Lipidvermittelte Modifikation der Immunantwort bei Patienten mit
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Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. M. Kemen Dienstort: Evangelisches Krankenhaus Herne Abteilung für Chirurgie Lipidvermittelte Modifikation der Immunantwort bei Patienten mit großen Oberbaucheingriffen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Ikbale Siercks aus Cankiri 2003 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. M. Kemen Koreferent: Prof. Dr. med. W. Schmiegel Tag der Mündlichen Prüfung: 1.07.2003 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung.................................................................................................................. 7 1.1 Ernährung und Immunität................................................................................. 8 1.1.1 Die Ernährung des chirurgischen Patienten............................................ 10 1.1.1.1 Formen der enteralen Diät .................................................................. 11 1.1.2 Die Immunonutrition .............................................................................. 11 1.1.2.1 Arginin ................................................................................................ 12 1.1.2.2 Omega-3-Fettsäuren............................................................................ 12 1.1.2.3 Pyrimidin- und Purinnukleotide.......................................................... 16 1.2 Das Immunsystem........................................................................................... 17 1.2.1 Die natürliche Resistenz ......................................................................... 18 1.2.2 Die humorale Abwehr............................................................................. 18 1.2.2.1 Immunglobuline.................................................................................. 18 1.2.2.2 Komplementsystem ............................................................................ 19 1.2.3 Zelluläre Abwehr .................................................................................... 20 1.2.3.1 Phagozytose ........................................................................................ 20 1.2.3.2 T-Lymphozyten .................................................................................. 20 1.2.3.3 B-Zellen/Plasmazellen ........................................................................ 21 1.2.3.4 Mononukleäre Phagozyten ................................................................. 22 1.2.3.5 NK-Zellen ........................................................................................... 22 1.3 Das System der Mediatoren............................................................................ 23 1.3.1 Eicosanoide Lipidmediatoren ................................................................. 23 1.3.1.1 Metabolismus der Arachidonsäure ..................................................... 23 1.3.1.2 Metabolismus von n-3-Fettsäuren ...................................................... 26 1.3.2 Cytokine.................................................................................................. 29 1.3.2.1 Interleukin 1........................................................................................ 30 1.3.2.2 Tumor-Nekrose-Faktor-α ................................................................... 30 1.3.2.3 Interferon-Gamma .............................................................................. 31 2 Fragestellung........................................................................................................... 32 3 Klinische Studie...................................................................................................... 33 3.1 Patienten und Methode ................................................................................... 33 3.1.1 Studiendesign.......................................................................................... 33 3.1.2 Operationen............................................................................................. 34 3.1.3 Narkoseverfahren.................................................................................... 35 3.1.4 Intensivtherapie....................................................................................... 35 3.1.5 Ernährungstherapie ................................................................................. 35 3.1.5.1 Studiendiäten ...................................................................................... 37 3.1.6 Klinisch orientierte Erfassungsgrößen.................................................... 39 3.1.7 Untersuchung der Leukotriene................................................................ 41 3.1.8 Bestimmung der Fettsäuren EPA und DHA ........................................... 42 3.1.9 Statistische Methoden ............................................................................. 42 4 Ergebnisse............................................................................................................... 43 4.1 Vergleich zwischen Placebo- und Verumgruppe............................................ 43 4.1.1 Patienten-Charakteristika........................................................................ 43 4.1.2 Verträglichkeit der enteralen Ernährung................................................. 43 4.1.3 Diagnosen und Operationen.................................................................... 44 4.1.4 Postoperativer klinischer Verlauf ........................................................... 45 4.1.5 Klinische Komplikationen ...................................................................... 45 4.1.6 Lipidmediatoren...................................................................................... 47 5 6 7 8 9 4.1.6.1 Docosahexaensäure- und Eicosapentaensäurespiegel im Serum........ 47 4.1.6.2 Leukotriene ......................................................................................... 48 4.1.6.2.1 LTB4............................................................................................. 48 4.1.6.2.2 LTB5.............................................................................................. 48 4.1.6.2.3 Verhältnis LTB4/LTB5 .................................................................. 49 4.1.7 Klinische Abschlussparameter................................................................ 49 Diskussion............................................................................................................... 51 5.1 Immunmodulation durch Ernährung............................................................... 51 5.2 Omega-3 Fettsäuren........................................................................................ 53 5.3 Klinische Bedeutung....................................................................................... 56 5.4 Konzept der perioperativen Immunonutrition ................................................ 58 Zusammenfassung .................................................................................................. 61 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 63 Danksagung ............................................................................................................ 81 Lebenslauf............................................................................................................... 82 Abkürzungsverzeichnis 5 Abkürzungsverzeichnis Ak Antikörper APC Antigenpräsentierende Zellen CD-Antigene Cluster of Differentiation CDD Chemisch definierte Diät DHA Docosahexaensäure DNA Desoxyribonucleic Acid ELISA Enzyme linked immuno sorband essay EPA Eicosapentaensäure FC-Anteil Fragment crystallizable FNKJ Feinnadelkatheterjejunostomie FS Fettsäure GMCSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor HETE Hydroxyeikosatetraensäure HPETE Hydroperoxytetraensäure HPEPE Hydroperoxypentaensäure HLA-DR Human Leucozyte Antigen ICU Intensive care unit IFN-Gamma Interferon-Gamma IGM Immunglobulin M IL-1 Interleukin-1 IL-2 Interleukin-2 IL-6 Interleukin-6 kb Kilo Basen kDA Kilo Dalton K-Zelle Killer-Zelle kg/KG Kilogramm pro Körpergewicht LPS Lipopolysaccharid LTB4 Chemotaxin Leukotrien B4 M Mol MHC Major histocompatibility complex MOV Multiorganversagen Abkürzungsverzeichnis 6 NDD Nährstoff definierte Diät NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen PAF Platelet activating factor PGE2 Prostaglandin E2 RES Reticuloendotheliales System RNA Ribonucleic Acid SD Standardabweichung SEM Mittlerer Fehler des Mittelwertes SIRS Systemic inflammatory response syndrome TCR T-Zell-Antigenrezeptor TEN Totale enterale Ernährung Tc Zytotoxischer T-Lymphozyt TH Helfer/Inducer T-Lymphozyt TNF Tumor Nekrose Faktor TPN Totale parenterale Ernährung Ts Suppressor T-Lymphozyt Einleitung 1 7 Einleitung Schwere Verletzungen sowie grosse operative Eingriffe führen zu posttraumatischen Fehlfuktionen des Immunsystems, die durch die Veränderung von spezifischen und unspezifischen Immunfunktionen und eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Infektionen gekennzeichnet sind. Die gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Infektionen stammt aus dem Ungleichgewicht der metabolischen und immunologischen Parameter bedingt durch Traumen, Minderduchblutung von Gewebe, durch den chirurgischen Eingriff an sich, der Operations- und Narkosezeit, dem Blutverlust und dem Vorhandensein anderer Grunderkrankungen [12]. Die Interaktion von verschiedenen mikrobiologischen Pathogenitätsfaktoren mit den Zellen des Immunsystems führt zu Reaktionen, die durch überschiessende Produktionen von inflammatorischen und proinflammatorischen Mediatoren unterhalten werden. Dabei spielen Leukotriene eine wichtige Funktion. Sie haben zweierlei Funktionen. Zum einen sind sie potente proinflammatorische Mediatoren zum anderen dienen sie als Signale für die Regulation von Cytokin Gen-Expression in einem immunregulatorischen Netzwerk [104,151,153]. Die Leukotriene der 4er Serie sind Metaboliten der Arachidonsäure (Omega-6 Fettsäure). Im Gegensatz dazu sind Leukotriene der 5er Serie Stoffwechselprodukte der Eicosapentaensäure (Omega-3 Fettsäure). Sie haben eine geringere biologische Aktivität im Vergleich zu den Leukotrienen der 4er Serie. Viele Untersuchungen zur Ernährung haben sich auf die immunmodulatorische Fähigkeit von speziell zusammengesetzten, enteral verabreichten Diäten konzentriert. Eine mit Arginin, RNA und Omega-3 Fettsäure angereicherte Diät wurde benutzt, um die Eicosanoidsynthese, die Zytokinproduktion und die Immunfunktion zu verändern und so die unerwünschten Immunreaktionen nach einem chirurgischen Eingriff zu vermindern [44,158]. Daly et al. beobachteten bei einer Studie mit Krebspatienten, die eine Immunernährung erhielten, eine signifikante Verbesserung ab dem 7. post- operativen Tag [44]. Kemen et al konnte in einer ähnlichen Studie zeigen, dass Patienten, die an einem Malignom des oberen Gastrointestinaltraktes operiert worden sind, durch eine frühe postoperative Gabe einer immunonutritiven Diät, nach einer Woche postoperativ einen signifikanten Vorteil des humoralen und zellulären Immunsystems zeigten, verglichen mit einer Kontrollgruppe [100]. Diese günstigen Einleitung 8 immunologischen Effekte waren mit einer insgesamten Reduktion der infektiösen Komplikationen verbunden. Eine signifikante Verbesserung trat erst ab dem 5. postoperativen Tag auf [159]. Die Verabreichung der Immunernährung kann eine katabole Stoffwechsellage und die Immunantwort gegenüber Traumen nur verbessern, nicht rückgängig machen. Deshalb scheint der präoperative Beginn der immunologischen Diät durch Verbesserung der immunologischen Ausgangslage und Reduktion der postoperativen Komplikationen am effektivsten zu sein. Braga et al beobachteten nach der perioperativen Gabe der Immundiät eine verbesserte Darmfunktion und eine positive Veränderung der postoperativen Immunsuppression und der Entzündungsreaktionen. Dieselbe Arbeitsgruppe zeigte ebenfalls, dass die postoperativen Komplikationen durch die Vorbehandlung von Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff des Gastrointestinaltraktes unterziehen mussten, mit einer Immunonutrition verringert wurde [25,26]. In dieser Studie soll erstmals eine Veränderung des Verhältnis Leukotrien B4 zu Leukotrien B5 sowie die direkte Konzentrationsveränderung von EPA und DHA im Serum bei Patienten, die perioperativ eine enterale immunnutritive Diät, angereichert mit Omega-3- Fettsäure, RNA und Arginin erhielten, untersucht werden im Vergleich zu einer Kontrollgruppe mit einer isokalorischen und isonitrogenen Ernährungsformel. Ziel dieser Studie ist es herauszuarbeiten, ob eine Modulation der Immunantwort durch die Veränderung von Lipidmediatoren stattgefunden hat und der klinische postoperative Zustand durch die perioperative Gabe dieser enteralen Diät bei Patienten mit tumorbedingten Operationen im oberen Gastrointestinaltrakt positiv beeinflusst wird. Hierzu ist es sinnvoll, einerseits die Lipidmediatoren wie das Verhältnis LTB4/LTB5, die Serumspiegel von EPA und DHA sowie die postoperativen Verläufe in der Gruppe der Immunonutriton mit einer Placebo-Ernährungsformel zu vergleichen. 