DissertationRamonaSarfert

Proteasominhibitorbehandlung
bei Patienten mit therapierefraktärem
systemischen Lupus erythematodes
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Ramona Sarfert, geb. Peukert
aus
Münchberg
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 10. Juli 2014
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. med. B. Manger
Prof. Dr. med. G. Schett
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ................................................................................................. 1
1.1 Zusammenfassung .............................................................................................. 1
1.2 Abstract ............................................................................................................... 3
2. Einleitung ................................................................................................................ 5
2.1 Systemischer Lupus erythematodes (SLE) .......................................................... 5
2.1.1 Definition....................................................................................................... 5
2.1.2 Überblick über das Immunsystem und die Entstehung von
Autoimmunkrankheiten .......................................................................................... 7
2.1.3 Autoantikörper .............................................................................................. 8
2.1.4 Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) ............... 10
2.1.5 Behandlungsstrategien bei SLE .................................................................. 12
2.2 Proteasom und Proteasominhibition durch Bortezomib ..................................... 14
2.3 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit ...................................................... 16
3. Materialien und Methoden .................................................................................... 18
3.1 Materialien......................................................................................................... 18
3.1.1 Verbrauchsmaterialien ................................................................................ 18
3.1.2 Tetanus-Toxoid-ELISA................................................................................ 18
3.1.2.1 Puffer und Lösungen ............................................................................ 18
3.1.2.2 Antigene und Antikörper ....................................................................... 19
3.1.2.3 Geräte .................................................................................................. 19
3.1.3 Varelisa ANA Profile Assay ......................................................................... 19
3.1.3.1 Puffer und Lösungen ............................................................................ 19
3.1.3.2 Antigene und Antikörper ....................................................................... 20
3.1.3.3 Geräte .................................................................................................. 20
3.2 Methoden .......................................................................................................... 21
3.2.1 Patientenkollektiv ........................................................................................ 21
3.2.2 Behandlung mit Bortezomib ........................................................................ 21
3.2.3 Bestimmung von lupusassoziierten Serumparametern ............................... 23
3.2.3.1 Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) .................... 23
3.2.3.2 Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) ................................. 24
3.2.3.3 Komplementfaktoren C3 und C4 .......................................................... 25
3.2.4 Bestimmung der Proteinausscheidung im 24-Stunden-Urin ........................ 25
3.2.5 Bestimmung protektiver Antikörper ............................................................. 26
3.2.5.1 Tetanus-Toxoid-Antikörper ................................................................... 26
3.2.5.2 Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen .............................. 28
3.2.6 Dokumentation im SLEDAI ......................................................................... 28
4. Ergebnisse ............................................................................................................ 30
4.1 Auswirkungen der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der
Autoantikörper gegen dsDNA und ENA ................................................................... 30
4.2 Komplementfaktoren C3 und C4 ....................................................................... 35
4.3 Renale Proteinausscheidung bei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis im
Verlauf .................................................................................................................... 38
4.4 Einfluss von Bortezomib auf protektive Antikörper ............................................. 41
4.5 Verlauf der Krankheitsaktivität anhand des SLEDAI .......................................... 42
4.6 Unerwünschte Wirkungen unter der Therapie mit Bortezomib ........................... 44
4.7 Zusammenfassung ............................................................................................ 45
5. Diskussion ............................................................................................................ 47
5.1 Einfluss von Bortezomib auf die Antikörperproduktion durch Elimination von
Plasmazellen ........................................................................................................... 48
5.2 Effekt von Bortezomib auf den Krankheitsverlauf bei aktiver Nephritis .............. 50
5.3 Proteasominhibition als zukünftige Therapieoption bei refraktärem SLE? ......... 53
6. Literaturverzeichnis .............................................................................................. 56
7. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 65
1
1. Zusammenfassung
1.1 Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele:
Die Behandlung von Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankungen stellt auch in der
gegenwärtigen Medizin noch immer eine große Herausforderung dar. Bislang
einsetzbare Therapieverfahren müssen oft aufgrund schwerer Nebenwirkungen oder
Wirkungslosigkeit abgebrochen werden. Autoantikörper-produzierende langlebige
Plasmazellen, die gegenüber konventionellen Therapeutika wie Glucocortikoiden und
Cyclophosphamid weitestgehend resistent sind, dürften entscheidend zu den häufigen
therapierefraktären Krankheitsverläufen beitragen (Hiepe et al., 2011).
Der systemische Lupus erythematodes ist eine vorwiegend Antikörper-vermittelte
Autoimmunerkrankung. Insbesondere durch Ablagerung von Immunkomplexen im
Gewebe kommt es zu einer Schädigung zahlreicher Organe. In Mausmodellen für den
SLE konnte gezeigt werden, dass der Proteasominhibitor Bortezomib, der für die
Behandlung des multiplen Myeloms zugelassen ist, nicht nur kurzlebige, sondern auch
die langlebigen Plasmazellen eliminiert und so zu einer Verbesserung der
Lupusnephritis und Abnahme der Autoantikörpertiter führt (Neubert et al., 2008).
Diese Ergebnisse gaben Anlass zu der Annahme, dass Bortezomib auch beim
Menschen zu einer deutlichen Verminderung der Autoantikörperproduktion führen kann
und die Proteasominhibition somit zukünftig eine neue Behandlungsmethode für
Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankungen, wie den SLE, darstellen könnte.
Materialien und Methoden:
Im
Rahmen
individueller
Heilversuche
wurde
bei
fünf
Patientinnen
mit
therapierefraktärem SLE eine Behandlung mit Bortezomib durchgeführt. Jede Patientin
wurde vor Therapiebeginn über die off-label-Behandlung aufgeklärt und willigte
schriftlich ein. Bortezomib wurde in einer Dosis von 1,3 mg/m2 Körperoberfläche an
den Tagen 1, 4 und 8, sowie bei den Patientinnen 4 und 5 zu Beginn auch an Tag 11
intravenös (i.v.) verabreicht. Dazu erhielten die Patientinnen oral (p.o.) 20 mg
Dexamethason
und
2x
400
mg/Tag
Aciclovir
zur
Prophylaxe
einer
Herpesvirusreaktivierung. In einem Abstand von zwei bis vier Wochen wurden die
Therapiezyklen bis zu fünfmal wiederholt. Im Verlauf wurden folgende Parameter
bestimmt:
Antikörper
gegen
ENA
bei
Patientin
1-3,
Anti-dsDNA-Antikörper,
2
Komplementfaktoren C3 und C4, Proteinurie/24h bei Patientin 2-4, Impfantikörper
gegen Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen und der Krankheitsaktivitätsindex SLEDAI.
Ergebnisse:
Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit
und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine nennenswerten
Nebenwirkungen auf.
Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich bei allen Patientinnen drei
Monate nach Therapiebeginn eine verminderte Krankheitsaktivität. Die Antikörper
gegen dsDNA lagen bei einer Patientin nach der Therapie im physiologischen Bereich,
während die Antikörper gegen ENA bei den Patientinnen 1-3 nur geringe
Veränderungen zeigten. Die Komplementfaktoren C3 und C4 stiegen unter der
Therapie tendenziell wieder an. Bei den Patientinnen 2-4 mit aktiver Lupusnephritis
ging die Proteinausscheidung im 24h-Urin deutlich zurück, wobei Patientin 2 bis sechs
Monate nach Therapiebeginn sogar eine Proteinausscheidung im physiologischen
Bereich
zeigte.
Die
Bestimmung
der
Tetanus-Toxoid-
und
HBs-Antikörper-
Konzentrationen ergab nach der Behandlung mit Bortezomib eine mäßiggradige
Abnahme, die Konzentrationen blieben aber im protektiven Bereich.
Schlussfolgerungen:
Sowohl die Autoantikörperproduktion, als auch die klinischen Symptome sowie die
Lupusnephritis wurden bei den SLE-Patienten durch die Behandlung mit Bortezomib
meist erheblich gebessert. Kontrollierte klinische Studien sollten demnach prüfen, ob
die Proteasominhibition zukünftig eine neue Option zur Behandlung therapierefraktärer
Antikörper-vermittelter Erkrankungen darstellt.
3
1.2 Abstract
Introduction:
Successful treatment of antibody-mediated diseases is a great challenge even in
modern medicine. Current treatments often have to be interrupted because of severe
side effects or insufficient treatment response. Autoantibody-secreting long-lived
plasma cells are quite resistant to conventional treatments and hence, they may
frequently cause refractory disease (Hiepe et al., 2011).
Systemic lupus erythematosus is a classical autoimmune disease mainly driven by
pathogenic
autoantibodies.
Production
of
autoantibodies
and
deposition
of
immuncomplexes lead to damage of several organs. We showed that the proteasome
inhibitor bortezomib, which is approved for the treatment of multiple myeloma,
efficiently eliminates short- as well as long-lived plasma cells, reduces autoantibody
titres and ameliorates lupus nephritis in mouse models of SLE (Neubert et al., 2008).
Due to these auspicious results in mice, off label therapy with bortezomib was offered
to SLE patients who had failed conventional treatments. The favorable responses
implicate that proteasome inhibition might represent a new way to manage antibodymediated diseases like SLE.
Methods:
Five refractory SLE patients received bortezomib intravenously at a dose of 1.3 mg/m2
body surface. Three patients were injected at day 1, 4 and 8, two patients additionally
at day 11. The patients had given informed consent to off label treatment before start of
treatment. The patients received 20 mg dexamethasone at the day of bortezomib
injection and 2x 400 mg aciclovir p.o. daily for herpes prophylaxis during the treatment
period. Treatment cycles were repeated up to five times with a time interval of two to
four weeks. The following parameters were monitored: antibodies to ENA in patient 13, antibodies to dsDNA, complement C3 and C4, proteinuria/24h in patient 2-4,
antibodies to tetanus toxoid and hepatitis B surface antigen, and the disease activity
SLEDAI.
Results:
No serious adverse effects have been observed during bortezomib treatment. Some
patients experienced fever, cephalgia, nausea and diarrhea within one day after
injection. The SLEDAI illustrated reduced disease activity in all patients. Antibodies to
dsDNA strongly decreased or even nearly disappeared, while antibodies to ENA in
4
patients 1-3 showed only moderate alterations. In general concentrations of
complement C3 and C4 have increased upon treatment with bortezomib. Protein
excretion decreased considerably in the three patients with active lupus nephritis, even
reaching the physiological range in one patient. Antibody concentrations to tetanus
toxoid and hepatitis B surface antigen decreased, but remained within protective range.
Conclusion:
Autoantibody production as well as clinical symptoms and lupus nephritis were
markedly ameliorated in SLE patients treated with bortezomib. Clinical trials should be
initiated to investigate if proteasome inhibition may be a new option in treatment of
refractory autoantibody-mediated diseases.
5
2. Einleitung
2.1 Systemischer Lupus erythematodes (SLE)
2.1.1 Definition
Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine Multisystemerkrankung, bei der
Autoantikörper an verschiedenen Krankheitsmanifestationen entscheidend beteiligt
sind.
So
initiieren
Manifestationen
Immunkomplexe
(Wallace,
2002,
S.
die
687),
Lupusnephritis
während
und
vaskulitische
zytotoxische
Antikörper
Immunthrombopenie und autoimmunhämolytische Anämie verursachen (Quismorio,
2002, S. 800-802). Auch der neonatale Lupus mit kongenitalem Herzblock wird wohl
durch zytotoxische Antikörper gegen Ro/SS-A induziert (Reichlin, Harley, 2002, S. 468469). Im Verlauf der Erkrankung kommt es immer wieder zu Remissionen und
Exazerbationen, die lebensgefährlich sein können (Grossmann, Kalunian, 2002, S. 19).
Betroffen sind vor allem junge Frauen im gebärfähigen Alter. Als late-onset-SLE wird
eine
Form
bezeichnet,
die
nach
dem
50.
Lebensjahr
auftritt.
Die
Erkrankungswahrscheinlichkeit liegt bei Frauen ca. um den Faktor zehn höher als bei
Männern, die Inzidenz liegt bei etwa zwei bis acht Fällen pro 100.000 Einwohnern pro
Jahr (Rus, Hochberg, 2002, S. 67-68).
Bis heute ist die Ätiologie dieser Autoimmunerkrankung unbekannt. Aufgrund der
familiären Häufung und des gehäuften Auftretens innerhalb bestimmter ethnischer
Gruppen besteht eine genetische Komponente, unter anderem findet sich eine
Assoziation mit den HLA-Antigenen DR2 und DR3. Bei monozygoten Zwillingen wurde
eine ca. 50-prozentige Konkordanz für das Auftreten von SLE festgestellt, jedoch in
unterschiedlicher Ausprägung, wenn die eineiigen Zwillinge getrennt voneinander
aufgewachsen sind (Rus, Hochberg, 2002, S. 77). Dies weist darauf hin, dass auch
Umwelteinflüsse, besonders UV-Exposition, Infektionen und Medikamente, z.B.
Antihypertensiva, Antikonvulsiva oder bestimmte Antibiotika, an der Manifestation des
SLE beteiligt sind (Mongey, Hess, 2002, S. 33-35; Rubin, 2002, S.886).
Der systemische Lupus erythematodes ist eine lebensbedrohende Erkrankung, bei der
neben Haut und Gelenken vor allem die inneren Organe betroffen sein können.
Hingegen ist beim kutanen chronisch diskoiden Lupus erythematodes in über 90% der
Fälle nur die Haut betroffen. Beim SLE treten häufig Müdigkeit, Gewichtsverlust und
Fieber auf, das durch die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren, wie Interleukine,
Interferone und Prostaglandine und deren Wirkung auf temperaturregulierende Zentren
im Gehirn ausgelöst wird (Wallace, 2002, S. 625-626). Mit am häufigsten betroffen sind
6
beim SLE die Muskeln und Gelenke. Dabei kann eine zumeist nicht-erosive Arthritis
beobachtet werden, bei der es zu Morgensteifigkeit, Schwellung, Gelenkerguss und bei
fortgeschrittener Krankheit zu Deformitäten kommt (Wallace, 2002, S. 629-630).
Hautmanifestationen,
wie
das
charakteristische
Schmetterlingserythem,
Lichtempfindlichkeit oder diskoider Lupus mit roten Papeln und schuppenden Plaques,
kommen auch beim SLE vor (Dutz, Sontheimer, 2002, S. 549). Bei kardiovaskulären
und pulmonalen Manifestationen müssen leichtere Symptome wie Perikarditis oder
Pleuritis von den schweren und unter Umständen lebensbedrohlichen Komplikationen,
wie Myokardinfarkt, Arrhythmien, Herzklappenerkrankungen und Embolien abgegrenzt
werden
(D’Cruz
et
al.,
2002,
S.
645).
Sowohl
neurologische
als
auch
Nierenveränderungen gelten als prognosebestimmend. Eine zerebrale Vaskulitis kann
in kurzer Zeit über Fieber, Verwirrtheit und Kopfschmerz bis zu Krampfanfällen und
schließlich zu Koma und Tod führen (West, 2002, S. 698). Auch zerebrovaskuläre
Insulte oder MS-ähnliche Verläufe sind möglich. Bei über 40% der Patienten kommt es
zum Auftreten einer Lupusnephritis. Dabei handelt es sich oft um eine ImmunkomplexGlomerulonephritis, in deren Folge es zu einer rasch progredienten, meist diffusen
Schädigung
der
Glomeruli
(WHO Grad IV)
und
zu
einer
eingeschränkten
Nierenfunktion bis hin zur chronischen Niereninsuffizienz und Dialysepflichtigkeit
kommen
kann.
Klinisch
äußert
sich
eine
Nierenbeteiligung
durch
eine
asymptomatische Proteinurie oder Hämaturie, sowie durch Akanthozyten im
Urinsediment (Ehrenstein, 1995; Kashgarian, 2002, S. 1070).
Im Jahre 1971 entstanden durch das American College of Rheumatology (ACR) die
ersten Klassifikationskriterien für klinische Studien. Die ursprünglich 14 Kriterien
wurden bis 1997 um drei reduziert. Ein SLE ist dann als wahrscheinlich anzunehmen,
wenn
mindestens
vier
der
elf
Kriterien
zutreffen.
