Borna Disease Virus (BDV) - biomed

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05.07.2007
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wissenschaft & praxis
Borna Disease Virus (BDV) –
neuen Familie Bornaviridae notwendig,
deren einziges Genus bis dato BDV darstellt.
AK-Status in psychiatrischen Patienten und gesunden Probanden
Wirtsspektrum und Pathogenese
Das Borna Disease Virus ist ein neurotropes Virus, das sowohl den Menschen, als auch zahlreiche Nutz- und
Haustiere wie z. B. Pferde, Schafe, Rinder und Katzen infiziert. Im Tierversuch konnten außerdem Ratten, Mäuse, Kaninchen, Hühner und Rhesusaffen mit BDV infiziert werden.
Weder der Hauptinfektionsmodus, noch die Hauptinfektionswege sind heute endgültig geklärt. Aus experimentellen Infektionen weiß man aber, dass der intranasale Infektionsweg (Nasensekret) mit hohen Virusdosen erfolgreich
ist. Man nimmt an, dass BDV über die Fila olfactoria der
Riechzellen und den Bulbus olfactorius in das limbische System wandert, wo es vor allem die Funktion und weniger die
Struktur der Neuronen beeinträchtigt. Neben der Verarbeitung von Geruchsempfindungen beeinflusst das limbische
System das Verhalten bei der Nahrungsaufnahme, das Sexualverhalten und die Kontrolle der Biorhythmen. Es hat zudem große Bedeutung für das emotionale Verhalten (Wut,
Angst, Lust, Unlust, Motivation) und koordiniert Gedächtnisvorgänge.
Die Beeinflussung des limbischen Systems durch eine BDVInfektion geschieht sehr wahrscheinlich über eine Störung des
Neurotransmitternetzwerkes, die über direkten oder indirekten Kontakt von BDV-Proteinen bzw. ihrer Komponenten mit
Neurotransmitterrezeptoren zustande kommt. In der Folge
kann es zu einem schwerwiegenden Ungleichgewicht im gesamten Neurotransmitternetzwerk kommen, das schließlich
die für verschiedenste psychiatrische Erkrankungen beschriebenen Verhaltensveränderungen bedingen könnte.
Auszug aus der Diplomarbeit „Untersuchung von Profil und
Häufigkeit der Infektion mit Borna Disease Virus (BDV) in
Patienten mit psychiatrischen Störungen und gesunden Probanden“
Einleitung
Im Sommer 2005 bot sich im Rahmen meiner Ausbildung zur Biomedizinischen Analytikerin die Gelegenheit, ein Praktikum am
Robert Koch Institut (RKI) Berlin in der Projektgruppe Bornavirus-Infektionen unter der Leitung von
Priv. Doz. Dr. Liv Bode zu absolvieren. Gegen Ende dieses Aufenthaltes erhielt ich das Angebot, meine Diplomarbeit am
RKI und an der Freien Universität (FU) Berlin im Fachbereich Veterinärmedizin, Abteilung Virologie zu verfassen.
Das Borna Disease Virus (BDV) ist ein neurotropes Virus,
das durch eine besondere Prävalenz für die Neuronen des
limbischen Systems charakterisiert ist. Hier führt die Infektion
sowohl bei verschiedenen Tierspezies, als auch beim Menschen zu einer vermutlich lebenslangen Viruspersistenz, wobei lange Latenzphasen von kurzen Aktivierungsphasen abgelöst werden. Häufige Aktivierungen dürften schließlich der
Grund für das Auftreten klinischer Symptome sein. So sprechen viele Untersuchungsergebnisse dafür, dass die BDV-Infektion beim Menschen mit unterschiedlichen psychiatrischen Erkrankungen assoziiert ist.
Für die Auftraggeber war diese Arbeit insofern von
großem Interesse, als erstmalig ein vollständiges BDV-Antikörper-Profil von Mensch und Pferd erstellt werden sollte, von
dem man sich ein tieferes Verständnis des Infektionsgeschehens bei BDV-Infektionen verspricht. Um dieses Ziel zu erreichen, hatte ich unter anderem die Aufgabe, zwei ELISA-Systeme aufzubauen, die es erlauben, gegen das BDV-Matrixprotein gerichtete AK (Antikörper) zu detektieren. Mit diesen
AK werden neutralisierende und damit für das Individuum
protektive Eigenschaften assoziiert. Bisher war es zwar möglich, AK gegen andere Virusproteine nachzuweisen – diese
stellen aber lediglich Infektionsmarker dar und besitzen kein
protektives Potential.
wissenschaft
& praxis
Borna Disease Virus (BDV)
Morphologie und Genomorganisation
Betrachtet man das Borna Disease Virus elektronenmikroskopisch, so zeigt sich, dass es sich um sphärische, behüllte Partikel mit einem Durchmesser von etwa 90 nm handelt.
