Die Institute Abteilung Genvektoren

Die Institute
Abteilung Genvektoren
Department of Gene Vectors
München / Munich
(Leiter / Head: Prof. Dr. Wolfgang Hammerschmidt)
ie Abteilung Genvektoren befasst sich
mit der molekularbiologischen Untersuchung eines Herpesvirus des Menschen und dessen Interaktion mit menschlichen Zielzellen. Epstein-Barr-Virus war das
erste bekannte menschliche Tumorvirus, es
gilt heute als karzinogenes Agens nach der
internationalen Klassifikation der WHO. Das
Virus ist assoziiert mit einer Reihe von
Tumoren wie dem Nasopharyngealen Karzinom, dem Magenkarzinom, dem Burkittund Hodgkin Lymphom und anderen Lymphomen des Menschen, die vor allem bei
immunsupprimierten Patienten auftreten.
Eine herausragende Eigenschaft des Epstein-Barr-Virus macht die Forschung mit
diesem viralen System besonders attraktiv:
Das Virus infiziert sehr effizient ruhende,
nicht proliferierende, menschliche B Zellen.
Die Infektion ist latent, Nachkommenviren
werden nicht gebildet, die genetische Information des Virus bleibt aber in der infizierten Zelle erhalten. Diese latent infizierten
Zellen erwerben die Eigenschaft, im Labor
unbegrenzt zu proliferieren und spiegeln
damit einige (aber nicht alle) Aspekte der
Tumorentstehung beim Menschen wider.
Diese veränderten, ständig proliferierenden
B-Zellen stellen ein Modellsystem dar, das
wir als Plattform für unsere Arbeit nutzen.
Im Rahmen unserer molekularbiologischen
Forschung verfolgen wir verschiedene
Aspekte, die sich mit der Kontrolle der
Zellproliferation, der viralen und zellulären
DNA-Replikation und der Signalübertragung
von Virus-kodierten und verwandten zellulären Rezeptoren befassen. Als methodischen
Ausgangspunkt haben wir molekulargenetische Werkzeuge geschaffen, die uns nicht
nur die gezielte Manipulation der pathogenen Eigenschaften des Virus erlauben,
D
esearch in the Department of
Gene Vectors is concerned with the
molecular analysis of a human
herpes virus, Epstein-Barr virus, and the
interaction of the virus with its host cell.
Epstein-Barr virus (EBV) is a model
pathogen in that it infects man and
establishes a latent infection for a lifetime.
It was the first human tumour virus to be
discovered and is now classified as a Group
1 carcinogen by the WHO. This virus is
strongly associated with a number of
human tumours such as nasopharyngeal
carcinoma, stomach carcinoma, Burkitt’s
and Hodgkin’s lymphoma, and other
human lymphomas, especially those that
occur in patients undergoing immunosuppression. A special characteristic of the
virus makes it particularly attractive as a
model system for research: EBV easily
infects resting human B-lymphocytes.
The infection is latent, no viruses are
produced, but the infected cells are transformed into cell lines that can proliferate
indefinitely in cell culture, thus reflecting
some (but not all) aspects of tumour
etiology in man. These transformed,
proliferating B-cells provide us with a
model system for our research. The
molecular-biological research focuses on
different aspects of control and regulation
of cell proliferation, DNA replication,
and signalling of cellular and viral receptor
molecules. For this, we have developed
tools that not only enable targeted manipulation of the pathogenic characteristics of
the virus, but also enable us to construct
safe gene vectors that can deliver genes of
therapeutic interest into normal or transformed human B-cells. In order to work on
the different tasks effectively, the research
R
GSF " 163
sondern es auch ermöglichen, sichere Genvektoren herzustellen, die therapeutisch
interessante Gene in normale oder transformierte menschliche B-Zellen einbringen
können. Um diesen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden, arbeiten wir an drei
teilweise überlappenden Themen, die EBVGenetik und virale Vektorentwicklung zum
Inhalt haben oder Aspekte der DNA-Replikation beziehungsweise der Signaltransduktion bearbeiten.