Dazu
gehören:
Schmetterlingserythem, diskoider Lupus erythematodes, Fotosensibilität, orale oder
nasale Schleimhautulzera, nichterosive Arthritis von zwei oder mehr Gelenken,
Serositis (Pleuroperikarditis), Nierenbeteiligung (pathologische Proteinurie), ZNSBeteiligung
(Krampfanfälle,
Thrombopenie,
Leukopenie),
doppelsträngige
DNA,
Psychosen),
immunologische
Antikörper
Antiphospholipidantikörper)
und
Blutbildveränderungen
gegen
positive
Befunde
extrahierbare
antinukleäre
(Anämie,
(Antikörper
nukleäre
Antikörper
gegen
Antigene,
(Grossmann,
Kalunian, 2002, S. 19). Die Diagnose und Entscheidung zur Therapie sollte in jedem
Fall anhand einer Zusammenschau von Laborparametern und klinischen Symptomen
gestellt werden.
7
2.1.2 Überblick über das Immunsystem und die Entstehung von
Autoimmunkrankheiten
Das Immunsystem kann in das unspezifische, angeborene und das spezifische,
erworbene Immunsystem unterteilt werden. Während das angeborene Immunsystem
mithilfe
einiger
Dutzend
Muster-Erkennungsrezeptoren
Gruppen
von
Krankheitserregern erkennt, besitzen die Lymphozyten des adaptiven Immunsystems
viele Millionen verschiedener Rezeptoren, deren Spezifitäten durch somatische
Rekombination entstehen und die hochspezifisch bestimmte Antigene bzw. Erreger
erkennen. Vor allem besitzt das adaptive Immunsystem eine hochspezifische
Gedächtnisfunktion, die den Organismus effektiv vor wiederholten Infektionen mit den
gleichen Erregern, besonders Viren, schützt. In Knochenmark und Thymus, die auch
als primäre lymphatische Organe bezeichnet werden, reifen die B- und T-Zellen heran,
die bei der spezifischen Immunantwort eine zentrale Rolle spielen. Autoreaktive Zellen,
die gegen körpereigene Antigene gerichtet sind, werden in Thymus und Knochenmark
im
Rahmen
der
negativen
Selektion
weitgehend
eliminiert.
Binden
unreife
Lymphozyten Selbstantigene mit hoher Affinität, so werden sie durch Apoptose
eliminiert. Dieser Vorgang wird auch als zentrale Toleranz bezeichnet (Hof et al., 2009,
S. 48-51). Gelangen trotz dieser negativen Selektion autoreaktive T- oder B-Zellen in
die Peripherie, so stellt dies zunächst kein Problem dar, solange die Zellen nicht
aktiviert werden. Bei Autoimmunerkrankungen kann allerdings eine Störung der
Mechanismen, die für die immunologische Toleranz verantwortlich sind, dazu führen,
dass zirkulierende CD4+ T-Helferzellen durch die Erkennung körpereigener Antigene,
die über MHC-II-Moleküle der dendritischen Zellen präsentiert werden, aktiviert
werden. Es kann auch zu einer Umgehung der T-Zell-Toleranz kommen, wenn
Antigene durch Umweltfaktoren, Medikamente oder Mikroorganismen modifiziert
werden und T-Zellen diese modifizierten Selbstantigene als körperfremd erkennen
(Böcker et al., 2004, S. 1116). Die aktivierten T-Helferzellen interagieren selektiv mit BZellen, die ihnen das Antigen, das sie über Ihren B-Zellrezeptor internalisiert haben, in
MHC-II-Molekülen
präsentieren.
Diese
B-Zellen
werden
anschließend
über
Zelloberflächenrezeptoren sowie die Produktion von Wachstumsfaktoren aktiviert,
unterlaufen gegebenenfalls in den Keimzentren der Lymphknoten die Affinitätsreifung
und differenzieren schließlich zu Plasmazellen, die Antikörper gegen das präsentierte
körpereigene Antigen bilden (Hof et al., 2009, S.105). Durch die Ausbildung eines
Immungedächtnisses in Form von autoreaktiven T- und B-Zellklonen, kann die
Immunantwort gegen körpereigene Antigene immer wieder ablaufen. Die von den
Plasmazellen produzierten Autoantikörper binden z. B. an Oberflächenstrukturen von
Zellen
oder
formen
Immunkomplexe
und
lösen
so
die
Aktivierung
des
8
Komplementsystems aus. Komplementfaktoren binden die Immunkomplexe und führen
sie der Phagozytose zu. Durch die überschießende Immunkomplexbildung bei einigen
Autoimmunerkrankungen, kann deren Abbau durch phagozytierende Zellen jedoch
unter Umständen nicht kompensiert werden, was die Ablagerung der Immunkomplexe
im Gewebe zahlreicher Organe begünstigen dürfte (Hof et al., 2009, S. 140).
Die Organschädigung beim SLE wird vor allem durch Autoantikörper, die mit nukleären
Bestandteilen, wie doppelsträngiger DNA (dsDNA) oder Histonen Immunkomplexe
bilden und durch proinflammatorische Moleküle, wie Zytokine, Chemokine oder
Sauerstoffradikale hervorgerufen. Umweltfaktoren, wie UV-Licht oder Medikamente,
sowie genetische Faktoren und ein gestörter Metabolismus weiblicher Sexualhormone
können zu einer abnormalen Immunantwort führen, bei der immunregulierende
Mechanismen beeinträchtigt sind (Hahn, 2002, S. 90-91). Regulatorische T-Zellen, die
normalerweise die überschießende Aktivität von Effektor-T-Zellen supprimieren,
wurden bei SLE-Patienten in verminderter Zahl bzw. herabgesetzter Aktivität gefunden
(Scheinecker et al., 2010). Daraus resultiert eine mangelnde Kontrolle der B-Zellen,
was eine vermehrte Produktion von Autoantikörpern durch Plasmazellen zur Folge hat.
Durch die Ablagerung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Gewebe kommt es
schließlich zu den typischen SLE-Manifestationen (Hahn, 2002, S. 87-88). Weitere
Mechanismen bei der Entstehung des SLE sind wahrscheinlich eine fehlregulierte bzw.
gesteigerte Apoptose und besonders die beeinträchtigte Phagozytose apoptotischer
sowie nekrotischer Zellen. Vor allem Nukleosomen bzw. dsDNA und Histone, die bei
der Apoptose entstehen, bilden eine Autoantigen-Quelle, die beim SLE zur
Autoantikörperbildung gegen Zellkernbestandteile beiträgt (Böcker et al., 2004, S.
1118). Insbesondere Antikörper gegen dsDNA spielen eine große Rolle, da sie mit der
Krankheitsaktivität des SLE korrelieren.
2.1.3 Autoantikörper
Im Rahmen der humoralen Immunantwort kommt es beim systemischen Lupus
erythematodes
zur
Bildung
von
Antikörpern gegen körpereigene Strukturen,
insbesondere gegen Zellkernbestandteile. Einige dieser Autoantikörper spielen
besonders für die Diagnosestellung des SLE eine wichtige Rolle, z.B. antinukleäre
Antikörper (ANA) und Anti-dsDNA-Antikörper, während die Anti-dsDNA-Antikörper,
Anti-Phospholipidantikörper sowie Antikörper gegen Erythrozyten, Leukozyten oder
Thrombozyten eine Bedeutung in der Immunpathogenese und bei der Zell- bzw.
Organschädigung haben.
9
Antikörper sind Proteine, die durch Plasmazellen entweder in membrangebundener
oder löslicher Form gebildet werden. Die antinukleären Antikörper beim SLE gehören
überwiegend der Immunglobulinklasse G (IgG) an, die von autoreaktiven Plasmazellen
gebildet werden. Über ihr Fc-Fragment können sie die Phagozytose der AntigenAntikörper-Komplexe und die Aktivierung des Komplementsystems einleiten (Peeva et
al., 2002, S. 391). Mit Hilfe eines Suchtests für ANA, dem Immunfluoreszenztest, kann
bei klinischem Verdacht auf einen SLE ein erster Schritt in Richtung der Diagnose
erfolgen. Werden ANA im Serum der Patienten in einem Verhältnis von mindestens
1:160 nachgewiesen, so werden diese Autoantikörper genauer spezifiziert, z.B. in
solche, die gegen dsDNA und Histone gerichtet sind und solche, die mit extrahierbaren
nukleären Antigenen (ENA) reagieren (Aringer et al., 2007, S. 16/17; Mierau et al.,
2002).
Die größte klinische Bedeutung kommt wohl den Antikörpern gegen doppelsträngige
(ds) DNA zu. Die Höhe der Anti-dsDNA-Antikörper-Titer ist mit der Krankheitsaktivität
und Exazerbationen des SLE assoziiert. Arbuckle et al. konnten in einer Studie mit 633
Patienten zeigen, dass 55% der Patienten bereits detektierbare Anti-dsDNA-Antikörper
aufwiesen, bevor klinische Zeichen des SLE erkennbar waren. Steigende AntikörperKonzentrationen kündigten den baldigen Ausbruch klinischer Zeichen des SLE an.
Zudem hatten Patienten mit einem sehr starken Anstieg der Anti-dsDNA-AntikörperTiter ein hohes Risiko, im weiteren Verlauf eine renale Manifestation des SLE zu
entwickeln (Arbuckle et al., 2001). Die Bindung der Antikörper bzw. die Ablagerung von
Immunkomplexen führt zu einer Entzündungsreaktion und letztlich zu schweren
Schäden
an
der
glomerulären
Basalmembran.
Eine
Glomerulonephritis
mit
fortschreitender Niereninsuffizienz ist die Folge (Aringer et al., 2007, S. 17). Antikörper
gegen dsDNA können außerdem Apoptose induzieren, so dass durch programmierten
Zelltod weitere Autoantigene aus dem Zellkern freigesetzt werden, die wiederum durch
Antikörper komplexiert werden können (Hahn, Tsao, 2002, S. 426).
Auch Antikörper gegen Nukleosomen korrelieren mit der Krankheitsaktivität des SLE
und mit der Ausprägung von Lupusnephritis und neuropsychiatrischen Manifestationen.
Nukleosomen stellen eine Untereinheit des Chromatins dar und bestehen aus Histonen
und doppelsträngiger DNA. Spezifische autoreaktive T-Zellen führen über die
Aktivierung von B-Zellen zur Antikörperproduktion. Über die Histonproteine erfolgt wohl
eine Bindung der Immunkomplexe zum Beispiel an die glomeruläre Basalmembran
(Bruns et al., 2000; Mierau et al., 2002).
Zu den extrahierbaren nukleären Antigenen gehören unter anderem Ro/SS-A, La/SSB, snRNP und Sm. Antikörper gegen Ro-Antigene finden sich bei ca. 40-60% der SLEPatienten und können mit Lichtempfindlichkeit und Hautläsionen in Verbindung
10
gebracht werden. Eine wichtige Rolle spielen Anti-Ro und auch Anti-La bei
schwangeren SLE-Patientinnen. Hier besteht ein erhöhtes Risiko, dass sich bei dem
Foeten ein kongenitaler Herzblock entwickelt. Bei einigen Kindern mit neonatalem
Lupus erythematodes wurden, ebenso wie bei den Müttern, Antikörper gegen Ro und
La nachgewiesen (Aringer et al., 2007, S. 20; Reichlin, Harley, 2002, S. 468). Die
snRNP (small nuclear Ribonukleoproteine) sind Komponenten des Spleißosoms,
welches RNA im Zellkern prozessiert und für die Translation vorbereitet. Sm-Proteine
sind wiederum Bestandteile der snRNP. Anti-Sm sind hochspezifisch für den SLE, so
dass sie in die ACR-Kriterien aufgenommen wurden. Fluktuationen in der Höhe der
Titer sind im Verlauf der Erkrankung möglich, ein komplettes Verschwinden wird
jedoch, auch unter intensiver Therapie, praktisch nie beobachtet. Anti-U1-RNP
kommen außer bei SLE auch noch bei der Mixed connective tissue disease (MCTD)
vor, gelten aber, besonders wenn sie gemeinsam mit Anti-Sm auftreten, als spezifische
Marker
für
SLE.
Weder
Anti-Sm
noch
Anti-U1-RNP
korrelieren
mit
der
Krankheitsaktivität. In einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass der
Nachweis von Anti-Sm bei SLE-Patienten mit einer geringeren Ausprägung von
Nephritis und neuropsychologischen Manifestationen assoziiert ist. Allerdings konnte
diese negative Assoziation nicht in allen Untersuchungen nachvollzogen werden. Trotz
der unklaren Bedeutung für die klinischen Manifestationen des SLE, sind die Anti-Sm
eine hilfreiche Ergänzung in der Diagnostik (Craft, 2002, S. 487-488). Bei Patienten mit
hohen
Konzentrationen
an
Anti-U1-RNP,
konnte
eine
erniedrigte
Rate
an
Lupusnephritis festgestellt werden (Aringer et al., 2007, S. 19).
Zur Diagnosefindung werden zunächst ANA und, bei positivem Befund, auch die
extrahierbaren nukleären Antigene (ENA) bestimmt, während insbesondere der Titer
der Anti-dsDNA-Antikörper und Antikörper gegen Nukleosomen zur Einschätzung von
Krankheitsaktivität und -verlauf herangezogen werden können. Der Nachweis einer
Korrelation der Anti-dsDNA-Antikörper-Titer mit der immunologischen Aktivität des SLE
dürfte der Grund für die Aufnahme in einen Aktivitätsscore gewesen sein.
2.1.4 Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI)
Der SLEDAI wurde von Bombardier et al. im Jahre 1992 an der Universität von Toronto
entwickelt, um die Krankheitsaktivität des SLE anhand einer Gesamtpunktzahl fassbar
zu machen. Ziel war es, einen validierten klinischen Index zu finden, der zur
Abschätzung
der
Krankheitsaktivität
des SLE
bzw.
zur
Verdeutlichung
von
Veränderungen im Krankheitsverlauf vor oder nach therapeutischen Maßnahmen
11
herangezogen werden kann. In diesem Index werden 1, 2, 4 oder 8 Punkte für
lupusspezifische Symptome bzw. Laborparameter in insgesamt neun Organsystemen
vergeben. Die Definitionen und Regeln für die Erfassung der 24 wichtigsten Parameter
des SLE basieren auf den ACR-Kriterien.
Ursprünglich wurden 37 Deskriptoren in Form von lupusspezifischen Symptomen und
Laborparametern festgelegt, die schließlich auf die 24 wichtigsten Parameter reduziert
wurden.
Zum
Beispiel
wurden
Deskriptoren
wie
Enteritis,
erhöhte
Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit, Hypergammaglobulinämie oder arterielle
Hypertonie über 140/90 mmHg aus der Wertung genommen, da man davon ausging,
dass es sich bei den genannten Veränderungen vor allem um Schädigungen im
Rahmen des SLE bzw. um Folgen der Erkrankung handelte, durch die jedoch nicht
zwangsweise die aktuelle Krankheitsaktivität widergespiegelt wird. Die in der Studie
untersuchten Patienten zeigten vor allem immunologische und Hautmanifestationen,
weshalb diese klinischen Zeichen des SLE als erste in den SLEDAI aufgenommen
wurden.
Danach
wurden
auch
Serositis,
ZNS-Beteiligung
und
renale,
muskuloskelettale und hämatologische Veränderungen in die Wertung einbezogen. In
der Endfassung des SLEDAI von 1992 werden 8 Punkte für ZNS- und vaskuläre, 4
Punkte für renale und muskuloskelettale Symptome, 2 Punkte für Serosa- und
Hautbeteiligung bzw. immunologische Symptome und 1 Punkt für konstitutionelle und
hämatologische Veränderungen vergeben (Bombardier et al., 1992). Der SLEDAI
erfasst als einziger der Scores zur Erfassung lupusspezifischer Symptome, nur
objektive Parameter. Subjektive Empfindungen, wie zum Beispiel Müdigkeit,
Arthralgien oder Myalgien werden nicht berücksichtigt (Grossmann, Gordon, 2007, S.
926). Dadurch werden Schwankungen der Werte aufgrund subjektiver Änderung der
Krankheitssymptome vermieden. Der Score kann zur Verlaufsbeobachtung speziell im
Hinblick auf das Ansprechen auf eine Therapie verwendet werden. Eine Erhöhung des
SLEDAI um 3 Punkte spricht für eine Verschlechterung des SLE, während eine
Erhöhung um mehr als 12 Punkte einen schweren Schub anzeigt (Grossmann,
Gorden, 2007, S. 926). Insgesamt können 105 Punkte vergeben werden, wobei aber
nur sehr wenige Patienten letztendlich einen Wert über 45 Punkten erreichen
(Bombardier et al., 1992).
Eine große Rolle spielt der SLEDAI im Hinblick auf den Krankheitsverlauf unter
Therapie. Insbesondere fällt ein Rückgang von klinischen Symptomen ins Gewicht.
