Wahlpraktikum 5034
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Wahlpraktikum 5034 "Ihr Partner im Labor: Forschung auf den Gebieten Herzchirurgie, Herztransplantation und Herzinfarkt" Teilnehmende Studierende und Verfasser dieses Berichtes: Patrick Buntschu Lukas Burri Eveline Janosa Silvan Jungi Benedikt Kislinger Christian Muster Julia Rheinberger Céline Rolle Hans Schudel WP-Crew: Thusitha Gajanayake, PhD-Doktorand Katja Matozan, Forschungslaborantin Rolf Spirig, PhD-Doktorand Leiter des Wahlpraktikums: Robert Rieben Universität Bern Departement Klinische Forschung Hintergrund, Fragestellung und Methoden Forschungsthematik und Aufteilung in Arbeitsgruppen (Robert Rieben) Die Forschungsgruppe von Robert Rieben beschäftigt sich mit der Problematik der Aktivierung von vaskulären Endothelzellen im Zusammenhang mit der Organtransplantation, der kardiovaskulären, rekonstruktiven und plastischen Chirurgie sowie dem Herzinfarkt. In allen diesen Fällen sind Organe und Gewebe und insbesondere die betroffenen Blutgefässe für eine gewisse Zeit einer Ischämie ausgesetzt, sie werden also nicht durchblutet. Sobald die Blutzufuhr wieder instand gestellt ist, d.h. bei der Reperfusion, tritt das "Ischämie-Reperfusionssyndrom" auf (I/R-Injury oder Reperfusionsschaden), eine Schädigung der Blutgefässe und des betroffenen Gewebes, die unterschiedlich stark ausgeprägt sein kann und im klinischen Alltag von grosser Bedeutung ist. Bei der Herzchirurgie unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine muss der Reperfusionsschaden des Herzmuskels mittels spezieller Kardioplegielösungen gering gehalten werden. Insbesondere bei länger dauernden Operationen am offenen Herzen, bei Kleinkindern und bei alten Patienten können aufgrund des postoperativen Reperfusionsschadens Herzinsuffizienzen auftreten, die behandelt werden müssen und die unter Umständen so gravierend sein können, dass ein Multiorganversagen auftritt. Bei der Herztransplantation ist der Reperfusionsschaden mit verantwortlich für das gefürchtete akute Transplantatversagen und mit ein Grund für die limitierte kalte Ischämiezeit von 4-6 Stunden, denen ein menschliches Spenderherz vor einer Transplantation maximal ausgesetzt werden darf. Beim Myokardinfarkt schliesslich, insbesondere wenn die Wiedereröffnung der verstopften Koronararterie rasch erfolgt, ist der Reperfusionsschaden für einen beträchtlichen Teil des verbleibenden Gewebeschadens im Myokard verantwortlich: Nach der Reperfusion findet man bei Ischämiezeiten unter 2-3 Stunden wesentlich mehr nekrotisches Gewebe als bereits durch die Ischämie entstanden war. Das Komplementsystem, die Aktivierung von Endothelzellen und die daraus resultierende Aktivierung des angeborenen Immunsystems (innate immunity) sind wesentliche Faktoren, die bei der Entstehung des Reperfusionsschadens und der dadurch verstärkten akuten Abstossung eines transplantierten Organs eine Rolle spielen. Die Teilnehmenden des Wahlpraktikums wurden deshalb in drei Gruppen eingeteilt, die je einen dieser Teilaspekte im Labor untersuchten: - Entwicklung eines ELISA zum Nachweis der Komplementaktivierung (C5a) Nachweis des Verlustes von Heparansulfat von der Oberfläche aktivierter Endothelzellen und Verhinderung desselben durch niedrigmolekulares Dextransulfat (DXS) Nachweis der Aktivierung dendritischer Zellen durch Heparansulfat und ebenfalls Verhinderung dieser Aktivierung durch DXS Nachweis von C5a als Marker für die Komplementaktivierung Das Komplementsystem ist ein wesentlicher Teil unseres humoralen Immunsystems. Es hat die Möglichkeiten