Untersuchungen über den Einfluss der akuten
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Maren Martin Hamburg Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Veronika Maria Stein Klinik für Kleintiere 1. Gutachterin: PD Dr. med. vet. Veronika Maria Stein 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Andreas Beineke Tag der mündlichen Prüfung: 11.11.2013 Diese Arbeit wurde finanziell durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (FOR 1103/TI 309/4-1) unterstützt. . Für meine Familie Die Kunst ist, einmal mehr aufzustehen, als man umgeworfen wird. Winston Churchill Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: Vortrag: 1. M. Martin, R. Carlson, A. Tipold, W. Baumgärtner und V. M. Stein "Akute Staupevirusinfektion reduziert die ROS-Produktion in ex-vivo kultivierten kaninen Monozyten" 21. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und klinische Labordiagnostik" der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) 01.-02.02.2013 in München 2. M. Martin, R. Carlson, A. Tipold, W. Baumgärtner und V. M. Stein "Acute distemper virus infection reduces ROS generation of ex vivo cultivated canine monocytes" American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) Forum 2013 12.-15. Juni 2013 in Seattle, USA Posterpräsentation: 1. M. Martin, R. Carlson, A. Tipold, W. Baumgärtner und V. M. Stein "Does monocyte recruitment to the CNS during acute canine distemper virus infection influence the pathogenesis of the disease?" 26th Symposium of the Europeam Society of Veterinary Neurology (ESVN) und des European College of Veterinary Neurology (ECVN) 26.-28.09.2013 in Paris, Frankreich Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................8 1 Einleitung ............................................................................................................ 11 2 Literaturübersicht ...............................................................................................13 2.1 Staupevirusinfektion des Hundes ..................................................................13 2.1.1 Terminologie und Ätiologie ...................................................................13 2.1.2 Klinisches Bild der kaninen Staupevirusinfektion .................................13 2.1.3 Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion ...................................15 2.1.4 Die Rolle des Immunsystems bei der kaninen Staupevirusinfektion ....16 2.1.5 Entstehung von Läsionen im ZNS bei der kaninen Staupevirusinfektion .............................................................................................................17 2.1.6 Staupevirusstämme .............................................................................19 2.2 Mikroglia - die Makrophagen des ZNS ..........................................................20 3 Material und Methoden.......................................................................................22 3.1 Material..........................................................................................................22 3.1.1 Labor-Equipment .................................................................................22 3.1.2 Reagenzien und Lösungen ..................................................................29 3.1.3 Computer Software ..............................................................................38 3.1.4 Virus ....................................................................................................39 3.1.5 Tiere.....................................................................................................39 3.2 Methoden ......................................................................................................41 3.2.1 Methodik zur Kultivierung kaniner Mikroglia ........................................41 3.2.2 Methodik zur Charakterisierung kaniner Monozyten ............................47 3.2.3 Statistik über die Charakterisierung kaniner Monozyten ......................50 4 Ergebnisse ..........................................................................................................51 4.1 Ergebnisse der Mikroglia-Isolation ................................................................51 4.2 REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION IS SUPPRESSED IN CANINE DISTEMPER VIRUS INFECTED MONOCYTES USING A VIRULENT STRAIN.......................................................................................62 5 Übergreifende Diskussion .................................................................................82 6 Zusammenfassung .............................................................................................87 7 Summary .............................................................................................................90 8 Literaturverzeichnis ...........................................................................................92 9 Anhänge ............................................................................................................ 110 10 Danksagung ......................................................................................................125 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung Ag Antigen Ak Antikörper Aqua bidest. Aqua bidestilata Art.-Nr. Artikelnummer BSA Bovines Serum Albumin °C Grad Celsius CD14/TLR4 Cluster of differentiation 14/Toll-like receptor 4 CD Cluster of differentiation CDV Canine Distemper Virus Ch.-B. Chargenbezeichnung cm Zentimeter CNS central nervous system CO2 Kohlenstoffdioxid ctr control DG Dichtegradientenzentrifugation DHR Dihydrorhodamin 123 DMSO Dimethylsulfoxid DNAse Desoxyribonuclease EDTA Ethylendiamintetraacetat FACS Fluorescence-activated cell sorter FC Fragment cristalline FITC Fluorescein-Isothiocyanat FKS Fetales Kälberserum FL Fluoreszenzkanal F-Protein Fusionsprotein FSC Forward scatter g Gramm g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec2) gamPE R-Phycoerythrin-konjugiertes Ziege-anti-Maus h Stunde Abkürzungsverzeichnis HBSS Hanks´ gepufferte Salzlösung H-Protein Hämagglutininprotein HuIgG Humanes Normal-Immunglobulin G IFNα/β Interferon I IgG Immunglobulin G KGW Körpergewicht Ktr Negativkontrolle l Liter L-Protein Largeprotein M Molar MACS Magnetic-activated cell sorter m-csf Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor mfi mean fluorescence intensity MHC I/II Haupthistokompatibilitäts-Komplex Klasse I/II MIF Membran-Immunfluoreszenz min Minuten ml Milliliter mm Millimeter MM-prf Microglia Medium phenolrotfrei MOI Multipilicity of infection M-Protein Maxtrixprotein n.m. nicht messbar NP Nukleoprotein N-Protein Nukleokapsidprotein mv mean value mw Mittelwert OND Staupevirusstamm Onderstepoort p.i. post infection PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung pH Potentia Hydrogenii PMA Phorbol-Myristat Acetat ROS Reaktive Sauerstoffspezies Abkürzungsverzeichnis P-Protein Phosphorprotein R252 Staupevirusstamm R252 SLAM signaling lymphocyte activation molecule SSC side scatter Std. Stunde Tab. Tabelle TNF Tumornekrosefaktor x Multiplikationszeichen ZNS Zentrales Nervensystem µl Mikroliter Einleitung 1 Einleitung Die Staupevirusinfektion des Hundes wird durch das Canine Distemper Virus (CDV) ausgelöst und infiziert immer noch Karnivoren weltweit (DEEM et al., 2000; PRINGLE, 1999). Zu Beginn der Infektion kommt es zu einer Virusvermehrung in den Zellen des Immunsystems, was zu Apoptose und massiver Immunsuppression führt (KUMAGAI et al., 2004; MCCULLOUGH et al., 1974; SCHOBESBERGER et al., 2005). Daraufhin gelangt das Virus über die Blutbahn zu Magendarmtrakt, Urogenitaltrakt und Atmungsapparat (APPEL, 1969; OKITA et al., 1997) und im weiteren Verlauf auch in das Zentrale Nervensystem (ZNS; KRAKOWKA, 1989; KRAKOWKA et al., 1987). Dort führt die Staupevirusinfektion zu einer Aktivierung der Mikrogliazellen welche daraufhin ihre funktionellen Eigenschaften und ihren Immunphänotyp ändern, sie produzieren reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), phagozytieren und fungieren als Antigen präsentierende Zellen (STEIN et al., 2004b). Die Produktion von ROS ist ein Mechanismus des Immunsystems infizierte Zellen zu Schädigen und auf den weiteren Zellabbau vorzubereiten. Jedoch kann ROS in einer Umgebung wie dem ZNS, welches sehr anfällig für oxidativen Stress ist, dazu führen, dass sekundär eine Demyelinisierung ausgelöst werden kann (GILGUN-SHERKI et al., 2004, GRIOT et al., 1990, STEIN et al., 2004b). Außerdem führt die Staupevirusinfektion zu einer Migration von Monozyten aus dem peripheren Blut in das ZNS, wo sie als Makrophagen die dort ansässigen Mikroglia bei ihrer Immunantwort unterstützen (GRIOT-WENK et al., 1991a, b; WISNIEWSKI et al., 1972). Nach der Einwanderung in das ZNS ist eine Differentierung zwischen Mikroglia und Makrophagen schwierig, somit ist das Ausmaß der ROS-Bildung des jeweiligen Zelltyps nicht zu unterscheiden und folgedessen auch ihre Bedeutung in der Entstehung der Demyelinisierung oder der Viruspersistenz bei der akuten Staupevirusinfektion. Generell führen virale Infektionen bei Monozyten zu einer Aufregulation des Oberflächenmarkers CD14 und somit zur Aktivierung des CD14/TLR4-Signalwegs, was wiederum zu einer Produktion proinflamatorischer Zytokine führt und zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems (ROLLAND et al., 2006). Eine Studie von Stein et al. (2008) hat gezeigt, dass eine CDV-Infektion von Monozyten in vivo zu einer Aufregulierung des Oberflächenmarkers CD14 führt, welche in ihrer Intensität mit der Schwere der neurologischen Ausfälle und dem 11 Einleitung Ausmass der histopathologisch nachgewiesenen Demyelinisierung im ZNS korrelierte. Eine Differentierung der Mikroglia und der Makrophagen ist im ZNS schwer, jedoch ist eine Charakterisierung beider Zelltypen unabhängig von einander nötig um ihren Einfluss auf die Pathogenese der akuten Staupevirusinfektion zu evaluieren. Demnach lag das Ziel der vorliegenden Arbeit zum einen in der Etablierung einer Mikroglia Reinkultur mit anschließender Charakterisierung nach CDV-Infektion und zum anderen in der Charakterisierung ex vivo CDV-infizierter kaniner Monozyten. 12 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Staupevirusinfektion des Hundes 2.1.1 Terminologie und Ätiologie Bei der Staupevirusinfektion des Hundes handelt es sich um eine Infektion mit dem Caninen Distemper Virus aus der Ordnung Mononegavirales, welche zur Familie der Paramyxoviridae und somit zur Gattung Morbillivirus gehören. Zu dieser Gattung zählen auch das Rinderpestvirus, das Morbillivirus der Delphine, sowie das Masernvirus der Menschen (PRINGLE 1999). Das Virion des CDV ist behüllt und enthält ein nicht-segmentiertes einzelsträngiges RNS-Genom negativer Ausrichtung (PRINGLE 1999). Es enthält sechs Strukturproteine: das Nukleokapsid- (N-), Matrix- (M-), Fusions- (F-), Hämagglutinin- (H-), Phosphor- (P-) und das Largeprotein (L-) und zwei Nicht-Strukturproteine (V- und C- Protein) (ORVELL 1980; DIALLO 1990). Die Virulenz verschiedener Stämme und Isolate ist sehr variabel, sie sind jedoch antigenetisch einheitlich (SUMMERS et al. 1984; PRINGLE 1999). Weltweit kann ein breites Wirtsspektrum an Karnivoren mit dem CDV infiziert werden; Mitglieder der Familien der Canidae (Hunde, Füchse und Wölfe), Felidae (Löwen, Tiger), Procyonidae (Waschbär) oder Mustelidae (Frettchen, Nerz und Mader) können genau so infiziert werden, wie Pinnipedia (Robben und Seelöwen) (APPEL et al. 1994; ROELKE-PARKER et al. 1996; DEEM et al. 2000; KENNEDY et al. 2000). 2.1.2 Klinisches Bild der kaninen Staupevirusinfektion Abhängig von dem Virusstamm und der Immunantwort des infizierten Tieres können die Ausprägung der klinischen Symptome und der Verlauf der Erkrankung sehr unterschiedlich sein. So ist ein milder Krankheitsverlauf mit geringgradiger Ausprägung der Symptome genauso möglich, wie ein perakuter Krankheitsverlauf, der mit dem Tod des infizierten Tieres enden kann (MCCULLOUGH et al. 1974b; KRAKOWKA et al. 1975; APPEL et al. 1982; SUMMERS et al. 1984; PARDO et al. 1997; KUMAGAI et al. 2004; CARVALHO et al. 2012). 13 Literaturübersicht Es wird zwischen einer katarrhalischen (respiratorisch und/oder gastrointestinal) und einer neurologischen Form differenziert. Beide Formen können allein, aber auch in Kombination auftreten. Die CDV-Infektion kann akut oder chronisch verlaufen (FRISK et al. 1999; WUNSCHMANN et al. 2000; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005; BEINEKE et al. 2009; CARVALHO et al. 2012). Unabhängig von der Form der Erkrankung tritt eine massive Immunsuppression mit hochgradiger Leukopenie auf (MCCULLOUGH et al. 1974b; KUMAGAI et al. 2004; SCHOBESBERGER et al. 2005). Erkrankte Hunde zeigen zuerst unspezifische Symptome auf, wie Lethargie, Anorexie und Apathie gefolgt von einer biphasischen Fieberkurve und Entzündungen der Konjunktiven, Hautproblemen, respiratorischen Symptomen wie Nasenausfluss und Husten, aber auch gastrointestinalen Symptomen, wie Durchfall und Erbrechen (WRIGHT et al. 1974; MARTELLA et al. 2008). Die neurologische Form kann durch eine Vielzahl von neurologischen Symptomen geprägt sein, wie Myoklonus, Ataxie, Tremor, Krampfanfällen, sowie Paresen und Plegien der Gliedmaßen (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005; AMUDE et al. 2007). Zudem gibt es seltener vorkommende Erscheinungsformen wie die „old dog encephalitis“, das Staupegebiss der jungen Hunde und die „hard pad disease“ (ORMROD 1949; ANDERSON 1950; LOPEZ-PACHECO 1956; APPEL 1970; DUBIELZIG et al. 1981; RIMA et al. 1987; AXTHELM u. KRAKOWKA 1998; GRONE et al. 2003; KOUTINAS et al. 2004; HEADLEY et al. 2009). Die "old dog encephalitis" betrifft meist Hunde mit einem Alter von über sechs Jahren, bei denen es nach einer akuten CDV-Infektion zu einer Viruspersistenz im ZNS kommt, die nach einiger Zeit der Remission wieder aufflammen kann. Daraus resultiert eine seltene chronische Form der Polioenzephalitis, bei der klassischerweise Neurone und Astrozyten, vor allem im Kortex und im Hirnstamm, betroffen sind (NESSELER et al. 1999). Als Ort der Viruspersistenz wird die graue Substanz angesehen (NESSELER et al. 1999). Bei jungen Hunden, die sich zum Zeitpunkt der CDV-Infektion im Zahnwechsel befinden, befällt das Virus die Ameloblasten. Infolge dessen kommt es zu einer dauerhaften Schädigung des Dentin (DUBIELZIG et al. 1981), wodurch es zur Entstehung des so genannten "Staupegebisses" kommt. 14 Literaturübersicht Zu einer Hyperkeratose der Pfotenballen, der „hard pad disease“, kommt es durch eine CDV-Infektion der Keratinozyten der Epidermisschicht. Die „hard pad disease“ stellt eine weitere Form der Viruspersistenz dar (GRONE et al. 2004; KOUTINAS et al. 2004). 2.1.3 Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion Das hochkontagiöse CDV wird durch alle Se- und Exkrete infizierter Tiere ausgeschieden und durch direkten Kontakt oronasal aufgenommen (KRAKOWKA et al. 1980b). Dies führt zu einer Primärbesiedelung des Rachens und des oberen Respirationstrakts und somit zu einer initialen Virusvermehrung in den Makrophagen, B- und T-Lymphozyten innerhalb der ersten 24 Stunden nach Infektionsbeginn. Nach zwei bis vier Tagen sind auch die Tonsillen und regionalen Lymphknoten betroffen, von denen ausgehend virämisch das gesamte lymphoretikuläre Gewebe (Knochenmark, Milz, Thymus, Peyersche-Platten, mesenteriale Lymphknoten, Kupferzellen und mononukleäre Zellen der Gefäße von Bronchien und Lunge) infiziert wird. Diese massive Virusvermehrung führt zu einer direkten Zellschädigung mit Apoptose, woraus eine starke Immunsuppression mit Leukopenie (vor allem Lymphopenie) resultiert (APPEL 1969, 1970; KRAKOWKA et al. 1980a; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995; KUMAGAI et al. 2004; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005; BEINEKE et al. 2009; CARVALHO et al. 2012). Acht bis zehn Tage nach der Infektion findet eine zweite zellgebundene Virämie statt, bei der aufgrund des epithelialen Zelltropismus des CDV eine Infektion des Respirations-, Magen-Darm- und Urogenitaltrakts erfolgt. Diese ist mit einer massiven Virusvermehrung und -ausscheidung verbunden (APPEL 1969; OKITA et al. 1997). In das zentrale Nervensystem gelangt das CDV durch die anterograde Wanderung entlang des N. olfactorius, hämatogen als freie Viruspartikel oder zellgebunden an Thrombozyten und Lymphozyten über den Plexus choroideus und zerebrale Gefäße in Endothelzellen der Meningen sowie über den Liquor cerebrospinalis (HIGGINS et al. 1982; VANDEVELDE et al. 1985; RUDD et al. 2006). Um in das Innere der Zelle zu gelangen, nutzt das CDV verschiedene zelluläre Oberflächenmoleküle. Das signaling lymphocyte activation molecule (SLAM oder CD150) ist ein auf aktivierten Monozyten, B- und T-Lymphozyten und dendritischen 15 Literaturübersicht Zellen exprimierter Rezeptor, an den das Hämagglutininprotein des CDV andockt. Mit Hilfe des Fusionsproteins wird es ermöglicht, dass die Wirts- und Viruszellmembran verschmelzen und auf diesem Wege kann CDV Zellen des lymphatischen Gewebes infizieren (COCKS et al. 1995; VON MESSLING et al. 2001; SEKI et al. 2003; LAN et al. 2005; VON MESSLING et al. 2005; SCHWARTZBERG et al. 2009; ZIPPERLE et al. 2010). Auf kaninen Epithelzellen wird das Protein Nectin 4/PVLR4 exprimiert, welches das CDV als Ligand nutzt, um in die Zelle zu gelangen (NOYCE et al. 2012). 2.1.4 Die Rolle des Immunsystems bei der kaninen Staupevirusinfektion Die hochgradige Leukopenie (vor allem Lymphopenie), hervorgerufen durch den virus-induzierten Zelltod und den Verlust der Lymphozytenproliferation, ist für die Immunsuppression verantwortlich und erhöht die Wahrscheinlichkeit bakterieller Sekundärinfektionen (KRAKOWKA et al. 1980a; KUMAGAI et al. 2004). Während der Phase der akuten Staupevirusinfektion ist die Lymphopenie vor allem durch eine vorübergehende Depletion der CD4 + T-Zellen, aber auch der CD8+ T-Zellen gekennzeichnet, wobei das Ausmaß der Depletion mit der Schwere der Erkrankung und der Entstehung der Viruspersistenz korreliert (WUNSCHMANN et al. 2000; SCHOBESBERGER et al. 2005; BEINEKE et al. 2009). Um eine CDV-Infektion erfolgreich abwehren zu können, wird eine gute humorale und zelluläre Immunantwort benötigt. Die Bildung von Antikörpern (Ak) gegen virale Nukleoproteine im akuten Stadium sowie im späteren Verlauf der Erkrankung gegen virale Hüllproteine ist unabkömmlich (KRAKOWKA et al. 1975; MIELE u. KRAKOWKA 1983; RIMA et al. 1991). Das virale H-Protein ermöglicht über eine Kopplung an den zellulären SLAM-Rezeptor das Eindringen in die Zellen. Aus diesem Grund ist vor allem die Ak-Bildung gegen dieses Strukturprotein notwendig, um eine effektive Virusabwehr zu gewährleisten. Im Besonderen kann dadurch die Entstehung von Läsionen im ZNS verhindert werden (RIMA et al. 1991). Interferon I (IFNα/β) wird vom angeborenen Immunsystem freigesetzt, um das erworbene Immunsystem zu aktivieren, so dass dieses die Virusproteinsynthese in infizierten Zellen hemmt, virale RNA abbaut und benachbarte Zellen aktiviert 16 Literaturübersicht (STARK et al. 1998; PALM u. MEDZHITOV 2009). Das IFN-Signal kann durch eine Infektion mit einem hochvirulenten CDV-Stamm gestört werden (RÖTHLISBERGER et al. 2010). 2.1.5 Entstehung von Läsionen im ZNS bei der kaninen Staupevirusinfektion Die CDV-Infektion des ZNS ist meist mit einem klinisch sehr kritischen Zustand verbunden, da es zu einer Vielzahl neurologischer Ausfälle kommen kann, welche auch in Abwesenheit systemischer Symptome auftreten können (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005; AMUDE et al. 2007). Die CDV-Infektion kann bei der selten vorkommenden "old dog encephalitis" zu einer Polioenzephalitis der grauen Substanz führen. Klassischerweise führt die CDV-Infektion jedoch zu einer demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis. Daher ist die Staupevirusinfektion ein gut etabliertes Tiermodel für die Multiple Sklerose beim Menschen (KOESTNER 1975; COOK et al. 1978). Bei CDV-infizierten Tieren sind Läsionen vor allem in der weißen Substanz des Kleinhirns, in der periventrikulären weißen Substanz, sowie in der weißen Substanz des Großhirns und im Rückenmark beschrieben (BAUMGÄRTNER et al. 1989; BATHEN-NOETHEN et al. 2008). Diese Läsionen können je nach zeitlichem Auftreten in akut, chronisch und rezidivierend eingeteilt werden (MCCULLOUGH et al. 1974a; SUMMERS et al. 1979; HIGGINS et al. 1982). Läsionen, die im ZNS durch eine akute Staupevirusinfektion entstehen, sind auf eine direkte Aktivität des CDV im ZNS zurückzuführen und treten vermehrt bei jungen immunsupprimierten Tieren auf (SUMMERS et al. 1995). Die chronische Form der CDV-Infektion führt zu einer Viruspersistenz in der weißen Substanz ohne demyelinisierenden Charakter (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995). Bei einer Viruspersistenz im ZNS und in den Zellen des lymphatischen Gewebes kann es zu einem späteren Zeitpunkt unter bestimmten Bedingungen zu einem Wiederaufflammen der Erkrankung und somit zu Rezidiven kommen (KRAKOWKA et al. 1975; MULLER et al. 1995; ZURBRIGGEN et al. 1995a; ZURBRIGGEN et al. 1995b). 