Kann zum Beispiel durch ein bestimmtes Therapieverfahren eine vollständige
Remission der neurologischen oder renalen Organmanifestation erreicht werden, so
spiegelt sich dies in einer deutlich niedrigeren SLEDAI-Gesamtpunktzahl wider. So
12
können unterschiedliche Therapieansätze miteinander in Bezug auf ihre Wirksamkeit
verglichen werden.
2.1.5 Behandlungsstrategien bei SLE
Wichtig bei der Behandlung des SLE ist eine gezielte, aber stadiengerechte
interdisziplinäre Therapie. Zur Behandlung des SLE sind in Deutschland verschiedene
Medikamente zugelassen, zu denen Glukokortikosteroide, die Antimalariamedikamente
Chloroquin
und
Hydroxychloroquin,
die
Immunsuppressiva
Azathioprin
und
Cyclophosphamid und seit kurzem der monoklonale Antikörper Belimumab gehören
(Aringer et al., 2011). Erforderlichenfalls werden bei Therapieversagen Medikamente
ohne Zulassung („off lable“) für die Behandlung des SLE eingesetzt, wie Mycophenolat
Mofetil, Rituximab, Methotrexat, Ciclosporin A oder Leflunomid. Bei schwerer,
therapierefraktärer SLE-Aktivität wurden außerdem Erfolge mit Immunadsorption in
Kombination mit Cyclophosphamid erzielt (Aringer et al., 2007, S. 51). Insbesondere
bei jungen Patienten mit sehr schwerem Krankheitsverlauf und ungenügendem
Therapieansprechen ist im Einzelfall auch eine Hochdosischemotherapie mit autologer
Stammzelltransplantation zu erwägen.
Notwendig ist, vor allem bei vorliegender Hautbeteiligung grundsätzlich ein adäquater
UV-Lichtschutz in Form von Lichtschutzsalben bzw. entsprechender Kleidung oder
Kopfbedeckung. In leichten Fällen ohne viszeralen Befall können z.B. bei Arthritiden
und Myalgien nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAR), wie Diclofenac oder Etoricoxib,
sowie Hydroxycholoroquin oder Methotrexat als Basistherapeutika oder niedrig
dosierte Glukokortikoide ausreichend sein. Zur Prävention von entzündlichen Schüben
können Chloroquin und Hydroxychloroquin erfolgreich eingesetzt werden. Die
immunsuppressive und antiinflammatorische Wirkung ist wahrscheinlich zum einen auf
die Hemmung der Antigenpräsentation durch pH-Wert-Erhöhung in den Lysosomen
antigenpräsentierender Zellen und zum anderen auf die Blockade von sog. Toll-likeRezeptoren (TLR) zurückzuführen. Die TLR aktivieren das angeborene Immunsystem
und
damit
die
Produktion
von
Immunglobulinen
und
Zytokinen,
wodurch
Entzündungsreaktionen verursacht werden (Senq-J et al., 2011).
Bei schweren Krankheitsverläufen mit Organbeteiligung kommen eine hochdosierte
Prednisolon-Stoßtherapie und Immunsuppressiva, insbesondere Cyclophosphamid
bzw. auch Azathioprin und Mycophenolat-Mofetil (MMF) zum Einsatz (Kirou, Boumpas,
2002, S.1180; McCune, Riskalla, 2002, S.1206, 1210). Vor allem bei schwerer
Lupusnephritis, ZNS-Beteiligung und hämorrhagischer Pneumonitis verbesserte sich
13
die Prognose entscheidend mit Einführung der Cyclophosphamidtherapie. Im Vergleich
zu einer alleinigen Cortisonstoßtherapie konnte in Studien gezeigt werden, dass unter
Cyclophosphamid ein deutlich besseres Outcome in Bezug auf die terminale
Niereninsuffizienz im Rahmen der Lupusnephritis erzielt werden kann (Aringer et al.,
2007, S. 34). Ein großes Problem stellen jedoch die zahlreichen und schwerwiegenden
unerwünschten Wirkungen des Zytostatikums dar. Übelkeit und Erbrechen, Infektionen,
hämorrhagische Zystitis bis hin zur Blasenfibrose und Urothelkarzinom, sowie die
Gefahr der vorzeitigen Menopause bei Frauen mit Kinderwunsch, sind ernste
Nebenwirkungen. Wegen dieser Nebenwirkungen stellt man nach erfolgreicher
Remissionsinduktion mit mehreren Cyclophosphamid-Boli auf eine weniger toxische
Erhaltungstherapie mit Azathioprin oder MMF um (Aringer et al., 2007, S. 35). Sowohl
Azathioprin als auch MMF sind aus der Transplantationsmedizin als wirkungsvolle
Immunsuppressiva durch Hemmung der Lymphozytenproliferation bekannt. Aufgrund
der
Knochenmarkstoxizität
mit
konsekutiver
Panzytopenie
sind
engmaschige
Blutbildkontrollen indiziert.
Bei therapierefraktärer Nephritis konnten in Kasuistiken und Fallserien gute Erfolge mit
dem monoklonalen Anti-CD20-Antikörper Rituximab, zugelassen für das B-Zell-NonHodgkin-Lymphom und die Rheumatoide Arthritis, erzielt werden. Rituximab eliminiert
hierbei B-Zellen, wobei Gedächtnis-B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen
zumindest teilweise resistent sein dürften (Vallerskog et al., 2006). In einigen,
allerdings unkontrollierten Studien konnten durch Rituximabtherapie LangzeitRemissionen erreicht werden (Jónsdóttir et al., 2007). Im Durchschnitt regenerieren
sich die B-Lymphozyten nach ca. vier bis zwölf Monaten wieder, was möglicherweise
mit erneuter SLE-Aktivität assoziiert ist. Da CD20 auf Plasmazellen nicht exprimiert ist,
werden die Antikörper-Konzentrationen im Serum nur unwesentlich vermindert.
Besonders wenn pathogene Autoantikörper von langlebigen Plasmazellen sezerniert
werden, dürfte Rituximab die Autoantikörperspiegel kaum beeinflussen (Vallerskog et
al., 2006; Aringer et al., 2007, S. 49). Zudem konnte gezeigt werden, dass bestimmte
B-Lymphozytensubpopulationen auch nach der Therapie mit Rituximab noch
nachweisbar waren, insbesondere im entzündeten Gewebe und in sekundären
lymphatischen Organen, was entweder für eine primäre Resistenz gegen CD20Antikörper spricht oder dafür, dass diese B-Lymphozyten in Nischen überleben, die
durch die Therapie nicht erreicht werden (Dolff et al., 2009; Vallerskog et al., 2006).
Eine neue Behandlungsoption stellt der neu zugelassene monoklonale Antikörper
Belimumab dar, der gegen BLyS (B-Lymphozyten-Stimulator), ein Mitglied der TNFFamilie, gerichtet ist. Dadurch soll die Aktivierung der B-Zellen gehemmt werden.
Erfolge
konnten
insbesondere
im
Hinblick
auf
die
muskuloskelettale
und
14
Hautbeteiligung des SLE erzielt werden (Aringer et al., 2011). Ob mit Hilfe dieses
Antikörpers unter Umständen Komplettremissionen erreichbar sind, wird sich in den
nächsten Jahren zeigen.
Mit zahlreichen Therapieoptionen ist es bisher immer wieder gelungen, eine
Verminderung der Krankheitsaktivität bei SLE zu erreichen. Wie jedoch gezeigt werden
konnte, ist bislang eine vollständige Remission des SLE nicht möglich. Eine wichtige
Rolle spielen dabei wohl die langlebigen Plasmazellen, die durch die bisherigen
Behandlungsstrategien nicht oder nur unzureichend eliminiert werden (Hiepe et al.,
2011). Zudem müssen erfolgreiche Therapieoptionen oft aufgrund erheblicher
Nebenwirkungen wieder abgebrochen werden.
Aus diesem Grund ist es dringend notwendig nach alternativen Therapieoptionen zu
suchen, die eine vollständige Remission der SLE-Symptome, insbesondere durch eine
Depletion von langlebigen Plasmazellen, ermöglichen könnten.
2.2 Proteasom und Proteasominhibition durch Bortezomib
Ein wichtiger pathogener Mechanismus bei der Entstehung des SLE dürfte eine
fehlregulierte bzw. gesteigerte Apoptose und ein mangelnder Abbau von Bestandteilen
apoptotischer Zellen sein.
Das 26S-Proteasom ist ein Proteinkomplex der im Inneren von eukaryotischen Zellen
die Induktion und Suppression der Apoptose reguliert. Bestehend aus einer 19SUntereinheit zur Erkennung und Entfaltung von Proteinen und einer 20S-Untereinheit
mit proteolytischer Aktivität, baut das Proteasom im Zytoplasma und im Zellkern
Proteine zu Peptidfragmenten ab, die nach Freisetzung ins Zytosol durch
Endopeptidasen
und
Aminopeptidasen
zu
Aminosäuren
abgebaut
und
zur
Neusynthese von Proteinen verwendet werden (Naujokat et al., 2002; Lecker et al.,
2006). Ungefaltete oder falsch gefaltete Proteine sowie Transkriptionsfaktoren,
Tumorsuppressor-Proteine und andere Regulatoren des Zellzyklus, werden über
Enzyme mit Ubiquitin-Polypeptid-Ketten markiert und dem proteasomalen Verdau
zugeführt (Naujokat et al., 2002; Lecker et al., 2006). Das Proteasom spielt außerdem
eine wichtige Rolle in der Immunkontrolle. Die aus dem Proteinabbau generierten
Peptide werden zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) transportiert, wo sie an MHCI-Moleküle gekoppelt werden, über die sie dem Immunsystem präsentiert werden
(Lecker et al., 2006). Vor allem Nukleosomen bzw. dsDNA und Histone, die bei der
Apoptose
entstehen,
bilden
eine
Autoantigen-Quelle,
die
beim
SLE
zur
15
Autoantikörperbildung gegen Zellkernbestandteile beiträgt (Böcker et al., 2004, S.
1118).
Das Proteasom trägt durch den Abbau von Wachstumsfaktorinhibitoren zur
Zellproliferation bei. Insbesondere bei malignen Erkrankungen spielt dies eine zentrale
Rolle. So wird z.B. der Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor kappa B)
normalerweise durch ein inhibitorisches Molekül IκB gehemmt. Wird IκB durch
Ubiquitin-Markierung im Proteasom degradiert, kann NF-κB als Transkriptionsfaktor die
Zellproliferation fördern sowie antiapoptotische Faktoren induzieren und damit das
Tumorwachstum fördern (Naujokat et al., 2002). Durch die Entwicklung des
Proteasominhibitors Bortezomib, auch bekannt unter dem Handelsnamen Velcade®,
war es möglich, in die molekularen Abbau- und Synthesewege der Zelle einzugreifen
und gegen die Krebsentstehung vorzugehen. Bortezomib ist ein Borsäuredipeptid aus
Phenylalanin und Leucin, das reversibel an die Chymotrypsin-ähnliche Protease des
Proteasoms bindet und dadurch die Funktion des Proteasoms hemmt. Bislang ist
Bortezomib für die Behandlung des therapierefraktären multiplen Myeloms und des
Mantelzelllymphoms zugelassen (Simons et al., 2006). Durch die Proteasominhibition
wird der Abbau von IκB verhindert, wodurch die NF-κB-Aktivität reguliert wird (Meister,
Voll, 2007). Da NF-κB ein Mediator zur Produktion proinflammatorischer Zytokine und
Adhäsionsmoleküle ist, spielt dieser Transkriptionsfaktor wohl auch in der Pathogenese
des SLE eine wichtige Rolle (Lecker et al., 2006). Zudem bewirkt Bortezomib die
indirekte Aktivierung der sog. unfolded protein response (UPR). Dabei handelt es sich
um unterschiedliche Mechanismen, die die Faltung von Proteinen bzw. den Abbau
ungefalteter Proteine regulieren. Durch die Proteasominhibition kumulieren die zum
Abbau anstehenden fehlerhaften Proteine in der Zelle. Dadurch kommt es zu einer
hohen Belastung des Endoplasmatischen Retikulums, wo die Proteine durch die
Blockade des letztlich Proteasom-abhängigen ERAD (endoplasmatic reticulum
associated degradation) akkumulieren. Bei übermäßigem ER-Stress wird schließlich
durch die UPR die zum Zelltod führende Apoptose eingeleitet (Meister, Voll, 2007;
Neubert et al., 2008). Vor allem bei Zellen mit einer hohen Proteinsyntheserate ist die
UPR nötig, um die große Anzahl an ungefalteten oder falsch gefalteten Proteinen zu
eliminieren und so ein Überleben der Zelle zu ermöglichen. Damit sind z.B. die Zellen
des multiplen Myeloms, die eine extrem hohe Anzahl an monoklonalen Antikörpern
synthetisieren, sehr sensibel für die Einleitung der Apoptose durch die sog. UPR
(Meister, Voll, 2007; Neubert et al., 2008).
Wie im SLE-Mausmodell gezeigt werden konnte, aktiviert Bortezomib die terminale
UPR auch in nicht malignen Plasmazellen, die eine noch höhere Proteinsyntheserate
als Myelomzellen aufweisen (Neubert et al., 2008; Voll, Hiepe, 2009).
16
Daraus ergibt sich möglicherweise eine neue Therapieoption, insbesondere zur
Elimination von autoantikörperproduzierenden langlebigen Plasmazellen bei Patienten
mit SLE.
2.3 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit
Die Therapie des systemischen Lupus erythematodes stellt noch immer eine große
Herausforderung dar. Zahlreiche unterschiedliche Therapieverfahren führen zu einer
Abnahme der Autoantikörpertiter und zu einer Verbesserung lebensbedrohlicher
Symptome, wie Nephritis oder ZNS-Vaskulitis. Doch häufig müssen diese, zum Teil
hochtoxischen Medikamente aufgrund schwerer Nebenwirkungen wieder abgesetzt
werden. Zudem wird oft keine länger anhaltende oder komplette Remission erreicht.
Aus
diesem
Grund
wird
nach
besser
verträglichen
und
effizienteren
Therapiemöglichkeiten gesucht.
Bortezomib, bislang für die Behandlung des therapierefraktären Multiplen Myeloms und
des Mantelzelllymphoms zugelassen, hemmt reversibel die katalytische Aktivität des
26S-Proteasoms und damit den proteolytischen Abbau von IκB, dem Inihibitor des
Transkriptionsfaktors NF-κB, der zu einer Proliferation von Myelomzellen bzw. zur
Induktion proinflammatorischer Zytokine führt. Zudem induziert Bortezomib die
terminale unfolded protein response (UPR) durch Überladung des Endoplasmatischen
Retikulums (ER) mit zu degradierenden Proteinen, wodurch die Zelle in die Apoptose
geht (Meister, Voll, 2007; Lecker et al., 2006; Simons et al., 2006).
Wie gezeigt werden konnte, eliminiert Bortezomib insbesondere Zellen mit einer hohen
Proteinsyntheserate. Damit sind die Myelomzellen ebenso wie alle normalen
antikörperproduzierenden Plasmazellen extrem sensibel für eine Apoptoseeinleitung
durch Aktivierung der terminalen UPR (Meister, Voll, 2007).
Neubert et al. zeigten in Tiermodellen mit weiblichen New-Zealand-Black/WhiteMäusen
(NZB/W)
und
der
MRL/lpr-Linie,
dass
eine
Elimination
der
autoantikörperproduzierenden Plasmazellen zu einem deutlichen Rückgang der
klinischen Symptome in den Lupus-Mäusen führt. Durch eine Therapie mit dem
Proteasominhibitor Bortezomib kam es zu einem deutlichen Rückgang der ds-DNAAntikörper-Titer sowie der Proteinausscheidung bei Nephritis. Während die Mäuse der
Kontrollgruppe, die Placebo erhielten, nach wenigen Wochen starben, kam es bei
Mäusen, die mit Bortezomib behandelt wurden, teilweise zu einer kompletten
Remission der Lupusnephritis. Zudem konnte gezeigt werden, dass Bortezomib auch
die langlebigen Plasmazellen durch Induktion der terminalen UPR erfolgreich eliminiert.
17
Im Vergleich mit einer Kontrollgruppe, die Cyclophosphamid und Dexamethason
erhielt, war Bortezomib deutlich überlegen. Blutbildkontrollen ergaben keine negativen
Auswirkungen und damit keine lebensbedrohlichen toxischen Nebenwirkungen durch
den Proteasominhibitor.
