Untersuchungen in einem Peritonitismodell der Maus

Die Rolle der CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis Untersuchungen in einem Peritonitismodell der Maus
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Mandy Busse, geb. Klabunde
geboren am 18.03.1979
in Anklam
Greifswald, 17.08.2007
Dekan: .............................................................................................................................
1. Gutachter : ..................................................................................................................
2. Gutachter: ..................................................................................................................
Tag der Promotion: ..........................................................................................................
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen
Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht
wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
darin angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
I
VII
1. Einleitung
1
1.1 Definition und Epidemiologie der Sepsis
1
1.2 Das Immunsystem und seine Funktion
2
1.2.1 Zelluläre Abwehr
2
1.2.1.1 Das angeborene Immunsystem
3
Antigenerkennung und Aktivierung der Zellen des angeborenen
Immunsystems
3
Effektormechanismen des angeborenen Immunsystems
5
1.2.1.2 Das adaptive Immunsystem
5
Rezeptoren und Aktivierung von T-Lymphozyten
6
Der T-Zell-Rezeptor-Komplex
6
Corezeptoren auf T-Zellen
6
Antigenerkennung der T-Zellen
6
Costimulatorisch wirksame Rezeptoren
7
Expression und Funktion von CTLA-4
8
Effektormechanismen der T-Zellen
10
Rezeptoren und Aktivierung von B-Lymphozyten
11
Kognate T-Zell- B-Zellinteraktion und Keimzentrumsreaktion
12
Das immunologische Gedächtnis
13
Zusammenwirken von angeborenem und adaptivem Immunsystem
14
Regulatorische T-Zellen- Bindeglied zwischen angeborenem und
erworbenem Immunsystem?
15
1.2.2 Humorale Abwehr
16
1.3 Immunantworten während einer Sepsis
16
1.3.1 Die Rolle der T-Zellen bei einer Sepsis
17
1.4 Tiermodelle zur Untersuchung der Pathophysiologie der Sepsis
19
1.5 Therapieansätze zur Behandlung einer Sepsis
20
Ziele der Arbeit
22
I
Inhaltsverzeichnis
2. Material und Methoden
24
2.1 Material
24
2.1.1 Allgemein verwendete Materialien
24
Laborgeräte
24
Verbrauchsmaterialien
25
2.1.2 Material für zellbiologische und molekularbiologische Arbeiten
25
Reagenzien für zellbiologische Arbeiten
25
Reagenzien für molekularbiologische Arbeiten
29
Testsysteme
29
2.1.3 Lösungen
30
Lösungen zur Gewinnung und Analyse von Zellen
30
Lösungen zur Gewinnung monoklonaler Antikörper
31
Lösungen zur Analyse von Poteinen
32
2.1.4 Zelllinien
33
2.1.5 Antikörper
34
Antikörper für die Fluoreszenzfärbung
34
Antikörper für die immunhistochemische Färbung
34
Antikörper für die FACS-Färbung
35
Isotypkontrollen
36
Antikörper für ELISA
36
2.2 Methoden
37
2.2.1 Tierexperimentelle Methoden
37
2.2.1.1 Haltung der Tiere
37
2.2.1.2 CASP-Operation
37
2.2.1.3 Interventionsexperimente
38
Depletion oder Blockade von T-Zellpopulationen bzw. ihrer Funktion
38
SEB-induzierter Schock
39
2.2.1.4 Überlebenskurven
39
2.2.1.5 Immunisierung
39
2.2.2 Zellbiologische Versuche
40
2.2.2.1 Gewinnung von Vollblut und Serum
39
2.2.2.2 Lavage des Peritoneums
39
2.2.2.3 Gewinnung von Splenozyten und Thymozyten
40
II
Inhaltsverzeichnis
2.2.2.4 Gewinnung lymphomyeloider Zellen der Leber
40
2.2.2.5 Zellzählung
41
2.2.2.6 Organlyse
41
2.2.2.7 Bakteriologische Untersuchungen
42
2.2.2.8 Stimulation von Zellen in vitro
42
Zellkultur
42
Stimulation von Zellen in vitro
43
2.2.2.9 Herstellung von Kryostatschnitten
43
2.2.3 Nachweis der Aktivierung von Zellen
43
2.2.3.1 Nachweis der Phagozytoseaktivität (Phagotest)
43
2.2.3.2 Nachweis der Expression proinflammatorischer Zytokine mit einem
Cytometric bead array (CBA)
44
2.2.3.3 Nachweis des Immunglobulinspiegels im Serum
45
2.2.3.4 Nachweis von anti-TNP-spezifischen Antikörpern im Serum
46
2.2.3.5 Proliferationsassay mit [³H]-Thymidin
46
2.2.3.6 Fluoreszenzfärbungen
47
Fluoreszenzfärbung von CTLA-4 und CD4 auf histologischen Schnitten
47
Färbung apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Test auf
histologischen Schnitten
48
Färbung von Keimzentren auf histologischen Schnitten
48
2.2.3.7 Immunhistologische Färbungen
49
HE-Färbung
49
Immunhistochemische Färbung von Granulozyten und Makrophagen
49
2.2.3.8 FACS-Färbungen
FACS-Färbung von Zellen in murinem Vollblut
49
49
FACS-Färbung von Splenozyten, Thymozyten und lymphomyeloider
Zellen der Leber
50
2.2.4 Molekularbiologische Methoden
51
2.2.4.1 Gewinnung monoklonaler Antikörper
51
Gewinnung antikörperhaltigen Zellkulturüberstandes
51
Gewinnung von Antikörpern
51
Bradford-Test
51
Bestimmung der Proteinkonzentration durch Messung der
optischen Dichte
52
III
Inhaltsverzeichnis
Erhöhung der Konzentration der Antikörper
52
SDS-Gelelektrophorese zur Prüfung der Reinheit der
Antikörperpräparationen
52
Bestimmung der Endotoxin-Konzentration in
Antikörperpräparationen
52
Entfernung des Endotoxins aus den Antikörperpräparationen
53
2.2.4.2 Nachweis einer Kontamination von Hybridomzellen mit Mycoplasmen
54
Gewinnung von DNA aus Hybridomzellen
54
Nachweis von Mycoplasmen durch PCR
54
2.2.4.3 Real-time PCR
55
RNA-Isolation mit Trizol
55
Messung von IDO mRNA mit Real-time PCR
56
2.2.5. Statistische Auswertungen
57
3. Ergebnisse
58
Themenkomplex I: Interventionen vor CASP und deren Folgen
58
Ausgangssituation
58
3.1 Funktion der CD4+ T-Lymphozyten bei der CASP
58
3.1.1 Depletion von CD4+ T-Zellen
58
3.1.2 Überleben einer polymikrobiellen Sepsis nach der Depletion
der CD4+ T-Zellen
61
3.1.3 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Zellzahl im
Peritoneum nach CASP
62
3.1.4 Einfluss der Depletion CD4+ T-Zellen auf die Phagozytoseaktivität im
Blut
63
3.1.5 Einfluss der Depletion CD4+ T-Zellen auf die bakterielle Last nach
CASP
64
+
66
+
69
3.1.6 Bedeutung der Depletion CD4 T-Zellen für Expression von Zytokinen
3.1.7 Bedeutung der Depletion CD4 T-Zellen für die Expression von IDO
3.1.8 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Apoptoserate in der
Milz
70
3.1.9 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Apoptoserate im
Thymus
71
+
3.1.10 Bedeutung der Depletion CD4 T-Zellen für die Infiltration von
IV
Inhaltsverzeichnis
Zellen des angeborenen Immunsystems in die Milz und die Leber
72
3.1.10.1 Anteil von Granulozyten und Makrophagen in der Milz nach
Depletion der CD4+ T-Zellen
73
3.1.10.2 Anteil von Makrophagen in der Leber nach Depletion der
CD4+ T-Zellen
74
3.2 Funktion der CTLA-4-positiven T-Lymphozyten bei der CASP
76
3.2.1 Blockade von CTLA-4
76
3.2.2 Überleben einer polymikrobiellen Sepsis nach Blockade von CTLA-4
76
3.2.3 Expression von Aktivierungsmarkern nach Blockade von CTLA-4
76
3.2.4 Expression von Zytokinen nach Blockade von CTLA-4 in der
Peritoneallavage und im Serum
78
3.2.6 Apoptose in der Milz nach Blockade von CTLA-4
81
3.2.7 Vergleich des anti-CTLA-4-Antikörpers mit einem Isotyp-Antiköper
82
3.3 Depletion regulatorischer T-Zellen vor CASP
84
3.4 Bedeutung einer T-Zell-Hemmung durch Tacrolimus nach CASP
85
Wahl einer geeigneten Dosis
85
Überleben Tacrolimus-vorbehandelter Tiere nach CASP
86
Themenkomplex II: Immunologische Langzeitkonsequenzen einer
generalisierten polymikrobiellen Sepsis
87
3.5 Entwicklung des Gewicht peripherer Lymphorgane im Zeitverlauf nach
CASPI
89
3.6 Apoptose in der Milz
90
3.7 Zusammensetzung der Zellpopulationen im Langzeitverlauf nach CASPI
93
3.7.1 Entwicklung der Zellzahlen von Milz, Thymus und mesenterialen
Lymphknoten nach CASPI
3.7.2 Anteil der Granulozyten in der Milz im Langzeitverlauf nach CASPI
93
94
3.7.3 Phänotypische Analyse der T-Zellpopulationen im Zeitverlauf nach
CASPI
96
3.7.3.1 Anteil der T-Lymphozyten in der Milz und den mesenterialen
Lymphknoten im Langzeitverlauf nach CASPI
96
3.7.3.2 Untersuchung des Anteils CD45RB- und CD62L-exprimierender
T-Zellpopulationen
97
3.7.3.3 Untersuchung CD103+ regulatorischer T-Zellen in der Milz und den
mesenterialen Lymphknoten im Zeitverlauf nach CASPI
101
V
Inhaltsverzeichnis
3.7.4 Expression von Aktivierungsmarkern im Zeitverlauf nach CASPI
102
3.8 Expression von Zytokinen im Zeitverlauf nach CASPI
104
3.9 Entwicklung von Keimzentren
107
3.10 Expression von IgM und IgG im Langzeitverlauf nach CASPI
107
3.11 Auswirkungen der CASPI auf das immunologische Gedächtnis
109
3.11.1 Einfluss einer generalisierten, polymikrobiellen Infektion auf die
primäre Immunantwort
111
Proliferation muriner Splenozyten nach Restimulation mit TNP-KLH
in vitro nach Primärimmunisierung
111
Bildung TNP-spezifischer Antikörper nach Primärimmunisierung
113
3.11.2 Einfluss einer generalisierten, polymikrobiellen Infektion auf die
sekundäre Immunantwort
114
Proliferation muriner Splenozyten nach Restimulation mit TNP-KLH
in vitro nach Sekundärimmunisierung
114
Bildung TNP-spezifischer Antikörper nach Sekundärimmunisierung
116
4. Diskussion
117
5. Literaturverzeichnis
143
6. Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen
Patienten
159
Expression von CTLA-4 auf T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut
von chirurgischen Hochrisikopatienten
(Teil einer prospektiven klinischen Pilotstudie)
158
Einleitung
158
Material und Methoden
158
Ergebnisse
162
Diskussion
176
Literatur
182
Anhang
184
7. Zusammenfassung
218
8. Anhang: Bildmaterial
220
Danksagung
Lebenslauf
Veröffentlichungen
VI
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Ag
Antigen
ADCC
Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (antibodydependent cellular cytotoxictiy)
AICD
aktivierungsinduzierter Zelltod (activation-induced cell death)
Ak
Antikörper
APC
antigenpräsentierende Zellen
CARS
kompensierende anti-inflammatorische Antwort (compensatory
anti-inflammatory response syndrome)
CASP
Colon ascendens stent peritonitis
CASPI
Colon ascendens stent peritonitis intervention
CBA
Cytometric Bead Array
CCR
Chemokinrezeptor
ConA
ConcanavalinA
cpm
counts per minute
CR
complement receptor
CRP
C-reaktives Protein
CD
Differenzierungsantigen (cluster of differentiation)
CLP
cecal ligation and puncture
CTL
Zytotoxische T-Zelle
CTLA-4
cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4
DABCO
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan
DC
dendritische Zellen
ELISA
enzyme linked immunabsorbent assay
FACS
fluorescence activated cell scanning
FCS
fötales Kälberserum (fetal calf serum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
Foxp3
Forkhead box protein 3
h
Stunde (hour)
HLA
Human Leukocyte Antigen
ICOS
inducible co-stimulator
IDO
Indolamin-2,3-dioxygenase
IFN
Interferon
VII
Abkürzungsverzeichnis
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
ITAM
immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
KLH
keyhole limpet hemocyanin
LSC
Laser-Scanning-Zytometer
LPS
Lipopolysaccharid
mAk
monoklonaler Antikörper
MARS
gemischte antagonistishe Antwort (mixed antagonists response
syndrome)
MCP
Monocyte chemoattractant Protein
MHC
Haupthistkompatibilitaätskomplex (major histocompatibility
complex)
MODS
Multiorganversagen (multiple organ dysfunction syndrome)
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
PAMPs
pathogen-associated molecular patterns
OD
optische Dichte
OVA
Ovalbumin
PBMC
mononucleäre Zellen aus peripherem Blut
PBS
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline)
PCR
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PCT
Procalcitonin
PE
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyd
PMA
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat
PMN
polymorphkernige Neutrophile
PMT
Photovervielfacherröhre (Photomultiplier tube)
POD
Peroxidase
PRR
pattern recognition receptors
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
SD
Standardabweichung
SEB
Staphylokokken Enterotoxin B
SIRS
systemische Entzündungsreaktion (systemic inflammatory
response syndrome)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
VIII
Abkürzungsverzeichnis
R10F
RPMI 1640 mit 10% FCS
RT
Raumtemperatur
TCR
T-Zellrezeptor
TGF
Transforming growth fator
Th
T-Helferzelle
TLR
Toll-like receptor
TNF-α
Tumornekrosefaktor
TNP
Trinitrophenyl
Treg
Regulatorische T-Zellen
TRITC
Tetramethyl-Rhodamin-Isocyanat
TUNEL
TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) -mediated dUTPbiotin nick end labeling
IX
Einleitung
1. Einleitung
Trotz aller Fortschritte auf dem Gebiet der Intensivmedizin ist die Sepsis, die Reaktion
des Organismus auf eine systemische Infektion, nach wie vor eine schwer beherrschbare
und relativ häufige Komplikation, nicht selten zum Tod des Patienten führt. In den
folgenden Abschnitten soll eine Übersicht über dieses Krankheitsbild gegeben werden,
es sollen pathophysiologische Ursachen betrachtet werden und ein kurzer Einblick in
die Forschung und Therapieansätze geliefert werden.
1.1 Definition und Epidemiologie der Sepsis
In einer im Jahr 2001 veröffentlichten Studie zur Epidemiologie der Sepsis in den USA
zeigte sich, dass es sich um eine weit verbreitete, teure und häufig tödlich endende
Erkrankung handelt [1]. Auch in Deutschland erkranken nach neuesten Schätzungen des
Kompetenznetzwerkes Sepsis (SepNet) jährlich 154.000 Patienten an einer Sepsis. Die
Erkrankung ist mit einer Mortalität von 54% (septischer Schock, schwere Sepsis) bzw.
20% (Sepsis) verbunden. Damit ist die Sepsis eine der häufigsten Todesursachen auf
Intensivstationen mit einer vergleichbaren Mortalität wie nach einem akuten
Herzinfarkt. Die Kosten für die intensivmedizinische Behandlung von Patienten mit
schwerer Sepsis belaufen sich in Deutschland auf jährlich 1,77 Milliarden Euro,
zusammen mit den indirekten Kosten ist von 6,3 Milliarden Euro auszugehen.
Die Diagnostik einer Sepsis ist vor allem dadurch erschwert, dass bis zum heutigen
Zeitpunkt noch keine zuverlässigen diagnostischen Testverfahren existieren. Daneben
ist noch keine kausale Therapie etabliert, außer der Gabe von Antibiotika und eventuell
von aktiviertem Protein C.
Zunächst ist zwischen einer Infektion (Eindringen von Bakterien, Viren, Pilzen etc. in
einen Wirt) und einer Sepsis (Antwort des Wirts auf diese Infektion) zu differenzieren.
Beim Krankheitsbild „Sepsis“ wiederum sind verschiedene Phasen zu unterscheiden:
das systemic inflammatory response syndrome (SIRS), Sepsis, schwerer Sepsis, dem
septischen Schock und MODS [2] [3], die durch das Auftreten verschiedener Symptome
definiert sind. Festzustellen bleibt, dass kein Symptom spezifisch für eine „Sepsis“ ist.
SIRS ist u. a. charakterisiert durch eine Hyper- oder Hypothermie, Leukozytose oder
Leukopenie, eine erhöhte Herzschlag- und eine verminderten Respirationsrate. Eine
Sepsis liegt vor, wenn neben dem SIRS eine Infektion nachgewiesen wurde. Ist die
Sepsis assoziiert mit einer Organfehlfunktion, Hypoperfusion oder Hypotension oder ist
1
Einleitung
der mentale Zustand des Patienten akut verändert, definiert dies eine schwere Sepsis.
Bewirkt eine adäquate Flüssigkeitszufuhr keine Verbesserung der Hypotension und
zeigen sich Abnormalitäten der Perfusion von Organen, charakterisiert dies einen
septischen Schock. Kommt es zur Fehlfunktion von Organen, so dass die Homöostase
nicht ohne intensivmedizinische Interventionen aufrecht erhalten werden kann, ist das
MODS
(multiple
organ
dysfunction
syndrome)
eingetreten.
Das
reversible
Organversagen kann irreversibel werden und schließlich zum Tod des Patienten führen.
Während die meisten Patienten unter intensivmedizinischer Betreuung das initiale SIRS
überleben, ohne dass sich ein MODS entwickelt, kann es bei ihnen nach einer Phase
klinischer Stabilität zur Entwicklung eines CARS (compensatory anti-inflammatory
response syndrome) kommen. Dieses Stadium ist charakterisiert durch eine
supprimierte Immunität und verminderte Fähigkeit zur Abwehr von Infektionen und
wird deshalb auch als „Immunparalyse“ bezeichnet. Sollte sich der Patient während des
CARS infizieren, kann sich wiederum ein MODS entwickeln und den Tod des Patienten
bedingen.
Eine Sepsis kann ausgelöst werden durch Gram-positive und Gram-negative Bakterien,
Pilze, Viren und Parasiten. Zu der Gruppe von Patienten, die ein erhöhtes Risiko für die
Entwicklung einer Sepsis aufweisen, gehören ältere Menschen und Patienten mit
metabolischen und neoplastischen Erkrankungen oder einer Immundefizienz. Auch
immunsupprimierte Patienten z.B. nach Organtransplantationen und jene, die auf die
Nutzung von Kathetern und anderer invasiver Geräte angewiesen sind, zählen dazu.
1.2 Das Immunsystem und seine Funktion
Der Entstehung einer Sepsis liegt eine Dysregulation der induzierten Immunantworten
zugrunde. Bevor diese näher betrachtet werden, sollen zunächst die Komponenten des
Immunsystems und ihre Funktionen vorgestellt werden.
1.2.1 Zelluläre Abwehr
Die zelluläre Abwehr beruht auf den Zellen des angeborenen und des adaptiven
Immunsystems, die verschiedene Strategien im Kampf gegen Infektionen entwickelt
haben.
2
Einleitung
1.2.1.1 Das angeborene Immunsystem
Wie alle Immunzellen stammen auch die Zellen des angeborenen Immunsystems von
den pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks ab, aus denen sich
die allgemeinen lymphatischen und myeloiden Vorläuferzellen entwickeln. Die Zellen
des angeborenen Immunsystems sind ein Teil dieser „myeloiden Reihe“. Zu ihnen
gehören die Granulozyten, die aufgrund ihrer Morphologie auch als polymorphkernige
Leukozyten (PMN) bezeichnet werden und sich weiter in neutrophile, eosinphile oder
basophile Granulozyten unterteilen lassen sowie die Monozyten, welche nach ihrer
Extravasation in die Gewebe „Makrophagen“ genannt werden. Sie bilden die erste
Verteidigungsfront gegen eingedrungene Mikroorganismen, welche sie phagozytieren
(daher werden sie auch als „Phagozyten“ bezeichnet) können. Schätzungsweise 99%
aller Infektionen werden nur durch das angeborene Immunsystem abgewehrt.
Natürliche Killer (NK)-Zellen stammen zwar von den lymphatischen Vorläuferzellen
ab, haben jedoch keine antigenspezifischen Rezeptoren und sind deshalb Teil des
angeborenen Immunsystems.
Antigenerkennung und Aktivierung der Zellen des angeborenen Immunsystems
Die Phagozyten erkennen Bakterien an Oberflächenkomponenten, die als PAMPs
(„pathogen“-associated molecular patterns) bezeichnet werden. Diese konservierten
molekularen Bestandteile von pathogenen und apathogenen Mikroorganismen, zu denen
z. B. LPS und Peptidoglykane gehören, werden von pattern recognition receptors (PRR)
erkannt.
Scavenger-Rezeptoren werden u. a. von Gewebemakrophagen exprimiert. Sie binden
Bakterien und bakterielle Komponenten wie LPS (Lipopolysaccharid). Die Bindung an
Scavenger- Rezeptoren führt zwar zur Aufnahme des Liganden, nicht aber zur
Aktivierung der Zellen. Ihre protektive, anti-inflammatorische Funktion besteht im
Entfernen überschüssiger Bakterien und deren Bestandteile und somit in der
Unterbindung einer Ligation durch CD14.
Andere von den Zellen des angeborenen Immunsystems exprimierte Rezeptoren
gehören zur Familie der β2-Integrine, die gebildet werden durch drei eng verwandte
Glycoproteine der Zelloberfläche mit einer variierenden α-Kette (CD11) und einer
identischen β-Kette (CD18). LFA-1 (CD11a/CD18; α1β2) wird von allen Leukozyten
exprimiert und erkennt die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und ICAM-2. Mac-1
(CD11b/CD18; α2β2; complement receptor [CR] 3) wird exprimiert durch Monozyten,
3
Einleitung
Makrophagen, PMN und Lymphozyten und erkennt oberflächengebundenes C3bi und
Fibrinogen. CR4 (CD11c/CD18; α3β2) ist auf Monozyten und Makrophagen zu finden
und bindet wie das murine Zelloberflächenmolekül Mac-1 oberflächengebundenes
Fibrinogen.
Zu den bedeutendsten Rezeptoren der Zellen des angeborenen Immunsystems zählen
CD14 und die Toll-like Rezeptoren (TLR). CD14 ist ein Glykoprotein, welches in zwei
Formen zu finden ist: einer membrangebundenen und einer löslichen (sCD14). Die
membrangebundene Form wird u. a. exprimiert von Monozyten, Makrophagen, PMN,
B-Zellen und den Parenchymzellen der Leber [4] [5] [6] [7]. Die Expressionsdichte von
CD14 erhöht sich mit der Reifung der Zellen [8], ebenso führt der Kontakt mit LPS zu
einer vermehrten Expression [4] [9] [10] [11]. CD14 dient nicht nur LPS als Rezeptor,
sondern hat auch andere mikrobielle Liganden. Der Transfer von LPS zu CD14 wird
katalysiert durch LBP (LPS-bindendes Protein). LBP ist ein Akute-Phase-Protein [12],
welches von Leber, Lunge und Nieren exprimiert wird. Die Produktion von LBP wird
durch IL-6 und IL-1 induziert [13, 14].
CD14 ist ein Glykosylphosphadidylinositol-verankerter Rezeptor ohne Transmembrandomäne [15]. Deshalb wird für die Weiterleitung der Signale ein weiteres Molekül
benötigt, TLR4. TLR4 ist ein Mitglied der Familie der Toll-like-Rezeptoren (TLR), zu
der bis jetzt 10 Rezeptoren gehören (TLR1-TLR10). Die TLR gehören zur TIRSuperfamilie, die durch eine Toll/IL-1-Rezeptordomäne (TIR) charakterisiert ist. TLR25 und TLR9 sind an der Erkennung mikrobieller Bestandteile beteiligt, unterscheiden
sich jedoch hinsichtlich ihrer Liganden. TLR1 und TLR6 hingegen haben modulierende
Funktionen. Auch unterscheiden sie sich bezüglich ihres Expressionsmusters. Die TLR
haben eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung und Unterscheidung einer großen
Vielfalt mikrobieller Bestandteile haben.
NK-Zellen erkennen ihre Zielzellen anhand fehlender oder stark reduzierter Expression
von MHC-Klasse I. Sie haben zwei Arten von Rezeptoren auf ihrer Oberfläche:
aktivierende (z.B. calciumbindende C-Typ Lektine) und inhibierende Rezeptoren
(Mitglieder aus folgenden Familien: murin: C-Typ Lektine namens Ly49; human: p58
und p70; beide: CD94:NKG2). Sie induzieren bzw. hemmen die Aktivierung der NKZellen. Daneben exprimieren NK-Zellen FcγRIII (CD16), durch welche sie IgGAntikörperbeladene Zellen binden und im Prozess der antikörper-abhängigen
4
Einleitung
zellvermittelten Zytotoxizität (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)
töten.
Effektormechanismen des angeborenen Immunsystems
Nach der Erkennung bakterieller Komponenten werden die Phagozyten aktiviert. LPSaktivierte Makrophagen produzieren freie Sauerstoffradikale und andere Mediatoren
(Lysozym, kationische Proteine, Laktoferrin) mit mikrobizider Wirkung. Es kommt
ebenfalls zur Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine (u. a. TNF-α, IL-1, IL-6,
IL-12, HMGB1), Chemokine (u. a. MCP-1, IL-8, MIP-1α und β) sowie
Lipidmediatoren (u. a. platelet-activating factor, Prostaglandine, Leukotriene), die das
umgebende Gewebe beeinflussen. Zusammen mit den Komplementfaktoren C3a und
C5a führen diese Mediatoren zur Anlockung (ermöglicht durch Vasodilatation und
verstärkter Expression von Adhäsionsmolekülen) und Aktivierung von PMN, welche
sich in Diapedese und der Produktion verschiedener pro-inflammatorischer Mediatoren
und anti-mikrobiell wirksamer Substanzen äußern.
1.2.1.2 Das adaptive Immunsystem
Das adaptive oder erworbene Immunsystem ist phylogenetisch jünger als das
angeborene Immunsystem und nur bei Wirbeltieren zu finden. Die Zellen des adaptiven
Immunsystems entwickeln sich aus den „allgemeinen“ lymphatischen Vorläuferzellen
und werden entsprechend dem Ort ihrer Reifung als B- (bei der Reifung im
Knochenmark; englisch: bone marrow) oder als T-Lymphozyten (wenn die Zellen in
einem sehr frühen Entwicklungsstadium in den Thymus auswandern, um dort ihre
Reifung zu vollenden) bezeichnet.
Während die Zellen des angeborenen Immunsystems relativ unspezifisch Mikrobenassoziierte molekulare Muster erkennen, ist die Antigenerkennung der Lymphozyten
hochspezifisch. Jeder Lymphozyt exprimiert Antigenrezeptoren einer einzigen
Antigenspezifität. Diese ist bei individuellen Lymphozyten verschieden, so dass im
Körper Millionen von B- und T-Zellen vorhanden sind, die sich in ihrer
Antigenspezifität voneinander unterscheiden.
5
Einleitung
Rezeptoren und Aktivierung von T-Lymphozyten
Der T-Zell-Rezeptor-Komplex
Der T-Zell-Rezeptor (TCR) wird gebildet durch zwei Polypeptidketten, entweder einer
α- und einer β-Kette oder, in seltenen Fällen, einer γ- und einer δ-Kette, die durch
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Der T-Zell-Rezeptor ist verantwortlich für
die Antigenerkennung, nicht jedoch für die Signaltransduktion, da er nicht über die
benötigten zytoplasmatischen Domänen verfügt. Diese Funktion wird übernommen vom
CD3-Komplex, der sich aus den drei Proteinen CD3γ, CD3δ und CD3ε zusammensetzt,
und der eng mit dem TCR assoziiert ist. Daneben ist ein Dimer aus zwei ζ-Ketten mit
dem TCR assoziiert. Eine strukturelle Gemeinsamkeit aller CD3-Proteine sowie der ζKetten sind ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) in der
zytoplasmatischen Domäne, die nach Stimulation des TCR von den Tyrosinkinasen Lck
und Fyn phosphoryliert werden. Die Signalweiterleitung erfolgt anschließend über GProteine und eine Kaskade von Serinproteinkinasen, die letztlich zu einer Aktivierung
von Transkriptionsfaktoren und ihrer Translokation in den Zellkern führt, wo sie die
Transkription von Genen einleiten, welche z. B. für Proliferation und Differenzierung
verantwortlich sind.
Corezeptoren auf T-Zellen
Neben dem T-Zell-Rezeptor exprimiert jede T-Zelle einen weiteren Rezeptor, welcher
über die Art der erkannten Peptide und die Funktion der Zelle nach deren Aktivierung
und Differenzierung bestimmt. Es gibt zwei dieser Corezeptoren, von denen jede Zelle
jedoch nur einen exprimieren kann: entweder CD4 oder CD8. Die Entscheidung
darüber, welches der beiden Glykoproteine auf der Zelloberfläche zu finden ist, fällt im
Thymus während der Reifung der T-Zellen.
Antigenerkennung der T-Zellen
T-Zellen erkennen ihr spezifisches Antigen nur, wenn es ihr gebunden an MHCMoleküle
präsentiert
wird.
Es
handelt
sich
dabei
um
membrangebundene
Glykoproteine, die vom Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility
complex; MHC) codiert werden. MHC-Moleküle der Klasse I werden von fast allen
kernhaltigen Zellen exprimiert, jedoch in unterschiedlichem Umfang. Sie präsentieren
Peptide von Proteinen, die im Zytoplasma prozessiert wurden. Es handelt sich dabei
normalerweise um Peptide von Selbst-Proteinen, sie können aber auch von Pathogenen
6
Einleitung
stammen, insbesondere Viren. Die Bindung von MHC-Klasse I-Molekül an das Peptid
erfolgt im endoplasmatischen Retikulum (ER), nach dem Transport an die
Zelloberfläche wird der Peptid-MHC-Klasse I-Komplex von CD8+ T-Zellen erkannt.
MHC-Moleküle der Klasse II hingegen werden im allgemeinen nur von professionellen
antigenpräsentierenden Zellen (APC) exprimiert, zu denen vor allem dendritische
Zellen (DC), aber auch Makrophagen und B-Lymphozyten gehören. Die von ihnen
präsentierten Peptide stammen von Selbst-Proteinen aus dem Extrazellulärraum, bei
einer Infektion jedoch präsentieren sie Peptide von Pathogenen, in entweder in Vesikeln
leben oder die durch Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden.
Peptide, die an MHC-Moleküle der Klasse II gebunden sind, werden durch CD4+ TLymphozyten erkannt.
Costimulatorisch wirksame Rezeptoren
Die Ligation von TCR und Corezeptor an den Komplex aus MHC-Molekül und Antigen
liefert das erste Signal zur Aktivierung der T-Zellen. Dieses ist jedoch nicht
ausreichend, um naive T-Lymphozyten zu Proliferation und Differenzierung anzuregen.
Dazu wird ein zweites, costimulatorisches Signal benötigt. Es muss von derselben Zelle
geliefert werden, die auch den MHC-Antigen-Komplex präsentiert hatte. Es sind
mehrere Moleküle identifiziert worden, die diese Funktion erfüllen, und es werden
wahrscheinlich weitere Mitglieder dieser Familie entdeckt werden. Die bedeutendste
und am genauesten untersuchte Interaktion ist die der B7-Moleküle CD80 (B7.1) und
CD86 (B7.2) mit CD28. CD80 und CD86 sind strukturverwandte Glykoproteine, die
nur auf der Oberfläche von professionellen antigenpräsentierenden Zellen zu finden
sind. Dabei wird CD80 von unreifen dendritischen Zellen praktisch nicht, CD86 nur in
geringen Umfang exprimiert. Die Expression beider Moleküle wird induziert bzw.
verstärkt nach Stimulation der APC als Reaktion z.B. auf eine Infektion, auf
proinflammatorische Zytokine oder den Kontakt mit aktivierten T-Zellen [16]. CD28 ist
ein aus zwei Glykoproteinen zusammengesetztes Homodimer, das konstitutiv von fast
allen humanen CD4-Zellen und 50% der CD8-Zellen, aber allen murinen T-Zellen
exprimiert wird. Durch die Bindung von CD28 an CD80 oder CD86 wird ein TCRunabhängiger Signaltransduktionsweg angesprochen, das wichtigste Ergebnis dieser
Interaktion ist die Erhöhung der Transkriptionsrate und die Stabilisierung der IL-2
mRNA, wodurch deutlich mehr IL-2 produziert wird. Das Zytokin IL-2 ist essentiell für
das Überleben, die Proliferation und Differenzierung einer T-Zelle. Sollte eine naive T7
Einleitung
Zelle ihr Antigen erkennen, jedoch kein costimulatorisches Signal geliefert bekommen,
wird sie anerg. Dies bedeutet, dass die T-Zelle nicht reagiert und auch später nicht mehr
aktiviert werden kann, selbst wenn sie dann das zweite Signal erhalten würde. Dieser
Mechanismus ist entscheidend für die Aufrechterhaltung peripherer Toleranz.
CD28 besitzt eine extrazelluläre immunoglobulin variable-like (IgV) Domäne, die von
einem kurzen, zytoplasmatischen Abschnitt gefolgt wird. Diese Struktur weisen auch
andere Moleküle auf, die deshalb zur CD28-Familie der Rezeptoren zusammengefasst
sind. Zu dieser Familie gehören ICOS (inducible costimulator; CD278), CTLA-4
(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4; CD152), PD-1 (programmed death-1;
CD279) und BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator; CD272). CD28, ICOS und
CTLA-4 sind beim Menschen auf dem Chromosom 2q33 nah beieinander angeordnet.
Sie verfügen über einen ungepaarten Cysteinrest, durch den sie an der Oberfläche der TZelle Homodimere bilden können [17]. Ihre Liganden binden sie mit einem PPP-Motiv,
in ihrem zytoplasmatischen Teil befindet sich ein zentrales Src homology 2 (SH2)Bindungsmotiv YXXM. PD-1 liegt auf dem Chromosom 2q37 und ist als Monomer auf
der Zelloberfläche zu finden [18], BTLA befindet sich auf dem Chromosom 3q13 und
ist wahrscheinlich auch als Monomer vorliegend. Die Expression von ICOS wird nach
der Stimulation der T-Zelle induziert, das Protein ist wie CD28 ein positiver Regulator
der T-Zell-Aktivierung. CTLA-4, PD-1 und BTLA hingegen wirken inhibierend auf die
Funktionen der T-Zellen.
Expression und Funktion von CTLA-4
CTLA-4 (CD152) wurde 1987 von Brunet et al. [19] bei der Suche nach Genen, die in
differenzierten zytotoxischen T-Zellen exprimiert werden, identifiziert. CTLA-4 ist ein
Homodimer, bestehend aus Polypeptidketten von jeweils 35 kDa, die über
Disulfidbrücken kovalent verbunden sind [20] [21]. CTLA-4 und CD28 sind zu 30%
homolog. CTLA-4 wird aber nicht nur von aktivierten CD8+ und CD4+ T-Zellen
exprimiert [22], sondern auch von aktivierten B-Zellen [23]. CD4+CD25+ regulatorische
T-Zellen hingegen exprimieren das Molekül konstitutiv.
CTLA-4 wird zwar auch von ruhenden T-Zellen exprimiert [24], ist aber vor allem in
intrazellulären Kompartimenten zu finden. 24-72 Stunden nach der Stimulation von TZellen erreicht die Expression von CTLA-4 an der Zelloberfläche maximale Werte [22]
[25]. CTLA-4 unterliegt einer komplexen intrazellulären Wanderung, vermittelt durch
die Bindung eines nicht phosphorylierten Tyrosinrests (Tyr165) an die Clathrin8
Einleitung
Adaptermoleküle AP-1 und AP-2 [26] [27]. Durch die so bedingte clathrin-vermittelte
Endozytose wird das Protein rasch internalisiert, so dass es bei ruhenden TLymphozyten nicht auf der Zelloberfläche akkumuliert. Nach Aktivierung der T-Zelle
wird die Expression von CTLA-4 stark erhöht, der Tyrosinrest wird phosphoryliert und
AP-2 dissoziiert vom CTLA-4, so dass es länger auf der Zelloberfläche nachweisbar ist
[28]. Aber auch bei aktivierten T-Zellen wandert das Protein ständig zwischen
intrazellulären Kompartimenten und der Oberfläche der Zelle, was seinen Nachweis
deutlich erschwert.
Nach der Aktivierung der T-Zelle wandert CTLA-4 zum Ort der Interaktion der T-Zelle
mit der APC [29] [30]. Dort bindet es ebenso wie CD28 an CD80 und CD86, jedoch
mit mindestens zwanzigfach höherer Affinität [31] [32], wodurch es zu einer
Kompetition um die Bindungsstellen der beiden B7-Moleküle kommen könnte. CTLA4 wirkt inhibierend auf die T-Zell-Aktivierung [33], was auch durch die Erzeugung
CTLA-4-defizienter Mäuse gezeigt wurde. Bei diesen Tieren kommt es zu einer
Störung der Proliferation der Lymphozyten, woraus eine Lymphadenopathie und
Splenomegalie resultiert. Die Entwicklung der T-Zellen im Thymus verläuft zwar
normal [34], die Mehrheit der peripheren T-Zellen jedoch sind aktiviert und autoreaktiv
[35]. Dieser schwere Immundefekt führt zu einem frühen Tod der Tiere im Alter von
drei bis vier Wochen [36, 37].
Durch die Blockade des Signalweges, der durch die Bindung von CTLA-4 an
CD80/CD86 ausgelöst wird, wird weniger CD25, Bcl-XL und IL-2 gebildet. Dadurch
kommt es zum Zellzyklusarrest und zu einer verstärkten Apoptose [38]. CTLA-4
inhibiert frühe Ereignisse der T-Zell-Aktivierung, nicht nur IL-2-abhängige, sondern
auch IL-2-unabhängige, so dass es möglicherweise antagonistisch zu TCR-vermittelten
Signalen und nicht nur zur CD28-vermittelten Costimulation wirkt [39, 40].
Ein weiterer Mechanismus, durch den CTLA-4 inhibitorisch wirken kann, wurde 2002
von Grohmann et al. [41] beschrieben, die gezeigt haben, dass die Bindung von CTLA4 an B7 auf dendritischen Zellen die Expression der Indolamin-2,3-dioxygenase (IDO)
erhöht, wodurch es zum vermehrten Abbau von Tryptophan kommt. Als Folge werden
die Aktivierung und die Proliferation der T-Zellen beendet, Produkte des
Tryptophankatabolismus können Apoptose in T-Zellen induzieren [42] [43].
Weiterhin wirkt CTLA-4 regulierend auf Immunantworten, indem es während der
Differenzierung von CD4-Zellen die Entwicklung von Th2-Zellen inhibiert, jedoch
keinen Einfluss auf Th1-Zellen nimmt. Nach der Differenzierung der T-Zellen aber
9
Einleitung
hemmt CTLA-4 die Produktion von Zytokinen sowohl von Th1- als auch von Th2Effektorzellen [44-46]. Allerdings wird CTLA-4 vorwiegend auf der Oberfläche von
aktivierten Th2-Zellen exprimiert, und schützt vor allem diese Zellen vor dem
aktivierungsinduzierten Zelltod (activation-induced cell death, AICD) [47].
CTLA-4 hat wichtige Funktionen bei der Immunantwort gegen Infektionen. Es wurde
gezeigt, dass die Blockade des Proteins die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen mit
intrazellulären Pathogenen wie Leishmania donovani [48] oder Trypanosoma cruzi
erhöht, assoziiert mit einer gesteigerten Produktion von IFN-γ [49]. Die Blockade von
CTLA-4 bewirkt eine uneingeschränkte, durch TCR- und CD28-vermittelte Aktivierung
von T-Lymphozyten und dadurch eine extensive Proliferation der Zellen. Dadurch steigt
die Frequenz zytokinsezernierender T-Zellen, insbesondere die der Th1-Zellen. Die
verbesserte Antwort des adaptiven Immunsystems führt schließlich zur gesteigerten
Beseitigung der Erreger. Die Blockade von CTLA-4 bei einer Infektion mit
Plasmodium berghei hingegen verschlimmert den Krankheitsverlauf [50]. Dieser
Erreger ist nur kurz extrazellulär und ansonsten in Erythrozyten präsent, welche nicht
zur Präsentationen von Antigenen befähigt sind. Bei der murinen Malaria wird CTLA-4
vor allen die Rolle zugeschrieben, pathogenspezifische T-Zellantworten zu begrenzen
und auf diese Weise vor pathologischen Reaktionen während der Infektion zu schützen.
Diese protektive Funktion wird durch die Blockade des Moleküls aufgehoben, so dass
der Verlauf der Erkrankung verschlimmert wird.
CTLA-4 kann darüber hinaus auch den Verlauf von Tumorerkrankungen beeinflussen.
Eine Blockade des Moleküls führte zu einer verbesserten T-Zellantwort gegen den
Tumor [51], ebenfalls durch eine erhöhte Produktion von IFN-γ [52].
Effektormechanismen der T-Zellen
CD8+ T-Effektorzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von
zytosolischen Erregern, zu denen vor allem Viren gehören. Nachdem eine CD8+ T-Zelle
aktiviert worden ist, setzt sie durch gezielte Exozytose in ihrer Granula gespeicherte
Zytotoxine frei, die sich in zwei Klassen von Proteinen unterteilen lassen, Perforine und
Granzyme. Diese bewirken die Lyse der Zielzelle. CD8+ T-Effektorzellen können aber
ebenso über FasL, eines ihrer Membranproteine, die Aktivierung von Fas in ihrer
Zielzelle bewirken und auf diesem Weg ebenfalls Apoptose induzieren. Sie werden
deshalb auch als zytotoxische T-Zellen (CTL) bezeichnet. Außerdem bilden CD8+ T-
10
Einleitung
Effektorzellen Zytokine wie IFN-γ, das die virale Replikation hemmt, die Expression
von MHC-Klasse I-Molekülen induziert und Makrophagen aktiviert.
CD4+ T-Zellen bilden nach ihrer Aktivierung verschiedene Zytokine, wodurch sie sich
in ihrer Funktion unterscheiden: Th1-Zellen (Th= T helper) bilden vor allem IL-2, das
für das Überleben und die Proliferation der T-Zellen essentiell ist, sowie IFN-γ, welches
Makrophagen-aktivierend wirkt. Th1-Zellen haben somit „Helferfunktion“ bei der
Abwehr intrazellulärer Pathogene. Aktivierte Th2-Zellen hingegen bilden vor allem IL4 und IL-10, Zytokine, die es ihnen ermöglichen, B-Zellen zu aktivieren. Th2-Zellen
sind damit an der Beseitigung extrazellulärer Krankheitserreger beteiligt. Die
Entscheidung, welcher der beiden CD4-Zelltypen bei einer Krankheit dominiert, kann
entscheidenden Einfluss auf den Verlauf und den Ausgang dieser Erkrankung haben.
Ein Grund hierfür ist, dass sich beide Untergruppen gegenseitig beeinflussen: IFN-γ
wirkt pro-inflammatorisch und inhibiert die Differenzierung der Th2-Zellen, IL-4
hingegen hemmt die Entwicklung der Th1-Zellen. Außerdem ist das von Th2-Zellen
ausgeschüttete, anti-inflammatorisch wirksame IL-10 ein negativer Regulator der
Aktivierung von Makrophagen.
Rezeptoren und Aktivierung von B-Lymphozyten
Der B-Zell-Rezeptor (BCR) besteht aus schweren und leichten Immunglobulinketten,
deren Antigenbindungsstellen dieselbe Spezifität aufweisen wie die Antikörper, die von
dieser B-Zelle nach ihrer Aktivierung synthetisiert würden. Der einzige Unterschied
liegt darin, dass der BCR an die Zelloberfläche gebunden ist, während Antikörper
löslich sind. Mit den schweren Ketten sind zwei Proteine assoziiert, Igα und Igβ.
Daneben verfügen B-Zellen über einen Corezeptor-Komplex, welcher aus den
Zelloberflächenmolekülen CD19, CD21 (Komplementrezeptor 2; CR2) und CD81
zusammengesetzt ist.
Die meisten Antikörperantworten sind auf die Hilfe aktivierter Th2-Zellen angewiesen
(siehe unten). Einige bakterielle Komponenten jedoch können auch unabhängig von der
Hilfe von T-Lymphozyten B-Zell-Antworten auslösen. Sie werden deshalb als
thymusunabhängige
Antigene
(thymus-independent;
TI)
bezeichnet.
Aufgrund
verschiedener Mechanismen, welche die TI-Antigene nutzen, um B-Zellen zu
aktivieren, werden sie in zwei Klassen eingeteilt: TI-1-Antigene induzieren in hoher
Konzentration direkt Proliferation und Differenzierung aller B-Zellen (polyklonale
Aktivierung). Zu diesem B-Zell-Mitogenen gehören bakterielle Lipopolysaccharide. TI11
Einleitung
1-Antigene können unreife und reife B-Zellen aktivieren, TI-2-Antigene nur reife BZellen. TI-2-Antigene, zu denen bakterielle Polysaccharide mit hochrepetitiven
Strukturen gehören, können B-Zellen nicht aus sich heraus stimulieren. Sie sind
bedeutend bei der Abwehr von Pathogenen, deren Oberflächenantigene keine T-ZellAntwort induzieren.
Kognate T-Zell- B-Zellinteraktion und Keimzentrumsreaktion
Zur Aktivierung von B-Zellen wird meist die Hilfe von T-Effektorzellen benötigt. Die
B-Zelle muss dazu das thymusabhängige Antigene (thymus-dependent; TD) mit ihrem
Oberflächenimmunglobulin binden, internalisieren und an MHC-II-Moleküle gebunden
zurück an die Oberfläche transportieren. Wenn es dort von einer T-Zelle derselben
Antigenspezifität erkannt wird, treten B-Zelle und T-Zelle in Wechselwirkung. Dieser
Prozess findet in der T-Zell-Zone von Lymphgeweben statt. Die sich dort befindenden
aktivierten T-Helferzellen fangen die antigenspezifischen B-Zellen, während die
anderen rasch in die B-Zell-Zone (Primärfollikel) wandern. Durch die Aktivierung
beginnen die B- und die T-Zellen zu proliferieren und bilden den Primärfokus. Nach
einiger Zeit werden viele der Lymphozyten apoptotisch, während ein Teil der B-Zellen
zu Plasmazellen differenzieren, die Antikörper sezernieren. Ein weiterer Teil der
proliferierenden B- und T-Zellen hingegen wandern in einen primären Lymphfollikel
und bilden dort ein Keimzentrum.
Dort differenzieren die aktivierten B-Zellen, was zu verschiedenen Modifikationen in
ihrem Antikörper führen kann, zu denen der Wechsel des Isotyps, die somatische
Hypermutation und die Affinitätsreifung gehören: Während alle naiven B-Zellen IgM
und IgD auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden durch den Klassenwechsel
Antikörper der Isotypen IgG, IgA oder IgE sezerniert. Die Isotypen entscheiden über
den Effektormechanismus, der bei einer B-Zellantwort genutzt wird. Durch die
Affinitätsreifung, ein Ergebnis aus somatischer Hypermutation und anschließender
Selektion von B-Zellen mit hochaffinen Oberflächenimmunglobulinen, steigt die
Affinität der Antikörper für das Antigen.
Die B-Zellen, die das Keimzentrum verlassen, differenzieren dann entweder zu
antikörpersezernierenden Plasmazellen oder aber zu B-Gedächtniszellen.
12
Einleitung
Das immunologische Gedächtnis
Nachdem die adaptive Immunantwort beendet ist, ist die Infektion meist unter Kontrolle
gebracht oder eliminiert. Dann setzt ein Zustand schützender Immunität ein, der auf den
Effektorzellen und den von ihnen produzierten Mediatoren basiert, die bei der
ursprünglichen Reaktion gebildet worden sind, sowie dem immunologischen
Gedächtnis. Darunter versteht man die Fähigkeit des Immunsystems, schneller und
effektiver auf einen Erreger zu reagieren, mit dem der Organismus schon einmal
Kontakt hatte. Es beruht auf dem Vorhandensein einer klonal expandierten Population
antigenspezifischer Lymphozyten.
Nach dem ersten Kontakt mit ihrem spezifischen Antigen erhöht sich die Anzahl der BZellen, die auf das Antigen reagieren können und die Affinität der von ihnen erzeugten
Antikörper ist gestiegen. Während zu Beginn der primären Reaktion auf das Antigen
zunächst Antikörper der Klasse IgM und erst später Antikörper anderer Isotypen
gebildet werden, überwiegen bei weiteren Antigenkontakten Antiköper der Klasse IgG,
daneben sind auch die Isotypen IgA und IgE präsent, da die B-Gedächtniszellen, die für
die Produktion dieser Antikörper verantwortlich sind, den Klassenwechsel bereits
vollzogen haben.
Nicht nur B-Zellen, sondern auch T-Zellen können sich zu Gedächtniszellen
entwickeln. Ihre Untersuchung ist jedoch deutlich problematischer als die der BGedächtniszellen, da sie viele phänotypische Eigenschaften von T-Effektorzellen
aufweisen. Sie sind dennoch langlebige Zellen, die sich in der Expression einiger
Zelloberflächenmoleküle, der Antwort auf Stimulation und der Expression von Genen,
die das Überleben der Zelle betreffen, unterschieden. CD8+ T-Gedächtniszellen
exprimieren CD44, jedoch nicht CD69, reagieren sensitiv auf eine Restimulation und
produzieren daraufhin rasch große Mengen an Zytokinen wie IFN-γ. CD4+ TGedächtniszellen exprimieren kein L-Selektin, dafür verstärkt jedoch CD44, und die
Isoform
von
CD45
wechselt.
Sie
lassen
sich
weiter
unterteilen
in
Effektor/Gedächtniszellen und zentrale Gedächtniszellen. Effektor/Gedächtniszellen
exprimieren kein CCR7, dafür aber verstärkt β1- und β2-Integine sowie Rezeptoren für
inflammatorisch wirksame Chemokine. Deshalb können sie rasch in entzündete Gewebe
einwandern. Der andere Typ der CD4+ T-Gedächtniszellen sind die zentralen
Gedächtniszellen. Sie reagieren sehr sensitiv auf eine Aktivierung und exprimieren
daraufhin CD40L.
13
Einleitung
Zusammenwirken von angeborenem und adaptivem Immunsystem
Wie bereits beschrieben, ist es nur durch das Zusammenarbeiten von angeborenem und
erworbenen Immunsystem möglich, sämtliche Infektionen zu beseitigen. Nach der
Erkennung von beispielsweise LPS und dem Ansprechen des TLR-Signalwegs setzen u.
a. Makrophagen Zytokine und Chemokine frei. Einige dieser Zytokine steigern die
Expression von MHC-Molekülen und erhöhen damit die Fähigkeit der Zellen zur
Antigenpräsentation. Darüber hinaus wird über TLR4 die Expression von CD80 und
CD86 durch Makrophagen und dendritischen Zellen induziert. Der TLR-Signalweg
induziert so Moleküle, die essentiell für die Induktion adaptiver Immunantworten
verantwortlich sind. Andere Zytokine, die in den frühen Phasen der Immunantwort
gebildet werden, beeinflussen die funktionelle Differenzierung von CD4+ T-Zellen. Auf
diese Weise hat der TLR-Signalweg modulierende Funktion auf die adaptive
Immunantwort: Bei MyD88-defizienten Mäusen zeigten sich Defekte bei der
Entstehung antigenspezifischer Th1-Antworten, das Fehlen des TLR4 hingegen wirkt
sich auf die Entstehung von Th2-Antworten aus. Andere Zytokine wirken aktivierend
auf NK-Zellen sowie B- und T-Lymphozyten und steigern die Bildung von
Antikörpern. Mehrere Chemokine wirken chemotaktisch auf T-Zellen.
NK-Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr viraler Infektionen spielen, können
in ihren Zielzellen den programmierten Zelltod induzieren nach dem gleichen Prinzip,
wie auch die CD8+ T-Lymphozyten agieren. Auch sind NK-Zellen wichtige
Produzenten von IFN-γ, welches essentiell für eine Th1-Immunantwort ist.
Die aktivierten T-Zellen wiederum reagieren u. a. mit der Produktion von IL-2, IFN-γ,
MCF, MIF und IL-3 sowie GM-CSF. Daraufhin werden Makrophagen aktiviert, ein
Prozess, der streng von Th1-Zellen reguliert wird, um eine Gewebeschädigung zu
minimieren. Die Differenzierung der Makrophagen im Knochenmark wird induziert,
das Endothel am Infektionsort aktiviert für die Bindung und den Durchtritt der
Makrophagen aus den Blutgefäßen und Makrophagen verstärkt an den Ort der
Entzündung gelockt. Dadurch wird die Entzündungsreaktion weiter vorangetrieben, was
in den meisten Fällen zur schnellen Beseitigung der Erreger führt.
Auch die B-Zellen leisten nach ihrer Aktivierung einen wichtigen Beitrag zur
Bekämpfung der Infektion, indem sie die Aufnahme von Pathogenen durch Phagozyten
erleichtern: Einige der von ihnen gebildeten Antikörper haben opsonierende Funktion,
sie bedecken die Oberfläche des Pathogens und werden von spezifischen Fc-Rezeptoren
auf Phagozyten erkannt. Dieser Prozess verstärkt die Phagozytose. Andere Antikörper
14
Einleitung
aktivieren Proteine des Komplementsystems, nachdem sie an das Pathogen gebunden
haben. Die Komplementproteine binden und opsonieren das Pathogen dann ihrerseits
und werden von Komplementrezeptoren auf Phagozyten gebunden.
Regulatorische T-Zellen- Bindeglied zwischen angeborenem und erworbenem
Immunsystem?
Die so genannten regulatorischen oder suppressiven T-Zellen (Treg) sind zwar ein
Bestandteil der erworbenen Immunantwort, sie zeigen jedoch auch Eigenschaften und
beeinflussen die Funktion der Zellen des angeborenen Immunsystems. Die
Zellpopulation der Treg ist sehr heterogen und wahrscheinlich sind noch nicht alle
Mitglieder charakterisiert worden. Sie zeichnen sich dadurch aus, dass sie anerg sind,
gleichzeitig aber auch suppressiv wirken [53] [54]. Sie können „natürlich“ vorkommen
oder induziert werden.
Die bis jetzt am besten charakterisierte Gruppe sind die CD4+CD25+ „natürlichen“
Treg. Sie entstehen im Thymus, weshalb thymektomierte Mäuse kaum oder keine
CD4+CD25+ Tregs haben, und machen etwa 5-10% der Th-Zellen in der Peripherie aus
[55]. Der TCR dieser Zellen scheint dabei eine vergleichsweise hohe Affinität zu
Selbstpeptiden
aufzuweisen
[56].
Der
Transkriptionsfaktor
Foxp3
ist
von
entscheidender Bedeutung für die Entwicklung der CD4+CD25+ Treg, da in Foxp3-/oder scurfy-Mäusen (weisen einen Defekt im Foxp3 auf; [57], [58], [59]) keine
CD4+CD25+ Tregs gefunden wurden. Foxp3 wird von den natürlichen Treg stark
exprimiert und wird deshalb häufig zu ihrer Identifizierung genutzt [60]. Neben Foxp3
exprimieren CD4+CD25+ Tregs verschiedene weitere Moleküle, zu denen CTLA-4 [61],
Neuropilin-1 [62], die Chemokinrezeptoren CCR4 und CCR8 [63] und das Integrin αEβ7
(CD103; [64]) gehören.
CD4+CD25+ zeigen starke regulatorische Wirkung in vivo und in vitro [55], [65]. Sie
haben eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Autoimmunantworten durch die
Hemmung autoreaktiver T-Zellen [66], [67], [68], sie hemmen aber auch die Funktion
der Zellen des angeborenen Immunsystems [69], [70], [71]. Sie sind auch an der
Suppression von Immunantworten auf Infektionen mit Viren, Bakterien oder Protozoen
[72] und gegen Tumoren beteiligt [73]. Darüber hinaus beeinflussen CD4+CD25+ Tregs,
die CTLA-4 konstitutiv exprimieren, den Tryptophankatabolismus dendritischer Zellen
[43], da sie B7- und IFN-γ-abhängig das Enzym IDO (Indolamin-2,3-Dioxygenase) in
dendritischen Zellen aktivieren. IDO führt zum Abbau von Tryptophan zu Kynurenin,
15
Einleitung
und da Tryptophan essentiell für die Proliferation von T-Effektorzellen ist, werden sie
in einer tryptophanarmen Umgebung in die Apoptose geschickt.
Die Gruppe induzierter regulatorischer T-Zellen ist sehr heterogen: Tr1-Zellen (Type 1
regulatory T cells) wurden durch wiederholte Stimulation von CD4+ TCR-transgenen TZellen mit ihrem Peptid in Gegenwart von IL-10 erzeugt [74]. Sie inhibieren TZellantworten in vivo und in vitro, regulieren die Aktivierung von naiven und TGedächtniszellen und hemmen T-Zellvermittelte Immunantworten gegen Pathogene und
maligne Erkrankungen [75], [76]. Sie proliferieren schwach nach Stimulation und
produzieren große Mengen an IL-10. Th3-Zellen wurden in einem Mausmodell der
experimentellen allergische Enzephalomyelitis (EAE) identifiziert [77]. Sie bilden
große Mengen des Zytokins TGF-β und geringe Mengen IL-10 und verhindern
Autoimmunkrankheiten in verschiedenen Tiermodellen [78].
Weitere Arten von regulatorischen T-Zellen sind CD4+CD25- Tregs, NKTregs [79],
CD8+ Tregs [80] und CD8+CD28- Tregs [81].
1.2.2 Humorale Abwehr
Neben der zellulären Abwehr gibt es einen zweiten Mechanismus zur Bekämpfung von
Infektionen: die humorale Abwehr. Sie setzt sich hauptsächlich aus dem
Komplementsystem, den Antikörpern und den Akute-Phase-Proteine zusammen.
Zwei Wege führen zur Aktivierung des Komplementsystems: ein klassischer und ein
alternativer. Beide Wege führen zur Spaltung der Proteine C3 und C5 in C3a und C5a,
welche auch als Anaphylaxine bezeichnet werden. Sie haben chemotaktische und
vasoaktive Funktionen und bewirken u. a. die Aktivierung von Phagozyten.
Die Leber beginnt als Reaktion auf TNF-α, IL-1 und IL-6 mit der Produktion der
Akute-Phase-Proteine. Zu diesen zählen das LBP und das C-reaktive Protein (CRP). Sie
vermindern den Gewebeschaden, der durch die Infektion entsteht, und haben z. T.
immunmodulatorische Funktion.
1.3 Immunantworten während einer Sepsis
Die Auslöser einer Sepsis können vielfältig sein. Ein Schock, Trauma, schwere
Verletzungen oder große Operationen begünstigen jedoch die Entstehung, da diese
Patienten häufig immunsupprimiert sind und entsprechend anfällig für Infektionen sind.
Zunächst entwickelt sich eine systemische Entzündungsantwort (SIRS). Ein
entscheidender Faktor für den Eintritt eines SIRS ist die generalisierte Aktivierung der
16
Einleitung
pro-inflammatorischen Kaskade. Es erfolgt eine starke, generalisierte Ausschüttung von
Zytokinen wie TNF-α, IL-1 und IL-6 durch Zellen des angeborenen Immunsystems wie
Makrophagen und NK-Zellen, aber auch durch aktivierte T-Zellen. Diese Mediatoren
regulieren die Entzündungsantwort, indem sie weitere Zytokine induzieren, pyrogen
oder chemotaktisch wirken und Zellen aktivieren. Es kommt zur Fehlfunktion der
Endothelzellen, wodurch die mikrovaskuläre Permeabilität erhöht wird. Das
Blutgerinnungssystem wird systemisch aktiviert, durch die Aggregation von
Thrombozyten wird die Mikrozirkulation unterbunden, es kommt zu einer starken
Vasodilation und zum Abfall des Blutdrucks. Dies kann zu einem schwerer Schock
führen sowie zu einer Fehlfunktion von Organen, die letztlich in irreversiblen Schäden
enden können, wenn die Fehlregulation nicht in kurzer Zeit beseitigt wird.