1.1 Ernährung und Immunität Trotz der Verbesserung der Operationstechniken, Anästhesieverfahren sowie Fortschritten der intensivmedizinischen Überwachung und Versorgung der Patienten, ist die postoperative Morbidität, Mortalität und Länge des Krankenhausaufenthaltes bei mangelernährten im Vergleich zu wohlernährten Patienten bei ähnlichen Operations- Einleitung 9 verfahren für ähnliche Operationsindikationen grösser [59]. In einem medizinisch wichtigen Zusammenhang steht der präoperative Ernährungszustand des Patienten mit einem gut funktionierenden Immunsystem. Studley berichtete erstmals 1936 über den Zusammenhang zwischen präoperativem Gewichtsverlust und operativer Motalität [165]. In weiteren Studien wurde gezeigt, dass eine erhöhte Rate an infektionsbedingten Komplikationen bei unterernährten chirurgischen-und Tumorpatienten auftrat [20,32,39,135]. Ein Gewichtsverlust grösser als 10 % wird mit einem erhöhten Morbiditätsrisiko in Verbindung gebracht [32,165,115]. Es zeigte sich, dass schweres Trauma oder Stress zu einem katabolen Stoffwechselprozess führt, durch den sich Proteinspeicher der Muskulatur erschöpfen und es zu einem rapiden Muskelabbau kommt [182]. Dadurch wird das Abhusten von Sekreten erschwert und gemeinsam mit der oft postoperativ bestehenden Bettlägerigkeit die Entwicklung einer Pneumonie gefördert. Unter dem katabolen Zustand leidet auch die Wundheilung und die Schutzfunktion der Haut und Schleimhäute; es drohen Druckulzera und mit dem Eintreten von Keimen eine invasive Infektion [14]. Die Malnutrition scheint auch eine signifikante Schwächung der körpereigenen Abwehr zu bedingen [34,147]. Postoperativer oder posttraumatischer Stress haben ebenfalls Einfluss auf die Regulation des Immunsystems [142,144,181]. Durch die Schwächung der humoralen und zellulären Immunität durch eine Mangelernährung werden Infektionen prädispositioniert [39,115]. Dabei sind die Antigenpräsentation, die Neutrophilen- und Makrophagenfunktion, die Aktivierung des Komplementsystems und die bakterielle Opsonierung besonders betroffen [115]. Die Entwicklung einer Infektion wiederum führt zu einer katabolen Stoffwechsellage und dies bewirkt erneut eine Immunsuppression [182]. Bei jedem mangelernährten oder kritischen chirurgischen Patienten ist also bis zu einem gewissen Grad mit einer immunologischen Dysfunktion zu rechnen. Daher liegt in einer sorgfältigen Unterstützung der Ernährung ein wesentlicher Teil der Beherrschung von Infektionen und postoperativen Komplikationen. Einleitung 1.1.1 10 Die Ernährung des chirurgischen Patienten Die natürliche Ernährung stellt in der Chirurgie bei Patienten mit Erkrankungen oder Operationen im Bereich des Gastrointestinaltraktes ein großes Problem dar. Die künstliche Ernährung ist ein wichtiger Faktor in der Behandlung mangelernährter Patienten mit konsumierenden Erkrankungen [38]. Mit der parenteralen Ernährung und der enteralen Ernährung stehen zwei sinnvolle sich ergänzende Ernährungskonzepte zur Verfügung. Die Verabreichung der parenteralen Ernährung erfolgt bei einer bedarfsdeckenden Ernährung über einen zentralvenösen Katheter. Die enterale Ernährung wird über nasoenterale Sonden, über perkutan endoskopisch kontrollierte Gastrostomien (PEG) und intraoperativ angelegte Feinnadelkatheterjejunostomien (FNKJ) verabreicht [48,2,30,72,132,134]. Die parenterale Ernährung hat eine bevorzugte Anwendung in der perioperativen Phase gefunden, da es von der digestiven und resorptiven Kapazität des Gastrointestinaltraktes unabhängig ist. In einer Studie mit unterernährten chirurgischen Patienten wurde nach totaler parenteralen Ernährung eine signifikante Reduktion der nichtinfektiösen Komplikationen, wie der Wunddehiszens and Anastomoseninsuffizienz beobachtet [167]. Ungünstige Wirkungen sind dabei die häufiger aufgetretenen metabolischen Entgleisungen [136], die durch das Umgehen des Gastrointestinaltraktes und des Portalkreislaufes zustande kommen. Engmaschiges Monitoring ist deshalb notwendig. Auch bestehen bei der Anlage eines zentralvenösen Katheters katheterbedingte und punktionstechnische Probleme. Zudem kam es im Tiermodell zu vermehrten Bakterientranslokationen durch die Darmbarriere [5] und nach posttraumatischer Applikation bei Traumapatienten zu einer erhöhten Infektionsrate [122], die mit der Translokalisation in Verbindung gebracht wurde. Die enterale Ernährung schützt die Integrität der Darmmukosa und stellt das kostengünstigere Verfahren im Vergleich zur parenteralen Ernährung [121] dar. Wesentliche Nachteile der enteralen Ernährung sind die Komplikationen wie Nausea, Vomitus, Abdominalkrämpfe und Diarrhöen. Kontraindiziert ist die enterale Ernährung bei diffuser Peritonitis, schweren Diarrhöen und Erbrechen und beim Ileus. Ein zu niedriger Blutdruck mit hämodynamischer Instabilität ist mit reduzierter intestinaler Durchblutung verbunden, so dass in der Regel eine niedrigerer Toleranz gegenüber enteraler Ernährung besteht [150] Einleitung 11 1.1.1.1 Formen der enteralen Diät Da künstliche enterale Ernährung eine längerfristge Behandlung darstellt, muss bei den Patienten der Bedarf an sämtlichen Nährstoffen, Elektrolyten, Spurenelementen und Vitaminen gedeckt werden. Bei den heute industriell hergestellten Diäten unterscheidet man nährstoffdefinierte (NND) und chemisch definierte Diäten (CDD). Das Charakteristikum der NND ist das hochmolekulare Substrat. Sie enthalten ein intaktes Protein, Poly- und Oligosaccharide sowie überwiegend langkettige Fettsäuren. Nach Zumischung von Geschmackskomponenten eignen sie sich zur oralen Verabreichung. Auch bei der Applikation in den Magen, das Duodenum und das Jejunum wird die NDD gut vertragen. Die CDD ist aus Elementar- oder fast Elementarkomponenten zusammengesetzt und somit quasi vorverdaut. Nachteile der CDD liegen im schlechten Geschmack, der hohen Osmolarität und dem hohen Preis. Die Indikation zur Gabe einer Oligopeptiddiät besteht bei eingeschränkter Digestion- und Resorptionskapazität [13]. In den letzten Jahren kristallisierte sich der Zusammenhang zwischen einer Mangelernährung und der daraus resultierenden Dysfunktion des Immunsystems heraus [38,15]. Die immunologischen Fehlsteuerungen bei Patienten, die eine enterale oder parenterale Ernährung nach operativen Eingriffen benötigen, werden nur wenig durch die Verabreichung eines enteralen oder parenteralen Standard Protein- und Kaloriensubstrates gebessert. 1.1.2 Der Die Immunonutrition Begriff Immunonutrition wird verwendet, um die Auswirkung einer Ernährungstherapie auf das Immunsystem zu beschreiben. In zahlreichen Studien hat man Substrate untersucht, die nach enteraler oder parenteraler Zufuhr immunologisch wirksam sind. Zu diesen Substraten zählen Arginin, Omega-3-Fettsäuren und RNA. Einleitung 12 1.1.2.1 Arginin Arginin wird als semiessentielle Aminosäure angesehen, die im Kindesalter essentiell ist und bei Patienten mit höhergradigen Verletzungen oder Infektionen nicht ausreichend selbst synthetisiert werden kann [3]. Nach Verletzungen ist sie für Gewebswachstum und Stickstoffbilanz wichtig und wird von allen Geweben für die cytoplasmatische und nukleäre Proteinsynthese verwendet [115]. In Studien wurden in „vitro“- Versuchen eine erhöhte Expression von IL-2, IL-2-Rezeptor und Interferon-γ [8] beobachtet. Bei Tierexperimenten könnte dies ein Grund für die Verstärkung der IL2-Antitumortherapie unter Argininzugabe sein. Dabei wird auch Arginin und seinen im Harnstoffzyklus entstehenden Metaboliten Ornithin zugeschrieben, dass sie einen positiven Effekt auf die T-Zellproliferation und die Produktion von Immunglobulin M und G haben [8,43,44,155]. Bei einem Experiment mit verbrennungsverletzten Meerschweinchen konnte die Überlebensrate erhöht sowie eine verzögerte kuntane Hypersensivitätsreaktion festgestellt werden, die mit einer 2 % Arginin angereicherten Diät ernährt wurden [155]. Bei gesunden Patienten führte in einer Studie eine 30 g Argininzufuhr über 1-2 Wochen zu einer Steigerung der Lymphozytenblastogenese. Eine enterale sowie parenterale Argininsupplementierung verhinderte bei Karzinompatienten in der postoperativen Phase die traumabedingte Hemmung der antigeninduzierbaren Lymphoblastogenese. Auch bei HIV-seropositiven Patienten konnte ein ähnliche positiver Effekt auf das Immunsystem festgestellt werden [8,114]. In einem anderen Tierexperiment steigerte Arginin die Zytotoxigenität der Makrophagen gegenüber Tumorzellen [11, 149] 1.1.2.2 Omega-3-Fettsäuren Omega-3-Fettsäuren gehören wie die Omega-6-Fettsäuren zu den mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Diese Fettsäuren sind essentiell, denn sie können weder von Mensch noch von allen anderen Säugetieren synthetisiert werden. Eine ausreichende exogene Zufuhr über die Nahrung ist lebenswichtig (Tabelle 1.1). Einleitung 13 Tabelle 1.1: Formel und Vorkommen der essentiellen Fettsäuren Fettsäure C-Atome : Doppelbindungen Omega-3-Fettsäure Linolensäure Körper (z.B. Leinöl, Sojaöl) Phospholipide der Zellmembran und der Eikosa- Fischöl 20:5 pentaensäure Lipoproteine, Vorläufer der Eicosanoide nsäure Omega-6-Fettsäure Natur Pflanzliche Öle 18:3 Docosahexae In Vorkommen Linolsäure 22:6 Fischöl 18:2 Pflanzliche Öle Im Nervengewebe Phospholipide der Tierische Fette Arachidon- 20:4 (z.B.Waltran) säure Zellmembran, Vorläufer der Eicosanoide ihren Eigenschaften sind sie unverzichtbare Bestandteile der Membranphospholipiddoppelschicht und üben als Strukturbausteine der Zellmembran [166] viele Funktionen der Zelle aus: Unter anderem werden die Expression von Antigenen und Rezeptoren, enzymale Funktionen [19,57,123,152,162], die zelluläre Adhäsion [31,173] und der transmembranäre Signalstoffwechsel [173] mit Auswirkungen für die Funktion immunkompetenter Zellen [6,119,169] und deren Zielzellen [127,128, 177, 106] beeinflusst. Sie werden als einzige ihrer Stoffklasse zu Lipidmediatoren (Eikosanoiden) verstoffwechselt. Zu den Omega-3-Fettsäuren gehören die Linolensäure, die in pflanzlichen Ölen wie Leinsamen- oder Sojabohnenöl in der Natur vorzufinden ist, die Eicosapentaensäure (EPA) und die Docosahexaensäure (DHA), die aus Meerestieren stammen. Die Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren werden von dem gleichen Enzymsystem (siehe Abbildung 1.1) verstoffwechselt. Obwohl die Omega-3 Fettsäure und die Omega-6 Fettsäure um die Destaurase konkurrieren, Einleitung 14 bevorzugen die 4- und 6-Destaurase die Omega-3 Fettsäuren [127,128, 177]. Bekannte Faktoren, die die Destauraseschritte hemmen sind Altern, Rauchen, Diabetes, hohe Einnahmen von Natrium und Biotinmangel. Calciummangel hingegen kann die Kettenverlängerung von essentiellen Fettsäuren schwächen [106]. Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure sind Präkursoren für Leukotriene und Prostanoide. Eicosapentaensäure (EPA), das Omega-3-Analog der Arachidonsäure, wird kompetitiv auf dem Zyklooxygenase- und Lipoxygenaseweg metabolisiert. Gegenüber Arachidonsäure ist sie sogar ein bevorzugtes Substrat der Lipoxygenase [110,145]. Auf dem Lipoxygenaseweg entstehen aus Eicosapentaensäure (EPA) Leukotriene der 5 er Reihe, wie z.B. das Leukotrien B5 (LTB5). Die zweite Klasse der mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind die Omega- 6-Fettsäuren. Diese Fettsäuren leiten sich von der Linolsäure ab. Linolsäure wird zu Arachidonsäure metabolisiert, die unter Vermittlung der Zyklooxygenase und der Lipoxygenase das Substrat für eine Vielzahl biologisch aktiver Mediatoren darstellt [46,139]. Über den Zyklooxygenaseweg entstehen Prostaglandine und Thromboxane. Die Lipooxygenaseprodukte der Arachidonsäure stellen Hydroxyeikosatetraensäuren, Cysteinylleukotriene und Leukotrien B4 und seine Metabolite dar. Leukotriene spielen eine zentrale Rolle im Ablauf vasoregulativer und inflammatorischer Prozesse. Einleitung Omega-3-Fettsäuren 15 Enzyme α -Linolensäure Omega-3-Fettsäuren Linolsäure 6-Destaurase γ -Linolensäure Octadecatetraenosäure Elongase Dihomo-γLinolensäure Eicosatetraensäure 5-Destaurase Eicosapentaensäure (EPA) Arachidonsäure Elongase Docosapentaensäure Adrensäure 4-Destaurase Docosahexaensäure (DHA) Docosapentaensäure Abbildung 1.1: Metabolismus von Omega-3- und Omega-6-Fettsäuren Schon frühere Untersuchungen weisen darauf hin, dass diätetisch verabreichte Fettsäuren und deren Metabolite verschiedene Immunfunktionen beeinflussen [92]. Hohe Plasmakonzentrationen von EPA und DHA bewirken einen Einbau dieser Omega3 Fettsäuren in die Plasma- und Zellmembrane von Thrombozyten, Erythrocyten, Neutrophilen, Monocyten und Leberzellen. Dies führt zu einer Veränderung des Verhältnisses von Omega-6: Omega-3 Fettsäuren in den Membranen [41,36] zu einer Änderung der Funktionen der Membranen [36] und zu einer verminderten Produktion von IL-1, IL-6 und TNF- α [53,129,130]. Im Human- und Tierversuch konnte die Synthese proinflammatorischer Zytokine [53] wie des Tumornekrosefaktors und verschiedener Interleukine um 30-40% vermindert werden [18,53]. Daly konnte bei einer mit fischölangereicherten Diät eine erhöhte Omega 3:6-Ratio im Plasma und eine verminderte Produktion von PGE2 feststellen [44]. Es stellt sich die Frage, ob nicht durch Austausch diätetischer Omega-6-Fettsäuren gegen Omega-3-Fettsäuren oder Verschiebung des Verhältnisses zugunsten der Omega-3-Fettsäuren die Immun- und Einleitung 16 Entzündungsreaktion allgemein verbessert werden könnte. In einem Tiermodell, in dem die experimentelle Transplantation von Rattenherzen als in vivo-Immunstimulationsmodell verwendet wurde, konnte belegt werden, dass eine Verschiebung des Fettsäureverhältnis zugunsten der Omega-3-Fettsäuren eine Verlängerung der Transplantatabstossungszeit bewirkte [74]. In einem anderen Tierversuch konnte die Überlebensrate nach Endotoxininjektion bei partieller Ernährung mit Fischöl mit hohem Anteil an Omega-3-Fettsäuren deutlich verbessert werden [120]. Umgekehrt zeigte sich in einer Studie über die Auswirkungen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf den Tuberkuloseverlauf im Tierexperiment, dass stärkere Entzündungsreaktionen bei den mit Omega-3-Fettsäure gefütterten Tieren auftraten [157]. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass eine mit Omega-3-Fettsäure angereicherte Diät bei Patienten mit Tumoren, Verbrennungen und großen Operationen signifikant geringere Komplikationsraten und verringerte Krankenhausliegezeiten aufwiesen [23,27,44,67,70,71,101,159]. Auch bei schwer kranken Patienten auf den Intensivpflegestationen konnte dies beobachtet werden [24, 63,64]. In anderen Studien konnten bei traumatisierten Patienten die infektiösen Komplikationen und das Multiorganversagen reduziert werden [28,133,177]. Lee et al zeigten, dass die biologische Aktivität der Metabolite der Arachidonsäure einen größeren Einfluss auf die Entzündungsreaktion haben, als die Metabolite der Omega-3-Fettsäuren Eicosapentaensäure (EPA) und der Docosahexaensäure (DHA) [112]. Leukotrien B5 besitzt ein mehr als 10fach vermindertes granulozytenaktivierendes und chemotaktisches Potential [69,83,111] und konkurriert mit Leukotrien B4 um die Anbindung an den Rezeptor polymorphkernigen Granulozyten [105]. Da Leukotrien B4 einen großen Einfluss auf den Steuerungsmechanismus polymorphkerniger Granulozyten hat, ist eine deutliche Reduktion der Neutrophilenaktion zu erwarten [74].Die Beeinflussung der Arachidonsäurekonzentration und die daraus resultierende Eicosanoidsynthese in immunkompetenten Zellen wird als ein Mechanismus angesehen [102]. 1.1.2.3 Pyrimidin- und Purinnukleotide Nukleotide sind Bausteine der DNA und RNA. Sie sind aus drei Komponenten zusammengesetzt, einer Pentose einer Base und einer Phosphorsäure. Die wichtigste Einleitung 17 Quelle stellt die Nahrungsaufnahme und die Reutilisation dieser Bausteine vom Organismus dar, obwohl der Organismus in der Lage ist, sie selbst zu synthetisieren [154]. Nukleotide sind für die Purin- und Pyrimidinsynthetisierenden, sich schnell teilenden Zellen wichtig [57,108]. Solche Gewebe mit hoher Zellteilungsaktivität, wie die lymphatischen Gewebe oder die intestinalen Epithelzellen, scheinen auf die Zufuhr von Pyrimidinen und Purinen aus anderen Organen angewiesen zu sein, um ihre optimale Funktionsfähigkeitt zu behalten [21,163]. Nukleotide beinflussen die normale und pathologische Entwicklung der intestinalen Schleimhaut, deren Funktion, Adaptation und Wiederherstellung. Bei optimaler Versorgung der Darmschleimhaut, helfen sie die Nahrungsaufnahme zu fördern [113]. In einem Tierexperiment an Mäusen steigerte eine mit Nukleotiden angereicherte Diät bei Mäusen die Aktivität der NK-Zellen und verbesserte die Überlebenschance bei Kandida- oder Staphylokokken induzierten Sepsis [57,108]. Auf die hohe Stoffwechselaktivität des lymphatischen Gewebes scheinen Nukleotide bei der Proliferation und Differenzierung der Zellen einen stimulierenden Einfluss zu haben, und bei kritischen Patienten kann der Einfluss von Nukeotiden als Bestandteil der Ernährung auf die Funktion des Immunsystems und der Darmmukosa hinsichtlich der Translokation von Krankheitserregern und deren Toxinen eine erhebliche Bedeutung erlangen [108,180]. 1.2 Das Immunsystem Das Immunsystem ist der Träger der körpereigenen Abwehrmechanismen und ist ein komplexes interagierendes System spezialisierter Zellen und Organe, die in der Lage sind, eigen und fremd zu unterscheiden. Die Zellen des Immunsystems – Lymphozyten und mononukleäre Phagozyten – bilden zusammen ein Organ von einer Gesamtmasse von ca 1-1.5 kg bei einem jugendlichen erwachsenen Menschen. Der Organismus verteidigt seine Integrität durch drei Abwehrbarrieren: die natürliche Resistenz, die humorale und die zelluläre Abwehr [141]. Einleitung 18 1.2.1 Die natürliche Resistenz Die natürliche Resistenz ist die Basisabwehr, die angeboren und unspezifisch ist. Sie umfasst alle physikalischen und chemischen Schutzfunktionen des Körpers. Die intakte innere und äussere Körperoberfläche, die Flimmerepithelien der Schleimhaut, der vorherrschende pH-Wert, unspezifische Enzyme der Schleimhäute sowie die schützende Wirkung der Flora bieten Schutz vor der Invasion von Mikroorganismen. Nach der Überwindung der äusseren Barrieren treffen Krankheitserreger auf die zellulären und humoralen Abwehrmechanismen des Körpers. 1.2.2 Die humorale Abwehr Die Antikörper kommen in den flüssigen Bestandteilen des Blutes (Plasma) und in extrazellulären Flüssigkeiten vor. Da die Körperflüssigkeiten früher als Humores bezeichnet wurden, spricht man dann von der humoralen Immunität. Diese humorale Immunantwort durch die spezifischen Antikörper wird ergänzt durch das Komplementsystem: Sie komplettiert die antibakterielle Aktivität der Antikörper [93]. 1.2.2.1 Immunglobuline Serumproteine kann man in eine Albumin- und Globulinfraktion auftrennen, wobei letzteres Antikörper enthält, die etwa 20 % der gesamten Plasmaproteine ausmacht. Antkörper, sogenannte Immunglobuline, werden von antigen-spezifischen B- Lymphozyten, den Plasmazellen gebildet [80]. Jedes Immunglobulinmonomer besitzt die gleiche Grundkonfiguration, bestehend aus einer Y-förmigen Struktur aus zwei identischen leichten Ketten (Lambda- oder Kappaketten) und zwei identischen schweren Ketten. Die schweren Ketten existieren in fünf Hauptvarianten: µ, δ, γ, α, ε. Je nachdem welche schwere Kette verwendet wurde heissen die Immunglobulinklassen IgM, IgD, IgG, IgA oder IgE. Bei den Immunglobulinen IgA und IgM kann die Monomergrundstruktur verdoppelt bzw. verfünffacht (Dimere bzw. Pentamere) auftreten [98]. Antikörper bieten in vierfacher Weise Schutz vor Infektionen: durch Schutz vor Adhäsion von Krankheitserregern an Schleimhäute, Neutralisation von Einleitung bakteriellen 19 Toxinen, Opsonierung von Bakterien und Aktivierung des Komplementsystems [13]. 1.2.2.2 Komplementsystem Der zweite Pfeiler des humoralen Abwehrsystems ist das Komplementsystem, bestehend aus 11 Plasmaproteine. Die Aktivierung löst eine Kaskade von Reaktionen aus, von denen jede zur Aktivierung der nächsten Komplementkomponente führt. Einige aktivierte Komplementproteine binden kovalent an Bakterien und opsonisieren sie so für die Aufnahme von Phagozyten. Es gibt zwei Wege das Komplementsystem zu aktivieren. Beim klassischen Weg geschieht dies durch eine Antikörperbindung an Antigene. Er ist deshalb ein Teil der humoralen Immunantwort. Der alternative Weg kann ausgelöst werden, wenn eine spontan aktivierte Komplementkomponente an die Oberfläche eines Pathogens bindet. Er ist daher ein Teil des angeborenen Immunsystems. Der alternative Weg bildet auch eine Verstärkerschleife des klassischen Weges der Komplementaktivierung, da eine der aktivierten Komponenten des klassischen Weges auch den alternativen Weg in Gang setzen kann [93]. Die einzelnen Komponenten üben in ihrer aktivierten Form in vielfacher Hinsicht Einfluss auf die Entzündungsreaktion aus: gerichtete Bewegung von polymorphkernigen Leukozyten und Eosinophilen, Aktivierung der Leukozyten mit erhöhter Adhäsion an Endothelzellen, wodurch es zu einer vermehrten Randständigkeit und Aggregation der Leukozyten in den Gefässen kommt. Der oxidative Stoffwechsel wird mit konsekutiver Entstehung von Wasserstoffperoxiden in der Umgebung von Leukozyten und Freisetzung lysosomaler Enzyme angeregt. Das Endprodukt der Komplementkaskade ist ein Makromolekülkomplex, der sich sowohl in die Lipidschicht von Zellmembranen einsenken kann und so zur osmotischen Lyse der Zelle als auch zur Abtötung gramnegativer Bakterien führt [13]. Einleitung 1.2.3 20 Zelluläre Abwehr Die zelluläre Immunabwehr kann unspezifisch durch Phagozytose oder spezifisch durch die lymphozytären Reaktionen wirksam werden. 1.2.3.1 Phagozytose Die professionelle Phagozytose wird durch die polymorphkernigen, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten, die auch als Mikrophagen bezeichnet werden, sowie durch die mononukleären Phagozyten bewerkstelligt. Die Phagozyten sind zur Aufnahme partikulärer Substanzen (Phagozytose) und gelöster Stoffe (Pinozytose) befähigt. Der Kontakt kommt über Rezeptoren auf der Membran der Phagozyten zustande. Sobald Partikel an der Membran haften, werden sie durch Umfliessen ins Innere aufgenommen und befinden sich im Zytoplasma in einer von einer Membran umgebenden Vakuole, dem sog. Phagosom. Diese fusionieren mit Enzymen vollbepackten Zellstrukturen, den Lysosomen, zu Phagolysosom und machen die Partikel in dem Phagosom unschädlich [13,98]. Bei diesem Vorgang entstehen durch Aktivierung des oxidativen Stoffwechsels hochtoxische Sauerstoffverbindungen. Neben diesen anorganischen Verbindungen werden auch eine Reihe von Enzymen wie Elastase, Fibrinogenaktivator, Proteasen, Lysozym und andere freigesetzt. 1.2.3.2 T-Lymphozyten Eine Gruppe von Lymphozyten erlangt ihre biologische Funktionsfähigkeit erst durch einen Reifungsprozess im Thymus und werden deshalb als T-Lymphozyten bezeichnet [80]. Ihr Anteil an den Lymphozyten des strömenden Blutes oder der Lymphgefässe beträgt ungefähr 60-80% [64], sie rezirkulieren sehr stark. Die wichtigsten Aufgaben von T-Lymphozyten sind in der Tabelle 1.2 zusammengefasst: Einleitung 21 Tabelle 1.2: T-Zell vermittelte Immunphänomene T-Zell Wirkungen 1. Abwehr intrazellulärer Keime 2. Abtötung virusinfizierter Zellen 3. Helferfunktion bei der humoralen Immunität 4. Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ 5. Transplantatabstossung 6. Tumorüberwachung 7. Suppression einer Immunantwort Die menschlichen T-Lymphozyten besitzen zwei Typen von membranständigen Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche, die durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden können. Sie ähneln hinsichtlich ihres Aufbaus dem Antikörper-Molekül, werden im Gegensatz zu ihnen allerdings niemals sezerniert [98]. Diese Rezeptoren sind mit anderen Polypeptiden auf der T-Zelloberfläche assoziert: mit dem mehrkettigen CD3Komplex (Cluster of Differentiation ) und, je nach Subpopulation der T-Zelle mit dem CD4- (Helfer-Funktion) oder dem CD8-Molekül (Zytolytische oder SuppressorFunktion). T-Lymphozyten erkennen Fremdantigen nicht in dessen Nativzustand, sondern das Antigen muss vielmehr auf der Oberfläche von Wirtszellen erscheinen und zwar in Assoziation mit körpereigenen Proteinen, die vom Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) kodiert werden, den MHC Klasse I- oder Klasse II- Molekülen. CD4+ T-Zellen erkennen Fremdantigen plus Klasse II-Molekül und CD8+ T-Zellen erkennen Fremdantigen plus Klasse I-Molekül [80]. 1.2.3.3 B-Zellen/Plasmazellen Beim Menschen findet in der Leber des Feten und im Knochenmark des Erwachsenen (Bursa-Äquivalent) die B-Zell-Differenzierung statt. B-Lymphozyten sind für die humoralen Immunreaktionen verantwortlich. Ihr Anteil an den Lymphozyten des strömenden Blutes oder der Lymphgefässe beträgt ungefähr 10-20% [66]. Sie wandeln sich nach Bindung eines Antigens in Antikörper sezernierende Zellen um und reifen Einleitung 22 dabei zu Plasmazellen [66]. Die Subpopulation der B-Zellen werden nach ihrer Fähigkeit unterschieden, verschiedene Antikörperklassen zu sezernieren (Antikörperklasse IgG, IgM, IgA, IgD und IgE). Zum anderen können sich B-Zellen zu Gedächtniszellen differenzieren, die lediglich noch ein Isotop von Immunglobulin an ihrer Oberfläche exprimieren. Die langlebigen Gedächtnishilfen werden beim wiederholten Kontakt mit einem bestimmten Antigen stimuliert [55]. 1.2.3.4 Mononukleäre Phagozyten Der Begriff Mononukleäre Phagozyten umfasst alle phagozytisch aktiven Zellen, die von Monozyten abstammen. Makrophagen nennt man Blutmonozyten, die ins Gewebe eingewandert sind. Makrophagen der verschiedenen Körperhöhlen und Gewebe sind z.B. Kupffer´sche-Zellen der Leber, Histiozyten, Osteoklasten und Mikrogliazellen. Als langlebige Zellen können Makrophagen Monate überleben und vielseitige Funktionen ausüben, wie Phagozytose, die intrazelluläre Keimabtötung, die Sekretion biologisch aktiver Moleküle und die Antigenpräsentation [66]. Die aktivierten Makrophagen produzieren Substanzen, die für die Entzündungsreaktion bedeutungsvoll sind: Interleukin-1 (IL-1) und Tumor Nekrose Faktor (TNF) sowie chemotaktische Faktoren und Akut-Phase-Protein [13]. 