zur Opsonisierung, Chemotaxis, Aktivierung der Gerinnung und Bildung von zelllytischen Porenkomplexen. Folglich induziert und potenziert es auf verschiedenen Wegen die Entzündungsreaktion. Bei Transplantaten oder Einsatz der Herz-Lungenmaschine kommen die Plasmaproteine der Komplementkaskade mit Fremdoberflächen in Kontakt und werden aktiviert. Das Ausmass der so ausgelösten Entzündung ist relevant für Prognose und therapeutische Massnahmen. Unsere Gruppe hat sich mit der Messung und Quantifizierung von aktiviertem Komplement beschäftigt. Solche Bestimmungen werden bei den betroffenen Patienten noch nicht routinemässig durchgeführt. Für Analyse und Referenzwerte stehen bislang nur eingekaufte Kits zur Verfügung, was Abhängigkeit von den Herstellern dieser Analysekits und deren Angaben zu Sensitivität und Spezifität der Tests bedeutet. Ziel unserer Arbeit war es deshalb, mithilfe eingekaufter Standards und Antikörper einen eigenen Test aufzubauen und die Quantifizierung von C5a in unseren Proben zu ermöglichen. Das soll die Einführung von hauseigenen Standards ermöglichen und einen Beitrag dazu leisten, dass in Zukunft bei Patientenseren die Komplementaktivierung standardmässig kontrolliert werden kann. Material und Methoden Das Experiment umfasste einen ELISA-Nachweis (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) von C5a in verschiedenen Testseren. - Die Wells (96 well Mikrotiterplatte) wurden zuerst mit einem monoklonalen Maus-Antikörper (MAb) gegen humanes C5a gecoatet und die Platten anschliessend gewaschen. Die Testseren wurden in drei verschiedenen Verdünnungen aufgetragen, ebenso ein Blank und die Standards, alles in zweifacher Ausführung. Die Seren wurden ausgewaschen, d.h. nur humanes C5a bleibt in den Wells. Der Detektionsantikörper, ebenfalls ein MAb gegen C5a, wurde dazugegeben. Nach einem Waschschritt wurde ein zweiter, biotinylierter Ziege anti-Maus Antikörper dazugegeben. Nichtgebundene Antikörper wurden ausgewaschen. Alkalische Phosphatase, konjugiert an Streptavidin, wurde als Markerenzym dazugegeben und schliesslich dessen Aktivität zur Umsetzung des Substrates 4-NPP (4-Nitrophenyl-Phosphat) mit einem Extinktionsmessgerät (Photometer) bestimmt. Nachweis von Heparansulfat-Proteoglykanen auf der Oberfläche von Endothelzellen Die Endothelzellen (EC), welche die innere Schicht der Blutgefässe darstellen, sind im Zentrum unseres Forschungsinteresses. Im Normalzustand sind die Endothelzellen von einer Glykokalyx umgeben, die verschiedene Funktionen hat. Sie bildet eine Schutzschicht vor chemischen Einflüssen und beinhaltet unter anderem Signalstrukturen, Rezeptoren und Zellhaftstrukturen. Diese Glykokalyx besteht hauptsächlich aus Glykoproteinen und Glykolipiden. Der Hauptbestandteil ist ein Molekülkomplex namens Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG). Dieses ist auch ein wichtiger Bestandteil unserer Forschungsarbeit. Das HSPG dient dem Schutz der Endothelzellen, indem es, nebst anderen Funktionen, die Bindung von Komplement und die Adhäsion von Leukozyten verhindert. Dies hat zur Folge, dass im Normalzustand nicht überall an den Gefäßwänden Komplement und Leukozyten adhärieren und so eine Entzündungsreaktion auslösen. Bei einer Organtransplantation erfährt das zu transplantierende Gewebe immer eine gewisse Ischämie-Phase, welche je nach Situation mehr oder weniger lange dauert. Diese Ischämie bedeutet einen „Stress“ für die Endothelzellen, und es kommt zu deren Aktivierung. Man hat nun beobachtet, dass die Endothelzellaktivierung durch das Ablösen von HSPG charakterisiert ist. Die