Das Immunsystem reagiert auf die überschießende Entzündungsantwort mit einer
Gegenregulation (CARS). Diese ist gekennzeichnet durch das Überwiegen antiinflammatorischer Zytokine (wie IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β), verminderter Expression
von HLA-DR auf Monozyten und einer erhöhten Anfälligkeit für Infektionen. Das
Endstadium der Organfehlfunktion wird als „MODS“ oder „immunologische
Dissonanz“ bezeichnet. Die Ursache ist sowohl in der anhaltenden überschießenden
Inflammation als auch in einer anhaltenden Immunsuppression zu finden [2]. Beide
bedingen eine hohe Mortalität, da das Gleichgewicht des Körpers nur schwer
wiederhergestellt werden kann.
Obwohl verschiedene Autoren eine Hyperaktivität des angeborenen Immunsystems bei
der Entwicklung des SIRS und einen Funktionsverlust des erworbenen Immunsystems
als Ursache des CARS ansahen, ist es wahrscheinlich eher so, dass Interaktionen
zwischen den beiden Teilen des Immunsystems sowohl zum SIRS als auch zum CARS
einen Beitrag leisten.
1.3.1 Die Rolle der T-Zellen bei einer Sepsis
Während die Funktionen der Zellen des angeborenen Immunsystems bei einer Sepsis
seit längerem untersucht werden, ist über eine mögliche Rolle der adaptiven
Immunantwort in der Pathophysiologie weniger bekannt. Dennoch verdichten sich die
Hinweise, die besonders den T-Zellen einen entscheidenden Beitrag zuschreiben.
Bereits 1997 fanden Hensler et al. [82] heraus, dass Patienten nach großen Operationen
Defekte in der Proliferation ihrer T-Zellen sowie der von ihnen sezernierten Zytokine
(IFN-γ, IL-2, TNF-α) nach Stimulation mit aCD3 und aCD28 zeigten. Der Umfang
17
Einleitung
dieser Fehlregulation bestimmte den Ausgang der Erkrankung [83]. IL-10 hingegen
wird postoperativ verstärkt durch CD4+ T-Zellen gebildet. Sie zählen somit zu den
Hauptproduzenten dieses Zytokins als Folge einer Operation [84]. Während einer Sepsis
kommt es somit zu einer Verschiebung der Th1/Th2-Balance zugunsten der Th2Antwort [85], [86]. Das Überwiegen der Th2-Antwort, gekennzeichnet durch eine
erhöhte Produktion von IL-4 und IL-10 und eine verminderte Bildung von IL-12 und
IFN-γ, korrespondiert mit einer erhöhten Anfälligkeit für opportunistische Infektionen
und ist ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung des CARS.
Defekte in der Antigenpräsentation leisten ebenfalls einen wichtigen Beitrag zum
immunsuppressorischen Zustand. Patienten, die an einer Sepsis erkrankten, zeigten eine
verminderte Expression von CD28 und CD86, während CTLA-4 verstärkt
nachzuweisen war [87]. Ebenfalls vermindert ist die Expression von HLA-DR auf
Monozyten [88], [86] und T-Lymphozyten [89]. Dadurch kommt es zu einer deutlich
eingeschränkten Antigenpräsentation und damit Aktivierung von T-Zellen.
Eine Sepsis bewirkt einem massiven Verlust von B- und CD4-positiven T-Zellen durch
Apoptose [90, 91],[92]. Da Lymphozyten Produzenten pro-inflammatorischer Zytokine
sind, könnte die Apoptose dieser Zellen einer überschießenden Entzündungsantwort
entgegenwirken und damit einen Überlebensvorteil darstellen [90, 93]. Andererseits
kann diese Apoptose aber auch schädliche Folgen haben, da es so zu einem Verlust von
Effektorzellen kommt, wodurch eine Immunsuppression bedingt wird. Dieses
Geschehen wird unterstützt durch einen starken Verlust von dendritischen Zellen, der zu
einer deutlichen Funktionseinschränkung von T- und B-Zellen führt [94]. Im Tiermodell
konnte gezeigt werden, dass durch den adoptiven Transfer apoptotischer Splenozyten
die Mortalität einer Sepsis IFN-γ-abhängig erhöht ist, während der Transfer
nekrotischer
Splenozyten
zu
einem
Anstieg
von
IFN-γ
führt
und
einen
Überlebensvorteil bietet [95]. Dies bedeutet, dass Apoptose nicht nur durch den
Funktionsausfall der toten Zellen die Immunkompetenz einschränkt, sondern dass die
apoptotischen Zellen darüber hinaus suppressiv wirken.
Im Vergleich zu den klassischen αβ T-Zellen sind γδ T-Zellen bei Patienten mit SIRS
bereits in einem frühen Stadium aktiviert, wobei die Expression von CD69 im Verlauf
der Erkrankung noch weiter ansteigt. Dennoch ist auch die Zahl der γδ T-Zellen bei
einer Sepsis vermindert [96].
18
Einleitung
1.4 Tiermodelle zur Untersuchung der Pathophysiologie der Sepsis
Eine generalisierte bakterielle Sepsis ist ein Prozess, bei dem es zu einer großen Anzahl
von Interaktionen von Zelltypen untereinander, auf von ihnen selbst oder von anderen
Zellen produzierte Mediatoren oder mit verschiedenen Proteinen wie z.B. Faktoren des
Gerinnungssystems und des Komplementssystems kommt. Eine Untersuchung in vitro
ist deshalb kaum möglich, um diese komplexen Zusammenhänge zu verstehen. Deshalb
wurden unterschiedliche Tiermodelle entwickelt, um Einsicht in die Pathophysiologie
der Sepsis zu erlangen. Sie lassen sich in zwei Arten einteilen: Zum einem
Tierversuche, die auf einer Bolusinjektion von Bakterien wie E. coli oder Salmonella,
mikrobieller Komponenten wie Endotoxin oder Toxinen (Superantigenen) beruhen. Die
andere Gruppe von Tiermodellen beruht auf einer chirurgisch induzierten Freisetzung
endogener mikrobieller Flora aus einem septischen Fokus. Hierzu zählen die CLP und
die CASP, die kurz beschrieben werden sollen.
Cecal ligation and puncture (CLP)
Das operative Methodik der cecal ligation and puncture (CLP) wurde 1980 von
Wichterman et al. [97] beschrieben. Dabei wird das Cäcum ligiert und ein- (CLP[1])
oder zweimal (CLP[2]) punktiert. CLP ist ein weit verbreitetes Tiermodell einer
peritonealen Sepsis. Es konnte gezeigt werden, dass TNF-α protektiv im CLP-Modell
ist, IL-12 jedoch keinen Einfluss auf den Ausgang der Peritonitis hat [98]. Viele
Beobachtungen, die bei der humanen Sepsis beschrieben wurden, wurden auch nach
CLP beobachtet. Hierzu zählen die Induktion von Apoptose und der initiale proinflammatorische Zustand, der durch die Anti-Inflammation mit überwiegender Th2Antwort gefolgt wird.
Colon ascendens stent peritonitis (CASP)
Eine schwere Komplikation nach großen abdominalen Operationen ist die
Nahtinsuffizienz. Durch Austreten von Darminhalt entsteht eine septischen Peritonitis,
die, selbst wenn sie behandelt wird, mit einer hohen Mortalität verbunden ist. Um diese
Ereignisse in einem Tiermodell reflektieren zu können, wurden die Colon ascendens
Stentperitonitis (CASP) entwickelt. Die CASP ist ein standardisiertes und gut
reproduzierbares Tiermodell abdominaler Sepsis, das von Zantl et al. 1998 [99] zuerst
beschrieben wurde. Durch die der Insertion eines Stents in das Colon ascendens wird
ein septischer Fokus generiert, die Wahl von Stents verschiedener Durchmesser erlaubt
19
Einleitung
eine „Titration“ der Letalität. Ein 14G-Stent führt zu 100% Letalität, während ein 22GStent nur etwa 40% Mortalität bewirkt. Während TNF-α keinen Einfluss auf die
Letalität zeigt, sind IFN-γ und IL-10 essentiell für das Überleben einer CASP, da IFN-γRezeptor-defiziente und Kupffer-Zell-depletierte Tiere dramatische Überlebensnachteile
zeigen. Kupffer-Zellen gelten als eine der wichtigsten Produzenten von IL-10, und der
Verlust von IL-10 führt zu einer verminderten Produktion von IFN-γ, hat aber keinen
Einfluss auf die Ausschüttung anderer Zytokine wie TNF-α oder IL-1 [100]. Hingegen
wirkt sich die Induktion einer Endotoxin-Toleranz positiv auf das Überleben der
Peritonitis aus [101], da es zu einer verstärkten Einwanderung und Aktivierung von
Neutrophilen in das Peritoneum kommt.
Im Vergleich zur CLP, die eher als ein Modell intraabdominaler Abszessbildung mit
geringen Zeichen einer systemischen Entzündung anzusehen ist, imitiert die CASP den
klinischen Verlauf einer diffusen Peritonitis mit einer frühen und stetig ansteigenden
Infektion und Entzündung [102].
Es bleibt jedoch zu beachten, dass bei allen Tiermodellen die Tiere während der ersten
72 Stunden versterben, d.h. in der pro-inflammatorischen Phase, die Mehrheit der
Patienten jedoch in der sich anschließenden Immunparalyse.
1.5 Therapieansätze zur Behandlung einer Sepsis
Bei Patienten, bei denen ein hohes Risiko besteht, eine Sepsis zu entwickeln, versucht
man eine Infektion zu verhindern. Dies ist jedoch oft nicht möglich oder nur in
ungenügendem Umfang zu realisieren. Die Standardtherapie einer Sepsis besteht meist
aus einer Substitution von Flüssigkeit und Vasopressoren, um den Blutdruck zu
stabilisieren, Beatmung des Patienten und die Verabreichung von antibiotisch
wirksamen Medikamenten.
In den letzten Jahren sind jedoch auch verschiedene neue Therapieansätze getestet
worden, basierend auf Ergebnissen, die man zuvor durch in vivo und in vitro-Versuchen
gewonnen hatten. Die Interventionen richten sich gegen bakterielle Komponenten und
Mediatoren, die vom Immunsystem ausgeschüttet werden und einen Beitrag zur
Pathogenese leisten. Nachfolgend wird ein kurzer Überblick zu verschiedenen
Behandlungsansätzen gegeben.
20
Einleitung
Antikörperpräparationen gegen LPS
Verschiedene anti-LPS-Antikörper (z.B. CHESS-Studie: HA-1A, XOMA-Sudie: E5)
wurden genutzt, alle jedoch ohne einen Schutzeffekt erzielen zu können [103, 104].
Immunsuppression und Neutralisation proinflammatorischer Zytokine
Eine generalisierte Immunsuppression erhöht die Mortalität der Patienten. Ein anderer
Ansatz liegt in der Neutralisation proinflammatorischer Zytokine. Da TNF-α ein
Hauptmediator der Sepsis ist, wurden zum einen rekombinante, humanisierte, murine
anti-TNF-α-Antikörper (INTERSEPT-Studie: BAY x 1351: [105], NORASEPT IIStudie [106]), zum anderen ein TNF-R-Fc-Fusionsprotein (Lenercept bzw. Ro 45-2081Studie [107, 108]) getestet, beide zeigten im Einsatz zur Behandlung einer Sepsis
jedoch keinen Erfolg. Auch ein rekombinanter IL-1-Rezeptor [109] zeigte keine
Wirkung.
Corticosteroide zeigen in der frühen Erkrankungsphase in hoher Konzentration keine
Vorteile [110], in geringerer Dosis und einer späteren Phase könnten sie jedoch Erfolg
versprechend sein [111-113]. Ein weiterer Ansatz zielt auf das aktivierte Protein C. Die
PROWESS-Studie (Human Activated PROtein C Worldwide Evaluation in Severe
Sepsis: drotrecogin alfa (activated) [114]) endete erfolgreich mit einem signifikanten
Überlebensvorteil der behandelten Gruppe.
21
Einleitung
Ziele der Arbeit
Systemische bakterielle Infektionen, auch als Sepsis bezeichnet, sind trotz aller
Fortschritte bei der intensivmedizinischen Behandlung noch immer mit einer sehr hohen
Mortalität assoziiert. Die Erkrankung verläuft biphasisch: zunächst dominiert eine
überschießende Entzündungsantwort, anschließend setzt eine Phase der generalisierten
Immunparalyse ein. Zur Untersuchung einer intraabdominelle Keimausschwemmung
als Folge einer chirurgischen Nahtinsuffizienz im Magen-Darm-Trakt wurde das CASPModell (colon ascendens stent peritonitis) entwickelt. Dieses Modell ist hoch
standardisiert und reproduzierbar und deshalb sehr gut zur Untersuchung diffuser
Peritonitis geeignet.
In vorangegangenen Versuchen wurde eine rasche und starke Induktion von CTLA-4
(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4) in CD4+ T-Lymphozyten als Reaktion
auf CASP gezeigt. CTLA-4 wird auf T-Lymphozyten nach Aktivierung exprimiert und
gilt als negativer Regulator dieser Zellen. Diese Beobachtung deutet auf eine wichtige
Rolle der T-Zellen in der Pathogenese der Sepsis, zu deren Aufklärung diese Arbeit
beitragen sollte. Dafür sollten die CD4+ T-Lymphozyten depletiert bzw. durch
Tacrolimus inhibiert und die Konsequenzen dieser Interventionen für den Verlauf der
CASP untersucht werden. Die Rolle des T-Zelloberflächenmoleküls CTLA-4 sollte
durch Blockadeexperimente mit monoklonalen Antikörpern beleuchtet werden.
Eine genauere Charakterisierung der Funktion der CD4+ T-Zellen war ein weiteres Ziel
dieser Arbeit. Die Auswirkungen der Depletion dieser Zellen auf Faktoren, die für die
Ausprägung der Sepsis relevant sind wie die bakterielle Last, die Ausschüttung von
Zytokinen oder die Einwanderung von Zellen in das Peritoneum, waren dabei von
besonderem
Interesse.
Diese
Untersuchungen
sollten
Rückschlüsse
auf
die
Wechselwirkungen der CD4+ T-Lymphozyten mit anderen Zelltypen und deren
Konsequenzen für den Ausgang der Peritonitis ermöglichen.
Sepsis verursacht häufig eine immunologische Inkompetenz, die mit profunden TZellfunktionsverlusten einhergeht. Über Umfang und Dauer der Immunsuppression ist
nur wenig bekannt, so dass diese in dieser Arbeit thematisiert werden sollten. Hierzu
sollten Langzeitexperimente über drei Monate mit einem subletalen CASP-Modell
(CASPI) dienen. Im Zeitverlauf sollten u.a. die Expression pro- und anti22
Einleitung
inflammatorischer Zytokine bestimmt und die Rekonstitution des Immunsystems nach
dem massiven akuten Verlust von Immunzellen bei CASPI verfolgt werden. .
Es ist beschrieben, dass nach bakteriellen Infektionen kein solides Immungedächtnis
aufgebaut wird, die Gründe hierfür sind nicht bekannt. Deshalb sollte im
Langzeitverlauf die Bildung von Keimzentren beobachtet, sowie die Konzentration von
IgM und IgG im Serum nach CASPI bestimmt werden. Schließlich sollte der Einfluss
einer diffusen Peritonitis auf die Entwicklung einer primären Immunantwort sowie auf
das Immungedächtnis untersucht werden.
23
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Allgemein verwendete Materialien
Laborgeräte
ABI Prism 7000
Applied Biosystems, CA, USA
Agarose-Gelelektrophoresekammer
OWL Separation Systems, Portsmouth,
USA
Bechergläser (100 ml, 300 ml und 1000 ml) Rasotherm
Bunsenbrenner 206
Merck, Darmstadt
Bürker-Zählkammer
OptikLabor, Friedrichsdorf
CO2 –Inkubator
Binder Labortechnik, Tuttlingen
Digitalkamera
Visitron, München
Digitalwaage
Sartorius AG, Göttingen
Durchlichtmikroskop
Hund, Wetzlar
ELISA-Photometer
Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
Erlenmeyerkolben (100 ml)
Rasotherm
FACS-Gerät
Becton Dickinson, NJ, USA
FACS Calibur
Becton Dickinson, NJ, USA
Fluoreszenzmikroskop
Olympus, Japan
Homogenisator Ultraturrax T25
Janke und Kunkel, Staufen
SDS-Gelelektrophoresekammer
Mini Protean II, Bio-Rad, Eberstadt
Inkubator für Bakterienkulturen
Binder Labortechnik
Instrumentenschale mit Deckel
Merck, Darmstadt
Isolierbehälter (Dewar-Transportgefäß)
Roth, Karlsruhe
Küvetten (Photometer)
Brand, Wertheim
Laborschüttler KL-2
Merck, Darmstadt
Magnetrührer (MR 3001)
Heidolph, Schwabach
Micro cell harvester (Zellerntegerät)
Inotech, Dottikon, Schweiz
Microplate reader ThermoMax
Molecular Devices, Ismaning
Microtom-Kryostat Cryo Star HM560
Microm Int, Walldorf
24
Material und Methoden
Mehrkanalpipette
Eppendorf, Hamburg
Pipetten
Eppendorf, Hamburg
PhosphorImager
Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA
Photometer
Biometra, Göttingen
pH-Meter (inoLab)
WtW, Weilheim
Präparierbesteck
Kraut und Timmermann Medizintechnik,
(Scheren, Pinzetten, Skalpelle)
Hamburg
Schüttelgerät (Vortexer)
Heidolph, Schwabach
Sterile Arbeitsbank
Heraeus Instruments, Hanau
Tritium Storage PhosphorScreen
Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA
Ultrazentrifuge Sorvall RC 5B
Kendro Laboratory products, Hanau
Ultrazentrifugenröhrchen
Kendro Laboratory products, Hanau
Waagen BP 121S
Sartorius, Göttingen
BP 1200
Sartorius, Göttingen
Wachsstift
DAKO, Glostrup, Dänemark
Wasserbad
Haake
Zellerntegerät (Micro cell harvester)
Scatron Instruments, Lier
Zentrifugen Biofuge fresco,
Heraeus Instruments, Hanau
Megafuge 1.0,
Heraeus Instruments, Hanau
Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments, Hanau
25
Material und Methoden
Verbrauchsmaterialien
Amicon-Filter
Millipore, MA, USA
Columbia Blutagarplatten
BD Biosciences, Franklin Lakes, USA
Dialyseschläuche
Roth, Karlsruhe
Deckgläser
Superior, Marienfeld
Drigalski-Spatel
Merck, Darmstadt
Einbettschälchen
Miles Inc., Elkhart, USA
Ethilon 4/0 und 7/0
Ethicon, Norderstedt
FACS-Röhrchen
Sarstedt, Nümbrecht
Heparinröhrchen (Blutabnahme)
Braun, Melsungen
Kanülen
Braun, Melsungen
Klebefolien für ELISA-Platten
Roth, Karlsruhe
MaxiSorp Immunoplatte
NUNC, Roskilde, Dänemark
Mikrohämatokritkapillaren
Brand, Wertheim
Objektträger Superfrost
Menzel Gläser, Braunschweig
Optical Adhesive Covers
Applied Biosystems, CA, USA
Optical caps
Applied Biosystems, CA, USA
Optical reaction plate (96 well)
Applied Biosystems, CA, USA
Optical tubes
Applied Biosystems, CA, USA
Parafilm
American National Can, Chicago, USA
Petrischalen
Greiner, Frickenhausen
Pipettenspitzen
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (0,5 ml und 1,5 ml)
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (1,5 ml),
Eppendorf, Hamburg
RNase- und DNase-frei
Röhrchen (5 ml und 12 ml)
Greiner, Frickenhausen
Sterilfilter (0,45 µm)
Schleicher & Schnell, Dassel
Spritzen (1 ml)
Dispomed, Gelnhausen
Spritzen (2 ml)
Braun, Melsungen
Spritzen (30 ml)
Fresenius, Bad Homburg
[methyl-³-H]-Thymidin
Amersham Biosciences Freiburg
Venenverweilkatheder 16G und 18G
Venflon, BOC
Zellsiebe (70 µm)
BD Pharmingen, Heidelberg
26
Material und Methoden
Zellkulturplatten (mit 96 Vertiefungen,
Greiner, Frickenhausen
Rund- und Flachboden)
Zentrifugenröhrchen
Falcon, Becton Dickinson
(Spitzboden, 15 ml und 50 ml)
2.1.2. Material für zellbiologische und molekularbiologische Arbeiten
Reagenzien für zellbiologische Arbeiten
Aceton
Hedinger, Stuttgart
AEC chromogenes Substrat „Ready to use“ Dako, Carpenteria
BM Blue POD Substate
Boehringer Mannheim
Biotin Blocking-System
Dako, Carpenteria
Bromphenolblau
Roth, Karlsruhe
Carbonatpuffer (Beladungspuffer-
Scil Diagnostics GmbH
Konzentrat,
10-fach)
CHAPS
Merck, Darmstadt
Chloroform
J.T. Baker, Griesheim
Concanavalin A (ConA)
Sigma, Deisenhofen
Complete
Roche, Mannheim
DABCO
Merck, Darmstadt
Dimethylformamid
Serva, Heidelberg
DMSO
Sigma, Deisenhofen
Ethylendiaminetetraacetic acid (EDTA)
Sigma, Deisenhofen
Eosin
Merck, Darmstadt
Essigsäure
Merck, Darmstadt
Ethanol (100%)
Roth, Karlsruhe
Fix-and-Perm cell permeabilization kit
An der Grub Bio Research, Kammberg
Fötales Kälberserum (FCS)
Gibco BRL, Eggenstein
L-Glutamin mit Penicellin/Streptomycin
PAA, Pasching, Österreich
Glycin
Roth, Karlsruhe
Glyceringelatine
Merck, Darmstadt
27
Material und Methoden
Glycerol
AppliChem, Darmstadt
Hämalaunlösung nach Mayer
Merck, Darmstadt
Heparin
Blutspende Uni Greifswald
Hoechst Nr. 33258; Kernfarbstoff
Sigma, Deisenhofen
Isopropanol
Roth, Karlsruhe
Mausnormalserum
Caltag, Burlingame
Natriumacid (NaN3)
Sigma, Deisenhofen
Na2HPO4
Sigma, Deisenhofen
NaH2PO4
Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid
Sigma, Deisenhofen
Natriumcitrat
Sigma, Deisenhofen
Paraformaldehyd (PFA)
Sigma, Deisenhofen
phosphatgepufferte Saline (PBS)
Sigma, Deisenhofen
PEFA Bloc
Roche, Mannheim
Penicillin-Streptomycin
Gibco (Invitrogen) Karlsruhe
Percoll
Sigma, Deisenhofen
PMSF
Sigma, Deisenhofen
RPMI 1640
Sigma, Deisenhofen
Salzsäure (HCl)
Roth, Karlsruhe
Saponin
Merck, Darmstadt
Schwefelsäure (H2SO4; 2N)
Merck, Darmstadt
Staphylokokken enterotoxin B (SEB)
Sigma, Deisenhofen
tert. Amylalkohol
Sigma, Deisenhofen
Tacrolimus
Fujisawa, München
TissueTek Einbettmedium
Sakura, Zoeterwonde; Niederlande
TNP-KLH
Biosearch Technologies
TNP-OVA
Biosearch Technologies
2,2,2 Tribromethanol
Sigma, Deisenhofen
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Sigma, Deisenhofen
Triton X-100
Ferak, Berlin
Trypanblau-Lösung
Sigma, Deisenhofen
Tween 20
Serva, Heidelberg
Wasserstoffperoxid (30 %)
Merck, Darmstadt
28
Material und Methoden
Reagenzien für molekularbiologische Arbeiten
Acrylamid/Bisacrylamid
Roth, Karlsruhe
Acrylamid (linear)
Invitrogen, Karlsruhe
Agarose
PeqLab, Erlangen
Ammoniumpersulfat (APS)
Serva, Heidelberg
Β-Mercaptoethanol
Invitrogen, Karlsruhe
Coomassie Brilliantblau G250
Fluka Chemie, Buchs
Diatomaceous Earth
Sigma, Deisenhofen
DEPC
Sigma-Aldrich, Steinheim
DNA-Größenmarker
100 bp ladder
Promega, Madison, USA
1 kb ladder
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
DNA/RNA-Ladepuffer
Promega, Madison, USA
Ethidiumbromid
Roth, Karlsruhe
LAL-Wasser
Acila, Mörfelden-Walldorf
MgCl2
Promega, Madison, USA
RNA-Größenmarker (0,24-9,5 kb)
Invitrogen, Karlsruhe
SDS
AppliChem, Darmstadt
Serva Blue G
Serva, Heidelberg
Taq-Polymerase
Promega, Madison, USA
Taq-Reaktionspuffer
Promega, Madison, USA
TEMED
Serva, Heidelberg
Trizol
Invitrogen, , Karlsruhe
Testsysteme
in situ cell death detection kit (TUNEL
Roche, Mannheim
assay)
Mouse inflammation cytometric bead
BD Biosciences, Heidelberg
assay (CBA)
Phagotest
Orpegen, Heidelberg
29
Material und Methoden
2.1.3 Lösungen
Lösungen zur Gewinnung und Analyse von Zellen
FACS-Waschpuffer:
990 ml PBS
10 ml FCS
0,02% Natriumacid
Saponinpuffer:
0,1 g Saponin
100 ml FACS-Waschpuffer
Ammoniumchloridpuffer (Erythrozytenlyse):
155 mM NH4Cl (8,4 g)
10 mM KHCO3 (1,0 g)
0,1 mM EDTA (29,22 mg)
ad 1 l Aqua bidest.
Organlysepuffer:
1x PBS
0,25% w/v CHAPS
0,5% v/v Tween 20
1 mM EDTA
1 mM PEFA-Bloc
1 mM PMSF
1x Complete
Permeabilisierungspuffer (TUNEL assay)
0,1 g Natriumcitrat
100 µl Triton X100
ad 100 ml PBS (1x)
30
Material und Methoden
Einbettungspuffer für Zytospins:
Glycinpuffer:
1,4 g Glycin
1,7 g NaCl
70 µl NaOH (10M)
0,1 g NaNO3
ad100 ml A. bidest.
DABCO-Puffer:
30 ml Glycinpuffer
2,5 g DABCO
70 ml Glycerin
auf pH 8,6 einstellen, in einer braunen Flasche bei 4°C lagern
Lösungen zur Gewinnung monoklonaler Antikörper
Natriumphosphatpuffer (20 mM):
2,84 g NaH2PO4
ad 1 l Aqua bidest.
mit HCl auf pH 7,0 einstellen, bei 4°C lagern
Glycinpuffer (0,1 M)
0,75 g Glycin
ad 100 ml Aqua bidest.
mit HCl auf pH 2,7 einstellen, bei 4°C lagern
Tris-HCl:
121,14 g Tris
ad 1 l Aqua bidest.
mit HCl auf den gewünschten pH-Wert einstellen
Bradford-Stammlösung:
100 ml Ethanol (95%)
200 ml Phosphorsäure (88%)
31
Material und Methoden
350 mg Serva Blue G
Bradford-Gebrauchslösung:
425 ml A. bidest
15 ml Ethanol (95%)
30 ml Phosphorsäure (88%)
30 ml Bradford-Stammlösung
durch einen Papierfilter geben, in eine braune Flasche abfüllen und bei RT aufbewahren
Lösungen zur Analyse von Proteinen
Probenpuffer (mit β-Mercaptoethanol; 5-fach konzentriert):
0,6 ml 1M Tris-HCl (pH 6,8)
5 ml Glycerol (50%)
2 ml SDS (10%)
0,5 ml 2-Mercaptoethanol
1 ml Bromphenolblau
0,9 ml Aqua bidest.
Trenngel (10%):
4,94 ml A. bidest
3 ml 1.5M Tris-HCl (pH 8,8)
120 µl SDS (10%)
4 ml Acrylamid/Bis (30%)
60 µl Ammoniumpersulfat (10%)
6 µl TEMED
Sammelgel:
3 ml A. bidest
1,25 ml 1.5M Tris-HCl (pH 6,8)
50 µl SDS (10%)
650 µl Acrylamid/Bis (30%)
25 µl Ammoniumpersulfat (10%)
5 µl TEMED
32
Material und Methoden
10x SDS-Laufpuffer:
30 g Tris-base
144 g Glycin
10 g SDS
ad 1000 ml Aqua bidest.
Coomassie Blue- Färbelösung:
400 ml Methanol
100 ml Essigsäure
2,5 g Coomassie blue R-250
500 ml Aqua bidest.
Narkotikum:
1 g 2,2,2- Tribromethanol
1 ml tert. Amylalkohol
davon 2%ige Lösung in PBS
2.1.4 Zelllinien
UC10-4F10
Hybridomzellen, die Hamster anti Maus CTLA-4
monoklonale Antikörper exprimieren
CRL1968
Hybridomzellen, die Hamster anti Maus IgG1 Isotyp
monoklonale Antikörper exprimieren
GK1.5
Hybridomzellen, die Ratte anti Maus CD4 monoklonale
Antikörper exprimieren
PC61.5
Hybridomzellen, die Ratte anti Maus CD25 monoklonale
Antikörper exprimieren
33
Material und Methoden
2.1.5 Antikörper
Antikörper für die Fluoreszenzfärbung
Antikörper
Spezifität
Lieferant
Biotin-konjugierter anti-
Maus IgG1
BD Biosciences,
Hamster IgG (cocktail)
FITC-konjugierter anti-
Heidelberg
Ziege IgG (H+L)
Dianova, Hamburg
Ratte IgG
TSA Biotinsystem NEL700:
NEN, Boston, USA
Streptavidin-HRP
Amplifikationsdiluent
Biotinyltyramid
Rhodamin (TRITC)-
Dianova, Hamburg
konjugiertes Streptavidin
anti-FITC/ Oregon Green
Kaninchen IgG- Fraktion
Molecular Probes, Eugene,
Alexa Fluor 488- Konjugat
Oregon, USA
FITC-konjugiertes peanut
Vector, Burlingame
agglutinin (PNA)
MOMA-1 (unkonjugiert)
Ratte IgG2a
BMA Biomedicals, Augst
Antikörper für die immunhistochemische Färbung
Antikörper
Spezifität
Lieferant
anti-Maus Mac-3
Ratte IgG1, κ
BD PharMingen,
Heidelberg
anti-Maus Gr1.1
Ratte IgG2b, κ
BD PharMingen,
Heidelberg
Peroxidase-gekoppelter
Ziege IgG (H+L)
Dianova, Hamburg
anti-Ratte IgG
34
Material und Methoden
Antikörper für die FACS-Färbung
Antikörper
Spezifität
Lieferant
anti-Maus CD3 FITC
Ratte IgG2b, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD3 PE
Ratte IgG2b, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD4 FITC
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD4 Alexa 647
Ratte IgG2a, κ
Invitrogen, , Karlsruhe
anti-Maus CD8a FITC
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD25 FITC
Ratte IgM, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD25 PE
Ratte IgG2b, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD31 Biotin
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD45R/B220
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD45RB PE
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD62L PE
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus CD69 PE
armenischer Hamster IgG1, BD Biosciences,
λ
anti-Maus CD69 Biotin
anti-Maus CD103 PE
Heidelberg
armenischer Hamster IgG1, BD Biosciences,
λ
Heidelberg
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus ICOS PE
Ratte IgG2a, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus Gr1.1 (Ly-6G Ratte IgG2b, κ
BD Biosciences,
und Ly-6C FITC
Heidelberg
35
Material und Methoden
anti-Maus Mac-1 PE
Ratte IgG2b, κ
BD Biosciences,
Heidelberg
anti-Maus 4F80 PE
Ratte IgG2b, κ
Acris, Herford
Annexin V FITC
BD Biosciences,
Heidelberg
Streptavidin-Alexa 647
Molecular Probes,
Karlsruhe
Propidiumiodid
BD Biosciences,
Färbelösung
Heidelberg
Isotypkontrollen
Antikörper
Lieferant
Ratte IgM
BD Biosciences, Heidelberg
Ratte IgG2a
BD Biosciences, Heidelberg
Ratte IgG2b
BD Biosciences, Heidelberg
armenischer Hamster IgG1
BD Biosciences, Heidelberg
Antikörper für ELISA
Antikörper
Lieferant
anti-Maus IgM (unkonjugiert)
Dianova, Hamburg
anti-Maus IgG (unkonjugiert)
Dianova, Hamburg
Maus IgM
BD Biosciences, Heidelberg
Maus IgG
BD Biosciences, Heidelberg
Ziege anti-Maus IgM
Dianova, Hamburg
(Peroxidase-gekoppelt)
Ziege anti-Maus IgG
Dianova, Hamburg
(Peroxidase-gekoppelt)
anti-Maus TNP IgM
BD Pharmingen
anti-Maus TNP IgG
BD Pharmingen
36
Material und Methoden
2.2. Methoden
2.2.1 Tierexperimentelle Methoden
2.2.1.1 Haltung der Tiere
In allen Experimenten wurden weibliche Mäuse des Stammes C57BL/6 im Alter
zwischen 8 und 12 Wochen (Körpergewicht 20-25 g) verwendet. Sie wurden in den
überwiegenden Fällen durch die Charles-River-Labore geliefert, selten stammten die
Tiere aus eigener Zucht. Die Tiere wurden in einem konventionellen Tierlabor
entsprechend den Bedingungen des deutschen Tierschutzgesetzes gehalten.
2.2.1.2 CASP-Operation
Vor der CASP wurden die Tiere durch eine intraperitoneale Injektion narkotisiert (17 μl
des Narkotikums pro g Körpergewicht Maus) und mit Klebeband an den Vorder- und
Hinterläufen auf einer Styroporplatte fixiert. Der äußere Bauchraum wurde desinfiziert,
die obere Bauchdecke mit einer Pinzette angehoben und eröffnet. Das Peritoneum
wurde mit einem ca. 1,5 cm langem Schnitt eröffnet. Der Darm wurde aus dem
Bauchsitus entnommen und die Stelle, an welcher das Illeum in das Caecum mündet,
aufgesucht. 1,5 cm oberhalb dieser Stelle wurde die Darmwand periphär mit Ethilon 0/7
durchstochen und der Faden fixiert. In unmittelbarer Nähe zu dieser Fixierungsstelle
wurde der Darm mit einer Braunüle durchstochen. 3 mm oberhalb des Beginns der
Kunststoffummantelung wurde eine Zirkuläreinkerbung vorgenommen. An dieser
wurde der Venenverweilkatheder (Stent) mit den freien Enden des Fadens an der
Darmwand mit zwei weiteren Stichen fixiert. Das Mandrin wurde zurückgezogen und
der Stent 1 mm außerhalb der Darmwand abgeschnitten. Um die sichere Platzierung und
die korrekte Verbindung zwischen Darmlumen und Peritonealraum zu kontrollieren,
wurde ein Tröpfchen des Darminhaltes in das Peritoneum gerückt. Anschließend wurde
der Darm wieder im Bauchsitus platziert und die Wunde mit Ethilon 4/0 vernäht.
Schon nach kurzer Zeit entwickeln die Tiere deutlich Krankheitssymptome. Durch den
gewählten Durchmesser des implantierten Stents lässt sich die Letalität gut titrieren. Bei
den meisten durchgeführten Experimenten wurde eine 16G-CASP durchgeführt, d.h. ein
Stent mit einem Durchmesser von 16 gauge inseriert. Die Überlebensrate innerhalb von
72 Stunden nach Operation beträgt etwa 30%.
37
Material und Methoden
Bei der CASP-I (I= Intervention) wurde der Stent in einer zweiten Operation 5 bzw. 6
Stunden nach der CASP-Operation wieder entfernt und der septische Fokus saniert.
Dies hat zur Folge, dass sich viele der Tiere relativ schnell wieder erholen und nach
spätestens 24 Stunden wieder unauffällig sind. Dies erhöht die Überlebensrate auf über
50%.
2.2.1.3 Interventionsexperimente
Depletion oder Blockade von T-Zellpopulationen bzw. ihrer Funktion
Zum Nachweis der Funktion verschiedener T-Zellpopulationen wurden diese mit
Antikörper depletiert oder blockiert. Depletierende Funktion hatte der Antikörper
GK1.5 (anti-Maus CD4). Die Antiköper gegen murines CTLA-4 (4F10) und CD25
(PC61.5) hingegen haben blockierende Wirkung.
Zur Inhibition der T-Zell-Aktivierung wurde das immunsuppressive Medikament
Tacrolimus (FK506) appliziert.
Alle Antikörper bzw. Tacrolimus wurden an den Tagen -3 und -1 intraperitoneal
injiziert. Am Tag 0 wurde dann die CASP-Operation durchgeführt, soweit nicht anders
angegeben, 16G-CASP.
Folgende Mengen von Antikörper/Medikament wurden appliziert:
Antikörper/
Medikament
Konzentration appl. Konzentration
GK1.5
0,5 mg/ml
applizierte Konzen-
(pro Injektion)
tration (gesamt)
300 µl (= 150 µg)
600 µl (= 300µg)
(Ratte anti-Maus
CD4)
PC61.5
1 mg/ml
(Ratte anti-Maus
500 µl (=500 µg)
1 ml (=1 mg)
CD25)
4F10 (Hamster
1 mg/ml
500 µl (=500 µg)
1 ml (=1 mg)
1 mg/ml
500 µl (=500 µg)
1 ml (=1 mg)
0,1 mg/ml
500 µl (= 0,05 mg)
1 ml (=0,1 mg)
anti-Maus CTLA-4)
CRL 1968 (Hamster
anti-Maus IgG1)
Tacrolimus (FK506)
38
Material und Methoden
SEB-induzierter Schock
Das Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB) wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml
gelagert. Kurz vor der Injektion wurden 20 µl der Stammlösung mit 80 µl sterilem PBS
gemischt und in die Schwanzvene injiziert. Gleichzeitig wurden 200 µl GalactosaminLösung intraperitoneal appliziert. Zur Herstellung der Galactosaminlösung wurden 20
mg Galactosamin in 200 µl PBS aufgenommen und anschließend steril filtriert. Das
SEB wurde intravenös und das Galactosamin direkt im Anschluss intraperitoneal
injiziert.
2.2.1.4 Überlebenskurven
Überlebenskurven wurden über 72 Stunden aufgenommen, da dies der kritische
Zeitrahmen ist, in dem der Tod der Tiere eintritt. Die Tiere zeigen bereits 3 Stunden
nach der CASP-Operation erste Krankheitssymptome, die rasch an Intensität zunehmen
und ihren Höhepunkt zwischen 12 und 24 Stunden nach CASP-Operation erreichen.
Danach erholen sich die Tiere wieder relativ schnell und sind nach spätestens 3 Tagen
wieder unauffällig. Innerhalb dieser 72 Stunden wurde der Zustand der Tiere alle 3
Stunden kontrolliert.
Überlebende Tiere wurden 10 Tage nach der CASP-Operation schmerzfrei durch
cervikale Dislokation getötet.
2.2.1.5 Immunisierung
Zur Bestimmung der Auswirkungen der CASP auf das immunologische Gedächtnis
wurde die Antwort auf die Immunisierung mit dem Hapten-Carrier-Komplex TNP-KLH
untersucht. Dabei sollte zum einen die Auswirkungen auf die immunologische
Primärantwort, zum anderen auf die immunologische Sekundärantwort untersucht
werden.
Den Mäusen wurden zu den unten genannten Zeiten 100 µl TNP-KLH (Stammlösung 1
mg/ml), aufgenommen in 100 µl Imject Alum (Pierce), i.p. injiziert. Danach und/oder
davor wurde eine CASPI-Operation durchgeführt und zu verschiedenen Zeiten wurden
dann Serum und die Milz gewonnen, um den anti-TNP-Titer im Serum zu bestimmen
und die Antwort antigenspezifischer T-Zellen der Milz auf (Re-) Stimulation zu
ermitteln.
39
Material und Methoden
Untersuchung der immunologischen Primärantwort
Zur Untersuchung der immunologischen Primärantwort wurden 14 und 28 Tage nach
der CASPI die Tiere mit TNP-KLH immunisiert und 12 Tage später getötet. Daneben
gab es eine nicht-operierte, ebenfalls immunisierte Kontrollgruppe und eine weitere
Kontrollgruppe, die weder operiert noch immunisiert wurde. Das Versuchsschema ist
im Ergebnisteil aufgezeigt.
Untersuchung der immunologischen Sekundärantwort
Zur Untersuchung der immunologischen Sekundärantwort wurden die Tiere 10 Tage
vor und ein zweites Mal zu verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI mit TNP-KLH
immunisiert, die Kontrollgruppen wurden ebenfalls zweimal immunisiert zu den jeweils
gleichen Zeiten wie die septischen Tiere. Die Tiere wurden 12 Tage nach der zweiten
Immunisierung getötet und analysiert. Das im Ergebnisteil aufgeführte Schema zeigt
den Aufbau dieses Versuchs.
2.2.2 Zellbiologische Versuche
2.2.2.1 Gewinnung von Vollblut und Serum
Blut bzw. Serum wurden durch Orbitalpunktion der narkotisierten Mäuse entnommen.
Zur Gewinnung von Vollblut wurden die Tiere in heparinisierte Röhrchen geblutet, zur
Gewinnung von Serum wurde das Blut in einem Eppendorf-Röhrchen aufgefangen und
bei 13000 rpm für 10 min. bei 4°C zentrifugiert, das Serum wurde abgenommen und in
ein neues Röhrchen überführt, der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt und das
Serum bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
2.2.2.2 Lavage des Peritoneums
Zur Spülung des Peritoneums wurde zunächst die Bauchhaut freigelegt und dann 1,5 ml
PBS (zum Nachweis der Expression von Zytokinen) bzw. 10 ml PBS (zur Bestimmung
der Zellzahl) injiziert. Durch kreisende Bewegungen wurde das Peritoneum gründlich
lavagiert und die Flüssigkeit wieder abgezogen. Zur Untersuchung der Lavage
hinsichtlich des Vorhandenseins von Zytokinen wurde die Flüssigkeit dann bei -20°C
bzw. -80°C gelagert, zur Bestimmung der Zellzahl wurden die gewonnenen Zellen
zweimal mit PBS bei 1200 rpm und Raumtemperatur für 10 min. gewaschen und in 1
ml R10F aufgenommen.
40
Material und Methoden
2.2.2.3 Gewinnung von Splenozyten und Thymozyten
Die Milz bzw. der Thymus wurde entnommen und in PBS überführt. Das Organ wurde
anschließend durch ein Zellsieb (70 µm) unter PBS-Spülung gedrückt. Die
Zellsuspension wurde auf 25-35 ml aufgefüllt und dreimal mit PBS gewaschen (1200
rpm, 8 min., RT), wobei zur Gewinnung der Milzzellen nach der zweiten Zentrifugation
eine Erythrozytenlyse durchgeführt wurde, indem das Zellpellet zunächst mit 5 ml Aqua
bidest. resuspendiert wurde, bevor wiederum mit PBS gewaschen wurde. Das Zellpellet
wurde nach dem letzten Waschschritt in 10 ml RPMI bzw. R10F resuspendiert und die
Zellen gezählt.
2.2.2.4 Gewinnung lymphomyeloider Zellen der Leber
Die Maus wurde narkotisiert und das Peritoneum eröffnet. Nach der Punktion der Vena
cava wurde die Leber über die rechte Herzkammer mit 40 ml PBS (37°C) gespült,
entnommen und in eiskaltes PBS/2% FCS überführt. Die Leber wurde durch ein
Zellsieb (70 µm) unter PBS-Spülung gedrückt, die Suspension auf 50 ml mit PBS
aufgefüllt und gewaschen (1200 rpm, 10 min., RT). Das Zellpellet wurde in 5 ml
heparinisiertem Percoll-Puffer resuspendiert und zentrifugiert (1500 rpm, 10 min., RT),
das Zellpellet in 5 ml PBS/2% FCS resuspendiert und mit Ammoniumchlorid-Puffer
(zur Erythrozytenlyse) auf 30 ml aufgefüllt. Nach einer Inkubation von 7 min. bei RT
wurde zweimal gewaschen (1200 rpm, 10 min., RT). Anschließend wurden die Zellen
in RPMI aufgenommen und gezählt.
2.2.2.5 Zellzählung
Zur Bestimmung der Zahl vitaler Zellen wurden 10 µl der Zellsuspension in 90 µl
Trypanblau-Lösung aufgenommen. Lebende Zellen können aufgrund ihrer intakten
Zellmembran den Farbstoff aktiv aus ihrem Zellinneren ausschließen, während er bei
toten Zellen wegen des Verlusts der Membranintegrität in das Zytoplasma diffundieren
kann und die Zellen somit vollständig blau anfärbt.
10 µl der Trypanblau-Zellsuspension wurden in eine Bürker-Zählkammer pipettiert und
die Zahl der lebenden Zellen unter einem Lichtmikroskop bestimmt.
2.2.2.6 Organlyse
Um die Expression von Zytokinen direkt im Organ zu bestimmen, wurde zunächst ein
Lysepuffer angesetzt, der Proteasehemmer enthielt, um die ansonsten rasch einsetzende
41
Material und Methoden
Degradierung der Proteine zu minimieren. Dann wurde das Organ (Milz) entnommen
und gewogen, um anschließend als 10%-ige Lösung im Organlysepuffer mit dem
Ultraturrax auf Stufe 5 für 30-60 sec. homogenisiert zu werden. Die Suspension wurde
in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und zur Abtrennung grober Zelltrümmer bei 4000
rpm und 4°C für 20 min. zentrifugiert. Der Überstand wurde in neues Reaktionsgefäß
überführt und bei 13000 rpm und 4°C für 20 min. zentrifugiert. Der daraufhin
entstandene, möglichst klare Überstand wurde aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei –80°C gelagert.
2.2.2.7 Bakteriologische Untersuchungen
Zur Bestimmung der bakteriellen Last nach der Peritonealsepsis wurden 20 Stunden
nach 16G CASP Blut, Peritoneallavage, Milz, Leber, Niere und Lunge entnommen. Die
Organe wurden in 2 ml sterilem PBS mit einem Ultraturrax bei 9500 rpm in 1 min.
homogenisiert. Der Ultraturrax wurde vor jeder Homogenisierung jeweils mit 70%
Ethanol und PBS gespült. Anschließend wurden jeweils drei Verdünnungsstufen vom
Vollblut, Lavage und den Organsuspensionen hergestellt und jeweils 10 µl davon auf
Blutagar ausplattiert, jede Verdünnung in dreifacher Bestimmung. Die Blutagarplatten
wurden 22 Stunden bei 37°C inkubiert und dann die Kolonien ausgezählt.
2.2.2.8 Stimulation von Zellen in vitro
Zellkultur
Die Zellen wurden im Begasungsbrutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Als
Standardmedium für die Zellkulturen wurde RPMI 1640 genutzt, dem 10% FCS, 2% LGlutamin (200 mM) und 2% Penicillin/Streptomycin zugesetzt wurde (R10F). Alle
Arbeiten wurden unter der sterilen Werkbank ausgeführt.
Stimulation von Zellen in vitro
Zum Nachweis einer Immunisierung mit TNP-KLH wurden die Milzzellen mit TNPKLH und TNP-OVA (höchste Konzentration jeweils 100 µg/ml) und ConA (höchste
Konzentration: 6 µg/ml) stimuliert. Die Verdünnungen der Stimulansien erfolgte in
R10F-Medium, in welchem auch die murinen Milzzellen (2*106 Zellen/ml)
aufgenommen wurden. Es wurden Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen verwendet,
wobei jeweils 100 µl der Testsubstanz pro Vertiefung vorgelegt wurde und 100 µl
42
Material und Methoden
Zellsuspension zugesetzt wurde. Die Kultivierung der Zellen verlief über einen
Zeitraum von 96 Stunden.
2.2.2.9 Herstellung von Kryostatschnitten
Die Gewebeblöcke wurden bei einer Messertemperatur von -21°C und einer
Objekttemperatur von -20°C mit einem Kryostat geschnitten. Die Schnittdicke der
Objekte betrug 4-6 µm. Die Schnitte wurden durch Superfrost Plus-Objektträger
aufgenommen und eine Stunde luftgetrocknet. Dann wurden sie mit Aceton (vorgekühlt
auf -20°C) für 10 min. fixiert und über Nacht getrocknet, anschließend in
Aluminiumfolie gewickelt und bei -80°C gelagert.
2.2.3 Nachweis der Aktivierung von Zellen
2.2.3.1 Nachweis der Phagozytoseaktivität (Phagotest)
Der Nachweis der Phagozyoseaktivität erfolgte in heparinisiertem Vollblut. Dieses
wurde nach der Gewinnung in FACS-Röhrchen pipettiert (100 µl/Röhrchen) und für 10
min. im Eisbad inkubiert. Dann wurden 20 µl einer FITC-markierte E.coli-Suspension
in das Test- und das Kontrollröhrchen gegeben und für 2-3 sek. auf dem Schüttelgerät
gemischt. Das Teströhrchen inkubierte dann für 15 min. bei 37°C im Wasserbad,
während das Kontrollröhrchen im Eisbad blieb. Zum Abstoppen der Reaktion wurde
das Teströhrchen wieder ins Eisbad gestellt, 100 µl einer Quenching-Lösung den beiden
Röhrchen zugesetzt und mit dem Schüttelgerät gemischt. Dann wurden 3 ml FACSWaschpuffer zugegeben, bei 1200 rpm für 5 min. bei 4°C zentrifugiert, dekantiert und
der Waschschritt wiederholt. Die Lyse von Erythrozyten und die Fixierung erfolgte
durch die Zugabe von 3 ml des auf Raumtemperatur erwärmten BD-Lysepuffer und
einer Inkubation von 20 min. bei Raumtemperatur im Dunkeln. Im Anschluss an die
Zentrifugation wurde mit 3 ml Waschpuffer bei 1200 rpm und 4°C für 5 min.
gewaschen. Nach der Zugabe von 100 µl DNA-Färbelösung inkubierte diese 15 min. im
Eisbad. Bis zur Messung am FACS Calibur wurden die Röhrchen bei 0°C im Dunkeln
gelagert und innerhalb einer Stunde nach Zugabe von 100 µl FACS-Waschpuffer
analysiert.
43
Material und Methoden
2.2.3.2 Nachweis der Expression proinflammatorischer Zytokine mit einem
Cytometric bead array (CBA)
Die Expression von Zytokinen wurde ermittelt mit einem Cytometric Bead Array
(CBA) zum Nachweis inflammatorischer Zytokine. Mit Hilfe dieses Verfahrens lassen
sich in bei einer sehr geringen Probenmenge gleichzeitig sechs Zytokine quantitativ
erfassen. Beim murinen CBA-Inflammationstest handelt es sich dabei um TNF-α, IL-6,
IL-10, MCP-1, IFN-γ und IL-12p70. Das Prinzip des Tests beruht darauf, dass sechs
Beadpopulationen mit verschiedenen Fluoreszenzintensitäten mit Fangantikörpern,
welche spezifisch für die oben genannten Zytokine sind, versehen worden sind. Diese
Beads werden dann im Fluoreszenzkanal 3 des FACS-Gerätes sichtbar. Durch die
Zugabe von PE-konjugierten Detektionsantikörpern, die im Fluoreszenzkanal 2 sichtbar
werden, zu den Proben und Standardverdünnungen kommt es zur Bildung von
„Sandwich“-Komplexen. Die Ergebnisse des Tests können anschließend mit Hilfe einer
Analysesoftware sowohl graphisch als auch tabellarisch erzeugt werden.
Zunächst wurden die Standards vorbereitet. Dazu wurde ein Röhrchen der
lyophilisierten Standards mit 0,2 ml Verdünnungspuffer aufgenommen, um eine
Stammlösung (zehnfach konzentriert) zu erzeugen. Nach einer fünfzehnminütigen
Inkubationszeit wurde die Lösung gut geschüttelt, dann wurden 9 Verdünnungen (1:1)
aus der Stammlösung hergestellt, der Verdünnungspuffer diente als Negativkontrolle.
Die „beat“-gekoppelten Fangantikörper zur Messung von IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ,
TNF-α und IL-12 wurden vereinigt und jeweils 25 µl der Fangantikörper-Mischung in
die Röhrchen gegeben. Dazu wurden jeweils 25 µl der Standardverdünnungen bzw. der
Proben pipettiert. Anschließend wurden 25 µl des PE-Detektionsreagenz zugesetzt und
die Röhrchen für 2 Stunden bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen mit 1 ml
Waschpuffer bei 1200 rpm für 5 min. wurde das Zellpellet mit 300 µl Waschpuffer
aufgenommen und gut resuspendiert.
Während der zweistündigen Inkubationszeit wurde das Zytometer kalibriert. Dazu
wurden jeweils 50 µl der Beads zur Einstellung des Zytometers in drei Röhrchen
pipettiert. Zu einem der Röhrchen wurden dann 50 µl des Kontrolldetektors zugegeben,
der FITC-positiv war, zu einem zweiten 50 µl des Kontrolldetektors, der positiv für PE
war. Die Röhrchen wurden für 30 min. bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach der Zugabe
von Waschpuffer zu allen drei Röhrchen wurden die aktuellen Einstellungen für die
FACS-Analyse ermittelt. Als Programm diente hierfür das „BD CBA Instrument Setup
template“.
44
Material und Methoden
Nach der Ermittlung der Instrumenteinstellungen (settings) konnten die Proben und
Standards gemessen werden. Dazu wurden zunächst die Beadpopulation identifiziert
und markiert, dann 2000 Ereignisse in dieser Region gezählt. Die entsprechende
Software wurde anschließend zur Auswertung der Daten genutzt.
2.2.3.3 Nachweis des Immunglobulinspiegels im Serum
Die Konzentration von Immunglobulinen in Proben und Standards wurde grundsätzlich
in Doppelbestimmung ermittelt. Zum Nachweis von Immunglobulinen der Klassen IgM
und IgG wurden zunächst unmarkierte Antikörper gegen IgM (100 pg/ml) bzw. IgG (2
µg/ml) in Karbonatpuffer (pH 9,6) aufgenommen und jeweils 50 µl in eine Vertiefung
einer NUNC Maxisorp-Platte pipettiert. Sie hatten die Funktion von Wandantikörpern.
Die Platte wurde mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt, um eine Verdunstung zu
vermeiden, und bei 4°C für 16 Stunden gelagert. Dann wurden die Antikörper entfernt,
zweimal mit PBS/Tween 20 gewaschen und mit 10% FCS/PBS für eine Stunde
geblockt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween 20 wurden dann jeweils 50 µl
der Proben und Standards aufgetragen, welche mit dem Blockpuffer verdünnt wurden.
Der Standard zum Nachweis von IgM wurde beginnend mit einer Konzentration von 25
ng/ml, der Standard zum Nachweis von IgG ab einer Konzentration von 50 ng/ml
jeweils in einer 1:2-Verdünnung über acht Verdünnungsstufen aufgetragen, von jeder
Probe wurden vier Verdünnungsstufen bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von zwei
Stunden bei Raumtemperatur auf dem Laborschüttler wurde viermal mit PBS/Tween 20
gewaschen und mit einem Peroxidase-gekoppelten Detektionsantikörper (Ziege antiMaus IgM oder Ziege anti-Maus IgG, verdünnt jeweils 1:5000) für eine weitere Stunde
inkubiert. Dann wurde erneut viermal mit PBS/Tween 20 gewaschen und daraufhin 50
µl des Substrats für die Peroxidase, BM blue, zugegeben, welches für 15 min. im
Dunkeln inkubierte. Währenddessen kam es zu einem Farbumschlag des Substrats zu
blau bei Vorhandensein von IgM bzw. IgG, wobei die Intensität des Farbumschlags
abhängig war von der gebundenen Peroxidase und damit vom der Menge an IgM bzw.
IgG in der Probe bzw. in den Standardverdünnungen. Die Reaktion wurde beendet
durch die Zugabe von 2N Schwefelsäure und die Platte wurde mit einem ELISAMessgerät bei 450 nm gelesen.
45
Material und Methoden
2.2.3.4 Nachweis von anti-TNP-spezifischen Antikörpern im Serum
Der Nachweis der Konzentration von anti-TNP-spezifischen Antikörpern in
Serumproben und Standards erfolgte ebenfalls grundsätzlich in Doppelbestimmung. Als
Wandantikörper diente TNP-OVA (10 µg/ml), welches in Karbonatpuffer (pH 9,6)
aufgenommen und wovon jeweils 50 µl in eine Vertiefung einer NUNC MaxisorpPlatte pipettiert wurde. Die Platte wurde mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt und
bei 4°C für 16 Stunden gelagert. Dann wurde der Antikörper entfernt, zweimal mit
PBS/Tween 20 gewaschen und mit 10% FCS/PBS für eine Stunde geblockt. Nach
dreimaligem Waschen mit PBS/Tween 20 wurden dann jeweils 50 µl der Proben und
Standards aufgetragen, welche mit dem Blockpuffer verdünnt wurden. Der Standard
zum Nachweis von anti-TNP-spezifischen Antikörpern der Klasse IgM wurde
beginnend mit einer Konzentration von 100 ng/ml, der Standard zum Nachweis von
anti-TNP-spezifischen Antikörpern der Klasse IgG ab einer Konzentration von 200
ng/ml jeweils in einer 1:2-Verdünnung über acht Verdünnungsstufen aufgetragen, von
jeder Probe wurden vier Verdünnungsstufen bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von
zwei Stunden bei Raumtemperatur auf dem Laborschüttler wurde viermal mit
PBS/Tween 20 gewaschen und mit einem Peroxidase-gekoppelten Detektionsantikörper
(Ziege anti-Maus IgM oder Ziege anti-Maus IgG, verdünnt jeweils 1:2500) für eine
weitere Stunde inkubiert. Dann wurde erneut viermal mit PBS/Tween 20 gewaschen
und daraufhin 50 µl BM blue Peroxidase-Substrat zugegeben, welches für 15 min. im
Dunkeln inkubierte. Die Reaktion wurde abgestoppt durch die Zugabe von 2N
Schwefelsäure und die Platte wurde mit einem ELISA- Messgerät bei 450 nm gelesen.
2.2.3.5 Proliferationsassay mit [³H]-Thymidin
Das Prinzip dieses Tests zum Nachweis der Proliferation von Zellen beruht in dem
Einbau von [³H]-markiertem Thymidin in deren DNA während ihrer Teilung. [³H]
(Tritium) ist ein radioaktives Isotop von Wasserstoff, welches β-Strahlung aussendet.
Durch Messung der Intensität dieser Strahlung kann auf die Menge eingebauten [³H]Thymidins und damit der Teilungsrate der Zellen schließen.
Nachdem die Zellen mit verschiedenen Stimulantien 96 Stunden kultiviert worden sind,
wurden
0,5
µCi
[³H]-Thymidin/Vertiefung
zugesetzt.
Nach
einer
weiteren
Inkubationszeit von 17 Stunden wurden die Zellkulturplatten für mindestens 24 Stunden
bei -20°C eingefroren. Dann wurden die Platten wieder aufgetaut und mit einem
automatischen Zellerntegerät auf spezielle Filter gebracht. Nach dem Trocknen der
46
Material und Methoden
Filter wurden sie für etwa 48 Stunden auf einem Phosphorscreen inkubiert. Mit einem
PhosphorImager wurden die Phosphorscreens gelesen und die durch den Einbau des
[³H]-markierten Thymidins in die DNA der Zellen entstandene Radioaktivität
nachgewiesen.
2.2.3.6 Fluoreszenzfärbungen
Fluoreszenzfärbung von CTLA-4 und CD4 auf histologischen Schnitten
Die
histologischen
Schnitte
blieben
bis
zum
vollständigen
Auftauen
bei
Raumtemperatur in der Folienverpackung, um die Bildung von Kondenswasser zu
verhindern. Alle Färbeschritte wurden in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur
(soweit nicht anders angegeben) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit einem Fettstift
umrandet und mit 20 µl 20% FCS/PBS für 10 min. geblockt. Zur Inaktivierung der
endogenen Peroxidase wurde die Präparate mit 50 µl 0,1% H2O2 für 10 min. inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen mit PBS für je 4 min. wurde endogenes Biotin blockiert.
