäuft an Asthma bronchiale. Anhand dieser Studie kann nicht vorausgesagt werden, welches Kind im späteren Leben einmal an einer allergischen Erkrankung oder an Asthma bronchiale leiden wird, da die Patienten nicht weiter beobachtet wurden. Wir konnten nachweisen, dass die an Bronchiolitis erkrankten Kinder eine reduzierte Interferon-γ Konzentration nach in vitro Infektion mit dem RS-Virus zeigen. Dies bedeutet, dass die TH2-Zellantwort überwiegt, die mit IgEErhöhung und der Entwicklung von Allergien und Asthma bronchiale in Zusammenhang steht [6,39,63]. 4.7 Interferon-γγ und Asthma bronchiale Einige Autoren beschreiben, dass eine RSV-Infektion die Entwicklung eines Asthma bronchiales im Kindesalter, also in den ersten 10 Lebens- 47 4. DISKUSSION jahren, begünstigt [34,43]. Bei 40-50 % der Kinder, die wegen einer RSVBronchiolitis stationär behandelt werden mussten, fand man im Verlauf weitere Episoden von Giemen. Bezüglich des Giemens werden in der Literatur folgende zwei Punkte unterschieden: Einmal führt man auf eine durchgemachte RSV-Bronchiolitis rezidivierende Atemwegsobstruktionen in den folgenden Lebensjahren zurück. Dies wird vor allem in den ersten beiden Lebensjahren beobachtet und geht vermehrt mit einem kindlichen Asthma bronchiale einher [67]. Auf der anderen Seite aber hat man keinen Zusammenhang zwischen Asthma bronchiale im 11. Lebensjahr und Bronchiolitis in früher Kindheit festgestellt [43]. Den größte Einfluss auf die Entstehung sowohl des wiederholten Auftretens von Giemen als auch auf die allergische Sensibilisierung scheint das RS-Virus während des auf die schwere Infektion folgenden Jahres zu haben [51]. Die Autoren weisen darauf hin, dass sowohl die klinischen Symptome als auch die histologischen Veränderungen in den Bronchien bei Asthma bronchiale und RSV-Bronchiolitis nahezu identisch sind. Beide sind charakterisiert durch Eosinophilen-Infiltration, Freisetzung von Mediatoren wie zum Beispiel Histamin und Leukotrienen, sowie klinisch durch Stridor, Tachypnoe und ein verlängertes Exspirium. Für diese Gemeinsamkeiten wird zum einen verantwortlich gemacht, dass eine TH2-Zellantwort bei beiden Erkrankungen überwiegt [57]. Zum anderen wird darauf verwiesen, dass man bei Kindern mit RSV-Bronchiolitis und einer späteren Asthmaerkrankung vermehrt IgE-Antikörper gegen RSV im Bronchialsekret gefunden hat. Diese bewirken eine Freisetzung von Mediatoren, die für die Entstehung eines Asthma bronchiales verantwortlich gemacht werden. Interferon-γ mindert nicht nur, wie oben beschrieben, die TH2Zellantwort. Es mindert ebenso die Eosinophileninfiltration und die Mucusproduktion in der Lunge bei allergischen Reaktionen, wie eine an Mäusen durchgeführte Studie bestätigt [19]. 48 4. DISKUSSION Dies liefert eine Erklärung für die Assoziation zwischen schwerer RSVInfektion mit niedriger Interferon-γ Konzentration, einhergehend mit vermehrter TH2-Zellantwort, und Asthma bronchiale. Nachweisen können wir das gehäufte Auftreten eines Asthma bronchiales nach RSVInfektion mit der vorliegenden Studie nicht, da wir die Kinder nicht weiter beobachteten. 4.8 Interferon-γγ und die Entwicklung von Allergien Verschiedene Studien haben sich mit dem Zusammenhang zwischen RSV-Bronchiolitis und allergischer Sensibilisierung befasst und schreiben der Virus-induzierten reduzierten Interferon-γ Produktion eine Begünstigung allergischer Erkrankungen zu [62,64]. Während allerdings im Falle der Entstehung von frühkindlichem Asthma sich viele Autoren einig sind, dass eine RSV-Infektion neben der familiären Belastung, männlichen Geschlecht, westlichem Lebensstil zu den Hauptrisikofaktoren gehört [43], sind sich die Autoren in Bezug auf die RSV-Infektion als Risikofaktor für die Allergieentstehung uneinig. So kann in einigen Studien kein Zusammenhang zwischen