Ablösung von HSPG bei Ischämie führt dazu, dass bei der Reperfusion in den Geweben die Leukozyten und das Komplement mit den Endothelzellen direkt in Kontakt kommen und an sie binden. Dies wiederum führt zu einer Entzündungsreaktion. Die Substanz Dextransulfat (DXS) ist ein HSPG-Analog. Wie oben erklärt, führt ischämischer Stress zur Ablösung von HSPG. Unsere Hypothese ist nun, dass das HSPG-Analog DXS an die freien Stellen bindet und so die Funktion von HSPG übernimmt und die Endothelzellen schützt. Fig.1: Modell für DXS-vermittelten Schutz von EC: (A) Zellulärer Stress führt zu ECAktivierung und zu Ablösung von HSPG von der Zelloberfläche. (B) „Nackte“ EC werden zum bevorzugten Ziel von Mediatoren der angeborenen Immunität, wie Komplement und natürliche Killerzellen. (C) DXS kann als „Reparatur-Mantel“ dienen und die EC vor Schaden schützen. Wirkung von Heparansulfat aktivierter Endothelzellen auf antigenpräsentierende dendritischen Zellen und Hemmung dieser Aktivierung durch DXS Im normalen Körper ist die humorale Immunantwort des adaptiven Immunsystems unabdingbar um die Integrität des Individuums zu bewahren. Als 'fremd' erkannte Strukturen werden mit Antikörpern bekämpft. Im Falle einer Organtransplantation wird das transplantierte Organ als „fremd“ erkannt und die ausgelöste Antikörperbildung gegen die fremden Antigene trägt zur akuten Abstossungsreaktion bei. Diese Abstossung muss unterbunden werden damit das transplantierte Organ nicht bleibend geschädigt wird. Die Aktivierung von DC (Dendritische Zellen) ist ein Schlüsselschritt zur Auslösung der humoralen Immunantwort. Diese Aktivierung zu verhindern wäre ein weiterer Schritt in der Transplantationsmedizin. DC sind professionelle APCs (Antigen präsentierende Zellen). Sie phagozytieren dauernd Proteine und verarbeiten sie zu kleinen Peptidfragmenten. Die DC kann durch ihre TLR (Toll-like Rezeptoren) verschiedene Gefahrensignale erkennen. Diese sind zum Beispiel LPS (Lipopolysaccharide) von gramnegativen Bakterien, HS (freigesetztes Heparansulfat von geschädigtem Gefässendothel, z.B. der Blutgefässe des Spenderorgans), LTA (Lipoteichonsäure von grampositiven Bakterien), doppelsträngige RNA, bakterielle DNA, oder verschiedene Polysaccharide fremder Oberflächen. Bindet ein solches Gefahrensignal, wird die DC aktiviert: MHCII (Major Histocompatibility Complex) mit den verarbeiteten Peptidfragmenten besetzt und verschiedene Co-Stimulatoren (z.B. CD80, CD83, CD86) werden exprimiert. Die nun reife DC stoppt mit dem Phagozytieren und wandert in den nächsten Lymphknoten. Dort präsentiert sie den CD4+ T-Helferzellen auf dem MHCII das Antigenspektrum des alten Standortes. Erkennt die T-Helferzelle ein Antigen mit ihrem spezifischen TCR (T-Zell Rezeptor), wird auch sie aktiviert und unterstützt die dem Antigen entsprechenden B-Lymphozyten bei der Produktion von Antikörpern (humorale Immunantwort). Normalerweise ist das Antigen Bestandteil von etwas Bedrohlichem (Virus, Krebszelle, Fremdprotein, Bakterium...) und die Immunantwort gegen das Antigen hat eine Schutzfunktion. Im Falle einer Organtransplantation ist das Antigen Bestandteil von einem lebenswichtigen Organ. Die ausgelöste humorale und zelluläre Immunantwort führt zu einer Schädigung/Abstossung des transplantierten Organs, was durch Immunsuppression oder durch die Induktion immunologischer Toleranz unterbunden werden muss. DXS (Dextransulfat) ist ein bekannter Inhibitor der Blutgerinnung und des Komplementsystems, welche zur Transplantatabstossung beitragen. Hauptfrage in unserem Praktikum war nun, ob das DXS neben seinen bekannten Wirkungen auch die Aktivierung der DCs hemmt und so durch einen weiteren Weg der Transplantatabstossung unterbindet. Die Experimente im Wahlpraktikum gingen von 2 verschiedenen Fragen aus: 1. Experiment: Kann die Aktivierung der Dendritischen Zellen durch Dextransulfat gehemmt werden? 