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AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV KLASSIFIZIERUNG: Familie: Bornaviridae Genus: Bornavirus Seite 1 von 9 1. ALLGEMEINES Die Infektion mit dem Virus der Bornaschen Krankheit (BDV) verursacht eine nicht-eitrige Encephalomyelitis. Empfängliche Tierarten sind vor allem Pferd und Schaf, aber auch Esel, Rind, Ziege, Katze und Hund. Experimentell ist die Infektion auf verschiedene Labortiere (Ratte, Maus, Kaninchen) zu übertragen. Neben Infektionen mit klinischer Symptomatik (Bewußtseins-, Verhaltens-, Bewegungsstörungen) werden auch klinisch inapparente Infektionen diagnostiziert. Die post mortem-Diagnostik mit Gehirnmaterial erfolgt durch (i) die histopathologische Untersuchung, (ii) den Antigennachweis, (iii) die Virusisolierung und (iv) den Nachweis viraler RNA mit Hilfe der Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR). Im Unterschied zur Diagnostik am verstorbenen Tier ist die labordiagnostische intra vitamDiagnostik schwieriger. Sie erfolgt durch (i) den Nachweis BDV-spezifischer Antikörper im Serum bzw. Liquor cerebrospinalis, (ii) den Nachweis viraler RNA in Zellen des peripheren Blutes oder (iii) durch den Nachweis von Antigen in Zellen des peripheren Blutes. Die Virusisolierung aus Zellen des peripheren Blutes ist bis heute nur in Einzelfällen gelungen und für die Routinediagnostik nicht geeignet. 2. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 2.1. Direkter Virusnachweis intra vitam: EDTA-Blut post mortem: Gehirn 2.2. Indirekter Virusnachweis Serum 3. UNTERSUCHUNGSGANG 3.1. Direkter Virusnachweis 1 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 2 von 9 3.1.1. Virusanzüchtung aus Gehirngewebe Die Virusanzüchtung in der Zellkultur aus dem Überstand von 10 %igen Gehirnhomogenaten gelingt bei experimenteller Infektion meist problemlos, während sie bei natürlich infizierten Tieren nicht regelmäßig gelingt. 3.1.1.1. Herstellung eines 10 %igen Gehirnhomogenats - Homogenisierung von 1 g Gehirngewebe (Hippocampus, Cortex cerebri) in einem Glashomogenisator unter Zugabe von eiskaltem 'Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)' mit 2 % fetalem Kälberserum (FKS) - Dreimalige Ultraschall-Behandlung für je 15 Sek. - 10 Min. zentrifugieren bei 1000 x g - Aufbewahren des Überstandes bei -80 °C 3.1.1.2. Virusisolierung - Einsäen von 'Rabbit Embryonic Brain' (REB) Zellen in Chamber Slides (pro Kavität 1-2 x 104 REB Zellen in 100 µl DMEM, 2 % FKS) - Zugabe von 100 µl pro Kavität eines 10 %igen Gehirnhomogenats - 2 Std. Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2 - Ersetzen des Mediums durch 350 µl DMEM mit 10 % FKS - Inkubation über 10 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 - 6 Std. Fixierung der Zellen mit eiskaltem Aceton Zur Darstellung BDV-spezifischen Antigens mittels der indirekten Immunofluoreszenztechnik werden die so angefertigten Chamber Slides wie unter 3.1.3. beschrieben mit einem BDVImmunserum der Ratte und dem entsprechenden mit FITC-markierten anti-Spezies-IgG inkubiert. Wird die Virusisolierung als Titration durchgeführt, kann als Virustiter die Verdünnungsstufe bestimmt werden, bei der im Doppelansatz noch eine Zellgruppe mit BDV-spezifischer Fluoreszenz