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Identifizierung und Charakterisierung von Tumorantigenen
beim Pankreaskarzinom
Andreas Wadle, Boris Kubuschock, Beate Wüllner, Sascha Kleber, Frank Neumann, Gerhard Held,
Michael Pfreundschuh, Christoph Renner
Innere Medizin
Die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit Pankreaskarzinom liegt bei
<5% für alle Stadien zusammengenommen. Ist eine Operation nicht möglich, kann durch Radiation- und Chemotherapie bestenfalls ein minimaler
lebensverlängernder Effekt erwartet
werden. Dabei stellen spezifische immuntherapeutische Strategien aufgrund der zunehmende Erfolge der
letzten Jahre eine vielversprechende
Therapieoption dar. Es liegt daher auf
der Hand, dass bei dieser Erkrankung
neue Therapieoformen gesucht werden
müssen. Voraussetzung für den Einsatz
von Immuntherapien ist die Existenz
geeigneter Tumorantigene, d.h. Zielstrukturen, die sich ausschließlich oder
vorwiegend auf Tumorzellen/-geweben finden, nicht aber auf gesunden
Körperzellen (Abb.1). Solche Tumorantigene würden es ermöglichen, die entsprechenden Immuntherapeutika (tumorspezifische Antikörper bzw. zytotoxische T-Zellen) direkt gegen Tumorzellen zu lenken, ohne dabei gesunde
Organe zu schädigen. Entsprechend ihrem Expressionsmuster und ihrer genetischen Basis können Tumorantigene in
verschiedene Gruppen eingeteilt werden, die im folgenden genannt sind:
onkospermatogonale Antigene, im
angelsächsischen als Cancer Testis Antigene bezeichnet (z.B. die MAGE-Familie) [Scanlan et al., 2002], onkofötale
Antigene (z.B.CEA) [Berinstein, 2002],
Differenzierungsantigene (z.B. Melan
A) [Romero et al., 2002], klonale Antigene (z.B. Immunglobulinidiotypen)
[McCarthy et al., 2003], Antigene bestehend aus viralen Genprodukten (z.B.
E6/E7 von HPV-16) [Harper et al.,
2004], sowie antigene Produkte von
mutierten Genen (z.B. mutiertes p53)
[Offringa et al., 2000], alternativ gespleißten Genen (z.B.LDH C) [Koslowski
et al., 2002], überexprimierten (z.B.
Her-2/neu) [Disis et al., 2004] oder amplifizierten Genen (z.B. eIF-4g) [Brass et
al., 1997]. Solche Tumor-”Targets”bieten sich für Therapien an und wurden
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Pankreaskarzinome sind aufgrund ihrer Biologie und klinischen Manifestation
zum jetzigen Zeitpunkt nur unzureichend zu therapieren und damit von hoher
Priorität für die Entwicklung neuer Therapieansätze. Adenokarzinome des exokrinen Pankreas stellen mit einer jährlichen Inzidenz von ca. 9,5/100 000 und einer
Mortalität von derzeit ca. 8,5/100 000 mit leicht steigender Tendenz die fünfthäufigste Krebstodesursache in Deutschland dar.
molekularbiologisch
charakterisiert
(Untersuchung ihrer Expression auf
RNA- und Proteinebene in diversen
Karzinomen). Zumdem wurden von
diesen Antigenen abstammende, immunogene T- und B-Zellepitope definiert und zur Entwicklung einer therapeutischen Vakzinierung mit z.B. Peptiden oder einer monoklonalen Antikörpertherapie genutzt.