Dazu wurde zunächst 1 Tropfen der Biotin-Blocking-Lösung 1 für 10 min., nach
einmal waschen mit PBS für je 4 min. 1 Tropfen der Biotin-Blocking-Lösung 2 für 10
min. auf die Schnitte gegeben. Es wurde zweimal mit PBS für je 4 min. gewaschen und
dann das 1. Antikörpergemisch zugesetzt, das sich aus dem Überstand des Hybridoms
UC10-4F10 (Hamster-anti-Maus-CTLA-4) und einem aufgereinigten Ratte anti-MausCD4 Antikörper 1:100 zusammensetzte. Die Inkubationszeit betrug entweder 90 min.
bei RT oder über Nacht im Kühlschrank. Nach zweimaligem Waschen mit PBS für je 4
min. wurden 50 µl des 2. Antikörpergemisches zugegeben, bestehend aus einem
biotinylierten Ziege-anti-Hamster Antikörper (1:50) und einem FITC-markierten antiRatte IgG Antikörper (1:50 in 20% FCS/PBS). Nach einer Inkubation für 90 min. bei
RT wurde zweimal mit PBS gewaschen für je 4 min. und zur Fixierung 50 µl 4% PFA
für 15 min. zugesetzt. Nach zweimaligem Waschen mit PBS für je 4 min. wurde 50 µl
3% H2O2 (1:10 in PBS) für 10 min. zugegeben, wiederum zweimal mit PBS für je 4
min.
gewaschen.
Zur
Verstärkung
des
CTLA-4
Signals
wurde
ein
Signalverstärkungssystem auf der Basis von Biotinyltyramid (tyramide signal
amplification, TSA) genutzt. Das System besteht aus zwei Komponenten: zunächst
wurden die Schnitte mit 50 µl Streptavidin-Peroxidase (1:500 in PBS) für 30 min.
inkubiert, nach zweimaligem Waschen mit PBS für je 4 min. wurde dann 50 µl
Biotinyltyramid (1:200 in Amplifikationsdiluent) zugegeben, abhängig vom Alter der
47
Material und Methoden
Reagenzien zwischen 2 und 4 min. Es wurde wieder zweimal mit PBS für je 4 min.
gewaschen, dann wurde 50 µl des 3. Antikörpergemisches zugesetzt, bestehend aus
Streptavidin-TRITC 1:100 und anti-FITC-Alexa 488 1:50 in 20% FCS/PBS. Es wurde
erneut zweimal mit PBS für je 4 min. gewaschen und anschließend wurden die
Präparate mit dem Einbettmedium DABCO eingedeckelt. Bis zur Auswertung unter
dem Fluoreszenzmikroskop wurden die Schnitte bei 4°C gelagert.
Färbung apoptotischer Zellen mittels TUNEL-Test auf histologischen Schnitten
Die histologischen Präparate wurden mit einem Wachsstift umrandet und mit 50 µl 4%
PFA für 20 min. bei RT fixiert. Anschließend wurden sie für 30 min. mit PBS
gewaschen und mit 50 µl Permeabilisierungslösung (0,1% Triton X-100 und 0,1%
Natriumcitrat in PBS) für 2 min. auf Eis (2°C-6°C) inkubiert. Die Schnitte wurden
zweimal mit PBS gewaschen und mit 50 µl der TUNEL Reaktionsmischung (1:10
verdünnte Enzymlösung in Medium) oder nur das Medium als Negativkontrolle für 60
min. bei 37°C im Brutschrank (5% CO2, 37°C, dunkel) inkubiert. Nach zweimaligem
mit PBS waschen erfolgte eine Zellkernfärbung durch dreißigminütige Zugabe des
Hoechst Kernfarbstoffs (1:105 in PBS). Erneut wurde zweimal mit PBS gewaschen und
mit DABCO eingedeckelt. Bis zur Analyse wurden die Präparate im Kühlschrank
gelagert.
Färbung von Keimzentren auf histologischen Schnitten
Die Schnitte wurden bei Raumtemperatur erwärmt, mit einem Fettstift das Gewebeareal
umrandet und mit 20 µl PBS/20% FCS für 10 min. geblockt. Zur Färbung muriner
marginaler Makrophagen wurde der Antikörper MOMA-1 (1:100) genutzt, zum
Nachweis PNA-Ligand-positiver Zellen (z.B. aktivierte B-Zellen) wurde FITCmarkiertes PNA (1:250) in PBS/20% FCS dem Primärantikörpergemisch zugesetzt.
Nach einer Inkubationszeit von 60 min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer
wurde die Gewebsschnitte zweimal mit PBS für je 4 min. gewaschen. Der
Sekundärantikörper setzte sich zusammen aus einem TRITC-markiertem Ziege antiRatte IgG-Antikörper, der von dem Ratte anti-Maus MOMA-1 (1:50) gebunden wurde,
und zur Verstärkung der FITC-Färbung Alexa 488 (1:50). Beide Antikörper wurden in
PBS/20% FCS aufgenommen und für 60 min. bei RT in der feuchten Kammer
inkubiert. Dann wurde zweimal mit PBS für je 4 min. gewaschen, mit DABCO
48
Material und Methoden
eingedeckelt und bis zur Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 4°C im
Dunkeln gelagert.
2.2.3.7 Immunhistologische Färbungen
HE-Färbung
Die auf Raumtemperatur erwärmten Schnitte wurden mit einem Fettstift umrandet und
für 4 min. mit Aqua bidest. gespült. Die Präparate wurde mit 100 μl Hämalaun nach
Mayer (nach Filtration) 10 min. bei RT in der feuchten Kammer gefärbt und 15 min.
unter fließenden Leitungswasser gebläut. Dann wurde 100 μl Eosin (unter Zusatz von
20 μl Eisessig, 1:100 verdünnt mit Aqua bidest., auf 1 ml Eosin) für 3 min. zugegeben
und die Schnitte wurden zweimal für 4 min. mit Aqua bidest. gewaschen. Nach dem
Trocknen der Präparate wurde sie mit Glyceringelatine eingedeckelt. Sie konnten bei
RT gelagert werden und wurden unter dem Lichtmikroskop ausgewertet.
Immunhistochemische Färbung von Granulozyten und Makrophagen
Alle Färbeschritte erfolgten in der feuchten Kammer. Die Gewebeschnitte wurden bei
Raumtemperatur erwärmt, mit einem Fettstift umrandet und mit 20% FCS/ PBS für 10
min. geblockt. Dann wurden unmarkierte Antikörper zur Markierung von Makrophagen
(Mac-1) bzw. Granulozyten (Gr1.1), jeweils 1:100 verdünnt mit 20% FCS/ PBS,
zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 45 min. wurde zweimal mit PBS gewaschen
und ein Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper, der gegen die Primärantikörper
(Ratte anti-Maus) gerichtet ist zugegeben. Nach 45 min. Inkubation wurde wieder
zweimal mit PBS gewaschen und für 15 min. ein AEC-Substrat zugesetzt, welches von
der Peroxidase umgesetzt wurde. Daraufhin wurde zweimal mit Aqua bidest.
gewaschen und Hämalaun (1:5 verdünnt mit Aqua bidest.) zugesetzt. Nach 5 min.
Inkubation wurde für 5 min. unter fließendem Wasser gebläut, dann wurden die
Gewebeschnitte getrocknet und mit erwärmter Glyceringelatine eingedeckelt.
2.2.3.8 FACS-Färbungen
FACS-Färbung von Zellen in murinem Vollblut
In jedes FACS-Röhrchen wurden 100 µl Vollblut pipettiert und mit 10 µl Mausserum
bzw. FCS für 10 min. geblockt. Dann wurden die Antikörper zugesetzt und 20 min. bei
49
Material und Methoden
4°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FACS-Waschpuffer bei 1200 rpm und
4°C für 6 min. wurde Ammoniumchloridpuffer zur Erythrozytenlyse zugesetzt und 20
min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde
zweimal gewaschen und dann am FACS-Gerät analysiert.
FACS-Färbung von Splenozyten, Thymozyten und lymphomyeloiden Zellen der
Leber
Für die FACS-Färbungen wurden jeweils 106 Zellen/Röhrchen eingesetzt. Die
Inkubationsschritte erfolgten auf Eis, gewaschen wurde bei 1200 rpm für 6 min. und bei
4°C. Für die extrazelluläre Färbung wurden die Zellen zunächst zweimal mit FACSPuffer gewaschen, dann wurde 10 min. mit 10 µl FCS bzw. Mausserum geblockt.
Anschließend wurde der Antikörper zugesetzt und für 20 min. inkubiert. Die jeweiligen
Konzentrationen der Antikörper wurden durch Titration ermittelt. Die Zellen wurden
wieder zweimal gewaschen und die Zellen im FACS Calibur analyiert.
Die Expression von CTLA-4 konnte nur durch eine intrazelluläre Färbung bestimmt
werden. Nachdem Inkubation der Antikörper der extrazellulären Färbung beendet war,
wurde nicht gewaschen, sondern 100 µl der PFA-haltigen Lösung 1 des Fix-and-PermKits zugegeben und für 15 min. bei RT inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit
saponinhaltigem Puffer gewaschen, wobei nach dem zweitem Mal die Zellen 5 min.
ruhen gelassen wurden, damit das PFA aus den Zellen diffundieren konnte. Daraufhin
wurde entweder der 4F10-Überstand oder der aufgereinigte Antikörper (7,5 µl) und 100
µl der Lösung 2 des Fix-and-Perm-Kits zugegeben und 45 min. bei 4°C inkubiert. Nach
zweimaligem waschen mit Saponinpuffer erfolgte die Zugabe des biotinylierten antiHamster Cocktails (1:50 verdünnt in Saponinpuffer). Nach einer Inkubation von 45 min.
bei 4°C wurden die Zellen wieder zweimal mit Saponinpuffer gewaschen. Dann wurde
der 3. Antikörper zugesetzt, Streptavidin-Alexa 647 (1:800 verdünnt in Saponinpuffer),
der ebenfalls 45 min. bei 4°C inkubiert wurde. Die Zellen wurden dreimal mit
Saponinpuffer gewaschen und in FACS-Waschpuffer aufgenommen und im FACSCalibur in der 4. Fluoreszenz analysiert.
50
Material und Methoden
2.2.4 Molekularbiologische Methoden
2.2.4.1 Gewinnung monoklonaler Antikörper
Gewinnung antikörperhaltigen Zellkulturüberstandes
Die Hybriomzellen GK1.5 (Ratte anti-Maus CD4), PC61.5 (Ratte anti-Maus CD25),
UC10-4F10 (Hamster anti-Maus CTLA-4) und CRL 1968 (Hamster anti-TNP) wurden
in R10F-Medium im Inkubator bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Die Zellen gaben dabei
Antikörper in das Medium ab, welches gesammelt und bei -20°C gelagert wurde.
Gewinnung von Antikörpern
Die Aufreinigung der Antikörper erfolgte bei 4°C. Eine Säule wurde mit Protein G
gepackt und mit ca. 100 ml Natriumphosphatpuffer (20 mM, pH 7,0) gewaschen. Der
Hybridomüberstand wurde aufgetaut und bei 4°C für 20 min. bei 20000 rpm
zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. 100 ml des Überstandes wurden daraufhin
über die Säule gegeben. Dann wurde wieder mit dem Phosphatpuffer gewaschen, bis
der Bradford-Test (Abschnitt 3.4.1.3.) negativ war.
Die Antikörper der Klasse IgG, die an das Protein G gebunden hatten, wurden durch
Glycinpuffer (pH 2,7) eluiert und jeweils 900 µl der sauren Suspension zur sofortigen
Neutralisation des pH-Werts in Röhrchen aufgefangen, in denen 100 µl Tris-HCl (pH
9,0) vorgelegt wurde. Auch bei den gewonnenen Fraktionen wurde der Bradford-Test
durchgeführt und die proteinhaltigen Röhrchen bei 4°C gelagert. Die erhaltenen
Fraktionen einer Aufreinigung von 500 ml Überstand wurden vereinigt. Das
Gesamteluat wurde in einen Dialyseschlauch gegeben und über Nacht bei 4°C unter
ständigem Rühren gegen 1 Liter PBS dialysiert.
Bradford-Test
Der Bradford-Test zum Nachweis von Proteinen beruht auf der Anfärbung durch den
Farbstoff Coomassie Brilliantblau G 250 oder Serva Blue G. Durch den Bindung von
kationischen und exponierten hydrophoben Seitenketten eines Proteins an Farbstoff
kommt es zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm (rot) auf 595
nm (blau), da die anionische Sulfonatform im Komplex mit Proteinen stabilisiert wird.
51
Material und Methoden
Diese Methode ist besonders gut zum schnellen Nachweis von Protein geeignet, da es
ein sehr einfacher Test ist und sich durch seine Unempfindlichkeit gegenüber störenden
Ionen und Reduktionsmitteln auszeichnet.
u 90 µl Bradford-Gebrauchslösung wurden 10 µl der Testlösung pipettiert. Ein
Farbumschlag zu blau signalisierte die Anwesenheit von Protein.
Bestimmung der Proteinkonzentration durch Messung der optischen Dichte
Die photometrische Bestimmung des Proteingehalts erfolgte bei 280 nm, wobei PBS als
Referenz diente. Bei einer optischen Dichte (OD) von 1,43 sind 1 mg Antikörper der
Klasse IgG in 1 ml PBS vorhanden. Die Antikörper wurden auf eine Konzentration von
0,5 mg/ml bzw. 1 mg/ml eingestellt, steril filtriert durch einen 40 µm Filter, aliquotiert
und bei -70°C gelagert.
Erhöhung der Konzentration der Antikörper
War die Konzentration der Antikörper geringer als die gewünschte, wurden sie mit
Hilfe eines Amicon-Filters erhöht. Die Porengröße hält große Moleküle zurück, das
PBS wird jedoch durchgelassen. Dazu wurde die antikörperhaltige Suspension in den
Filter gegeben und bei 2700 rpm sowie Raumtemperatur zentrifugiert, bis die
gewünschte Konzentration erreicht worden war.
SDS-Gelelektrophorese zur Prüfung der Reinheit der Antikörperpräparationen
Zur Prüfung der Reinheit der Antikörperlösungen wurden sie nach Denaturierung bei 95
°C für 5 min. unter Verwendung eines β-Mercaptoethanolhaltigen Probenpuffers auf ein
10% SDS-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden bei 200 V aufgetrennt.
Das SDS-Gel wurde anschließend für 20-30 min. mit Coomassie-Blau auf dem
Schüttler bei Raumtemperatur gefärbt. Zum Entfärben wurde das Gel in Leitungswasser
gelegt und in der Mikrowelle für mehrere Minuten gekocht, bis das Gel wieder bis auf
die spezifischen Banden hell geworden war. Das Gel wurde anschließend fotografiert
und entsorgt.
Bestimmung der Endotoxin-Konzentration in Antikörperpräparationen
Zur Bestimmung der Endotoxin-Konzentration wurde ein Test der Firma Cambrex auf
Basis von LAL genutzt. Der Messbereich lag zwischen 0,1 EU LPS/ml und 1 EU
LPS/ml. Alle Arbeiten wurden unter der Sicherheitswerkbank durchgeführt.
52
Material und Methoden
Das Endotoxin wurde zunächst mit LAL-Wasser (Endotoxin-frei) zu einer
Stammlösung verdünnt (24 EU/ml) und vor jeder Verwendung 15 min. auf dem
Vortexer geschüttelt. Dann wurden 4 Verdünnungen hergestellt, beginnend mit 1
EU/ml. LAL-Wasser diente als Negativkontrolle. Die Antikörperpräparationen wurden
ebenfalls mit LAL-Wasser verdünnt und in mindestens zwei Konzentrationen
gemessen. Eine 96-Loch-Platte wurde auf 37°C vorgewärmt, das LAL mit 1,5 ml LALWasser und das chromogene Substrat mit 6,5 ml LAL-Wasser verdünnt. Das Substrat
wurde ebenfalls auf 37°C vorgewärmt.
Zunächst wurden jeweils 50 µl der Proben- und Standardverdünnungen in die 96-LochPlatte pipettiert, dann wurde 50 µl LAL/ Vertiefung zugesetzt und bei 37°C für 10 min.
inkubiert. Dann wurde 100 µl des chromogenen Substrats pro Vertiefung zugefügt und
wieder bei 37°C für 6 min. inkubiert. Bei Anwesenheit von Endotoxin kam es zu einem
Farbumschlag zu gelb, ansonsten blieb die Lösung farblos. Die Reaktion wurde beendet
durch die Zugabe von Essigsäure. Anschließend wurde der Farbumschlag bei 405 nm in
einem ELISA- Messgerät bestimmt.
Entfernung des Endotoxins aus den Antikörperpräparationen
Zur Entfernung des Endotoxins wurde das von der Firma Profos entwickelte EndoTrapSystem genutzt. Dazu wurden entweder vorgepackte Säulen verwendet oder leere
Säulen wurden mit Gel gepackt.
Vor der LPS-Entfernung wurde die Antikörperpräparationen über Nacht bei 4°C auf
dem Magnetrührer gegen 0,5x PBS dialysiert, um die Salzkonzentration zu halbieren.
Die
Säulen
wurden
Regenerationspuffer,
Äquilibrierungspuffer
zunächst
dann
zweimal
zweimal
gewaschen.
mit
jeweils
einem
Säulenvolumen
mit
jeweils
einem
Säulenvolumen
Dann
wurde
die
endotoxinhaltige
Antikörperpräparation über die Säule gegeben, wobei die ersten 0,5 ml des Durchlaufs
verworfen wurden und erst dann mit dem Auffangen der Antikörper begonnen wurde.
Um die Proteinverluste möglichst gering zu halten, wurde anschließend mit 1 ml
Äquilibrierungspuffer nachgespült und auch dieser Säulendurchlauf aufgefangen.
Anschließend wurde die Säule zur Entfernung des gebundenen Endotoxins zunächst
zweimal mit jeweils einem Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer, dann zweimal mit
jeweils einem Säulenvolumen Regenerationspuffer gewaschen und nach Zugabe von
0,02% Natriumazid zur Unterbindung bakterieller Kontamination bei 4°C gelagert.
53
Material und Methoden
Der aufgefangene Durchlauf wurde auf den Gehalt an Protein und Endotoxin
untersucht, dann mehrfach gegen LPS-freies PBS dialysiert, um die Salzkonzentration
der Antikörperlösung wieder zu erhöhen, anschließend wurde erneut der Gehalt an
Protein bestimmt und die Proteinkonzentration bei Bedarf erhöht. War in dieser
Präparation wenig Endotoxin nachweisbar, wurde sie bis zur Verwendung bei 4°C
gelagert.
2.2.4.2 Nachweis einer Kontamination von Hybridomzellen mit Mycoplasmen
Gewinnung von DNA aus Hybridomzellen
Zunächst wurde 1 ml des Zellkulturüberstandes bei 13000 rpm für 6 min. zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das entstandene Pellet zweimal mit PBS
gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 100 µl PBS resuspendiert und für 15 min.
bei 95°C denaturiert. Nach der Zugabe von 20 µl 20% Diatomeen-Suspension wurde
dieser Ansatz für 5 min. auf dem Laborschüttler inkubiert und zweimal mit QCWachpuffer (Qiagen Midiprep-Kit) gewaschen. Daraufhin wurde mit 25 µl Aqua bidest.
eluiert und bei 6000 rpm für 1 min. zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde in
ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt und entweder sofort genutzt oder bei -20°C
gelagert.
Nachweis von Mycoplasmen durch PCR
Der Ansatz der PCR erfolgte grundsätzlich auf Eis.
Verwendete Primer:
5´-Primer:
cgc ctg ag tagt acg ttc gc
w
cgc ctg agt agt acg tac gc
tgc ctg ggt agt aca ttc gc
r
tgc ctg agt agt aca ttc gc
cgc ctg agt agt atg ctc gc
cgc ctg ggt agt aca ttc gc
3´-Primer:
gcg gtg tgt aca aga ccc ga
54
Material und Methoden
r
gcg gtg tgt aca aaa ccc ga
gcg gtg tgt aca aac ccc ga
Die Primerkonzentration beträgt 100 µM. Zur Herstellung des 5´-Primergemisches
wurden von den Primern 102 und 103 jeweils 20 µl, von den Primern 104 und 105
jeweils 10 µl auf 100 µl mit Aqua bidest. verdünnt, zur Herstellung des 3´Primergemisches wurden vom Primer 106 20 µl und vom Primer 107 10 µl auf 100 µl
mit Aqua bidest. aufgefüllt.
Die PCR-Ansatz für jeweils eine Probe bestand aus:
0,5 µl Nukleotidgemisch (jeweils 5mM)
0,5 µl 5´-Primergemisch (jeweils 10 µM)
0,5 µl 3´-Primergemisch (jeweils 10 µM)
9,8 µl Aqua dest.
1 µl MgCl2 (25 mM)
1,5 µl 10x PCR-Puffer
0,2 µl Taq-Polymerase
1 µl DNA-Probe
Dieser Ansatz wurde gemischt und kurz zentrifugiert und anschließend die PCR
durchgeführt, die aus 33 Zyklen (30 sec. 94°C, 30 sec. 60°C, 60 sec. 72°C). bestand.
Die Produkte wurden auf ein TBE-Gel (0,8% oder 1%) bei 100 V für ca. 30 min.
aufgetrennt und ihre Größe anhand eines 100 bp-Markers bestimmt (die Größe der
PCR-Produkte beträgt 510 bp).
2.2.4.3 Real-time PCR
RNA-Isolation mit Trizol
Nach der Explantation der Milz wurde sie halbiert und eine Hälfte schockgefroren. Zur
Gewinnung der RNA wurden 50-100 mg Milzgewebe in sterilen Röhrchen in 1 ml
Trizol für 3 min. mit einem Ultraturrax bei 24000 rpm homogenisiert. Die
homogenisierte Gewebeprobe wurde für 15 min. bei Raumtemperatur inkubiert.
Zur Isolierung der RNA wurde die Organsuspension (in 1 ml Trizol) in ein neues
Röhrchen überführen, 200 µl Chloroform zugegeben und 15 sec. geschüttelt. Nach einer
Inkubation von 7 min. bei Raumtemperatur wurde bei 4°C und 9500 rpm für 15 min.
zentrifugiert. 1 µl lineares Acrylamid wurde in ein neues Röhrchen vorgelegt und die
55
Material und Methoden
wässrige Phase der zentrifugierten Suspension zugegeben. Zur Fällung wurden dann
500 µl Isopropanol zugesetzt und 30 min. bei 4°C inkubiert . Nach einer Zentrifugation
bei 4°C und 9500 rpm für 15 min. wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit
500 µl 80%-igem Ethanol (vorgekühlt auf -20°C) gewaschen. Nach einer erneuten
Zentrifugation bei 4°C und 7500 rpm für 3-5 min. wurde der Überstand verworfen und
noch ein weiteres Mal mit Ethanol gewaschen. Der Überstand wurde abpipettiert und
das Pellet getrocknet. Das Pellet wurde durch die Zugabe von RNase-freiem Wasser
(15-20 µl) bei Raumtemperatur gelöst (5-10 min.), anschließend aliquotiert und bei 70°C gelagert.
Die RNA-Konzentration wurde bestimmt durch Messung der Absorption bei 260 nm,
wobei eine Absorptionseinheit 40 µg RNA/ml entspricht. Durch Messung der
Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260/A280) einer 1:100-Verdünnung der RNA in TE
wurde die Reinheit der RNA bestimmt. Die RNA-Proben, deren A260/A280-Verhältnis
zwischen 1,8 und 2,1 lag, wurden als geeignet für die PCR angesehen. Um störende
Einflüsse durch DNA bei der RT-PCR zu unterbinden, wurde zu der gereinigten RNA
RNA-freie DNase zugesetzt.
Messung von IDO mRNA mit Real-time PCR
Zur Transkription der RNA in cDNA wurde die Superscript II Reverse Transkriptase
genutzt. Der PCR-Ansatz bestand aus:
1 µl Random-Primer (3 U/ml)
4 µl 5x First strand buffer
2 µl DTT (0,1 M)
2 µl dNTP-Mix (10 mM)
0,5 µl RNAsin Ribonuklease-Inhibitor (40 U/µl)
1 µl Superscript II RNase Reverse Transkriptase (200 U/µl)
1,5 µl RNase-freies Wasser
8 µl RNA (125 µg/ml)
Nach dem Mischen und kurzem zentrifugieren wurde die Platte in einem Thermocycler
platziert und die PCR durchgeführt, die sich zusammensetzte aus:
Inkubation bei 25°C für 10 min.
RT bei 37°C für 60 min.
RT-Inaktivierung bei 95°C für 5 min.
Die entstandenen Produkte wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
56
Material und Methoden
Zur Bestimmung der IDO mRNA wurde eine Real-time PCR im ABI Prism 7000 SDSSystem durchgeführt. Der Reaktionsansatz bestand aus:
12,5 µl TaqMan Universal-PCR Mastermix
1,25 µl Maus-IDO-Primer
4 µl cDNA-Probe (verdünnt 1:2)
7,25 µl Nukleasefreies Wasser
Als Referenz wurde bei jedem Ansatz zusätzlich Maus-GAPDH bestimmt:
12,5 µl TaqMan Universal-PCR Mastermix
0,75 µl Maus-GAPDH forward primer
0,75 µl Maus-GAPDH reverse primer
0,5 µl Maus-GAPDH TaqMan-Probe
4 µl cDNA-Probe (verdünnt 1:2)
6,5 µl Nukleasefreies Wasser
Die Real-time PCR wurde zunächst bei 50°C für 2 min. und für 95°C für 10 min.
durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen bei 95°C für 15 sec. und bei 60°C für 1 min. Mit
der ABI Prism 7000 SDS 1.1-Software erfolgte die qualitative Auswertung mit der
comparativen Ct-Methode.
2.2.5 Statistische Auswertungen
Alle im Ergebnisteil angegebenen Auswertungen beruhen (soweit nicht anders
angegeben) auf dem ungepaarten T-Test und zweiseitigem p-Wert. War der ermittelte pWert <0,05, war der Unterschied zwischen den verglichenen Daten statistisch
signifikant und wurde mit einem * gekennzeichnet, war der p-Wert <0,005 wurde die
Signifikanz durch ** verdeutlicht und bei einem p-Wert <0,001 wurde dies durch das
Symbol *** markiert.
57
Ergebnisse
3. Ergebnisse
Themenkomplex I
Interventionen vor CASP und deren Folgen
Ausgangssituation
Vorversuche (Diplomarbeiten: M. Klabunde und A. Billing) zeigten, dass es als Folge
einer durch die CASP-Operation induzierten generalisierten bakteriellen Infektion zu
einem starken Anstieg der Expression von CTLA-4 kommt (Abb. 1). Besonders die
CD4+ T-Lymphozyten regulierten das Molekül herauf, beginnend 6 Stunden nach
CASP mit einem weiteren Anstieg bis 12 Stunden nach der Operation, dann nahm die
Expression wieder geringfügig ab.
A
6h CASP
unbehandelt
% CTLA-4+/ CD4+
B
12h CASP
30
***
20
**
10
0
*
0
3
6
12
Zeit (h) nach CASP
+
Abb. 1: Expression von CTLA-4 auf CD4 T-Zellen in der Milz im Kurzzeitverlauf nach CASP
Untersucht wurde die Expression von CTLA-4 (visualisiert mit dem Farbstoff Rhodamin-TRITC; rot) auf
+
den CD4 T-Lymphozyten (detektiert mit einem FITC-markierten Antikörper; grün) mittels
Immunfluoreszenzfärbungen von Gewebeschnitten der Milz. Dargestellt sind unbehandelte Tiere sowie
Tiere 6 und 12 Stunden nach CASP (A). Das sich daraus ergebene Histogramm ist in (B) gezeigt (n=6-16
Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; * p<0,05; **p<0,005; ***p<0,001).
Diese überraschend deutlichen Effekte wiesen auf eine Rolle der T-Zellen bei einer
polymikrobiellen Sepsis hin. Zu deren genaueren Charakterisierung wurden spezifische
58
Ergebnisse
T-Zell-Populationen depletiert (CD4+ T-Zellen) oder blockiert (CTLA-4+ T-Zellen),
oder ihre Funktion wurde durch Applikation des immunsuppressiven Medikaments
Tacrolimus (FK506) unterdrückt.
3.1 Funktion der CD4+ T-Lymphozyten bei der CASP
3.1.1 Depletion von CD4-Zellen
Zur Depletion der CD4+ T-Lymphozyten wurde an den Tagen -3 und -1 vor der CASPOperation jeweils 150 µg des monoklonalen Antikörper GK1.5 (Ratte anti-Maus CD4;
L3T4) intraperitoneal gespritzt, während den Kontrolltieren das äquivalente Volumen
PBS injiziert wurde. Die vollständige Depletion der CD4+ T-Zellen aus der Milz wurde
durch eine FACS-Analyse nachgewiesen. (Abb. 2)
A
0%
0%
82.2%
17.8%
B
19.5%
0.2%
67.2%
13.1%
+
Abb. 2: Depletion CD4 Milzzellen durch anti-CD4 mAk
Milzzellen wurden von Tieren nach Applikation von GK1.5 (A) bzw. von PBS (B) gewonnen. Sie
wurden gefärbt mit einem anti-CD8- (X-Achse) und einem anti-CD4-Antikörper (Y-Achse) und deren
Bindung durchflusszytometrisch bestimmt.
In der Milz sowie im Blut (nicht gezeigt) waren nach der Applikation des Antikörpers
GK1.5 praktisch keine CD4+ Zellen nachweisbar, sowohl bei den septischen als auch
bei den nicht operierten Tieren (Abb. 3B). Die Injektion von PBS hingegen hatte keine
Einfluss auf die Anzahl der CD4+ T-Zellen, bei nicht operierten Tieren waren
durchschnittlich 57,1% CD4+CD3+ T-Zellen in der Milz vorhanden und 12 Stunden
nach CASP waren es 60,2%. Die Depletion der CD4+ T-Lymphozyten zeigte sich auch
bei der Bestimmung von Zellzahl: die Anzahl der Splenozyten war bei den anti-CD4vorbehandelten Tieren deutlich vermindert (Abb. 3A). Bei den PBS-Kontrollen zeigten
sich größere Schwankungen bei den bestimmten Zellzahlen, eine Folge der geringen
Anzahl der Tiere (n=5 Tiere/Gruppe).
59
Ergebnisse
A
B
80
7
Splenozytenanzahl (*10 )
20
% CD4+/CD3+
15
10
***
40
20
5
0
***
60
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 3: Gesamtzellzahl der Milz und Anzahl der CD4+CD3+ T-Zellen nach Depletion CD4+ T-Zellen
und 12 Stunden nach CASP
+
Nach der Depletion CD4 T-Zellen bzw. Injektion von PBS wurde die Gesamtzellzahl in der Milz (*107)
sowohl bei nicht-operierten Tieren als auch bei Tieren 12 Stunden nach CASP (A) bestimmt. Der Anteil
+
der CD4 Zellen in der Milz wurde durch FACS-Analyse nach Färbung der Splenozyten mit einem antiCD3- und einem anti-CD4-Antikörper bei den Tieren, die den GK1.5-Antikörper oder PBS injiziert
bekamen, analysiert (B). (n=5 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; ***p<0,001)
Während die Applikation des Antikörpers GK1.5 zu einer vollständigen Depletion reifer
CD4+ T-Lymphozyten in Milz und Blut führte, wurde ihre Reifung im Thymus nur
unwesentlich beeinflusst (Abb. 4). In diesem Kompartiment ist die überwiegende Zahl
der Zellen phänotypisch CD4+CD8+, nur wenige Zellen sind CD4+CD8- oder CD4CD8+. Bei den PBS-Kontrollen waren 81,5% ± 4,4% der Zellen CD4+CD8+, 12 Stunden
nach der CASP war deren Anzahl auf 71,5% ± 1,8% gesunken (Abb. 4A; p= 0,0006).
Nach zweifacher Injektion des Antikörpers war die Zahl der CD4+CD8+ Thymozyten
bei den nicht-operierten Tieren auf 68,3% ± 2,5% gesunken (p= 0,0107), ein weiterer
Abfall auf 51,8% ± 8,5% konnte 12 Stunden nach der Operation beobachtet werden (p=
0,0002 im Vergleich zu den septischen PBS-Kontrollen).
Die Applikation des anti-CD4-Antikörpers führte neben einem verminderten Anteil
CD4+CD8+ Thymozyten zu einer erhöhten Zahl CD8+ T-Lymphozyten, so dass der
Antikörper eine Verschiebung der Zellpopulationen im Thymus von CD4+CD8+ zu
CD4-CD8 bedingte. Diese Wirkung wurde durch die Peritonitis weiter verstärkt.
Der Antikörper beeinflusste daneben auch die absoluten Zellzahlen im Thymus, die
sowohl vor der CASP als auch 12 Stunden nach der Operation deutlich unter deren der
nicht-operierten bzw. septischen PBS-Kontrollen lagen (Abb. 4B).
60
Ergebnisse
aCD4/CASP
A
11,31%
PBS/CASP
63,15%
10,85%
77,31%
17,02%
CD4
6,60%
aCD4
9,69%
PBS
73,78%
7,50%
7,21%
82,84%
4,91%
CD8
7
Thymozytenanzahl (*10 )
B
15
10
*
5
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 4: Anzahl der CD4-Zellen im Thymus nach der Depletion CD4-positiver T-Zellen und CASP
Die Wirkung des depletierenden Antikörpers GK1.5 auf die CD4-Populationen im Thymus wurde durch
eine FACS-Analyse nach Färbung der Zellen mit einem anti-CD4- und einem anti-CD8-Antikörper
bestimmt. Dargestellt ist jeweils ein typisches Ergebnis bei 5 voneinander unabhängigen
Versuchsdurchführungen mit jeweils vergleichbarem Resultat (A). In absoluten Zellzahlen im Thymus
sind in Abb. B dargestellt (n=5 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05).
3.1.2 Überleben einer polymikrobiellen Sepsis nach der Depletion der CD4+ TZellen
Um zu untersuchen, welche Rolle die CD4+ T-Zellen bei der murinen generalisierten
bakteriellen Infektion nach einer CASP-Operation spielen, wurden nach der Injektion
des depletierenden Antikörpers Überlebenskurven aufgenommen (Abb. 5). Es zeigte
61
Ergebnisse
sich, dass die Applikation der anti-CD4-Antikörper die Letalität im Vergleich zur PBSBehandlung signifikant senkte (p=0,0004).
PBS
aCD4
% Überleben
100
50
0
0
25
50
75
100
Zeit (h) nach CASP
+
Abb. 5: Einfluss der Depletion von CD4 T-Zellen auf das Überleben einer CASP
Die gezeigten Daten fassen vier unabhängige Versuche zusammen, die alle ein ähnliches Ergebnis hatten.
Das Überleben C57Bl/6-Mäuse nach Applikation von entweder GK1.5 (n=18) oder PBS (n=18) wurde
über 72 Stunden dokumentiert.
3.1.3 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Zellzahl im Peritoneum nach
CASP
Bei einer durch die CASP-Operation induzierten generalisierten Infektion ist das
Peritoneum der primäre Infektionsherd, von welchem sich die Entzündung ausbreitet.
Darum sind die Zahl und die Funktion der Zellen, die sich dort befinden bzw. die dort
infiltrieren, von entscheidender Bedeutung für den weiteren Verlauf und den Ausgang
der Peritonitis.
Aus vorangegangenen Versuchen war bekannt, dass allein die Injektion von eiskaltem
PBS eine Infiltration von Zellen in das Peritoneum bewirkt. Darum wurde stets darauf
geachtet, dass alle Lösungen und Antikörper, die intraperitoneal injiziert wurden,
Körpertemperatur hatten.
Durch die Injektion von Antikörper bzw. PBS allein zeigten sich keine Unterschiede
zwischen den Gruppen, es wurden weniger als 1x 106 Zellen/Lavage nachgewiesen
(Abb. 6). Nach CASP erhöhte sich die Zellzahl bei den PBS-Kontrollen auf
durchschnittlich 1,7 ± 0,2 x 106 (p=0,0009). Bei den CD4-depletierten, septischen
Mäusen war eine durchschnittliche Zellzahl im Vergleich damit mehr als fünffach auf
10,2 ± 5,0 x 106 erhöht, allerdings mit beträchtlichen Unterschieden zwischen den
einzelnen Tieren. Der Unterschied zwischen den operierten anti-CD4- und PBSvorbehandelten war trotz kleiner Gruppengröße (n=3) signifikant (p=0,0428).
62
Ergebnisse
20
Zellzahl (*10 6 )
*
***
15
10
5
0
aCD4/CASP
PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 6: Anzahl infiltrierter Zellen im Peritoneum
Zur Bestimmung der Zellzahl im Peritoneum wurde der Bauchraum mit 10 ml sterilem PBS gespült und
die Zellen nach dem Waschen der Suspension mit Trypanblau gefärbt. Angegeben sind die absoluten
Zellzahlen der anti-CD4- bzw. PBS-vorbehandelten Tiere nach CASP und von nicht operierten
Kontrollen aus zwei unabhängigen Durchführungen mit jeweils ähnlichem Ergebnis (n=3 Tiere/Gruppe;
Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD).
3.1.4 Einfluss der Depletion CD4+ T-Zellen auf die Phagozytoseaktivität im Blut
Eine der wichtigsten Funktionen der Zellen des angeborenen Immunsystems bei der
Abwehr
von
Krankheitserregern
ist
die
Phagozytose,
die
Aufnahme
der
Mikroorganismen und ihre anschließende Zerstörung. Nach der CASP-Operation
kommt es zu einem massiven Austritt von Darmbakterien in das Peritoneum, die
daraufhin über das Blut in die verschiedenen anderen Organe gelangen.
Zur Bestimmung der Phagozytoseaktivität wurden die Zellen aus dem Vollblut CD4depletierter und PBS-vorbehandelter, septischer und nicht-operierter Tiere hinsichtlich
ihrer Fähigkeit zur Aufnahme FITC-markierter E. coli untersucht. Ein Beispiel für ein
Resultat nach der FACS-Analyse ist in Abbildung 7 dargestellt.
A
B
C
D
Quadrant A: Zellen, die nicht phagozytiert haben
Quadrant B: Zellen, die FITC-markierte E. coli
aufgenommen haben
Quadrant C: Zelltrümmer u.a.
Quadrant D: nicht-phagozytierte E. coli
Abb. 7: Messung der Phagozytosekapazität im Vollblut
Die Fähigkeit zur Phagozytose FITC-markierter E. coli-Bakterien durch Zellen aus murinem Vollblut
anti-CD4- und PBS-vorbehandelter CASP-Tiere oder nicht operierter Mäuse wurde durch FACS-Analyse
bestimmt. Dargestellt ist ein typisches Messergebnis.
Durch die Depletion der CD4+ T-Zellen allein änderte sich die Fähigkeit der Phagozyten
zur Aufnahme FITC-markierter E. coli nicht (Abb. 8). Durchschnittlich 25,2 ± 3,4%
63
Ergebnisse
(CD4-depletierte) bzw. 28,0 ± 5,9% (PBS-Kontrollen) der Zellen des Blutes
phagozytierten die Bakterien innerhalb der 15-minütigen Inkubation bei 37°C. Die
Phagozytosekapazität war 12 Stunden nach CASP bei den PBS-vorbehandelten Tiere
(33,1 ± 5,6%) erhöht, bei den CD4-depletierten Tieren im Vergleich dazu hingegen
deutlich erniedrigt (20,9 ± 2,9%; p=0,0286).
% E.coli-positive Zellen
40
30
*
20
10
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 8: Phagozytosekapazität nach Depletion CD4-positiver T-Zellen und CASP
Dargestellt ist das Ergebnis der Messung der Fähigkeit der Zellen aus dem Vollblut septischer und nichtseptischer Mäuse zur Phagozytose FITC-markierter E.coli (n=3 Tiere/Gruppe). Angegeben ist der
prozentuale Anteil der Zellen, welche die Bakterien aufgenommen haben (* p< 0,05; Daten dargestellt als
Mittelwerte ± SD).
3.1.5 Einfluss der Depletion CD4+ T-Zellen auf die bakterielle Last nach CASP
Zur Untersuchung der Auswirkung der Depletion CD4+ T-Lymphozyten auf die
Verbreitung der Bakterien wurden Blut, Peritoneallavage, Leber, Lunge, Milz und eine
Niere der septischen Mäuse untersucht. Nach Depletion der CD4+ T-Zellen war die
bakterielle Last bei CASP in allen untersuchten Körperflüssigkeiten und Organen
signifikant um den Faktor 10 bis 100 vermindert (Abb. 9).
64
Ergebnisse
Blut
Peritoneallavage
2
6
cfu (log 10)
cfu (log 10)
3
*
1
0
aCD4/CASP
4
*
2
0
PBS/CASP
aCD4/CASP
Leber
Lunge
3
cfu (log 10)
cfu (log 10)
4
*
2
0
aCD4/CASP
2
1
0
PBS/CASP
*
aCD4/CASP
3
cfu (log 10)
cfu (log 10)
4
0
PBS/CASP
Niere
Milz
2
PBS/CASP
*
aCD4/CASP
PBS/CASP
2
*
1
0
aCD4/CASP
PBS/CASP
Abb. 9: Bakterielle Last nach Depletion CD4-positiver T-Zellen und CASP
Gemessen wurde die bakterielle Last in Blut, Peritonellavage, Leber, Lunge, Milz und Niere von CD4depletierten und PBS-Kontrolltieren 20 Stunden nach CASP-Operation. Die Flüssigkeiten und
Organhomogenisate wurden in dreifacher Ausführung auf Blutagar ausgestrichen und 22 Stunden bei
37°C kultiviert, anschließend wurden die Kolonien ausgezählt (n=5 Tiere/Gruppe, zusammengefasste
Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten mit ähnlichem Ergebnis; Daten dargestellt als
Mittelwerte ± SD).
65
Ergebnisse
3.1.6 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für Expression von Zytokinen
Die Messung von TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ und IL-12p70 erfolgte mit einen
CBA-Test, welcher durch FACS-Analyse ausgewertet wurde. Mit dieser Methode
können auch bei geringen Probenvolumina mehrere Zytokine gemessen werden. Mit
steigender
Konzentration
eines
Zytokins
erhöht
sich
dessen
Intensität
im
Fluoreszenzkanal 2, da sie verstärkt von PE-konjugierten Detektionsantikörpern
gebunden werden (Abb. 10). Durch eine mitgeführte Standard-Verdünnungsreihe
konnte die Konzentration der Zytokine bestimmt werden.
IL-6
IL-10
MCP-1
IFN-γ
TNF-α
IL-12p70
A
B
Abb. 10: XY-Plot einer CBA-Analyse.
Auf der Y-Achse ist die Intensität der Fluoreszenz 3 gezeigt, durch welche sich die für verschiedene
Zytokine spezifischen Beadpopulationen differenzieren lassen. Auf der X-Achse ist der Fluoreszenzkanal
2 gezeigt, welcher die PE-markierten Detektionsantikörper sichtbar macht. Steigende
Zytokinkonzentrationen in der Probe führen zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität in diesem Kanal.
Durch Mitführen eines Standards lassen sich die Konzentrationen bestimmen. Abbildung A zeigt ein
nicht operiertes Tier mit geringen Zytokinkonzentrationen im Serum, Abbildung B die Messergebnisse
eines anderen Tiers 12 Stunden nach Induktion einer CASP.
Die Konzentration der Zytokine wurde gemessen in der Peritoneallavage (Abb. 11) und
im Serum (Abb.12) anti-CD4- bzw. PBS-vorbehandelter Tiere 12 Stunden nach CASP
und bei nicht-operierten Tieren.
66
Ergebnisse
IL-6
TNF-α
110000
p=0,0572
400
60000
300
10000
10000
pg/ml
pg/ml
500
200
5000
100
0
0
MCP-1
IL-10
15000
7000
5000
pg/ml
pg/ml
3000
10000
1000
300
200
5000
100
0
0
aCD4/CASP
PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 11: Expression der Zytokine TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 in der Peritoneallavage
Die Expression von TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 wurde in der Lavage des Peritoneums der jeweils 10
Mäuse nach Applikation von entweder GK1.5 oder PBS und jeweils bei nicht-operierten und Tieren 12
Stunden nach CASP mit einem CBA-Inflammationstest durch FACS-Analyse bestimmt. (n=10
Tiere/Gruppe; Daten repräsentieren die Zusammenfassung von 5 voneinander unabhängigen
Experimenten mit vergleichbarem Ergebnis und sind dargestellt als Mittelwerte ± SD)
In der Peritoneallavage war die Konzentration aller Zytokine bei nicht operierten Tieren
gering (Abb. 11). 12 Stunden nach der CASP-Operation stiegen diese mit Ausnahme
von IL-12 und IFN-γ (Daten nicht gezeigt) stark an. Die Zunahme der Konzentration
von TNF-α war bei den CD4-depletierten Tieren (237,5 ± 105,9 pg/ml) ausgeprägter im
Vergleich zu den PBS-Kontrollen (146,8 ± 69,3 pg/ml; p=0,0572). Auch die
Konzentration von IL-10 und IL-6 war bei Tieren nach Depletion der CD4+ T-Zellen
tendenziell höher als bei den entsprechenden Kontrollen.
Im Serum zeichnet sich hingegen ein anderes Bild ab (Abb. 12).
67
Ergebnisse
TNF-α
IL-6
300
25000
200
pg/ml
pg/ml
20000
15000
10000
100
5000
0
0
MCP-1
IL-10
10000
10000
pg/ml
pg/ml
7500
5000
*
5000
2500
0
0
aCD4/CASP
PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 12: Expression der Zytokine TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 im Serum
Die Expression von TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 wurde im Serum der jeweils 10 Mäuse nach
Applikation von entweder GK1.5 oder PBS sowie bei nicht operierten und Tieren 12 Stunden nach CASP
mit einem CBA-Inflammationstest durch FACS-Analyse bestimmt (n=10 Tiere/Gruppe; Daten
repräsentieren die Zusammenfassung von 5 voneinander unabhängigen Experimenten mit vergleichbarem
Ergebnis und sind dargestellt als als Mittelwerte ± SD)
Auch im Serum waren bei den nicht operierten Tieren nur geringe Mengen von TNF-α,
IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ und IL-12 zu detektieren, unabhängig von der
Vorbehandlung. Abgesehen von IFN-γ und IL-12 (Daten nicht gezeigt) war die
Konzentration der anderen Mediatoren 12 Stunden nach der CASP deutlich gestiegen,
tendenziell stärker bei den PBS-Kontrollen als bei den Tieren nach Depletion der CD4+
T-Zellen. Dies äußerst sich signifikant bei IL-10, dessen Konzentration bei den PBSKontrollen nach der Operation auf 6807 ± 2355 pg/ml stieg, bei den Tieren, die mit dem
Antikörper GK1.5 vorbehandelt waren, jedoch nur auf 4299 ± 2490 pg/ml (p= 0,0326)
an.
68
Ergebnisse
Zusammenfassend waren die Unterschiede zwischen den Tieren, die mit dem
monoklonalen anti-CD4-Antikörper vorbehandelt waren, und denen, die PBS erhalten
hatten, gering. Jedoch ließ sich bei TNF-α und IL-10 die gleiche Tendenz beobachten:
Die Depletion der CD4+ T-Zellen führte dazu, dass die Zytokinkonzentrationen bei
CASP lokal im Peritoneum anstiegen, im Blut dagegen abfielen. Die erzielten Resultate
deuten darauf hin, dass die generalisierte Entzündungsreaktion als Folge der
bakteriellen Infektion nach der Depletion der CD4+ T-Lymphozyten in abgeschwächter
Form verläuft als Konsequenz einer verbesserten Elimination der infiltrierten Bakterien
im Peritoneum.
3.1.7 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Expression von IDO
Die Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) ist ein intrazelluläres Enzym, welches den
oxidativen Tryptophankatabolismus katalysiert. Es wird von Makrophagen und anderen
Zelltypen gebildet und als Folge einer Infektion und Gewebeentzündung verstärkt
exprimiert. IDO hat eine regulierende Wirkung auf T-Zellen, die aus der Depletion von
Tryptophan resultiert.
Die Transkription von IDO wurde mit Real-time PCR untersucht. Die Depletion der
CD4+ T-Zellen resultierte in der leicht verminderten Expression von IDO (0,8; Abb. 13)
im Vergleich zu dem PBS-Kontrolltieren (1,0). Zwölf Stunden nach der CASPOperation jedoch war eine um den Faktor 2,7 erhöhte Transkription bei den PBSbehandelten Kontrolltieren zu verzeichnen (p< 0,0001). In der Milz der CD4depletierten septischen Mäuse ließ sich ein noch stärkerer Anstieg der IDO mRNAKonzentration (7,1; p< 0,0001) beobachten.
***
***
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
IDO mRNA -fache
Expression
7.5
5.0
2.5
0.0
PBS
+
Abb. 13: Expression der IDO mRNA in der Milz nach Depletion CD4 T-Zellen und CASP
Die Messung der IDO mRNA in Milzhomogenisaten anti-CD4- und PBS-vorbehandelter Tiere vor und
12 Stunden nach CASP-Operation wurde mit einer Real-time-PCR durchgeführt. n=5 Tiere/Gruppe
(***p< 0,0001).
69
Ergebnisse
3.1.8 Bedeutung der Depletion CD4+T-Zellen für die Apoptoserate in der Milz
Zwei verschiedene Arten des Zelltodes lassen sich aufgrund von morphologischen,
biochemischen und molekularen Veränderungen der sterbenden Zellen unterscheiden:
Nekrose und Apoptose.
Die Nekrose ist nicht induzierbar und energieunabhängig. Der Prozess beginnt mit dem
Verlust der Integrität der Zellmembran, wodurch sie ihre Barrierefunktion nicht mehr
wahrnehmen kann. Als Folge kommt es aufgrund von Osmose zu einer Zunahme des
Zellvolumens, durch die Akkumulation von Stoffwechselprodukten, die zur
Denaturierung und Präzipitation von Proteinen führen. Die Zellkerne fragmentieren und
lösen sich schließlich auf. Die freigesetzten lysosomalen Enzyme greifen auch andere
Zellen in der unmittelbaren Umgebung an, so dass auch diese nekrotisch werden.
Die Apoptose, auch als programmierter Zelltod bezeichnet, hingegen ist ein
induzierbarer, energieabhängiger Prozess. Sie beginnt mit der Schrumpfung des
Zellkerns, erst viel später zerfällt die Membran. Die DNA wird zwischen den
Nukleosomen zu Fragmenten charakteristischer Länge gespalten. Zum histologischen
Nachweis der Apoptose kann eine enzymatische in situ-Markierung der DNAStrangbrüche genutzt werden. Der TUNEL-Test (TdT-mediated dUTP nick end
labeling) nutzt die terminale Deoxynucleotidyltransferase (TdT) zum Anbau markierter
Nukleotide an DNA-Strangbrüche in situ. Der Test markiert apoptotische Zellen sehr
sensitiv und weist vor allem Apoptose und nicht Nekrose nach, so dass man durch
diesen Test die beiden Arten des Zelltodes unterscheiden kann.
Zur Bestimmung der Apoptoserate wurden nach der TUNEL-Färbung von jedem
Gewebeschnitt zwei Aufnahmen hergestellt (das Bildmaterial ist dem Anhang, Abb. 71,
zu entnehmen). Die Berechnung des prozentualen Anteils der FITC-markierten Fläche
(TUNEL-positiv) von der gesamten Milzfläche erfolgte dann durch das Programm
„MetaMorph“, wobei die Resultate beider Schnitte gemittelt wurden (Abb. 14).
70
Ergebnisse
% TUNEL+ Milzflaeche/
gesamte Milzflaeche
40
30
20
**
10
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 14: Bestimmung der Apoptose nach der Depletion der CD4+ T-Zellen in der Milz mit der
TUNEL-Methode
Der programmierte Zelltod (Apoptose) wurde mit einem TUNEL-Test auf Milzschnitten bei den Mäusen
nach Applikation von GK1.5 oder PBS vor der Operation und 12 Stunden nach der CASP gemessen. Die
Auswertung erfolgte mit der MetaMorph-Software, wobei zwei verschiedene, charakteristische
Ausschnitte eines Milzschnittes ausgewählt wurden und von diesen die TUNEL- (FITC-) positive Fläche
in Abhängigkeit von der gesamten Milzfläche berechnet wurde. Anschließend wurden die beiden so
erhaltenen Ergebnisse gemittelt. (n= 5 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwert ± SD; **p<0,005;
***p<0,001)
Die Behandlung mit dem CD4-depletierenden Antiköper GK1.5 allein führte bei den
nicht-operierten Tieren zu keiner Veränderung der TUNEL-positiven Fläche in der Milz
(2,5 ± 1,5%). Als Folge der generalisierten bakteriellen Infektion kam es in der Milz zu
einem Untergang von Zellen durch Apoptose. Während bei den nicht-operierten PBSKontrolltieren der prozentuale Anteil der apoptotischen Fläche von der gesamten
Milzfläche bei 4,4 ± 2,2% lag, stieg er 12 Stunden nach CASP bei den PBSvorbehandelten Tieren auf durchschnittlich 23,2 ± 6,2% an (p=0,0004). Nach
Behandlung der Tiere mit anti-CD4-Antikörper und anschließender CASP war deutlich
weniger Apoptose nachweisbar (6,8 ± 4,2%; p=0,005).
3.1.9 Bedeutung der Depletion CD4+T-Zellen für die Apoptoserate im Thymus
Die TUNEL-Methode wurde ebenfalls eingesetzt, um den Umfang apoptotischer
Prozesse im Thymus zu untersuchen. Durch die bakterielle Peritonitis, induziert durch
die CASP-Operation, kam es auch im Thymus zu einer starken Zunahme des
apoptotischen Zelltodes. Es zeigte sich, dass es zwischen dem Cortex und der Medulla
deutliche Unterschiede bezüglich der Empfänglichkeit für den programmierten Zelltod
gab (Abb. 15).
71
Ergebnisse
B
40
% TUNEL-positive Flaeche
(Medulla)/
gesamte Flaeche der Medulla
% TUNEL-positive Flaeche
(Cortex)/
gesamte corticale Flaeche
A
30
20
10
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
15
**
10
**
5
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 15: Apoptose im Thymus nach der Depletion der CD4-positiven T-Zellen und CASP
Wie auch in der Milz wurde die Apoptose mit einem TUNEL-Test auf Schnitten des Thymus bei Mäusen
nach Applikation von GK1.5 oder PBS vor der Operation und 12 Stunden nach der CASP gemessen. Die
Auswertung erfolgte ebenfalls mit der MetaMorph-Software, wobei jeweils zwei verschiedene,
charakteristische Ausschnitte aus dem corticalen (links) und medullären (rechts) Bereich des Thymus
ausgewählt wurden und von diesen die TUNEL- (FITC-) positive Fläche in Abhängigkeit von der
gesamten Fläche des Cortex bzw. der Medulla berechnet wurde. Anschließend wurden die beiden so
erhaltenen Ergebnisse gemittelt. (n=5 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; **p<0,005;
***p<0,001)
Bei den PBS-Kontrolltieren waren 4,9 ± 1,8% der Fläche des Cortex TUNEL-positiv
nach der CASP stieg dieser Anteil auf 25,9 ± 4,5% (p< 0,0001). Diese Zunahme war
allerdings unabhängig von der Vorbehandlung, denn auch nach der Depletion der CD4positiven T-Zellen waren vor der Operation 5,3 ± 2,1% der gesamten Cortex-Fläche
FITC-markiert und damit TUNEL-positiv, 12 Stunden nach der CASP stieg der Anteil
der apoptotischen Cortex-Fläche auf 23,5 ± 6,5% an.
Im medullären Thymus hingegen hatte die Depletion der CD4-positiven T-Zellen einen
deutlichen Einfluss auf die Apoptoserate. Bei den nicht operierten Tiere stieg der Anteil
der apoptotischer Fläche in Abhängigkeit von der gesamten Fläche der Medulla von 1,5
± 0,8% bei den PBS-Kontrollen auf 4,4 ± 1,3% bei den CD4-depletierten Tieren
(p=0,0026). 12 Stunden nach der CASP veränderte sich der prozentuale Anteil der
TUNEL-positiven Fläche bei den PBS-Tieren kaum (1,3 ± 1,0%), erhöhte sich aber bei
den GK1.5-vorbehandelten Tieren auf 7,6 ± 3,3% (p= 0,0039).
3.1.10 Bedeutung der Depletion CD4+ T-Zellen für die Infiltration von Zellen des
angeborenen Immunsystems in die Milz und die Leber
Durch die CASP kommt es zu einer massiven Einwanderung von Zellen des
angeborenen Immunsystems in das Peritoneum, das Immunsystem insgesamt reagiert
mit einer starken Aktivierung auf die Infektion. Da die Milz eine zentrale Rolle in der
Erzeugung von Immunantworten einnimmt, sollte die Anzahl sowie die Lokalisation
von Granulozyten und Makrophagen bei CD4-depletierten und PBS-vorbehandelten
72
Ergebnisse
Mäuse, vor oder ohne CASP, untersucht werden. Dazu wurden FACS-Analysen und
immunhistochemische Färbungen zur Charakterisierung der beiden Zelltypen genutzt
(Antikörper Gr1.1 für Granulozyten; Mac-1 zur Markierung von Makrophagen).
3.1.10.1 Anteil von Granulozyten und Makrophagen in der Milz nach Depletion
der CD4+ T-Zellen
Nach Oberflächenfärbung von Splenozyten mit entweder Mac-1 oder Gr1.1 zeigten sich
jeweils zwei distinkte Zellpopulationen abhängig von der Expressionsdichte dieser
Moleküle: Makrophagen waren Mac-1high/Gr1.1low , wogegen Granulozyten Gr1.1high
waren (Abb. 16, linke Spalte). CD3+ T-Lymphozyten und tote Zellen wurden durch
elektronische Eingrenzung aus der Betrachtung ausgeschlossen.
Mac-1high
Mac-1low
l
% Mac-1+ Zellen/
Splenozyten
15
10
5
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Gr1.1high
Gr1.1
low
% Gr1.1+ Zellen/
Splenozyten
5
4
3
2
1
0
Abb. 16: Anteil der Makrophagen und Granulozyten nach der Depletion CD4-positiver T-Zellen
und CASP
Der Anteil von Makrophagen und Granulozyten in der Milz wurde bestimmt durch FACS-Färbung mit
einem PE-konjugierten Mac-1 Antikörper (oben links; zur Detektion der Makrophagen) und mit einem
FITC-markierten Gr1.1 Antikörper (unten links; zur Detektion von Granulozyten). In der linken Spalte
sind jeweils die Bilder der FACS-Analyse dargestellt, rechts die Diagramme, die den prozentualen Anteil
der Granulozyten und Makrophagen in der Milz darstellen nach Injektion von GK1.5 oder PBS vor der
Operation und 12 Stunden nach CASP. Die in der rechten Spalte dargestellte Gesamtpopulation von
Makrophagen bzw. Granulozyten ergab sich durch Addition des prozentualen Anteils der Populationen,
die das entsprechende Molekül in hoher sowie in geringere Dichte exprimieren (n=5 Tiere/Gruppe; Daten
dargestellt als Mittelwerte ± SD).
Es zeigte sich, dass die Vorbehandlung mit dem Antikörper GK1.5 keinen großen
Einfluss auf den Anteil von Makrophagen oder Granulozyten hatte. Auch 12 Stunden
nach der CASP-Operation veränderten sich die Phagozytenpopulationen kaum.
73
Ergebnisse
Durch die FACS-Analyse konnte zwar die Anzahl von Makrophagen und Granulozyten
bestimmt werden, aber nicht deren Lokalisation in der Milz. Hierfür wurden
immunhistochemische Färbungen eingesetzt.
Die Färbung von Granulozyten und Makrophagen auf Milzschnitten bestätigte die
Ergebnisse der FACS-Färbung: Weder durch die Depletion der CD4+ T-Zellen noch 12
Stunden nach der induzierten generalisierten Infektion veränderte sich der Anteil der
beiden Zelltypen. Bei den nicht-operierten Tieren befanden sich sowohl Makrophagen
als auch Granulozyten vereinzelt in der roten Pulpa. Zwölf Stunden nach CASPOperation jedoch waren nur noch wenige dieser Zellen in der roten Pulpa vorhanden,
ein Großteil hatte sich um die weiße Pulpa in Gruppen angeordnet (das Bildmaterial ist
dem Anhang, Abb. 72, zu entnehmen).
3.1.10.2 Anteil von Makrophagen in der Leber nach Depletion der CD4+ T-Zellen
Die Leber ist ebenfalls ein zentrales Organ, das stark von der Sepsis betroffen wird. Zur
Untersuchung des prozentualen Anteils von Makrophagen an den hepatischen
lymphomyeloiden Zellen wurde die FACS-Analyse genutzt. Es zeigte sich, dass die
Leber bereits 12 Stunden nach Induktion der Peritonitis stark von Makrophagen
infiltriert worden war. Die Zunahme des prozentualen Anteils der Makrophagen war
% Mac1+/ lymphomyeloide
Zellen
jedoch unabhängig von der Vorbehandlung (Abb. 17).
