Über den Mechanismus der Protonentranslokation

Über den Mechanismus
der Protonentranslokation
des respiratorischen Komplex I
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
vorgelegt von
Diplom-Chemiker
Stefan Steimle
aus Achern
Freiburg im Breisgau
2014
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Referent:
Korreferent:
Datum der mündlichen Prüfung:
Prof. Dr. Thorsten Koslowski
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Prof. Dr. Oliver Einsle
27.06.2014
„Gott, gib mir die Gelassenheit,
die Dinge hinzunehmen, die ich nicht ändern kann,
den Mut, die Dinge zu ändern, die ich ändern kann,
und die Weisheit, das eine vom anderen zu unterscheiden.“
Reinhold Niebuhr
Teile der in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurden bereits in folgenden
Artikeln veröffentlicht:
Steimle, S., Bajzath, C., Dörner, K., Schulte, M., Bothe, V. & Friedrich, T. (2011). Role of
subunit NuoL for proton translocation by respiratory complex I. Biochemistry 50, 3386-3393.
Morina, K., Schulte, M., Hubrich, F., Dörner, K., Steimle, S., Stolpe, S. & Friedrich, T.
(2011). Engineering the respiratory complex I to energy-converting NADPH:ubiquinone
oxidoreductase. J. Biol. Chem. 286, 34627-34634.
Steimle, S., Willistein, M., Hegger, P., Janoschke, M., Erhardt, H. & Friedrich, T. (2012).
Asp563 of the horizontal helix of subunit NuoL is involved in proton translocation by the
respiratory complex I. FEBS Lett. 586, 699-704.
Steimle, S.*, Erhardt, H.*, Muders, V., Pohl, T., Walter, J. & Friedrich, T. (2012). Disruption
of individual nuo-genes leads to the formation of partially assembled NADH:ubiquinone
oxidoreductase (complex I) in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 1817, 863-871.
*gleichberechtigte Autoren
Folgender Artikel wurde eingereicht:
Steimle, S., Schnick, C., Burger, E.-M., Nuber, F., Krämer, D., Dawitz, H., Brander, S.,
Matlosz, B., Schäfer, J., Maurer, K., Glessner, U. & Friedrich, T. (2014). Cysteine scanning
reveals minor local rearrangements of the horizontal helix of respiratory complex I during
turnover.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung………………………………………………….1
2. Einleitung…………………………………………………………..3
2.1 Die aerobe Elektronentransportkette in Escherichia coli………………...3
2.2 Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I)…………………….5
2.3 Kopplung von Elektronentransfer und Protonentranslokation………….10
2.4 Der Mrp Komplex………………………………………………………15
2.5 Die induzierbare Lysin Decarboxylase…………………………………16
2.6 Elektronenspinresonanz-Spektroskopie und ortsgerichtete
Spinsondenmarkierung………………………………………………….18
2.7 In vivo FRET-Messungen……………………………………………….21
2.8 Thema der Arbeit………………………………………………………..23
3. Material & Methoden……………………………………………..25
3.1 Materialien………………………………………………………………25
3.1.1 Chemikalien……………………………………………………………………25
3.1.2 Bakterienstämme……………………………………………………………….29
3.1.3 Vektoren………………………………………………………………………..30
3.1.4 Oligonucleotide………………………………………………………………...36
3.1.5 Enzyme…………………………………………………………………………40
3.1.6 Medien…………………………………………………………………………41
3.1.7 Puffer und Lösungen…………………………………………………………...44
3.2 Mikrobiologische Methoden……………………………………………48
3.2.1 Bakterienkultivierung…………………………………………………………..48
3.2.2 Messung der optischen Dichte…………………………………………………50
3.2.3 Herstellung von kompetenten Zellen…………………………………………..51
3.3 Molekularbiologische Methoden………………………………………..52
3.3.1 Ligation………………………………………………………………………...52
Inhaltsverzeichnis
3.3.2 Ligasefreies Klonieren (Gibson-Klonierung)………………………………….52
3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)……………………………………………..52
3.3.4 Transformation…………………………………………………………………56
3.3.5 λ-Red vermittelte Rekombination.......................................................................57
3.3.6 Plasmidisolation………………………………………………………………..58
3.3.7 Restriktionsanalyse…………………………………………………………….59
3.3.8 Agarose-Gelelektrophorese…………………………………………………….59
3.3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung……………………………………………..60
3.3.10 DNA-Sequenzierung………………………………………………………….60
3.4 Proteinchemische und Proteinanalytische Methoden…………………...60
3.4.1 Sequenzvergleiche……………………………………………………………..60
3.4.2 Präparation der cytoplasmatischen Membranen aus E. coli Zellen und
Detergenzextraktion der Membranproteine……………………………………60
3.4.3 Präparation von Komplex I…………………………………………………….61
3.4.4 Auftrennung verschiedener Komplex I Populationen………………………….62
3.4.5 Gelfiltration…………………………………………………………………….63
3.4.6 Zuckergradientenzentrifugation………………………………………………..64
3.4.7 Proteinbestimmung…………………………………………………………….64
3.4.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)………………………...65
3.4.9 Rekonstitution in Liposomen…………………………………………………..65
3.4.10 Aktivitätsmessungen………………………………………………………….66
3.4.11 TMR-Markierung……………………………………………………………..68
3.4.12 MTSL-Markierung……………………………………………………………68
3.4.13 EPR-Spektroskopie…………………………………………………………...69
3.4.14 Fluoreszenzspektroskopie…………………………………………………….69
3.4.15 Massenspektrometrie…………………………………………………………69
3.5 Mikroskopische Methoden……………………………………………...70
3.5.1 In vivo Fluoreszenzmikroskopie……………………………………………….70
3.5.2 In vivo FRET-Messungen……………………………………………………...70
3.5.3 Elektronenmikroskopie………………………………………………………...71
Inhaltsverzeichnis
4. Ergebnisse………………………………………………………...72
4.1 Einfluss einer verkürzten horizontalen Helix auf die
Protonentranslokation…………………………………………………...72
4.1.1 Darstellung der Mutanten……………………………………………………....73
4.1.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten
mit verkürztem C-Terminus……………………………………………………74
4.1.3 H+/e--Stöchiometrie der Varianten……………………………………………..79
4.2 Bedeutung konservierter saurer Aminosäurereste
auf der horizontalen Helix………………………………………………82
4.2.1 Darstellung der Mutanten………………………………………………………84
4.2.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten
mit mutierten Aspartat-Resten auf HL…………………………………………86
4.2.3 H+/e--Stöchiometrie der Varianten……………………………………………..88
4.2.4 Die Bedeutung des konservierten Restes Tyr594 der Untereinheit NuoL……..90
4.3 Cystein-Scanning der horizontalen Helix……………………………….92
4.3.1 Darstellung der Mutanten………………………………………………………93
4.3.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten
mit eingeführtem Cysteinrest auf der horizontalen Helix……………………...94
4.3.3 Aktivität der Cystein-Varianten………………………………………………..97
4.3.4 Fluoreszenzmarkierung der Cystein-Varianten……………………………….100
4.3.5 Beweglichkeit von MTSL in den mutierten Positionen………………………103
4.3.6 Molekularbiologische Grundlagen für eine doppelte Spinsondenmarkierung..107
4.4 Mutagenese des Ubichinon-Bindemotivs……………………………...109
4.4.1 Darstellung der Mutanten……………………………………………………..110
4.4.2 Überproduktion der Varianten und Präparation der Cytoplasmamembranen...111
4.4.3 NADH Oxidase-Aktivität der Varianten……………………………………...112
4.5 Wechselwirkung des Komplex I mit der induzierbaren
Lysin Decarboxylase LdcI……………………………………………..115
4.5.1 Darstellung eines FRET-fähigen E. coli Stammes……………………………115
4.5.2 Assemblierung des Komplex I in den verwendeten Stämmen…….................117
4.5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Zellen……………………….120
Inhaltsverzeichnis
4.5.4 In vivo FRET-Messungen…………………………………………………….121
4.5.5 Elektronenmikroskopie……………………………………………………….122
4.6 Versuche zum Ersatz von NuoL durch die
homologe Untereinheit MrpA…………………………………………128
4.6.1 Isolation und Charakterisierung des chimären Komplex I NuoL::MrpA…….128
4.6.2 Fusion von MrpA und NuoL………………………………………………….135
5. Diskussion……………………………………………………….143
5.1 Die Bedeutung der horizontalen Helix für die Protonentranslokation...143
5.2 Die Rolle konservierter Reste auf der horizontalen Helix……………..146
5.3 Cystein-Scanning der horizontalen Helix……………………………...148
5.4 Stabilität der Komplex I Präparationen und Zuverlässigkeit
der ACMA-Messung…………………………………………………..154
5.5 Die Bedeutung konservierter Reste an der Ubichinon-Bindestelle……157
5.6 Wechselwirkung des Komplex I mit der induzierbaren
Lysin Decarboxylase…………………………………………………..158
5.7 Austausch von NuoL gegen die homologe Untereinheit MrpA……….161
6. Literatur………………………………………………………….164
Anhang…………………………………………………………………
A1. Sequenzierungen………………………………………………………....I
A2. Vektorkarten……………………………………………………………IX
1. Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Die energiewandelnde NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch respiratorischer Komplex I
genannt, koppelt den Transfer von zwei Elektronen von NADH auf Ubichinon mit der
Translokation von vier Protonen über die innere Mitochondrienmembran von Eukaryoten und
die cytoplasmatische Membran von Prokaryoten. In Escherichia coli besteht der Komplex I
aus 13 Untereinheiten, die mit NuoA-N bezeichnet werden. Der Elektronentransportweg von
NADH über ein Flavinmononukleotid und eine Reihe von Eisen-Schwefel-Zentren auf
Ubichinon ist gut verstanden, der Mechanismus der Kopplung von Elektronentransfer und
Protonentranslokation
ist
jedoch
weitgehend
ungeklärt.
Eine
Beteiligung
der
membranständigen Untereinheiten NuoL, NuoM und NuoN an der Protonentranslokation
erscheint aufgrund ihrer Homologie zu Kationen/Protonen-Antiportern wahrscheinlich. Es
werden sowohl direkte, redoxgetriebene, als auch indirekte, konformationsgetriebene
Kopplungsmechanismen diskutiert, sowie eine Mischung aus beiden Mechanismen.
Das zentrale Thema dieser Arbeit ist der Mechanismus der Protonentranslokation durch den
E. coli Komplex I. Aus vorangegangenen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass die
ΔNuoL-Variante des Komplex I eine im Vergleich zum Wildtyp halb so große Stöchiometrie
von 2H+/2e- aufweist. Eine horizontale Helix, die Teil von NuoL ist und sich fast entlang des
gesamten Membranarms erstreckt, wird als Kopplungselement diskutiert, das möglicherweise
Konformationsänderungen von der Chinon-Bindestelle auf die Antiporter-Untereinheiten im
Membranarm überträgt. Die Charakterisierung von Varianten mit verkürzter horizontaler
Helix zeigte, dass bereits die Deletion der C-terminalen transmembranen Helix, mit der die
horizontale Helix in der Membran verankert ist, zu der geringen Stöchiometrie führt. Das
zeigt, dass dieser Teil der Untereinheit NuoL essentiell für ihre Funktion ist. Die Mutagenese
konservierter Aminosäuren auf der horizontalen Helix ergab, dass das in den meisten Spezies
konservierte Asp563L an der Translokation von einem Proton beteiligt ist, während die
Mutation der nur in Prokaryoten konservierten Reste Asp542L und Asp546L keinen Einfluss
auf die Stöchiometrie hatte. Um mögliche Konformationsänderungen der horizontalen Helix
zu untersuchen, wurde ein Cystein-Scanning durchgeführt. Hierzu wurden 15 Positionen auf
der Helix individuell gegen Cysteinreste ausgetauscht. Die Markierung der eingeführten
Cysteinreste mit einem Fluoreszenzfarbstoff und mit einer Spinsonde zur EPRspektroskopischen Charakterisierung zeigte, dass beim Wechsel des Redoxzustands
1
1. Zusammenfassung
geringfügige lokale Konformationsänderungen auftreten. Die Bedeutung dieser Ergebnisse für
einen möglichen Mechanismus wird diskutiert.
Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigten, dass die induzierbare Lysin Decarboxylase in der
Präparation der Komplex I-Variante ΔNuoL, aber nicht in der des Komplex I, vorhanden ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch in vivo FRET-Messungen belegt, dass die Lysin
Decarboxylase auch unter physiologischen Bedingungen mit der Deletionsvariante, aber nicht
mit dem vollständig assemblierten Komplex I, wechselwirkt. Elektronenmikroskopische
Aufnahmen lieferten erste Hinweise auf eine mögliche Bindestelle der Lysin Decarboxylase
an den Komplex, dies muss aufgrund der minderen Qualität der Aufnahmen jedoch noch
durch weitere Experimente bestätigt werden. Auch die physiologische Bedeutung der
Wechselwirkung bleibt ungeklärt.
Es wurde berichtet, dass die Produktion von NuoL den Na+-sensitiven Phänotyp einer mrpA
Deletionsmutante in Bacillus subtilis retten kann. MrpA ist Teil des membranständigen
Na+/H+-Antiporterkomplexes Mrp, der aus 6-7 verschiedenen Untereinheiten besteht. Im
Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob MrpA in der Lage ist, NuoL im Komplex I
strukturell und funktionell zu ersetzen. Die Aufreinigung sowohl der physiologisch
produzierten als auch der episomal überproduzierten Chimäre lieferte mehrere unvollständig
assemblierte Populationen des Komplexes mit fehlender oder eingeschränkter Aktivität.
MrpA konnte duch massenspektrometrische Analyse in keiner der Präparationen eindeutig
nachgewiesen werden. Es besteht die Möglichkeit, dass der chimäre Komplex für die
Extraktion aus der Membran zu instabil ist.
2
2. Einleitung
2. Einleitung
2.1 Die aerobe Elektronentransportkette in Escherichia coli
Die Energie aus katabolen Stoffwechselprozessen wird durch die oxidative Phosphorylierung
über die Synthese des universellen Energieüberträgers ATP für den Organismus nutzbar
gemacht. Die bei der Glykolyse, der Fettsäureoxidation und im Citratzyklus gewonnenen
Reduktionsäquivalente NADH und FADH2 werden oxidiert, wobei die Elektronen über eine
Reihe von Enzymkomplexen auf einen terminalen Akzeptor übertragen werden. Dieser
Vorgang wird als Atmung bezeichnet und ist mit dem Aufbau eines Protonengradienten über
die Membran gekoppelt. Die Gesamtheit der Enzymkomplexe, die die Elektronenübertragung
katalysieren, wird als Atmungskette bezeichnet. Der resultierende Protonengradient, auch
protonenmotorische Kraft (PMK) genannt, wird durch Gleichung 2-1 beschrieben (Mitchell,
1961; Mitchell & Moyle, 1967):
(2-1)
Die protonenmotorische Kraft
Protonen
entspricht dem elektrochemischen Potential der
und setzt sich zusammen aus dem Membranpotential ΔΨ und dem chemischen
Konzentrationsgradienten über die Membran, der durch die pH-Differenz ΔpH beschrieben
wird. Die weiteren Parameter in Gleichung 2-1 sind die universelle Gaskonstante R, die
Faraday-Konstante F und die Temperatur T. Die Energie des Protonengradienten wird für
endergone Prozesse wie Transportvorgänge (Booth & Morris, 1975), Flagellenbewegung
(Manson et al., 1977) und ATP-Synthese (Junge, 2004; Walker, 2013) genutzt. Die Kopplung
der ATP-Synthese an die protonenmotorische Kraft wird durch die chemiosmotische Theorie
beschrieben (Mitchell & Moyle, 1967). Die durch die Atmungskette getriebene ATP-Synthese
wird als oxidative Phosphorylierung bezeichnet. Bei Prokaryoten sind die Enzyme der
Atmungskette und die ATP-Synthase in der cytoplasmatischen Membran, bei Eukaryoten in
der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert.
Escherichia coli ist ein stäbchenförmiges, gram-negatives Enterobakterium (griech.: entero =
Darm; Escherich, 1885; Castellani & Chalmers, 1919). Es ist Teil der natürlichen Darmflora
der meisten Säugetiere und fakultativ anaerob (Gray et al., 1966). Es ist in der Lage,
Stoffwechselprodukte unter aeroben und anaeroben Bedingungen oxidativ abzubauen und
3
2. Einleitung
dabei Elektronen auf verschiedene Akzeptoren zu übertragen. In seinem natürlichen,
sauerstoffarmen Lebensraum im Intestinaltrakt ist E. coli auf anaerobe Atmung und
Fermentation angewiesen, wobei unter anderem Fumarat und Nitrat als Elektronenakzeptoren
dienen (Ingledew & Poole, 1984; Clark, 1989; Jones et al., 2011). Weiterhin ist E. coli auch
in der Lage, Elektronen über die aerobe Atmungskette auf Sauerstoff zu übertragen. Aufgrund
seiner einfachen Kultivierbarkeit, der Zugänglichkeit für molekularbiologische Methoden
sowie der Verfügbarkeit nicht-pathogener Stämme gehört E. coli zu den am besten
charakterisierten Modellorganismen. Sein aus 4.6 Millionen Basenpaaren bestehendes
Chromosom wurde vollständig sequenziert (Blattner et al., 1997). Die Untersuchung einfach
aufgebauter und leicht zugänglicher bakterieller Proteine aus E. coli und die Übertragung der
dabei gewonnenen Erkenntnisse auf die wesentlich komplexeren humanen Enzyme tragen
zum Verständnis von enzymatischen Dysfunktionen beim Menschen bei.
Die aerobe Elektronentransportkette in E. coli besteht aus zwei primären Dehydrogenasen, der
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-I) und der alternativen NADH Dehydrogenase
(NDH-II), sowie zwei terminalen Chinol-Oxidasen, der Cytochrom bo3 Oxidase und der
Cytochrom bd Oxidase. Die NDH-I besteht aus 13 Untereinheiten, deren Homologe auch in
der mitochondrialen NADH:Ubichinon Oxidoreduktase vorkommen (Friedrich & Scheide,
2000). Sie koppelt den Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit dem Aufbau eines
Protonengradienten über die cytoplasmatische Membran. Die NDH-II besteht nur aus einer
Untereinheit und besitzt Homologe in den Mitochondrien von Pflanzen und Pilzen, aber nicht
in Säugetieren (Melo et al., 2004). Sie katalysiert ebenfalls die Oxidation von NADH und die
Reduktion von Ubichinon, koppelt diese Redoxreaktion jedoch nicht mit der Translokation
von Protonen über die Membran (Matsushita et al., 1987). Die NDH-II ist das einzige Enzym
der Elektronentransportkette, das keine transmembranen Segmente aufweist, sie liegt
membranassoziiert vor (Feng et al., 2012; Heikal et al., 2014). Einen alternativen
Eintrittspunkt für Elektronen in die aerobe Elektronentransportkette stellt die Succinat
Dehydrogenase dar, welche die Atmungskette mit dem Citratzyklus verknüpft. Auch sie
katalysiert die Reduktion von Ubichinon, trägt jedoch nicht zum Aufbau eines
Protonengradienten bei (Léger et al., 2001). Die Cytochrom bd Oxidase weist im Vergleich
zur Cytochrom bo3 Oxidase eine sehr hohe Affinität zu Sauerstoff auf, pumpt jedoch nur halb
so viele Protonen pro Elektron über die Membran (Anraku & Gennis, 1987; Weiss et al.,
1991; Puustinen et al., 1991; Walker, 1992). Durch Kombination verschiedener primärer
Dehydrogenasen und terminaler Oxidasen ist E. coli in der Lage, in Abhängigkeit von den
jeweiligen Wachstumsbedingungen das optimale Gleichgewicht zwischen effizienter ATP4
2. Einleitung
Synthese und schneller Reoxidation von NADH einzustellen. Unter aeroben Bedingungen
wird der Elektronentransfer von NADH auf Sauerstoff hauptsächlich durch die alternative
Dehydrogenase NDH-II und die Cytochrom bo3 Oxidase katalysiert, unter mikro-aeroben
Bedingungen sind vor allem die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase NDH-I und die
Cytochrom bd Oxidase aktiv (Unden et al., 2002).
2.2 Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I)
Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch respiratorischer Komplex I genannt, ist der
Haupteintrittspunkt für Elektronen in die Atmungskette. Komplex I katalysiert den
Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon (Q) und koppelt diese Redoxreaktion mit der
Translokation von Protonen über die Membran. Dabei werden pro übertragenem
Elektronenpaar vier Protonen entgegen des elektrochemischen Gradienten von der negativen
Innenseite (
auf die positive Außenseite (
der Membran transportiert (Wikström,
1984; Bogachev et al., 1996; Galkin et al., 2006). Die Gesamtreaktion wird durch Gleichung
2-2 beschrieben:
(2-2)
Dysfunktionen des menschlichen Komplex I werden als Ursache von neurodegenerativen
Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Morbus Leigh und Morbus Alzheimer vermutet
(Schapira et al., 1990; Smeitink et al., 2001; Rhein et al., 2009). Außerdem ist Komplex I
eine Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (engl.: reactive oxygen species, ROS), denen eine
entscheidende Rolle bei biologischen Alterungsprozessen zugesprochen wird (Galkin &
Brandt, 2005; Lin & Beal, 2006; Grivennikova & Vinogradov, 2006; Kussmaul & Hirst,
2006).
Struktur
und
Mechanismus
des
Komplex
I
sind
somit
ein
wichtiger
Forschungsgegenstand, da ein besseres Verständnis des Enzyms helfen könnte, die
molekularen Ursachen dieser Prozesse zu verstehen und entsprechende Erkrankungen
frühzeitig zu erkennen und zu behandeln (Sharma et al., 2013).
Der eukaryotische Komplex I besteht je nach Organismus aus 44-46 Untereinheiten, von
denen sieben durch mitochondriale DNA codiert sind (Caroll et al., 2003; Caroll et al., 2006;
Balsa et al., 2012). Er besitzt eine Masse von etwa 1 MDa und enthält ein
5
2. Einleitung
Flavinmononukleotid (FMN) sowie acht Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren als Kofaktoren
(Walker et al., 1992; Hirst et al., 2003). Der bakterielle Komplex ist deutlich einfacher
aufgebaut: er setzt sich in der Regel aus 14 Untereinheiten zusammen, besitzt eine Masse von
etwa 500 kDa und enthält ein FMN und bis zu zehn Fe/S-Zentren (Friedrich et al., 1995;
Sazanov & Hinchliffe, 2006). Alle 14 Untereinheiten des bakteriellen Komplex I besitzen
Homologe im eukaryotischen Komplex (Friedrich et al., 1995; Friedrich & Scheide, 2000),
darunter die sieben mitochondrial kodierten Untereinheiten, was im Einklang mit der
Endosymbiontentheorie steht, nach der die Mitochondrien evolutionär aus Prokaryoten
hervorgegangen sind (Wallin, 1927). Diese 14 Untereinheiten bilden den sogenannten
Kernkomplex, die kleinste katalytisch aktive Einheit (Walker et al., 1992). Da der bakterielle
und der mitochondriale Komplex I außerdem über die gleichen Kofaktoren verfügen
(Friedrich, 1998; Ohnishi, 1998) und eine Sensitivität gegenüber den gleichen Hemmstoffen
aufweisen (Degli Esposti, 1998), wird der bakterielle Komplex als strukturelle Minimalform
einer energiewandelnden NADH:Ubichinon Oxidoreduktase betrachtet (Friedrich & Scheide,
2000). Er wird als strukturell einfacheres Modell für den mitochondrialen Komplex I
verwendet, da er für Mutagenese und funktionelle Untersuchungen besser zugänglich ist.