2. Experiment: Aktiviert humanes Serum Schweineendothel? Aktiviert der Überstand vom Schweineendothel humane DCs? Material und Methoden Material: Zentrifuge, Durchflusszytometer, humanes Blut, HBSS, Ficoll, IL4, GM-CSF, fluorochrommarkierte monoklonale Anti-CD80/83/86 Experiment 1 Methoden: (Details in der Praktikumsanleitung) 1. Herstellung eines Buffy Coat (=Lymphozytenkonzentrat) a. Suspendierung von humanem Vollblut mit HBSS (isoosmolare Lösung) und Ficoll (trennt durch seine mittlere Dichte Erythrozyten/Granulozyten von Lymphozyten/Monozyten) b. Zentrifugieren c. Isolieren peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten und Lymphozyten) aus dem Zentrifugat mittels Pipette. d. 3 x „waschen“ des Zellkonzentrates 2. Bestimmung der Anzahl und Vitalität der gewonnenen Monozyten/Lymphozyten mittels Neubauer Zählkammer 3. Separation der Monozyten (von den Lymphozyten) unter Ausnutzung deren spontanen Autoaggregation. 4. Stimulierung der Monozyten mit IL4 und GM-CSF Monozyten differenzieren sich zu unreifen DCs während 6 Tagen 5. Nach sechs Tagen Durchführung der eigentlichen Experimentes a. Inkubation der unreifen Zellen mit: - LPS (Kontrolle) - LPS und HS - LTA (Kontrolle) - LTA und HS b. Markierung von Reifemarkern (CD80/83/86) auf den DCs fluorochrommarkierten monoklonalen Antikörpern (Anti-CD80/83/86) 6. Messung der markierten CD80/83/86 mit dem Durchflusszytometer 7. Analyse der Daten mit der Software FlowJo Experiment 2 Methoden (Details in der Praktikumsanleitung) 1. Auftauen von PAEC (Pig aortic endothelial cells) 2. PAEC in Kultur nehmen 3. Aktivierung der PAEC mit humanem Serum mit 4. 5. 6. 7. Beurteilung der Endothelschädigung im Lichtmikroskop Absaugen vom Überstand der PAEC Stimulation von humanen DCs (aus Experiment 1) mit dem Überstand Markierung von Reifemarkern (CD80/83/86) auf den DCs fluorochrommarkierten monoklonalen Antikörpern (Anti-CD80/83/86) 8. Messung der markierten CD80/83/86 mit dem Durchflusszytometer 9. Analyse der Daten mit der Software FlowJo mit Resultate C5a-ELISA Vorab: Die maximale Standardabweichung während allen Versuchsreihen überschritt bei keiner Datenreihe den Wert 0.067 (7.9%), abgesehen von drei Ausnahmen mit einer maximalen Standardabweichung von 0.18 (12.8%). Im „Übungsversuch“ mit dem kommerziellen Set wurden die erwarteten Resultate erreicht. Im aktivierten Schweineserum war keinerlei Komplemt-System-Aktivierung nachweisbar, dies nicht zuletzt, weil die benutzten monoklonalen Antikörper gegen humanes C5a gerichtet sind. Welcher Coat? Platte B und C (mo-a-hu C5a11878 als Coat) zeigen keine auswertbaren Daten, selbst nach >90 Minuten Inkubationszeit. Die Farbreaktion ist kaum nachweisbar, eine Regressionskurve daher auch nicht ableitbar. Platte A zeigt farbliche Reaktionen. Leider liegt der Blank-Wert zu fast allen Zeitpunkten höher als die Mehrheit der anderen Reaktionen. 