BDV besitzt ein negatives, nicht segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom mit einer Länge von 8,9 kb, dessen
Replikation und Transkription im Nukleus infizierter Zellen
stattfindet.
Aufgrund seiner Genomorganisation und Sequenz wird
BDV der Ordnung Mononegavirales zugerechnet, zu der
auch das Masern- und das Tollwutvirus zählen. Da seine Replikation im Gegensatz zu anderen Viren dieser Ordnung im
Kern der Wirtszelle stattfindet und es sich eines komplizierten Splicing-Mechanismus bedient, war die Schaffung der
Klinik
Symptomatik beim Menschen
Viele Untersuchungsergebnisse sprechen dafür, dass die
BDV-Infektion beim Menschen mit unterschiedlichen psychiatrischen Erkrankungen assoziiert ist. Im Vordergrund
stehen dabei affektive Störungen, wie unipolare und bipolare Depressionen. Die Symptomatik äußert sich häufig in Stimmungsschwankungen, Ängstlichkeit, Konzentrations- und
Gedächtnisstörungen, Schläfrigkeit, aber auch zwanghaftem
Verhalten.
Symptomatik beim Pferd
Die sog. Borna’sche Krankheit des Pferdes wurde nach
der sächsischen Stadt Borna bei Leipzig benannt, wo man
im Jahre 1885 eine große Zahl an Todesfällen bei Pferden, hervorgerufen durch eine infektiöse, epidemische Enzephalitis,
registrierte.
Das klinische Bild der Borna’schen Krankheit reicht von
geringgradigen Verhaltensauffälligkeiten bis hin zu fatalen
Verläufen mit möglichem tödlichem Ausgang. Durch das pathophysiologische Geschehen im Gehirn kommt es zur Ausbildung typischer Symptome wie z. B. Gangunsicherheit,
Ängstlichkeit, Apathie, Somnolenz, Fressunlust, Kopfschlagen und Kolik. Besonders im fortgeschrittenen Stadium kann
auch das Auge betroffen sein, was sich in Veränderungen des
Augenhintergrundes oder sogar Blindheit äußert.
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Methodik/Diagnostik
Glykoprotein
Westernblot
In der am RKI und an der FU Berlin
durchgeführten BDV-Diagnostik für Pferd
Matrixprotein
Westernblot, ELISA (Lektin, GST)
und Mensch galt das Hauptaugenmerk
bisher dem BDV-Phosphoprotein und
Phosphoprotein
Westernblot, Triple-ELISA
dem Nukleoprotein (abgekürzt P- und NProtein). Der dort entwickelte Triple-ELINukleoprotein
Westernblot, Triple-ELISA
SA erlaubt es einerseits, N- und P-ProL-Polymerase
tein, also Antigene, nachzuweisen. Andererseits können mit Hilfe dieser Technik
gegen das N- und P-Protein gerichtete AK
Abb. 1: Überblick über die diagnostischen Möglichkeiten einer BDV-Infektion
gleichzeitig detektiert werden. Zusätzlich
(Bildquelle: Dreidimensionale BDV-Darstellung von Dr. Roman Stoyloff)
werden aber auch zirkulierende Immunkomplexe, bestehend aus N-/P-Protein und den korrelieren- Protein gerichtete AK im Probandenserum vorhanden, binden
den AK nachgewiesen. AK gegen N- und P-Protein wurden zu- sie im nächsten Schritt an das Fusionsprotein M und können
anschließend durch eine Enzym-Substrat-Reaktion sichtbar
dem auch im Westernblot dargestellt.
Gegen das Glykoprotein (G-Protein) gerichtete AK, denen gemacht werden.
genau so wie dem M-Protein neutralisierende Eigenschaften
zugeschrieben werden, konnten vor kurzem im Rahmen einer
Ergebnisse
Diplomarbeit im Westernblot gezeigt werden, ein ELISA exisEin Großteil der Probanden konnte sowohl im von mir
tiert hier allerdings noch nicht.