1.2.3.5 NK-Zellen Natürliche Killerzellen (NK) entfalten zytolytische Aktivität gegen eine Reihe von Zellen unabhängig von einer vorangegangenen Sensibilisierung [84,96]. Klonierte NKZellen haben kein einheitliches Spektrum von Zielzellen und es ist immer nochr nicht klar, ob es sich bei den NK-Zellen um eine eigene Zelllinie mit klonal exprimierter Rezeptordiversität handelt. Die zytotoxische Aktivität ist nicht an den Haupthistokompatibilitäts-Komplex gebunden. NK-Zellen besitzen kein klassisches immunologisches Gedächtnis [73]. Einleitung 1.3 23 Das System der Mediatoren Mediatoren sind biologische Botenstoffe, die mit spezifischen Rezeptoren an Zielzellen oder Organen reagieren und so zur sekundären Aktivierung von biochemischen Prozessen an den Zielzellen führen. Es wird zwischen freien und zellgebundenen Mediatoren unterschieden. Bei den freien handelt es sich um Proteine und Polypeptide, die gewöhnlich in inaktiver Form im Blut zirkulieren und nach Umwandlung eines Proenzyms in seinen aktiven Zustand kaskadenartig aktiviert werden. Eine besondere Rolle im Zusammenspiel der Immunantwort kommt in der vorliegenden Arbeit zwei Mediatoren zu, dem Leukotrien B4 und B5 [97,143]. 1.3.1 Eicosanoide Lipidmediatoren Die biologisch aktiven Metabolite der Arachidonsäure wie Prostaglandine, Leukotriene, Thromboxan und weitere wenig charakterisierte Produkte werden unter dem Begriff Eicosanoide zusammengefasst. Diese Lipidmediatoren sind Oxygenationsprodukte der Omega-6-Fettsäure Arachidonsäure. Eicosanoide sind keine präformierten Mediatoren, sondern können erst nach Arachidonsäurefreisetzung durch die Aktivität der Cyclooxygenase oder der Lipoxygenase von Endothelzellen, Thrombozyten und allen Leukozyten mit Ausnahme der Lymphozyten neu gebildet werden. Ihre Auslöser sind nahezu alles Stimuli, die auch eine Entzündung in Gang setzen und unterhalten. Dazu gehören vor allem: phagozytierte Mikroorganismen mit und ohne Opsonisierung, Antigen-Antikörper-Komplexe, Komplementprodukte, bakterielle Lipopolysaccharide und Exotoxine, chemotaktische Faktoren und die Zytokine IL1, TNF- α und GM-CSF. Eicosanoide wirken streng lokalisiert am Ort ihrer Freisetzung und werden rasch zu inaktiven Metaboliten ungewandelt oder werden nach Eintritt in die Blutzirkulation durch Inaktivierung im Lungengewebe an einer systemischen Aktivität gehindert [66]. 1.3.1.1 Metabolismus der Arachidonsäure Arachidonsäure wird unter Vermittlung der Zyklooxygenase und der Lipoxygenase in eine Vielzahl biologisch aktiver Mediatoren umgewandelt [46,139]. Einleitung 24 a) Zyklooxygenaseprodukte der Arachidonsäure Initial entsteht durch Bis-Dioxygenierung der Arachidonsäure die instabilen Endoperoxide Prostaglandin G2 und H2. Aus dem Schlüsselsubstrat H2 werden verschiedene Prostaglandine und Thromboxan metabolisiert (Abbildung 1.2) unter Vermittlung von Synthetasen, Isomerasen und Reduktasen, deren Verteilungsmuster organ- und zellspezifisch ist [74,139]. Die Umwandlungen von PGH2 in HHT und Malondialdehyd, von PGI2 in 6-keto- PGF2α und von TXA2 in TXB2 geschehen spontan [74]. Die verschiedenen Prostanoide können teilweise antagonistische Effekte bewirken (Tabelle 1.3) z.B. TXA2 thrombozytenaggregatorisch und PGE2 und PGI2 Plättchenaggretation inhibierend. Exogen Omega-6-Fettsäuren Endogen Phospholipide Arachidonsäure PGG2 PGH2 TXA2 TXB2 PGD2 PGE2 PGF2α PGI2 HHT2 6-KetoPGF1α MDA Abbildung 1.2: Arachidonsäuremetabolismus über den Zyklooxygenaseweg Einleitung 25 b) Lipoxygenaseprodukte der Arachidonsäure Auf diesem Reaktionsweg entstehen hauptsächlich Cysteinylleukotrienen (LTC4, LTD4, LTE4) und LTB4 (Abbildung 1.3). Dabei wird Arachidonsäure zunächst zu Hydroperoxide (HPETEs) oxidiert, die rasch durch Hydroxyperoxidasen zu Monohydroxyfettsäuren (HETEs) umgewandelt werden. Letztere entfalten biologische Eigenschaften (z.B. Chemotaxis [118]) oder werden als einzige der Lipoxygenaseprodukte in Membranphospholipide eingebaut [62]. Aus 5-HPETE entsteht Dehydrase-abhängig das extrem instabile LTA4, dass weiter zu Cysteinylleukotrienen und zu LTB4 umgewandelt wird. In neutrophilen Granulozyten führt die zellspezifische Enzymausstattung zum biologisch hochaktiven LTB4 [62,82]. Seine herausragende Wirkung ist neben der Förderung der granulozytären Adhärenz und Diapedese die chemotaktische Aktivität [156]. In Mastzellen entstehen vorzugsweise Cysteinylleukotriene [179]. Die biologische Funktion von Cysteinylleukotrienen ist verantwortlich für eine spasmogene Aktivität, die früher unter dem Begriff “slow reacting substance of anaphylaxis“ zusammengefasst wurde [42,53,66,91,]. Insgesamt spielen Leukotriene eine inflammatorischer Prozesse. zentrale Rolle im Ablauf vasoregulativer und Einleitung 26 Exogen Omega-6-Fettsäuren Endogen Phospholipide Arachidonsäure 5-HPETE 5-HETE LTA4 LTB4 LTC4 LTD4 LTE4 Abbildung 1.3: Arachidonsäuremetabolismus über den Lipoxygenaseweg 1.3.1.2 Metabolismus von n-3-Fettsäuren Eikosapentaensäure, das Omega-3-Analog der Arachidonsäure, wird kompetitiv auf dem Zyklooxygenase- und Lipoxygenaseweg metabolisiert. Gegenüber Arachidonsäure ist sie sogar ein bevorzugtes Substrat der Lipoxygenase [110,145]. a) Zyklooxygenaseprodukte der Eicosapentaensäure Zyklooxygenaseprodukte der Eicosapentaensäure (3er-Reihe) haben gegenüber Zyklooxygenaseprodukten der Arachidonsäure (2er-Reihe) ein verändertes Wirkungs- Einleitung profil [59,138,176]. 27 Thromboxan A3 beispielsweise ist wesentlich weniger proaggregatorisch und vasokonstriktiv als Thromboxan A2. b) Lipoxygenaseprodukte der Eicosapentaensäure Auf dem Lipoxygenaseweg kann die Eicosapentaensäure trotz einer zusätzlichen Doppelbindung in Analogie zur Arachidonsäure zu Leukotriene der 5er Reihe (LTB5, LTC5, LTD5, LTE5) (Abbildung 1.4) mit teilweise antagonistischen Wirkungen [61] gegenüber den Arachidonsäurederivaten der 4er Reihe verstoffwechselt werden. LTB5 besitzt eine 90 % geringere biologische Aktivität hinsichtlich ihrer inflammatorischen, thromboseerzeugenden und vasokonstriktorischen Wirkung als das vergleichbare Produkt der Arachidonsäure [51]. Leukotrien B5 konkuriert mit Leukotrien B4 um die Anbindung an den Rezeptoren polymorphkernigen Granulozyten [105]. Einleitung 28 Exogen Omega-3-Fettsäuren Endogen Phospholipide Eicosapentaensäure 5-HPETE 5-HEPE LTA5 spontan LTB5 6-trans-LTB5 LTC5 OH-LTB5 6-trans-epi-LTB5 LTD5 COOH-LTB5 5,6-DiHEPEs LTE5 Abbildung 1.4: Eicosapentaensäuremetabolismus über den Lipoxygenaseweg Einleitung 29 Tabelle 1.3: Übersicht der Wirkung der wichtigsten Lipidmediatoren Lipidmediator Zyklooxygenaseprodukte der Arachidonsäure Thromboxan A2 Prostaglandin D2 Wirkung Vasokonstriktion PMN-Aktivierung Vasokonstriktion Vasodilatation Prostaglandin E2 Hyperalgesie Fieber PMN-Inaktivierung Vasodilatation Prostaglandin I2 Hyperalgesie Lipooxygenaseprodukte der Eikosapentaensäure Lipooxygenaseprodukte der Arachidonsäure PMN-Thrombozyten-Inhibition 1.3.2 5-HETE PMN-Aktivierung Chemotaxis Chemotaxis Leukotrien B4 Leukozytenadhärenz PMN-Aktivierung Vasokonstriktion Cyteinylleukotriene Kontraktion glatter MuskelzellenBronchospasmus Chemotaxis Leukotrien B5 Vasokonstriktion PMN-Aktivierung Cytokine Zytokine sind kleine, lösliche Glykoproteine, die von einer Zelle gebildet werden und das Verhalten oder die Eigenschaften einer anderen Zelle verändern. Sie sind Antigen- Einleitung 30 unspezifisch, besitzen aber eine gewisse Funktionsspezifität, d.h. sie induzieren in ihren Zielzellen eine bestimmte Einzelfunktion [80]. Sie werden von vielen Zellen, nicht nur denen des Immunsystems, freigesetzt. Die meisten Zytokine wirken lokal und unterstützen so membrangebundene Effektoren auf den spezifischen Zielzellen, mit denen sie in Kontakt sind. T-Helferzellen (TH2) sezernieren IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10, die alle B-Zellen aktivieren. Inflammatorische T-Zellen (TH1) bilden Interferon-γ (IFNγ), das wichtigste makrophagenaktivierende Cytokin, und TNF-β, das auf einige Zellen direkt cytotoxisch wirkt. Einige Cytokine agieren jedoch auch über eine Entfernung. IL-3 und GM-CSF zum Beispiel, die von beiden Typen von CD4-T-Effektorzellen gebildet werden, helfen bei einer Infektion, Effektorzellen zu rekrutieren. Sie wirken auf Knochenmarkzellen und stimulieren so die Myelopoese, also die Produktion von Makrophagen und Granulocyten. Das sind wichtige Effektorzellen der humoralen und der zellvermittelten Immunität [93]. 1.3.2.1 Interleukin 1 Interleukin 1 (IL-1) ist ein Monokin, das hauptsächlich von Makrophagen gebildet und sezerniert wird. Auch können B-Lymphozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Gliazellen, Fibroblasten, Mesangialzellen und Astrozyten IL-1 synthetisieren. Es spielt bei der Stimulation von T- Helferzellen (TH2) eine wesentliche Rolle. Darüber hinaus induziert IL-1 eine grosse Zahl anderer Effekte. Es wirkt u.a. auf B-Lymphozyten, Hepatozyten, Synovialzellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Osteoklasten und Endothelzellen. Als endogenes Pyrogen löst IL-1 im Wärmezentrum des ZNS die Fieberreaktion aus. Durch seine Wirkung auf Hepatozyten vermittelt es die Akutphasenreaktion. Schliesslich induziert IL-1 die Sektretion von Fibrinogen, Kollagenase und Prostaglandinen. Viele dieser Faktoren sind am Zustandekommen der Entzündung beteiligt. IL-1 ist somit ein wichtiger Entzündungsmediator [80]. 1.3.2.2 Tumor-Nekrose-Faktor-α Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wird unter physiologischen Bedingungen von Makrophagen, T-Zellen und NK-Zellen nach Stimulation mit Lipopolysacchariden Einleitung 31 sezerniert. Stimulierte periphere (polymorphkernige) Neutrophile, aber auch nicht stimulierte Zellen, wie Astrozyten, glatte Muskelzellen und Fibroblasten sezernieren ebenfalls TNF-α [117]. In vielerlei Hinsicht wirkt TNF-α ähnlich wie IL-1. Es induziert Fieber und wirkt immunregulatorisch. TNF-α ist mit Kachektin, welches für kachektische Zustände verantwortllich ist, identisch. Es ist entscheidend an der Ausbildung von Granulomen beteiligt. Weiterhin ist TNF-α im wesentlichen für den septischen Schock zuständig und wirkt stark nekrotisierend auf Tumorzellen [80]. 1.3.2.3 Interferon-Gamma Interferone sind körpereigene Proteine, die ein grosses Spektrum an biologischen Wirkungen aufweisen. Man unterscheidet α -, β- und γ- Interferon. Interferon-α wird von Monozyten, Makrophagen und B-Zellen, Interferon-β von Fibroblasten und Interferon-γ von T-Zellen gebildet [80]. Interferone heften sich an Rezeptoren von Organ- und Gewebszellen an und lösen eine Vielzahl von Wirkungen aus, die nicht sehr selektiv sind. Sie sind regulatorische Proteine der Zellphysiologie mit antiviralen, immunstimulierenden und tumorhemmenden Eigenschaften. In einem spezieshomologen Wirt wird die Synthese von nahezu allen Virusarten blockiert [80]. Interferon-γ ist ein Glykoprotein, zusammengesetzt aus 46 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 20-25 kDa und wird fast ausschliesslich nach vorausgegangener spezifischer Aktivierung von aktivierten T-Lymphozyten produziert [66,137]. Interferon-γ wirkt aktivierend auf die antigen-unspezifischen Effektorzellen des Abwehrsystems, wie z.B. Lymphozyten, NK-Zellen, Makrophagen und bewirkt die vermehrte Expression von MHC- Antigenen der Klasse I und II, die eine Rolle bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen spielen könnten [95,137]. Aufgrund der nicht sehr selektiven Wirkung kann eine hochdosierte, lang dauernde Interferon-Therapie Nebenwirkungen zeigen, wie Fieber, Schädigung der Blutbildung der Nieren und Leber [80]. Fragestellung 2 32 Fragestellung Die Bedeutung der Leukotriene als Lipidmediatoren der Immunreaktion im Rahmen verschiedener immunsupprimierender Krankheitszustände wie Tumoren, operative Eingriffe, Infektionen und Verletzungen hat eine grosses theoretisches und klinisches Potential. So ist durch Messung der Leukotrienkonzentration möglich, Informationen über die traumainduzierte Immunreaktion zu gewinnen. Im Rahmen dieser Studie sollte der Einfluss einer perioperativ verabreichten enteralen immunnutritiven Diät, angereichert mit Omega-3- Fettsäure, RNA und Arginin bei Patienten mit Karzinomen im oberen Gastrointestinaltrakt untersucht werden im Vergleich zu einer Kontrollgruppe mit einer isokalorischen und isonitrogenen Ernährungsformel. Die Fragen im Einzelnen: Welchen Einfluss hat eine mit Arginin-, RNA- und Omega-3 Fettsäure supplementierte enterale Diät auf die Plasmakonzentration der Fettsäuren EPA und DHA? Wie verändern sich durch die perioperative Ernährung die Lipidmediatoren LTB4 und LTB5 und somit das Verhältnis LTB4/LTB5? Kann eine perioperativ verabreichte immunonutritive Diät den postoperativen klinischen Verlauf beeinflussen? Klinische Studie 3 3.1 33 Klinische Studie Patienten und Methode In die Studie wurden Patienten vom Januar 1995 bis zum November 1995 aufgenommen, die sich nach histologischer Sicherung eines Karzinoms einem ausgedehnten Oberbaucheingriff (Ösophagusresektionen, Gastrektomien, subtotale Magenresektionen mit Lymphadenektomien, Duodenohemipankreatektomien) unterziehen mussten. In einem ausführlichen Aufklärungsgespräch wurden die Patienten über die geplanten Untersuchungen umfassend informiert und die Studienteilnahme durch eine Einverständniserklärung bestätigt. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. 