Der Komplex I wird in E. coli von dem 15 kbp großen nuo-Operon (von NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase) kodiert, welches die 13 Strukturgene nuoA-nuoN enthält (Weidner et al.,
1993). Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem einzigen Gen fusioniert, so dass
sich der Komplex I aus 13 verschiedenen Untereinheiten mit den entsprechenden
Bezeichnungen NuoA-NuoN zusammensetzt. Er besitzt eine Gesamtmasse von 535 kDa und
enthält
ein
FMN
sowie
neun
Fe/S-Zentren
als
Kofaktoren
(Friedrich,
1998).
Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass der Komplex I eine L-förmige Struktur
mit einem ins Cytoplasma ragenden Arm und einem Membranarm besitzt (Guénebaut et al.,
1998; Grigorieff, 1998; Baranova et al., 2007).
Phylogenetische Analysen haben gezeigt, dass der Komplex I evolutionär aus drei Modulen
hervorgegangen ist (Friedrich & Weiss, 1997). Es handelt sich dabei um das NADHDehydrogenase-Modul, das Hydrogenase-Modul und das Transporter-Modul (Abb. 2.1). Das
NADH-Dehydrogenase-Modul besteht aus den hydrophilen Untereinheiten NuoE, NuoF und
NuoG. Es enthält die NADH-Bindestelle, das FMN sowie sechs der neun Fe/S-Zentren: die
zweikernigen Zentren N1a und N1b und die vierkernigen Zentren N3, N4, N5 und N7. Dieses
Modul stellt den Eintrittspunkt der Elektronen in den Komplex dar und ist in vielen
NAD(P)H-abhängigen Hydrogenasen und Dehydrogenasen vorhanden (Friedrich et al.,
6
2. Einleitung
1995). Das Hydrogenasemodul setzt sich aus den hydrophilen Untereinheiten NuoB, NuoCD
und NuoI sowie den hydrophoben Untereinheiten NuoH und NuoN zusammen. Es enthält die
restlichen, vierkernigen, Fe/S-Zentren N6a, N6b und N2 sowie die Ubichinon-Bindestelle und
ist homolog zu membranständigen, energiewandelnden Ni/Fe-Hydrogenasen, die ebenfalls als
redoxgetriebene Ionenpumpen arbeiten (Friedrich & Scheide, 2000). Das Transportermodul
besteht aus den hydrophoben, membranständigen Untereinheiten NuoA, NuoJ, NuoK, NuoL
und NuoM. Die Untereinheiten NuoL, NuoM und NuoN sind homolog zu Untereinheiten von
monovalenten H+/Na+- und H+/K+-Antiportern (Friedrich & Scheide, 2000; Mathiesen &
Hägerhäll, 2002). Es wurde berichtet, dass NuoL und NuoN aus E. coli ihre jeweiligen
Homologe im Mrp Antiporter in Bacillus subtilis funktionell ersetzen können (Moparthi et al.,
2011).
A)
NADHDehydrogenaseModul
B)
FMN
N1a
N1b
N3
N4
TransporterModul
N5
HydrogenaseModul
N7
N6a
N6b
N2
Abb. 2.1: Modularer Aufbau des Komplex I und Elektronentransportweg im peripheren Arm. A) zeigt die
Struktur des Komplex I aus T. thermophilus bei einer Auflösung von 3.3 Å (PDB: 4HEA). Die Untereinheiten
sind entsprechend ihrer Zugehörigkeit zu den drei Modulen gefärbt, die Bezeichnung der Module ist in der
jeweiligen Farbe angegeben. B) zeigt die Anordnung der Kofaktoren, wie sie der Struktur des peripheren Arms
des T. thermophilus Komplex I zu entnehmen ist (PDB: 2FUG). Der wahrscheinlichste Weg der Elektronen
durch den Komplex ist durch Pfeile angedeutet (nach Sazanov & Hinchliffe, 2006).
2006 wurde die Struktur des hydrophilen Teils des Komplex I aus Thermus thermophilus bei
einer Auflösung von 3.3 Å aufgeklärt (Sazanov & Hinchliffe, 2006). Dabei zeigte sich, dass
in der Struktur eine zusätzliche Untereinheit vorhanden ist die als Nqo15 (von
NADH:quinone oxidoreductase) bezeichnet wird. Nqo15 gehört zur Familie der Frataxine,
7
2. Einleitung
denen eine Rolle bei der Assemblierung von Fe/S-Zentren zugesprochen wird. Es wurde
jedoch gezeigt, dass das orthologe Protein CyaY in E. coli keinen Einfluss auf die
Assemblierung und die Aktivität des Komplex I hat (Pohl et al., 2007a). 2010 wurde erstmals
die Struktur des gesamten Komplex I aus T. thermophilus bei einer Auflösung von 4.5 Å
veröffentlicht, außerdem wurde die Struktur des Membranarms des Komplexes aus E. coli bei
einer Auflösung von 3.9 Å aufgeklärt (Efremov et al., 2010). Bemerkenswert war hier vor
allem die horizontale Helix, die sich mit einer Länge von 110 Å fast entlang des gesamten
Membranarms zieht. Im gleichen Jahr wurde erstmals eine Struktur des mitochondrialen
Komplex I aus Yarrowia lipolytica bei einer Auflösung von 6.3 Å erhalten (Hunte et al.,
2010). Auch hier ist eine horizontale Helix im Membranarm vorhanden, jedoch mit einer
Länge von nur 60 Å. Ein Jahr später wurde die Auflösung der Struktur des Membranarms des
E. coli Komplexes auf 3.0 Å verbessert, so dass in der Struktur einzelne Aminosäurereste
identifiziert werden konnten (Efremov & Sazanov, 2011). 2013 wurde schließlich die
Kristallstruktur des gesamten Komplexes aus T. thermophilus mit einer Auflösung von 3.3 Å
aufgeklärt (Abb. 2.2; Baradaran et al., 2013). In dieser Struktur ist erstmals auch die
Ubichinon-Bindestelle aufgelöst, die sich an der Grenzfläche zwischen dem hydrophilen Arm
und dem Membranarm befindet. In der ersten Struktur des gesamten Komplexes aus
T. thermophilus waren hydrophile „loops“ in diesem Bereich nicht aufgelöst und in der
Struktur des Membranarms des E. coli Komplexes fehlt die Untereinheit NuoH, die einen Teil
der Ubichinon-Bindestelle darstellt. Im Unterschied zu der ersten Struktur ist hier außerdem
eine weitere Untereinheit enthalten die in E. coli nicht vorkommt und die mit Nqo16 betitelt
wurde. Es wird spekuliert, dass es sich bei Nqo16 um ein Chaperon bzw. einen
Assemblierungsfaktor handeln könnte (Baradaran et al., 2013).
Der Elektronentransportweg in Komplex I ist seit der Veröffentlichung der Kristallstruktur
des hydrophilen Arms recht gut verstanden. Aus der Lage und den Mittenpunktspotentialen
des FMN und der Fe/S-Zentren (Abb. 2.1) lässt sich der wahrscheinlichste Weg der
Elektronen durch den Komplex ableiten. Der Elektronentransfer wird durch die Bindung von
NADH an der Untereinheit NuoF und eine Hydridübertragung auf das FMN initiiert. Von
dem reduzierten FMNH2 wird vermutlich zunächst ein Elektron auf das Fe/S-Zentrum N3
übertragen. Eine Übertragung auf das Zentrum N1a, dessen Mittenpunktspotential bei
-330 mV liegt, ist unwahrscheinlich, da das Potential des FMNH•/FMNH2-Paares bei
-300 mV liegt. Nach dem Transfer des ersten Elektrons auf N3 kann jedoch das zweite
Elektron auf das Zentrum N1a übertragen werden, da das Redoxpotential des
FMN/FMNH•-Paares mit -390 mV hinreichend niedrig ist. So wird die Zwei8
2. Einleitung
Elektronenübertragung von NADH auf das FMN in zwei Ein-Elektronenübertragungen auf
die Fe/S-Zentren umgewandelt (Weiss & Friedrich, 1991; Sled et al., 1994; Verkhovskaya et
al., 2008). Das auf N3 übertragene Elektron wird entlang der Elektronentransportkette aus den
Fe/S-Zentren N1b, N4, N5, N6a und N6b auf das terminale Zentrum N2 weitergeleitet
(Ohnishi, 1998; Rasmussen et al., 2001). Das auf N1a übertragene Elektron wird vermutlich
nach der Reoxidation von N3 zurück auf das FMN, von dort auf N3 und dann ebenfalls über
die Transportkette auf N2 übertragen. Die zwischenzeitliche Übertragung des Elektrons auf
N1a könnte dazu dienen, das instabile Semichinonradikal schnell zu reoxidieren und so die
Entstehung von ROS zu verhindern (Kussmaul & Hirst, 2006).
Abb. 2.2: Struktur des Komplex I aus T. thermophilus bei einer Auflösung von 3.3 Å (PDB: 4HEA). Die
Untereinheiten sind individuell gefärbt, die Bezeichnung der Untereinheit in E. coli ist jeweils in der
entsprechenden Farbe angegeben. Für Untereinheiten, die im E. coli Komplex I nicht vorkommen, ist die
jeweilige Bezeichnung in T. thermophilus angegeben.
9
2. Einleitung
2.3 Kopplung von Elektronentransfer und Protonentranslokation
Im Gegensatz zum recht gut verstandenen Elektronentransportweg im peripheren Arm des
Komplex I ist der Mechanismus der Ubichinon-Reduktion und der Kopplung des
Elektronentransfers mit der Translokation von Protonen noch ungeklärt. Lange Zeit waren
keine strukturellen Daten über die Ubichinon-Bindestelle bekannt, da diese in den ersten
Kristallstrukturen des Gesamtkomplexes nicht aufgelöst war (Efremov et al., 2010; Efremov
& Sazanov, 2011). Es wird diskutiert, dass der Komplex I zwei Ubichinon-Bindestellen
enthält, da EPR-spektroskopische Signale von zwei Semichinonen im Abstand von 12 bzw.
30 Å vom terminalen Fe/S-Zentrum N2 detektiert wurden (Yano et al., 2000; Ohnishi &
Salerno, 2005; Ohnishi et al., 2010a). Im Widerspruch hierzu deuten Bindungsstudien mit
verschiedenen Inhibitoren auf eine einzige Ubichinon-Bindestelle hin (Okun et al., 1999;
Fendel et al., 2008). Außerdem wurde der Chinongehalt in Präparationen des prokaryotischen
und des eukaryotischen Komplex I zu 0.2-1.0 Chinonmolekülen pro Komplex bestimmt
(Dröse et al., 2002; Euro et al., 2008; Verkhovskaya et al., 2008). Anhand der Struktur des
hydrophilen Arms wurde ein hydrophober Kanal zwischen den Untereinheiten Nqo4 (NuoD)
und Nqo6 (NuoB) identifiziert, der am terminalen Fe/S-Zentrum N2 endet und der als
vermutliche Ubichinon-Bindestelle angenommen wurde (Sazanov & Hinchliffe, 2006). Durch
EPR-spektroskopische Abstandsmessungen zwischen dem spinsondenmarkierten Komplex I
und einem gleichermaßen markierten Ubichinon wurde der Abstand zwischen der
hydrophoben Alkylkette des Chinons und dem Zentrum N2 zu 15 Å bestimmt, was im
Einklang mit der Position der vermuteten Ubichinon-Bindestelle stand (Pohl et al., 2010). In
der 2013 veröffentlichten Struktur des gesamten Komplex I aus T. thermophilus war
schließlich erstmals die Ubichinon-Bindestelle mit kokristallisiertem Decyl-Ubichinon bzw.
dem Inhibitor Piericidin A aufgelöst (Baradaran et al., 2013). Die Struktur zeigt eine 30 Å
lange, schmale, im Inneren des Komplexes eingeschlossene Bindetasche mit einem engen
Spalt von etwa 2-3 × 4-5 Å als Eintrittsöffnung für das Ubichinon. Das Innere der Tasche ist
in der Nähe von N2 positiv und auf der dem Membranarm zugewandten Seite negativ
geladen, die gegenüberliegende Seite in Richtung der Öffnung ist neutral und kann die
Alkylkette des Chinons aufnehmen. Diese Kette verschließt die Öffnung und bildet so einen
geschlossenen Reaktionsraum, wobei je nach Länge der Kette eine bis drei Isopren-Einheiten
nach außen in die Lipidschicht ragen. Somit unterscheidet sich die Ubichinon-Bindestelle des
Komplex I von denen anderer Proteine wie der Cytochrome bc1 und b6f, wo lediglich die
Kopfgruppe und ein bis zwei Isopren-Einheiten mit dem Protein interagieren (Zhang et al.,
1998; Kurisu et al., 2003). Die ungewöhnlich enge Öffnung der Ubichinon-Bindetasche legt
10
2. Einleitung
den Schluss nahe, dass konformative Änderungen notwendig sind, um den Ein- und Austritt
der Ubichinon-Kopfgruppe zu ermöglichen (Baradaran et al., 2013). Die Kopfgruppe des
gebundenen Ubichinons befindet sich in einem Abstand von 12 Å zu N2 was eine geeignete
Distanz für einen effizienten Elektronentransfer ist (Page et al., 1999). Eine der Ketogruppen
ist über eine Wasserstoffbrücke an einen konservierten Tyrosinrest der Untereinheit Nqo4
(NuoD) gebunden, die andere an einen ebenfalls konservierten Histidinrest. Beide Reste
erwiesen sich in Mutagenesestudien als essentiell für die katalytische Aktivität (Kashani-Poor
et al., 2001; Angerer et al., 2012). Hinweise auf eine mögliche zweite Ubichinon-Bindestelle
wurden in der Struktur nicht gefunden (Baradaran et al., 2013).
Der genaue Mechanismus der Protonentranslokation durch den Komplex I ist noch
weitgehend ungeklärt. Aufgrund ihrer Homologie zu Na+/H+- und K+/H+-Antiportern ist es
naheliegend, dass die Untereinheiten NuoL, NuoM und NuoN am Protonentransport beteiligt
sind (Friedrich, 2001; Mathiesen & Hägerhäll, 2002). Als Weg der Energieübertragung von
der Ubichinon-Bindestelle auf die Antiporter-Untereinheiten erscheinen konformative
Änderungen wahrscheinlich, da keine Redoxzentren im Membranarm vorhanden sind.
Konformationsänderungen des Komplex I beim Wechsel des Redoxzustands wurden durch
verschiedene, unabhängige Untersuchungen belegt (Belogrudov & Hatefi, 1994; Friedrich,
2001; Brandt et al., 2003; Mamedova et al., 2004; Berrisford & Sazanov, 2009). Alternativ
zur
konformationsgetriebenen
Protonentranslokation
wurde
ein
redoxgetriebener
Mechanismus vorgeschlagen (Brandt, 1997) sowie eine Kombination aus beiden
Kopplungsarten (Friedrich, 2001; Ohnishi & Salerno, 2005; Berrisford & Sazanov, 2009).
Die 2010 von Efremov et al. veröffentlichte Kristallstruktur des Membranarms zeigte
erstmals, dass der Komplex I über ein einzigartiges strukturelles Merkmal verfügt: Eine
110 Å lange, horizontale Helix die sich, ausgehend von NuoL am distalen Ende des
Membranarms, fast entlang des gesamten Membranarms zieht und mit einer transmembranen
(TM) Helix an der Grenzfläche der Untereinheiten NuoN, NuoJ und NuoK endet (Abb. 2.2
und 2.3). Hierbei handelt es sich um eine C-terminale Verlängerung der Untereinheit NuoL,
die in den homologen Untereinheiten NuoM und NuoN nicht vorkommt. Gemeinsam ist den
drei Antiporter-Untereinheiten ihr Aufbau aus 14 konservierten TM-Helices, die zu einem
Kern aus vier Helices angeordnet sind, der von einem Ring aus zehn weiteren Helices
umgeben ist. Jede der drei Untereinheiten enthält zwei diskontinuierliche TM-Helices, die
durch einen „loop“ in der Mitte der Membran unterbrochen sind (Abb. 2.3).
11
2. Einleitung
A)
B)
C)
βH
βH
βH
Abb. 2.3: Mögliche Kopplungselemente im Membranarm des Komplex I und vorgeschlagener
Mechanismus der Protonentranslokation. A) zeigt die Struktur des Membranarms von oben und B) zeigt die
Ansicht von der Seite (PDB: 4HEA). Die Bezeichnung der Untereinheiten ist in A) jeweils in der entsprechenden
Farbe angegeben. Die diskontinuierlichen Helices in NuoL, M und N sind türkis hervorgehoben, die
Aminosäurereste die die hydrophile Achse in der Mitte des Membranarms bilden sind rot dargestellt. C) zeigt
eine schematische Seitenansicht des gesamten Komplexes mit dem vorgeschlagenen Mechanismus (Baradaran et
al., 2013). Der Weg der Elektronen von NADH über die Kofaktoren zum Ubichinon in der Bindetasche ist
angedeutet. Außerdem sind die hydrophile Achse in der Mitte der Membran sowie der postulierte
Protonentransport über Halbkanäle unter Einbeziehung dieser Achse dargestellt. Die horizontale Helix (HL) und
das βH-Element sind eingezeichnet, eine mögliche Bewegung dieser Elemente ist durch Pfeile angedeutet.
12
2. Einleitung
Anhand der Struktur wurde vorgeschlagen, dass die lange horizontale Helix (HL) dazu dient,
Konformationsänderungen von der Ubichinon-Bindestelle auf die Antiporter-Untereinheiten
im Membranarm zu übertragen (Efremov et al., 2010). Die Helix wurde daher auch mit einem
Kolben verglichen, der eine Dampfmaschine antreibt. Nach dem vorgeschlagenen
Mechanismus wird durch die Bewegung von HL in jeder der drei Antiporter-Untereinheiten
ein Protonenkanal geöffnet, durch den je ein Proton transloziert wird. Ein viertes Proton wird
demnach an der Kontaktstelle der beiden Arme des Komplexes über einen damals nicht näher
benannten Mechanismus transloziert (Efremov et al., 2010). Seit der Veröffentlichung dieser
ersten Kristallstruktur des Membranarms wird die Rolle der ungewöhnlichen Helix HL
kontrovers diskutiert. Ebenso herrscht Uneinigkeit darüber, ob und in welchem Umfang die
verschiedenen vorgeschlagenen Kopplungsarten zu der H+/e--Stöchiometrie des Komplex I
beitragen. Obwohl in jüngerer Zeit aufgrund thermodynamischer Betrachtungen eine
Stöchiometrie von 3 gepumpten Protonen pro oxidiertem NADH postuliert wurde (Wikström
& Hummer, 2012), ist die Stöchiometrie von 4 H+/2 e- weitgehend anerkannt (Wikström,
1984; Bogachev et al., 1996; Galkin et al., 2006). Im Gegensatz zum Vorschlag von Efremov
et al. (2010) wurde von Ohnishi et al. (2010b) ein Mechanismus vorgeschlagen, nach dem
zwei Protonen durch die Redoxchemie des Chinons und unter Beteiligung der Untereinheiten
NuoH, NuoA, NuoJ und NuoK über die Membran transportiert werden. Die verbleibenden
zwei Protonen werden durch die Antiporter-Untereinheiten NuoL und NuoM, jedoch nicht
durch NuoN transloziert. Gegen eine Beteiligung von NuoN am Protonentransport spricht,
dass die Mutation konservierter geladener Reste in dieser Untereinheit keinen Einfluss auf die
Protonentranslokation hatte (Amarneh & Vik, 2003) und dass die drei N-terminalen TMHelices von NuoN in höheren Metazoen fehlen (Birrell & Hirst, 2010).
Die 2011 veröffentlichte Struktur des Membranarms des Komplex I aus E. coli zeigt, dass
innerhalb der Antiporter-Untereinheiten zweimal fünf TM Helices rotationssymmetrisch
angeordnet sind (Efremov & Sazanov, 2011). Die fünf Helices bilden je einen Halbkanal, die
beiden Halbkanäle sind in der Mitte über konservierte Glutamat- und Lysinreste verbunden
wobei der Lysinrest jeweils Teil des hydrophilen „loops“ in einer der diskontinuierlichen TMHelices ist. Außerdem zeigt die Struktur neben der horizontalen Helix HL auf der
cytoplasmatischen Seite der Membran noch ein weiteres Element auf der periplasmatischen
Seite, das die Antiporter-Untereinheiten verbindet: Das sogenannte βH-Element, eine
Kombination aus drei β-Haarnadeln die Teil der Antiporter-Untereinheiten sind (Abb. 2.3).
Die 2013 veröffentlichte Struktur des gesamten Komplex I aus T. thermophilus zeigt
schließlich einen vierten Protonenkanal, der von den Untereinheiten NuoH, NuoJ und NuoK
13
2. Einleitung
gebildet wird (Baradaran et al., 2013). Auch dieser Kanal besteht, ähnlich wie bei den
Antiporter-Untereinheiten, aus zwei Halbkanälen, die durch geladene Reste verbunden sind.
Hierbei wird ein Halbkanal von NuoH und der zweite von den wesentlich kleineren
Untereinheiten NuoJ und NuoK gemeinsam ausgebildet. Die Struktur zeigt eine hydrophile
Achse, die sich, ausgehend von der Ubichinon-Bindestelle, in der Mitte der Membran bis zum
distalen Ende des Membranarms erstreckt (Abb. 2.3). Diese hydrophile Achse besteht aus
geladenen und polaren Aminosäureresten innerhalb der Halbkanäle oder an deren
Verbindungsstellen, die von Wassermolekülen umgeben sind. Basierend auf diesen
strukturellen Daten erscheint folgender Mechanismus plausibel: Durch die Reduktion des
Chinons
werden
Konformationsänderungen
induziert
und
durch
elektrostatische
Wechselwirkungen über die hydrophile Achse an den Protonenkanal übertragen, der durch die
Untereinheiten NuoH, NuoJ und NuoK gebildet wird. Von dort aus werden die
Konformationsänderungen, ebenfalls durch elektrostatische Wechselwirkungen, entlang der
hydrophilen Achse in der Mitte der Membran auf die Antiporter-Untereinheiten
weitergeleitet. Dies führt jeweils zum Öffnen bzw. Schließen der Halbkanäle auf der
cytoplasmatischen
bzw.
periplasmatischen
Seite
der
Membran
und
somit
zur
Protonentranslokation. Die Helix HL und das βH-Element unterstützen möglicherweise die
Konformationsänderungen im Membranarm (Baradaran et al., 2013).