Die effiziente und nebenwirkungsarme Wirkung des bereits klinisch zugelassenen
Proteasominhibitors Bortezomib im Lupus-Mausmodell gab den Anlass, Patientinnen
mit schwerem therapierefraktären SLE im Rahmen eines individuellen Heilversuchs zu
behandeln. Begleitend zu der off-label-Therapie mit Bortezomib wurde untersucht, ob
durch Proteasominhibition eine Abnahme der Autoantikörper-Titer, sowie der
Proteinausscheidung bei aktiver Lupusnephritis und damit eine Verminderung der
Krankheitsaktivität erreicht werden kann. Im Rahmen individueller Heilversuche wurde
bei fünf Patientinnen mit therapierefraktärem SLE eine Behandlung mit Bortezomib
durchgeführt. Dazu wurden in bis zu fünf Zyklen jeweils 1,3 mg/m2 Körperoberfläche
Bortezomib an den Tagen 1, 4 und 8, bzw. bei zwei Patientinnen zu Beginn auch an
Tag 11 intravenös (i.v.) verabreicht. In regelmäßigen Abständen wurden die
Konzentrationen
von
Antikörpern gegen
doppelsträngige
DNA
(dsDNA)
und
extrahierbare nukleäre Antigene (ENA), Komplement C3 und C4, die protektiven
Antikörper gegen Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen sowie die Proteinausscheidung im
24h-Urin bei den Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis bestimmt, um das
Therapieergebnis zu evaluieren. Die Krankheitsaktivität wurde mit Hilfe des Systemic
Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) erfasst. Durch regelmäßige
Blutbildkontrollen sowie ausführliche Anamnese und klinische Untersuchung sollten
evtl. aufgetretene unerwünschte Wirkungen, insbesondere eine periphere Neuropathie,
Thrombozytopenie, Diarrhoe, Übelkeit und Müdigkeit durch die Behandlung mit
Bortezomib erkannt werden.
Ziel war es, eine deutliche Verbesserung der klinischen Symptome, insbesondere der
Proteinausscheidung bei aktiver Nephritis, bestenfalls bis in den physiologischen
Bereich, zu erreichen. Dabei sollte das Ausmaß unerwünschter Wirkungen durch den
Heilversuch mit Bortezomib so gering wie möglich gehalten werden.
18
3. Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Verbrauchsmaterialien
96F-Maxisorp-Platte für ELISA (Nunc, Dänemark)
Varelisa ANA Profile Assay (Phadia, Freiburg)
Pipettenspitzen, 2 bis 200 µl (Ratiolab, Frankfurt)
Pipettenspitzen, 100 bis 1000 µl (Ratiolab, Frankfurt)
Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Brand, Wertheim)
Falcon-Röhrchen, 50 ml (Greiner, Frickenhausen)
3.1.2 Tetanus-Toxoid-ELISA
3.1.2.1 Puffer und Lösungen
10x PBS
80 g NaCl
2 g KCl
2,4 g KH2PO4
26,8 g Na2HPO4 * 7 H2O
ad 1000 ml H2O dest.
PBS/BSA (2%)
PBS
20 g BSA (Sigma Aldrich, St. Louis)
pH 7,4
PBST (0,1%)
1,0 ml Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis)
ad 1000 ml PBS
Kopplungspuffer
15 mM Na2CO3
35 mM NaHCO3
pH 9,6
Substratpuffer
20 mM Na2HPO4
10 mM Zitronensäure-Monohydrat
19
Substratlösung
10 ml Substratpuffer
10 mg ortho-Phenylendiamin
(Sigma Aldrich, Taufkirchen)
10 µl H2O2 30%
Stopplösung
2 M H2SO4
3.1.2.2 Antigene und Antikörper
Antigen (feste Phase)
Tetanus-Toxoid
Sekundärantikörper
Anti-human-IgG-Peroxidase (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, UK)
1:5000 in PBS/BSA (2%)
3.1.2.3 Geräte
Pipettierhilfe
Pipetman (Gilson, Frankreich)
Waschgerät
ELISA-Washer (Tecan Group, Schweiz)
Photometer
Emax precision microplate reader MW6Biotech
3.1.3 Varelisa ANA Profile Assay
3.1.3.1 Puffer und Lösungen
Waschpuffer
1 Fläschchen, 20x PBS-Konzentrat mit
0,095% (w/v) Natriumazid und Detergens,
75 ml
ad 1425 ml H2O dest.
Probenpuffer
1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)
Natriumazid und Detergens, 100 ml (gelb
eingefärbt), gebrauchsfertig
Substratlösung
1 Fläschchen TMB (3, 3‘, 5, 5‘-
20
Tetramethylbenzidin), 20 ml,
gebrauchsfertig
Stopplösung
1 Fläschchen 0,5 M H2SO4, 20 ml (farblos),
gebrauchsfertig
Negativ-Kontrolle
1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)
Natriumazid, Detergens und Humanserum
in PBS, 3,5 ml, gebrauchsfertig
Kalibrator
1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)
Natriumazid, Detergens und Humanserum
in PBS, 3,5 ml, gebrauchsfertig
3.1.3.2 Antigene und Antikörper
Antigene (feste Phase)
RNP 70
U1RNP (RNP70, A, C)
SmD
SS-A/Ro (52 kDa, 60 kDa)
SS-B/La
Scl-70
CENP-B
Jo-1
Sekundärantikörper
Anti-human-IgG-Peroxidase,
20 ml, gebrauchsfertig
3.1.3.3 Geräte
Pipettierhilfe
Pipetman (Gilson, Frankreich)
Photometer
Emax precision microplate reader MW6Biotech
Software
Synelisa 5.2 D
(Pharmacia Diagnostics, Freiburg)
21
3.2 Methoden
3.2.1 Patientenkollektiv
Im Rahmen individueller Heilversuche wurde bei fünf Patientinnen im Alter zwischen 26
und 34 Jahren mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes eine
Behandlung mit dem Proteasominhibitor Bortezomib durchgeführt. Alle Patientinnen
waren zuvor bereits in der Medizinischen Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen
behandelt worden.
Aus Datenschutzgründen wurden die Patientinnen anonymisiert und den Zahlen 1 bis 5
zugeordnet. Jede Patientin wurde vor Therapiebeginn über die off-label-Behandlung
mit
dem
Proteasominhibitor
aufgeklärt
und
unterzeichnete
eine
schriftliche
Einverständniserklärung.
Bei jeder Patientin wurde ein internistischer Status mit EKG und Echokardiographie
erhoben, sowie eine neurologische Untersuchung, vor allem im Hinblick auf eine
möglicherweise bestehende Neuropathie, z.B. SLE-assoziiert, durchgeführt. Zudem
wurde
eine
umfangreiche
Labordiagnostik,
inklusive
Antikörper-Status,
Urinuntersuchung und Differentialblutbild veranlasst.
Vor jeder Behandlung mit Bortezomib wurden Anamnese, körperliche Untersuchung
und Blutentnahmen durchgeführt. Dabei sollten vor allem die Vitalparameter sowie die
Entzündungsparameter vor der Injektion bestimmt werden.
3.2.2 Behandlung mit Bortezomib
Allen Patientinnen wurde in einer Dosierung von 1,3 mg/m2 Körperoberfläche
Bortezomib an den Tagen 1, 4 und 8, sowie den Patientinnen 4 und 5 zu Beginn auch
an Tag 11 intravenös (i.v.) appliziert. Dazu erhielten die Patientinnen oral (p.o.) 20 mg
Dexamethason
und
2x
400
mg
Aciclovir
zur
Prophylaxe
einer
Herpesvirenreaktivierung.
Die Therapiezyklen wurden nach einer Pause von zwei bis vier Wochen bis zu fünfmal
wiederholt. Dabei sollten Patientin 1 und 2 jeweils zwei Therapiezyklen erhalten,
Patientin 3 insgesamt drei und Patientin 4 und 5 jeweils vier Zyklen (Abb 3.1). Bei
Patientin 5 wurde der dritte Zyklus aus persönlichen und gesundheitlichen Gründen,
die nicht auf die Behandlung mit Bortezomib zurückzuführen waren, abgebrochen. Erst
nach einer Pause von fünf Monaten wurde bei dieser Patientin ein neuer
Therapiezyklus begonnen. Aufgrund schwerer SLE-Aktivität erhielt Patientin 5
schließlich noch einen weiteren Therapiezyklus.
22
Abb. 3.1: Therapieschema für die Behandlung mit Bortezomib
Injektionen jeweils an den Tagen 1, 4 und 8, sowie bei Patient 4 und 5 zusätzlich an Tag 11.
Wiederholung des Zyklus im Abstand von zwei bis vier Wochen.
Pause von 5 Monaten bei Patient 5 (roter Balken) nach Abbruch des dritten Zyklus.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob durch die Behandlung mit
Bortezomib eine Abnahme der Antikörper-Titer sowie der Proteinausscheidung bei
aktiver Lupusnephritis und damit eine Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht
werden kann, was zuvor in SLE-Mausmodellen bereits gelungen war (Neubert et al.,
2008).
Bei den Patientinnen wurde vor Behandlungsbeginn sowie in regelmäßigen Abständen
nach den Injektionen die Konzentrationen von Antikörpern gegen doppelsträngige DNA
(dsDNA), Komplementfaktoren C3 und C4, sowie die Gesamtpunktzahl im Systemic
Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) bestimmt. Bei den Patientinnen
mit aktiver Lupusnephritis WHO Grad IV (Patient 2-4) wurde die Proteinausscheidung
im 24h-Urin quantifiziert. Die Antikörpertiter gegen extrahierbare nurkleäre Antigene
(ENA) wurden bei den Patientinnen 1 bis 3 bestimmt. Zusätzlich erfolgte bei allen
Patientinnen die Bestimmung von protektiven Impfantikörpern gegen Tetanus-Toxoid
und Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HBs-Antigen).
23
Für Patientin 1 konnten sämtliche Laborwerte nur bis 8 Wochen nach der ersten
Injektion bestimmt werden, da die Patientin nicht mehr zu Nachuntersuchungen in
unsere Klinik kam.
3.2.3 Bestimmung von lupusassoziierten Serumparametern
3.2.3.1 Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA)
Die Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene wurden mit Hilfe eines ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt. Dabei handelt es sich um einen
quantitativen Immunoassay in Sandwich-Technik, bei dem die Komplexbildung
zwischen
Antigenen
und
Antikörpern
zur
Bestimmung
von
Antigen-
oder
Antikörperkonzentrationen in Serum- und Plasmaproben genutzt wird. Die Anfänge
dieser Technik gehen auf die frühen 1970er Jahre zurück. Im Jahre 1971 beschrieben
Engvall und Perlman in Schweden sowie Avrameas und Guilbert in Frankreich die
ersten erfolgreichen Versuche. Antigene bzw. Antikörper werden an eine feste Phase
gebunden. Dabei handelt es sich überwiegend um Mikrotiterplatten aus Polystyrol,
welches eine hohe Bindungskapazität für Proteine aufweist. An diese beschichtete
feste
Phase
binden die
Antigene bzw.
Primärantikörper
im
Serum,
deren
Bindungskapazität mit Hilfe eines Enzym-markierten Sekundärantikörpers quantitativ
bestimmt werden kann. Nach Zugabe eines spezifischen chromogenen Substrates wird
dieses vom Enzym umgesetzt, was zu einer Farbreaktion führt, die photometrisch bei
einer bestimmten Wellenlänge gemessen wird (Luttmann et al., 2006, S. 106-116).
Zur Bestimmung der Antikörper gegen verschiedene ENA (RNP 70, U1RNP, SmD, SSA/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B und Jo-1) im Serum der Patientinnen 1, 2 und 3,
wurde ein Varelisa ANA Profile Assay der Firma Phadia aus Freiburg verwendet. Dabei
handelt es sich um einen indirekten, nichtkompetitiven Enzym-Immunoassay, bei dem
ein Enzym-markierter Antikörper spezifisch an die Antikörper gegen ENA im Serum
bindet (Arnold, Rauch, 2007, S.51). Auf einem vorgefertigten Kit mit humanen
rekombinanten Antigenen oder synthetischen Peptiden (SmD) als antigene Festphase,
wurden Serumproben der ersten drei Patientinnen in einer Verdünnung mit
Probenpuffer von 1:100 aufgetragen, die vor der Behandlung mit Bortezomib, nach ca.
vier, acht und zwölf Wochen entnommen wurden. Zur Qualitätskontrolle wurden ein
Kalibrator, der alle acht antinukleären Antikörper in erhöhten Konzentrationen enthält
und eine Negativ-Kontrolle als PBS/BSA-Gemisch mitgeführt (siehe 3.1.3.1). Die im
Serum vorhandenen Antikörper gegen nukleäre Antigene binden spezifisch an die
antigene Festphase. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur
24
und dreimaligem Waschen mit je 300 µl Waschpuffer wurde anschließend der
Sekundärantikörper Anti-human-IgG-Peroxidase zugegeben und für weitere 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an einen weiteren Waschvorgang
wurden je 100 µl TMB-Enzymsubstrat in die einzelnen Vertiefungen pipettiert und die
Platte für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe der Stopplösung und
Inaktivierung des Enzyms wurde bis ca. 30 Minuten nach dem Abstoppen die optische
Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt.
Zur Auswertung der Ergebnisse durch Berechnung des Cut-off (ODCut-off) und der Ratio
wurde die Synelisa Software von Pharmacia Diagnostics aus Freiburg verwendet.
3.2.3.2 Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA)
Die Antikörper gegen doppelsträngige (ds) DNA wurden im Labor der Medizinischen
Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen mittels eines kommerziellen FarrRadioimmunoassays (RIA) bestimmt. Dabei handelt es sich um eine ImmunoassayTechnik, bei der ein Antigen, das mit einem Radioisotop (=Tracer) markiert ist, zu den
zu untersuchenden Serumproben gegeben wird. Nach Inkubation und erfolgter
Immunreaktion zwischen den Anti-dsDNA-Antikörpern und den radioaktiv markierten
Antigenen im Teströhrchen, muss als nächstes eine Trennung der markierten
Immunkomplexe von den nicht gebundenen Antigenen und Tracermolekülen erfolgen
(Luttmann et al., 2006, S. 111). Hierfür gibt es unterschiedliche Methoden. Zum einen
kann Ammoniumsulfat zugegeben werden, das selektiv an die radioaktiv markierten
Immunkomplexe bindet und diese ausfällt. Alternativ können auch Polyethylenglycol
(PEG), Ethanol, Methanol oder Aceton verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit ist
die
Zugabe
eines
Sekundärantikörpers,
der
spezifisch
den
Fc-Teil
des
Primärantikörpers, in diesem Fall an die Anti-dsDNA-Antikörper, bindet. Durch
Vernetzung der beiden Antikörper kommt es zur Präzipitation der Immunkomplexe. In
modernen Farr-Assays wird der Primärantikörper an das Teströhrchen gebunden,
während die ungebundenen Antigene und Tracermoleküle frei im Überstand bleiben
und abpipettiert werden können, ein Vorgehen, das auch unter dem Begriff
Festphasentrennung bekannt ist (Luttmann et al., 2006, S. 112-113).
Die
Messung
der
Radioaktivität
der
Immunkomplexe
erfolgte
mittels
eines
Szintillationszählers. Die Auswertung der Daten und die Berechnung der AntikörperKonzentration erfolgte über eine Computersoftware (Luttmann et al., 2006, S. 112113).
25
3.2.3.3 Komplementfaktoren C3 und C4
Das Komplementsystem, ein Bestandteil der humoralen Abwehr, besteht aus mehreren
Faktoren, die auf verschiedenen Wegen aktiviert werden können. Der klassische
Reaktionsweg umfasst die Bindung von C1 durch das Fc-Fragment von Antikörpern
nach erfolgter Komplexbildung mit Antigenen. Dieser Weg spielt unter anderem bei
Autoimmunerkrankungen
eine
zentrale
Rolle.
Durch
die
Aktivierung
der
Komplementkaskade werden die Komplementfaktoren zur Opsonierung und Zytolyse
von Antigen-Antikörper-Komplexen benötigt und somit verbraucht. Eine verminderte
C3-Konzentration im Serum zeigt eine Aktivierung des Systems an. Ist gleichzeitig
auch C4 vermindert, so spricht dies für eine Aktivierung des klassischen Weges und
somit für den Kontakt mit Immunkomplexen (Hallbach, 2006, S. 103; Schur, Klickstein,
2002, S.243-244).