Die Forschungsarbeiten der Abteilung
Genvektoren werden im Rahmen des HGF
Programms „Infektion und Immunität“ des
Helmholtz-Forschungsbereiches Gesundheit
durchgeführt. Im Mittelpunkt der Forschungsaktivitäten der Abteilung steht die
Aufklärung von Genfunktionen des humanen Herpesvirus Epstein-Barr (EBV). Der
Fokus liegt hierbei auf der Kontrolle der
Virus-regulierten Zellproliferation, der viralen und zellulären DNA-Replikation und der
Signalübertragung von Virus-kodierten und
verwandten zellulären Rezeptoren. Ein
breites Spektrum an Untersuchungsmethoden der Genomik, Proteomik, Bioinformatik
und Phänotypanalyse ermöglicht ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen und Entstehungsmuster von Tumorerkrankungen des Menschen. Es bestehen
Kooperationen innerhalb des HGF-Programms „Infektion und Immunität“ des
HGF-Forschungsbereiches Gesundheit.
Die Arbeiten am Institut werden federführend von Prof. Dr. Wolfgang Hammerschmidt, Dr. Arnd Kieser und Dr. Aloys
Schepers geleitet.
Am Jahresende waren in der Abteilung
10 Wissenschaftler/innen, 10 Doktoranden/
innen und vier technische Mitarbeiter/innen
beschäftigt; insgesamt werden ca. 60 % der
Personalstellen über Drittmittel finanziert.
is focused on three, partially overlapping,
themes: EBV genetics and vector
development, DNA replication, and signal
transduction.
The research is carried out under the
HGF programme on ‘Infection and
Immunity’. The central research theme is
the elucidation of gene functions of the
human herpes virus, Epstein-Barr (EBV).
The focus is on the control of virus
regulated cell proliferation, viral and
cellular DNA replication, and signal
transfer by virus-coded and related cell
receptors. We use a broad spectrum of
investigation methods from the fields of
genomics, proteomics, bioinformatics,
and phenotype analysis, to help improve
understanding of the basic mechanisms
and development patterns of tumours in
man. We collaborate with others within
the HGF programme on ‘Infection and
Immunity’. The research is coordinated
by Prof. Wolfgang Hammerschmidt,
Dr. Arnd Kieser, und Dr. Aloys Schepers.
At the end of the year there were
10 scientists, 10 postgraduate students,
and 4 technicians in the Department,
two-thirds of them supported by external
grants.
Der B-Zell-Rezeptor und das latente
Membranprotein 2A des Epstein-Barr Virus
haben analoge Funktionen für Überleben
und Proliferation von menschlichen B-Zellen
Hodgkin und Reed-Sternberg (HRS) Zellen,
ihren Ursprung in B-Lymphozyten haben.
Solche B-Zellen sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems, weil sie für die
Erkennung und Eliminierung von körperfremden Proteinen und infektiösen Erregern
wie Bakterien und Viren verantwortlich sind.
Das wichtigste Werkzeug bei der Abwehr
Das Hodgkin Lymphom ist ein bösartiger
Tumor des lymphatischen Systems, dessen
charakteristische Zellen, die so genannten
164 " GSF
Die Institute
sind Antikörper, die von den B-Zellen produziert werden. Diese Antikörper können
sowohl als B-Zell-Rezeptoren (BCRs) oder
als lösliche Antikörper (Immunglobuline)
gebildet werden. B-Zellen werden auch sehr
spezifisch vom Epstein-Barr Virus (EBV)
infiziert; sie sind somit ein gemeinsames
Glied zwischen EBV und den transformierten Zellen eines Hodgkin Tumor.
Einige Beobachtungen lassen einen direkten Zusammenhang zwischen einer EBVInfektion und der Erkrankung an Hodgkin
erkennen:
• über 50% der HRS Zellen sind mit EBV
infiziert;
• Patienten die an der infektiösen Mononucleose (Pfeiffersches Drüsenfieber, eine
durch EBV verursachte Erkrankung) erkrankt waren, haben ein dreifach erhöhtes
Risiko, an Hodgkin Lymphom zu erkranken;
• Hodgkin Lymphom Patienten weisen
erhöhte Antikörperkonzentrationen gegen
EBV auf.
