Besenfelder Urban
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Besenfelder Urban Institut für Tierzucht und Genetik, der Veterinärmedizinischen Universität Wien, Veterinärplatz 1, A-1210 Wien IFA-Tulln VU-Wien Reproduktionstechniken beim Rind Künstliche Besamung Superovulation In vitro Produktion Semen Sorting Embryo Sexing Klonierung Embryo Splitting Transgentechnologie Reproduktionstechniken beim Rind Prä-Implantationsbereich Implantationsbereich Eizelle+Samenzelle=Embryo 1 Zelle 10 Zellen Stunden/Tage Diagnostik + Selektion 100 Zellen >1,000,000,000,000 Zellen 9 Monate …. Diagnostik Erste Generation: Künstliche Besamung > 110 Mio. pro Jahr (seit 1945) Zweite Generation: Embryotransfer ½ Mio. pro Jahr (seit 1975) Dritte Generation: Embryo sexing/IVP/Klonierung ~ X 103/Jahr 1990 1992 Vierte Generation: Transgenesis Ab 2000 N= ? 1995 Samengewinnung/Künstliche Besamung/Befruchtung beim Rind Öffentlichkeit: „Gegen künstliche Besamung – Tabu-Thema“ „KB führt zu abnormalen Kälbern“ „Handel mit Bullen war gefährdet…“ Test von Bullen Merkmalserhebung Selektion Fortschritt 110.000.000 Besamungen >600 Besamungsstationen >40.000 Bullen Veterinärhygienische Kontrolle Betriebsmanagement >60 Jahre im Einsatz Kombination mit „neueren Biotechniken“ Künstliche Besamung Kryokonservierung Superovulation In vitro-Fertilisation ICSI Semen Sorting Samengewinnung/Künstliche Besamung/Befruchtung beim Rind Weibl. Tiere tion duk Betrieb Pr o Samen Leistungssteigerung Betriebsanpassung Reproduktion Konzeption Remontierung Nutzungsdauer Gewinnung und Transfer von Embryonen Berücksichtigung der männlichen und weiblichen Gameten Superovulation: Gewinnung von Embryonen eines Tieres über hormonelle Induktion Embryotransfer: Embryoübertragung auf Empfänger, deren Ovarzyklus dem Alter des Embryonalstadiums entspricht Embryo: die früheste Form der genetischen Vollständigkeit Overall Activity of In Vivo-Derived Bovine Embryos in 2004 (*) Those European data are derived from the statistics of AETE, 2005. (**) One country did not split the figures between fresh and frozen (Total 5,000). By convention, they were all included in the frozen column so as to take them into account in the gross total. (***) Due to lack of responses from many ET teams from this continent, this line is highly underestimated. Michèle Thibier, 2005 Embryogewinnung I: ÆSuperovulation Follikelstimulierendes Hormon - FSH aus Hypophysen von Schwein und Schaf kurze Halbwertszeit, 8 Injektionen [12 h] Pregnant mares serum gonadotropin von der Stute (PMSG, eCG) lange Halbwertszeit, einmalige Injektion exogenes FSH endogenes FSH Zyklus Embryogewinnung II: Follikelstimulation Ovulation Eileitereintritt Fertilisation Wanderung („Migrationsphase“) Übertritt in die Gebärmutter Spülung ~ Tag 7, Morula- oder Blastozystenstadium 5 – 8 (12) Embryonen guter Qualität Aber: nur 1/3 aller Spender mit guter Reaktion rs e Vo n tio l ek Æ mit wenige Embryonen Æ nur Eizellen Æ nur sprungreife Follikel Æ keine Reaktion am Eierstock z.T. unerwünschte Auswirkung auf das Exterieur 2/3 Embryotransfer: ÆEmpfängersynchronisation 1) Spontanbrunst, Nutzung des