100
***
***
75
50
25
0
aCD4/CASP PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 17: Anteil der Makrophagen in der Leber nach Depletion der CD4-positiven T-Zellen und
CASP
Der prozentuale Anteil der Makrophagen an den isolierten lymphomyeloiden Zellen der Leber bei
C57Bl/6-Mäusen nach der i.p. Applikation von entweder GK1.5 oder PBS sowie vor und 12 Stunden
nach CASP wurde bestimmt durch FACS-Färbung der Zellen mit einem PE-markierten Antikörper Mac-1
(n=5 Tiere/Gruppe; *** p<0,0001; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD).
Vor Induktion der Peritonitis waren bei den Tieren nach Applikation von GK1.5 33,88
± 6,8% der isolierten lymphomyeloiden Zellen der Leber Mac-1+, bei den PBSKontrollen waren es 42,45 ± 2,8% (p= 0,0603). 12 Stunden nach der CASP waren
74
Ergebnisse
unabhängig von der Vorbehandlung vermehrt Makrophagen in das Organ eingewandert:
bei den Tieren, deren CD4-T-Zellen depletiert wurden, waren 74,51 ± 5,7% der
lymphomyeloiden Zellen Mac-1+ (p=0,0004 zu den nicht operierten Tieren nach
Depletion der CD4-T-Zellen), bei den septischen PBS-Kontrollen waren es 69,57 ±
7,4% (p<0,0001 zu den nicht operierten PBS-Kontrollen).
75
Ergebnisse
3.2 Funktion der CTLA-4+ T-Lymphozyten bei der CASP
3.2.1 Blockade von CTLA-4
CTLA-4 wird einerseits nach der Aktivierung von T-Zellen induziert, andererseits wird
es von regulatorischen T-Zellen konstitutiv exprimiert. Aus der Literatur (Walunas et
al., 1994 [115]; Karandikar et al, 1996 [116]; Murphy et al., 1998 [117]) wurde
entnommen, dass die Applikation des Antikörpers UC10-4F10 eine Blockade von
CTLA-4 (CD152) bewirkt. Die Funktionalität des Antikörpers wurde mit einer
Fluoreszenzfärbung ConA-stimulierter Milzzellen auf Zytozentrifugationspräparaten
geprüft, denn es ist bekannt, dass diese CTLA-4 verstärkt exprimieren.
3.2.2 Überleben einer polymikrobiellen Sepsis nach Blockade von CTLA-4
Jeweils 500 µg des anti-CTLA-4-Antikörpers wurden an den Tagen -3 und -1 i.p.
injiziert, den Kontrolltieren wurde das äquivalente Volumen PBS appliziert. Am Tag 0
wurde dann die CASP-Operation durchgeführt und das Überleben der Tiere innerhalb
der folgenden 72 Stunden dokumentiert.
PBS
aCTLA-4
% Überleben
100
50
0
0
25
50
75
100
Zeit (h) nach CASP
Abb. 18: Überleben einer polymikrobiellen Sepsis nach Blockade von CTLA-4.
Die dargestellte Überlebenskurve fasst die Ergebnisse von 2 voneinander unabhängigen Experimente
zusammen, die beide ein ähnliches Resultat hatten. Das Überleben C57Bl/6-Mäuse nach Applikation von
entweder 4F10 (n=13) oder PBS (n=9) wurde über 72 Stunden dokumentiert.
3.2.3 Expression von Aktivierungsmarkern nach Blockade von CTLA-4
Nach Aktivierung von T-Zellen kommt es zu bedeutenden Änderungen in der
Expression von verschiedenen Molekülen. Da verschiedene Proteine werden verstärkt
gebildet
werden,
können
durch
ihre
Bestimmung
Rückschlüsse
auf
den
Aktivierungszustand der Zelle gezogen werden. Zu diesen T-Zellaktivierungsmarkern
gehören CD69 („very early activation antigen“), CD25 und ICOS, deren Expression
76
Ergebnisse
durch die CD3+ T-Lymphozyten als Reaktion auf die Blockade von CTLA-4 sowie in
Kombination mit der CASP-Operation untersucht wurden (Abb. 19).
A
B
20
10
0
10
%CD25+/CD3+
% CD69+/CD3+
30
aCTLA-4/CASP PBS/CASP
aCTLA-4
C
PBS
5
0
aCTLA-4/CASP
PBS/CASP
aCTLA-4
PBS
% ICOS+/CD3+
20
15
**
10
5
0
aCTLA-4/CASP PBS/CASP
aCTLA-4
PBS
Abb. 19: Expression von ICOS, CD25 und CD69 in der Milz nach Blockade von CTLA-4 und
CASP
Die Expression von CD69 (A), CD25 (B) und ICOS (C) auf den CD3-positiven T-Zellen der Milz wurde
nach Applikation von entweder 4F10 oder PBS vor oder 12 Stunden nach CASP durch FACS-Analyse
bestimmt. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD;**p<0,005).
CD69 wird unmittelbar nach Aktivierung verschiedener Zellarten, darunter TLymphozyten, verstärkt exprimiert. Vor der CASP waren von den CD3+ T-Zellen der
Tiere nach Applikation von 4F19 durchschnittlich 6,9 ± 1,3% CD69-positiv und bei den
PBS-Kontrollen waren es 8,1 ± 2,5%. 12 Stunden nach Induktion der Peritonitis war der
Anteil CD69+CD3+ T-Zellen deutlich erhöht, unabhängig von der Vorbehandlung: Nach
der Blockade von CTLA-4 exprimierten 18,8 ± 2,6% der CD3+ T-Zellen CD69 (im
Vergleich zu den nicht operierten Tieren nach Blockade von CTLA-4 p=0,0002), bei
den septischen PBS-Kontrollen 18,0 ± 1,6% (im Vergleich zu den nicht operierten PBSKontrollen p=0,0005).
ICOS (inducible costimulator) ist ein costimulatorisch wirksames Molekül, welches erst
nach Aktivierung der T-Zelle induziert wird. Vor der Operation waren bei beiden
Gruppen weniger als 1% der CD3+ T-Zellen ICOS-positiv. 12 Stunden nach Induktion
der Peritonitis konnte jedoch ein dramatischer Unterschied beobachtet werden: Die
Blockade von CTLA-4 bewirkte eine Expression von ICOS auf 12,3 ± 3,3% der CD3+
77
Ergebnisse
T-Lymphozyten, bei den septischen PBS-Tieren konnte dieses Molekül nur auf 2,6 ±
1,1% der T-Zellen detektiert werden (p=0,0014).
CD25 ist die α-Kette des Rezeptors für IL-2, einem Zytokin, welches essentiell für das
Überleben und die Proliferation der T-Zellen ist. Die Expression dieses Proteins konnte
bei den nicht operierten Tieren beider Gruppen auf weniger als 1% der CD3+ T-Zellen
gefunden werden, stieg 12 Stunden nach CASP bei den Tieren nach Blockade von
CTLA-4 auf 3,5 ± 2,6%, bei den septischen PBS-Kontrollen auf 3,8 ± 1,8% (im
Vergleich zu den nicht septischen PBS-Kontrollen p= 0,0132).
3.2.4
Expression
von
Zytokinen
nach
Blockade
von
CTLA-4
in
der
Peritoneallavage und im Serum
Die Konzentration von TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-10, IL-12 und IFN-γ in der Lavage des
Peritoneums wurde nach zweimaliger Injektion entweder des CTLA-4-blockierenden
Antikörpers 4F10 oder von PBS sowohl vor als auch 12 Stunden nach der CASPOperation. Hierzu wurde erneut ein CBA-Test zur Messung inflammatorischer
Mediatoren genutzt (weitere Informationen: siehe 4.1.6). In Abbildung 20 sind die
Ergebnisse dargestellt.
In der Peritoneallavage waren vor der CASP-Operation nur geringe Menge TNF-α, IL6, IL-12 und IFN-γ vorhanden, unabhängig von der Vorbehandlung. Hingegen war nach
Blockade von CTLA-4 bei den nicht operierten Tieren die Expression von MCP-1
signifikant erhöht (114,5 ± 31 pg/ml; PBS-Kontrollen: 53,65 ± 20,8 pg/ml; p=0,0173).
12 Stunden nach CASP wurden sowohl TNF-α, IL-6 und MCP-1 sowie in deutlich
geringerem Umfang auch IFN-γ induziert, aber sowohl nach Injektion von 4F10 als
auch PBS in vergleichbarem Ausmaß.
Die Ausnahme bildete IL-10, die Applikation des anti-CTLA-4-Antikörpers hatte
entscheidenden Einfluss auf die Expression dieses Zytokins: bei den mit dem
Antikörper vorbehandelten Tiere wurde in der Peritoneallavage eine kompletten
Depletion von IL-10 beobachtet, die Grundexpression bei den PBS-Kontrollen lag bei
etwa 55 ± 44,5 pg/ml (p=0,0492). 12 Stunden nach der CASP stieg die Menge an IL-10
bei den CTLA-4-blockierten Tieren auf durchschnittlich etwa 1774 ± 1395 pg/ml an,
während sie bei den PBS/CASP-Tieren im Mittel 21151 ± 15502 pg/ml betrug (p=
0,0499). Die großen Schwankungen bei den Standardabweichungen haben ihre Ursache
vor allem in dem kleinen Umfang der Versuchsgruppen (n=4 Tiere/Gruppe).
78
Ergebnisse
IL-6
TNF-α
400
pg/ml
pg/ml
300
200
40000
30000
20000
10000
200
100
100
0
0
MCP-1
IL-10
5000
200
*
pg/ml
pg/ml
15000
40000
30000
20000
10000
100
100
50
0
0
*
IL-12
IFN-γ
300
100
pg/ml
75
pg/ml
*
50
200
100
25
0
0
aCTLA-4/CASP
PBS/CASP
aCTLA-4
PBS
Abb. 20: Expression von Zytokinen in der Peritoneallavage nach Blockade von CTLA-4 und CASP
Die Expression von TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-10, IL-12p70 und IFN-γ nach Applikation von entweder
4F10 oder PBS vor der Operation und 12 Stunden nach CASP wurde mit einem CBA-Test durch FACSAnalyse bestimmt
(n=4 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD, *p<0,05).
79
Ergebnisse
Neben der Konzentration der Zytokine in der Lavage des Peritoneums wurde auch der
Gehalt von TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-10, IL-12 und IFN-γ im Serum bestimmt (Abb.
21).
IL-6
TNF-α
400
pg/ml
pg/ml
300
200
40000
30000
20000
10000
100
100
50
0
0
17500
12500
7500
2500
400
IL-10
pg/ml
pg/ml
MCP-1
35000
25000
15000
5000
200
200
100
0
0
***
IL-12
200
200
150
150
pg/ml
pg/ml
IFN-γ
100
50
**
100
50
0
0
aCTLA-4/CASP
PBS/CASP
aCTLA-4
PBS
Abb. 21: Expression von Zytokinen im Serum nach Blockade von CTLA-4 und CASP
Die Expression von TNF-α, IL-6, MCP-1, IL-10, IL-12p70 und IFN-γ nach Applikation von entweder
4F10 oder PBS vor der Operation und 12 Stunden nach CASP wurde mit einem CBA-Test durch FACSAnalyse bestimmt
(n=4 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD, **p<0,005; ***p<0,001).
80
Ergebnisse
Auch im Serum waren TNF-α, IL-6, MCP-1 sowie IL-12 und IFN-γ vor der Operation
kaum vorhanden, unabhängig von der Vorbehandlung. 12 Stunden nach der CASP
wurden TNF-α, IL-6 und MCP-1 stark induziert, IL-6 und MCP-1 tendenziell stärker
bei den PBS-Kontrollen als bei den Tieren nach Applikation von 4F10.
Wie auch in der Lavage des Peritoneums hatte die Vorbehandlung mit dem Antikörper
entscheidenden Einfluss auf die Expression von IL-10: Dieses Zytokin war bereits im
Serum der Tiere nach Blockade von CTLA-4 geringfügig niedriger (23,87 ± 41,34
pg/ml) als bei den PBS-Kontrollen vor CASP (67,8 ± 63,3 pg/ml). 12 Stunden nach
Induktion der Sepsis jedoch war dieser Unterschied hoch signifikant: Nach Injektion des
anti-CTLA-4-Antikörpers war deutlich weniger IL-10 (5889 ± 2051 pg/ml) im Serum
zu finden als bei den mit PBS vorbehandelten Tieren (26080 ± 4790 pg/ml; p= 0,0006).
Aber auch die Expression von IFN-γ wurde durch die Applikation von 4F10 beeinflusst:
12 Stunden nach der CASP war die Konzentration von IFN-γ bei den Tieren nach
Blockade von CTLA-4 signifikant geringer (46,43 ± 6,6 pg/ml) als bei den septischen
PBS-Kontrollen (119,1 ± 26,2 pg/ml; p= 0,0017).
3.2.6 Apoptose in der Milz nach Blockade von CTLA-4
Der progammierte Zelltod (Apoptose) wurde durch eine TUNEL-Färbung auf Schnitten
der Milz der Tiere nach Blockade von CTLA-4 bzw. Applikation von PBS vor CASP
sowie 12 Stunden nach der Operation bestimmt (Abb. 22).
*
% TUNEL+ Flaeche/
Gesamtflaeche der Milz
30
**
20
10
0
aCTLA-4/CASP
PBS/CASP
aCTLA-4
PBS
Abb. 22: Bestimmung der Apoptose in der Milz mit der TUNEL-Methode nach Blockade von
CTLA-4 und CASP
Der programmierte Zelltod wurde mit einem TUNEL-Test auf Milzschnitten bei den Mäusen nach
Applikation von 4F10 oder PBS vor der Operation und 12 Stunden nach der CASP gemessen. Die
Auswertung erfolgte mit der MetaMorph-Software, wobei zwei verschiedene, charakteristische
Ausschnitte eines Milzschnittes ausgewählt wurden und von diesen die TUNEL- (FITC-) positive Fläche
in Abhängigkeit von der gesamten Milzfläche berechnet wurde. Anschließend wurden die beiden so
erhaltenen Ergebnisse gemittelt. (n=4 Tiere/Gruppe; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD, *p<0,05;
**p<0,005)
81
Ergebnisse
Bei den nicht operierten Tieren beider Gruppen war die TUNEL-positive Fläche in
Abhängigkeit von der Gesamtfläche der Milz vergleichbar gering (aCTLA-4: 4,1% ±
3,2%; PBS: 5,1% ± 4,3%). 12 Stunden nach Induktion der Peritonitis war die
Apoptoserate sowohl nach Injektion des anti-CTLA-4-Antikörpers (19,23% ± 7,9%) als
auch nach PBS (17,43% ± 4,9%) stark angestiegen. Dieser Unterschied war nur zur
jeweiligen nicht operierten Gruppe statistisch signifikant (anti-CTLA-4/CASP: antiCTLA-4: p= 0,0120; PBS/CASP: PBS: p= 0,0089), die Behandlung mit dem Antikörper
hatte keinen Einfluss auf die Rate der Apoptose in der Milz.
3.2.7 Vergleich des anti-CTLA-4-Antikörpers mit einem Isotyp-Antiköper
Da sich weitere Experimente anschließen sollten, bei denen ein Isotyp-Antikörper
(Hamster anti-Maus IgG1; CRL1968) das PBS ersetzen sollte, wurde eine weitere
Überlebenskurve aufgenommen (Abb. 23).
PBS
aCTLA-4
Isotyp
% Ueberleben
100
50
0
0
25
50
75
100
Zeit (h)
Abb. 23: Überleben der polymikrobiellen Sepsis nach Applikation von 4F10 im Vergleich zu PBS
und Hamster anti-Maus IgG1
Bei einer weiteren Überlebenskurve sollte die Letalität der C57Bl/6-Mäuse nach Blockade von CTLA-4
verglichen werden mit einer Kontrollgruppe, die PBS injiziert bekam und einer weiteren Kontrollgruppe,
der ein Hamster anti-Maus IgG1-Antikörper i.p. gespritzt wurde (n=12 Tiere/Gruppe). Das Überleben
wurde über 72 Stunden nach der CASP-Operation dokumentiert.
Das Ergebnis zeigte bei den PBS-vorbehandelten Tiere etwa die gleiche Überlebensrate
wie im vorangegangenen Versuch, die Mäuse hingegen, die den anti-CTLA-4Antikörper (4F10) appliziert bekamen, zeigten überraschend ein deutlich verbessertes
Überleben. Auch die CRL1968-vorbehandelten Tiere wiesen nur eine geringe Letalität
auf, die sich kaum von der der CTLA-4-blockierten Gruppe unterschied.
Die regelmäßig vor dem Einsatz im Tierexperiment durchgeführte Überprüfung der
Antikörper-Präparationen mit SDS-Gel und durch Fluoreszenzfärbung hatte eine hohe
Reinheit und das erwartete Bindungsverhalten gezeigt. Weitere Tests der Antikörper82
Ergebnisse
präparationen ergaben jetzt hohe Konzentrationen von LPS. Vermutlich ist dies darauf
zurückzuführen, dass die Hybridome, die die anti-CTLA-4- bzw. die Isotyp-Antikörper
produzierten, inzwischen mit Mycoplasmen kontaminiert waren (Abb. 24). Die
Antikörper, die gegen CTLA-4 und CD4 gerichtet waren und im ersten Experiment
eingesetzt wurden, wiesen keine Kontamination mit Endotoxin auf.
1 Marker
2 Positivkontrolle
3 Negativkontrolle
4 Hamster-Isotyp-Antikörper (CRL1968)
5 aCD4-Antikörper (GK1.5)
6 aCTLA-4-Antikörper (UC10-4F10)ursprüngliche Charge, die im ersten Experiment
eingesetzt wurde
7 aCTLA-4-Antikörper (UC10-4F10)neue Charge, die im zweiten Experiment eingesetzt
wurde
Abb. 24: Untersuchung von Hybridomzellen auf Infektion mit Mycoplasmen
Aus den Hybridomzellen wurde zunächst die DNA isoliert. Anschießend wurde eine PCR zum Nachweis
der Mycoplasmen durchgeführt und die Produkte auf ein TBE-Gel aufgetragen. Ihre Größe wurde anhand
eines 100 bp-Markers bestimmt. Eine Bande von etwa 510 bp ist charakteristisch für eine
Mycoplasmeninfektion.
Das von der Firma Profos gelieferte EndoTrap-System depletiert LPS aus in E. coli
exprimierten rekombinanten Superantigen-Präparationen mit sehr hoher Effizienz (Silva
Holtfreter,
persönliche
Mitteilung).
Es
wurde
deshalb
auch
für
die
Antikörperpräparationen eingesetzt. Nach einem Abreicherungsschritt konnte die LPSMenge jedoch nur halbiert werden (auf 5000 EU LPS/ml). Notwendig war jedoch eine
Abreicherung auf maximal 10 EU/ml, so dass die Herstellerfirma Profos mit der
Detoxifizierung beauftragt wurde. Die daraufhin erhaltenen Antikörper enthielten zwar
nur noch geringe Mengen LPS, erwiesen sich aber als sehr instabil (kein Einfrieren,
sondern nur Lagerung bei 4°C möglich) und ihre Funktionalität war sehr eingeschränkt.
Weitere Versuche waren deshalb mit diesen Antikörpern nicht möglich.
83
Ergebnisse
3.3 Depletion regulatorischer T-Zellen vor CASP
CTLA-4 wird nicht nur nach Aktivierung von T-Lymphozyten heraufreguliert, sondern
es wird auch konstitutiv von murinen regulatorischen T-Zellen exprimiert. Diese Zellen
sind überwiegend CD4+CD25+. Es wurde berichtet, dass die Verabreichung des antiCD25-Antikörpers PC61.5 eine Depletion regulatorischer T-Zellen bewirkt (Tanaka et
al., 2002 [118]; Rad et al., 2006 [119]). Es war von Interesse, ob dies auch den Verlauf
der murinen Peritonitis beeinflusst.
Zur Depletion regulatorischer T-Zellen wurden an den Tagen -3 und -1 jeweils 500 µg
des anti-CD25-Antikörpers PC61.5 verabreicht, die Kontrolltiere erhielten PBS. Am
Tag 0 wurde die CASP-Operation durchgeführt und das Überleben in den folgenden 72
Stunden dokumentiert. Es zeigte sich kein Unterschied zwischen beiden Gruppen
(p=0,66; Abb. 25).
PBS
aCD25
% Überleben
100
50
0
0
25
50
75
100
Zeit (h) nach CASP
Abb. 25: Überlebenskurve nach Depletion regulatorischer T-Zellen
C57Bl/6-Mäusen wurden an den Tagen -3 und -1 jeweils 500 µg des CD25-depletierenden Antikörpers
PC61.5 verabreicht. Die Kontrolltiere bekamen das äquivalente Volumen PBS i.p. gespritzt. Am Tag 0
wurden die Tiere operiert und das Überleben innerhalb der darauf folgenden 72 Stunden dokumentiert
(n=10 Tiere/Gruppe).
84
Ergebnisse
3.4 Bedeutung einer T-Zell-Hemmung durch Tacrolimus nach CASP
Tacrolimus (FK506) ist ein immunsuppressives Medikament, das eine Aktivierung von
T-Zellen unterbindet, welche durch Bindung des T-Zell-Rezeptor-Komplexes an MHCAntigen-Komplexe stimulierende Signale empfangen haben. Tacrolimus wird in der
Klinik u.a. nach Organtransplantationen eingesetzt, um einer durch aktivierte T-Zellen
bedingten Abstoßung entgegenzuwirken.
Wahl einer geeigneten Dosis
Da Tacrolimus die Inhibition von T-Zell-Aktivitäten nach Stimulation des T-ZellRezeptor-Komplexes bewirkt, sollte die Wirksamkeit des Medikaments mit einer
Substanz geprüft werden, die über den TCR agiert. Zu diesen Substanzen gehören die
Superantigene, von Bakterien produzierte Toxine, die zu einer polyklonalen T-ZellAktivierung führen. Zu diesen gehört das Staphylokokken-Enterotoxin B (SEB),
welches nach Applikation einen toxischen Schock hervorruft. Es wurde eine aus
Vorversuchen ermittelte SEB-Konzentration eingesetzt, welche bei 50% der Tiere einen
tödlichen Schock induzierte (LD50-Dosis). Tacrolimus wird im Tiersystem nur selten
genutzt. In der Literatur wurde als eine hohe, eingesetzte Konzentration 0,05 mg
Tacrolimus angegeben, welche vor der Injektion von SEB zweifach (an den Tagen -3
und -1) appliziert wurde. Bei der PBS-Kontrollgruppe überlebten weniger als 50% den
SEB-induzierten Schock (Abb. 26), es verstarb jedoch kein Tier aus der Gruppe, die mit
Tacrolimus vorbehandelt wurde. Trotz der kleinen Tierzahl (n=5/Gruppe) war dieser
Unterschied signifikant (p=0.0468). Die Konzentration von zweimal 0,05 mg
Tacrolimus erwies sich demnach als wirksam vor einem SEB-induzierten Schock und
konnte in weiteren Versuchen verwendet werden.
85
Ergebnisse
Ueberleben (%)
100
PBS-vorbehandelt
Tacrolimus-vorbehandet
50
0
0
25
50
75
Zeit (h) nach SEB-Injektion
Abb. 26: Überleben eines experimentell induzierten SEB-Schocks nach Vorbehandlung mit
Tacrolimus
C57Bl/6-Mäusen wurden an den Tagen -3 und -1 jeweils 0,05 mg Tacrolimus (FK506) verabreicht. Die
Kontrolltiere bekamen das äquivalente Volumen PBS i.p. gespritzt. Am Tag 0 wurde den Tiere eine
LD50-Dosis SEB und Galactosamin appliziert und das Überleben innerhalb der darauf folgenden 72
Stunden dokumentiert (n=5 Tiere/Gruppe).
Überleben Tacrolimus-vorbehandelter Tiere nach CASP
Die als wirksam ermittelte Konzentration von zweimal 0,05 mg Tacrolimus wurde auch
eingesetzt, um die Bedeutung der Hemmung einer Aktivierung von T-Zellen nach einer
durch den T-Zellrezeptor induzierten Signalgebung zu untersuchen. Den Tiere wurden
an den Tagen -3 und -1 Tacrolimus, den Kontrollen PBS, appliziert und am Tag 0
wurde die CASP-Operation durchgeführt. Das Überleben der Tiere wurde bis 72
Stunden nach CASP beobachtet (Abb. 27).
Ueberleben (%)
100
PBS-vorbehandelt
Tacrolimus-vorbehandelt
50
0
0
25
50
75
Zeit (h) nach CASP
Abb. 27: Überleben eines experimentell induzierten SEB-Schocks nach Vorbehandlung mit
Tacrolimus
C57Bl/6-Mäusen wurden an den Tagen -3 und -1 jeweils 0,05 mg Tacrolimus (FK506) verabreicht. Die
Kontrolltiere bekamen das äquivalente Volumen PBS i.p. gespritzt. Am Tag 0 wurde die CASPOperation durchgeführt und das Überleben innerhalb der darauf folgenden 72 Stunden dokumentiert
(n=10 Tiere/Gruppe).
Es zeigte sich jedoch kein Unterschied zwischen der Überlebensrate der Tacrolimusund der PBS-vorbehandelten Gruppe (p= 0,6278). Aufgrund dessen wurden keine
Funktionsversuche durchgeführt.
86
Ergebnisse
Themenkomplex II
Immunologische
Langzeitkonsequenzen
einer
generalisierten
polymikrobiellen Sepsis
Schwere Sepsis bzw. septischer Schock sind mit einer Mortalität von etwa 50%
verbunden. Aufgrund einer sehr guten intensivmedizinischen Betreuung sind
Sepsispatienten heute weniger durch die akute inflammatorische Phase gefährdet, in der
die Tiere nach der CASP-Operation sterben, sondern vielmehr durch die darauf
folgende Immunparalyse. Aufgrund dessen hatten wir eine Langzeitstudie geplant, die
unter anderem nach Korrelationen des CARS sucht. Sie stellt die Frage, ob z. B. die
Apoptose
und
weitere
negative
Rückkopplungsmechanismen
zu
einer
Immunsuppression führen. Die Beobachtung der massiven Apoptose führte außerdem
zu der Frage, ob und wann es zur Rekonstitution der Immunzellpopulationen kommt
und ob eine Sepsis immunologische Langzeitfolgen hinterlässt.
Die meisten Studien beschäftigen sich mit der Frage, welche Faktoren die Sterblichkeit
der Patienten beeinflussen und wodurch die Überlebensrate erhöht werden kann. Über
die Folgen jedoch, die eine Sepsis bei den überlebenden Patienten hinterlässt, ist nur
wenig bekannt. Besonders die Frage, welche Konsequenzen das Krankheitsbild für die
Funktionalität des Immunsystem nach sich zieht, war für uns von besonderem Interesse.
Hinterlässt die massive Immunantwort, die eine Sepsis auslöst, später einen Defekt bei
nachfolgenden
immunologischen
Reaktionen
z.B.
auf
Infektionen
oder
Immunisierungen? Entwickelt sich ein Immungedächtnis, das vor weiteren Infektionen
schützt?
Zur
Untersuchung
immunologischer
Konsequenzen
einer
generalisierten
polymikrobiellen Sepsis wurden die Reaktionen nach einer CASP-Operation bestimmt.
Da die CASP selbst mit einer hohen Mortalität assoziiert ist, wurde eine Variante dieser
Methode genutzt, die CASPI (I= Intervention). Bei der CASPI wird der Stent 6 Stunden
nach dem Einsetzen in einer zweiten Operation wieder entfernt. Die Tiere entwickeln
eine mildere Form der Peritonitis mit einer höheren Überlebensrate.
Der Untersuchungszeitraum betrug insgesamt drei Monate (schematischer Aufbau der
Versuchsreihe: siehe Abbildung 28). Zunächst wurde engmaschig (1, 3, 7 und 14 Tage
nach CASPI) beobachtet, dann einen Monat (28 Tage) und drei Monate (84 Tage) nach
CASPI. Es wurden zwei Kontrollgruppen eingesetzt: 8-10 Wochen alte Tiere (Ktrl),
87
Ergebnisse
entsprechend dem Alter bei CASPI, und 5 Monate alte Tiere (84 Ktrl) zum Vergleich
mit den Tieren, die 3 Monate nach CASPI untersucht wurden.
013
7
14
8-10 Wochen alte
Kontrolltiere (Ktrl)
28
84
5 Monate alte
Kontrolltiere
(84 Ktrl)
Abb. 28: Schematische Darstellung der untersuchten Zeitpunkte zum Langzeitüberleben nach
CASPI
Direkt nach der CASPI wurden die Tiere in kurzen Abständen untersucht (1,3 und 7 Tage), mit
zunehmendem Abstand von Zeitpunkt der Induktion der Peritonitis wurden auch in
Untersuchungsabstände länger (14 Tage, 1 Monat und 3 Monate). Dazu gab es zwei Gruppen von
Kontrolltieren: einerseits Tiere in dem Alter, in welchem die Operation stattfindet (8-10 Wochen) und
welche die ersten 14 Tage nach CAPSI abdeckt. Zum anderen 5 Monate alte Tiere als Kontrolle für die
Tiere, deren Operation 3 Monate zurücklag.
Bei den im folgenden aufgezeigten Ergebnissen ist zu beachten, dass es sich hierbei um
ein Pilotexperiment handelt. Es sollten nur Parameter gefunden werden, bei denen
interessante Unterschiede im Untersuchungszeitraum detektiert werden konnten. Diese
sollen dann in weiteren, sich anschließenden Versuchen genauer charakterisiert werden.
Aufgrund dessen war die Gruppengröße stark dezimiert: je Untersuchungszeitpunkt
wurden 5 Tiere eingeschlossen. Als Folge davon ergaben sich teilweise große
Streuungen und einige Daten konnten nur tendenziell aufgenommen werden, da zur
Bestätigung einer Signifikanz nur unzureichende Daten zugrunde gelegt werden
konnten.
88
Ergebnisse
3.5 Entwicklung des Gewicht peripherer Lymphorgane im Zeitverlauf nach
CASPI
Zunächst wurde das Gewicht von Milz und Thymus sowie der mesenterialen
Lymphknoten bestimmt.
Die Milz einer 8 bis 10 Wochen alten, unbehandelten Maus wog durchschnittlich
0,09182 g ± 0,02 g (Abb. 29A). Als unmittelbare Folge der Peritonitis kam es zu einer
Gewichtsabnahme (0,07084 g ± 0,00852 g). Sehr rasch jedoch wurde der
Ausgangszustand wieder erreicht. Das Gewicht der Milz nahm daraufhin innerhalb der
ersten 14 Tage nach der Operation kontinuierlich zu (Tag 3: 0,0960 g ± 0,02 g; Tag 7:
0,1594 g ± 0,043 g; p=0,0071; Tag 14: 0,1993 g ± 0,05 g; p=0,0011). Einen Monat nach
CASPI sank das Gewicht zwar wieder leicht ab, blieb aber signifikant höher als jenes
unbehandelter Tiere (0,1456 g ± 0,05 g; p=0,0471). Bei den ehemals septischen Tieren
nahm das Milzgewicht anschließend noch einmal stark zu und betrug bei den Tiere 3
Monate nach der Operation durchschnittlich 0,2449 g ± 0,08 g im Vergleich zu 0,0845 g
± 0,02 g bei den nicht operierten, altersentsprechenden Kontrollen (p=0,0018).
Die Mesenteriallymphknoten unbehandelter Tiere hatten ein mittleres Gewicht von
38,34 mg ± 12,8 mg (Abb. 29B), es blieb auch während der ersten Tage nach der
Operation unauffällig. Es konnte jedoch eine Tendenz zur Gewichtszunahme beobachtet
werden, die 28 Tage nach CASPI signifikant war (74,5 mg ± 21,9 mg; p=0,0351). Auch
3 Monate nach der CASPI war das Gewicht der Lymphknoten höher (101,1 mg ± 48,1
mg) als das der nicht operierten Kontrolltiere gleichen Alters (68,22 mg ± 32,2 mg).
Während das Gewichts von Milz und den mesenterialen Lymphknoten, das zunächst
abnahm, bereits 3 Tage nach der Operation wieder unauffällig war, zeichnete sich beim
Thymus ein anderes Bild ab (Abb. 29C): Der Thymus unbehandelter Mäuse wog
durchschnittlich 84,03 mg ± 16,4 mg. Unmittelbar nach Beginn der Sepsis kam es zu
einem dramatischen Verlust an Organmasse: einen Tag nach CASPI sank das Gewicht
des Organs im Mittel auf 44,36 mg ± 15,1 mg, 3 Tage nach der Operation war der
Thymus nur noch durchschnittlich 21,34 mg ± 6,3 mg schwer. Nach etwa einer Woche
begann die Rekonstruktion: das Gewicht des Thymus stieg auf 66,34 mg ± 50,2 mg. 14
Tage nach CASPI war die Wiederherstellung der Architektur abgeschlossen, das
Gewicht verhielt sich wieder unauffällig und blieb es auch innerhalb des weiteren
Beobachtungszeitraums.
89
Ergebnisse
A
B
Milzgewicht (g)
**
0.3
**
**
0.2
0.1
0.0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
0.15
Gewicht
Mesenteriallymphknoten (g)
0.4
0.05
0.00
84 Ktrl
*
0.10
Ktrl
1
Tage nach CASPI
Thymusgewicht (g)
C
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
0.20
0.15
0.10
**
0.05
***
0.00
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 29: Gewicht von Milz, mesenterialen Lymphknoten und Thymus im Langzeitverlauf nach
CASPI
Gezeigt ist der Verlauf des Gewichts von Milz (A; in g), mesenterialen Lymphknoten (B; in g) und
Thymus (C; in g) bei den Mäusen zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den
Kontrolltieren (weiß). (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,001)
3.6 Apoptose in der Milz
Einen Tag nach der CASPI hatten Milz und mesenteriale Lymphknoten, besonders aber
der Thymus an Gewicht verloren. Welche Ursache hatte diese Gewichtsabnahme?
Einen Aufschluss darüber sollte die Bestimmung des programmierten Zelltodes geben.
Die Messung der Apoptose wurde auf zwei verschiedene Arten durchgeführt: Einerseits
wurden Annexin V-positive Zellen durch eine FACS-Färbung ermittelt, andererseits
wurden Gewebeschnitte der Milz mit der TUNEL-Methode gefärbt.
Wie bereits bei der Apoptosefärbung nach Depletion von CD4+ T-Zellen beschrieben,
werden bei der TUNEL-Methode FITC-markierte Nukleotide an die an den Bruchenden
der
DNA
freiwerdenden
Hydroxylgruppen
durch
die
terminale
Desoxynukleotidyltransferase (TDT) gehängt (Abschnitt 3.1.8). Sie dient also der
Darstellung der Zellkerne apoptotischer Zellen. Diese Methode gilt als sensitiv. Von
den gefärbten Milzschnitten wurden jeweils zwei charakteristische Aufnahmen gemacht
und mit dem „MetaMorph“-Programm die Fläche, die nach TUNEL-Färbung grün
90
Ergebnisse
fluoreszierte, berechnet und deren prozentualer Anteil an der Gesamtfläche des
Milzgewebes kalkuliert (Abb. 31).
% TUNEL+Milzflaeche/
gesamte Milzflaeche
40
**
**
*
30
**
**
**
20
**
10
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 30: Apoptose in der Milz im Langzeitverlauf nach CASPI
Der programmierte Zelltod wurde mit einem TUNEL-Test auf Milzschnitten bei den Mäusen zu den
verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den Kontrolltieren (weiß) bestimmt. Die
Auswertung erfolgte mit der MetaMorph-Software, wobei zwei verschiedene, charakteristische
Ausschnitte eines Milzschnittes ausgewählt und dort die Fläche der TUNEL- (FITC-) positive Zellen
berechnet wurde. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005)
Die Fläche der apoptotischen Zellen, die durch die TUNEL-Methode detektiert wurden,
nahm bei den Kontrolltieren 0,4 ± 0,7% der Gesamtfläche der Milz ein. Einen Tag nach
der CASPI hatte sie sich nur gering erhöht (2,1 ± 2,1%), vergrößerte sich am Tag 3
jedoch dramatisch (21,0 ± 12,1%; p=0,0063) und blieb auch 7 Tage (14,6 ± 7,3%;
p=0,0026) und 14 Tage nach Induktion der Peritonitis hoch (16,02% ± 14,3%;
p=0,0414). Einen Monat nach CASPI war noch einmal eine erhöhte Apoptoserate zu
beobachten (23,2% ± 13%; p=0,0045), drei Monate nach der Operation hingegen war
die Fläche, welche FITC-markiert war, wieder auf dem gleichen Niveau verglichen mit
den Kontrolltieren gleichen Alters (jeweils zwischen 1,8% ± 1,3% bzw. 2,6% ± 2,4%).
Die Färbung der Apoptose mit der TUNEL-Methode auf den Milzschnitten erlaubte
jedoch keine Aussage über die betroffenen Zellpopulationen. Zur genaueren
Untersuchung des programmierten Zelltodes bei den CD4+ T-Zellen wurde die
Oberflächenexpression von Phosphatidylserin bestimmt. Dieses befindet sich bei
intakten Zellen auf der Innenseite der Zellmembran. Während der Apoptose wird es
jedoch verstärkt auf die Außenseite der Membran transloziert. Dort wird es spezifisch
von Annexin V gebunden. Wenn es bei nekrotischen Zellen zur Permeabilisierung der
Zellmembran kommt, kann das Annexin V in die Zelle eindringen und dort das
Phosphatidylserin an der Innenseite der Membran färben. Deshalb wurden nach dem
91
Ergebnisse
Eingrenzen der Lymphozyten zunächst die nekrotischen Zellen durch Propidiumiodid
markiert und von der Analyse ausgeschlossen. Erst dann erfolgte die Bestimmung der
Annexin V (FITC)/CD4 (PE)-positiven Zellen in der Milz (Abb. 31).
%Annexin V+/CD4+
40
30
**
20
CD4
*
10
0
Ktrl
1
3
7
28
84
Tage nach CASPI
84 Ktrl
Annexin V
+
Abb. 31: Bestimmung der Apoptose der CD4 T-Zellen im Langzeitverlauf nach CASPI mit
Annexin V
+
Der programmierte Zelltod der CD4 T-Lymphozyten der Milz wurde im FACS bestimmt. Dazu wurde
ein PE-markierter anti-CD4-Antikörper zur Detektion der Zielzellpopulation eingesetzt und mit FITC
+
markiertes Annexin V zum Nachweis von Phosphadidylserin. Der prozentuale Anteil der Annexin V
+
CD4 Zellen bei den Mäusen zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den
Kontrolltieren (weiß) ist auf der linken Abbildung ersichtlich (Zeitpunkt 14 Tage nach CASPI nicht
verfügbar). Auf der rechten Seite ist ein typisches Bild einer FACS-Färbung zu sehen. Dargestellt sind
die Lymphozyten der Milz nach Ausschluss nekrotischer Zellen, auf der X-Achse ist die Fluoreszenz des
FITC-markierten Annexins V aufgetragen (FL1), auf der Y-Achse die PE-Fluoreszenz des anti-CD4
Antikörpers (FL2). (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005)
Bei den unbehandelten, 8 bis 10 Wochen alten Tieren ließen sich 10,2 ± 2,7% der CD4+
T-Zellen der Milz mit Annexin V färben. Einen Tag nach CASPI blieb dieser Anteil
nahezu unverändert, stieg aber 3 Tage nach der Operation leicht an (14,5 ± 2% der
CD4+ T-Zellen; p=0,0429). Eine Woche nach Induktion der Peritonitis war der Anteil
apoptotischer CD4+ T-Zellen mit durchschnittlich 22,5 ± 3,3% (p=0,0028) am höchsten,
danach fiel er wieder ab auf 16,5 ± 5,9% bei den Mäusen 28 Tage nach CASPI. Drei
Monate nach der Operation war die Anzahl Annexin V+CD4+ Zellen vergleichbar mit
der der Kontrollen gleichen Alters.
92
Ergebnisse
3.7 Zusammensetzung der Zellpopulationen im Langzeitverlauf nach CASPI
Das Gewicht von Milz, mesenterialen Lymphknoten und Thymus war während des
Untersuchungszeitraums teilweise großen Schwankungen ausgesetzt, in der Milz
wurden verstärkt apoptotische Prozesse auch noch längere Zeit nach Induktion der
Peritonitis beobachtet. Ob und wie stark sich dies in den Zellzahlen niederschlägt, wird
im folgenden Abschnitt beschrieben. Besonders berücksichtigt bei den Untersuchungen
wurden verschiedene Zellpopulationen der Milz wie Granulozyten und T-Zellen, die
aufgrund der Expression weiterer Moleküle genauer charakterisiert wurden und in den
sich anschließenden Abschnitten beschrieben werden.
3.7.1 Entwicklung der Zellzahlen von Milz, Thymus und mesenterialen
Lymphknoten nach CASPI
Die Milz einer 8 bis 10 Wochen alten, unbehandelten Maus beinhaltete 10,48 ± 2,3 x
107 Zellen (Abb. 32A). Einen Tag nach der Operation konnte ein Abfall der Anzahl der
Splenozyten (6,88 ± 1,8 x 107 Zellen; p= 0,0201) beobachtet werden. Sehr rasch jedoch
wurde der Ausgangszustand wieder erreicht und blieb zunächst weitgehend konstant, 14
Tage nach CASPI jedoch war eine starke Zunahme der Milzzellzahl zu beobachten (im
Mittel 14,48 ± 4,6 x 107). Außerdem konnten bei den Tieren, die drei Monate zuvor
septisch waren, annähernd die doppelte Anzahl an Splenozyten (20,20 x 107 ± 10,9)
isoliert werden wie bei den nicht operierten Tieren gleichen Alters (10,44 x 107 ± 2,4).
Die Mesenteriallymphknoten unbehandelter Tiere bestanden aus 8,2 ±0,8 x 106 Zellen
(Abb. 32B). Einen Tag nach CASPI wurde eine starke Verminderung der Zellzahl auf
3,7 ± 1,4 x 106 (p= 0,0001) detektiert, die jedoch schon drei Tage nach der Operation
wieder unauffällig war. Drei Monate nach CASPI jedoch war die Zellzahl in den
mesenterialen Lymphknoten um etwa die Hälfte vermindert verglichen mit der nicht
operierter Tiere gleichen Alters (operiert: 5,7 ± 1,0 x 106; nicht operiert: 10,6 ± 5,5 x
106).
Aus dem Thymus unbehandelter Mäuse konnten 12,18 ± 3,4 x 107 Zellen isoliert
werden (Abb. 32C). Einen Tag nach CASPI sank die Zellzahl dramatisch auf 2,4 ± 3,1 x
107 Thymozyten, 3 Tage nach der Operation konnten sogar nur noch 0,4 ± 0,3 x 107
Zellen nachgewiesen werden, auch 7 Tage nach CASPI war die Zellzahl nur
geringfügig auf 2,45 ± 1,8 x 107 angestiegen. 14 Tage nach CASPI jedoch war die
Zellzahl wieder unauffällig und zeigte im Beobachtungszeitraum auch keine weiteren
Änderungen.
93
Ergebnisse
B
40
30
Zellzahl meseteriale
6
Lymphknoten (*10 )
7
Anzahl der Splenozyten (*10 )
A
30
20
10
0
*
Ktrl
1
20
10
***
3
7
14
28
84
0
84 Ktrl
Ktrl
1
Tage nach CASPI
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
30
7
Anzahl der Thymozyten (*10 )
C
3
20
10
***
0
***
***
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 32: Zellzahlen von Milz, mesenterialen Lymphknoten und Thymus
Dargestellt ist die Anzahl der in der Milz (A; x 107), den Mesenteriallymphknoten (B; x 106) und den im
Thymus vorhandenen Zellen (C; x 107) bei den Mäusen zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI
(schwarz) und bei den Kontrolltieren (weiß). (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05;
***p<0,001)
3.7.2 Anteil der Granulozyten in der Milz im Langzeitverlauf nach CASPI
In den Versuchen, die die Antwort des Immunsystems auf die akute Phase der
Peritonitis betrachtete, konnten wir zwar eine starke Infiltration von Granulozyten in
das Peritoneum nachweisen, eine Einwanderung in die Milz wurde jedoch nicht
beobachtet. Eine Funktion dieser Zellen betrifft die Phagozytose u.a. apoptotischer
Zellen, welcher in größerem Umfang in der Milz vorhanden waren - allerdings erst ab
dem 3. Tag nach CASPI.
In Abbildung 33 dargestellt ist die prozentuale Anteil der Granulozyten in der Milz, der
im Untersuchungszeitraum bestimmt wurde. Bei unbehandelten Tieren waren 3,2 ±
1,5% Granulozyten in der Milz vorhanden. Sie befanden sich größtenteils verstreut in
der roten Pulpa, nur wenige dieser Zellen ließen sich in der weißen Pulpa nachweisen.
Einen und drei Tage nach CASPI änderte sich der prozentuale Anteil der Granulozyten
in der Milz kaum, es ließ sich jedoch eine verstärkte Organisation der Zellen erkennen,
welche sich um die weiße Pulpa herum anordneten. 7 Tage nach der Induktion der
Peritonitis konnte eine massive Infiltration von Granulozyten in die Milz beobachtet
94
Ergebnisse
werden. Dieser Zelltyp machte nun 19,68 ± 6,7% der Milzzellen aus. Nach einer
weiteren Woche, 14 Tage nach CASPI, blieb der Anteil der Granulozyten in der Milz
hoch, es konnte sogar noch eine geringe Steigerung auf 27 ± 7,9% festgestellt werden.
Dann jedoch fiel die Anzahl der in der Milz vorhandenen Granulozyten bis 28 Tage
nach CASPI wieder etwas ab auf durchschnittlich 16,9 ± 6,9%, zu keinem Zeitpunkt
konnte jedoch eine deutliche Infiltration dieser Zellen in die weiße Pulpa beobachtet
werden. Bei den Tieren drei Monate nach CASPI gab es kaum einen Unterschied mehr
zur altersentsprechenden Kontrolle. Aber auch bei den Kontrolltieren zeigte sich, dass
bei den älteren Tieren mehr Granulozyten vorhanden waren (im Mittel 7,2 ± 3,1%;
p=0,0309) als bei den 8 bis 10 Wochen alten Tieren (das Bildmaterial ist der Abb. 73 im
Anhang zu entnehmen).
% Granulozyten/Milzschnitt
40
**
30
***
***
20
10
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 33: Anteil von Granulozyten in der Milz im Langzeitverlauf nach CASPI
Die Granulozyten wurden mit dem Antikörper Gr1.1 immunhistologisch angefärbt, das Milzgewebe mit
Hämalaun sichtbar gemacht. Mit dem MetaMorph-Programm wurde der prozentuale Anteil der Fläche,
welche die Granulozyten markierte, von der Gesamtfläche der Milz kalkuliert.
(Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; **p<0,005; ***p<0,001)
95
Ergebnisse
3.7.3 Phänotypische Analyse der T-Zellpopulationen im Zeitverlauf nach CASPI
3.7.3.1 Anteil der T-Lymphozyten in der Milz und den mesenterialen
Lymphknoten im Langzeitverlauf nach CASPI
In der Studie zum Langzeitüberleben nach einer Peritonitis sollte insbesondere das
Verhalten der T-Zellen beobachtet werden. Dazu wurde der prozentuale Anteil der TZellen in der Milz und den mesenterialen Lymphknoten, aber auch verschiedener
Subpopulationen der T-Zellen in der Milz betrachtet.
Der prozentuale Anteil der CD3+ T-Lymphozyten in der Milz und den mesenterialen
Lymphknoten wurde durch FACS-Analyse ermittelt. Infolge der CASPI kam es zu
einem stetigen Abfall des Anteils CD3+ T-Zellen (Abb. 34A). Bei unbehandelten Tieren
exprimierten durchschnittlich 48,5 ± 14,2% der Zellen in der Lymphozytenregion CD3.
Schon einen Tag nach CASPI begann der Anteil der CD3+ T-Lymphozyten zu sinken,
drei Tage nach der Operation waren noch durchschnittlich 32 ± 7,6% CD3+ T-Zellen
(p=0,0646) nachweisbar und am Tag 7 nach Induktion der Peritonitis konnten nur noch
26,5 ± 3,1% der Zellen mit einem anti-CD3-Antikörper gefärbt werden (p=0,0175). 14
Tage nach CASPI war eine deutliche Zunahme der CD3+ T-Zellen zu verzeichnen
(44,75 ± 16,4%), aber 28 Tage waren wieder deutlich weniger T-Zellen vorhanden (29,1
± 7,4%; p=0,0668). Danach stieg der Anteil der CD3+ T-Zellen wieder an und war bei
den Tieren drei Monate nach CASPI im Vergleich zu den Kontrollen gleichen Alters
unauffällig.
Der prozentuale Anteil der CD4+ T-Zellen an den CD3+ T-Zellen hingegen blieb über
den gesamten Zeitraum weitgehend konstant.
Die Zahl der CD3+ T-Zellen in den mesenterialen Lymphknoten unbehandelter Tiere
betrug durchschnittlich 79,44 ± 9,7% (Abb. 34B). Schon einen Tag nach der CASPI
sank die Anzahl der T-Zellen stark ab (62,37 ± 5,5%; p=0,012) bis 7 Tage nach CASPI
(53,7 ± 14,4%; p=0,0353) und blieb auf diesem niedrigen Niveau bis 28 Tage nach der
Operation (56,2 ± 8,9%; p=0,0277). Auch bei den Tieren drei Monate nach CASPI
wurden signifikant weniger CD3+ T-Zellen in den Mesenteriallymphknoten (52,7 ±
11,1%) gefunden als bei den Kontrollen gleichen Alters (66,65 ± 4,6%; p=0,0313).
96
Ergebnisse
A
B
% CD3+ T-Lymphozyten
(Mesenteriallymphknoten)
% CD3+ T-Lymphozyten
(Milz)
80
60
40
*
20
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
100
75
*
*
*
*
28
84
50
25
0
Ktrl
1
Tage nach CASPI
3
7
14
84 Ktrl
Tage nach CASPI
+
Abb. 34: Anzahl CD3 T-Lymphozyten in der Milz und in den mesenterialen Lymphknoten im
Langzeitverlauf nach CASPI
+
Zur Bestimmung des przentualen Anteils der CD3 T-Zellen in der Milz (A) und in den mesenterialen
Lymphknoten (B) zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den Kontrolltieren
(weiß) wurde die FACS-Analyse eingesetzt. Dazu wurde die Region, welche die Lymphozyten enthielt,
eingegrenzt und der prozentuale Anteil der dort vorhandenen T-Zellen, welche mit einem PE-gekoppelten
anti-CD3-Antikörper gefärbt wurden, kalkuliert. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05)
3.7.3.2 Untersuchung des Anteils CD45RB- und CD62L-exprimierender TZellpopulationen
Die CASP-Operation führte zu massiver Apoptose in den peripheren Lymphorganen.
Deshalb war es von großen Interesse nachzuweisen, ob und wann die Organe wieder
mit Zellen besiedelt werden und ob dies durch naive oder durch Gedächtniszellen
geschieht. Dazu wurden die Milzzellen hinsichtlich der Expression von Molekülen
untersucht, die zur Unterscheidung von naiven und Gedächtniszellen genutzt werden
können.
Messung der Expression von CD45RB im Zeitverlauf nach CASPI
CD45RB ist ein Oberflächenmolekül, das auf fast allen B- und T-Lymphozyten
exprimiert wird. Aufgrund der Expressionsdichte unterscheidet man zwischen Zellen,
die CD45RB in hoher Dichte exprimieren (CD45RBhigh), Zellen, die CD45RB in
geringerer Dichte exprimieren (CD45RBlow) und CD45RB-negativen Zellen (CD45RB). Die Expression von CD45RB wird abhängig vom Zelltyp, vom Reifungsgrad und
vom Aktivierungsgrad der Zellen reguliert. So nimmt die Expression von CD45RB auf
T-Zellen ab, wenn sich diese von naiven Zellen zu Gedächtniszellen entwickeln.
Weiterhin sind Subpopulationen von CD4+ T-Zellen mit hoher bzw. niedriger
Expression von CD45RB durch verschiedene Zytokinmuster und unterschiedliche
biologische Funktionen gekennzeichnet. CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, welche
intestinale Entzündungen und Autoimmunität kontrollieren, sowie Makrophagen und
dendritische Zellen exprimieren geringe Mengen von CD45RB.
97
Ergebnisse
Im Langzeitexperiment wurde die Expression von CD45RB auf den CD3+ TLymphozyten durch FACS-Analyse bestimmt. Ein charakteristisches Diagramm der
FACS-Analyse mit den distinkten CD45RB-Populationen ist in Abbildung 35
dargestellt.
A
B
Abb. 35: FACS-Darstellung der Expression von CD45RB auf Splenozyten.
Die Expression von CD45RB wurde mit Hilfen der FACS-Analyse bestimmt. Zunächst wurde die
Region, in der sich Lymphozyten befanden, eingegrenzt und waren die Grundlage der Auswertung. Die
T-Zellen waren mit einen FITC-markierten anti-CD3 Antikörper gefärbt (FL1). Von diesen wurde der
Anteil der CD45RB-exprimierenden Zellen mit einem PE-gekoppelten anti-CD45RB Antikörper
bestimmt. Dazu wurden zwei Regionen gezeichnet. Die Region R3 (blau) deklariert die CD45RBhighZellen, die Region R4 (violett) die CD45RBlow-Zellen (A). Die mitgeführte Isotypkontrolle (B) dient der
Abgrenzung der CD45RB-negativen Zellen.
In den ersten drei Tagen nach der CASPI blieb die Verteilung der beiden CD45RBexprimierenden CD3+ T-Zellpopulationen unverändert (Abb. 36). Etwa 22% der TZellen exprimierten das Protein in hoher und etwa 21% in geringerer Dichte. Sieben
Tage nach der Operation jedoch fiel sowohl der Anteil der CD45RBhigh (8,5 ± 2,8%;
p=0,007) als auch der der CD45RBlowCD3+ Zellen (9,7 ± 3,8%; p=0,0007) stark ab,
auch 14 Tage nach CASPI war der Anteil der CD45RBlowCD3+ Zellen noch deutlich
erniedrigt (11,45 ± 4,5%; p=0,0013). Trotz eines anschließenden Anstiegs des Anteils
beider Zellpopulationen war bei den Tieren drei Monate nach der CASPI der Anteil der
CD3+ T-Zellen, die CD45RB mit hoher Dichte exprimierten, weiterhin signifikant
erniedrigt (13,11 ± 3,1%) im Vergleich mit dem Kontrollen gleichen Alters (19,2 ±
0,9%; p=0,0032).
98
Ergebnisse
40
+/CD3+
low
30
20
**
**
10
0
40
B
CD45RB
CD45RB
high
+/CD3+
A
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
30
20
***
**
10
0
Tage nach CASPI
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 36: Expression von CD45RB auf den CD3-positiven T-Lymphozyten der Milz im
Langzeitüberleben nach CASPI
Dargestellt ist der Anteil der CD45RBhigh (A) und CD45RBlow (B) positiven CD3-T-Zellen in der Milz
von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den Kontrollen (weiß),
bestimmt mittels FACS-Analyse. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005;
***p<0,001)
Expression von CD62L im Zeitverlauf nach CASPI
Neben CD45RB ist auch die Expression von CD62L ein Unterscheidungsmerkmal
zwischen naiven, Effektor- und Gedächtniszellen. CD62L (L-Selektin) ist ein Mitglied
der Familie der Selektin-Adhäsionsmoleküle. Es wird auf den meisten murinen
Thymozyten exprimiert, außerdem auf Populationen von B- und T-Zellen sowie
Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen. Das Molekül wird benötigt für das
„homing“ der Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten und für die Rekrutierung
von Neutrophilen zu Orten der Entzündung. Nach der Aktivierung der Lymphozyten
und Neutrophilen wird die Expression von CD62L herunterreguliert.
Die Expression von CD62L wurde ebenfalls auf den CD3+ T-Lymphozyten duch eine
FACS-Analyse bestimmt. Unterschieden wurde dabei zwischen der Population, die das
Molekül in hoher (CD62Lhigh), in geringerer Dichte (CD62Llow) oder nicht exprimierten
(CD62L-).
Ähnlich wie bei CD45RB änderte sich in den ersten 3 Tagen nach CASPI die
Zusammensetzung der T-Zellpopulation kaum. Etwa 70% der CD3+ T-Zellen
exprimierten CD62L in hoher und 11% in intermediärer Dichte, etwa 19% waren
CD62L-negativ. Am Tag 7 nach der Operation kam es jedoch zu einer starken
Abnahme der CD62LhighCD3+ T-Zellen (45,9 ± 3,7%; p=0,0166; Abb. 37A) bei
gleichzeitiger Zunahme sowohl der CD62LlowCD3+ T-Zellen (21,1 ± 2,3%; p=0,042;
Abb. 37B) als auch der CD62L-negativen T-Zellen (34,1 ± 2,2%; p=0,0047; Abb. 37C).
14 Tage nach CASP hatte der Anteil der CD62LhighCD3+ T-Zellen Zellen fast wieder
99
Ergebnisse
das Ausgangsniveau erreicht und veränderte sich im Untersuchungszeitraum auch kaum
noch, abgesehen von einer altersbedingten geringen Reduktion dieser Zellpopulation. Es
waren aber auch zu diesem Zeitpunkt noch vermehrt CD62LlowCD3+ T-Zellen
vorhanden (30,2 ± 7,5%; p=0,0079), während die CD62L-negative Fraktion stark
abgenommen hatte (9,1 ± 2,4%; p=0,0242). Anschließend kam es zu einem
kontinuierlichen Abfall der CD62LlowCD3+ T-Zellen und einem stetigen Anstieg der
CD62L-negativen CD3+ T-Zellen, was zur Folge hatte, dass die Tiere drei Monate nach
CASPI deutlich weniger CD62LlowCD3+ T-Zellen (8,3 ± 1,7%) als die Kontrollen
gleichen Alters (9,7 ± 7,2%; p=0,0089) hatten, dafür aber mehr CD62L-CD3+ T-Zellen
(41,49 ± 8,2% im Vergleich zu 15,7 ± 6,7% bei den Kontrollen; p=0,0005).
A
B
/CD3+
25
0
Ktrl
1
3
7
**
30
*
low
*
50
% CD62L
% CD62L
40
75
high
/CD3+
100
14
28
84
20
0
84 Ktrl
**
10
Ktrl
1
Tage nach CASPI
C
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
60
% CD62L-/CD3+
**
40
**
20
*
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 37: Expression von CD62L auf den CD3+ T-Lymphozyten im Langzeitüberleben nach CASPI
Dargestellt ist der Anteil der CD62Lhigh (A) und CD62Llow CD3+ T-Zellen (B) in der Milz von Mäusen zu
verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den Kontrollen (weiß), bestimmt mittels
FACS-Analyse. Eine mitgeführte Isotypkontrolle diente der Unterscheidung der Zellen, die CD62L
exprimierten, von den CD62L-negativen Zellen. (C; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05;
**p<0,005)
100
Ergebnisse
3.7.3.3 Untersuchung CD103+ regulatorischer T-Zellen in der Milz und den
mesenterialen Lymphknoten im Zeitverlauf nach CASPI
Es wurde ebenfalls die Dynamik einer Subpopulation CD4+CD25+ regulatorischer TZellen bestimmt, die das Integrin αEβ7 (CD103) exprimieren. Der Anteil dieser Zellen in
der Milz nahm bei einer Peritonitis von durchschnittlich 6,7 ± 1,3% auf 3,6 ± 0,3% ab
(Abb. 38A), erreichte aber bereits drei Tage nach CASPI wieder das Niveau
unbehandelter Tiere und blieb im Verlauf des Untersuchungszeitraums weitgehend
konstant. Am Tag 14 nach CASPI jedoch wurde eine erhöhte Zahl CD103+CD4+ TZellen ermittelt (10,1 ± 4,9%). Während es bei den unbehandelten Tieren in der Milz zu
einer Abnahme der CD103+ Zellen im natürlichen Alterungsprozess kam (3,9% ±
0,7%), war dies bei den Tieren drei Monate nach der Operation nicht zu beobachten, bei
ihnen war die Zahl der CD103+ T-Zellen erhöht (6,4 ± 1,6%; p=0,026).
In den mesenterialen Lymphknoten war der Anteil CD103+CD4+ T-Zellen auch bei
unbehandelten Tiere höher (8,9 ± 2,5%; Abb. 38B) als in der Milz. Am Tag 7 nach
CASPI hatte er sich weiter erhöht (19,6 ± 9,8%; p=0,048), ansonsten blieb der Anteil
dieser Zellpopulation in den mesenterialen Lymphknoten weitgehend konstant. Wie
auch in der Milz blieb der bei den unbehandelten Tieren zu beobachtende altersbedingte
Rückgang des Anteils Integrin αEβ7+CD4+ regulatorischer T-Zellen als Folge der CASPI
aus (17,1 ± 11,9% im Vergleich mit 6 ± 2,1% bei den Kontrollen gleichen Alters).