Allerdings sind für das Pankreaskarzinom bisher keine tumorspezifischen
Tumorantigene gefunden worden, die
ohne Einschränkungen als Zielstruktur
für immuntherapeutische Ansätze verwendet werden konnten [Kaufman et
al., 2002]. Die wenigen Tumorantige-
ne, die bekannt sind, sind lediglich tumorassoziiert, d.h. werden zwar auf
Tumorzellen überexprimiert, finden sich
aber auch in normalen Körpergeweben
(z.B. Her-2/neu, MUC-1, CA 19-9, 171A) und stellen somit eine Hauptursache für potenzielle Nebenwirkungen
wie Autoimmunreaktionen dar [Ludewig et al., 2000]. Darüber hinaus haben die Forschungen der letzten Jahre
gezeigt, dass nahezu alle Tumorantigene heterogen im Tumorgewebe repräsentiert sind. Es verdichten sich die Hinweise, dass es wichtig ist, mehr als ein
oder zwei Tumorantigene als Zielstrukturen einer etwaigen Immuntherapie
einzusetzen. Vor dem Hintergrund dieser Entwicklungen ist es daher dringend
Abb.1: Während der Veränderung einer gesunden zur Tumorzelle entstehen
auf der Zelloberfläche neue Strukturen, die vom Immunsystem (durch
Antikörper und T-Zellen) erkannt werden. Diese körpereigene “Abwehrmechanismen” kann man zur Identifikation solcher Strukturen
nutzen. Nach erfolgreicher molekularbiologischer Charakterisierung
kann darauf basierend neue Behandlungsstrategien entwickelt werden.
Universität des Saarlandes
Abb.2: Zur Identifikation und serologischer Charakterisierung von Tumor-Antigene wird
der Vektor pYD1 mit einem induzierbaren
Promoter benutzt. Antigene werden als
streng regulierte Fusionsproteine mit der
Aga-2p-Rezeptorkomponente und einem
His-Tag auf der Hefe-Oberfläche produziert [Wadle et al., 2005a]. Solche Antigene kann man zum Nachweis von autoreaktiven Serum-IgG-Antikörpern nutzen. Zur
Expression-Qualitätskontrolle dieser Antigene auf der Hefeoberfläche kann das Cterminale Penta-His-Epitop des Fusionsproteins mit spezifischen Antikörpern
gefärbt werden.
erforderlich, neue tumorspezifische Tumorantigene für das Pankreaskarzinom
zu identifizieren.
Neue Zielstrukturen
Unser Institut hat vor wenigen Jahren
die SEREX Technologie (serological
identification of antigens by recombinant expression cloning) entwickelt und
damit die Identifizierung einer Vielzahl
neuer Tumorantigene ermöglicht [Sahin
et al., 1995]. Diese Technik ist mittlerweile weltweit anerkannt und hat zur
Identifizierung einer großen Anzahl
(>2000) an neuen Tumorantigenen bei
verschiedenen Tumorentitäten geführt,
die in der Internationalen Krebs-Immunomdatenbank erfasst sind. Leider war
jedoch die Suche nach neuen Tumorantigenen beim Pankreaskarzinom wenig
erfolgreich. Eine kürzlich von uns etablierte Weiterentwicklung der SEREX
Methode basiert auf einem eukaryontischen Expressionssystem in Hefen
(RAYS: recombinant antigen expression
on yeast surface; Abb.2) und erlaubt
sowohl einen viel größeren Probendurchsatz als auch die Identifizierung
magazin forschung 1/2006
konformationsabhängiger
Epitope relevanter Zielstrukturen des erkrankten
Gewebes [Wadle et al.,
2005]. Ein automatisiertes Verfahren mittels ZellSorter und eine verbesserte Proteinexpression
erlauben ein effektiveres
Screening solcher TumorcDNA-Genbanken mit
autoreaktiven hoch-titrigen IgG-Antikörpern aus
dem Serum von Krebspatienten. Auf Hefen exprimierte Proteine liegen in
korrekter Konformation
vor und werden auch
post-translationellen Modifikationen (z.B. Glykosylierung)
unterzogen
[Mischo et al., 2003;
Wadle et al., 2005, Boder
and Wittrup, 1997; Boder
and Wittrup, 2000]. Da
gerade die serologische
Immunantwort
häufig
gegen Konformationsepitope gerichtet ist, ist bei
der Identifikation neuer
Zielstrukturen mit einem
anderen Antigenspektrum zu rechnen.
