Die Expression von Osteopontin und seinen Rezeptoren bei

Universität Ulm
Universitätsklinik für Dermatologie und Allergologie
Ärztliche Direktorin:
Prof. Dr. med. K. Scharfetter-Kochanek
Die Expression von Osteopontin und seinen Rezeptoren
bei allergischen Kontaktekzemen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Tanja Uebele
geboren in Stuttgart Bad Cannstatt
Vorgelegt 2012
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. Johannes Weiss
2. Berichterstatter:
Priv.-Doz. Dr. med. Christian Schumann
Tag der Promotion:
24. Oktober 2013
Für Dietmar, Philipp und Daniel
Verzeichnisse
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... I
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... III
1
Einleitung ........................................................................................................... 1
1.1 Die allergische Kontaktdermatitis, Epidemiologie ............................................ 1
1.2 Das klinische Bild der allergischen Kontaktdermatitis...................................... 1
1.3 Histologie des allergischen Kontaktekzems ...................................................... 2
1.4 Kontaktallergie: Sensibilisierungs- und Auslösephase ..................................... 2
1.5 T-Effektorzellen und Zytokinpolarisierung von T-Zellen im Kontaktekzem.... 4
1.6 Osteopontin (OPN) ............................................................................................ 5
1.6.1. Struktur und Funktion von OPN: ............................................................ 6
1.6.2. OPN und zellvermittelte Immunität ........................................................ 7
1.6.3. Osteopontin und Immunerkrankungen ................................................... 9
1.7. Osteopontinrezeptoren und ihre Funktion ...................................................... 10
1.7.1. OPN-Rezeptoren aus der Integrinfamilie ............................................. 10
1.7.2. Der OPN-Rezeptor CD44 ..................................................................... 10
1.8. Aufgabenstellung ............................................................................................ 11
2
Material und Methoden .................................................................................. 13
2.1. Patienten.......................................................................................................... 13
2.1.1. Patienten Hautprobe.............................................................................. 13
2.1.2.Patienten Plasmaprobe ........................................................................... 14
2.2. Gewebeproben ................................................................................................ 16
2.2.1. Gewinnung ............................................................................................ 16
2.2.2. Weiterverarbeitung der Proben ............................................................. 16
2.3. Grundprinzip der immunhistologischen Technik ........................................... 16
2.4. Materialien ...................................................................................................... 17
2.4.1. Primäre Antikörper ............................................................................... 17
2.4.2. Verwendete Reagenzien und Geräte ..................................................... 18
2.4.3. Herstellung von Puffern und Lösungen ................................................ 19
2.5. Färbeprotokolle ............................................................................................... 20
2.5.1. Die DAB Methode ................................................................................ 20
2.5.2. Doppelfärbung ...................................................................................... 23
2.6. Auswertungsverfahren .................................................................................... 25
2.7. Statistik ........................................................................................................... 26
2.8. Quantitative Bestimmung von OPN mittels Elisa .......................................... 26
2.8.1 Theoretische Grundlagen ...................................................................... 26
3.
Ergebnisse ........................................................................................................ 27
I
Verzeichnisse
3.1 OPN-Expression im Verlauf der Chronifizierung von Kontaktekzemen ........ 27
3.1.1 Verstärkung der OPN-Expression in der Epidermis, durch
Kapillarendothelzellen und infiltrierende Immunzellen ....................... 27
3.1.2 Zunahme der OPN-Expression durch Endothelzellen des papillären
Gefäßplexus ........................................................................................... 29
3.1.3. Zunahme OPN-exprimierender Immunzellen im entzündlichen Infiltrat30
3.2. Expression der OPN-Rezeptoren αv Integrin, CD44s und CD44v6 im akuten
und im chronischen Kontaktekzem ................................................................ 31
3.2.1 Kolokalisation von OPN mit seinen Rezeptoren CD44 und αvß3 ........ 31
3.2.2. Expression der OPN Rezeptoren αv Integrin und CD44s von
Endothelzellen des papillären Gefäßplexus .......................................... 32
3.2.3. Expression der OPN Rezeptoren αv- Integrin und CD44s von
Immunzellen des entzündlichen Infiltrats ............................................. 35
3.3. Im akuten und chronischen Kontaktekzem exprimieren CD45RO +
Gedächtnis T-Zellen OPN .............................................................................. 37
3.4. Im akuten und chronischen Kontaktekzem exprimieren CD1a+ Dendritische
Zellen OPN und wandern in Bereiche hoher OPN Expression ...................... 41
3.5. Differenzierung der OPN Expression im T-Zellinfiltrat................................. 45
3.5.1. Expression von T-Zellmarkern bei Patienten mit akutem und chronischem
Kontaktekzem ................................................................................................. 45
3.6. OPN Plasmakonzentration bei Patienten mit allergischem Kontaktekzem .... 49
4.
Diskussion ........................................................................................................ 51
4.1. Die Expression von OPN auf den Kapillaren im papillären Gefäßplexus und
auf den Entzündungszellen im dermalen Infiltrat ........................................... 51
4.2. Bedeutung der OPN-Rezeptorenexpression auf den Kapillaren im papillären
Gefäßplexus und auf den Entzündungszellen im dermalen Infiltrat .............. 52
4.3. Expression von OPN durch infiltrierende Zellsubpopulationen im
Kontaktekzem ................................................................................................. 55
4.3.1. Dendritische Zellen ...................................................................................... 55
4.3.2. CD45 RO+ T-Gedächtniszellen ................................................................... 56
4.4. Expression von T-Zellmarkern bei Patienten mit akutem und chronischem
Kontaktekzem ................................................................................................. 57
4.5. OPN Plasmaspiegel beim allergischen Kontaktekzem ................................... 58
4.6. Modell zur Rolle von OPN beim allergischen Kontaktekzem ....................... 59
5.
Zusammenfassung ........................................................................................... 60
6.
Literaturverzeichnis ........................................................................................ 61
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 78
Danksagung ............................................................................................................... 79
Lebenslauf ................................................................................................................. 80
II
Verzeichnisse
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ABC
Avidin-Biotin Komplex
AEC
3-Amino-9Ethylcarbazole
AK
Antikörper
CD
Differenzierungsantigen (cluster of differentiation)
DAB
Diaminobenzidinlösung
DZ
Dendritische Zelle
EAE
Experimentelle Autoimmunencephalitis
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay ( Enzym-Immuntest)
IFN
Interferon
IL
Interleukin
kDA
kiloDalton
LZ
Langerhanszelle
MHC
Major histocompatibility complex
OPN
Osteopontin
PBS
phosphat-buffered-saline, Phosphat gepufferte Salzlösung
RGD
Arginin Glycin Aspartat
TBS
Tris buffered saline, (tris- gepufferte Kochsalzlösung)
Th
T-Helferzelle
TNF
Tumornekrosefaktor
T-reg
regulatorische T-Zelle
III
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die allergische Kontaktdermatitis, Epidemiologie
Kontaktekzeme gehören zu den häufigsten dermatologischen Krankheiten. Sie treten meist
im Erwachsenenalter auf. Man unterscheidet das toxisch irritative Kontaktekzem, das
durch direkte Irritation entsteht vom allergischen Kontaktekzem, welches auf Basis einer
Typ IV-Immunreaktion gegen meist exogen auf die Haut auftreffende Substanzen
verursacht wird. Beide Mechanismen können zu akuten und chronischen Ekzemreaktionen
führen. Die Mehrheit der berufsbedingten Dermatosen (mehr als 95%) sind Unterformen
des Kontaktekzems. Man nimmt an, dass die Inzidenz auf 1000 Beschäftigte etwa 0,5-1,9
Fälle pro Jahr beträgt (Rietschel et al. 1997; Diepgen und Conraads. 1999). Sie sind die
häufigste
Ursache
für
Berufserkrankungen
und
sind
somit
von
großem
volkswirtschaftlichem Interesse.
Zu den häufigen Kontaktallergenen zählen die Salze von Chrom und Nickel und zyklische
Kohlenwasserstoffe wie 2-4-Dinitrochlorbenzol und Pentadecylcatechol (Lonsdorf und
Enk. 2009).
1.2 Das klinische Bild der allergischen Kontaktdermatitis
Das allergische Kontaktekzem kann als akutes Ekzem, bzw. bei wiederholter oder
persistierender Allergenexposition auch als chronisches Kontaktekzem auftreten.
Das akute allergische Kontaktekzem entwickelt sich gewöhnlich 24 bis 48h nach Kontakt
mit dem auslösenden Stoff an der allergenexponierten Haut. Beispielsweise kommt es zu
Reaktionen auf Nickel und Chromate. Gürtelschnallen, Hosenknöpfe und Ohrringe
enthalten häufig Nickel und können an den Hautkontaktstellen ein Ekzem hervorrufen.
Chromate sind z.B. im Leder von Schuhen enthalten und verursachen dadurch ein
Kontaktekzem.
Die allergische Kontaktdermatitis im akuten Stadium zeigt eine starke Rötung und
ödematöse Schwellung der Haut. Schwere Reaktionen sind durch Bläschen, Blasen und
nässende oder verkrustete Erosionen gekennzeichnet. Im Rahmen der Abheilung des
Ekzems kommt es zur Schuppung. Ein Resterythem im betroffenen Bereich kann für
einige Zeit zurückbleiben (Rustemeyer et al. 2006). Subjektiv besteht meist starker
Juckreiz. Das chronische allergische Kontaktekzem entwickelt sich durch wiederholten
Allergenkontakt, Persistenz des Kontaktallergens in der Haut oder durch Entwicklung
Einleitung
2
einer autoimmunen Dermatitis bei Kreuzreaktivität des Allergens zu einem körpereigenen
Protein. Hier treten neben den entzündlichen Papulovesikeln chronisch entzündliche
Hautverdickungen mit stärkerer Verhornung in den Vordergrund. Charakteristisch ist die
Lichenifikation der Haut, die durch eine entzündliche Verdickung und eine Vergröberung
der Hautfelderung gekennzeichnet ist (Rustemeyer et al. 2006). Sind Sensibilisierungen
und Kontaktekzeme entstanden, ist die bislang einzig wirksame Therapie die
Allergenmeidung, da die Sensibilisierung ein Leben lang fortbestehen kann (Diepgen und
Conraads. 1999).
1.3 Histologie des allergischen Kontaktekzems
In der Lichtmikroskopie lassen sich folgende Charakteristika des akuten allergischen
Kontaktekzems erkennen. Es finden sich erweiterte Gefäße im Stratum papillare und im
oberem Stratum reticulare mit ausgeprägten besonders die oberen Papillen betreffenden
Ödemen sowie perivaskulären Infiltraten aus Lymphozyten vereinzelt auch neutrophilen
und eosinophilen Granulozyten. In der Epidermis kommt es zu einem interzellulären
Ödem mit schwammartiger Epidermisauflockerung (Spongiose) und Einwanderung von
lymphozytären Zellen in den interzellulären Raum (Frosch et al. 2006).
Das
chronisch-allergische
Hautverdickung
infolge
Kontaktekzem
zellulärer,
ist
durch
entzündlicher
eine
chronisch-entzündliche
Infiltrate
im
oberen
Korium
gekennzeichnet. Es kommt zu einer reaktiven Epidermisverdickung (Akanthose) mit
vermehrter und qualitativ gestörter Hornschichtbildung (Hyperparakeratose, Parakeratose)
(Rustemeyer et al. 2006). In der Epidermis und Dermis gibt es ein dichtes Netz
Dendritischer Zellen (DZ). Hierzu zählen neben den epidermalen Langerhanszellen (LZ)
die verschiedenen Untertypen von dermalen DZ (Merad et al. 2008).
1.4 Kontaktallergie: Sensibilisierungs- und Auslösephase
Die allergische Kontaktdermatitis ist eine spezifische, durch T-Lymphozyten vermittelte
entzündliche Immunreaktion gegen spezifische Kontaktallergene und ist ein Beispiel einer
allergischen Reaktion vom verzögerten Typ beziehungsweise einer Typ IV-Reaktion nach
Coombs und Gell (Grabbe und Schwarz 2003; Cavani et al. 2005).
Kontaktallergene sind meist Haptene (Halbantigene), die wegen ihrer geringen
Molekülgröße allein nicht immunogen wirken. Erst nach Bindung an körpereigene
Proteine werden sie zum Vollantigen komplettiert und erlangen immunogene
Eigenschaften.
Einleitung
3
Die Kontaktallergie kann in eine Sensibilisierungsphase und eine Auslösephase unterteilt
werden. Als Sensibilisierungsphase bezeichnet man den Zeitverlauf des Erstkontakts und
der folgenden Erkennung des Allergens durch das Immunsystem. Nach dem Kontakt der
Haut mit dem Allergen wird das Allergen von epidermalen und dermalen dendritischen
Zellen der Haut aufgenommen und prozessiert (Nestle et al. 2009; Merad et al. 2008). Die
DZ verlassen die Haut und wandern über die afferenten Lymphgefäße zu den Haut
drainierenden Lymphknoten (Jakob et al. 2001). Die Migration der DZ wird über die
komplexe Interaktion von Chemokinen, Zytokinen und Proteinen der Extrazellulären
Matrix mit DZ gesteuert. Über afferente Lymphgefäße gelangen sie in die regionalen
Lymphknoten.
In den T-Zell Arealen, den parakortikalen Zonen der regionalen Lymphknoten werden die
Antigene nach Prozessierung MHC abhängig an naive antigenspezifische CD8+ und CD4+
T-Zellen präsentiert (Rustemeyer et al. 2006).
Die Aktivierung und Proliferation von naiven T-Zellen erfordert zwei Signale.
Das erste Signal erfolgt aufgrund der Erkennung des HLA-Antigen Komplexes durch den
T-Zell Rezeptor (Signal 1). Darüberhinaus wird auch ein kostimulatorisches Signal (Signal
2) benötigt, das durch die Bindung von CD28 an die entsprechenden Liganden (CD80,
CD86) auf der Oberfläche professioneller antigenpräsentierender Zellen zur Verfügung
gestellt wird. Die Kombination dieser Signale führt zur Induktion und Proliferation von
antigen-spezifischen
Effektor-
und
Gedächtnis
T-Zellen.
Diese
verlassen
den
Lymphknoten durch die efferenten lymphatischen Gefäße zum Ductus thoracicus und
schließlich zurück in die Blutbahn (Rustemeyer et al. 2006; Grabbe und Schwarz 2003;
Cavani et al. 2005). Einerseits sind die antigenspezifischen Effektor- und Gedächtnis TZellen wie die naiven T-Zellen in der Lage in lymphatisches Gewebe einzuwandern, da sie
weiterhin L-Selektin auf ihrer Oberfläche exprimieren (Westerman et al. 1997; Marshall et
al. 2002). Andererseits wandern antigenspezifische Gedächtnis, wie auch Effektor-TLymphozyten über postkapilläre Venolen in periphere Organe wie z. B. die Haut ein.
Beispielsweise überexprimieren die antigenspezifischen T-Lymphozyten CLA (engl.:
cutaneous lymphocyte antigen) und P-Selektin Glykoprotein. Diese binden an E-Selektin
und P-Selektin auf den Venolen der oberen Dermis (Pober et al. 2001; Mackay et al. 1993).
Nachdem die Sensibilisierungsphase abgeschlossen ist finden sich viele haptenspezifische
T-Lymphozyten in der Haut, in den regionalen Lymphknoten und rezirkulierend im Blut,
von wo aus sie bei erneuter Stimulation schnell proliferieren und in die Haut einwandern
können (Enk und Lonsdorf. 2009).
Einleitung
4
Die Auslösephase des allergischen Kontaktekzems ist immunologisch ein T-Zell
abhängiger Prozess, da sich in T-Zell defizienten Mäusen keine allergische Immunantwort
vom verzögerten Typ induzieren lässt (Cavani et al. 2001). Im sensibilisierten Organismus
führt die erneute kutane Exposition mit dem Allergen in der Auslösephase innerhalb
weniger Stunden zum Entstehen eines Kontaktekzems. Eine wichtige Voraussetzung ist die
direkte proinflammatorische Aktivität des Haptens in der frühen Auslösephase (Grabbe et
al. 1996). Die Aktivierung und Schädigung der Keratinozyten durch das Hapten führt zu
einer raschen Freisetzung inflammatorischer Botenstoffe (Kupper et al. 1995; Martin und
Jakob. 2008). Die Ausschüttung großer Mengen von in Keratinozyten vorgespeicherten IL1α
triggert
sowohl
die
Freisetzung
von
weiterem
IL-1α
als
auch
andere
proinflammatorische Zytokine wie TNFα, IL-8, IL-6, GM-CSF und Chemokine. Unter
dem Einfluss dieser Zytokine steigern die Endothelzellen der Hautgefäße die Expression
von Adhäsionsmolekülen wie E-Selektin und P-Selektin, VLA-4 und LFA-1, die über die
Interaktion mit den entsprechenden Rezeptoren an der Oberfläche von Immunzellen
einschließlich allergen-spezifischer T-Zellen deren Migration in die Dermis vermitteln
(Kondo et al. 1995; Wardorf et al. 1991; Pober et al. 1986; Shimizu et al. 1991). Die frühen
Merkmale der Effektorphase sind neutrophile Granulozyten, Mastzelldegegranulation und
Vasodilatation in der Dermis, gefolgt von einer späteren Einwanderung mononukleärer
Zellen und CD4+ und CD8+ T-Zellen (Grabbe und Schwarz 2003). Eine Chronifizierung
des allergischen Kontaktekzems erfolgt durch eine wiederholte Allergenexposition der
Haut, was zu einem massiven entzündlichen Infiltrat führt.
1.5 T-Effektorzellen und Zytokinpolarisierung von T-Zellen im
Kontaktekzem
T-Zellen sind die Haupteffektoren der Auslösephase im allergischen Kontaktekzem. Da in
den Hautinfiltraten die CD4+ T-Zellen überwiegen, wurden die CD4+ T-Zellen lange Zeit
als die hauptsächlichen Effektoren einer allergischen Kontaktallergie angenommen. Jedoch
bestehen die Entzündungsinfiltrate aus verschiedenen T-Zell Subgruppen (Zanni et al.
1998; Akadis et al. 1991). Girlomoni et al. 2001 zeigte, dass bei Auslösung eines
Kontaktekzems, die einwandernden T-Zellen sowohl aus CD4+ als auch aus CD8+ TZellen bestehen. CD4+ T-Zellen auch T-Helferzellen (Th) genannt sezernieren Zytokine,
erkennen die von MHC Klasse II Molekülen präsentierten Antigene und regen B-Zellen
zur Teilung, Differenzierung und Antikörperproduktion an. CD8+ T-Zellen (Tc,
Einleitung
5
engl.:cytotoxic T cell) sind gewöhnlich zytotoxische Zellen, erkennen MHC-Klasse Ipräsentierte Antigene. Sie töten virusinfizierte und entartete Körperzellen. Goscinski und
Tigelaar
erbrachten durch Depletionsexperimente den Nachweis, dass der CD8+
Subpopulation die hauptsächliche Rolle in der Auslösephase zukommt (Goscinski und
Tigelaar. 1990). Spätere Arbeiten bestätigen die Rolle der CD8+ T-Zellen als
Haupteffektorzellen und wiesen darauf hin, dass den CD4+ T-Zellen eine regulatorische
Funktion zugeordnet werden kann (Xu et al. 1996). MHC-Klasse I defiziente Mäuse zeigen
keine allergische Kontaktdermatitis während MHC-Klasse-II defiziente Mäuse verstärkte
Reaktionen zeigen (Xu et al. 1996; Bour et al. 1995). Weiter abgrenzen lassen sich diese
beiden hauptsächlich beteiligten T-Zell Populationen durch ihre unterschiedlichen
Zytokinprofile. CD4+ T-Helferzellen vom Typ1(Th1)-Zellen produzieren IFN γ, IL-2 und
TNFα und Th2-Zellen produzieren IL-4 und IL-10. Ähnlich sezernieren CD8+ Tc1 Zellen
Typ I Zytokine (IFNγ, IL-2 und TNF α) und CD8+ Tc2 Zellen Typ 2 Zytokine (IL-4, IL10) (Salmon et al. 1989; Sad et al. 1995). Neben den eben beschriebenenen CD4+ und
CD8+ T-Zellen existiert eine weitere wichtige Untergruppe die CD4+CD25+ T-Zellen
(regulatorische T-Zellen (T-reg)). T-reg-Zellen unterdrücken die Aktivität von Effektor-TZellen am Entzündungsort und sezernieren IL-10 und IL-5 (Seddon und Mason 1999). Die
Ergebnisse neuerer Studien weisen auf eine bedeutende Rolle des immunsuppressiven
Zytokins IL-10 hin (Ghoreishi et al. 2006). In Tierversuchen führt die Gabe von IL-10 vor
Haptenapplikation
zu
einer
Blockierung
der
Auslösephase
der
allergischen
Kontaktdermatitis (Ferguson et al. 1994; Schwarz et al. 1994) und IL-10 sezernierende
Nickel-spezifische T-reg wurden im Blut von nichtallergischen Versuchspersonen häufiger
isoliert als bei Allergikern (Cavani et al. 2000). Zu Beginn des allergischen Kontaktekzems
bestehen 70% der einwandernden T-Zellen aus Th1 und Tc1 Zellen (Goebeler et al. 2001).
Erst im Verlauf wandern T-reg und Th2 Zellen ein , was zur Eindämmung der
Kontaktallergie führt (Cavani et al. 2000).
1.6 Osteopontin (OPN)
Osteopontin (OPN) ist ein Phospoglykoprotein, das von diversen Zelltypen sezerniert
werden kann. Im Immunsystem hat OPN Chemokin und Th1-Zytokinfunktionen. Wie
verschiedene Moleküle der extrazellulären Matrix enthält es eine Integrin-bindende RGDSequenz.