Erste Mutagenesestudien an der Untereinheit NuoL ergaben, dass diese an der Translokation
von einem oder zwei Protonen beteiligt ist (Nakamaru-Ogiso et al., 2010). Die
Charakterisierung der ΔNuoL Variante des Komplex I in unserem Arbeitskreis zeigte, dass
NuoL für die Translokation von zwei der vier Protonen essentiell ist (Steimle, 2009).
Basierend auf der Mutagenese der Helix HL wurde, in Widerspruch zu dem von Efremov et
al. (2010) vorgeschlagenen Mechanismus, postuliert, dass diese keine mechanistische Rolle
spielt, sondern vielmehr als eine Art Klammer dient, welche die Antiporter-Untereinheiten
zusammen hält (Belevich et al., 2011). Weitere Mutagenesestudien und experimentelle Daten
zur Rolle der Untereinheit NuoL und der horizontalen Helix HL bei der Protonentranslokation
durch den Komplex I sind bislang nicht bekannt.
14
2. Einleitung
2.4 Der Mrp Komplex
Die Antiporter-Untereinheiten des Komplex I sind Homologe einer bestimmten Klasse von
Antiportern, die erstmals in dem alkalophilen Bakterium Bacillus halodurans entdeckt
wurden (Hamamoto et al., 1994). Diese Art von Antiportern, die seitdem in vielen
alkalophilen und mesophilen Bakterien gefunden wurden (Hiramatsu et al., 1998; Putnoky et
al., 1998), sind in einem Operon aus den 6-7 Strukturgenen mrpA-G (für multiple resistance
and pH locus) organisiert. Die Gene mrpA und mrpB können als zwei separate Gene oder zu
einem längeren mrpA fusioniert vorliegen (Swartz et al., 2005). Die Mrp Antiporter, bei
denen es sich um monovalente Kationen/Protonen Antiporter handelt, bilden eine eigene
Familie, CPA-3 (für cation proton antiporter-3), und besitzen auch eine eigene TransporterKlassifizierung (TC.2.A.63; Busch & Saier, 2002). Sie regulieren die Na+-Konzentration in
der Zelle und die pH Homöostase (Ito et al., 1999; Kosono et al., 1999; Ito et al., 2000). Der
Mrp Komplex ist ein sekundärer Antiporter, der durch das Membranpotential angetrieben
wird (Kitada et al., 2000; Swartz et al., 2005; Swartz et al., 2007). Eine Kristallstruktur des
Mrp Komplexes ist bislang nicht bekannt, die Bildung eines hetero-oligomeren Komplexes
wurde jedoch anhand der Aufreinigung des Gesamtkomplexes über Affinitätspeptide sowie
native Gelelektrophorese nachgewiesen (Kajiyama et al., 2007). Aufgrund der Tatsache, dass
alle 6-7 Mrp Proteine für die Antiporter-Aktivität benötigt werden, wird vermutet, dass die
Komplexbildung aus allen Untereinheiten für die katalytische Aktivität notwendig ist (Ito et
al., 2000).
Die Antiporter-Untereinheiten des Komplex I, NuoL, NuoM und NuoN, sind homolog
zueinander sowie zu den Untereinheiten MrpA und MrpD des Mrp Komplexes (Hamamoto et
al., 1994). Außerdem ist NuoK vermutlich homolog zu der Untereinheit MrpC. Dies lässt
darauf schließen, dass im Laufe der evolutionären Entwicklung des Komplex I nicht ein
einzelnes Mrp Protein sondern ein komplettes Modul, bestehend aus MrpABCD, als
ursprüngliches Transporter-Moldul akquiriert wurde (Mathiesen & Hägerhäll, 2003). Ein
entsprechender Subkomplex MrpABCD wurde nachgewiesen (Morino et al., 2008).
Eingehendere Sequenzanalysen haben gezeigt, dass MrpA der Untereinheit NuoL ähnlicher
ist als den anderen Antiporter-Untereinheiten, während MrpD größere Ähnlichkeit mit NuoM
und NuoN aufweist (Mathiesen & Hägerhäll, 2002). Mutagenesestudien ergaben, dass die
NaCl-sensitive Bacillus subtilis Deletionsmutante ΔmrpA durch in trans Komplementation
mit dem nuoL Gen aus E. coli wieder wachsen kann (Moparthi et al., 2011). Ebenso kann die
ΔmrpD Mutante durch Komplementation mit dem nuoN Gen gerettet werden. Die
15
2. Einleitung
Komplementation mit dem jeweils anderen nuo Gen hat jedoch keinen Einfluss auf das
Wachstum der Deletionsmutanten, gleiches gilt für die Komplementation mit nuoM. Die
Autoren schlossen daraus, dass die Antiporter-Untereinheiten nicht nur strukturell homolog
sind, sondern dass sich NuoL und MrpA bzw. NuoN und MrpD jeweils auch funktionell
ersetzen. Des weiteren wurde postuliert, dass jede der Untereinheiten eine spezielle Funktion
besitzt, weshalb sie sich trotz ihrer Homologie nicht in beliebiger Kombination ersetzen
können. Nach dieser unbewiesenen Theorie würde MrpA Na+ transportieren, während MrpD
H+ transportiert. Komplex I würde demnach mit NuoL eine Na+- und mit NuoM und NuoN
zwei H+-Antiporter-Untereinheiten enthalten (Moparthi et al., 2011).
2.5 Die induzierbare Lysin Decarboxylase
In vorangegangenen Arbeiten unserer Gruppe wurde eine Wechselwirkung der Komplex I
Variante ΔNuoL mit der induzierbaren Lysin Decarboxylase (LdcI) beobachtet (Steimle,
2009). Hierbei handelt es sich um ein 81 kDa Protein, das die Decarboxylierung von Lysin zu
Cadaverin unter Verbrauch eines Protons katalysiert und so bei Bedarf der Übersäuerung der
Zelle entgegenwirkt (Sabo et al., 1974). Die LdcI ist zusammen mit dem Lysin/CadaverinAntiporter
CadB
im
cadBA-Operon
codiert,
das
unter
der
Kontrolle
des
Transkriptionsregulators CadC steht (Watson et al., 1992). CadB transportiert Cadaverin im
Austausch gegen Lysin aus der Zelle (Tomitori et al., 2011). Die Expression des cadBAOperons wird unter sauren Bedingungen sowie bei einem Überschuss an intrazellularem
Lysin induziert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie die Kristallstruktur zeigen, dass
die induzierbare Lysin Decarboxylase als Decamer vorliegt, das sich aus fünf cyclisch
angeordneten Dimeren zusammensetzt (Abb. 2.5.; Kanjee et al., 2011).
Untersuchungen zur Funktion von Chaperonen in E. coli ergaben, dass LdcI einen stabilen
Komplex mit RavA bildet (Snider et al., 2006). Dieser Komplex besitzt eine käfigartige
Struktur aus fünf LdcI-Dimeren und fünf RavA-Hexameren (Abb. 2.6; El Bakkouri et al.,
2010). RavA (engl. regulatory ATPase variant A) ist ein 55 kDa Protein das der Familie der
MoxR AAA+-ATPasen angehört (Neuwald et al., 1999, Frickey & Lupas, 2004). Diese p-loop
NTPasen nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse, um Faltungsvorgänge an Proteinen,
DNA und RNA zu katalysieren (Neuwald et al., 1999; Iyer et al., 2004). Ihnen wird daher
eine mögliche Funktion als Chaperone zur Assemblierung von Enzymkomplexen
zugeschrieben (Snider & Houry, 2006). Es wurde gezeigt, dass die Aktivität von RavA durch
16
2. Einleitung
93 Å
183 Å
A)
25 Å
9Å
90°
B)
90°
Abb 2.5: Struktur des LdcI-Decamers (Kanjee et al., 2011). Links ist jeweils die Seitenansicht und rechts die
Aufsicht dargestellt. A) zeigt die Röntgenstruktur mit einer Auflösung von 2.0 Å. Die beiden Monomere, die
zusammen ein Dimer bilden, sind jeweils gleich gefärbt mit Ausnahme des Dimers oben in der Mitte. In diesem
Dimer sind verschiedene Domänen eines Monomers unterschiedlich gefärbt, das zweite Monomer ist grau
dargestellt. Die Dimension der Poren in dem Komplex ist angegeben, ebenso wie die Abmessungen des
gesamten Komplexes. Der grau unterlegte Bereich stellt den Van-der-Waals-Radius dar. B) zeigt das
elektronenmikroskopische Modell des Decamers mit einer Auflösung von 20 Å.
17
2. Einleitung
A)
B)
90°
Abb. 2.6: Struktur des Komplexes aus fünf LdcI-Dimeren und fünf RavA-Hexameren (El Bakkouri et al.,
2010). Gezeigt ist die elektronenmikroskopische Aufnahme des Komplexes in hellgrau, in die jeweils die
Kristallstruktur des RavA-Hexamers mit einer Auflösung von 2.9 Å bzw. des LdcI-Decamers mit einer
Auflösung von 2.0 Å eingepasst wurde. A) zeigt die Seitenansicht mit zwei eingepassten RavA-Hexameren, die
grau bzw. violett gefärbt sind. B) zeigt die Aufsicht mit einem eingepassten RavA-Hexamer in schwarz sowie
dem LdcI-Decamer, in dem die Monomere eines Dimers rot bzw. grün gefärbt sind, die weiteren Dimere sind
grau dargestellt. Die blauen Kugeln stellen das an LdcI gebundene Alarmon ppGpp dar.
die Wechselwirkung mit LdcI erhöht wird, was auf eine funktionelle Bedeutung des
Komplexes hindeutet. Aufgrund dessen wurde vorgeschlagen, dass die Komplexbildung zu
Konformationsänderungen in der ATPase führt, durch die neue Substrate für die Faltung oder
Assemblierung von Proteinen zugänglich werden (Snider et al., 2006).
Die Art und Weise der Wechselwirkung von LdcI mit der Komplex I Variante ΔNuoL sowie
deren Bedeutung ist unbekannt. Aufgrund der bekannten Wechselwirkung von LdcI mit RavA
und der Funktion von RavA als Chaperon könnte jedoch ein Zusammenhang mit der
Assemblierung des Komplex I bestehen.
2.6
Elektronenspinresonanz-Spektroskopie
und
ortsgerichtete
Spinsondenmarkierung
Die Elektronenspinresonanz (engl. electron paramagnetic resonance, EPR) -Spektroskopie
wird eingesetzt, um ungepaarte Elektronen nachzuweisen und zu untersuchen. Dabei macht
man sich den Energieunterschied zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand
18
2. Einleitung
zunutze, den ein Elektron in einem äußeren Magnetfeld einnehmen kann. Dies beruht auf dem
magnetischen Moment, das mit dem Eigendrehimpuls des Elektrons verbunden ist. Ein
Elektron mit der Spinquantenzahl s = ½ kann zwei verschiedene Orientierungen in einem
Magnetfeld der Stärke Bo einnehmen, die durch die magnetische Quantenzahl ms = ±½
beschrieben werden (Uhlenbeck & Goudsmit, 1926). Die unterschiedliche Wechselwirkung
des magnetischen Dipolmoments des Elektrons mit dem Magnetfeld je nach Orientierung
führt zu einer Aufspaltung des Energieniveaus in einen Grundzustand und einen angeregten
Zustand, die durch den Zeeman-Effekt (Zeeman, 1897) beschrieben wird:
E
E+½ - E-½ = g · µB · Bo
Demnach ist die Energiedifferenz
(2-3)
E zwischen den Zuständen proportional zu der
magnetischen Feldstärke Bo, wobei µB das Bohrsche Magneton und g den Landé-Faktor
bezeichnet.
Bei der EPR-Spektroskopie wird Mikrowellenstrahlung mit einer konstanten Frequenz ν
eingestrahlt und die Feldstärke Bo variiert, bis die Resonanzbedingung
g · µB · Bo = h · ν
(2-4)
erfüllt ist. Dabei bezeichnet h das Planck’sche Wirkungsquantum. Da die Spinpaarung zweier
Elektronen einen Gesamtspin von 0 ergibt, sind für die EPR-Spektroskopie prinzipiell nur
Systeme mit ungepaarten Elektronen zugänglich. In der Proteinbiochemie sind dies
insbesondere Übergangsmetallzentren wie z.B. Fe/S-Zentren in Proteinen (Beinert, 1982).
Eine weitere Anwendung der EPR-Spektroskopie zur Charakterisierung von Proteinen ist die
ortsgerichtete Spinsondenmarkierung. Hierzu wird durch ortsgerichtete Mutagenese an der zu
untersuchenden Position ein Cysteinrest eingeführt, der anschließend mit einer Spinsonde
selektiv markiert wird. Als Spinsonde werden in der Regel sterisch gehinderte NitroxidRadikale wie (1-oxyl-2,2,5,5,-tetramethylpyrrolin-3-methyl)-methanthiosulfonat (MTSL)
eingesetzt, die aufgrund der Abschirmung des Radikals durch die Substituenten bei
19
2. Einleitung
Raumtemperatur hinreichend stabil sind (Berliner et al., 1982). MTSL bindet über seine
Methylthiosulfonat-Funktion als Disulfid an das Cystein (Abb. 2.4). Die Größe der Spinsonde
entspricht in etwa der einer Tryptophan-Seitenkette, so dass Stabilität, Faltung und Aktivität
des Proteins nicht beeinträchtigt werden (Mchaourab et al., 1996; Czogalla et al., 2007). Die
Anwendung der ortsgerichteten Spinsondenmarkierung zur Untersuchung von Proteinstruktur
und -dynamik basiert auf der Abhängigkeit des EPR-Signals von der Mobilität der Spinsonde
(Hubbell et al., 1996). Je freier die Beweglichkeit desto schärfer ist die Resonanzlinie, da die
ungehinderte Bewegung der Spinsonde zu einer gemittelten Orientierung der magnetischen
Momente relativ zum äußeren Magnetfeld führt (Czogalla et al., 2007). Ist die Bewegung
gehindert, so resultiert daraus eine Signalverbreiterung (Abb. 2.4).
A)
B)
C)
Abb. 2.4: Spinsondenmarkierung von Proteinen mit MTSL. A) zeigt die Reaktion von MTSL mit der
Thiolgruppe in der Cystein-Seitenkette. Aufgrund der Wechselwirkung zwischen dem Sδ und dem H-Atom am
Cα ist die Rotation der Spinsonde auf die dihedralen Winkel χ4 und χ5 beschränkt. B) zeigt das EPR-Spektrum
von freiem MTSL, C) ein typisches Spektrum von proteingebundenem MTSL (aus Pohl et al., 2010).
Die Linienbreite des EPR-Signals ist somit ein Maß für die Beweglichkeit der Spinsonde an
der jeweiligen Position im Protein. Dabei tragen zur Mobilität der Spinsonde die Rotation des
Proteins in Lösung, die Bewegung des Proteinrückgrats und die interne Rotation der
Spinsonde bei. Die relativ langsame Rotation des Proteins in Lösung ist hierbei zu
20
2. Einleitung
vernachlässigen und die interne Rotation der Spinsonde ist aufgrund der Wechselwirkung
zwischen dem Sδ und dem H-Atom am Cα auf die dihedralen Winkel χ4 und χ5 beschränkt
(Abb. 2.4; Mchaourab et al., 1996). Somit spiegelt das EPR-Signal die interne Beweglichkeit
der Seitenkette und die Dynamik des Proteinrückgrats an der markierten Position wieder
(Columbus & Hubbell, 2002).
2.7 In vivo FRET-Messungen
Die Messung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) ist eine geeignete Methode
zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo (Pollok & Heim, 1999). Es
handelt sich um eine nicht-invasive Methode mit Hilfe derer Proteine unter physiologischen
Bedingungen in lebenden Zellen untersucht werden können. Sie beruht auf der Markierung
der zu untersuchenden Proteine mit zwei verschiedenen Fluorophoren. FRET ist ein
strahlungsfreier Energietransfer von einem angeregten Donor-Fluorophor auf ein AkzeptorFluorophor über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen (Förster, 1948). Die Effizienz des
Energietransfers EFRET ist gemäß Gleichung 2-5 umgekehrt proportional zur sechsten Potenz
des Abstandes r:
(2-5)
Dabei steht die Konstante R0, der sogenannte Förster-Radius, für den Abstand der beiden
Fluorophore, in dem die Effizienz des Energietransfers 50% beträgt. Der Förster-Radius hängt
ab von dem Winkel zwischen Donor und Akzeptor, der Quantenausbeute des Donors, dem
Extinktionskoeffizienten des Akzeptors und dem Überlappungsintegral zwischen dem
Emissionsspektrum des Donors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors (Förster, 1948).
Er kann für ein gegebenes Donor-Akzeptor-Paar berechnet werden. Aufgrund der
Eigenschaften einzelner Fluorophore gibt es Paare, die für FRET-Messungen besonders
geeignet sind (Piston & Kremers, 2007; Ciruela, 2008). In der vorliegenden Arbeit wurde ein
bewährtes FRET-Paar mit mCerulean als Donor und dem so genannten gelb fluoreszierenden
Protein (YFP) als Akzeptor verwendet (Miyawaki & Tsien, 2000; Kentner & Sourjik, 2009).
Der Förster-Radius liegt in der Regel bei 10-50 Å und somit in der Größenordnung der
21
2. Einleitung
Dimensionen eines typischen Proteins (Patterson et al., 2000). Aufgrund der starken
Abstandsabhängigkeit ist FRET spezifisch für Proteine, die in einem Komplex interagieren
(Ciruela, 2008; Kentner & Sourjik, 2009). Falsch positive Signale sind dabei
unwahrscheinlich; es ist jedoch zu beachten, dass falsch negative Ergebnisse möglich sind,
wenn größere Proteinkomplexe untersucht werden und der Abstand der Fluorophore innerhalb
des Komplexes für einen effizienten Energietransfer bereits zu groß ist (Wouters & Bastiaens,
2001).
Eine Möglichkeit, die FRET-Effizienz experimentell zu bestimmen, besteht darin, das DonorFluorophor anzuregen und dessen Fluoreszenzemission vor und nach dem Ausbleichen des
Akzeptor-Fluorophors zu messen (Sourjik et al., 2007; Kentner & Sourjik, 2009). Im Falle
einer Wechselwirkung zwischen den mit Donor- und Akzeptor-Fluorophor markierten
Proteinen wird ein Teil der Anregungsenergie durch FRET auf den Akzeptor übertragen.
Deswegen ist die Fluoreszenzemission des Donors geringer als in einem System ohne FRETWechselwirkung. Wird der Akzeptor durch einen Laserpuls ausgebleicht, so ist kein FRET
A)
C)
B)
b)
Protein 1
D
D
D
A
A
Protein
2
Protein 1 Protein
2
X
X
A
Protein 1 Protein
2
Fluoreszenzemission (AU)
mehr möglich, was zu einer verstärkten Fluoreszenzemission des Donors führt (Abb. 2.7).
22
D)
Emnach
21
Emvor
20
ΔEm
19
0
200
Zeit [s]
400
Abb. 2.7: Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen fluoreszenzmarkierten Proteinen. A)
Protein 1 ist mit einem Donor-Fluorophor (D) und Protein 2 ist mit einem Akzeptor-Fluorophor (A) fusioniert.
Das Anregungslicht und die Fluoreszenzemission des Donors sind durch dunkel- bzw. hellblaue Blitze
dargestellt. B) Bilden die Proteine einen Komplex, so ist über die geringe Distanz ein Energietransfer, dargestellt
durch den blauen Pfeil, möglich. Dadurch wird der Akzeptor zur Fluoreszenzemission angeregt, die Intensität
der Fluoreszenzemission des Donors ist verringert. C) Wird das Akzeptor-Fluorophor ausgebleicht, so ist kein
FRET mehr möglich, die Fluoreszenzemission des Donors nimmt im Vergleich zu B) zu. D) Messung der
Fluoreszenzemission des Donors vor (Emvor) und nach (Emnach) dem Ausbleichen des Akzeptors (Kentner &
Sourjik, 2009). Aus der Differenz ΔEm lässt sich die FRET-Effizienz berechnen.
22
2. Einleitung
Aus der Differenz ΔEm der Fluoreszenzemission des Donors vor (Emvor) und nach (Emnach)
dem Ausbleichen des Akzeptors lässt sich nach Gleichung 2-6 die FRET-Effizienz berechnen,
wobei die relative Effizienz auf die Fluoreszenzintensität nach dem Laserpuls normiert wird:
(26)
Ab einer FRET-Effizienz von 0.5% ist die Wechselwirkung zwischen den beiden
Fluorophoren und somit zwischen den untersuchten Proteinen als spezifisch anzusehen
(Kentner & Sourjik, 2009).
2.8 Thema der Arbeit
Der Mechanismus der Kopplung von Elektronentransfer und Protonentranslokation im
Komplex I ist noch weitgehend unverstanden und wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
Die bislang vorgeschlagenen Mechanismen basieren überwiegend auf strukturellen Daten,
funktionelle Untersuchungen dazu sind wenig vorhanden. In der vorliegenden Arbeit sollte
der Protonentranslokationsmechanismus des Komplex I eingehend untersucht werden. Der
Fokus lag dabei auf der Untereinheit NuoL, der aufgrund der ungewöhnlichen horizontalen
Helix vermutlich eine besondere funktionelle Bedeutung zukommt und die deshalb im
Zentrum der Diskussionen über mögliche Mechanismen steht.
Durch die Charakterisierung von Komplex I-Varianten, denen Teile der horizontalen Helix
fehlen, sollte die Bedeutung dieses ungewöhnlichen Strukturelements für den Mechanismus
des Komplex I untersucht werden. Konservierte Aminosäuren auf der horizontalen Helix
sollten mutiert werden, um die Bedeutung einzelner Reste für die Protonentranslokation zu
untersuchen. Durch
Cystein-Scanning sollten Erkenntnisse über die konformative
Beweglichkeit der horizontalen Helix gewonnen werden. Die Komplex I-Varianten sollten
überproduziert,
aufgereinigt
Elektronentransfer-
und
und
charakterisiert
werden.
Protonentranslokationsaktivität
nach
Durch
der
Messung
Rekonstitution
der
in
Proteoliposomen sollte die H+/e--Stöchiometrie der Varianten bestimmt werden. Die CysteinVarianten sollten im oxidierten sowie im reduzierten Zustand mit einem Fluoreszenzfarbstoff
23
2. Einleitung
markiert werden. Außerdem sollten die mutierten Positionen mit einer Spinsonde versehen
und deren Mobilität in beiden Redoxzuständen durch EPR-spektroskopische Messungen
untersucht werden. Eine unterschiedliche Zugänglichkeit bzw. Beweglichkeit würde auf eine
Konformationsänderung beim Wechsel des Redoxzustands hindeuten. Das Ausmaß der
Unterschiede würde darüber hinaus Hinweise auf dem Umfang der konformativen
Beweglichkeit liefern.
Die erst kürzlich aufgeklärte Struktur der Ubichinon-Bindestelle zeigt eine Wechselwirkung
konservierter Aminosäurereste mit der Ubichinon-Kopfgruppe über Wasserstoffbrücken. Die
Bedeutung dieser Wechselwirkung sollte durch Mutation der entsprechenden Positionen und
Messung der NADH Oxidase-Aktivität experimentell überprüft werden.
Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die induzierbare Lysin Decarboxylase in der
Präparation der Komplex I-Variante ΔNuoL vorhanden ist. In der Literatur wird berichtet,
dass die LdcI einen Komplex mit einer AAA+-ATPase bildet, der eine Funktion als Chaperon
bei der Assemblierung von Proteinkomplexen zugeschrieben wird. Somit könnte die LdcI
eine Rolle bei der Assemblierung des Komplex I spielen, über die bislang noch wenig bekannt
ist. Durch in vivo FRET-Messungen sollte überprüft werden, ob die Komplex I-Variante
ΔNuoL mit der LdcI unter physiologischen Bedingungen wechselwirkt. Hierzu sollte ein
FRET-fähiger E. coli Stamm mit entsprechend markierten Proteinen dargestellt werden.
Mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen sollte darüber hinaus die Bindestelle der LdcI
an den Komplex lokalisiert werden.
Es
wurde
berichtet,
dass
NuoL
die
homologe
Untereinheit
MrpA
des
Mrp-
Antiporterkomplexes in B. subtilis funktionell ersetzen kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollte
untersucht werden, ob dies auch umgekehrt möglich ist und ob eine vollständig assemblierte
Chimäre aufgereinigt werden kann. Dies wäre ein experimenteller Beweis für die evolutionäre
und funktionelle Verwandtschaft der Proteine.
24
3. Material & Methoden
3. Material & Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Chemikalien
Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien sind in Tab. 3.1 aufgelistet. In Tab. 3.2 sind
die verwendeten Chromatographiesäulen aufgeführt sowie die Materialien, die zum Packen
von Säulen verwendet wurden.
Tab. 3.1: Liste der verwendeten Chemikalien und ihrer Hersteller.
Chemikalie
Hersteller
Acrylamid/Bisacrylamid (29/1; w/w)
Gerbu
Agar für die Bakteriologie
AppliChem
Agarose low EEO (Agarose Standard)
AppliChem
9-Amino-6-chloro-2-methoxy-acridin (ACMA)
Sigma-Aldrich
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Roth
Ammoniumeisen(III)-citrat (etwa 15% Fe)
Merck
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Merck
Ampicillin Natriumsalz
Gerbu \ Roth
Antifoam 204
Sigma-Aldrich
L-(+)-Arabinose
Roth
Biobeads SM-2
Bio-Rad
Borsäure
AppliChem
Bromphenolblau
Merck \ Roth \ Sigma \
EGA-Chemie
Calciumchlorid-dihydrat (CaCl2•2H2O)
Grüssing \ Fluka
Carbonylcanid-m-chlorphenylhydrazon (CCCP)
Sigma-Aldrich
Casamino Acids
Difco
Chloramphenicol
Roth
Coomassie Brillantblau R-250
AppliChem
L-Cystein
AppliChem
25
3. Material & Methoden
Tab. 3.1: Fortsetzung.
Chemikalie
Hersteller
2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzochinon
Sigma-Aldrich
(Decyl-Ubichinon, DecQ)
di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat (Na2HPO4•2H2O)
VWR
Dithiothreitol (DTT)
Gerbu
DNase I
AppliChem
dNTP-Mix
Fermentas
n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM)
AppliChem
E. coli polar lipid extract
Avanti
Eisen-(III)-chlorid (FeCl3)
Sigma
Essigsäure
VWR
Ethanol
VWR
Ethidiumbromid
aus Institutsbeständen
Ethylendiamintetraacetat-dihydrat Dinatriumsalz (EDTA•2H2O)
Sigma
Formaldehyd
Fluka
Glucose•H2O
Grüssing
Glutamat
Roth
Glycerin
Roth
Hefeextrakt
Ohly
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N‘-2-ethansulfonsäure (HEPES)
Gerbu
Imidazol
AppliChem
Kaliumacetat (KOAc)
Roth
Kaliumchlorid (KCl)
Merck
Kaliumcyanid (KCN)
Grüssing \ Merck
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Roth
di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)
Merck
Kaliumhexacyanoferrat(III)
Fluka \ AppliChem
Kaliumhydroxid (KOH)
Sigma
Kaliumiodid (KI)
Grüssing
Kaliumnatriumtartrat-tetrahydrat (K-Na-Tartrat•4H2O)
Grüssing
26
3. Material & Methoden
Tab. 3.1: Fortsetzung.
Chemikalie
Hersteller
Kanamycinsulfat
Gerbu \ Roth
Kupfer-(II)-sulfat-pentahydrat (CuSO4•5 H2O)
Grüssing
Magnesiumchlorid-hexahydrat (MgCl2•6H2O)
VWR
Magnesiumsulfat-heptahydrat (MgSO4•7H2O)
Grüssing
Mangan-(II)-chlorid (MnCl2)
Riedel-de Haën
D-Mannitol
AppliChem
2-Mercaptoethanol
Roth
Methanol
Sigma-Aldrich
L-(-)-Methionin
Merck
2- Morpholinoethansulfonsäure (MES)
AppliChem
3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)
AppliChem
Natriumcarbonat-decahydrat (Na2CO3•10 H2O)
Grüssing
Natriumchlorid (NaCl)
VWR
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Serva \ Bio-Rad
Natriumhydroxid (NaOH)
VWR \ Grüssing
Natriumlactat (Na-Lactat)
Merck
Natriumsulfat (Na2SO4)
Roth
Natriumthiosulfat-pentahydrat (Na2S2O3•5 H2O)
Riedel-de Haën
Nicotinamidadenin-dinucleotid Dinatriumsalz (NADH)
Roth \ Sigma-Aldrich
(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl)-
Toronto Research
methanthiosulfonat (MTSL)
Chemicals
Paraffinöl
aus Institutsbeständen
Pepton aus Casein (pankreatischer Verdau)
AppliChem
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Sigma-Aldrich
Piericidin A
Fluka \
aus Institutsbeständen
2-Propanol (Isopropanol)
Fluka
Riboflavin
AppliChem
Rinderserumalbumin (BSA)
Sigma-Aldrich
27
3. Material & Methoden
Tab. 3.1: Fortsetzung.
Chemikalie
Hersteller
RNase A
AppliChem
Rubidiumchlorid (RbCl2)
Amresco
D-(+)-Saccharose
Gerbu \ Roth
Salzsäure (HCl)
VWR
Silbernitrat (AgNO3)
aus Institutsbeständen
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Serva
Tetramethylrhodamin-maleimid (TMR-Maleimid)
Molecular Probes
Thiamin-Hydrochlorid
Merck
Trichloressigsäure (TCA)
Merck
Tricine
Roth
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
AppliChem
Uranylacetat
EM-facility,
University of Edinburgh
Zinkchlorid (ZnCl2)
Merck
Tab. 3.2: Säulenmaterialien und vorgepackte Säulen für die Chromatographie.
Säulenmaterial
Hersteller
Fractogel EMD TMAE Hicap (M)
Merck
ProBond Ni2+-IDA
Invitrogen
Source 15Q
Amersham Biosciences
vorgepackte Säulen
Hersteller
HiTrap Q HP, 5 mL
GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL
GE Healthcare
Yarra SEC-4000
Phenomenex
28
3. Material & Methoden
3.1.2 Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit verwendeten E. coli Stämme sind in Tab. 3.3 aufgeführt.
Tab. 3.3: Liste der verwendeten E. coli Stämme.
Stamm
XL10 Gold Kan
Genotyp
r
R
tet , Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-
Referenz
Stratagene
mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1,
gyrA96, relA1, lac, Hte, [F', proAB,
lacIq, ZΔM15, Tn10 (Tetr), Tn5 (Kanr)
Amy]
DH5α
F-, ϕ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-
Invitrogen
argF)U169, deoR, recA1, endA1,
hsdR17 (rK- mK+), gal-, phoA, supE44,
λ-, thi-1, gyrA96, relA1
DH5αΔnuo
F-, ϕ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-
Pohl et al., 2007b
argF)U169, deoR, recA1, endA1,
hsdR17 (rK- mK+), gal-, phoA, supE44,
λ-, thi-1, gyrA96, relA1,Δnuo
BW25113
BW25113 cadA::nptIFRT
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
Datsenko & Wanner,
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568, rph-1
2000
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
Baba et al., 2006
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
rph-1, cadA::nptIFRT
29
3. Material & Methoden
Tab. 3.3: Fortsetzung.
Stamm
Genotyp
Referenz
BW25113Δnuo
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
Vranas, 2013
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
rph-1, Δnuo
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
T. Lenn (London),
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
unveröffentl.
rph-1, Δnuo, Δndh, nptI
Ergebnisse
BW25113Δnuo
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
Garbers, 2010
cadA::nptIsacRB
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
BW25113ΔnuoΔndh/Kan
rph-1, Δnuo, cadA::nptIsacRB
BW25113Δnuo cadA-yfp
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
diese Arbeit
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
rph-1, Δnuo, cadA-yfp
BW25113 HisnuoF
lacIq, rrnB3, ΔlacZ4787, hsdR514,
nuoL::mrpA Bp
Δ(araBAD)567, Δ(rhaBAD)568,
Stahl, 2012
rph-1, HisnuoF, nuoL::mrpA
3.1.3 Vektoren
Die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren sind in Tab. 3.4 aufgeführt.
Tab. 3.4: Liste der verwendeten Vektoren.
Vektor
Genotyp
Referenz
pVO1100
ampR, kanR, nptI-sacR-sacB
V. Spehr, unveröffentl.
Ergebnisse
pKD46
p64YFP
ampR, R101 origin, araC-ParaBAD exo, Datsenko & Wanner,
bet, gam
2000
bla cat Pxyl–yfp
Tadesse & Graumann,
2006
30
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
Referenz
pCA24N cadA
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Kitagawa et al., 2005
cadA
pCA24N cadA-yfp
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Garbers, 2010
cadA-yfp
pCA24N nuoCD-gfp
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Kitagawa et al., 2005
nuoCD-gfp
pCA24N nuoCD H224M
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
nuoCD-gfp H224M
pCA24N nuoCD Y273F
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
nuoCD-gfp Y273F
pCA24N nuoCD H224M
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Y273F
nuoCD-gfp H224M Y273F
pCA24N nuoL
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
Kitagawa et al., 2005
nuoL
pCA24N nuoL T516Stop
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
nuoL T516Stop
pCA24N nuoL Y544Stop
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
nuoL Y544Stop
pCA24N nuoL W592Stop
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
diese Arbeit
nuoL W592Stop
pCA24N nuoL K551C
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Janoschke, 2011
nuoL K551C
pCA24N nuoL P552C
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Brander, 2011
nuoL P552C
31
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
Referenz
pCA24N nuoL F553C
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Brander, 2011
nuoL F553C
pCA24N nuoL L554C
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-
Janoschke, 2011
nuoL L554C
pETBlue-1
ampR, pUC origin, PT7-lac lacZ
Novagen
pETBlue K_nuoL_M
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL
Janoschke, 2011
pETBlue K_nuoL_M R529C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL R529C
Schnick, 2012
pETBlue K_nuoL_M V550C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL V550C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M K551C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL K551C
Krämer, 2012
pETBlue K_nuoL_M P552C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL P552C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M F553C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL F553C
Krämer, 2012
pETBlue K_nuoL_M L554C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL L554C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M L560C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL L560C
Schnick, 2012
pETBlue K_nuoL_M K561C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL K561C
Schnick, 2012
pETBlue K_nuoL_M R562C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL R562C
Schnick, 2012
pETBlue K_nuoL_M N566C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL N566C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M I571C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL I571C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M P572C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL P572C
Matlosz, 2012
pETBlue K_nuoL_M A573C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL A573C
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M V574C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL V574C
Schnick, 2012
pETBlue K_nuoL_M Y590C ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL Y590C
Schnick, 2012
32
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
Referenz
pETBlue K_nuoL_M D542N ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D542N
Willistein, 2011
pETBlue K_nuoL_M D546N ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D546N
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M D563N ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D563N
Willistein, 2011
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D563E
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M D563Q ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D563Q
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M D563A ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL D563A
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL_M Y594F
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL Y594F
diese Arbeit
pETBlue K_nuoL’mrpA_M
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoL’mrpA
Straub, 2014
pETBlue nuoM
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoM
diese Arbeit
pETBlue nuoM T166C
ampR, pUC origin, PT7-lac nuoM T166C
diese Arbeit
pBAD24 mrpA Bs
ampR, pBR322 origin, araC-ParaBAD,
Stahl, 2012
pETBlue K_nuoL_M D563E
mrpA
pBADnuoHis
camR, p15a origin, araC-ParaBAD nuoA-
Pohl et al., 2007c
N, His6-nuoF
pBADnuoHis nuoCD D187C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD nuoA-
Glessner, 2011
N, nuoCD D187C, His6-nuoF
pBADnuoHis
camR, p15a origin, araC-ParaBAD nuoA-N, Morina, 2009
nuoCD::nptIsacRB
nuoCD::nptIsacRB, His6-nuoF
pBADnuoHis nuoCD H224M
camR, p15a origin, araC-ParaBAD nuoA-
diese Arbeit
N, nuoCD H224M, His6-nuoF
pBADnuoHis nuoCD Y273F
camR, p15a origin, araC-ParaBAD nuoA-
diese Arbeit
N, nuoCD Y273F, His6-nuoF
33
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
pBADnuoHis nuoCD H224M camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Y273F
Referenz
diese Arbeit
nuoA-N, nuoCD H224M Y273F,
His6-nuoF
pBADnuo nuoF-mCerulean
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Erhardt, 2008
nuoA-N, nuoF-mCerulean
pBADnuo nuoF-mCerulean
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
nuoL::nptIsacRB
nuoA-N, nuoF-mCerulean,
Garbers, 2010
nuoL::nptIsacRB
pBADnuoHis
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
nuoL::nptIsacRB
nuoA-N, His6-nuoF nuoL::nptIsacRB
pBADnuoHis nuoL::mrpA Bp camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Bajzath, 2009
Bajzath, 2009
nuoA-N, His6-nuoF nuoL::mrpA
pBADnuoHis nuoL’mrpA Bp
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Straub, 2014
nuoA-N, His6-nuoF nuoL’mrpA
pBADnuoHis nuoL T516Stop camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL T516Stop
pBADnuoHis nuoL Y544Stop camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL Y544Stop
pBADnuoHis nuoL
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
W592Stop
nuoA-N, His6-nuoF nuoL W592Stop
pBADnuoHis nuoL R529C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL R529C
pBADnuoHis nuoL V550C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL V550C
34
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
Referenz
pBADnuoHis nuoL K551C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Krämer, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL K551C
pBADnuoHis nuoL P552C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL P552C
pBADnuoHis nuoL F553C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Krämer, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL F553C
pBADnuoHis nuoL L554C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL L554C
pBADnuoHis nuoL L560C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL L560C
pBADnuoHis nuoL K561C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL K561C
pBADnuoHis nuoL R562C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL R562C
pBADnuoHis nuoL R562C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
nuoM::nptIsacRB
nuoA-N, His6-nuoF nuoL R562C
diese Arbeit
nuoM::nptIsacRB
pBADnuoHis nuoL N566C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL N566C
pBADnuoHis nuoL I571C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL I571C
pBADnuoHis nuoL P572C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL P572C
35
3. Material & Methoden
Tab. 3.4: Fortsetzung.
Vektor
Genotyp
Referenz
pBADnuoHis nuoL A573C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL A573C
pBADnuoHis nuoL V574C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL V574C
pBADnuoHis nuoL Y590C
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Schnick, 2012
nuoA-N, His6-nuoF nuoL Y590C
pBADnuoHis nuoL D542N
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Willistein, 2011
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D542N
pBADnuoHis nuoL D546N
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D546N
pBADnuoHis nuoL D563N
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
Willistein, 2011
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D563N
pBADnuoHis nuoL D563E
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D563E
pBADnuoHis nuoL D563Q
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D563Q
pBADnuoHis nuoL D563A
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL D563A
pBADnuoHis nuoL Y594F
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
diese Arbeit
nuoA-N, His6-nuoF nuoL Y594F
3.1.4 Oligonucleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonucleotide sind in den Tabellen 3.5 und 3.6 aufgeführt.
Oligonucleotide wurden von Eurofins MWG Operon, Ebersberg, bezogen. In der Regel wurde
der Reinheitsgrad HPSF (High Purity Salt Free), bei einer Länge über 50 Nucleotiden der
Reinheitsgrad HYPUR (PAGE-gereinigt), gewählt.
36
3. Material & Methoden
Tab. 3.5: Liste der verwendeten DNA-Oligonucleotide. Homologe Bereiche, die für die λ-Red vermittelte
Rekombination bzw. die Klonierung nach Gibson et al. (2009) angefügt wurden, sind unterstrichen.
Oligonucleotid
Sequenz
cadA-eYFP-rev
5‘-CTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCC
TTGTACGAGCTAATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3‘
CadA-fwd
5‘-AGAAGAACCCATCCGTGAAC-3‘
cadA-sacRB-fwd
5‘-GTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATG
AAATCTGATATTGGAAAGCCACGTTGTGTCTC-3‘
cadA-sacRB-rev
5‘-CTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCC
TTGTACGAGCTAAGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3‘
Check-cadA-fwd
5’-TGCTTCATCGCGCTGATGGG-3’
Check-cadA-rev
5’-AAGCCAGCCGCCGAGAATAG-3’
Clone_nuoM_fwd
5‘-ATCTTGATTGGCTAGCACGTAGGTCGGATAAGCCGCC
TTC-3‘
Clone_nuoM_rev
5‘-ATGATTACAACGCCCGGGGCGTTGAGGAAATGATTGC
GTC-3‘
mrpA_abP474_rev
5‘-CAGTTCCGTCGTTTGAGGCTCTATCAGGCTGTACG-3‘
mrpA_Anfang_fwd
NheI_nuoK_fwd
5‘-GAGATGCGCGGATGACACAGCTCTTACATCTTGCTAT
TTTATCG-3‘
5‘-CTACCAGCTAGCCGCCAGAACCTGAACATCGATTC-3‘
NotI_mCerufwd
5‘-TATGCGGCCGCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3’
NotI_mCerurev
5‘-TTAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
GAG-3’
nuoCD_fwd
5‘-CTTAACCGCGCAAGAACCCG-3‘
nuoCD_rev
5‘-GCGGTCCACATCTGACATAAC-3’
nuoCD_seq
5‘-CGAACGCTAACTGGTATGAG-3‘
nuoJ-fwd
5‘-ACCTGGGCGGTTCAGAAATC-3‘
nuoK_fwd
5‘-CGCCAGAACCTGAACATCGATTC-3‘
nuoL_abQ481_fwd
5‘-CAAACGACGGAACTGGCGCAC-3‘
nuoL_midi
5‘-CGTGAAAGGGGTAACTCAC-3‘
nuoLM-rev
5‘-GATATCGGTCTGGGCGAAGGCCATC-3‘
nuoM_nptIsacRB_fwd
5'-TCCGGTCCTGACGGGACTTTTACAAGGAATAAAGATC
GCCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3'
37
3. Material & Methoden
Tab. 3.5: Fortsetzung.
Oligonucleotid
Sequenz
nuoM_nptIsacRB_rev
5'-CAACGGTAGCAGTGCGATCAGGTTTTGTGGAGTTATTG
TCATGGCGATGAATTCCCCGGGGGATCCG-3'
nuoM_rev
5‘-CCGACCTACGTTCTTATATGCC-3‘
pCA_nuoL_fwd
5’-CGCCAGAACCTGAACATCGATTCAGTAAGTGAGATG
CGCGGATGAACATGCTTGCCTTAACC-3’
pCA_nuoL_rev
5’-CCGACCTACGTTCTTATATGCCCAGGGGCAATCCCAC
AATCCTTAACTCAACGCAGTACCATCAACAGTGC-3’
SmaI_nuoM_rev
5‘-CAGTTCCCCGGGCCGACCTACGTTCTTATATGCC-3‘
vor_nuoL_rev
5‘-TCATCCGCGCATCTCACTTAC-3’
Tab. 3.6: Liste der Oligonucleotide für die ortsgerichtete Mutagenese. Das jeweils mutierte Codon ist kursiv
gedruckt, die ausgetauschten Basen sind rot dargestellt. Die zum Nachweis der Mutation neu generierten
Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen. Angegeben ist jeweils das auf dem Strang bindende Oligonucleotid
(Forward-Primer), das auf dem Gegenstrang bindende zweite Oligonucleotid (Reverse-Primer) besitzt die
entsprechende komplementäre Sequenz.
Restriktions-
Oligonucleotid
Sequenz
nuoCD_H224M_fwd
5‘-CCACCCGTCGGCCATGGGGGCTTTCCGT
Eco130I
ATC-3‘
(StyI)
nuoCD_Y273F_fwd
5‘-GACCGTATCGAATTCCTCGGCGGCTGC-3‘
EcoRI
nuoL_T516Stop_fwd
5’-CTGGGTAAACGTTAACTGGTGACCTCC-3’
KspAI
nuoL_Y544Stop_fw
5’-CGCCTGGGGATTTGACTGGTTATAAGACAA
PsiI (AanI)
schnittstelle
AGTGTTCGTC-3’
nuoL_W592St_fwd
5’-CTATCTGCGCTAATATGTGGCTAGCATGAG
NheI
CATCGG-3’
nuoL_R529C_fwd
5‘-CGCCAACAGTGCCCCGGGCTGTCTGCTG
Eco88I (AvaI)
GGC-3‘
nuoL_V550C_fwd
5‘-GACAAAGTGTTCTGCAAGCCATTCCTTGGTA Van91I
TTGCCTGG-3‘
nuoL_K551C_fwd
5‘-CAAAGTGTTCGTCTGCCCGTTCCTCGGGAT
Eco88I (AvaI)
TGCCTGGTTGC-3‘
38
3. Material & Methoden
Tab. 3.6: Fortsetzung.
Oligonucleotid
Sequenz
nuoL_P552C_fwd
5‘-GTGTTCGTCAAGTGCTTCCTCGGGATTGCC
Restriktionsschnittstelle
Eco88I (AvaI)
TGGTTGC-3‘
nuoL_F553C_fwd
5‘-GTCAAGCCGTGCCTCGGGATTGCCTGG
Eco88I (AvaI)
TTG-3‘
nuoL_L554C_fwd
5‘-GTTCGTCAAGCCATTCTGTGGTATTGCC
Van91I
TGG-3‘
nuoL_L560C_fwd
5‘-GTATTGCCTGGTTGTGTAAACGGGATCCGCT
BamHI
GAAC-3‘
nuoL_K561C_fwd
5‘-GCCTGGTTGCTGTGTCGCGATCCGCTG-3‘
Bsp68I (NruI)
nuoL_R562C_fwd
5’-GCCTGGTTGCTTAAGTGCGATCCGCTG-3‘
BspTI (AflII)
nuoL_N566C_fwd
5‘-CGCGATCCGCTGTGCTCGATGATGAAC
TaqI
ATC-3‘
nuoL_I571C_fwd
5‘-CTCAATGATGAACTGCCCTGCAGTCCTTTC
PstI
CCG-3‘
I571C_fwd_long
5‘-GAACTCAATGATGAACTGCCCTGCAGTCCT
PstI
TTCCCGC-3‘
nuoL_P572C_fwd
5‘-CCGCTGAACTCGATGATGAACATCTGCGCT
TaqI
GTCCTTTCC-3‘
nuoL_A573C_fwd
5‘-GATGAACATCCCGTGTGTCCTTTCTCGATTT
TaqI
GCAGGTAAAG-3‘
nuoL_V574C_fwd
5‘-GAACATCCCGGCTTGCCTTTCTCGATTTGCA
TaqI
GGTAAAG-3‘
nuoL_Y590C_fwd
5‘-GTGAGAACGGCTGTCTTCGATGGTATGT
TaqI
GGC-3‘
nuoL_D542N_fwd
5’-GTGGTACAACGCGTGGGGATTTAACTGGC
MluI
TGTATG-3’
nuoL_D546N_fwd
5’-GACTGGCTGTACAATAAAGTGTTCGTC-3’
Bsp1407I
(BsrGI)
nuoL_D563N_fwd
5’-GGTTGCTGAAACGCAATCCGCTGAATTCA
EcoRI
ATGATGAACATCCCGGC-3’
39
3. Material & Methoden
Tab. 3.6: Fortsetzung.