3.1.1 Studiendesign Das Studiendesign war prospektiv, doppelblind, randomisiert und placebokontrolliert angelegt. Die Doppelblindheit wurde durch das äußerlich gleiche Aussehen der Placebolösung und der Verumlösung sichergestellt. Die Randomisierung der Patienten wurde vor der Operation mit einem Zufallscomputerprogramm festgelegt, und die Patienten wurden in eine experimentelle Verum-Gruppe und in eine Placebo-KontrollGruppe eingeteilt. Die Einschlusskriterien beinhalteten Patienten zwischen 40 - 80 Jahren, bei denen wegen eines Karzinoms eines der obengenannten Operationsverfahren durchgeführt werden mußte und die ihr Einverständnis zur Anlage einer Katheterjejunostomie gaben. Die Patienten erklärten sich bereit, präoperativ während des stationären Aufenthaltes neben der normalen Nahrung eine zusätzliche Ernährung oral einzunehmen, deren Gabe dann postoperativ über einen Feinnadelkatheter fortgesetzt werden würde. Ausschlusskriterien waren eine bis drei Monate vor der Operation durchgeführte Steroid-, Chemo- und Radiotherapie. Eine anamnestisch bekannte Schwangerschaft, ein insulinpflichtiger Diabetes mellitus oder eine höhergradige Niereninsuffizienz (Crea > 2,0 mg/dl) galten ebenfalls als Ausschlusskriterien. Die Untersuchungen dauerten vom 5. präoperativen Tag bis zum 10. postoperativen Tag. Die biometrische Planung war auf 30 Patienten angelegt. Die Tabelle 3.1 zeigt die anthropometrischen Patientendaten. Klinische Studie 34 Tabelle 3.1: Anthropometrische Patientendaten. (X±SEM) Kontrollgruppe Verumgruppe 16 14 62 ± 17 60 ± 14 5:11 6:8 76 ± 15 72 ± 14 Karnofski-Index (%) 87.5 ± 8.6 89.3 ± 8.3 Intraoperative Bluttransfusion 1.2 ± 2.1 1.1 ± 1.9 Ösophagusresektion 4 4 Subtotale Magenresektion 4 2 Gastrektomie 4 6 Duodenohemipankreatektomie 4 2 5.8 ± 2.7 5.7 ± 1.7 Patientenzahl Alter Geschlecht (w:m) Körpergewicht Operative Eingriffe: Mittlere Operationsdauer (h) 3.1.2 Operationen Bei den Patienten mit einem Ösophaguskarzinom wurde je nach Tumorlokalisation und Ausdehnung eine transthorakale oder eine transmediastinale Ösophagusresektion durchgeführt. Durch eine Magenschlauchbildung mit einer kollaren Ösophagogastrostomie wurde in allen Fällen die Kontinuitätswiederherstellung gesichert. Der hochgezogene Magen wurde dabei retrosternal oder im Ösophagusbett geführt. Ein ösophago-duodenales Jejunuminterponat wurde als ein Magenersatz bei Patienten mit einem Magenkarzinom angelegt, bei denen eine Gastrektomie indiziert war. Die Wiederherstellung der gastrointestinalen Passage nach subtotaler Magenresektion erfolgte in Form einer Y-förmigen Gastroenterostomie nach Roux. Bei der Duodenohemipankreatektomie wurde der Magen samt Pylorus erhalten und es erfolgte eine gastrojejunale und hepaticojejunale Anastomose sowie eine Pankreatogastrostomie. Eine Vagotomie oder eine Pankreasschwanzgangokklusion wurde nicht durchgeführt. Zum Ende der Operation wurde allen Patienten in die erste Jejunumschlinge eine Feinnadelkatheterjejunostomie (FNKJ) plaziert. Perioperativ erhielten die Patienten eine Klinische Studie 35 Antibiotikaprophylaxe mit Cefuroxim, die bei der Narkoseeinleitung begonnen wurde und ggf. vier Stunden nach Beginn der Operation wiederholt wurde. 3.1.3 Narkoseverfahren Die Operationsnarkosen wurden in Absprache mit den Anästhesisten standardisiert. Es wurde jeweils ein balanziertes Verfahren mit einem 02 / Lachgasgemisch von 35 - 50 % / 50 – 65 %, Isoflurane als Narkosegas und eine kontinuierliche Relaxation mit Atnacurium besilat angewandt. Für die Analgesie kam zusätzlich ein Periduralkatheter zur Anwendung. 3.1.4 Intensivtherapie Postoperativ wurden intensivmedizinischen alle Patienten Regime im Rahmen unterzogen. Neben der Studie der demselben perioperativen Kurzzeitantibiotikaprophylaxe erfolgte keine Langzeitprophylaxe oder eine sogenannte „antibiotische Abdeckung“. Eine Antibiotikagabe erfolgte nur als gezielte Therapie bei nachgewiesener Infektion. Auf eine Immunglobulingabe wurde während des Studienverlaufs gänzlich verzichtet. Die Substitution von Albumin erfolgte unterhalb eines Grenzwertes von 20 g/dl und die von Antithrombin ΙΙΙ ab einem Grenzwert von 50 %. 3.1.5 Ernährungstherapie Nach der stationären Aufnahme und nach Abschluß der Diagnostik wurde sowohl die Studiengruppe als auch die Kontrollgruppe neben der normalen Krankenhausnahrung mit den Studiendiäten zusätzlich über den Zeitraum fünf Tagen vor dem operativen Eingriff versorgt. Beide Gruppen sollten bis zum Operationszeitpunkt ein Gesamtvolumen von 5000 ml der oral einzunehmenden Verum- oder Placebolösung trinken und damit eine zusätzliche Gesamtenergiedichte von 5000 kcal in 5 Tagen erhalten. Die postoperative enterale Ernährung begann 12 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff über den intraoperativ platzierten FNKJ. Die enterale Ernährung begann, bezogen auf 70 kg Körpergewicht, mit 20 ml/h in den ersten postoperativen Klinische Studie 36 Tagen und erreichte nach einer Anpassungsphase durchschnittlich am 5. postoperativen Tag, entsprechend der Regeneration des Dünndarms und dem Rückgang der katabolen Stoffwechsellage, die Zielmenge von 80 ml/h (entsprechend 2000 kcal/Tag). Bei den Patienten mit Flüssigkeitsdefiziten wurden diese parenteral durch eine 5 % Dextrose-, isotone Kochsalz- oder andere medizinisch indizierte Elektrolytlösungen ausgeglichen. Zwischen dem 5. und dem 7. postoperativen Tag wurde überlappend mit dem oralen Nahrungsaufbau begonnen, beginnend mit flüssiger Kost. Keiner der Patienten erhielten eine andere parenterale Ernährung vor oder nach dem operativem Eingriff (Abbildung 3.1). Zwischen dem 1. und 10. postoperativen Tag wurden die Studiendiäten und ab dem 11. postoperativen Tag eine konventionelle NDD eingesetzt. Täglich wurden die Patienten untersucht und die Befunde dokumentiert. Das Gewicht wurde zweimal wöchentlich bestimmt. Gastrointestinale Beschwerden wie z.B. Nausea oder Erbrechen, die einer antiemetischen Therapie bedurften oder eine Diarrhoe wurden notiert. Bei mässigen bis schweren Erscheinungsformen wurde die Nährstoffzufuhr reduziert oder kurzfristig (<12 Stunden) unterbrochen. Enterale Standarddiät 90 80 70 60 Energie / J x 10^5 Enterale Studiendiät Orale Standarddiät 50 40 30 20 10 Orale Studiendiät 0 -5 -4 -3 -2 -1 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tag Abbildung 3.1: Perioperative Energiezufuhr bezogen auf einen 70 kg schweren Patienten Klinische Studie 37 3.1.5.1 Studiendiäten Beide Studiendiäten basierten auf dem gleichen nährstoffdefinierten Grundgerüst mit 53 kcal % Kohlenhydraten, 22 kcal % Eiweiß und 25 kcal % Fett. Dieses Grundgerüst enthielt pro 100 ml 0.3 Maltose und 13.4 g Polysaccharide und war lactosefrei. Die Eiweißkomponente bestand aus hochwertigem Milcheiweiß mit 17 essentiellen und nicht essentiellen Aminosäuren (Tabelle 3.2). Das Fettsäurespektrum wies pro 100 ml 1.66 g gesättigte Fettsäuren, wobei der Anteil mittelkettiger Triglyzeride 0.6 g / 100 ml betrug. Der Anteil einfach ungesättigter und mehrfach ungesättigter Fettsäuren betrug jeweils 0.57 g / 100 ml. Das Vitaminspektrum beinhaltete alle fettlöslichen und wasserlöslichen Vitamine (Tabelle 3.3) und ebenfalls die in der Tabelle 3.4 und Tabelle 3.5 aufgeführten Mineralstoffe und Spurenelemente. Tabelle 3.2: Aminogramm des Nährstoffdefinierten Grundgerüst der Studiendiäten g/100 ml Diät Essentielle und nicht essentielle Aminosäuren Isoleucin 0.20 Leucin 0.40 Valin 0.26 Lysin 0.33 Phenylalanin 0.21 Tyrosin 0.20 Thyreonin 0.19 Methionin 0.11 Tryptophan 0.04 Histidin 0.12 Arginin 0.14 Glutamin 0.96 Alanin 0.13 Glycin 0.09 Serin 0.26 Prolin 0.47 Asparaginsäure 0.30 Tabelle 3.3: Vitaminzusammensetzung der Studiendiäten pro 100 ml Vitamine Vitamin A mg 0.1 Vitamin B12 mg 0.5 Vitamin D mg 0.67 Vitamin C mg 6.7 Vitamin E mg 1.33 Biotin mg 10 Vitamin K mg 7 Folsäure mg 0.02 Vitamin B1 mg 0.12 Niacin mg 1.6 Vitamin B2 mg 0.17 Pantothsäure mg 0.8 Vitamin B6 mg 0.15 Klinische Studie 38 Tabelle 3.4: Mineralstoffe der Studiendiäten pro 100 ml Mineralstoffe Einheit Natrium 110 4.8 mg mmol Kalium 134 3.4 mg mmol Calcium 80 2 mg mmol Phosphor 72 2.3 mg mmol Magnesium 27 1.1 mg mmol Chlorid 159 5 mg mmol Tabelle 3.5: Spurenelemente der Studiendiäten pro 100 ml Spurenelemente Einheit Eisen 1.2 mg Zink 1.5 mg Kupfer 0.17 mg Mangan 0.2 mg Fluor 0.16 mg Jod 15 µg Chrom 10 µg Molybdän 20 µg Selen 4.6 µg Die Unterschiede zwischen den beiden Diäten bestanden in der Zusammensetzung bestimmter Aminosäuren, der RNA-Nukleotide, der Kohlenhydratmengen und der Fettsäuren. So wurde der Verumdiät 1,24 g Arginin pro 100 ml beigemischt. Zur Aufrechterhaltung der Isonitrogenität enthielt die Kontrolllösung, eine entsprechend hohe Menge der vier nicht essentiellen Aminosäuren Serin, Glyzin, Alanin und Prolin. Klinische Studie 39 Diese vier nicht essentiellen Aminosäuren wurden ausgewählt, da bei ihnen keine speziellen immunologischen Effekte bekannt sind. Weitere Unterschiede bestanden darin, dass die Verumlösung im Gegensatz zur Kontrolllösung pro 100 ml 0.13 g Purin- und Pyrimidinnukleotide und 11.8 % des Gesamtfettanteiles bestanden aus Omega-3 Fettsäuren und 8,6 % aus Omega-6 Fettsäuren. Die Placebodiät enthielt zum Ausgleich der Isokalorität einen entsprechend hohen Anteil an Omega-6 Fettsäuren (25.7 %). Somit waren die beiden Diäten hinsichtlich ihres Stickstoffgehaltes und ihrer Energiedichte gleich und unterschieden sich nur in ihrer Osmolarität (Tabelle 3.6). Tabelle 3.6: Besonderheiten der Verum- und Placebodiät pro 100 ml Placebo Gesamtprotein (g) 5.58 7 Milcheiweis (g) 4.34 4.34 Arginin (g) 1.24 - Glycine (g) 0.77 Serin (g) 0.93 Prolin (g) 0.45 Alanin (g) 0.51 RNA-Nukleotide (g) 0.13 - Gesamtfette (g) 2.8 2.8 Omega-6-FS (g) 0.24 0.72 Omega-3-FS (g) 0.33 - Kohlenhydrate (g) 13.4 12 (mOsm/l) 59.2 97.4 (kJ) 418 418 Osmolarität Energiedichte 3.1.6 Verum Klinisch orientierte Erfassungsgrößen Präoperativ wurden Alters- und Geschlechtverteilung, die Körpergröße und das aktuelle Gewicht erfasst. Außerdem wurde die mittlere Trinkmenge von Verum- und Klinische Studie 40 Placebolösung dokumentiert. Zur Erfassung des präoperativen Ernährungsstatus wurde der Nutrition-Risk-Index nach der Formel Istgewicht g Nutrition-Risk-Index = 1,519 ⋅ Serumalbumin + 41,7 ⋅ übliches Gewicht l errechnet. Von den intraoperativ erhobenen Parametern erschienen neben der Operationsart die Operationsdauer, der Blutverlust sowie die intraoperative Erythrozytensubstitution besonders wichtig. Zusätzlich wurde die Menge an kolloiden und kristalloiden Lösungen registriert. Im Anschluss an die Operation wurde die Nachbeatmungsdauer der Patienten erfasst. In den ersten 10 Tagen nach dem operativen Eingriff wird täglich die Gesamtmenge an parenteral und enteral zugeführter Flüssigkeit, bzw. Nährlösung sowie die Substitution von Erythrozyten dokumentiert. Zweimal täglich erfolgte bei allen Patienten eine klinische Untersuchung unter besonderer Berücksichtigung des Abdominalbefundes hinsichtlich Meteorismus, Peristaltik und geäußerten Beschwerden (Vomitus, Krämpfe, etc.). Neben der Stuhlfrequenz erfassten wir die Stuhlkonsistenz und Stuhlmenge. Als Diarrhoe wurden mehr als drei dünnflüssige Stühle in 24 Stunden eingestuft. Der weitere klinische Verlauf der Patienten wurde durch Dokumentation der infektiösen und septischen Komplikationen sowie der Wundheilungsstörungen festgehalten. Als Wundheilungsstörung wurde die Ausbildung eines punktionswürdigen Seroms oder Hämatoms gewertet. Als Wundinfektion galt eine Eiteransammlung, die durch Wundspaltung behandelt werden musste. Anastomoseninsuffizienzen wurden dann als solche eingestuft, wenn sie radiologisch durch Kontrastmittelaussparung nachweisbar waren. Als eine Harnwegsinfektion galt eine Bakteriurie > 1000 Keime pro ml und eine positive Kultur. Ein röntgenologisches Infiltrat mit entsprechendem Auskultationsbefund und klinischen Symptomen der Entzündung (Temperaturerhöhung, Leukozytenerhöhung) werteten wir als Pneumonie. Die Diagnose Sepsis stellten wir, wenn innerhalb von 24 Stunden drei der nachfolgend aufgeführten Kriterien (< 5000/ml), unreife erfüllt waren: Leukozytose Leukozyten > 20 %, (> 15000/ml), Thrombopenie Leukopenie (< 100000/ml), Klinische Studie 41 Thrombozytenabfall > 20 % in 24 Stunden, Fieber > 38,5 °C (rektal), bekannter Herd, positive Blutkultur. An Abschlussdaten wurde das Entlassungsgewicht, der Karnofsky-Index, die Gesamtliegedauer sowie die Intensivliegedauer erfasst. Zusätzlich erfolgte die Berechnung des Nutrition Risk-Index am 10. postoperativen Tag. 3.1.7 Untersuchung der Leukotriene Bei allen dokumentierten Patienten wurde präoperativ, intraoperativ mit Hautnaht sowie am 1., 5. und 10. postoperativen Tag venöses Blut abgenommen. Die Durchführung der Leukotrienmessungen erfolgte im Institut für Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität-Bochum unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. W. König. Fünfzig Milliliter durch EDTA antikoaguliertes Blut wird zunächst durch Isolation eines thrombozytenreichen Plasmas (Zentrifugation bei 1285 G, 20 Min bei 21 °C) von den Thrombozyten befreit. Der thrombozytenarme Plasmaüberstand wird mit der zellulären Fraktion resuspendiert. Die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten werden anschließend auf einem Ficoll-Gradienten und nachfolgender Dextransedimentation separiert. Dann erfolgt die Stimulation der polymorphkernigen Granulozyten mit Ca-Ionophor (A23187) in der Anwesenheit von 1 mmol / l Ca und 0.5 mmol Mg bei 37 °C. Zur Leukotrienanalyse werden nach einer Inkubationszeit von 20 Min. bei 37 °C 3 ml Aceton/Methanol-Gemisch den Proben hinzugefügt. Anschließend werden die Proben bei –70 °C für zwei Stunden gelagert. Nach der Gefrierperiode werden sie erneut bei 2000 G zwanzig Minuten lang zentrifugiert und der gewonnene Überstand durch Lyophilisierung dampfgetrocknet. Der Rückstand wird in einem 600 Mikroliter Methanol-Wasser-Gemisch gelöst und für drei Stunden bei -70 °C aufbewahrt. In 200 µl-Portionen wird die Leukotrienanalyse auf einem analytischen HPCL-System (high performance liquid chromatography) durchgeführt. Die Identifizierung und Quantifizierung der Leukotriene erfolgen durch synthetisch hergestellte Referenzseren. Klinische Studie 42 3.1.8 Bestimmung der Fettsäuren EPA und DHA Die Durchführung der Fettsäuremessungen erfolgte im Institut für Ernährungswissenschaft der Technischen Universität München, Weihenstephan unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. G. Wolfram. Das Serum-Phospholipid-Fettsäuremuster wird im „Liquid Gaschromatographen“ bestimmt. Von einem Lipidextrakt werden zuerst die Phospholipide durch eine Dünnschichtchromatographie von den anderen Lipiden getrennt. Anschließend werden die Fettsäurenmethylester mit 5 % Methanolhydrochloridsäure und Acethylsäuremethylester erzeugt. Schließlich wird die FettsäuremethylesterAnalyse in einem Gaschromatographen (HP 5890, Hewlett Packard) unter Verwendung von geschmolzenen Silicium-Kapillarsäulen (Modell CP-Si-88; Chrompack, Frankfurt) durchgeführt. 