Die Bestimmung der Komplementfaktoren C3 und C4 erfolgte im Labor der
Medizinischen
Klinik
3
des
Universitätsklinikums
Erlangen
mittels
der
Immunnephelometrie. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem quantitativ
Einzelproteine in Serum- oder Plasmaproben bestimmt werden können. Die
Komplementfaktoren bilden mit spezifischen Antikörpern Immunkomplexe, an denen
eingestrahltes Licht unterschiedlich stark gestreut wird. Dieses Phänomen ist auch
unter der Bezeichnung Tyndall-Effekt bekannt. Mit einem speziellen Photometer, dem
Nephelometer, kann die Streulichtintensität bestimmt werden. Durch die Mitführung
eines Standards mit bekannter Konzentration wurden die C3- und C4-Konzentrationen
über eine Computer-Software berechnet.
3.2.4 Bestimmung der Proteinausscheidung im 24-Stunden-Urin
Die Ausscheidung einer geringen Menge an Proteinen im Urin ist in einem
Grenzbereich von 120 bis 150 mg/24h physiologisch (Kuhlmann et al., 2008, S.8). Die
einfachste Nachweismethode mittels Teststreifen erfasst vor allem die vermehrte
Ausscheidung von Albumin, während eine Mikroalbuminurie jedoch nicht erfasst
werden kann. Zur quantitativen Bestimmung von Proteinen im Urin wurde in
regelmäßigen Abständen über 24 Stunden Urin von Patientin 2, 3 und 4 gesammelt.
Patientin
1
wurde
aufgrund
einer
dialysepflichtigen
Niereninsuffizienz
nicht
berücksichtigt, Patientin 5 zeigte während des Heilversuchs keine renale Manifestation
des
SLE.
Die
Patientinnen
wurden
dazu
angehalten,
sich
während
des
Sammelvorganges keiner extremen körperlichen Belastung auszusetzen, welche zu
einem Anstieg der Kreatinin- und Proteinausscheidung und somit zu falsch hohen
26
Ergebnissen führen kann. Desweiteren sollte auf eine ausreichende Trinkmenge von
1,5 bis 2 Litern pro Tag geachtet werden.
Die Bestimmung der Proteinurie/24h erfolgte im Zentrallabor des Universitätsklinikums
Erlangen mittels der Farbstoffbindungsmethode. Dabei macht man es sich zunutze,
dass Farbstoffe nach der Bindung an Proteine ihr Absorptionsverhalten ändern, ein
Vorgang, der auch als Metachromasie bezeichnet wird. Der Farbstoff CoomassieBrillant-Blue (CBB) hat im ungebundenen Zustand ein Absorptionsmaximum bei einer
Wellenlänge von 465 nm (Hallbach, 2006, S.98-99). Sind in der zu untersuchenden
Urinprobe Plasmaproteine nachweisbar, so bindet CBB diese und es erfolgt eine
Farbänderung
von
orangebraun
nach
blau
und
eine
Erhöhung
des
Absorptionsmaximums auf 595 nm. Die Änderung der optischen Dichte kann
photometrisch bestimmt werden (Hallbach, 2006, S.98-99).
3.2.5 Bestimmung protektiver Antikörper
3.2.5.1 Tetanus-Toxoid-Antikörper
Zur Bestimmung der Antikörper gegen Tetanus-Toxoid wurden von allen Patientinnen
Serumproben vor der Behandlung mit Bortezomib, zwei bis vier Wochen nach Beginn
der Therapie und weitere drei bis sechs Monate später abgenommen. Zur Beurteilung
der Antikörperkonzentrationen unter Bortezomib wurde ein Festphasen-EnzymImmunoassay durchgeführt. Dazu wurden zwei NuncImmunoTM Platten mit MaxisorpTM
Oberfläche und 8x12 Matrix = 96 Vertiefungen (engl.: wells) mit 100 µl/well TetanusToxoid, verdünnt mit Kopplungspuffer beschichtet und bei 4°C im Kühlschrank über
Nacht inkubiert. Anschließend wurde die antigene Festphase mit 200 µl/well PBS/BSA
(2%) zwei Stunden bei Raumtemperatur geblockt, um eine Hintergrundaktivität durch
unspezifisch adsorbierte, enzymmarkierte Antikörper- bzw. Antigenmoleküle zu
reduzieren (Luttmann et al., 2006, S.114). Nach einem dreimaligen Waschvorgang mit
dem Universalwaschpuffer PBST im ELISA-Washer (Tecan Group, Schweiz) wurden
die in PBS/BSA (2%) verdünnten Patientenseren im Verhältnis 1:100, 1:1000 und
1:10000 in die Vertiefungen der Platten pipettiert. Zur späteren Ermittlung des
Hintergrundsignals wurde ein Leerwert mit PBS/BSA (2%) ohne Serum auf beiden
Platten mitgeführt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur, während der die
Antikörper gegen das Tetanus-Toxoid aus den Patientenseren an die feste Phase
binden konnten, erfolgten weitere vier Waschvorgänge mit PBST. Anschließend wurde
ein Enzym-konjugierter Antikörper, der den Fc-Teil humaner IgG-Antikörper bindet, in
einer Verdünnung mit PBS/BSA (2%) von 1:10000 in 100 µl/well zugegeben und eine
27
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Enzym-konjugierte Antikörper bindet die
Tetanus-Toxoid-Antikörper,
die
eine
Bindung
mit
der
antigenen
Festphase
eingegangen sind (Abb. 3.2).
Abb. 3.2: Schematische Darstellung des indirekten Festphasen-ELISA zur
Bestimmung der Tetanus-Toxoid-Antikörper
Dargestellt ist die Bindung der Tetanus-Toxoid-Antikörper (TT-AK) im Patientenserum an die mit
Tetanus-Toxoid (Antigen) beschichtete ELISA-Platte. An das Fc-Fragment der Tetanus-ToxoidIgG-Antikörper bindet spezifisch der Detektor-Antikörper, an den das Enzym (
) gebunden ist,
das die photometrisch messbare Umsetzung des Substrates katalysiert.
Bei dem Enzym handelt es sich um eine Meerrettich-Peroxidase (horse raddish
peroxidase, HRP), die nach Zugabe eines geeigneten Substrates, eine photometrisch
messbare Reaktion katalysiert. Dazu wurde ortho-Phenylendiamin mit Substratpuffer
und Wasserstoffperoxid vermischt und je 100 µl dieser Substratlösung in die
Vertiefungen der Platten pipettiert. Vor Substratzugabe wurde zur Entfernung
ungebundener Antikörper wiederum viermal im ELISA-Washer gewaschen. Nach einer
Inkubationszeit von 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Enzymreaktion
mit je 100 µl/well 2 M Schwefelsäure gestoppt. Nach einem sichtbaren Farbumschlag
von blau nach gelb erfolgte die Messung im Photometer Emax bei einer optischen
Dichte von 490 nm (OD490) und die Auswertung über eine entsprechende Software am
Computer.
Da kein Standard-Antikörper mitgeführt wurde, wurden keine genauen Konzentrationen
der Tetanus-Toxoid-Antikörper-Titer bestimmt, sondern Veränderungen im Verlauf in %
ermittelt.
28
3.2.5.2 Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen
Die Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HBs) wurden aus
Serumproben vor und nach der Behandlung mit Bortezomib bestimmt. Patientin 4
wurde dabei nicht berücksichtigt, da bei ihr keine Impfung gegen Hepatitis B erfolgt
war.
Die Bestimmung wurde mittels eines quantitativen indirekten Enzym-Immunoassays im
Zentrallabor des Universitätsklinikums Erlangen unter der Leitung von Herrn Dr. med.
Hans Parsch durchgeführt.
3.2.6 Dokumentation im SLEDAI
Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität im Verlauf der Behandlung wurde der
Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) verwendet. Tabelle
3.1 zeigt lupusspezifische Symptome und Laborwerte, für die eine unterschiedliche
Anzahl an Punkten vergeben wird. Die Summe der einzelnen Punkte ergibt den
SLEDAI. Die Höhe des erhaltenen Wertes korreliert mit der Krankheitsaktivität.
Bei jeder Patientin wurde 12 Wochen vor der Behandlung mit Bortezomib, sowie vier
bis acht Wochen, drei bis vier Monate und sechs Monate nach Therapiebeginn der
SLEDAI bestimmt und graphisch dargestellt.
Tab. 3.1: Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI)
Beschreibung
Definition
8
Krampfanfall
8
Psychose
8
Psychoorganisches
Syndrom
kürzlicher Beginn; metabolische, infektiöse, medikamentöse
Ursache ausgeschlossen
eingeschränkte Fähigkeit, normale Aktivitäten auszuführen,
aufgrund einer schweren Störung der Realitätswahrnehmung;
einschließlich Halluzinationen, Verworrenheit, deutlich verminderte
Assoziationsfähigkeit, verarmter Gedankeninhalt, ausgeprägtes
unlogisches Denken, bizarres, desorganisiertes oder katatonisches
Verhalten; Urämie und medikamentöse Ursachen ausgeschlossen
veränderte geistige Funktion mit Beeinträchtigung von Orientierung,
Gedächtnis oder anderen intellektuellen Funktionen, mit raschem
Beginn und fluktuierenden klinischen Merkmalen; einschließlich
Beeinträchtigung des Bewusstseins mit reduzierter Fähigkeit, zu
fokussieren und Unfähigkeit zu anhaltender Konzentration auf die
Umgebung;
zusätzlich
zwei
der
folgenden
Kriterien:
Wahrnehmungsstörung, verworrene Sprache, Schlaflosigkeit oder
Abgeschlagenheit am Tag, gesteigerte oder verminderte
psychomotorische
Aktivität;
metabolische,
infektiöse
oder
medikamentöse Ursachen ausgeschlossen
29
8
Sehstörung
8
Hirnnervenstörung
8
8
LupusKopfschmerz
Zerebrovaskulärer
Insult
Vaskulitis
4
Arthritis
4
Myositis
4
Harnzylinder
4
Hämaturie
4
Proteinurie
4
Pyurie
2
Erythem
2
Alopezie
2
Schleimhautulzera
2
Pleuritis
2
Perikarditis
2
1
Komplementerniedrigung
erhöhte
dsDNAAntikörper
Fieber
1
Thrombozytopenie
<100000 Thrombozyten/µl
1
Leukopenie
<3000 Leukozyten/µl; medikamentöse Ursache ausgeschlossen
8
2
Netzhautveränderungen bei SLE; einschließlich Schwellung der
Nervenfasern, Netzhautblutungen, erhebliche Exsudate oder
Blutungen in der Aderhaut oder Opticus-Neuritis; Bluthochdruck,
infektiöse oder medikamentöse Ursachen ausgeschlossen
neu aufgetretene, die Hirnnerven betreffende, sensorische oder
motorische Neuropathie
andauernder, heftiger Kopfschmerz, eventuell migräneartig, aber
ohne Ansprechen auf Analgetika
neu aufgetretene zerebrovaskuläre Ereignisse; Arteriosklerose
ausgeschlossen
Ulzerationen, Gangrän, schmerzhafte Knötchen an den Fingern,
periunguale Infarkte, Splitterblutungen oder durch Biopsie oder
Angiogramm nachgewiesene Vaskulitis
mehr als zwei schmerzhafte oder entzündlich veränderte Gelenke
(Überwärmung, Schwellung, Erguss)
Schmerzen/Ermüdung der proximalen Muskulatur, assoziiert mit
erhöhter Kreatinin-Phosphorylase/Aldolase oder Veränderungen im
Elektromyogramm oder in der Biopsie, die für eine Myositis
sprechen
granuläre oder Erythrozyten-Zylinder
>5 Erythrozyten/Gesichtsfeld im Mikroskop; Nierensteine, infektiöse
oder medikamentöse Ursachen ausgeschlossen
>500mg/24h; neu aufgetreten oder kürzlicher Anstieg um mehr als
500mg/24h
>5 Leukozyten/Gesichtsfeld im Mikroskop; infektiöse Ursache
ausgeschlossen
Neubeginn oder erneutes Auftreten eines Erythems
Neubeginn oder erneutes Auftreten von pathologischem
Haarausfall, ungleichmäßigem oder diffusem Haarausfall
Neubeginn oder erneutes Auftreten von oralen oder nasalen Ulzera
pleuritischer Brustschmerz mit Pleurareiben oder Pleurerguss oder
Pleuraverdickungen
perikardialer Schmerz mit mindestens einem der folgenden
Merkmale: Perikardreiben, Erguss oder Bestätigung im EKG
verminderte Werte für CH50, C3 oder C4, unterhalb der für die
Labortests normalen unteren Referenzbereiche
oberhalb des Normbereichs im Labortest
>38°C; infektiöse Ursache ausgeschlossen
eigene Darstellung gemäß Bombardier et al., 1992, S. 637
30
4. Ergebnisse
4.1 Auswirkungen der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der
Autoantikörper gegen dsDNA und ENA
Die Produktion von Autoantikörpern spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese des
SLE. Durch die Ablagerung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Gewebe kommt es
zu schweren Organschäden, z.B. an der glomerulären Basalmembran. Dabei korreliert
vor
allem
die
Höhe
der
Antikörper
gegen
doppelsträngige
DNA
mit
der
Krankheitsaktivität und Schwere der Manifestationen (Arbuckle et al., 2001). Der
Therapieversuch mit Bortezomib sollte zeigen, ob ein Rückgang der Antikörper gegen
dsDNA und damit eine Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht werden kann.
Abb. 4.1: Auswirkung der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der
Antikörper gegen dsDNA im Serum bei Patientin 1-5 (A-E)
A
31
B
C
D
32
E
Dargestellt sind die Konzentrationen der Antikörper gegen dsDNA in U/ml in einem Zeitraum
von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis sechs Monate nach der letzten
Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw. nach
Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid), MMF
(Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).
Referenzbereich Anti-dsDNA-Antikörper: 0-7 U/ml.
Wie die Kurvenverläufe zeigen, waren die dsDNA-Antikörper-Titer unter der Therapie
mit Bortezomib bei allen fünf Patientinnen rückläufig.
Bei Patientin 3 (Abb. 4.1 C) wurde vier Wochen nach der ersten Injektion eine
Konzentration von nur 4,6 U/ml im Serum gemessen, was einem Wert im
Referenzbereich (0-7 U/ml) entspricht. Kurz nach der letzten Bortezomib-Injektion stieg
die Konzentration der Antikörper gegen dsDNA wieder an, blieb jedoch bis sechs
Monate nach Therapieende stets unterhalb der nachgewiesenen Konzentration vor der
Behandlung mit dem Proteasominhibitor.
Für Patientin 1 (Abb. 4.1 A) konnte der Verlauf der Antikörper nur bis acht Wochen
nach der ersten Injektion bestimmt werden, da sie nicht mehr zu Nachuntersuchungen
in unsere Klinik kam. Unter der Therapie mit Bortezomib zeigen sich auch hier
rückläufige Werte.
Bereits zehn Tage nach der ersten Injektion war im Serum von Patientin 2 (Abb. 4.1 B)
eine deutliche Abnahme der Antikörperkonzentration nachweisbar. Ein weiterer Abfall
konnte bis vier Wochen nach der letzten Bortezomib-Gabe beobachtet werden. Zur
Erhaltungstherapie
Azathioprin,
wurde
Tacrolimus,
Mycophenolat-Mofetil
Nebenwirkungen nicht toleriert wurden.
ein
sowie
Calcineurininhibitor
Antimalariamittel
eingesetzt,
aufgrund
da
von
33
Patientin 4 und 5 erhielten aufgrund hoher Krankheitsaktivität zwischen den einzelnen
Zyklen mit Bortezomib zusätzlich eine Erhaltungstherapie mit Mycophenolat-Mofetil.
Bei Patientin 4 (Abb. 4.1 D) zeigte sich bis acht Wochen nach der ersten Injektion ein
deutlicher Rückgang der Anti-dsDNA-Antikörper.
Patientin 5 (Abb. 4.1 E) wurde aufgrund schwerster Arthritis, Arthralgien und Myalgien
zwischen den einzelnen Bortezomib-Zyklen zusätzlich mit zwei Infusionen Rituximab
behandelt. Daraufhin kam es zu einer deutlichen Abnahme der Anti-dsDNA-AntikörperTiter im Serum. Der dritte Zyklus mit Bortezomib musste aufgrund psychischer
Probleme der Patientin zunächst unterbrochen werden. Während dieser Pause stiegen
die Antikörper wieder extrem an, sodass zwei Zyklen Immunadsorption notwendig
wurden. Nach einer Pause von fünf Monaten wurde Patientin 5 in weiteren drei Zyklen
mit Bortezomib behandelt, was wiederum einen Abfall der Anti-dsDNA-Antikörper
bewirkte. Unmittelbar im Anschluss wurde eine erneute Therapie mit Rituximab
eingeleitet, in deren Verlauf bis acht Wochen nach der letzten Bortezomib-Injektion die
Konzentration der Antikörper im Serum abnahm.