Einleitung
6
1.6.1. Struktur und Funktion von OPN:
OPN ist ein sezerniertes glykosiliertes Phosphoprotein und wird auch als frühes T-ZellAktivierungs-Gen (Eta-1; engl.: early T-cell activation gene) bezeichnet. Es wurde 1979
erstmals als Knochenstrukturprotein beschrieben (Senger et al. 1979). Das humane OPN
besteht aus 314 Aminosäureresten, wobei unterschiedliche Splicevarianten vorkommen
(Young et al. 1990; Saitoh et al. 1995). Durch unterschiedliche posttranslationelle
Modifizierung, einschließlich Phosphorylierung und Glykosylierung liegt seine Masse
zwischen 44 und 75kDa (Singh et al.1990; Berman et al. 2000). OPN wird durch ein Gen
kodiert, das auf dem humanen Chromosom 4 lokalisiert ist (Berman et al. 2000) und dem
murinen Ric`Lokus auf Chromosom 5 zugeordnet wird (Young et al. 1990; Patarca et al.
1993). Es kommt in einer monomeren und einer polymeren Form vor, wobei die polymere
Form hauptsächlich mit extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen und Fibronektin
interagiert. Die monomere Form besitzt eine zytokinartige Wirkung (Kaartinen et al.
1999).
Das OPN Molekül beinhaltet mehrere funktionell wichtige Regionen: Zu den wichtigen
strukturellen Domänen zählt die Arginin-Glycin-Aspartat Sequenz (= RGD-Sequenz), die
in extrazellulären Matrixkomponenten vorkommt, wie z. B. in Fibronektin und Kollagen
(Patarca et al.1989). Sie vermittelt die Bindung an Integrine wie z. B. αvβ3, αvβ1, αvβ5 und
integrinabhängig die Adhäsion und Migration von verschiedenen Immunzellen gegen OPN
(Patarca et al. 1993; Berman et al. 2000; Denhardt et al. 2001). Die Funktion von OPN
kann durch Thrombinspaltung modifiziert werden. Hierbei wird eine matrixkryptische
Bindungsstelle (SVVYGLR) freigelegt. Diese Sequenz interagiert mit α9β1 und α4β1
Integrin (Yokosaki et al. 1999). Die Thrombinspaltungsstelle befindet sich in der Nähe der
RGD-Domäne. Die entstehenden OPN-Fragmente, nicht aber das intakte OPN,
unterstützen
beispielsweise
die
RGD-abhängige
Migration
einer
humanen
Melanomzelllinie (Smith und Giachelli. 1998). Ein weiterer Rezeptor für OPN ist CD44
(Hyaluronsäure-Rezeptor).
Dieser
Rezeptor
hat
mehrere
RGD-
unabhängige
Bindungsstellen im OPN Molekül (Weber et al. 1996; Katagiri et al. 1999). Über CD44
vermittelt OPN RGD unabhängig Zellmigration (Weber et al. 1999). Weiterhin enthält das
OPN-Molekül eine Calcium und zwei Heparinbindungsstellen (Patarca et al. 1993).
OPN wird in verschiedenen Organen von unterschiedlichen Zellen exprimiert und durch
verschiedene Mechanismen in seiner Expression reguliert. OPN wird stark durch
Immunzellen wie z. B. T-Zellen, Makrophagen und natürlichen Killerzellen exprimiert
(Patarca et al. 1989; Pollack et al. 1994; Nau et al. 1997). Außerdem wird es von
Einleitung
7
Epithelzellen des Respirationstraktes, des Gastrointestinaltraktes und des Urogenitaltraktes
exprimiert (Berman et al. 2000). T-Zellen sezernieren nach ihrer Aktivierung schnell OPN
(O`Regan und Berman et al. 2000). LPS führt bei Makrophagen zu einer starken OPN
Expression (Shinohara et al. 2005). Verschiedene Zytokine regulieren die OPN Expression
von Immunzellen. Unter Zytokinen, die zu einer Differenzierung der Monozyten zu
Dendritischen Zellen führen, kommt es ebenfalls zu einer ausgeprägten OPNSekretionssteigerung (Renkl et al. 2005). Weiterhin wird OPN bei pathologischen
Prozessen
in
erhöhtem
Maße
von
verletzten
und
entzündeten
Epithelzellen,
Endothelzellen, glatten Muskelzellen und bestimmten Tumorzellen produziert (Patarca et
al. 1989; Nau et al. 1997; Giachelli et al. 1998). OPN ist an der Entstehung und
Progression der Atherosklerose beteiligt, indem es die Migration und Akkumulation von
glatten Muskelzellen und Makrophagen in atherosklerotischen Läsionen fördert. Die
Überexpression von OPN führt zu einer Größenzunahme atherosklerotischer Läsionen
(Scatena et al. 2007). OPN ist auch beteiligt an Knochenaufbau und Umbauprozessen. Es
reguliert die Mineralisierung und regt Osteoklasten zur Resorption an (O’Reagan et al.
2000).
1.6.2. OPN und zellvermittelte Immunität
OPN spielt eine wichtige Rolle im Rahmen der zellvermittelten Immunantwort,
insbesondere bei immunologischen Reaktionen vom Spättyp (Typ IV Immunreaktionen).
OPN rekrutiert und aktiviert Entzündungszellen und ist an der Regulation verschiedener
Zytokine beteiligt (Patarca et al. 1989; O`Regan et al. 1999).
Die Expression von OPN führt zu protektiven T-Zellvermittelten Immunreaktionen gegen
bakterielle und virale Infektionen. So weisen OPN-defiziente Mäuse eine herabgesetzte
Abwehr gegen das intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes auf und entwickeln
eine eingeschränkte Immunität gegen Herpes Simplex Virus (Ashkar et al. 2000). Auch
zeigen OPN-defiziente Mäuse ein verändertes Abwehrverhalten gegen Mykobakterium
bovis (Nau et al. 1999). Wenn Schistosomen in die Lungen von OPN-defizienten Mäusen
eingebracht wurden ließ sich eine veränderte Granulombildung mit auffallend weniger
Makrophagen erkennen (O`Regan et al. 2001). Bei diesen infektiologischen Mausmodellen
handelt es sich um zellvermittelte Immunreaktionen, die auf eine Th1- Polarisierung der
CD4 T-Zellen basiert.
Die Polarisierung von T-Zellen in einen Th1 oder Th2 Phänotyp ist ein wichtiger Schritt in
der zellvermittelten Immunantwort wie z. B. beim allergischen Kontaktekzem (Denhardt et
Einleitung
8
al. 2001). Für die Polarisierung von T-Zellen in einen Th1-Phänotyp ist eine frühzeitige
Produktion von Zytokinen einschließlich OPN erforderlich. So führt die Interaktion von
Osteopontin mit ß3 Integrinen in kultivierten Maus- Peritonealmakrophagen zu einer
vermehrten Sekretion von IL-12, welches die Th1 Polarisierung steuert. (Ashkar et al.
2000). IL-12 polarisiert die CD4+ T-Zellen und induziert die Sekretion von IFNγ aus TZellen (Renkl et al. 2005). Die Interaktion von Osteopontin mit CD44 führt zur
Verminderung der durch LPS induzierten IL-10 Produktion bei Makrophagen (Ashkar et
al. 2000). Weiterhin hat OPN einen kostimulierenden Effekt auf T-Lymphozyten (CD3+
T-Zellen) induziert deren IFNγ Produktion und erhöht die CD40 Ligand Expression.
Hierdurch wird die T-zellabhängige Produktion von IL-12 durch Makrophagen verstärkt
(O`Regan et al. 2000). Eine Fehlregulation der OPN Expression wurde in Zusammenhang
gebracht mit einer verstärkten Th1 Polarisierung von CD4+ T-Zellen (Ashkar et al. 2000;
Jansson et al. 2002). Die Überexpression von OPN besonders bei aktivierten T-Zellen ist
assoziiert
mit
einer
Verschlimmerung
von
Autoimmunerkrankungen,
darunter
systemischer Lupus Erythematodes, Rheumatoide Arthritis und Multiple Sklerose. So
zeigen Patienten mit Multipler Sklerose erhöhte OPN-Plasmaspiegel und OPN-null Mäuse
entwickeln eine mildere Form der experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE)
(Jansson et al. 2002; Comabella et al. 2005). In EAE Modellen beispielsweise fördert OPN
das
Überleben
der
Signaltransduktionswege
autoaggressiven
moduliert.
Dies
T-Zellen,
geschieht
indem
durch
es
die
verschiedene
Hemmung
des
Transkriptionsfaktors Foxo 3a bei gleichzeitiger Aktivierung des Transkriptionsfaktors
NF-kappa B (Jannson et al. 2002; Hur et al. 2007).
Wie die OPN-Expression in Th1-polarisierenden Immunzellen gesteuert wird ist bisher
wenig erforscht. Shinohara et al zeigte, dass in T-Zellen die OPN Expression durch T-bet
reguliert wird (Shinohara et al. 2005). Der Transkriptionsfaktor T-bet steuert die
Polarisierung von T-Helferzellen zu einem Th1- Phänotyp. Die T-bet abhängige
Expression von OPN fördert die Differenzierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen zu Th1
oder Tc1-Zellen. Auch fördert OPN die Aktivierung und Migration von Dendritischen
Zellen und induziert ihre Maturation zu einem Th1 polarisierenden Phänotyp (Weiss et al.
2001; Renkl et al. 2005). Diese Eigenschaften sind wichtig für die Auslösung und
Aufrechterhaltung der Kontaktallergie.
Eine weitere wichtige Funktion von OPN bei zellvermittelnden Immunreaktionen ist seine
chemotaktische und migrationsfördende Wirkung auf immunkompetente Zellen. OPN
wirkt auf verschiedene Zellsysteme migrationsfördernd (z .B. Endothelzellen, glatte
Einleitung
9
Muskelzellen, Lymphozyten und Makrophagen) (Senger et al. 1996; Liaw et al. 1995).
Weiss et al. konnte zeigen, dass OPN chemotaktisch auf DZ und LZ wirkt (Weiss et al.
2001).
OPN induziert die Auswanderung von murinen LZ aus der Haut und lockt DZ in die
regionalen Lymphknoten. Dies geschieht über die Interaktion der Dentritischen Zellen mit
den OPN-Rezeptoren CD44 und αvβ3 Integrin. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die
Expression
von
MHC-
Klasse
II
(engl.:
major
histocompatibility
complex),
kostimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen durch OPN aufreguliert wird (
Weiss et al. 2001; Renkl et al. 2005). Ein weiterer interessanter Aspekt ist, dass OPN die
pro-angiogenetische Sekretion von IL-1ß durch Monozyten induziert. Dieser Effekt könnte
zu einer erhöhten Blutgefäßneubildung in chronischen Entzündungsreaktionen beitragen
(0`Regan et al. 2000, Sodek et al. 2006).
1.6.3. Osteopontin und Immunerkrankungen
Die Assoziation von OPN mit Autoimmunerkrankungen wurde zum ersten Mal vor 20
Jahren beschrieben (Lampe et al. 1991; Singh et al. 1990). Die OPN Überexpression wurde
bei Multipler Sklerose, Rheumatoider Arthritis und dem Systemischen Lupus
erythematodes (SLE) untersucht (Hur et al. 2007; Yamamoto et al. 2003; Chabas et al.
2001;
Jansson et
al. 2002;
Xu et
al.
2007).
SLE ist
eine
generalisierte
Autoimmunerkrankung, die in ihrem chronisch rezidivierenden Verlauf alle Organe
betreffen kann und besonders an Haut, Gelenken, Nieren und serösen Häuten zu
Schädigungen führt. Pathophysiologisch findet sich eine veränderte T-Zell-Immunantwort
und eine Dysregulation der B-Zell Aktivierung mit Produktion von Autoantikörpern
(Weber et al. 2001). Patienten, die an SLE und Rheumatoider Arthritis erkrankt sind,
weisen erhöhte OPN Serumspiegel auf (Wong et al. 2005). Bei Kaukasiern war das
Auftreten einer Genvariante von OPN (707C>T, rs 1126616) signifikant assoziert mit SLE.
Studien von Alfonso et al. bestätigten diese Ergebnisse und berichteten über 2
Sequenzvarianten von OPN, die die Anfälligkeit für systemischen Lupus erythematodes
erhöhen (Alfonso et al. 2005). Das MRL-lpr Mausmodell bestätigt einen entscheidenden
Einfluss von OPN auf den SLE. (Theofilopoulos et al. 1985). Die exakten Mechanismen
wie OPN die Entwicklung von systemischem Lupus erythematodes fördert sind noch
unklar. Vermutlich beeinflusst OPN die Lymphozytenproliferation und wirkt antiapoptotisch (Chiocchetti et al. 2004).
Einleitung
10
1.7. Osteopontinrezeptoren und ihre Funktion
1.7.1. OPN-Rezeptoren aus der Integrinfamilie
Integrine sind Glycoprotein-Oberflächenrezeptoren, die Zell-Zell-Wechselwirkungen und
Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix vermitteln. Sie sind
Heterodimere, die jeweils aus einer α-Kette und einer nicht kovalent gebundenen β- Kette
aufgebaut sind. Die Integrin-Familie besteht aus 24 Mitgliedern, die sich aus 18α
Untereinheiten und 8β Untereinheiten zusammensetzt (van der Flier. 2001). Daraus können
sich 24 verschiedene Heterodimere bilden. Alternatives Spleisen der m-RNA von einigen α
und β Untereinheiten und posttranslatinelle Modifikationen erhöht nochmals die Diversität
der Integrine.
Integrine, die das Zytoskelett ordnen, sind relevant für die Proliferation, die
Differenzierung, die Apoptose von Zellen und die Zellwanderung (van der Flier. 2001).
Für OPN wurden verschiedene Integrinrezeptoren beschrieben. Integrine können OPN
RGD-abhängig binden. OPN interagiert über eine Adhäsionssequenz mit αv-Integrinen wie
z.B. αvβ3, αvβ1, αvβ5, α8β1 und α5β1) (Hu et al. 1995; Liaw et al. 1995; Denda et al. 1998;
Barry et al. 2000). Die RGD-unabhängige Bindung an das OPN Molekül erfolgt über die
Integrine α4β1, α4β7 und α9β1 (Yokosaki et al. 1999; Green et al. 2001; Palmer et al.
1993; Smith et al. 1996; Bayless et al. 1998). Sie binden an das SVVYGLR-Motiv des
OPN. Der am besten charakterisierte OPN Rezeptor ist αvβ3 Integrin. Dieser Rezeptor
ermöglicht OPN u. a. die Bindung an B-Zellen, Thrombozyten, Osteoklasten und glatte
Muskelzellen (Reinhold et al. 1990; Liaw et al. 1994; Liaw et al. 1995b; Bennett et al.
1997). Daneben vermittelt der αvβ3 Integrin Rezeptor die OPN induzierte Migration von
glatten Muskelzellen und Endothelzellen (Senger et al. 1996, Liaw et al. 1995).
1.7.2. Der OPN-Rezeptor CD44
CD44 ist ein transmembranärer Oberflächenrezeptor. Er vermittelt als Adhäsionsmolekül
Zell-Matrix und Zell-Zellinteraktionen und wird stark bei akuten und chronischen
Entzündungen aufreguliert (Denhardt et al.2001). Das CD44-Gen besteht in seiner
genomischen Organisation aus 20 Exons (Screaton et al. 1992). 7 Exone kodieren den
konstanten extrazellulären Anteil der Standardform (CD44s). Durch alternatives Spleisen
der nukleären RNA können bis zu 10 Exonvarianten (CD44v1-v10) in den extrazellulären
Teil des CD44s Moleküls eingebaut werden (Screaton et al.1992). CD44 ist funktionell an
der Zell-Zell und Zell-Matrix-Adhäsion beteiligt, wie z. B. der Lymphozytenaktivierung
Einleitung
11
und dem Lymphozytenhoming in die Haut und im Lymphknoten (Jalkanen et al. 1990;
Picker et al. 1989). OPN interagiert mit bestimmten CD44 Isoformen (Weber et al. 1996).
Weber und Mitarbeiter wiesen die CD44 Bindung von Osteopontin bei CD44 transfizierten
Fibroblasten nach (Weber et al. 1996). Die Expression von bestimmten CD44-Isoformen,
die das Exon v6 enthalten spielen eine wesentliche Rolle für die Migration von DZ/ LZ
(Weiss et al. 1997/98).
1.8. Aufgabenstellung
Osteopontin (OPN) ist ein saures Phosphoglykoprotein, das von verschiedenen
Immunzellen insbesondere von T-Zellen, Makrophagen und Dendritischen Zellen
sezerniert wird (O`Regan et al. 2000; Denhardt et al. 2001; Wang et al. 2008). Es besitzt
strukturelle Eigenschaften extrazellulärer Matrixproteine und Th1 Zytokinfunktion. Es
wurde gezeigt, dass OPN einen wesentliche Rolle bei der Auslösung Th1 vermittelter
Immunantworten, bei infektiösen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen spielt
(Cantor et al. 2009, Shinohara et al. 2006; Shinohara et al. 2008; Xanthou et al. 2007;
Weiss et al. 2001; Murugaiyan et al. 2008). Die Kontaktallergie ist eine zellvermittelte
Immunreaktion, die durch antigenspezifische T-Zellen vom Th1 Typ ausgelöst wird.
In dieser Arbeit wurden die OPN Expression und die OPN Rezeptorexpression im akuten
und im chronischen allergischen Kontaktekzem untersucht. Es wurde untersucht, ob
infiltrierende T-Zellen und Dendritische Zellen in Kontaktekzemläsionen OPN
exprimieren und ob Kontaktekzempatienten eine veränderte OPN Plasmakonzentration
aufweisen.
Folgende spezielle Fragestellungen wurden bearbeitet:
-
Durch immunhistochemische Färbungen von Hautproben aus akuten und chronischen
Kontaktekzemen sowie gesunder Haut sollte geklärt werden, ob OPN in der Epidermis,
der Dermis, dem Gefäßplexus und im entzündlichen Infiltrat exprimiert wird und wie
sich die OPN-Expression in gesunder Haut, im akuten Kontaktekzem und während der
Chronifizierung von Ekzemen darstellt.
-
Es sollte der Frage nachgegangen werden in welchem Bereich die verschiedenen OPNRezeptoren CD44s, CD44v6, αvß3 und αv in den verschiedenen Ekzemstadien im
Vergleich zu gesunder Haut exprimiert werden
und wie sich die OPN
Rezeptorexpression in gesunder Haut, im akuten Kontaktekzem und im Verlauf der
Chronifizierung des Ekzems darstellt.
Einleitung
-
12
Es sollte untersucht werden, ob infiltrierende T-Zell Untergruppen (z. B. CD45RO) und
infiltrierende DZ (CD1a) im akuten und chronischen Kontaktekzem OPN exprimieren.
-
Durch immunhistochemische Färbungen serieller histologischer Schnitte von akuten
und chronischen Kontaktekzemläsionen sollte geklärt werden, welche T-Zell
Subpopulationen am perivaskulären entzündlichen Infiltrat beteiligt sind.
-
Während in immunhistochemischen Färbungen die lokale OPN-Expression dargestellt
wird, sollte durch Elisa Untersuchungen die
OPN-Plasmakonzentration bei
Kontaktekzempatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen bestimmt werden.
Material und Methoden
13
2 Material und Methoden
2.1. Patienten
2.1.1. Patienten Hautprobe
Es wurden Hautbiopsien von Patienten mit Ekzemreaktionen gewonnen. Als Kontrolle
dienten Hautbiopsien gesunder Personen. Untersucht wurden Biopsien von 9 Patienten mit
einer akuten Ekzemreaktion und Biopsien von 6 Patienten mit chronischer Ekzemreaktion.
Es handelt sich um 5 Männer und 10 Frauen im Alter von 27 bis 85 Jahren.