15
B
% CD03+/CD4+
(Mesenteriallymphknoten)
% CD103+/CD4+ (Milz)
A
10
*
5
0
**
Ktrl
1
3
7
14
28
Tage nach CASPI
84
84 Ktrl
40
*
30
20
10
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 38: Expression von CD103 durch CD4+ T-Zellen der Milz und der mesenterialen Lymphknoten im Langzeitüberleben nach CASPI
Die Expression von CD103 (Integrin αEβ7), eines Proteins, welches von einer Subpopulation CD4+CD25+
regulatorischer T-Zellen exprimiert wird, wurde auf den Treg in der Milz (A) und der
Mesenteriallymphknoten (B) der jeweils 5 Mäuse zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI
(schwarz) und der Kontrolltiere (weiß) wurde durch FACS-Analyse bestimmt. (Daten dargestellt als
Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005)
101
Ergebnisse
3.7.4 Expression von Aktivierungsmarkern im Zeitverlauf nach CASPI
Zur Bestimmung des Aktivierungszustandes der T-Zellen wurde die Expression von
CD69, ICOS und CD25 auf den T-Lymphozyten der Milz im FACS analysiert (Abb.
39). Von besonderem Interesse waren die CD4-positiven T-Zellen, da aus
vorangegangenen Versuchen bekannt war, dass vor allem diese Zellen mit einer
verstärkten Expression von Aktivierungsmarkern auf die Peritonitis reagieren.
A
B
40
*
*
20
0
0
1
3
7
14
28
84
40
% ICOS+/CD4+
% CD69+/CD4+
60
30
*
20
**
10
0
84 Ktrl
**
0
1
3
Tage nach CASPI
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
30
% CD25+/CD4+
C
20
***
10
0
0
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 39: Expression von CD69, ICOS und CD25 im Langzeitüberleben nach CASPI
Die Expression von CD69, ICOS und CD25 auf den Milzzellen der jeweils 5 Mäuse zu den
verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und der Kontrolltiere (weiß) wurde durch FACSAnalyse bestimmt.
(Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,001)
CD69 wurde von 8,7 ± 4,2% der CD4+ T-Zellen unbehandelter Tiere exprimiert. Das
Molekül wurde nach CASPI rasch heraufreguliert und war in der ersten Woche nach
Operation auf 16 -17% ± 5 - 6,9% der T-Zellen zu finden (Tag 3: p=0,0224; Tag 1 und
Tag 7: p=0,07). Am 14. Tag kam es erneut zu einer starken Induktion des TZelloberflächenmoleküls: im Mittel 32 ± 24,7% der CD4+ T-Zellen waren positiv für
CD69 (p=0,0705). Am 28. Tag nach CASPI war die Expression rückläufig. Allerdings
zeigen die Tiere, die drei Monate zuvor operiert wurde, eine signifikant erhöhte
Expression von CD69 (22 ± 3,4%) im Vergleich zu den altersentsprechenden
Kontrollen (14,7 ± 4,5%; p=0,019).
102
Ergebnisse
Bei unbehandelten Tieren wurde CD25 von durchschnittlich 8,1 ± 1,4% der CD4+ TZellen der Milz exprimiert, der Anteil CD25+CD4+ T-Zellen stieg einen Tag nach
CASPI auf 14 ± 5,3% und 3 Tage nach der Operation auf 18,7 ± 2,3% (p=0,0003).
Dann sank die Zahl der CD25+CD4+ T-Lymphozyten stark ab, das Protein wurde jedoch
am 14. Tag nach Induktion der Peritonitis erneut induziert, zu diesem Zeitpunkt
exprimierten 17,5 ± 9,7% der CD4+ T-Zellen das Molekül. Dann fiel der Anteil der
CD25+CD4+ T-Zellen wieder ab und blieb unauffällig.
Bei 6,7 ± 3,7% der CD4+ T-Zellen der Milz unbehandelter Tiere konnte ICOS bestimmt
werden. Die Expression des costimulatorisch wirksamen Moleküls nahm durch die
CASPI zu, einen Tag nach der Operation wurden 16,5 ± 5,5% ICOS+CD4+ T-Zellen
(p=0,0107) nachgewiesen werden, dann fiel ihr Anteil wieder leicht ab bis zum Tag 7
nach CASPI. Am 14. Tag nach der Operation konnte eine weitere Induktion des
Proteins detektiert werden: im Mittel 28,3 ± 10% der CD4+ T-Lymphozyten waren
ICOS-positiv (p=0,002). Dann sank der Anteil der ICOS+CD4+ T-Zellen wieder ab und
blieb unauffällig.
Die Messung von CTLA-4 erfolgte sowohl im FACS als auch auf histologischen
Schnitten.
Da
die
Ergebnisse
beider
Untersuchungsmethoden
weitgehend
übereinstimmten, werden hier nur die Daten aus den Immunfluoreszenzfärbungen
gezeigt. Die Bilder sind dem Anhang (Abb. 74) zu entnehmen, die graphische
Auswertung der Daten in Abbildung 40 gezeigt.
In den T-Zellarealen der Milz unbehandelter Tiere war CTLA-4 nur auf durchschnittlich
1,3 ± 1,9% der CD4+ T-Zellen nachweisbar. Die Expression des Moleküls wurde durch
die CASPI induziert und stieg in den ersten Tagen nach der Operation kontinuierlich an:
einen Tag nach CASPI wurde im Mittel von 6,9 ± 7,6% der CD4+ T-Lymphozyten
CTLA-4 exprimiert, am Tag 3 nach CASPI waren es 16,1 ± 1,9% und 7 Tage nach der
Operation waren 17,7 ± 13,2% der CD4+ T-Zellen CTLA-4-positiv. Dann sank die
Expression des Proteins bis einen Monat nach der Operation. Bei den 5 Monate alten
Tieren exprimierten mehr T-Helferzellen CTLA-4 als zu Beginn des Experiments.
Dabei gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen Tieren mit und ohne Peritonitis
(15,3 ± 10,6% nach CASPI; 12,8 ± 13,7% bei unbehandelten Kontrolltieren).
103
Ergebnisse
% CTLA-4+/CD4+
40
*
30
20
***
*
10
0
*
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 40: Expression von CTLA-4 im Langzeitüberleben nach CASPI
Die Expression von CTLA-4 wurde auf Gewebeschnitten der Milz der jeweils 5 Mäuse zu den
verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und der Kontrolltiere (weiß) durch eine
Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. Dabei wurde neben CTLA-4 auch CD4 gefärbt und der prozentuale
Anteil der CTLA-4/CD4-positiven Zellen der Gesamtheit der CD4-T-Zellen mit der Software von
MetaMorph berechnet. Dazu wurden je Milzschnitt 2-3 Aufnahmen angefertigt, die Fläche der
Grünfluoreszenz (FITC-markierte CD4-Zellen) bestimmt zur Fläche der Rotfluoreszenz (TRITC-gefärbte
CTLA-4/CD4-positive Zellen) in Beziehung gesetzt.
(Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; ***p<0,001)
3.8 Expression von Zytokinen im Zeitverlauf nach CASPI
Die Konzentration der Zytokine TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ und MCP-1 im
Serum der jeweils 5 Tiere zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI und der
Kontrolltiere wurde mit einen CBA-Inflammationstest durch FACS-Analyse bestimmt.
Dabei zeigte sich, dass es 2 Gruppen von Mediatoren gab, deren Expressionsprofil sich
deutlich voneinander unterschied: zur ersten Gruppe gehören TNF-α, MCP-1, IL-6 und
IL-10, deren graphische Auswertung der Messergebnisse in Abbildung 41 aufgezeigt
ist.
Die Konzentration von TNF-α, IL-6, MCP-1 und IL-10 im Serum der unbehandelten, 8
bis 10 Wochen alten Kontrolltiere war sehr gering. Einen Tag nach CASPI war sie stark
angestiegen: die Konzentration von TNF-α stieg auf 115,7 ± 91,16 pg/ml (p=0,0203)
und war auch noch 3 Tage (23,2 ± 6,9 pg/ml; p=0,0092) und 7 Tage nach der Operation
(42,14 ± 44,22 pg/ml) erhöht. Dasselbe Expressionsprofil zeigte auch IL-6, ein weiteres
pro-inflammatorisches Zytokin: es wurde durch die Peritonitis induziert (8697 ± 7236
pg/ml; p=0,0158) und nach einem Abfall am Tag 3 (53,1 ± 40,9 pg/ml; p=0,0134) am
Tag 7 erneut verstärkt exprimiert (207 ± 191,1 pg/ml; p=0,0267). MCP-1 wurde
ebenfalls als Folge der CASPI induziert (im Mittel 1135 ± 1038 pg/ml; p=0,0304) und
wurde nach einem Abfall am Tag 7 wieder verstärkt exprimiert (148 ± 59,1 pg/ml;
p=0,0062). 14 Tage nach CASPI jedoch lag die messbare Menge von MCP-1 deutlich
unter dem Grundspiegel (33,74 ± 9,0 pg/ml; unbehandelte Tiere: 58,22 ± 18,1pg/ml;
104
Ergebnisse
p=0,0228). Auch die Konzentrationen von IL-10 war einen Tag nach CASPI stark
erhöht (768 ± 367,4 pg/ml; p=0,0009), zeigte jedoch keine weitere Induktion im
Untersuchungszeitraum. Auch die Konzentrationen von TNF-α, IL-6, MCP-1 blieben
anschließend unauffällig.
TNF-α
MCP-1
300
3500
200
*
1500
100
100
pg/ml
pg/ml
2500
*
500
300
**
200
50
**
100
*
0
Ktrl
3
7
14
28
84
0
84 Ktrl
Ktrl
1
3
7
14
28
Tage nach CASPI
Tage nach CASPI
IL-6
IL-10
84
84 Ktrl
84
84 Ktrl
1450
*
***
950
600
pg/ml
pg/ml
20000
15000
10000
5000
1
450
400
*
400
200
200
0
*
Ktrl
1
3
7
14
28
Tage nach CASPI
84
84 Ktrl
0
Ktrl
1
3
7
14
28
Tage nach CASPI
Abb. 41: Expression der Zytokine TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 im Langzeitüberleben nach
CASPI
Die Expression von TNF-α, IL-6, IL-10 und MCP-1 wurde im Serum der jeweils 5 Mäuse zu den
verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und der Kontrolltiere (weiß) mit einem CBAInflammationstest durch FACS-Analyse bestimmt. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05;
**p<0,005; ***p<0,001)
Zur zweiten Gruppe von Mediatoren gehörten IL-12 und IFN-γ, deren zeitlicher Verlauf
der Expression deutlich von der anderen abweicht (Abb. 42): IFN-γ und IL-12 waren
unmittelbar nach der CASPI nur in sehr geringer Konzentration nachweisbar und
wurden später induziert. Die Konzentration von IL-12 stieg erst ab Tag 7 nach CASPI,
dann aber kontinuierlich bis 28 Tage nach Induktion der Peritonitis. IFN-γ konnte erst
ab dem 7. Tag nach der Operation detektiert werden, allerdings in äußerst geringer
105
Ergebnisse
Konzentration. Drei Monate nach CASPI war auch bei diesen Zytokinen kein
Unterschied zwischen der operierten und der nicht operierten Gruppe zu beobachten.
IL-12
IFN-γ
500
30
400
pg/ml
pg/ml
20
300
200
10
100
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
0
Ktrl
1
Tage nach CASPI
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 42: Expression der Zytokine IFN-γ und IL-12 im Langzeitüberleben nach CASPI
Die Expression von IFN-γ und IL-12 wurde im Serum der jeweils 5 Mäuse zu den verschiedenen
Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und der Kontrolltiere (weiß) mit einem CBA-Inflammationstest durch
FACS-Analyse bestimmt. (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD)
Bei allen Zytokinmessungen traten große Streuungen auf. Dabei bleibt zu beobachten,
dass die Tiere alle untersuchten Mediatoren in gleichem Umfang regulierten: war die
Konzentration von TNF-α stark erhöht, war auch die der anderen Zytokine stark erhöht.
Eine Ursache hierfür ist das unterschiedliche Ausmaß der Erkrankung, welches die
CASPI bei den einzelnen Tieren hervorrief, was zu starken Unterschieden in der
Erholungsphase der Tiere führte. Da sich eine Gruppe nur aus 5 Tieren
zusammensetzte, konnten nur Tendenzen ermittelt werden.
IL-2, IL-4 und IL-5 waren über den gesamten Beobachtungszeitraum nur in sehr
geringen Konzentrationen nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
106
Ergebnisse
3.9 Entwicklung von Keimzentren
Wenn T- und B-Zellen dasselbe Antigen erkennen, bilden sich an der Grenze zwischen
T- und B-Zellarealen sogenannte primäre Foci klonaler Expansion, in denen beide
Zelltypen proliferieren. Einige dieser B- und T-Lymphozyten wandern danach in die
primären Lymphfollikel und bilden ein Keimzentrum. Bei der Keimzentrumsreaktion
kommt es zum Wechsel des Isotyps der von den B-Zellen produzierten Antikörper
sowie zur Affinitätsreifung der Antikörper durch somatische Hypermutation. In
Keimzentren befinden sich ebenfalls follikulär dendritische Zellen, welche den B-Zellen
Antigene präsentieren, und Makrophagen, welche apoptotische B-Zellen abräumen.
Die Ausbildung von Keimzentren nach dem Kontakt mit einem Antigen, z.B. im
Verlauf einer Infektion, ist von entscheidender Bedeutung für die Abwehr der
bestehenden und folgenden Infektionen mit demselben Erreger. Da durch die CASPI
große Mengen verschiedener Antigene exponiert werden, sollte die Formierung von
Keimzentren in der Milz durch eine Immunfluoreszenzfärbung mit PNA und MOMA-1,
einem Antikörper zum Nachweis marginaler Makrophagen bestimmt werden (das
Bildmaterial ist dem Anhang zu entnehmen; Abb. 75).
Bei unbehandelten, 8 bis 10 Wochen alten Mäusen konnten nur wenige Zellen in der
Milz detektiert werden, die mit PNA oder MOMA-1 gefärbt werden konnten. Drei Tage
nach der CASPI waren sowohl die Anzahl PNA-positiver als auch MOMA-1-positiver
Zellen deutlich erhöht, die Formierung von Keimzentren konnte ab Tag 7 nach
Induktion der Peritonitis beobachtet werden. Allerdings waren die Keimzentren
ektopisch und kleiner als solche, die sich beispielsweise nach einer Immunisierung mit
einem Modellantigen wie TNP-KLH typischerweise bilden (Daten nicht gezeigt). Auch
noch 3 Monate nach der CASPI waren Keimzentrumsstrukturen nachweisbar.
3.10 Expression von IgM und IgG im Langzeitverlauf nach CASPI
Die Funktionalität der Keimzentren wurde untersucht, indem die Konzentration von
Gesamt-IgM und -IgG im Serum der Tiere gemessen wurde. Nach dem Kontakt mit
ihrem Antigen differenzieren die B-Zellen nach kurzer Zeit zu Plasmazellen, welche
Antikörpern sezernieren. Diese sind zu Beginn einer Immunantwort immer IgM, durch
den Klassenwechsel im Keimzentrum werden dann jedoch auch Antikörper anderer
Klassen produziert, Antikörper der Klasse IgG sind jedoch überwiegend.
Bei unbehandelten Tieren war die Konzentration von IgM (0,217 ± 0,063 mg/ml) und
IgG (2,2 ± 1,7 mg/ml) im Serum sehr niedrig (Abb. 43), doch schon 3 Tage nach
107
Ergebnisse
CASPI begann die Konzentration von IgM zu steigen (0,688 ± 0,344 mg/ml; p=0,0169),
und bis zum Tag 7 nach Operation konnte eine weitere, starken Zunahme der Menge
von IgM im Serum (1,702 ± 1,256 mg/ml; p=0,0297) festgestellt werden. In den
folgenden Tagen blieb der Spiegel nahezu konstant (Tag 14 nach CASPI: 1,765 ± 1,259
mg/ml; p=0,0268), sank dann aber wieder ab (Tag 28 nach CASPI: 1,059 ± 0,731
mg/ml; p=0,035). Erstaunlicherweise wurde drei Monate nach der Operation die
höchste Konzentration von IgM im Serum detektiert werden (2,841 ± 1,895 mg/ml).
Aber auch die Kontrollen gleichen Alters zeigten einen deutlichen Anstieg von IgM im
Serum (0,921 ± 0,289 mg/ml) im Vergleich zu den drei Monate jüngeren Kontrollen.
Die Konzentration von IgG blieb während der ersten 7 Tage nach CASPI gering und
begann erst 14 Tage nach der Operation zu steigen (17,2 ± 13,22 mg/ml; p=0,0362),
nahm dann aber im untersuchten Zeitrahmen kontinuierlich zu (Tag 28 nach CASPI:
34,62 ± 9,1 mg/ml; p<0,0001). Es ließ sich auch bei den 5 Monate alten Kontrollen ein
Anstieg der Konzentration von IgG im Serum nachweisen (13,09 ± 4,7 mg/ml), dieser
lag aber sehr deutlich unter dem IgG-Spiegel der Tiere, die drei Monate zuvor operiert
wurden (44,18 ± 17,01 mg/ml; p=0,0099).
5
4
*
3
*
2
*
*
1
0
80
B
Serum IgG (mg/ml)
Serum IgM (mg/ml)
A
Ktrl
1
3
7
14
28
Tage nach CASPI
84
84 Ktrl
*
60
***
40
*
20
0
Ktrl
1
3
7
14
28
84
84 Ktrl
Tage nach CASPI
Abb. 43: IgM- und IgG-Spiegel im Serum im Langzeitüberleben nach CASPI
Dargestellt ist die Konzentration von Gesamt-IgM (A; in mg/ml) und Gesamt-IgG (B; in mg/ml) im
Serum von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI (schwarz) und bei den Kontrollen (weiß),
gemessen mit einem ELISA, 4 Verdünnungsstufen je Serum, jede Verdünnungsstufe als Duplikat. (Daten
dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05; ***p<0,001)
108
Ergebnisse
3.11 Auswirkungen der CASPI auf das immunologische Gedächtnis
Mit den im folgenden beschriebenen Experimenten sollten Auswirkungen einer
generalisierten
polymikrobiellen
Infektion
auf
die
primäre
und
sekundäre
Immunantwort charakterisiert und damit ein Beitrag zur Beantwortung folgender Fragen
geleistet werden:
1. Führt eine generalisierte bakterielle Infektion zu einer Immunsuppression, die
eine Immunreaktion auf den Erstkontakt mit einem Antigen beeinträchtigt?
Damit im Zusammenhang steht auch die Frage, ob während einer bakteriellen
Infektion ein schützendes Immungedächtnis ausgebildet werden kann.
2. Wird durch eine generalisierte bakterielle Infektion ein bereits ausgebildetes
Immungedächtnis beeinflusst, z. B. dadurch, dass viele Gedächtniszellen
sterben?
Zur Untersuchung dieser Fragestellungen wurde ein etabliertes, verbreitetes System
genutzt: die Immunisierung mit TNP-KLH. TNP (Trinitrophenyl) ist ein Hapten, ein
organisches Molekül einfacher Struktur (Strukturformel: siehe Abbildung 44), welches
allein keine Antikörper- oder T-Zellantwort hervorruft. Dafür muss es an ein
Trägerprotein wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt sein, welches nach
seiner Prozessierung von Gedächtnis- und T-Effektorzellen bei der Restimulation
erkannt wird.
Abb. 44: Chemische Struktur von TNP-KLH.
TNP-KLH setzt sich zusammen aus TNP (Trinitrophenyl), einer einfachen organischen Verbindung, und
dem Protein KLH (Strukturformel übernommen von Biosearch Technologies).
Der Versuchsaufbau, der zur Analyse einer primären immunologischen Antwort genutzt
wurde, ist in Abbildung 45 schematisch dargestellt. Die Tiere wurden in zunehmendem
zeitlichen Abstand nach der Operation (14 sowie 28 Tage nach CASPI) mit TNP-KLH
immunisiert. Als Kontrollgruppen dienten zum einen unbehandelte Tiere, zum anderen
immunisierte, aber nicht operierte Tiere. 12 Tage nach der Immunisierung wurde der
„Impferfolg“ gemessen, indem die Splenozyten auf ihre Kapazität zur Proliferation nach
109
Ergebnisse
einer Restimulation mit TNP-KLH in vitro untersucht wurden. Daneben wurde die
Konzentration von anti-TNP-spezifischen Antikörpern im Serum bestimmt.
Kontrolle
Kontrolle
CASPI (d=0)
14d
28d
Immunisierung mit TNP-KLH
12d
Untersuchung der immunologischen Primärantwort
Abb. 44: Schematischer Versuchsaufbau zur Untersuchung der immunologischen Primärantwort
nach CASPI
Am Tag 0 unterzogen sich jeweils 5 Tiere/Gruppe der CASP-Operation. 14 bzw. 28 Tage später, als die
Tiere wieder unauffällig waren, wurden sie mit TNP-KLH immunisiert. 12 Tage danach wurden sie
hinsichtlich der Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses untersucht. Daneben gab es zwei
Kontrollgruppe: eine immunisierte, nicht operierte sowie eine unbehandelte, d.h. nicht immunisierte und
nicht operierte Tiere.
Der Versuchsaufbau, welcher der Untersuchung des Einflusses einer bakteriellen Sepsis
auf ein bereits etabliertes Immungedächtnis dienen sollte, ist in Abbildung 45
dargestellt. Hier wurden alle Tiere mit dem Antigen TNP-KLH immunisiert. 10 Tage
später wurde eine Hälfte der Tiere operiert, die andere diente als Kontrolle. 7, 14 sowie
28 Tage später wurde den Tieren, sowohl den operierten als auch den nicht operierten,
erneut TNP-KLH appliziert. 12 Tage nach der zweiten Injektion mit dem Antigen
wurde dann das Immungedächtnis untersucht (immunologische Sekundärantwort),
indem wiederum in vitro Proliferationstests durchgeführt und die Konzentrationen TNPspezifischer Antikörper im Serum ermittelt wurde.
110
Ergebnisse
1. Immunisierung (d= -10)
CASPI Kontrolle
7d
7d
CASPI Kontrolle
14d
14d
CASPI Kontrolle
28d
28d
2. Immunisierung
12d
Untersuchung der immunologischen Sekundärantwort
Abb. 45: Schematischer Versuchsaufbau zur Untersuchung der immunologischen
Sekundärantwort
Alle Tiere wurden mit TNP-KLH immunisiert. Nach 10 Tagen wurde die Hälfte der Tiere operiert, die
Kontrollgruppe hingegen nicht. Nach 7, 14 und 28 Tiere wurde allen Tieren dann erneut TNP-KLH i.p.
gespritzt. Nach weiteren 12 Tagen wurde dann die sekundäre Immunantwort untersucht.
3.11.1 Einfluss einer generalisierten, polymikrobiellen Infektion auf die primäre
Immunantwort
Proliferation muriner Splenozyten nach Restimulation mit TNP-KLH in vitro nach
Primärimmunisierung
Um zu prüfen, ob eine Immunisierung auch nach CASP mit einer normalen
Immunreaktion beantwortet wird oder ob eine immunsuppressorischer Phase eintritt, die
durch eine verminderten Fähigkeit auf antigene Stimulation gekennzeichnet ist, wurde
zum einen die Fähigkeit der Milzzellen zur Proliferation, zum anderen die Bildung
spezifischer Antikörper im Serum untersucht.
In den Proliferationsversuchen, deren Ergebnisse in der Abbildung 46 graphisch
dargestellt sind, wurden neben TNP-KLH auch zwei Substanzen eingesetzt, die als
Kontrollen dienten: TNP-OVA und ConA. TNP-OVA diente als Kontrolle für eine
spezifische Reaktion auf die Immunisierung mit TNP-KLH, da die Mäuse mit dem
Trägerprotein OVA (Ovalbumin) vorher noch nicht in Kontakt kamen, so dass direkt ex
vivo keine proliferative Antwort erwartet wurde. ConcanavalinA (ConA) ist ein T-ZellMitogen, welches eine polyklonale Aktivierung von T-Zellen bewirkt. Es wurde
eingesetzt, um die allgemeine Fähigkeit der Splenozyten zur Proliferation und deren
Beeinflussung durch die CASPI zu untersuchen.
111
Ergebnisse
20000
15000
15000
10000
10
100
0
1000
20000
20000
15000
15000
10000
1
10
100
0
1000
10000
10
100
0
1000
20000
15000
15000
cpm
20000
10000
0
1
2
3
4
5
6
7
Immunisierung
nicht-septisch
20000
10000
1
10
100
0
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
30000
cpm
1
Unbehandelt
30000
5000
0.1
20000
10000
cpm
1
cpm
cpm
0.1
5000
cpm
10000
5000
5000
0
0.01
30000
cpm
20000
0
0.01
ConA
TNP-OVA
cpm
cpm
TNP-KLH
10000
Immunisierung
14d CASPI
20000
10000
0.1
1
10
100
0
1000
20000
20000
15000
15000
cpm
cpm
0
0.01
5000
10000
5000
0
0.01
0
1
10
100
1000
1
10
Konzentration in µg/ml
100
1000
2
3
4
5
6
7
Immunisierung
28d CASPI
20000
10000
0
1
30000
10000
5000
0.1
0
cpm
5000
1
10
100
Konzentration in µg/ml
1000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Konzentration in µg/ml
Milz 1
Milz 2
Milz 3
Milz 4
Milz 5
Abb. 46: Proliferation nach Primärimmunisierung
Die Mäuse wurden 14 bzw. 28 Tage nach CASPI mit TNP-KLH immunisiert und 12 Tage später die
Proliferation der Splenozyten nach Stimulation mit TNP-KLH, TNP-OVA (Negativkontrolle) und ConA
(T-Zell-Mitogen) durch den Einbau von ³H-Thymidin in die DNA der sich teilenden Zellen gemessen.
Als Kontrollen dienten zum einen unbehandelte Tiere, zum anderen mit TNP-KLH immunisierte Tiere.
Milzzellen von Tieren, die weder immunisiert noch operiert wurden, reagierten nicht
auf TNP-KLH. Die mit TNP-KLH immunisierten Tiere zeigten nach Restimulation mit
diesem Hapten-Trägerprotein-Komplex eine deutliche Proliferation, die mit der
Konzentration des zugesetzten TNP-KLH zunahm. Wurden die Tiere 14 Tage nach
CASPI mit TNP-KLH immunisiert, war die proliferative Antwort auf die in vitroRestimulation schwächer als die der immunisierten, nicht operierten Kontrolle, vor
allem bei hohen Konzentrationen von TNP-KLH. Eine weitere Abnahme der Reaktion
auf das immunisierende Antigen konnte bei den Tieren beobachtet werden, die 28 Tage
nach CASPI mit TNP-KLH immunisiert wurden.
112
Ergebnisse
Keine Gruppe zeigte eine Reaktion auf TNP-OVA und die Milzzellen aller Gruppen
proliferierten nach Stimulation mit ConA.
Bildung TNP-spezifischer Antikörper nach Primärimmunisierung
Zum Nachweis der Bildung spezifischer Antikörper wurde ein ELISA eingesetzt. Nach
der Immunisierung mit TNP-KLH werden drei verschiedene Gruppen von Antikörpern
produziert: TNP-spezifische Antikörper, KLH-spezifische Antikörper und Antikörper,
die den Komplex aus TNP-KLH erkennen. Unser Interesse galt den TNP-spezifischen
Antikörpern, welche sowohl freies TNP als auch an jedes andere Trägerprotein
gekoppeltes TNP erkennen. Bestimmt wurden die Konzentrationen von Antikörpern
sowohl der Klasse IgM als auch der Klasse IgG im Serum der Tiere, die Messergebnisse
200
B
150
100
50
200
150
100
*
50
P
I+
TN
P
CA
SP
28
d
CA
SP
I+
TN
TN
P
14
d
un
be
ha
nd
el
t
I+
TN
CA
SP
28
d
CA
SP
I+
TN
TN
P
P
P
0
14
d
un
be
ha
nd
el
t
0
anti-TNP-IgG (µg/ml)
A
anti-TNP-IgM (µg/ml)
der ELISA sind in der Abbildung 47 graphisch dargestellt.
Abb. 47: Bildung TNP-spezifischer IgM- und IgG-Antikörper nach primärer Immunisierung
Gemessen wurde die Konzentration TNP-spezifischer IgM- (A) und IgG-Antikörper (B) im Serum der
Tiere 12 Tage nach Immunisierung mit TNP-KLH. 12 bzw. 28 Tage vor der Immunisierung wurden die
Tiere operiert. Die Kontrolltiere wurden entweder nur immunisiert und nicht operiert oder aber
unbehandelt (Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p<0,05).
Bei den unbehandelten Tieren waren weder TNP-spezifische IgM- noch IgGAntikörper im Serum nachweisbar. Die Immunisierung bewirkte einen Anstieg der
Konzentration der TNP-spezifischen IgM-Antikörper, welcher bei den Tieren mit
zunehmendem zeitlichen Abstand von der Operation noch deutlicher wurde.
TNP-spezifische Antikörper der Klasse IgG konnten nur im Serum jener Tiere
nachgewiesen werden, die 28 Tage nach CASPI immunisiert wurden (p=0,0383 zur
immunisierten Kontrolle).
113
Ergebnisse
3.11.2 Einfluss einer generalisierten, polymikrobiellen Infektion auf die sekundäre
Immunantwort
Proliferation muriner Splenozyten nach Restimulation mit TNP-KLH in vitro nach
Sekundärimmunisierung
Zum Nachweis einer antigenspezifischen Proliferation wurden die isolierten
Splenozyten 12 Tage nach der zweiten Immunisierung mit TNP-KLH in vitro
restimuliert, außerdem wurde ihre Reaktion auf die Zugabe von TNP-OVA und ConA
gemessen. Die daraus resultierenden Proliferationskurven sind in der Abbildung 48
dargestellt.
Bei den 7-Tage-Kontrollen konnte eine konzentrationsabhängige Zunahme der
Proliferation nach Stimulation mit TNP-KLH beobachtet werden. Der Verlauf dieser
Kurve war nicht so, wie nach einer sekundären Immunisierung zu erwarten wäre. Die
Milzzellen der anderen Tiere, besonders jedoch jener, die zu den verschiedenen
Zeitpunkten vor der sekundären Immunisierung operiert wurden, proliferierten schon
bei geringeren Antigenkonzentrationen. Es konnte demnach eine Zunahme der
Sensitivität
auf
die
Restimulation
mit
TNP-KLH
beobachtet
werden,
ein
charakteristisches Merkmal der sekundären Immunantwort.
Bei keiner Gruppe wurde eine Reaktion auf mit TNP-OVA beobachtet und die Tiere
aller Gruppen proliferierten nach Stimulation mit ConA.
114
Ergebnisse
TNP-KLH
20000
15000
15000
10000
1
10
100
1000
20000
20000
15000
15000
10000
1
10
100
0
1000
0.1
1
10
100
10000
0
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
30000
septisch
2. Immunisierung
7 Tage nach CASPI,
d.h. 17 Tage nach der
primären Immunisierung
20000
10000
5000
5000
nicht-septische Kontrolle
für Tag 7;
Reimmunisierung 17 Tage
nach der primären
Immunisierung
20000
10000
cpm
0
0.1
cpm
cpm
10000
5000
5000
0
0.01
30000
cpm
20000
0
0.01
ConA
TNP-OVA
cpm
cpm
a)
1
10
100
0
1000
0
1
Konzentration (µg/ml)
Konzentration (µg/ml)
2
3
4
5
6
7
Konzentration (µg/ml)
20000
15000
15000
10000
1
10
100
1000
20000
20000
15000
15000
10000
5000
0
0.01
1
10
100
0
1000
1
10
100
10000
0
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
30000
septisch
2. Immunisierung
14 Tage nach CASPI,
d.h. 24 Tage nach der
primären Immunisierung
20000
10000
5000
0.1
nicht-septische Kontrolle für
Tag 14;
Reimmunisierung 24 Tage
nach der primären
Immunisierung
20000
10000
cpm
0
0.1
cpm
cpm
10000
5000
5000
0
0.01
30000
cpm
20000
cpm
cpm
b)
1
Konzentration (µg/ml)
10
100
0
1000
0
1
Konzentration (µg/ml)
2
3
4
5
6
7
Konzentration (µg/ml)
20000
15000
15000
10000
5000
10000
1
10
100
0
1000
20000
20000
15000
15000
10000
10
100
1
10
100
Konzentration (µg/ml)
1000
0
1
2
3
4
5
6
7
30000
septisch
2. Immunisierung
28 Tage nach CASPI,
d.h. 38 Tage nach der
primären Immunisierung
20000
10000
0
0.1
0
1000
10000
5000
5000
0
0.01
1
cpm
0.1
nicht-septische Kontrolle
für Tag 28
Reimmunisierung 38 Tage
nach der primären
Immunisierung
20000
10000
5000
cpm
cpm
0
0.01
30000
cpm
20000
cpm
cpm
c)
1
10
100
Konzentration (µg/ml)
1000
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Konzentration (µg/ml)
Milz 1
Milz 2
Milz 3
Milz 4
Milz 5
Abb. 48: Proliferation nach zweimaliger Applikation von TNP-KLH
Alle Tiere wurden mit TNP-KLH immunisiert, 10 Tage später wurde dann bei der einen Hälfte die
CASPI-Operation durchgeführt, die anderen Tiere bildeten als Kontrolle den normalen Verlauf der
Immunantwort ab. Allen Mäusen wurde 7, 14 bzw. 28 Tage später erneut TNP-KLH appliziert. 12 Tage
später wurde die Proliferation der Splenozyten nach Stimulation mit TNP-KLH, TNP-OVA
(Negativkontrolle) und ConA (T-Zell-Mitogen) durch Thymidineinbau gemessen.
115
Ergebnisse
Bildung TNP-spezifischer Antikörper nach Sekundärimmunisierung
Die Quantifizierung TNP-spezifischer IgM- und IgG-Antikörper im Serum nach einer
zweiten Immunisierung erfolgte ebenfalls mit einem ELISA, die Ergebnisse sind in der
Abbildung 49 schematisch dargestellt.
300
anti-TNP-IgG (µg/ml)
100
100
CA
SP
I
TN
P
TN
P+
28
d
28
d
TN
P+
CA
SP
I
TN
P
14
d
14
d
A
SP
I
TN
P
TN
P+
C
7d
A
SP
I
TN
P
TN
P+
C
28
d
28
d
A
SP
I
TN
P
TN
P+
C
14
d
14
d
TN
P+
C
7d
7d
A
SP
I
0
TN
P
0
200
7d
anti-TNP-IgM (µg/ml)
200
Abb. 49: Bildung TNP-spezifischer IgM- und IgG-Antikörper nach sekundärer Immunisierung
10 Tage nach der ersten Applikation von TNP-KLH wurden die Tiere operiert oder wurden nicht operiert
und dienten als Kontrollen. Gemessen wurde die Konzentration TNP-spezifischer IgM- und IgGAntikörper im Serum der Mäuse 12 Tage nach sekundärer Immunisierung mit TNP-KLH (Daten
dargestellt als Mittelwerte ± SD).
Im Vergleich zur Primärantwort wurden nach der zweiten Immunisierung mit dem
Modellantigen TNP-KLH etwa drei- bis vierfach höhere Serumkonzentrationen Haptenspezifischer IgM-Antikörper ermittelt. Während bei der primären Immunantwort noch
kein TNP-spezifisches IgG messbar war, lag dessen Konzentration bei der sekundären
Immunantwort bei etwa 100 µg/ml. Eine interkurrente bakterielle Infektion (CASP)
beeinflusste weder die sekundäre IgM- noch die IgG-Antwort signifikant.
116
Diskussion
4. Diskussion
Sepsis ist nach wie vor eine schwer zu kontrollierende Erkrankung. Durch
Dysregulationen im Zusammenspiel verschiedener Zelltypen, von Komplement- und
Gerinnungssystem wird aus einer Infektion eine systemische, häufig tödlich endende
Erkrankung. Viele Forschergruppen haben sich in den letzten Jahrzehnten intensiv mit
Ursachen, Folgen und möglichen Interventionen zur Verhinderung oder Abschwächung
einer Sepsis beschäftigt. In eigenen vorangegangenen Arbeiten war gezeigt worden,
dass es innerhalb von wenigen Stunden nach experimenteller Induktion einer Peritonitis
im Mausmodell (CASP) zu einer erhöhten Expression von CTLA-4 auf CD4+ T-Zellen
kommt. Deshalb sollte der Schwerpunkt in dieser Arbeit auf die Rolle der T-Zellen
während der Sepsis gelegt werden. Hierzu wurden zwei Interventionen im Vorfeld der
CASP genauer untersucht: die Depletion der CD4+ T-Zellen einerseits, die Blockade
von CTLA-4 andererseits. Durch die beiden Eingriffe wurde das T-Zellkompartiment
auf unterschiedliche Weise beeinflusst und der Ausgang der peritonealen Sepsis war
ebenfalls verschieden: die Depletion der CD4+ T-Zellen verbesserte das Überleben der
Tiere deutlich, während die Blockade von CTLA-4 die Mortalität erhöhte. Die von uns
dargelegten Ergebnisse werfen ein neues Licht auf die Rolle der T-Zellen, insbesondere
in der akuten Phase der Erkrankung.
Interventionen vor CASP und ihre Bedeutung für den Krankheitsverlauf
Ausgangspunkt für die Interventionsstudien war die Beobachtung, dass es durch die
CASP sehr rasch, bereits sechs Stunden nach der Operation, zu einer starken Zunahme
CTLA-4-positiver Zellen in der Milz kam. Besonders die CD4+ T-Zellen reagierten mit
einer erhöhten Expression des Proteins auf die Peritonitis. Die höchste Anzahl von
CTLA-4+CD4+ Zellen wurde in der Milz 12 Stunden nach CASP detektiert, danach fiel
die Expression allmählich wieder ab, blieb aber auch weiterhin deutlich über dem
Grundniveau.
Im Vergleich zu anderen costimulatorischen T-Zellmolekülen wie z. B. CD28 oder
ICOS ist die Expressionsdichte von CTLA-4 sehr gering. Obwohl CTLA-4 auch von
ruhenden T-Zellen in geringer Menge exprimiert wird, unterliegt es dort einer
ausgeprägten Rezirkulation, so dass es kaum auf der Zelloberfläche und stattdessen eher
in intrazellulären Kompartimenten nachweisbar ist. Die Expression von CTLA-4 auf der
Oberfläche der Zelle ist aktivierungsinduziert und erreicht ihre höchste Dichte 48 bis 72
117
Diskussion
Stunden nach Beginn der Stimulation [120], aber auch dann ist ein Großteil des Proteins
weiterhin intrazellulär lokalisiert. Dies erschwert die Quantifikation des Moleküls. Das
von uns aufgebaute System zum Nachweis von CTLA-4 basiert auf einer
Signalamplifikation durch ein Tyramidsystem und ermöglichte uns die Färbung des
Gesamtproteins sowohl auf Gewebeschnitten als auch im FACS. Die Methode erlaubt
allerdings keine Unterscheidung zwischen intrazellulärem und membranassoziiertem
CTLA-4.
Die von uns bei der abdominellen Sepsis beobachtete starke Expression von CTLA-4
bereits 6 Stunden nach CASP war aufgrund der in der Literatur beschriebenen Befunde
sehr überraschend. Es wurde zwar von verschiedenen Autoren berichtet, dass es nach
experimentell induzierten Infektionen z.B. mit Trypanosoma cruzi [121, 122] oder
Plasmodium berghei [123], einem Erreger der murinen Malaria, zu einer verstärkten
Expression von CTLA-4 auf Milzzellen kommt, die teilweise mit der Schwere der
Infektion korrelierte, dies war jedoch erst mehrere Tage nach der Infektion der Fall.
Bei den CTLA-4-positiven Zellen bei CASP könnte es sich um aktivierte TLymphozyten handeln, die das Protein sehr rasch induzieren, oder/und um
regulatorische T-Zellen (Treg), welche CTLA-4 konstitutiv exprimieren und darüber
hinaus induzieren können. Dafür spricht, dass wir beobachteten, dass sowohl auf
Foxp3+ als auch bei Foxp3- T-Zellen die Expressionsdichte von CTLA-4 deutlich stieg
(eigene Beobachtungen und persönliche Mitteilung von Ch. Pötschke).
Da der prozentuale Anteil der CTLA-4+CD4+ T-Zellen deutlich unter dem der
CD69+CD4+ T-Zellen lag, ist es wahrscheinlich, dass es sich zumindest bei einem Teil
der CTLA-4+ T-Zellen um aktivierte T-Effektorzellen handelt. Es könnte sich hierbei
also um eine frühe, verstärkte Expression beider Aktivierungsmarker handeln. In der
Arbeitsgruppe von
David C. Wraith wurden in einem Modell zur Induktion von
Toleranz gegenüber experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) ähnliche
Beobachtungen gemacht ([124] und persönliche Mitteilung). Aber nicht nur in der Milz
konnte nach CASP ein Anstieg der Frequenz CTLA-4+ T-Zellen beobachtet werden:
auch in weiteren peripheren lymphatischen Organen wie den mesenterialen
Lymphknoten (Daten nicht gezeigt) kam zu einer raschen Induktion der Expression von
CTLA-4, wie dies auch nach Infektion mit dem Nematoden Trichinella spiralis
berichtet wurde [125]. Auch konnte nach CASP eine Infiltration CTLA-4+ T-Zellen in
die Leber beobachtet werden, was nach Infektion mit Plasmodium berghei gezeigt
wurde [126].
118
Diskussion
Bei der CASP kommt es zum Austritt von Bakterien des Colon ascendens in das
Peritoneum und somit zur Exposition mit Endotoxin, einem Bestandteil der Zellwand
Gram-negativer Bakterien, welches als starker Induktor pro-inflammatorischer Zytokine
gilt [127]. LPS konnte schon 2 Stunden nach CASP im Blut operierter Tiere
nachgewiesen werden, stieg kontinuierlich an und blieb bis zum Tod der Tiere erhöht
[128]. Es ist unklar, wie dieses LPS auf die T-Lymphozyten wirkt. Mehrere Autoren
berichteten, dass Treg TLR-4, TLR-5, TLR-7 und TLR-8 [129] sowie TLR-2
exprimieren [130] und TLR-2, TLR-3 und TLR-9 auch von T-Effektorzellen gebildet
wird [131]. Diese Moleküle werden für die Erkennung bakterieller Bestandteile,
darunter LPS, benötigt. Dennoch wurde früher mehrfach gezeigt, dass T-Lymphozyten
nicht direkt auf Endotoxin reagieren können [132, 133]. Caramalho et al. [129]
hingegen berichteten, dass Treg, vermittelt durch TLR4, nach Stimulation mit LPS
aktiviert werden können. Eine Induktion von CTLA-4 beobachteten sie jedoch nicht.
Dennoch könnte eine Aktivierung der Treg möglicherweise eine verstärkte Expression
von CTLA-4 auf diesen Zellen bewirken [134, 135]. Demnach könnten Treg nach
CASP durch LPS direkt aktiviert werden und daraufhin CTLA-4 induzieren. Somit
könnten sie einen Beitrag zum Anstieg der Frequenz CTLA-4+CD4+ T-Zellen leisten.
Diese Vermutung wird durch die Beobachtung von Jones-Carson et al. [136] unterstützt,
die zeigten, dass die Depletion von αβ-T-Zellen die Sensitivität für LPS stark erhöht
und mit einer verstärkten Ausschüttung von TNF-α, IFN-γ und IL-10 assoziiert ist. Sie
schrieben Treg eine protektive Funktion gegen die pro-inflammatorische Kaskade zu,
die während einer Endotoxinämie abläuft und berichteten, dass bereits 3 Stunden nach
der Gabe einer letalen Dosis LPS CTLA-4 verstärkt nachgewiesen werden konnte. Dies
ist vergleichbar mit der nach CASP beobachteten Kinetik der Induktion der Expression
des Moleküls. Auch nach CLP, einem anderen Peritonitismodell, kam es innerhalb von
4 Stunden nach der Operation zu einem Anstieg der Konzentration von Endotoxin im
Blut und 24 Stunden nach CLP wurde eine verstärkte Expression von CD40L, CD28
und CTLA-4 beobachtet. Es wäre also denkbar, dass Treg durch die Exposition von
LPS aktiviert werden oder auf Signale, die mit einer Zerstörung von Gewebe
einhergehen, reagieren [137] und daraufhin Funktionen von Zellen des angeborenen
Immunsystems wie Makrophagen [138], Neutrophilen [139] und NK-Zellen
supprimieren [140, 141]. Als Folge bilden diese Zellen weniger Zytokine [142] und
exprimieren vermindert MHC-Klasse II-Moleküle, CD40, CD80 und CD86. Dadurch ist
ihre Fähigkeit zur Costimulation von T-Zellen limitiert, so dass die Wirtsabwehr
119
Diskussion
insgesamt geschwächt wird. Auf diese Weise beeinflussen die Treg Immunantworten
vom Beginn (durch ihre Effekte auf die Zellen des angeborenen Immunsystems) bis zur
Effektorphase des adaptiven Immunsystems, indem sie die Rekrutierung und
Aktivierung von T-Effektorzellen verhindern. Treg könnten so eine effiziente
Immunantwort negativ beeinflussen.
Treg spielen eine wichtige physiologische Rolle bei der Aufrechterhaltung der
Homöostase im Darm, wo sie in der Mukosa zahlreich vorhanden sind [143].
Untersuchungen mit murinen Modellen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen
(IBD) haben gezeigt, dass kommensale Darmbakterien T-Effektorzellen aktivieren und
schwere Entzündungsreaktionen hervorrufen können. Treg unterdrücken diese
Immunantworten durch die Zytokine IL-10 und TGF-β sowie möglicherweise auch
durch CTLA-4. Dadurch können sie Gewebeschäden durch inflammatorische
Immunreaktionen minimieren.
Treg könnten aber auch auf eine andere Weise einen Beitrag zur Erhöhung der CTLA4+CD4+ T-Zellen, die nach der CASP beobachtet wurde, leisten: Bei Patienten mit
septischem Schock wurde im peripheren Blut eine relative Zunahme der natürlichen
Treg und ein erhöhter Anteil CTLA-4+ Zellen gefunden. Diese Verschiebung der TZellsubpopulationen wurde deutlich länger bei jenen Patienten beobachtet, die später
verstarben [134]. Die Vermehrung von Treg bei Sepsis weniger auf Proliferation als auf
selektive Depletion von CD4+CD25- T-Zellen zurückzuführen ist [144], denn Treg sind
relativ Apoptose-resistent, während T-Effektorzellen bei der Sepsis in großer Zahl
apoptotisch werden [145, 146]. Neben der Induktion der Expression von CTLA-4
könnte somit auch die prozentuale Zunahme der Treg zu der erhöhten Frequenz CTLA4+CD4+ T-Zellen nach CASPI beitragen.
Im CLP-Modell wurde den Treg eine protektive Rolle zugeschrieben, da der adoptive
Transfer in vitro-stimulierter Treg die Rekrutierung von Mastzellen ins Peritoneum
erhöhte, die bakterielle Last verminderte und zu einem verbesserten Überleben der Tiere
führte [147]. Im CASP-Modell hingegen hatte die Depletion der Treg durch den antiCD25-Antikörper PC61.5 keinen Effekt auf das Überleben der Tiere.
Neben TLR-4 können auch andere TLR nach Bindung ihrer Liganden auf T-Zellen
aktivierend wirken: TLR-2 bewirkt eine Expansion der Effektorzellen und der Treg, die
vorübergehend ihre suppressiven Eigenschaften verlieren. Ebenso konnte gezeigt
werden, dass TLR-3 und TLR-9, die von aktivierten CD4+ T-Zellen exprimiert werden
[148], direkten Einfluss auf deren Überleben haben. Dies deutet darauf hin, dass es
120
Diskussion
während einer bakteriellen Infektion zu einer T-Zellrezeptor-unabhängigen Aktivierung
der Treg durch Stimulation der TLR kommen könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit
liefern einen weiteren Hinweis darauf: Tacrolimus (FK506) beeinflusste die suppressive
Wirkung der CD4+ T-Zellen nicht. Tacrolimus ist ein immunsuppressives Medikament,
welches den TCR-vermittelten Signalweg blockiert, indem es im Zytoplasma das
FK506-bindende Protein bindet. Der Komplex aus Tacrolimus und FK506-bindendem
Protein bindet Calcineurin. Dadurch wird die Aktivierung von Calcineurin unterbunden
und so die Aktivierung von NFAT verhindert. Superantigene wie SEB imitieren einen
antigenen Stimulus, indem sie TCR bestimmter Vβ-Familien mit MHC-Klasse IIMolekülen vernetzen. Ihre Wirkung ist dementsprechend abhängig von einer TCRvermittelten Signalgebung und wird durch den Einsatz von Tacrolimus unterbunden.
Dies konnten wir durch Induktion eines SEB-Schocks demonstrieren, vor dem
Tacrolimus schützte. Tacrolimus zeigte aber keine Wirkung auf das Überleben nach
CASP, so dass vermutlich zumindest ein Teil der Aktivierung T-Zellrezeptorunabhängig verläuft.
Depletion der CD4+ T-Zellen
Zur Depletion der CD4+ T-Zellen wurde den Mäusen der monoklonale Antikörper
GK1.5 i.p. appliziert. Danach waren sowohl in der Milz als auch im Blut praktisch
keine CD4+ T-Zellen mehr nachweisbar. Eine Überlebenskinetik nach CASP zeigte,
dass die Depletion der CD4+ T-Zellen den Ausgang der Erkrankung deutlich
verbesserte. Wir beobachteten 20 Stunden nach der CASP große Mengen infiltrierter
Bakterien in der Peritoneallavage, im Blut, in Milz, Leber, Niere und Lunge. In allen
getesteten Kompartimenten waren nach der Depletion der CD4+ T-Zellen signifikant
weniger Mikroorganismen zu detektieren als bei den Kontrolltieren. Wir konnten
weiterhin beobachten, dass es nach Depletion der CD4+ T-Zellen bei CASP zu einer
verstärkten Einwanderung von Makrophagen und Granulozyten in das Peritoneum kam.
Dies lässt vermuten, dass diese eingewanderten Phagozyten in der Folge die Bakterien
bereits am primären Ort der Infektion weitgehend beseitigten konnten. Es gelangten
folglich weniger Bakterien über das Blut in die verschiedenen Organe und die Infektion
verlief milder. Auch Feterowski et al. [149] beobachteten nach der experimentellen
Induktion einer LPS-Toleranz durch intraperitoneale Injektionen geringer Mengen von
LPS vor der CASP eine verstärkte Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten in das
Peritoneum, verbunden mit einer Verminderung der Bakterienlast in Lunge, Leber und
121
Diskussion
Milz. Dies führte dazu, dass mehr Tiere die Peritonitis überlebten. Umgekehrt wurde
durch eine Blockade von CCR2 [150] die Rekrutierung von Makrophagen und
Neutrophilen ins Peritoneum nach CASP vermindert, was zu einer Erhöhung der
bakteriellen Last führte. Folglich erscheint die vermehrte Rekrutierung von Phagozyten
in den Bauchraum ein entscheidender Faktor bei der Bekämpfung der systemischen
bakteriellen
Dissemination
während
einer
Peritonitis
zu
sein.
Dies
erklärt
wahrscheinlich das verbesserte Überleben der Mäuse nach Depletion der CD4+ TZellen.
Eine protektive Wirkung durch Depletion der CD4+ T-Zellen wurde bereits in anderen
Infektionsmodellen beschrieben: So wurde nach der Infektion mit Leishmania
amazonensis beobachtet, dass bei den Tieren, deren CD4+ T-Zellen vor der Infektion
depletiert wurden, die Last der Parasiten etwa zehnfach geringer war und mit einer
niedrigeren Mortalität assoziiert war [151].
Die Depletion der CD4+ T-Zellen bewirkte eine Zunahme der Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine im Peritoneum, im Blut waren diese jedoch geringer. Dies
deutet darauf hin, dass die Depletion der CD4+ T-Zellen im Peritoneum zu einer
effizienteren Abwehr der Bakterien durch das angeborene Immunsystem führte, was
sich in einer verstärkten lokalen Entzündung zeigte. Es zeigte sich, dass besonders
TNF-α 12 Stunden nach der CASP im Peritoneum in deutlich höherer Konzentration
nach der Depletion der CD4+ T-Zellen nachweisbar war. TNF-α stimuliert lokale
Entzündungsreaktionen, bewirkt einen vermehrten Einstrom von Immunzellen in das
Peritoneum, die wiederum weitere pro-inflammatorische Zytokine ausschütten und sich
mit verschiedenen Mechanismen an der Abwehr der Bakterien beteiligen. Damit scheint
12 Stunden nach der Operation ein entscheidender Zeitpunkt zu sein: die Kontrolltiere
erkrankten zu diesem Zeitpunkt schwer, während die Tiere nach Depletion der CD4+ TZellen deutlich geringere Zeichen der Erkrankung zeigten. Eine Ursache hierfür ist die
verminderte systemische Ausbreitung der Bakterien, so dass die systemische Reaktion
des Immunsystems abgeschwächt verlief. Auch Feterowski et al. [149] und Weighardt
et al. [152] zeigten in den Modellen, die mit einem verbesserten Überleben einhergehen,
eine verminderte Expression von TNF-α nach CASP im Serum.
Weiterhin konnten wir zeigen, dass nach der Depletion der CD4+ T-Zellen in der
Lavage der septischen Tiere eine erhöhte, im Serum hingegen verminderte Menge von
IL-10 zu finden war. Dies entspricht dem Expressionsmuster der pro-inflammatorischen
122
Diskussion
Zytokine. Emmanuilidis et al. [153] zeigten, dass IL-10 von entscheidender Bedeutung
für das Überleben der CASP-induzierten Peritonitis ist, denn Makrophagen-depletierte
Tiere hatten einen Überlebensnachteil. Außerdem identifizierten sie die Kupfferzellen
der Leber als Hauptquelle des systemischen IL-10. Entscheidend dabei ist, dass keine
Änderungen von TNF-α, IL-1 oder IL-18 zu finden waren und somit die protektive
Funktion von IL-10 in diesem Fall nicht mit seinem dämpfenden Einfluss auf die
Sekretion inflammatorischer Zytokine erklärt werden kann.
Zusammenfassend
lässt
sich
sagen,
dass
eine
verminderte
systemische
Zytokinausschüttung mit einem verbesserten Überleben der polymikrobiellen Sepsis
nach CASP-Operation assoziiert ist. Dies kann auf verschiedene Weise, u.a. durch
Depletion der CD4+ T-Zellen, erreicht werden.
12 Stunden nach der CASP-Operation ließ sich die Induktion von Apoptose in
lymphatischen Geweben beobachten. Besonders betroffen war der kortikale Thymus.
Dort wurde massiver Zelltod beobachtet, unabhängig von der Vorbehandlung. In der
Milz hingegen war die Frequenz der Apoptose nach CASP bei den Tieren nach der
Depletion der CD4+ T-Zellen deutlich geringer. Es wurde mehrfach gezeigt, dass es bei
Sepsis vor allem zu einem massiven Verlust von B-Zellen und CD4+ T-Zellen durch
Apoptose kommt [154, 155]. Da die CD4+ T-Zellen der Milz schon vor der CASP
depletiert wurden, konnte diese nach Induktion der Peritonitis nicht mehr apoptotisch
werden, deshalb war die Apoptoserate in der Milz nach CASP deutlich geringer.
Die Induktion von Apoptose könnte mehrere verschiedene Gründe haben: Nach der
CASP kommt es zur systemischen Ausschüttung von TNF-α, vor allem durch
Makrophagen und T-Zellen. Neben seiner Funktion als pro-inflammatorisches Zytokin
ist es auch in die zelluläre Apoptose involviert und wird deshalb auch als
„Todeszytokin“ bezeichnet. TNF-α induziert Zelltod u.a. in Thymozyten bei Sepsis
[156]. Auch über den Fas-FasL-Signalweg könnte Apoptose nach CASP induziert
werden. So zeigten Giordano et al. [157], dass die Expression von Fas (CD95) durch
pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1 induziert und verstärkt werden kann und die
Expression des Liganden von Fas, FasL, im Verlauf einer Peritonitis verstärkt wird
[158]. Die Aktivierung von T-Zellen führt zu einer Coexpression von Fas und FasL,
wobei die Expression von FasL durch hohe Konzentrationen von IL-2 verstärkt wird
[159-161]. Somit fördert IL-2 die Sensitivität aktivierter T-Zellen für die Fas-vermittelte
Apoptose. Die Induktion von IL-2 konnte auch nach CASP beobachtet werden.
123
Diskussion
Durch die CASP kommt es zum Austritt verschiedener Arten von Bakterien und damit
zur Exposition von LPS. LPS induziert Apoptose in murinen Makrophagen [162], im
murinen Thymus [163] sowie in Milz und Knochenmark [164]. Außerdem konnte
gezeigt werden, dass LPS nicht nur zur Aktivierung, sondern auch zur Apoptose von
murinen T-Zellen führt [165]. Apoptose könnte daneben auf einem LPS- und TNF-αunabhängigen Weg induziert werden wie dies für das CLP-Modell gezeigt wurde [166].
Weiterhin ist bekannt, dass es im Verlauf einer Sepsis zu einer starken Ausschüttung
von Glukocorticoiden kommt, die Apoptose in Lymphozyten auslösen [167, 168]. Wir
konnten zeigen, dass auch als Reaktion auf die CASP eine massive Freisetzung von
Glukocorticoiden erfolgt (Abb. 50), die ebenfalls zu der beobachteten Apoptose
Corticosterone (ng/ml)
beitragen könnten.
400
***
300
200
100
0
unbehandelt
20h CASP
Abb. 50: Konzentration von Corticosteronen im Serum unbehandelter Mäuse und Tieren 20 Stunden
nach CASP (*** p<0,0001; Daten entstanden in Kooperation mit Cornelia Kiank, AG Prof. Dr. Schütt).
Daneben könnte IDO einen Beitrag zur Induktion des programmierten Zelltodes leisten.
IDO (Indolamin-2,3-Dioxygenase) wurde nach CASP stark induziert und es ist bekannt,
dass Metabolite von Tryptophan selektiv Apoptose in murinen Thymozyten und Th1Zellen, aber nicht in Th2-Zellen induzieren [169]. Außerdem führt Tryptophanmangel
aktivierte T-Zellen in den Zelltod, wobei sie dennoch CD25 und CD69 in den ersten 12
Stunden exprimieren [170]. Dies wäre eine Erklärung dafür, dass nach der CASP trotz
der Induktion von Apoptose in der Milz eine erhöhte Frequenz CD69+ T-Zellen und, in
geringem Umfang, auch CD25+ CD4+ T-Zellen beobachtet wurde.
Apoptose begleitet auch die humane Sepsis. Hotchkiss et al. [154] wiesen Apoptose in
intestinalen Epithelzellen und Lymphozyten bei Patienten mit Schock und Trauma
sowie Sepsis, septischem Schock und multiplem Organversagen [171] nach.
124
Diskussion
Blockade von CTLA-4
Die Blockade von CTLA-4 durch den Antikörper 4F10 erhöhte die Mortalität als Folge
der CASP-Operation deutlich. Die Tiere, denen der Antikörper appliziert wurde,
erkrankten auch deutlich früher und schwerer als die Kontrolltiere. Eine mögliche
Ursache wäre der Verlust des Mechanismus, der zur Inhibition aktivierter T-Zellen
führt, denn dieser Prozess wird vor allem durch CTLA-4 reguliert. Es kommt zu einer
Enthemmung der T-Zellen, die daraufhin große Mengen pro-inflammatorischer
Mediatoren produzieren und auch durch weitere Effektorfunktionen die systemische
Entzündungsreaktion weiter vorantreiben könnten. Wie Treg durch die Blockade von
CTLA-4 beeinflusst werden, wird kontrovers diskutiert: obwohl die Blockade von
CTLA-4 zu einem Verlust ihrer suppressiven Funktion führte [172], zeigten CTLA-4defiziente Tiere eine normale Entwicklung ihrer Treg und auch ihre suppressive
Funktion war nicht eingeschränkt [173, 174].
12 Stunden nach CASP wurden sowohl CD25 als auch CD69 verstärkt exprimiert,
unabhängig von einer vorangegangenen Behandlung mit dem anti-CTLA-4-Antikörper,
was dafür spricht, dass diese Moleküle nicht durch CTLA-4 reguliert werden.