sichtbar ist. 3.1.2. Antigennachweis - Entnahme von Gehirnmaterial (Hippocampus, Cortex cerebri) - Fixierung der Gewebe in 10 %igen, nicht-gepuffertem Formalin 2 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 3 von 9 - Einbettung in Paraffin Nachweis viralen Antigens mittels der Peroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Technik wird unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 'Bo18' durchgeführt. Der paraffingängige Antikörper 'Bo18' ist gegen das Nukleoprotein (p40) des BDV gerichtet und in den Publikationen Haas et al., 1986 und Morales et al., 1988 näher charakterisiert. 3.1.3. RNA-Nachweis 3.1.3.1. RNA-Isolierung aus Gehirngewebe - Homogenisierung von 1 g Gehirngewebe (Hippocampus, Cortex cerebri) in einem Glashomogenisator unter Zugabe von 5 ml GTC Lösung - Überführen des Homogenats in ein steriles Kunststoff-Zentrifugengefäß (15 ml) - Zugabe von 500 µl 2 M Na-Acetat (pH 4.0), schütteln - Zugabe von 5 ml Phenol (wassergesättigt), schütteln - Zugabe von 1 ml Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) - 15 Sek. schütteln und Inkubation auf Eis für 10 min. - 5 Min. zentrifugieren bei 4000 RPM - Abnahme der oberen wässrigen Phase - Zugabe des gleichen Volumens Isopropanol, durchmischen - Präzipitation über Nacht bei -20 °C - 10 Min. zentrifugieren bei 4000 RPM - Aufnahme des Pellet in 1.5 ml GTC Lösung - Überführen in neues steriles Kunststoff-Zentrifugengefäß (15 ml) - Zugabe von 50 µl 2 M Na-Acetat (pH 4.0), schütteln - Zugabe von 1.5 ml Phenol (wassergesättigt), schütteln - Zugabe von 300 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) - 15 Sek. schütteln und Inkubation auf Eis für 15 min. - 10 Min. zentrifugieren bei 4000 RPM - Abnahme der oberen wässrigen Phase - Zugabe des gleichen Volumens Isopropanol, durchmischen - Präzipitation über Nacht bei -20 °C - 5 Min. zentrifugieren bei 4000 RPM - Verwerfen des Überstandes, Aufnahme des Pellets in 70 % Ethanol und Überführen in ein Eppendorf Tube 3 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 4 von 9 - 3 Min. zentrifugieren bei 12000 RPM - Verwerfen des Überstandes und erneutes Waschen des Pellets mit 70 % Ethanol - Abnehmen des Überstandes und Trocknen des Pellets - Resuspendieren des getrockneten Pellets in 100 µl RNase-freiem Aqua bidest. - Photometrische Bestimmung des RNA-Gehaltes 3.1.3.2. RNA-Isolierung aus Zellen des peripheren Blutes Zur intra vitam-Diagnostik wird neuerdings zusätzlich der Nachweis viraler RNA in Zellen des peripheren Blutes mit der Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt. Die Isolierung der gesamten zellulären RNA erfolgt unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Qiagen 'RNeasy blood kit') nach Protokoll des Herstellers. Hierbei wird nach Erythrozytenlyse die Gesamtheit aller Leukozyten für die anschließende RNA-Isolierung berücksichtigt. Nach Denaturierung der Zellen mittels GuanidiniumIsothiocyanat und Zentrifugation durch ein Sieb wird das hergestellte Homogenat auf eine mit Silica-Matrix beschickte Säule pipettiert. Diese adsorbiert RNA-Moleküle mit einer Größe von über 100 Nukleotiden. Zur Beseitigung von Protein- und Salzkontaminationen wird die Säule mehrfach gewaschen. Nach Trocknung der Silica-Matrix wird die RNA mittels RNasefreiem Aqua bidest. eluiert. 