17 Literaturübersicht Das CDV weist generell einen Tropismus für lymphatisches Gewebe auf (APPEL et al. 1982; CERRUTI-SOLA et al. 1983). Im ZNS wurde das CDV in Mikroglia, Oligodendrozyten, Astrozyten, Neuronen, Aldynoglia und Zellen des Plexus choroideus nachgewiesen (ORLANDO et al. 2008). Die Infektion der Oligodendrozyten durch das CDV ist noch nicht ausreichend geklärt. Einige Oligodendrozyten Vorläuferzellen sind besonders empfindlich gegenüber bestimmten Staupevirusstämmen (PEARCE-KELLING et al. 1991), wobei in ausgereiften Oligodendrozyten eine CDV-Infektion nur zu einer nicht-zytolytischen Infektion führt, da es in diesen immaturen Zellen nur zu einer viralen Transkription, nicht aber zu einer viralen Translation kommt (HIGGINS et al. 1982; SUMMERS u. APPEL 1987; BLAKEMORE et al. 1989; ZURBRIGGEN et al. 1998). Astrozyten werden zu einem großen Anteil infiziert, dort findet die hauptsächliche Virusvermehrung im ZNS statt (MUTINELLI et al. 1989). Außerdem wird postuliert, dass das Astrozytennetzwerk vom CDV genutzt wird, um sich entlang der Zellfortsätze effektiver auszubreiten und somit größere Distanzen im ZNS zu überwinden. Durch diesen Mechanismus kann es der Immunantwort des Wirts leichter entkommen und zur Entstehung der Viruspersistenz beitragen (ZURBRIGGEN et al. 1995a; ZURBRIGGEN et al. 1995b; WYSS-FLUEHMANN et al. 2010). In der akuten Phase der Infektion wird ein Anschwellen der Astrozyten und des Myelins beobachtet, gefolgt von der Phagozytose des Myelins und Vakuolisierung der weißen Substanz (VANDEVELDE et al. 1985; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005). Zur Entstehung der Demyelinisierung im akuten Stadium der CDV-Infektion gibt es mehrere Hypothesen. Die erste Hypothese postuliert, dass durch die Infektion der Oligodendrozyten eine primäre Demyelinisierung entsteht. Durch die Infektion des CDV wird der Zellmetabolismus der Oligodendrozyten verändert und es kommt durch einen direkten Zellschaden zur Zerstörung des Myelins (VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005). Eine zweite Hypothese schreibt der Mikroglia eine zentrale Rolle zu. Durch das CDV wird die Mikrogliazelle aktiviert, und die daraus resultierende Interleukin-8-Sekretion steuert das Einwandern von CD8+-Lymphozyten (TIPOLD et al. 1999). Die Aktivierung resultiert zudem bei der Mikroglia in einer Aufregulation der MHC II- und CD44-Expression und einer erhöhten Phagozytoseaktivität. Außerdem werden zytotoxische Stoffe, wie freie 18 Literaturübersicht Radikale (ROS) und andere proteolytische Enzyme gebildet. Dieses Reaktionsprofil aktivierter Mikroglia kann zu einer Schädigung benachbarter Zellen führen. Vor allem Oligodendrozyten zeigen eine selektive Vulnerabilität für ROS (GRIOT et al. 1990), wodurch das Myelin geschädigt wird, degeneriert und eine sekundäre Demyelinisierung stattfindet (STEIN et al. 2004b; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005). Die Prädilektionsstellen für eine Demyelinisierung sind entlang der weißen Substanz der Sehbahn, im Zerebellum, im Rückenmark und im periventrikulären Gewebe der weißen Substanz, vor allem aber an dem Ependym des vierten Ventrikels zu finden (HIGGINS et al. 1982). Weniger häufig sind Läsionen in der grauen Substanz zu finden, wo es durch die Infektion von Neuronen und deren Nekrose zu einer Polioenzephalomalazie kommen kann. (HIGGINS et al. 1982; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 1995). Entzündliche Veränderungen des Parenchyms bei der akuten Staupevirusinfektion sind kaum vorhanden, da perivaskuläres cuffing nicht zu beobachten ist (VANDEVELDE et al. 1985). 2.1.6 Staupevirusstämme Es wurden bereits verschiedene virulente Staupevirusstämme isoliert, beispielsweise der Snyder Hill, der Cornell A75-17 und der Ohio R252 Virusstamm (GILLESPIE u. RICKARD 1956; MCCULLOUGH et al. 1974a; MCCULLOUGH et al. 1974c). Die Virusstämme unterscheiden sich in ihrer Ausprägung der klinischen Symptome bei den infizierten Hunden. Beispielsweise führt eine Infektion mit dem R252 Virusstamm (R252) klinisch zu einer Vielzahl an neurologischen Symptomen, bei dem Snyder Hill Virusstamm werden im Gegensatz hauptsächlich Krampfanfälle beobachtet (SUMMERS et al. 1984). Klassischerweise verläuft eine R252 Infektion subakut und weist histologisch eine Demyelinisierung in der weißen Substanz auf, vor allem auf der Höhe des vierten Ventrikels (SUMMERS et al. 1984). Zudem korreliert bei der R252-Infektion das Alter des Tieres mit der Mortalität, denn je jünger die Tiere zum Zeitpunkt der Infektion sind, desto höher ist die Mortalitätsrate (KRAKOWKA u. KOESTNER 1976). 19 Literaturübersicht Der apathogene Virusstamm Onderstepoort (OND) wird als Impfstamm genutzt und führt bei infizierten Tieren nicht zur Entstehung von neurologischen Symptomen (STETTLER et al. 1997). Ursprünglich wurde dieser Virusstamm von Green and Carlson, (1945) als Wildtyp isoliert. Nach mehrfacher Passage in Frettchen wurde das Virus an Hühnereier adaptiert. Es hat die Fähigkeit eine Vielzahl von Zelllinien zu infizieren und führt in der Zellkultur zu einer Zytolyse und Virusvermehrung durch budding (STETTLER et al. 1997). 2.2 Mikroglia - die Makrophagen des ZNS Mikrogliazellen wurden erstmals von Rio-Hortega entdeckt und als eigenständige Zellen im ZNS charakterisiert (RIO-HORTEGA 1939). Es sind verschiedene Formen der Mikrogliazellen beschrieben, denn je nach Aktivierungsgrad ändert sich nicht nur ihr morphologisches, sondern auch ihr funktionelles Bild. Die ruhende Mikroglia ist klein und oval mit unterschiedlich langen Zellausläufern und zytoplasmatischen Einschlusskörperchen (MORI u. LEBLOND 1969). Sie wird im Gehirn gesunder adulter Tiere gefunden (PERRY u. GORDON 1988). Amöboide Mikroglia sind histologisch gekennzeichnet durch eine irreguläre Morphologie mit Pseudopodien und dünnen Filopodien-ähnlichen Zellausläufern (LING 1976a, b) und sind im Gegensatz zu den ruhenden Mikroglia in fetalem und postnatalem Gehirn zu finden (GIULIAN 1987). Die reaktive Mikroglia enthält histochemische und ultrastrukturelle Eigenschaften der amöboiden und der ruhenden Mikroglia. Sie ist klein, rund bis stabförmig, ohne Zellausläufer und wird vermehrt in verletzen Gehirnregionen gefunden (MATTHEWS u. KRUGER 1973a, b). Dieser Zelltyp kann durch seine Migrationseigenschaft in verletzte Regionen des ZNS einwandern und dort proliferieren (GRAEBER et al. 1988; GONZALEZ-SCARANO u. BALTUCH 1999). Die amöboide und die reaktive Mikroglia besitzen die Fähigkeit der Phagozytose und ROS-Produktion, wobei diese Eigenschaften bei der reaktiven Mikroglia deutlich ausgeprägter sind als bei der amöboiden Mikrogliazelle (TORVIK 1975; LING 1977; BRIERLEY u. BROWN 1982) Bei der akuten Staupevirusinfektion spielen die Mikrogliazellen bei der Entstehung demyelinisierender Läsionen im ZNS eine entscheidende Rolle. Im Gehirn führt die CDV Infektion zu einer Aktivierung der Mikrogliazelle, worauf hin diese ihr Reaktionsprofil verändert und durch eine erhöhte 20 Literaturübersicht ROS Produktion die umliegenden Oligodendrozyten schädigen kann, so dass eine Demyelinisierung sekundär hervorgerufen wird (STEIN et al. 2004b). Zudem werden Monozyten aus dem peripheren Blut rekrutiert, um nach ihrer Einwanderung im ZNS die dort ansässigen Mikroglia bei ihrer Immunantwort zu unterstützen (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991b, a). Nach Einwanderung ist eine Differenzierung zwischen Mikrogliazellen und eingewanderten Monozyten/Makrophagen nur sehr schwer möglich, da ihre Oberflächenmarker identisch sind (DIJKSTRA et al. 1985). 21 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Labor-Equipment Geräte autoMACSpro Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Durchflusszytometer FACSCalibur mit Apple Macintosh-Computer Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Eismaschine, “Scotsman”, AF 10 AS Tepa Service- und Vertriebs GmbH, Barsbüttel, Deutschland Elektrische Säge, Oscillow GL 2000/83 Nr. 67790 PRO-MED Instrumente GmbH, Tuttlingen, Deutschland Gefrierschrank (-20 °C), Premium NoFrost Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland Gefrierschrank, ultra low vip series - 86 °C, MDF-U50V SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland GenPure ReinstwasserAufbereitungssystem TKA, Thermo Electron LED GmbH, Niederelbert, Deutschland Kühlschrank, „profi-line“ Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach, an der Riss, Deutschland Kühlschrank, K3120, “Comfort” Liebherr-International Deutschland GmbH, Biberach an der Riss, Deutschland Laborwaage Omnilab, OL 1500-P OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland Laborwaage, LabStyle 204 Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Lichtmikroskop, Wilovert S Helmut Hund GmbH, Wetzlar, Deutschland 22 Material und Methoden Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland pH Meter, pH300 Hanna Instruments Deutschland GmbH, Kehl am Rhein, Deutschland Pipetten, einstellbar (0,1 – 1000 µl) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Pipettierhelfer, accu-jet Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Pipettierhelfer, Handystep Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Reagenzglasschüttler, “REAX control” Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland Stanzer groß (Art.-Nr. 54742) M.C. Mieth Manufacturing, Inc., Port Orange, USA Stanzer klein, Harris Uni-Core-5.00 Ted Pellar Inc., Redding, USA Wasserbad mit Einhängethermostat Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Deutschland Material für das sterile Arbeiten Bunsenbrenner, gasprofi WLD-TEC GmbH, Göttingen, Deutschland CO2-Brutschrank, MCO-18AIC (UV) SANYO Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland Mikrobiologische Sicherheitsbank, Herasafe KS Thermo Fischer Scientific GmbH, Karlsruhe, Deutschland Pinzette BD660 Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland UV-Lampe (Art.-Nr. NU-959-400E) INTEGRA Bioscience GmbH, Fernwald, Deutschland 23 Material und Methoden Perfusionsmaterial Arterienklemme (Art.-Nr. BH804R) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland DocCheck Advance II Stethoskop (Art.-Nr. 100.100.1) DocCheck Medizinbedarf und Logistik GmbH, Weil im Schönbuch, Deutschland Handschuhe Novaglove-Latex (Art.-Nr. 905452, Ch.-B. 118668) Noba Verbandsmittel Danz GmbH & Co. KG, Wetter, Deutschland Infusionsbesteck, Typ: IV-Standard-Luer Lock (Art.-Nr. 4062955, Ch.-B. 1G12218SIB) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Kanülen, BD Microlance 3, 18G (Art.-Nr. 304662, Ch.-B. 0802 05) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Knochensplitterzange (Art.-Nr. F0626) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Messer, TWIN Master Zwilling J.A. Henckels AG, Solingen, Deutschland Peha-haft (Art.-Nr. 9324370) PAUL HARTMANN AG, Heidenheim, Deutschland Pinzette, anatomisch (Art.-Nr. BD 27) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Pinzette, chirurgisch (Art.-Nr. BD 557) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Präzisionspinzette, anatomisch (Art.-Nr. AE 160-12) Geomed Medizin-Technik GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland Präzisionspinzette, chirurgisch (Art.-Nr. BD 512) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Schere, klein (Art.-Nr. BC 111) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Skalpellklingen, Größe 10 (Art.-Nr. 5518059, Ch.-B. E3250486) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Skalpellklingenhalter (Art.-Nr. BB73) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Spritze, 2 ml (Art.-Nr. SS+T02ES1, Ch.-B. 11 163/02) Terumo Deutschland GmbH, Eschborn, Deutschland 24 Material und Methoden Spritze, 5 ml (Art.-Nr. SS+T05ES1, Ch.-B. 12 202/1507) Terumo Deutschland GmbH, Eschborn, Deutschland Spritze, 10 ml (Art.-Nr. SS+T10ES1, Ch.-B. 11 264/1686) Terumo Deutschland GmbH, Eschborn, Deutschland Spritze, 20 ml (Art.-Nr. 4606205V, Ch.-B. 1K04048) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Transversalsägeblatt (Art.-Nr. GC500R) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Venenverweilkatheter, VasoVet, 103 ml / min (Art.-Nr. 4269355, Ch.-B. 9D01258317) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Venenverweilkatheter, VasoVet, 36 ml/ min (Art.-Nr. 4269102, Ch.-B. 1A 12258332) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Verbandsschere (Art.-Nr. BC 283R) Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland Verlängerungsschlauch Typ Heidelberger 140 cm (Art.-Nr. 4097300, Ch.-B. 2A23018401) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Labormaterial 6-Wellplatten (Art.-Nr. 92406, Ch.-B. 20090122) TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz 12-Wellplatten (Art.-Nr. 92412, Ch.-B. 20110071) TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz 48-Wellplatten (Art.-Nr. 677102) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Aclar Film, 203 x 318 cm (Art.-Nr. 10501-10) Ted Pellar Inc., Redding, USA Becherglas, mehrere Größen OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland Beschwerungsring, Innendurchmesser 48 mm (Art.-Nr. 214-1942) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland 25 Material und Methoden Beschwerungsring, Innendurchmesser 57 mm (Art.-Nr. 214-1944) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Brühsieb Gourmet, Durchmesser 8 cm (Art.-Nr. 0645079990) Württembergische Metallfabrik AG (WMF), Geislingen/Steige, Deutschland EDTA-Röhrchen, 4,5 ml (Art.-Nr. 32.332) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Erlenmeyerkolben, mehrere Größen OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland Filteraufsatz 500 ml, „rapid“ – Filtermax (Art.-Nr. 99505, Ch.-B. 20110036) TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz Flasche 500 ml, „rapid“ – Filtermax (Art.-Nr. 94507, Ch.-B. 20010259) TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz Glasflaschen, Plastibrand, verschiedene Größen OMNILAB–LABORZENTRUM GmbH & Co. KG, Bremen, Deutschland Labortücher Kimtech Science, 21 x 20 cm, 2-lagig (Art.-Nr. 115-2235, Ch.-B. 007998) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Locher, Leitz 5008 Esselte Leitz GmbH & Co KG, Stuttgart, Deutschland Parafilm M, 4 IN. X 250 FT. Roll (Art.-Nr. 291-1213) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Pasteur Pipetten, 150 mm (Art.-Nr. 747715) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Petrischale ohne Nocken (Art.-Nr. 450 2000) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Pipettenspitzen, 0,1 – 20 µl (Art.-Nr. 7023 12) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Pipettenspitzen, 2 – 200 µl (Art.-Nr. 7023 15) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Pipettenspitzen, 50 – 1000 µl (Art.-Nr. 7023 20) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Plättchen Stanzer, 11 mm (Art.-Nr. 54742) Ted Pellar Inc., Redding, USA 26 Material und Methoden Präzisions-Dispenser-Tip, Plastibrand, 2,5 ml (Art.-Nr. 702379, Ch.-B. 409856) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Präzisions-Dispenser-Tip, Plastibrand, 5 ml (Art.-Nr. 702376, Ch.-B. 410255) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Präzisions-Dispenser-Tip, Plastibrand, 25 ml (Art.-Nr. 702380, Ch.-B. 315399) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Reaktionsgefäß mit Deckel, Eppendorf Safe-Lock Gefäß, 0,5 ml (Art.-Nr. 0030 121.023, Ch.-B. A143175/1321) Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Reaktionsgefäß mit Deckel, Eppendorf Safe-Lock Gefäß, 2 ml (Art.-Nr. 0030 120.094) Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Röhrchen für das Durchflusszytometer, 5 ml (Art.-Nr. 55.1579) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Röhrchen, steril, 15 ml (Art.-Nr. 62.554.502, Ch.-B. 0042801) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Röhrchen, steril, 50 ml, Cellstar-Tubes (Art.-Nr. 227 261, Ch.-B. E10110AS) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Serologische Glasauslaufpipetten, 5 ml (Art.-Nr. 27112) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Serologische Glasauslaufpipetten, 10 ml (Art.-Nr. 27113) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Serologische Glasauslaufpipetten, 25 ml (Art.-Nr. 27115) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Serologische Pipette, steril, 1 ml (Art.-Nr. 86.1251.001, Ch.-B. 6027E) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Serologische Pipette, steril, 5 ml (Art.-Nr. 86.1253.001, Ch.-B. 1272E) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Serologische Pipette, steril, 10 ml (Art.-Nr. 86.1254.001, Ch.-B. 1287E) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Serologische Pipette, steril, 25 ml (Art.-Nr. 86.1685.001, Ch.-B. 1292K) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland 27 Material und Methoden Serologische Pipette, steril, 50 ml, Cellstar (Art.-Nr. 768180, Ch.-B. 11050801) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Sterile Spritzenfilter, 0,2 µm Zelluloseazetat (Art. Nr. 514-0061, Ch.-B. 1145753) VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland Vakuum Filtrationsprinzip 150 ml (Art.-Nr. 99150, Ch.-B. 20090194) TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz Vernichtungsbeutel (Art.-Nr. 86.1197) SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht, Deutschland Wheaton Potter-Elvehjem GewebeHandhomogenisator mit PVC-Überzug, 10 ml (Art.-Nr. 9-0914) neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg, Deutschland Zählkammer nach Türk (Art.-Nr. 719505) Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland Zellkulturflasche, CELLSTAR (Art.-Nr. 690 160, Ch.-B. E10070FA) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland Zentrifugen Zentrifuge „Allegra 6KR“ Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Zentrifuge „Rotina 35R“ Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland 28 Material und Methoden 3.1.2 Reagenzien und Lösungen Reagenzien Brenztraubensäure (Art.-Nr. 107360) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Bovines Serum Albumin (Art.-Nr. A4503, Ch.-B. 041M1801V) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium (DMEM) Pulver (Art.-Nr. 12800-017) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany Ethanol (Art.-Nr. 1.00986.100, Ch.-B. K28967886-111) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Fetales Kälberserum (FKS) eine Stunde bei 56 °C inaktiviert (Art. Nr. 10270-106, Ch.-B. 40F5173) Gibco, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland Gentamycin (Art.-Nr. G1522-10ML) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Glukose (Art.-Nr. G7021) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Ham´s F12 Nutrient-Mix (Art.-Nr. N6760) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Hände-Desinfektionsmittel, Sterillium (Art.-Nr. 976600, Ch.-B. 325087) BODE CHEMIE GmbH, Hamburg, Deutschland Hanks´- gepufferte Salzlösung (HBSS) Lösung (Art.-Nr. H4385, Ch.-B. 051M6004) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Heparin-Natrium-25000-ratiopharm (Art.-Nr. 3029843, Ch.-B. L16825) Ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland HEPES (= N- [2-hydroxyethyl] piperazin-N-2ethansulfonazid (Art.-Nr. H-3375, Ch.-B. 110K5419) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Histopaque 1,119 (Art.-Nr. 11191-100ML, Ch.-B. 126K6002) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Insulin (Art.-Nr. I4011-50MG) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland 29 Material und Methoden Kaliumchlorid (KCl) (Art.-Nr. 1.04936.0500, Ch.-B. K31517236 309) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) (Art. Nr. 1.04873.0250, Ch.-B. A397373 251) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland L-Glutamin (Art.