Neben ihrer Größe und einer Vielzahl an
Zellkernen weisen die HRS Zellen noch eine
weitere Besonderheit auf: durch DNA-Sequenzierung konnte gezeigt werden, dass
eine beträchtliche Anzahl der HSR Zellen
Mutationen in den Immunglobulingenen
besitzen, die für die Synthese der B-Zellspezifischen Antikörper benutzt wird. Antikörper (oder B-Zell-Rezeptoren) erkennen
körperfremde Stoffe und leiten Signale von
der Zelloberfläche in den Zellkern weiter,
was dazu führt, dass die B-Zellen proliferieren und weiter differenzieren. Fehlen solche
Signale, weil der Antikörper aufgrund der
erwähnten Mutationen nicht mehr gebildet
werden kann, werden die Zellen sofort
durch den programmierten Zelltod (Apoptose) eliminiert. Warum im Falle des HodgkinTumors Zellen ohne einen B-Zell-Rezeptor
dennoch überleben und so wahrscheinlich
die Stammzelle des Tumors darstellen, ist
Gegenstand unserer Forschung. Uns interessiert auch, welche Rolle eine Infektion
mit EBV bei der Tumorentstehung spielt,
und welche viralen Proteine bei der Tumorentstehung wichtig sind.
Eine herausragende Rolle bei der Entstehung eines Hodgkin Lymphoms spielt wahrscheinlich das virale Protein LMP2A, das eine
hohe Homologie mit dem intrazellulären Teil
COOH
NH2
ITAM
LMP2A
lg-α
lg-β
(AS 62-88)
Abb. 1: Ähnlichkeiten zwischen dem viralen Protein LMP2A und dem zellulären B Zell-Rezeptor.
Gezeigt ist eine schematische Darstellung des
LMP2A-Proteins mit hervorgehobenen N-terminalen Tyrosin-Resten (Y), die Bindestellen für SH2Proteine bilden. Zwei Tyrosine sind Teil des ITAMMotifs, das Sequenz-Homologien zum BCRKorezeptor-Komplex Igα und Igβ aufweist. Durch
diese Ähnlichkeiten kann LMP2A BCR-ähnliche
Signale ersetzen und BCR-defiziente Zellen vor
dem programmierten Zelltod bewahren.
des B-Zell-Rezeptors aufweist (Abb. 1).
Ähnlich wie Komponenten des B-Zell-Rezeptors kann der cytoplasmatische Teil von
LMP2A an mehreren Tyrosinen phosphoryliert werden, die dadurch zu Bindestellen für
SH2-Proteine wie den Proteinkinasen Lyn
und Syk werden. Zwei solcher Tyrosine
liegen in einem so genannten ITAM-Motif,
das Sequenzhomologien zu den BCR-Korezeptoren Iga und Igb aufweist. Dort binden
die SH2-Proteine und initiieren BCR-spezifische Signalkaskaden. Sie sind somit wichtige Mediatoren der für B-Zellen überlebenswichtigen Signalwege von der Zelloberfläche in den Zellkern. Nicht nur strukturell
sondern auch funktionell bestehen Parallelitäten zwischen LMP2A und dem BCR: das
virale Protein greift in die zellulären BCR
Signalwege ein, wie durch biochemische
Experimente belegt wurde. Allerdings zeigen HRS Tumorzellen in der Regel keine
Expression eines BCR auf Grund von Mutationen in den Immunglobulingenen. Das
Fehlen eines BCR führt zum Ausfall von
wichtigen Signalen, die als Konsequenz den
physiologischen Zelltod der B-Zelle nach
sich ziehen sollte. Aufgrund der beschriebenen Homologien zwischen LMP2A und dem
BCR lag die These nahe, dass LMP2A funktionell den B-Zell-Rezeptor auf Zellen erset-
GSF " 165
A
BrdU
BCR+/–
uninf.