3.1.3.3. Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR Der Nachweis viraler RNA in Gehirngewebe und peripheren Blutzellen wird mit einem sogenannten 'Ein-Schritt' System (Firma Qiagen, Hilden [One Step RT-PCR Kit]) durchgeführt, bei dem die Reverse Transkription (RT) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ohne zwischenzeitliches Öffnen des Reaktionsgefäßes durchgeführt werden. RT-PCR - 3 Min. Inkubation von 20 µl der isolierten RNA (in 0.2 ml PCR Tubes) bei 72 °C - 3 Min. Kühlung auf Eis - Zugabe des Reaktionsgemisches (30 µl) bestehend aus: je 100 pmol der Primer p40 s und p40 as (siehe Anhang), 10 µl 'One Step' RT-PCR Puffer, 10 µl 'Q-Solution', 2 µl dNTP (400 µmol je dNTP), 2 µl Enzym Mix, 0.25 µl RNAsin und 3.75 µl nukleasefreien Wassers. - 30 Min. Inkubation bei 50 °C (Reverse Transkription) - 15 Min. Inkubation bei 95 °C (Inaktivierung der Reversen Transkriptase und Aktivierung der 'Hotstar Taq DNA Polymerase') 4 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 5 von 9 - Amplifizierung der synthetisierten cDNA in 45 Zyklen bestehend aus 30 Sek. Denaturierung bei 94 °C, 45 Sek. 'Annealing' bei 56.5 °C und 1 Min. Polymerisierung bei 72 °C - 10 Min. Inkubation bei 72 °C nested PCR - Zugabe von 5 µl des RT-PCR Produktes zu 45 µl eines Reaktionsgemisch bestehend aus: je 100 pmol der Primer p40 nested s und p40 nested as (siehe Anhang), 0.2 mM dNTP, Expand High Fidelity Puffer mit 1.5 mM MgCl2 , und 2.6 U Expand High Fidelity PCR System Enzym mix (Roche, Mannheim) und 33.25 µl nuklease-freies Wasser. - 2 Min. Denaturierung der DNA bei 94 °C - Amplifizierung der DNA in 45 Zyklen bestehend aus je 30 Sek. Denaturierung bei 94 °C, 30 Sek. 'Annealing' bei 55 °C und 45 Sek. Polymerisierung bei 72 °C - 10 Min. Inkubation bei 72 °C - Analyse der PCR-Produkte nach Agarose-Gelelektrophorese Die Primer p40 s und p40 as synthetisieren ein Produkt der Länge von 449 Basenpaaren. Die Primer p40 nested s und p40 nested as synthetisieren ein Produkt der Länge von 281 Basenpaaren. 3.2. Indirekter Virusnachweis Der Antikörpernachweis wird mit der indirekten Immunofluoreszenztechnik durchgeführt. Andere serologische Nachweisverfahren (ELISA, Western Blot) zeigen häufig unspezifische Reaktionen. Zur Durchführung des indirekten Immunofluoreszenztests werden persistent BDV-infizierter 'Madin Darby Canine Kidney' (MDCK) Zellen verwendet. Zur Vermeidung unspezifischer Reaktionen wird das zu untersuchende Serum vorher an Schweineleberpulver adsorbiert. Liquorproben als auch Seren experimentell infizierter Tiere müssen nicht adsorbiert werden. 3.2.1. Adsorption der Seren - 100 mg (Spatelspitze) Schweineleberpulver in Eppendorf Tube mit 1 ml PBS aufschwemmen - 10 Min. bei Zimmertemperatur inkubieren - 5 Min zentrifugieren bei 4000 RPM, Überstand verwerfen - Testseren 1:5 in 20 %igem Schweineserum (in PBS) verdünnen 5 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 6 von 9 - 0.5 ml des verdünnten Testserums mit aufgeschwemmtem Schweineleberpulver mischen - 15 Min. bei Zimmertemperatur inkubieren - 5 Min. zentrifugieren bei 4000 RPM - Testseren abnehmen (=1:5 verdünnt) 3.2.2. Indirekter Immuniofluoreszenztest Der Nachweis BDV-spezifischer Antikörper erfolgt