-Nr. G8540-10MG) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (m-csf), (Art.-Nr. 216-MC) R&D Systems Inc., Minneapolis, USA Microglia Medium (MM-prf) (Art.-Nr. 1901-prf, Ch.-B. 8727) ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, USA Narcodorm (182,3 mg/ml Pentobarbital) (Art.-Nr. E1705, Ch.-B. 11B15-5) CP-Pharma Handelsgesellschaft GmbH, Burgdorf, Deutschland Natriumazid (NaN3), Molekulargewicht: 65.01 g/mol (Art.-Nr. 71289, Ch.-B. 351939/1012397) Fluka Chemika übernommen von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Natriumbicarbonat (NaHCO3) (Art.-Nr. 55761, Ch.-B. 050M0129V) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Natriumcarbonat (Na2CO3) (Art.-Nr. 1.06392.0500, Ch.-B. A185092 937) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Natriumchlorid (NaCl) (Art.-Nr. 1.06404.1000, Ch.-B. K42150704 116) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Art.-Nr. 1.06586.0500, Ch.-B. F1169586 306) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Natriumhydroxid (NaOH) 1 N (Art.-Nr. 1.09137.1000, Ch.-B. HC616601) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Pancoll, 1,077 g/ml (Art.-Nr. P04-60500, Ch.-B. 6161011 und 8851112) PAN BIOTECH GmbH, Aidenbach, Deutschland Paraformaldehyd (Art.-Nr. 76240 ) Fluka Chemika übernommen von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland 30 Material und Methoden Penicillin (G-)Streptomycin (10.000 U/ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH, + 10 mg/ml), CellCulture Steinheim, Deutschland (Art.-Nr. P0781) Percoll, steril (Art.-Nr. 17-0891-01, Ch.-B. 10041457) GE Healthcare GmbH, Solingen, Deutschland Phenolrot (Art.-Nr. BP3532, Ch.-B. 054K3721) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Progesteron (Art.-Nr. P8783-1G) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Putreszin (Art.-Nr. P5780-5G) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Salzsäure (HCl) 1 N (Art.-Nr. 1.09057.1000, Ch.-B. HC622391) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland Saponin (Art.-Nr. A18820, Ch.-B. 10130141) Alfa Aecar GmbH und Co., Karlsruhe, Deutschland Selen (Art.-Nr. S5261-10G) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Sterofundin Infusionslösung (Art.-Nr. 8646960, Ch.-B. 120118151) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Transferrin (Art.-Nr. T8158) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Trypanblau (Art.-Nr. T-6146, Ch.-B. 25H50266) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland 31 Material und Methoden Lösungen Dissoziationspuffer: NaCl 89,4 g/l KCl 37,3 g/l MgCl2 40,0 g/l CaCl2 25,3 g/l Hanks´- gepufferte Salzlösung: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland NaCl 8,0 g KCl 0,4 g Glucose 1,0 g KH2PO4 60,0 mg Na2PO4 47,5 mg Phenolrot 17,0 mg Aqua bidest. ad 1000 ml + Zusatz von: FKS 20,0 ml Na2CO3, 7,5% 4,7 ml um den pH-Wert auf 7,3-7,4 einzustellen Kollagenase-DNAse-Puffer: (Kollagenase, SERVA Electrophoresis (pro 8 g Gehirnmaterial) GmbH, Heidelberg, Deutschland; DNAse, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland) DNAse 4.000 Units Aqua bidest. 8,00 ml Kollagenase 45,6 mg Dissoziationspuffer 0,8 ml 32 Material und Methoden Lösung zum Lysieren von Erythrozyten: doppelt konzentrierte Phosphatgepufferte Salzlösung (2 x PBS) Aqua bidest. ad 1000 ml MACS-Puffer: EDTA-PBS 40 ml FKS 0,5 ml PBS ad 100 ml Membran-Immunfluoreszenz (MIF) -Puffer: PBS mit 1% BSA und 0,01% NaN3 BSA 1,00 g NaN3, 10% 0,01 g PBS ad 100 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS): (pH 7,4) NaCl 8,00 g KCl 0,20 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,20 g Aqua bidest. ad 1000 ml 33 Material und Methoden Sato-Medium: (für 1 Liter Medium) Ham´s F12 Nutrient-Mix 5,32 g Hepes 2,38 g DMEM Pulver 6,68 g Brenztraubensäure 0,055 g NaHCO3 2,438 g Transferrin 0,005 g Insulin (5 mg/ml) 1 ml Aqua tridest. 1000 ml Glukose 6g L-Glutamin 0,0292 g Penicillin-Streptomycin 1,25 ml Putreszin 0,1 ml Progesteron 0,02 ml Selen 0,01 ml vor Gebrauch: Phenolrot 3,18 ml Gentamycin 1,2 ml + Zusatz von: FKS 20,0 ml Na2CO3, 7,5% 4,7 ml um den pH-Wert auf 7,3-7,4 einzustellen Sterofundin Infusionslösung: NaCl 5,55 g KCl 0,30 g CaCL2 x 2 H2O 0,37 g MgCl2 x 6 H2O 0,20 g Natriumlactat – Lösung 10,09 g (≈ 5,05 g Natriumlactat) Aqua ad inj. 1000 ml 34 Material und Methoden Reagenzien zur Isolierung von Mikroglia CD11b (Mikroglia) MicroBeads Maus / Mensch (Art.-Nr. 130-093-634, Ch.-B. 5111005005) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Histopaque 1,119 (Art.-Nr. 11191-100ML, Ch.-B. 126K6002) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland MACS-Puffer (Kap. 3.1.2.) Percoll, steril (Art.-Nr. 17-0891-01, Ch.-B. 10041457) GE Healthcare GmbH, Solingen, Deutschland Enzyme Collagenase von Clostridium histolyticum, EC 3.4.24.3, lyophilisiert (Art.-Nr. 1.102PZU/mg, Ch.-B. 100675) SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland Desoxyribonuclease I (DNAse I, EC 3.1.21.1), Typ IV: aus Rinderpankreas (Art.-Nr. D5025, Ch.-B. 31K7659) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Reagenzien für die indirekte Membran-Immunfluoreszenz MIF-Puffer (Kap. 3.1.2.) Primärantikörper (monoklonal) Humanes Normal-Immunglobulin G (HuIgG) (Ch.-B. 015 177.01) verwendete Verdünnung 1:16 Serum- und Impfinstitut Bern (Berna), Bern, Schweiz Maus-anti-Hund CD18 verwendete Verdünnung 1:5 Prof. Peter F. Moore, University of California, Davis, CA, USA Maus-anti-Hund CD11b (Art.-Nr. MCA1777F,Ch.-B. 280709) verwendete Verdünnung 1:5 Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland 35 Material und Methoden Ratte-anti-Hund CD45 konjugiert mit Biotin (Art.-Nr. MCA1042B, Ch.-B. 0903) verwendete Verdünnung 1:10 Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland R-Phycoerythrin-konjugiertes CD14 Clone TüK4 (Art.-Nr. R0864, Ch.-B. 108) verwendete Verdünnung 1:8 BIOZOL Diagnostica Vertrieb GmbH, Eching, Deutschland Sekundärantikörper Aufgereinigtes R-Phycoerythrinkonjugiertes F(ab´)2-fragment Ziege-anti-Maus (gαm-PE) IgG (Art.-Nr. 115-116-072, Ch.-B. 96050) verwendete Verdünnung 1:100 Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Newmarket, England Streptavidin-konjugiertes FluoreszinIsothiocyanat (Isomer 1; FITC); STAR2B (Art.-Nr. 710002, Ch.-B. 0906) verwendete Verdünnung 1:100 Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland Isotypkontrolle Maus IgG1 (Art.-Nr. MCA928, Ch.-B. 0310) verwendete Verdünnung 1:5 Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland Ratte IgG2b konjugiert mit Biotin (Art.-Nr. MCA 1125B, Ch.-B. 1107) verwendete Verdünnung 1:10 Serotec, MorphoSys AbD GmbH, Düsseldorf, Deutschland Maus IgG2a konjugiert mit R-Phycoerythrin, Clone PPV-04 (Art.-Nr. 21275524, Ch.-B. 273104) verwendete Verdünnung 1:15 Immunotools, Friesoythe, Deutschland 36 Material und Methoden Reagenzien für die intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung Saponin (Art.-Nr. A18820) Alfa Aeser, GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Paraformaldehyd (Art.-Nr. 76240 ) Fluka Chemika übernommen von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Primärantikörper (monoklonal) Humanes Normal-Immunglobulin G (HuIgG) (Art.-Nr. 009-000-002Ch.-B. 98054) verwendete Verdünnung 1:16 Johnson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Suffolk, England D110 Ein aus der Maus und über den Zellkulturüberstand gewonnener Antikörper, der an ein Epitop des CDV-Nukleokapsid-Proteins bindet. Er ist gegen Fixation und Einbettung unempfindlich. Verwendete Verdünnung 1:16 (BOLLO et al. 1986) Sekundärantikörper Aufgereinigtes R-Phycoerythrinkonjugiertes F(ab´)2-fragment Ziege-anti-Maus (gαm-PE) IgG (Art.-Nr. 115-116-072, Ch.-B. 96050) verwendete Verdünnung: 1:50 Jackson ImmunoResearch Laboratories Europe Ltd., Newmarket, England Material für den Test der ROS-Bildung der Monozyten Phorbol Myristat Acetat (PMA) (Art.-Nr. P9268) (zuerst in Dimethylsulfoxid auf eine Konzentration von 1 mmol einstellen und dann weiter in PBS verdünnen auf eine finale Konzentration von 100 nmol) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland Dihydrorhodamin 123 (DHR) (Art.-Nr.D1054) (1,5 mg/ml verdünnt in Dimethylsulfoxid und dann weiter verdünnt in PBS auf eine finale Konzentration von 15 µg/ml) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland 37 Material und Methoden Material für die Durchflusszytometrie Nukleinsäurefarbstoff: TO-PRO-3 1 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (Art.-Nr. 642/661) Molecular probes, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland Reinigungs- und Desinfektionslösung: FACSClean (Art.-Nr. 340345, Ch.-B. 1109001013) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Spüllösung: FACSRinse (Art.-Nr. 340346, Ch.-B. 0924300006) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Trägerlösung: FACSFlow (Art.-Nr. 342003, Ch.-B. 1125700032) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Waschlösung: CellWash (Art.-Nr. 349524, Ch.-B. 1002900030) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Material für das autoMACSpro MACS BSA Stock Solution (Art.-Nr. 130-091-376) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland MACS Chill Racks (Art.-Nr. 130-092-952) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Magnetsäulen: autoMACS Columns (Art.-Nr. 130-021-101) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Reinigungs- und Desinfektionslösung: autoMACS Washing Solution (Art.-Nr. 130-092-987) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Separationspuffer: autoMACS Running Buffer (Art.-Nr. 130-091-221) Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland Spüllösung: autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec GmbH, (Art.-Nr. 130-091-222) Bergisch Gladbach, Deutschland 3.1.3 Computer Software Cell-Quest Pro Version 6.0 - Software (für Apple Macintosh Computer) Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland 38 Material und Methoden 3.1.4 Virus Staupevirus R252, Passage 11, vom 26.01.2011, Virustiter: TCID 50 x 104,5 ad 100 µl Dr. S. Krakowka Staupevirus Onderstepoort, Passage XI, vom 01.03.2011, Virustiter: TCID 50 x 104,5 ad 10 µl Dr. von Messling Der virulente Staupevirusstamm R252 wurde freundlicherweise von Dr. S. Krakowka und der avirulente Staupevirusstamm Onderstepoort wurde freundlicherweise von Dr. von Messling zur Verfügung gestellt. Das Virus wurde auf Verozellen gezüchtet und unter pathogen-freien Bedingungen gewonnen. Die Lagerung fand bei -80 °C statt. 3.1.5 Tiere Die Hunde, deren Gehirnmaterial für die Isolation und Charakterisierung der Mikroglia verwendet wurden, stammten aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (siehe Tab. 1). Die Besitzer entschieden sich für eine Euthanasie ihrer Hunde, da diese an unterschiedlichen Erkrankungen mit infauster Prognose erkrankt waren. Tabelle 1: Darstellung der für die Charakterisierung der Mikroglia rekrutierten Hunde Hund Rasse Gewicht des verwendeten Gehirnmaterials 1 Dackel-Mischling 26,1 g 2 Havaneser 29 g 3 Mischling 61,6 g 4 Beagle 60,4 g 39 Material und Methoden Für die Charakterisierung kaniner Monozyten wurden zehn gesunde adulte Hunde der Rasse Beagle in einem Alter von ein bis sechs Jahren zur Beprobung herangezogen. Fünf von ihnen gehörten zu den Blutspendehunden der Klinik für Kleintiere, die anderen fünf Hunde wurden vom Institut für Pharmakologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Die Allgemeinuntersuchung sowie das Blutbild der für die Studie verwendeten Hunde waren unauffällig. Die Genehmigung der Studie wurde von der Landesregierung erteilt (Regierungspräsidium Hannover, Deutschland, Bewilligungsnummer 33.9-42502-05-12A275) und die Probengewinnung und Untersuchung der zehn Hunde wurde entsprechend der Maßgabe des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt. 40 Material und Methoden 3.2 Methoden 3.2.1 Methodik zur Kultivierung kaniner Mikroglia Isolation kaniner Mikroglia Die angewandte Isolationsmethode kaniner Mikroglia beruht auf einer von Stein (STEIN 2001; STEIN et al. 2004a) für den Hund modifizierten Methode nach Sedgwick et al. (1991). Den Hunden wurde ein peripherer Venenverweilkatheter gelegt, über den zuerst Heparin (150 IE/kg KGW) und dann Pentobarbital (60 mg/kg KGW) intravenös injiziert wurde. Daraufhin trat der sofortige Tod der Hunde ein, welcher mittels Auskultation des Herzens bestätigt wurde. Unmittelbar nach dem Tod wurde eine Thorakotomie durchgeführt, um die Perfusion über den linken Herzventrikel zu beginnen. Das Abklemmen der Vena cava caudalis unterbrach den Blutfluß zu den abdominalen Organen und das Eröffnen des linken Herzohrs ermöglichte das Abfließen des Blutes und später auch der Perfusionslösung. Der Hund wurde für 30 bis 45 Minuten mit 1 l kalter Sterofundin Infusionslösung perfundiert. Nachdem die Perfusion abgeschlossen war, wurde mittels Kraniotomie das Gehirn entnommen und in eiskalte sterile Hanks´gepufferte Salzlösung (HBBS-Lösung) mit fetalem Kälberserum (FKS) überführt. Die folgenden Schritte wurden unter einer mikrobiologischen Sicherheitsbank durchgeführt, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Meningen wurden anschließend vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und das restliche Gehirnmaterial gewogen. Zur Dissoziation wurde das Gehirnmaterial zunächst mit einer Skalpellklinge zerkleinert und danach durch ein Sieb gerieben und mit HBBS-Lösung verdünnt. Der Gewebebrei wurde daraufhin mit Hilfe eines Gewebehomogenisator weiter zerkleinert und weiter aufgeschlossen um dann in ein 50 ml Röhrchen überführt zu werden. Drei Waschschritte mit HBSS-Lösung mit anschließender Zentrifugation bei 170 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 4 °C folgten. Der Gewebebrei wurde mit Kollagenase-DNAse-Puffer (1 ml pro 1 g Gehirnmaterial) versetzt und für 60 Minuten im Wasserbad bei einer Temperatur von 37 °C verdaut. Danach wurde die gewonnene Zellsuspension 41 zweimal mit HBSS-Lösung Material und Methoden gewaschen und bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert. Zur Anfertigung des Dichtevorgradienten wurde das Zellpellet in 45 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml resuspendiert und mit 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml unterschichtet, um dann anschließend bei 1250 x g bei einer Temperatur von 20 °C für 5 Minuten bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert zu werden. Nach der Zentrifugation befanden sich Myelin und Zelldebris auf der obersten Schicht des Gradienten und wurden verworfen, nur Zellen auf Percoll der Dichte 1,124 g/ml wurden gewonnen und in HBBS-Lösung resuspendiert. Zellseparation mittels Dichtegradientenzentrifugation Nach erneutem Waschen und Zentrifugieren bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das gewonnene Zellpellet mit 5 ml HBSS-Lösung resuspendiert und auf die Hauptgradienten verteilt. Pro 8 g ursprünglichem Gehirnmaterial wurde ein Hauptgradient gegossen. Der Hauptgradient bestand aus fünf übereinander geschichteten Dichten. Zuerst wurde 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml in ein 50 ml Röhrchen vorgelegt, darauf wurden 12 ml Percoll der Dichte 1,077 g/ml, gefolgt von weiteren 12 ml Percoll der Dichte 1,066 g/ml, 8 ml Percoll der Dichte 1,050 g/ml und 8 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml. Die erstellten Gradienten wurden bei 1250 x g für 25 Minuten bei einer Temperatur von 20 °C bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert. Die Zellen auf den Percoll-Dichten 1,077 g/ml und 1,066 g/ml wurden geerntet und mit HBBS-Lösung resuspendiert, um erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert zu werden. Anschließend wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die verbleibende Zellsuspension wurde erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert. 42 Material und Methoden Separation mittels autoMACSpro Das Zellpellet wurde in 80 µl Magnetic-activated cell sorter (MACS) -Puffer pro 107 Zellen resuspendiert und mit 20 µl CD11b MicroBeads pro 10 7 Zellen für 15 Minuten bei 4-8 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MACS-Puffer und Zentrifugation bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Zellen resuspendiert, bevor es in ein 15 ml Röhrchen überführt wurde, um mit dem autoMACS pro zweimal separiert zu werden. Die positive Zellfraktion wurde dann mit Trypanblau angefärbt und erneut in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die restlichen Zellen der positiven Fraktion wurden bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert und das Zellpellet in Microglia Medium (MM-prf) überführt und zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank mit einem Gehalt von 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) und einer Temperatur von 37 °C gelegt. Lichtmikroskopische Zählung der Zellzahl 10 µl der isolierten Zellsuspension wurden mit 90 µl 0,4 % Trypanblau verdünnt, wovon 10 µl in die Zählkammer nach Türk überführt wurden. Lebende Zellen mit einer intakten Zellwand stellten sich farblos dar, tote Zellen erschienen blau, da der Farbstoff durch die zerstörte Zellwand in den Interzellularraum gelangen konnte. Die Zellzahl der lebenden Zellen wurde ermittelt, indem drei der mittelgroßen Quadrate mit einer Länge von 1 mm und einer Tiefe von 0,1 mm auszählt wurden, was einen Rauminhalt pro Quadrat von 0,1 mm3 widerspiegelte. Der Mittelwert der drei gewonnenen Zellzahlen wurde mit dem Faktor zehn multipliziert, um die Zellzahl der verdünnten Suspension pro 1 µl wiederzugeben. Um die Verdünnung mit zu berücksichtigen, wurde das Ergebnis erneut mit 10.000 multipliziert, um die Zellzahl pro 1 ml der unverdünnten Zellsuspension zu errechnen. Herstellung der Dichten mit Percoll Um Vor- und Hauptgradienten zu gießen, mussten vorher die benötigten Dichten hergestellt werden. Dazu wurde Percoll mit 1,5 M NaCl-Lösung in einem Verhältnis von 1:10 vermischt. Die Dichte dieser isotonen Lösung entsprach 1,124 g/ml. Zur Herstellung der weiteren unterschiedlichen benötigten Dichten (1,077 g/ml, 43 Material und Methoden 1,066 g/ml, 1,050 g/ml und 1,030 g/ml) wurde HBSS-Lösung nach Herstelleranweisungen hinzugefügt. Prinzip des autoMACSpro CD11b MicroBeads sind superparamagnetische Teilchen, die an CD11b-Antikörper gekoppelt sind. Bei Zugabe der CD11b MicroBeads zu der Zellsuspension bindet der CD11b-Antikörperteil der MicroBeads Mikrogliazellen. Das autoMACSpro an die CD11b-Oberflächenmarker der separiert die Zellen anhand der CD11b-Expression. Dazu passiert die Zellsuspension mit den CD11b MicroBeadsgekoppelten und den nicht gekoppelten Zellen eine magnetisch aufgeladene Säule, an der die gekoppelten Zellen aufgrund der superparamagnetischen MicroBeads haften bleiben. Nachdem die negative Fraktion, also die nicht gekoppelten Zellen, die Säule passiert hat und in einem Röhrchen aufgefangen wurde, schaltet das autoMACSpro die Magnetsäulen aus und die positive Fraktion wird in ein separates Röhrchen abgegeben. So wird innerhalb weniger Minuten eine weitere Aufreinigung der vorher mittels Dichtegradienten separierten Mikrogliapopulation erreicht. Infektion kaniner Mikroglia mit Staupevirus Die Zellmenge der kultivierten Mikroglia wurde gedrittelt und in jeweils eine Vertiefung einer separaten 12-Wellplatte gegeben. Die Virusstämme R252 und Onderstepoort wurden jeweils mit 0,1 multiplicity of Infection (MOI) eingesetzt. Es wurden separate Platten für die verschiedenen Virusstämme und die Negativkontrolle verwendet um Kontaminationen zu vermeiden. Zu den Zellen in der Vertiefung der ersten Wellplatte wurde der Virusstamm R252, in die Vertiefung der zweiten Wellplatte der Virusstamm Onderstepoort und in die Vertiefung der dritten Wellplatte wurde als Negativkontrolle HBBS-Lösung hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde im Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt wurden die infizierten Zellen in 15 ml Röhrchen überführt und dreimal mit HBBS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g zentrifugiert. Danach wurden die Zellsuspensionen der drei Zellpopulationen (R252, Onderstepoort und Negativkontrolle) jeweils in vier Teile geteilt. Ein Teil wurde direkt weiter bearbeitet und die anderen drei Teile wurden in jeweils eine eigene 44 Material und Methoden Vertiefungen einer 6-Wellplatten überführt und kamen zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt. Nach zwei, vier und sechs Stunden wurden jeweils die Zellen einer Vertiefung der 6-Wellplatten von jedem Versuchsansatz zur weiteren Bearbeitung entnommen. Kultivierung kaniner Mikroglia Die gewonnenen Mikroglia wurden in eine mit einem Kulturmedium gefüllte Zellkulturflasche überführt und in einen Brutschrank mit 37 °C und einem Kohlenstoffdioxidgehalt von 5 % verbracht. Einen, drei und acht Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde jeweils ein Mediumwechsel durchgeführt. Indirekte Membran-Immunfluoreszenz Durch den Nachweis der Expression der Oberflächenmoleküle CD11b, CD18 und CD45low, welche in ihrer Kombination spezifisch für die kaninen Mikroglia sind (STEIN 2001), soll die Reinheit der isolierten Mikrogliazellpopulation ermittelt werden. Nachdem die Zellsuspension auf eine Zellzahl von 2 x 105 Zellen pro 50 µl PBS eingestellt wurde, wurden mittels humanem Immunglobulin G (IgG) unspezifische Bindungen geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu reduzieren. Danach wurden die Zellen gleichmäßig in fünf Röhrchen aufgeteilt und wie folgt beschriftet: Nativkontrolle, Isotypkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle, Teströhrchen CD11b und CD45low sowie Teströhrchen CD18 und CD45 low. In das Isotypkontroll-Röhrchen wurden die Isotypkontrollen Ratte IgG2b konjugiert mit Biotin und Maus IgG 1 pipettiert. In die Röhrchen der Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde MIF-Puffer hinzugefügt und in die beiden Teströhrchen wurde ihrer Beschriftung entsprechend der Primärantikörpern Ratte-anti-Hund CD45 konjugiert mit Biotin, Maus-anti-Hund CD11b und Maus-anti-Hund CD18 pipettiert. Alle Röhrchen wurden für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Darauf folgten zwei Waschschritte mit MIF-Puffer mit anschließender Zentrifugation über sechs Minuten bei 200 x g. Anschließend erfolgte die Zugabe der Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus IgG konjugiert mit R-Phycoerythrin und Fluoreszin-Isothiocyanat konjugiert mit Streptavidin in alle 45 Material und Methoden Röhrchen außer der Natikontrolle, welche mit MIF-Puffer versetzt wurde. Danach fand eine Inkubation aller Röhrchen für 20 Minuten bei 4 °C statt. Vor dem Messen im Durchflusszytometer erfolgte ein weiterer Waschschritt mit CellWash und Zentrifugieren für sechs Minuten bei 200 x g. Die Zellen wurden anschließend in Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Flow resuspendiert. Unmittelbar vor der Messung wurde FACSFlow mit TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 hinzugefügt. Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung Die Zellen wurden zuerst mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und für jeweils zehn Minuten bei 250 x g bei 4 °C zentrifugiert. Daraufhin erfolgten die Permeabilisierung der Zellmembran mit 0,03%iger PBS-SaponinLösung und das Blocken unspezifischer Bindungen mit humanem IgG. Die Zellsuspensionen wurden auf vier Röhrchen (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle und CDV-Ag-Teströhrchen) verteilt. In das Nativ- und Isotypkontrollröhrchen wurde 0,03%ige PBS-Saponin-Lösung und in das Isotypkontrollröhrchen Maus IgG1 hinzugefügt. Der monoklonale Primärantikörper anti-CDV-NP D110, der die Nukleoproteine der Staupeviren detektiert, wurde in das CDV-Ag-Teströhrchen hinzu gegeben und alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach dem Ablauf der Inkubationszeit wurde zweimal mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung gewaschen und für je fünf Minuten bei 250 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der an R-Phycoerythrin gekoppelte Sekundärantikörper Ziege-antiMaus IgG wurde in alle Röhrchen pipettiert, außer in die Nativkontrolle, da diese mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung versetzt wurde. Anschließend wurden alle Röhrchen für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation für fünf Minuten bei 250 x g wurden die Zellpellets in FACSFlow resuspendiert und im Durchflusszytometer gemessen. 46 Material und Methoden 3.2.2 Methodik zur Charakterisierung kaniner Monozyten Isolation und Infektion peripherer mononukleärer Zellen Den Hunden wurde 10 ml Vollblut durch die Punktion der V. cephalica antebrachii und/oder V. saphena lateralis entnommen und in einem EDTA-Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Dazu wurden 2 ml Histopaque in ein 15 ml Röhrchen pipettiert und mit 5 ml Pancoll der Dichte 1,077 g/ml überschichtet, gefolgt von maximal 6 ml in PBS verdünntem Vollblut (Verdünnung 1:1). Um 10 ml Vollblut zu verteilen wurden vier Gradienten gegossen, welche bei 700 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden. Nach dem Zentrifugieren haben sich die Zellen entsprechend ihrer Dichte auf den verschiedenen Schichten angesammelt. Die Interphase zwischen dem Plasma und dem Pancoll bestand aus der Akkumulation mononukleärer Zellen. Diese Zellschicht wurde abpipettiert und dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und zweimal bei 170 x g und einmal bei 250 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Falls das Zellpellet mit Erythrozyten kontaminiert war, wurde eine hypotone Lyse durchgeführt. Bei der hypotonen Lyse wurde das Zellpellet mit 5 ml Aqua dest. für 20 Sekunden resuspendiert und danach mit 5 ml doppelt konzentriertem PBS aufgefüllt und bei 170 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand verworfen und das Monozyten-Zellpellet in CellWash resuspendiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde mittels Zählkammer nach Türk bestimmt. Staupevirusinfektion Die isolierte Monozyten-Zellsuspension wurde gedrittelt und jeweils in ein 15 ml Röhrchen gegeben. Ein Röhrchen wurde mit 0,1 multiplicity of infection des CDV-Impfstamms Onderstepoort und das andere mit 0,1 multiplicity of infection des virulenten Staupevirusstamm R252 versetzt. In dem dritten Röhrchen wurden die Monozyten mit HBSS-Lösung versetzt und dienten als Negativkontrolle. Nach einer Stunde im Inkubator bei einer konstanten Temperatur von 37 °C und einem CO2-Gehalt von 5 % wurden die Zellen dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Infektion wurden die Zellen der verschiedenen Versuchsansätze (Ktr, Ond und R252) 47 Material und Methoden geteilt. Der erst Teil wurde direkt post infectionem (p.i.) gemessen und der zweite Teil wurde nach drei weiteren Stunden der Inkubation (3 Stunden p.i.) gemessen. Für diese zwei Messzeitpunkte wurde jeweils die Expression des Oberflächenmoleküls CD14, das intrazelluläre CDV-Ag und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies für jeweils die Negativkontrolle und die OND-, bzw. R252-infizierten Monozyten mittels FACS-Analyse evaluiert. Durchflusszytometrie Die Identifikation der Monozyten wurde mit der Cell-Quest-Software durchgeführt und die Populationen der Monozyten und Lymphozyten anhand ihrer Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität (side scatter, SSC) voneinander differenziert. Detektion des Oberflächenmoleküls CD14 Die Membran-Immunfluoreszenz wurde, wie bereits von Stein et al. (2004a) beschrieben, durchgeführt. Fc-Rezeptoren wurden mit humanem IgG geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu minimieren. Danach wurde die Zellsuspension in drei Teile geteilt (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, CD14-Teströhrchen). Die Zellsuspension der Nativkontrolle wurde mit MIF-Puffer, die Zellsuspension der Isotypkontrolle mit R-Phycoerythrin-konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG und die Zellsuspension aus dem CD14-Teströhrchens mit direkt R-Phycoerythrin-konjugierten mononukleärer Antikörper gegen CD14 versetzt und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MIF-Puffer wurden die Zellen bei 300 x g für zehn Minuten bei 10 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in FACSFlow mit TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 resuspendiert und direkt im FACSCalibur gemessen. Pro Messung wurden insgesamt 104 live-gated events pro Messung analysiert. Der cut-off wurde so gesetzt, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten. 48 Material und Methoden Detektion des Staupevirusantigens in den Monozyten Die intrazelluläre Identifikation des CDV in den Monozyten wurde nach den Angaben in der Literatur (CHERPILLOD et al. 2000) durchgeführt. Nach einer Fixation der Monozyten mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und jeweils bei 250 x g für zehn Minuten zentrifugiert. Um die Zellmembran zu permeabilisieren, wurden 150 µl einer 0,03%igen PBSSaponin-Lösung zu dem Zellpellet hinzu gegeben. Humanes IgG wurde zum Blocken des Fc-Rezeptors benutzt. Die Zellsuspensionen der drei Versuchsansätze (Ktr, OND, R252) wurden gedrittelt und in drei Röhrchen überführt (Nativkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle und CDV-Ag-Teströhrchen). In die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und in das CDV-Ag-Teströhrchen der gegen das Nukleoprotein gerichtete Antikörper D110 in einer Verdünnung von 1:16 hinzugefügt und für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Danach folgten zwei Waschschritte mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C. Der R-Phycoerythrin-konjugierte Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus wurde in die Sekundärantikörperkontrolle und in das CDV-Ag-Teströhrchen hinzugefügt und erneut für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach zwei letzten Waschschritten mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C, wurde das Zellpellet in FACSFlow resuspendiert und unverzüglich im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden wiederum 104 live-gated events pro Probe analysiert und der cut-off so adjustiert, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten. Detektion der ROS-Produktion von Monozyten Die Detektion der ROS-Produktion von Monozyten wurde, wie in der Literatur für Mikrogliazellen beschrieben durchgeführt (STEIN et al. 2004a). Pro Versuchsansatz wurden jeweils 90 µl Zellsuspension in eins von fünf Röhrchen überführt und anschließend für 15 Minuten bei 37 °C mit einem CO 2 Gehalt von 5 % inkubiert. Nach der Inkubation wurden, da der Versuch im Doppenansatz durchgeführt wurde, 10 µl PMA in zwei Röhrchen pipettiert. Phorbol Myristat Acetat triggert die ROS-Produktion in den Zellen. In die verbleibenden drei Röhrchen wurden 10 µl PBS pipettiert, wobei ein Röhrchen davon als Nativkontrolle geführt wurde. Nach einer 49 Material und Methoden weiteren Inkubationsperiode aller Röhrchen von 15 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO 2 wurde allen Ansätzen außer der Nativkontrolle 20 µl des nicht-fluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 zugefügt und wiederum unter den gleichen Bedingungen wie zuvor für 15 Minuten inkubiert. In dieser Zeit wandelt das von den Monozyten produzierte ROS das Dihydrorhodamin 123 (DHR) in das fluoreszierende Rhodamin 123 um. Nach der Inkubation wurden die Zellen 15 Minuten auf Eis gestellt, um die Rhodamin 123 Umwandlung innerhalb der Zellen zu stoppen. Daraufhin wurden die Zellen mit FACSFlow und TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden 10 4 live-gated events pro Probe analysiert. Der cut-off wurde in der Negativkontrolle so adjustiert, dass das Signal der Population der nicht-getriggerten Monozyten als negativ detektiert wurde. Da die Versuche im Doppelansatz durchgeführt wurden, wurden der Mittelwerte aus beiden Ergebnissen zur weiteren Analyse verwendet. 3.2.3 Statistik über die Charakterisierung kaniner Monozyten Der Spearmans Rangkorrelationskoeffizient wurde ermittelt, um eine Korrelation zwischen den einzelnen Merkmalen der infizierten Monozyten zu evaluieren. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant festgelegt. Zum Vergleich der Resultate für die Negativkontrolle, sowie die OND- und R252-infizierten Monozyten und der zwei Messzeitpunkte wurde eine ein- und zweifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt. Bei dem globalen F-Test wurde ein f-Wert von < 0,05 als signifikant definiert. Um die Details der Gruppenzusammenhänge zu evaluieren, wurde ein Student´s T-Test durchgeführt, bei dem ein p-Wert von < 0,05 als signifikant galt. Die Statistik wurde mit dem Programm SAS Version 9.2 durchgeführt. Die Boxplots wurden mit dem Programm GraphPad Prism 6 erstellt. 50 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Ergebnisse der Mikroglia-Isolation Zur Identifizierung der kaninen Mikroglia wurden phänotypische Merkmale, wie die Größe (FSC) und Komplexität (SSC) der Zellen (Abb. 1), sowie die Expression der Oberflächenmarker CD11b, CD18 (Abb. 2) und CD45 herangezogen. Die Expression von CD18, CD11b/c und CD45low sind als Mikroglia-spezifisch in der Literatur beschrieben (FORD et al. 1995; STEIN et al. 2004a), während im Gegensatz dazu die Makrophagen eine Expression von CD11b/c und CD45 high aufweisen (SEDGWICK et al. 1991; FORD et al. 1995). Abbildung 1: Darstellung der isolierten Mikroglia-Population im Dot Plot mit den Merkmalen Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität (side scatter, SSC). Aufgrund der relativ uniformen Größe und Komplexität ist die Population innerhalb des roten Gates sehr gut erkennbar. Die Zellen rechts von der Mikroglia-Population stellen zusammengelagerte Mikrogliazellen dar, die somit ein höheres Signal in dem forward scatter aufweisen. 51 Ergebnisse Isotyp a) CD18-positive Zellen b) 2% 86,5% Abbildung 2: Darstellung der Mikroglia-Population im Dot Plot im Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H) Der Cut-off wurde in der Isotypkontrolle (a) so gesetzt, dass nicht mehr als 2 % der Zellen ein positives Signal aufweisen. Bei Übertragung dieses cut-offs auf das Testfeld (b) stellen sich 86,5 % der Zellen CD18+ dar. Zur Herstellung einer reinen Mikroglia-Zellkultur sollte eine möglichst reine MikrogliaPopulation isoliert werden. Die Reinheit der Mikroglia nach Dichtegradientenzentrifugation liegt beim Hund bei circa 86 % - 98 % (STEIN et al. 2004a). Daher ergab sich die erste zu bearbeitende Fragestellung, ob durch eine Isolation mittels MACS eine höhere Aufreinigung der Zellpopulation erzielt werden kann, als durch die übliche Isolationsmethode mittels Dichtegradientenzentrifugation (STEIN et al. 2004b). Für den Vergleich wurden 26,1 g Gehirnmaterial eines Hundes (Tab. 1) als Ausgangsmaterial genutzt. Nach der Zentrifugation des Vorgradienten wurde die Zellsuspension auf zwei Proben aufgeteilt, wovon die Zellen der einen Probenhälfte über das MACS und die andere mittels Dichtegradientenzentrifugation separiert wurden. Die Messergebnisse beider Methoden wurde direkt verglichen. Die Isolation mit dem MACS erzielte 2,6 x 106 Zellen/ml mit einer Vitalität von 68,5 %, während die Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation eine Gesamtzellzahl von 2,3 x 10 6 Zellen/ml mit einer Vitalität von 60 % erreichte. Zur Identifikation der Mikrogliazellen und Bestimmung ihrer Reinheit wurde ihre Größe und Komplexität und die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD45 gemessen. Die isolierte Zellpopulation, die mittels MACS aufgereinigt wurde, zeigte 10,8 % CD11b + und 8,5 % CD45low+ Zellen, während von der Zellpopulation, + die mittels Dichtegradientenzentrifugation separiert wurde, 84,3 % CD11b (Abb. 3) und 29,8 % CD45low+ exprimierten. 52 Ergebnisse Somit konnte zwar bei der Isolation mittels MACS eine geringfügig höhere Zellausbeute erzielt werden, jedoch war die Reinheit der mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnenen Zellen deutlich höher als bei der Isolation mit dem MACS. negativ CD11b Abbildung 3: Darstellung der CD11b+ Zellen nach Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation im Histogramm. Die X-Achse stellt den Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H) und die Y-Achse stellt die Zellzahl dar. Die Negativkontrolle (Isotypkontrolle, pink) lässt sich deutlich von den CD11b+ Zellen (türkis) abgrenzen. Für die Charakterisierung des Reaktionsprofils der Mikroglia in der Kultur wurden optimale Kulturbedingungen definiert. Als Kulturmedium wurde das Sato-Medium (Kap. 2.1.2) verwendet, welches in der Literatur zur Isolierung von Mikroglia aus einer Mischkultur erfolgreich benutzt wurde (KRUDEWIG 2006). Das Sato-Medium wurde mit und ohne Zugabe von Monozytenkolonie-stimulierendem Faktor (m-csf) eingesetzt und die Mikroglia in Bezug auf Vitaliät mit der Zählkammer nach Türk und der Immunphänotyp im Durchflußzytometer evaluiert. Die isolierten Zellen wurden insgesamt neun Tage in Kultur gehalten. Die Mediumwechsel fanden an Tag 1, 3 und 8 nach der Aussaat statt. An Tag 6 (Tab. 2) und 9 (Tab. 3) wurde die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD18 gemessen. 53 Ergebnisse Tabelle 2: Expression von CD11b und CD18 auf Zellen nach sechs Tagen in Kultur mit Sato-Medium + / - m-csf Isolationsmethode Kulturmedium CD11b CD18 MACS Sato-Medium - m-csf 9,4 % 14,0 % MACS Sato-Medium + m-csf 18,1 % 8,1 % Dichtegradienten – zentrifugation Sato-Medium - m-csf Dichtegradienten – zentrifugation Sato-Medium + m-csf kontaminiert 31,3 % 34,0 % Tabelle 3: Expression von CD11b und CD18 auf Zellen nach neun Tagen in Kultur mit Sato-Medium + / - m-csf Isolationsmethode Kulturmedium CD11b CD18 MACS Sato-Medium - m-csf 12,1 % 84,3 % MACS Sato-Medium + m-csf 2,7 % 43,9 % Dichtegradienten – zentrifugation Sato-Medium - m-csf Dichtegradienten – zentrifugation Sato-Medium + m-csf kontaminiert 42,6 % 48,1 % Die mittels Dichtegradientenzentrifugation separierten Zellen in Sato-Medium ohne m-csf konnten ab Tag sechs aufgrund von bakteriellem Wachstum in den Kulturflaschen nicht mehr evaluiert werden. Wie aus Tabelle 2 und 3 ersichtlich, ist der Anteil CD11b und CD18 exprimierender Zellen, die mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden, deutlich höher als der Anteil derer, die mittels MACS aufgereinigt wurden. Daher ist davon auszugehen, dass die Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender Kultivierung im Sato-Medium + m-csf eine bessere Methode darstellt als die Isolation mit dem MACS und der Kultivierung mit Sato-Medium - m-csf. 54 Ergebnisse Um die Reinheit der isolierten Zellpopulation für die Etablierung einer MikrogliaReinkultur zu optimieren, wurde in einer nächsten Fragestellung evaluiert, ob eine auf die Dichtegradientenzentrifugation folgende MACS (DG + MACS) in einer effektiveren Aufreinigung dieser Zellpopulation resultiert. Zudem wurde die Kultivierung der Zellen in zwei verschiedenen Medien untersucht, in Sato-Medium mit m-csf und in Phenolrot-freiem Microglia Medium (MM-prf). Die Zellen wurden inklusive dem Tag der Isolation täglich auf ihre Zellzahl pro ml, ihre Vitalität und die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD18 im Durchflußzytometer untersucht. Die Anzahl und Vitalität der Zellen wurden mittles Zählkammer nach Türk unter Zugabe von TO-PRO-3 bestimmt. Es erfolgte jeden Tag ein Mediumwechsel. Die Zellen wurden insgesamt 4 Tage in Kultur gehalten. 29 g Gehirnmaterial eines Hundes wurde auf zwei Ansätze mit je 14,5 g Gehirnmaterial aufgeteilt. Aus einem der beiden Ansätze wurden die Mikrogliazellen mittels DG + MACS isoliert und aufgereinigt, während die Mikroglia aus dem anderen Ansatz lediglich mittels MACS separiert wurden. Der erste Ansatz mit DG + MACS lieferte am Tag der Isolation eine Zellzahl von 1,2 x 10 6 Zellen/ml mit einer Vitalität von 62 %, wobei der zweite Ansatz mit Isolation via MACS eine Zellzahl von 2,0 x 106 Zellen/ml mit einer Vitalität von 50 % ergab. Von den mittels DG + MACS isolierten Zellen aus dem Gehirnmaterial zeigten 45,3 % eine Expression von CD11b und 49,7 % exprimierten CD18. Bei den mittels MACS isolierten Zellen war der Anteil CD11b- und CD18-exprimierender Zellen niedriger; es wiesen 12,1 % eine Expression von CD11b und 44,8 % eine Expression von CD18 auf. An Tag 1 in Kultur wurden bei den mittels MACS isolierten und in MM-prf kultivierten Zellen mehr CD11b- und CD18-positive Zellen gemessen (Tab. 4), im Vergleich zu den Ergebnissen am Tag der Isolation. Wenn man die Kulturmedien der Isolationsmethode DG + MACS vergleicht, dann ist das MM-prf als Kulturmedium besser geeignet, da mehr Zellen CD11b und CD18 exprimieren im Vergleich zum Sato-Medium (Tab. 4). Zudem ist auch in dieser Kombination aus Isolationsmethode und Kulturmedium die Vitalität der Zellen am höchsten und die Zellzahl ist nur bei der mittels MACS isolierten Zellen mit Sato + m-csf höher, allerdings mit deutlich niedriger Zellvitalität (Tab. 4). Aufgrund eines technischen Fehlers konnten die 55 Ergebnisse Zellen, welche mittels MACS isoliert und mit Sato + m-csf kultiviert wurden, am Tag eins in Kultur nicht weiter verwendet werden. Tabelle 4: Vergleich der Methoden DG + MACS und MACS zur Isolation von Mikrogliazellen aus Gehirnmaterial eines Hundes. Es wurde die Expression von CD11b und CD18, die Vitalität sowie die Zellzahl pro ml an Tag 1 in Kultur in zwei verschiedenen Kulturmedien, Sato + m-csf und MM-prf untersucht. Isolationsmethode Kultur medium CD11b CD18 Vitalität Zellzahl DG + MACS Sato + m-csf 8,0 % 57,7 % 23,7 % 2,5 x105/ml DG + MACS MM-prf 27,7 % 59,6 % 41,8 % 4,4 x105/ml MACS Sato + m-csf 31,1 % 5,1 x105/ml MACS MM-prf 35,8 % 2,8 x105/ml n.m. 29,1 % 58,2 % Es gelang nicht, die isolierten Mikrogliazellen länger als 24 Stunden in Kultur zu halten. An Tag 2, 3 und 4 konnten keine CD11b + oder CD18+ Zellen im Durchflusszytometer detektiert werden. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde im Folgeversuch der Untersuchungszeitraum auf die ersten 24 Stunden nach Isolation festgelegt. Die besten Ergebnisse zur Isolation von Mikroglia aus Gehirnmaterial wurden mit der Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation und einer Kultivierung der Zellen in dem Kulturmediums MM-prf erziehlt, da in dieser Kombination der höchste Prozentsatz an CD11b- und CD18-positiven Zellen (Abb. 4), sowie die zweithöchste Zellzahl pro ml mit prozentual den meisten vitalen Zellen ermittelt wurde. 56 Ergebnisse CD11b negativ CD18 Abbildung 4: Darstellung der CD11b+ und CD18+ Zellen nach Dichtegradientenzentrifugation und MACS-Separation im Histogramm. Die X-Achse stellt den Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H) und die Y-Achse die Zellzahl dar. Die Negativkontrolle (pink) lässt sich deutlich von den CD11b + Zellen (türkis) und CD18+ Zellen (blau) abgrenzen. Zur Untersuchung des Reaktionsprofils der Mikroglia nach Staupevirusinfektion ergab sich die nächste Fragestellung, ob sich Mikrogliazellen in vitro mit Staupeviren infizieren lassen. Dazu wurden die Mikroglia aus 61,6 g Gehirnmaterial eines Hundes mittels Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation isoliert. Dies resultierte in einer Gesamtzellzahl von 1,56 x 10 6 Zellen/ml. Um Unterschiede im Reaktionsprofil der Mikroglia in Abhängigkeit des verwendeten Staupevirusstamms zu evaluieren, wurde die isolierte Zellmenge auf drei Ansätze verteilt. Im ersten Ansatz wurden 5,2 x 10 5 Zellen mit 0,1 MOI des Staupevirusstammes R252 und im zweiten Ansatz wurden 5,2 x 10 5 Zellen mit 0,1 MOI des Staupevirusimpfstamms Onderstepoort hinzugefügt. Der dritte Ansatz war die Negativkontrolle und zu 5,2 x 10 5 Zellen wurde HBSS-Lösung hinzu gegeben. Alle drei Ansätze wurden für eine Stunde inkubiert. Nach dem Inkubationsende (Stunde 0), sowie nach 2, 4 und 6 Stunden wurde die Expression von CD18 und CD45low mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Tab. 5). 57 Ergebnisse Tabelle 5: Anteil CD18- und CD45low-exprimierender Zellen direkt nach Inkubationsende, sowie 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende. Infektion der Zellen Stunden nach Inkubationsende 0 2 4 6 CD18 CD45low CD18 CD45low CD18 CD45low CD18 CD45low HBSS (Ktr) 90 % 4% 67,3 % 3,5 % 64,4 % 7,5 % 45,4 % 2,9 % OND 86,5 % 3,5 % 44,3 % 2,6 % 73,7 % 3,7 % 71,4 % 3,4 % R252 90,9 % 4,5 % 69,2 % 3,8 % 91,7 % 3,9 % 72,5 % 3,4 % Oberflächenmarkers CD18, Die Expression des gemessen direkt nach Inkubationsende (Stunde 0), liegt im Mittel bei 89 % und die Expression des Oberflächenmarkers CD45low bei 4%. Zwei Stunden nach Inkubationsende wurde eine 30 % geringere CD18-Expression im Vergleich zur Stunde 0 gemessen (mw = 60,3 %), wobei die Messwerte einer größeren Streuung unterlagen. Die mit OND-inkubierten Zellen exprimierten CD18 zu ca. 20 % weniger als die mit R252-inkubierten Zellen und die Ktr (Tab. 5). Im Vergleich zur Stunde 2 stieg vier Stunden nach Inkubationsende die CD18-Expression um 29,4 % bei den ONDinkubierten Zellen und um 22,5 % bei den R252-inkubierten Zellen an, während bei der Ktr die CD18-Expression um 2,9 % sank. Sechs Stunden nach Inkubationsende sank die CD18-Expression in der Ktr sowie bei den R252-inkubierten Zellen um ungefähr 20 %, nur bei OND-inkubierten Zellen sank die Prozentzahl der CD18-exprimierenden Zellen um 2,3 %. Bei Betrachtung der vier Messzeitpunkte ist die CD45low-Expression der Zellen nicht durch die Infektion mit den Virusstämmen beeinflusst worden, da der Prozentsatz der CD45low-positiven Zellen in allen Gruppen (Ktr, OND, R252) über die gesamte Zeitspanne ungefähr gleich blieb (mw = 3,9 %, + 3,6 %, - 1,3 %). Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die Zellen aus der Ktr direkt nach Inkubationsende zu 90 % CD18 exprimierten, es aber im Verlauf der sechs Stunden zu einem Abfall der CD18-Expression um 44,5 % kam. Die Prozentzahl der CD18-exprimierenden Zellen bei den OND- und R252-inkubierten Zellen sank zwar 58 Ergebnisse auch über den Zeitraum von sechs Stunden ab, allerdings nur um 15,1 % bei den OND- und 18,4 % bei den R252-inkubierten Zellen. Um nachzuweisen, dass eine Infektion der Mikrogliazellen mit dem R252- oder dem OND-Stauvirusstamm stattgefunden hat, wurde zudem jeweils eine Untersuchung auf Staupevirusantigen durchgeführt. Direkt nach Inkubationsende (Stunde 0) konnte bei keinem Ansatz CDV-Ag nachgewiesen werden. Bei den Mikroglia, die mit dem demyelinisierenden Virusstamm R252 inkubiert wurden, konnte zwei Stunden nach Inkubationsende in 2,3% der isolierten Mikroglia Staupevirusantigen intrazellulär nachgewiesen werden. Vier Stunden nach Inkubationsende stieg diese Zahl auf 2,8 % und 6 Stunden nach Inkubation auf 4,3 %. Bei den Mikroglia, die mit dem Virusimpfstamm Onderstepoort inkubiert wurden, konnte zu keinem Zeitpunkt der Messungen CDV-Ag detektiert werden. Die Ergebnisse dieses Versuchs beantworten die Fragestellung insoweit, dass keine ausreichende Infektion der isolierten Mikroglia - weder mit dem Impfstamm Onderstepoort, noch mit dem demyelinisierenden Virusstamm R252 - erzielt werden konnte. Die Expression von CD18 und CD45 low der isolierten Mikroglia waren jedoch über die gesamte Versuchszeit ausreichend hoch, so dass der Fokus des Untersuchungszeitraums auf die Stunden nach Inkubationsende richtig gewählt war. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des vorherigen Versuchs zu überprüfen, wurde der gleiche Versuchsansatz mit Isolation der Mikrogliazellen mittels Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation und Kultivierung mit MM-prf angewendet. Aus 60,4 g Gehirnmaterial eines Hundes wurde eine Zellzahl von 1,7 x 106 Zellen/ml isoliert. Vor der Infektion mit den Virusstämmem R252 und Onderstepoort wurden die Oberflächenmarker CD11b, CD18 und CD45 gemessen. Bei den isolierten Zellen lag die Expression des Oberflächenmarkers CD11b bei 60,8 %, während 91,6 % CD18- und 19,2 % CD45low positiv waren. Anschließend wurden die Zellen in drei Versuchsansätze aufgeteilt und wie im vorherigen Versuch mit 0,1 MOI des Impfstamms Onderstepoort oder mit 0,1 MOI des Virusstamms R252 infiziert. Zu den Zellen der Negativkontrolle wurde HBSS-Lösung hinzugefügt. Die Expression des Oberflächenmarkers CD18 wurde direkt nach Inkubationsende (Stunde 0), 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende mit dem Durchflusszytometer gemessen (Tab. 6). 59 Ergebnisse Tabelle 6: Anteil der CD18-exprimierenden Zellen direkt nach Inkubationsende, 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende. CD18-Expression Infektion der Zellen Stunde 0 Stunde 2 Stunde 4 Stunde 6 HBSS (Ktr) 96,6 % 70,5 % 86 % 47,7 % OND 98,4 % 94,5 % 95,2 % 70,5 % R252 94,6 % 94,5 % 91,6 % 90,9 % Direkt nach Inkubationsende (Stunde 0) exprimierten die isolierten Zellen CD18 zu 96,5 % (mw aller Versuchsansätze) unabhängig davon, ob sie mit R252, OND oder HBSS inkubiert wurden. Die mit R252 inkubierten Zellen zeigten kaum eine Veränderung in Bezug auf die Expression von CD18 im weiteren zeitlichen Verlauf und wiesen auch 2, 4, und 6 Stunden nach Inkubation eine Expression von über 90 % auf. Die mit OND inkubierten Zellen exprimierten CD18 in den ersten 4 Stunden nach Inkubationsende relativ konstant zwischen 94,5 % - 98,4 %, während nach 6 Stunden ein Abfall auf 70,5 % zu verzeichnen war. Die CD18-Expression der Ktr sank allerdings über die folgenden sechs Stunden im Vergleich zu den anderen Virusstämmen, so dass zum letzten Messzeitpunkt nur noch 47,7 % der Zellen CD18+ waren. Der intrazelluläre Nachweis des Staupevirusantigens wurde zu den oben bereits erwähnten Messzeitpunkten direkt nach Inkubationsende, sowie 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende gemessen. Bei der Ktr, aber auch bei den Zellen, die mit dem Impfstamm Onderstepoort inkubiert wurden, konnte zu keinem Messzeitpunkt CDV-Ag detektiert werden. Somit fand keine Infektion mit dem Onderstepoort statt. In der Zellpopulation, die mit dem R252 Virusstamm inkubiert wurde, konnte direkt nach Inkubationsende in 5,1 % der Zellen CDV-Ag nachgewiesen werden, 2 und 4 Stunden nach Inkubationsende wurde das CDV-AG in 6 % bzw. 5,8 % der Zellen detektiert. Sechs Stunden nach Inkubationsende wurde in 21,7 % der Zellen CDV-Ag detektiert. Somit konnte eine Infektion der Zellen mit dem Virusstamm R252 nachgewiesen werden, welche 6 Stunden nach Inkubationsende am höchsten war. Als Resultat der unterschiedlichen Fragestellungen kann festgehalten werden, dass für das Gewinnen einer möglichst reinen Population kaniner Mikroglia aus 60 Ergebnisse Gehirnmaterial die Methode der Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender MACS-Separation die besten Ergebnisse lieferte. Für die Kultivierung der Mikroglia in Reinkultur konnten bessere Ergebnisse mit dem Kulturmedium MM-prf erzielt werden im Vergleich mit dem Sato-Medium. Die Kultivierung von Mikrogliazellen in der Reinkultur stellt sich als sehr schwierig da und es war nicht möglich, die Zellen länger als 24 Stunden in der Kultur zu halten. Eine Infektion der kultivierten Mikrogliazellen mit dem Staupevirusstamm Onderstepoort war nicht erfolgreich, mit dem Virustamm R252 war jedoch eine Infektion nachweisbar, die nach 6 Stunden Inkubation die höchste Infektionsrate aufwies. Die Zellzahl der R252-infizierten Mikroglia war nicht ausreichend hoch, um ihr Reaktionsprofil nach Infektion mit CDV zu evaluieren. Neben der Aktierung der Mikroglia werden auch Monozyten aus dem peripheren Blut in das ZNS rekrutiert (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991a, b). Sobald die Monozyten in das ZNS eingewandert sind, ist eine Differenzierung von der ansässigen Mikroglia schwer möglich. Ihr funktionalen Eigenschaften, wie die Produktion von ROS, Antigen-Präsentation und Phagozytose sind vergleichbar mit denen der Mikroglia, jedoch ist ihr Einfluß auf die Pathogenese der CDV-Infektion nicht bekannt. Zur Evaluierung ihres Einflusses auf das Immunsystem im Rahmen der akuten Staupevirusinfektion wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit Monozyten aus dem peripheren Blut in vitro mit dem Onderstepoort und dem R252- Staupevirusstamm infiziert und ihre ROS-Produktion und CD14-Expression zu evaluiert. 61 Ergebnisse 4.2 REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION IS SUPPRESSED IN CANINE DISTEMPER VIRUS INFECTED MONOCYTES USING A VIRULENT STRAIN Maren Martin1, Regina Carlson1, Wolfgang Baumgärtner2, Andrea Tipold1, and Veronika M. Stein1 1 Department of Small Animal Medicine and Surgery, 2Department of Pathology, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany Corresponding author: Maren Martin Department of Small Animal Medicine and Surgery University of Veterinary Medicine Hannover Buenteweg 9 D-30559 Hannover Germany Tel. 0049-511-953-6200 Fax 0049-511-953-6204 E-Mail: [email protected] 62 Ergebnisse ABSTRACT Canine distemper virus (CDV) infection induces immunosuppression. Microglia cells are shown to be activated and generate reactive oxygen species (ROS) which might represent one mechanism of virus clearance leading simultaneously to demyelination in the central nervous system (CNS). CDV infection causes recruitment of peripheral blood monocytes to the CNS to become tissue macrophages. In this environment they show effector functions such as phagocytosis and ROS generation which makes them indistinguishable from microglia. However, their contributing role to the pathogenesis of virus clearance and demyelination is so far not defined. Therefore, monocytes were isolated with density gradient centrifugation from 10 mL of whole blood from 10 healthy Beagle dogs and infected with either an attenuated CDV vaccination strain (Onderstepoort, OND) or a virulent CDV strain (R252). The expression of CD14 and the ROS generation were measured directly and 3 hours post infection (p.i.) by flow cytometry. Non-infected monocytes were used as negative control (ctr). Both CDV strains were capable to infect the isolated monocytes but the percentages and the virus load were significantly lower with the OND (mv = 32.5%) compared to the R252 strain (mv = 61.2%). The expression of CD14 was approximately 20% higher in the infected monocytes (OND mv = 71.6%, R252 mv = 68.9%) compared to the ctr (mv = 50.3%). Furthermore, the CD14 expression intensity was significantly up-regulated in CDV-infected monocytes compared to the ctr (3 hours p.i., OND: 4.9fold, R252: 4.7fold). CDV infection of peripheral blood monocytes results in a distinct ROS generation, but interestingly, CDV-infected monocytes synthesized significantly less ROS than the non-infected ctr. Intriguingly, the virulent R252 strain generated less ROS than the attenuated OND which might represent a possible mechanism for the virulent strain to escape the immune surveillance and pave the way to enter the CNS which can result in virus persistence. Keywords: monocytes, canine distemper virus infection (CDV), pathogenesis, reactive oxygen species (ROS), CD14, demyelination 63 Ergebnisse INTRODUCTION Canine distemper virus (CDV) belongs to the genus morbillivirus and infects carnivores worldwide (Deem et al., 2000; Pringle, 1999). Primary virus replication is seen in the cells of the immune system which leads to apoptosis and therefore to massive immunosuppression and leucopenia (Kumagai et al., 2004; McCullough et al., 1974; Schobesberger et al., 2005). In a second step the virus spreads via haematogenous pathways to the gastrointestinal tract, the urogenital tract and to the respiratory system (Appel, 1969; Okita et al., 1997). The virus enters the central nervous system (CNS) mainly haematogenously as free virus particles or bound to thrombocytes and lymphocytes (Krakowka, 1989; Krakowka et al., 1987). Other pathways for entering the CNS are through endothelial cells of the meninges (Bäumgartner et al., 1989) or the liquor cerebrospinalis (Vandevelde et al., 1985). Once in the CNS, the virus induces activation of the microglia cells which will change their functionality and immunophenotype (Stein et al., 2004b), they release reactive oxygen species (ROS), start phagocytosis and act as antigen presenting cells through expression of MHC and CD1c (Stein et al., 2004b). Although, ROS is essential for defence and repair mechanisms (Gilgun-Sherki et al., 2004) it can also be cytotoxic once released in a vulnerable environment such as the CNS. It therefore causes degeneration of oligodendrocytes as innocent bystanders (Stein et al., 2004b) resulting in damage to the myelin sheath (Griot et al., 1990). CDV infection recruits peripheral blood monocytes to migrate into the CNS and become macrophages to support the immune response of microglia (Griot-Wenk et al., 1991a, b; Wisniewski et al., 1972). Viral infections in general lead to activation of monocytes through a CD14/TLR4dependent pathway associated with pro-inflammatory cytokine production such as interleukin (IL-) 1β, IL-6, and tumor necrosis factor (TNF)-α to further activate the innate immunity (Rolland et al., 2006). It has been shown that monocytes of in vivo CDV-infected dogs present an increased expression intensity of the surface molecules CD1c, B7-2, MHC I, and CD11b, all of which play an important role in the host´s immune response (Stein et al., 2008). The percentage of CD14-positive monocytes was generally increased in the acute phase of the infection. However, in the dogs with severe neurological signs and demyelinating lesions in the CNS the CD14 expression was about 30% lower compared to monocytes of dogs with only 64 Ergebnisse mild clinical signs without histopathological lesions in the CNS and of the noninfected control group. Therefore, the percentage of CD14-expressing monocytes reflects the activation state of the innate immune system (Stein et al., 2008) and leads to the assumption that CDV infection of the CNS with a virulent strain results in immunosuppression and reduced virus clearance. The aim of our study was to prove the hypothesis that CDV-infected monocytes are capable to generate ROS. It should be evaluated to what extent the possible ROS generation can lead to systemic cell damage and after recruitment to the CNS may contribute to immunosuppression and virus clearance in the acute phase of CDV infection. Furthermore the ability to generate ROS was compared between two CDV strains of different virulence. MATERIAL AND METHODS Animals Whole blood samples of 10 mL of ten healthy one to six-years-old Beagle dogs were taken from the V. cephalica antebrachii or V. saphena lateralis by sterile venipuncture into heparinised tubes. The dogs were examined regularly and results of general examination as well as total blood count were unremarkable. All animal experiments were performed according to national regulations for animal welfare (animal experiment number 33.9-42502-05-12A275). Antibodies R-Phycoerythrine (PE)-conjugated primary monoclonal antibody (mAbs) against the cell surface marker CD14 (Clone TÜK4, DakoCytomation, Glostrup, Denmark) was used to identify the isolated monocytes together with their morphological characteristics. R-Phycoerythrine conjugated mouse immunoglobulin G2a (Clone PPV-04, Immunotools, Friesoythe, Germany) was used for the isotype control. The murine mAb D110 from harvesting cell culture supernatant (Bollo et al., 1986) was used for detection of the CDV nucleocapsid protein. The antibody binds to the nucleocapsid protein which is resistant to tissue fixation and embedding procedures. 65 Ergebnisse Non-specific bindings were blocked using human normal immunoglobulin G (IgG) (Human TrueStain FcX, BioLegend Inc., San Diego, USA) following the manufacturer’s instructions. The labelled cells were evaluated by flow cytometry (FACS) analysis. Virus strains The virulent CDV-strain R252 (R252, kindly provided by Dr. S. Krakowka) and the attenuated vaccine strain Onderstepoort (OND, kindly provided by Dr. von Messling). Both viruses were cultivated in vero cells in a pathogen-free environment and stored at -80 °C. Isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) Immediately following sampling, density gradient centrifugation with Histopaque (density 1.119, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) and Pancoll (density 1.077; PAN BIOTECH GmbH, Aidenbach, Germany) (Somberg et al., 1992; Wunderli and Felsburg, 1989) was performed at 700 x g for 30 minutes at room temperature with the blood diluted in phosphate buffered saline (ratio 1:1; PBS). Mononuclear cells were collected from the interphase between plasma and Pancoll and washed three times with PBS. After the last washing step the cells were infected with either the attenuated OND or the virulent R252 CDV strain, both at 0.1 multiplicity of infection (MOI). The negative control (ctr) was incubated with Hanks´ buffered saline solution (HBBS, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany). The cells (ctr, Ond-infected, R252-infected) were evaluated by flow cytometry for their CD14 expression, CDV content, and ROS generation after incubation for one hour (directly post infection, p.i.) and for additional three hours (37°C and a carbon dioxide level of 5%; 3 h p.i.). These points of measurement were chosen because preliminary testing showed that cultivation past three hours resulted in a decrease of cell viability. Before the FACS measurement, the cells were washed three times with HBSS, centrifuged at 170 x g for ten minutes each at room temperature. 