Gruppe 1: Patienten mit akutem Kontaktekzem (n=9)
Patient
Geschlecht Alter
Histologie
293/04
w
27
Akutes Kontaktekzem auf Nickel
602/04
w
38
Subakutes Ekzem
410/04
w
57
Akutes Kontaktekzem auf Nickel
509/03
w
75
Nummuläres Ekzem, Kontaktekzem
1369/03
w
54
Subakutes Ekzem
1076/03
m
54
Vereinbar mit atopischem Ekzem
378/04
m
49
738/03
w
65
Ekzem, hämatogenes Kontaktekzem
523/03
w
69
Subakutes Ekzem
Subakutes Ekzem
Gruppe 2: Patienten mit chronischem Kontaktekzem (n=6)
Patient
Geschlecht
Alter
Histologie
1347/03
w
85
Chronisch-lichenifiziertes Ekzem
1047/03
w
59
chronisches Ekzem
1710/03
m
81
chronisches Ekzem
1313/04
m
61
chronisches Ekzem
1737/03
w
65
Subakutes bis chronisches Ekzem
502/04
m
27
Chronisches Ekzem
Material und Methoden
14
Gruppe 3: Kontrollpersonen mit gesunder Haut (n=10)
Patient
Geschlecht
Alter
Histologie
377/04
w
32
Normalhaut
453/04
w
29
Normalhaut
P60/04
m
53
Normalhaut
P31/05
m
46
Normalhaut
P2/05
m
28
Normalhaut
P3/05
m
28
Normalhaut
P6/05
w
64
Normalhaut
P8/05
m
53
Normalhaut
P10/05
m
42
Normalhaut
P29/05
m
23
Normalhaut
2.1.2.Patienten Plasmaprobe
Gruppe 1: Patienten mit Kontaktekzem (n=19)
Patient
Geschlecht
Alter
Art de Ekzems
JH
w
20
Handekzem; Kontaktallergie auf Nickel
AB
w
28
Kontaktekzem auf Nickel nach Nickelprovokation
DM
w
27
Kontaktekzem auf Nickel
GG
w
58
Kontaktekzem auf Nickel nach Nickelprovokation
PW
m
61
Multiple Typ IV Allergien mit Ekzem
KS
m
47
Hyperkeratotisch-rhagadiformes
Handekzem,
Kontaktallergie
ID
w
23
Kontaktekzem auf Nickel
JG
m
43
Kontaktallergisches Ekzem
RB
w
77
Stauungsekzem mit Kontaktallergie
LA
w
58
Hyperkeratotisch-rhagadiformes
Handekzem,
Kontaktallergie
AK
m
53
Ekzem
mit
nummulärer
Komponente,
Kontaktallergie
MM
w
32
Kontaktekzem auf Nickel
ML
M
49
Handekzem, Kontaktallergie auf Nickel
Material und Methoden
15
SH
w
32
Kontaktekzem auf Nickel
CF
w
41
Chronisches
Ekzem
bei
atopischer
Diathese,
Kontaktallergie
CL
w
38
Chronisches Handekzem, Kontaktallergie
PS
m
55
Chronisches Hand und Fußekzem, Kontaktallergie
AS
w
47
Chronisches
Ekzem
bei
atopischer
Diathese,
bei
atopischer
Diathese,
Kontaktallergie
SS
w
22
Chronisches
Ekzem
Kontaktallergie
Gruppe 2: gesunde Kontrollpersonen (n=19)
Patient
Geschlecht
Alter
Art de Ekzems
HU
w
61
gesund
MU
m
66
gesund
BG
w
66
gesund
AG
m
68
gesund
AG
m
64
gesund
MM
m
29
gesund
HM
m
68
gesund
LM
w
58
gesund
RC
m
30
gesund
HH
w
49
gesund
MW
m
53
gesund
DK
m
35
gesund
AA
m
26
gesund
AK
w
34
gesund
CT
m
35
gesund
SH
w
50
gesund
KA
w
25
gesund
AH
w
28
gesund
KB
w
25
gesund
Material und Methoden
16
2.2. Gewebeproben
2.2.1. Gewinnung
Von Patienten mit unterschiedlicher Ausprägung von Kontaktekzemen und von alters- und
geschlechtgematchten gesunden Probanden wurden je 5ml Plasma und Serum asserviert.
Weiterhin wurden Hautproben aus betroffener und unbetroffener Haut von Patienten und
Haut von gesunden Probanden für immunhistologische Untersuchungen gewonnen. Ein
entsprechender Ethikantrag zum Aufbau einer Gewebe- und Plasmabank von Patienten und
gesunden Probanden wurde von der Ethikkommision Ulm am 25.02.2004 genehmigt
(05/2004). Die Empfehlungen des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki, in der vom
Weltärztebund bei seiner 52. Generalversammlung im Oktober 2000 in Edinburgh/
Schottland beschlossenen revidierten Fassung) wurden beachtet.
Nach mündlicher und schriftlicher Aufklärung und nach schriftlichem Einverständnis
wurde von den volljährigen Probanden Hautbiopsien entnommen.
2.2.2. Weiterverarbeitung der Proben
Die gewonnenen Hautbiopsien wurden in 4%iger gepufferter Formalinlösung fixiert und
durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert. Als Intermedium (alkoholentziehende
paraffinlösliche Flüssigkeit) diente Xylol. Danach wurde das Gewebe in Paraffinblöckchen
ausgegossen (Ausgießrähmchen aus Messingwinkel).
Mit Mikrotomen wurden 5μm dicke Schnitte hergestellt. Diese wurden im Wasserbad
durch Objektträger aufgefangen und im Brutschrank bei ca. 60°C getrocknet.
2.3. Grundprinzip der immunhistologischen Technik
Das Prinzip beruht auf der spezifischen Erkennung von Antigenen in Schnitten und
Geweben durch monoklonale Antikörper (Boenisch 2001). Eine Verstärkung des Signals
erhält man durch Brückenantikörper. Durch eine Farbreaktion kommt es zur
Sichtbarmachung des Antigens.
Wichtig ist die Vorbehandlung der Gewebe. Die Bindungsstellen, an die der Antikörper
binden soll, dürfen nicht durch zu lange Formalineinwirkung zerstört oder maskiert sein.
Durch entsprechende Vorbehandlung der Schnitte (Antigendemaskierung) kann dies
vermieden werden. Verschiedene Verfahren sind entwickelt: Mit Proteinase K, Kochen der
Gewebsschnitte in der Mikrowelle oder, wie hier angewendet, Antigendemaskierung im
Dampfgarer mit z. B. Target Retrieval Solution (Dako) (Pileri et al. 1997, Taylor et al.
Material und Methoden
17
1996). Nach der Blockierung der endogenen Peroxidase wird der primäre Antikörper als
gebrauchsfertige Lösung oder verdünnt auf den Schnitt aufgetragen. Meist verwendet man
hierzu monoklonale Antikörper aufgrund ihrer höheren Spezifität. Nach der klassischen
Immunhistologiemethode wird, nach dem der primäre Antikörper an die entsprechenden
Antigene im Hautpräparat gebunden hat, ein Sekundärantikörper (Brückenantikörper)
aufgebracht. Dieser heftet sich an den Fc-Teil des Primärantikörpers.
An den Sekundärantikörper werden Stoffe z. B. Enzyme gekoppelt, die eine Farbreaktion
ermöglichen.
Es gibt enzymatische Methoden z. B. den Avidin-Biotin Komplex oder alkalische
Phosphatase anti-alkalische Phosphatase. Die Farbreaktionen werden mit löslichen
Substraten z. B. DAB ausgelöst (Boenisch 2001).
2.4. Materialien
2.4.1. Primäre Antikörper
Folgende Antikörper wurden verwendet:
Monoklonale Antikörper
Primärantikörper Klon
Firma
Verdünnung Isotyp
anti- CD1a
Dako-Cytomation,
1:50
mu-IgG1, κ
1:30
mu-IgG1, κ
010
Hamburg, BRD
anti- CD3
F7.2.38
Dako-Cytomation
anti-CD4
1F6
Zymed, San Francisco, CA, unverdünnt
mu-IgG1
USA
anti-CD8
C8/144B Dako-Cytomation
1:100
mu-IgG1, κ
anti-CD68
KP1
unverdünnt
mu-IgG1, κ
anti-HLA-Dr
TAL.1B5 Dako-Cytomation
1:50
mu-IgG1, κ
anti-CD45 R0
UCHLl
Dako-Cytomation
Chemicon, Temecula, CA, 1:100
mu-IgG2a
USA
anti-OPN
MP3B10 University
of
Iowa unverdünnt
mu-IgG1, k
Hybridoma Bank, USA
anti β5
Chemicon International
1:750
mu-IgG1
anti- alphav
Chemicon international
1:750
mu-IgG1
1:10
mu-IgG1
anti-αvβ3
LM 609
Chemicon International
anti-CD44std
SFF-2
Bender Med Systems, Wien, 1:3000
mu-IgG2a
Material und Methoden
18
Österreich
Anti-CD44var(v6)
VFF-18
Bender Med Systems
1:3000
mu-IgG1
Isotypkontroll- Antikörper
Primärantikörper Klon
Firma
Verdünnung Isotyp
Anti-IgG1
MOPC-31-C BD-Pharminogen
1:100
mu-IgG1, κ
Anti-IgG2a
G155-178
1:100
mu-IgG2a
BD-Pharminogen
2.4.2. Verwendete Reagenzien und Geräte
Verwendte Reagenzien
Code-Nr. Firma
DAB- Färbung
Peroxidase Blocking
S2001
Dako-Cytomation
Dako RealTMEnVisionTMHRP,Rabbit/ Mouse (ENV)
K5007
Dako-Cytomation
Dako RealTMbstrate Buffer
K5007
Dako-Cytomation
Dako RealTMDAB+Chromogen
K5007
Dako-Cytomation
Dako RealTM Antibody Diluent
S2022
Dako-Cytomation
Dako REAL TMLink, Secondary Antibody
K5000
Dako-Cytomation
Dako REAL TMAPAAP Immunocomplex
K5000
Dako-Cytomation
Dako REAL TM Chromogen Red 1
K5000
Dako-Cytomation
Dako REAL TM Chromogen Red 2
K5000
Dako-Cytomation
K5000
Dako-Cytomation
K5000
Dako-Cytomation
APAAP-Färbung
Dako REAL
TM
Chromogen Red 3
Dako REAL TM AP Substrate Buffer
Allgemeine Reagenzien
Firma
Trishydroxymethylaminomethan
USB Corporation USA
HCL (37%)
Riedel-de Haen
Natriumchlorid (NaCL)
Applichem GmbH
Ethanol
Riedel-de Haen
Mayers Hämalaunlösung
Merck
Material und Methoden
19
Entellan Eindeckmedium
Merck
Target Retrieval Puffer PH 6,1
Dako S1699
Xylol
Riedel de Haen
Verbrauchsmaterialien
Firma
Deckgläser
VWR international
Glasobjektträger
Menzel Gläser Super Frost Plus
Pipettenspitzen (10μl, 100μl, 1000μl)
Eppendorf
1,5ml Tubes
Eppendorf
Geräte
Firma
Abzug
Hohenloher
Diverse Glaskolben, -gefäße und
Duran Hirschmann EM Techcolor
-meßbecher
Elektronische Präzisionswaage
Scaltec
Lichtmikroskop
Zeiss
Magnetrührer
IKAR Werke
Mikroliterpipetten
Eppendorf
pH-Meter
Schott
Vortex- Schüttelgerät
Scientific Industries
2.4.3. Herstellung von Puffern und Lösungen
Puffer/Lösung
Anleitung
1. Tris- Puffer
Herstellung eines 0,05M TBS-Puffer pH: 7,6.
Hierzu wird 6,075g Tris (hydroxymethyl)- aminomethan in 250ml
Aqua dest gelöst. Es wird 8,766g NaCL (=150mmol) hinzugefügt.
Danach gibt man 1N HCL (Ca 80ml) hinzu bis ein pH-Wert von
7,6 erreicht ist. Anschließend wird die Lösung mit Aqua dest
aufgefüllt bis ein Volumen von 1000ml erreicht ist und der pHWert wird kontrolliert. Es wird eine 10x-fache Konzentration vor
Beginn angesetzt, da viel TBS-Puffer benötigt wird. Vor Gebrauch
wird wieder verdünnt.
Material und Methoden
20
Puffer/Lösung
Anleitung
2. 1N HCL
Herstellung von 1N HCL:
Es wird 81,8ml 37%-ige rauchige HCL auf 1 Liter H2O angesetzt.
Zuerst wird 800ml bidest. H2O in den Glaskolben gefüllt. Danach
fügt man 81.8ml rauchige HCL hinzu und füllt auf ein Volumen
von 1000ml auf.
3. Puffer für Antigen- Puffer Target Retrieval pH 6,1, Dako S1699x10 vor Gebrauch
demaskierung
verdünnen. Für eine Küvette 20ml Puffer und 180ml Aqua dest
ansetzen.
4. DAB-Färbelösung
Die DAB- haltige Substrat- Arbeitslösung (CHROM)b wird durch
gründliches Mischen von 20μl Dako REAL
(Fläschen C) und 1ml Dako REAL
TM
TM
DAB+ Chromogen
Substrate Buffer (Fläschen
B) angesetzt.
5. APAAP-Färbe-
Die
Chromogen
Red
enthaltende
Substrat-
Arbeitslösung
lösung
(CHROM) wird angesetzt, indem 750μl AP Substrate Buffer
(Fläschen F) mit 30μl Chromogen Red 1 (Fläschen C), 30μl
Chromogen Red 2 (Fläschen D) und 30μl Chromogen Red 3
(Fläschen E) in genau dieser Reihenfolge zugegeben werden, nach
Zusatz jedes einzelnen Chromogens gründlich mischen. CHROM
innerhalb von 20 Minuten verbrauchen.
2.5. Färbeprotokolle
2.5.1. Die DAB Methode
2.5.1.1.
generelle Anmerkungen zum Dako RealTM EnVisionTM Detektionssystem
Peroxidase/DAB+
Es wurde das Dako EnVisionTM-System verwendet. Im Gegensatz zur ABC-Methode, bei
der 3 Schritte aufeinanderfolgen (primärer Antikörper, Brückenantikörper und sekundärer
Antikörper), sind bei der Dako EnVision Methode nur 2 Schritte erforderlich (primärer
Antikörper, Dako EnVisionTM)( Sabattini et al. 1998). Das Dako EnVisionTM- System
eignet sich für immunhistochemische Färbungen mit Primärantikörper (mono- oder
polyklonal) aus der Maus oder dem Kaninchen. Es besteht aus Polymerketten an den die
Material und Methoden
21
Sekundärantikörper (Ziege Anti- Maus oder Anti- Kaninchen) und die Enzyme HRP (=
Meerettichperoxidase) und AP (=alkalische Phosphatase) gebunden sind. Das Dako
EnVisionTM- System kann als gebrauchsfertige Lösung verwendet werden und wird nur auf
den Objektträger aufgetropft ( Marc Key. 2009) . Diese Methode ist empfindlicher als die
ABC- Methode. Die Farbreaktion kann wie hier angewandt mit DAB (braun) erzielt
werden. Sie kann aber auch mit AEC (rot) oder Fast Red (rot) vorgenommen werden. Das
DAB + Chromogen besteht aus der konzentrierten Diaminobenzidinlösung (DAB-Lösung)
und dem wasserstoffperoxidhaltigen Substratpuffer. Vor dem Gebrauch muss DAB+
Chromogen mit dem Substratpuffer verdünnt werden.
Abbildung 1: EnVision
TM
– 2-Schritt-Detektionssystem (nach Methodenblatt Envision, Dako
Cytomation)
HRP
Meerrettichperoxidase
AP
Alkalische Phosphatase
2.5.1.2.
Durchführung
Vorbereitung für die Färbung:
Schritt Anleitung
1
Küvetten für Xylol und Ethanol:
Jede Küvette benötigt ca. 250ml Flüssigkeit. Xylol verwendet man pur. Die
Ethanolverdünnungsreihe wird unter Verwendung eines 100%-igen Ethanols mit
H2O (bidest) hergestellt.
2
Objektträger markieren: z.B. welcher Antikörper befindet sich an welcher
Position.
3
Feuchte Kammer: Damit die Objektträger nicht austrocknen, werden sie in der
Material und Methoden
22
Inkubationszeit in Aluboxen mit Deckel gelegt. Dazu befestigt man 2
Glasstäbchen am Boden. Darüber legt man Zellstoff, der mit H2O befeuchtet wird.
Vorgehen bei der Färbung:
Um zu verhindern, dass die Schnitte während der Färbung austrocknen werden in
Färbepausen die Schnitte im TBS-Pufferbad gelagert.
Schritt Anleitung
1
Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte:
30 min bei 57°C im Brutschrank.
2
Entparaffinierung der Schnitte erfolgt durch Xylol ( 2x 10min).
3
Rehydrierung durch Ethanol (100%, 95%, 80%,70%) (2x für 3-5min).
4
Eintauchen in aqua bidest für 3-5min
5
Umpufferung mit 1xTBS für 3-5min
6
Zur
Antigendemaskierung
wurden
die
Gewebsschnitte
im
Dampfgarer
vorbehandelt. Hierzu wurde eine Küvette mit Target-Retrieval-Puffer pH 6,1
gefüllt (Dako, Hamburg, Deutschland) 20ml Puffer und 180ml aquadest auf
120°C erhitzt und 20min mit der puffergefüllten Küvette vorgewärmt. Nach 20
min wurden die Gewebsschnitte in die Küvette verteilt und für 30min in der
Küvette gekocht. Abschließend wurde die Küvette aus dem Dampfgarer
entnommen und bei geöffnetem Deckel für 20min abgekühlt.
7
Anschließend wurde kurz in aqua dest gespült.
8
Danach wurden die Schnitte für 3-5min in das TBS-Pufferbad gestellt.
9
Auf den getrockenen Objektträgern wurden die Gewebsschnitte mit einem
Wachsstift (Dako) umrandet.
10
Die
Inkubation
zur
Blockierung
der
endogenen
Peroxidase
mit
der
gebrauchsfertigen Peroxidase-Blockierungsreagenz (Dakocytomation) wurde für
5min direkt auf den Schnitt aufgetragen.
11
Spülen im TBS-Puffer. Dann wurden die Schnitte 2x für 3-5min ins TBSPufferbad gestellt.
12
Anschließend wurden die Schnitte, in einer feuchten Kammer mit dem jeweiligen
Primärantikörper benetzt und für 30-45min bei Raumtemperatur inkubiert. Der
Primärantikörper wurde entweder in der jeweiligen Verdünnung, durch
Titrationsversuche bestimmt oder gebrauchsfertig auf den Schnitt pipettiert.
Material und Methoden
23
Schritt Anleitung
13
Mit TBS wurde der überschüssige AK herausgewaschen und für 3-5min in das
TBS-Pufferbad gestellt.
14
Anschließend wurde für 20min die Envision TM-Lösung aufgetropft.
15
Spülen erfolgte mit TBS-Puffer und für 2x 3-5min wurden die Schnitte in das
Pufferbad gestellt.
16
Mit DAB+ Chromogen wurde die Farbreaktion unter Sichtkontrolle ausgelöst. Zur
Vermeidung einer Überfärbung wurde nach ca. 5min mikroskopisch kontrolliert.
17
Anschließend wurde mit TBS-Puffer gewaschen und die Schnitte wurden für 2x
3-5min in das Pufferbad gestellt.
18
Es wurde nochmals DAB+ Chromogen aufgetragen und für 2x 3-5min auf dem
Schnitt belassen.
19
Anschließend wurde mit TBS-Puffer gewaschen und die Schnitte wurden für 2x
3-5min in das Pufferbad gestellt.
20
Zum Abschluss wurden die Schnitte kurz in aqua bidest gespült und mit
Hämalaun (mit Alkohol) für 30 Sekunden gegengefärbt. Auslösung des
Farbumschlages erfolgte durch Bläuen unter fließendem Wasser für 7-10
Minuten.
21
Die Dehydratation erfolgte über die aufsteigende Ethanolreihe (70%, 80%, 95%,
100% für je 2x 3-5min.
22
2x 3-5min in Xylol
23
Die Schnitte wurden mit Entellan eingedeckt.
Färbeergebnis: Positive Immunhistochemiesignale stellen sich braun dar, die Kerne
durch die Gegenfärbung blau.
2.5.2. Doppelfärbung
2.5.2.1. generelle Anmerkung zur Doppelfärbung
Mit einer Doppelfärbung ist es möglich, mehrere Zielproteine auf einem Schnitt
nachzuweisen. Mit der Doppelfärbung lassen sich auf einer Zelle zwei verschiedene
Antigene nachweisen z.B. ob eine CD1a positive Zelle auch Osteopontin exprimiert. Dies
bezeichnet man als Kolokalisation zweier Antigene. Hier gibt es mehrere Möglichkeiten.
Material und Methoden
24
Beim Schneidevorgang kann man Serienschnitte anfertigen. Bei entsprechender
Schnittdicke kann davon ausgegangen werden, dass auf benachbarten Schnitten dieselben
Zellen vorhanden sind. Die Methode hat allerdings den Nachteil, dass man die Auswertung
der beiden Objektträger nacheinander im Mikroskop betrachten muss und damit eine
Verwechslungsmöglichkeit besteht. Als Alternative steht die Doppelfärbung zur
Verfügung. Hierbei werden durch den Einsatz unterschiedlicher Farben 2 Antigene auf
dem Schnitt gleichzeitig nachgewiesen (Nanna K Christensen und Lars Winter 2009).
Dazu werden zwei verschiedene Detektionssysteme verwendet. Hierzu wurde der erste
Primärantikörper mit der Envision Methode, der zweite mit der APAAP-Methode
dargestellt. Es werden 2 verschiedene Chromogene eingesetzt, die einen deutlichen
Farbkontrast aufweisen. In dieser Arbeit wurden die Farbstoffe DAB und Neufuchsin
verwendet. Ein Nachteil ist die räumliche Nähe der Antigene. Es kann zu unklaren
Überschneidungen in der Färbung kommen.
Die Kernfärbung erfolgte mit Hämalaun.
2.5.2.2. Durchführung
Für immunhistochemische Doppelfärbungen wurden die Gewebsschnitte wie für
Einfachfärbungen behandelt und anschließend für 3-5 Minuten in aqua bidest gewaschen.
Es erfolgte die Darstellung des zweiten Antigens mit folgendem Protokoll.
Schritt
Anleitung
1
Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem zweiten Primärantikörper für
30-45 Minuten in der feuchten Kammer in der entsprechenden Verünnung.
2
Mit TBS wurde der überschüssige Antikörper herausgewaschen und für 35min in das TBS-Pufferbad gestellt.
3
Aufbringen des Brückenantikörpers ChemMate 2AB, Dako für 30 Minuten
4
Spülen erfolgte mit dem TBS-Puffer und die Schnitte wurden für 3-5min.
in das Pufferbad gestellt.
5
Aufbringen des APAAP-Komplexes für 30min
6
Anschließendes Spülen erfolgte mit dem TBS-Puffer und die Schnitte
wurden für 3-5Minuten in das Pufferbad gestellt.
7
Durchführung einer Neufuchsinfärbung (Dako, 8min.)Auch hier erfolgte
die Neufuchsinfärbung zweimalig und wurde jeweils lichtmikroskopisch
kontrolliert.
Material und Methoden
25
Schritt
Anleitung
8
Zwischen den einzelnen Färbeschritten wurden die Schnitte im TBS-Puffer
gewaschen (2x 3-5min.)
9
Anschließend spülen in aqua dest.
10
Die
Gegenfärbung
erfolgte
mit
Hämalaun.
Dann
Bläuen
mit
Leitungswasser für 7-10min. Anschließend kurz in aqua dest wie bei der
Einfachfärbung.
11
Die Dehydratation erfolgte über die Ethanolreihe (70%, 80%, 95%, 100%)
für je 2x 3-5min.