aktuellen Zyklus 2) Abbruch des Zyklus im Di-Östrus Æ „Neustart“ 3) Verlängerung des Zyklus im Di-Östrus Æ „Neustart“ Transfer eines Embryos Æ Gebärmutterhornseite mit Gelbkörper Tolerierte Asynchronität zwischen Empfänger und Embryo: ±36 h Trächtigkeitsraten: zwischen 50 und 70 % chirurgisch ≥ unblutig (selten) (Routine) Konstante Ergebnisse in den letzten > 20 Jahre In vitro-Produktion von Rinderembryonen IVF IVM IVK In vitro-Produktion - IVP Voraussetzung: Follikeldynamik am Ovar Eizellgewinnung: Kalb geschlechtsreife Tiere, zuchtreife Tiere, Tiere, für die Trächtigkeit unzumutbar wäre während der Gravidität Problemtiere post mortem Eizellgewinnung beim Rind Einmalige Punktion Mehrmalige Punktion -1x/Woche -2x/Woche Ohne/mit hormoneller Stimulation Endoskopie Ultraschall ET OPU Lagerung d-1 d0 IVM d1 IVF d7 IVK In vitro-Produktion von Rinderembryonen Ex vivo-Gewinnung 5 bis 15 Eizellen (60%) Æ 90 % Maturation Æ 80-90% Fertilisation 20 bis 30 % Blastozystenrate Æ 40 bis 50 % Trächtigkeitsrate CAVE: Tiefgefrierkonservierung, Aborte, Geburt Verwendung von Standardverfahren, aber… In vitro-Gewinnung Punktion „Dissection“ (Follikel an der Eierstocksoberfläche) “Slicing” (gesamter Eierstock) Follikelpräparation Effizienz: Eizellen (Eierstöcke nach Schlachtung) >> Eizellen (ex vivo) Endoskopie > Ultraschall Fleischrassen >> Milchrassen >> Kälber Anzahl in vitro-produzierter, transferierter Rinderembryonen 2004 Michèle Thibier, 2005 In vivo Unterschied: In vitro in vivo –gewonnene vs. in vitro-produzierte Embryonen Perivitelliner Raum Kompaktierung Dichte (>1.3 vs. 1.14 g/ml) Zellzahl Innere Zellmasse (ICM) Größe Mixoploidie, Methylierung, Genomaktivität.. Entwicklungsraten Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Temperaturen Implantation Trächtigkeit Geburt Vitalität Problem: Problem: Quantität Qualität In vivo In vitro 1992 –2001 Rassen: Spender: tiefgefroren: Ex vivo In vivo-Kultur von Rinderembryonen im Schafeileiter 5 5240 17519 9,1 Oozyten/Donor 69,4 % Teilungsrate 24,7 % transferierte Embryonen 79,9 % tauglich zur Kryokonserv. Galli et al., 2003 Eileiter Gebärmutter Ovulation D7 Embryogewinnung In vivo-Kultur im Rindereileiter Entwicklungsprofil Expressionsprofil Elektronenmikroskopie Raster-Elektronenmikroskopie Tiefgefrierkonservierung Embryotransfer -methodische Entwicklung -Zucht im Innland und Ausland Geschlechtsbestimmung Gene: ZFX7ZFY, Amelogenin Mikrosatelliten DNA-Menge (Y<X) Größe (Y<X, 34.5 µm2) Motilität Immunseparation Gelelektrophorese Embryo sexing Semen Sorting Unterschied im DNA-Gehalt: Mensch 2,8 % Kaninchen 3,0 % Maus 3,2 % Schwein 3,6 % Pferd 3,7 % Rind 3,8 % Hund 3,9 % Schaf 4,2 % Chinchilla 7,5 % XY XX Y X Geschlechtsbestimmung I: Aspiration Mikrosektion Blastomerenentnahme: Genauigkeit: 1-4% ohne Ergebnis >99% Aber: Embryomanipulation ½ aller Embryonen verwertbar Æ große Nachfrage! Geschlechtsbestimmung II: Durchflußzytometrie Semen Sorting 20 Mio gesortete Spermien/h 2 – 2.5 Mio/straw -DNA-Färbung -Kryokonservierung (Johnson and Welch, 2000)) Samenprobe 90 kt e t e °D -Motilität -Lebenszeit -DNA Fragmente… or Computersignal Argon-Laser