Die Expression von ICOS auf T-Zellen war nach CASP durch die CTLA-4-Blockade
dramatisch erhöht. ICOS wird wie CTLA-4 von T-Zellen erst nach Stimulation
exprimiert [175], und hat eine wichtige Funktion bei T- Effektor- und Gedächtniszellen.
Die Regulation der Expression des Liganden von ICOS, ICOS-L (CD275), durch
professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) erfolgt anders als die der B7Moleküle,
so
dass
spezifische
Antworten
von
entweder
naiven
oder
T-
Effektor/Gedächtniszellen ermöglicht werden [176-178]. ICOS-L kann durch TNF-α
und LPS auch in nicht-lymphatischen Geweben induziert werden [176], weshalb sie
periphere T-Effektor/Gedächtniszellen im Gewebe, aber nicht naive T-Zellen
stimulieren können. Erstere könnten dann rasch auf eine Entzündung, wie die durch die
CASP induzierte Peritonitis, reagieren.
CTLA-4 kann sowohl die CD28-induzierte Costimulation [179] als auch die ICOSICOSL-vermittelte Costimulation hemmen. Dies erfolgt durch zwei Mechanismen: zum
einen interferriert der durch Ligation von CTLA-4 initiierte Signalweg mit Signalen,
welche die Expression von ICOS auf der Zelloberfläche induzieren, zum anderen wird
die ICOS-vermittelte Induktion von Zytokinen gehemmt [180]. Durch die Blockade von
CTLA-4 werden diese Rückkopplungsmechanismen unwirksam, was dazu beitragen
125
Diskussion
könnte, dass signifikant mehr ICOS (CD278) exprimiert wird. Ähnlich wie nach der
Blockade von CTLA-4 und CASP konnte auch bei CTLA-4-defizienten Tieren eine 5bis 6-fach erhöhte Expression von ICOS beobachtet werden [181].
12 Stunden nach CASP waren die Konzentrationen von TNF-α, MCP-1 und IL-6
unabhängig von der Vorbehandlung in vergleichbarem Umfang angestiegen. Dies
deutet darauf hin, dass CTLA-4 zumindest zu diesem Zeitpunkt kaum Einfluss auf die
Freisetzung dieser pro-inflammatorischen Mediatoren hat.
In der Peritoneallavage konnte nach der Behandlung mit dem 4F10-Antikörper kein IL10 gemessen werden. Auch 12 Stunden nach CASP war die Konzentrationen von IL-10
sowohl im Serum als auch in der Lavage des Peritoneums nach Blockade von CTLA-4
signifikant vermindert. Emmanuilidis et al. [153] zeigten, dass IL-10 essentiell für das
Überleben nach CASP ist, denn die Depletion von Kupffer-Zellen vor CASP bewirkte
ebenfalls einen Überlebensnachteil, der mit einer starken Verminderung der IL-10Konzentration im Serum einherging. Supplementierung dieser Tiere mit exogenem IL10 konnte die Tiere retten. Die Verminderung der Sekretion von IL-10 könnte also
erklären, warum die CTLA-4-Blockade die Letalität der Tiere nach CASP erhöhte und
beschleunigte. Die Daten von Emmanuilidis schreiben allerdings den Kupfferzellen der
Leber die Funktion als Hauptproduzenten systemischen IL-10 zu. Es stellt sich die
Frage, wie die Blockade des T-Zell-Moleküls CTLA-4 einen so dramatischen Einfluss
auf die Bildung von IL-10 haben kann und warum eine Abnahme der IL-10-Produktion
durch T-Zellen nicht durch die Kupfferzellen der Leber kompensiert werden kann. Es
wäre möglich, dass die T-Zellen die Bildung von IL-10 durch die Kupfferzellen der
Leber fördern und dass dies durch Blockade von CTLA-4 unterbunden wird.
Anders als in dieser Arbeit fanden verschiedene Autoren nach Blockade von CTLA-4
eine gesteigerte Expression von IL-10: Nach Riley et al. [180] blockiert die Ligation
von CTLA-4 die ICOS-vermittelte Induktion von IL-10. Lohning et al. [182] zeigten,
dass eine hohe Expressionsdichte von ICOS mit der Sekretion von IL-10 assoziiert war.
Aber CTLA-4 könnte die Freisetzung von IL-10 auch auf andere Weise beeinflussen:
CTLA-4 wird deutlich stärker in Th2- als in Th1-Zellen exprimiert [183], sodass Th2Zellen durch eine CTLA-4-Blockade besonders stark betroffen sind. Außerdem gelten
sie als wichtige Produzenten von IL-10. Auch sind bestimmte Arten von Treg eine
Quelle von IL-10 und diejenigen, die CTLA-4 exprimieren, sind ebenfalls durch die
Applikation des blockierenden Antikörpers in ihrer Funktion gestört. Jovasevic et al.
126
Diskussion
[184] zeigten in einem Modell zur Immunität gegen Tumoren, dass die Blockade von
CTLA-4 zur Inhibition der Sekretion von IL-10 durch Treg führt.
Langzeitkonsequenzen der Peritonitis
Wir haben gezeigt, dass die Peritonitis, die durch die CASP ausgelöst wurde, zu einer
starken Reaktion des Immunsystems führte. T-Zellen scheinen bei den Vorgängen eine
wichtige Rolle zu spielen. Wir beobachteten in verschiedenen lymphatischen Organen,
besonders im Thymus, einen dramatischen Untergang von Zellen durch Apoptose. Dies
führte zu den Fragen, ob und wann diese Organe wieder mit Zellen besiedelt werden
und wie lange die Immunzellen, im Besonderen die T-Zellen, aktiviert bleiben.
Große Studien zeigten, dass Patienten, die eine Sepsis überlebten, auch eine sehr
schlechte Langzeitprognose haben [185, 186]. Deshalb interessierten wir uns für die
Langzeitkonsequenzen, welche die Sepsis für die Funktionen des Immunsystems hat,
besonders im Hinblick auf die Entwicklung einer Immunparalyse.
Wir konnten zeigen, dass noch lange nachdem die akute Phase überstanden und die
Tiere wieder äußerlich unauffällig waren, Veränderungen im Immunsystem
persistierten, teilweise bis zum Ende des Beobachtungszeitraums 3 Monate nach der
Operation.
Entwicklung von Gewicht und Zellzahl peripherer Lymphorgane; Apoptose
Im Thymus wurde innerhalb der ersten 3 Tage nach CASPI eine dramatische Reduktion
von Gewicht und Zellzahl beobachtet. TUNEL-Färbungen zeigten, dass besonders im
Cortex Apoptose induziert wurde Mit diesen Befunden übereinstimmend berichteten
Wang et al. [187] nach i.p. Injektion Gram-negativer Bakterien von einem Verlust des
Gewichts des Thymus und der Zahl der Thymozyten, beginnend 3 Stunden nach dem
Eingriff und dem niedrigsten Niveau nach 72 Stunden. Apoptose wurde vor allem in
CD4+CD8+ Thymozyten induziert, welche sich im Cortex befinden. Dies deutet darauf
hin, dass nach CASPI durch die Infiltration der Darmbakterien in das Peritoneum und
der daraus resultierenden Exposition mit Endotoxin und/oder Freisetzung von TNF-α
Apoptose in unreifen Thymozyten induziert wird. Eine weitere wichtige Ursache für
diese Art des Zelltods könnte in der Ausschüttung großer Mengen von Glukocorticoiden
während der CASPI-induzierten Peritonitis liegen, denn Glukocorticoide induzieren
Apoptose
von
Thymozyten
[188,
189].
Aber
auch
die
Aktivierung
des
Komplementsystems könnte zur Induktion von Apoptose beitragen. Dadurch kommt es
127
Diskussion
zur Freisetzung der Anaphylatoxine C3a und C5a. C5a ist ein starker proinflammatorischer Mediator [190], der an der Induktion des programmierten Zelltods im
Thymus beteiligt ist, denn durch Blockade von C5a ließ sich die Apoptoserate
vermindern [191]. 14 Tage nach CASPI war die Architektur des Thymus
wiederhergestellt und blieb unauffällig. Demnach scheinen nur die frühen Prozesse nach
CASPI den Thymus zu beeinflussen ohne dauerhafte negative Wirkungen.
Im Gegensatz zum Thymus stieg das Gewicht der Milz und der mesenterialen
Lymphknoten nach der CASPI kontinuierlich an, drei Monate nach CASPI zeigte die
Milz eine massive Hypertrophie. Nach CASPI war Apoptose in der Milz erst 3 Tage
nach der Operation zu beobachten und hatte ein wesentlich geringeres Ausmaß als im
Thymus. Ayala et al. [192] beobachteten ebenfalls keine Veränderungen der
Apoptoserate in dem Organ 24 Stunden nach CLP. Die Milz enthält gereifte
Immunzellen, die anscheinend resistenter gegen Apoptose-auslösende Faktoren
innerhalb der ersten Tage nach CASPI sind. Dafür spricht, dass zwar die Zahl der CD3+
T-Zellen innerhalb der ersten drei Tage abfällt, dies aber erst am 7. Tag nach CASPI
signifikant war. Gleichzeitig wurde innerhalb dieser ersten 72 Stunden nach der
Operation eine starke Expression von Aktivierungsmarkern auf T-Zellen gemessen. Es
ist
also
denkbar,
dass
es
als
Folge der Stimulation zur Induktion des
aktivierungsinduzierten Zelltods (AICD) in Splenozyten gekommen sein könnte [193].
Im Gegensatz zu unseren Daten zeigten Unsinger et al. [194], dass Sepsis nur mit
geringer T-Zellaktivierung, jedoch extensiver Apoptose innerhalb der ersten 48 Stunden
assoziiert ist, die infolge dessen nicht dem AICD zugeschrieben werden könne. Andere
Autoren sind hingegen der Ansicht, dass AICD während einer Sepsis zu beobachten ist
[195]. Allerdings scheinen vor allem Th1-Zellen empfindlich für den AICD zu sein
aufgrund ihrer stärkeren Expression von FasL [196, 197]. Watanabe et al. [198]
hingegen zeigten, dass sowohl Th1- als auch Th2-Zellen FasL in vergleichbarem
Umfang exprimierten und im gleichem Ausmaß empfänglich für den FasL-induzierten
AICD sind. Weiterhin schrieben Ayala et al. [195] IL-10 eine wichtige Rolle bei der
Induktion des FasL-induzierten AICD im Verlauf einer Sepsis zu, wodurch eine
selektiven Depletion von Th1-Zellen zu beobachten ist.
Aber auch die Keimzentrumsreaktion könnte zu der erhöhten Rate apoptotischer Zellen
beitragen, denn dort wird ein Großteil der B-Zellen während der natürlichen Selektion
durch Apoptose eliminiert.
128
Diskussion
7 Tage nach CASPI waren die CD3+ T-Zellen stark depletiert, gleichzeitig wanderten
Zellen des angeborenen Immunsystems in die Milz. So blieb die Gesamtzahl der in der
Milz vorhandenen Zellen fast unverändert und war nur drei Monate nach CASPI
tendenziell erhöht. Dieser Anstieg war jedoch nicht so groß, dass damit die massive
Hypertrophie der Milz erklärt werden könnte. Vermutlich wurde mehr Bindegewebe
gebildet ähnlich wie nach der Infektion mit Plasmodium chabaudi, einem
Malariaerreger der Maus. Während der frühen Phase des Blutstadiums von Plasmodium
chabaudi wurde eine polyklonale B- und T-Zellantwort beobachtet [199], die jedoch im
Verlauf der Erkrankung durch Apoptose eliminiert und durch eine spezifische B- und TZellantwort ersetzt wurde [200]. Die starke Apoptose war assoziiert mit starker
Parasitämie und Splenomegalie sowie Expansion und einer Umorganisation der weißen
Pulpa [201]. Nach der Entfernung der Erreger normalisierten sich Größe der Milz und
Architektur der weißen Pulpa wieder. Dies bedeutet möglicherweise, dass es selbst drei
Monate nach CASPI noch Stimuli geben könnte, die zur Hypertrophie der Milz führten.
Veränderungen in den Zellpopulationen
Granulozyten
Neutrophile erwerben während einer Entzündungsantwort die Fähigkeit, auf Chemokine
wie MCP-1 und MIP-1α zu antworteten [202], welche sie an den Ort der Entzündung
locken. Einen Tag nach CASPI wurden erhöhte Konzentrationen von MCP-1 im Serum
gemessen, so dass erwartet wurde, dass die Granulozyten entsprechend rasch in die
Milz einwandern. Bereits 12 Stunden nach CASP lassen sich hohe bakterielle Lasten in
der Milz nachweisen ([203] und eigene Ergebnisse) und auch nach CASPI, der milderen
Variante der CASP, sollten spätestens 24 Stunden nach CASPI eine große Anzahl von
Erregern die Milz infiltriert haben. Doch innerhalb der ersten 3 Tage nach CASPI blieb
die Anzahl der Granulozyten in der Milz konstant.
Möglicherweise wandern Granulozyten als direkte Folge der Induktion der Peritonitis
aus verschiedenen Organen in das Peritoneum ein, um am Entstehungsort der Sepsis die
Infektion zu bekämpfen. Es wurde aber auch beschrieben, dass es im Verlauf der
Entzündungsantwort zu vorübergehenden Funktionsverlusten der Granulozyten kommt
[204, 205]. Diese könnten durch die generalisierte Freisetzung von Zytokinen wie TNFα, wie sie nach CASPI beobachtet wurde, ausgelöst werden, da diese die systemische
Ausschüttung von NO induzieren. Dadurch könnten die Granulozyten zeitweise ihre
Fähigkeit zur chemotaktischen Wanderung zur Milz verlieren.
129
Diskussion
Die Einwanderung der Granulozyten in die Milz begann 7 Tage nach CASPI und hielt
bis einen Monat nach der Operation an. Damit ähnelt die Kinetik der Infiltration dieser
Zellen in die Milz dem Zeitverlauf der Apoptose, die in diesem Organ gemessen wurde.
Es scheint demnach, dass die Granulozyten weniger durch bakterielle oder andere
chemotaktisch wirksame Mediatoren als durch Signale der sterbenden Zellen angelockt
werden.
Expression von Aktivierungsmarkern
Infolge der CASPI kam es zu einer raschen Induktion von CD69, CD25, ICOS und
CTLA-4 auf T-Zellen. Teilweise blieb ihre Expression über den gesamten
Beobachtungszeitraum erhöht.
CD69 ist das erste Molekül, dessen Expression nach der Aktivierung von TLymphozyten induziert wird und hat wahrscheinlich die Funktion, Lymphozyten zu
Beginn einer Immunreaktion in den Lymphorganen zurückzuhalten [206]. CD69 kann
nach unspezifischer Aktivierung von T-Zellen induziert werden [207]. Die verstärkte
Expression des Proteins wurde 6 und 24 Stunden nach mitogener Stimulation
beschrieben [133]. Auch nach CASPI ließ sich die Induktion von CD69 schon wenige
Stunden nach der Operation beobachten. Mögliche Ursache ist die Exposition großer
Mengen von Endotoxinen nach CASPI, da CD69 auf T-Lymphozyten durch LPS
induziert werden kann [208]. Nach LPS-induzierter Lungenverletzung wurde eine
erhöhte Frequenz von CD69+CD4+ T-Zellen bis 5 Tage nach Induktion der Pneumonie
festgestellt, einem Zeitpunkt, zu dem die Erkrankung rückläufig war [209]. Da die
Expression von CD69 aber über den gesamten Beobachtungszeitraum nach CASPI
erhöht bleibt, müssen neben LPS noch andere Faktoren zur Induktion des Proteins
beitragen.
ICOS wird innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach der Aktivierung von T-Zellen
exprimiert [210] und reguliert die Proliferation sowohl von CD8+ T-Zellen als auch von
CD4+ T-Zellen und bei diesen sowohl vom Th1- als auch vom Th2-Typ [211]. Bei der
Induktion von Th2-Antworten wird ICOS eine essenzielle Funktion zugesprochen, denn
ICOS-defiziente Tiere haben schwere Defizite in T-Zellabhängigen B-Zellantworten
wie der Bildung von Keimzentren, dem Wechsel des Antikörperisotyps (insbesondere
IgE) und der Bildung von IL-4 nach Restimulation [212, 213]. Aber auch Th1Antworten können durch ICOS-Signale gesteigert werden [211, 214]. ICOS hat
beispielsweise eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Infektionen mit Salmonella
130
Diskussion
enterica, bei denen ICOS-Signale Antikörper-, Th1- und CD8+ T-Zellantworten steigern
[215]. Nach der CASPI, in deren Folge es zu einer systemischen Verbreitung von
Darmbakterien kommt und das Immunsystem generalisiert aktiviert wird, scheint ICOS
ebenfalls eine Th1-Antwort zu unterstützen, denn während es zu einer gesteigerten
Bildung von IFN-γ kam, blieb die Expression von IL-4 und IL-5 niedrig.
Wie ICOS wird auch CTLA-4 nach Aktivierung von T-Zellen induziert [216], und die
starke Präsenz von CTLA-4 in den ersten Tagen nach CASPI könnte ebenfalls zur
Unterstützung einer Th1-Antwort beitragen, denn es wurde gezeigt, dass CTLA-4 ein
starker Inhibitor der Th2-Differenzierung und der Expression der GATA-3 mRNA ist
[217, 218]. So wurde bis zu 60 Tagen nach einer Th1-assoziierten Infektion mit dem
Nematoden Trichinella spiralis eine erhöhte Expression von CTLA-4 beobachtet [125].
Die Expression von CD25, der α-Kette des IL-2-Rezeptors, stieg in den ersten Tagen
nach CASPI kontinuierlich an. IL-2 ist essentiell für das Überleben und die Proliferation
aktivierter T-Zellen. Es könnte sich bei der Zunahme CD25+CD4+ T-Zellen demnach
um die Akkumulation aktivierter, sich schnell teilender T-Zellen handeln. Bei Patienten
mit Polytrauma und Pankreatitis wurden sowohl CD69 als auch CD25 verstärkt
exprimiert [219, 220].
Bei den CD69+, CD25+ bzw. ICOS+ T-Zellen könnte es sich neben kürzlich aktivierten
T-Effektorzellen auch um Treg handeln, denn diese reagieren auf die Stimulation mit
LPS ebenfalls mit einer verstärkten Expression von CD69 [129, 221]. Da der Anteil der
Treg aufgrund ihrer Resistenz gegenüber dem programmierten Zelltod nach CASPI
wahrscheinlich erhöht ist, könnten sie ebenfalls einen Beitrag zu der beobachteten
erhöhten Frequenz CD25+CD4+ T-Zellen leisten. Es wird vermutet, dass ICOS eine
wichtige Rolle bei der Funktion der Treg spielt [222]. Auch der kontinuierliche Anstieg
von CTLA-4 innerhalb der ersten Tage nach CASPI könnte durch einen relativen
Anstieg der Treg bedingt sein, denn Treg exprimieren das Molekül konstitutiv [223].
Außerdem zeigten Pandiyan et al. [224], dass CTLA-4 anti-apoptotische Signale bei
aktivierten T-Zellen induziert, so dass diese Zellen akkumulieren, während andere
Zelltypen wie z.B. naive T-Zellen apoptotisch werden, was ebenfalls zu der nach
CASPI beobachteten relativen Zunahme der CTLA-4+CD4+ T-Zellen beitragen könnte.
14 Tage nach CASPI stiegen die Expression von CD69, ICOS und CD25 auf den CD4+
T-Zellen ein zweites Mal stark an, stärker als direkt nach der Operation. Im Vergleich
dazu war die Expression von CTLA-4 gesunken. Es ist möglich, dass zu diesem
Zeitpunkt ein weiterer T-Zellstimulus auftritt oder die T-Zellen noch mit den Folgen der
131
Diskussion
CASPI beschäftigt sind. Da CTLA-4 ein negativer Regulator der Aktivierung von TZellen ist und u.a. die Induktion von CD69 und CD25 verhindert [120], ist zu vermuten,
dass das Fehlen des Moleküls zur stark erhöhten Expression von CD69, CD25 und
ICOS beiträgt.
Andererseits konnte gezeigt werden, dass auch Gedächtniszellen CD69 [225, 226] und
ICOS exprimieren [227, 228]. Es wurde weiter beschrieben, dass ICOS-L eine wichtige
Rolle bei der Reaktivierung von T-Effektor/Gedächtniszellen und beim Eintritt der
Immunzellen in entzündetes Gewebe hat [227]. Es ist zu vermuten, dass sich 14 Tage
nach CASPI solche Gedächtniszellen entwickelt haben. Diese Hypothese wird durch die
verminderte Expression von CD62L auf einem Teil der T-Zellen gestützt. Damit
könnten Gedächtniszellen, die CD69 und ICOS exprimieren, zu der beobachteten
zweiten Welle der erhöhten Expression dieser Moleküle beitragen.
Bestimmung von T-Zellpopulationen anhand differentieller Expression von CD45RB
und CD62L sowie CD103+ Treg
Ein wichtiger Aspekt, der durch diese Versuchsreihe geklärt werden sollte, war die
Frage, ob sich nach einer generalisierten bakteriellen Infektion ein Immungedächtnis
entwickelt. Dazu wurden die Bildung von Keimzentren und die Expression von
Antikörpern der Klassen IgM und IgG durch B-Zellen untersucht. Daneben wurde die
Entwicklung von T-Gedächtniszellen untersucht.
CD45, eine Tyrosinkinase auf der Oberfläche von Leukozyten, ist essentiell für die
TCR-vermittelte Signalgebung. CD45RB ist eine Isoform dieses Rezeptors. CD62L ist
ein Adhäsionsmolekül auf der Oberfläche von Lymphozyten und Granulozyten. Es ist
entscheidend für das „Rollen“, den ersten Schritt der Rekrutierung von Leukozyten zu
Entzündungsherden. Es ist bekannt, dass die Expression von CD45RB und CD62L (LSelektin) während der Entwicklung zu T-Gedächtniszellen sinkt [229, 230]. Diese beide
Moleküle wurden von anderen Arbeitsgruppen entweder zusammen oder einzeln zur
Identifizierung der verschiedenen Zellpopulationen genutzt.
Innerhalb der ersten drei Tage nach CASPI konnte keine Veränderungen der
Zellpopulationen, die CD45RB und CD62L exprimierten, beobachtet werden. Eine
Woche nach CASPI jedoch sank der Anteil der Zellpopulationen, die CD45RB sowohl
in hoher als auch in geringer Dichte exprimierten, dramatisch ab, folglich stieg der
Anteil der CD45RB-negativen T-Zellen. Dies lässt darauf schließen, dass TLymphozyten aktiviert und Gedächtniszellen gebildet wurden. So zeigten Kelly et al.
132
Diskussion
[231], dass 8 Tage nach einer Immunisierung 90% der T-Zellen in den Keimzentren
CD45RB-negativ waren. Da auch nach CASPI zu diesem Zeitpunkt die Formierung von
Keimzentren nachgewiesen werden konnten, könnte dieser Prozess einen Beitrag zu
dem Anstieg der CD45RB-negativen T-Zellen leisten. Auch der Anteil der CD62Lhigh
T-Zellen war stark abgefallen. Dafür stiegen aber sowohl die CD62Llow- als auch die
CD62L-negativen CD3+ T-Zellen stark an. Dies deutet auf eine Aktivierung der Zellen,
denn die CD45RB-negativen sowie CD62L-negativen T-Lymphozyten charakterisieren
die Population der aktivierten T-Zellen [232]. Es wurde beobachtet, dass CD62L
während der humanen Sepsis und nach CLP von der Zelloberfläche entfernt wird [233235], wodurch es im Serum zu einem Anstieg von löslichem CD62L (sL-Selektin)
kommt. Es wird diskutiert, ob die Konzentration von sL-Selektin im Serum eine
Prognose über den Ausgang der Sepsis erlaubt [236], denn es wurde nachgewiesen, dass
sL-Selektin der zerstörerischen systemischen Wirkung aktivierter Leukozyten
entgegenwirken kann [237]. Der Anstieg der Fraktion aktivierter CD62L-negativer TZellen ging einher mit dem zweiten Höhepunkt der Expression von TNF-α, IL-6 und
MCP-1. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass T-Zellen einen entscheidenden Beitrag
zur Produktion dieser Mediatoren zu diesem Zeitpunkt leisteten. Aber auch auf die
Bildung von T-Effektor/Gedächtniszellen lässt sich aus dem beobachteten Phänotyp der
T-Zellen (CD45RBlow/-CD62Llow/-; [238]) schließen, die in entzündetes Peritoneum
infiltrieren können.
14 Tage nach CASPI konnte ein Anstieg der CD45RBhigh- und CD62Llowexprimierenden T-Zellpopulationen verzeichnet werden. Diese Beobachtung deutet
darauf hin, dass sich nun aus der Population aktivierter T-Zellen und TEffektor/Gedächtniszellen zentrale Gedächtniszellen entwickelt haben (CD45RBhigh
CD62Llow/high; [239]). Da sie CD62L exprimieren, können sie in lymphatische Organe
einwandern [240, 241]. Zwischen den T-Effektor/Gedächtniszellen, den zentralen
Gedächtniszellen und den Effektorzellen entwickelt sich ein Gleichgewicht, welches
von der Zeit und der Verfügbarkeit des Antigens abhängig ist. Es wurde gezeigt, dass
sich in Anwesenheit des Antigens Effektorzellen entwickelten, in Abwesenheit
hingegen zentrale Gedächtniszellen [242, 243]. Dies könnte demnach bedeuten, dass 14
Tage nach CASPI die stimulierenden Antigene eliminiert worden sind und es bei dieser
Form
der
experimentellen
Gedächtniszellen
kommt.
Es
Peritonitis
zur
scheint,
als
Entwicklung
würden
sich
beider
Arten
Effektor-
von
und/oder
Gedächtniszellen relativ anreichern. Verschiedene Arbeitsgruppen wiesen nach, dass
133
Diskussion
Gedächtniszellen anti-apoptotische Moleküle wie Bcl-x(L), Bcl-2 und FLIP(L)
exprimieren [244], wodurch sie unempfindlicher für die TNF-α- und Fas-induzierte
Apoptose sind [244-246], die, wie bereits oben ausgeführt, durch die Peritonitis in
hohem Umfang induziert wird. Es kommt dadurch zu einer „Ausdünnung“ der T-ZellPopulation mit einer relativen Zunahme der Gedächtniszellen.
Drei Monate nach CASPI war die Frequenz beider CD45RB- bzw. CD62Lexprimierenden
T-Zellpopulationen
vermindert
im
Vergleich
zu
denen
der
altersentsprechenden, nicht operierten Tieren. Die CD45RB- und CD62L-negativen TZellen waren hingegen vermehrt. Es wäre möglich, dass es zu einer Abnahme der
Frequenz der Gedächtniszellen gekommen ist. Es könnte aber auch eine weitere Welle
der Aktivierung der T-Zellen stattgefunden haben, eine Schlussfolgerung, die auch
durch eine erhöhte Expression von CD69 auf den T-Zellen gestützt wird. Da besonders
die CD45RBhigh T-Zellen stark vermindert war, könnte es sich auch um eine
Immunantwort auf eine wiederholte Infektion handeln, denn D`Imperio Lima et al.
[199] beobachteten, dass nach einer primären Infektion der Großteil der aktivierten
CD4+ T-Zellen phänotypisch CD45RBhigh waren, während sie nach der sekundären
Infektion überwiegend CD45RBlow exprimierten.
Regulatorische T-Zellen haben essentielle Funktionen bei der Regulation der
Immunantwort. Es wird vermutet, dass sie zur Polarisierung einer Th2-Antwort und zur
Immunparalyse, die im Verlauf der Erkrankung häufig eintritt, einen entscheidenden
Beitrag leisten könnten. Die Untersuchung der regulatorischen T-Zellen konzentrierte
sich in diesem Pilotprojekt auf eine Untergruppe adaptiver Treg, welche das Integrin
αEβ7 (CD103) exprimieren. Natürliche CD4+CD25+ Treg exprimieren CD103 nicht, es
wurde jedoch auf Treg identifiziert, die sowohl CD25-positiv als auch CD25-negativ
waren [247], in beiden Fällen aber Foxp3 in hohem Umfang exprimierten.
14 Tage nach CASPI wurde ein deutlich erhöhter Anteil CD103+CD4+ Treg in der Milz
festgestellt, gleichzeitig eine starke Aktivierung der T-Zellen in der Milz beobachtet. Es
wäre also denkbar, dass zu diesem Zeitpunkt CD103+ Treg in die Milz einwanderten.
CD103 wird erst unmittelbar vor oder nach der Ankunft der Treg im infizierten Gewebe
induziert und dann beibehalten [248]. Außerdem exprimieren die CD103+CD4+ Treg
E/P-Selektin-bindende
Liganden,
Adhäsionsmoleküle
und
Rezeptoren
für
inflammatorische Zytokine. Diese ermöglichen ihnen eine effiziente Migration in
entzündetes Gewebe, wo sie als potenteste Inhibitoren von Entzündungen identifiziert
134
Diskussion
werden konnten [249]. Da es sich bei den CD103+ Treg um adaptive Treg handelt, wäre
es möglich, dass es sich bei der am Tag 14 nach CASPI erhöhten Anzahl der
CD103+CD4+ Treg um ehemals natürliche Treg handelte, die im Verlauf der
Erkrankung einen Wechsel ihres Phänotyps unternommen haben, der eine verstärkte
suppressive Aktivität bewirkte, was nach Infektion mit Schistosomas beschrieben wurde
[250].
Expression von Zytokinen
SIRS und Sepsis sind zunächst durch eine starke generalisierte Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet. Auch einen Tag nach CASPI, der
subletalen Variante der CASP, war die Expression von TNF-α, IL-6 und MCP-1 am
höchsten. TNF-α trägt wesentlich zur Induktion der „überschießenden“ Immunantwort
bei, die schließlich im Schock enden kann. TNF-α ist in der frühen Phase der humanen
Sepsis oder nach CLP nachweisbar, aber meist rasch wieder aus der Zirkulation
verschwunden [251, 252]. Obwohl vermutlich vor allem Zellen des angeborenen
Immunsystems für die Bildung dieser Mediatoren verantwortlich sind, zeigten Shelley
et al. [253] auch eine Rolle des adaptiven Immunsystems bei der Regulation der
inflammatorischen Antwort und den Schutz vor polymikrobieller Sepsis.
7 Tage nach CASPI gab es einen zweiten Gipfel der Expression von TNF-α, IL-6 und
MCP-1. Diese zweite Welle der Zytokinexpression könnte das Ergebnis einer
„klassischen Aktivierung“ von T-Lymphozyten sein, die einige Tage in Anspruch
nimmt. Außerdem könnte sie bedeutend bei der Antwort von Gedächtniszellen sein:
MCP-1 könnte zu diesem Zeitpunkt Bedeutung als chemotaktischer Mediator für
(aktivierte) T-Gedächtniszellen haben [254, 255]. Außerdem zeigten Ding et al. [256],
dass TNF-α die Migration von Gedächtniszellen, induziert durch verschiedene
Chemokine, verbessert.
Während einer humanen Sepsis [134] oder einer durch CLP induzierten Peritonitis
[257] wurde beobachtet, dass auf den initialen pro-inflammatorischen „Zytokinsturm“
eine Phase der Immunsuppression folgt, die durch die starke Ausschüttung antiinflammatorischer Zytokine gekennzeichnet ist. Insbesondere IL-10 hat entscheidende
Bedeutung beim Übergang in die Immunparalyse, in der die Expression dieses Zytokins
stark überwiegt. Nach CASPI hingegen wurde IL-10 zwar rasch induziert, war aber
ebenso rasch wieder aus der Zirkulation verschwunden. Es konnte nach CASPI auch
135
Diskussion
keine weitere oder andauernde Induktion von IL-10 beobachtet werden, so dass es
keinen Anhalt für eine Immunparalyse gibt.
Assoziiert mit der Auslösung einer Immunsuppression ist der Wechsel einer Th1- zu
einer Th2-Antwort, der häufig bei Patienten und im Tiermodell beobachtet wurde. Er ist
charakterisiert durch eine verminderte Bildung von IL-2, IL-12 und IFN-γ und eine
gesteigerte Synthese von IL-4 und IL-10 [258, 259], denn IL-12 und IFN-γ fördern die
Differenzierung von CD+ T-Zellen zu Th1-Zellen, IL-10 hingegen die Reifung von Th2Zellen. Im Zeitverlauf nach CASPI stiegen die Konzentrationen von IL-12, IL-2 und
IFN-γ an, während IL-10 nach dem initialen Anstieg ebenso wie IL-4 kaum noch
nachzuweisen war. Dies deutet eher auf das Überwiegen einer Th1-Antwort hin.
Folglich unterscheidet sich das CASPI-Modell deutlich vom CLP-Modell und auch von
der Situation vieler septischer Patienten.
Entwicklung von Keimzentren und Expression von IgM und IgG
Die Architektur der Milz ist für den Ablauf von Immunantworten, insbesondere der
Entstehung von Keimzentren, von großer Bedeutung. Eine Komponente ist die
marginale Zone, welche die retikuloendotheliale rote Pulpa von der lymphoiden weißen
Pulpa trennt und in der sich Makrophagen der marginalen Zone und marginale
metallophile Makrophagen befinden [260]. Keimzentren entwickeln sich während einer
Immunantwort in den B-Zellfollikeln sekundärer Lymphgewebe. Reife Keimzentren
lassen sich unterteilen in eine dunkle Zone und eine helle Zone. In der dunklen Zone
konnten proliferierende Zellen, die Zentroblasten, nachgewiesen werden. In der hellen
Zone befinden sich die nicht mehr proliferierenden Zentrozyten sowie ein Netzwerk von
follikulär dendritischen Zellen [261, 262]. Im Keimzentrum erfahren die B-Zellen
bedeutende Modifikationen wie somatische Hypermutation, Wechsel des Isotyps der
Antikörper und Affinitätsreifung. Für diese Prozesse ist meist die Hilfe von Th2-Zellen
erforderlich, denn die Ereignisse in den Keimzentren sind abhängig von den
Interaktionen CD40L (CD154)/ CD40 und CD28/ CD86 [263]. Die selektierten BLymphozyten differenzieren dann zu Plasmazellen, die hochaffine Antikörper bilden,
oder zu B-Gedächtniszellen. Diese können bei erneutem Kontakt mit demselben Erreger
schneller und effizienter agieren.
Es gibt kaum Untersuchungen, die sich mit der Frage beschäftigen, ob nach
generalisierten bakteriellen Infektionen ein humorales Immungedächtnis aufgebaut
wird. Bei Patienten, die an einer Sepsis verstarben, zeigte sich häufig eine Hyperplasie
136
Diskussion
der Keimzentren [264]. Auch nach post-traumatischer Splenektomie waren bei der
überwiegenden Zahl der Patienten Keimzentren vorhanden, deren marginale Zone
häufig hyperplastisch war [265]. Die expandierten marginalen Zonen enthielten jedoch
keine B-Zell-Klone [266]. Die Funktionsfähigkeit der Keimzentren wurde nicht
untersucht. Es wurde jedoch beobachtet, dass es während einer systemischen
Entzündungsantwort nicht nur zum Verlust von B- und T-Zellen, sondern auch von
follikulären dendritischen Zellen kommt [267]. Die vorhandenen Immunzellen sind
häufig stark in ihrer Funktion eingeschränkt.
Zur Untersuchung der Formierung von Keimzentren wurden zwei charakteristische
Zellarten gefärbt: marginale metallophile Makrophagen, die durch den Antikörper
MOMA-1 [268] visualisiert wurden, und Keimzentrums-B-Zellen, die mit PNA (peanut
agglutinin) nachgewiesen wurden. Lahvis et al. [269] zeigten, dass murine B-Zellen der
Milz den Rezeptor von PNA (PNA-R) nach Interaktion mit CD4+ T-Zellen und von
CD40 mit CD40L exprimieren. Deshalb sind die von uns detektierten Keimzentren nach
dem Kontakt mit T-Zellabhängigen Antigenen entstanden. T-Zellunabhängige Antigene
wie LPS allein konnten PNA-R nicht induzieren. Keimzentren können wenige Tage
nach einer Immunisierung oder Infektion detektiert werden [270, 271]. Mit diesen
Beobachtungen übereinstimmend fanden wir 3 Tage nach CASPI in der Milz MOMA1+ Makrophagen und PNA-R+ B-Zellen, die ab Tag 7 Gruppen bildeten. Diese
„Keimzentren“ waren teilweise sehr klein und über das gesamte Organ verteilt. Damit
unterschieden sie sich deutlich von den Keimzentren, die beispielsweise nach der
Injektion des Standardantigens TNP-KLH gebildet wurden (Diplomarbeit: Christian
Pötschke). Eine mögliche Ursache für das Auftreten dieser ungewöhnlichen Cluster
könnte in der generalisierten Ausschüttung von Zytokinen wie TNF-α liegen, ausgelöst
durch die Peritonitis, welche zur Zerstörung der Architektur der Milz durch Apoptose
beiträgt. Ähnliches wurde auch nach Infektion mit Plasmodium chabaudi, einem
Malariaerreger der Maus, beobachtet. In diesem Modell wurde gezeigt, dass es auf dem
Höhepunkt der Parasitämie zu einer vollständigen Depletion der marginalen
metallophilen Makrophagen und Makrophagen der marginalen Zone kam, bei der TNFα bzw. IFN-γ eine wichtige Rolle spielten [260, 272]. Daraus resultierte die Auflösung
der marginalen Zonen und die Zerstörung der Architektur der Milz [273]. Weiterhin
wurde in demselben Tiermodell beobachtet, dass die Plasmazellen ab dem 10. Tag nach
Infektion unkonventionell in einem Gebiet der weißen Pulpa Cluster formten, in dem
ansonsten T-Zellen vorzufinden waren [271].
137
Diskussion
Keimzentren persistieren bis 30 Tage nach Immunisierung [262]. Es ließen sich jedoch
auch drei Monate nach CASPI zahlreiche Gruppen von PNA-R+ B-Zellen und MOMA+
Makrophagen beobachten. Achtman et al. [271] beobachteten, dass sich noch 60 Tage
nach Infektion mit Plasmodium chabaudi Keimzentren nachweisen ließen aufgrund der
Persistenz der Parasiten. Es wäre möglich, dass sich das Immunsystem selbst drei
Monate nach CASPI noch mit den Folgen der Sepsis beschäftigt, möglicherweise
aufgrund eines vorübergehenden Verlusts der Immunkompetenz. Eine weitere Infektion
könnte in diesem Fall fatale Folgen haben. Dies könnte auch dazu beitragen, warum
septischen Patienten eine deutlich höhere Langzeitmortalität als beispielsweise
Patienten nach einem Trauma haben [274].
Aufgrund des Zytokinprofils ist davon auszugehen, dass nach CASPI eine Th1-Antwort
überwiegt, für die Bildung von Keimzentren und die dort stattfindenden Prozesse ist
eine Th2-Antwort jedoch notwendig. Nach Infektion mit Plasmodium chabaudi wurde
beobachtet, dass nach der initialen Th1-Antwort verstärkt IL-4 und IL-10 gebildet und
somit eine Th2-Antwort eingeleitet wurde [275]. Nach CASPI wurden hingegen
während des gesamten Untersuchungszeitraums nur geringe Mengen IL-4 gemessen
und nach der initialen Induktion auch kaum IL-10. Beide Zytokine sind für die
Differenzierung von Th2-Zellen wichtig [276]. Ob dennoch eine ausreichende
Aktivierung von Th2-Zellen stattfindet, um B-Zell-Hilfe zu leisten, sollte durch die
Bestimmung der Isotypen der sezernierten Antikörper (IgM und IgG) im Serum
überprüft werden, denn ein Klassenwechsel von IgM zu IgG ist ein T-Zellabhängiges
Ereignis. Die Konzentration von IgM war bereits 3 Tage nach CASPI signifikant
erhöht, stieg bis zum Tag 14 kontinuierlich an und war auch noch 28 Tage nach der
Operation stark erhöht. Es wird angenommen, dass B-Zellen der marginalen Zone für
die erste Welle der Bildung von Antikörpern gegen bakterielle Antigene verantwortlich
sind, schon 24 Stunden nach Infektion sezernierten sie spezifische Antikörper der
Klasse IgM [277]. Sie bleiben jedoch in der marginalen Zone und sind für die lokale
Bildung von Antikörpern verantwortlich [278]. LPS und CpG-DNA sind starke BZellmitogene und wurden nach CASP in großen Mengen systemisch freigesetzt [128].
Solche mikrobiellen molekularen Muster (PAMP) könnten ebenfalls zum schnellen
Anstieg der Konzentration von IgM beitragen. Bei der murinen Infektion mit
Citrobacter entscheidet eine schnelle und starke spezifische IgM-Antwort über das
Überleben [279].
138
Diskussion
Die Konzentration von IgG stieg ab dem 14. Tag nach CASPI im Serum an und
erreichte schließlich mit 44 mg/ml sehr hohe Werte. Da LPS weder Isotypwechsel noch
Affinitätsreifung induziert [280], spielen T-Zellunabhängige Ereignisse vermutlich nur
eine untergeordnete Rolle. Die Kinetik der IgG-Antwort unterstützt die Hypothese, dass
es sich hierbei um eine „klassische“ T-Zellabhängige Antwort auf mikrobielle
(Protein)antigene handelt. Wahrscheinlich resultierte der Großteil der infolge der
polymikrobiellen Sepsis produzierten Antikörper aus einer kognaten Interaktion von TZellen mit B-Zellen. Beobachtungen in murinen Infektionsmodellen mit Plasmodium
chaubaudi und Citrobacter unterstützen diese Vermutung. In diesen Modellen war die
schützende Antikörperantwort abhängig von der T-Zellfunktion. CD28 auf der
Oberfläche der T-Zellen war bedeutend bei der Erzeugung spezifischer B- und T-ZellAntworten, die für den Schutz vor dem Erreger benötigt wurden [281]. Diese waren
essentiell für die Generation akuter pathogenspezifischer IgM- und früher IgGAntikörper nach Infektion mit Citrobacter [282]. Daneben leistet auch ICOS einen
entscheidenden Beitrag zur Bildung von Keimzentren und zum Klassenwechsel des
Antikörperisotyps. Die Expression von ICOS nach CASPI hatte einen zweiten
Höhepunkt am Tag 14, dem Beginn der vermehrten IgG-Produktion. T-Zellen in den
Keimzentren, sogenannte follikuläre B-Helfer-T-Zellen (T(FH)), sind durch eine hohe
Expression von ICOS und CXCR5 gekennzeichnet und gelten als stärkste Induktoren
der Bildung von IgG [283].
Sowohl die Konzentration von IgM als auch von IgG waren bei den Tieren 3 Monate
nach Peritonitis deutlich höher als bei den Alterskontrollen. Dies bedeutet, dass die
Keimzentren, die zu diesem Zeitpunkt bei den operierten Tieren nachweisbar waren,
auch funktionell waren. Es muss geprüft werden, ob über diese lange Zeit Bakterien
oder bakterielle Bestandteile im Organismus vorhanden sind, die eine chronische
Immunreaktion bewirken.
Auswirkungen der CASPI auf das immunologische Gedächtnis
Es ist bekannt, dass septische Patienten häufig in einen immunsupprimierten Zustand
verfallen. Dieser ist gekennzeichnet durch eine stark verminderte Fähigkeit zur
Antigenpräsentation, hervorgerufen u.a. durch eine dramatisch verminderte Expression
von HLA-DR und CD86 auf Monozyten und CD28 auf Lymphozyten, während CTLA4 verstärkt induziert ist [284-286]. Auch könnten regulatorische T-Zellen eine wichtige
Rolle spielen, denn ihre Anzahl ist bei einem septischen Schock relativ erhöht [134].
Weitere suppressive Faktoren sind die Depletion von B- und T-Lymphozyten sowie von
139
Diskussion
dendritischen Zellen [287]. Auch nach CASPI wurde eine starke Induktion des
negativen Regulators CTLA-4 beobachtet sowie in Thymus, Milz und weiteren
peripheren Lymphorganen die Induktion von Apoptose gemessen. Ein großer
Unterschied zwischen der Immunantwort, die nach CASPI ausgelöst wurde und der, die
in den meisten anderen Modellen und auch bei der humanen Sepsis überwiegt, liegt
darin, dass nach CASPI eine Th1-Antwort zu überwiegen scheint. Die ansonsten
überwiegende Th2-Antwort mit einer starken Ausschüttung von IL-10 wird als
entscheidender Faktor für den immunparalytischen Zustand angesehen. Es stellte sich
deshalb die Frage, ob es nach CASPI überhaupt zu einer Immunsuppression kommt,
welche eine Neuimmunisierung behindert oder sogar ein bereits entwickeltes
Immungedächtnis beeinträchtigt. Dazu wurde in einem Pilotexperiment der Einfluss
von CASPI auf die primäre und sekundäre Immunantwort auf das Antigen TNP-KLH
untersucht.
Nach primärer Immunisierung mit TNP-KLH wurden überwiegend Antikörper der
Klasse IgM produziert. Die Konzentration von TNP-spezifischem IgM war bei den
Tieren nach CASPI signifikant höher als bei der immunisierten, nicht operierten
Kontrolle. Dies könnte einerseits bedeuten, dass durch die Peritonitis die
antigenspezifische B-Zellantwort verbessert ist oder aber dass durch CASPI induzierte
Antikörper mit TNP kreuzreagierten. Wie bereits im vorangegangenen Kapitel
beschrieben, war die Konzentration von Gesamt-IgM nach CASPI ebenfalls sehr stark
erhöht. Da IgM multivalent ist und somit leichter Kreuzreaktionen eingeht,
insbesondere mit repetitiven Epitopen, könnte dies zur Erhöhung vermeintlich TNPspezifischer Antikörpertiter beigetragen haben.
Die proliferative Antwort der Milzzellen nach CASPI auf ConA war nicht
beeinträchtigt, was darauf deutet, dass sie auf eine polyklonale Aktivierung mit einer
adäquaten Antwort reagieren konnten. Auch Adamik et al. [251] zeigten eine starke
Proliferation von Lymphozyten septischer Patienten nach Stimulation mit PHA.
Es zeigte sich jedoch, dass mit zunehmendem zeitlichen Abstand der Immunisierung
mit TNP-KLH zur CASPI die Proliferation der Milzellen auf das stimulierende Antigen
schwächer wurde und schließlich fast ganz ausblieb. Demnach war ihre Kapazität zur
antigenspezifischen Proliferation deutlich eingeschränkt. Da der Komplex aus TNPKLH ein T-Zellabhängiges Antigen darstellt, wird zur Aktivierung, Expansion und
Differenzierung antigenspezifischer B-Zellen die Hilfe von Th2-Zellen benötigt. Eine
mögliche Ursache wäre, dass antigenspezifische T-Zellen im Verlauf der Erkrankung
140
Diskussion
durch Apoptose depletiert wurden, die bis zum Tag 28 nach CASPI deutlich erhöht war.
Es ist ebenfalls zu berücksichtigen, dass nach CASPI eine Th1-Antwort zu überwiegen
scheint, so dass es möglich wäre, dass eine Aktivierung von Th2-Zellen nur in
ungenügendem Umfang erfolgte.
Auch könnte die starke Expression von CTLA-4 einen wichtigen Beitrag zu diesen
Ereignissen leisten. CTLA-4 konkurriert mit CD28 um die Bindungsstellen der B7Moleküle, ist aber höher affin und kann deshalb die Ligation von CD28 deutlich
vermindern. Aufgrund des fehlenden costimulatorischen Signals wird die Aktivierung
der T-Zellen verhindert. CD28 ist bedeutend bei der Erzeugung spezifischer B- und TZell-Antworten, hat jedoch kaum Einfluss auf die polyklonale Aktivierung von B- und
T-Zellen und die Bildung polyklonaler Antikörper der Klassen IgM und IgG [281]. Da
erhöhte Konzentrationen TNP-spezifischer Antikörper auch in nichtimmunisierten
Tieren in bestimmten zeitlichen Abständen zur CASPI gefunden wurden, ist es
wahrscheinlich, dass es nach der Operation zu einer polyklonalen Aktivierung von BZellen, unabhängig von der Spezifität des B-Zellrezeptors, kam. Es bleibt jedoch
ungeklärt, ob dies die einzige Quelle der gebildeten Antikörper ist. Es ist sehr
wahrscheinlich, dass sich polyklonale und antigenspezifische Effekte addieren.
Nach der sekundären Immunisierung war die Konzentration TNP-spezifischer
Antikörper der Klassen IgM und IgG deutlich höher im Vergleich zu denen, die nach
Primärimmunisierung gemessen wurden. Dies spricht für eine klassische sekundäre
Immunantwort. Es wurde kein Unterschied zwischen den operierten Gruppen und den
Kontrollen gemessen. Auch hatte der Zeitpunkt, zu dem die 2. Immunisierung erfolgte,
keinen starken Einfluss auf den Spiegel TNP-spezifischer Antikörper beider
Isotypklassen. Die Induktion der Peritonitis beeinflusste das etablierte Immungedächtnis
hinsichtlich der Bildung spezifischer Antikörper offenbar nicht.
Bei einer typischen Sekundärantwort reagieren die Lymphozyten schneller auf eine
geringere Antigenkonzentration als bei einer Primärantwort. Überraschend war jedoch,
dass Splenozyten operierter Tiere tendenziell stärker und sensitiver auf die gleichen
Antigenkonzentrationen reagierten als die der zugehörigen nicht operierten Kontrollen.
Hingegen zeigten Manjuck et al. [286], dass die Sekundärantwort auf Tetanus-Toxid,
gemessen an der Proliferation der Lymphozyten, bei septischen Patienten deutlich
schwächer ausfiel als bei gesunden Probanden. Außerdem wurde gezeigt, dass LPS
Apoptose in B-Gedächtniszellen immunisierter Tiere induzierte und dadurch die
141
Diskussion
Immunantwort abschwächte [288]. Im Gegensatz dazu wurde nach CASPI eine relative
Zunahme von Gedächtniszellen beobachtet, die offenbar resistenter gegen den
programmierten Zelltod sind als z.B. naive T-Zellen. Je länger der zeitliche Abstand
von der CASPI zur 2. Immunisierung war, desto stärker wirkte sich dieser aus, da die
Apoptose in der Milz mindestens bis zum Tag 28 nach CASPI anhielt. Aufgrund dessen
kam es bei den Tieren mit zunehmendem zeitlichen Abstand der 2. Immunisierung von
der CASPI zu einer erhöhten Sensitivität und einer Zunahme der Proliferationsstärke.
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158
Anhang: Bildmaterial
Anhang: Messung der Apoptoserate in der Milz nach der Depletion
CD4+ T-Zellen
aCD4/CASP
PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 71: Messung der Apoptoserate der Milz als Folge der Depletion CD4+ T-Zellen sowie CASP
Dargestellt sind charakteristische Bilder von TUNEL-Färbungen von Milzschnitten nach der
Vorbehandlung der Tiere mit dem depletierenden anti-CD4 (aCD4)-Antikörper GK1.5 (linke Spalte) bzw.
von PBS-Kontrolltieren (rechte Spalte) 12 Stunden nach CASP (oben) oder bei den nicht operierten
Mäusen (unten). Apoptotische Zellen wurden mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff FITC markiert.
220
Anhang: Bildmaterial
Anhang: Bestimmung des Anteils von Granulozyten in der Milz nach
der Depletion der CD4+ T-Zellen
aCD4/CASP
PBS/CASP
aCD4
PBS
Abb. 72: Immunhistochemische Färbung von Granulozyten auf Milzschnitten nach der Depletion
CD4+ T-Zellen sowie CASP
Dargestellt sind charakteristische Färbungen von Milzschnitten mit dem Antikörper Gr1.1 nach der
Vorbehandlung der Tiere mit dem depletierenden anti-CD4 (aCD4)-Antikörper GK1.5 (linke Spalte) bzw.
von PBS-Kontrolltieren (rechte Spalte) 12 Stunden nach CASP oder bei den nicht operierten Mäusen. Die
Granulozyten sind rotbraun angefärbt, das Gewebe wurde mit Hämalaun (blau) kenntlich gemacht.
221
Anhang: Bildmaterial
Anhang: Anteil der Granulozyten in der Milz im Zeitverlauf nach
CASPI
unbehandelt
1 d CASPI
3 d CASPI
7 d CASPI
14 d CASPI
28 d CASPI
84 d CASPI
unbehandelt (84 d)
Abb. 73
Abb. 73: Immunhistochemische Färbung von Granulozyten auf Milzschnitten im Zeitverlauf nach
CASPI
Dargestellt sind charakteristische Färbungen von Milzschnitten zu den verschiedenen Zeitpunkten nach
CASPI bzw. der unbehandelten Kontrollen im Alter von 8-10 Wochen oder altersentsprechend den Tieren
84 Tage nach der Operation. Die Granulozyten sind rotbraun angefärbt, das Gewebe wurde mit Hämalaun
(blau) kenntlich gemacht.
222
Anhang: Bildmaterial
Anhang: Expression von CTLA-4 im Zeitverlauf nach CASPI
unbehandelt
1 d CASPI
3 d CASPI
7 d CASPI
14 d CASPI
28 d CASPI
84 d CASPI
unbehandelt (84 d)
Abb. 74: Expression von CTLA-4 auf den CD4+ T-Lymphozyten der Milz im Zeitverlauf nach
CASPI
Gezeigt werden charakteristische Bilder der Expression von CTLA-4 auf den CD4+ T-Zellen der Milz zu
den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI bzw. der unbehandelten Kontrollen im Alter von 8-10
Wochen oder altersentsprechend den Tieren 84 Tage nach der Operation. CTLA-4 wurde mit dem roten
Farbstoff Rhodamin-(TRITC) angefärbt, die CD4+ T-Zellen mit dem grünen Farbstoff FITC.
223
Anhang: Bildmaterial
Anhang: Ausbildung von Keimzentren im Zeitverlauf nach CASPI
unbehandelt
1 d CASPI
3 d CASPI
7 d CASPI
14 d CASPI
28 d CASPI
84 d CASPI
unbehandelt (84 d)
Abb. 75: Entwicklung von Keimzentren nach CASPI
Zur Untersuchung der Entwicklung von Keimzentren wurden marginale Makrophagen mit dem
Antikörper MOMA-1 (rot) und aktivierte B-Zellen mit FITC-markiertem PNA (grün) gefärbt. Dargestellt
sind charakteristische Aufnahmen der Milz zu den verschiedenen Zeitpunkten nach CASPI bzw. der
unbehandelten Kontrollen im Alter von 8-10 Wochen oder altersentsprechend den Tieren 84 Tage nach
der Operation.
224
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Expression von CTLA-4 auf T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut
von chirurgischen Hochrisikopatienten
(Teil einer prospektiven klinischen Pilotstudie)
Einleitung
Die Ergebnisse aus dem CASP-Modell implizieren eine deutliche Beteiligung von TZellen bei polymikrobieller Sepsis, charakterisiert insbesondere durch die schnelle und
starke Induktion von CTLA-4. Um zu prüfen, ob diese Befunde auch für den Menschen
relevant sind, wurde die Expression von CTLA-4 als ein Parameter in eine prospektive
klinische Studie integriert, die von den Kliniken und Instituten für Chirurgie,
Anästhesie, Medizinische Psychologie und Immunologie gemeinsam konzipiert und
durchgeführt wurde. In dieser Studie wurden Patienten untersucht, die sich einem
großen abdominalchirurgischen Eingriff unterzogen, welcher mit einem hohen Risiko
für die Entwicklung einer Sepsis verbunden war (chirurgische Hochrisikopatienten). Bei
diesen Patienten wurde eine Vielzahl klinischer, immunologischer und psychologischer
Parameter erhoben, um Zusammenhänge zwischen ihnen aufzudecken und Muster zu
identifizieren, welche einen guten bzw. schlechten Ausgang prognostizieren. In diese
multiparametrische Studie wurden 32 Patienten eingeschlossen, von denen 30
auswertbare Daten lieferten.
Material und Methoden
Gewinnung humaner peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMC)
Die Gewinnung mononukleärer Zellen aus dem periphern Blut (PBMC) von Patienten
und Probanden für die multiparametrische Hochrisikopatienten-Studie erfolgte aus 5 ml
heparinisiertem Vollblut. Das Blut wurde mit dem gleichen Volumen PBS verdünnt
und über 5 ml Ficoll 1,077 (Biochrom AG, Berlin) geschichtet. Nach der Zentrifugation
bei 2800 rpm ohne Bremse für 15 min. konnten die PBMC gewonnen werden, die sich
im Zellring in der Interphase zwischen Ficoll und Serum/PBS befanden. Das 1:2
verdünnte Serum wurde aliquotiert und weiteren Untersuchungen zur Verfügung
gestellt. Die Zellen hingegen wurden zunächst bei 2700 rpm, dann zweimal bei 800 rpm
für jeweils 5 min. mit PBS gewaschen, anschließend in Medium (R10F; Sigma,
Deisenhofen) aufgenommen und auf eine Konzentration von 1*106 Zellen/ml
eingestellt.
159
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Gewinnung von Zytozentrifugenpräparaten
Die Zellsuspension wurde auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml eingestellt.
Anschließend wurden 50 –100 µl der Zellsuspension in die Pipettierhilfe der
Zytozentrifuge (Shandon, Frankfurt) gegeben und nach Zentrifugation bei 800 rpm für 8
min. auf Superfrost-Objektträger (Menzel Gläser, Braunschweig) gebracht.
Die Zytozentrifugenpräparate wurden über Nacht getrocknet und dann in auf – 20°C
vorgekühltem Aceton (Hedinger, Stuttgart) 5 min. fixiert und bei -70°C gelagert,
nachdem das Aceton verdampft war.
Färbung von CTLA-4 und CD3 auf humanen PBMC
Der Nachweis der Expression von CTLA-4 auf den PBMC der Studienpatienten
erfolgte an den Tagen vor (-1) sowie einen (+1), zwei (+2), fünf (+5) und sieben (+7)
Tage nach der geplanten Operation. Die Proben jedes Patienten wurden gesammelt und
vor der gemeinsamen Färbung mindestens 17 Stunden bei -70°C gelagert.
Die Zytozentrifugenpräparate wurden nach dem Auftauen durch 15-minütige
Inkubation mit Cohn II γ-Globulin (Sigma, Deisenhofen) inkubiert, um unspezifische
Bindungsstellen zu blockieren. Dann wurde 50 µl der Primärantikörperlösung
dazugegeben, welche die monoklonalen Antikörper UCHT-1 (Maus anti-human CD3)
und biotinylierten anti-human CTLA-4 Antikörper (BNI3; BD Biosciences, Heidelberg)
zusammensetzte. Nach einer Inkubation von 90 min. in einer feuchten Kammer bei
Raumtemperatur wurden die Präparate zweimal mit PBS gewaschen und 15 min. mit
Paraformaldehyd (4%; Sigma, Deisenhofen) inkubiert. Dann wurde 3% H2O2 (Merck,
Darmstadt) für 10 min. zugesetzt, zweimal gewaschen und Streptavidin-Peroxidase
(NEN, Boston, USA; 1:500) zugegeben. Nach wiederholtem Waschen mit PBS wurde
Biotinyltyramid (NEN, Boston, USA; 1:200 verdünnt in Amplifikationsdiluent) zu den
Zellen pipettiert. Nach erneutem Waschen wurden synchron die Detektionsreagenzien
hinzugegeben, Streptavidin (Rhodamin)-TRITC (Dianova, Hamburg) und anti-Maus
IgG1-FITC (Southern Biotechnology, Birmingham, USA) . Nach 90-minütiger
Inkubation wurden die Objektträger, mit DABCO (Merck, Darmstadt) als anti-FadingReagenz überschichtet und mit Deckgläschen versehen.
Die Färbung von CD3 und CTLA-4 für die Laser-Scanning-Zytometrie erfolgte wie für
die Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, Streptavidin-TRITC wurde jedoch durch
Streptavidin-Alexa 647 (1:800; Molecular Probes, Karlsruhe) als Detektionsreagenz
ersetzt. Nach der Inkubation des zweiten Antikörpers wurde zusätzlich eine DNA160
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Färbung durchgeführt, indem den Zytozentrifugenpräparate der Kernfarbstoff 7AAD
(1:50; Orpegen, Heidelberg) für 30 min. zugesetzt wurde. Als Negativkontrolle diente
ein Biotin-konjugierter Antikörper desselben Isotyps (BD Biosciences, Heidelberg)
anstelle des anti-CTLA-4 Antikörpers, die Färbung von CD3 blieb jedoch unverändert.
Laser-Scanning-Zytometrie (LSC)
Zunächst wurde das Zellareal definiert, indem dessen Grenzen mit Hilfe des
Durchlichtmikroskops bestimmt und die Lokalisation der Zellen durch die
entsprechenden XY-Koordinaten im WinCyte-Programm determiniert wurden. Bei dem
genutzten 20x Objektiv betrug die Größe der Y-Pixel etwa 0,5 μm.
Das LSC besitzt zwei unabhängige Laser. Der Argon-Laser regt FITC an, dessen grüne
Emission zwischen 505 und 540 nm liegt, sowie das orange emittierende 7AAD, der
Helium-Neon-Laser aktiviert dunkelrote Fluorochrome wie Streptavidin-Alexa 647,
dessen Emission bei 647 nm liegt.
Vor dem eigentlichen Scannen der Objektträger wurde ein Probedurchlauf
durchgeführt, um die Einstellungen des LSC zu überprüfen und gegebenenfalls der
jeweiligen Färbung anzupassen. Leichte Korrekturen der PMT- (Photomultiplier Tube)Spannung
und
Detektionsschwelle
(Offset-Rate)
waren
häufig
nötig.
Das
Fluoreszenzsignal der Zellen wird durch mehrere Filter und PMT-Detektoren geleitet.
War die Färbung sehr hell, waren die Intensitäten der Pixel zu hoch und die PMT
musste erniedrigt werden. Bei schwächeren Färbungen musste die PMT entsprechend
erhöht werden. Die Offset-Rate kontrolliert den Hintergrund und musste nur selten
angepasst werden. Die folgende Tabelle zeigt die am häufigsten verwendeten
Einstellungen:
Laser
Farbe
PMT (%)
Detektionsschwelle
Argon
grün (FITC)
47
2000
orange (7AAD)
43
2050
dunkelrot
50
2070
Helium-Neon
Nach erfolgter Einstellung wurde diese für alle Objektträger derselben Färbung
beibehalten. Die Identifikation der Zellen erfolgte durch die Färbung der DNA mit
7AAD und anhand der Zellgröße. So konnten Zelltrümmer und Erythrozyten
161
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
ausgegrenzt werden. Ein großer Nachteil der Nutzung von 7-AAD ist die große
Helligkeit der Färbung, so dass die Verwendung einer zusätzlichen Farbe zur weiteren
Charakterisierung der Zellen in demselben Kanal unmöglich ist. Deshalb musste die
Färbung des T-Zellmoleküls CTLA-4, die für die Immunfluoreszenzmikroskopie und
die Durchflusszytometrie bereits optimiert war, für die LSC modifiziert werden. Bei der
Immunfluoreszenzmikroskopie wurde CTLA-4 mit Rhodamin-TRITC visualisiert,
dieser Farbstoff wurde für die LSC durch Alexa647 ersetzt, welches von dem HeNeLaser gemessen wurde.
CD3 wurde bei beiden Methoden mit dem Farbstoff FITC angefärbt und wie 7-AAD
mit dem Argon-Laser bestimmt. Aber auch eosinophile Granulozyten binden FITC
binden unspezifisch mit hoher Affinität [1]. Sie sind jedoch deutlich größer und
granulärer als T-Lymhozyten. Deshalb erfolgte die Eingrenzung der Population der TLymphozyten über FSC/ SSC, 7-AAD und anschließend über die Expression von CD3.
Auf der so definierten Zellpopulation wurde die Expression von CTLA-4 bestimmt.
Nach der Färbung von CD3 und CTLA-4 wurden jeweils die „Max Pixel“ gemessen,
die Ereignisse mit der stärksten Fluoreszenz. Die folgenden Dotplot-Diagramme zeigen
das Ergebnis der Färbung von PBMC eines Patienten. Neben den CD3+/7AAD+ Zellen
(grün markiert) sind wie erwartet auch zahlreiche CD3-/7AAD+ Zellen zu finden sowie
einige 7AAD-negative Ereignisse, vermutlich kernlose Zelltrümmer.
7AAD-positiv
7AAD-negativ
Die Bestimmung der Fraktion der CTLA-4-positiven T-Lymphozyten erfolgte, wie
bereits
oben
beschrieben,
mittels
einer
Färbung
des
Moleküls
mit
dem
Fluoreszenzfarbstoff Alexa 647. Ein biotinylierter Isotypantikörper, welcher wie der
anti-CTLA-4 Antikörper mit dem Streptavidin-Alexa 647 als Detektionsreagenz gefärbt
wurde, diente der Abgrenzung unspezifischer Bindungen. Die Fraktion Isotyp+/CD3+
wurde von der Fraktion CTLA-4+/CD3+ Zellen subtrahiert.
162
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
CTLA-4+/CD3+
Isotyp+/CD3+
Alexa 647+
/CD3+
Alexa 647/CD3+
Die Ergebnisse der Messung am LSC wurden in Parallelfärbungen mikroskopisch
kontrolliert.
In die Studie wurden 32 Patienten (P001-P032) eingeschlossen, wobei die Patienten
P002 und P029 vorzeitig ausschieden und deshalb nicht ausgewertet wurden, und 8
gesunde Probanden.
FACS-Färbung humaner PBMC
Für die FACS-Färbungen wurden jeweils 106 Zellen eingesetzt. Die Inkubationsschritte
erfolgten auf Eis, gewaschen wurde bei 1200 rpm für 6 min. und bei 4°C. Für die
extrazelluläre Färbung wurden die Zellen zunächst zweimal mit FACS-Puffer
gewaschen, dann wurde 10 min. mit Cohn II γ-Globulin (Sigma, Deisenhofen) geblockt.
Anschließend wurde der Überstand des Hybridoms UCHT-1 (Maus anti-human CD3)
zugesetzt und für 20 min. inkubiert. Die Zellen wurden wieder zweimal gewaschen und
bis zur Aufarbeitung der letzten Probe des jeweiligen Patienten bei 4°C gelagert.
Die Expression von CTLA-4 wurde durch intrazelluläre Färbung bestimmt. Die Zellen
wurden dreimal mit saponinhaltigem Puffer gewaschen, nach dem zweitem Mal wurden
sie 5 min. ruhen gelassen, damit das Paraformaldehyd aus den Zellen diffundieren
konnte. Daraufhin wurden 50 µl des biotinylierten anti-human CTLA-4 Antikörper
(1:50; BD Biosciences, Heidelberg) zugegeben und 45 min. bei 4°C inkubiert. Nach
zweimaligem waschen mit Saponinpuffer erfolgte die Zugabe von Streptavidin-Alexa
647 (1:800 verdünnt in Saponinpuffer), welches ebenfalls 45 min. bei 4°C inkubierte.
Die Zellen wurden dreimal mit Saponinpuffer gewaschen, in FACS-Waschpuffer
aufgenommen und im FACS-Calibur analysiert.
163
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Ergebnisse
Die Messung der Expression von CTLA-4 auf den CD3-positiven T-Zellen erfolgte am
Tag vor (-1) sowie einen (+1), zwei (+2), fünf (+5) und sieben (+7) Tage nach der
geplanten Operation. Dazu wurden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC)
aus heparinisiertem Vollblut isoliert und analysiert. Blut freiwilliger gesunder
Probanden wurde als Kontrolle eingesetzt.
Etablierung einer geeigneten Methode zur Quantifizierung der Expression von CTLA-4
Der Nachweis von CTLA-4 gestaltete sich vor allem dadurch schwierig, dass das
Molekül in sehr geringer Dichte exprimiert wird, auch nach Induktion der Expression
größtenteils intrazellulär vorliegt und dass das auf der Oberfläche vorhandene Protein
rasch durch Endozytose internalisiert wird. Durch intrazelluläre Färbung und Nutzung
eines Signalverstärkungssystems auf der Basis von Biotinyltyramid (TSA) ließ sich das
Signal von CTLA-4 stark amplifizieren. Dieses System kann jedoch nur für die Färbung
des Proteins auf immobilisierten Zellen, z. B. Zytozentrifugenpräparaten, genutzt
werden, nicht aber bei Zellsuspensionen, wie sie für eine FACS-Analyse benötigt
werden.
Zum Nachweis der Expression von CTLA-4 auf den PBMC wurden zunächst drei
verschiedene Methoden auf ihre Eignung überprüft: die FACS-Analyse, die Analyse mit
einem Laser-Scanning-Zytometer (LSC) und die optische Auswertung einer
fluoreszenzmikroskopischen Färbung. Die Etablierung einer Färbung für das LSC stand
dabei im Zentrum, denn das LSC verbindet die Vorteile einer FACS-Messung (hohe
Anzahl ausgewerteter Zellen, hoch standardisiert) und der Fluoreszenzmikroskopie, für
die die Färbung von CD3 und CTLA-4 etabliert war und bei der das genannte
Biotinyltyramidsystem (TSA) zur Amplifikation des CTLA-4- Signals genutzt werden
kann.
Messung der Expression von CTLA-4 auf den PBMC von gesunden Probanden und
Patienten mit der Durchflusszytometrie (FACS)
Die Färbung von CTLA-4 im FACS wurde bei den ersten 10 Patienten parallel zu den
anderen Methoden durchgeführt. Durch den Einsatz von Saponin, welches die Poren der
Zellmembranen öffnet, sollten sowohl oberflächenassoziierte als auch intrazelluläre
Moleküle auf den CD3-positiven T-Lymphozyten erfasst werden. Bei allen Färbungen
lag der prozentuale Anteil der CTLA-4+/CD3+ Zellen unter 2%.
164
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Die Daten wurden mit den Ergebnissen der Oberflächenfärbung und einer
intrazellulären Färbung von CTLA-4 nach Stimulation der Blutzellen verglichen, die
durch die AG Dr. Frank erhoben wurden (Abb. 51; Daten freundlicherweise zur
% CTLA-4+/CD3+
Verfügung gestellt von Dr. J. Frank).
50
30
10
3
2
1
0
-2
OF
IZ_PBS
IZ_PMA
AG Broeker
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 51: Durchflusszytometrische Bestimmung der CTLA-4-Expression auf CD3+ T-Lymphozyten
Die Expression von CTLA-4 auf CD3-positiven T-Lymphozyten wurde durch die AG Frank mittels
Oberflächenfärbung (OF) sowie intrazellulärer Färbung nach Stimulation mit PMA (IZ_PMA) bzw. PBS
als Kontrolle (IZ_PBS) bestimmt. Daten freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. J. Frank.
Der durch intrazelluläre Färbung ohne Stimulation in dieser Arbeit gemessene Anteil der CTLA-4/CD3positiven T-Zellen ist rot eingezeichnet.
Durchflusszytometrisch ließ sich CTLA-4 erst nach mehrstündiger Inkubation der
Zellen und intrazellulärer Färbung nachweisen, nicht jedoch direkt ex vivo, weder mit
einer Oberflächenfärbung noch durch die Färbung von oberflächenassoziiertem und
intrazellulärem CTLA-4. Deshalb wurde dies Verfahren nach der Analyse von 10
Patienten aufgegeben.
Etablierung der LSC-Färbung
Zunächst musste eine Methode gefunden werden, mit der die PBMC auf die
Objektträger gebracht und vom LSC als einzelne Zellen erkannt werden konnten. Dazu
wurden
Tropf-
und
Zytozentrifugenpräparate
auf
ihre
Eignung
untersucht.
Zytozentrifugenpräparate mit geringer Zellzahl, bei denen die Zellen weitgehend separat
auf den Objektträgern verteilt waren, wurden favorisiert. Die Präparate wurden für
mindestens eine Nacht bei -70°C gelagert, bevor sie gefärbt wurden. Stets wurden alle
Präparate
eines
Patienten
synchron
gefärbt
und
mit
denselben
Instrumenteneinstellungen gemessen. Zur Färbung der DNA wurde 7AAD eingesetzt,
auch die Färbung mit Alexa 647 konnte nach Titration für das LSC genutzt werden.
165
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Da die FACS-Analyse ungeeignet war, wurde zum Vergleich mit den Ergebnissen der
LSC als Kontrolle die etablierte Immunfluoreszenzfärbung von Zytozentrifugenpräparaten genutzt mit anschließender Auswertung unter dem Mikroskop. Aus der
Literatur [2] war bekannt, dass die Ergebnisse der beiden Techniken gut korrelieren.
Dies konnten wir durch den Vergleich der Ergebnisse beider Methoden bestätigen.
Offensichtlich ist die LSC-Methode jedoch sensitiver, denn die prozentualen Anteile der
CTLA-4+CD3+ T-Zellen lagen lagen hier regelmäßig über den mikroskopisch
ermittelten Werten.
Messung der Expression von CD3 und CTLA-4 auf den PBMC von gesunden
Probanden und Patienten mit dem Laser-Scanning-Zytometer
Zunächst wurde bei acht gesunden Probanden der prozentuale Anteil der CD3-positiven
T-Zellen an den PBMC bestimmt, danach in dieser Population die CTLA-4exprimierenden Zellen quantifiziert (CTLA-4+CD3+, Abb. 52).
5
60
40
20
0
% CTLA-4+/CD3+
% CD3+
80
4
3
2
1
0
Abb. 52: Messung der Expression von CD3 und CTLA-4 auf PBMC gesunder Probanden mit dem
LSC.
Dargestellt ist der prozentuale Anteil von CD3-positiven T-Zellen (links) und CTLA-4+/CD3+ T-Zellen
(rechts) der PBMC gesunder Probanden.
Auf der Basis der Ergebnisse wurden Normbereiche als Mittelwerte ± 2
Standardabweichungen festgelegt: 59,6 ± 14,8% für den Anteil CD3+ T-Zellen an der
Gesamtzellzahl (PBMC) und 3,1 ± 2,2% für die Fraktion der CTLA-4+ Zellen innerhalb
der CD3+ T-Lymphozytenpopulation. Diese Normbereiche sind in den folgenden
Abbildungen grau unterlegt.
166
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Bei allen Patienten wurde eine Abnahme der Fraktion der CD3+ T-Lymphozyten
festgestellt. Es kristallisierten sich 3 Gruppen mit unterschiedlichen Verläufen heraus,
für die jeweils ein charakteristischer Vertreter in Abbildung 53 dargestellt ist.
A
P010
OP
75
% CD3+
%CD3+
75
50
25
0
-2
0
2
4
6
B
P024
OP
50
25
0
-2
8
0
2
Tag
4
6
8
Tag
C
P015
% CD3+
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 53: Fraktion der CD3+ T-Lymphozyten im Verlauf des Untersuchungszeitraums.
Die Fraktion der CD3+ T-Zellen in den analysierten PBMC war deutlichen individuellen Schwankungen
ausgesetzt. Für jede der 3 Gruppen mit vergleichbaren Verläufen ist ein Vertreter gezeigt: Patient 010 (A)
hatte vor der Operation eine normale Fraktion von T-Zellen, die in den folgenden Tagen bis zu seinem
Tod kontinuierlich abnahm. Patient 024 (B) hatte vor der Operation eine etwas verminderte T-Zellzahl,
die in den folgenden Tagen weiter abnahm, ab dem 5. postoperativen Tag jedoch anstieg. Patient 015 (C)
hatte einen sehr geringen Anteil CD3-positiver Zellen während des gesamten Untersuchungszeitraums.
dieser nahm der Operation geringfügig zu, fiel nach Tag 6 aber wieder ab. Der grau unterlegte Fläche
kennzeichnet den Normbereich der Anteils der CD3-T-Zellen an den PBMC.
Bei 13 Patienten wurde ein steter Abfall des Anteils der CD3+ T-Zellen während des
Untersuchungszeitraums gemessen. Bei den anderen 16 Patienten waren zunächst ein
Abfall, und danach ein Wiederanstieg des prozentualen Anteils der CD3+ T-Zellen zu
beobachten. Unter diesen Patienten zeigten einige bereits zu Untersuchungsbeginn, also
präoperativ, eine stark erniedrigte T-Zellzahl, bei anderen Patienten nahm der Anteil der
CD3+ T-Zellen nach der Operation ab, stieg aber rasch wieder an.
167
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Der Verlauf der CTLA-4 Expression war individuell ebenfalls sehr verschieden. Bei 9
der Patienten blieben die Messwerte im Normbereich (Abb. 54A) oder es traten geringe
Schwankungen auf, die sich im Bereich des Mittelwertes ± 5 Standardabweichungen
bewegten (Abb. 54B).
A
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
6
B
P008
% CTLA-4+/CD3+
% CTLA-4+/CD3+
P014
75
50
25
0
-2
8
OP
0
2
4
6
8
Tag
Tag
Abb. 54: Patienten mit geringen oder moderaten Schwankungen der Expression von CTLA-4.
Dargestellt sind charakteristische Vertreter jener Patienten, deren CTLA-4-Expression im Untersuchungszeitraum keinen (Patient 014; A) oder geringen (Patient 008; B) Schwankungen unterworfen war. Die
grau unterlegte Fläche kennzeichnet den Normbereich der Anteils der CTLA-4+CD3+ T-Zellen.
Bei der überwiegenden Anzahl der Patienten (21 der insgesamt 30 Patienten) hingegen
waren deutliche Veränderungen im prozentualen Anteil der CTLA-4+CD3+ TLymphozyten zu beobachten. Es konnten zwei verschiedene Gruppen unterschieden
werden: Einige Patienten wiesen bereits vor der Operation eine deutlich erhöhte
Frequenz CTLA-4+CD3+ T-Zellen im peripheren Blut auf; zwei charakteristische
Vertreter dieser Gruppe sind in der Abbildung 55 dargestellt.
A
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
Tag
6
8
B
P031
% CTLA-4+/ CD3+
% CTLA-4+/CD3+
P005
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 55: Patienten mit einer präoperativ erhöhten Expression von CTLA-4.
Dargestellt sind Patienten, bei denen die Frequenz CTLA-4+CD3+ T-Zellen bereits vor der Operation
erhöht war. Die Kurvenverläufe waren individuell verschieden. Patient 005 (A) hatte präoperativ einen
sehr hohen Anteil CTLA-4+/ CD3+ T-Zellen, der nach der Operation abfiel und dann konstant blieb. Bei
Patient 031 (B) fiel der Anteil CTLA-4+CD3+ T-Zellen nach der Operation vorübergehend ab, stieg aber
168
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
zum Ende des Beobachtungszeitraums wieder an. Der grau unterlegte Bereich kennzeichnet den
Normbereich des Anteils der CTLA-4+CD3+ T-Zellen.
169
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Bei den meisten Patienten erhöhte sich jedoch der Anteil CTLA-4+CD3+ T-Zellen nach
der Operation. Zwei charakteristische Verläufe finden sich in Abbildung 56. Die
Zunahme des Anteils CTLA-4+ T-Zellen war regelmäßig mit einer starken Erhöhung
der Expressionsdichte verbunden, in den Messwerten der Laserscanning-Zytometrie
erkennbar an der höheren maximalen Intensität der CTLA-4-Färbung.
A
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
Tag
6
8
B
P006
% CTLA-4+/CD3+
% CTLA-4+/CD3+
P007
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 56: Patienten mit einer postoperativ erhöhten Expression von CTLA-4.
Dargestellt sind Patienten, bei denen die Frequenz CTLA-4+CD3+ T-Zellen nach der Operation anstieg.
Auch hier sind die Kurvenverläufe individuell. Bei Patient 007 (A) nahm die Expression von CTLA-4
postoperativ zu, fiel nach Tag 2 wieder ab. Bei Patient 006 (B) hingegen stieg der Anteil CTLA-4+/ CD3+
T-Zellen erst nach Tag 5 an. Der grau unterlegte Fläche kennzeichnet den Normbereich der Anteils der
CTLA-4+CD3+ T-Zellen.
Im Untersuchungszeitraum verstarben zwei Patienten. Patient 010 verstarb am 5.
postoperativen Tag, Patient 019 am 2. postoperativen Tag. Bei Patient 010 war die
Frequenz der CTLA-4+CD3+ T-Zellen bereits präoperativ dramatisch erhöht, bei P019
nahm der Anteil der CTLA-4+CD3+ T-Zellen unmittelbar nach dem chirurgischen
Eingriff zu (Abb. 57).
170
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
A
75
OP
50
25
0
-2
0
2
4
6
B
P019
% CTLA-4+/CD3+
% CTLA-4+/CD3+
P010
8
75
OP
50
25
0
-2
Tag
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 57: Expression von CTLA-4 bei verstorbenen Patienten
Patient 010 (A) und Patient 019 (B) verstarben im Untersuchungszeitraum. Bei P010 war der prozentuale
Anteil der CTLA-4+CD3+ T-Zellen schon vor dem Eingriff stark erhöht, bei P019 stieg der Anteil der
CTLA-4+CD3+ T-Zellen unmittelbar nach der Operation leicht an. Die grau unterlegte Fläche
kennzeichnet den Normbereich der Anteils der CTLA-4+CD3+ T-Zellen.
Eine Übersicht des prozentualen Anteils der CD3+ T-Zellen and den mononukleären
Zellen des peripheren Bluts und der CTLA-4+ Zellen an der T-Zellpopulation bei allen
Patienten ist dem Anhang zu entnehmen.
Aufgrund des Verlaufs der CTLA-4-Expression wurden die Patienten in zwei Gruppen
eingeteilt; innerhalb der zweiten Gruppe ließen sich zwei Untergruppen unterscheiden:
1. Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5SD; n=9)
2. Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression (n=21)
a. Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression
(≥ Mittelwert + 5SD; n=7)
b. Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (<
Mittelwert + 5SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA4-Expression (≥ Mittelwert + 5SD; n=14).
171
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Alle im folgenden angegebenen klinischen Daten wurden freundlicherweise zur
Verfügung gestellt von Prof. Dr. Lehmann, Frau Kiesow, Dr. Feyerherd und Dr.
Gründling aus der Anästhesie. Die immunologischen Parameter wurden von der AG Dr.
Frank durch FACS-Analyse gewonnen und uns ebenfalls zur weiteren Auswertung zur
Verfügung gestellt.
Vergleich der Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4Expression vom Normbereich mit Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4Expression
Diese Gruppen unterschieden sich in einigen klinischen Parametern: Patienten, die
einen großen Anstieg der Expression von CTLA-4 aufwiesen, hatte tendenziell höhere
PCT-Werte und eine höhere Konzentration von LBP im Blut verglichen mit Patienten,
bei denen die CTLA-4-Expression im Norm- bzw. Grenzbereich blieb (Abb. 58). Auch
die postoperativ regelmäßig beobachtete Leukozytose war deutlich ausgeprägter bei den
Patienten, deren Expression von CTLA-4 im Untersuchungszeitraum stark anstieg. Bei
Patienten mit keinen/ geringen Änderungen der Induktion von CTLA-4 sank die
Leukozytenzahl ab dem 5. postoperativen Tag wieder ab, stieg bei Patienten mit großen
Anstieg der Expression von CTLA-4 jedoch weiter an. Die Thrombozytenzahl war
hingegen bei Patienten mit einem starken Anstieg in der Expression von CTLA-4
während
des
gesamten
Untersuchungszeitraums
geringer
als
bei
Patienten
keinen/geringen Abweichungen der CTLA-4-Expression vom Normbereich (Abb. 58).
Eine Übersicht aller getesteten klinischen Parameter ist dem Anhang zu entnehmen.
172
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
A
5
100
4
75
3
2
50
25
1
0
B
LBP
mg/l
μg/l
PCT
-1
1
2
Tag
5
0
7
-1
C
Leukozytenzahl
1
2
Tag
5
7
D
Thrombozytenzahl
20
400
Gpt/l
Gpt/l
300
10
200
100
0
-1
1
2
Tag
5
7
0
-1
1
2
Tag
5
7
keine/geringe Abweichungen der CTLA-4-Expression vom Normbereich
starker Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 58: Vergleich von PCT, LBP, Leukozyten- sowie Thrombozytenzahl bei Patientengruppen,
eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4-Expression
Bestimmt wurden Procalcitonin (PCT), LBP sowie die Zahl der Thrombozyten und Leukozyten im
Untersuchungszeitraum bei Patienten ohne oder mit geringem Anstieg der Expression von CTLA-4
(weiße Balken; n=9) sowie bei Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression, die größer waren
als der Mittelwert ± 5 Standardabweichungen gesunder Probanden (schwarze Balken; n=21; Daten
dargestellt als Mittelwerte ± SD).
Postoperativ konnte bei allen Patienten ein deutlicher Anstieg des prozentualen Anteils
der CD14+ Monozyten/ Makrophagen an den PBMC festgestellt werden (Abb. 59A).
Ab dem 5. postoperativen Tag war dieser jedoch signifikant stärker ausgeprägt bei
Patienten mit großem Anstieg der Expression von CTLA-4 als bei jenen ohne einen
solchen Anstieg. Der Anteil HLA-DR+ Zellen an den CD14+ Monozyten/ Makrophagen
fiel direkt nach der Operation stark ab und blieb bis zum Ende des
Untersuchungszeitraums signifikant erniedrigt (Abb. 59B). Zwischen Patienten mit
starken bzw. geringen Abweichungen der CTLA-4-Expression vom Normbereich
wurden hier keine signifikanten Unterschiede festgestellt.
173
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
75
*
*
50
25
0
-1
1
2
Tag
5
7
B
%HLA-DR+/CD4+
% CD14+/CD45+
A
100
75
50
25
0
-1
1
2
Tag
5
7
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 59: Vergleich des prozentualen Anteils CD14+ und HLA-DR+CD14+ Monozyten/
Makrophagen bei Patientengruppen, eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4-Expression
Dargestellt ist der prozentuale Anteil CD14+ Monozyten/Makrophagen an den CD45+ Leukozyten (A)
sowie der prozentuale Anteil der HLA-DR+CD14+ Monozyten/Makrophagen im Untersuchungszeitraum
bei Patienten ohne oder mit geringem Anstieg der Expression von CTLA-4 (weiße Balken; n=9) sowie
bei Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression, d.h. größer als der Mittelwert ± 5
Standardabweichungen gesunder Probanden (schwarze Balken; n=21). Der grau unterlegte Balken
verdeutlicht den Normbereich (Mittelwert ± 1 Standardabweichung; Daten dargestellt als Mittelwerte ±
SD; * p<0,05)
Der Anteil der CD3+ T-Zellen an den PBMC war bei den Patienten bereits vor dem
chirurgischen Eingriff signifikant erniedrigt. Nach der Operation sank die Frequenz der
CD3+ T-Lymphozyten weiter ab, ab dem 5. postoperativen Tag signifikant stärker bei
den Patienten mit großem Anstieg der Expression von CTLA-4 als bei den Patienten mit
keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich in der
Expression des Proteins (Abb. 60A). Nach dem Eingriff sank der Anteil aktivierter
(HLA-DR+) T-Zellen stark ab. Ab dem 5. postoperativen Tag war dieser Abfall
tendenziell bei den Patienten mit großem Anstieg der Expression von CTLA-4 stärker
als bei jenen ohne deutliche Unterschiede (Abb. 60B).
174
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
100
75
50
*
*
25
0
-1
1
2
Tag
5
7
B
% HLA-DR+/CD3+
%CD3+/CD45+
A
15
10
5
0
-1
1
2
Tag
5
7
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 60: Vergleich des prozentualen Anteils CD3+ und HLA-DR+CD3+ T-Zellen bei
Patientengruppen, eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4-Expression
Dargestellt ist der prozentuale Anteil CD3+ T-Lymphozyten an den CD45+ Leukozyten (A) sowie der
prozentuale Anteil der HLA-DR+CD3+ T-Zellen im Untersuchungszeitraum bei Patienten ohne oder mit
geringem Anstieg der Expression von CTLA-4 (weiße Balken; n=9) sowie bei Patienten mit starkem
Anstieg der CTLA-4-Expression, d.h. größer als der Mittelwert ± 5 Standardabweichungen gesunder
Probanden (schwarze Balken; n=21). Der grau unterlegte Balken verdeutlicht den Normbereich
(Mittelwert ± 1 Standardabweichung; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD; * p<0,05)
Von der Depletion waren vor allem die CD4+ T-Zellen, aber auch die CD8+ T-Zellen
betroffen (siehe Tabelle im Anhang). Bei den CD4+ T-Zellen war die Fraktion naiver
(CD45RA+) bereits vor der Operation erniedrigt und sank nach dem Eingriff weiter
(Abb. 61A). Bei den Patienten mit großem Anstieg der CTLA-4-Expression war ebenso
der Anteil aktivierter (CD38+) CD4+ T-Zellen deutlich herabgesetzt (Abb. 61B), am 1.
postoperativen Tag war er bei beiden Gruppen signifikant niedriger und blieb trotz eines
leichten Anstiegs im gesamten Beobachtungszeitraum unter dem Normbereich.
175
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
50
40
30
20
10
0
B
% CD38+/ CD4+
%CD45RA+/ CD4+
A
-1
1
2
Tag
5
7
75
50
25
0
-1
1
2
Tag
5
7
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 61: Vergleich des prozentualen Anteils naiver (CD45RA+) und aktivierter (CD38+) CD4+ TZellen bei Patientengruppen, eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4-Expression
Dargestellt ist der prozentuale Anteil naiver (CD45RA+, A) und aktivierter (CD38+; B) CD4+ T-Zellen
im Untersuchungszeitraum bei Patienten ohne/ mit geringem Anstieg der Expression von CTLA-4 (weiße
Balken; n=9) sowie bei Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression, d.h. größer als der
Mittelwert ± 5 Standardabweichungen gesunder Probanden (schwarze Balken; n=21). Der grau unterlegte
Balken verdeutlicht den Normbereich (Mittelwert ± 1 Standardabweichung; Daten dargestellt als
Mittelwerte ± SD)
Eine Übersicht über die erfassten Immunzellpopulationen ist dem Anhang zu
entnehmen.
Neben der Quantifizierung verschiedener Zellpopulationen und Oberflächenmarker
direkt aus dem Blut wurden auch PBMC isoliert und entweder mit LPS oder mit PMA
und Ionophor stimuliert. Die dadurch induzierbare Zytokinproduktion wurde auf
Einzelzellebene
durch
intrazelluläre
Fluoreszenzfärbung
durchflusszytometrisch
quantifiziert. Nach Stimulation mit LPS war der prozentuale Anteil der CD14+
Monozyten/Makrophagen, die TNF-α und IL-10 sowie IL-6 produzierten, während des
gesamten Untersuchungszeitraums bei den Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4Expression niedriger als bei Patienten, die keine oder nur geringe Abweichungen in der
Expression des Proteins vom Normbereich zeigten (Abb. 62).
176
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
B
60
100
% IL-6+IL-12-
% TNF-α+IL-10-
A
50
40
30
*
20
10
0
-1
1
2
Tag
5
75
50
25
0
7
-1
1
2
Tag
5
7
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 62: Vergleich der Induzierbarkeit von TNF-α, IL-10, IL-6 und IL-12 durch CD14+ Zellen
nach Stimulation mit LPS bei Patientengruppen, eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4Expression
Dargestellt ist der prozentuale Anteil der CD14+ Zellen im Untersuchungszeitraum bei Patienten ohne/
mit geringem Anstieg der Expression von CTLA-4 (weiße Balken; n=9) sowie bei Patienten mit starkem
Anstieg der CTLA-4-Expression, d.h. größer als der Mittelwert ± 5 Standardabweichungen gesunder
Probanden (schwarze Balken; n=21), die nach Stimulation mit LPS entweder TNF-α, aber kein IL-10
bildeten (A) bzw. die IL-6, jedoch nicht IL-12 produzierten (B) Der grau unterlegte Balken verdeutlicht
den Normbereich (Mittelwert ± 1 Standardabweichung; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD)
Die CD3+ T-Zellen von Patienten mit starkem Anstieg der Expression von CTLA-4
bildeten nach Stimulation mit PMA zu Beginn des Untersuchungszeitraums weniger
TNF-α und IFN-γ, am 7. postoperativen Tag jedoch mehr (Abb. 63).
B
15
10.0
% IL-2-IFN-γ+
% TNF-α+IL-10-
A
10
5
0
-1
1
2
Tag
5
7
7.5
5.0
2.5
0.0
-1
1
2
Tag
5
7
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
Abb. 63: Vergleich der Induzierbarkeit von TNF-α und IFN-γ durch CD3+ Zellen nach Stimulation
mit PMA bei Patientengruppen, eingeteilt aufgrund verschiedener CTLA-4-Expression
Dargestellt ist der prozentuale Anteil der CD3+ T-Zellen im Untersuchungszeitraum bei Patienten ohne/
mit geringem Anstieg der Expression von CTLA-4 (weiße Balken; n=9) sowie bei Patienten mit starkem
Anstieg der CTLA-4-Expression, d.h. größer als der Mittelwert ± 5 Standardabweichungen gesunder
Probanden (schwarze Balken; n=21), die nach Stimulation mit PMA entweder TNF-α, aber kein IL-10
bildeten (A), oder die IFN-γ, jedoch kein IL-2 produzierten (B; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD)
177
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Vergleich der Patienten mit prä- bzw. postoperativem Anstieg der Expression von
CTLA-4
Von den 21 Patienten, die durch einen starken Anstieg der CTLA-4-Expression
charakterisiert wurden, zeigten 7 der Patienten bereits präoperativ eine hohe CTLA-4Expression, die verbleibenden 14 Patienten waren gekennzeichnet durch eine
präoperativ normale oder nur leicht erhöhte, postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA4-Expression.
Die PCT-Serumkonzentration war während des Untersuchungszeitraums tendenziell bei
den Patienten höher, deren Frequenz der CTLA-4+CD3+ T-Zellen schon vor dem
chirurgischen Eingriff erhöht war (Abb. 64), die Serumkonzentration des C-reaktiven
Proteins (CRP) hingegen, welches von Tag 2 bis Tag 7 verstärkt exprimiert wurde, war
bei ihnen vermindert. Auch die Konzentration von IL-6 und die Zahl der Leukozyten
waren an den postoperativen Tagen 5 und 7 bei den Patienten mit einem präoperativ
erhöhten Anteil der CTLA-4+CD3+ T-Zellen geringer als bei jenen Patienten, die erst
nach der Operation eine Induktion von CTLA-4 zeigten.
178
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
CRP
7.5
300
5.0
200
mg/l
µg/l
PCT
2.5
0.0
**
100
-1
1
2
Tag
5
0
7
-1
IL-6
1
2
Tag
5
7
Leukozytenzahl
500
30
gpt/l
pg/ml
400
300
200
*
10
100
0
20
*
-1
1
2
Tag
5
7
0
-1
1
2
Tag
5
7
praeoperativ erhoeht
postoperativ erhoeht
Abb. 64: Vergleich von PCT, CRP, IL-6 und Leukozytenzahl bei Patientengruppen, eingeteilt
aufgrund prä- oder postoperativer CTLA-4-Induktion
Bestimmt wurde Procalcitonin (PCT), CRP und IL-6 sowie die Zahl der Leukozyten im
Untersuchungszeitraum bei Patienten mit präoperativ erhöhter Expression von CTLA-4 (hellgraue
Balken; n=7) sowie bei Patienten mit einem postoperativen Anstieg der CTLA-4-Expression
(dunkelgraue Balken; n=21; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD* p<0,05; **p<0,005)
Der prozentuale Anteil der HLA-DR+ (aktivierten) CD3+ T-Zellen war sowohl vor als
auch direkt nach dem Eingriff bei den Patienten erhöht, deren Frequenz der CTLA4+CD3+ T-Zellen bereits präoperativ erhöht war. Diese Patienten zeigten nach dem
Eingriff einen deutlichen Abfall der CD45RA+ (naiven) CD4+ T-Zellen (Abb.65).
179
A
20
*
10
0
-1
1
2
Tag
5
% CD45RA+CD4+
% HLA-DR+CD3+
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
B
40
30
20
10
0
7
**
**
-1
1
2
Tag
5
7
praeoperativ erhoeht
postoperativ erhoeht
Abb. 65: Vergleich des prozentualen Anteils HLA-DR+CD3+ T-Zellen und naiver (CD45RA+) CD4+
T-Zellen, eingeteilt aufgrund prä- oder postoperativer CTLA-4-Induktion
Dargestellt ist der prozentuale Anteil der HLA-DR+CD3+ T-Zellen und der CD45RA+CD4+ T-Zellen im
Untersuchungszeitraum bei Patienten mit präoperativ erhöhter Expression von CTLA-4 (hellgraue
Balken; n=7) sowie bei Patienten mit einem postoperativen Anstieg der CTLA-4-Expression
(dunkelgraue Balken; n=21; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD* p<0,05; **p<0,005)
Bei Patienten, die präoperativ einen erhöhten Anteil CTLA-4+CD3+ T-Zellen
aufwiesen, ließen sich am Tag vor und am Tag nach der Operation mehr CD14+ Zellen
durch LPS zur Synthese von IL-10 und zum Teil gleichzeitig TNF stimulieren (Abb.
A
5
4
3
2
1
0
-1
1
2
Tag
5
7
% TNF-α+IL-10+
% TNF-α-IL-10+
66).
B
5
4
3 *
2
1
0
-1
1
2
Tag
5
7
praeoperativ erhoeht
postoperativ erhoeht
Abb. 66: Vergleich der Induzierbarkeit von IL-10 bzw. sowohl von IL-10 als auch TNF-α durch
CD14+ Zellen nach Stimulation mit LPS, eingeteilt aufgrund prä- oder postoperativer CTLA-4Induktion
Dargestellt ist der prozentuale Anteil der CD14+ Zellen, die nach Stimulation mit LPS entweder IL-10
allein (A) oder sowohl IL-10 als auch TNF-α bildeten (B) bei Patienten mit präoperativ erhöhter
Expression von CTLA-4 (hellgraue Balken; n=7) sowie bei Patienten mit einem postoperativen Anstieg
der CTLA-4-Expression (dunkelgraue Balken; n=14; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SD* p<0,05)
Die Induzierbarkeit des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α war nach Stimulation
von CD3+ T-Zellen mit PMA perioperativ bei den Patienten supprimiert, die präoperativ
eine gesteigerte Expression von CTLA-4 zeigten. Am Ende des Beobachtungszeitraums
180
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
hingegen war bei ihnen die Induzierbarkeit von IFN-γ stark erhöht im Vergleich zu den
A
15
10
5
0
*
-1
1
2
Tag
5
7
B
15
% IL-2-IFN-γ+
% TNF-α+IL-10
Patienten, die erst nach dem Eingriff CTLA-4 verstärkt exprimierten (Abb. 67).
10
**
5
0
-1
1
2
Tag
5
7
praeoperativ erhoeht
postoperativ erhoeht
Abb. 67: Vergleich der Induzierbarkeit von TNF-α und IFN-γ durch CD3+ Zellen nach Stimulation
mit PMA, eingeteilt aufgrund prä- oder postoperativer CTLA-4-Induktion
Dargestellt ist der prozentuale Anteil der CD3+ T-Zellen, die nach Stimulation mit PMA entweder TNF-α,
aber kein IL-10 bildeten (A), oder die IFN-γ, jedoch kein IL-2 produzierten (B) bei Patienten mit
präoperativ erhöhter Expression von CTLA-4 (hellgraue Balken; n=7) sowie bei Patienten mit einem
postoperativen Anstieg der CTLA-4-Expression (dunkelgraue Balken; n=14; Daten dargestellt als
Mittelwerte ± SD* p<0,05; **p<0,005)
181
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Diskussion
Die Ergebnisse aus den tierexperimentellen Studien zeigen, dass T-Zellen eine wichtige
Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis haben. Überraschend war die schnelle und
starke Induktion von CTLA-4 nach CASP. Die Kinetik der Expression dieses sehr
wichtigen Moleküls sollte deshalb auch beim Menschen untersucht werden. Die LaserScanning-Zytometrie (LSC) erwies sich in umfangreichen Versuchen als optimales
Messverfahren für die Quantifizierung des stets nur in geringer Menge exprimierten
Moleküls.
Die ersten Versuche der Kombination von sehr schneller, hoch auflösender
Multicoloranalyse mit Bildgebung wurden Ende der 1980er Jahre publiziert [3], seit
1991 ist die LSC allgemein verfügbar [4]. Die LSC ermöglicht wie die FACS-Analyse
die Untersuchung kleiner Zellpopulationen, ist ebenso sensitiv und standardisierbar.
Darüber hinaus ermöglicht die LSC, die Zellmorphologie über den forward (FSC) und
side scatter (SSC) hinaus zu analysieren. Es bietet die Möglichkeit, einzelne Zellen in
verschiedenen, aufeinander folgenden Färbungen zu charakterisieren, denn sie gehen
bei
der
Analyse
nicht
verloren
und
die
Zellen
können
wie
bei
der
Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Ein Nachteil der LSC ist, dass sie sehr
zeitintensiv und aufwändig ist. Bei unserer Anwendung ließ sich der letztgenannte
Nachteil
durch
den
Einsatz
eines
Färbeverfahrens
mit
Signalamplifikation
kompensieren, so dass für die CTLA-4-Bestimmung unsere LSC-Messungen viel
sensitiver waren als die Durchflusszytometrie, bei der sich das Verstärkungsverfahren
nicht anwenden lässt. Von anderen Arbeitsgruppen wurde die LSC bisher am häufigsten
eingesetzt für Untersuchungen des DNA-Gehalts, der Proliferation und der Apoptose
verschiedener Zellpopulationen, seltener für die Typisierung von Gewebeschnitten und
peripheren Blutleukozyten. Das letztgenannte Anwendungsgebiet basiert auf dem
Triggern von Scatter-Signalen, spezifischer Immunfluoreszenz [6, 7] oder nukleärer
DNA. Anders als beim Durchflusszytometer benötigt das LSC ein fluoreszierendes
Signal für die Zellerkennung. Dies kann entweder Propidiumiodid oder 7-AAD sein.
Auch das von uns etablierte System basiert auf Detektierung der Zellen durch DNAFärbung mit Amino-Actinomycin D (7-AAD) [8-10].
Zur Kontrolle der Ergebnisse wurde parallel eine zweite Methode eingesetzt. Diese
sollte zunächst die FACS-Analyse sein, denn mehrere Publikationen zeigten eine sehr
gute Korrelation zwischen beiden Techniken [2, 11]. In unserem Fall erwies sich die
Durchflusszytometrie jedoch für die Quantifizierung von CTLA-4 als ungeeignet,
182
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
deshalb
war
die
etablierte
Immunfluoreszenzfärbung
mit
anschließender
mikroskopischer Auszählung der Zellen durch zwei unabhängige Personen die Methode
der Wahl.
Die Patienten, die für die Studie ausgewählt wurden, unterzogen sich großen
abdominalen Operationen. Die Studie basierte auf der Hypothese, dass der damit
verbundene physische und psychische Stress Änderungen im zellulären und im
humoralen Abwehrsystem, u.a. in der Zusammensetzung der Leukozytenpopulationen,
bewirkt, die zu einer postoperativen Immunsuppression beitragen.
Bisher wurde bereits gezeigt, dass diese Immunparalyse gekennzeichnet ist durch
Defekte in der Funktion von Monozyten wie einer beeinträchtigten Antigenpräsentation,
einhergehend mit einer stark überwiegenden Th2-Antwort. Mehrere Autoren zeigten,
dass große Verletzungen eine Immunsuppression induzieren, der die Patienten für die
Entwicklung einer Sepsis und ausgedehnter Gewebezerstörung prädisponiert [12-14].
Naive T-Zellen benötigen zwei Signale zur Aktivierung: ein TCR-vermitteltes und
eines, welches durch die Bindung von CD28 an seine Liganden CD80 oder CD86
entsteht. CTLA-4 bindet diese Liganden ebenfalls, jedoch mit höherer Affinität.
Während CD28 konstitutiv auf den meisten T-Zellen exprimiert wird, wird die
Expression von CTLA-4 nach Aktivierung der T-Zelle induziert und bewirkt die
Inhibierung verschiedener T-Zellfunktionen. Eine verstärkte Expression von CTLA-4
könnte somit zu einer weiteren Verschlechterung Aktivierbarkeit der T-Zellen führen.
Das Expressionsprofil von CTLA-4 zeigte bei der überwiegenden Zahl der untersuchten
Patienten deutliche Veränderungen, meist transiente starke Erhöhungen. Es wurde
bereits berichtet, dass CTLA-4 bei septischen Patienten stark induziert wird [15]. Auch
bei akuter Malaria war die CTLA-4-Expression auf T-Zellen sehr stark erhöht und in
ihrem Ausmaß mit der Schwere der Erkrankung korreliert [16]. Die Ergebnisse dieser
Pilotstudie deuten darauf hin, dass dies bei großen chirurgischen Eingriffen ähnlich ist:
Die Konzentration von Procalcitonin (PCT), einem etablierten Marker für die Diagnose
bakterieller Infektionen und Sepsis, war bei Patienten, die einen starken Anstieg der
CTLA-4-Expression aufwiesen, stärker und länger anhaltend erhöht als bei Patienten
mit unveränderter CTLA-4-Expression.
Verschiedene Autoren berichteten von Verschiebungen von Leukozytenpopulationen
nach großen Operationen. Die Gesamtzahl der Leukozyten stieg postoperativ stark an,
fiel jedoch bei der Gruppe, die durch einen starken Anstieg der CTLA-4-Expression
charakterisiert wurde, im weiteren Verlauf nicht ab, sondern stieg weiter an. Die
183
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
beobachtete Leukozytose wird vor allem einer Neutrophilie zugeschrieben [17, 18]. Es
wurde
weiterhin
gezeigt,
dass
chirurgischer
Stress
und
Sepsis
mit
einer
Lymphozytopenie assoziiert sind, welche ihre Ursache in der selektiven Depletion von
T-Zellen hat [19-21]. Venet et al. [22] berichteten zudem, dass CD3 bei septischen
Patienten deutlich vermindert exprimiert wird. Die meisten Patienten zeigten bereits vor
der Operation eine verminderte Frequenz CD3+ T-Zellen. Eine mögliche Ursache
hierfür ist der Gesundheitszustand der Patienten. Beim überwiegenden Anteil war ein
Tumor der Grund für den chirurgischen Eingriff, und es ist bekannt, dass das
Immunsystem der Patienten als Folge der Krebserkrankung schon vor der Operation
stark beeinflusst ist [23].
Die Depletion der CD3+ T-Zellen nach der Operation war bei der Gruppe mit starkem
Anstieg der CTLA-4-Expression stärker ausgeprägt als bei den Patienten, deren
Frequenz der CTLA-4+CD3+ T-Zellen keinen oder geringen Änderungen unterworfen
waren. Einige Autoren fanden eine Korrelation zwischen der Dauer und des Umfangs
der T-Zell-Apoptose und dem Schweregrad der Erkrankung [17, 24]. CTLA-4 scheint
die T-Zellen vor Apoptose zu schützen [25]. Demnach haben die T-Lymphozyten, die
das Molekül exprimieren, einen Überlebensvorteil und können akkumulieren. Venet et
al. (2004) [26] beobachteten bei septischen Patienten einen relativen Anstieg
CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen (Treg), die häufig CTLA-4 coexprimierten. Diese
könnten aufgrund des chirurgischen Stresses eine Resistenz gegenüber Apoptose
entwickeln, während CD4+CD25- T-Zellen anfälliger für den programmierten Zelltod
werden. In dieser Studie beobachteten wir aber gleichzeitig mit der Zunahme des
Anteils CTLA-4-exprimierender T-Zellen eine Starke Erhöhung der Intensität der
Expression von CTLA-4. Deshalb muss es bei den meisten Patienten ebenfalls zu einer
Neusynthese des Moleküls gekommen sein. Dies könnte sowohl auf aktivierten TEffektorzellen als auch auf (Treg) stattgefunden haben, ähnlich wie im CASP-Modell
(Christian Pötschke, persönliche Mitteilung).
Der prozentuale Anteil der Monozyten/ Makrophagen war bei den Patienten gegenüber
den Kontrollen vor dem Eingriff relativ erhöht mit weiteren postoperativen
Steigerungen. Der wahrscheinlichste Grund hierfür ist die beobachtete Lymphopenie.
HLA-DR wird von T-Lymphozyten nach Aktivierung exprimiert. Der Anteil HLADR+CD3+ T-Zellen war am Ende des Beobachtungszeitraums bei der Gruppe, die einen
starken Anstieg der CTLA-4-Expression aufwies, geringer. Einen Abfall HLADR+CD3+ T-Zellen beschrieben Rokyta et al. (2002) bei septischen Patienten, jedoch
184
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
nicht bei Patienten, die keine Sepsis entwickelten. Es wäre denkbar, dass entweder
aktivierte T-Zellen apoptotisch werden oder die Aktivierung der T-Zellen durch das
CTLA-4 unterbunden wird.
Die Expression von HLA-DR auf Monozyten/ Makrophagen ist bedeutend für ihre
Funktion als antigenpräsentierende und entzündungsfördernde Zellen. Verschiedene
Autoren berichteten, dass sowohl durch chirurgischen Stress als auch bei einer Sepsis
oder Trauma die Expression von HLA-DR auf Monozyten stark vermindert ist [27, 28].
Auch in unserer Studie zeigte sich unmittelbar nach der Operation eine deutliche
Abnahme der Expression von HLA-DR Ein wichtiger Beitrag dazu wird IL-10
zugeschrieben, denn dieses Zytokin bewirkt eine Herabsetzung der Expression von
MHC Klasse II [29].
Wir beobachteten, dass eine lange Verweildauer der Patienten auf der Intensivstation
aufgrund postoperativer Komplikationen sowie die Entwicklung eines letalen septischen
Schocks bei einem Patienten (P010) mit einer dramatischen Abnahme der CD3+ TZellen und einer deutlichen Zunahme CTLA-4+ T-Zellen assoziiert war. Auch
Hotchkiss et al. [30] berichteten, dass bei septischen Patienten der Grad der Apoptose
der CD3+ T-Zellen mit der Schwere der Sepsis korreliert. Dies unterstützt die
Hypothese, dass Faktoren wie die Depletion von T-Zellen und eine verstärkte Induktion
von CTLA-4 zur Immunparalyse beitragen.
Der Vergleich der Patienten mit keinen/geringen Änderungen der CTLA-4-Expression
mit denen, die einen starken Anstieg der Expression dieses Moleküls aufwiesen, zeigte
nur wenige signifikante Unterschiede. Neben geringen Patientenzahl dieser Pilotstudie
liegt eine weitere Ursache darin, dass bei einzelnen Patienten CTLA-4 zu
unterschiedlichen Zeitpunkten verstärkt exprimiert wurde.
Wir vermuteten, dass Patienten, deren T-Zellen bereits vor der Operation vermehrt
CTLA-4 exprimieren, sich von denen unterscheiden, bei denen das Molekül erst durch
die Operation und ihre Folgen induziert wird. Deshalb wurde eine weitere Unterteilung
der Patienten vorgenommen: zum einen jene Patienten, die bereits vor der Operation
eine erhöhte Expression des Moleküls zeigten und andererseits diejenigen, die erst nach
dem Eingriff CTLA-4 induzierten. Bei der überwiegenden Zahl der Patienten, die vor
der Operation eine erhöhte Expression von CTLA-4 zeigten, sank die Frequenz CTLA4+CD3+ T-Zellen nach dem Eingriff ab. Damit einhergehend waren deutlich
185
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
abgeschwächte Entzündungszeichen wie die Konzentration von CRP und IL-6 sowie
die Anzahl der Leukozyten. Diese Patienten hatten offenbar eine bestehende
Erkrankung, die sich durch die Operation besserte.
Auch die Zusammensetzung der T-Zellpopulationen und deren Aktivierungszustand
wiesen Abweichungen von denen jener Patienten auf, die CTLA-4 erst nach dem
Eingriff induzierten. Dies könnte eine Folge der vorbestehenden Erkrankung und ihrer
Behandlung, aber auch von psychischem Stress sein. Der präoperative Anstieg CTLA4+ T-Zellen war assoziiert mit einer erhöhten Frequenz HLA-DR+ T-Zellen. Dies
verweist auf das Expressionsprofil von CTLA-4, denn das Molekül wird von aktivierten
T-Zellen induziert.
Einhergehend mit einer präoperativ erhöhten Frequenz CTLA-4+CD3+ T-Zellen war ein
massiver Abfall der Konzentration naiver T-Zellen im Blut direkt nach dem Eingriff.
Dies kann nur zum Teil mit einem vermehrten Anteil aktivierter T-Zellen erklärt
werden, da dieser am Ende des Untersuchungszeitraums rückläufig ist und keinen
Unterschied zu dem der Patienten aufwies, die CTLA-4 erst nach dem Eingriff
induzierten. Im Vergleich dazu ist der Anteil CD45RA+ T-Zellen auch am 7.
postoperativen Tag dramatisch vermindert. Am wahrscheinlichsten ist, dass diese Zellen
besonders empfindlich für den programmierten Zelltod sind und deshalb deletiert
wurden.
CTLA-4 wirkt hemmend auf die Aktivitäten der T-Zellen. Dies passt zu unserem
Befund, dass bei den Patienten, die das Molekül schon vor der Operation vermehrt
exprimierten, perioperativ TNF-α in T-Zellen weniger induzierbar war. Am Ende des
Untersuchungszeitraums, bei dem die Expression von CTLA-4 meist nicht mehr
gesteigert war und das Protein dadurch keinen Einfluss mehr auf die T-Zellfunktionen
nahm, reagierten die T-Zellen auf Stimulation mit der vermehrten Bildung von IFN-γ.
CTLA-4 ist ein wichtiges regulatorisches Molekül der T-Zellen. Da es dämpfend auf die
Funktionen von T-Zellen wie die Ausschüttung pro-inflammatorischer Mediatoren
wirkt, könnte eine präoperativ gesteigerte Expression des Moleküls für die Patienten
durchaus von Vorteil sein, wenn dadurch die Entzündungsantwort des Körpers als
Reaktion auf den chirurgischen Eingriff abgeschwächt wird. Wird CTLA-4 jedoch nach
der Operation induziert, also in einer Phase der generalisierten Immunsuppression, in
der die Antigenpräsentation und Aktivierung von T(h1)-Zellen ohnehin gestört ist,
zeigen sich die Anzeichen einer Immunparalyse wie die Depletion von CD3+ T-Zellen
186
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
sowie eine anhaltende Leukozytose deutlich länger. Dies prädisponiert für postoperative
Komplikationen.
Die Identifikation neuer diagnostischer und prognostischer Parameter zur Beurteilung
des Immunstatus bei Trauma und Sepsis ist ein wichtiges Ziel der aktuellen
Sepsisforschung. Da es sich um eine akute Erkrankung handelt, ist insbesondere eine
schnelle Messung der Marker notwendig. Obwohl sich in dieser Pilotstudie andeutet,
dass die Bestimmung CTLA-4-Expression für die Beurteilung des Immunstatus nützlich
sein könnte,
erscheint sie aktuell ungeeignet für die Routinediagnostik, denn die
notwendigen hochsensitiven Messverfahren sind sehr aufwändig, zeitintensiv und
schwer standardisierbar.
187
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
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189
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Anhang
Übersicht: Einteilung der Gruppen auf der Grundlage der Expression von
CTLA-4
A
75
P004
P014
P021
P022
P024
P025
50
25
0
-2
0
2
4
6
% CTLA-4+/ CD3+
% CTLA-4+/ CD3+
1. Patienten mit keinen/ geringen Änderungen der Expression von CTLA-4
P003
P008
P015
P020
50
25
0
-2
8
B
75
0
Tag
2
4
6
8
Tag
Abb. 68: Patienten mit geringen oder moderaten Schwankungen der Expression von CTLA-4.
Dargestellt sind die Patienten, deren CTLA-4-Expression im Untersuchungszeitraum keinen (Mittelwert ±
1 SD) geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (Mittelwert ± 5SD)
% CTLA-4+/ CD3+
2. Patienten mit präoperativ hoher Expression von CTLA-4
75
P001
P005
P010
P012
P027
P028
P031
50
25
0
-2
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 69: Patienten mit einer präoperativ erhöhten Expression von CTLA-4.
Gezeigt sind die Patienten, bei denen die Frequenz der CTLA-4+CD3+ T-Zellen bereits vor der Operation
erhöht (≥ Mittelwert + 5SD) war.
190
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
A
75
P006
P007
P008
P009
P011
P013
P016
50
25
0
-2
0
2
4
Tag
6
8
% CTLA-4+/ CD3+
% CTLA-4+/ CD3+
3. Patienten mit postoperativer Induktion der Expression von CTLA-4
B
75
P017
P018
P019
P023
P026
P030
P032
50
25
0
-2
0
2
4
6
8
Tag
Abb. 70: Patienten mit einer postoperativ erhöhten Expression von CTLA-4.
Dargestellt sind die Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5SD),
postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5SD). Aus Gründen besserer
Übersichtlichkeit sind die Patientenkurven auf zwei Abbildungen verteilt.