einer RSVInfektion und Allergien nachgewiesen werden [50,67], während andere Studien auch im Falle der allergischen Sensibilisierung die RSVBronchiolitis als unabhängigen Risikofaktor gefunden haben [61,64]. Im Rahmen der allergischen Sensibilisierung scheint wichtig zu sein, dass der Einfluss des RS-Virus im ersten Jahr nach der Infektion besonders stark ist und hier eindeutig als Risikofaktor zu nennen ist. Insbesondere gilt RSV als Risikofaktor für die Entstehung allergischer Erkrankungen für die Kinder, die stationär wegen einer schweren Bronchiolitis behandelt wurden [61]. Da die Kinder etwa sechs Monate nach der RSVInfektion und damit im ersten Jahr nach der Infektion untersucht wurden, führten wir eine Messung der Gesamt-IgE-Werte im Serum durch. 49 4. DISKUSSION 4.9 Erhöhte IgE-Werte bei 6 Kindern mit Bronchiolitis Die Auswertung des Gesamt IgE-ELISA-Tests zeigte bei sechs an Bronchiolitis erkrankten Kindern erhöhte Gesamt IgE-Werte. Wie bereits beschrieben, scheint das Virus bezüglich allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale und damit einhergehender IgEErhöhung im ersten Jahr nach der Infektion den größten Einfluss zu nehmen [43]. Da die Kinder etwa sechs Monate nach der RSV-Infektion und damit im ersten Jahr nach der Infektion untersucht wurden, führten wir eine Messung der Gesamt-IgE-Werte im Serum durch. TH2-Zellreaktionen, wie sie bei Kindern mit RSV-Bronchiolitis beobachtet werden, sind dadurch charakterisiert, dass sie aufgrund der Interleukin 4-Freisetzung und der dadurch induzierten IgE-Produktion mit hohen Serum IgE-Werten einhergehen [47]. Hohe IgE-Spiegel im Serum gehen mit dem Risiko einher, Asthma und Allergien zu entwickeln. Vor allem bei Kindern, die im ersten Jahr an Bronchiolitis erkrankt waren und in den folgenden beiden Lebensjahren ein persistierendes Giemen zeigten, wurden erhöhte IgE-Level festgestellt. Ab dem 6. Lebensjahr können weder in Bezug auf das Giemen noch auf den erhöhten IgE-Spiegel Unterschiede zur Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Eine allergische Sensibilisierung oder Asthma bronchiale wird sogar seltener beobachtet als bei den Kontrollkindern [70]. In der vorliegenden Studie können solche Hypothesen nicht bestä- tigt werden, da es sich nicht um eine Längsschnittstudie handelt. Jedoch zeigt sich auch hier bei 6 der an Bronchiolitis erkrankten Kindern die Assoziation zwischen RSV-Bronchiolitis und erhöhten Gesamt-IgE-Werten (siehe Abb. 7). 50 4. DISKUSSION 4.10 Der Einfluss von Viren auf die Entstehung von Asthma und Allergien Für den Zusammenhang zwischen Virusinfektionen, allergischer Sensibilisierung und Asthma bronchiale gibt es in der Literatur zwei Erklärungsansätze. Eine Hypothese besagt, dass Virusinfektionen die sich noch in der Entwicklung befindende Lunge schädigt und das Immunsystem des Kindes beeinflusst. Eine zweite Hypothese besagt, dass Virusinfektionen bei Kindern, die ein für Allergene anfälliges Bronchialsystem schon seit der Geburt aufweisen, gravierende Verläufe nehmen [74]. Als Beispiel sei hier die Exazerbation eines Asthmas im Rahmen von RSVirusinfektionen zu nennen [67]. Im ersten Fall würde die RSV-Infektion eindeutig einen Risikofaktor für die Entwicklung von Allergien und Asthma darstellen. Im zweiten Fall deckt die schwere Infektion nur eine bereits vorhandene Disposition auf, die ohne Virusinfektion bis zum Auftreten der Allergie unerkannt bleiben würde. Untersuchungen bei Kindern mit nachgewiesener RSV- Bronchiolitis, die ergeben haben, dass das Virus eine reduzierte Lungenfunktion sowie ein hyperreagibles Bronchialsystem verursacht, lösen das Problem nicht auf. Eine andere Erklärung für den Zusammenhang zwischen Asthma bronchiale und RS-Virusinfektion, sowie der Erkrankung an Bronchiolitis oder milder Atemwegsinfektion durch das RS-Virus liefert die häusliche Umgebung der an Bronchiolitis erkrankten Kinder. Die an Bronchiolitis erkrankten Kinder hatten im Mittel mehr Geschwister als die mildinfizierten Kinder. 