66 Ergebnisse Flow cytometry Analysis of the flow cytometry data was performed with the Cell-Quest-Software (Becton and Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany). Monocyte and lymphocyte populations were differentiated by their size (forward scatter, FSC) and complexity (side scatter, SSC). Detection of the surface molecule CD14 Membrane immunofluorescence for detection of CD14 on monocytes was performed as previously described (Stein et al., 2008). Fc-receptor blockade was attained using human IgG. Primary labelled PE-conjugated CD14 mAb (dilution of 1:8), the isotype (dilution of 1:5) and the negative control (HBBS) were incubated for 20 minutes at 4°C. After washing once with HBBS and centrifugation at 300 x g for ten minutes at 10°C the cells were resuspended in FACS flow solution (Becton and Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany) with TO-PRO-3 (dilution of 1:1.000, Molecular probes, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) to assess cell viability and measured directly using a FACSCalibur™ (Becton and Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany). Each dog was evaluated separately by flow cytometry to reveal percentages of CD14-expressing monocytes as well as CD14 expression intensities (mfi; measured by means of fluorescent channel numbers) for ctr, OND, and R252 at the two described time points (directly p.i. and 3 h p.i.). For each sample 104 live-gated events were analysed. The analysis gate of the negative control was adjusted not to exceed a 2% cut-off of positive staining. Detection of CDV infection of monocytes Intracellular detection of CDV in monocytes was performed as previously described (Cherpillod et al., 2000). After fixation with 4% paraformaldehyde the monocytes were incubated for 20 minutes at 4°C and washed twice with PBS and centrifuged at 250 x g for ten minutes at 10 °C. The cell membrane was permeabilized with 150 µl of 0.03 % PBS-Saponin-solution (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) followed by Fc-receptor blockade using human IgG. 3.125 µL of the 67 Ergebnisse primary antibody D110 (in a dilution of 1:16) was added and incubated for 30 min at 4°C. After two washing steps with 0.03% PBS-Saponin-solution and centrifugation at 250 x g for five minutes at 10 °C secondary goat-anti-mouse PE-conjugated IgG antibody (in a dilution of 1:50) was added to all samples and incubated again for 30 minutes at 4 °C. Following two last washing steps with 0.03% PBS-Saponinsolution and centrifugation at 250 x g for five minutes at 10 °C, the cell pellet was resuspended in FACSFlow solution and measured immediately by flow cytometry using FACSCalibur™. For each sample 10 4 live-gated events were analysed and using the Cell-Quest-Software the percentage of CDV-positive monocytes and the virusload (measured by means of fluorescent channel numbers; mfi) where assessed for ctr, OND-, and R252-infected cells at the two time points (directly p.i. and 3 h p.i.) The negative control was adjusted not to exceed a 2% cut-off of positive staining in the analysis gate. Detection of ROS production in monocytes Detection of ROS production of monocytes was performed as previously described for microglia cells (Stein et al., 2004b). For evaluation of the ROS production of infected monocytes the cells were triggered with phorbol myristate acetate (PMA, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) whereas the control received PBS. The test was performed in duplicates and mean values were assessed. 90 µL of cell suspension was filled into each tube and incubated for 15 minutes at 37°C with a carbon dioxide level of 5%. Either 10 µL PMA (diluted in dimethylsulfoxid to a concentration of 1 mmol and further diluted in PBS to a final concentration of 100 nmol) or 10 µL PBS were added and the cells again incubated for 15 minutes at 37°C. Following incubation, 20 µL of the non-fluorescent dihydrorhodamin 123 (DHR; 1.5 mg/mL diluted in dimethylsulfoxid and further diluted in PBS to a concentration of 15 µg/mL; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) was added, followed by another incubation step. Cells were then placed on ice for 15 minutes, FACS flow solution with TO-PRO-3 was added, and finally the cells were measured by flow cytometry using FACSCalibur™. For each sample 10 4 live-gated events were analysed. The percentage of ROS generating monocytes and ROS generation intensity measured by means of fluorescent channel numbers) were 68 Ergebnisse assessed with the Cell-Quest-Software for the ctr, OND- and R252-infected cells at the two time points (directly p.i. and 3 h p.i.) seen as a shift in FL-1. The negative control received PBS instead of PMA and DHR. Statistics Statistics were performed using SAS version 9.2. (SAS Institute Heidelberg, Germany). Spearman´s rank correlation coefficient was calculated to evaluate any correlation between the different features of the infected monocytes; a value of p < 0.05 was considered significant. A one-way variance analysis as well as a twoway variance analysis was performed using the global F-test to compare the results of the ctr, OND-, and R252-infected cells and the two time-points of testing (p.i. and 3 h p.i.). The f-distribution was considered significant if f < 0.05. To evaluate the details of that analysis a Student’s t-test was performed, where p < 0.05 was considered significant. RESULTS Immunophenotypical characterization of monocytes during CDV infection CDV infected monocytes (OND and R252) showed a significantly up-regulated expression and expression intensity of CD14. The percentages of CD14-expressing monocytes was approximately 20% higher compared to the non-infected control directly p.i. (ctr: mv = 50.3%, OND: mv = 71.6%; R252: mv = 68.9%, p = 0.0002 and 0.0004, respectively) and 3 h p.i. (ctr: mv = 42.4%; OND: mv = 67.6%; R252: mv = 65.4%, p = 0.0263 and 0.0066, respectively). In the CDV-infected monocytes also the CD14 expression intensities were 2.5-fold higher directly p.i. (ctr: mv = 659; OND: mv = 1621; R252: mv = 1648, p = 0.0019 and 0.0004, respectively) and 4.8-fold higher 3 h p.i. (ctr: mv = 289; OND: mv = 1424; R252: mv = 1379, p = 0.0008 and 0.0003, respectively) compared to the non-infected control (see Fig. 1). 69 Ergebnisse Detection and virus load of CDV in canine monocytes Monocytes could be experimentally infected with both CDV strains. OND virus could be detected in 33% of the monocytes directly p.i. and 23% 3 h p.i. whereas R252 was demonstrated in 61% directly p.i. and 50% 3 h p.i. Therefore, the virulent R252 strain infected significantly more monocytes than the attenuated OND (p = 0.0475; see Fig. 2). The virus load of the R252-infected monocytes directly p.i. was 2.3fold higher than the one of the OND-infected monocytes (R252 mfi: mv = 108.2; OND mfi: mv = 247.7, p = 0.0108) and 2.9fold higher 3 h p.i. (R252 mfi: mv = 88.9; OND mfi: mv = 259.2) (see Fig. 2). ROS-production in CDV infected monocytes Without triggering only a low percentage of monocytes produced ROS directly p.i. (ctr: mv = 5.6%; OND: mv = 4.0%; R252: mv = 3.7%) whereas a much higher percentage of the monocytes produced ROS after triggering with PMA (ctr: mv = 37.2%; OND: mv = 40.0%; R252: mv = 41.4%). Directly p.i. the ROS-generation was significantly higher in the OND-infected monocytes in comparison to the ctr. (p = 0.0109). At 3 h p.i., monocytic ROS generation was approximately 42% (mv of all groups) without triggering (ctr: mv = 35.4%; OND: mv = 45.0%; R252: mv = 46.4%) and was not further enhanced by triggering with PMA (ctr: mv = 44.2%; OND: mv = 43.6%; R252: mv = 41.6%). The ROS generation intensity was low in the non-triggered monocytes directly p.i. (ctr mfi: mv = 198; OND mfi: mv = 163; R252 mfi: mv = 154) and enhanced after triggering (ctr mfi: mv = 781; OND mfi: mv = 514; R252 mfi: mv = 474). Three hours p.i. the ROS generation intensity was even lower in the non-triggered monocytes (ctr mfi: mv = 131; OND mfi: mv = 97; R252 mfi: mv = 107) compared to directly p.i. but higher in the triggered monocytes (ctr mfi: mv = 1252; OND mfi: mv = 933; R252 mfi: mv = 428) compared to directly p.i. (see Fig. 3). The ROS generation intensity is significantly higher in the control compared to the R252-infected triggered monocytes directly p.i. and 3 h p.i. (p = 0.0463 and p = 0.0431, respectively). 70 Ergebnisse In OND-infected monocytes the up-regulated expression of CD14 correlated with the up-regulated percentage of ROS-producing monocytes after PMA triggering directly p.i. (p = 0.036). The increased virus load of R252-infected monocytes directly p.i. correlated with the elevated percentage of ROS-generating non-triggered monocytes (p = 0.0366). DISCUSSION Acute canine distemper virus infection leads to immunosuppression and demyelination in the CNS (Vandevelde et al., 1982). In this process microglia cells are activated and act as antigen presenting cells through their MHC-molecules and their surface molecule CD1c. They futhermore stimulate T-cell activation and enhance their ROS generation (Stein et al., 2004a). Microglial generation of ROS could play an important role in the pathogenesis of demyelination (Stein et al., 2004b). During the course of the CDV infection peripheral blood monocytes were recruited to invade the CNS to support microglia cells in their defence against invaders (Griot-Wenk et al., 1991a, b; Wisniewski et al., 1972). Following their crossing of the blood-brain-barrier monocytes transform into macrophages which makes them hardly distinguishable from microglia since their immunophenotype adapts to microglia cells. However, not much is known about ROS generation of CDV-infected peripheral blood monocytes. Therefore, the aim of this study was to prove the hypothesis that peripheral blood monocytes have the capacity to generate ROS and whether different CDV strains may influence the extent of the ROS generation. The isolated monocytes were identified in flow cytometry by their morphology concerning size and complexity and their expression of CD14. They were infected by two different CDV strains: the attenuated OND which is known not to cause any neurological lesions in the CNS (Stettler et al., 1997) and the R252 which is known to cause demyelinating lesions in the CNS (Summers et al., 1984). An infection of the monocytes with either OND or R252 induced an up-regulation of the CD14 expression as well as an enhanced CD14 expression intensity. The CD14 expression intensity was higher 3 h p.i. compared to directly p.i. Although another CDV strain was used (A75/17), an up-regulation of CD14 expression on monocytes 71 Ergebnisse was also found in a longitudinal study with in vivo CDV infected dogs (Stein et al., 2008). The up-regulation of the percentage of CD14 + monocytes was noted in the second week p.i. and remained constant until the end of the experiment (5 weeks p.i.). Therefore, in that study differences in CD14 expression were not evaluated within the first hours post CDV infection. Interestingly, the group of dogs with no or only mild clinical signs and no CNS lesions showed 74% CD14 + monocytes whereas in the group of dogs with severe clinical signs and demyelinating lesions in the CNS only 54% were CD14+. Both virus strains were able to infect the isolated monocytes but the percentage of infected monocytes and virus load of the R252-infected monocytes was twice as high as the OND-infected monocytes p.i. and 3 h p.i.. The infection of the two different strains modulates the CD14 expression and the ROS generation. Initiation of the CD14/TLR4 dependend pathway is necessary for activating the innate immunity. The results of the study show that ROS is generated by CDV-infected peripheral blood monocytes but depending on the virus strain the extent of ROS generation is different. Whereas infection with the vaccine strain OND results in a generous ROS generation, the ROS generation of the R252-infected monocytes seems to be restricted. ROS can cause oxidative damage to proteins, lipids and nucleic acids (Gilgun-Sherki et al., 2004) which might result in neurodegeneration (Lu et al., 2000). Therefore, also small amounts of ROS have to be seen critical in the vulnerable environment of the CNS. Interestingly, the demyelinating strain R252 just mildly triggers the monocytes to generate ROS which results in a higher chance to escape the immune system and enter the CNS but once there the small amount of ROS might be enough to cause damage to the oligodendrocytes because of their specific vulnerability for ROS (Griot et al., 1990). Another interesting finding is that the percentage and the virus load of R252-infected monocytes in comparison to the OND-infected monocytes is twice as high but the ROS production is decreased in the R252-infected monocytes. Decreased ROS generation will lead to reduced virus clearance and enable the possibility of escaping the immune system to cause virus persistence. 72 Ergebnisse This feature supports findings of other studies that virulent CDV strains show the ability to cause viral persistence in the CNS (Zurbriggen et al., 1995a; Zurbriggen et al., 1995b). The generous ROS generation of the vaccine strain OND activates the immune system so antibodies will be produced to eliminate CDV infection in the ongoing life of a dog. Monocytes can activate the innate immunity through the CD14/TLR4-dependent pathway to fight viral infections (Rolland et al., 2006). Although this mechanism is aimed at elimination of the virus, the activation can result in triggering neurodegeneration (Lehnardt et al., 2003). It has been reported that patients suffering from multiple sclerosis, which is a demyelinating neurodegenerative disease in humans, show an increase of CD14 to trigger the innate immunity (Brettschneider et al., 2002). Since monocytes are recruited to migrate into the CNS in case of a CDV infection to explore there potential to generate ROS, they could play a crucial part in the pathogenesis of demyelination in the CNS, probably even to a higher degree than microglia. Conclusions This study confirms that CDV infection triggers peripheral blood monocytes to generate ROS, so once recruited to the CNS there ROS generation may play a pivotal role in the pathogenesis of demyelination in acute canine distemper virus infection. Otherwise, the extent of ROS generation depends on the virus strain and interestingly, the virulent strain R252 triggers less ROS generation than the attenuated OND strain and is below the ROS generation potential of non-infected monocytes. The suppression of monocytic ROS generation could be a mechanism for virus persistence in the CNS. 73 Ergebnisse ACKNOWLEDGEMENTS The study was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (FOR 1103/TI 309/4-1). The authors thank Dr. Martin Beyerbach, Department of Biometry, Epidemiology, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany for the support with the statistical analysis. 74 Ergebnisse REFERENCES Appel, M.J., 1969, Pathogenesis of canine distemper. 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Detection of CDV-antigen in monocytes directly p.i. (a) and 3 h p.i. (b) in the non-infected ctr (dottet box) compared to OND (white box) and R252 (grey box) infected monocytes. Virus load measured by mean fluorescence intensity of the intracellular CDV-antigen measured directly p.i. (c) and 3 h p.i. (d) in the ctr, as well as the OND, and R252 infected monocytes. The boxplots display minimums and maximums, lower and upper quartiles, and medians. The percentage of infected monocytes as well as the virus load of the R252 infected monocytes is twice as high as the OND infected monocytes measured directly p.i. as well as 3 h p.i. The up-regulation is significant for the percentage of infected monocytes directly p.i. (p = 0.0475) and the virus load directly p.i. (p = 0.0108). 80 Ergebnisse Fig. 3. The cell count of the isolated monocytes on the abscissa and intensity of ROS generation measured by mean fluorescence intensity (log values) in flow cytometry on the ordinate. Measurements were performed directly p.i. (a, b) and 3 h p.i. (c, d) for the ctr (dottet box), and OND (white box) and R252 (grey box) infected monocytes. The ROS generation was measured in non-triggered (a, c) and PMA triggered (b, d) monocytes. The boxplots display minimums and maximums, lower and upper quartiles, and medians. The ROS generation intensity is higher in the triggered monocytes compared to the non-triggered monocytes and is enhanced at 3 h p.i.. The ROS generation intensity of PMA triggered monocytes infected with R252 was significantly lower compared to the control directly p.i. (p = 0.0463) and 3 h p.i. (p = 0.0431). The ctr displays the highest ROS generation intensity after triggering with PMA directly p.i. and 3 h p.i. whereas R252 shows the lowest ROS generation intensity. 81 Übergreifende Diskussion 5 Übergreifende Diskussion Die Pathogenese der Demyelinisierung bei der akuten Staupevirusinfektion beim Hund ist noch nicht abschließend geklärt, jedoch wird den Mikroglia eine entscheidende Rolle zugesprochen (STEIN et al. 2004b). Im Rahmen der CDV-Infektion werden Monozyten ins ZNS rekrutiert, um die Immunabwehr zu unterstützen (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991a, b). Welchen Einfluss allerdings die rekrutierten Monozyten aus dem peripheren Blut auf die Entstehung der Demyelinisierung haben, ist bis dato nicht bekannt. Um zur Aufklärung dieser Fragestellung beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Methodik zur Isolierung und Kultivierung kaniner Mikroglia untersucht und zum anderen in vitro CDV-infizierte Monozyten des peripheren Blutes charakterisiert. Das Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war, die Methode zur Isolierung kaniner Mikroglia nach Stein et al. (2004a) an nicht-pathologisch veränderten Gehirnen anzuwenden und zu optimieren, um eine Mikroglia-Reinkultur zu etablieren. Eine Reinkultur von Mikrogliazellen würde die Bearbeitung weiterer Fragestellungen ermöglichen, in denen gezielte Versuche zum Reaktionsprofil der Mikroglia ohne Einfluss anderer Zellen durchgeführt werden könnten. Zur Bearbeitung der Fragestellung eines optimierten Isolationsprotokolls zum Erlangen einer möglichst reinen Mikrogliapopulation wurden die Isolationsmethoden der Dichtegradientenzentrifugation und MACS-Separation angewendet und die Ergebnisse verglichen. Hierbei zeigte die Mikrogliapopulation, die mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurde, eine deutlich höhere Reinheit als die, die mittels MACS-Separation gewonnen wurde. Dafür war mit der MACS-Separation eine geringgradig höhere Zellzahl zu verzeichnen. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Versuchs wurde bei dem darauf aufbauenden Versuch eine Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender MACS-Separation angewendet und das Resultat mit der Isolationsmethode MACS-Separation verglichen. Durch eine Kombination beider Isolationsmethoden, der Dichtegradientenzentrifugation mit einer anschließenden MACS-Separation, wurde neben einer höheren Gesamtzellzahl zudem ein höherer Anteil CD11b+, CD45low+ und CD18+ Zellen gewonnen, was auf 82 Übergreifende Diskussion eine höhere Reinheit der isolierten Mikrogliapopulation hinweist, als durch eine Isolationmethode allein erreicht werden konnte. Die so gewonnene Mikrogliapopulation wurde zur Bearbeitung der nächsten Fragestellung nach der Verwendung des optimalen Zellkulturmediums in zwei verschiedenen Medien kultiviert und Unterschiede zwischen den Medien evaluiert. Die Kultivierung der Mikrogliazellen in Sato-Medium + m-csf resultierte in einer deutlich reduzierten Vitalität und Reinheit im Vergleich zu dem MM-prf-Kulturmedium. Ein weiterer Vorteil dieses Mediums stellt die deutlich längere Haltbarkeit und die wesentlich leichtere Herstellung dar, wodurch das Risiko für Kontaminationen verringert wird. Jedoch zeigte sich im zeitlichen Verlauf der Kultivierung ein starker Abfall der CD11b+, CD45low+ und CD18+ Zellen und wies darauf hin, dass die Auswahl des Mediums noch zu optimieren ist, um die Mikrogliazellen länger in Kultur halten zu können. Die hier angewendeten Konditionen erlaubten lediglich eine Untersuchung der Mikroglia innerhalb des ersten Tages in Kultur. Eine Studie hat gezeigt, dass Mikrogliazellen in der Mischkultur ein sehr gutes Wachstum aufwiesen, allerdings auch dort an Tag drei nicht mehr nachweisbar waren (ORLANDO et al. 2008). Auch die während der oben beschriebenen Versuche erhobenen Ergebnisse zeigen, dass die Erhaltung der Mikroglia in Reinkultur mit einem hohen Schwierigkeitsgrad assoziiert ist und dass sie nach einem Zeitraum von zwei Tagen eine hohe Mortalität aufweisen. Unter den bisher untersuchten Versuchsbedingungen ist daher eine Evaluierung der Mikrogliazellen in Kultur nur innerhalb des ersten Tages möglich. Im Vergleich der Kulturmedien hat das Medium MM-prf im Vergleich zu dem Sato-Medium (+/- m-csf) bessere Ergebnisse in Bezug auf das Zellwachstum und die Vitalität geliefert, deshalb ist das Medium MM-prf für weitere Versuche mit Kultivierung von Mikroglia zu empfehlen. Die Bearbeitung der dritten Arbeitsaufgabe, Mikrogliazellen in vitro mit R252 oder OND zu infizieren, brachte ein unterschiedliches Ergebnis in Abhängigkeit davon, welcher Virusstamm verwendet wurde. Während der attenuierte OND nicht in Mikroglia nachgewiesen werden konnte, war der demyelinisierendeR252-Virusstamm befähigt, Mikrogliazellen bis zu 27 % zu infizieren. Laut Literatur ist eine Infektion der Mikroglia zu 100 % mit dem R252-Virusstamm möglich, wobei der Virusstamm OND 83 Übergreifende Diskussion nur 1 % der Mikroglia infizierte (ORLANDO et al. 2008). Allerdings wurden bei diesen Versuchen die isolierten Mikroglia in einer Mischkultur gehalten und die Ergebnisse nicht im Durchflusszytometer, sondern mittels immunzytologischer Untersuchung erhoben. Bei den Mikrogliainfektionsversuchen der vorliegenden Arbeit könnte somit die Infektion mit dem OND unterhalb des Detektionslimit der Durchflusszytometrie gelegen haben. Bei der Arbeit von Stein et al (2004a) wurde eine höhere Gesamtzellzahl und Reinheit der Mikroglia durch alleinige Dichtegradientenzentrifugation erzielt als in dieser Studie. Allerdings wurden in oben genannter Arbeit junge Hunde in einem Alter von ca. 6 Monaten verwendet und es ist bekannt, dass die Isolation der Mikroglia junger Tiere deutlich bessere Resultate als die bei älteren liefert (STEIN et al. 2004a). Zudem wurde die Mikroglia aus in vivo CDV-infizierten Hunden isoliert, während in vorliegender Studie Mikroglia aus dem Gehirn von Hunden ohne pathologische Veränderungen isoliert wurden. Im Gehirn von Hunden ohne pathologische Veränderungen sind ruhende Mikroglia vorhanden, welche sich mit ihren Zellausläufern in der Umgebung verankern (MATTHEWS u. KRUGER 1973a, b). Es wird vermutet, dass sich die ruhende ramifizierte Mikroglia schlechter von der Umgebung lösen und somit isolieren lässt, als aktivierte Mikroglia ohne Zellausläufer (MORI u. LEBLOND 1969). Zudem führt eine Aktivierung nicht nur zu einer Veränderung der Morphologie, sondern auch zu einer erhöhten Proliferationsbereitschaft und zur Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut, welche nach ihrer Einwanderung in das ZNS kaum mehr von Mikroglia unterschieden werden können (DIJKSTRA et al. 1985). Demnach ist es nicht erstaunlich, dass bei der Arbeit von Stein et al (2004a) eine höhere Gesamtzellzahl und Reinheit der Mikroglia nach der Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation erzielt werden konnte. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von in vitro CDV-infizierten Monozyten aus dem peripheren Blut. Es konnte gezeigt werden, dass die ROS-Produktion kaniner Mikroglia zur Pathogenese der Demyelinisierung bei der akuten Staupevirusinfektion beitragen kann (STEIN et al. 2004b). Im Rahmen der Infektion wandern Monozyten in das ZNS ein, um die dort ansässige Mikroglia bei der 84 Immunabwehr zu unterstützen Übergreifende Diskussion (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991b, a). Es ist jedoch noch nicht geklärt, welchen Einfluss die CDV-Infektion auf die Monozyten ausübt und welche Konsequenzen sich daraus für die Entstehung demyelinisierender Läsionen nach deren Rekrutierung ins ZNS ergeben. Um den Einfluss der Monozyten auf die Entstehung der Viruspersistenz und den Demyelinisierungsprozess bei der akuten Staupevirusinfektion zu evaluieren , ist eine Charakerisierung der Monozyten anhand ihrer ROS-Produktion und CD14Expression nötig. Die isolierten Monozyten konnten mit beiden Virusstämmen, OND und R252, infiziert werden, jedoch war das Reaktionsprofil der infizierten Monozyten in Abhängigkeit von dem infizierenden Virusstamm sehr unterschiedlich. Der demyelinisierende R252-Stamm infizierte signifikant mehr Monozyten als der OND, zudem war in den R252-infizierten Monozyten auch quantitativ signifikant mehr CDV-Ag nachweisbar, als in den OND-infizierten Monozyten. Beide Virusstämme lösten bei den infizierten Monozyten im Vergleich zu den nicht-infizierten Monozyten eine ähnliche Aufregulation des Oberflächenmarkers CD14 und dessen Expressionsintensität aus. Diese Ergebnisse untermauern die Resultate der in vitro Versuche von Stein et al. (2008), in denen gezeigt wurde, dass die Mikroglia der Hunde mit schweren neurologischen Symptomen und einer Demyelinisierung im ZNS CD14 nur zu 54 % exprimieren, wobei die Mikroglia der Hunde mit geringgradigen neurologischen Symptomen ohne Demyelinisierung im ZNS zu 74 % CD14 + waren. Generell können Viren das angeborene Immunsystem über den CD14/TLR4Signalweg aktivieren (ROLLAND et al. 2006). Die Aktivierung des CD14/TLR4Signalwegs könnte also zu einer frühzeitigen Elimination des Virus führen und somit die Viruspersistenz verhindern. Die hochgradig R252-infizierten Monozyten lösen allerdings im Verhältnis zu den geringgradig OND-infizerten Mikroglia eine geringere Expression von CD14 aus, was einen Mechanismus zur Entstehung einer Viruspersistenz darstellen könnte. Mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden Monozyten aus dem peripheren Blut isoliert und kultiviert. Staupevirusstämmen Die infiziert, Monozyten zum wurden einen mit anschließend dem mit zwei demyelinisierenden R252-Virusstamm und zum anderen mit dem Impfstamm OND. Die Virusinfektion der Monozyten stimulierte diese, ROS zu produzieren. Das Ausmaß der Produktion war jedoch von dem infizierenden Virusstamm abhängig. Interessanterweise waren die 85 Übergreifende Diskussion Anzahl ROS-produzierender Monozyten und die ROS-Bildungsintensität bei den OND-infizierten Monozyten höher als bei den R252-infizierten. Die nicht-infizierte Negativkontrolle produzierte die größte Menge ROS. Die ROS-Generation CDV-infizierter Monozyten lag somit unterhalb des Potentials gesunder, nichtinfizierter Monozyten. Ein Vergleich der ROS-Produktion in vivo infizierter Mikroglia (STEIN et al. 2004b) mit in vitro infizierten Monozyten verdeutlicht, dass das Potential der Monozyten erheblich oberhalb dessen der Mikroglia liegt. Da Monozyten im Rahmen der CDV-Infektion ins ZNS rekrutiert werden und dort ihr ROS-Bildungspotential entfalten, können sie entscheidend an der Pathogenese der Demyelinisierung beteiligt sein und vermutlich in größerem Maße als die Mikroglia für den Schaden im ZNS verantwortlich sein. Die gewonnenen Ergebnisse können neue Therapieansätze bei der akuten Staupevirusinfektion ermöglichen, da durch das Verhindern der Einwanderung von Monozyten ins ZNS die Pathogenese der Demyelinisierung entscheidend beeinflusst und verhindert Cannabinoiden oder zeigen zumindest vermindert erfolgsversprechende werden Resultate könnte. in Versuche Bezug auf mit eine Verhinderung der Einwanderung von Monozyten in das ZNS (SADATIPOUR et al. 1998; HENDRIKS et al. 2004), welche somit eine Therapiestrategie darstellen könnten. 86 Zusammenfassung 6 Maren Martin: Zusammenfassung Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten In der akuten Phase der Infektion mit dem kaninen Staupevirus (CDV) kommt es bei der neurologischen Verlaufsform klassischerweise zu einer Immunsuppression gefolgt von einer Demyelinisierung in der weißen Substanz des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Pathogenese der Demyelinisierung ist nicht abschließend geklärt, jedoch werden verschiedene Hypothesen postuliert. Zum einen kann der Zellmetabolismus der Oligodendrozyten durch eine CDV-Infektion direkt gestört werden, woraus eine Schädigung des Myelins resultiert (primäre Demyelinisierung). Zum anderen führt die CDV-Infektion zu einer Aktivierung der Mikroglia, welche als einen Mechanismus der unspezifischen Immunabwehr reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produziert. Oligodendrozyten sind besonders empfindlich gegenüber ROS und können als innocent bystander geschädigt werden, was ebenso zu einem Myelinschaden führen kann (sekundäre Demyelinisierung). Eine weitere vom Immunsystem initiierte Reaktion bei der CDV-Infektion ist die Rekrutierung von Monozyten aus dem peripheren Blut ins ZNS, wo sie sich zu Makrophagen wandeln. Sobald die Monozyten in das ZNS eingewandert sind, ist eine Differenzierung von der dort ansässigen Mikroglia schwierig. Daher ist nicht sicher zu bestimmen, was den Ursprung der ROS-Produktion darstellt, da die eingewanderten Monozyten genauso wie die Mikroglia zur ROS-Produktion befähigt sind und somit auch einen Beitrag zur Pathogenese der sekundären Demyelinisierung leisten können. Demnach war das Ziel dieser Arbeit die Hypothese zu belegen, dass CDV-infizierte Monozyten ROS produzieren und dass das Ausmaß dieser Produktion vom Virusstamm abhängig ist und somit den Einfluss auf das Immunsystem widerspiegelt. Desweiteren sollte die Isolation der Mikroglia optimiert werden, um eine Reinkultur mit Mikroglia für die Bearbeitung weiterer Fragestellungen zu etablieren. Zur Optimierung der Mikroglia-Isolation wurden verschiedene Protokolle angewendet und deren Effektivität mittels der Expression von CD11b, CD18 und CD45 low durchflusszytometrisch bestimmt. Die 87 Dichtegradientenzentrifugation mit Zusammenfassung anschließender MACS-Separation lieferte die höchste Zellzahl mit der höchsten Reinheit und Vitalität der isolierten Mikroglia. Desweiteren sollten die Bedingungen definiert werden, die es erlauben, Mikroglia in Reinkultur zu halten. Dazu wurden zwei Medien, Microglia Medium (MM-prf) und Sato-Medium jeweils mit und ohne Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (m-csf), verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kultivierung im MM-prf-Kulturmedium eine höhere Gesamtzellzahl, Reinheit und Vitalität der Mikroglia erzielte als im Sato-Medium. Dennoch wiesen die Mikroglia in der Reinkultur nach 24 Stunden eine sehr hohe Mortalitätsrate auf. Daher konnte eine Untersuchung der Mikroglia nur innerhalb der ersten 24 Stunden durchgeführt werden. Zur Untersuchung, ob Mikrogliazellen in vitro mit CDV infiziert werden können, wurden sie mit zwei verschiedenen Virusstämmen, dem attenuierten Onderstepoort (OND) und dem virulenten R252-Stamm, inkubiert. Interessanterweise konnte eine Infektion der Mikroglia mit dem R252 durchflusszytometrisch nachgewiesen werden, während eine Infektion mit dem Impfstamm OND nicht nachgewiesen werden konnte. Zur Untersuchung der Monozyten wurde 10 ml Vollblut von zehn gesunden Beaglen entnommen und die Monozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Monozyten wurden anschließend kultiviert und mit dem Impfstamm OND oder dem R252-Virusstamm infiziert und mit nicht-infizierten Monozyten als Negativkontrolle verglichen. Der Nachweis intrazellulären CDV-Antigens, die Expression von CD14 und die ROS-Produktion wurden direkt nach der Infektion (p.i.) und nach drei Stunden Inkubation (3 h p.i.) im Durchflusszytometer gemessen. Anders als bei der Mikroglia war eine Infektion der Monozyten mit beiden Virusstämmen möglich, wobei der R252 signifikant mehr Monozyten infizierte und zudem einen signifikant höheren virus load der Monozyten aufwies. Bei den CDV-infizierten Monozyten waren sowohl die Expression des Oberflächenmarkers CD14 als auch die Expressionsintensität im Vergleich zur nicht-infizierten Negativkontrolle signifikant aufreguliert. Neben einer Aufregulation von CD14 stimulierte die CDV-Infektion die Monozyten zur Generation von ROS, wobei interessanterweise die R252-infizierten Monozyten weniger ROS produzierten als die OND-infizierten und die nicht-infizierte Negativkontrolle. Monozyten können das angeborene Immunsystem über den CD14/TLR4-Signalweg aktivieren und eine frühzeitige Elimination des Virus bewirken. Die hochgradig R252-infizierten Monozyten zeigten jedoch im Vergleich zu den geringgradig OND88 Zusammenfassung infizierten Monozyten eine geringere Expression von CD14, was einen Mechanismus zur Entstehung einer Viruspersistenz darstellen könnte. Die ROS-Generation von CDV-infizierten Monozyten kann entscheidend Demyelinisierung beitragen. 89 zur Pathogenese der Summary 7 Summary Maren Martin: Investigation about the influence of acute canine distemper virus infection on the function of ex vivo cultivated canine monocytes The acute phase of canine distemper virus (CDV) infection is characterized by immunosuppression and demyelination in the white matter of the central nervous system (CNS). The pathogenesis of demyelination is still poorly understood. However, different hypotheses are postulated of which one sees a disturbance in the metabolism of the oligodendrocytes by the CDV infection as causative as it leads to damage of the myelin sheaths (primary demyelination). Another hypothesis considers microglial activation due to the CDV infection as a central role. Activated microglia generates reactive oxygen species (ROS) as a mechanism of the non-specific immunity. Since oligodendrocytes are highly vulnerable to ROS they can be damaged as innocent bystanders and consequently also the myelin sheath will be damaged (secondary demyelination). Another mechanism initiated by the immune system is the recruitment of peripheral blood monocytes into the CNS. After the monocytes entered the CNS they change into tissue macrophages and their differentiation from microglia is complicated. As both, microglia and the invading monocytes are capable to generate ROS its source is indistinguishable. Therefore, monocytes could also play an important part in the pathogenesis of secondary demyelination. The aim of this study was to evaluate the ROS generation of peripheral blood monocytes in response to CDV infection as this can reflect the activation of the immune system. Moreover, the aim was to optimize the isolation protocol of microglia in order to establish a pure micoglia cell culture for further research on microglial reaction profile. For optimizing the microglia isolation different protocols were applied and their effectivities were determined via the cells’ expression of CD11b, CD18 und CD45 low using flow cytometry. Density gradient centrifugation with subsequent MACS separation revealed the highest cell yield, purity and vitality of the isolated microglia population. Additionally, the conditions had to be established that allow cultivation of a pure microglia cell culture. Therefore, two culture media, Microglia Medium 90 Summary (MM-prf) and Sato-Medium each with and without macrophage colony-stimulating factor (m-csf) were compared. It could be demonstrated that microglial cultivation with MM-prf media leads to a higher cell yield, purity and vitality compared to SatoMedium. Nevertheless, the mortality rate of the microglia was very high after 24 hours in culture. Therefore, microglial characterization had to be performed within the first 24 hours of culturing. Two CDV strains, the virulent R252 strain and the attenuated Onderstepoort (OND), were used to test whether microglia could be infected in vitro. Interestingly, only the R252 could be detected in microglia whereas no infection could be confirmed with OND. For the characterization of monocytes 10 mL of whole blood was collected from 10 healthy Beagle dogs and isolated using density gradient centrifugation. The monocytes were cultured and infected with either the vaccine strain OND or the demyelinating strain R252 and the results of their characterization compared to that of non-infected monocytes that served as negative control (ctr). The intracellular CDV-antigen, the expression of CD14, and the ROS production were measured using flow cytometry directly post infection (p.i.) and three hours post infection (3 h p.i.). In contrast to the trial with microglia both virus strains were able to infect the isolated monocytes. However, the R252 strain infected significantly more monocytes with a significantly higher virus load compared to OND. The CDV-infected monocytes showed a significant up-regulation of the CD14 expression and expression intensity compared to the non-infected controls. Moreover, the CDV infection stimulated the monocytes to generate ROS. Interestingly, the R252-infected monocytes generated less ROS than the OND-infected and the non-infected monocytes. Monocytes can activate the innate immunity via the CD14/TLR4 signaling pathway and eliminate the virus early in the course of the disease. However, the severely R252-infected monocytes showed a distinctly lower CD14 expression than the ONDinfected monocytes which might represent a mechanism for the development of virus persistence. The ROS generation of CDV-infected monocytes may have an essential role in the pathogenesis of demyelination. 91 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis AMUDE, A. M., A. A. ALFIERI u. A. F. ALFIERI (2007): Clinicopathological findings in dogs with distemper encephalomyelitis presented without characteristic signs of the disease. Res Vet Sci 82, 416-422 ANDERSON, L. G. (1950): Hard Pad Disease. Can J Comp Med Vet Sci 14, 217 APPEL, M. J. (1969): Pathogenesis of canine distemper. Am J Vet Res 30, 1167-1182 APPEL, M. J. (1970): Distemper pathogenesis in dogs. J Am Vet Med Assoc 156, 1681-1684 APPEL, M. J., W. R. SHEK u. B. A. SUMMERS (1982): Lymphocyte-mediated immune cytotoxicity in dogs infected with virulent canine distemper virus. Infect Immun 37, 592-600 APPEL, M. J., R. A. YATES, G. L. 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Überstand verwerfen, resuspendieren der Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren (Pasteur-Pipette). 7. Zentrifugieren bei 4 °C 170 x g für 10 min. 8. Überstand verwerfen, resuspendieren der Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren (Pasteur Pipette). 9. Zentrifugieren bei 4 °C 170 x g für 10 min. 10. Überstand verwerfen, Gewebebrei (max. 30 ml / 50 ml Röhrchen) mit x ml Kollagenase-DNAse-Puffer (pro 1 g Gehirnmaterial 1 ml Kollagenase-DNAsePuffer) versetzen und 60 min im Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Zellsuspension alle 15 min aufschütteln. 11. 10 ml HBSS-Lösung dazu und durch Auf- uns Abpipettieren verbliebene größere Gewebereste zerkleinern und dann auf 50 ml mit HBSS auffüllen. 12. Zentrifugieren bei 20 °C 200 x g für 10 min. 13. Überstand verwerfen, 10 ml HBSS-Lösung dazu und durch Auf- und Abpipettieren verbliebene größere Gewebereste zerkleinern und dann auf 50 ml mit HBSS auffüllen. 14. Zentrifugieren bei 20 °C 200 x g für 10 min. 15. Überstand verwerfen. 16. Dichtevorgradient: Zellsuspension mit Percoll der Dichte 1,030 g/ml auf 45 ml auffüllen; unterschichten mit 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml. 17. Zentrifugieren bei 20 °C 1250 x g, 5 min, Bremse und Beschleunigung auf geringster Stufe. 110 Anhänge 18. Ernte der Zellen auf der Dichte 1,124 g/ml Percoll mit einer 10 ml Pipette, Überführen in ein neues 50 ml Röhrchen und Auffüllen mit HBSS auf 50 ml 19. Zentrifugieren bei 20 °C 200 x g für 10 min. 20. Hauptgradienten gießen: 5 ml 1,124 g/ml; 12 ml 1,077 g/ml; 12 ml 1,066 g/ml; 8ml 1,050 g/ml; 8ml 1,030 g/ml; (max. 8 g Ausgangsmaterial / Hauptgradient). 21. Überstand verwerfen und Pellet in 5 ml HBSS resuspendieren, vorsichtig auf den Hauptgradienten pipettieren. 22. Zentrifugieren bei 20 °C 1250 x g für 25 min, Bremse und Beschleunigung auf geringster Stufe. 