Restriktions-
Oligonucleotid
Sequenz
nuoL_D563E_fwd
5’-GGTTGCTGAAACGCGAACCGCTGAATTCA
schnittstelle
EcoRI
ATGATGAACATCCCGGC-3’
nuoL_D563Q_fwd
5‘-GTTGCTGAAACGCCAGCCGCTGAATTCAA
EcoRI
TGATGAAC-3‘
nuoL_D563A_fwd
5‘-GTTGCTGAAACGTGCACCGCTGAACTCA
Alw44I
ATG-3‘
nuoL_Y594F_fwd
5‘-GCTATCTGCGCTGGTTTGTGGCATCGATG
TaqI
AGCATCGGTGC-3‘
nuoM_T166C_fwd_13
5‘-CTCTGACGGTAAATGTCGTATCACGGCG-3‘
MluI*
*Hier wurde durch die eingefügte Mutation eine vorhandene MluI-Schnittstelle entfernt.
3.1.5 Enzyme
Die in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsenzyme sind in Tab. 3.7, die verwendeten DNAPolymerasen in Tab. 3.8 und weitere Enzyme in Tab. 3.9 aufgeführt. Alle Enzyme wurden
nach Herstellerangaben in den jeweiligen Puffern eingesetzt.
Tab. 3.7: Liste der verwendeten Restriktionsenzyme. Alle Enzyme wurden von Fermentas bzw. Thermo
Fisher Scientific bezogen. Gängige Isoschizomere sind, sofern vorhanden, in Klammern angegeben.
Alw44I (ApaLI)
Eco88I (AvaI)
PsiI (AanI)
BamHI
EcoRI
PstI
Bsp1407I (BsrGI)
KspAI (HpaI)
SmaI
Bsp68I (NruI)
MluI
TaqI
BspTI (AflII)
NcoI
Van91I (PflMI)
DpnI
NheI
Eco130I (StyI)
NotI
40
3. Material & Methoden
Tab. 3.8: Liste der verwendeten DNA-Polymerasen.
Polymerase
Hersteller
Pfu DNA Polymerase (recombinant)
Fermentas
Phusion DNA Polymerase
Finnzymes
LongAmp Taq DNA Polymerase
New England Biolabs
GoTaq DNA Polymerase
Promega
Tab. 3.9: Weitere in dieser Arbeit verwendete Enzyme.
Enzym
Hersteller
T4 DNA Ligase
Fermentas
In-Fusion HD Enzyme Mix
Clontech
3.1.6 Medien
Die für die Bakterienkultivierung verwendeten Nährmedien sind in Tab. 3.10 aufgeführt, die
bei Bedarf zugesetzten Antibiotika sind in Tab. 3.11 angegeben.
Tab. 3.10: Nährmedien für die Bakterienkultivierung.
Medium
Zusammensetzung
LB-Medium (Lysogeny Broth)
Pepton*
Hefeextrakt*
Konzentration
1% (w/v)
0.5% (w/v)
NaCl*
1% (w/v)
für Agar-Platten zusätzlich
Agar*
2% (w/v)
YP/Sac-Medium
Pepton*
1% (w/v)
für Agar-Platten zusätzlich
Hefeextrakt*
0.5% (w/v)
Saccharose
10% (w/v)
Agar*
2% (w/v)
*Diese Komponenten wurden autoklaviert, alle anderen Komponenten wurden steril filtriert.
41
3. Material & Methoden
Tab. 3.10: Fortsetzung.
Medium
Zusammensetzung
SOC-Medium (Super Optimal broth
Pepton*
with Catabolite repression)
Hefeextrakt*
Medium G
Autoinduktionsmedium
Konzentration
2% (w/v)
0.5% (w/v)
NaCl*
10 mM
KCl*
2.5 mM
MgSO4
10 mM
MgCl2
10 mM
Glucose
20 mM
Pepton*
1% (w/v)
Hefeextrakt*
0.5% (w/v)
Mannitol
0.5% (w/v)
NaCl*
0.8% (w/v)
Na3PO4*
15 mM
Na2HPO4*
10 mM
KH2PO4*
10 mM
Pepton*
Hefeextrakt*
1% (w/v)
0.5% (w/v)
Na2HPO4*
25 mM
KH2PO4*
25 mM
NH4Cl*
50 mM
Na2SO4*
5 mM
MgSO4
2 mM
L-Cystein
0.5 mM
Ammoniumeisen(III)-Citrat
30 mg/L
Riboflavin
50 mg/L
Mannitol
0.5% (w/v)
L-(+)-Arabinose
0.2% (w/v)
Glucose
0.05% (w/v)
*Diese Komponenten wurden autoklaviert, Riboflavin wurde in EtOH suspendiert, alle anderen Komponenten
wurden steril filtriert.
42
3. Material & Methoden
Tab. 3.10: Fortsetzung.
Medium
Zusammensetzung
Konzentration
S750-Medium
MOPS, pH 7.0
50 mM
(NH4)2SO4
10 mM
KH2PO4
5 mM
MgCl2
2 mM
CaCl2
0.7 mM
MnCl2
0.05 mM
ZnCl2
0.001 mM
Thiamin-Hydrochlorid
1 µg/mL
HCl
0.02 mM
FeCl2
0.005 mM
Mannitol
1% (w/v)
Glutamat
0.1% (w/v)
Casamino Acids
0.004% (w/v)
Pepton
1% (w/v)
NaCl
0.5% (w/v)
PB-Medium (Peptone Broth)
Tab. 3.11: Liste der verwendeten Antibiotika.
Antibiotikum
Stammlösung
Endkonzentration
Ampicillin
50 mg/mL
100 µg/mL
Kanamycin
50 mg/mL
50 µg/mL
Chloramphenicol
34 mg/mL in EtOH
170 µg/mL (flüssige Medien)
20 µg /mL (feste Medien)
43
3. Material & Methoden
3.1.7 Puffer und Lösungen
Die in dieser Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen sind in den Tabellen 3.12 bis 3.14
angegeben.
Tab. 3.12: Puffer für die Molekularbiologie.
Puffer
Zusammensetzung
TFB1-Puffer
KOAc, pH 5.8
30 mM
MnCl2
50 mM
CaCl2
10 mM
RbCl2
100 mM
Glycerin
TFB2-Puffer
10 mM
CaCl2
75 mM
RbCl2
10 mM
15% (w/v)
Tris/HCl, pH 8.0
50 mM
EDTA
10 mM
RNase A
Puffer P2
10% (w/v)
MOPS/NaOH, pH 6.5
Glycerin
Puffer P1
Konzentration
NaOH
SDS
Puffer P3
K-Acetat, pH 5.5
TBE-Puffer
Tris/Borat, pH 8.3
EDTA
100 µg/mL
200 mM
1% (w/v)
3M
89 mM
1 mM
44
3. Material & Methoden
Tab. 3.13: Puffer und Lösungen für die Proteinchemie.
Puffer
Zusammensetzung
Konzentration
A-Puffer
MES/NaOH, pH 6.0
50 mM
NaCl
50 mM
A*-Puffer
A-Puffer mit
MgCl2
A*DM-Puffer
A*-Puffer mit
DDM
B-Puffer
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
B*DM-Puffer
DDM
MES/NaOH, pH 6.3
NaCl
Imidazol
DDM
Elutionspuffer
0.1% (w/v)
50 mM
350 mM
B-Puffer mit
MgCl2
Bindepuffer
5 mM
MES/NaOH, pH 6.3
5 mM
0.1% (w/v)
50 mM
500 mM
20 mM
0.1% (w/v)
50 mM
NaCl
500 mM
Imidazol
500 mM
DDM
0.1% (w/v)
45
3. Material & Methoden
Tab. 3.13: Fortsetzung.
Puffer / Lösung
Zusammensetzung
Biuret-Lösung
NaOH
ACMA-Puffer
0.5% (w/v)
KI
0.5% (w/v)
CuSO4•5 H2O
0.3% (w/v)
MES/KOH, pH 6.0
Fluoreszenzpuffer
Tethering-Puffer
5 mM
50 mM
MgCl2
2 mM
MES/KOH, pH 6.0
5 mM
MgCl2
2 mM
DDM
Na+-Puffer
200 mM
K-Na-Tartrat
KCl
Lipidpuffer
Konzentration
MES/KOH, pH 6.0
2% (w/v)
5 mM
NaCl
80 mM
MgCl2
2 mM
HEPES/HCl, 7.5
50 mM
NaCl
60 mM
KH2PO4, pH 7.0
10 mM
K2HPO4
10 mM
NaCl
67 mM
Na-Lactat
10 mM
EDTA
0.1 mM
L-Methionin
1 µM
46
3. Material & Methoden
Tab. 3.14: Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE nach Schägger & von Jagow (1987).
Puffer / Lösung
Zusammensetzung
Konzentration
Probenpuffer
Tris/Acetat, pH 6.8
200 mM
SDS
16% (w/v)
Glycerin
48% (v/v)
2-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
Sammelgel
Tris/HCl, pH 8.45
SDS
0.7 M
0.07% (w/v)
3.9% (w/v)
TEMED
0.16% (v/v)
Tris/HCl, pH 8.45
0.065% (w/v)
1M
SDS
0.1% (w/v)
Acrylamid/Bisacrylamid (29/1; w/w)
10% (w/v)
Glycerin
11% (w/v)
TEMED
0.08% (v/v)
APS
Kathodenpuffer
0.04% (w/v)
Acrylamid/Bisacrylamid (29/1; w/w)
APS
Trenngel
8% (v/v)
0.035% (w/v)
Tris/HCl, pH 8.25
100 mM
Tricine
100 mM
SDS
0.1% (w/v)
Anodenpuffer
Tris/HCl, pH 8.9
Färbelösung
Ethanol
50% (v/v)
Essigsäure
10% (v/v)
Coomassie Brilliant Blue R250
200 mM
0.1% (w/v)
47
3. Material & Methoden
Tab. 3.14: Fortsetzung.
Puffer / Lösung
Zusammensetzung
Entfärbelösung
Ethanol
30% (v/v)
Essigsäure
10% (v/v)
Silberlösung
AgNO3
Formaldehyd
Entwickler
Konzentration
0.2% (w/v)
0.012% (v/v)
Na2CO3
0.57 M
Na2S2O3
16 µM
Formaldehyd
0.048% (v/v)
3.2 Mikrobiologische Methoden
Alle Medien und Lösungen wurden vor der Verwendung autoklaviert (121°C, 40 min,
Varioklav, HP Medizintechnik, Oberschleißheim) oder steril filtriert (Filtropur S 0.45,
Sarstedt).
3.2.1 Bakterienkultivierung
Glycerindauerkulturen: 150 µL Glycerin (80%, w/v) wurden mit 250 µL einer Vorkultur
vermischt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Glycerindauerkulturen wurden bei
-80°C gelagert.
Vorkulturen: 4 mL LB-Medium in einem Reagenzglas oder 50 mL LB-Medium in einem
Erlenmeyerkolben wurden mit 5-50 µL einer Glycerindauerkultur bzw. einer anderen
Vorkultur oder mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte angeimpft. Als Vorkultur für die
Anzucht im 10 L-Maßstab wurden 400 mL LB-Medium mit 200 µL einer anderen Vorkultur
versetzt. Für die Anzucht im 28 L-Maßstab wurden zunächst 10 mL LB-Medium in einem
Reagenzglas mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte angeimpft. Mit zwei dieser 10 mLVorkulturen wurde 1 L LB-Medium in einem 2 L-Erlenmeyerkolben mit Schikane angeimpft.
48
3. Material & Methoden
Alle Vorkulturen wurden jeweils mit dem benötigten Antibiotikum versetzt und 14-18 h bei
37°C unter Schütteln (Vibrax VXR, IKA; GFL 3005; Certomat U, B. Braun) inkubiert. Bei
Verwendung des temperatursensitiven Vektors pKD46 wurde bei 30°C inkubiert (Certomat
H/R, B. Braun).
Bakterienkultivierung für die Fluoreszenzmikroskopie: 4 mL S750-Medium wurden mit 50 µL
einer Vorkultur angeimpft und bei 30°C für 5 h inkubiert (Certomat H/R, B. Braun). Die
Expression episomal codierter Gene wurde nach 3 h durch Zugabe von 0.2% L-(+)-Arabinose
induziert.
Bakterienkultivierung für in vivo FRET-Messungen: FRET-fähige E. coli Stämme wurden im
Labor von Prof. Dr. Victor Sourjik, Zentrum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg,
kultiviert. 10 mL PB-Medium wurden mit dem benötigten Antibiotikum versetzt, mit 100 µL
einer Vorkultur angeimpft und bei 30°C für 4 h inkubiert (Infors HAT Multitron 2). Nach
90 min wurde die Expression des episomal codierten nuo-Operons durch Zugabe von 0.2%
(w/v) L-(+)-Arabinose induziert. Anschließend wurden die Zellen bei 2’506·g sedimentiert
(3’500 Upm, 8 min, 4°C, Rotor 8074, Varifuge 3.0R, Heraeus), in 10 mL Tethering-Puffer
aufgenommen und erneut sedimentiert (3’500 Upm, 8 min, 4°C, Rotor 8074, Varifuge 3.0R,
Heraeus). Die Zellen wurden in 4 mL Tethering-Puffer aufgenommen. 1.5 mL der Suspension
wurden bei 20’800·g zentrifugiert (14’000 Upm, 5 min, 4°C, Rotor F-45-30-11, Eppendorf
Centrifuge 5804 R), der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 1.5 mL
Tethering-Puffer resuspendiert.
Anzucht von E. coli Stämmen zur Isolierung von Komplex I: Zur Überproduktion von
Komplex I wurde der E. coli Stamm BW25113Δnuo verwendet. Der Stamm wurde mit dem
jeweiligen Expressionsvektor transformiert und im 400 mL-Maßstab in Erlenmeyerkolben
sowie im 10 L- und im 28 L-Maßstab im Fermenter kultiviert. Hierfür wurde jeweils
Autoinduktionsmedium verwendet. Zur Untersuchung chromosomal codierter Proteine wurde
der jeweilige Stamm in Medium G kultiviert. Alternativ wurde Autoinduktionsmedium ohne
Arabinose verwendet.
49
3. Material & Methoden
Anzucht im 400 mL-Maßstab: In einem 1 L-Erlenmeyerkolben mit Schikane wurden 400 mL
Medium mit dem jeweiligen Antibiotikum versetzt und mit 4 mL einer Vorkultur angeimpft.
Die Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln (180 Upm, Certomat U, B. Braun) inkubiert.
Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen durch Zentrifugation bei
4‘410·g (4‘800 Upm, 10 min, 4°C, Rotor JLA 8.1000; Avanti J26-XP, Beckman Coulter)
sedimentiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Anzucht im 10 L-Maßstab: In einem Glasfermenter (Innendurchmesser: 242×450 mm,
Miethke Laborglas, Leverkusen) mit Rührwerk (B. Braun) wurden 10 L Medium mit einer
400 mL-Vorkultur angeimpft. Die Kultur wurde im Brutraum bei 37°C unter Luftzufuhr und
ständigem Rühren (200 Upm, Heidolph RZR 2020) inkubiert. Am Ende der exponentiellen
Wachstumsphase wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 4‘410·g (4‘800 Upm, 10 min,
4°C, Rotor JLA 8.1000; Avanti J26-XP, Beckman Coulter) sedimentiert, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Anzucht im 28 L-Maßstab: Um ausreichend Zellen für die Präparation von chromosomal
codiertem Komplex I und andere, häufig durchgeführte Präparationen, zu erhalten, wurden in
einem Fermenter (LP 351, Bioengineering) 28 L Medium mit zwei 1 L-Vorkulturen
angeimpft. Die Zellen wurden bei 37°C unter Luftzufuhr und ständigem Rühren (380 Upm)
inkubiert. Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurde die Kultur auf 15°C gekühlt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 18‘540·g (10‘000 Upm, 10 min, 4°C, Rotor JLA
10.500; J2-HS, Beckman) sedimentiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
3.2.2 Messung der optischen Dichte
Die optische Dichte (OD600) einer Zellsuspension wurde als Absorbanz bei 600 nm gegen LBMedium als Referenz gemessen (d=1 cm, Halbmikroküvetten, Brand; Ultrospec 1100 pro,
Amersham Biosciences). Ab einer OD600 von 0.4 wurde die Probe zur Messung 1:10 bzw.
1:20 mit LB-Medium verdünnt, so dass der gemessene Wert stets unter 0.4 lag.
50
3. Material & Methoden
3.2.3 Herstellung von kompetenten Zellen
Chemisch-kompetente Zellen: 100 mL LB-Medium wurden mit 1 mL einer Vorkultur des
Stammes XL10 Gold Kanr angeimpft und bei 37°C unter Schütteln (Certomat U, B. Braun)
inkubiert. Bei einer OD600 von 0.6 wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 4‘500·g
(5‘000 Upm, 10 min, 4°C, Rotor A-4-44; Eppendorf Centrifuge 5804 R) sedimentiert. Das
Sediment wurde in 30 mL TFB1-Puffer resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurde die Zellsuspension erneut bei 4‘500·g zentrifugiert (5‘000 Upm, 10 min,
4°C, Rotor A-4-44; Eppendorf Centrifuge 5804 R). Das Sediment wurde in 1 mL TFB2Puffer resuspendiert, in 50 µL Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
Elektrokompetente Zellen: 100 mL LB-Medium wurden mit 1 mL einer E. coli Vorkultur
angeimpft und bei 37°C unter Schütteln (Certomat U, B. Braun) inkubiert. Bei einer OD600
von 0.6-0.7 wurden die Zellen für 10 min auf Eis gestellt und dann bei 4‘500·g (5‘000 Upm,
10 min, 4°C, Rotor A-4-44; Eppendorf Centrifuge 5804 R) zentrifugiert. Das Sediment wurde
in 50 mL eiskaltem MilliQ-H2O resuspendiert und erneut unter gleichen Bedingungen
zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde einmal mit MilliQ-H2O und einmal mit 10%igem
Glycerin (w/v) wiederholt. Nach der letzten Zentrifugation wurde das Sediment in 10%igem
Glycerin (w/v) bis zu einer OD600 von 35-45 resuspendiert. Die Zellsuspension wurde bis zur
Transformation auf Eis aufbewahrt oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
Elektrokompetente Zellen für die Rekombination: Für die λ-Red vermittelte Rekombination
wurden elektrokompetente Zellen mit überproduziertem λ-Red Rekombinase-System
hergestellt. Hierzu wurden 100 mL LB-Medium mit 1 mL einer Vorkultur des Stammes
DH5αΔnuo/pKD46 angeimpft und bei 30°C unter Schütteln (180 Upm, Certomat H/R, B.
Braun) inkubiert. Zur λ-Red vermittelten Rekombination auf dem Chromosom wurde der
jeweilige Stamm mit dem Vektor pKD46 transformiert und analog behandelt. Bei einer OD600
von 0.25-0.35 wurde durch Zugabe von 0.2% (w/v) L(+)-Arabinose die Expression des RedOperons induziert. Die Zellen wurden für weitere 20 min bei 30°C inkubiert, danach für
10 min auf Eis gestellt und wie für elektrokompetente Zellen beschrieben weiter behandelt.
Die Zellsuspension wurde auf Eis aufbewahrt und direkt zur Transformation eingesetzt, nur in
51
3. Material & Methoden
Ausnahmefällen wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
Verwendung bei -80°C gelagert.
3.3 Molekularbiologische Methoden
3.3.1 Ligation
Für die Ligation wurde ein lineares DNA-Fragment mittels PCR amplifiziert; geeignete
Restriktionsschnittstellen wurden über die verwendeten Oligonucleotide eingeführt. Das
lineare Fragment sowie der Vektor wurden mit den jeweiligen Restriktionsenzymen
geschnitten und mit der T4 DNA Ligase (Fermentas) nach Herstellerangaben ligiert.
Ligationsansätze wurden mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
aufgereinigt. Die DNA wurde mit 30 µL MilliQ-H2O (55°C) von der Präparationssäule eluiert
und elektrokompetente Zellen des Stammes DH5α wurden mit 1 µL der DNA-Lösung
elektroporiert.
3.3.2 Ligasefreies Klonieren (Gibson-Klonierung)
Für die Klonierung nach Gibson et al. (2009) wurde der Vektor in der multiplen
Klonierungsstelle mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten oder alternativ
mittels PCR an den gewünschten Stellen linearisiert. Ein lineares DNA-Fragment mit
homologen Bereichen zu den Nahtstellen auf dem Vektor wurde mittels PCR amplifiziert. Je
75 ng des linearisierten Vektors und des PCR-Produkts wurden in einem Reaktionsansatz
nach Herstellerangaben mit dem In-Fusion HD Enzyme Mix (Clontech, Mountain View, CA)
fusioniert. Kompetente Zellen des Stammes XL10 Gold Kanr wurden mit 2.5 µL des
Reaktionsansatzes transformiert.
3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR-Reaktionen wurden in dünnwandigen PCR-Reaktionsgefäßen (0.2 mL, Biozyme) auf Eis
angesetzt und in einem Thermocycler (Mastercycler, Eppendorf; GeneAmp PCR System,
Perkin Elmer; PTC-200, MJ Research) durchgeführt, wobei das Temperaturprogramm jeweils
an die Eigenschaften der verwendeten Polymerase und Oligonucleotide angepasst wurde.
52
3. Material & Methoden
Ortsgerichtete Mutagenese: Zur ortsgerichteten Mutagenese wurde das QuikChange Protokoll
(Stratagene, La Jolla, CA) verwendet. Reaktionsansätze wurden gemäß Tab. 3.15 vorbereitet.
Das verwendete Temperaturprogramm ist in Tab. 3.16 angegeben. Um den Reaktionserfolg
zu überprüfen, wurden 10 µL des Ansatzes auf ein Agarosegel aufgetragen. Der restliche
Ansatz wurde durch Restriktion mit DpnI von der Templat-DNA befreit und mit dem Wizard
SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) aufgereinigt. Die DNA wurde mit 30 µL
MilliQ-H2O
(55°C)
von
der
Präparationssäule
eluiert.