7-AAD
B
+
BCR
LMP2A+
D
–
BCR
LMP2A+
C
+
BCR
LMP2A–
E
–
BCR
LMP2A–
Abb. 2: DNA-Synthese Experimente verschiedener Zell-Populationen nach EBV Infektion. Uninfizierte B Zellen beginnen in vitro keine DNA-Synthese (A, eingerahmtes Feld). Infektion mit einem
LMP2A-positiven Virus führt in beiden Populationen, BCR-positiv und BCR-negativ zur Zellteilung
(B und D). Fehlt dem Virus das LMP2A-Gen, kann
es nur die BCR+ Population zur Proliferation treiben (C), nicht dagegen die BCR– Population (E).
zen könnte, in dem es zur Aktivierung von
intrazellulären Signalkaskaden – ähnlich
dem BCR – beiträgt. Sollte LMP2A essentielle Funktionen des B-Zell-Rezeptor übernehmen können (man spricht auch von molekularem Mimikry), würde die Zelle lebensnotwendige Signale erhalten und somit auch
ohne BCR überleben können. Solche BZellen würden dann nicht mehr eliminiert
werden, sondern einen Pool für die Entstehung des Hodgkin Lymphoms darstellen.
Experimentell konnten wir diese Hypothese durch Infektionen verschiedener humaner B-Zellpopulationen mit Virusmutanten
belegen, die kein virales LMP2A Protein
exprimieren können. Die B-Zellpopulationen
wurden mit Hilfe von magnetisch gekoppelten Antikörpern in zwei Fraktionen getrennt:
Zellen, die den B-Zell-Rezeptor auf der
Oberfläche tragen und solche, die keinen
B-Zell-Rezeptor exprimieren. Letztere haben
keine Möglichkeit, überlebenswichtige
Signale vom BCR zu empfangen und werden deshalb nur kurzzeitig überleben kön-
166 " GSF
nen. Beide B-Zellpopulationen wurden mit
Wildtyp-EBV infiziert. Das Überleben und
die Proliferation der Zellen nach Infektion
mit EBV wurde durch BrdU-Einbauexperimente untersucht. Wir konnten zeigen, dass
sowohl die BCR-positive Population, als
auch diejenige, die keinen BCR an der Oberfläche trägt, zu wachstumstransformierten
Zelllinien auswächst. Eine Auswahl solcher
Experimente ist in Abbildung 2 gezeigt.
Infizierte (Abb. 2 B-E) bzw. uninfizierte (Abb.
2A) Zellen wurden mit dem DNA-Basenanalogon BrdU behandelt. Sich teilende Zellen
bauen dieses Molekül in ihre DNA ein, was
durch BrdU-spezfische Antikörper nachgewiesen werden kann. In der Abbildung sind
proliferierende Zellen in den eingesetzten
Fenstern zu erkennen. Ohne EBV-Infektion
proliferieren die Zellen nicht, im Fenster
befinden sich keine Zellen (Abb. 2A). Dagegen führte eine EBV Infektion sowohl bei
BCR-positiven Zellen (Abb. 2B) als auch
BCR-negativen Zellen (Abb. 2D) zur B-ZellProliferation. Dieser Befund zeigt, dass eine
EBV-Infektion in der Lage ist, BCR-negative
B-Zellen vor dem physiologischen Zelltod,
der Apoptose, zu schützen. Aus diesen
Infektionen wurden 300 transformierte
Einzelzellklone mittels FACS-Analyse (fluorescence activated cell sorting), WesternBlotting (Protein-Nachweismethode) und
Sequenzierung auf Mutationen in den Immunglobulingenen des BCR untersucht. In
fünf Klonen konnte eine Mutation nachgewiesen werden, die die Expression des BCR
unmöglich macht. Diese fünf Klone stellen
somit genetisch eine Situation ähnlich dem
Hodgkin Lymphom dar und zeigen einen
möglichen Beitrag von EBV zur Entstehung
dieses Tumors auf.