Zelluläre Immunantwort
Für einige Cancer-Testis-Antigene wurde mittlerweise gezeigt, dass sie nicht
nur eine humorale Immunantwort, sondern auch eine zelluläre T-Zellantwort
auslösen können [Jager et al., 1998;
Ayyoub et al., 2003]. Daraus lässt sich
schliessen, dass SEREX-definierte Antigene für Therapiestrategien mit Antikörpern und als Impfstoffe geeignet
sind. So konnten wir zeigen, dass verschiedene tumorspezifische Antigene,
produziert in der Bäckerhefe, als Impfsubstanz wirksam sind [Wadle et al.,
2005]. Die produzierten Proteine wurden aufgereinigt und spezifischen Zellen des Immunsystems, den “Antigen
präsentierenden Zellen (APCs)” “verfüttert”. Diese antigenpräsentierenden
Zellen (Dendriten und Makrophagen)
haben die Aufgabe, Bruchstücke dieser
Strukturen den Effektorzellen des Immunsystems “zugänglich zu machen”
und somit Immunantworten gegen Tumorstrukturen einzuleiten. Dabei müssen diese Impfstoffe von den APCs aufgenommen, verarbeitet und präsentiert
werden. Vergleichende Analysen mit
bakteriell hergestellten Antigenen zeigten, dass die Potenz eine spezifische
Immunantwort zu induzieren bei “Hefe-produzierten” Proteine deutlich erhöht war (Abb. 5). Diese in der Hefe
produzierten Antigene sollen in der Zukunft bei “Vakzinierungsstudien” eingesetzt werden.
Lösliche Immunantwort
Durch den Nachweis von Antikörpern
gegen das Tumorantigen SCP-1 im Serum von Pankreaskarzinompatienten
lässt sich neben der Vakzinierungstherapie auch eine Antikörper-Therapie
vorstellen [Wadle et al., 2005] (Abb. 34). Zudem konnte die Ziel-Region genauer charakterisiert werden, gegen
welche sich die „humorale“ Immunantwort richtet. Andere Arbeitsgruppen
Dr. Andreas Wadle studierte Biologie an der Universität des Saarlandes mit Abschluss Diplom in der Angewandten Mikrobiologie. Seine Dissertation legte er in
der Onkologischen Abteilung der Inneren Medizin I an
den Universitätskliniken Homburg bei Professor Dr.
Michael Pfreundschuh ab.
Der vorliegende Beitrag vermittelt einen Einblick in die
Arbeit der Forschungsgruppe von Professor Dr. Christoph Renner, der neben dem Autor auch die Wissenschaftler Boris Kubuschock, Beate Wüllner, Sascha Kleber, Frank Neumann, Gerhard Held, Michael Pfreundschuh, Christoph Renner angehören.
Forschungsschwerpunkte dieser Gruppe sind
- Konstruktion von tumorspezifischen, zytotoxischen Antikörpern
- Selektion von spezifischen Fab-Antiköpern aus komplexen Phagen-Banken
- Identifikation neuer tumorassozierter Antigenstrukturen
- Etablierung neuer Vaccinierungsstrategien, auf Hefe basierend
Die Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. C. Renner ist seit ersten Januar an die Universität nach Zürich gewechselt.