Um zu untersuchen, ob Bortezomib auch eine Abnahme der Antikörper-Titer gegen
extrahierbare nukleäre Antigene bewirkt, wurden diese zusätzlich bei drei Patientinnen
bestimmt (Abb. 4.2). Dazu wurden Serumproben, die den Patientinnen 1 bis 3 vor der
ersten Injektion, sowie ca. vier, acht und zwölf Wochen nach Therapiebeginn
entnommen wurden, mit Hilfe eines Festphasen-ELISA auf Antikörper gegen ENA
getestet.
34
Abb. 4.2: Auswirkung der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der
Antikörper gegen ENA im Serum bei Patientin 1-3 (A-C)
A
B
35
C
Dargestellt sind insgesamt vier Messungen zur Bestimmung der Antikörper gegen ENA in der
Konzentration U/ml vor der ersten Bortezomib-Injektion sowie ca. vier, zwölf und acht Wochen
nach Therapiebeginn.
A: Nachweis von Antikörpern gegen SS-A/Ro im Serum von Patientin 1.
B: Nachweis von Antikörpern gegen RNP-70, Sm, SS-A/Ro und SS-B/La im Serum von
Patientin 2.
C: Nachweis von Antikörpern gegen RNP-70 und Sm im Serum von Patientin 3.
Die Konzentration der Antikörper gegen ENA, wie in den Kurvenverläufen zu sehen,
blieb während der Therapie mit Bortezomib im Durchschnitt weitgehend konstant.
Dennoch konnte bereits innerhalb von vier bis zwölf Wochen nach Therapiebeginn bei
jeder Patientin zumindest eine geringe Abnahme der Antikörper-Titer verzeichnet
werden.
4.2 Komplementfaktoren C3 und C4
Bei Autoimmunerkrankungen wie dem SLE kann durch die Bildung von AntigenAntikörper-Komplexen
das
Komplementsystem
aktiviert
werden.
Die
Komplementfaktoren werden an die Immunkomplexe gebunden, umgesetzt und somit
verbraucht. Eine verminderte C3-Konzentration im Serum zeigt eine Aktivierung des
Systems an. Ist gleichzeitig auch C4 vermindert, so spricht dies für eine Aktivierung
des klassischen Weges und somit für den Kontakt mit Immunkomplexen (Hallbach,
2006, S.103).
36
Da Bortezomib im Mausmodell eine Eliminierung der Plasmazellen und damit eine
Reduktion der freien Antikörper bewirkte, sollte es im Rahmen der Behandlung zu einer
verminderten
Immunkomplexbildung
und
damit
zu
einem
geringeren
Komplementverbrauch kommen. Um die Komplementaktivierung unter Bortezomib zu
evaluieren, wurde die Konzentration der Faktoren C3 und C4 im Serum bestimmt.
Abb. 4.3: Entwicklung der Komplementfaktoren C3 und C4 unter Bortezomib bei
Patientin 1-5 (A-E)
A
B
37
C
D
E
Dargestellt sind die Konzentrationen der Komplementfaktoren C3 und C4 in mg/dl in einem
Zeitraum von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis etwa sechs Monate nach
der letzten Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw.
38
nach Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid),
MMF (Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).
Referenzbereich C3: 79-152 mg/dl.
Referenzbereich C4: 16-47 mg/dl.
Tendenziell kam es bei den Patientinnen 1, 2, 4 und 5 unter der Behandlung mit
Bortezomib zu einem Anstieg der Komplementfaktoren.
Bei Patientin 1 (Abb. 4.3 A) stieg nur das C4-Komplement an, während das C3 noch
weiter abfiel.
Patientin 2 (Abb. 4.3 B) zeigte einen deutlichen Anstieg beider Komplementfaktoren,
der unter der anschließenden Behandlung mit Tacrolimus zumindest für C3 bis in den
physiologischen Bereich (79-152 mg/dl) reichte.
Patientin 4 (Abb. 4.3 D) und 5 (Abb. 4.3 E) zeigten unter der Behandlung Fluktuationen
im Konzentrationsverlauf von C3 und C4. Tendenziell konnte beobachtet werden, dass
wenige Tage nach der Injektion die Konzentrationen eher wieder zunahmen.
Unter der Behandlung mit Rituximab unmittelbar nach der letzten Bortezomib-Injektion,
lagen die Komplementfaktoren C3 und C4 bei Patientin 5 (Abb. 4.3 E) im
physiologischen Bereich.
Bei Patientin 3 (Abb. 4.3 C) lagen die Werte sowohl vor der Behandlung mit
Bortezomib, als auch danach immer im physiologischen Bereich. Unklar bleibt ob die
geringen Schwankungen in der C3- und C4-Konzentration SLE-assoziiert sind.
4.3 Renale Proteinausscheidung bei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis im
Verlauf
Die Lupusnephritis gehört zu den schwersten Manifestationen des SLE. Bei Patientin 1
bis 4 wurde im Verlauf der Erkrankung eine diffuse Glomerulonephritis WHO Grad IV
durch eine Nierenbiopsie gesichert. Durch Ablagerung von Immunkomplexen und
Induktion einer Entzündungsreaktion kommt es zur Zerstörung der glomerulären
Basalmembran. Damit werden auch größere Proteine, die normalerweise die Barriere
nicht passieren können, mit dem Urin ausgeschieden. Die Ausscheidung einer
geringen Menge an Proteinen im Urin ist in einem Grenzbereich von 120 bis 150
mg/24h
physiologisch
(Kuhlmann
et
al.,
2008,
S.8).
Die
Menge
der
Proteinausscheidung korreliert mit dem Ausmaß der Schädigung der glomerulären
Basalmembran. Zur quantitativen Bestimmung von Proteinen im Urin unter der
Behandlung mit Bortezomib, wurde in regelmäßigen Abständen über 24 Stunden Urin
39
von Patientin 2, 3 und 4 gesammelt. Patientin 1 wurde aufgrund einer bereits
bestehenden dialysepflichtigen Niereninsuffizienz nicht berücksichtigt, Patientin 5
zeigte keine renale Manifestation des SLE.
Abb. 4.4: Proteinausscheidung im 24h-Urin bei Patientin 2-4 (A-C) im Verlauf
A
B
40
C
Dargestellt ist die Proteinausscheidung im 24h-Urin bei drei Patientinnen mit aktiver
Lupusnephritis (Proteinkonzentration im Urin in mg/24h). Die Messung umfasst einen Zeitraum
von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis etwa sechs Monate nach der letzten
Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw. nach
Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid), MMF
(Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).
Referenzbereich Proteinurie/24h: < 150 mg/24h.
Bei den drei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis ließ sich während der Therapie mit
Bortezomib bereits nach kurzer Zeit eine deutliche Abnahme der Proteinurie
nachweisen.
Patientin 2 (Abb. 4.4 A) zeigte unter Bortezomib bereits einen Monat nach der ersten
Injektion eine deutlich geringere Proteinausscheidung. Sechs Monate nach der letzten
Injektion, kurz nachdem eine Therapie mit Tacrolimus begonnen wurde, lag die
Proteinausscheidung im physiologischen Bereich.
Auch bei Patientin 3 (Abb 4.4 B) und 4 (Abb 4.4 C) ging die Proteinausscheidung. nach
der Behandlung mit Bortezomib deutlich zurück.
Damit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit Bortezomib wie schon im
Mausmodell auch beim Menschen zu einer Abnahme der Proteinausscheidung im Urin
führt.
41
4.4 Einfluss von Bortezomib auf protektive Antikörper
Um zu untersuchen, welchen Einfluss die Behandlung mit Bortezomib auf protektive
Plasmazellen hat, wurden die Impfantikörper gegen Tetanus-Toxoid und Hepatitis-BOberflächen-Antigen bestimmt. Zudem sollte ermittelt werden, ob die Konzentration der
Impfantikörpertiter durch die Behandlung mit Bortezomib soweit abnimmt, dass eine
Auffrischimpfung zur Gewährleistung eines ausreichenden Impfschutzes notwendig
wird.
Abb. 4.5: Protektive Antikörper gegen Tetanus-Toxoid (A) und gegen HBsAntigen (B) im Verlauf
A
B
42
Dargestellt ist die Konzentration protektiver Antikörper im Serum.
A: Konzentration der Antikörper gegen Tetanus-Toxoid im Serum von Patientin 1-5, wobei der
Ausgangswert vor Bortezomib als 100% gewertet wurde, um die relative Änderung zwei bis vier
Wochen und drei bis sechs Monate nach Therapiebeginn zu erfassen. Letzter Wert bei
Patientin 1 nach ca. acht Wochen.
B: Konzentration der Antikörper gegen HBs-Antigen in U/l im Serum der Patientinnen 1-3 und 5
vor der Behandlung mit Bortezomib und jeweils unmittelbar nach Therapieende.
Nach der Behandlung mit Bortezomib nahm die Konzentration der Tetanus-ToxoidAntikörper (Abb. 4.5 A) im Serum der fünf Patientinnen ab.
Bei Patientin 1 bis 4 nahm der prozentuale Anteil an Tetanus-Toxoid-Antikörpern
bereits zwei bis vier Wochen nach Therapiebeginn ab. Nach Abschluss der
Behandlung stieg der Antikörper-Titer prozentual wieder an, ohne dass eine erneute
Impfung erfolgt war.
Bei Patientin 5 nahm der Antikörper-Titer erst später ab, möglicherweise ein Hinweis
auf ein verspätetes Ansprechen auf die Behandlung mit Bortezomib oder ein Effekt der
Immunadsorption, die ca. drei Monate nach der ersten Bortezomib-Injektion
durchgeführt wurde.
Die Konzentration der Antikörper gegen HBs-Antigen (Abb. 4.5 B) im Serum von
Patientin 2 und 5 nahm nach der Behandlung mit Bortezomib deutlich ab. Bei Patientin
1 und 3 zeigte sich ein geringerer Abfall der HBs-Antikörper im Serum. Patientin 4
wurde nicht gegen Hepatitis B geimpft und daher in dieser Messung nicht
berücksichtigt.
Damit konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit Bortezomib auch die
Konzentration protektiver Antikörper reduziert wird. Die Konzentrationen blieben aber
sowohl bei den Tetanus-Toxoid-Antikörpern als auch bei den Anti-HBs-Antikörpern im
protektiven Bereich.
4.5 Verlauf der Krankheitsaktivität anhand des SLEDAI
Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität im Verlauf der Behandlung wurde der
Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) verwendet.
In diesem Index werden 1, 2, 4 oder 8 Punkte für lupusspezifische Symptome bzw.
Laborparameter in insgesamt neun Organsystemen vergeben (siehe auch Tab. 3.1).
43
Um die Wirkung von Bortezomib auf die Krankheitsaktivität zu analysieren, wurde die
SLEDAI-Gesamtpunktzahl für jede Patientin während und nach der Behandlung mit
dem Proteasominhibitor graphisch dargestellt.
Abb.: 4.6 Graphische Darstellung der Krankheitsaktivität im Verlauf anhand der
Gesamtpunktzahl im SLEDAI
Dargestellt ist der Verlauf der SLEDAI-Gesamtpunktzahl von Patientin 1-5. Die Bestimmung des
SLEDAI erfolgte ca. zwölf Wochen vor Bortezomib, am Tag der ersten Injektion, sowie vier bis
acht Wochen, drei bis vier Monate und sechs Monate nach Therapiebeginn.
Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich drei Monate nach
Therapiebeginn bei allen Patientinnen eine verminderte Krankheitsaktivität (Abb. 4.6).
Da subjektive Empfindungen der Patientinnen in diesem Score nicht berücksichtigt
werden, kann der SLEDAI zur Verlaufsbeobachtung, speziell im Hinblick auf das
Ansprechen einer Therapie verwendet werden (Grossmann, Gordon, 2007, S. 926).
Die hohe Gesamtpunktzahl vor der Behandlung mit Bortezomib setzt sich bei Patientin
1 aus folgenden Parametern zusammen: Arthritis, Erythem, Schleimhautulzera,
Pleuritis,
Perikarditis,
Komplementerniedrigung,
Antikörper
gegen
dsDNA,
Thrombozytopenie und Leukopenie (zur Punkteverteilung siehe auch Tab. 3.1). Bereits
vier bis acht Wochen nach Behandlungsbeginn, waren Arthritis, Erythem, Pleuritis,
Perikarditis und Thrombozytopenie nicht mehr nachweisbar.
Patientin 2 zeigte nach vier bis acht Wochen keine Hämaturie, Erythem, Alopezie und
Leukopenie mehr. Nach drei bis vier Monaten verschwand auch die Arthritis und sechs
Monate nach Therapiebeginn war keine Proteinurie mehr nachweisbar. Die noch
44
verbliebenen 4 Punkte erklären sich aus den weiterhin positiven Antikörpern gegen
dsDNA und der noch bestehenden Verminderung der Komplementfaktoren C3 und C4.
Bei Patientin 3 lagen die Antikörper gegen dsDNA zeitweise im physiologischen
Bereich, sodass sich der Punktwert nach vier bis acht Wochen von 14 auf 12 Punkte
verbesserte. Drei bis sechs Monate nach Behandlungsbeginn konnten Hämaturie und
Arthritis nicht mehr nachgewiesen werden, sodass von den ursprünglichen Symptomen
nur die erhöhte Proteinausscheidung für den SLEDAI noch relevant war. Zudem lagen
die Anti-dsDNA-Antikörper wieder oberhalb des Referenzbereichs, sodass die
Gesamtpunktzahl letztendlich bis sechs Monate nach Therapiebeginn bei 6 Punkten
lag.
Patientin 4 zeigte eine pathologische Proteinurie, Komplementerniedrigung, Antikörper
gegen dsDNA und Leukopenie. Im Verlauf verschwand unter der Therapie mit
Bortezomib nur die Leukopenie.
Die Punktzahl vor Therapiebeginn bei Patientin 5 setzt sich aus den Parametern
Arthritis, Komplementerniedrigung und Antikörper gegen dsDNA zusammen. Nach vier
bis acht Wochen trat Fieber ohne infektiöse Ursache auf, das mit einem Punkt in den
Index einging. Nach sechs Monaten traten wieder Fieber und zusätzlich Leukopenie
auf, während die Arthritis nicht mehr nachweisbar war. Insgesamt war damit bei
Patientin 5 nur ein geringer Rückgang des SLEDAI zu beobachten.
Da im SLEDAI nur Punkte abgezogen werden können, wenn das entsprechende
klinische Symptom vollständig verschwunden ist bzw. Laborparameter nur noch im
physiologischen Bereich nachweisbar sind, stellt die Gesamtpunktzahl einen absoluten
Wert dar. Eine geringe Verbesserung der Krankheitsaktivität, z.B. durch rückläufige
dsDNA-Antikörper-Konzentrationen oder eine Abnahme der Proteinausscheidung
werden nicht berücksichtigt. Dennoch konnte auch anhand des SLEDAI, vor allem bei
Patientin 1 bis 4 gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Bortezomib einen
deutlichen Einfluss auf die Krankheitsaktivität hat.
4.6 Unerwünschte Wirkungen unter der Therapie mit Bortezomib
Unter der Therapie mit Bortezomib traten bei Patienten mit multiplem Myelom
verschiedene
unerwünschte
Wirkungen
auf.
Relativ
häufig
war
dabei
die
dosisabhängige periphere, vor allem sensorische Polyneuropathie, die jedoch bei
rechtzeitigem Abbruch der Therapie vollständig reversibel war. Zudem traten Übelkeit
und Diarrhoe sowie Müdigkeit und Leistungsminderung auf. Als eher seltene
45
Nebenwirkungen
wurden
Thrombozytopenie,
Hypotension
mit
Synkope
und
Leberversagen angegeben (Rajappa, 2010).
Daher wurde bei unseren Patientinnen vor Beginn der Therapie ein internistischer
Status mit EKG und Echokardiographie erhoben, sowie eine neurologische
Untersuchung, vor allem im Hinblick auf eine bereits bestehende SLE-assoziierte
Neuropathie,
durchgeführt.
Zudem
wurde
vor
jeder
weiteren
Injektion
eine
umfangreiche Labordiagnostik, inklusive Differentialblutbild, sowie eine ausführliche
Anamnese und körperliche Untersuchung durchgeführt.
Insgesamt traten während der Behandlung mit Bortezomib bei keiner der fünf
Patientinnen ernste Nebenwirkungen auf. Patientin 1 bis 4 gaben wenige Tage nach
der ersten Injektion geringe Übelkeit sowie Kopfschmerzen und Fieber für einen Tag
an. Bei Patientin 2 trat nach einer Injektion Durchfall auf. Patientin 5 zeigte keine
Nebenwirkungen.