12
2x 3-5min in Xylol
13
Die doppelgefärbten Schnitte wurden mit Entellan eingedeckt.
Färbeergebnis: Positive Immunhistochemiesignale stellen sich braun (DAB) und rot
(Neufuchsin) dar. Die Kerne stellten sich durch die Gegenfärbung blau
dar.
Bei jeder Doppelfärbung wurden Isotypkontrollen durchgeführt. Ebenso die jeweiligen
Einzelfärbungen. Bei unklaren Ergebnissen in der Doppelfärbung kann das Ergebnis mit
den jeweiligen Einzelfärbungen verglichen werden.
2.6. Auswertungsverfahren
Die Auswertung der einzelnen Präparate fand am Lichtmikroskop in einer 20 fachen
(Gefäße) und 40 fachen (Zellen im entzündlichen Infiltrat) Vergrößerung statt. Als positiv
wurden Zellen gewertet, deren Kern eindeutig zu identifizieren war und die eine deutliche
braune Färbung aufwiesen. Bei Doppelfärbungen galten jene Zellen als doppelt positiv,
deren Zellkern sichtbar war und die sowohl den braunen als auch den roten Farbton
aufwiesen. Bei jeder Färbung wurden 4 repräsentative
Gesichtsfelder eines Schnitts
beurteilt. Es wurde die absolute Anzahl an OPN positiven Kapillaren bzw. Zellen in einem
Gesichtsfeld bestimmt und der relative Anteil der angefärbten Zellen innerhalb des
entsprechenden Zellkollektivs angegeben. Anschließend wurde der arithmetische
Mittelwert berechnet. Die Fotos wurden mit einem Olympus HX 70 Fotomikroskop auf
Diakleinbildfilm aufgenommen und mit einem Diascanner (Nikon) digitalisiert.
Material und Methoden
26
2.7. Statistik
Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt.
Mit Hilfe des „Mann Whitney Rank Sum Tests“ wurde überprüft, ob die Unterschiede
zwischen den einzelnen Versuchsgruppen signifikant sind. Dabei wurde der P-Wert
errechnet. Die statistische Berechnung erfolgte mit SigmaPlot 12 der Systat Software
GmbH.
2.8. Quantitative Bestimmung von OPN mittels Elisa
Zur OPN Quantifizierung im Plasma wurde das humane OPN Assay Kit-IBL Code No.
27158 entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet.
2.8.1 Theoretische Grundlagen
Bei dem verwendeten Sandwich-Elisa (Human Osteopontin Assay Kit- IBL Code No.
27158) wird die zu untersuchende Substanz (OPN) durch einen spezifischen an das
Probengefäss gekoppelten Antikörper nachgewiesen. Dieser erste Antikörper (coatingAntikörper) ist an der festen Phase der 96 Well-Mikrotiterplatte gebunden. Bei Zugabe des
Standards oder der zu untersuchenden Probe bindet das enthaltene OPN an den Antikörper
(IBL instructions, Code Nr. 27158, Japan). Je größer die OPN-Konzentration, desto mehr
OPN bindet an die mit Antikörper beladene Matrix. Anschließend erfolgt die Zugabe eines
zweiten Antikörpers (HRP conjugated Anti- Human OPN (10A16) Mouse IgG Fab`MoAb
(x30)). Dieser ist mit dem Enzym (HRP) gekoppelt und bindet an den Antikörper-OPN
Komplex. Das Enzym setzt das im Folgenden zugegebene Substrat TMB in einen Farbstoff
um. Die enzymatische Substratumsetzung wird durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt.
Je größer die OPN Konzentration der Probe, desto größer die Anzahl der gekoppelten
Antikörper und desto ausgeprägter die Substratumsetzung. Die Messung der Probe erfolgt
photometrisch bei Licht der Wellenlänge 450nm. Die Intensität der Farbe ist dabei der
Konzentration des entstandenen TMB proportional und damit auch der Konzentration des
OPN in der Probe proportional.
Ergebnisse
27
3. Ergebnisse
3.1
OPN-Expression
im
Verlauf
der
Chronifizierung
von
Kontaktekzemen
3.1.1
Verstärkung
der
OPN-Expression
in
der
Epidermis,
durch
Kapillarendothelzellen und infiltrierende Immunzellen
Im Verlauf der Chronifizierung von Kontaktekzemen kommt es zu einer Verstärkung der
OPN-Expression in der Epidermis, durch Kapillarendothelzellen und infiltrierende
Immunzellen.
Durch immunhistochemische Färbungen von Hautproben sollte geklärt werden, ob und in
welchen Bereichen OPN exprimiert wird und wie sich die OPN-Expression in gesunder
Haut, im akuten Kontaktekzem und bei chronifizierten Ekzemen darstellt.
Abb. 1 zeigt repräsentative Fotos der OPN-Expression in gesunder Haut, bei akutem und
chronischem Kontaktekzem.
In allen Hauttypen wird OPN im Bereich der Epidermis durch Keratinozyten exprimiert.
In gesunder Haut (Abb. 1 A, B) findet sich eine diskrete OPN-Expression auf den
Gefäßendothelzellen des papillären Gefäßplexus und auf einzelnen Immunzellen
perivaskulär. Beim akuten allergischen Kontaktekzem (Abb. 1 C, D) kommt es zu einer
Verstärkung der OPN-Expression im papillären Gefäßplexus. Gleichzeitig erkennt man
eine verstärkte OPN-Expression im Bereich des entzündlichen Infiltrates und der
Epidermis. Das chronische Kontaktekzem (Abb. 1 F, G, H) zeigt eine weitere Verstärkung
der OPN-Expression sowohl auf den Gefäßendothelzellen der dilatierten Gefäße als auch
auf den einwandernden Entzündungszellen. Auch hier exprimieren die Keratinozyten
deutlich OPN.
Ergebnisse
28
A
B
C
D
E
F
G
H
Abb. 1 Osteopontin-Expression (OPN-Expression) in gesunder Haut, bei akutem und
chronischem Kontaktekzem
Es wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, immunhistochemische Färbungen von
Hautbiopsien gesunder Haut (A, B), akuter allergischer Kontaktekzeme (C, D) und chronischer
Kontaktekzeme (F-H) mit dem anti-OPN monoklonaler Antikörper MPIIIB10 durchgeführt. In allen
Hauttypen wird OPN im Bereich der Epidermis auf Keratinozyten exprimiert (A-H). (A, B) diskrete
OPN-Expression auf den Gefäßendothelzellen des papillären Gefäßplexus (B Pfeil) und auf
einzelnen Immunzellen perivaskulär. (C, D) Akutes allergisches Kontaktekzem mit verstärkter
OPN-Expression im papillären Gefäßplexus und starke OPN-Expression auf Entzündungszellen
perivaskulär (D). (F-H) Beim chronischen Kontaktekzem kommt es zu einer weiteren OPNVerstärkung auf den Gefäßendothelzellen der dilatierten Gefäße in der Dermis (H Pfeil) und im
Bereich des entzündlichen Infiltrates (G).
(E) Negativkontrolle mit primär irrelevantem
Kontrollantikörper.
Erstveröffentlichung in Am J Pathol., 176/1, Anne M. Seier, Andreas C. Renkl, Guido Schulz, Tanja Uebele, Anca Sindrilaru,
Sebastian Iben, Lucy Liaw, Shigeyuki Kon, Toshimitsu Uede, Johannes M. Weiss, “Antigen-specific Induction of
Osteopontin contributes to the chronification of Allergic Contact Dermatitis”, S. 246-258, 2010 mit der Erlaubnis von
Elsevier.
Zusammenfassend kommt es bei allergischen Kontaktekzemen zu einer Aufregulation der
OPN-Expression in der Epidermis. Insbesondere finden sich starke OPN Expression im
Bereich des entzündlichen Infiltrates. Im Vergleich zum akuten Ekzem zeigt sich bei
chronischen Kontaktekzemen eine weitere Verstärkung der OPN-Expression insbesondere
auf den Gefäßendothelzellen der dilatierten Gefäße.
Ergebnisse
3.1.2
Zunahme
29
der
OPN-Expression
durch
Endothelzellen
des
papillären
Gefäßplexus
Im Verlauf der Chronifizierung von Kontaktekzemen kommt es zu einer Zunahme der
OPN-Expression durch Endothelzellen des papillären Gefäßplexus
In einem weiteren Schritt wurde die OPN-Expression der Kapillarendothelzellen des
papillären Gefäßplexus und der Immunzellen des entzündlichen Infiltrates näher
quantifiziert (Abb. 2 und 3). Vorausgegangene Arbeiten konnten zeigen, dass OPN durch
Gefäßendothelzellen des papillären Gefäßplexus exprimiert wird.
Abb. 2A zeigt die absolute Anzahl OPN positiver Kapillaren pro Gesichtsfeld in gesunder
Haut, im akuten und im chronischen Kontaktekzem. Abb. 2B zeigt den jeweils
prozentualen Anteil OPN positiver Kapillaren bezogen auf die Gesamtzahl pro
Gesichtsfeld. In allen Stadien wird OPN im Bereich der Kapillaren exprimiert. Tendenziell
weist Normalhaut sowohl absolut als auch prozentual die geringsten Werte OPN positiver
Kapillaren auf, während Haut mit akutem Kontaktekzem höhere Werte aufweist. Die
höchsten Werte finden sich beim chronischen Kontaktekzem. Statistisch ließ sich keine
Signifikanz nachweisen.
A
B
Abb. 2 Expression von Osteopontin (OPN) auf Kapillarendothelzellen im akuten und
chronischen Kontaktekzem im Vergleich zu gesunder Haut
Hautbiopsien gesunder Haut, akuter allergischer Kontaktekzeme und chronischer Kontaktekzeme
wurden immunhistochemisch mit dem anti-OPN monoklonalen Antikörper MPIIIB10 angefärbt.
(A) absolute Anzahl OPN positiver Kapillaren pro Gesichtsfeld in gesunder Haut, im akuten und
chronischen Kontaktekzem (Objektiv: 20x). (B) prozentualer Anteil OPN positiver Kapillaren
bezogen auf die Gesamtzahl der Kapillaren pro Gesichtsfeld (Objektiv: 20x). Auf allen Diagrammen
wird die Standardabweichung der zu Grunde gelegten Werte angegeben.
Ergebnisse
30
3.1.3. Zunahme OPN-exprimierender Immunzellen im entzündlichen Infiltrat
Im Verlauf der Chronifizierung von Kontaktekzemen kommt es zur Vermehrung OPNexprimierender Immunzellen im entzündlichen Infiltrat.
Es konnte zuvor gezeigt werden, dass OPN in der Haut während der Sensibilisierungsphase einer Kontaktallergie und in den immunzellreichen T-Zell Arealen der drainierenden
Lymphknoten vermehrt exprimiert wird (Weiss et al. 2001).
Nun wurde die OPN-Expression durch Immunzellen im entzündlichen Infiltrat im akuten
Kontaktekzem und im chronischen Kontaktekzem im Vergleich zu gesunder Haut
untersucht. In gesunder Haut findet sich nur eine geringe Zahl OPN positiver
Infiltratzellen. Haut im akuten Ekzem zeigt mit durchschnittlich 96 OPN positiven Zellen
pro Gesichtsfeld die höchste Anzahl OPN positiver infiltrierender Entzündungszellen. Im
chronischen Ekzem hat die Zahl der insgesamt infiltrierenden Entzündungszellen leicht
abgenommen. Mit 97 % ist jedoch der ganz überwiegende Anteil der Zellen OPN positiv.
A
B
Abb. 3 Osteopontin-Expression (OPN-Expression) auf
Immunzellen im akutem und
chronischem Ekzem, im Vergleich zu gesunder Haut
Hautbiopsien gesunder Haut, akuter allergischer Kontaktekzeme und chronischer Kontaktekzeme
wurden immunhistochemisch mit dem anti-OPN monoklonalen Antikörper MPIIIB10 angefärbt und
wie in Material und Methoden beschrieben ausgewertet.
(A) absolute Anzahl OPN positiver Immunzellen pro Gesichtsfeld in gesunder Haut, im akuten und
chronischen Kontaktekzem (Objektiv: 40x). Die Differenz zwischen Patienten ohne Ekzemreaktion
und akutem Ekzem war signifikant, P= 0,001, Mann-Whitney Rank Sum Test und die Differenz
zwischen Patienten ohne Ekzemreaktion und chronischem Ekzem war signifikant, P= 0,002, MannWithney Rank Sum Test (B) prozentualer Anteil OPN positiver Immunzellen bezogen auf die
Gesamtzellzahl des entzündlichen Infiltrats pro Gesichtsfeld (Objektiv:40x).
Ergebnisse
31
3.2. Expression der OPN-Rezeptoren αv Integrin, CD44s und CD44v6 im
akuten und im chronischen Kontaktekzem
3.2.1 Kolokalisation von OPN mit seinen Rezeptoren CD44 und αvß3
Sowohl im akuten als auch beim chronischen Kontaktekzem findet man eine
Kolokalisation von OPN mit seinen Rezeptoren CD44 und
Nachdem gezeigt werden
konnte, dass in akuten Kontaktekzemen und chronischen Kontaktekzemen große Mengen
von OPN exprimiert werden, wurde die Expression der OPN Rezeptoren CD44 und vß3
in den verschiedenen Ekzemstadien untersucht (Abb. 4). Immunhistochemische Färbungen
serieller Schnitte von akuten und chronischen Ekzemen wurden mit dem anti-OPN mAk
MPIIIB10 und mAk gegen CD44s, CD44v6 und vß3 angefärbt. In den Bereichen hoher
OPN Expression, in der Epidermis und im perivaskulären entzündlichen Infiltrat findet
sich eine starke Expression des CD44s Proteins (Abb. 4 B). CD44v6 Epitope werden von
Keratinozyten exprimiert. Im Bereich des Infiltrats und des papillären Gefäßplexus zeigt
sich hingegen nur eine schwache oder keine CD44v6 Expression (Abb. 4 C). Der OPN
Rezeptor vß3 findet sich sowohl in der Epidermis, im papillären Gefäßplexus als auch im
Bereich des entzündlichen Infiltrates (Abb. 4 E und H).
Ergebnisse
32
Abb. 4 Expression von Osteopontin (OPN) und OPN-Rezeptoren bei chronischem Ekzem
Es wurden immunhistochemische Färbungen serieller Schnitte der Hautprobe eines chronischen
Kontaktekzes mit anti-OPN monoklonaler AK (mAk), und mAk gegen die Differenzierungsantigene,
engl. cluster of differentiation (CD) CD44s, CD44v6 und das Integrin avß3 durchgeführt. In den
Bereichen hoher OPN-Expression (A) in der Epidermis und im perivaskulären entzündlichen
Infiltrat zeigt sich ebenfalls eine hohe Expression des CD44s Proteins (B). Auch Keratinozyten
exprimieren stark CD44v6 Epitope (C), nicht aber die Kapillarendothelzellen und die Zellen des
entzündlichen Infiltrates (C). Die Lokalisation des OPN-Rezeptors avß3 findet sich sowohl in der
Epidermis als auch im Bereich des entzündlichen Infiltrates (E und H).
Erstveröffentlichung in Am J Pathol., 176/1, Anne M. Seier, Andreas C. Renkl, Guido Schulz, Tanja Uebele, Anca Sindrilaru,
Sebastian Iben, Lucy Liaw, Shigeyuki Kon, Toshimitsu Uede, Johannes M. Weiss, “Antigen-specific Induction of
Osteopontin contributes to the chronification of Allergic Contact Dermatitis”, S. 246-258, 2010 mit der Erlaubnis von
Elsevier.
3.2.2. Expression der OPN Rezeptoren αv Integrin und CD44s von Endothelzellen des
papillären Gefäßplexus
Im akuten und im chronischen Kontaktekzem werden die OPN Rezeptoren αv Integrin und
CD44s von Endothelzellen des papillären Gefäßplexus exprimiert.
Es wurde die Expression der OPN Rezeptoren αv Integrin, CD44s und CD44v6 in
gesunder Haut, im akuten Kontaktekzem und bei einer Chronifizierung im Bereich des
Ergebnisse
33
papillären Gefäßplexus näher quantifiziert. Die Säulendiagramme in Abb. 5 zeigen die
absolute Anzahl an αv, αvß3, CD44s und CD44v6 positiven Kapillaren pro Gesichtsfeld in
den verschiedenen Hauttypen. In gesunder Haut und im akuten Kontaktekzem ist die
absolute Anzahl der αv, αvß3 Integrin sowie der CD44s positiven Kapillarendothelzellen
vergleichbar (Abb. 5 A B C).
Im Verlauf der Chronifizierung von Kontaktekzemen kommt es zu einer ausgeprägten
Zunahme der Anzahl αv, αvß3 und CD44s positiver Kapillarendothelzellen des papillären
Gefäßplexus (Abb. 5 A B C) CD44v6 enthaltende Isoformen werden durch die
Kapillarendothelzellen in den unterschiedlichen Hauttypen kaum reguliert (Abb. 5 D).
Ergebnisse
A
34
Abb.
5
Expression
Rezeptoren
der
Osteopontin
(OPN-Rezeptoren)
αv-Integrin
und Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation (CD) CD44s und CD44v6 durch
Kapillaren im Kontaktekzem
Es wurden wie in Material und Methoden
beschrieben, immunhistochemische Färbungen
von
Hautbiopsien
gesunder
Haut,
akuter
allergischer Kontaktekzeme und chronischer
B
Kontaktekzeme mit monoklonalem Antikörper
gegen αv (A), αvß3 (B), CD44s (C) und CD44v6
(D) angefertigt.
(A, B, C, D) Die absolute Anzahl der αv, αvß3Integrin positiven Kapillarendothelzellen und der
CD44s
und
CD44v6
positiven
Kapillarendothelzellen pro Gesichtsfeld ist in
gesunder Haut und im akuten Kontaktekzem
vergleichbar.
C
(A, B, C) Beim chronischen Kontaktekzem
kommt es zu einer Zunahme der Anzahl αv,
αvß3
und
Kapillarendothelzellen
CD44s
positiven
des
papillären
Gefäßplexus. Die Anzahl der αv, αvß3 positiven
Kapillaren im akuten Ekzem sind nicht signifikant
höher als im chronischen Ekzem, P= 0,098 und
P= 0,055, Mann Whitney Rank Sum Test.
(D) Geringe Expression des OPN-Rezeptors
CD44v6 durch die Kapillarendothelzellen in den
D
unterschiedlichen Hautproben.
Ergebnisse
35
Der Anteil αv, αvß3 und CD44s positiver Kapillarendothelzellen beträgt in allen Hauttypen
annährend 100%, während CD44v6 durch die Endothelzellen des papillären Gefäßplexus
in den unterschiedlichen Hauttypen nur zu ca. 10% exprimiert wird. Auf die Darstellung
der Abbildung wurde verzichtet. Der angegebene Prozentsatz bezieht sich auf die Anzahl
der angefärbten Kapillaren bezogen auf die Gesamtzahl der Kapillaren im jeweiligen
Gesichtsfeld.
3.2.3. Expression der OPN Rezeptoren αv- Integrin und CD44s von Immunzellen des
entzündlichen Infiltrats
Im akuten und im chronischen Kontaktekzem werden die OPN Rezeptoren αv- Integrin
und CD44s von Immunzellen des entzündlichen Infiltrats exprimiert.
In früheren Arbeiten wurde nachgewiesen, dass OPN mit αv Integrinen interagiert. Die
Migration verschiedener Zelltypen gegen OPN wird durch αvß3 Integrin vermittelt (Liaw
et al. 1995; Senger et al. 1996; Weber et al. 1996) Weiterhin konnte gezeigt werden, dass
die OPN vermittelte Chemotaxis und Adhäsion von Fibroblasten und T-Zelllinien über die
Interaktion mit CD44 Isoformen vermittelt wird (Weber et al. 1996; Katagiri et al. 1999).
Aufgrund dieser Daten wurde die Expression der OPN-Rezeptoren αv-Integrin, CD44s und
CD44v6 auf den Immunzellen im entzündlichen Infiltrat in gesunder Haut, im akuten
Kontaktekzem und chronischen Kontaktekzem quantifiziert.
Abb. 6 zeigen die absolute Anzahl an αv, αvß3, CD44s und CD44v6 positiven
Entzündungszellen pro Gesichtsfeld in den verschiedenen Ekzemstadien. In gesunder Haut
findet sich nur eine geringe Zahl an αv, αvß3, CD44s und CD44v6 positiver Infiltratzellen.
Das akute Ekzem zeigt mit durchschnittlich 70-80 Zellen pro Gesichtsfeld die höchste
Anzahl αv-Integrin positiver infiltrierender Entzündungszellen. Im chronischen Ekzem hat
die absolute Zahl an αv und αvß3 infiltrierender
Ergebnisse
A
36
Abb.
6
Expression
Rezeptoren
der
Osteopontin
(OPN-Rezeptoren)
αv-Integrin
und Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation (CD) CD44s und CD44v6 im
Kontaktekzem.
Es wurden wie in Material und Methoden
beschrieben, immunhistochemische Färbungen
von
Hautbiopsien
gesunder
Haut,
akuter
allergischer Kontaktekzeme und chronischer
B
Kontaktekzeme mit monoklonalem Antikörker
gegen αv (A), αvß3 (B), CD44s (C) und CD44v6
(D) angefertigt.
(A, B, C, D) Gesunde Haut zeigt eine geringe
Anzahl
an αv,
αvß3, CD44s und CD44v6
positiven Infiltratzellen.
(A, B, C, D) Akutes allergisches Kontaktekzem
zeigt die höchste Anzahl an. αv, αvß3, CD44s
C
und CD44v6 Rezeptor positiven Infiltratzellen.