3.1.9 Statistische Methoden Angegeben werden im Folgenden immer die Mittelwerte x und der mittlere Fehler des Mittelwertes (SEM). Zur Auswertung der Studienendpunkte kam der Fischer´s-ExaktTest und die Varianzanalyse mit Berücksichtigung von Messwiederholungen (ANOVA) mit nachgeschaltetem T-Test zur Anwendung. Bei allen weiteren Studienzielen wurde die Varianzanalyse (ANOVA) und bei Unterschieden zwischen den Ernährungsgruppen zusätzlich der T-Test benutzt. Da alle Untersuchungsparameter eine annähernd symmetrische Verteilung hatten und kein Anhalt für schwerwiegende Varianzinhomogenität bestand, wurden für alle Variablen die untransformierten Werte verwandt. Signifikanzaussagen erfolgten auf dem 5 %- und dem 1 % Niveau. Ergebnisse 4 43 Ergebnisse 4.1 4.1.1 Vergleich zwischen Placebo- und Verumgruppe Patienten-Charakteristika In der ersten Phase der Studienplanung wurden 32 Patienten in die Studie aufgenommen. Hiervon mussten zwei Patienten wegen Änderung der therapeutischen Maßnahmen ausgeschlossen werden. Diese Patienten erhielten zwar 5 Tage lang die immunonutritive Diät, danach wurde aber beschlossen, diese Patienten nicht zu operieren, sondern bei Ihnen eine Radiatio und eine Chemotherapie durchzuführen. So wurden 30 Patienten in die Auswertung aufgenommen. Auf die zu untersuchende Verumgruppe, die die supplementierte Diät erhielt, entfielen deshalb 14 Patienten, auf die Placebo-Kontrollgruppe entfielen 16 Patienten. Es gab im Vergleich zwischen Kontroll- und Verumgruppe keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Eingangskriterien Alter, Geschlecht und Körpergewicht. Tabelle 4.1: Präoperative Patientenkenngrößen bei allen Patienten, der Placebo-(P) und der Verumgruppe(V). (X±SEM) alle P V (n=30) (n=16) (n=14) Alter (Jahre) 61±16 62±17 60±14 Ist-Körpergewicht (kg) 75±14 76±15 72±14 Weiblich 11 5 6 Männlich 19 11 8 104±9 105±9 103±8 Nutrition-Risk-Index 4.1.2 Verträglichkeit der enteralen Ernährung Während des gesamten Studienverlaufes wurden beide Diäten gut toleriert. In keiner Gruppe traten Unverträglichkeitsreaktionen auf, die zum Abbruch der enteralen Diätzufuhr geführt hätten. Ergebnisse 4.1.3 44 Diagnosen und Operationen Alle 30 Patienten wurden wegen bösartigen Neoplasien operiert. Es lag 8 mal ein Ösophaguskarzinom, 16 mal ein Magenkarzinom und 6 mal ein Pankreaskarzinom vor. Unter Berücksichtigung der Histologie, der Tumorlokalisation und -ausbreitung ergaben sich hieraus, die in der Tabelle 4.2 dargestellten Operationsverfahren. Tabelle 4.2: Operationsverfahren bei allen Patienten, der Verum- und Placebogruppe alle P V n=30 n=16 n=14 Ösophagusresektionen 8 4 4 Gastrektomien 10 4 6 Subtotale Magenresektionen 6 4 2 Duodenohemipankreatektomien 6 4 2 Die Durchschnittliche Operationsdauer betrug 5,8 Stunden und der durchschnittliche Blutverlust in dieser Zeit lag bei 962 ml. Der Blutverlust wurde mit 1,2 Erythrozytenkonzentrate substutiert. Die intraoperative Gesamtflüssigkeitszufuhr betrug durchschnittlich 4900 ml (Tabelle 4.3). Tabelle 4.3: Tabelle Intraoperative Patientenkenngrößen bei allen Patienten, der Placebo- (P) und der Verumgruppe (V). (X±SEM) alle P V n=30 n=16 n=14 OP. Dauer (h) 5.8±2.2 5.8±2.7 5.7±1.7 Blutverlust (ml) 962±742 1000±847 918±630 Erythrozytenkonzentratgabe 1.2±2.0 1.2±2.1 1.1±1.9 Volumengabe gesamt (ml) 4900±1900 4950±2100 4800±1700 Kristalloide (ml) 3700±1700 3800±1700 3490±1750 Kolloide (ml) 1200±900 1100±600 1300±1100 Ergebnisse 4.1.4 45 Postoperativer klinischer Verlauf Kein Unterschied bestand postoperativ hinsichtlich der parenteralen Infusionszufuhr und dem oralen Kostaufbau. Die Nachbeatmungsdauer war in der Verumgruppe mit 30 Stunden kürzer als in der Placebogruppe mit 70 Stunden (Tabelle 4.4). Der orale Kostaufbau mit der Gabe von festen Speisen wurde im Durchschnitt nach 7.6 Tagen begonnen. Einen Tag zuvor erhielten die Patienten meistens oral Tee und kohlensäurefreies Mineralwasser (Tabelle 4.4). Tabelle 4.4: Postoperative Patientenkenngrößen. (X±SEM) Postoperative alle P V Patientenkenngrößen n=30 n=16 n=14 Volumengabe gesamt (ml) 2600±1000 2800±1100 2200±700 Nachbeatmungsdauer (h) 51±88 70±105 30±62 Oraler Kostaufbau (Tage) (feste Speisen) 7.6±2.9 7.6±4.0 7.8±2.6 Stuhlgang (Tage) 5.1±2.3 5.6±2.6 4.1±1.1 4.1.5 Klinische Komplikationen Bis zum 10. postoperativen Tag verfolgten wir das klinische Bild der Patienten unter Berücksichtigung des Auftretens klinisch manifester Komplikationen. Bei 8 von den 30 Patienten traten postoperative Komplikationen auf. Aus der Placebogruppe waren 5 und aus der Verumgruppe 3 Patienten betroffen. Von Komplikationen sprach man, wenn Wundheilungsstörungen (Wundinfekt, Anastomoseninsuffizienz) und infektiösen Komplikationen (Pneumonie, Harnwegsinfekt, Sepsis) auftraten, da hier evtl. ein immunologischer Zusammenhang zu erwarten ist [9,17,56,131]. Zwei Patienten verstarben während des Krankenhausaufenthaltes. Beide wurden obduziert. Einmal lag ein Multiorganversagen im Rahmen von multiplen Organmetastasen eines primären Adenokarzinoms des Pankreaskopfbereiches vor. Ein weiterer Patient verstarb an einem Multiorganversagen, das durch eine schwere postoperative SIRS (systemic inflammatory response syndrom) herzuleiten war. Da Ergebnisse 46 beide Patienten nach dem 10. postoperativen Tag verstarben, wurden die kompletten Untersuchungsergebnisse mit in die Studie aufgenommen. Die häufigste postoperative Komplikation war die Pneumonie gefolgt vom Harnwegsinfekt. Das Sepsissyndrom entwickelte sich einmal auf dem Boden einer Anastomoseninsuffizienz, einmal konnte für diese Komplikation kein Fokus gefunden werden (Tabelle 4.5). Tabelle 4.5: Häufigkeit klinischer Komplikationen bei großen Oberbaucheingriffen (n=30) Komplikationen n P V Pneumonie 5 3 2 Harnwegsinfekt 3 2 1 Sepsis 1 1 0 Wundinfekt 1 0 1 Anastomoseninsuffizienz 1 1 0 Letalität 2 2 0 Wenn eine postoperative Komplikation eintrat, kam sie durchschnittlich zwischen dem 5. und 6. postoperativen Tag klinisch in Erscheinung (Tabelle 4.6). Tabelle 4.6: Postoperativer Verlauf bei Patienten mit großen Oberbaucheingriffen (n=30) Postoperativer Verlauf n % Ohne Komplikation 22 73,3 Mit Komplikation 8 26,7 Klinische Manifestation der Komplikation (p. op. Tag) 5.1 ± 2.5 Bei den 30 Patienten lag 8 mal ein Ösophaguskarzinom, 6 mal ein Pankreaskarzinom und 16 mal ein Magenkarzinom vor. Bei den Patienten aus der Komplikationsgruppe wurden, die in der Tabelle 4.7 dargestellten Operationsverfahren durchgeführt. Ergebnisse 47 Tabelle 4.7: Durchgeführte Operationen bei Patienten mit Komplikationen (n=8). 4.1.6 Operationen n Ösophagusresektion 1 Gastrektomien 2 Subtotale Magenresektionen 3 Duodenohemipankreatektomien 2 Lipidmediatoren 4.1.6.1 Docosahexaensäure- und Eicosapentaensäurespiegel im Serum Nach der Beendigung der präoperativen Ernährungsphase sind die Serumspiegel der beiden Omega-3-Fettsäuren EPA und DHA, berechnet in Prozentanteil der Gesamtfettsäuren ± SEM, signifikant höher in der Verumgruppe im Vergleich zur Placebogruppe. EPA der Verumgruppe mit 0.66 % ± 0.17 % vs.0.25 % ± 0.08 %, p = 0.04 und DHA der Verumgruppe mit 1.88 % ± 0.41 % vs. 1.07 % ± 0.36 %, p = 0.04. In der Gruppe mit der immunsupplementierten Diät werden die signifikant erhöhten Serumspiegel von EPH und DHA bis zum 10. postoperativen Tag beibehalten. EPA der Verumgruppe mit 0.66 % ± 0.16 % vs.0.18 % ± 0.03 %, p = 0.02 und DHA der Verumgruppe mit 2.3 % ± 0.46 % vs. 0.61 % ± 0.07 %, p = 0.005. Ergebnisse 48 EPA Standarddiät EPA Studiendiät DHA Standarddiät DHA Studiendiät 2.500 * p<0.05 * p <0,05 % der Gesamtfettsäuren 2.000 1.500 * 1.000 * * * 0.500 * * * * 1 5 10 -5 0 Tag Abbildung 4.1: Präoperative und postoperative Serumspiegel von EPA und DHA bei Patienten mit Verum- und Placebodiät. 4.1.6.2 Leukotriene 4.1.6.2.1 LTB4 Die Analyse der Fähigkeit der Leukozyten LTB4 zu bilden zeigt, dass in beiden Gruppen kein statistisch signifikanter Unterschied an allen Untersuchungstagen bestand. 4.1.6.2.2 LTB5 Die mit der Nahrung aufgenommenen Omega-3 Fettsäuren führen zu der Erzeugung der jeweiligen Lipidmediatoren (z.B. LTB5). Eine signifikante Steigerung der Leukotriene Ergebnisse 49 der 5er Reihe war nach zellulärer Stimulation in der immunonutritiven Diätgruppe zu beobachten ohne einen begleitenden Abfall der Konzentration der Leukotriene der 4er Reihe (LTB4). 4.1.6.2.3 Verhältnis LTB4/LTB5 Bei gleichen Ausgangswerten sinkt das Verhältnis LTB4/LTB5 signifikant nach der Gabe der immunnutritiven Diät im Gegensatz zu den Werten der Placebogruppe. Das signifikant erniedrigte Verhältnis von LTB4/LTB5 hielt bis zum 10. postoperativen Tag an (Abbildung 4.2). Standarddiät 40 Studiendiät Perioperativ verabreichte enterale Ernährung 30 20 p<0.05 10 p<0.05 p<0.01 0 präoperativ OP 1. Tag 5. Tag 10. Tag Abbildung 4.2: Perioperatives Verhältnis LTB4/LTB5 nach Ca-IonophorStimulation bei Patienten mit Verumdiät und Placebodiät 4.1.7 Klinische Abschlussparameter Das Körpergewicht aller Patienten lag am 10. postoperativen Tag bei 73 kg. Das Körpergewicht betrug in der Placebogruppe 75 kg und lag damit um 3.8 % unter dem Ausgangsgewicht. In der Verumgruppe betrug das Ausgangs- und Entlassungsgewicht 71 kg. Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen bestand nicht. Ähnlich verhielt sich der Nutrition- Risk-Index. Die Liegedauer auf der 10. Tag Ergebnisse 50 Intensivstation betrug im Durchschnitt 16 Tage und die Gesamtliegedauer 48 Tage. In der Placebogruppe lag die Gesamtliegedauer 6 Tage und die Liegedauer auf der Intensivstation 7 Tage höher. Bei der Verumgruppe lag die Gesamtliegedauer 7 Tage und die Liegedauer auf der Intensivstation 9 Tage niedriger als die durchschnittlichen Werte. Somit lag die Gesamtliegedauer 13 Tage und die Liegedauer auf der Intensivstation 16 Tage höher als in der Verumgruppe (Tabelle 4.8). Tabelle 4.8: Abschlussparameter bei allen Patienten, der Placebo- (P) und Verumgruppe (V). (X±SEM) Abschlussparameter alle P V n=30 n=16 n=14 Körpergewicht (kg) (10. postop. Tag) 73 ± 14 76 ± 13 71 ± 14 Gesamtliegedauer (Tage) 48 ± 35 54 ± 44 41 ± 20 Intensivliegedauer (Tage) 16 ± 32 23 ± 42 7 ± 11 Karnofsky-Index % (Entlassungstag) 77 ± 6.8 77.7 ± 6 76.4 ± 7.5 85.7 ± 12.3 84.6 ± 15.1 86.9 ± 8.6 Nutrition Risk-Index (10. postop. Tag) Diskussion 5 5.1 51 Diskussion Immunmodulation durch Ernährung Traumen und chirurgische Eingriffe können schwere Veränderungen vom Immunsystem verursachen, die zu einer erhöhten postoperativen entzündlichen und septischen Komplikation führen können [125]. Die Reihenfolge der proinflammatorischen Kaskade führt beginnend mit dem chirurgischen Eingriff, in den ersten postoperativen Tagen zu einer Lähmung des Immunsystems. In der Gesamtheit entsteht ein Patientenkollektiv, dessen Abwehrmechanismen so ernsthaft durchbrochen worden sind, dass selbst wenig aggressive Keime wie hochgradig pathogene Keime wirken können. Onkologische Patienten mit einem Karzinom im oberen Gastrointestinaltrakt sind zudem Risikopatienten für eine Mangelernährung mit resultierender zusätzlicher Schwächung des Immunsystems [15,38,50,99,140]. Deshalb ist bei Tumorpatienten, die sich aufgrund ihrer Erkrankung einem chirurgischen Eingriff unterziehen, die Kombination aus Mangelernährung und Immunschwäche von grosser Bedeutung für den postoperativen Verlauf [44]. Dabei spielt eine unterstützende Ernährung eine lebenserhaltende Rolle in der Vorbeugung und Behandlung von Mangelernährung bei risikoreichen, kritisch kranken Patienten [37,103]. In verschiedenen Studien zeigte sich, dass dabei die sehr kranken Patienten von einer immunonutritiven Diät profitieren [186]. Mit der parenteralen und enteralen Ernährungstherapie stehen zwei Konzepte zur Verfügung, die sich gegenseitig ergänzen. Eine frühzeitige postoperative enterale Ernährung stellt im Vergleich zu einer parenteralen Ernährung die physiologischere, einfacher anwendbare, komplikationsärmere und wirtschaftlichere Methode dar [5,86,121,136]. Viele Untersuchungen [89] der enteralen Ernährung