191
P001
37,4
35,8
45,2
39
37,6
P012
34,8
28
25,9
24
23,7
P022
48
32,7
44,7
35,6
13,1
Tag
-1
1
2
5
7
Tag
-1
1
2
5
7
Tag
-1
1
2
5
7
P023
0,7
18,4
4
5,5
1,2
P013
43,7
24,9
15,4
12,3
16,8
P003
41,1
37,4
29,9
18,3
44,2
P024
29,9
13,7
16,7
18,6
37,5
P014
10,6
7,5
11,6
16,2
12,4
P004
41,3
28
26,5
36,1
37,4
P025
30,7
28,8
28,7
6,1
3,6
P015
6,4
15,6
7,8
22,4
17,4
P005
34,1
9,1
18,6
7,5
11,6
P026
39,6
11,5
1,8
5,4
5,6
P016
7,5
9,1
2,4
11,4
18,7
P006
62,3
55,3
61,4
40,4
49,2
P027
1,3
2,6
9,3
9,9
2,9
P017
12,3
3
2,2
3,5
2,9
P007
35,6
20,4
23,1
25,4
8,7
P028
10,5
20,8
17,2
13,9
9
P018
8,1
7,1
13,2
4,5
5,4
P008
46,1
37,6
29,5
19,1
22,6
P030
42,5
20,1
33,2
17,8
16,9
P019
15,8
26
P009
58,9
26,1
42,6
24,3
30,5
P031
3,6
17
14,3
14,5
5,3
P020
39,3
38,5
30,7
14,9
10,3
P010
55,7
43
15,8
6,5
1. Prozentualer Anteil der CD3+ T-Zellen an den mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut der Patienten
Gesamtübersicht: Anteil der CD3+ T-Zellen und der CTLA-4+CD3+ T-Zellen im peripheren Blut der Patienten,
basierend auf den LSC-Messungen
P032
20,6
15,7
1,6
16
1,3
P021
56,9
33,7
32,4
42,3
21,6
P011
31,8
12,3
20,8
7,2
10
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
192
P001
14,1
1,4
5,4
3,5
0,3
P012
10,9
11,8
10,6
7,4
13,5
P022
0,7
5,1
2,8
1,3
5,2
Tag
-1
1
2
5
7
Tag
-1
1
2
5
7
Tag
-1
1
2
5
7
P023
0
0
14,6
0,9
5,9
P013
4,5
2,2
7,7
18,4
17,1
P003
1
3,4
3,6
2
7
P024
0,2
6,3
5,4
2,5
4,4
P014
3,4
1,4
4
2
2,7
P004
0,4
3,8
0,5
2,2
3,4
P025
0
3,7
2,2
2,4
4,8
P015
5,5
5,8
5,5
2,8
9
P005
43,8
41,6
8,1
8,3
8,5
P026
0
18,1
0,8
29,9
17,3
P016
5,1
20,3
18,2
6,3
23,4
P006
6,1
2,5
7,4
9,8
25,3
P027
20,4
1,2
0,6
1,4
5,7
P017
3,6
16,8
10,5
0,4
12,4
P007
1,1
31,5
36,3
3,8
4,7
P028
27,3
28,3
18
23,6
24,9
P018
6,2
2,9
4,2
10,7
3,4
P008
5,6
6,8
1,4
8,2
7,9
P030
9,2
29
32,1
32,5
32,3
P019
0,6
10,3
P009
4,7
63,2
5,2
5,9
21,5
2. Prozentualer Anteil der CTLA-4+ Zellen an den CD3+ T-Zellen aus dem peripheren Blut der Patienten
P031
21,1
12
5,8
2,9
17,1
P020
1,7
6,5
4,9
5,9
7,6
P010
47
27,6
42,8
50,9
P032
7,6
9,3
2,9
34
7
P021
1,5
3,7
6,1
2,3
1,2
P011
1,1
7,4
3,8
12,7
3
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
193
0,7564
0,333 ± 0,249
0,850 ± 0,452
1,985 ± 0,465
16,15 ± 2,857
136,8 ± 4,969
89,85 ± 25,13
5,480 ± 3,818
6,940 ± 7,007
6,624 ± 2,285
234,2 ± 63,67
1,010 ± 0,030
5,416 ± 4,053
13,23 ± 7,462
39,35 ± 4,573
71,16 ± 6,873
9,840 ± 3,848
7,674 ± 3,571
1,064 ± 0,685
1,577 ± 0,674
15,70 ± 3,180
138,9 ± 3,621
86,22 ± 17,28
5,311 ± 2,349
18,30 ± 32,98
7,078 ± 1,534
247,8 ± 74,40
1,017 ± 0,033
7,467 ± 11,76
13,74 ± 9,246
36,86 ± 5,049
67,11 ± 4,197
12,17 ± 5,299
5,778 ± 1,391
TSH
T3
fT4
Natrium
Kreatinin
Harnstoff
CRP
Leukozyten
Thrombozyten
INR
IL-6
LBP
Albumin
Protein
Bilirubin
Glukose
0,1390
0,1917
0,1154
0,1989
0,8762
0,4962
0,5807
0,6143
0,5913
0,1457
0,9038
0,6985
0,2690
0,7180
0,0719
8,971 ± 4,892
9,057 ± 3,363
71,30 ± 6,507
39,96 ± 4,437
12,83 ± 8,305
4,689 ± 3,200
1,010 ± 0,027
233,5 ± 38,50
5,357 ± 1,823
6,014 ± 7,914
6,743 ± 5,861
92,29 ± 32,99
136,3 ± 3,546
15,46 ± 1,813
1,941 ± 0,300
1,018 ± 0,397
0,439 ± 0,322
präoperativ hohe
CTLA-4- Expression c
6,917 ± 2,473
10,26 ± 4,152
71,08 ± 7,322
39,02 ± 4,789
13,47 ± 7,303
5,841 ± 4,556
1,009 ± 0,032
209,1 ± 58,66
7,257 ± 2,281
7,438 ± 6,757
4,800 ± 2,114
88,54 ± 21,23
137,1 ± 5,708
16,43 ± 3,220
2,010 ± 0,550
0,751 ± 0,469
0,283 ± 0,177
postoperativ hohe
CTLA-4- Expression d
0,2367
0,5191
0,9488
0,6750
0,8632
0,5651
0,9486
0,3957
0,0711
0,6765
0,2897
0,7598
0,7440
0,5395
0,7660
0,2244
0,1886
p-Wert
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
b
a
PCT
0,3300
p-Wert
starker Anstieg der
CTLA-4- Expression b
Parameter
kein/ geringer Anstieg
der CTLA-4Expressiona
0,303 ± 0,199
Vergleich klinischer Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag -1)
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
194
0,5411
1,725 ± 1,823
0,593 ± 0,501
1,149 ± 1,483
13,75 ± 3,207
134,3 ± 3,759
80,86 ± 20,99
3,871 ± 1,733
89,34 ± 30,59
10,43 ± 5,073
127,3 ± 50,67
1,149 ± 0,135
248,3 ± 267,2
35,70 ± 13,60
22,23 ± 5,772
39,76 ± 9,250
19,14 ± 12,12
9,038 ± 2,560
1,035 ± 0,658
0,766 ± 0,369
11,96 ± 2,027
135,2 ± 2,728
75,44 ± 12,49
4,111 ± 1,517
109,4 ± 30,72
10,91 ± 3,683
158,0 ± 43,99
1,194 ± 0,101
181,3 ± 155,9
46,74 ± 19,58
20,81 ± 5,062
38,79 ± 7,002
13,31 ± 9,023
8,333 ± 2,510
TSH
T3
fT4
Natrium
Kreatinin
Harnstoff
CRP
Leukozyten
Thrombozyten
INR
IL-6
LBP
Albumin
Protein
Bilirubin
Glukose
0,4929
0,2066
0,7812
0,5274
0,0853
0,4900
0,3756
0,1258
0,8012
0,1121
0,7220
0,4795
0,5285
0,1357
0,4545
8,657 ± 2,381
12,41 ± 6,248
39,39 ± 10,76
21,64 ± 6,782
30,97 ± 12,10
194,3 ± 245,4
1,146 ± 0,194
117,9 ± 29,04
9,000 ± 4,076
71,77 ± 19,27
4,500 ± 2,124
77,00 ± 23,89
134,9 ± 4,947
14,32 ± 4,825
0,770 ± 0,360
0,860 ± 0,688
1,880 ± 2,608
präoperativ hohe
CTLA-4- Expression c
9,229 ± 2,711
22,51 ± 13,09
39,94 ± 8,834
22,53 ± 5,453
38,06 ± 14,10
275,4 ± 282,2
1,150 ± 0,102
132,0 ± 59,07
11,15 ± 5,501
98,12 ± 31,93
3,557 ± 1,489
82,79 ± 20,07
134,1 ± 3,198
13,51 ± 2,421
1,339 ± 1,791
0,460 ± 0,331
1,647 ± 1,398
postoperativ hohe
CTLA-4- Expression d
0,6418
0,0706
0,9004
0,7495
0,2704
0,5258
0,9595
0,5601
0,3734
0,0607
0,2497
0,5651
0,6633
0,6175
0,4217
0,0842
0,7905
p-Wert
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
b
a
PCT
0,0537
p-Wert
starker Anstieg der
CTLA-4- Expression b
Parameter
kein/ geringer Anstieg
der CTLA-4Expression a
1,320 ± 1,063
Vergleich klinischer Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +1)
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
195
0,1768
1,842 ± 2,060
1,010 ± 0,833
1,026 ± 0,552
12,67 ± 2,828
132,8 ± 4,211
77,89 ± 17,82
5,389 ± 2,262
182,2 ± 71,79
13,71 ± 5,416
125,9 ± 46,62
1,111 ± 0,128
109,2 ± 85,73
57,92 ± 27,50
23,16 ± 5,585
43,91 ± 7,027
12,47 ± 8,460
8,879 ± 2,603
1,656 ± 0,737
0,901 ± 0,597
12,25 ± 3,469
133,4 ± 3,321
69,67 ± 13,98
5,078 ± 1,511
196,9 ± 47,70
12,66 ± 4,231
165,0 ± 51,77
1,101 ± 0,099
72,09 ± 41,26
48,73 ± 13,91
19,86 ± 3,509
41,01 ± 3,844
7,856 ± 3,914
8,767 ± 4,019
TSH
T3
fT4
Natrium
Kreatinin
Harnstoff
CRP
Leukozyten
Thrombozyten
INR
IL-6
LBP
Albumin
Protein
Bilirubin
Glukose
0,9296
0,1338
0,2601
0,1168
0,3557
0,2316
0,8419
0,0558
0,6122
0,5835
0,7115
0,2352
0,6860
0,7464
0,6097
8,129 ± 2,227
13,71 ± 10,44
44,00 ± 7,872
23,50 ± 4,404
45,56 ± 21,48
98,44 ± 87,17
1,136 ± 0,190
121,4 ± 27,92
10,93 ± 5,091
144,7 ± 73,26
6,586 ± 2,779
80,14 ± 24,88
135,3 ± 3,592
12,46 ± 3,630
1,007 ± 0,522
1,393 ± 1,067
2,190 ± 2,948
präoperativ hohe
CTLA-4- Expression c
9,231 ± 2,695
11,75 ± 7,175
43,95 ± 6,570
22,97 ± 6,082
63,22 ± 28,46
105,9 ± 75,70
1,091 ± 0,078
126,2 ± 54,07
15,21 ± 4,909
207,1 ± 62,20
4,985 ± 1,899
80,38 ± 18,71
132,2 ± 4,811
12,88 ± 2,283
1,050 ± 0,569
0,737 ± 0,556
1,535 ± 1,431
postoperativ hohe
CTLA-4- Expression d
0,3684
0,6248
0,9871
0,8415
0,1698
0,7598
0,4635
0,8326
0,0829
0,0592
0,1433
0,9806
0,1499
0,7548
0,8725
0,0932
0,5074
p-Wert
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
b
a
PCT
0,0712
p-Wert
starker Anstieg der
CTLA-4- Expression b
Parameter
kein/ geringer Anstieg
der CTLA-4Expression a
0,853 ± 0,711
Vergleich klinischer Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +2)
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
196
0,0895
0,895 ± 0,702
1,615 ± 1,327
1,603 ± 0,667
12,43 ± 1,963
135,2 ± 3,870
71,58 ± 24,21
8,116 ± 3,300
119,2 ± 58,40
11,84 ± 5,568
176,8 ± 75,37
1,029 ± 0,050
35,48 ± 22,54
48,05 ± 18,99
21,16 ± 3,410
47,45 ± 6,069
12,84 ± 12,08
8,555 ± 2,141
1,603 ± 0,832
1,204 ± 0,741
11,94 ± 4,442
136,1 ± 5,085
66,33 ± 14,92
7,711 ± 3,070
103,7 ± 47,97
8,467 ± 1,645
210,4 ± 58,62
1,064 ± 0,074
30,36 ± 23,51
34,04 ± 15,39
21,41 ± 4,865
45,26 ± 7,550
9,022 ± 3,917
7,067 ± 1,429
TSH
T3
fT4
Natrium
Kreatinin
Harnstoff
CRP
Leukozyten
Thrombozyten
INR
IL-6
LBP
Albumin
Protein
Bilirubin
Glukose
0,0689
0,3679
0,4154
0,8769
0,0650
0,5876
0,1364
0,2497
0,0885
0,4944
0,7594
0,5568
0,5793
0,6874
0,1706
8,929 ± 2,666
15,80 ± 20,49
50,33 ± 3,327
22,50 ± 3,271
41,97 ± 17,00
20,23 ± 23,37
1,039 ± 0,075
153,9 ± 72,69
9,100 ± 2,884
86,07 ± 58,08
8,417 ± 2,460
75,17 ± 28,22
136,7 ± 3,352
12,60 ± 1,486
1,743 ± 0,772
1,341 ± 0,528
1,288 ± 1,033
präoperativ hohe
CTLA-4- Expression c
8,354 ± 1,891
11,47 ± 6,143
46,12 ± 6,677
20,55 ± 3,417
50,85 ± 19,83
41,56 ± 18,67
1,023 ± 0,032
196,7 ± 77,12
13,32 ± 6,180
134,5 ± 53,92
7,977 ± 3,707
69,92 ± 23,19
134,3 ± 3,987
12,35 ± 2,220
1,533 ± 0,633
1,751 ± 1,592
0,714 ± 0,426
postoperativ hohe
CTLA-4- Expression d
0,5809
0,4836
0,1659
0,2569
0,3577
0,0468
0,5133
0,2429
0,1078
0,0930
0,7958
0,6735
0,1921
0,8076
0,5436
0,5530
0,0980
p-Wert
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
b
a
PCT
0,9818
p-Wert
starker Anstieg der
CTLA-4- Expression b
Parameter
kein/ geringer Anstieg
der CTLA-4Expression a
0,469 ± 0,227
Vergleich klinischer Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +5)
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
197
0,0793
0,665 ± 0,421
1,662 ± 1,444
1,639 ± 0,811
13,64 ± 2,436
135,1 ± 2,644
70,84 ± 21,78
7,642 ± 3,063
126,5 ± 68,52
14,12 ± 7,576
269,5 ± 117,6
1,052 ± 0,062
33,38 ± 23,24
43,92 ± 17,20
21,69 ± 5,291
48,83 ± 6,510
11,16 ± 9,633
10,08 ± 3,241
2,057 ± 1,843
1,490 ± 0,701
14,91 ± 4,274
136,3 ± 4,743
72,22 ± 16,07
7,800 ± 3,160
92,18 ± 65,90
9,378 ± 1,457
294,9 ± 66,59
1,171 ± 0,210
20,22 ± 14,63
32,19 ± 16,32
25,08 ± 5,020
51,54 ± 6,422
8,911 ± 3,499
7,611 ± 3,195
TSH
T3
fT4
Natrium
Kreatinin
Harnstoff
CRP
Leukozyten
Thrombozyten
INR
IL-6
LBP
Albumin
Protein
Bilirubin
Glukose
0,0700
0,5057
0,3106
0,1200
0,1020
0,1351
0,0290
0,5533
0,0768
0,2210
0,9006
0,8672
0,3843
0,3237
0,6392
11,37 ± 3,667
11,08 ± 13,67
51,38 ± 4,842
23,62 ± 3,955
32,52 ± 13,10
17,32 ± 9,818
1,027 ± 0,042
254,3 ± 90,17
8,517 ± 1,396
64,52 ± 50,34
8,200 ± 1,903
69,67 ± 21,64
135,7 ± 0,817
14,35 ± 1,700
2,057 ± 1,076
1,858 ± 0,504
0,752 ± 0,525
präoperativ hohe
CTLA-4- Expression c
9,485 ± 2,990
11,20 ± 7,832
47,65 ± 7,003
20,80 ± 5,724
48,30 ± 16,94
39,56 ± 24,17
1,064 ± 0,067
276,5 ± 131,1
16,70 ± 7,897
155,2 ± 56,34
7,385 ± 3,513
71,38 ± 22,70
134,8 ± 3,158
13,31 ± 2,706
1,447 ± 0,614
1,571 ± 1,731
0,625 ± 0,382
postoperativ hohe
CTLA-4- Expression d
0,2504
0,9813
0,2571
0,2936
0,0804
0,0669
0,2320
0,7144
0,0238
0,0037
0,6041
0,8783
0,5448
0,4007
0,1311
0,6992
0,5585
p-Wert
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
b
a
PCT
0,5551
p-Wert
starker Anstieg der
CTLA-4- Expression b
Parameter
kein/ geringer Anstieg
der CTLA-4Expression a
0,397 ± 0,175
Vergleich klinischer Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +7)
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
198
CD3-HLA-DRCD14+
CD3-HLADR+CD14+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
HLA-DR+
Zellen
aktivierte T-
T-Zellen
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
12,39 ± 3,197
1,913 ± 0,363
2,538 ± 1,913
59,00 ± 6,058
21,81 ± 3,253
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
35,21 ± 4,383
11,75 ± 4,114
8,013 ± 3,684
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
61,98 ± 5,429
CD45+
Makrophagen
CD3+CD16/56-
14,65 ± 3,286
CD15-CD14+
Monozyten/
T-Zellen
Kontrollen
Marker
Zellpopulation
18,29 ± 7,734
5,453 ± 4,173
2,557 ± 1,970
48,39 ± 10,60
16,32 ± 7,242
30,63 ± 9,717
11,44 ± 6,799
9,287 ± 6,223
50,71 ± 10,55
22,10 ± 7,236
Tag -1
Patienten
0,0433
0,0274
0,9800
0,0106
0,0453
0,2056
0,9033
0,5854
0,0063
0,0079
p-Wert
14,42 ± 8,277
28,60 ± 11,93
2,037 ± 1,648
31,84 ± 12,29
12,86 ± 7,914
19,87 ± 7,853
14,94 ± 9,609
10,59 ± 5,816
33,18 ± 12,49
38,20 ± 12,73
Tag +1
Patienten
Vergleich der Leukozytenpopulationen bei Patienten und gesunden Probanden (Tag -1 und Tag +1)
0,5037
<0.0001
0,4477
<0.0001
0,0037
<0.0001
0,3696
0,2438
<0.0001
<0.0001
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
199
5,688 ± 2,430
24,69 ± 4,956
26,14 ± 6,007
18,16 ± 5,303
4,057 ± 3,124
17,56 ± 8,100
33,71 ± 9,678
12,07 ± 4,755
0,1806
0,0239
0,0431
0,0033
5,663 ± 5,605
9,847 ± 4,479
28,36 ± 11,80
9,877 ± 9,877
0,9906
<0.0001
0,6120
0,0003
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression
(≥ Mittelwert + 5 SD)
a
aktivierte CTL
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
200
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-
DR+CD14+
T-Zellen
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
12,39 ± 3,197
1,913 ± 0,363
2,538 ± 1,913
59,00 ± 6,058
21,81 ± 3,253
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
35,21 ± 4,383
11,75 ± 4,114
8,013 ± 3,684
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
61,98 ± 5,429
CD45+
Makrophagen
CD3+CD16/56-
14,65 ± 3,286
CD15-CD14+
Monozyten/
T-Zellen
Kontrollen
Marker
Zellpopulation
16,12 ± 9,599
32,33 ± 12,67
1,700 ± 1,305
28,40 ± 12,56
11,67 ± 6,376
17,93 ± 7,227
11,47 ± 8,270
9,359 ± 4,594
29,73 ± 12,37
42,81 ± 12,87
Tag +2
Patienten
0,2902
<0.0001
0,1348
<0.0001
0,0001
<0.0001
0,9261
0,4515
<0.0001
<0.0001
p-Wert
18,20 ± 11,57
31,22 ± 15,46
1,497 ± 1,161
29,12 ± 12,10
10,25 ± 6,093
20,24 ± 9,623
12,20 ± 9,292
6,728 ± 3,583
29,50 ± 11,79
45,18 ± 12,20
Tag +5
Patienten
Vergleich der Leukozytenpopulationen bei Patienten und gesunden Probanden (Tage +2 bis +7)
0,1722
<0.0001
0,0464
<0.0001
<0.0001
0,0002
0,8954
0,3781
<0.0001
<0.0001
p-Wert
19,76 ± 11,26
26,50 ± 14,58
1,604 ± 1,086
29,15 ± 11,79
10,70 ± 7,021
18,93 ± 6,613
11,54 ± 9,487
7,664 ±3,665
30,39 ± 11,90
40.65 ± 11,23
Tag +7
Patienten
0,0786
<0.0001
0,0628
<0.0001
0,0001
<0.0001
0,9511
0,8143
<0.0001
<0.0001
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
201
5,688 ± 2,430
24,69 ± 4,956
26,14 ± 6,007
18,16 ± 5,303
3,593 ± 2,987
12,26 ± 7,375
27,43 ± 10,60
9,600 ± 4,634
0,0776
<0.0001
0,7437
<0.0001
4,600 ± 5,972
14,10 ± 8,723
29,63 ± 14,25
9,948 ± 4,685
0,6205
0,0024
0,5067
0,0001
4,518 ± 5,126
14,82± 10,50
30,37 ± 12,31
10,00 ± 4,252
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression
(≥ Mittelwert + 5 SD)
a
aktivierte CTL
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,5389
0,0152
0,3567
<0.0001
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
202
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-DR+
CD14+
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
CD3+HLA-DR-
CD4-CD8+CD3+
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
T-Zellen
nicht aktivierte
T-Zellen
zytotoxische
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
CD3+CD16/56-
CD45+
Makrophagen
T-Zellen
CD15-CD14+
Marker
Monozyten/
Zellpopulation
203
15,50 ± 4,468
8,400 ± 6,188
2,844 ± 2,173
48,09 ± 12,16
16,73 ± 6,675
29,76 ± 9,923
8,589 ± 5,222
10,36 ± 5,803
50,96 ± 10,06
22,13 ± 7,276
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
19,49 ± 8,587
4,190 ± 2,085
2,433 ± 1,919
48,52 ± 10,19
16,14 ± 7,624
31,00 ± 9,851
12,66 ± 7,133
8,829 ± 6,476
50,60 ± 10,99
22,09 ± 7,399
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
0,2011
0,0087
0,6090
0,9201
0,8420
0,7531
0,1351
0,5473
0,9352
0,9884
p-Wert
17,14 ± 11,72
3,643 ± 2,163
3,600 ± 2,555
50,84 ± 10,12
17,73 ± 8,862
31,94 ± 10,71
11,89 ± 4,192
11,60 ± 8,163
53,69 ± 10,98
20,39 ± 9,567
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
20,66 ± 6,753
4,464 ± 2,070
1,850 ± 1,246
47,36 ± 10,40
15,35 ± 7,151
30,54 ± 9,780
13,05 ± 8,348
7,443 ± 5,250
49,06 ± 11,07
22,94 ± 6,296
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
Vergleich der Leukozytenpopulationen bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag -1)
0,3904
0,4086
0,0456
0,4750
0,5144
0,7663
0,7341
0,1713
0,3773
0,4695
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
16,76 ± 10,36
5,433 ± 4,555
CD4+CD38+CD8-
CD4-CD38+CD8+
29,28 ± 9,069
11,64 ± 4,319
3,467 ± 2,153
17,91 ± 7,198
35,61 ± 9,500
12,25 ± 5,021
0,1155
0,7274
0,1010
0,7544
4,086 ± 2,310
15,83 ± 7,274
38,99 ± 10,49
10,47 ± 5,810
3,157 ± 2,087
18,95 ± 7,197
33,93 ± 8,879
13,14 ± 4,543
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
aktivierte CTL
T-Helferzellen
aktivierte
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,3647
0,3621
0,2605
0,2607
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
204
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-DR+
CD14+
T-Zellen
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
11,74 ± 3,746
32,46 ± 10,93
1,989 ± 0,796
31,46 ± 10,95
13,90 ± 7,643
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
4,700 ± 4,502
11,27 ± 7,399
13,66 ± 5,217
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
32,86 ± 10,08
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
38,46 ± 10,33
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
CD3+CD16/56-
CD45+
Makrophagen
T-Zellen
CD15-CD14+
Marker
Monozyten/
Zellpopulation
15,57 ± 9,441
26,95 ± 12,20
2,057 ± 1,919
32,00 ± 13,07
12,41 ± 8,170
4,490 ± 5,136
16,51 ± 10,17
9,276 ± 5,667
33,31 ± 13,61
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
38,09 ± 13,87
0,2534
0,2533
0,9193
0,9130
0,6446
0,9164
0,1751
0,0572
0,9284
0,9441
p-Wert
20,53 ± 12,04
22,70 ± 11,15
3,357 ± 2,620
28,57 ± 8,224
12,36 ± 7,590
18,73 ± 7,538
20,16 ± 11,41
11,34 ± 6,068
32,04 ± 9,432
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
37,56 ± 8,683
13,09 ± 7,091
29,07 ± 12,54
1,407 ± 1,064
33,72 ± 14,90
12,44 ± 8,724
21,51 ± 8,967
14,69 ± 9,389
8,243 ± 5,382
33,95 ± 15,58
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
38,36 ± 16,15
Bestimmung der Leukozytenpopulationen bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +1)
0,0885
0,2701
0,0239
0,4086
0,9841
0,4896
0,2550
0,2471
0,7707
0,9045
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
205
aktivierte CTL
6,200 ± 3,991
10,46 ± 4,981
27,66 ± 14,19
8,389 ± 3,287
5,433 ± 6,245
9,586 ± 4,350
28,66 ± 11,00
10,51 ± 5,702
0,7379
0,6343
0,8348
0,3072
8,900 ± 9,629
9,086 ± 3,394
33,30 ± 11,97
6,443 ± 1,698
3,700 ± 2,738
9,836 ± 4,857
26,34 ± 10,13
12,55 ± 5,941
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,0707
0,7196
0,1779
0,0163
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
206
CD14+CD45+
CD3+CD16/56-
Makrophagen
T-Zellen
CD14-
CD3+HLA-
DR+CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-
DR+CD14+
T-Zellen
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
13,08 ± 6,979
33,93 ± 8,675
1,611 ± 1,137
28,88 ± 13,15
13,04 ± 6,629
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
15,91 ± 4,705
6,856 ± 2,958
11,34 ± 5,148
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
31,04 ± 12,19
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
39,54 ± 11,04
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD15-
Monozyten/
CD19-
Marker
Zellpopulation
17,49 ± 10,44
31,62 ± 14,25
1,740 ± 1,399
28,19 ± 12,63
11,06 ± 6,334
18,84 ± 8,052
13,54 ± 9,083
8,465 ± 4,151
29,14 ± 12,71
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
44,29 ± 13,61
0,2595
0,6568
0,8106
0,8937
0,4470
0,3214
0,0417
0,1201
0,7078
0,3682
p-Wert
16,70 ± 8,922
32,17 ± 11,67
2,129 ± 1,738
26,56 ± 11,41
10,17 ± 4,116
18,39 ± 9,075
10,16 ± 2,833
10,36 ± 2,734
28,23 ± 10,22
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
41,54 ± 13,24
17,92 ± 11,49
31,32 ± 15,91
1,531 ± 1,206
29,06 ± 13,61
11,53 ± 7,373
19,08 ± 7,829
15,36 ± 10,79
7,446 ± 4,510
29,62 ± 14,24
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
45,76 ± 14,11
Bestimmung der Leukozytenpopulationen bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +2)
0,8114
0,9021
0,3764
0,6841
0,6595
0,8589
0,2312
0,1386
0,8221
0,5233
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
207
aktivierte CTL
3,956 ± 1,929
12,51 ± 9,527
26,47 ± 12,38
8,233 ± 3,166
3,430 ± 3,389
12,15 ± 6,472
27,87 ± 10,02
10,22 ± 5,114
0,6692
0,9055
0,7481
0,2950
2,871 ± 1,691
11,61 ± 6,608
27,01 ± 7,461
8,500 ± 4,745
3,731 ± 4,060
12,44 ± 6,651
28,33 ± 11,43
11,14 ± 5,245
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,6023
0,7941
0,7878
0,2828
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
208
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-DR+
CD14+
T-Zellen
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
14,50 ± 6,742
27,58 ± 9,374
2,100 ± 1,248
36,31 ± 8,317
13,31 ± 6,881
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
21,97 ± 6,202
8,500 ± 3,165
8,311 ± 4,984
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
36,42 ± 7,049
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
37,57 ± 6,551
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
CD3+CD16/56-
CD45+
Makrophagen
T-Zellen
CD15-CD14+
Marker
Monozyten/
Zellpopulation
19,87 ± 12,99
32,86 ± 17,49
1,225 ± 1,039
25,89 ± 12,30
8,875 ± 5,324
19,47 ± 10,87
13,87 ± 10,66
6,015 ± 2,597
26,38 ± 12,28
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
48,61 ± 12,70
0,2549
0,4043
0,0589
0,0291
0,0687
0,5279
0,1537
0,1117
0,0310
0,0211
p-Wert
16,81 ± 13,11
32,44 ± 20,83
1,443 ± 0,962
27,71 ± 13,06
8,629 ± 3,427
21,87 ± 13,56
13,06 ± 8,386
6,700 ± 2,124
28,16 ± 13,85
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
42,37 ± 13,26
21,52 ± 13,15
33,08 ± 16,35
1,108 ± 1,097
24,91 ± 12,30
9,008 ± 6,241
18,18 ± 9,492
14,30 ± 12,01
5,646 ± 2,829
25,42 ± 11,84
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
51,97 ± 11,51
Bestimmung der Leukozytenpopulationen bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +5)
0,4552
0,9401
0,5063
0,6392
0,8840
0,4836
0,8111
0,4013
0,6476
0,1085
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
209
aktivierte CTL
4,444 ± 3,561
15,93 ± 10,37
29,69 ± 14,25
10,00 ± 3,645
4,670 ± 6,870
13,28 ± 8,034
29,60 ± 14,62
9,925 ± 5,172
0,9270
0,4586
0,9879
0,9690
3,857 ± 4,862
12,59 ± 8,111
32,54 ± 16,04
8,529 ± 5,999
5,108 ± 7,894
13,65 ± 8,299
28,02 ± 14,21
10,68 ± 4,755
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,7088
0,7852
0,5236
0,3901
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
210
CD14-
CD3+HLA-DR+
CD14-
CD3-HLA-DR-
CD14+
CD3-HLA-DR+
CD14+
T-Zellen
aktivierte
T-Zellen
HLA-DR+
Monozyten
HLA-DR-
Monozyten
nicht aktivierte
CD3+HLA-DR-
14,34 ± 10,24
22,91 ± 11,56
2,033 ± 1,576
36,81 ± 10,11
12,73 ± 6,638
CD4-CD8+CD3+
zytotoxische
T-Zellen
21,90 ± 7,479
8,967 ± 3,036
8,744 ± 3,408
CD4+CD8-CD3+
CD19+
CD3-CD16/56-
CD19-
CD3-CD16/56+
38,47 ± 10,63
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
31,99 ± 8,911
T-Helferzellen
B-Zellen
NK-Zellen
CD19-
CD3+CD16/56-
CD45+
Makrophagen
T-Zellen
CD15-CD14+
Marker
Monozyten/
Zellpopulation
22,32 ± 11,05
28,20 ± 15,82
1,400 ± 0,727
25,52 ± 10,95
9,737 ± 7,164
17,52 ± 5,849
12,75 ± 11,23
7,153 ± 3,758
26,57 ± 10,69
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
44,75 ± 9,929
0,0796
0,3802
0,1529
0,0149
0,3003
0,1022
0,3334
0,2916
0,0106
0,0030
p-Wert
23,80 ± 14,07
26,03 ± 18,82
1,417 ± 0,615
26,10 ± 9,322
8,883 ± 3,350
18,32 ± 7,245
9,017 ± 2,413
9,367 ± 5,010
28,95 ± 9,023
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
41,87 ± 7,833
21,64 ± 9,943
29,20 ± 14,98
1,392 ± 0,796
25,25 ± 11,97
10,13 ± 8,472
17,15 ± 5,384
14,48 ± 13,28
6,131 ± 2,672
25,47 ± 11,54
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
46,08 ± 10,78
Bestimmung der Leukozytenpopulationen bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher CTLA-4-Expression (Tag +7)
0,7035
0,6970
0,9481
0,8808
0,7350
0,6972
0,3386
0,0803
0,5249
0,4049
p-Wert
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
211
aktivierte CTL
5,533 ± 4,196
15,41 ± 12,94
28,24 ± 14,47
10,37 ± 3,401
4,037 ± 5,553
14,54 ± 9,523
31,38 ± 11,44
9,826 ± 4,677
0,4811
0,8414
0,5393
0,7599
3,083 ± 1,780
17,40 ± 10,57
38,68 ± 8,075
7,683 ± 4,051
4,477 ± 6,653
13,22 ± 9,140
28,01 ± 11,40
10,82 ± 4,755
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
CD4-CD38+CD8+
CD4+CD38+CD8-
aktivierte
T-Helferzellen
CD45RO+CD4+
CD45RA-
T-Gedächtnis-
zellen
CD45RO-CD4+
CD45RA+
T-Helferzellen
naive
0,6250
0,3886
0,0558
0,1819
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
212
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
11,24 ± 5,446
5,571 ± 3,546
0,210 ± 0,412
0,162 ± 0,124
6,662 ± 4,379
9,657 ± 4,681
0,219 ± 0,282
0,924 ± 0,829
52,38 ± 10,75
1,100 ± 1,636
0,067 ± 0,220
0,329 ± 0,302
51,96 ± 11,26
0,500 ± 0,576
0,371 ± 0,455
0,738 ± 0,491
5,344 ± 3,043
0,122 ± 0,259
0,178 ± 0,083
4,233 ± 2,494
8,689 ± 5,559
0,211 ± 0,337
0,578 ± 0,233
50,27 ± 10,50
1,333 ± 1,447
0,033 ± 0,050
0,400 ± 0,378
51,13 ± 10,37
0,733 ± 0,748
0,344 ± 0,477
1,156 ± 1,376
LPS TNFα-IL-10-CD14+
LPS TNFα+IL-10-CD14+
LPS TNFα-IL-10+CD14+
LPS TNFα+IL-10+CD14+
LPS IL-6-IL-12-CD14+
LPS IL-6+IL-12-CD14+
LPS IL-6-IL-12+CD14+
LPS IL-6+IL-12+CD14+
PMA TNFα-IL-10-CD3+
PMA TNFα+IL-10-CD3+
PMA TNFα-IL-10+CD3+
PMA TNFα+IL-10+CD3+
PMA IL-2-IFNγ-CD3+
PMA IL-2+IFNγ-CD3+
PMA IL-2-IFNγ+CD3+
PMA IL-2+IFNγ+CD3+
0,2250
0,8844
0,3607
0,8524
0,5859
0,6592
0,7144
0,6238
0,2327
0,9473
0,6271
0,1325
0,7298
0,5635
0,8685
0,2936
p-Wert
0,886 ± 0,644
0,371 ± 0,431
0,329 ± 0,111
54,67 ± 10,99
0,413 ± 0,398
0
0,643 ± 0,276
55,67 ± 9,354
0,729 ± 0,512
0,243 ± 0,428
8,343 ± 5,411
5,414 ± 2,171
0,229 ± 0,180
0,300 ± 0,619
4,229 ± 3,468
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
9,800 ± 4,439
0,664 ± 0,403
0,371 ± 0,483
0,586 ± 0,694
50,60 ± 11,55
0,264 ± 0,224
0,100 ± 0,266
1,329 ± 1,978
50,73 ± 11,34
1,021 ± 0,952
0,207 ± 0,194
10,31 ± 4,336
7,286 ± 5,106
0,129 ± 0,073
0,164 ± 0,279
6,243 ± 3,513
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
11,96 ± 5,905
213
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
Parameter
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
9,033 ± 4,406
CTLA-4-Expression (Tag -1)
0,3432
0,3480
0,4490
0,2731
0,3787
0,3330
0,4598
0,7923
0,3764
0,3693
0,0820
0,4911
0,2287
0,4061
p-Wert
Bestimmung der Induktion verschiedener immunologisch relevanter Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
4,386 ± 2,712
0,319 ± 0,256
0,238 ± 0,132
16,34 ± 13,48
12,29 ± 8,163
0,243 ± 0,387
0,557 ± 0,319
35,24 ± 13,76
1,352 ± 1,315
0,019 ± 0,040
0,586 ± 0,603
35,16 ± 12,78
0,914 ± 0,784
1,071 ± 1,728
1,295 ± 1,048
6,667 ± 5,213
0,133 ± 0,050
0,189 ± 0,105
11,04 ± 5,983
15,67 ± 7,439
0,044 ± 0,053
0,500 ± 0,357
34,64 ± 8,146
2,144 ± 2,024
0,033 ± 0,050
0,622 ± 0,576
34,67 ± 10,05
1,511 ± 1,800
1,311 ± 2,034
1,944 ± 1,818
LPS TNFα-IL-10-CD14+
LPS TNFα+IL-10-CD14+
LPS TNFα-IL-10+CD14+
LPS TNFα+IL-10+CD14+
LPS IL-6-IL-12-CD14+
LPS IL-6+IL-12-CD14+
LPS IL-6-IL-12CD14+
LPS IL-6+IL-12+CD14+
PMA TNFα-IL-10-CD3+
PMA TNFα+IL-10-CD3+
PMA TNFα-IL-10+CD3+
PMA TNFα+IL-10+CD3+
PMA IL-2-IFNγ-CD3+
PMA IL-2+IFNγ-CD3+
PMA IL-2-IFNγ+CD3+
PMA IL-2+IFNγ+CD3+
0,2254
0,7436
0,2103
0,9194
0,8789
0,4141
0,2104
0,9053
0,6673
0,1402
0,2963
0,2709
0,3321
0,0415
0,1238
0,5313
p-Wert
1,343 ± 0,700
0,886 ± 0,908
0,786 ± 0,970
33,90 ± 9,871
0,543 ± 0,282
0,043 ± 0,053
0,729 ± 0,535
33,61 ± 13,50
0,443 ± 0,199
0,371 ± 0,525
8,429 ± 4,668
16,81 ± 11,93
0,186 ± 0,090
0,386 ± 0,280
2,986 ± 1,536
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
23,30 ± 10,79
1,271 ± 1,209
1,164 ± 2,046
0,979 ± 0,705
35,79 ± 14,32
0,607 ± 0,723
0,007 ± 0,027
1,664 ± 1,488
36,05 ± 14,32
0,614 ± 0,357
0,179 ± 0,299
14,22 ± 8,967
16,10 ± 14,61
0,264 ± 0,145
0,286 ± 0,248
5,086 ± 2,940
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
24,90 ± 14,60
0,8873
0,7372
0,6078
0,7588
0,8247
0,0525
0,1270
0,7124
0,2554
0,2929
0,1282
0,9123
0,2070
0,4130
0,0948
0,8008
p-Wert
214
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
24,37 ± 13,19
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
21,27 ± 9,606
Parameter
CTLA-4-Expression (Tag +1)
Bestimmung der Induktion verschiedener immunologisch relevanter Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
4,550 ± 2,779
0,260 ± 0,250
0,200 ± 0,181
17,02 ± 11,00
16,01 ± 10,33
0,145 ± 0,154
0,640 ± 0,658
33,92 ± 12,23
1,250 ± 0,824
0,020 ± 0,041
0,910 ± 1,261
33,78 ± 12,25
0,665 ± 0,476
0,560 ± 0,648
1,700 ± 1,604
7,022 ± 3,461
0,178 ± 0,120
0,289 ± 0,197
9,311 ± 5,240
18,81 ± 5,728
0,089 ± 0,117
0,733 ± 0,686
35,53 ± 11,82
2,656 ± 1,809
0,022 ± 0,044
1,211 ± 1,393
33,63 ± 12,62
1,400 ± 1,387
1,022 ± 1,347
2,506 ± 1,866
LPS TNFα-IL-10-CD14+
LPS TNFα+IL-10-CD14+
LPS TNFα-IL-10+CD14+
LPS TNFα+IL-10+CD14+
LPS IL-6-IL-12-CD14+
LPS IL-6+IL-12-CD14+
LPS IL-6-IL-12+CD14+
LPS IL-6+IL-12+CD14+
PMA TNFα-IL-10-CD3+
PMA TNFα+IL-10-CD3+
PMA TNFα-IL-10+CD3+
PMA TNFα+IL-10+CD3+
PMA IL-2-IFNγ-CD3+
PMA IL-2+IFNγ-CD3+
PMA IL-2-IFNγ+CD3+
PMA IL-2+IFNγ+CD3+
0,0848
0,2180
0,0411
0,9774
0,5692
0,8960
0,0072
0,7418
0,7298
0,3396
0,4544
0,0571
0,2429
0,3595
0,0497
0,1716
p-Wert
2,486 ± 2,470
0,614 ± 0,596
0,514 ± 0,349
34,21 ± 10,05
1,671 ± 1,959
0,043 ± 0,053
1,329 ± 1,090
33,60 ± 9,779
0,614 ± 0,393
0,200 ± 0,141
12,86 ± 5,438
18,24 ± 12,10
0,229 ± 0,189
0,243 ± 0,151
4,486 ± 2,307
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
27,34 ± 8,685
1,277 ± 0,686
0,531 ± 0,697
0,746 ± 0,527
33,54 ± 13,67
0,500 ± 0,278
0,008 ± 0,028
1,208 ± 0,690
34,08 ± 13,75
0,654 ± 0,780
0,115 ± 0,157
17,70 ± 12,05
16,35 ± 10,81
0,185 ± 0,182
0,269 ± 0,296
4,585 ± 3,093
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
30,08 ± 14,25
0,1096
0,7918
0,3115
0,9100
0,0441
0,0657
0,7637
0,9353
0,9020
0,2511
0,3306
0,7246
0,6171
0,8289
0,9419
0,6508
p-Wert
215
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
29,12 ± 12,41
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
22,67 ± 8,763
Parameter
CTLA-4-Expression (Tag +2)
Bestimmung der Induktion verschiedener immunologisch relevanter Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
7,105 ± 10,23
0,310 ± 0,329
0,255 ± 0,242
17,34 ± 11,81
18,91 ± 12,09
0,175 ± 0,231
0,490 ± 0,361
32,28 ± 12,49
2,085 ± 1,644
0,060 ± 0,082
1,310 ± 0,979
30,61 ± 13,53
1,260 ± 1,971
0,880 ± 1,427
2,805 ± 1,873
7,244 ± 3,968
0,144 ± 0,133
0,189 ± 0,145
8,556 ± 3,739
20,23 ± 5,560
0,100 ± 0,123
1,089 ± 0,902
40,51 ± 8,983
2,811 ± 1,838
0,033 ± 0,050
2,144 ± 2,434
37,59 ± 12,04
1,367 ± 1,219
1,022 ± 1,532
2,822 ± 2,179
LPS TNFα-IL-10-CD14+
LPS TNFα+IL-10-CD14+
LPS TNFα-IL-10+CD14+
LPS TNFα+IL-10+CD14+
LPS IL-6-IL-12-CD14+
LPS IL-6+IL-12-CD14+
LPS IL-6-IL-12+CD14+
LPS IL-6+IL-12+CD14+
PMA TNFα-IL-10-CD3+
PMA TNFα+IL-10-CD3+
PMA TNFα-IL-10+CD3+
PMA TNFα+IL-10+CD3+
PMA IL-2-IFNγ-CD3+
PMA IL-2+IFNγ-CD3+
PMA IL-2-IFNγ+CD3+
PMA IL-2+IFNγ+CD3+
0,9828
0,8099
0,8825
0,1957
0,1934
0,3775
0,2977
0,0872
0,0154
0,3707
0,7570
0,0396
0,4556
0,1600
0,9690
0,1190
p-Wert
3,586 ± 2,196
1,429 ± 2,162
1,186 ± 1,470
32,31 ± 13,07
1,886 ± 1,101
0,071 ± 0,076
2,443 ± 2,367
35,46 ± 12,44
0,371 ± 0,125
0,171 ± 0,198
14,11 ± 9,981
17,63 ± 10,59
0,371 ± 0,315
0,343 ± 0,382
3,286 ± 2,339
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
29,14 ± 11,49
2,385 ± 1,611
0,585 ± 0,786
1,300 ± 2,251
29,69 ± 14,21
1,000 ± 0,784
0,054 ± 0,088
1,892 ± 1,167
30,56 ± 12,67
0,554 ± 0,431
0,177 ± 0,255
21,48 ± 12,69
17,18 ± 12,84
0,192 ± 0,175
0,292 ± 0,312
9,162 ± 12,25
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
29,56 ± 16,17
0,1778
0,2158
0,9055
0,6908
0,0507
0,6601
0,4899
0,4179
0,2934
0,9612
0,2015
0,9387
0,1160
0,7528
0,2302
0,9525
p-Wert
216
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
29,42 ± 14,38
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
21,50 ± 3,841
Parameter
CTLA-4-Expression (Tag +5)
Bestimmung der Induktion verschiedener immunologisch relevanter Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
6,242 ± 6,041
0,268 ± 0,291
0,184 ± 0,083
15,06 ± 11,81
15,43 ± 8,715
0,179 ± 0,207
0,521 ± 0,369
33,45 ± 11,60
1,426 ± 1,237
0,026 ± 0,045
0,995 ± 1,084
31,67 ± 10,76
1,174 ± 2,334
0,705 ± 0,938
2,179 ± 1,723
5,822 ± 3,233
0,133 ± 0,071
0,167 ± 0,071
8,056 ± 3,265
15,40 ± 5,328
0,078 ± 0,109
0,611 ± 0,582
41,19 ± 7,933
1,556 ± 0,957
0
1,122 ± 1,188
40,49 ± 8,815
0,700 ± 0,361
0,322 ± 0,244
2,422 ± 1,917
LPS TNFα-IL-10-CD14+
LPS TNFα+IL-10-CD14+
LPS TNFα-IL-10+CD14+
LPS TNFα+IL-10+CD14+
LPS IL-6-IL-12-CD14+
LPS IL-6+IL-12-CD14+
LPS IL-6-IL-12CD14+
LPS IL-6+IL-12+CD14+
PMA TNFα-IL-10-CD3+
PMA TNFα+IL-10-CD3+
PMA TNFα-IL-10+CD3+
PMA TNFα+IL-10+CD3+
PMA IL-2-IFNγ-CD3+
PMA IL-2+IFNγ-CD3+
PMA IL-2-IFNγ+CD3+
PMA IL-2+IFNγ+CD3+
0,7389
0,2430
0,5539
0,0422
0,7802
0,7849
0,0828
0,6216
0,1827
0,9934
0,0950
0,5912
0,1848
0,8473
0,0973
p-Wert
2,433 ± 0,973
1,417 ± 1,389
1,967 ± 3,936
31,62 ± 8,714
0,883 ± 0,445
0,033 ± 0,052
1,617 ± 1,781
34,45 ± 8,942
0,300 ± 0,200
0,133 ± 0,151
12,47 ± 8,950
15,92 ± 8,829
0,150 ± 0,054
0,117 ± 0,204
5,233 ± 5,413
präoperativ hohe
CTLA-4Expression c
22,05 ± 5,566
2,062 ± 2,003
0,377 ± 0,383
0,808 ± 1,121
31,69 ± 11,92
1,046 ± 1,293
0,023 ± 0,044
1,338 ± 0,973
32,98 ± 12,95
0,623 ± 0,390
0,200 ± 0,231
16,79 ± 8,611
14,67 ± 13,28
0,200 ± 0,091
0,339 ± 0,304
6,708 ± 6,464
postoperativ hohe
CTLA-4Expression d
26,24 ± 13,79
0,6746
0,0198
0,3283
0,9891
0,7705
0,6591
0,6617
0,8062
0,0749
0,5296
0,3285
0,8376
0,2348
0,1251
0,6347
0,4881
p-Wert
217
b
Patienten mit keinen/geringen Abweichungen in der CTLA-4-Expression vom Normbereich (alle Werte < Mittelwert + 5 SD)
Patienten mit starkem Anstieg der CTLA-4-Expression
c
Patienten mit bereits präoperativ hoher CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
d
Patienten mit präoperativ normaler oder nur leicht erhöhter (< Mittelwert + 5 SD), postoperativ jedoch stark erhöhter CTLA-4-Expression (≥ Mittelwert + 5 SD)
a
starker Anstieg der
CTLA-4Expression b
24,92 ± 11,81
kein/ geringer
Anstieg der CTLA4-Expression a
17,93 ± 3,663
Parameter
CTLA-4-Expression (Tag +7)
Bestimmung der Induktion verschiedener immunologisch relevanter Parameter bei Patienten, eingeteilt aufgrund unterschiedlicher
Anhang: Expression von CTLA-4 auf T-Zellen bei chirurgischen Patienten
Zusammenfassung
Zusammenfassung der Dissertation
zum Thema: „Untersuchungen zur Rolle der CD4+ T-Lymphozyten
in einem Peritonitismodell der Maus“
vorgelegt von Mandy Busse, geb. Klabunde
Generalisierte
bakterielle
Infektionen,
auch
Sepsis
genannt,
sind
trotz
intensivmedizinischer Behandlung mit einer sehr hohen Letalität verbunden. Um kausale
Therapiestrategien zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden
Pathomechanismen, insbesondere der Reaktionen des Immunsystems, notwendig. Da die
Sepsis ein hoch komplexer Vorgang ist, an dem der gesamte Organismus beteiligt ist, sind
grundlegende Untersuchungen im Tiermodell dafür unverzichtbar.
Nach aktuellen Modellvorstellungen verläuft die Immunreaktion bei einer Sepsis
typischerweise in zwei Phasen: Auf eine überschießenden Entzündungsantwort folgt eine
Phase der generalisierten Immunparalyse. Die Rolle des angeborenen Immunsystems bei
diesen Reaktionen ist gut dokumentiert, jene des adaptiven Immunsystems in der
Pathogenese der Sepsis ist dagegen wenig untersucht. Ihr wurde zwar eine wichtige Rolle
in der späten Phase zugesprochen, denn die Lymphozytenapoptose trägt zur Entstehung
einer Immunparalyse bei. Da adaptive Immunreaktionen jedoch einige Zeit in Anspruch
nehmen, wurde eine wichtige Rolle in der frühen Phase des hoch akuten Krankheitsbildes
Sepsis für unwahrscheinlich gehalten und deshalb bisher kaum betrachtet.
Wir hatten jedoch aus Vorversuchen Hinweise auf eine sehr schnelle T-Zellbeteiligung bei
der Sepsis. Deshalb lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Aufklärung der Rolle von
CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis. Diese wurde in einem etablierten Sepsismodell der Maus
untersucht, der Colon ascendens Stent-Peritonitis (CASP). Das Modell wurde entwickelt,
um die klinische Situation von Patienten, bei denen es aufgrund der Insuffizienz einer
chirurgischen Naht im Magen-Darm-Trakt zur Entwicklung einer diffusen Peritonitis
kommt, möglichst genau abzubilden.
Überraschend beobachteten wir bei CASP innerhalb weniger Stunden eine starke Induktion
der Expression von CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4) auf den CD4+
218
Zusammenfassung
T-Lymphozyten. Die Expression dieses Moleküls wird nach der Aktivierung von T-Zellen
induziert. Dies lässt auf eine Beteiligung der CD4+ T-Zellen in einem frühen Stadium der
Erkrankung schließen. Eine Depletion der CD4+ T-Zellen im Vorfeld der CASP-Operation
mit dem monoklonalen Antikörper GK1.5 führte zu einer effektiveren Beseitigung der
Bakterien aus dem Peritoneum, zu einer geringeren systemischen Verbreitung der Erreger
und zu einem deutlich verbesserten Überleben der Tiere. Damit verbunden war eine
verstärkte Einwanderung von Zellen des angeborenen Immunsystems in das Peritoneum.
Dies impliziert, dass bei einer systemischen Dissemination kommensaler Bakterien die
CD4+ T-Zellen die lokale Reaktion des angeborenen Immunsystems inhibieren, in diesem
Tiermodell mit lebensbedrohlichen Konsequenzen.
Die Blockade der T-Zellrezeptor-vermittelten Signalgebung durch Tacrolimus (FK506)
hatte dagegen keinen Einfluss auf das Überleben der Peritonitis. Dies zeigt, dass die
Effekte der CD4+ T-Zellen zumindest teilweise unabhängig von der T-Zellrezeptorvermittelten Antigenerkennung sein müssen.
Eine Blockade des inhibititorischen T-Zelloberflächenmoleküls CTLA-4 bewirkte eine
starke Induktion von ICOS (inducible co-stimulator) sowie eine deutliche Inhibition der
Sekretion von IL-10. Die verstärkte T-Zellaktivierung und Hyperinflammation ging einher
mit einem Überlebensnachteil.
Zur Untersuchung der Langzeitkonsequenzen, die eine Sepsis nach sich zieht, wurden die
Tiere bis zu drei Monate nach der Operation untersucht. Die Peritonitis war mit massivem
Zelltod in Thymus, Milz und mesenterialen Lymphknoten assoziiert, jedoch mit
unterschiedlicher Kinetik. Die systemische Infektion führte innerhalb kurzer Zeit zu einem
fast vollständigen Verlust des Thymus, doch 14 Tage nach der Operation war das Organ
wieder unauffällig. In der Milz hingegen setzte die Apoptose später ein und war nicht so
ausgeprägt, hielt aber länger an. Eine sich anschließende Hyperplasie der Milz war drei
Monate nach Induktion der Peritonitis am stärksten und ein Zeichen für eine noch nicht
abgeschlossene Immunreaktion.
Neben der Aktivierung von T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung wurde auch etwa
eine Woche nach der Operation eine Reaktion von T-Zellen anhand der Änderung von
Oberflächenmolekülen und der Sekretion von Zytokinen beobachtet. Diese Aktivierung
erfolgte aufgrund der Kinetik vermutlich auf dem „klassischen“ Weg. Das Muster der
Zytokinausschüttung lässt vermuten, dass nach CASP eine Th1-Antwort überwiegt.
219
Zusammenfassung
Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Dissertation ist, dass nach diffuser Peritonitis ein
Immungedächtnis aufgebaut wird. Es entwickelten sich funktionsfähige Keimzentren, und
im Serum ließen sich ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Antikörpern der Klassen
IgM und IgG messen. Die Bildung von T-Gedächtniszellen ging damit einher.
Erste Immunisierungsversuche mit TNP-KLH zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach
CASP deuten darauf hin, dass die Peritonitis weder die Entwicklung einer primären
Immunantwort verhinderte noch ein bereits etabliertes Immungedächtnis störte.
Im multifaktoriellen Prozess einer Sepsis spielen folglich auch die T-Lymphozyten eine
wichtige Rolle. Dies sollte bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien berücksichtigt
werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Population der CD4+ T-Lymphozyten sehr
heterogen ist und verschiedene Funktionen bei der Abwehr bakterieller Infektionen ausübt.
Deshalb ist die Elimination der Gesamtheit der CD4+ T-Zellen höchstwahrscheinlich keine
Behandlungsoption bei der Sepsis, obwohl sie in dieser Arbeit beim Tiermodell einen
deutlichen Überlebensvorteil bewirkte. Es ist jetzt notwendig, die Funktionen der
verschiedenen T-Zellsubpopulationen bei generalisierten bakteriellen Infektionen im Detail
zu untersuchen. Die Herausforderung liegt in der Identifikation von wichtigen
Kontrollpunkten der T-Zellen, die therapeutischen Eingriffen zugänglich sind. Bei diesen
Interventionen muss die Gefahr einer starken Dysbalance des Immunsystems vermieden
werden.
Es ist ebenso wichtig zu beachten, dass die Reaktion des Immunsystems nicht nach der
akuten Phase einer Sepsis endet, sondern Monate - möglicherweise sogar Jahre - danach
andauert, wie in dieser Arbeit gezeigt wird. Dies könnte erklären, warum sich bei
Patienten, die diese Erkrankung überlebt haben, bis zu fünf Jahren später eine signifikant
erhöhte Mortalität epidemiologisch nachweisen lässt. Ein besseres Verständnis der
immunologischen Langzeitkonsequenzen einer Sepsis ist die Voraussetzung für die
Entwicklung therapeutischer Strategien zur Senkung der Mortalität bei Überlebenden
dieser schweren Erkrankung.
In einer prospektiven klinischen Pilotstudie sollte überprüft werden, ob die aus den
tierexperimentellen Versuchen gewonnenen Befunde auch für den Menschen Relevanz
haben könnten. Hierzu wurde die Expression von CTLA-4 als Parameter einer Beteiligung
von T-Zellen bei Patienten untersucht, die sich einem großen abdominalchirurgischen
Eingriff unterzogen, welcher mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer Sepsis
220
Zusammenfassung
verbunden war. Bei allen Patienten zeigten sich eine teilweise dramatische Abnahme der
CD3+ T- Zellen, bei dem überwiegenden Teil der Patienten war ein Anstieg der Expression
von CTLA-4 zu beobachten. Mit der Induktion des Moleküls gingen Änderungen der
klinischen Parameter, der Zusammensetzung der T-Zellpopulationen und deren
Aktivierungszustand einher, so dass die Bestimmung der Expression von CTLA-4 für die
Beurteilung des Immunstatus der Patienten nützlich sein könnte. Da die Messung jedoch
sehr aufwändig, zeitintensiv und schwer standardisierbar ist, erscheint sie aktuell
ungeeignet für die Routinediagnostik.
221
Danksagung
Danksagung
Ich möchte mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Barbara Bröker für die Bereitstellung dieses
spannenden Themas bedanken, die sehr gute Betreuung und die vielen Ratschläge, die mir
sehr bei der Erstellung dieser Doktorarbeit geholfen haben.
Während der Arbeit an meiner Doktorarbeit schrieben Anja Billing, Annegret Dummer
und Christian Pötschke erfolgreich ihre Diplomarbeiten. Ich danke Euch für die
angenehme Zusammenarbeit und Unterstützung.
Ein großes Dankeschön richtet sich an alle Mitarbeiter den Instituts für Immunologie und
Transfusionsmedizin, der Chirurgie und Neuroimmunologie. Im besonderen danke ich
Frau Erika Friebe, die mir immer mit Rat und Tat zur Seite stand und für die nette
Atmosphäre in der Arbeitsgruppe sorgte.
Auch bei Dr. Tobias Traeger und Dr. Wolfram Keßler sowie den Doktoranden der
Chirurgie möchte ich mich bedanken für die CASP-Operationen, die Ihr in Eurer ohnehin
schon knapp bemessenen Freizeit durchgeführt habt.
Dr. Grunwald stand mir immer hilfreich bei Fragen zur Anwendungen und Problemen zum
Thema „FACS“ zur Seite. Ein großes Dankeschön dafür.
Ich bedanke mich bei Prof. Dr. Barbara Bröker, Monika Müller und Susanne Kühl sowie
allen Studenten des Graduiertenkollegs für die erfolgreiche Zusammenarbeit. Besonderer
Dank gilt dabei Dr. Silva und Birte Holtfreter und Dr. Cornelia Kiank für Ihre vielseitige
Unterstützung. Auch bei Dr. Ngyuen Nam, der zusammen mit mir die Messung der IDOmRNA durchführte, möchte ich mich bedanken.
Ganz großer Dank allen Verantwortlichen der Hochrisikopatienten-Studie. Prof. Dr.
Lehmann, Frau Kiesow, Dr. Feyerherd und Dr. Gründling aus der Anästhesie für die
Auswahl der Patienten und die Bereitstellung der klinischen Daten sowie den MTAs Frau
Kreplin und Frau Hollenbach aus der Immunologie für die Probenaufarbeitung und die
FACS-Analyse. Im Besonderen danke ich Dr. Johannes Frank für die Hilfe beim Erlernen
der LSC-Technik, der Beschaffung des Probenmaterials und der Bereitstellung der
Ergebnisse der FACS-Auswertung.
Danksagung
Frau Prof. Dr. Schütt danke ich vielmals für die hilfreiche Unterstützung während der
Arbeit an meiner Doktorarbeit.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, die mich stets unterstützte und
auch in schweren Stunden mir Mut zusprachen und mich stets zum Weitermachen
motivierten.
Für meine Kinder David und Sarah- Danke, dass ihr da seid.
Lebenslauf
Name :
Mandy Busse
Geburtsname:
Klabunde
Wohnort :
Goethestraße 35/1
39108 Magdeburg
Tel. : 0172/4213525
[email protected]
Geburtsdatum :
18.03.1979
Geburtsort :
Anklam
Familienstand:
verheiratet
Kinder:
David Lukas Busse, geb. 21.12.2003
Sarah Maria Busse, geb. 01.08.2006
Nationalität :
Deutsch
Schulbildung :
1985-1991 Grundschule „Karl-Liebknecht“ Anklam
1991-1997 Lilienthal-Gymnasium Anklam
1997 Abitur
Berufsausbildung :
1997-2002 Studium der Humanbiologie an der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Abschluss: Diplom (Note: 1,3)
2002-2007 Promotion am Institut für Immunologie
und Transfusionsmedizin der Ernst-Moritz-ArndtUniversität Greifswald
Magdeburg, 21.08.2007
Veröffentlichungen
Abstracts
Klabunde, M., A. Billing, M. Entleutner, T. Bruemmer, R.S. Jack, C.D. Heidecke, and
B.M. Bröker. 2003. Rapid induction of CTLA-4 expression in murine polymicrobial
sepsis. In 34. Annual Meeting of the German Society of Immunology, Berlin.
Frank J., I. Kiesow, U. Müller, M. Klabunde, F. Feyerherd, U. Wiesmann, B.M.
Bröker, H.J. Hannich, C. Lehmann, M. Gründling, and C. Schütt. 2003. Immunological,
clinical and psychological profiling in high-risk patients who underwent major
abdominal surgery: 2 case reports. Infection 31:283 (2003)
Busse, M., T. Traeger, A. Billing, M. Entleutner, T. Brümmer, A. Dummer, E. Friebe,
A. Müller, B. Fürrl, U. Grunwald, S. Maier, C.D. Heidecke, and B.M. Bröker. 2004. T
cells are involved early in the physiological stress reaction to polymicrobial infection in
mice. In 1. International Alfried Krupp Kolleg Symposium: Stress, Behaviour, Immune
response, Greifswald
Busse, M., S. Pogodda, N. Mayumder, N. Follak, E. Friebe, J. Castan, J. Frank, I.
Kiesow, B. Fleischer, C. Schütt, M. Gründling, and B.M. Bröker. 2004. Reaktion of
human T lymphocytes to different forms of physiological stress. In 1. International
Alfried Krupp Kolleg Symposium: Stress, Behaviour, Immune response, Greifswald
Mayerle, J., C. Sünder, F.-U. Weiss, M. Busse, K. Eske, B.M. Bröker, and M.M. Lerch.
2004. CTLA-4 a new severity marker for acute necrotising pancreatitis? European
Pancreatic Club, Graz, Österreich
Busse, M., T. Traeger, A. Dummer, A. Billing, E. Friebe, A. Müller, S. Maier, C.D.
Heidecke, and B.M. Bröker. 2005. CD4 T lymphocytes in murine poymicrobial sepsis.
Euroconference on the interactions between innate and adaptive immunity in
mammalian defense against bacterial infections. Joachimsthal
Busse, M., T. Traeger, A. Dummer, A. Billing, E. Friebe, M. Entleutner, A. Müller, S.
Maier, C.D. Heidecke, and B.M. Bröker. 2005. T cells dampen innate defense
mechanisms
in
polymicrobial
sepsis.
28.
Arbeitstagung
der
Norddeutschen
Immunologen, Borstel
Publikation
Busse M., T. Traeger, A. Billing, A. Dummer, C. Pötschke, E. Friebe, C. Kiank, U.
Grunwald, R.S. Jack, C. Schütt, C.D. Heidecke, S. Maier, and B.M. Bröker. Detrimental
role for CD4+ T cells in murine diffuse peritonitis by inhibition of local bacterial
elimination. Gut, in revision.