Auswirkungen
der
Regelmäßige
Blutbildkontrollen
Bortezomib-Behandlung
auf
ergaben
keine
Erythrozyten,
wesentlichen
Leukozyten
und
Thrombozyten. Während der gesamten Therapie gab es laborchemisch keinen Anhalt
für eine Leber- oder Nierenschädigung durch die Behandlung.
4.7 Zusammenfassung
Der individuelle Heilversuch mit dem Proteasominhibitor Bortezomib bei fünf
Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes zeigte, wie
schon im Tierversuch, eine positive Auswirkung auf den Krankheitsverlauf. Bei allen
fünf
Patientinnen
nahmen
die
Konzentrationen
an
Autoantikörpern
gegen
doppelsträngige (ds) DNA ab und die Patientinnen mit histologisch gesicherter
Glomerulonephritis WHO Grad IV zeigten eine deutlich niedrigere Proteinausscheidung
im
Verlauf.
Die Antikörper-Titer gegen ENA
nahmen nur
gering
ab.
Der
Komplementverbrauch durch Immunkomplexbildung nahm tendenziell unter der
Therapie bei der Mehrzahl der Patienten ab, sodass die Komplementfaktoren C3 und
C4 im Verlauf wieder anstiegen.
Insgesamt sind die größten Erfolge bei Patientin 2 und 3 zu verzeichnen. Durch den
Rückgang der Antikörper gegen dsDNA im Serum von Patientin 3 bis in den
physiologischen Bereich konnte die aus den Lupus-Mausmodellen bekannte Wirkung
von Bortezomib auf die Antikörperproduktion auch beim Menschen nachgewiesen
werden. Patientin 2 zeigte wenige Monate nach der ersten Injektion eine
Proteinausscheidung im physiologischen Bereich.
46
Bei allen Patienten wurde durch Bortezomib die Produktion von Antikörpern gegen
Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen vermindert, ein Hinweis darauf, dass Bortezomib
nicht nur die Produktion von Autoantikörpern verhindert, sondern auch eine
Verminderung nicht autoreaktiver Plasmazellen bewirkt, wie vom Wirkmechanismus zu
erwarten war. Die Konzentration der Impfantikörper blieb während der gesamten
Therapie im protektiven Bereich.
Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich bei allen Patientinnen
bereits drei Monate nach Therapiebeginn eine deutlich verminderte Krankheitsaktivität.
Die SLEDAI-Gesamtpunktzahl, korrelierend mit der Krankheitsaktivität, war bei allen
Patientinnen im Verlauf rückläufig.
Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit
und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine nennenswerten
Nebenwirkungen auf.
Damit könnte Bortezomib in Zukunft einen neuen Therapieansatz für die Behandlung
des therapierefraktären systemischen Lupus erythematodes darstellen.
47
5. Diskussion
Trotz der Entwicklung und Erforschung zahlreicher Therapieverfahren in den letzten
Jahren, kann der systemische Lupus erythematodes in vielen Fällen immer noch nicht
ausreichend behandelt werden. Vor allem die Beteiligung der Nieren in Form einer
Glomerulonephritis stellt eine häufige und schwerwiegende Komplikation dar
(Kashgarian, 2002, S.1061), die bis zur dialysepflichtigen Niereninsuffizienz führen
kann. Da mit den bisher üblichen Therapieverfahren eine Heilung des SLE bislang
nicht möglich ist und zudem häufig schwere Nebenwirkungen den Einsatz wirksamer
Medikamente
limitieren,
ist
es
erforderlich
nach
effizienteren
und
nebenwirkungsärmeren Alternativen zu suchen.
Die wohl größte Rolle in der Pathogenese des SLE spielt die Produktion von
Autoantikörpern. Eine gestörte zentrale Toleranz in Thymus und Knochenmark kann
dazu
führen,
dass
zirkulierende
CD4+
T-Helferzellen
durch
die
Erkennung
körpereigener Antigene, die über MHC-II-Moleküle der dendritischen Zellen präsentiert
werden, aktiviert werden (Böcker et al., 2004, S. 1116). Die aktivierten T-Helferzellen
interagieren
mit
B-Zellen,
die
durch
Wachstumsfaktoren
bzw.
Zelloberflächenrezeptoren ebenfalls aktiviert werden. Im Verlauf differenzieren diese BZellen zu Plasmazellen, die autoreaktive Antikörper produzieren (Hof et al., 2009,
S.105). Durch überschießende Immunkomplexbildung kann der Abbau durch
Phagozyten nicht kompensiert werden, sodass die Ablagerung der Immunkomplexe im
Gewebe zahlreicher Organen begünstigt wird (Hof et al., 2009, S. 140; Gaipl, 2003).
Weitere pathogene Mechanismen, die häufig diskutiert werden, sind wahrscheinlich
eine fehlregulierte oder gesteigerte Apoptose (Hieronymus, 2000) und eine gestörte
Phagozytose toter Zellen (Herrmann et al., 1998). Antigenes Zellmaterial das dem
programmierten Zelltod zugeführt wurde, wird anschließend über MHC-I-Moleküle
präsentiert und so dem Immunsystem zugänglich gemacht. Handelt es sich dabei um
autologe Antigene, z.B. um Bestandteile von apoptotischem Zellkernmaterial, ist eine
Immunreaktion die Folge, in deren Verlauf es zu einer Antikörperproduktion durch
Plasmazellen gegen körpereigene Antigene kommt (Hahn, 2002, S.90-91; Böcker et
al., 2004, S. 1118).
Die Induktion und Suppression der Apoptose und damit die Menge an antigenem
Zellmaterial wird unter anderem durch das 26S-Proteasom, einen Proteinkomplex im
Inneren von eukaryotischen Zellen, reguliert (Naujokat et al., 2002; Lecker et al., 2006).
Da das Proteasom auch die Aktivierung von Wachstumsfaktoren kontrolliert, spielt es
zudem eine wichtige Rolle in der Entstehung maligner Zellen (Naujokat et al., 2002).
48
Durch den Proteasominhibitor Bortezomib konnte bei Patienten mit multiplem Myelom
die
Proliferation
maligner
Zellen
reduziert
werden,
wobei
die
Antikörper-
produzierenden Myelomzellen durch ihre extrem hohe Proteinbiosynthese sehr
empfindlich gegenüber Proteasominhibition werden (Simons et al., 2006; Meister, Voll,
2007). Das gab Anlass zu der Annahme, dass auch nicht maligne Zellen mit einer
hohen Proteinsyntheserate, wie zum Beispiel nicht maligne antikörperproduzierende
Plasmazellen, einen Angriffspunkt für Bortezomib darstellen könnten (Meister, Voll,
2007). Wie in Lupus-Mausmodellen gezeigt wurde, führte die Proteasominhibition zu
einer Eliminierung von Plasmazellen, einschließlich der langlebigen und damit zu einer
Reduktion lupusspezifischer Symptome in Mäusen (Neubert et al., 2008).
In dieser Arbeit wurden die Ergebnisse von individuellen Heilversuchen an fünf
Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes ausgewertet.
Hierbei zeigte sich, dass Bortezomib auch beim Menschen zu einer deutlichen
Verbesserung SLE-assoziierter Manifestationen führen kann.
5.1 Einfluss von Bortezomib auf die Antikörperproduktion durch Elimination von
Plasmazellen
Neubert et al. konnten in Versuchen mit NZB/W F1-Mäusen zeigen, dass Bortezomib
erfolgreich zu einer Elimination von autoreaktiven Plasmazellen und dadurch zu einer
Reduktion lupusrelevanter Autoantikörper führt.
In malignen Plasmazellen bei Patienten mit multiplem Myelom induziert Bortezomib
durch Inhibition des Proteasoms die terminale UPR (unfolded protein response), durch
die letztendlich die Apoptose der Zelle eingeleitet wird (Meister, Voll, 2007). Die UPR
ist ein Signaltransduktionsweg im Inneren der Zelle, bei dem ungefaltete oder falsch
gefaltete Proteine, die in Stresssituationen vermehrt anfallen, abgebaut werden und so
das Überleben der Zelle ermöglicht wird (Walter, Ron, 2011). Je höher die
Syntheserate der Zelle ist, desto höher ist auch der Anteil falsch gefalteter Proteine, die
zum ER-Stress führen. Zellen mit einer hohen Proteinsyntheserate sind daher auf die
UPR angewiesen, damit die Homöostase der Zelle aufrechterhalten wird (Meister, Voll,
2007; Walter, Ron, 2011). Eine lange andauernde übermäßige Aktivierung der UPR
durch anhaltenden extremen ER-Stress hat den Tod der Zelle durch Apoptose zur
Folge (Walter, Ron, 2011; Elkon, 2002, S.146).
Im SLE-Mausmodell wurde gezeigt, dass Bortezomib die sogenannte terminale UPR
aktiviert und so zur Apoptose von Plasmazellen führt, die ebenso wie die Zellen des
multiplen Myeloms eine hohe Proteinsyntheserate haben (Neubert et al., 2008). Bereits
49
48 Stunden nach der ersten Injektion war bei den Mäusen eine deutliche Abnahme der
Autoantikörper-Titer gegen dsDNA zu verzeichnen. Zudem bewirkte Bortezomib
zusätzlich zu der Zerstörung kurzlebiger Plasmazellen auch eine Elimination der
langlebigen Plasmazellen, die für die anhaltende Antikörperproduktion, das humorale
Gedächtnis, entscheidend sind. Eine Kontrollgruppe, die mit Cyclophosphamid und
Dexamethason behandelt wurde, zeigte keine Reduktion der langlebigen Plasmazellen
(Neubert et al., 2008).
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Behandlung mit Bortezomib bei
Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes zu einem
Rückgang der Autoantikörperproduktion führt und damit eine mögliche neue
Therapieoption darstellen könnte.
Bei allen fünf Patientinnen fielen die Antikörper gegen dsDNA im Serum bereits nach
der ersten Injektion mit Bortezomib ab. Wie im Mausmodell konnte auch hier gezeigt
werden, dass bereits nach wenigen Tagen ein deutlicher Effekt von Bortezomib
erkennbar ist. Während im Serum aller NZB/W-Mäuse nach acht Wochen keine AntidsDNA-Antikörper mehr nachweisbar waren (Neubert et al., 2008), erreichten wir
zumindest bei einer Patientin nach dem zweiten Zyklus Werte im physiologischen
Bereich. Insgesamt lagen die Autoantikörper-Titer aller Patientinnen am Ende deutlich
unter den Werten vor der Behandlung mit Bortezomib.
Im Mausmodell zeigte sich, dass die IgG-Gesamtkonzentration nur auf etwa die Hälfte
reduziert werden konnte, was teilweise mit einer Regeneration von Plasmazellen
innerhalb
der
Pause
von
drei
bis
vier
Tagen
zwischen
den
Injektionen
zusammenhängen dürfte (Neubert et al., 2008). Vor allem die mucosaassoziierten
lymphatischen Gewebe, z.B. im Darm sind wahrscheinlich dafür verantwortlich, dass
Plasmazellen schnell wieder regeneriert werden. Der erneute Anstieg der Anti-dsDNAAntikörper im Serum von Patientin 3 ca. drei Wochen nach dem zweiten Zyklus mit
Bortezomib sowie die zwischen den Zyklen aufgetretenen Schwankungen in der AntidsDNA-Antikörper-Konzentration bei Patientin 4 und 5, könnten ebenfalls auf eine
Regeneration von Plasmazellen im Zeitraum zwischen den Injektionen zurückzuführen
sein. Zudem wird ein Wiederanstieg bzw. eine unvollständige Elimination von AntidsDNA-Antikörpern auf eine Resistenz der Marginalzonen-B-Zellen in der Milz
diskutiert, die jedoch bisher nur für die Maus gezeigt ist (Lang et al., 2010). Wie gezeigt
werden konnte, führt die Behandlung mit Bortezomib in Lupus-Mäusen zu einer
Proteasominhibition und Depletion von Plasmazellen im Rahmen der T-zellabhängigen
Immunantwort. Die Marginalzonen-B-Zellen, die jedoch T-zellunabhängig Antikörper
produzieren, werden durch Bortezomib nicht eliminiert. Ein möglicher Grund dafür
50
dürfte sein, dass in Marginalzonen-B-Zellen die proapoptotische terminale UPR durch
Proteasominhibition nicht aktiviert wird (Lang et al., 2010).
Die Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) bei Patientin 1-3 zeigten
insgesamt nur eine geringe Veränderung unter der Therapie mit Bortezomib. Vier
Wochen nach der ersten Injektion fand sich bei allen drei Patientinnen zunächst eine
Abnahme der Konzentration, die jedoch nicht konsequent bis zwölf Wochen nach der
ersten Injektion zu verfolgen war. Während Antikörper gegen dsDNA unmittelbar mit
der Krankheitsaktivität korrelieren, werden Antikörper gegen ENA mit der möglichen
Entwicklung bestimmter Manifestationen des SLE in Verbindung gebracht (Craft, 2002,
S. 488). Die ENA dürften im Gegensatz zu den dsDNA-Antikörpern ganz überwiegend
von sehr resistenten langlebigen Plasmazellen sezerniert werden. Die beim Menschen
verwendeten Bortezomibkonzentrationen genügen offenbar nicht, um den Großteil der
langlebigen Plasmazellen zu eliminieren. Zudem gibt es verschiedene Hinweise, dass
sich auch die Gedächtnis-Plasmazellen hinsichtlich Apoptoseresistentz unterscheiden,
wobei die Ursachen hierfür noch unklar sind.
Da Bortezomib in den Versuchen mit NZB/W-Mäusen nachweislich nicht nur zu einer
Elimination autoreaktiver Plasmazellen führte, sondern auch zu einer Verminderung
nicht autoreaktiver IgG-Antikörper (Neubert et al., 2008), war davon auszugehen, dass
auch die Konzentration der protektiven Impfantikörper im Serum der Patientinnen
während der Behandlung mit Bortezomib abnimmt. Der Verlauf der Antikörpertiter
gegen Tetanus-Toxoid und Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen zeigte deutlich den
Einfluss der Proteasominhibition auf diese Anti-Tetanus-Toxoid- bzw. Anti-HBsAntigen-spezifischen Plasmazellen (siehe Abb. 4.5). Folglich könnte unter der Therapie
mit dem Proteasominhibitor der Impfschutz durchaus bestehen bleiben, was eine
generelle Auffrischimpfung nach der Therapie nicht zwingend notwendig machen
dürfte. Allerdings sollten die Titer entweder getestet werden oder sicherheitshalber
Auffrischimpfungen erfolgen.
5.2 Effekt von Bortezomib auf den Krankheitsverlauf bei aktiver Nephritis
Eine schwere und potentiell lebensbedrohliche Manifestation des systemischen Lupus
erythematodes ist die Beteiligung der Nieren, in Form einer Glomerulonephritis. Etwa
50-80% der Patienten mit SLE zeigen eine renale Beteiligung (Kashgarian, 2002, S.
1061, S.1070). Die häufigste Form ist die diffus proliferative Glomerulonephritis, WHO
Grad IV, bei der die meisten bzw. häufig auch alle Glomeruli betroffen und
mikroskopisch durch nekrotische und sklerotische Areale gekennzeichnet sind. Durch
51
subendotheliale Immunkomplexablagerungen werden zirkulierende zelluläre oder
humorale
Entzündungsmediatoren
Komplementfaktoren
und
wie
Makrophagen,
antikörperproduzierende
zytotoxische
Plasmazellen
T-Zellen,
aktiviert,
die
wiederum proinflammatorische Zytokine aktivieren. Diese erhöhen durch Induktion von
Entzündungsreaktionen die Permeabilität der Basalmembran, wodurch z.B. höher
molekulare Proteine die Basalmembran passieren können und über den Urin
ausgeschieden werden (Kashgarian, 2002, S. 1065). Anti-dsDNA-Immunkomplexe
können direkt an die glomeruläre Basalmembran binden und so Schäden verursachen
(Ehrenstein et al., 1995). Durch Immunkomplexablagerungen an den Gefäßwänden
kann es zu Vaskulitiden, Thrombenbildungen und schließlich zur Nekrose kommen
(Kashgarian, 2002, S. 1068). Nephrotisches Syndrom und eine verminderte
glomeruläre Filtrationsrate bis hin zur Niereninsuffizienz sind die Folge (Kashgarian, S.
1065).