51 4. DISKUSSION 4.11 Bedeutung der Geschwisterzahl in Bezug auf eine RSVInfektion und die Entwicklung eines Asthma bronchiales Die Auswertung des Fragebogens ergab, dass sich die Patienten nur bezüglich der Geschwisterzahl signifikant voneinander unterschieden. Prädisponierender Faktor für die Erkrankung an RSV-Bronchiolitis ist eine große Geschwisterzahl. Der Zusammenhang ist in der Literatur beschrieben [5,31,32,65] und nach Auswertung des Fragebogens in der vorliegenden Studie bestätigt worden. Besonders die älteren Geschwister, die schon Kindergärten oder Schulen besuchen, übertragen durch den engen häuslichen Kontakt die Viren auf ihre jüngeren Geschwister. Wie bereits erwähnt, liegt die Durchseuchung mit RS-Viren bis zum 4. Lebensjahr bei nahezu 100% [65,45]. Das Immunsystem der Jüngeren kommt dadurch, im Gegensatz zu Kindern ohne ältere Geschwister, mit einer Vielzahl von Viren und Bakterien in Kontakt. Im ersten Lebensjahr dominiert beim Säugling die TH2-Zellantwort. Vornehmlich TH2-Zellen reifen unter plazentarem Einfluss [20]. Dadurch sind nach der Geburt TH2-Zellen die Zellen, die die Immunantwort des Neugeborenen prägen. Nach und nach wird aus diesem Übergewicht ein Gleichgewicht zwischen TH1 und TH2-Zellreaktion hergestellt [33]. In dieser so genannten „kritischen Phase“ sind die Kinder anfällig für Virusinfektionen, die nur durch eine funktionierende TH1-Zellreaktion wirksam einzudämmen sind [19]. Zu diesen Virusinfektionen gehört die RSVInfektion. Dies erklärt, warum Säuglinge und Kleinkinder anfälliger für die Erkrankung an Bronchiolitis sind und dass ältere Kinder nur selten an einer Bronchiolitis leiden [49]. Die Umstellung der Immunantwort auf eine vorwiegende TH1-Antwort ist physiologisch. Im frühen Kindesalter durchgemachte Virusinfektionen scheinen die Umstellung beziehungsweise die Einstellung eines Gleichgewichts zwischen TH1- und TH2-Zellantwort zu beschleunigen. Damit 52 4. DISKUSSION ist zu erklären, dass Kinder, die viele Geschwister haben oder zusammen mit vielen Kindern aufwachsen, zwar in den ersten beiden Lebensjahren viele mehr oder weniger schwere Atemwegsinfektionen durchmachen, im Jugendalter allerdings seltener an Asthma bronchiale leiden [20]. 4.12 Der Einfluss weiterer Umgebungsfaktoren auf die RSVInfektion In der Literatur werden als Risikofaktoren für eine RSV-Infektion Rauchen der Eltern, vor allem das Rauchen der Mutter während der Schwangerschaft, eine große Anzahl Geschwisterkinder und der Besuch von Kindertagesstätten angegeben. Auch eine familiäre Asthmabelastung und Verwandte ersten Grades mit Atopie sollen hierbei eine Rolle spielen [5,31,32,65]. Vor allem die Kombination aus mehreren Risikofaktoren erhöht das Risiko, an Bronchiolitis zu erkranken [28]. Der von den Eltern beantwortete Fragebogen umfasste Fragen nach den in der Literatur aufgeführten Risikofaktoren (siehe Kapitel 2.5). Es stellte sich nach Auswertung der Fragebögen heraus, dass bei der vorliegenden Studie die Kinder, die an einer Bronchiolitis erkrankten, im Mittel mehr Geschwister (siehe oben) hatten. Hinsichtlich der anderen Risikofaktoren konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen festgestellt werden. 