6.0000 0min 5.0000 5min 4.0000 20min 3.0000 40min 2.0000 60min 1.0000 90min d KO C Lo KO w aS er hig h u aS m C V er um F aS C V er um F C hu VF S Z hu AS S ZA h no S u rm S ZA al h no S rm u S er al um no h rm u S e al hu rum Se ru m BL AN K st st d st d A B 0.0000 0.3500 0.3271 0.2500 0.2478 0.3096 0.3074 0.3000 0.2494 0.2544 0min O.D. 5min 0.2000 0.1500 0.1000 20min 0.1123 0.1108 0.0913 0.0803 0.1158 0.1072 0.0959 0.0855 0.1191 0.1200 0.0976 0.0789 0.0500 0.0000 std A std B std C 40min 60min 90min 1.4000 1.1514 1.2000 0min 1.0000 O.D. 5min 0.8000 20min 0.6000 40min 60min 0.4000 0.2740 0.2000 0.0908 0.1023 0.1126 90min 0.1241 0.0000 Blank Optimaler Puffer PBS und Carbonat wurden hinsichtlich Eignung als Puffer für den Coat anhand der Werte der Standardansätze verglichen. Coat: 1µg/ml in PBS, mo anti hu C5/C5a ab 11876 der Firma abcam Detektion: 1:250 mo anti hu C5a/C5a des arg 11878 (abcam), 0.4µg/ml Standard for C5a PBS Carbonat 1.600 1.400 OD 405nm 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 500ng/ml 250ng/ml 125ng/ml 62.5ng/ml 31.25ng/ml 15.625ng/ml concentration Data 1 1.75 A 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0 100 200 300 C 400 500 600 Darüber hinaus wurde eine Standardkurve berechnet (R2=0.9986). Mittels Regression wird ein hyperbolischer Verlauf errechnet. Verdünnungsversuch Coat 1µg/ml in PBS, mo anti hu C5/C5a ab 11876 abcam Detektion 1:250 mo anti hu C5a/C5a des arg 11878 abcam, 0.4µg/ml Carbonatpuffer für Coat. Standard for C5a 100!l 50!l 2.000 1.800 1.600 OD 405nm 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 500ng/ml 250ng/ml 125ng/ml 62.5ng/ml 31.25ng/ml 15.625ng/ml concentration Data 1 Data 1 2.0 A 1.00 1.5 0.75 1.0 0.50 0.5 0.0 100 µl 2 R =0.9931 0 100 200 300 C 400 500 A 50 µl 2 R =0.998 88 0.25 600 0.00 0 100 200 300 C Erneut kann eine hyperbolische Kurve durch die Standartwerte gelegt werden. 400 500 600 Nachweis von Heparansulfat auf Endothelzellen Naiv HEP II + DXS HEP II HEP II + DXS x400 Auf den Immunofluoreszenzbildern wurde HSPG markiert. Auf dem naiven Bild sieht man das HSPG. Die Membran ist deutlich dicker, als auf den anderen Bildern. Auf dem Bild unten links, bei welchem das Gefäss mit Heparinase II behandelt wurde, sieht man, dass die Gefässwand dünner erscheint, was auf eine Ablösung des HSPG hinweist. Auf dem Bild rechts unten wurde das Gefäss noch mit DXS behandelt. In diesem Fall sieht man allerdings nicht die erhoffte Bindung von DXS an die Oberfläche. Die Gefässwand ist, im Vergleich zu dem nur mit Heparinase II behandelten Präparat, nicht dicker. Naiv e HEP II HEP II Naiv HEP II + DXS HEP II + DXS CD31 wurde markiert. Auf dem Bild oben links sieht man die Gefässwand. Auf den zwei unteren Bildern ist keine Markierung sichtbar. Naiv e HEP II HEP II Naiv HEP II + DXS HEP II + DXS x400 Von Willebrand Faktor wurde markiert. Auf dem Bild oben links ist ein intaktes Endothel zu sehen. Auf dem Bild links unten ist das Endothel geschädigt. Auf dem Bild links unten ist kaum eine Markierung erkennbar, auf dem Bild rechts unten sieht man das Endothel besser, was auf einen Schutz der Integrität des Endothels durch DXS hinweist. Wirkung von Heparansulfat auf dendritische Zellen Nun folgen die Resultate der vorgestellten Experimente. Zuerst wird die Aktivierung der Schweineendothelzellen dargestellt, dann deren Aktivierungspotential auf dendritische Zellen und zum Schluss die Dextransulfat-induzierte Hemmung der Aktivierung von Dendritischen Zellen durch Lipopolysaccharid und Lipoteichonsäure. Aktivierung von Pig aortic endothelial Cells (PAEC; Endothelzellen aus der Aorta eines Schweines) durch Humanserum. activated control Im Mikroskop sieht man die Aktivierung der PAECs deutlich. Im Vergleich zur Kontrolle, wo die Endothelzellen durch Tight Junctions als Pflastersteinartig verbundener Zellverbund zu sehen sind, scheinen sich im linken Bild, viele Endothelzellen durch die Aktivierung vom Zellverband gelöst zu haben. Aktivierung von Dendritischen