haben sich darauf konzentriert, das Immunsystems bei Verletzungen über speziell zusammengesetzte enterale Diäten zu verändern. Immunonutrition bestehend aus Nährstoffen wie Arginin, RNA und Omega3 Fettsäuren sind benutzt worden, um die Eicosanoidsynthese, Cytokinproduktion und Diskussion 52 Immunantwort zu verändern mit dem Versuch die unerwünschten Immunreaktionen, die auf einen chirurgischen Eingriff folgen zu limitieren [44,158]. In Tierexperimenten hat sich gezeigt, dass Arginin essentiell für Gewebewachstum und -Heilung ist. Auch steigerte Arginin die NK-Zellaktivität und die Tumortoxizität von Makrophagen [186]. In Studien von Barbul und Reynolds mit einer mit Arginin angereicherten Diät hatten Patienten eine verbesserte T-Zellfunktion als in der Kontrollgruppe [10]. In einer Metaanalyse von Duggan kristallisierte sich heraus, dass Arginin enthaltende Ernährungsformeln, wahrscheinlich die infektiösen Komplikationen, besonders bei chirurgischen Patienten vermindern konnten [53]. Nukleotide sind wichtig für die Purin- und Pyrimidinsynthese bei Zellen des Immunsystems. Mäuse, die mit einer nukleotidreichen Diät gefüttert worden sind, hatten eine gesteigerte NK-Zellaktivität und eine verbesserte Überlebensrate [57]. Diätetische Nukleotide, wie durch Kukarani et al. Beschrieben, wirken durch Aktivierung und Reifung förderlich bei immunologischen Prozessen [109]. In einer Studie von Rudolph et al, in der er eine nukleotidfreie Diät verabreicht hat, fanden sich eine geschwächte zelluläre Immunfunktion und eine herabgesetzte Resistenz gegenüber Infektionen [154]. Omega-3 Fettsäuren üben ihren immunmodulierenden Einfluss über ein verändertes Verhältnis zwischen Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in den Membranphospholipiden der immunkompetenten Zellen, hauptsächlich den Monozyten und Makrophagen aus [4,51,89]. Omega-3 Fettsäuren zeigten in zahlreichen Studien eine signifikante Reduktion des Cytokins TNF und Sekretionsänderung vieler anderer Zytokine [13,18,54,148,168,184]. Kemen [100] zeigte bei Patienten mit einer immunsupplementierten enteralen Diät mit Arginin, RNA und Omega-3 Fettsäuren, dass durch eine signifikant erhöhte T-Zell- und B-Zellzahl in der supplementierten Patientengruppe mit korrelierenden erhöhten IgM-Serumspiegel und durch erhöhte Werte verschiedener Zytokinsysteme (IFN-γ, IL-2, IL-2R) eine raschere Erholung der operationsbedingten Suppression des Immunsystems im Vergleich zu einer Kontrollgruppe bewirkt wird. Wachtler stellte in einer ähnlichen Studie dar, dass durch eine immunonutritiven Diät, signifikant die LTB5 Konzentration anstieg und das Verhältnis LTB4/LTB5 gesenkt wurde [176]. In einer Studie bei transplantierten Rattenherzen zeigte Grimm, dass eine omega-3- betonte Diät auch die Bildung der Zytokine TNF-α und IL-6 hemmt [74]. Dabei konnte die Hemmung der Proliferation und Infiltration immunkompetenter Zellen im Transplantat, wahrscheinlich bedingt Diskussion durch die 53 Reduktion der Zytokine, die signifikante Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit erklären. In unserer Studie konnten wir ebenfalls den immunmodulierenden Einfluss von Omega3 Fettsäuren nachweisen. Dazu untersuchten wir bei 30 Patienen mit Tumoren des Gastrointestinaltraktes, nach perioperativer Gabe einer Arginin, RNA-Nukleotiden und Omega-3 Fettsäuren supplementierten Diät die Konzentration von den Fettsäuren EPA und DHA sowie das Verhältnis von LTB4/LTB5 im Serum. Unsere Daten zeigten signifikant erhöhte EPA- und DHA-Konzentrationen und ein signifikant erniedrigtes Verhältnis von LTB4/LTB5 in der Verumgruppe. 5.2 Omega-3 Fettsäuren In der vorliegenden Arbeit konnten wir erstmals darlegen, dass es unter einer perioperativen mit Arginin, RNA-Nukleotiden und Omega-3 Fettsäuren angereicherten enteralen Diät zu einem signifikanten Anstieg der Konzentration der Fettsäuren EPA und DHA und den daraus korrelierenden Konzentrationsanstieg des LTB5 mit Senkung des Verhältnis von LTB4/LTB5 kommt. In verschiedenen Tierstudien zeigte sich, dass eine intravenös verabreichte omega-3betonte Lipidemulsion innerhalb weniger Tage zu einem vielfachen Konzentrationsanstieg an Eikosapentaen- und Dokosahexaensäure in der Zellmembran [22,47,174,172] führt. In einer klinischen Studie beschreibt Bauer [13] den signifikant erhöhten Einbau der essentiellen Omega-3-Fettsäuren EPA und DHA in Leberzellen, den Enterozyten und die Tumorzellen bei Patienten, die eine immunonutritive Diät angereichert mit Arginin, RNA und Omega-3-Fettsäuren erhalten haben im Vergleich zu einer Placebogruppe. Dem Organismus zugeführte Fettsäuren werden in die Phospholipiddoppelschicht der Membranen immunkompetenter Zellen integriert [92,94]. Dies beeinflusst die Mikroviskosität und Fluidität der Membran [58,165] mit Auswirkungen für das Arrangement oligomerer Proteine (α-, β- und γ-Untereinheiten von G-Proteinen), die Aktivität membrangebundener Rezeptoren und Enzyme [90] und die Expression von Adhäsionsmolekülen [161] mit der Konsequenz einer veränderten Immunogenität. Diese Eigenschaften beeinflussen und steuern die konzentrierte Aktion immunkompetenter Zellen. Die Zytokinproduktion und -sekretion unterliegt einer extrazellulären Steuerung. Die Stimulierung erfolgt nach einem festen Schema. Ein Diskussion 54 extrazellulärer Ligand bindet an einen spezifischen Membranrezeptor. Seine „Botschaft wird durch Signaltransduktion in das Zellinnere geleitet. In die Signaltransduktion ist über einen komplexen Mechanismus das Phospholipid/Arachidonsäure-„second messenger“-System involviert [1,16,116]. Man kann davon ausgehen, dass dieses Phospholipid/Arachidonsäure-„second messenger“-System durch die Gabe von Omega3-Fettsäuren über eine Variation des Arachidonsäure/Eikosapentaensäureverhältnisses des relevanten Membranphospholipidpools verändert wird [74]. Endres berichtet, dass eine n-3 Fettsäuregabe das Arachidonsäure-/Eikosapentaensäureverhältnis der Membranphospholipide monozytärer Zellen reduziert und die TNF-α-Sekretion supprimiert [54]. Abgesehen davon, dass freie extrazelluläre Fettsäuren in den Membranphospholipidpool inkorporiert werden, beeinflussen sie direkt die Zellaktivierung und Lipidmediatorproduktion polymorphkerniger Granulozyten. Die Mobilisation der polymorphkerniger Granulozyten wird inhibiert, wenn der Lipidmediator Leukotrien B5 aus freier Eikosapentaensäure (n-3) anstellle von Leukotrien B4 aus freier Arachidonsäure (n-6) synthetisiert wird, denn Leukotrien B4 ist ein Mediator der Adhäsion, Diapedese [42] und der Chemotaxis polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten [68], Leukotrien B5 ist dagegen nahezu inaktiv. Die vermehrte Bildung des LTB5 in der Gruppe mit der Omega-3-Fettsäure angereicherten Diät ergibt sich aus der Tatsache, dass die ungesättigten Fettsäuren bei der Synthese ihrer Metabolite um ein gemeinsames Enzymsystem konkurrieren. Die Aktivität der Delta-6-Desaturase, die als erstes beteiligtes Enzym Schrittmacherfunktion hat, wird durch die entstehenden Produkte, durch die Zusammensetzung der Nahrung, durch Hormone, durch das Alter und weitere Faktoren beeinflusst. Die Omega-3-Fettsäuren haben die größte Affinität zu diesem Enzymsystem. Demzufolge hemmt alpha-Linolensäure kompetitiv die Desaturierung von Linolsäure [29,124]. Bei unserer üblichen Ernährung überwiegt mengenmäßig die Linolsäure so stark, dass die Bildung der langkettigen Derivate EPA und DHA aus Linolsäure nur sehr langsam abläuft. Durch eine erhöhte alphaLinolensäurezufuhr, wie in unserer Studiendiät, kann eine vermehrte Bildung von EPA und somit auch ihres Metaboliten LTB5 erreicht werden [75]. Diskussion 55 Verschiedene inflammatorisch aktive Zelltypen tauschen freie Arachidonsäure und Eikosapentaensäure interzellulär aus und synthetisieren sie zu Eikosanoiden. Diese transzelluläre Eikosanoidsynthese unterliegt Veränderungen der extrazellulären Konzentration freier Arachidon- und Eikosapentaensäure [40,75,76,78,79]. Mikromolare Konzentrationen unveresterter Arachidonsäure wurden in Gewebsarealen mit inflammatorischen Reaktionsabläufen nachgewiesen [81,170,171]. Im Vergleich zu LTB4 besitzt LTB5 ein mehr als 10fach vemindertes chemotaktisches und granulozytenaktivierendes Potential [69,83,113] und konkurriert mit LTB4 um die Anbindung an den Rezeptor auf polymorphkernigen Granulozyten [105]. Aufgrund der Einflussnahme auf den LTB4-vemittelten autokrinen Steuerungsmechanismus polymorphkerniger Granulozyten ist eine deutliche Reduktion der Neutrophilenaktion zu erwarten. Es ist davon auszugehen, dass Omega-3 Fettsäuren zum einen durch Änderung der Zytokinsekretion die spezifische und zum anderen die Lipidmediator- vermittelte unspezifische Immunantwort beeinflusst [74]. In der vorliegenden Arbeit konnte erwartungsgemäss der signifikante Anstieg der Fettsäuren EPA und DHA im Serum der Patienten in der Diätgruppe beobachtet werden. Diese Serumspiegel zeigen, dass die erhöhte Zirkulation der Omega-3 Fettsäuren nach der präoperativen Ernährung mit der fischölenthaltenden Diät schon am Tag des chirurgischen Eingriffs zu beobachten waren. Bis zum Studienende hielten die signifikant erhöhten Serumwerte an. Analog dazu stieg die Ausschüttung des 5-Lipoxygenaseproduktes LTB5 an und damit sank signifikant das Verhältnis LTB4/LTB5 nach in vitro-Stimulation von ex vivoNeutrophilen aus dem Blut der Patienten mit der omega-3-fettsäurereichen Diät schon am Operationstag an. Das erniedrigte Verhältnis LTB4/LTB5 hielt ebenfalls bis zum 10. postoperativen Tag an. Es war kein begleitender Abfall der LTB4 –Konzentration zu beobachten. Das erniedrigte Verhältnis LTB4/LTB5 kann zu einer abgeschwächten entzündlichen Reaktion führen ohne die Nachteile einer kompletten Mediatorblockierung. Diese Werte lassen vermuten, dass eine perioperative Immunernährung, angereichert mit Omega-3 Diskussion 56 Fettäure die postoperative Immunantwort über eine Modulation der Lipidmediatoren beeinflussen kann. 5.3 Klinische Bedeutung Postoperativ auftretende Komplikationen scheinen ihren Ursprung bereits in der prä- bis intraoperativen, bzw. in der frühen postoperativen Phase zu haben [35,185]. Der positive Effekt auf das Immunsystem einer frühen postoperativen enteralen Immunonutrion bei Patienten nach chirurgischen Eingriffen wurde in verschiedenen Studien demonstriert [14]. Ergebisse durch die Gabe einer postoperativen immunonutritven Diät in mehreren randomisierten, klinischen Studien bei Patienten mit einem chirurgischen Eingriff im oberen Gastrointestinaltrakt wegen eines Karzinoms, wurden gesammelt [7,23,24,27,34,44,45,63,65,67,70,85,107,159]. Ausser bei den Untersuchungen von Daly et al. [44,45] konnten keine signifikanten Reduktionen der infektiösen Komplikationen durch eine frühe postoperative immunonutritiven Diät erzielt werden. Es bestand aber ein Trend zu einer verminderten postoperativen Komplikationsrate unter einer Immunonutrition [67,159]. In mehreren Studien [159,100] fand man eine nichtsignifikante Reduktion der gesamten postoperativen Komplikationen in der Patientengruppe, die postoperativ eine immunsteigernde Diät erhielten versus einer Patientengruppe mit einer isokalorischen, isonitrogenen Formel (22% vs 31%). Eine Metaanalyse von Beale, in der er 15 Studien, bei denen Patienten entweder eine enterale Standardernährung oder eine enterale immunsteigernden Ernährung erhielten verglich, zeigte, dass es keinen Unterschied in der Sterblichkeitsrate in beiden Gruppen gab, aber eine signifikante Reduktion der Infektionsrate, Beatmungsdauer und Krankenhausliegezeit zu beobachten war [14]. Heyland hingegen stellte in seiner Metaanalyse dar, dass die Patientengruppe mit der immunonutritiven Diät vermehrt unter fieberinfektiösen Komplikationen litt, als die Kontrollgruppe. Eine kürzere Krankenhausliegezeit konnte auch er feststellen [88]. Im Gegensatz dazu berichtet Mendez [126] in einer Studie an Schwerverletzen, dass nach einer immunsupplemtierenden Diät sich scheinbar die TNF-Werte und Konzentrationen von Prostaglandinen normalisiert hätten, jedoch eine längere Beatmungszeit und Diskussion 57 Krankenhausliegezeit bei diesen Patienten zu beobachten war. Weiman [178] fand keinen Unterschied an infektiösen Komplikationen in der immunsupplemtierten Gruppe bei ebenfalls Schwerverletzen im Vergleich zu einer Placebogruppe. Er beobachtete mehr Tage mit Fieber in der Verumguppe. Man vermutete, dass die Untersuchungsergebnisse dieser beiden Studien an der schweren Verletzung der in die Studien aufgenommenen Patienten liegen könnten. In einer Studie über eine präoperativ verabreichte immunonutritiven Diät [13] konnte keine signifikante Verbesserung der postoperativen Immundepression mit einer begleitenden Reduktion der infektiösen Komplikationen bewirkt werden. Die in unserer Untersuchung als Nebenziel verfolgte klinische Bedeutung einer präoperativen Immunonutrition im Vergleich zu einem isokalorischen, isonitrogenen Placebo erlangt wegen der geringen Grösse der untersuchten Patientenzahlen in Verumund Kontrollgruppe eine nur unsichere Aussagekraft. Bezüglich der Eingangskriterien wie Geschlechtsverteilung, Alter, Gewicht, Karnofsky-Index und Nutrition-Risk-Index zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede in beiden Ernährungsgruppen. Die Ernährungsstudie begann nach