Der Unterschied der Anzahl an αv, αvß3 und
CD44s positiven Infiltratzellen in normaler Haut
verglichen mit Akutem Ekzem ist statistisch
signifikant. (A) P= 0,006; (B) P< 0,001; (C)
P< 0,001, Mann-Whitney Rank Sum Test.
(A, B, D) Im chronischen Ekzem hat die Zahl der
infiltrierenden
abgenommen.
D
Entzündungszellen
Mit
90 %
ist
der
leicht
ganz
überwiegende Anteil der Zellen OPN-Rezeptor
positiv. Auf die Darstellung der Abbildung wurde
verzichtet. Der Unterschied der Anzahl an αv,
αvß3 und CD44s positiven Infiltratzellen in
normaler
Haut
verglichen
mit
chronischem
Ekzem ist statistisch signifikant. (A) P= 0,002;
(B) P= 0,002; (C) P= 0,003, Mann Whitney Rank
Sum Test.
(C) im Verlauf der Chronifizierung kommt es zu
einer Zunahme der Anzahl der CD44s positiven
Infiltratzellen.
Ergebnisse
37
Entzündungszellen leicht abgenommen. Mit ca. 98 % ist der ganz überwiegende Anteil der
Zellen αv und αvß3 positiv. Auf die Darstellung der Abbildung wurde verzichtet.
Gleichzeitig erkennt man eine deutliche Zunahme an CD44s und CD44v6 positiver
Infiltratzellen im akuten Ekzem im Vergleich zu gesunder Haut. Beim chronischen
Kontaktekzem kommt es zu einer weiteren Erhöhung der CD44s positiven Infiltatzellen.
3.3. Im akuten und chronischen Kontaktekzem exprimieren CD45RO +
Gedächtnis T-Zellen OPN
Es wurde untersucht ob infiltrierende CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen in Kontaktekzemen
OPN exprimieren und wie diese Expression sich im Verlauf der Chronifizierung verändert.
Beim akuten Kontaktekzem exprimieren alle CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen in der
Epidermis OPN (Abb. 7). Gleichzeitig findet man in der Dermis in den Bereichen des
inflammatorischen perivaskulären Infiltrates eine starke Expression von OPN auf den
CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen.
Im Vergleich zu akuten Ekzemen erkennt man eine weitere Zunahme der OPN-Expression
im inflammatorischen perivaskulären Infiltrat bei chronischen Kontaktekzemen auf OPNpositiven CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen (Abb.8 10B). Durch die starke Sekretion des
OPN ist das Protein auch im Bereich der extrazellulären Matrix des entzündlichen
Infiltrates lokalisiert. Zu einem ganz überwiegenden Teil handelt es sich bei den
infiltrierenden T-Zellen um CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen, die in Bereichen hoher
Expression lokalisiert sind und selbst OPN exprimieren (Abb. 8 A B C).
Insgesamt kommt es im chronischen Kontaktekzem in der Epidermis
zu einer
ansteigenden Anzahl an OPN-positiven CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen verglichen zum
akuten Kontaktekzem (Abb. 9). Sowohl im akuten als auch im chronischen Kontaktekzem
exprimieren alle CD45RO+ Zellen in der Epidermis und im dermalen Infiltrat OPN (Abb.
10).
Ergebnisse
Abb. 7
38
Expression von Osteopontin (OPN) durch infiltrierende Gedächtnis T-Zellen im
akuten Kontaktekzem
Immunhistochemische Doppelfärbungen mit einem monoklonalen Antikörper gegen OPN (braun)
und Differenzierungsantigen, engl. cluster of differentiation (CD) CD45RO+ (rot). Alle CD45RO+
T-Zellen exprimieren in der Epidermis OPN. Im Bereich des dermalen Infiltrates exprimiert der
überwiegende Anteil der CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen OPN. Vergrößerung 40x.
Ergebnisse
A
39
B
C
Abb. 8
Expression von Osteopontin (OPN) durch infiltrierende Gedächtnis T-Zellen im
chronischen Kontaktekzem
Es wurden wie in Material und Methoden beschrieben immunhistochemische Doppelfärbungen
einer Hautprobe eines chronischen Kontaktekzems mit anti-OPN monoklonalem Antiköper (mAK)
(braun) und mAK gegen Differenzierungsantigen, engl. cluster of differentiation (CD) CD45RO+
(rot) durchgeführt. Die in die Epidermis eingewanderten Gedächtnis T-Zellen und die dermalen
CD45RO+ T-Zellen exprimieren OPN (A, B, C).
OPN liegt auch im Bereich der extrazellulären Matrix. Neben den infiltrierenden T-Zellen
exprimieren auch mikrovaskuläre Gefäßendothelzellen des kapillären Gefäßplexus OPN (C).
Vergrößerungen: (A) 10x, (B) 20x und (C) 40x.
Erstveröffentlichung in Am J Pathol., 176/1, Anne M. Seier, Andreas C. Renkl, Guido Schulz, Tanja Uebele, Anca Sindrilaru,
Sebastian Iben, Lucy Liaw, Shigeyuki Kon, Toshimitsu Uede, Johannes M. Weiss, “Antigen-specific Induction of
Osteopontin contributes to the chronification of Allergic Contact Dermatitis”, S. 246-258, 2010 mit der Erlaubnis von
Elsevier.
Ergebnisse
40
Abb. 9 Expression von Osteopontin (OPN) auf Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation
(CD)
CD45R0+
Gedächtnis
T-Zellen
in
akutem
und
chronischem
Kontaktekzem pro Gesichtsfeld in der Epidermis.
Absolute Anzahl OPN-positiver CD45RO+ Zellen pro Gesichtsfeld in der Epidermis im akuten und
chronischen Kontaktekzem (Vergrößerung: 40x). Die Differenz zwischen beiden Gruppen war nicht
signifikant, P= 0,167, Mann Whitney Rank Sum Test.
A
B
Abb. 10 Expression von Osteopontin (OPN) auf Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation
(CD)
CD45R0+
Gedächtnis
T-Zellen
in
akutem
und
chronischem
Kontaktekzem pro Gesichtsfeld im dermalen Infiltrat.
(A) absolute Anzahl OPN-positiver CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen im dermalen entzündlichen
Infiltrat im akuten und chronischen Kontaktekzem (Vergrößerung: 40x). (B) gibt den prozentualen
Anteil der OPN positiven CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen bezogen auf die Gesamtzahl der
CD45RO+ Gedächtnis T-Zellen im dermalen Entzündungsinfiltrat an (Vergrößerung: 40x).
Ergebnisse
41
3.4. Im akuten und chronischen Kontaktekzem exprimieren CD1a+
Dendritische Zellen OPN und wandern in Bereiche hoher OPN
Expression
Die LZ und DZ spielen in der Pathogenese des Kontaktekzems eine Schlüsselrolle. Sie
sind
in
der
Sensibilisierungsphase
der
Kontaktallergie
wesentlich
an
der
antigenspezifischen T-Zell vermittelten Immunantwort beteiligt. OPN induziert die
Aktivierung und Migration von DZ und ihre Maturation zu einem Th1-polarisierenden
Phänotyp (Weiss et al. 2001; Renkl et al. 2005). Weiterhin konnten Renkl et al. 2005
zeigen, dass OPN die Aktivierung von DZ verstärkt. Gleichzeitig induziert es die TNF-α
und IL-12 Sekretion durch DZ. Das von den DZ sezernierte IL-12 polarisiert T-Zellen zu
einem IFN-γ produzierenden Th1 Phänotyp (Renkl et al. 2005).
Daher sollte untersucht werden, ob CD1a+ DZ speziell in Gewebe mit hoher OPN
Expression einwandern und innerhalb des Entzündungsprozesses selbst OPN exprimieren.
Beim akuten Kontaktekzem exprimiert ein großer Teil der LZ OPN. Dabei findet man
innerhalb der Epidermis ein dichtes Netz an OPN+ CD1a+ Zellen. Gleichzeitig erkennt
man einige OPN+ CD1a+- Zellen in den perivaskulären entzündlichen Infiltraten
(Abb.11).
Beim chronischen Kontaktekzem kommt es zu einer deutlichen Zunahme der Anzahl OPN
positiver Dendritischer Zellen in der Epidermis. Hier findet sich in der Epidermis nicht
mehr das regelmäßige Muster von LZ, wie man es bei gesunder Haut oder beim akuten
Ekzem findet. Ein überwiegender Teil der LZ liegt nahe der Basalmembranzone (Abb. 12
C-F). Viele CD1a+ Zellen sind in Bereiche des stark OPN positiven, entzündlichen
Infiltrates eingewandert. In den Übersichtsaufnahmen erkennt man, dass sich CD1a+
Zellen sowohl in der Epidermis als auch im entzündlichen Infiltrat in Arealen hoher OPN
Expression finden. Auch im perivaskulären Infiltrat erkennt man eine Zunahme an OPN+
CD1a+ Zellen (Abb. 14). Der Anteil an OPN+ CD1a+ Zellen liegt im akuten und
chronischen Kontaktekzem bei ca. 80 %. Auf die Darstellung der Abbildung wurde
verzichtet.
Ergebnisse
42
Abb. 11 Expression von Osteopontin (OPN) durch Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation (CD) CD1a+ Dendritische Zellen (DZ) im akuten Kontaktekzem
Immunhistochemische Doppelfärbungen mit einem monoklonalen Antikörper gegen OPN (braun)
und CD1a (rot). Diese CD1a+ DZ exprimieren in der Epidermis deutlich OPN und sammeln sich
überwiegend im Bereich der Basalmembranzone an. Im Bereich des dermalen Infiltrates exprimiert
der überwiegende Anteil der CD1a+ Zellen OPN. Vergrößerung: 40x.
Ergebnisse
A
C
43
B
F
D
E
Abb. 12 Expression von Osteopontin (OPN) durch Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation (CD) CD1a+ Dendritische Zellen (DZ) im chronischen Kontaktekzem
Immunhistochemische Doppelfärbungen mit einem monoklonalen Antikörper (mAK) gegen OPN
(braun) und CD1a (rot). Im Bereich des dermalen Infiltrates exprimiert der überwiegende Anteil der
CD1a+ Zellen OPN. Vergrößerung: 40x (A, B).
Immunhistochemische Doppelfärbungen der Hautprobe eines chronischen Kontaktekzems mit antiOPN mAk (braun) und mAk gegen CD1a (rot) (C–F). In der Epidermis findet sich nicht mehr das
enge regelmäßige Muster von Langerhans-Zellen, wie man es bei gesunder Haut oder beim
akuten Ekzem findet (C, E, F). Langerhans-Zellen befinden sich überwiegend im Bereich der
Basalmembranzone (C, F). Weiterhin finden sich viele CD1a positive Zellen in den Zonen des OPN
positiven entzündlichen Infiltrates (siehe Pfeile in F). In den Übersichtsaufnahmen (E, F) erkennt
man, dass sich CD1a positive Zellen in Arealen hoher OPN Expression, in der Epidermis und im
Bereich des entzündlichen Infiltrates finden. Vergrößerungen: 40x (C, D, F); 20x (E).
Ergebnisse
Abb. 13
44
Osteopontin (OPN) Expression auf Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiation (CD) CD1a+ Zellen im akutem und chronischen Kontaktekzem in der
Epidermis.
Absolute Anzahl OPN positiver CD1a+ Zellen pro Gesichtsfeld in der Epidermis im akuten und
chronischen Kontaktekzem. (Vergrößerung: 40x). Die Differenz zwischen beiden Gruppen war
nicht signifikant, P= 0,400, Mann Whitney Rank Sum Test.
Abb. 14
Osteopontin (OPN) Expression auf Differenzierungsantigen, engl. cluster of
differentiaition (CD) CD1a+ Zellen im akutem und chronischem Kontaktekzem im dermalen
Infiltrat.
Absolute Anzahl OPN positiver CD1a+ Zellen pro Gesichtsfeld im perivaskulären Infiltrat im akuten
und chronischen Kontaktekzem. (Vergrößerung: 40x). Die Differenz zwischen beiden Gruppen war
nicht signifikant, P= 0,400, Mann Whitney Rank Sum Test.
Ergebnisse
45
3.5. Differenzierung der OPN Expression im T-Zellinfiltrat
3.5.1. Expression von T-Zellmarkern bei Patienten mit akutem und
chronischem Kontaktekzem
Nachdem gezeigt werden konnte, dass der überwiegende Anteil der T-Zellen im akuten
und chronischen Kontaktekzem OPN exprimiert, wurde durch immunhistochemische
Färbungen von Hautproben geklärt, welche T-Zell Subpopulationen am perivaskulären
entzündlichen Infiltrat beteiligt sind.
Hierzu wurden wie in Material und Methoden beschrieben immunhistochemische
Färbungen serieller Schnitte von Hautproben mit mAK gegen CD3, CD4 und CD8
angefertigt.
Ergebnisse
46
Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Auswertung der immunhistologischen Färbungen zur
Charakterisierung des lymphozytären perivaskulären Infiltrates beim akuten allergischen
Kontaktekzem.
Tabelle 1: Expression von T-Zellmarkern bei Gewebeproben von akuten allergischen
Kontaktekzemen.
Es wurden immunhistochemische Färbungen serieller Schnitte eines akuten Kontaktekzems mit
monoklonalem Antikörper gegen die Differenzierungsantigene, engl. cluster of differentiaition (CD)
CD3, CD4 und CD8 durchgeführt. Es wird jeweils der prozentuale Anteil der positiv gefärbten
Zellen bezogen auf das gesamte Infiltrat angegeben.
Patient
CD3
CD4
CD8
1
90,9 %
81.6 %
41,4 %
2
78,4 %
66,2 %
21,8 %
3
96,8 %
71,4 %
52,2 %
4
85,45 %
65,1 %
44,0 %
5
89,1 %
64,9 %
21,7 %
6
70,1 %
54,8 %
33,4 %
7
93,1 %
66,2 %
68,7 %
8
94,6 %
66,4 %
25,7 %
9
78,7 %
60,4 %
16,5 %
Mittelwert
86,4 %
66,35 %
36,2 %
Min/Max
70,1-96,8 %
54,8-81,6 %
16,5-68,7 %
Die Ergebnisse lassen erkennen, dass meist ein dichtes T-Zellinfiltrat besteht.
Im Mittel waren 86,4 % der Zellen des perivaskulären entzündlichen Infiltrates CD3+,
wobei in einer Probe der Anteil bei 70,1 % beschrieben werden konnte und in einer
Hautprobe sogar 96,8 % betrug. In der Epidermis wurden einzelne CD3+ T-Zellen
gefunden. Es handelt sich um T-Lymphozyten, die im Rahmen der Entzündungsreaktion in
die Epidermis eingewandert sind (Abb. 15 Expression von Differenzierungs-antigenen,
engl. cluster of differentiaition (CD) CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen im entzündlichen
Infiltrat des akuten allergischen Kontaktekzem).
Ergebnisse
A
47
Abb.
15
Expression
von
Differenzierungs-
antigenen, engl. cluster of differentiaition (CD)
CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen im entzündlichen
Infiltrat des akuten allergischen Kontaktekzems
an seriellen Schnitten
Es
wurden,
beschrieben,
wie
in
Material
und
immunhistochemische
Methoden
Färbungen
serieller Schnitte der Hautproben akuter allergischer
Kontaktekzeme mit monoklonalem Antikörper gegen
CD3, CD4 und CD8 angefertigt. Ein großer Anteil des
inflammatorischen Infiltrates ist CD3+
(A). Der
überwiegende Anteil des perivaskulären Infiltrates
B
C
besteht aus CD4+ T-Zellen (B). Ein geringerer Anteil
der T-Zellen ist CD8+ (C).
Ergebnisse
48
Die weitere Differenzierung der T-Zell Untergruppen zeigte mit 66,3 % ein deutliches
Überwiegen der CD4+- T-Helferzellen (Abb. 15B). Im Durchschnitt lag der Anteil der
CD8+ T-Zellen bei 36,2 % (Abb. 15C). Die Summe aus CD4+ und CD8+ T-Zellen ist
etwas höher als der Anteil der CD3+ T-Zellen.
Mögliche Ursachen sind Messungenauigkeiten, Rundungsfehler der Ergebnisse und die
CD4 Expression auch auf anderen Zellen.
Der Oberfächenmarker CD4 wird hauptsächlich von T-Helferzellen (CD3+, CD4+), aber
auch auf eosinophilen Granulozyten, Monozyten und Dendritischen Zellen exprimiert.
Der Oberflächenmarker CD8 wird hauptsächlich von zytotoxischen T-Zellen (CD3+,
CD8+), aber auch von natürlichen Killerzellen exprimiert.
Zusammenfassend liegt beim akuten allergischen Kontaktekzem ein CD3+ T-Zell
dominiertes Infiltrat vor, welches sich zu ca. 66% aus CD4+ T-Zellen und zu ca. 36% aus
CD8+ T-Zellen zusammensetzt.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Auswertung der immunhistologischen Färbungen zur
Charakterisierung des lymphozytären perivaskulären Infiltrates beim chronischen
allergischen Kontaktekzem.
Tabelle 2: Expression von T-Zellmarkern bei Gewebeproben von chronischen allergischen
Kontaktekzemen.
Es wurden immunhistochemische Färbungen serieller Schnitte eines chronischen Kontaktekzems
mit monoklonalem Antikörper gegen die Differenzierungsantigene, engl. cluster of differentiation
(CD) CD3, CD4 und CD8 durchgeführt. Es wird jeweils der prozentuale Anteil der positiv gefärbten
Zellen bezogen auf das gesamte Infiltrat angegeben.
Patient
CD3
CD4
CD8
1
83,1 %
56,3 %
31,8 %
2
89,9 %
60,9 %
28,5 %
3
82,5 %
49,9 %
24,0 %
4
80,3 %
58,0 %
37,7 %
5
86,0 %
66,0 %
38,7 %
Mittelwert
84,4 %
58,2 %
32,1 %
Min/ Max
80,3- 89,9 %
49,9- 66,0 %
24,0- 38,7 %
Ergebnisse
49
Auch im dichten T-Zellinfiltrat des chronischen Kontaktekzem dominieren CD3+ T-Zellen
das Entzündungsinfiltrat. Ca. 58% der T-Zellen sind CD4+ und ca. 32% der T-Zellen sind
CD8+.
3.6.
OPN
Plasmakonzentration
bei
Patienten
Abb.
16
mit
allergischem
Kontaktekzem
1.100
n=19
OPN Plasma Konzentration ng/ml
1.000
n=19
P=0.007
Patienten
Kontaktekzemen
mit
haben
900
Osteopontin (OPN) Spiegel.
800
Die
OPN
Plasma
allergischen
erhöhte
Konzentration
Plasma
von
19
gesunden Kontrollpersonen (10 männlich, 9
700
weiblich, Durchschnittsalter 45,8 Jahre) und von
600
19 Patienten mit Ekzemen (6 männlich, 13
500
weiblich, Durchschnittsalter 42,7 Jahre) wurde
durch OPN Enzymimmunoassay (ELISA) (IBL,
400
Japan) bestimmt. Die Differenz zwischen beiden
300
Gruppen war signifikant, P= 0.007, Mann-
200
Whitney Rank Sum Test.
Erstveröffentlichung in Am J Pathol., 176/1, Anne M. Seier,
100
Andreas C. Renkl, Guido Schulz, Tanja Uebele, Anca
0
Sindrilaru, Sebastian Iben, Lucy Liaw, Shigeyuki Kon,
Ekzem
Kontrolle
Toshimitsu Uede, Johannes M. Weiss, “Antigen-specific
Induction of Osteopontin contributes to the chronification of
Allergic Contact Dermatitis”, S. 246-258, 2010 mit der
Erlaubnis von Elsevier.
Vorausgegangene Arbeiten konnten zeigen, dass CD4+ und CD8+ T-Zellen OPN nach
antigenspezifischer Stimulation sezernieren. Durch seinen chemotaktischen Effekt auf DZ
und T-Zellen kann OPN die Einwanderung von Effektor T-Zellen in den Ekzemherd der
Kontaktekzeme fördern und somit zur Aufrechterhaltung der Th1 dominierten
Immunantwort einer chronischen Kontaktallergie beitragen (Weiss et al. 2001).
Neben anderen entzündlichen Erkrankungen wurden bei der Sarkoidose, der Multiplen
Sklerose und beim systemischen Lupus erythematodes, Erkrankungen mit typischer TZell-vermittelter Immunreaktion im Erkrankungsschub erhöhte OPN-Plasmaspiegel
gemessen (Comabella et al. 2005; Wong et al. 2005; Chiocchetti et al. 2004). Wir
bestimmten die OPN-Plasmakonzentration bei Kontaktekzempatienten im Vergleich zu
Ergebnisse
50
gesunden Kontrollpersonen (Abb 16). Die Kontaktekzempatienten hatten eine signifikant
erhöhte
OPN-Plasmakonzentration
im
Vergleich
zu
vergleichbarem Alter und gleicher Geschlechtsverteilung.
gesunden
Probanden
mit
Diskussion
51
4. Diskussion
Diese Arbeit untersucht die Expression von Osteopontin in der Effektorphase
(Auslösephase) des allergischen Kontaktekzems. Es zeigte sich, dass im Verlauf der
Chronifizierung von Kontaktekzemen zunehmend OPN und OPN-Rezeptoren von den
Kapillaren im papillären Gefäßplexus und von den Immunzellen im entzündlichen Infiltrat
exprimiert
werden.
Im
Weiteren
konnten
wir
zeigen,
dass
infiltrierende
T-
Gedächtniszellen in akuten und chronischen Kontaktekzemen sowohl in der Epidermis als
auch im entzündlichen Infilrat zu annäherend 100 % OPN exprimieren. Desweiteren zeigte
sich, dass CD1a+ positive DZ in der Epidermis und im dermalen entzündlichen Infiltrat
beim akuten Kontaktekzem stark OPN exprimieren. Während mit immunhistochemischen
Färbungen die lokale OPN-Expression untersucht wurde, wurde durch Elisa Untersuchung
von Plasmaproben gesunder und kranker Probanden die OPN Plasmakonzentration
quantifiziert. Hier zeigten Kontaktekzempatienten im Vergleich zu gesunden Probanden
mit vergleichbarem Alter und Geschlechtsverteilung eine signifikant erhöhte OPNPlasmakonzentration.