Zellen durch den Zellkulturüberstand aktivierter Pig aortic endothelial Cells (PAEC; Endothelzellen aus der Aorta eines Schweines) und durch LPS (Lipopolysaccharid) Isotyp Control Ohne Stimulus LPS PAEC 2h PAEC 4h PAEC 6h 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Diese beiden Grafiken zeigen, dass bei den dendritischen Zellen in Anwesenheit sowohl von PAEC-Überstand als auch von LPS aktiviert werden. Man sieht, dass die dendritischen Zellen deutlich mehr CD86 exprimieren, welches ein guter Marker für die Aktivierung darstellt. Bei der rechten Grafik sieht man eine Rechtsverschiebung der Kurven, wie sie in der Durchflusszytometrie gemessen wurden. Links sieht man die gleiche Darstellung in relativen Einheiten einander gegenübergestellt. PAEC ist indes nicht ein so starker Aktivator, wie das LPS. Hemmung der Reifung von dendritischen Zellen durch Dextransulfat (DXS) in verschiedenen Konzentrationen Isotyp Control Ohne Stimulus LPS &DXS 0.2 mg/ml &DXS 1 mg/ml &DXS 5 mg/ml 100 101 102 103 104 Die beiden Grafiken zeigen einerseits auf, dass LPS als potenter Aktivator von dendritischen Zellen wirkt, wie dies in den ersten beiden Grafiken gezeigt wurde, andererseits sieht man, das Dextransulfat diese starke Aktivierung zu hemmen vermag. Je höher die Aktivierung ist, umso stärker ist diese Hemmung. Mit einer Dextransulfatkonzentration von 5 mg/ml ist die Aufregulierung von CD86 auf dendritischen Zellen auf etwa einen Drittel gedrosselt worden. Das gleiche Resultat ist auch gegeben, wenn man als Aktivator Lipoteichonsäure (LTA) verwendet: Isotype Control Ohne Stimulus LTA &DXS 0.2 mg/ml &DXS 1 mg/ml 100 101 102 103 104 Mittels 5 mg/ml Dextransulfat wurde die durch LTA induzierte Aufregulierung von CD86 um 2/3 gehemmt. Diskussion Es folgt eine kurze Abhandlung unserer Experimente und darüber was wir daraus schliessen können. Als Ziel unserer Experimente wollten wir herausfinden, ob Dextransulfat nebst seiner Wirkung als endothelprotektive, gerinnungs- und komplementinhibitorische Substanz eine Aktivierung der dendritischen Zellen vermindern oder hemmen kann. Eine Hemmung der dendritischen Zellen wäre insofern wünschenswert, als dass man eine Immunabwehr bei einer Organtransplantation vermindern könnte. Wie wir in unseren Testreihen nachweisen konnten, konnten wir unter Einsatz von Dextransulfat eine deutliche Hemmung der aktivierten dendritischen Zellen erreichen. Es besteht also die Möglichkeit durch die Anwendung von Dextransulfat eine verminderte Induktion der Transplantatabstossung zu erreichen, zusätzlich zur Immunsuppression oder zur Unterstützung immunologischer Toleranz. Wie in unserer Einleitung schon gesagt worden ist, liegt der Schwerpunkt dieser Forschungsarbeit auf der Schädigung des Endothels nach einer Ischämie. Bei einer Ischämie löst sich das HSPG, welches eine Schutzschicht für die Endothelzellen darstellt, von den Endothelzellen ab, was die Endothelaktivierung fördert. Diese Schädigung kann dann mit der Beobachtung des Ablösens des HSPG vom Endothel abgeschätzt werden. Wir haben dieses Ablösen in unserem Experiment gezeigt indem wir die Ischämie mit Heparinase simuliert haben. Die Schädigung konnte dann mit Hilfe von Markern von gesunden Endothel, CD31 und vWF (Kontrolle verglichen mit Heparinase-behandelten Endothel), beobachtet werden. Die Resultate haben gezeigt, dass eine Schädigung des Endothels durch Heparinase erfolgreich war. Die zweite Hypothese unserer Arbeit war, dass das HSPG-Analog, Dextransulfat (DXS), an das geschädigte Endothel binden kann. Um dies zu zeigen, haben wir das Heparinase-geschädigte