Von wesentlicher Bedeutung in den ersten
Stunden nach einer Infektion sind zwei
virale anti-apoptotische Proteine, die aufgrund von Aminosäuren-Sequenz-Homologien zu einer Familie von zellulären Proteinen, Mitgliedern der BCL-2 Familie (Abb. 3),
gerechnet werden, die bei der Regulation
des programmierten Zelltodes entscheidend
sind. Diese viralen Gene werden mit den
Akronymen BHRF1 und BALF1 bezeichnet,
und sie werden sehr früh nach Infektion
primärer B-Zellen exprimiert (Abb. 4). Obwohl ihre anti-apototische Funktion gerade
BH4
BH3
BH1
BH2 TM
BHRF1
BALF1
BAX
BAD
Abb. 3: Vertreter der zellulären Bcl-2-Familie mit
den Bcl-2 Homologiedomänen (BH1-BH4).
Gezeigt sind auch die beiden EBV-Gene BALF1
und BHRF1 und ihre Domänenstruktur im Vergleich zu Bcl-2, BAX und BAD.
in den ersten Tagen nach Infektion von
besonderer Bedeutung ist, sind sie wenige
Wochen nach Infektion nicht mehr detektierbar. Wir konnten erstmals zeigen, dass EBV
zwei anti-apoptotische Gene besitzt, was
eine spektakuläre Ausnahme bei Viren
darstellt. Die Funktion dieser anti-apoptotischen Gene besteht darin, in den ersten drei
bis vier Tagen nach der EBV-Infektion die BZellen auch im infizierten Wirt erfolgreich zu
stabilisieren, besonders in Situationen, in
BHRF1 cDNA
BALF1 cDNA
HPRT control
B95.8
day 28
day 21
day 14
day 10
day 7
day 4
day 1
uninfected
18 h @ 4 °C
RNA control
Abb. 4: Expression der Gene BALF1 und BHRF1 zu
verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion primärer ruhender B-Lymphozyten. Mit Hilfe einer
RTPCR-Analyse mit mRNA, die zu den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion der B-Lymphozyten isoliert wurde, konnte bestimmt werden, dass
am Tag 1 die beiden Gene maximal exprimiert
werden und im Lauf der Infektion ständig abnehmen. Vier Wochen nach Infektion ist das BALF1Gen nicht mehr, beim BHRF1-Gen nur noch eine
wahrscheinlich nicht translatierte ungespleißte
mRNA-Form detektierbar.
denen die Zielzellen bereits im Begriff sind,
apoptotisch unterzugehen. Danach ist das
virale Programm so weit fortgeschritten,
dass alle anderen viralen Proteine, unter
ihnen auch LMP2A, voll exprimiert sind und
ihre Funktion entfalten können.
BCR-negative Zellen können durch eine
Infektion mit Wildtyp EBV gerettet werden,
wie in Abbildung 2D gezeigt. Die Rolle von
LMP2A ist aber auch entscheidend für das
Überleben dieser BCR-negativen Zellen. Wir
infizierten BCR-positive oder -negative BZellen mit einer EBV-Mutante, die genetisch
nicht mehr in der Lage ist, LMP2A zu exprimieren. In solchen Infektionsexperimenten
proliferierten nur BCR-positive B-Zellen; die
BCR-negative Population konnte nicht gerettet werden (Abb. 2C und E). Das bedeutet,
dass nur solche B-Zellen proliferieren und
zu Zelllinien auswachsen können, die entweder einen funktionellen BCR oder LMP2A
(oder beides) aufweisen. Einen weiteren
ergänzenden Hinweis lieferten EBV-infizierte
Zelllinien, die aus der Infektionen einer
gemischten Population aus BCR-positiven
und -negativen Zellen hervorgingen. Wurde
diese Population mit einem LMP2A exprimierenden Virus infiziert, so änderte sich an
ihrem Phänotyp nichts Wesentliches: auch
Wochen nach Infektion bestand die Zellpopulation wie ursprünglich sowohl aus BCRpositiven als auch aus BCR-negativen Zellen. Wurde die gleiche Population hingegen
mit dem LMP2A-negativen Virus infiziert, so
entstanden nur Zelllinien, die den BCR
exprimierten.