Bisher konnten gute Erfolge mit Cyclophosphamid erzielt werden (Aringer et al., 2007,
S. 34), jedoch stellen die zum Teil schweren Nebenwirkungen des Zytostatikums, wie
Übelkeit und Erbrechen, hämorrhagische Zystitis, Kanzerogenität und die Gefahr der
vorzeitigen Menopause Probleme dar, die den Einsatz dieses Medikamentes limitieren.
Zudem gelingt es manchmal nicht, die Aktivität der Nephritis ausreichend zu
kontrollieren. Ein Grund dafür dürften die extrem therapieresistenten langlebigen
Plasmazellen sein, die in größeren Zahlen im Nierengewebe von NZB/W F1 Mäusen
(Starke et al., 2011) und auch in den Nieren von SLE-Patienten (Espeli M. et al., 2011)
gefunden wurden. In histologischen Präparaten aus Nieren der SLE-Mäuse war der
Anteil der Plasmazellen, die Anti-dsDNA-Antikörper produzieren, höher als im
Knochenmark oder in der Milz. Zudem war der Anteil an langlebigen Plasmazellen
weitaus höher als der der kurzlebigen Plasmazellen (Starke et al., 2011).
Wie gezeigt werden konnte, reduziert eine Behandlung mit Bortezomib die Produktion
von Anti-dsDNA-Antikörpern durch Elimination von Plasmazellen sowohl in SLEMäusen (Neubert et al., 2008) als auch bei unseren Patientinnen und bietet damit
möglicherweise eine Chance, auch langlebige Plasmazellen im nephritischen Gewebe,
zumindest teilweise, anzugreifen.
Wie histologische Untersuchungen zeigten, verhinderte Bortezomib erfolgreich die
Ablagerung von Immunkomplexen im Nierengewebe von NZB/W F1 Mäusen, wodurch
die Nephritis-bedingte Proteinurie abnahm. Während die Mäuse der Kontrollgruppe, die
Placebo erhielten, nach wenigen Wochen starben, kam es bei Mäusen, die mit
Bortezomib behandelt wurden, zu einer kompletten Remission der Lupusnephritis
(Neubert et al., 2008). Da durch die Proteasominhibition bei unseren Patientinnen die
Konzentration der Anti-dsDNA-Antikörper und damit sehr wahrscheinlich auch die Zahl
52
der zirkulierenden Immunkomplexe abnahmen, war davon auszugehen, dass im
Verlauf auch die Menge der Proteinausscheidung im Urin abnehmen würde. Bereits
nach der ersten Injektion zeigte sich ein deutlicher Effekt durch den Proteasominhibitor.
Wie schon im Mausmodell (Neubert et al., 2008) korrelierte auch bei unseren
Patientinnen die Hemmung der Antikörperproduktion mit einer klinischen Besserung
der Nephritis. Patientin 2 zeigte sechs Monate nach Therapiebeginn sogar eine
Proteinausscheidung im physiologischen Bereich. Inwieweit ein weiterer off-lableVersuch mit Tacrolimus zwei Monate nach der letzten Bortezomib-Injektion in diesem
Fall einen weiteren Rückgang der Proteinurie bis in den physiologischen Bereich
beeinflusste, ist nicht ganz klar. Bei diesem Medikament handelt es sich um einen
Immunmodulator der im Rahmen der Organtransplantation zur Prävention und
Therapie von Abstoßungsreaktionen verwendet wird. 1997 wurden erstmals zwei
Patientinnen mit therapierefraktärem SLE erfolgreich mit Tacrolimus behandelt
(Duddridge, Powell, 1997). Bei Kindern mit Lupusnephritis konnte eine Verminderung
der Proteinausscheidung erreicht werden (Yoon, 2010). Da Tacrolimus jedoch die BZell-Aktivität und damit die Antikörperproduktion nur indirekt über die Modulation von TZellen und Zytokinen beeinflusst (Yoon, 2010), könnte Bortezomib im Vergleich durch
die Eliminierung von langlebigen Plasmazellen und durch die schnelle Verminderung
der
Autoantikörperkonzentration
Behandlungsmöglichkeit
darstellen.
möglicherweise
Ob
Tacrolimus
eine
unter
effektivere
Umständen
zur
Erhaltungstherapie nach einer Behandlung mit Bortezomib geeignet ist, sollte in
klinischen Studien geprüft werden.
Mit einer erhöhten Aktivität der Lupusnephritis werden erniedrigte Konzentrationen der
Komplementfaktoren C3 und C4 in Zusammenhang gebracht (Wallace, 2002, S. 1085).
Dabei handelt es sich um Proteine, die der humoralen Immunabwehr des Körpers
angehören
und
durch
Antikörperkomplexen
bzw.
Aktivierung
zur
zu
einer
Opsonierung
Membranperforation
von
von
Pathogenen
Antigenführen.
Desweiteren wird diskutiert, dass die Komplementfaktoren direkt an nekrotische Zellen
und deren Kerne binden, die durch eine unzureichende Clearance von apoptotischen
Zellen bei Patienten mit SLE entstehen (Munoz et al., 2005). Die Höhe der C3Konzentration
korreliert
mit
der
histologisch
gesicherten
Aktivität
der
Glomerulonephritis, während eine länger anhaltende Konzentration innerhalb des
Referenzbereichs mit einer besseren Prognose assoziiert wird (Wallace, 2002, S.
1085).
Dementsprechend sollte die C3- und C4-Konzentration auch mit dem Verlauf der AntidsDNA-Antikörper bzw. zirkulierenden Immunkomplexen korrelieren. Ein Abfall der
53
Antikörper sollte demnach mit einem Anstieg der Komplementfaktoren im Serum
assoziiert sein.
Wie in den Heilversuchen mit Bortezomib gezeigt werden konnte, stieg die
Konzentration der beiden Komplementfaktoren im Serum von Patientin 2, 4 und 5 an,
während korrespondierend dazu die Konzentration der Anti-dsDNA-Antikörper relativ
zeitgleich sank. Patientin 4 und 5 zeigten vor allem wenige Tage nach der Injektion
einen geringeren Komplementverbrauch an, was möglicherweise durch die akute
Wirkung von Bortezomib auf die autoantikörperproduzierenden Plasmazellen und die
damit akute Verminderung der zirkulierenden Immunkomplexe erklärbar ist. Bei
Patientin 1 stieg nur das C4-Komplement korrespondierend zu einem Abfall der AntidsDNA-Antikörper an, während C3 nach den beiden Bortezomib-Zyklen noch weiter
abfiel. Der Anstieg von ungebundenem C4 im Serum wird mit einer verminderten Zahl
an zirkulierenden Immunkomplexen in Zusammenhang gebracht (Hallbach, 2006, S.
103). Die Erniedrigung von C3 unter der Therapie, könnte eine Erklärung dafür sein,
dass
der
starke
Komplementverbrauch
nicht
nur
sekundär
durch
die
Komplementbindung an Immunkomplexe bzw. an nekrotische Zellen und deren Kerne
bedingt ist (Munoz et al., 2005), sondern dass es möglicherweise auch zu einer
primären Komplementerniedrigung im Rahmen des SLE kommt, deren Ursache jedoch
bislang nicht geklärt ist (Schur, 2002, S. 245, 252).
5.3 Proteasominhibition als zukünftige Therapieoption bei refraktärem SLE?
Noch immer stellt die Behandlung des systemischen Lupus erythematodes eine große
Herausforderung dar. Mit zahlreichen Therapieverfahren konnten ein Rückgang der
Autoantikörperproduktion und eine Verbesserung lebensbedrohlicher Symptome, wie
Nephritis oder ZNS-Vaskulitis erreicht werden. Doch häufig limitieren schwere
Nebenwirkungen den Einsatz dieser Medikamente.
Mit dem Proteasominhibitor Bortezomib gelang Neubert et al. im Mausmodell die
effiziente Elimination langlebiger Plasmazellen, die gegenüber den gängigen
Therapieverfahren resistent blieben. Mäuse mit aktiver Glomerulonephritis zeigten
nach
der
Behandlung
mit
Bortezomib
eine
renale
Proteinausscheidung
im
physiologischen Bereich (Neubert et al., 2008).
In individuellen Heilversuchen an fünf Patientinnen mit therapierefraktärem SLE konnte
erstmals gezeigt werden, dass Bortezomib auch beim Menschen zu einer deutlichen
Verbesserung lupusspezifischer Laborparameter und klinischer Symptome führt.
54
Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit
und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine ernsten Nebenwirkungen
auf. Bei einer Patientin (Patientin 5) traten während der gesamten Dauer der
Behandlung keine Nebenwirkungen auf. Die aus der Myelomtherapie bekannte
reversible periphere, vor allem sensorische Neuropathie trat bei unseren Patientinnen
nicht
auf.
Da
diese
unerwünschte
Wirkung
des
Proteasominhibitors
bei
Myelompatienten dosisabhängig unter Dauertherapie auftrat (Rajappa, 2010), ist bei
einem möglichen Einsatz von Bortezomib als langfristige Therapie bei SLE darauf zu
achten, dass regelmäßig neurologische Untersuchungen durchgeführt werden.
Keine der Patientinnen zeigte Blutbildveränderungen während der Behandlung. Damit
ließ sich auch in der Anwendung am Menschen die gute Verträglichkeit des
Proteasominhibitors im Vergleich zu anderen Medikamenten darstellen. Zum Beispiel
führte Cyclophosphamid im Mausmodell zu einer starken Reduktion von Granulozyten,
Lymphozyten und Marginalzonen-B-Zellen, die sich nur sehr langsam wieder erholten
(Lang et al., 2010). In NZB/W F1 Mäusen, die mit Bortezomib behandelt wurden,
blieben diese Zellen jedoch weitgehend unverändert (Neubert et al., 2008).
Insbesondere die Marginalzonen-B-Zellen der Milz konnten durch Bortezomib nicht
eliminiert werden, wodurch die Antikörperproduktion für die unmittelbare Immunantwort
auf Bakterien, die über das Blut im Körper verteilt werden, erhalten bleiben dürfte
(Lang et al., 2010). Dadurch könnte die Gefahr schwerer Infektionen, die bei
Zytostatika und Immunsuppressiva besteht, unter der Behandlung mit Bortezomib
relativ gering sein.
Neubert et al. konnten im Mausmodell zeigen, dass durch eine komplette Remission
der Lupusnephritis die Lebenserwartung der NZB/W F1 Mäuse deutlich erhöht war.
Zudem war eine präventive Behandlung mit Bortezomib, bevor lupusspezifische
Symptome auftraten, mit einem verlängerten Überleben der Mäuse verbunden.
Inwiefern Bortezomib zu einer erhöhten Lebenserwartung, insbesondere durch den
präventiven Einsatz vor der Manifestation schwerer Symptome, wie Glomerulonephritis
oder ZNS-Beteiligung, im Menschen beiträgt, sollte in kontrollierten klinischen Studien
untersucht werden.
In einer anderen Publikation konnte in Zellkulturen des multiplen Myeloms gezeigt
werden, dass Bortezomib zusammen mit dem Calciumkanalblocker Verapamil zu einer
effizienteren Induktion des Zelltodes führt (Meister et al., 2010). Verapamil verhindert
den Einstrom von Calcium ins Zellinnere, wodurch die Induktion des sog. MDR1-Gens
verhindert wird. Dieses Gen kodiert für den multidrug-resistance-Transporter, der
bestimmte Medikamente aus Zellen wieder hinausschleust und so zu einer
Resistenzentwicklung der Zelle beiträgt (Meister et al., 2010). Indem Verapamil
55
zusätzlich die Expression proapoptotischer Faktoren verbessert, unterstützt dieses
Medikament die Wirkung von Bortezomib auf die Induktion der Apoptose durch
Aktivierung der UPR (Meister et al., 2010). Aus diesem Grund kann angenommen
werden, dass Verapamil zusätzlich zu Bortezomib auch in der Behandlung des
therapierefraktären SLE einen positiven Effekt zeigen könnte. Da der Abbau von
Verapamil durch die Leber erfolgt, ist der Einsatz bei Niereninsuffizienz nicht
kontraindiziert
(Karow,
Lang-Roth,
2011,
S.123-124).
Folglich
könnte
dieser
Calciumkanalantagonist auch bei Patienten mit aktiver Lupusnephritis in Kombination
mit Bortezomib eingesetzt werden. Allerdings dürften die benötigten VerapamilKonzentrationen im obersten tolerierbaren Dosisbereich liegen und somit auch
erhebliche Nebenwirkungen verursachen.
Kontrollierte klinische Studien sollten zukünftig prüfen, in welcher Dosierung mit
Bortezomib
der
bestmögliche
Therapieeffekt
bei
einer
möglichst
geringen
Nebenwirkungsrate erzielt werden kann. Unter der Dosierung von 1,3 mg/m2
Körperoberfläche
konnte
in
unseren
Heilversuchen
bereits
eine
deutliche
Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht werden. Möglicherweise könnte eine
Langzeittherapie den erneuten Anstieg der Anti-dsDNA-Antikörper verhindern.
Desweiteren könnte z.B. durch Analyse der Plasmazellzahl im Knochenmark während
der Therapie untersucht werden, wie effizient diese durch Bortezomib beim Menschen
eliminiert werden bzw. wie schnell sich die Plasmazellen innerhalb der Therapiepausen
regenerieren.
Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, führt eine Behandlung mit dem Proteasominhibitor
Bortezomib bei Patienten mit therapierefraktärem SLE zu einer Abnahme der
Antikörperkonzentrationen sowie zu einem Rückgang der Glomerulonephritis. Bei einer
Patientin
lag
der
Anti-dsDNA-Antikörper-Titer
nach
dem
zweiten
Zyklus
im
physiologischen Bereich. Eine weitere Patientin zeigte sechs Monate nach
Therapiebeginn keine klinisch relevante Proteinurie mehr, was auf eine Remission der
Glomerulonephritis hindeutet. Klinische Symptome wie Arthritis, Erythem oder Alopezie
waren ebenfalls nicht mehr nachweisbar. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine
Behandlung mit Bortezomib, im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Medikamenten,
deren erhebliche unerwünschte Wirkungen häufig zum Therapieabbruch führen, nur
mit relativ geringen Nebenwirkungen verbunden ist.
Damit könnte der Einsatz von Proteasominhibitoren zukünftig einen entscheidenden
Fortschritt
in
der
Behandlung
erythematodes darstellen.
des
therapierefraktären
systemischen
Lupus
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Verwendete Abkürzungen
Abkürzung
Fachbegriff/Bezeichnung
Abb.
Abbildung
ACR
American College of Rheumatology
ANA
antinukleäre Antikörper
BSA
bovine serum albumine
CD
cluster of differentiation
CENP-B
centromere protein B
DNA
Desoxyribonukleinsäure
ds
doppelsträngig
EKG
Elektrokardiogramm
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
ENA
extractable nuclear antigens
ER
Endoplasmatisches Retikulum
ERAD
endoplasmatic reticulum associated degradation
Fc
„Fuß“ des Antikörpers, eine der drei Bindungsstellen
HBs-Antigen
hepatitis B surface antigen
HLA
human leukocyte antigen
HRP
horse raddish peroxidase
i.v.
intravenös
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IκB
inhibitor of kappa B
Jo-1
Histidyl-Transfer-RNA-Synthetase
MDR
multidrug resistance
MHC
major histocompatibility complex
MMF
Mycophenolat-Mofetil
NF-κB
nuclear factor kappa B
NZB/W
New Zealand Black/White
OD
optische Dichte
p.o.
per os
PBS
phosphate buffered saline
RNP
Ribonukleoprotein
Scl-70
DNA-Topoisomerase I
SLE
systemischer Lupus erythematodes
66
SLEDAI
systemic lupus erythematosus disease activity index
Sm
Spliceosom
SS-A/Ro
Robert-Antigen
SS-B/La
Lane-Antigen
Tab.
Tabelle
TLR
toll like receptor
TNF
Tumornekrosefaktor
Tween 20
Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat
UPR
unfolded proteine response
WHO
world health organization
ZNS
zentrales Nervensystem
Maßeinheiten
Abkürzung
Bezeichnung
°C
Grad Celsius
µl
Mikroliter (Multiplikationsfaktor: 10-6)
Da
Dalton
dl
Deziliter (Multiplikationsfaktor: 10-1)
g
Gramm
h
Stunde(n) (hour)
IE
internationale Einheit
kg
Kilogramm (Multiplikationsfaktor: 103)
l
Liter
m
Meter
M
molar (mol/l)
m2
Quadratmeter
min
Minute(n)
ml
Milliliter (Multiplikationsfaktor: 10-3)
mmHg
Millimeter Quecksilbersäule (Druck)
nm
Nanometer (Multiplikationsfaktor: 10-9)
U
Einheit (unit)