Endothel mit DXS behandelt. Um die Resultate zu beobachten, hat man die DXS-Bindung mit Immunfluoreszenz visualisiert. Daraus lässt sich schliessen, dass eine Bindung von DXS nicht festgestellt werden konnte. Dieses Resultat könnte Folge vielerlei Ursachen sein (Manipulationsfehler, Problem mit Antikörper (Marker), Zellschaden zu gross nach Heparinase-Behandlung, Heparinase-Qualität). Wir könnten versuchen diese Verfälschungen zu verhindern z.B. durch Wiederholen des Experimentes, mit einem neuen Enzym, mit DXS FITC oder mit anderen Manipulationsmethoden. Wenn dann gezeigt werden kann, dass das DXS effektiv an das geschädigte Endothel binden kann, könnte dies von grossem Interesse für die Transplantationsmedizin sein. Eines der grössten Probleme bei Transplantationen ist die Schädigung des Organs durch den ischämischen Zustand. Wenn das DXS Sulfat an diesem geschädigten Endothel wirklich binden und dadurch die Rolle des natürlichen HSPG übernehmen könnte, wäre dies ein grosser Fortschritt bei der Behandlung von Abstossungsreaktionen nach Transplantationen. Die Komplementaktivierung spielt eine wesentliche Rolle bei der Abstossung eines Transplantats. Deshalb bildet die Bestimmung der Serumkonzentration aktivierter Komplementkomponenten, namentlich von C5a, einen wichtigen Marker für das Ansprechen einer Therapie. C5a gehört zusammen mit C3a zu den sogenannten Anaphylatoxinen und wird durch die Spaltung der Komplementkomponente C5 durch die C5-Konvertase gebildet. C5a wirkt u.a. auf Gefässe dilatierend und permeabilitätssteigernd sowie chemotaktisch auf Entzündungszellen wie Neutrophile Granulozyten. Mit Hilfe des C5a-Elisa-Tests kann die Serumkonzentration dieser Komponente relativ leicht bestimmt werden und dadurch lassen sich Aussagen über das Ausmass und die Dynamik einer laufenden Komplementaktivierung machen. Zur Auswertung unseres C5a-Elisa-Tests: Als optimalen Puffer haben wir Carbonat gewählt, da Carbonat im Vergleich zu PBS höhere Extinktionen bei gleicher C5aKonzentration ergeben hat, was feinere Messungen zulässt von Werten, die knapp beieinander liegen, zulässt. Der von Katja durchgeführte Elisa zeigt eine schöne logarithmische Regressionskurve mit hohem Korrelationskoeffizienten (vgl. Verdünnungsversuch "Resultate"). Um mit dieser Standardkurve arbeiten zu können, muss das Serum genügend stark verdünnt sein, um im Bereich der linearen Steigung zu Beginn der Kurve Extinktionen zu erhalten. Ansonsten kriegt man für höhere Extinktionswerte falsch niedrige Endkonzentrationen. Um einen funktionierenden Test etablieren zu können, muss man verlässliche Standards generieren. Zu diesem Zweck wird die C5a-Konzentration des aktivierten Serums genügend oft gemessen, um dann mit der Normalverteilung einen Mittelwert +/- 2 Standardabweichungen zu erhalten. Die Vorteile eines eigenen Tests sind, auch Jahre später auf denselben Test zurückgreifen zu können um vergleichbare Resultate zu erhalten und somit Unabhängigkeit gegenüber einem kommerziellen Test, sowie eine positive KostenNutzen-Bilanz. Die beiden ersten Experimente nahmen Bezug auf eine Verminderung der Abstossungsreaktion; die Methode die im dritten Experiment ausgearbeitet wurde, dient dem Abschätzen des Ausmasses und der Dynamik einer mit der Abstossungsreaktion gekoppelten Komplementaktivierung. In der Zukunft bleibt zu hoffen, dass diese Techniken in der Praxis anwendbar werden und so ein Fortschritt in Transplantationsmedizin erreicht werden könnte. Die Lebensqualität heute obligat immunsupprimierter Patienten könnte wesentlich verbessert werden.