Beide Ergebnisse belegen eindeutig, dass
das Überleben von menschlichen B-Zellen
von BCR-ähnlichen Signalen entscheidend
abhängt. Es ist dabei gleichgültig, ob solche
Signale vom genuinen BCR oder von dem
viralen Protein LMP2A stammen. Die Rolle
des LMP2A Proteins besteht also darin,
BCR-negative Zellen vor dem physiologischen Zelltod zu schützen. Diese überlebenden Zellen stellen die Vorläuferzellen dar,
aus denen EBV-positive, maligne B-ZellLymphome beim Menschen entstehen
können.
Die Institute
BCL-2
GSF " 167
"
Zusammenarbeit
Es bestehen vielfältige Kooperationen im Münchner
Raum mit Instituten der Ludwig Maximilians-Universität
(LMU) und Klinischen Kooperationsgruppen der LMU
und der GSF. Auf nationaler Ebene bestehen Zusammenarbeiten mit dem Institut Virologie der Medizinischen
Universität Hannover, dem Biochemie Zentrum der
Universität Heidelberg, dem Heinrich-Pette-Institut in
Hamburg, der III. Medizinischen Klinik der Universität
Mainz, der Abt. Dermatologie der Universität ErlangenNürnberg, dem Zentrum für Innere Medizin, Abt. Hämatol. und Onkologie, Göttingen, dem Institut für Med.
Immunologie der Charitè Universität Berlin, dem Biozentrum der Univ. Würzburg und der Universität Konstanz.
Internationale Zusammenarbeiten betreffen Kollegen aus
dem CRC Institute for Cancer Studies, University of
Birmingham, Birmingham, UK, der Abteilung Medizinische Mikrobiologie der Universität Liverpool, UK, dem
McArdle Laboratory for Cancer Research, University of
Wisconsin, Madison, Wisconsin, USA, dem Baylor
College of Medicine, Department of Molecular Virology
and Microbiology, Houston, Texas, USA, dem National
Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, dem
Cancer Research Instute UK (Institutes in Oxford, London, Manchester), dem Albert-Einstein College of
Medicine, Bronx, NY, USA, dem Department of Microbiology and Immunology, Northwestern University, Chicago, IL, USA, dem Center for Cell and Gene Therapy,
Methodist Hospital, Texas USA, dem Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Wrigtht State
University, Dayton, dem Wistar Institute, Philadelphia,
USA, dem Shands Cancer Center, Univ. of Florida und
dem Laboratoire de Virologie Humaine, INSERM ENS,
Lyon Cédex, France.
Drei Mitarbeiter der Abteilung sind am Lehrbetrieb der
Münchner Universitäten beteiligt.
Die Arbeiten der Abteilung werden mit Drittmitteln der
Deutschen Forschungsgemeinschaft, der Deutschen
Krebshilfe, der Bayerischen Forschungsstiftung und der
National Institutes of Health der USA mit dem Partner
der Universität von Wisconsin, Madison unterstützt.
Weiter ist die Abteilung an regionalen und nationalen
Projekten der Universität München und an Sonderforschungsbereichen und Transregios der Deutschen
Forschungsgemeinschaft beteiligt.
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"
Ausgewählte Veröffentlichungen
Dirmeier, U., Hoffmann, R., Kilger, E., Schultheiß, U.,
Briseño, C., Gires, O., Kieser, A., Eick, D., Sugden, B. and
Hammerschmidt, W.: 2005. Latent membrane protein 1 of
Epstein-Barr virus coordinately regulates proliferation
with control of apoptosis. Oncogene. 24:1711-1717 (2005)
Mancao, C., Altmann, M., Jungnickel, B. and Hammerschmidt, W.: 2005. Rescue of „crippled“ germinal center
B cells from apoptosis by Epstein-Barr virus. Blood,
vol 106, number 13, 4339-4344 (2005)
Altmann, M. and Hammerschmidt, W.: 2005. Epstein-Barr
virus provides a new paradigm for viral inhibition of
apoptosis. PLoS Biology, Vol 3, Issue 12, 2148-2157 (2005)