23. Ernte der Zellen auf den Dichten 1,077 g/ml und 1,066 g/ml in ein neues 50 ml Röhrchen, dieses mit HBSS auf 50 ml auffüllen und Zentrifugieren bei 20 °C 200 x g für 10 min. 24. Überstand verwerfen, Zellen resuspendieren und mit Trypanblau zählen (Zählkammer nach Türk: 10 µl Zellsuspension: 90 µl Trypanblau-Lösung) 25. Die verbliebene Zellsuspension erneut zentrifugieren bei 20 °C 200 x g für 10 min. 26. Überstand komplett abpipettieren, Zellpellet in 80 μl Macs-Puffer / max. 107 Zellen resuspendieren. 27. 20 μl der CD11b MicroBeads je max. 107 Zellen hinzugeben, gut mischen und 15 min bei 4-8 °C inkubieren. 28. 2 ml MACS-Puffer zugeben und abzentrifugieren 20 °C 300 x g für 10 min. 29. Überstand komplett entfernen und bis zu 10 8 Zellen in 500 μl MACS-Puffer resuspendieren. 30. In ein 15 ml Röhrchen überführen und mit dem MACS separieren (2 x). 31. positive Zellfraktion in der Zählkammer nach Türk (10 µl Zellsuspension: 90 µl Trypanblau-Lösung) zählen. 32. Die übrigen Zellen der positiven Fraktion zentrifugieren 20 °C für 10 min bei 300 xg. 33. Überstand verwerfen und die Zellen in MM-prf Medium überführen. 111 Anhänge B) Staupevirusinfektion 1. Isolierte Zellsuspension dritteln und jeweils in ein Well einer 12-Wellplatte überführen. 2. 1. 12-Wellplatte: + x μl Onderstepoort (0,1MOI) 3. 2. 12-Wellplatte: + x μl R252 (0,1 MOI) 3. 12-Wellplatte: + x μl HBSS (Negativkontrolle) 4. Inkubieren: 1 Stunde (5% CO2, 37 °C). 5. Dann in 15 ml Röhrchen überführen. 6. Zentrifugieren: 170 x g für 10 min und Überstand verwerfen. 7. 3 x waschen mit HBSS (auf 10 ml auffüllen, 10 min 170 x g). 8. Überführen in 6-Well-Platten. C) Indirekte Membran-Immunfluoreszenz Zellsuspension adäquat einstellen und 5 Röhrchen beschriften: I. Nativkontrolle II. Isotypkontrolle III. Sekundärantikörperkontrollen(Gam PE + SA FITC) IV. CD11b + CD45 - Teströhrchen V. CD18 + CD45 - Teströhrchen 1. Zellsuspension mit humanem IgG blocken: 250 µl Zellsuspension + 15,6 µl humanes IgG. 2. In jedes der Röhrchen 50 µl Zellsuspension pipettieren, dabei die Zellen durch leichtes Schütteln in Suspension halten. 3. In das Isotypkontrollröhrchen 10 µl Ratte IgG2b Biotin und 10 µl Maus IgG1 Isotypkontrolle pipettieren, in die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle je 10 µl MIF-Puffer. 4. In das Teströhrchen IV 10 µl Ratte-anti-Hund CD45 Biotin und 10 µl Maus-anti-Hund CD11b pipettieren. 5. In das Teströhrchen V 10 µl Ratte-anti-Hund CD45 Biotin und 10 µl Maus-anti-Hund CD18 pipettieren. 6. Röhrchen mit Parafilm verschließen und 20 min bei 4 °C inkubieren. 112 Anhänge 7. Die Röhrchen nach der Inkubationszeit 2 x waschen mit je 2 ml MIF-Puffer, Zentrifugieren für 6 min bei 200 x g. 8. In der Zwischenzeit die Sekundärantikörper verdünnen: 245 µl MIF-Puffer + 5 µl gam PE bzw. SA-FITC (pro Verdünnungsreihe). 9. In die Röhrchen II-V jeweils 50 µl der verdünnten SekundärantikörperReagenzien pipettieren, in das Nativröhrchen 50 µl MIF-Puffer. 10. Röhrchen verschließen und 20 min bei 4°C inkubieren. 11. Mit 2 ml CellWash waschen, 6 min bei 200 x g zentrifugieren. 12. Dekantieren und mit 100 µl FACSFlow resuspendieren. 13. Messen (unmittelbar vor dem Messen je 100 µl FACSFlow mit TO-PRO-3 zufügen). D) Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung 1. Überführen der Zellsuspension in FACS-Röhrchen und mit 200 μl PBS resuspendieren. 2. Fixierung der Zellen mit 200 μl Paraformaldehyd (4% in PBS, pH 7,4). 3. Inkubation bei 4 °C für 20 min. 4. 2 x waschen mit PBS (1 ml), zentrifugieren für 10 °C 250 x g 10 min. ACHTUNG: beim letzten Waschschritt nicht dekantieren, sondern absaugen! 5. Permeabilisierung mit 50 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %). 6. Blocken mit 3,125 μl humanem IgG (1:16). 7. 150 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %) dazugeben. 8. Pro Untersuchungsgruppe (Onderstepoort, R252, Negativkontrolle) 4 FACSRöhrchen beschriften (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, CDV-Ag-Teströhrchen, Sekundärantikörperkontrolle) und in jedes Röhrchen 50 μl Zellsuspension pipettieren. 9. In die Nativ- und Sekundärantikörperkontroll-Röhrchen jeweils 3,125 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), in die Isotypkontrolle jeweils 10 μl Maus IgG 1 und in die CDV-Ag-Teströhrchen jeweils 3,125 μl Maus-anti CDV-NP pipettieren. 10. Inkubation für 30 min bei 4 °C. 11. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), Zentrifugieren für 5 min bei 250 x g 113 Anhänge 12. In die Isotyp-Röhrchen, die Primärantikörper-Röhrchen und die Sekundärantikörperkontroll-Röhrchen jeweils 50 μl R-Phycoerythrinkonjugierte Ak pipettieren (1:50), in die Nativröhrchen jeweils 50 µl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %). 13. Inkubation für 30 min. bei 4 °C. 14. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), zentrifugieren für 5 min für 250 x g 15. Zellpellet in 200 μl FACSFlow resuspendieren, kein TO-PRO-3! 16. Messen Protokoll zur Charakterisierung kaniner Monozyten A) Isolation der Monozyten 1. Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. 2. 5 ml Vollblut pro 15 ml Röhrchen überführen und mit PBS 1:1 verdünnen. Vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren Vollblut und PBS mischen. 3. In neues 15 ml Röhrchen 2 ml Histopaque 1,119 g/ml hinein pipettieren. 4. Darüber vorsichtig in einem dünnen Rinnsal am Röhrchenrand 2 ml Pancoll 1,077 g/ml pipettieren. 5. vorsichtiges Pipettieren des vorverdünnten Blutes auf den Dichtegradienten. Oberflächen müssen stabil bleiben! 6. Zentrifugieren bei 700 x g für 30 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung und Bremse auf geringster Stufe. 7. Die obere transparente Schicht enthält Plasma und Thrombozyten und kann verworfen werden. 8. Ernte der mononukleären Zellen aus der Interphase zwischen der Plasma-Schicht und dem Pancoll 1,077 g/ml und in neues 15 ml Röhrchen mit 10 ml HBSS überführen 9. Zentrifugieren bei 170 x g für 10 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung höchste Stufe, Bremse mittelere Stufe. 10. Röhrchen dekantieren und Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendieren. 11. Falls Pellet mit Erythrozyten kontaminiert, dann hypotone Lyse. 114 Anhänge 12. Hypontone Lyse: Zum Pellet 5 ml Aqua bidest. dazugeben und für 20 Sekunden mischen, danach 2 x PBS hinzufügen 13. Andernfalls erneutes Waschen mit 10 ml HBSS und Zentrifugieren bei 250 x g für 10 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung höchste Stufe, Bremse mittlere Stufe. 14. Röhrchen dekantieren und das Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendieren. Wenn das Pellet immer noch mit Erythrozyten kontaminiert ist, eine weitere hypotone Lyse durchführen. 15. Andernfalls einen dritten Waschschritt anschließen: 10 ml HBSS zufügen, durch Schwenken vorsichtig mischen und zentrifugieren: 170 x g für 10 min bei Raumtemperatur, Beschleunigung höchste Stufe, Bremse mittlere Stufe. 16. Überstand absaugen, Pellet in 500 µl CellWash resuspendieren. 17. Zellzahl mittels Türk-Zählkammer bestimmen. B) Staupevirusinfektion 1. Zellsuspension dritteln und in 3 Röhrchen überführen. 1. Röhrchen: + …………μl Onderstepoort (0,1 MOI) 2. Röhrchen: + …………μl R252 (0,1 MOI) 3. Röhrchen: + …………μl HBSS (Negativkontrolle) 2. Inkubieren für 1 Stunde (5% CO2, 37 °C). 3. Zentrifugieren bei 170 x g 10 min bei Raumtemperatur 4. Überstand dekantieren. 5. 3 x waschen mit HBSS (auf 2 ml auffüllen, 10 min 170 x g bei Raumtemperatur). 6. Trennen der Zellsuspensionen jeweils in 2 Ansätze (Stunde 0, 3). 7. Stunde 0 wird sofort verarbeitet! Die andere Hälfte wird jeweils in ein Well einer 24-Wellplatte pipettiert und zurück in den Brutschrank verbracht. 115 Anhänge C) Arbeitsschritte für den Messzeitpunkt "Stunde 0" 1. Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min zentrifugieren und dekantieren. 2. Pellet resuspendieren in 800 µl MIF-Puffer und in 3 Ansätze aufteilen (150 µl für die Membranimmunfluoreszenz, 150 µl für die IC-Färbung, 500 µl für die ROS-Bildung) A) Membran-Immunfluoreszenz 1. 18,75 µl humanes IgG zu 150 µl Zellsuspension dazugeben. 2. Jeweils 50 µl pro Röhrchen (Nativkontrolle, CD14-Teströhrchen, Isotypkontrolle). 3. In die Nativkontrolle 6,25 µl MIF-Puffer, in das CD14-Teströhrchen 6,25 µl CD14-PE markierten Ak und in die Isotypkontrolle 10 µl Isotyp pipettieren. 4. 20 Min im Kühlschrank inkubieren. 5. Waschen mit 2 ml MIF-Puffer und bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. 6. Überstand dekantieren und mit 200 µl FacsFlow mit TO-PRO-3 im FACS messen. B) Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung 17. 50 μl kalte PBS zu den 150 µl Zellsuspension hinzufügen, vorsichtig mischen. 18. Fixierung der Zellen mit 200 μl Paraformaldehyd (4% in PBS, pH 7,4). 19. Inkubation bei 4 °C für 20 min. 20. 2 x waschen mit PBS (1 ml), zentrifugieren für 10 min 250 x g, 10 °C. 21. 150 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %) dazugeben. 22. Blocken mit 21,6 μl humanem IgG (1:8). 23. Pro Ansatz (Onderstepoort, R252, Negativkontrolle) 3 FACS-Röhrchen beschriften (Nativkontrolle, CDV-Ak-Teströhrchen, Sekundärantikörperkontrolle). 116 Anhänge 24. In jedes Röhrchen 50 μl Zellsuspension pipettieren. 25. In die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle jeweils 3,125 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %) und in die CDV-Ak-Röhrchen jeweils 3,125 μl Antikörper gegen CDV-NP pipettieren 26. Inkubation für 30 min bei 4 °C. 27. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), zentrifugieren für 5 min 250 x g. 28. In die CDV-Ag-Röhrchen und die Sekundärantikörperröhrchen jeweils 50 μl R-Phycoerythrin-konjugierte Ak pipettieren (1:50). In die Nativröhrchen 50 µl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %). 29. Inkubation für 30 min bei 4 °C. 30. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), zentrifugieren für 5 min 250 x g. 31. Zellpellet in 200 μl FACSFlow resuspendieren, kein TO-PRO-3 32. Messen. C) ROS-Nachweis 1. PMA ist als 1 mmol Lösung in DMSO eingefroren. 2. Pro PMA-Verdünnung (0 und 100) werden in je 2 Röhrchen 90 µl Zellsuspension pipettiert und 90 µl Zellsuspension in ein anderes Röhrchen (Nativkontrolle). 3. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank vorinkubieren. 4. DHR-working-solution auftauen. 5. In der Zwischenzeit das PMA vorverdünnen: um auf eine 100 nmol Lösung zu kommen, ist eine Verdünnung von 1/10.000 erforderlich. Vorverdünnung: 1/1000 (10+9990) in PBS, durch Zugabe von 10 µl dieser vorverdünnten Lösung zu 90 µl der Zellsuspension erfolgt eine weitere 1/10 Verdünnung. 6. Zugabe von jeweils 10 µl der PMA-Verdünnungen bzw. PBS zu den vorinkubierten Zellen pipettieren, außer Nativkontrolle, dort 20 µl PBS zugeben. 7. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank inkubieren. 117 Anhänge 8. Zugabe von jeweils 20 µl DHR-working-solution je Röhrchen, außer Nativkontrolle, dort 20 µl PBS zugeben. 9. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank inkubieren 10. Danach 15 min auf Eis. 11. Zufügen von jeweils 100 µl FACS-Flow mit TO-PRO-3 12. Messen. D) Arbeitsschritte für den Messzeitpunkt "Stunde 3" 3. Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min zentrifugieren und dekantieren. 4. Pellet resuspendieren in 800 µl MIF-Puffer und in 3 Ansätze aufteilen (150 µl für die Membranimmunfluoreszenz, 150 µl für die IC-Färbung, 500 µl für die ROS-Bildung) A) Membran-Immunfluoreszenz 1. 18,75 µl humanes IgG zu 150µl Zellsuspension dazu geben. 2. Jeweils 50 µl pro Röhrchen (Nativkontrolle, CD14-Teströhrchen, Isotypkontrolle). 3. In die Nativkontrolle 6,25 µl MIF-Puffer, in das CD14-Teströhrchen 6,25 µl CD14-PE markierten Ak und in die Isotypkontrolle 10 µl Isotyp.pipettieren. 4. 20 Min im Kühlschrank inkubieren. 5. Waschen mit 2 ml MIF-Puffer und bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. 6. Überstand dekantieren und mit 200 µl FacsFlow mit TO-PRO-3 im FACS messen. 118 Anhänge B) Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung 33. 50 μl kalte PBS zu den 150 µl Zellsuspension hinzufügen, vorsichtig mischen. 34. Fixierung der Zellen mit 200 μl Paraformaldehyd (4% in PBS, pH 7,4). 35. Inkubation bei 4 °C für 20 min. 36. 2 x waschen mit PBS (1 ml), zentrifugieren für 10 min 250 x g, 10 °C. 37. 150 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %) dazugeben. 38. Blocken mit 21,6 μl humanem IgG (1:8). 39. Pro Ansatz (Onderstepoort, R252, Negativkontrolle) 3 FACS-Röhrchen beschriften (Nativkontrolle, CDV-Ak-Teströhrchen, Sekundärantikörperkontrolle). 40. In jedes Röhrchen 50 μl Zellsuspension pipettieren. 41. In die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle jeweils 3,125 μl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %) und in die CDV-Ak-Röhrchen jeweils 3,125 μl Antikörper gegen CDV-NP pipettieren 42. Inkubation für 30 min bei 4 °C. 43. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), zentrifugieren für 5 min 250 x g. 44. In die CDV-Ag-Röhrchen und die Sekundärantikörperröhrchen jeweils 50 μl R-Phycoerythrin-konjugierte Ak pipettieren (1:50). In die Nativröhrchen 50 µl PBS-Saponin-Lösung (0,03 %). 45. Inkubation für 30 min bei 4 °C. 46. 2 x waschen mit 1 ml PBS-Saponin-Lösung (0,03 %), zentrifugieren für 5 min 250 x g. 47. Zellpellet in 200 μl FACSFlow resuspendieren, kein TO-PRO-3 48. Messen. 119 Anhänge C) ROS-Nachweis 13. PMA ist als 1 mmol Lösung in DMSO eingefroren. 14. Pro PMA-Verdünnung (0 und 100) werden in je 2 Röhrchen 90 µl Zellsuspension pipettiert und 90 µl Zellsuspension in ein anderes Röhrchen (Nativkontrolle). 15. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank vorinkubieren. 16. DHR-working-solution auftauen. 17. In der Zwischenzeit das PMA vorverdünnen: um auf eine 100 nmol Lösung zu kommen, ist eine Verdünnung von 1/10.000 erforderlich. Vorverdünnung: 1/1000 (10+9990) in PBS, durch Zugabe von 10 µl dieser vorverdünnten Lösung zu 90 µl der Zellsuspension erfolgt eine weitere 1/10 Verdünnung. 18. Zugabe von jeweils 10 µl der PMA-Verdünnungen bzw. PBS zu den vorinkubierten Zellen pipettieren, außer Nativkontrolle, dort 20 µl PBS zugeben. 19. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank inkubieren. 20. Zugabe von jeweils 20 µl DHR-working-solution je Röhrchen, außer Nativkontrolle, dort 20 µl PBS zugeben. 21. Röhrchen 15 min bei 37 °C im Brutschrank inkubieren 22. Danach 15 min auf Eis. 23. Zufügen von jeweils 100 µl FACSFlow mit TO-PRO-3 24. Messen. 120 Anhänge Statistische Auswertung der Monozyten-Versuche Expression des Oberflächenmarkers CD14 auf ex vivo isolierten kaninen Monozyten CD14 % Messzeitpunktvergleich (Std. 0 + Std. 3) (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) 1-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte Versuchszeitpunkte Std. 0 (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) p-Wert Kontrolle Onderstepoort R252 F-Wert Std. 0 Std. 3 p-Wert F-Wert Std. 3 2-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte (Ktr/OND/R252) Stunden (O/3) Versuchszeitpunkte * Stunden Mittlere Diff. Zw. Gesamt-MW (Std. 0 + Std. 3) p-Wert (Ktr/OND/R252) 121 CD14 MFI 0,3152 0,4246 0,4302 0,2108 0,2388 0,2117 <0,0001 0,0061 0,0004 <0,0001 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 0,0002 0,0004 0,4701 0,0263 0,0066 0,6844 0,0019 0,0004 0,7752 0,0008 0,0003 0,7136 Std. 0 + Std. 3 Ktr+OND+R252 0,0142 0,132 0,0021 0,2968 0,9569 0,613 0,0045 0,0109 0,5331 0,132 0,0059 0,0021 0,7196 0,2968 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Std. 0/Std. 3 Anhänge Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung in ex vivo isolierten kaninen Monozyten CDV % Messzeitpunktvergleich (Std. 0 + Std. 3) (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) 1-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte Versuchszeitpunkte Std. 0 (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) p-Wert Kontrolle Onderstepoort R252 0,2902 0,2056 0,7262 0,1776 0,0773 0,9406 F-Wert Std. 0 Std. 3 0,0005 0,0085 0,0007 0,0805 p-Wert Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 0,0051 <0,0001 0,0475 0,0015 0,0065 0,0553 0,0355 0,0003 0,0108 0,0098 0,0707 0,0997 F-Wert Std. 0 + Std. 3 Ktr+OND+R252 0,0004 0,3118 0,0571 0,2287 0,608 0,6829 0,0062 0,0003 0,0799 0,3118 0,009 0,0183 0,0996 0,2287 Std. 3 2-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte (Ktr/OND/R252) Stunden (O/3) Versuchszeitpunkte * Stunden Mittlere Diff. Zw. Gesamt-MW (Std. 0 + Std. 3) Virusload p-Wert (Ktr/OND/R252) 122 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Std. 0/Std. 3 Anhänge ROS-Produktion von ex vivo isolierten kaninen Monozyten ROS % PMA 0 Messzeitpunktvergleich (Std. 0 + Std. 3) (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) 1-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte Versuchszeitpunkte Std. 0 (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) p-Wert Kontrolle Onderstepoort R252 0,4106 0,0569 0,3924 0,2343 0,9102 0,88 F-Wert Std. 0 Std. 3 0,4724 0,1548 0,4318 0,7322 p-Wert Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 0,0109 0,8673 0,4096 0,4846 0,0899 0,0537 0,4756 0,2725 0,5502 0,9096 0,6925 0,2267 F-Wert Std. 0 + Std. 3 Ktr+OND+R252 0,418 0,8812 0,7984 0,7461 0,2944 0,3221 0,1668 0,4608 0,8627 0,8812 0,7674 0,9527 0,0729 0,7461 Std. 3 2-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte (Ktr/OND/R252) Stunden (O/3) Behandlungen * Stunden Mittlere Diff. zw. Gesamt-MW (Std. 0 + Std. 3) ROS % PMA 100 p-Wert (Ktr/OND/R252) 123 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Std. 0/Std. 3 Anhänge ROS-Bildungsintensität von ex vivo isolierten kaninen Monozyten ROS MFI PMA 0 Messzeitpunktvergleich (Std. 0 + Std. 3) (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) 1-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte Versuchszeitpunkte Std. 0 (Mittlere Diff. zw. Zell-Mitteln) p-Wert Kontrolle Onderstepoort R252 0,1739 0,0884 0,4429 0,1805 0,3093 0,5042 F-Wert Std. 0 Std. 3 0,062 0,2932 0,0709 0,1002 p-Wert Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 0,0992 0,056 0,278 0,146 0,4093 0,5028 0,1127 0,0463 0,3818 0,4474 0,0431 0,182 F-Wert Std. 0 + Std. 3 Ktr+OND+R252 0,014 0,0081 0,0919 0,3325 0,8981 0,1372 0,0258 0,0425 0,5476 0,0081 0,3036 0,0442 0,2073 0,3325 Std. 3 2-fakt. ANOVA Versuchszeitpunkte (Ktr/OND/R252) Stunden (O/3) Behandlungen * Stunden Mittlere Diff. Zw. Gesamt-MW (Std. 0 + Std. 3) ROS MFI PMA 100 p-Wert (Ktr/OND/R252) 124 Ktr/OND Ktr/R252 OND/R252 Std. 0/Std. 3 Danksagung 10 Danksagung Mein besonderer Dank gilt meiner Doktormutter Frau PD Dr. Veronika Stein, die mir jederzeit mit Rat und Tat bei inhaltlichen sowie methodischen Fragen mit ihrem hohem Fachwissen zur Seite stand, ihre Freizeit opferte und es verstand mich in den richtigen Momenten zu motivieren und mir Mut zu machen. Vielen Dank für diese außerordentliche Betreuung! Bei Frau Prof. Dr. Andrea Tipold möchte ich mich für das Anvertrauen des Dissertationsthemas bedanken. Ihre Unterstützung durch konstruktive Kritik, wissenschaftliche Anregungen und hohes Fachwissen haben in allen Phasen der Doktorarbeit zum Gelingen beigetragen. Für die wirklich tolle Zusammenarbeit im Labor, ihre konstruktiven Ideen, die stetige Hilfsbereitschaft und die vielen produktiven und spannenden Nächte im Labor gebührt Frau Regina Carlson mein ganz besonderer Dank. Herrn Prof. Dr. Michael Fehr danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die finanzielle Unterstützung beim Besuch des ACVIM Forums in Seattle. Der Arbeitsgruppe Neuropathologie des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, im besonderen Frau Danuta Waschke und Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner möchte ich für ihre Hilfsbereitschaft und fachliche Kompetenz danken. Ein großer Dank gebührt meinen Kollegen der Arbeitsgruppe Neurologie der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Ich danke Euch, dass Ihr mich so nett in euer Team aufgenommen habt. Durch Euch und den familiären Zusammenhalt haben die langen Tage in der Klinik immer viel Spaß und Freude gemacht. Ich weiß mein Glück zu schätzen ein Teil des Neuro-Teams zu sein! Schließlich und keineswegs zuletzt möchte ich meiner Familie danken, vor allem aber meiner Mutter, denn ohne ihre Unterstützung wäre ich nie soweit gekommen. Vielen Dank für Deine endlose Geduld und Dein Vertrauen in mich! Bei meiner Oma möchte ich mich sehr für ihr fortwährendes Interesse an meiner Arbeit und ihre stetige Motivation bedanken. Danke für diesen Antrieb! 125 Danksagung Bei meinem Freund möchte ich mich sehr für seine mentale Unterstützung und seine Geduld während der Promotion bedanken. Vielen Dank Euch allen, ohne Euch wäre ich nicht so weit gekommen! 126