Anschließend
wurden
elektrokompetente Zellen des Stammes DH5α mit 1 µL der DNA-Lösung elektroporiert oder
es wurden kompetente Zellen des Stammes XL10 Gold Kanr mit 1-5 µL der DNA-Lösung
mittels Hitzeschock transformiert.
Tab. 3.15: Reaktionsansatz für die ortsgerichtete Mutagenese.
Komponente
Konzentration / Menge
Templat-DNA
50 ng
dNTPs
0.2 mM
Oligonucleotide (fwd/rev)
0.24 µM, jeweils
Pfu-Puffer + MgSO4
1×
Pfu Polymerase
2.5 U
H2O
ad 50 µL
Tab. 3.16: Temperaturprogramm für die ortsgerichtete Mutagenese.
Reaktionsschritt
Temperatur [°C]
Zeit [min]
Initiale Denaturierung
95
2:00
Denaturierung
95
0:30
Annealing
50-60
1:00
Elongation
72
2:00 / kbp
Lagerung
4
18 ×
nicht limitiert
53
3. Material & Methoden
Amplifikation von DNA-Fragmenten: Zur Erzeugung linearer DNA-Fragmente für die
Ligation, die Gibson-Klonierung und die λ-Red vermittelte Rekombination wurden
Reaktionsansätze gemäß Tab. 3.17 vorbereitet. Das jeweils an die Schmelztemperatur der
verwendeten Oligonucleotide und die Länge des erwarteten Fragments angepasste
Temperaturprogramm ist in Tab. 3.18 angegeben.
Tab. 3.17: Reaktionsansatz zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente.
Komponente
Konzentration / Menge
Templat-DNA
50 ng
dNTPs
0.2 mM
Oligonucleotide (fwd/rev)
0.2 µM, jeweils
Phusion HF Puffer
1×
Phusion Polymerase
1U
H2O
ad 50 µL
Tab. 3.18: Temperaturprogramm zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente.
Reaktionsschritt
Temperatur [°C]
Zeit [min]
Initiale Denaturierung
95
3:00
Denaturierung
95
0:30
Annealing
55-60
0:30
Elongation
72
0:30 / kbp
Finale Elongation
72
10:00
Lagerung
4
25 ×
nicht limitiert
DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 4 kbp wurden unter Verwendung der
LongAmp Taq Polymerase (New England Biolabs) amplifiziert. Hierzu wurden
Reaktionsansätze gemäß Tab. 3.19 pipettiert und das in Tab. 3.20 angegebene
Temperaturprogramm verwendet.
54
3. Material & Methoden
Tab. 3.19: Reaktionsansatz zur Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 4 kbp).
Komponente
Konzentration / Menge
Templat-DNA
50 ng
dNTPs
0.24 mM
Oligonucleotide (fwd/rev)
0.2 µM, jeweils
LongAmp Taq Reaction Buffer
1×
LongAmp Taq Polymerase
5U
H2O
ad 50 µL
Tab. 3.20: Temperaturprogramm zur Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 4 kbp).
Reaktionsschritt
Temperatur [°C]
Zeit [min]
Initiale Denaturierung
94
3:00
Denaturierung
94
0:20
Annealing
55-61
1:00
Elongation
65
0:50 / kbp
Finale Elongation
65
10:00
Lagerung
4
nicht limitiert
25 ×
Um den Reaktionserfolg zu überprüfen, wurden 3 µL des Ansatzes auf ein Agarosegel
aufgetragen. Der restliche Ansatz wurde durch Restriktion mit DpnI von der Templat-DNA
befreit. Alternativ wurde der Ansatz über ein präparatives Agarosegel aufgetrennt und das
gewünschte Fragment ausgeschnitten. Um eine möglichst hohe DNA-Konzentration zu
erhalten, wurden jeweils drei identische Ansätze mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System (Promega) über eine Präparationssäule aufgereinigt. Die DNA wurde mit 30 µL
MilliQ-H2O (55°C) eluiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Analytische PCR an ganzen Zellen: Um nach der λ-Red vermittelten Rekombination den
erfolgreichen Einbau linearer DNA-Fragmente mit der erwarteten Länge an der gewünschten
Position zu überprüfen wurden analytische PCR-Reaktionen an ganzen Zellen durchgeführt.
55
3. Material & Methoden
Als Vorlage wurde jeweils 1 µL einer E. coli Vorkultur verwendet. Der verwendete
Reaktionsansatz ist in Tab. 3.21 und das Temperaturprogramm in Tab. 3.22 angegeben.
Tab. 3.21: Reaktionsansatz für die analytische PCR an ganzen Zellen.
Komponente
Konzentration / Menge
E. coli Vorkultur
1 µL
dNTPs
0.2 mM
Oligonucleotide (fwd/rev)
0.4 µM, jeweils
Green GoTaq Buffer
1×
GoTaq Polymerase
2U
H2O
ad 20 µL
Tab. 3.22: Temperaturprogramm für die analytische PCR an ganzen Zellen.
Reaktionsschritt
Temperatur [°C]
Zeit [min]
Initiale Denaturierung
94
5:00
Denaturierung
94
0:30
Annealing
55
1:00
Elongation
65
1:00 / kbp
Finale Elongation
65
10:00
Lagerung
4
30 ×
nicht limitiert
Der Ansatz wurde komplett auf ein Agarosegel aufgetragen, elektrophoretisch getrennt und
das Bandenmuster dokumentiert.
3.3.4 Transformation
Transformation durch Hitzeschock : 50 µL kompetente Zellen des Stammes XL10 Gold Kanr
wurden mit 1-5 µL des gereinigten PCR-Produkts der ortsgerichteten Mutagenese oder 2.5 µL
eines Reaktionsansatzes zur Gibson-Klonierung vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert.
Zur Transformation wurden die Zellen für 45 sec auf 42°C erhitzt (Thermomixer compact,
56
3. Material & Methoden
Eppendorf) und anschließend für 5 min auf Eis gestellt. Der Ansatz wurde in 750 µL LBMedium aufgenommen und für 1 h bei 37°C geschüttelt (750 Upm, Thermomixer compact,
Eppendorf). Die Zellen wurden bei 1‘500·g und Raumtemperatur zentrifugiert (3 min,
4‘000 Upm, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D, Eppendorf), in 100 µL LB-Medium
resuspendiert, auf LB-Agar mit dem jeweils benötigten Antibiotikum ausgestrichen und für
14-18 h bei 37°C inkubiert.
Transformation durch Elektroporation: 50 µL elektrokompetente Zellen wurden mit 50 ng
Plasmid-DNA, 1 µL eines Ligationsansatzes oder 1 µL der aufgereinigten DNA-Lösung aus
der ortsgerichteten Mutagenese vermischt. Der Ansatz wurde in eine eisgekühlte
Elektroporationsküvette (1 mm, Eppendorf bzw. Bulldog Bio, Portsmouth, NH) überführt.
Die Zellen wurden für ≥ 5 ms einem Spannungspuls von 1700 V/mm ausgesetzt
(Electroporator 2510, Eppendorf) und unmittelbar nach der Elektroporation in 1 mL SOCMedium aufgenommen. Der Ansatz wurde 1 h bei 37°C inkubiert (750 Upm, Thermomixer
compact, Eppendorf) und anschließend auf LB-Agar mit dem jeweils benötigten Antibiotikum
ausgestrichen. Nach der Transformation mit Ligationsansätzen oder PCR-Produkten der
ortsgerichteten Mutagenese wurden die Zellen bei 1‘500·g und Raumtemperatur zentrifugiert
(3 min, 4‘000 Upm, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D, Eppendorf), das Sediment in
100 µL LB-Medium resuspendiert und vollständig auf eine Agarplatte ausgestrichen. Nach
der Transformation mit Plasmiden wurden 100 µL des Ansatzes je nach erwarteter
Transformationseffizienz unverdünnt oder in einer Verdünnung von 1:100 – 1:1000 (LBMedium, v/v) ausplattiert. Die Platten wurden für 14-18 h bei 37°C inkubiert. Bei
Verwendung des temperatursensitiven Vektors pKD46 wurde bei 30°C für 18-24 h inkubiert.
3.3.5 λ-Red vermittelte Rekombination
50 µL frisch hergestellte elektrokompetente Zellen des Stammes DH5αΔnuo/pKD46 wurden
mit 50 ng des Vektors und 100-500 ng des linearen DNA-Fragments vermischt. Zur λ-Red
vermittelten Rekombination auf dem Chromosom wurden 50 µL elektrokompetente Zellen
des jeweiligen Stammes mit 75-400 ng des linearen DNA-Fragments vermischt. Der Ansatz
wurde in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (1 mm, Eppendorf bzw. Bulldog Bio,
Portsmouth, NH) überführt. Die Zellen wurden für ≥ 5 ms einem Spannungspuls von
1700 V/mm ausgesetzt (Electroporator 2510, Eppendorf) und unmittelbar nach der
57
3. Material & Methoden
Elektroporation in 1 mL SOC-Medium aufgenommen. Der Ansatz wurde 1 h bei 37°C
inkubiert (750 Upm, Thermomixer compact, Eppendorf), anschließend wurden 100 µL auf
eine Agarplatte ausgestrichen. Sollte die nptIsacRB-Selektionskassette eingefügt werden, so
wurden 100 µL des Ansatzes auf LB-Agar mit Kanamycin ausplattiert und für 14-18 h bei
37°C inkubiert. Sollte die Kassette gegen ein lineares DNA-Fragment ausgetauscht werden,
so wurden 100 µL des Ansatzes auf YP/Sac-Platten ausgestrichen und für 18-24 h bei 30°C
inkubiert. Wurde auf einem Vektor rekombiniert, so wurden YP/Sac-Platten mit dem
entsprechenden Antibiotikum verwendet. War nur eine geringe Rekombinationseffizienz zu
erwarten, so wurde der Ansatz bei 1‘500·g und Raumtemperatur zentrifugiert (3 min,
4‘000 Upm, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D, Eppendorf), das Sediment in 100 µL LBMedium resuspendiert und vollständig auf eine entsprechende Agarplatte ausgestrichen.
3.3.6 Plasmidisolation
Analytische Plasmidisolation: Um nach Ligation, ligasefreier Klonierung, ortsgerichteter
Mutagenese und Rekombination den Erfolg der Reaktion zu überprüfen, wurden 4 mL
Vorkulturen mit einer Einzelkolonie von der jeweiligen Agarplatte angeimpft. In der Regel
wurden pro Reaktion 12-24 Klone analysiert. 2 mL der Vorkultur wurden bei 1‘500 g und
Raumtemperatur zentrifugiert (4 min, 4‘000 Upm, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D,
Eppendorf). Das Zellsediment wurde in 250 µL Puffer P1 resuspendiert, mit 250 µL Puffer P2
versetzt, durch Invertieren gemischt und für 4 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde das Zelllysat mit 250 µL Puffer P3 neutralisiert, erneut durch Invertieren
gemischt und für 15 min auf Eis gestellt. Die Suspension wurde bei 20‘800·g zentrifugiert
(15 min, 14‘000 Upm, 4°C, Rotor F45-30-11, Centrifuge 5417R, Eppendorf) und das
Sediment wurde verworfen. Der Überstand wurde mit 750 µL Isopropanol versetzt, für
20 min bei -20°C inkubiert und erneut bei 20‘800·g zentrifugiert (15 min, 14‘000 Upm, 4°C,
Rotor F45-30-11, Centrifuge 5417R, Eppendorf). Der Überstand wurde entfernt und die DNA
wurde für 1-2 h bei 37°C getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 30 µL ddH2O durch
Schütteln bei 55°C gelöst (750 Upm, Thermomixer compact, Eppendorf). 5 µL der DNALösung wurden für die Restriktionsanalyse eingesetzt.
58
3. Material & Methoden
Präparative Plasmidisolation: Für die Plasmidisolation im präparativen Maßstab wurde das
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) nach Herstellerangaben
verwendet. Die DNA wurde mit 30-50 µL MilliQ-H2O (55°C) von der Präparationssäule
eluiert und bei Bedarf bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
3.3.7 Restriktionsanalyse
Zu analytischen Zwecken wurden für eine Restriktionsanalyse 250 ng DNA oder 5 µL DNALösung aus der analytischen Plasmidisolation eingesetzt. Präparative Restriktionsansätze für
die Ligation und die Gibson-Klonierung enthielten 1-2 µg DNA. Anhand der vom Hersteller
Fermentas
angegebenen
Aktivität
wurde
die
benötigte
Menge
des
jeweiligen
Restriktionsenzyms berechnet und ein vierfacher Überschuss eingesetzt. Restriktionsansätze
wurden nach Herstellerangaben vorbereitet und, wenn nicht anders angegeben, für 1.5-2 h bei
37°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze je nach Bedarf auf ein analytisches oder
präparatives Agarosegel aufgetragen.
3.3.8 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Auftrennung und Analyse von DNA-Fragmenten wurde die DNA-Lösung mit der
benötigten Menge an 6x Loading Dye (Fermentas) versetzt und auf ein Agarosegel (0.8%,
w/v) in TBE-Puffer mit Ethidiumbromid (500 ng/mL) aufgetragen. Zur Abschätzung der
Größe der DNA-Fragmente wurde ein Längenstandard (λ-DNA/Eco130I (StyI) Marker 16; λDNA/EcoRI+HindIII Marker 3; GeneRuler 1 kb DNA Ladder; GeneRuler 1 kb Plus DNA
Ladder; alle Fermentas) mit aufgetragen. Die Fragmente wurden in TBE-Puffer bei einer
Spannung von 10 V/cm (EPS 601, Amersham Biosciences) aufgetrennt und das
Bandenmuster unter UV-Licht (Transluminator-312 nm, IL-200 M) dokumentiert.
Agarosegele wurden in der Regel mehrfach verwendet, zu präparativen Zwecken wurde stets
ein neues Gel verwendet und das gewünschte Fragment wurde mit dem Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System (Promega) extrahiert. In diesem Fall wurde außerdem auf die
Dokumentation verzichtet, um das Risiko von Mutationen durch das UV-Licht zu minimieren.
59
3. Material & Methoden
3.3.9 DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde mit dem Qubit Fluorometer unter Verwendung
des Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen) nach Herstellerangaben bestimmt. Es wurde
jeweils eine 1:10 (v/v) Verdünnung der DNA-Lösung in MilliQ-H2O angesetzt, von der 3 µL
für die Messung eingesetzt wurden.
3.3.10 DNA-Sequenzierung
Alle Mutationen wurden mittels Sequenzierung bestätigt. Hierzu wurden 20 µL Plasmid-DNA
mit einer Konzentration von 50 ng/µL zur Firma GATC Biotech AG, Konstanz, geschickt.
Die für die Sequenzierung benötigten Oligonucleotide wurden entweder durch die GATC
Biotech AG synthetisiert oder von Eurofins MWG Operon, Ebersberg, bezogen und zur
Sequenzierung mitgeschickt.
3.4 Proteinchemische und Proteinanalytische Methoden
3.4.1 Sequenzvergleiche
Sequenzvergleiche wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und Prof. Dr. Thorsten
Friedrich, Institut für Biochemie, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg, mit dem Programm
ClustalX 2.1 (Larkin et al., 2007) durchgeführt. Im Vergleich zu den voreingestellten Werten
wurden die Parameter für Gap Opening und Gap Extend leicht verändert. Die Parameter
wurden für das Pairwise Alignment auf 15 und 1 und für das Multiple Alignment auf 15 und 2
eingestellt.
3.4.2 Präparation der cytoplasmatischen Membranen aus E. coli Zellen und
Detergenzextraktion der Membranproteine
Alle Arbeiten wurden bei 4°C oder auf Eis ausgeführt. 25-35 g Zellen (Feuchtgewicht)
wurden mit der sechsfachen Menge A-Puffer sowie 100 µL PMSF (0.1 M) und einer
Spatelspitze DNaseI versetzt und mit Hilfe eines Mixers (Stufe I, 2 min, Braun) resuspendiert.
Die Suspension wurde in einem Teflon-in-Glas-Homogenisator homogenisiert, entstandener
Schaum wurde mit einer Spatelspitze Antifoam 204 entfernt und die Zellen wurden in 4
60
3. Material & Methoden
Durchgängen bei 1‘000 bar in einem Fluidizer (M110-P, Microfluidics) aufgeschlossen.
Alternativ wurde der Aufschluss in einer French Press (110 MPa, 1 Durchgang, 40 mL
Zylindervolumen; French Pressure Cell, SLM Aminco) durchgeführt. Nicht aufgeschlossene
Zellen und größere Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 9‘500·g (20 min,
10‘000 Upm, 4°C, Rotor A8.24, RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge, Sorvall)
sedimentiert. Der Überstand wurde bei 177‘520·g bzw. 160‘330·g zentrifugiert (50‘000 bzw.
42‘000 Upm, 70 min, 4°C, Rotor 60 Ti bzw. 50.2 Ti, L8-70M oder Optima LE-80K
Ultracentrifuge, Beckman Coulter. Bei den angegebenen g-Werten handelt es sich laut
Hersteller um Durchschnittswerte „RCF (avg)“) und die sedimentierten Membranen wurden
1:1 (w/v) mit A*-Puffer versetzt. Nach Zugabe von 50 µL PMSF (0.1 M) wurde die
Membransuspension in einem Teflon-in-Glas-Homogenisator homogenisiert und bis zu einer
Endkonzentration von 3% DDM mit einer 20%igen DDM-Stammlösung versetzt. Das
Gemisch wurde erneut homogenisiert und dann 15 min auf Eis inkubiert, wobei es alle
3-4 min nochmals durchmischt wurde. Der Extrakt wurde mit A*-Puffer auf 64 mL aufgefüllt
und bei 177‘520·g bzw. 160‘330·g (50‘000 bzw. 42‘000 Upm, 15 min, 4°C, Rotor 60 Ti bzw.
50.2 Ti, L8-70M oder Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman Coulter) zentrifugiert, um
nicht gelöste Bestandteile abzutrennen. Vor und nach der Zentrifugation wurde jeweils eine
Probe
zur
Bestimmung
der
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
und
der
Proteinkonzentration der Membransuspension bzw. des geklärten Detergenzextrakts
entnommen.
3.4.3 Präparation von Komplex I
Alle Schritte wurden bei 4°C oder auf Eis ausgeführt, alle Puffer wurden unmittelbar vor der
Verwendung mit 35 µM PMSF versetzt. Für die Chromatographie wurden die Systeme
ÄKTAprime, ÄKTAprime plus, ÄKTAexplorer oder ÄKTApurifier (alle GE Healthcare)
verwendet.
Der geklärte Detergenzextrakt wurde mit einer Flussrate von 8 mL/min auf eine in A*DMPuffer äquilibrierte 50 mL Anionenaustausch-Chromatographiesäule (95×26 mm, Fractogel
EMD TMAE Hicap, Merck) aufgetragen. Die Säule wurde mit A*DM-Puffer bis zur Abnahme
der Absorbanz bei 280 nm auf den ursprünglichen Wert und dann mit 50 mL 33% B*DMPuffer, was einer NaCl-Konzentration von 150 mM entspricht, gewaschen. Gebundene
Proteine wurden in einem linearen 40 mL-Gradienten von 33-100% B*DM-Puffer
61
3. Material & Methoden
entsprechend einer NaCl-Konzentration von 150-350 mM eluiert. Das Eluat wurde in 4 mL
Fraktionen gesammelt und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der einzelnen
Fraktionen bestimmt. Fraktionen, die mindestens die Hälfte der Aktivität der Gipfelfraktion
zeigten,
wurden
vereinigt.
Nach
Abnahme
einer
Probe
zur
Bestimmung
der
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und des Proteingehalts wurden die vereinigten
Fraktionen mit Elutionspuffer versetzt und so auf eine Imidazolkonzentration von 20 mM
eingestellt.
Die Proteinlösung wurde mit einer Flussrate von 1.2 mL/min auf eine in Bindepuffer
äquilibrierte Affinitäts-Chromatographiesäule (ProBond Ni2+-IDA, Invitrogen) aufgetragen.
Das Säulenvolumen variierte von 5-20 mL (30×15 mm - 64×20 mm). Die Säule wurde mit
Bindepuffer gewaschen bis die Absorbanz bei 280 nm unter 100 mAU gesunken war.
Anschließend wurden gebundene Proteine mit einem Stufengradienten von 25%, 75% und
100% Elutionspuffer entsprechend einer Imidazolkonzentration von 140 mM, 380 mM und
500 mM eluiert. Das Eluat der 75%-Stufe wurde in 1.5 mL Fraktionen gesammelt und die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der einzelnen Fraktionen bestimmt. Fraktionen,
die mindestens die Hälfte der Aktivität der Gipfelfraktion zeigten, wurden vereinigt und bei
3‘800·g auf ein Volumen von 200-500 µL konzentriert (Amicon Ultra-15, Millipore oder
Vivaspin 20, Sartorius, 100 kDa MWCO; 4‘595 Upm, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804 R,
Eppendorf). Um die Imidazolkonzentration zu verringern, wurde das Konzentrat dreimal mit
dem zehnfachen Volumen A*-Puffer verdünnt und die Probe erneut unter den gleichen
Bedingungen aufkonzentriert. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und der
Proteingehalt wurden bestimmt. Je nach Bedarf wurde die Präparation weiter aufgereinigt
oder aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei
-80°C gelagert.
3.4.4 Auftrennung verschiedener Komplex I Populationen
Zur
Auftrennung
verschiedener
Populationen
wurde
die
Präparation
nach
der
Affinitätschromatographie mit einer Flussrate von 1.5 mL/min auf eine in A*DM-Puffer
äquilibrierte 5 mL oder 15 mL Anionenaustausch-Chromatographiesäule (25×16 mm oder
75×16 mm, Source 15Q, Amersham Biosciences) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem
Säulenvolumen 33% B*DM-Puffer was einer NaCl-Konzentration von 150 mM entspricht
62
3. Material & Methoden
gewaschen. Gebundene Proteine wurden in einem linearen Gradienten von 33-100% B*DMPuffer entsprechend einer NaCl-Konzentration von 150-350 mM mit 3 Säulenvolumen eluiert.
Alternativ wurde die Präparation nach der Affinitätschromatographie mit einer Flussrate von
5 mL/min auf eine 5 mL HiTrap Q HP Säule (GE Healthcare) aufgetragen. Es wurde zunächst
mit 5% B*DM-Puffer entsprechend 65 mM NaCl und dann mit 15% B*DM-Puffer entsprechend
95 mM NaCl nachgewaschen, um schwach gebundene Verunreinigungen zu entfernen.
Anschließend wurde die Salzkonzentration in einem 10 mL Gradienten auf 30% B*DM-Puffer
entsprechend 140 mM NaCl erhöht und bis zur Grundlinie gewaschen. In einem weiteren
10 mL Gradienten auf 60% B*DM-Puffer wurde die Salzkonzentration auf 230 mM NaCl
erhöht und erneut bis zur Grundlinie gewaschen. Abschließend wurde die Säule mit 100%
B*DM-Puffer entsprechend 350 mM NaCl gespült.