Trenngenauigkeit: Verwendung ab > 90 % 0° Detektor - -+ + - + + + - - Y + ermi en XSp X Spannung + - „Abfall“ 1 mm Y-Sp erm ien - - 90 km/h - - ++ Männl-Kälber: 88 % Weibl. Kälber: 92 % „Verpackung“ Oberflächenbeladung Laser Klonierung Was sind Klone? Eine Gruppe von zwei oder mehreren genetisch identischen Individuen, die ungeschlechtlich aus einem Mutterorganismus entstanden sind. Prinzipien der Klonierung „Embryo Splitting“ Polkörperchen Metaphasenplatte Eizelle Morula Enukleation ICM Fötus Kerntransfer Embryotransfer Aktivierung Tier Sind KLONE wirklich genetisch identisch? 1. Ursprung –“Kopie“ 2. Entwicklung Der Genotyp entsteht durch Zusammenwirken von Kern-DNA und mitochondrialer (mt) DNA. Bei der Embryonen- und Individuen-Klonierung werden i.d.R. verschiedene Oozyten als Nukleus-Empfänger verwendet. Unterschiedliche mt-DNA Genotypen - Mutation - Translokation - Rearrangement - Diminution - Gene-Amplifikation -„Alterung“-Prozess der Chromosomen/DNA wie z.B. Telomerenverkürzung Sind KLONE phänotypisch identisch? Phänotyp = Genotyp + Umwelt Klone haben: Embryonalphase •eine unterschiedliche zytoplasmatische Umgebung Fötalphase •eine unterschiedliche uterine Umgebung Adultphase •eine unterschiedliche postnatale Entwicklung Probleme: Transfer von „rekonstruierten“ Embryonen Embryonaler Tod Pränatal: Fötaler Tod •niedrige Trächtigkeitsrate Tod des Kalbes •fetaler Tod (70% während des ersten Anomalien des Kalbes Trächtigkeitstrimesters) •fetale Anomalien, Eihautwassersucht Postnatal: •erhöhtes Geburtsgewicht •neonataler Tod •phänotypische Anomalien (Nierenversagen, vask. Anomalien inkl. Cardiomyopathien, Leberfibrose, Osteopetrose, Immundefizit,... ) Darstellung von Trächtigkeitsprofilen in Abhängigkeit der transferierten Embryonen (IVP und Klonierung) J. L. Edwards1 et al, (2003), AJRI, 50,113–123. Y. HEYMAN (2005), Reprod Nutr Dev. 45,353–361. Verhältnis von lebenden Nachkommen zu Transferierte Embryonen [%] Effizienz der Klonierung Rind Schaf Ziege Schwein Maus Kaninchen Katze Techniken zur Erzeugung von transgenen Tieren ¾ Vorkerninjektion (≤1 % tg Nachkommen) ¾ Erzeugung von Chimären (ES-Zellen, PGCs) ¾ Virale Vektoren ¾ Spermien – vermittelter Gentransfer ¾ Kerntransfer (100 % tg Nachkommen) Anwendung der Klonierung bei landwirtschaftlichen Nutztieren ¾ Medizinische Modelle ¾ Bereitstellung von Organe/Geweben ¾ Krankheitsresistenz ¾ Verbesserung von wirtschaftlichen Faktoren ¾ Erzeugung von Pharmazeutika (“gene pharming”) oder anderen Proteinen Zeit... Kostenaufwand • Zellkultur aus Zellen von Säugetieren (Myeloma-Zell-Fermenter) • Bakterien • Hefen, Insekten und andere Eukaryonten • Transgene Pflanzen • Transgene (geklonte) Tiere (Kaninchen, Ziegen, Schafe, Hühner, Rinder) Syntheseleistung Produktion von Antikörpern Reproduktionstechniken beim Rind 1) ...Potentielle Anwendung in der Zucht Sehr komplex Æ Zusammenwirken verschiedener Faktoren bedeutend für das zukünftige Betriebsmanagement 2) ...Vereinzelte Anwendung Aufwand relativ hoch 3) ...Wissenschaftliches Interesse: Steigt mit der genetischen Entschlüsselung ... Funktionelle Genomanalyse „Studium der Entwicklungsbiologie“