4.1. Die Expression von OPN auf den Kapillaren im papillären
Gefäßplexus und auf den Entzündungszellen im dermalen Infiltrat
Osteopontin (OPN) ist ein von Immunzellen sezerniertes, saures Phosphoprotein (Singh et
al.1990; Berman et al. 2000). OPN hat eine bedeutende Rolle im Rahmen der
zellvermittelten Immunität gegenüber Krankheitskeimen. So haben OPN-null Mäuse eine
abgeschwächte zelluläre Immunabwehr gegen Mykobakterium bovis (Nau et al. 1999) und
weisen eine schwächere zelluläre Immunabwehr gegen Herpes Simplex Virus I und
Listeria monozytogenes auf (Ashkar et al. 2000). In Vorarbeiten konnte gezeigt werden,
dass OPN defiziente Tiere eine abgeschwächte Kontaktekzemreaktion aufweisen (Weiss et
al. 2001). Es handelt sich hierbei um eine klassische Th1 vermittelte Immunreaktion (Typ
IV) der Haut.
In verschiedenen Modellen konnte eine Th1 Zytokinwirkung von OPN durch die
Interaktion von OPN mit Immunzellen nachgewiesen werden. OPN besitzt eine
chemotaktische Wirkung auf Monozyten, myeloische Dendritische Zellen und T-Zellen
(O´Regan et al. 1999, Weiss et al. 2001, Bruemmer et al. 2003). Diese Daten legen nahe,
Diskussion
52
dass OPN entscheidend am Ablauf der Effektorphase des T-Zell vermittelten
Kontaktekzems beteiligt ist.
Diese Arbeit untersucht deshalb, die OPN Expression auf den Gefäßendothelzellen und im
entzündlichen Infiltrat.
Im Vergleich zu gesunder Haut fanden wir bei akuten allergischen Kontaktekzemen eine
deutliche OPN-Expression auf den Kapillaren des papillären Gefäßplexus und im Bereich
des entzündlichen Infiltrates. Im Vergleich zum akuten Ekzem zeigt sich bei chronischen
Kontaktekzemen
entzündlichen
eine
Infiltrat.
weitere
In
deutliche
Verstärkung
Entzündungsreaktionen
der
wurde
OPN-Expression
eine
im
OPN-Expression
insbesondere bei aktivierten T-Zellen, Makrophagen und Gefäßendothelzellen beschrieben
(O`Regan et al. 2000). Dabei korreliert die vermehrte OPN-Expression mit der
Einwanderung von Makrophagen und dem klinischen Verlauf der Erkrankung (Liaw et al,
Giachelli et al 1994). Durch seinen chemotaktischen Effekt auf diese Immunzellen und
auch auf LZ und DZ ist OPN somit vermutlich an der koordinierten Einwanderung von
Entzündungszellen in Kontaktekzeme beteiligt (Weiss et al. 2001). In OPN defizienten
Mäusen wurde eine veränderte Einwanderung von T-Helfer und Effektorzellen beobachtet.
Zusammen legen diese Daten nahe, dass OPN an der Entstehung von Kontaktekzemen
beteiligt ist.
4.2. Bedeutung der OPN-Rezeptorenexpression auf den Kapillaren im
papillären Gefäßplexus und auf den Entzündungszellen im dermalen
Infiltrat
In
Entzündungsreaktionen
wurde
eine
OPN-Expression
insbesondere
durch
Gefäßendothelzellen, aktivierten T-Zellen und Makrophagen beschrieben (O`Regan et al.
2000). Wir untersuchten in welchen Zellen Osteopontin-abhängige Prozesse durch die
gleichzeitige Expression von Osteopontinrezeptoren reguliert werden können. Zunächst
wurde die Expression der OPN-Rezeptoren αvβ3 und αv auf Kapillaren untersucht. αvβ3
ist der am besten charakterisierte OPN-Rezeptor und vermittelt die OPN-Bindung an BZellen, Thrombozyten, Osteoklasten und glatten Muskelzellen (Liaw et al 1995).
Wir fanden, dass nahezu alle Kapillaren αvβ3 exprimieren. Dies legt nahe, dass αvβ3
unabhängig vom Hauttyp (Normalhaut und akutes Kontaktekzem) exprimiert werden.
Praktisch exprimieren alle Kapillaren im chronischen Ekzem αvβ3. Die verstärkte OPN
Expression im chronischen Ekzem ist durch Zunahme der Kapillaren bedingt. Die
Diskussion
53
Migration verschiedener Zelltypen gegen OPN wird hauptsächlich durch 2 OPNRezeptoren αvβ3 und CD44 vermittelt (Liaw et al. 1995; Senger et al. 1996; Weber et al.
1996). Dabei bindet OPN αvβ3 RGD abhängig und die biologische Wirksamkeit ist an die
Anwesenheit zweiwertiger Kationen (Ca2+/ Mg2+) gebunden (Liaw et al. 1995; Weber et al.
1996). In einer Studie zur Rolle von OPN bei der Lungenfibrose wurden primäre humane
Lungenfibroblasten und Alveolarepithelzellen mit rekombinantem OPN stimuliert. Nach
der Stimulation kam es zu einem signifikanten Anstieg der Migration und Proliferation von
Fibroblasten und Epithelzellen. Die OPN induzierte Proliferation der Fibroblasten und die
Epithelzellmigration wurden durch anti αvβ3 Antikörper inhibiert (Pardo et al; Gibson et
al. 2005). Die OPN Interaktion mit αvβ3 der Kapillarendothelien und Fibroblasten trägt
somit zur Epithelzellproliferation bei. OPN induziert die pro-angiogenetische Sekretion
von IL-1ß aus Monozyten. Ein Effekt der wahrscheinlich dazu beiträgt, dass es in
chronischen Entzündungen zur Blutgefäßneubildung kommt (O`Regan et al. 2000; Sodek
et al. 2006). Ferner fördert OPN das Überleben von Endothelzellen, die an der
Gefäßneubildung
beteiligt
sind
(Denhardt
et
al.
2001a).
Dabei
werden
die
überlebensfördernden Effekte von OPN auf Endothelzellen über αvß3 vermittelt (Scatena
et al. 1998). Unsere Experimente zeigen, dass im chronischen Ekzem die Anzahl der αv
bzw. αvß3 positiven Kapillaren erhöht ist. Die OPN Interaktion mit αvß3 Integrin trägt
somit vermutlich durch pro-proliferative Effekte zu einer Zunahme der Gefäße im
chronischen Ekzem bei.
Desweiteren untersuchten wir die Expression von αvβ3 auf Immunzellen in gesunder Haut,
im akuten und chronischen Kontaktekzem. In gesunder Haut wird αvβ3 bis auf die
Expression durch die Kapillarendothelzellen nicht exprimiert. Beim akuten Kontaktekzem
exprimieren die Entzündungszellen im Infiltrat αvβ3. Beim chronischen Kontaktekzem
zeigte sich eine weitere Zunahme der αvβ3 Expression auf den Immunzellen des
entzündlichen Infiltrates. Die nachgewiesene hohe Expression von OPN-Rezeptoren auf
Entzündungszellen könnte die Einwanderung von Entzündungszellen in Kontaktekzeme
erklären. Während der Sensibilisierungsphase induziert OPN die chemotaktische Migration
von LZ und DZ von der Haut in die drainierenden Lymphknoten durch die Interaktion mit
αvβ3 Integrin. Weiterhin hat OPN einen Th1 polarisierenden Zytokineffekt auf DZ und
induziert die IL-12 Sekretion der DZ. Dies geschieht RGD abhängig über die Interaktion
mit αvβ3 auf Immunzellen (Ashkar et al. 2000; Weber et al. 2002). Durch die erhöhte
Expression von αvβ3 auf Immunzellen trägt OPN wahrscheinlich zu einer verstärkten Th1
dominierten Immunantwort im Kontaktekzem bei (Ashkar et al. 2000).
Diskussion
54
Ein weiterer relevanter OPN Rezeptor ist CD44. Die Oberflächenrezeptoren der CD44
Familie spielen eine Rolle in vielen biologischen Prozessen wie Wachstum,
Differenzierung, Zellmigration und Metastasierung. CD44 ist ein OPN-Rezeptor der
verschiedene, RGD unabhängige Bindungsstellen im OPN Molekül aufweist und
unabhängig von Ca2+/ Mg2+ mit OPN interagiert. In AK Blockierungsexperimenten wurde
im Ca2+/ Mg2+ freien Medium die OPN induzierte Migration teilweise durch AK gegen
CD44 blockiert. Zugabe von AK gegen CD44 und αv führten unter Anwesenheit von
zweiwertigen Kationen zu einer kompletten Blockierung der DZ Migration (Weiss et al.
2001). Diese Ergebnisse legen nahe, dass auch CD44 zur OPN induzierten Migration
beiträgt.
Im Vorfeld dieser Arbeit wurde die Expression und Funktion von verschiedenen CD44
Isoformen auf DZ/LZ untersucht (Weiss et al. 1997). Dabei stellte sich heraus, dass unreife
DZ/LZ die Standardform von CD44 und CD44 Splicevarianten, welche die Exons v7/v8
enthalten exprimieren. Nach Aktivierung kam es zur Aufregulation der durch
Exonvarianten v5, v6 und v9 kodierte Epitope. Diese Epitope sind an der LZ Migration aus
der Epidermis, die Adhäsion im Lymphknoten und in Folge somit an der Auslösung einer
Kontaktallergie beteiligt (Weiss et al. 1997).
Wir untersuchten die Expression von CD44s und CD44v6 auf Kapillaren und Immunzellen
im akuten und chronischen Kontaktekzem und verglichen sie mit gesunder Haut. Wir
fanden, dass die Kapillaren und die perivaskulär gelegenen Entzündungszellen im akuten
allergischen Kontaktekzem CD44s stark exprimieren. Beim chronischen Kontaktekzem
konnten wir eine weitere Erhöhung der CD44s positiven Infiltratzellen feststellen. Durch
die Expression dieser OPN Rezeptoren auf Immunzellen bzw. Endothelzellen ist eine
autokrine Stimulation durch OPN möglich. Die Interaktionen von OPN mit seinen
Rezeptoren könnten chemotaktische und zytokinregulatorische Effekte haben. OPN wird
durch T-Effektorzellen, die in chronischen Ekzemläsionen einwandern stark exprimiert.
Die antigen-spezifische Stimulation dieser Effektorzellen induziert deren OPN Sekretion
(Seier et al. 2009). Das sezernierte OPN dieser Zellen könnte über die Interaktion mit den
OPN-Rezeptoren CD44s und CD44v6 enthaltenden Isoformen auf den Immunzellen, bzw.
Kapillaren weitere Entzündungszellen wie z. B. Monozyten, Neutrophile und Mastzellen
anlocken. Seier et al. generierten T-Zell Klone, die CD44v6 und CD44s exprimieren. Diese
T-Zell Klone wurden mit rekombinant hergestelltem OPN behandelt. Dies führte zur
Abnahme der IL-4 Sekretion der T-Zellen (Seier et al. 2009). Diese Ergebnisse deuten
daraufhin, dass während einer Entzündungsreaktion die antigen-spezifischen T-Zellen die
Diskussion
55
hohe OPN Sekretion nutzen, um die Immunantwort weiter in Richtung Th1 zu lenken,
indem durch das sezernierte OPN die IL-4 Sekretion von Effektorzellen vermindert wird.
Dies kann auch zur weiteren Chronifizierung der Ekzeme beitragen. Diese Ergebnisse
werden unterstützt durch eine kürzlich veröffentlichte Studie über allergische
Atemwegserkrankungen. In diesem Modell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit OPN
während der Auslösung der allergischen Reaktion in der Lunge die Th2 Immunantwort
über eine verminderte IL-4 Sekretion unterdrücken kann (Xanthou et al. 2007).
4.3. Expression von OPN durch infiltrierende Zellsubpopulationen im
Kontaktekzem
4.3.1. Dendritische Zellen
Dendritische Zellen sind hochspezialisierte antigenpräsentierende Zellen. Sie können
antigenspezifische Immunantworten initiieren und regulieren (Steinman et al. 1995) und
haben eine Schlüsselfunktion bei zellvermittelten Immunreaktionen, so auch beim
Kontaktekzem (Nestle et al. 2009).
Die Interaktion zwischen OPN und DZ wurde vor allem im murinen Modell der
Kontaktallergie untersucht. Hier zeigten OPN-defiziente Mäuse eine verminderte CHSReaktion (Weiss et al. 2001). In der Sensibilisierungsphase der Kontaktallergie kommt es
innerhalb von 6 Stunden zu einer Aufregulation von OPN in der Haut und in den
drainierenden Lymphknoten. Hier unterstützt OPN die Auswanderung und die Reifung von
Langerhanszellen (Weiss et al. 2001).
Wir untersuchten, ob CD1a positive Dendritische Zellen im akuten und chronischen
Kontaktekzemen selbst OPN exprimieren. Beim akuten Kontaktekzem exprimiert ein sehr
großer Teil der CD1a+ DZ OPN sowohl in der Epidermis als auch im Bereich des
dermalen Infiltrates. Beim chronischen Kontaktekzem kommt es im Bereich des dermalen
Infiltrates zu einer weiteren geringgradigen Vermehrung der OPN-Expression und die
Anzahl der OPN+ CD1a+ Zellen nimmt weiter zu. Kawamura et al; Renkl et al. fanden,
dass DZ im Verlauf der Differenzierung von Monozyten zu DZ selbst OPN produzieren
(Kawamura et al. 2005, Renkl et al. 2005). Schulz et al. stellten fest, dass die OPN
Expression von DZ entscheidend deren Migrationsfähigkeit beeinflusst und zeigten in
ihren Experimenten, dass die optimale DZ Migration in vitro und in vivo von der OPN
Expression abhängig ist (Schulz et al. 2008). Wir zeigten, dass in akuten und in noch
stärkerem Umfang in chronischen Kontaktekzemen DZ stark OPN exprimieren. Dies lässt
Diskussion
56
vermuten, dass in der akuten und chronischen Phase von Kontaktekzemen CD1a+ DZ
OPN produzieren und zugleich auch in Bereiche hoher OPN Expression einwandern.
Außerdem polarisiert OPN DZ zu einem Th1 polarisierenden Phänotyp. Diese Th1
polarisierenden DZ tragen zur Chronifizierung von Ekzemen bei. Bei OPN defizienten
Mäusen kommt es zu einer schwächeren Einwanderung von DZ in Ekzemherde. Hier in
unserer Arbeit exprimieren die DZ in der Epidermis und der Dermis OPN. Im Verlauf der
Chronifizierung kommt es im Bereich des dermalen Infiltrates zu einer weiteren Erhöhung
der Anzahl an OPN exprimierenden CD1a+ Zellen. In chronischen Ekzemen wird OPN
auch von Keratinozyten exprimiert. Diese OPN-Expression wird durch IFNγ induziert
(Seier et al. 2008). Das von den Keratinozyten sezernierte OPN könnte die Funktion von
intradermalen und dermalen DZ beeinflussen und so zur Th1 dominierenden Stabilisierung
der Chronifizierung beitragen
4.3.2. CD45 RO+ T-Gedächtniszellen
Die Einwanderung von T-Zellen ist charakteristisch während der Effektophase des
allergischen Kontaktekzems.
In der Sensibilisierungsphase werden naive T-Zellen (CD45RA+) aktiviert und
differenzieren in Antigen-spezifische Gedächtniszellen oder Effektorzellen (CD45RO+). In
der Auslösephase führt der erneute Kontakt mit dem Allergen zur Aktivierung von
Antigen-spezifischen „ memory“ T-Zellen in Effektorzellen, die an den Ort der Exposition
mit dem Kontaktallergen gelockt werden und dort die Entzündung hervorrufen (Helge
Riemann et al. 2003). Gedächtnis T-Zellen unterscheiden sich funktionell in vielerlei
Hinsicht
von
naiven
T-Zellen.
Zum
einen
reagieren
sie
auf
geringere
Antigenkonzentrationen (Zinkernagel et al. 1996) zum anderen proliferieren Gedächtnis TZellen schneller nach Antigenstimulation und setzen größere Mengen an Zytokinen frei
(Goldrath et al. 1999). Gedächtnis T-Zellen lassen sich aufgrund verschiedener
Oberflächenmarker von naiven T-Zellen unterscheiden. Hierzu zählen die Varianten des
CD45. Die niedrig-molekulare RO-Isoform des CD45 befindet sich bevorzugt auf TGedächtniszellen. Das höher molekulare CD45 RA vor allem auf naiven Zellen. Es ist
bisher nicht bekannt, ob die CD45 RO+ T-Gedächtniszellen im Ekzem OPN exprimieren.
In Entzündungsreaktionen wurde eine Osteopontin Expression insbesondere bei aktivierten
T-Zellen, Makrophagen und Gefäßendothelzellen beschrieben (O`Regan u. Berman et al.
2000). Wir konnten zeigen, dass beim akuten Kontaktekzem alle CD45 RO+TGedächtniszellen in der Epidermis und Dermis OPN exprimieren. Im chronischen Ekzem
Diskussion
57
findet sich eine weitere Zunahme der OPN-Expression. Es ist denkbar, dass die Interaktion
von OPN mit den OPN-exprimierenden T-Zellen durch die anti-apoptotischen
Eigenschaften von OPN zum Überleben der T-Zellen beiträgt. Hur et al. 2007 zeigte, dass
bei Multipler Sklerose OPN die Überlebensrate von aktivierten T-Zellen fördert, indem es
den Transkriptionsfaktor NF-kb aktiviert, den Transkriptionsfaktor Foxo 3a inhibiert und
die Expression der proapoptotischen Proteine Bim, Bak und Bax verändert. Es ist möglich,
dass OPN durch seine antiapoptotischen Eigenschaften entscheidend zur Chronifizierung
der Kontaktallergie beiträgt, indem es die Eliminierung von Effektor T-Zellen verhindert.
Wir konnten in unserer Arbeit zeigen, dass die CD45 RO+ T-Zellen in chronischen
Kontaktekzemen sowohl in der Epidermis als auch im perivaskulären Infiltrat OPN
exprimieren. Dass OPN promigratorische Effekte auf T-Zellen hat wurde in vitro durch
O`Regan et al. gezeigt (O`Regan et al. 1999). Seier et al. konnten in einem Modell mit
RAG 2-/- Mäusen in vivo zeigen, dass OPN die Einwanderung von T-Zellen in
Ekzemherde fördert und auf diese Weise den Verlauf einer chronischen Kontaktallergie
verstärkt (Seier et al. 2009).
4.4. Expression von T-Zellmarkern bei Patienten mit akutem und
chronischem Kontaktekzem
Der Schweregrad des Kontaktekzems ist abhängig vom Verhältnis aus CD8+ TEffektorzellen und CD4+ T-Helferzellen und deren Interaktion mit eingewanderten DZ
(Cavani et al. 2001). Da es sich bei Haptenen für gewöhnlich um exogene Allergene
handelt, wurden die CD4+ T-Zellen lange Zeit als die hauptsächlichen Effektoren einer
allergischen Kontaktallergie betrachtet. Gocinski und Tigelaar erbrachten durch
Depletionsexperimente den Nachweis, dass sowohl spezifische CD4+ als auch CD8+ TZellen im Rahmen der Sensibilisierung induziert werden, jedoch der CD8+ Subpopulation
die maßgebliche Rolle in der Auslösephase zukommt (Gocinski et al. 1990). Spätere
Arbeiten von Xu et al. bestätigten die Rolle der CD8+ T-Zellen als Haupteffektorzellen
und wiesen darauf hin, dass den CD4+ T-Zellen eine regulatorische Funktion
zugeschrieben werden kann. Wir untersuchten die Expression von T-Zellmarkern beim
akuten und chronischen Kontaktekzem. Wir fanden, dass sich das entzündliche Infiltrat
überwiegend aus CD3+ T-Zellen zusammensetzt. Im Durchschnitt überwiegen die CD4+
T-Zellen mit 66% deutlich gegenüber den CD8+ T-Zellen mit 36%. Beim chronischen
Kontaktekzem zeigte sich ein vergleichbares Verhältnis. CD4+ T-Zellen lassen sich
Diskussion
58
unterteilen in CD4+ Th1 und CD4+ Th2 Zellen. CD4 Th1 Zellen produzieren IFNγ und
IL-2 und sind Effektorzellen während CD4+ Th2 Zellen IL-4 und IL-10 produzieren und
hauptsächlich regulatorische Funktionen aufweisen. Daneben existiert noch eine weitere
wichtige T-Zelluntergruppe, die regulatorischen T-Zellen (T-regs). Sie haben die Funktion
Immunreaktionen zu verhindern. Phänotypisch und funktionell können T-regs in
verschiedene Populationen unterteilt werden. Zum einen in natürlich vorkommenden
CD4+ CD25+ T-regs (nT-regs), die im Thymus differenzieren und zum anderen die iTregs, die in der Peripherie aus konventionellen CD4+ T-Zellen entstehen. nT-regs wird
eine Schlüsselrolle in Entzündungsreaktionen, Infektionen und Allergien zugesprochen
(Curotto de Lafaille et al. 2004). Auch wurde die Bedeutung von n T-regs bei Typ IV
Allergien bereits untersucht. Im Mausmodell der CHS konnte gezeigt werden, dass nT-regs
in vivo durch Vermittlung einer Hapten-spezifischen Toleranz, u.a. durch die Produktion
von IL-10, zur Kontrolle der Effektor T-Zellen der CHS und damit der allergischen
Hauterkrankung beitragen (Ring et al. 2006). Da im Verlauf des Ekzems neben, CD8+ TZellen, CD4+ Th1 Effektorzellen und CD4+ Th2 Zellen auch CD4+ CD25+ T-regs
einwandern, die nach Stimulation die Zytokinproduktion und Proliferation von
konventionellen CD4+ und CD8+ T-Zellen unterdrücken (Piccirillo et al, Sherach et al.