auf Chamber Slides, die mit BDVinfizierten MDCK (BDV-MDCK) Zellen beschichtet sind. Zur Herstellung werden pro Kavität 2 x 104 BDV-MDCK Zellen in 200 µl DMEM mit 5 % FKS eingesät und 4 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach Fixierung mit Aceton werden die Chamber Slides bis zur Verwendung bei -20 °C aufbewahrt. - Auftauen der Chamber Slides bei Zimmertemperatur - 20 Min. Inkubation bei Zimmertemperatur mit unverdünntem Schweineserum - Schweineserum abklopfen, nicht waschen - Pro Kavität 50 µl der zu untersuchenden Serum- bzw. Liquorprobe auftragen - 60 Min. inkubieren in feuchter Kammer bei 37 °C - 3 x mit PBS waschen - PBS abklopfen und restliches PBS mit Zellstoff absaugen - Pro Kavität 60 µl des entsprechenden anti-Spezies-IgG FITC-Konjugates zugeben - 30 Min. inkubieren in feuchter Kammer bei 37 °C - 2 x mit PBS und 1 x mit Aqua demin. waschen - Slide trocknen und im Fluoreszenzmikroskop auf BDV-spezifische intranukleäre Fluoreszenz untersuchen 4. VALIDIERUNG DER METHODEN Die RT-PCR wurde mittels synthetisch hergestellter RNA-Moleküle im Hinblick auf ihre Sensitivität und ihre Spezifität validiert. Hierbei wurde eine Nachweisgrenze von 10 RNAMolekülen festgestellt. Die Validierung durch eine unabhängige Institution (industrieller Partner) ergab das gleiche Ergebnis. Vom Robert Koch-Institut durchgeführte Ringversuche zum Nachweis BDV-spezifischer Antikörper ergab für die indirekte Immunofluoreszenztechnik bei natürlich infizierten Tieren eine hohe Spezifität. Da der Test mit einem Fluoreszenzmikroskop abgelesen, wird ist die Charakterisierung der Zellen, eine genaue Durchführung des Tests, wie auch Erfahrung des Durchführenden bei der Beurteilung erforderlich. 6 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 7 von 9 ANHANG Nukleotidsequenz und Lokalisation der verwendeten Primer: Primer Sequenz (5' - 3') Lokalisation* p40 s ACGCCCAGCCTTGTGTTTCT 270-289 p40 as AATTCTTTACCTGGGGACTCAA 720-697 p40 nested s TTACGGGGAAAAGACGA 407-423 p40 nested as TTAGTAGAGACAACACAAAGGAG 687-666 *Briese et al., 1994. Guanidinium-Isothiocyanat (GTC) Vorratslösung - Zugabe von 293 ml Aqua bidest zu 250 g GTC - Zugabe von 17.6 ml 0.75 M Natriumcitrat (pH 7.0) - Zugabe von 26.4 ml 10 % Sarcosyllaurinat - Substanzen im Wasserbad bei 65 °C lösen (kann bei Zimmertemperatur 3 Monate aufbewahrt werden) Gebrauchslösung - Zugabe von 0.36 ml 2-Mercaptoethanol zu 50 ml Vorratslösung Endkonzentration: 4 M Guanidinium-Isothiocyanat (GTC) 25 mM Natriumcitrat (pH 7.0) 0.5 % Sarcosyllaurinat 0.1 M 2-Mercaptoethanol (kann bei Zimmertemperatur einen Monat aufbewahrt werden) 0.75 M Natriumcitrat-2-Hydrat (pH 7.0) 22.058 g Natriumcitrat-2-Hydrat in 100 ml H20 lösen und mit Zitronensäure auf pH 7.0 einstellen 2 M Natriumacetat (pH 4.0) 22.058 g Natriumacetat-3-Hydrat in 100 ml H20 lösen und mit Essigsäure auf pH 4.0 einstellen wassergesättigtes Phenol 250 g Phenol zur RNA-Isolierung 110 ml Aqua bidest. 0.1 % Hydroxychinolin 7 AVID XIII/2002 Virus der Bornaschen Krankheit (BDV Seite 8 von 9 LITERATUR Bode L, Riegel S, Lange W, Ludwig H (1992): Human infections with Borna disease virus: seroprevalence in patients with chronic diseases and healthy individuals. 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