Was das Matrixprotein (M-Protein) betrifft, so konnten aufgebauten Lektin-ELISA, als auch im GST-ELISA auf AK gedie entsprechenden AK bisher nur im Westernblot mit an- gen das M-Protein getestet werden. Um zu einem vollständischließender Immunfärbung gezeigt werden. Andere dia- gen AK-Profil zu kommen, war es weiters meine Aufgabe, alle Probanden gegen M-, P- und N-Protein zu blotten (Wesgnostische Mittel waren nicht verfügbar.
Im Rahmen meiner Diplomarbeit bekam ich die Aufgabe, ternblot), um die entsprechenden AK darzustellen. Zudem
zwei ELISA-Systeme zur Detektion von gegen das M-Protein führte ich einen ELISA durch, bei dem nur gegen das N-Progerichteter AK aufzubauen, die, wie bereits erwähnt, insofern tein gerichtete AK detektiert werden sollten. Für das P-Protein
von großem Interesse sind, als mit ihnen auch neutralisie- war dies leider nicht möglich, da dies in zu geringer Menge im
rende und damit protektive Eigenschaften verbunden sind. Da phosphorylierten Zustand vorhanden und damit die erfores sich bei den beiden Testsystemen um neuartige Verfahren derliche biologische Aktivität des Proteins nicht gegeben war.
Aus den von mir generierten Ergebnissen konnten schließhandelt, sollen sie im Folgenden kurz dargestellt werden.
lich mit Hilfe statistischer Testverfahren (Stichprobe: 53 PferELISA auf Lektinbasis
deseren, 120 humane Seren) folgende wesentliche Aussagen
Nach neuesten Untersuchungen handelt es sich beim Ma- abgeleitet werden:
trixprotein um ein funktionelles Glykoprotein. Das Prinzip des 1. Erfolgreicher Aufbau eines Lektin- und eines GST-ELISA
von mir aufgebauten Doppelsandwich-ELISA macht sich die
zur Detektion von Anti-BDV-M-AK. Die beiden TestsysEigenschaft des Lektins Concanavalin A (ConA) zunutze,
teme konnten in dem mir zur Verfügung stehenden Zeitspezifisch an α-D-Mannosehaltige Kohlenhydratreste des
raum aufgebaut werden. Eine Etablierung dieser Systeme,
Matrixproteins zu binden.
die z. B. eine statistische Festlegung der ReferenzbereiDer Doppelsandwich-ELISA auf Lektinbasis zur Detektion
che voraussetzt, war aber im gegebenen Zeitrahmen nicht
von gegen das Matrixprotein gerichteter AK gestaltet sich
möglich.
demnach wie folgt:
2. Mit Hilfe eines statistischen Testverfahrens für abhängi1. Beschichtung der Festphase mit ConA
ge Stichproben konnte die Aussage getroffen werden, dass
2. Inkubation mit dem Zucker Mannan
beide Tests im Wesentlichen gleichartig klassifizieren.
3. Blockierung
3. Sowohl beim Pferd als auch beim Menschen existieren
4. Inkubation mit rekombinantem Protein M
gegen das BDV-Matrixprotein gerichtete AK. Bisher wa5. Inkubation mit Probandenserum (Primärantikörper)
ren derartige AK nur in experimentell infizierten Labor6. Inkubation mit alkalischem phosphatase-konjugiertem
tieren und wenigen Pferdeprobanden nachgewiesen worSekundärantikörper
den. Es gelang mir, Anti-BDV-M-AK nun erstmalig auch
7. Sichtbarmachung der Reaktion durch Substratzusatz
beim Menschen zu zeigen. Pferdeseren: 50 % Anti-BDV8. Messung mittels Multikanalphotometer
M-AK positiv im Lektin-ELISA; Humane Seren: 28,3 %
Anti-BDV-M-AK positiv im Lektin-ELISA.
ELISA auf GST-Basis
4. Anti-BDV-M-AK treten sowohl mit zirkulierenden ImGlutathion (GSH) ist ein Triaminopeptid. Es wird kovamunkomplexen, als auch gleichzeitig mit Antigen auf.
lent an die Polystyrenoberfläche der verwendeten MikrotiAufgrund dieser Ergebnisse scheinen diese AK – entgegen
terplatte gekoppelt. In einem Ein-Schritt-Verfahren interfrüherer Annahmen – mehr mit einer akuten Virusaktiagiert es mit Glutathion-S-Tranferase (GST) unter Ausbilvierung zu korrelieren.
dung einer starken Enzym-Substrat-Bindung.