2001) ist es denkbar, dass daher ca 60 % der Infiltratzellen CD4+ sind , während die CD8
positiven T-Zellen, die durch ihre hohe IFN γ Produktion gekennzeichnet sind nur zu ca
30% im Infiltrat vorkommen. Welchen Effekt OPN auf T-regs hat ist bislang unbekannt.
4.5. OPN Plasmaspiegel beim allergischen Kontaktekzem
Die Überexpression von OPN wurde bei Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose,
Rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus erythematodes ausführlich untersucht
(Hur et al. 2007; Yanamoto et al. 2003, Chabas et al. 2001; Jansson et al. 2002; Xu et al.
2007). Pathophysiologisch sind diese entzündlichen Erkrankungen wie das allergische
Kontaktekzem charakterisiert durch eine veränderte T-Zell Immunantwort. Menschen, die
an Rheumatoider Arthrithis oder systemischer Lupus erythematodes erkrankt sind weisen
einen erhöhten Serumosteopontinspiegel auf (Wong et al. 2005). Außerdem ist die
Expression von OPN im Nierengewebe bei Lupusnephritis erhöht (Okado et al. 2000;
Masutani et al. 2001). Wir bestimmten die OPN-Plasmakonzentration bei Patienten
mit Kontaktekzem im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Die KontaktekzemPatienten hatten eine signifikant erhöhte OPN-Plasmakonzentration im Vergleich zu
gesunden Probanden. Dies ist vermutlich dadurch erklärbar, dass OPN in der Auslösephase
Diskussion
59
des allergischen Kontaktekzems sehr stark durch antigen-spezifische T-Effektorzellen
sezerniert wird (Seier et al. 2009). T-Effektorzellen sezernieren IFNγ, das Keratinozyten
zur OPN Produktion anregt. Das sezernierte IFNγ wiederrum aktiviert die Keratinozyten
zur OPN-Produktion. Es ist denkbar, dass die hohen OPN-Plasmaspiegel im Kontaktekzem
auch teilweise durch die OPN Sekretion der Keratinozyten zustande kommen (Seier et al.
2009).
4.6. Modell zur Rolle von OPN beim allergischen Kontaktekzem
Zusammenfassend unterstützen unsere Ergebnisse ein Modell, indem OPN eine
bedeutende Funktion für die Th1 vermittelte Immunantwort hat. Diese Ergebnisse könnten
neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen z.B. durch anti- OPN Antikörper zur
Behandlung von therapieresistenten T-zell vermittelten Hauterkrankungen.
Während der Sensibilisierungsphase ist OPN durch die Interaktion mit den OPNRezeptoren CD44 und αv- Integrinen auf LZ und DZ an deren Migration von der Haut in
die drainierenden Lymphknoten beteiligt (Weiss et al. 2001). Gleichzeitig hat OPN einen
Th1 polarisierenden Effekt auf die DZ, indem diese zur IL-12 Sekretion angeregt werden.
Dies führt zu einer Th1 Immunantwort (Renkl et al. 2005).
In der Effektorphase des Kontaktekzems wird OPN durch Immunzellen des entzündlichen
Infiltrates und auf den Endothelien des papillären Gefäßplexus exprimiert. Die erhöhte
OPN Expression korreliert mit der Aufregulation der entsprechenden OPN-Rezeptoren
αvß3 und CD44. Außerdem wird OPN stark durch antigenspezifische Effektor T-Zellen
(hauptsächlich
CD45RO
T-Zellen)
sezerniert.
Dies
führt
möglicherweise
zur
Plasmaerhöhung von OPN. Das sezernierte OPN lockt weitere Entzündungszellen in den
Entzündungsherd wie z. B. Monozyten. Diese werden durch OPN aktiviert und sezernieren
IL-12 während ihre IL-10 Produktion gehemmt wird. Die angelockten T-Effektorzellen
sezernieren IFNγ, welches die Keratinozyten aktiviert OPN zu produzieren. Das von den
Keratinozyten freigesetzte OPN könnte den T-Effektorzellen die Einwanderung in die
Epidermis erleichtern. OPN und OPN exprimierende Immunzellen sind durch ihre
chemotaktischen und Th1-Zytokineffekte an der Auslösung und an der Chronifizierung
von Kontaktekzemen beteiligt.
Zusammenfassung
60
5. Zusammenfassung
Osteopontin (OPN) ist ein von Immunzellen sezerniertes, saures Phosphoglykoprotein. Bei
der Auslösung zellvermittelter Immunantworten (Typ1) erfüllt OPN mehrere Funktionen.
OPN hat Th1-Zytokinwirkung und verstärkt zellvermittelte Immunantworten bei
gleichzeitiger Inhibition der Th2-Zytokinexpression. Auf aktivierte T-Zellen kann OPN
antiapoptotisch wirken. OPN ist chemotaktisch und wirkt promigratorisch auf
Immunzellen. Während der Sensibilisierungsphase einer Kontaktallergie wird OPN in der
Haut und in den Haut-drainierenden Lymphknoten verstärkt exprimiert und hat hierbei
chemotaktische und Th1 polarisierende Funktionen für Dendritische Zellen (DZ), die über
die OPN-Rezeptoren αvβ3 und CD44 vermittelt werden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von OPN und seiner Rezeptoren αvß3 und
Differenzierungsantigen 44 (Cluster of differentiation 44 [CD44]) im Rahmen der
Effektorphase des allergischen Kontaktekzems zu untersuchen. Weiterhin sollten die OPN
und OPN-Rezeptor exprimierenden Zellen im allergischen Kontaktekzem identifiziert
werden. Wir fanden, dass OPN im Bereich des papillären Gefäßplexus und des
entzündlichen Infiltrates exprimiert wird und dass es im Verlauf der Chronifizierung von
Kontaktekzemen hier zu einer Zunahme der OPN-Expression kommt. Die erhöhte OPN
Expression korreliert mit einer Aufregulation der OPN-Rezeptoren αvβ3 und CD44 in den
verschiedenen Ekzemstadien. Im Rahmen der Chronifizierung kommt es zu einer
Vermehrung von OPN und OPN-Rezeptor exprimierenden Endothelien des papillären
Gefäßplexus. Die größte Population OPN exprimierender Zellen im Ekzem sind
CD45RO+ T-Gedächtniszellen. Auch CD1a+ DZ exprimieren OPN. Die nähere
Charakterisierung des lymphozytären Infiltrates beim allergischen Kontaktekzem zeigte
ein überwiegend CD3+ T-Zellinfiltrat, welches sich zu ca 66% aus CD4+ T-Zellen und zu
36%
aus
CD8+
T-Zellen
zusammensetzt.
Besonders
bei
Patienten
mit
Autoimmunerkrankungen ist die akute Erkrankung assoziiert mit hohen OPN Plasma
Spiegeln. Bei Quantifizierung der OPN Plasmaexpression durch Elisa zeigten sich bei
Patienten mit allergischem Kontaktekzem signifikant erhöhte OPN Plasmaspiegel.
Diese Ergebnisse im Kontext mit bekannten chemotaktischen, Th1-polarisierenden und
anti apoptotischen Effekten deuten daraufhin, dass OPN bei der allergischen
Kontaktdermatitis zur Verstärkung der Aulösephase und zur Chronifizierung der
Erkrankung beiträgt.
Literaturverzeichnis
61
6. Literaturverzeichnis
1
Agrawal D, Chen T, Irby R et al: Osteopontin identified as lead marker of colon
cancer progression, using pooled sample expression profiling. J. Natl Cancer Inst
94: 513-521 (2002)
2
Akadis CA, Akdis M, Simon HU, Blaser K: Regulation of allergic inflammation
by skin-homing T cells in allergic eczema. Int Arch Allergy Immunol 118: 140144 (1999)
3
Albanesi C, Cavani A, Scarponi C, and Girolomoni G: Multiple roles of
keratinozytes in allergic contact dermatitis. Immune mechanisms in allergic
contact dermatitis. Edited by Cavani A and Girolomoni G. Georgetown, Landes
Bioscience 104-112 (2005)
4
Ashkar S, Weber G, Panoutsakopoulou V, Sanchirico M, Jansson M, Zawaaideh
S, Rittling S, Denhardt D, Glimcher M, Cantor H: Eta-1 (Osteopontin): An Early
Component of Type-1 (Cell-Mediated) Immunity. Science 287: 860-864 (2000)
5
Barry S, Ludbrook S, Murrison E, Horgan C: A regulated interaction between
alpha5 beta1 integrin and osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 267: 764769 (2000)
6
Bayless K, Meininger G, Scholtz J, Davis G: Osteopontin is a ligand for the
alpha4beta1 integrin. J Cell Sci 111: 1165-1174 (1998)
7
Bell D, Young JW, Banchereau J: Dendritic cells. Adv Immunol 72: 255-324
(1999)
8
Bendeck M, Irvin C, Reidy M: Smooth muscle cell matrix metalloptoteinase
production is stimulated via alpha(v)beta(3) integrin. Arterioscler Thromb Vasc
Biol 6: 1467-1472 (2000)
Literaturverzeichnis
9
62
Bennett JS, Chan C, Vilaire G, Mousa SA, De Grado WF: Agonist-activated
alphavbeta3 on platelets and lymphocytes binds to the matrix protein osteopontin.
J Biol Chem 272: 8137-8140 (1997)
10
Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH, Key M, Welcher R, Harvey R, Atwood KN
Handbook of immunochemical methods. 3 Auflage, Dako corporation 1-85
(2001)
11
Bour H, Peyron E, Gaucherand M et al: major histocompatibility complex class Irestricted CD8+T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate
and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. Eur J Immunol 25: 30063010 (1995)
12
Brand CU, Hunger RE, Yawalker N, Gerber HA, Schaffner T, Braathen LR:
Characterization of human skin-derived CD1a-positive lymph cells. Arch
Dermatol Res 291: 65-72 (1999)
13
Bruemmer D, Collins AR, Noh G, Wang W, Territo M, Arias-Magallona S,
Fishbein MC, Blaschke F, Kintscher U, Graf K, Law RE, and Hsueh WA:
Angiotensin II-accelerated atherosclerosis and aneurysm formation is attenuated
in osteopontin-deficient mice. J Cin Invest 112: 1318-1331 (2003)
14
Cantor H and Shinohara ML: Regulation of T-helper-cell lineage development by
osteopontin: the inside story. Nat Rev Immunol 9: 137-141 (2009)
15
Cavani A, Nasorri F, Prezzi C, Sebastiani S, Albanesi C, Girolomoni G: Human
CD4+ T Lymphocytes with remarkable regulatory functions on dentritic cells and
nickel-specific Th1 immune responses. J Invest Dermatol 114: 295-302 (2000)
16
Cavani A, Albanesi C, Traidl C, Sebatiani S, Girolomoni G: Effector and
regulatory T cells in allergic contact dermatitis. Trends immunology 3: 118-120
(2001)
17
Cavani A, Girolomoni G: Immune mechanisms in allergic contact dermatitis.
Georgetown, Texas, U.S.A. Landes Bioscience 1-147 (2005)
Literaturverzeichnis
18
63
Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D: The influence of the proinflammatory
cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease. Science 294: 17311735 (2001)
19
Chiocchetti A, Indelicato M, Bensi T, Mesturini R, Giordano M, Sametti S,
Castelli L, Bottarel F, Mazzarino MC, Garbarini L, Giacopelli F, Valesini G,
Santoro C, Dianzani I, Ramenghi U, and Dianzani U: High levels of osteopontin
associated with polymorphisms in its gene are a risk factor for development of
autoimmune/lymphoproliferation. Blood 103: 1376-1382 (2004)
20
Christensen NK, Winter L: Chapter 15 Multi- Staining Immunhistochemistry. In:
Kumar GL, Rudbeck L (Hrsg) Educational Guide Immunohistochemical (IHC)
Staining Methods, Dako, S. 103-108 (2009)
21
Comabella M, Pericot I, Goertsches R, Nos C, Castillo M, Blas Navarro J, Rio J
und Montalban X: Plasma osteopontin levels in multiple sclerosis. J
Neuroimmunol 158: 231-239 (2005)
22
Coppola D, Szabo M, Boulware D: Correlation of osteopontin protein expression
and pathological stage across a wide variety of tumor histologies. Clin Cancer Res
10: 184-190 (2004)
23
Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ: the role of regulatory T cells in allergy.
Springer Semin. Immunopathol 25: 295 (2004)
24
DÀlfonso S, Barizzone N, Giordano M et al: Two single–nucleotide
polymorphisms in the 5`and 3`ends of osteopontin gene contribute to
susceptibility to systemic lupus erythematodes. Arthritis Rheum 52: 539-547
(2005)
25
Denda S, Reichardt L, Muller U: Identification of Osteopontin as a novel ligand
for the integrin alpha8beta1 and potential roles for this integrin-ligand interaction
in kidney morphogenesis. Mol Biol Cell 9: 1425-1435 (1998)
Literaturverzeichnis
26
64
Denhardt D, Noda M, O`Regan A, Pavlin D, Barman J: Osteopontin as a means to
cope with environmental insults: regulation of inflammation, tissue osteopontin,
and cell survival. J Clin Invest 9: 1055-1061 (2001)
27
Diepgen T, Conraads P: The epidemiology of occupational contact dermatitis. Int
Arch Occup Environ Health 72: 496-506 (1999)
28
Dunon D, Piali L, Imhof B: To stick or not to stick: the new leukocyte homing
paradigm. Curr Opin Cell Biol 8: 714-723 (1996)
29
Enk A, Katz S: Early molecular events in the induction phase of contact
sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1398-1402 (1992)
30
Enk AH, Angeloni VL, Udey MC, Katz SI: An essential role for langerhans cellderived IL- 1b in the initiation of primary immune responses in skin. J immunol
150: 3698-3704 (1993)
31
Ferguson T, Dube P, Griffith T:
Regulation of contact hypersensitivity by
interleukin 10. J. Exp Med 179: 1597-1604 (1994)
32
Geissinger E, Weisser C, Fischer P, Schartl M, Wellbrock C: Autocrine
stimulation by osteopontin contributes to antiapoptotic signalling of melanocytes
in dermal collagen. Cancer Res 62: 4820-4828 (2002).
33
Ghoreishi M, Dutz J: Tolerance induction by transcutaneous immunization
through ultravioletirradiated skin is transferable through CD4+CD25+ T
regulatory cells and is dependent on host-derived Il-10. J Immunol 176: 26352644 (2006)
34
Giachelli C, Liaw L, Murry C, Schwartz S, Almeida M: Osteopontin expression in
cardiovascular diseases. Ann NY Acad Sci 760: 109-126 (1995)
35
Giachelli C, Lombardi D, Johnson R, Murrry C, Almeida M: Evidence for a role
of Osteopontin in macrophage infiltration in response to pathological stimuli in
vivo. Am. J. Pathol. 152: 353-358 (1998)
Literaturverzeichnis
36
65
Girolomoni G, Sebastiani S, Albanesi C, Cavani A: T-cell subpopulations in the
development of atopic and contact allergy, Curr Opin Immunology 13: 733-737
(2001)
37
Gocinski B, Tigelaar R: Roles of CD4+ and CD8+ T-cells in murine contact
sensitivity revealed by in vivo monoclonal antibody depletion. J Immunol 144:
1421-4128 (1990)
38
Goebeler M, Trautmann A, Voss A, v. Brocker E, Toksoy A und Gillizer
R:”Differential and sequential expression of multiple chemokines during
elicitation of allergic contact hypersensitivity.“ Am J Pathol 158: 431-440 (2001)
39
Goldrath A.W, Beran M.J:” Selecting and maintaining a diverse T-cell
repertoire”. Nature 402: 255-262 (1999).
40
Grabbe S, Steinert M, Mahnke K et al: Dissection of antigenic and irritative
effects of epicutaneously applied haptens in mice. Evidence that not the antigenic
component but nonspecificproinflammatory effects of haptens determine the
concentration-dependent elicitation of allergic contact dermatitis. J. Clin Invest
98: 1158-1164 (1996)
41
Grabbe S, Riemann H, Schwarz T: Pathomechanismen der Auslösephase der
allergischen Kontaktdermatitis. JDDG 1: 613-619 (2003)
42
Green P, Ludbrook S, Miller D, Horgan C, Barry S: structural elements of the
Osteopontin SVVYGLR motif important for the interaction with alpha(49
integrins. FEBS Lett 503: 75-79 (2001)
43
Gunthert U, Hofmann M, Rudy W, Reber S, Zoller M, Haussmann I, Matzku S,
Wenzel A, Ponta H, Herrlich P: A new variant of glycoprotein CD44 confers
metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24 (1991)
44
Harvey I, DanLott M, Lonardo F, Harbut M, Zhandong M: Asbestos exposure,
Pleural Mesothelioma, and Serum Osteopontin Levels. N Engl J Med 353: 15
(2005)
Literaturverzeichnis
45
66
Hu D, Lin N, Kovach N, Hoyer J, Smith J: A biochemical characterization of the
binding of Osteopontin to integrins v1 and v5. J Biol Chem 270: 2623226238 (1995)
46
Hur EM, Youssef S, Haws ME, Zhang SY, Sobel RA und.Steinman L:
Osteopontin-induced relapse and progression of autoimmune brain disease
through enhanced survival of activad T cells. Nat Immunol 8: 74-83 (2007)
47
Jakob T, Ring J, Udey MC: Multistep navigation of Langerhans/dentritic cells in
and out of the skin. J Allergy Clin Immunol 108: 688-696 (2001)
48
Jalkanen S, Saari S, Alimo H, Lqammintausta E, Vainio R, Leino A, Duijvestijn
A, Kalimo K: Lymphocyte migration into the skin: the role of lymphocyte homing
receptor (CD44) and endothelial cell antigen (HECA-452). J Invest Dermatol 94:
786-792 (1990)
49
Jansson M, Panoutsakopoulou V, Baker J, Klein L, Cantor H: Cuttin edge:
Attentuated Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Eta-1/ Osteopontindeficient Mice. J Immunol 168: 2096-2099 (2002)
50
Kaartinen M, Pirhonen A, Linnala-Kankunen A, Maenpaa P: Cross-linking of
Osteopontin by tissue transglutaminase increases ist collagen binding properties. J
Biol Chem 274: 1729-1735 (1999)
51
Kapsenberg M: Dendritic-cell control of pathogen-driven T-ell polarization. Nat
Rev Immunolog 3: 984-993 (2003)
52
Katagiri Y, Sleeman J, Fujii H: CD44 variants but not CD44s cooperate with
beta1-containing integrins to permit cells to bind to Osteopontin independently of
arginine-aspartic acid, thereby stimulating cell motility and chemotaxis. Cancer
Res 59: 219-226 (1999)
53
Kawamura K, Iyonaga K, Ichiyasu H, Nagano J, Suga M, Sasaki Y:
Differentiation, maturation, and survival of dentritic cells by osteopontin
regulation. Clin Diagn Lab Immunol 12: 206-212 (2005)
Literaturverzeichnis
54
67
Key Marc: Chapter 9 Immunhistochemistry Staining Methods. In: Kumar GL,
Rudbeck L (Hrsg) Educational Guide Immunohistochemical (IHC) Staining
Methods, Dako, S. 103-108 (2009)
55
Kondo S, Sauder DN: Epidermal cytokines in allergic contact dermatitis. J AM
Acad Dermatol 33: 786-800 (1995)
56
Koopmann J, Fedarko NS, Jain A: evaluation of osteopontin as biomarker for
pancreatic adenocarcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 13: 487-491
(2004)
57
Kupper T, Groves R: the Interleukin-1 axis and cutaneous inflammation. J Invest
Dermatol 105: 62S—66S (1995)
58
Lampe M A, Patarca R, Iregui M V, Cantor H: Polyclonal B cell activation by the
Eta-1 cytokine and the development of systemic autoimmune disease. J Immunol
147: 2902-2906 (1991)
59
Liaw L, Almeida M, HartCE, Schwartz M und Giachelli CM: Osteopontin
promotes vascular cell adhesion and spreading and is chemotactic for smooth
muscle cells in vitro. Circ Res 74: 214-224 (1994)
60
Liaw L, Skinner M, Raines E, Ross R, Cheresh D, Schwartz S, Giachelli C: The
adhesive and migratory effects of Osteopontin are mediated via distinct cell
surface integrins. Role of alphavbeta3 in smooth muscle cell migration to
Osteopontin in vitro. J Clin Invest 95: 713-724 (1995)
61
Liaw L, Birk D, Ballas C, Jeffrey S, Whitsitt S, Davidson J, Hogan L: Altered
wound Healing in Mice lacking a functional Osteopontin gene. J Cin Invest 101:
1468-1478 (1998)
62
Lonsdorf AS, Enk AH: Immunologie des allergischen Kontaktekzems. Hautarzt
60: 32-41 (2009)
Literaturverzeichnis
63
68
Ma J, Wing JH, Guo YJ, Sy MS, Bigby M: In vivo treatment with anti-ICAM-1
and antiLFA-1 antibodies inhibits contact sensitation-induced migration of
epidermal langerhans cells to regional lymph nodes. Cell Immunol 158: 389-399
(1994)
64
Mackay CR: Homing of naïve, memory and effector lymphocytes. Curr Opin
Immunol 5: 423-427 (1993)
65
Marshall D, Haskard DO: Clinical overview of leucocyte adhesion and migration:
where are we now? Semin Immunol 14: 133-140 (2002)
66
Martin SF, Jakob T: From innate to adaptive immune responses in contact
hypersensitivity. Curr opin Allergy Clin Immunol 8: 289-293 (2008)
67
Martinetti A, Bajetta E, Ferrari L: Osteoprotegrin and Osteopontin serum values
in postmenopausal advanced breast cancer patients treated with anastrozole.