Das Eluat wurde jeweils in 1 mL Fraktionen gesammelt und die Fraktionen der einzelnen
Absorptionsmaxima bei 280 nm wurden vereinigt und bei 3‘800·g auf ein Volumen von 100300 µL konzentriert (Amicon Ultra-15, Millipore oder Vivaspin 20, Sartorius, 100 kDa
MWCO; 4‘595 Upm, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804 R, Eppendorf). Nach Bestimmung
der NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und der Proteinkonzentration wurde die
Präparation aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren
Verwendung bei -80°C gelagert.
3.4.5 Gelfiltration
Um die Homogenität der Komplex I Präparationen zu überprüfen und um den Komplex
gegebenenfalls von teilassemblierten Fragmenten zu trennen, wurden 1-1.5 mg Protein in
300 µL A*DM-Puffer auf eine in A*DM äquilibrierte 24 mL GrößenausschlussChromatographiesäule (Superose 6 10/300 GL, GE Healthcare) aufgetragen und bei einer
Flussrate von 0.5 mL/min eluiert. Es wurden Fraktionen zu je 1 mL gesammelt. Zu
analytischen Zwecken wurden 100-200 µg Protein in 100 µL A*DM-Puffer auf eine Yarra
SEC-4000 Größenausschluss-Chromatographiesäule (Phenomenex) aufgetragen und bei einer
Flussrate von 1 mL/min eluiert.
63
3. Material & Methoden
3.4.6 Zuckergradientenzentrifugation
Für die analytische Zuckergradientenzentrifugation wurden 12 mL Gradienten von 5-30%
Saccharose in A*DM-Puffer vorbereitet. Wie oben beschrieben wurden die cytoplasmatischen
Membranen aus 5-7 g Zellen isoliert und die Membranproteine solubilisiert. Lipide und
andere nicht gelöste Bestandteile wurden durch Zentrifugation bei 150‘000·g (30 Psi, 15 min,
4°C, Beckman Airfuge) abgetrennt. Es wurden jeweils 300-500 µL geklärter Detergenzextrakt
auf einen Zuckergradienten aufgetragen und dieser bei 160‘000·g für 16 h zentrifugiert
(36‘000 Upm, 4°C, Rotor SW41, Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman Coulter). Die
Saccharosegradienten wurden in 600 µL Fraktionen aliquotiert und bis zur weiteren
Verwendung auf Eis gelagert.
3.4.7 Proteinbestimmung
Biuret-Methode: Der Proteingehalt der während der Präparation abgenommenen Proben
wurde mit der Biuret-Methode (Gornall et al., 1949) bestimmt. 10-50 µL Proteinlösung
wurden mit 1 mL 6%iger (w/v) Trichloressigsäure versetzt und bei 16‘100·g und
Raumtemperatur (13‘200 Upm, 1 min, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D, Eppendorf)
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment wurde in 1 mL BiuretLösung durch Schütteln (1‘400 Upm, 25-30°C, 30 min, Thermomixer compact, Eppendorf)
gelöst. Die Absorbanz der Lösung bei 546 nm wurde gemessen (Ultrospec 1100 pro,
Amersham Biosciences), wobei eine Probe ohne Protein analog behandelt und als Referenz
verwendet wurde. Zur Korrektur der Streuung durch Lipide und Detergenzien wurde die
Lösung durch Zugabe einiger Körnchen KCN entfärbt und die Absorbanz bei 546 nm erneut
gemessen. Aus der Differenz der Absorbanz wurde durch Abgleich mit einer Eichgeraden der
Proteingehalt der jeweiligen Probe ermittelt. Jede Probe wurde dreifach bestimmt; die
Eichgerade wurde mit elf Proben von 0-1 mg BSA erstellt.
UV-spektroskopische Methode: Die Konzentration des isolierten Komplex I wurde durch
Messung der Absorbanz bei 280 nm bestimmt (Quarzküvette QS 1.000, Hellma; TIDAS II,
J&M), wobei als Referenz der Puffer verwendet wurde. Zur Korrektur der Lichtstreuung
wurde von diesem Wert die Absorbanz bei 310 nm abgezogen. Zur Berechnung der
Proteinkonzentration
nach
dem
Lambert-Beerschen
Gesetz
wurden
der
molare
64
3. Material & Methoden
Extinktionskoeffizient ε280
nm
= 781 mM-1 cm-1 und die aus der Aminosäuresequenz des
Komplex I abgeleitete molare Masse von Mr = 535 kDa verwendet (Gill & von Hippel, 1989).
3.4.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Zusammensetzung und die Reinheit der Präparationen wurden mittels SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Schägger & von Jagow (1987)
analysiert. Hierfür wurde ein diskontinuierliches Gelsystem mit 3.9%igem Sammelgel und
10%igem Trenngel verwendet. 50 µg Protein wurden mit Probenpuffer versetzt, durch
Schütteln bei 30°C denaturiert (750 Upm, 20 min, Thermomixer compact, Eppendorf) und auf
das Gel aufgetragen. Die Proteine wurden bei einer konstanten Stromstärke von 45 mA (EPS
601, Amersham Pharmacia) elektrophoretisch aufgetrennt, bis die Farbstoffbande das Gel
verlassen hatte. Zur Färbung der Proteinbanden wurde das Gel in Coomassie-Färbelösung
gelegt, anschließend wurden die Banden durch Entfärben des Hintergrundes mit
Entfärbelösung sichtbar gemacht.
Hydrophobe Proteine, die sich mit Coomassie nur schlecht anfärben lassen, wurden mit
kolloidalem Silber gefärbt (Bartsch et al., 2012). Hierzu wurde das Gel nach der
Elektrophorese über Nacht in Entfärbelösung fixiert und anschließend dreimal für je 15 min
mit 30%igem Ethanol gewaschen. Das Gel wurde für 1 min mit einer 0.02%igen
Natriumthiosulfat-Lösung sensibilisiert, zweimal für je 30 sec mit ddH2O gewaschen und für
25 min in Silberlösung imprägniert. Nach zwei weiteren Waschschritten mit ddH2O für je
20 sec wurde der Entwickler zugegeben. Nach Anfärbung der Banden wurde die Reaktion
durch Zugabe von 100%iger Essigsäure gestoppt. Alle Schritte wurden auf einem
Kippschüttler (Eigenbau) durchgeführt.
Gefärbte Gele wurden mit einer Kamera (PowerShot S3 IS, Canon) oder einem
Geldokumentationssystem (AlphaImager Mini, Biozym oder GelDocXR+, BioRad)
dokumentiert.
3.4.9 Rekonstitution in Liposomen
Zur Rekonstitution von Komplex I in Proteoliposomen wurden 100 µg bzw. 200 µg Protein
im Verhältnis von 1:6 (w/w) mit E. coli polaren Lipiden (E. coli polar lipid extract, Avanti;
65
3. Material & Methoden
20 mg/mL in Lipidpuffer) versetzt und mit ACMA-Puffer auf 80 µL bzw. 160 µL aufgefüllt.
Die Lösung wurde zu einem achtfachen Überschuss an Biobeads bezogen auf die
Detergenzbindekapazität (105 µg DDM/mg Biobeads; Rigaud et al., 1997) gegeben, die zuvor
mit Methanol aktiviert und mit ddH2O gewaschen wurden, und für 3 h vorsichtig auf Eis
gerührt (Stolpe & Friedrich, 2004). Zur Berechnung der Gesamtmenge an DDM wurde das in
den Puffern gelöste und das proteingebundene DDM berücksichtigt, wobei davon
ausgegangen wurde, dass 0.5 µg DDM pro µg Komplex I gebunden sind (Böttcher et al.,
2002). Die Lösung wurde mit einer Pipette von den Biobeads abgenommen und bis zur
weiteren Verwendung auf Eis gelagert.
Im Laufe der Arbeit wurde die Methode zur Herstellung von Proteoliposomen angepasst, um
eine bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen. Nach dem modifizierten
Protokoll wurden 75 µg Protein im Verhältnis von 1:45 mit E. coli polaren Lipiden (E. coli
polar lipid extract, Avanti; 20 mg/mL in Lipidpuffer) versetzt und mit Na+-Puffer auf 450 µL
aufgefüllt. Je 150 µL dieses Ansatzes wurden zu 100 mg aktivierten Biobeads gegeben und
für 3 h langsam auf Eis gerührt. Die Lösung wurde von den Biobeads abgenommen, der
gesamte Ansatz wurde vereinigt und zur Abtrennung von Biobead-Resten bei 20‘800·g
zentrifugiert (5 min, 14‘000 Upm, 4°C, Rotor F45-30-11, Centrifuge 5417R, Eppendorf). Zur
Erzeugung von Proteoliposomen einheitlicher Größe wurde der Überstand mit einem Extruder
(Avanti) 49-mal über eine Membran mit einer Porengröße von 100 nm (PC Membran, Avanti)
passiert.
3.4.10 Aktivitätsmessungen
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität:
Die
artifizielle
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität wurde über die zeitliche Abnahme der [Fe(CN)6]3--Konzentration
spektroskopisch bestimmt. Zur Messung wurde 1 mL K3[Fe(CN)6]-Lösung (1 mM in APuffer) mit 200 µM NADH versetzt und die Reaktion durch Zugabe von 3-10 µL
Proteinlösung gestartet. Die Abnahme der Absorbanz bei 410 nm wurde verfolgt (d=1 cm,
Halbmikroküvetten; Ultrospec 1000 pro bzw. 1100 pro, Amsersham Biosciences) und mit
einem Schreiber aufgezeichnet. Zur Berechnung der Aktivität gemäß des Lambert-Beerschen
Gesetzes wurde ein molarer Extinktionskoeffizient des Ferricyanids von ε410 nm = 1 mM-1cm-1
verwendet (Friedrich et al., 1989).
66
3. Material & Methoden
NADH Oxidase-Aktivität: Die NADH Oxidase-Aktivität cytoplasmatischer Membranen
wurde mit einer Clarke-Sauerstoffelektrode (RE K1-1, Oxytec) bei 30°C gemessen und über
einen angeschlossenen Schreiber (561 Recorder, Perkin Elmer) dokumentiert. Es wurden
5 µL Membransuspension in 2 mL A-Puffer vorgelegt und die Grundlinie wurde für 1 min
aufgezeichnet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µL 0.5 M NADH (Endkonzentration
1.25 mM) gestartet. Nach 2-3 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 2.5-75 µM
Piericidin A (Stammlösung: 10 mM in EtOH) gehemmt. Zur Berechnung der Aktivität wurde
eine Sauerstoffkonzentration von 237 µM im Puffer angenommen (Weiss, 1970). Die
Messung wurde durch Zugabe einer Spatelspitze Natriumthiosulfat geeicht, wobei davon
ausgegangen wurde, dass durch die Zugabe von Thiosulfat ein Zustand vollkommener Anoxie
eingestellt wurde. Die Differenz des Signals vor und nach der Zugabe entspricht demnach
einer Konzentration von 237 µM Sauerstoff.
NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität: Die physiologische Elektronentransferrate
des Komplex I wurde über die zeitliche Abnahme der NADH-Konzentration spektroskopisch
bestimmt. Zur Messung wurde Komplex I im Verhältnis von 1:1 (w/w) mit E. coli polaren
Lipiden (E. coli polar lipid extract, Avanti; 10 mg/mL in Lipidpuffer) versetzt oder in
Liposomen rekonstituiert. Es wurden 3-7 µg Komplex I in A*-Puffer oder ACMA-Puffer
(30°C) vorgelegt, mit 60 µM Decyl-Ubichinon (Stammlösung: 20 mM in EtOH) versetzt und
für 1 min inkubiert. Nach Zugabe von 150 µM NADH wurde die Abnahme der Absorbanz bei
340 nm spektroskopisch verfolgt (d=1 cm, QS 1.000, Hellma; TIDAS II, J&M). Zur
Berechnung der Aktivität gemäß des Lambert-Beerschen Gesetzes wurde ein molarer
Extinktionskoeffizient des NADH von ε340 nm = 6.178 mM-1cm-1 verwendet (Kalckar, 1969).
Protonentranslokationsaktivität: Die Protonentranslokationsaktivität des Komplex I wurde
fluoreszenzspektroskopisch bestimmt (Huang et al., 1983). Zur Messung wurde Komplex I
wie beschrieben in Liposomen rekonstituiert. Es wurden 970 µL ACMA-Puffer (25°C)
vorgelegt, mit 5 µL Liposomen entsprechend einer Proteinmenge von 6.25 µg, 3 µL DecylUbichinon (20 mM in EtOH, Endkonzentration 60 µM) und 8 µL ACMA (25 µM in EtOH,
Endkonzentration: 0.2 µM) versetzt und für 1-3 min inkubiert, bis die Fluoreszenzemission
bei
480
nm
konstant
blieb
(d=1 cm,
Makro-Küvetten
Spezial
PS,
Ratiolab;
Anregungswellenlänge 430 nm, Spaltbreiten 2.5 nm, LS 55 Fluorescence Spectrometer,
67
3. Material & Methoden
Perkin Elmer). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 µM NADH gestartet und der
Aufbau eines Protonengradienten als Abnahme der Fluoreszenzemission verfolgt. Bei
Verwendung von Proteoliposomen mit einem Protein:Lipid-Verhältnis von 1:45 wurden
12 µL Liposomen entsprechend einer Proteinmenge von 2 µg eingesetzt. Bei Bedarf wurde
der Protonengradient durch Zugabe von 100 µM CCCP (Stammlösung: 10 mM in EtOH)
dissipiert bzw. die Reaktion durch Zugabe von 100 µM Piericidin A (Stammlösung: 10 mM
in EtOH) vor der Messung inhibiert.
3.4.11 TMR-Markierung
Zur Markierung von Cysteinvarianten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin
(TMR) wurden jeweils 50 µg Komplex I mit A*DM-Puffer auf 20 µL aufgefüllt. Der Komplex
wurde im oxidierten und im reduzierten Zustand markiert. Um Proben zu reduzieren, wurden
sie mit einem Tropfen Paraffinöl überschichtet und mit 0.4 µL NADH (1 M,
Endkonzentration: 20 mM) versetzt. Alle Ansätze wurden mit 0.7 µL TMR-Maleimid (74 µM
in A*DM, Endkonzentration: 2.6 µM) versetzt. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit des
Fluoreszenzfarbstoffes wurde ab hier im Dunklen gearbeitet. Die Ansätze wurden 20 min auf
Eis inkubiert, mit 5 µL Dithiothreitol (DTT; 40 mM, Endkonzentration: 8 mM) versetzt und
weitere 5 min inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze mit Probenpuffer versetzt, durch
Schütteln bei 30°C denaturiert (750 Upm, 20 min, Thermomixer compact, Eppendorf) und
mittels SDS-PAGE analysiert. Die Gele wurden unter UV-Licht (Transluminator-312 nm, IL200 M oder GelDocXR+, BioRad) dokumentiert, die Fluoreszenzintensität der einzelnen
Banden wurde mit Hilfe eines Geldokumentationssystems (GelDocXR+, BioRad)
quantifiziert.
3.4.12 MTSL-Markierung
Für EPR-spektroskopische Untersuchungen wurden Cysteinvarianten mit der Spinsonde
(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl)-methanthiosulfonat
(MTSL)
markiert.
Hierzu wurden 1-3 mg Komplex I in 20 µL A*DM-Puffer mit 0.28-0.84 µL MTSL (20 mM in
DMSO, 3 Äquivalente) versetzt. Der Ansatz wurde 20 min auf Eis inkubiert und dann dreibis fünfmal mit je 2-3 mL A*DM-Puffer verdünnt und bei 3‘800·g aufkonzentriert (Amicon
Ultra-15, Millipore, 100 kDa MWCO; 4‘595 Upm, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804 R,
68
3. Material & Methoden
Eppendorf), um überschüssiges Kopplungsreagenz zu entfernen. Im letzten Schritt wurde die
Probe auf ein Volumen von 100-120 µL konzentriert.
3.4.13 EPR-Spektroskopie
EPR-Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Katerina Dörner, Eva-Maria Burger und
Prof. Dr. Thorsten Friedrich, Institut für Biochemie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg,
durchgeführt. Es wurden jeweils 20 µL MTSL-markierter Komplex I in eine Glaskapillare
(Einmal-Mikropipetten Typ Sahli, Brand) überführt, die anschließend mit Modelliermasse
(FIMO, Staedtler) verschlossen wurde. Sollten Spektren im reduzierten Zustand des
Komplexes aufgenommen werden, so wurde die Probe zuvor mit 0.0044 µL NADH pro µg
Protein (1 M; 2350-facher Überschuss) versetzt. Die Spektren wurden mit einem X-Band
Spektrometer (EMX 1/6, Bruker) bei Raumtemperatur aufgenommen.
3.4.14 Fluoreszenzspektroskopie
Fluoreszenzmessungen wurden mit einem LS 45 Fluorescence Spectrometer (10 nm
Spaltbreite, Perkin Elmer) durchgeführt. Es wurden je 100 µL von ZuckergradientenFraktionen fluoreszenzmarkierter Proteine mit Fluoreszenzpuffer auf ein Endvolumen von
2 mL aufgefüllt. Die Fluoreszenz von YFP wurde bei einer Anregungswellenlänge von
514 nm und einer Emissionswellenlänge von 527 nm gemessen, die Fluoreszenz von
mCerulean bei einer Anregungswellenlänge von 430 nm und einer Emissionswellenlänge von
475 nm.
3.4.15 Massenspektrometrie
Zur massenspektrometrischen Analyse gelelektrophoretisch aufgetrennter Polypeptide wurde
das Gel zum Zentrum für Biosystemanalyse (ZBSA), Freiburg, geschickt. Dort wurden die
Banden aus dem Gel ausgeschnitten und mit Trypsin bzw. Thermolysin verdaut. Alternativ
wurde die Proteinlösung ohne gelelektrophoretische Auftrennung der Peptide mit dem
jeweiligen Enzym behandelt. Die Proben wurden von Stephanie Lamer, Dr. Andreas
Schlosser, Sarah Eitel oder Dr. Sebastian Wiese mit einem Q-TOF Massenspektrometer
(Agilent 6520, Agilent Technologies) analysiert.
69
3. Material & Methoden
3.5 Mikroskopische Methoden
3.5.1 In vivo Fluoreszenzmikroskopie
In vivo Untersuchungen zur Lokalisation der fluoreszenzmarkierten Proteine wurden im
Arbeitskreis von Prof. Dr. Peter Graumann, Institut für Biologie II - Mikrobiologie, AlbertLudwigs-Universität, Freiburg, in Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und Dr. Felix
Dempwolff durchgeführt.
Die Zellen für die Mikroskopie wurden wie beschrieben in S750-Medium kultiviert. Jeweils
3 μL einer Probe wurden auf einen mit 1% (w/v) Agarose in S750-Medium beschichteten
Objektträger gegeben, um die Zellen zu immobilisieren. Die Probe wurde mit einem Deckglas
abgedeckt. Für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen wurde ein Zeiss Observer Z1 mit
einem 1.45 NA Objektiv und einer Photometrix Cascade CCD Kamera verwendet. Die
Epifluoreszenz wurde mit einer Xenon-Hg-Lampe angeregt. Für Aufnahmen mit dem blauen
Fluorophor mCerulean wurde ein Filtersatz mit einem Anregungswellenlängenbereich (λEx)
von 411-461 nm und einem Emissionswellenlängenbereich (λEm) von 440-520 nm verwendet.
Für Aufnahmen mit dem gelben Fluorophor YFP wurde ein Filtersatz mit λEx = 474-525 nm
und λEm = 505-565 nm eingesetzt.
3.5.2 In vivo FRET-Messungen
Wechselwirkungen zwischen fluoreszenzmarkierten Proteinen in lebenden Zellen wurden im
Arbeitskreis von Prof. Dr. Victor Sourjik, Zentrum für Molekulare Biologie, Ruprecht-KarlsUniversität Heidelberg, in Zusammenarbeit mit Dr. Karin Grosse und Dr. Heiko Erhardt
untersucht.
Der verwendete E. coli Stamm BW25113 Δnuo cadA-yfp enthält eine chromosomal codierte
Fusion der Lysin Decarboxylase mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP, das bei den
Messungen als Akzeptorfluorophor diente. Der mit dem Donorfluorophor mCerulean
fusionierte Komplex I bzw. die ΔNuoL-Variante des Komplexes wurden vom jeweiligen
Expressionsplasmid überproduziert. Die Zellen für die in vivo FRET-Messungen wurden wie
beschrieben in PB-Medium kultiviert und gewaschen. Ein Tropfen der Zellsuspension wurde
auf einen mit 1% (w/v) Agarose in Tethering-Puffer beschichteten Objektträger gegeben und
mit einem Deckglas abgedeckt. Für die FRET-Messungen wurde ein modifiziertes Zeiss
Axiovert 200 Mikroskop verwendet. Der Anregungsstrahl (75 XBO Lampe) wurde durch
70
3. Material & Methoden
einen Neutralfilter (ND60, 0.2) abgeschwächt und über einen Bandpassfilter (BP, 436/20) und
einen dichroitischen Spiegel (495DCSP) mit Hilfe eines Strahlteilers (Z440/532,
Transmission 465-500 und 550-640 nm, Reflektion 425-445 und 532 nm) auf die Probe
reflektiert. Die Fluoreszenzemission von mCerulean und YFP wurde bis zur Signalstabilität
für ca. 3-5 min aufgezeichnet. Dann wurde das Akzeptorfluorophor YFP mit einem
Diodenlaser (20 sec, 532 nm, Rapp OptoElectronic, Hamburg) ausgebleicht, der mit einem
dichroitischen Spiegel (495DCSP) in den Lichtweg gelenkt wurde. Das Blickfeld wurde mit
einer Aperturblende begrenzt. Die vom Blickfeld ausgehende Emission wurde durch einen
Bandpassfilter (BP, BP 485/40) auf einen Photomultiplier (Hamamatsu H7421-40;
Hamamatsu, Bridgewater, NJ) geleitet. Pro Messpunkt wurde die Anzahl der emittierten
Photonen über einen Zeitraum von 0.5 sec mit Hilfe eines Zählers (PCI-6034E Board,
gesteuert durch eine individuell programmierte LabView 7.1 Anwendung, National
Instruments, Austin, TX) ermittelt. Die FRET-Effizienz wurde über das Verhältnis der
Fluoreszenzemission des Donorfluorophors mCerulean vor und nach dem Ausbleichen des
Akzeptorfluorophors YFP berechnet (Sourjik et al., 2007).
3.5.3 Elektronenmikroskopie
Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und
Prof. Dr. Bettina Böttcher in deren Labor an der University of Edinburgh, Schottland,
angefertigt.
Die Proteinlösung wurde mit A*DM-Puffer auf eine Konzentration von 5-20 µg/mL verdünnt.
Von dieser Lösung wurden 4 µL auf ein mit Kohlefilm beschichtetes Kupfernetz aufgetragen
und 1 min inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit mit einem Stück Filterpapier
abgenommen und das Kupfernetz dreimal in je einem Tropfen Wasser und dann dreimal in je
einem Tropfen Uranylacetat (2%, w/v) gewaschen. Zur Negativfärbung wurde ein Tropfen
Uranylacetat auf das Kupfernetz mit dem aufgetragenen Protein gegeben und 5 min inkubiert.
Die Lösung wurde mit Filterpapier abgenommen und das Kupfernetz an Luft getrocknet.