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Abb.3: Um autoreaktive Serumantworten gegen
Tumorantigene beim Pankreaskarzinom zu untersuchen, wurden letztendlich 13 CT-Antigene ausgewählt und mit insgesamt 96 Seren von Patienten mit
Pankreaskarzinom inkubiert. Um eine Aussage über
die Spezifität der Reaktionen für Patienten mit Pankreaskarzinom zu erhalten, wurden als Kontrollgruppe
Seren von Patienten mit akuter (n=3) und chronischer Pankreatitis (n=15) sowie Seren von gesunden
Personen (n=48) untersucht. Alle Seren wurden
simultan auf den tumorantigen-exprimierenden
sowie den Aga-2p-Kontrollhefen getestet. Es wurde
dann der Quotient aus Reaktivität des Serums mit
der tumorantigentragenden Hefe und der Reaktiviät
der Kontrollhefe gebildet. Lag der Quotient für das
betreffende Tumorantigen über 2 wurde von einer
positiven Reaktion ausgegangen [Wadle at al.,
2005]. Eine humorale Immunantwort gegen das
Cancer-Testis-Antigen SCP-1 war in 14 von 96
Pankreaskarzinomseren zu finden (14,6%). Für SSX1 fand sich nur 1 positive Antwort in 96 Fällen. Positive Serumantworten gegen weitere Tumorantigene fanden sich nicht. Seren von gesunden Spendern
oder Patienten mit akuter oder chronischer Pankreatitis reagierten nicht mit den SCP-1-Protein Fragmenten.
Abb. 4: Qualitätskontrolle der Antigenexpression des Tumorantigens SCP-1 auf der
Hefeoberfläche. A) Korrekte Expression wurde durch Fluoreszenz-Cytometry mit
einem anti-Histidin Antiköper überprüft. Nichtinduzierte Hefen dienten als Kontrolle. B) Ebenso wurde die korrekte Expression von Aga2p auf der parentalen Hefe
detektiert. C) Diese Hefen wurden nun mit Seren inkubiert, welche autoreaktive
Antikörper gegen tumorspezifische Antigenen aufwiesen. D) Diese spezifische Immunreaktivität konnte durch Verdünnungsreihen nachgewiesen werden. Positive
Reaktionen wurden bis zu einer Serumverdünnung 1:5000 bei hoch reaktiven Seren und 1:1000 bei mittleren Serumreaktionen beobachtet.
Abb. 5: Identifizierte Tumorantigene
wurden in der Bäckerhefe produziert, aufgereinigt und spezifischen
Zellen des Immunsystems verfüttert.
Diese antigenpräsentierenden Zellen
(Dendriten und Makrophagen) haben die Aufgabe, Bruchstücke dieser
Strukturen Effektorzellen des Immunsystems zu “offerieren” und somit Immunantworten gegen Tumorstrukturen einzuleiten. A) Erfolgreiche Antigenpräsentation konnte
nach Verfütterung hefeproduzierter
Antigene durch eine spezifische TZellaktivierung nachgewiesen werden. Die T-Zellreaktion war umso
intensiver, je mehr Tumorantigen
verfüttert wurde (1-4). Nichtrelevante Proteine dienten als Kontrolle
(5-7). B) Unserer Arbeitsgruppe
stand neben der Messung der T-Zellaktivität ein Messinstrument zur
Verfügung um die direkte Präsentationseffizienz zu detektieren. Dieser
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Antikörper bindet spezifisch an präsentierten Tumorantigenen im spezifischen
Kontext der antigenpräsentierenden Zelle. Nur Zellen, an welche das spezifische
Antigen verfüttert wurde, zeigten Reaktivität (graue Kurve).
Universität des Saarlandes
konnten zwar zeigen, dass Antikörper
gegen Tumorantigene wie MUC-1 und
p53 in ähnlicher Frequenz (10-20% der
Patienten) zu finden sind [Hamanaka et
al., 2003; Kotera et al., 1994; Raedle et
al., 1996; Gansauge et al., 1996]. Allerdings waren Antikörper gegen diese
Antigene auch bei gesunden Personen
und Patienten mit chronischer Pankreatitis gefunden worden, so dass hier
nicht von einer tumorspezifischen Serumreaktion gesprochen werden kann.
Der Nachweis von spezifischen autoreaktiven Antikörpern gegen das Tumorantigen SCP-1 in Seren von PankreasKarzinom-Patienten spricht dafür, dass
sich mittels RAYS voraussichtlich auch
bisher nicht bekannte Tumorantigene
identifizieren lassen.
Es ist zu hoffen, dass mit der modifizierten RAYS-Technik weitere potentielle
Tumorantigene identifiziert werden
können, um diese Strukturen durch geeignete Therapieformen anzusteuern.
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