Endocr Relat Cancer 11: 771-779 (2004)
68
Masutani K, Akahoshi M, Tsuruya K: Predominance of Th1 immune response in
diffuse proliferative lupus nephritis. Arthritis Rheum 44: 2097-2106 (2001)
69
Merad M, Ginhoux F, Collin M: Origin, homeostasis and function of Langerhans
cells and other langerin-expressing dendritic cells. Nature Reviews Immunology
8: 935-947 (2008)
70
Murugaiyan G, Mittal A, and Weiner HL: Increased osteopontin expression in
dentritic cells amplifies IL-17 production by CD4+ T-cells in experimental
autoimmune encephalitis and in multiple sclerosis. J Immunol 181: 7480-7488
(2008)
71
Nau G, Liaw L, Chupp G: a chemoattractant cytokine associated with granulomas
in tuberculosis and silicosis 94: 6414-6419 (1997)
72
Nau G, Liaw L, Chupp G, Berman BJ, Hogan B, Young R: Attentuated host
resistance against mycobacterium bovis BCG infection in mice lacking
Osteopontin. Infect Immun 67: 4223-4230 (1999)
Literaturverzeichnis
73
69
Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H et al.: Osteopontin deficiency reduces
experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues. J. Bone Miner Res 16:
652-659 (2001)
74
Nestle FO, Meglio D, Qin J, Nickoloff BJ: Skin Immune sentinels in health and
disease. Nat. Rev Immunol 9: 679-691 (2009)
75
O`Regan AW, Chupp GL, Lowry JA, Goetschkes M, Mulligan N, and Berman JS:
Osteopontin is associated with T cells in sarcoid granulomas and has T cell
adhesive and cytokine-like properties in vitro. J Immunol 162: 1024-1031 (1999)
76
O`Regan A, Nau G, Chupp G, Berman J: Osteopontin (Eta-I) in cell-mediated
immunity: teaching an old dog new tricks. Elsevier Science 10: 475-478 (2000)
77
O`Regan A, Hayden J, Body S, Liaw L, Mulligan N, Goetschkes M, Berman S:
Abnormal Pulmonary Granuloma Formation in Osteopontin-deficient Mice. Am J
respire Crit Care Med 156: 2243-2247 (2001)
78
Ohyama Y, Nemoto H, Rittling S et al. Osteopontin deficiency suppresses growth
of B16 melanoma cells implanted in bone and osteoclastogenesis in co-cultures.
J. Bone Miner Res 19: 1706-1711 (2004)
79
Okada H, Moriwaki K, Konishi K et al.:Tubular osteopontin expression in human
glomerulonephritis and renal vasculitis. Am J. Kidney Dis 36: 498-506 (2000)
80
Ophascharoensuk V, Giachelli C, Gordon K: Obstructive uropathy in the mouse:
role of Osteopontin in interstitial fibrosis and apoptosis. Kid internatl 56: 571-580
(1999)
81
Palmer E, Ruegg C, Ferrando R, Pytela R, Sheppard D: sequence and tissue
distribution of the integrin alpha 9 subunit, a novel partner of beta 1 that is widely
distributed in epithelia and muscle. J Cell Biol 123: 1289-1297 (1993)
82
Pan HW, Ou YH, Peng SY et al.: Overexpression of osteopontin is associated
with intrahepatic metastasis , early recurrence, and poorer prognosis of surgically
resected hepatocellular carcinoma. Cancer 98: 119-127 (2003)
Literaturverzeichnis
83
70
Pardo A, Gibson K, Cisneros J, Richards T, Yang Y, Becerril, Yousem S, Herrera
I, Riuz V, Selman M, Kaminski N: Up-Regulation and Profibrotic Role of
Osteopontin in Human Idiopathic Pulmonary Fibrosis 2: 891-903 (2005)
84
Patarca R, Freeman G, Singh R, Wei F, Durfee T, Blattner F, Regnier D, Kozak
C, Mock B, Morse H: structural and functional studies of the early T lymphocyte
activation 1 (Eta1) gene. Definition of a novel T cell dependent response
associated with genetic resistance to bacterial infection. J. Exp. Med 170: 145-161
(1989)
85
Patarca R, Saavedra R, Cantor H: Molecular and cellular basis of genetic
resistance to bacterial infection: the role of the early T-lymphocyte activation-1/
Osteopontin gene. Crit Rev Immunol 13: 225-246 (1993)
86
Philip S, Bulbule A, kundu G: Osteopontin stimulates tumor growth and
activation of promatrix metalloproteinase-2 through nuclear factor-kappa Bmediated induction of membrane type 1 matrix metalloproteinase in murine
melanoma cells. J Biol Chem 276: 44926-44935 (2001)
87
Piccirillo CA, Sherach EM: Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by
CD4+ CD25+ immunoregulatory cells. J Immunol 167: 1137 (2001)
88
Picker L, De los Toyos J, Telen M, Haynes B, Butcher E: Monoclonal antibodies
against the CD44 (In (Lu) related p80), and Pgp-1 antigens in man recognize the
Hermes class of lymphocyte homing receptors. J Immunol 142: 2046-2051 (1989)
89
Pileri SA, Roncador G, Ceccarelli M, Briskomatis A, Sabattini E, Ascani S,
Santini D, Piccaluga PP, Leone O, Damiani S, Ercolessi C, Sandri F, Pieri F,
Leoncini L, Falini B: Antigen retrieval techniques in immunhistochemistry:
comparison of different methods. J Pathol 183: 116-123 (1997)
90
Pober JS, Bevilacqua MP, Mendrick DL, Lapierre LA, Fiers W, Gimbrone MA Jr:
Two distinct monokines, interleukin 1 and tumor necrosis factor, each
independently induce biosynthesis and transient expression of the same antigen on
the surface of cultured human vascular endothelial cells. J Immunol 136: 16801687 (1986)
Literaturverzeichnis
91
71
Pober JS, Kluger MS, Schechner JS: Human endothelial cell presentation of
antigen and the homing of memory/effector T cells to skin. Ann NY Acad Sci
941: 12-25 (2001)
92
Pollack S, Linnemeyer P, Gill S: Induction of Osteopontin mRNA expression
during activation of murine NK cells. J Leuk Biol 55: 398-400 (1994)
93
Price AA, Cumberbatch M, Kimber I: α6 integrins are required for Langerhans
cell migration from the epidermis. J Exp Med 186: 1725-1735 (1997)
94
Rambukhana A, Bos JD, Irik D, Menko WJ, Kapsenberg ML, Das PK: In situ
behaviour of human Langerhans cells in skin organ culture. Lab Invest 73: 521531 (1995)
95
Reinholt FP, Hultenby K, Oldberg A, Heinegard D: Osteopontin- a possible
anchor of osteoclasts to bone. Proc Natl Acad Sci USA 87: 4473-4475 (1990)
96
Renkl A, Wussler J, Ahrens T, Thoma K, Kon S, Uede T, Martin S, Simon J,
Weiss J: Osteopontin functionally activates dendritic cells and induces their
Differentiation towards a th-1 polarizing Phenotype. Blood 106: 946-955 (2005)
97
Richters CD, Hoekstra MJ, van Baare J, Du Pont JS, Hoefsmit EC, Kamperdijk
EW: Isolation and characterization of migratory human skin dentritic cells. Clin
Exp Immunol 98: 330-336 (1994)
98
Riemann H, Schwarz T, Grabbe S: Pathomechanismen der Auslösephase der
allergischen Kontaktdermatitis. JDDG 1: 613-619 (2003)
99
Rietschel, R L : Occupational contact dermatitis. Lancet 349: 1093-1095(1997)
100 Ring S, Schafer SC, Mahnke K, Lehr A, Enk AH : CD4+ CD25+ regulatory cells
suppress contact hypersensitivity reactions by blocking influx of effector T cells
into inflamed tissue. Eur. J Immunol 36 : 2981 (2006)
101 Rittling S, Denhardt D: Osteopontin function in pathology: Lessons from
osteopontin- deficient mice. Exp Nephrol 7: 103-113 (1999)
Literaturverzeichnis
72
102 Rudland PS, Platt-Higgins A, El Tanani M et al.: Prognostic significance of the
metastasis-associated protein osteopontin in human breast cancer. Cancer Res 62:
3417-3427 (2002).
103 Rustemeyer, T., I. M. W. van Hoogstraten, B. M. E. von Blomberg und R. J.
Scheper (2006). Mechanisms in Allergic Contact Dermatitis. Contact Dermatitis.
P. J. M. Frosch, T.; Lepoittevin, J.-P. Heidelberg, Springer Medizin Verlag. 4: 1144 (2006)
104 Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, Poggi S, Piccioli M, Ceccarelli C, Pieri F,
fraternali-Orcioni
E,
Pileri
SA:
The
Envision++system:
a
new
immunohistochemical method for diagnostics and research. Critical comparison
with the APAAP, Chemmate TM, CSA, LABC, and SABC techniques. J Clin.
Pathol. 51: 506-511 (1998)
105 Sad, S, Marcotte R und Mosmann TR: Cytokine-induced differentiation of
precursor mouse CD8+ T cells into cytotoxic CD8+ T cells secreting Th1 or Th2
cytokines. Immunity 2: 271-279. (1995)
106 Saitoh Y, Kuratsu J, Takeshima H, Yamamoto S, Ushio Y: Expression of
osteopontin by human glioma : its correlation with malignancy. Lab Invest 72: 5563 (1995)
107 Salmon, M, Kitas GD und Bacon PA: Production of lymphokine mRNA by
CD45R+ and CD45R- helper T cells from human peripheral blood and by human
CD4+ T cell clones. J Immunol 143: 907-912 (1989)
108 Scatena M, Almeido M, Chaisson ML, Fausto N, Nicosia RF, Giachelli CM: NFkappa B mediates alphavbeta3 integrin-induced endothelial cell survival. J Cell
Biol 141: 1083-1093 (1998)
109 Scatena M, Liaw L, Giachelli CM: Osteopontin: a multifunctional molecule
regulating chronic inflammation and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc
Biol 27: 2302-2309 (2007).
Literaturverzeichnis
73
110 Schulz G, Renkl AC, Seier A, Liaw L and Weiss JM: Regulated osteopontin
expression by dendritic cells decisively affects their migratory capacity. J Invest
Dermatol 128: 2541-2544 (2008)
111 Schwarz A, Grabbe S, Riemann H et al: In vivo effects of interleukin-10 on
contact hypersensitivity and delayed-type hypersensitivity reactions. J Invest
Dermatol 103: 211-216 (1994)
112 Screaton G, Bell M, Jackson D, Cornelis F, Gerth U, Bell J: genomic structure of
Dann encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12
alternatively splieced exons. Proc Nat Acad Sci USA 89: 12160 (1992)
113 Seddon, B. und Mason D: Peripheral autoantigen induces regulatory T cells that
prevent autoimmunity. J Exp Med 189: 877-882 (1999)
114 Seier A, Renkl A, Schulz G, Uebele T, Sindrilaru A, Iben S, Liaw L, Kon S, Uede
T, Weiss J: Antigen-Specific Induction of Osteopontin contributes to the
Chronification of Allergic Contact Dermatitis. Am J Pathol 176: 246-258 (2010)
115 Senger D, Wirth D, Hynes R: Transformed mammalian cells secrete specific
proteins and phosphoproteins. Cell 16: 885 (1979)
116 Senger D, Ledbetter S, Claffey KP, Papadopoulou-Sergiou CA, Peruzzi A,
Detmar M: Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability
factor/ vascular endothelial growth factor through cooperative mechanisms
involving the alphavbeta3 integrin, osteopontin, and Thrombin. Am J Pathol 149:
293-305 (1996)
117 Senger D, Peruzzi C: Cell migration promoted by a potent GRGDS- containing
thrombin- cleavage fragment of osteopontin. Biochimica et Biophysica Acta
1314: 13-24 (1996)
118 Sherach EM, Mattugh RS, Piccirillo CA, Thornton AM: Control of T-cell
activation by CD4+ CD25+ suppressor T cells. Immunol Rev 182: 58 (2001)
Literaturverzeichnis
74
119 Shimizu Y, Newman W, Gopal TV, Horgan KJ, Graber N, Beall LD, van
Seventer GA, Shaw S: Four molecular pathways of T cell adhesion to endothelial
cells: roles of LFA-1, VCAM-1, and ELAM-1 and changes in pathway hierarchy
under different activation conditions. J. Cell Biol 113: 1203-1212 (1991)
120 Shinohara ML, Jansson M, Hwang ES, Werneck MB, Glimcher LH und Cantor
H: T-bet-dependent expression of osteopontin contributes to t-cell polarization.
Proc Natl Acad Sci U S A 102: 17101-17106 (2005)
121 Shinohara ML, Lu L, Bu J, Werneck MB, Kobayashi KS, Glimcher LH and
Cantor H: Osteopontin expression is essential for interferon-alpha production by
plasmacytoid dentritic cells. Nat immunol 7: 498-506 (2006)
122 Shinohara ML, Kim HJ, Kim JH, Garcia VA, and Cantor H: Alternative
translation of osteopontin generates intracellular and secreted isoforms that
mediate distinct biological activities in dentritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A
105: 7235-7239 (2008)
123 Shinohara, ML, Kim JH, Garcia VA, and Cantor H: Engagement of type I
interferon receptor on dentritic cells inhibits T helper 17 development: role of
intracellular osteopontin. Immunity 29: 68-78 (2008)
124 Singh K, De Vouge M, Mukherjee B: Physiological properties and differential
glycosilation of phosphorylated and non-phosphorylated forms of osteopontin
secreted by normal rat kidney cells. J Biol Chem 265: 18696-18701 (1990)
125 Singh R P, Patarca R, Schwartz J, Singh P, Cantor H: Definition of a specific
interaction between the early T lymphocyte activation 1 (Eta-1) protein and
murine macrophages in vitro and its effect upon macrophages in vivo. J Exp Med
171: 1931-1942 (1990)
126 Smith L, Cheung H, Ling L: Osteopontin N- terminal domain contains acryptic
adhesive sequence recognized by alpha9beta1 integrin. J Biol Chem 271: 2848528491 (1996)
Literaturverzeichnis
75
127 Smith L, Giachelli C: Structual requirements for α9β1 mediated adhesion and
migration to thrombin- cleaved OPN. Exp Cell Res 242: 351-360 (1998)
128 Sodek J, Batista Da Silva AP, Zohar R: Osteopontin and mucosal protection. J
Dent Res 85: 404-415 (2006)
129 Steinmann R: The dentritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev
Immunol 9: 271-96 (1991)
130 Steinman RM, Hoffman L, Pope M: Maturation and migration of cutaneous
dentritic cells. J Invest Dermatol 105: 2S-7S (1995)
131 Taylor CR, Shi SR: Comparative study of antigen retrieval heating methods:
Microwave, microwave and pressure cooker, autoclave, and steamer. Biotech
Histochem 71: 263-270 (1996)
132 Theofilopoulos A N, Dixon F J : Murine models of systemic lupus erythematodes.
Adv Immunol 37 : 269-390 (1985)
133 Van der Flier A, Sonnenberg A: Function and interactions of integrins. Cell
Tissue Res 305: 285-298 (2001)
134 Wang KX, Denhardt DT: Osteopontin: role in immune regulation and stress
responses. Cytokine Growth Factor Rev 19: 333-345 (2008)
135 Wardorf HA, Walsh LJ, Schechter NM: early cellular events in evolving
cutaneous delayed type hypertensitivity in humans. Am J Pathol 138: 477-486
(1991)
136 Weber G, Ashkar S, Glimcher M, Cantor H: Receptor-ligand interaction between
CD44 and Osteopontin (Eta-1). Science 271: 509-512 (1996)
137 Weber G, Cantor H: Differential roles of osteopontin/ Eta-1 in early and late lpr
disease. Clin Exp Immunol 126: 578-583 (2001)
Literaturverzeichnis
76
138 Weber G, Zawaideh S, Hikita S, Kumar VA, Cantor H, Ashkar S:
Phosphorylation-dependent interaction of osteopontin with its receptors regulates
macrophage migration and activation. J Leukoc Biol 72: 752-761 (2002)
139 Weinlich G, Heine M, Stössel H, Zanella M, Stoitzner P, Ortner U, Smolle J,
Koch F, Sepp NT, Schuler G, Romani N: Entry into afferent lymphatics and
maturation in situ of migrating murine cutaneous dentritic cells. J Invest Dermatol
110: 441-448 (1998)
140 Weiss JM, Sleeman J, Renkl A: An Essential Role for CD44 variant Isoforms in
Epidermal Langerhans Cell and Blood Dendritic Cell Function. The Journal of
Cell Biology Volume 137, Number 5: 1137-1147 (1997)
141 Weiss J, Renkl A, Maier C, Kimmig M, Liaw L, Ahrens T, Kon S, Maeda M,
Hotta H, Uede T, Simon J: Osteopontin is Involved in the Initiation of Cutaneous
Contact hypersensitivity by Inducing Langerhans and dendritic Cell Migration to
Lymph Nodes. J Exp Med 9: 1219-1229 (2001)
142 Westerman J, Geismar U, Sponholz A, Bode U, Sparshott, Bell EB CD4+ T cells
of both the naïve and the memory phenotype enter rat lymph nodes and
Peyer`patches via endothelial venules: within the tissue their migratory behaviour
differs. Eur J immunol 27: 3174-3181 (1997)
143 Wong CK, Lit LC, Tam LS, Li EK, and Lam CW: Elevation of plasma
osteopontin concentration is correlated with disease activity in patients with
systemic lupus erythematodes. Rheumatology (Oxford) 44: 602-606 (2005)
144 Xanthou G, Alissafi T, Semitekolou M, Simoes DC, Economidou E, Gaga M,
Lambrecht BN, Lloyd CM, and Panoutsakopoulou V: Osteopontin has a crucial
role in allergic airway disease through regulation of dentritic cell subsets. Nat
Med 13: 570-578 (2007)
145 Xu AP, Bai J, Lu J: Osteopontin gene polymorphism in association with systemic
lupus erythematodes in Chinese patients. Chin Med J (Engl) 120: 2124-2128
(2007)
Literaturverzeichnis
77
146 Xu H, Diiulio N, Fairchild R: T cell populations primed by haptensensitization in
contact sensitivity are distinguished by polarized patterns of cytokine production:
interferon gamma-producing (Tc1) effector CD8+ T cells and interleukin (II) 4/II
-10-producing (Th2) negative regulatory CD4+ T cells. J. Exp Med 183: 10011012 (1996)
147 Yanamoto N, Sakai F, Kon S: Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR
within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. J Clin Invest 112:
181-188 (2003)
148 Yokosaki Y, Matsuura N, Sasaki T: the integrin alpha(9)beta(1) binds to a novel
recognition sequence (SVVYGLR) in the thrombin-cleaved amino-terminal
fragment of Osteopontin. J Biol Chem 274: 36328-36334 (1999)
149 Young M, Kerr J, Termine J: cDNA cloning, mRNA distribution and
heterogeneity, chromosomal location, and RFLP analysis of human Osteopontin
(OPN). Genomics 7: 491-502 (1990).
150 Zanni MP, von Greyerz S, Schnyder B, Brander KA, Frutig K, Hari Y, Valitutti S,
Pichler WJ: HLA-restricted, processing- and metabolism-independent pathway of
drug recognition by human alpha beta T lymphocytes. J. Clin Invest 102: 15911598 (1998)
151 Zinkernagel R.M, Bachmann M.F: „ on immunologial memory“. Annu Rev
Immunol 14: 333-367 (1996)
Tabellenverzeichnis
78
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Expression von T-Zellmarkern bei Gewebeproben von akuten allergischen
Kontaktekzemen. ................................................................................................ 46
Tabelle 2: Expression von T-Zellmarkern bei Gewebeproben von chronischen allergischen
Kontaktekzemen. ................................................................................................ 48
Danksagung
79
Danksagung
An dieser Stelle bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Weiss und der
Experimentellen Dermatologie, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Ganz besonders bedanke ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Johannes
Weiss für die Bereitstellung des interessanten Themas, die gute Betreuung meiner Arbeit,
die konstruktiven Anregungen und die Korrektur meines Manuskrips. Vielen Dank für die
freundschaftliche Atmosphäre, durch die mir die Arbeit sehr viel Spaß gemacht hat.
Bei Frau Prof. Dr. Karin Scharfetter-Kochanek bedanke ich mich für die freundliche
Aufnahme in ihre Abteilung und für die Möglichkeit, in den Laboren der Klinik für
Dermatologie und Allergologie der Universität Ulm zu arbeiten.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Andreas Renkl für die gute Betreuung und Einarbeitung.
Vielen Dank auch für ermutigende Gespräche und die Hilfe bei der Literaturrecherche.
Heidi Hainzl und allen Mitarbeitern im Labor danke ich für die Unterstützung bei der
Durchführung der Immunhistochemie. Josef Schlick für die Hilfe bei der Anfertigung der
histologischen Schnitte, Dr. Anca Sindrilaru für die Einführung in das Photomikroskop
und Anne Saier für den Austausch über das Thema.
Außerdem danke ich den Labormitarbeitern des Robert-Bosch Krankenhauses Stuttgart für
die Beratung und Unterstützung bei der Doppelfärbung.
Ganz besonders danke ich meiner Familie für die Unterstützung meiner Arbeit. Meinem
Vater und meiner Mutter für die einzigartige Kinderbetreung meiner beiden Jungs.
Dietmar danke ich für Verständnis und Geduld und für ermutigende und aufbauende Worte
und für die schöne Zeit mit ihm neben der Arbeit.
Lebenslauf
Lebenslauf
Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
80