Diagnose- und Indikationsstellung mindestens fünf Tage vor den ausgedehnten operativen Eingriffen im oberen Gastrointestinaltrakt. Neben der Krankenhausnahrung (im Durchschnitt 800-1500kcal) erhielten die Patienten die aus Pulver frisch angerührten Studiendiäten. So konnte die Ununterscheidbarkeit der Diäten gewährleistet werden. Beide Diäten waren gut verträglich. Die bei den Patienten durchgeführten Operationsverfahren (Ösophagusresektion, Gastrektomie und Duodenohemipankreatektomie) waren Operationen vergleichbarer Grösse, jedoch war es schwierig die Grösse des Eingriffes allein durch das Verfahren zu definieren, so dass klinische Parameter wie die Operationsdauer, intraoperativer Blutverlust und Erythrozytenkonzentratgabe und Volumengabe erfasst und ausgewertet worden sind. In beiden Gruppen gab es keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich dieser Parameter. Aber es ist auch schwierig zu beurteilen, ob eine immunonutritive Diät einen positiven Einfluss auf den intraoperativen Verlauf ausübt, da sich intraoperativ Probleme entwickeln können, z.B. aus einem schwierigen Situs heraus, durch erhöhten Blutverlust oder durch iatrogene Faktoren wie Anästhesie, Erythrozytenkonzentratgabe, Fremdeiweiss- und Medikamentengabe. In der vorliegenden Arbeit traten bei fünf Patienten der Placebogruppe und drei Patienten der Verumgruppe postoperative Komplikationen wie Pneumonie, Diskussion 58 Harnwegsinfekte, septisches Syndrom, Wundinfekt und Anastomoseninsuffizienz auf. In der Placebogruppe starben zwei Patienten. Die Komplikationen traten in beiden Patientengruppen im Durchschnitt ab dem 5. postopertivem Tag auf. Dies steht im Gegensatz zu einer Studie von Senkal et al. [160], in der die infektiösen Komplikationen nach dem 3. postoperativem Tag durch eine perioperativ verabreichte enterale immunonutritive Diät günstig beeinflusst worden sind, verglichen mit einer früheren Studie über eine postoperativ verabreichte Diät, die erst ab dem 5. postoperativen Tag einen positiven Verlauf von Komplikationen beobachten konnte [159, 160]. Es zeigte sich bei dieser Arbeit zwar ein Trend zu einer geringeren postoperativen Komplikationsrate in der Verumgruppe, die aber bei einem kleinen Patientenkollektiv keine signifikanten Werte erreichten. Übereinstimmend mit den obengenannten Studien konnte gezeigt werden, dass es bei der Verumgruppe eine deutlich kürzere Nachbeatmungsdauer, eine Intensivstation- und Krankenhausliegezeit zu beobachten war als bei der Placebogruppe. Dies könnte zum einen daran liegen, dass durch die Gabe von Omega-3 Fischfettsäuren und durch die Verschiebung des Verhältnis von LTB4/LTB5 zugunsten des schwach inflammatorisch wirkenden LTB5 eine weniger aggressive Immunreaktion abgelaufen ist mit anschliessend schnellerer Erholung des Immunsystems. Zum anderen war die Komplikationsrate etwas höher in der Placebogruppe, so dass diese Ereignisse insgesamt gesehen auch zu einem längeren Aufenthalt auf der Intensivstation und im Krankenhaus für die Kontrollgruppe geführt haben könnten. Die klinischen Abschlussparameter wie Körpergewicht, Nutrition-Risk-Index und der Karnofsky-Index zeigten keine wesentlichen Unterschiede in beiden Gruppen (Tabelle 4.8). 5.4 Konzept der perioperativen Immunonutrition Heutzutage ist eine präoperative Ernährung im klinischen Alltag nicht üblich, obwohl eine enterale Ernährung der Patienten in der Vorbereitunsphase zur Operation relativ einfach und komplikationslos durchzuführen wäre. Zum einen ist dies begründet in der bisher nicht nachgewiesenen Effizienz einer solchen Ernährung (obwohl immer mehr Studien den positiven Effekt von immunsupplementierten enteralen Diäten beobachten [160]), zum anderen handelt es sich bei Patienten, die mit Tumoren des oberen Gastrointestinaltraktes und des Pankreas zur Operation anstehen, nur in seltenen Fällen Diskussion 59 um quantitativ mangelernährte. Da bei diesen Patienten durch einen chirurgischen Eingriff eine erhebliche Immundysfunktion zu erwarten ist, war es Ziel diese Arbeit zu untersuchen, ob eine perioperativ verabreichte immunsupplementierte Diät durch Veränderung der Lipidmediatoren einen positiven Effekt auf den postoperativen klinischen Verlauf hat. Die Gabe der Immunonutrition 5 Tage präoperativ in oraler Form und 10 Tage postoperative enteral über einen FNKJ waren klinisch und ökonomisch vertretbar. Im Rahmen unserer Untersuchungen wurde der direkte Anstieg der Konzentrationen von EPA und DHA im Serum bei Patienten mit der Omega-3 Fettsäure angereicherten Diät nachgewiesen. Infolgedessen kam es zu einer vermehrten Produktion von LTB5 und damit zu einem erniedrigten Verhältnis von LTB4/ LTB5. Das erniedrigte Verhältnis LTB4/LTB5 kann zu einer abgeschwächten entzündlichen Reaktion führen ohne die Nachteile einer kompletten Mediatorblockierung. Der Trend in der vorliegenden Arbeit zu geringeren postoperativen Komplikationen und einem deutlich verkürzten Aufenthalt auf der Intensivstation und im Krankenhaus könnte durch diese milder ablaufenden postoperativen Immunreaktionen mit resultierender rascheren Erholung des Immunsystem erklärt werden. Der klinische Nutzen von immunsupplementierten Ernährungskonzepten ist durch weitere Folgestudien mit höheren Patientenzahlen zu überprüfen. Eventuell kann eine verlängerte präoperative Ernährungsphase den positiven Effekt der perioperativen Diät verbessern, wie es in einer Studie von Yakoun beschrieben worden ist, bei der eine 7tägige präoperative Ernährung mit einem besseren postoperativen Heilverfahren verbunden war [183]. In einem Tierexperiment über die experimentelle Transplantation von Rattenherzen als in vivo-Immunstimulationsmodell konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis von Omega-6 zu Omega-3-Fettäuren eine immunneutrale bis immunsuppressive Reaktion auslösen konnte. Ob die Gabe einer immunsupplementierten Diät mit verschiedenen Anteilen von den essentiellen Omega-6- und Omega-3-Fettsäuren bei Patienten mit großen Oberbaucheingriffen eine abgestufte Immunmodifikation von immunneutral bis immunsuppressiv bewirken könnte, wäre eventuell eine Anregung für weitere klinische Studien. Man könnte somit Diäten je nach aktuellem immunologischen Bedarf des Diskussion 60 Patienten konzipieren und gezielt einsetzen, z.B. erwünschte immunsuppressive Wirkung bei Patienen nach Organtransplantationen oder Psoriasis [77]. Zusammenfassung 6 61 Zusammenfassung Wir verabreichten erstmals in unserer Studie eine Arginin-, RNA- und Omega-3Fettsäure supplementierte enterale Diät perioperativ und bestimmtenden die Konzentration der Fettsäuren EPA und DHA, sowie der Lipidmediatoren LTB4 und LTB5 , um die immunmodulatorische Wirkung von Omega-3 Fettsäuren zu bestimmen und den klinischen Verlauf in einem kleinen Karzinomkollektiv zu überprüfen. Durch die perioperative Gabe der immunnutritiven Diät war es erstmals möglich die vorausgegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe immunmodulierenden Effekt einer präoperativ [13] und über den postoperativ [100,159] verabreichten immunsupplemtierten Diät in dieser Studie zu komplettieren und die Wirkung zu befunden. Indirekt konnte der immunologische ernährungsbedingte Effekt durch das aus der EPA gebildete Leukotrien B5 nachgewiesen werden. Das Studiendesign war prospektiv, placebokontrolliert und doppelblind. In die Studie wurden 30 Patienten mit malignen Tumoren des oberen Gastrointestinaltraktes eingeschlossen, bei denen oral fünf Tage vor dem operativen Eingriff und ab dem 1. postoperativen Tag über eine intraoperativ plazierte FNKJ eine Ernährungstherapie durchgeführt worden ist. Präoperativ wurden die Patienten in zwei Gruppen randomisiert, wobei die eine Gruppe eine mit Arginin-, RNA- und Omega-3-Fettsäure supplementierte enterale Diät und die andere Gruppe eine isokalorische und isonitrogene Kontrolldiät erhielt. Die Blutentnahmen erfolgten bei allen Patienten präoperativ, intraoperativ und an den postoperativen Tagen 1,5 und 10. Als Messparameter wurden die Konzentrationen der Fettsäuren EPA und DHA sowie der Leukotriene LTB4 und LTB5 und das daraus resultierende Verhältnis LTB4/LTB5 bestimmt. Am Operationstag waren die Serumspiegel der beiden Omega-3-Fettsäuren EPA und DHA signifikant höher in der Verumgruppe im Vergleich zur Placebogruppe. In der Gruppe mit der immunsupplementierten Diät wurden die signifikant erhöhten Serumspiegel von EPH und DHA vom Operationstag (EPA p = 0.04, DHA p = 0.04) bis zum 10. postoperativen Tag (EPA p = 0.02, DHA p = 0.005) beibehalten. Zusammenfassung 62 Die mit der Nahrung aufgenommenen Omega-3 Fettsäuren führen zu der Erzeugung der jeweiligen Lipidmediatoren (z.B. LTB5). Eine signifikante Steigerung der Leukotriene der 5er Reihe war analog zu den Konzentrationen der Fettsäuren EPA und DHA in der immunonutritiven Diätgruppe zu beobachten ohne einen begleitenden Abfall der Konzentration der Leukotriene der 4er Reihe (LTB4). Bei gleichen Ausgangswerten sinkt das Verhältnis LTB4/LTB5 signifikant am Operationstag (p<0.05) nach der oralen Gabe der immunnutritiven Diät. Das signifikant erniedrigte Verhältnis von LTB4/LTB5 hielt bis zum 10. postoperativen Tag an (p<0.01). Desweiteren untersuchten wir den klinischen Verlauf in den beiden Patientenkollektiven. Bei acht Patienten traten postoperative Infektionskomplikationen, Wundheilungsstörung und Anastomoseninsuffizienz auf. Fünf Patienten gehörten zu der Placebogruppe und drei der Verumgruppe. Die Nachbeatmungsdauer, Intensivstationund Krankenhausliegezeit war in der Verumgruppe zwar nicht signifikant, jedoch deutlich kürzer als in der Placebogruppe. In diese Studie führte die perioperative enterale Gabe einer mit Arginin-, RNA- und Omega-3-Fettsäure angereicherte Diät zu signifikant hohen Serumspiegel der beiden Omega-3-Fettsäuren EPA und DHA und dem daraus korrelierenden Anstieg des weniger inflammatorisch wirkenden Leukotrien B5. Anolog dazu sank signifikant das Verhältnis von LTB4/LTB5. Klinisch zeigte sich der Trend zu kürzerer Nachbeatmungsdauer, Intensivstation- und Krankenhausliegezeit in der Verumgruppe. Die perioperative Gabe einer immunsupplementierten Diät könnte ein Therapiekonzept nach grossen chirurgischen Operationen sein, um durch Verschiebung der Lipidmediatoren zugunsten des weniger inflammatorisch wirkenden LTB5 eine abgeschwächte entzündliche Reaktion ohne die Nachteile einer kompletten Mediatorblockierung zu bewirken und so durch eine raschere Genesung der postoperativen Immunlage einen positven klinischen Verlauf zu erzielen. Literaturverzeichnis 7 1. 63 Literaturverzeichnis Abdel-Latif A.A., Calcium mobilizing receptors, polyphosphoinositides and the generation of second messengers. Pharmacol. Rev. 1986;38: 227 2. Adolph M., Eckart J., Der Energiebedarf operierter, verletzter und septischer Patienten. Infusionsther.1990;17:5-16 3. Alexander J.W., Immunoenhancement via enteral nutrition. Arch. Surg. 1993;128:21-32 4. Alexander J.W., Immunonutrition. An emerging strategy in the ICU. J. Crit. Care. Nutr. 1994;1:21-32 5. 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Kemen möchte ich ganz herzlich für die Möglichkeit zur Durchführung und Betreuung meiner Dissertation und für seine konstruktive Unterstützung und Hilfsbereitschaft danken. Weiterhin gilt mein ausserordentlicher Dank Herrn Priv. Doz. Dr. med. M. Senkal, der mir bei allen theoretischen und praktischen Fragen zur Seite stand. Meinen Kollegen Heinz von Gersum danke ich, dass er mich bei den Laboruntersuchungen überaus kollegial unterstützt hat und wir uns durch eine glänzende Zusammenarbeit ergänzen konnten. Es ist mir eine besondere Freude, meinem Ehemann Knut, meinen Eltern Lütfiye und Mustafa sowie Karin und Karl Hermann, meiner Schwägerin Edda und meinem Schwager Kay, meiner Schwester Ümmühan und meinem Schwager Mehmet zu danken, die durch ihr Verständnis und ihre tatkräftige Unterstützung eine grundlegende Voraussetzung für das Entstehen der vorliegenden Arbeit schufen. Desweiteren möchte ich meinen langjährigen Freundinnen Bianca Klopfer, Julia Lubina, Lolimar Rojas Rosas, Mahbubeh Amirhosseini, Martina Asbeck, Pari Tsiakoumi und Simona Gavata für die weiterführenden Diskussionen danken und dass uns eine tiefe Freundschaft verbindet. Abschliessend möchte ich all denen danken, die mich durch ihre Hilfe und Ratschläge bei meiner Arbeit unterstützt haben. Lebenslauf 9 82 Lebenslauf Ikbale Siercks Geburtsname: Özdemir Geburtsdatum: 25.10.1971 Geburtsort: Cankiri (Türkei) Schulausbildung: 08/79-06/83__ Grundschule in Bochum 08/83-05/ 91__ Gesamtschule in Bochum Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Studium: 10/91-07/92__ Studium der Chemie an der Ruhr-Universität Bochum 10/92-04/99__ Studium der Humanmedizin an der RuhrUniversität Bochum 08/94__ Ärztliche Vorprüfung 03/97__ Erster Abschnitt der ärztlichen Vorprüfung 03/98__ Zweiter Abschnitt der ärztlichen Vorprüfung 04/99__ Dritter Abschnitt der ärztlichen Vorprüfung 06/02 Berufstätigkeit: Erhalt der Vollapprobation als Ärztin 05/99-02/00__ Ärztin im Praktikum in der Augusta-KrankenAnstalt Bochum, Lehrkrankenhaus, im Fachgebiet Gynäkologie und Geburtshilfe 02/00-07/01__ Mutterschutz, anschließend Erziehungsurlaub seit 15.07.01 ÄiP und danach Assistenzärztin in der Frauenklinik im Kantonsspital St. Gallen, Schweiz