5. Anti-BDV-M-AK treten bei symptomatischen Pferden mit
Beim vorliegenden Doppelsandwich-ELISA-Verfahren
36,8 % häufiger auf, als bei symptomfreien Pferdeprozur Detektion von gegen das Matrixprotein gerichteter AK
banden. (Für humane Probanden konnte hier keine Auswird die GST-gekoppelte Festphase eingesetzt, um GST-“gesage getroffen werden, da die Stichprobe in dieser Gruptaggtes“ BDV-Fusionsprotein M zu binden. Sind gegen das Mpe hinsichtlich der Symptomatik zu klein war.)
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Abb. 2: Bindung eines GST-“getaggten“ Proteins an die GSH-gekoppelte Festphase
(Bildquelle: www.nunc.com Instruction Protocol Nunc Immobilizer Glutathione)
6. In der humanen Testgruppe konnten für 46,2 % der Probanden mit latenter BDV-Infektion (d. h. Präsenz von gegen das N-Protein gerichteter AK, aber Fehlen von zirkulierenden Immunkomplexen) Anti-BDV-M-AK nachgewiesen werden. Diese AK-Prävalenz könnte meiner Meinung nach insofern von großem Interesse sein, als AK gegen das Matrixprotein virus-neutralisierende Eigenschaften zugeschrieben werden und damit eine protektive Wirkung für die betreffenden Individuen im Falle einer wiederholten Virusaktivierung verbunden sein könnte.
Zusammenfassung und Ausblick
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass ich in
der vorliegenden Diplomarbeit erstmalig AK-Spezifitäten in der
Immunantwort von mit BDV infizierten Pferden und Menschen differenzieren und damit einen Beitrag zum tieferen
Verständnis des BDV-Infektionsgeschehens liefern konnte.
Mit Hilfe zweier neu entwickelter ELISA-Testsysteme gelang es mir, Anti-BDV-M-AK beim Pferd und erstmalig auch
beim Menschen nachzuweisen.
In Zukunft wird die Etablierung eines der beiden Systeme
einen wichtigen Schritt in der BDV-Diagnostik darstellen,
wobei hier natürlich finanzielle Aspekte, die Verfügbarkeit von
Reagenzien und Materialien, sowie die Praktikabilität der
Durchführung eine wesentliche Rolle
spielen werden.
■
Carina Gumpoldsberger
Biomedizinische Analytikerin
Zentrallabor AKh Linz
Ausbildung an der Akademie für den
Med. techn. Laboratoriumsdienst im MEDAZ AKh Linz von 2003
bis 2006. Die Diplomarbeit „Untersuchung von Profil und Häufigkeit der Infektion mit Borna Disease Virus (BDV) in Patienten
mit psychiatrischen Störungen und gesunden Probanden“ wurde im Jahr 2006 am Robert Koch Institut Berlin und an der Freien Universität Berlin im Fachbereich Veterinärmedizin, Abteilung Virologie, verfasst. Die Betreuung erfolgte durch Frau Priv.
Doz. Dr. Liv Bode und Herrn Prof. Dr. Hanns Ludwig.
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Österreichischer Berufsverband
der Biomedizinischen AnalytikerInnen
1150 Wien, Grimmgasse 31
Telefon: ++43/1/817 88 270
Fax: ++43/1/817 88 27-27
E-Mail: [email protected]
www.biomed-austria.at
Leitende Biomedizinische AnalytikerInnen – bitte melden!
biomed austria veranstaltet gemeinsam mit Roche Diagnostics vom 4. bis 6. Oktober 2007 ein Meeting für leitende
Biomedizinische AnalytikerInnen. Damit alle die Chance haben, an diesem Meeting teilzunehmen, ersuchen wir alle leitenden
Biomedizinischen AnalytikerInnen, sich zu melden. Sie bekommen dann sowohl die Einladung zu diesem Meeting als auch
in regelmäßigen Abständen Informationen von biomed austria zugeschickt.
Vorname
Nachname:
E-Mail:
Telefon:
Dienstgeber:
Position:
Für das Meeting der leitenden Biomedizinischen AnalytikerInnen vom 4. bis 6. Oktober habe ich folgende Wünsche:
Datum:
Unterschrift: