Quantifizierung proliferierender T-Zellen in situ

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Zytologische Diagnostik
Quantifizierung proliferierender
T-Zellen in situ
CHRISTIAN FLORIAN, UWE RITTER
INSTITUT FÜR IMMUNOLOGIE DER UNIVERSITÄT REGENSBURG
Das Thymidinanalogon 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU) wird bei der Zellteilung in die DNA eingebaut. Die simultane Darstellung des eingebauten
BrdU und zellspezifischer Oberflächenmoleküle durch fluoreszenzmarkierte Antikörper ermöglicht die exakte Charakterisierung der sich teilenden Zellen in situ.
The thymidine analogue 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) is incorporated
into the DNA during cell proliferation. Simultaneous detection of incorporated BrdU and surface molecules by fluorescent labelled antibodies
allows a characterization of proliferating cells in situ.
ó Viele Immunologen beschäftigen sich mit
der zentralen Frage, wie es zur Induktion
einer antigenspezifischen Immunantwort
kommt. Zur Beantwortung dieser wichtigen
Frage werden unterschiedliche Modelle
genutzt. Gerade Infektionsmodelle, bei denen
A
Versuchstiere die entsprechenden Pathogene
erfolgreich abwehren, eignen sich hierbei
besonders gut.
Generell wird zur Eliminierung der Pathogene eine hoch spezialisierte zelluläre Immunantwort benötigt. Bei dieser Immunant-
B
˚ Abb. 1: Quantifizierung proliferierender T-Zellen in situ. C57BL/6-Mäuse wurden mit Pathogenen (Leishmania major) subkutan infiziert. Die Analyse des drainierenden Lymphknotens der Haut
erfolgte am Tag 6 nach der Infektion. A, BrdU (rot), CD4 (grün) und DNA (blau) (Details zur Färbung siehe [8]). Das Insert zeigt eine Vergrößerung der BrdU+/CD4+/DAPI+-Zelle. Die Aufteilung
des Farbbildes in die entsprechenden Einzelkanäle (8-Bit-Graustufen) ist in A.I (DAPI), A.II (BrdU)
und A.III (CD4) gezeigt. B, Das Dot-Plot-Diagramm zeigt die Intensität von CD4 und BrdU der in A
dargestellten DAPI+-Zellen (der rote Kreis veranschaulicht die Lage der entsprechenden Zelle im
Schnitt und im Dot-Plot-Diagramm).
wort interagieren unterschiedlich spezialisierte Zelltypen in den sekundär lymphatischen Organen wie den Lymphknoten oder
der Milz. Handelt es sich bei den Krankheitserregern um Parasiten, die sich in Fresszellen des Wirts gewissermaßen „verstecken“
können, so liegt es auf der Hand, dass die Zellen des Immunsystems keine leichte Aufgabe
beim Aufspüren und Eliminieren dieser
Pathogene haben [1].
Prinzipiell arbeiten drei sehr unterschiedliche Zelltypen zusammen, um eine effiziente Immunabwehr zu gewährleisten: (1) Makrophagen (Fresszellen), (2) Typ-1-T-Helfer(TH1)Zellen (CD4+, sezernieren Makrophagen-aktivierende Zytokine) und (3) professionell Antigen-präsentierende Zellen (unterstützen die
Expansion von TH1-Zellen, welche die Antigene des Pathogens erkennen). Somit wird
deutlich, dass Antigen-präsentierende Zellen
zu Beginn einer T-Zell-vermittelten Immunantwort stehen. Diese Antigen-präsentierenden Zellen präsentieren den TH1-Zellen
Pathogen-assoziierte Antigene, worauf diese
antigenspezifischen TH1-Zellen klonal expandieren und zur Eliminierung der Pathogene in
größerer Anzahl zur Verfügung stehen [2].
Für den Erfolg bzw. den Ausgang der
Abwehrreaktion stellt diese antigenspezifische TH1-Antwort einen wichtigen Indikator
dar. Wie oben bereits erwähnt, können Antigen-präsentierende Zellen eine klonale
Expansion der TH1-Zellen induzieren. Dieser
gezielt induzierten Zellteilung der entsprechenden TH1-Zelle geht eine Duplikation des
Genoms voraus. Um die Duplikation des
Genoms zu erreichen, werden unter anderem
DNA-Bausteine wie Nukleotide benötigt. Fügt
man dem jeweiligen experimentellen System
ein entsprechend markiertes Nukleotid zu,
so kann dessen Einbau verfolgt bzw. gemessen werden. Hierfür wurde lange Zeit das
radioaktive Nukleotid [3H]-Thymidin verwendet. Die Quantifizierung des eingebauten
[3H]-Thymidins in die DNA erfolgt dann durch
Autoradiografen bzw. β-Counter [3].
Neben radioaktiv markierten Nukleotidanaloga werden auch nicht radioaktive DNABausteine wie das synthetische ThymidinBIOspektrum | 06.10 | 16. Jahrgang
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analogon 5-Bromo-2-desoxyuridin (BrdU) verwendet. Wie [3H]Thymidin baut sich BrdU in der SPhase des Zellzyklus in die DNA
der Zelle ein und kann dann
durch spezifische Antikörper
detektiert werden [4, 5]. Ein
Nachteil dieser Technik ist die
Tatsache, dass die DNA speziell
behandelt werden muss, um die
Bindung des Antikörpers an eingebautes BrdU zu ermöglichen.
Verschiedene Methoden wie
Behandlung mit Salzsäure, Hitze
oder enzymatische Prozesse führen hier zum Ziel [6, 7].
Somit kann der Einbau von
BrdU in die Zelle gemessen werden. Eine Aussage über den entsprechenden Zelltyp ist bei der
gegebenen Einfachfärbung allerdings nicht möglich. Eine
erweiterte Technik, die parallel
zur BrdU-Detektion noch andere
Oberflächenmarker darstellt,
würde zusätzliche Informationen
zum Zelltyp der BrdU-positiven
Zelle liefern.
Hierzu modifizierten wir den
BrdU in situ Detection Kit (BD Bioscience, Heidelberg) [8]. Wir
konnten zeigen, dass bestimmte
Fluorochrome den zur DNA-Denaturierung notwendigen Hitzeschritt von 89 °C überstehen und
spezifische Signale liefern. Somit
kann die T-Zell-Proliferation
direkt in sekundär lymphatischen
Organen charakterisiert werden.
Im Vergleich zu der konventionellen Methode, bei der Einzelzellsuspensionen mit dem entsprechenden Antigen restimuliert
werden müssen, bietet dieser
neue Ansatz entscheidende Vorteile: (1) Neben der Lokalisation
der T-Zell-Expansion ist eine
genaue Charakterisierung der
Zellsubtypen möglich. (2) Die Proliferation der T-Zellen spiegelt den
Status quo der Immunantwort im
Organ wider. So kann bei entsprechender Färbung zwischen
CD8+- und CD4+-T-Zellen differenziert werden [8]. Um diese Differenzierung auch statistisch
abzusichern, werden die generierten Farbbilder mit einer entBIOspektrum | 06.10 | 16. Jahrgang
sprechenden Software (TissueQuest™, TissueGnostics, Wien)
verarbeitet. Hierzu müssen die
Farbbilder in 8-Bit-GraustufenEinzelbilder aufgeteilt werden.
Dies erfolgt standardisiert mit der
Software ImageJ (http://rsbweb.
nih.gov/ij).
Die Auswertung der generierten Einzelbilder ergibt sich dann
je nach Fragestellung. In Abbildung 1 ist dies exemplarisch veranschaulicht. Deutlich sind die
BrdU-positiven Zellen zu erkennen. Betrachtet man die Färbung
gegen das T-Zell-Epitop CD4, so
erkennt man, dass einige der
CD4-positiven T-Zellen auch positiv für BrdU sind (Abb. 1A, Pfeil
und Insert). Nun ist es möglich,
alle Zellen mit Zellkern per TissueQuestTM auszuwerten. Hierfür kann beispielsweise die DAPIFluoreszenz als Referenz verwendet werden. Vergleichbar mit
gewöhnlichen FACS-Analysen ist
somit eine Bezugspopulation definiert, die hinsichtlich verschiedener fluoreszenzmarkierter Epitope (BrdU und CD4) untersucht
werden kann. Das Dot-Plot-Diagramm in Abbildung 1B zeigt,
dass 25,65 Prozent (3,87 Prozent
+ 21,77 Prozent) der Zellen in
dem Gesichtsfeld sich in Teilung
befinden. Darüber hinaus ist die
Aussage möglich, dass sich
29,39 Prozent der CD4+-T-Zellen
– bezogen auf die Gesamtpopulation der ausgewerteten CD4+-TZellen (21,77 Prozent + 52,28
Prozent) – in Teilung befinden. Durch serielle Schnitte
kann zudem festgestellt werden, ob sich die klonale T-ZellExpansion innerhalb eines
sekundär lymphatischen Organs statistisch gleichmäßig
über das Organ verteilt oder
in definierten Bereichen stattfindet.
Ein weiterer Vorteil dieser
Technik liegt darin, dass einzelne Zellen aus dem Dot-PlotDiagramm direkt in den
Schnitt zurückverfolgt werden
können (Abb. 1, roter Kreis).
Betrachtet man zudem die
Fluoreszenzintensität, so sind
Aussagen bezüglich der Markerdichte möglich. Somit erlauben
sich Rückschlüsse aufgrund der
Markerexpressionsdichte. Verwendet man hierbei weitere für
die T-Zell-Aktivierung typische
Marker, wie z. B. CD62L oder
CD69, kann über deren Fluoreszenzintensität der Aktivierungszustand der sich teilenden Zelle
bestimmt werden.
Fazit
Die hier vorgestellte Methode
erlaubt die Identifikation der proliferierenden Zellen in situ. Somit
bildet diese Anwendung eine hervorragende Ergänzung oder sogar
Alternative zu bisherigen FACSAnalysen, bei denen wichtige
Informationen über die Lokalisation der Zellen verloren gehen.
Danksagung
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft
(RI 1849/1-1) unterstützt. Dank
gilt auch der Firma TissueGnostics (Wien, Österreich) für die
Beratung und Bereitstellung einer
TissueQuest™-Testversion.
ó
Literatur
[1] Ritter U, Frischknecht F, van Zandbergen
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for Leishmania parasites? Trends Parasitol
25:505–510
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on cutaneous dendritic cell subsets in experimental leishmaniasis. Med Microbiol
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on BrdU indices in mammary carcinomas. J
Histochem Cytochem 48:355–362
[8] Florian C, Barth T, Wege AK et al. (2010)
An advanced approach for the characterization of dendritic cell-induced T cell proliferation in situ. Immunobiology 215:855–862
Christian Florian (links) und
Uwe Ritter
Korrespondenzadressen:
PD Dr. Uwe Ritter
Universität Regensburg
Institut für Immunologie
Franz-Josef-Strauss-Allee 11
D-93053 Regensburg
Tel.: 0941-944-5464
Fax: 0941-944-5462
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