53 4. DISKUSSION 4.13 Die Interleukin-4 Produktion Die Messung der Interleukin-4 Produktionen in der vorliegenden Studie ergaben keine Unterschiede zwischen den drei Vergleichsgruppen. Verschiedene Studien haben neben einer verminderten Interferon-γ Produktion eine erhöhte Interleukin-4 Produktion bei den Kindern feststellen können, die an einer RSV-Bronchiolitis erkrankten [11,53]. In einer anderen Arbeit heißt es, dass nur gering erhöhte Interleukin-4 Konzentrationen nachgewiesen werden konnte, dass aber der Interleukin- 4/Interferon-γ Quotient bei Kindern mit einer schweren Erkrankung deutlich erhöht war [17]. Eine tierexperimentelle Arbeit konnte sogar darlegen, dass die Gabe von Anti-Interleukin-4 bei einer in vitro erzeugten RSV-Infektion eine TH1 Immunantwort begünstigt und damit eine weniger schwere Erkrankung bei den in der Studie untersuchten Mäusen beobachtet wurde [69]. Obwohl, wie oben beschrieben, wahrscheinlich eine vermehrte Proliferation von TH2-Zellen und folglich eine Freisetzung von Interleukin-4 mitverantwortlich ist für die Erkrankung an einer schweren Bronchiolitis, konnten wir in unserer Studie diesen Effekt nicht nachweisen. 54 5. ZUSAMMENFASSUNG 5. ZUSAMMENFASSUNG Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist das Virus, das die meisten Atemwegsinfekte im Kindesalter verursacht. 70% aller Kinder leiden im ersten Lebensjahr an einer RSV-Infektion, die in den meisten Fällen die oberen Atemwege betrifft. Ein kleiner Teil der Kinder (etwa 1%) erleidet eine schwere Bronchiolitis und muss stationär behandelt werden. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die unterschiedliche Klinik der RSV-Infektion mit Abweichungen der zellulären Immunantwort einhergeht. Um den Einfluss des RS-Virus auf dendritische Zellen zu dokumentieren, wurde zunächst ein Modell der primären Immunantwort etabliert, bestehend aus dendritischen Zellen, naiven T-Zellen und dem Superantigen Toxic-Shock-Syndrom-Toxin 1 (TSST 1). Etwa 10% der naiven TZellen exprimieren die T-Zellrezeptorkette Vβ2. Diese Zellen wurden mit TSST 1 stimuliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zellkulturen, die mit RS-Viren infiziert wurden, produzierten signifikant weniger Interferon-γ im Vergleich zu nicht-infizierten Zellkulturen. Im ersten Teil der Studie wurde geprüft, ob die Zellkulturen tatsächlich die primäre Immunantwort imitieren . Naive T-Zellen und dendritische Zellen, gewonnen aus Nabelschnurblut und peripherem Blut im ersten und vierten Lebensjahr, wurden von 13 Kindern isoliert. Nach in vitro Infektion mit dem RS-Virus zeigte sich eine reduzierte Interferon-γ Produktion. Dieses Ergebnis zeigte keine Altersabhängigkeit und war bei jedem Kind individuell stabil. Auch eine im Beobachtungszeitraum erfolgte in vivo RSV-Infektion veränderte das Ergebnis nicht. Die primäre Immunantwort konnte in vitro dargestellt werden. Im zweiten Teil unserer Studie wurden von 26 Kindern, die im Laufe des ersten Lebensjahres wegen einer RSV-Bronchiolitis stationär behandelt wurden, und von 41 gesunden Kontrollkindern dendritische und naive T55 5. ZUSAMMENFASSUNG Zellen aus peripherem Blut gewonnen. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme waren alle 67 Kinder im Mittel ein Jahr alt und gesund. Die Eltern beantworteten vor der Blutentnahme einen Fragebogen, der die Umgebungsfaktoren und die bis zu dem Zeitpunkt aufgetretenen respiratorischen Symptome erfasste. Es wurde bei allen Kindern ein Anti-RSV-IgGELISA-Test im Serum durchgeführt. Anhand des Ergebnisses wurde eine Einteilung in drei Gruppen vorgenommen: Kinder, die nicht mit RSV infiziert waren, Kinder, die Antikörper gegen RSV im Serum aufwiesen, aber nicht stationär behandelt wurden (mild-infizierte Kinder) und Kinder, die an Bronchiolitis erkrankt waren. Nach in vitro-Infektion der Zellkulturen mit RSV wurde die Rate Interferon-γ und Interleukin-4 produzierender Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Kinder mit Bronchiolitis eine signifikant (p<0,001) geringere Rate Interferon-γ produzierender Zellen aufwiesen als die mild-infizierten Kinder. Der Anteil Interferon-γ produzierender Zellen der uninfizierten Kontrollgruppe wies eine weite Streubreite auf, war insgesamt jedoch niedriger (p<0,05) als die Interferon-γ Produktion der Zellen mild infizierter Kinder. Bezüglich der Interleukin-4 Produktion zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Zusätzlich wurden Zellkulturen aller Kinder teils mit polyIC stimuliert oder mit PMA restimuliert. Dies sollte eine maximale Interferon-γ Produktion bewirken. Außerdem wurden Zellkulturen zur Kontrolle weder mit RSV noch mit stimulierenden Substanzen inkubiert. Bei der anschließenden Messung der Rate Interferon-γ produierender Zellen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den drei Gruppen, so dass man bei allen Kindern von den gleichen Ausgangsbedingungen bezüglich der Kapazität der Interferon-γ Produktion ausgehen kann. Erklärt werden können die Ergebnisse der vorliegenden Studie damit, dass ein Zusammenhang zwischen Schwere der RS-Virusinfektion und der zellulären Immunantwort besteht. Unsere Arbeit zeigt, dass eine ho- 56 5. ZUSAMMENFASSUNG he Anzahl Interferon-γ produzierender Zellen im Rahmen der primären Immunantwort vor einer schweren RSV-Infektion schützt. . 57 6. LITERATURVERZEICHNIS 6. LITERATURVERZEICHNIS [1] Aberle JH, Aberle SW, Dworzak MN, Mandl CW, Rebhandl W, Vollnhofer G, Kundi M, Popow-Kraupp T (1999) Reduced interferon – gamma expression in peripheral blood mononuclear cells of infants with severe respiratory syncytial virus disease. Am J Respir Crit Care Med 160(4), 1263-8 [2] Aberle JH, Aberle SW, Pracher E, Hutter HP, Kundi M , PopowKraupp T (2005) Single versus dual respiratory virus infections in hospitalized infants: impact on clinical course of disease and interferon-gamma response. Pediatr Infect Dis J 24(7), 605-10 [3] Aberle JH, Aberle SW, Rebhandl W, Pracher E, Kundi M, PopowKraupp T (2004) Decreased interferon-gamma response in respiratory syncytial virus compared to other respiratory viral infections in infants. Clin Exp Immunol 137(1), 146-50 [4] Aoyagi M, Shimojo N, Sekine K, Nishimuta T, Kohno Y (2003) Respiratory syncytial virus infection suppresses IFN-gamma production of gammadelta T cells. 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Schauer danke ich für die Überlassung des Themas und die engagierte Betreuung meiner Arbeit. Ich danke Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die Einführung in labortechnische Arbeitsweisen und die geduldige Unterstützung während der Laborarbeit. Mein Dank gilt auch Frau Elisa Fuchs für den regen Austausch und die Motivation. Herzlicher Dank gilt meinen Freunden und Kommilitonen, insbesondere Frau Sarah Lange, Herrn Marco Schneider und Herrn Dr. med. Rolf Borchard für ihre Zuverlässigkeit, stetige Motivation und konstruktive Kritik an meiner Arbeit. Danken möchte ich auch meinem Freund Sven Wiegand für seine Unterstützung und seine Geduld sowie seine stete Ermutigung und Aufmunterung in vor allem technisch bedingten schwierigen Situationen. Mein ganz besonderer Dank gilt an dieser Stelle meinen Eltern, Gerlind und Dr. med. Klaus König, die mir das Studium der Humanmedizin ermöglichten und mich zur Fertigstellung dieser Arbeit stets motiviert haben. 70 LEBENSLAUF LEBENSLAUF Susanne König persönliche Daten: Geburtsdatum: 22.08.1980 Geburtsort: Frankfurt am Main Familienstand: Ledig Konfession: Katholisch Schulbildung: 1986-1990 Westerbach-Grundschule Niederhöchstadt 1990-1999 Altkönigschule Kronberg, Gymnasium 1999 Allgemeine Hochschulreife Hochschulbildung: 1999-2005 Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität Bochum 2001 Ärztliche Vorprüfung 2002 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2004 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2005 3. Abschnitt der ärztlichen Prüfung Beruf: seit Januar 2006 Assistenzärztin an der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin St. Josef-Hospital Bochum (Direktor: Prof. Dr. C. Rieger) 71