Für die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurde ein FEI F20 Elektronenmikroskop
(200 kV Beschleunigungsspannung, Feldemissionskathode), ausgestattet mit einer 8K x 8K
CMOS Kamera, verwendet. Einzelne Partikel wurden mit dem Programm Boxer (Ludtke et
al., 1999) ausgewählt, zur Bildbearbeitung in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Bettina Böttcher
wurde das Programm IMAGIC (van Heel et al., 1996) verwendet.
71
4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1
Einfluss
einer
verkürzten
horizontalen
Helix
auf
die
Protonentranslokation
Die Untereinheit NuoL des Membranarms des Komplex I enthält eine ungewöhnliche
horizontale Helix. Es wird diskutiert, dass diese Helix an der Protonentranslokation durch den
Komplex I beteiligt ist. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die ΔNuoL-Variante des
Komplex I eine von 4H+/2e- auf 2H+/2e- verringerte Stöchiometrie aufweist (Steimle, 2009).
Um die Bedeutung der ungewöhnlichen horizontalen Helix HL am C-terminalen Ende von
NuoL näher zu untersuchen, sollten in der vorliegenden Arbeit Varianten dargestellt und
charakterisiert werden, denen diese Helix oder Teile davon fehlen. Es wurden drei Varianten
untersucht: Eine, bei der die horizontale Helix HL komplett vorhanden ist, aber die Cterminale transmembrane Helix (TM16) fehlt; eine, bei der etwa die Hälfte von HL sowie
TM16 deletiert ist; und eine, der die gesamte Helix HL sowie TM16 fehlt (Abb. 4.1). Dient
die horizontale Helix der Übertragung von Konformationsänderungen auf die AntiporterUntereinheiten NuoL und NuoM, dann ist die gleiche geringere H+/e- Stöchiometrie zu
erwarten wie bei der ΔNuoL-Variante, wenn die Verbindung zu der Ubichinon-Bindestelle
durch
Deletion
des
C-Terminus
von
NuoL
unterbrochen
wird.
Werden
Konformationsänderungen hingegen über den Kontakt der TM Helices von NuoL, M und N
übertragen, dann wird die Stöchiometrie durch einen verkürzten C-Terminus von NuoL nicht
notwendigerweise beeinträchtigt.
Abb. 4.1: Deletierte Bereiche von NuoL im Membranarm der Komplex I-Varianten. Die C-terminale TM
16, die in der W592Stop-Variante fehlt, ist rot markiert. Der Teil der horizontalen Helix, der in der Y544StopVariante zusätzlich deletiert wurde, ist grün, und der in der T516Stop-Variante zusätzlich deletierte Teil ist
orange hervorgehoben (Struktur nach PDB: 3RKO).
72
4. Ergebnisse
Andererseits besteht die Möglichkeit, dass HL für die Bindung von NuoL an den Komplex
benötigt wird und dass NuoL ohne diesen Anker gar nicht an den Komplex bindet oder leicht
abdissoziiert.
4.1.1 Darstellung der Mutanten
Komplex I und die Varianten wurden jeweils von dem Expressionsvektor pBADnuoHis
überproduziert, der alle 13 nuo-Gene unter Kontrolle eines Arabinose-Promotors enthält (Pohl
et al., 2007c). Das nuoF-Gen ist mit der Sequenz für ein Hexahistidin-Affinitätspeptid (His6Tag)
fusioniert,
was
die
Aufreinigung
des
überproduzierten
Komplexes
mittels
Affinitätschromatographie ermöglicht. Der Komplex I mit His6-Tag am N-Terminus von
NuoF wird im Folgenden als „Wildtyp“ bezeichnet. Der Expressionsvektor ist mit 21 kb zu
groß für die ortsgerichtete Mutagenese mit der QuikChange-Methode, da derzeit keine
kommerziell erhältliche DNA-Polymerase in der Lage ist, diesen in ausreichender Menge
vollständig und fehlerfrei zu amplifizieren.
Aus diesem Grund wurden Punktmutationen stets auf einem Subklon eingeführt und das
modifizierte
nuo-Gen
dann
durch
λ-Red-vermittelte
Rekombination
auf
den
Expressionsvektor übertragen. Zur Darstellung von Komplex I-Varianten mit verkürztem CTerminus von NuoL wurde an den Positionen T516, Y544 und W592 jeweils ein Stop-Codon
eingeführt, wobei als Subklon der Vektor pCA24N nuoL verwendet wurde. Die Mutationen
wurden über die Primer-Paare nuoL_T516Stop, nuoL_Y544Stop und nuoL_W592Stop mit
der QuikChange-Methode eingeführt. Um den Reaktionserfolg mittels Restriktionsanalyse
überprüfen zu können, wurde neben der gewünschten Punktmutation jeweils eine weitere,
stille Mutation eingeführt und so eine neue Restriktionsschnittstelle erzeugt. Die Mutationen
wurden jeweils durch Restriktionsanalyse (Abb. 4.2) sowie Sequenzierung nachgewiesen.
Das mutierte nuoL-Gen mit dem Stop-Codon an der gewünschten Position wurde jeweils
unter Verwendung der Oligonucleotide pCA_nuoL_fwd/rev von dem Subklon amplifiziert.
Durch λ-Red-vermittelte Rekombination wurde schließlich die Selektionskassette auf dem
Vektor pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB gegen das lineare Fragment mit der gewünschten
Mutation auf nuoL ausgetauscht. Die für die Rekombination benötigten homologen Bereiche
wurden bei der Amplifikation des mutierten
nuoL-Gens über die verwendeten
Oligonucleotide eingebracht. Um unerwünschte Rekombinationen mit dem Chromosom zu
vermeiden, wurde der Stamm DH5αΔnuo mit einer chromosomalen Deletion des nuo73
4. Ergebnisse
Operons verwendet. Positive Klone wurden auf YP/Sac-Agarplatten selektiert, der Austausch
der Selektionskassette wurde durch Restriktionsanalyse nachgewiesen (Abb. 4.2) und die
Insertion des mutierten nuoL-Gens durch Sequenzierung (s. Anhang) bestätigt.
Abb. 4.2: Restriktionsanalysen der Konstrukte. Oben sind die Restriktionsanalysen der Subklone pCA24N
nuoL T516Stop mit KspAI, pCA24N nuoL Y544Stop mit PsiI und pCA24N nuoL W592Stop mit NheI und
Alw44I gezeigt. Unten sind die Restriktionsanalysen der Expressionsvektoren pBADnuoHis nuoL T516Stop mit
KspAI, pBADnuoHis nuoL Y544Stop mit PsiI und pBADnuoHis nuoL W592Stop mit NheI gezeigt. Die Proben
wurden jeweils auf die rechte Spur aufgetragen und die erwarteten Fragmentgrößen sind angegeben. Zum
Vergleich wurde auf der linken Spur jeweils der λ-DNA Eco130I(StyI) Marker 16 (Fermentas) aufgetragen. Die
Länge der Markerbanden ist am linken Bildrand angegeben.
4.1.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten mit verkürztem CTerminus
Der Expressionsstamm BW25113Δnuo wurde jeweils mit einem mutierten Vektor
transformiert
und
die
entsprechende
Komplex
I-Variante
durch
Anzucht
in
Autoinduktionsmedium im 10 L-Maßstab überproduziert. Eine typische Wachstumskurve ist
74
4. Ergebnisse
in Abb. 4.3 dargestellt. Aus 10 L Medium wurden in der Regel 40-50 g, in Ausnahmefällen
bis zu 110 g Zellen erhalten. Durch die Verwendung eines Stammes mit chromosomal
deletiertem nuo-Operon wurde sichergestellt, dass die Zellen lediglich die episomal codierte
Komplex I-Variante enthielten.
6
5
OD600
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
t [min]
Abb. 4.3: Wachstumskurve des Stammes BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL Y544Stop in 10 L
Autoinduktionsmedium. Es wurden 50 g Zellen erhalten. Das Zellwachstum der anderen Stämme verlief
ähnlich.
Nach dem Zellaufschluss wurden durch differentielle Zentrifugation die cytoplasmatischen
Membranen isoliert. Aus 20-30 g Zellen wurden 3-4 g Membranen erhalten.
Membranproteine wurden mit 3% DDM solubilisiert und anschließend zur raschen
Verringerung der DDM-Konzentration über Anionenaustauschchromatographie an Fractogel
TMAE vorgereinigt. Der Komplex I eluierte bei einer Konzentration von 250 mM NaCl und
wurde anschließend über Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA isoliert. Aus 3-4 g
Membranen wurden 4-5 mg Protein erhalten. Der typische Verlauf einer Präparation ist in
Tab. 4.1 und in Abb. 4.4 dargestellt.
Die Präparation der ΔNuoL-Variante war zuvor durch eine weitere AnionenaustauschChromatographie an Source 15Q in zwei Populationen aufgetrennt worden, von denen nur
eine enzymatisch aktiv war (Steimle, 2009). Zum Vergleich und gegebenenfalls zur weiteren
Auftrennung verschiedener Proteinpopulationen wurde dieser zusätzliche Reinigungsschritt
75
800
350
a)
300
40
600
250
500
200
400
150
300
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
700
50
30
20
100
200
10
50
100
0
0
50
100
150
200
250
300
0
350
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
4. Ergebnisse
350
500
b)
450
300
60
400
250
50
350
200
300
150
250
200
100
150
50
Imidazol [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
70
40
30
20
100
0
10
50
0
50
100
150
0
250
200
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
c)
125
350
35
300
30
250
25
2
100
200
75
1
150
50
25
0
0
10
20
30
40
50
60
70
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
150
20
15
100
10
50
5
0
80
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
Volumen [mL]
Abb. 4.4: Reinigung der Komplex I-Variante NuoL T516Stop. a) zeigt das Elutionsprofil der
Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE, b) das der Affinitätschromatographie an Probond Ni2+IDA und c) das der Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q. Gezeigt sind jeweils die Absorbanz bei
280 nm in blau, die Salzkonzentration in grün und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot. In c)
ist die im Folgenden verwendete Bezeichnung von Gipfel 1 und Gipfel 2 angegeben. Die Elutionsprofile der
Präparationen der anderen Varianten sehen ähnlich aus.
76
4. Ergebnisse
Tab. 4.1: Aufreinigung der Komplex I-Variante NuoL T516Stop aus 26 g (Feuchtgewicht) Zellen des
E. coli Stammes BW25113Δnuo/pBADnuoHis nuoL T516Stop. Die Ausbeute nach den einzelnen
Reinigungsschritten ist auf die Gesamtaktivität der Membransuspension bezogen. Die Präparation der anderen
Varianten verlief ähnlich.
Reinigungsschritt
Volumen
Protein
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
64
700
1870
2.7
100
Detergenzextrakt
61
680
1510
2.2
81
Fractogel TMAE
42
110
910
8.3
49
Probond Ni -IDA
0.80
4.9
680
140
36
Source 15Q, Gipfel 1
0.32
0.70
110
150
6
Source 15Q, Gipfel 2
0.40
1.3
290
220
16
2+
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
spezifisch
Ausbeute
Abb. 4.5: SDS-PAGE der Präparationen. Der Wildtyp und die beiden Populationen der Stop-Varianten
wurden wie angegeben aufgetragen. Zur Abschätzung der Bandengrößen wurde in der vierten Bahn des linken
Gels (M) der Page Ruler Unstained Protein Ladder (Fermentas) aufgetragen, die Größe der Markerbanden ist
angegeben. Die Zuordnung der Komplex I Untereinheiten zu den Banden ist am linken Bildrand angegeben. Die
Position von NuoL bezieht sich auf den Wildtyp, in den Varianten mit verkürzter Helix ist die NuoL-Bande
entsprechend der geringeren Masse zu einem niedrigeren apparenten Molekulargewicht hin verschoben und
überschneidet sich mit NuoM (vgl. Abb. 4.6). Die hydrophobe Untereinheit NuoH (Mr = 36 kDa) ist aufgrund
ihrer schwachen Anfärbung nicht zu erkennen.
77
4. Ergebnisse
auch mit den Varianten mit verkürzter Helix HL durchgeführt. Dadurch wurde die Präparation
in zwei Populationen separiert, von denen die erste bei 150 mM NaCl und die zweite bei
200 mM NaCl eluierte (Abb. 4.4). Dieses Elutionsprofil entspricht dem der ΔNuoL-Variante,
wobei dort der frühere Gipfel enzymatische Aktivität zeigte (Steimle, 2009). Von einer
Population wurden jeweils 0.5-1.5 mg Protein erhalten.
Die SDS-PAGE (Abb 4.5) zeigt, dass im früheren Elutionsgipfel 1 jeweils alle Komplex IUntereinheiten vorhanden sind, während im späteren Gipfel 2 einige hydrophobe
Untereinheiten, darunter NuoL, M und N, fehlen. Die verkürzte Untereinheit NuoL besitzt im
Vergleich zum Wildtyp eine verringerte molekulare Masse, was sich in der SDS-PAGE in
einem schnelleren Laufverhalten niederschlägt.
Abb 4.6: Zuordnung der hydrophoben Untereinheiten NuoL, M, N und H durch massenspektrometrische
Analyse. Der Wildtyp sowie die Gipfel 1 der Präparationen der Varianten ΔNuoL und Y544Stop wurden wie
angegeben aufgetragen. Die bei den Varianten im Bereich von 25-50 kDa sichtbaren Banden wurden im
Zentrum für Biosystemanalyse, Freiburg, entsprechend der roten Markierung aus dem Gel ausgeschnitten und
massenspektrometrisch analysiert. NuoL wurde lediglich in der untersten der drei analysierten Banden der
Y544Stop-Variante nachgewiesen, es wurde ein Peptid bestehend aus den Aminosäureresten 516-528 der NuoLSequenz identifiziert. Peptide der Untereinheiten NuoM, N und H wurden jeweils in allen Banden gefunden, die
Zuordnung wurde anhand der jeweils höchsten Sequenzabdeckung getroffen. Auf der linken Seite ist die
Zuordnung der fraglichen Untereinheiten im Wildtyp angegeben. Auf der rechten Spur (M) wurde zum
Vergleich der Page Ruler Unstained Protein Ladder (Fermentas) aufgetragen, die Größe der Markerbanden ist
angegeben.
78
4. Ergebnisse
In der Probe der Y544Stop-Variante wurde die Position der NuoL-Bande auf dem Gel durch
massenspektrometrische Analyse bestätigt (Abb 4.6). Die hydrophobe Untereinheit NuoH ist
aufgrund ihrer schwachen Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue nicht in allen Proben zu
erkennen. Es wird vermutet, dass durch die verkürzte Helix die Stabilität des Membranarms
verringert ist und der Komplex aus diesem Grund teilweise zerfällt. Gipfel 1 entspricht laut
SDS-PAGE der vollständig assemblierten Variante während Gipfel 2 ein Teil des
Membranarms fehlt.
4.1.3 H+/e--Stöchiometrie der Varianten
Zur Bestimmung der H+/e--Stöchiometrie der Präparationen wurden der Komplex I und die
Varianten in Proteoliposomen rekonstituiert. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
der Proteoliposomen wurde bestimmt. Anschließend wurde zu den Proteoliposomen 2%
DDM zugegeben und die Aktivität erneut gemessen. Das Verhältnis der Aktivitäten vor und
nach dem Auflösen der Liposomen mit DDM ist ein Maß für den Anteil an Komplex I, der
nach außen orientiert ist. Auf diese Weise wurde ermittelt, dass je nach Präparation etwa 5070% des Proteins mit der NADH-Bindestelle nach außen orientiert vorliegt. Aliquots
derselben Präparation von Proteoliposomen wurden jeweils für die Bestimmung der
Elektronentransfer-
und
der
Protonentranslokationsaktivität
verwendet.
Die
Protonentranslokation wurde über die Löschung der ACMA-Fluoreszenz gemessen. Die
Fluoreszenzmessungen zeigten, dass der Gipfel 1 der Varianten Y544Stop und W592Stop
jeweils eine gegenüber dem Wildtyp verringerte Protonentranslokationsaktivität besitzt (Abb.
4.7
a).
Der
Gipfel
1
der
Präparation
der
T516Stop-Variante
zeigte
keine
Protonentranslokation, obwohl die Elektronentransferrate ähnlich war wie bei den anderen
Präparationen (Abb 4.7 a; Tab. 4.2). Gipfel 2 aller Präparationen zeigte keine Aktivität (Abb.
4.7 b), was aufgrund der fehlenden Untereinheiten zu erwarten war. Alle beobachteten
Signale waren vollständig sensitiv gegenüber dem Komplex I-spezifischen Inhibitor Piericidin
A und dem Protonophor CCCP (Abb. 4.7). Dies zeigt, dass die Signale durch einen
Protonengradienten zustande kommen und dass dieser durch die Katalyse des Komplex I
erzeugt wird. Zur Berechnung der H+/e-- Stöchiometrie wurde die Amplitude des durch die
einzelnen
Varianten
Oxidoreduktaseaktivität
erzeugten
der
Signals
jeweils
Proteoliposomen
auf
normiert.
die
NADH:Ubichinon
Hierzu
wurde
die
Fluoreszenzlöschung durch die Elektronentransferrate geteilt und der Quotient als relatives
Maß für die Stöchiometrie angesehen.
79
4. Ergebnisse
a)
b)
Abb. 4.7: Aufbau eines Protonengradienten durch den Komplex I und die Stop-Varianten nach
Rekonstitution in Proteoliposomen. a) zeigt die ACMA-Signale von Komplex I und des Gipfel 1 der
jeweiligen Stop-Variante. Es sind das Signal des Wildtyps (schwarz), der W592Stop-Variante (magenta), der
Y544Stop-Variante (cyan) und der T516Stop-Variante (orange) dargestellt. Ein Ansatz enthielt jeweils 5 µL
Liposomen mit 6.25 µg Protein, 50 µM DecQ und 0.2 µM ACMA. Nach 120-160 s wurde die Reaktion durch
Zugabe von 150 µM NADH (Pfeil) gestartet. Beim Wildtyp wurde der Protonengradient nach 250 s, bei der
Y544Stop- und der W592Stop-Variante nach 400 s durch Zugabe von 100 µM CCCP (Pfeil) dissipiert. b) zeigt
das Signal des Gipfel 2 der Y544Stop-Variante (blau), die Signale des Gipfel 2 der anderen Varianten waren
identisch. Außerdem ist das Signal von Peak 1 der Y544Stop-Variante in Gegenwart von 100 µM Piericidin A
(grün) sowie 100 µM CCCP (rot) dargestellt, die Signale, die mit dem Wildtyp und den anderen Varianten unter
diesen Bedingungen erhalten wurden, waren identisch. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze war wie in
a) angegeben, nach 100 s wurde jeweils 150 µM NADH zugegeben (Pfeil).
80
4. Ergebnisse
Durch Vergleich mit dem Wildtyp wurde, unter der Annahme, dass dieser pro 2 übertragenen
Elektronen 4 H+ pumpt, die H+/e-- Stöchiometrie der Varianten abgeschätzt. Durch die
Normierung werden gegebenenfalls unterschiedliche Anteile an intaktem oder nach außen
orientiertem Protein in den jeweils verwendeten Proteoliposomen ausgeglichen. So variiert je
nach Präparation von Proteolipsomen die Fluoreszenzlöschung durch den Wildtyp zwischen
28% und 44% bei Elektronentransferraten von 0.8-1.6 µmol min-1 mg-1, das Verhältnis der
beiden Werte ist jedoch nahezu konstant. Die Normierung auf die Elektronentransferrate und
der Vergleich mit dem Wildtyp ergaben, dass die Stöchiometrie der Varianten Y544Stop und
W592Stop auf 1.6 bzw. 1.5 H+/2 e- reduziert ist (Tab. 4.2).
Tab. 4.2: NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase- und Protonentranslokationsaktivität des Komplex I
und der Varianten nach Rekonstitution in Proteoliposomen. Es wurde jeweils der Gipfel 1 der Präparationen
der Varianten verwendet. Jeder Ansatz enthielt 5 µL Proteoliposomen mit 6.25 µg Protein und 50 µM DecQ. Die
Reaktion wurde jeweils mit 150 µM NADH gestartet. Der Quotient aus Fluoreszenzlöschung und
Elektronentransferrate wurde als relatives Maß für die H+/e--Stöchiometrie angesehen, die Stöchiometrie der
Varianten wurde durch Vergleich mit dem Wildtyp (4 H+/2 e-) abgeschätzt.
Fluoreszenz-
NADH:DecQ
Fluoreszenzlöschung /
löschung
Oxidoreduktaseaktivität
NADH:DecQ
[%]
[µmol min-1 mg-1]
Oxidoreduktaseaktivität
Komplex I Wildtyp
40 ± 5
1.5 ± 0.2
27
4
NuoL W592Stop
14 ± 2
1.3 ± 0.2
11
1.6
NuoL Y544Stop
12 ± 2
1.2 ± 0.1
10
1.5
NuoL T516Stop
0
2.0 ± 0.2
0
0
Proteoliposomen mit
H+/2e-
Da nur ganzzahlige Werte sinnvoll sind und die Messung der Protonentranslokation in der
Regel zu geringe Werte liefert, ergibt sich eine Stöchiometrie von rund 2 H+/2 e-. Dies
entspricht der Stöchiometrie, die für die ΔNuoL-Variante bestimmt wurde, und dies lässt
darauf schließen, dass die Anwesenheit der C-terminalen Helix TM16 für die Translokation
von 2 Protonen essentiell ist. Dass die ermittelten Stöchiometrien kleiner als 2 sind, könnte
daran liegen, dass die Proteoliposomen nicht vollständig protonen-dicht sind, was einen
scheinbar geringeren Gradienten zur Folge hat. Bezüglich der T516Stop-Variante wird
vermutet, dass ohne die gesamte Helix HL die Bindung von NuoL an den Rest des
Membranarms zu instabil ist und NuoL, wenn nicht bereits während der Reinigung, spätestens
während der Rekonstitution abdissoziiert. Nachdem es möglich ist, eine Population der
ΔNuoL-Variante mit halbierter Stöchiometrie zu isolieren und zu rekonstituieren, wäre dies
81
4. Ergebnisse
auch für die T516Stop-Variante zu erwarten. Weshalb von dieser Variante dennoch nur
Protein ohne Protonentranslokationsaktivität erhalten wurde, bleibt ungeklärt. Es ist möglich,
dass bei der Abdissoziation der verkürzten Untereinheit NuoL weitere Untereinheiten des
Membranarms mit abgelöst werden.
4.2 Bedeutung konservierter saurer Aminosäurereste auf der horizontalen
Helix
D542 D546
D563
Y594
Abb. 4.8: Sequenzvergleich über den Bereich der horizontalen Helix von NuoL aus verschiedenen Spezies.
Die Aminosäurereste D542, D546 und D563 sind rot hinterlegt, wobei sich die Nummerierung auf die E. coli
Sequenz bezieht. Weiterhin ist der ebenfalls in fast allen Spezies konservierte Rest Y594 blau hinterlegt. Es
wurden die NuoL Sequenzen aus den folgenden Organismen verwendet, die UniParc Identifikationsnummern
sind jeweils in Klammern angegeben: Escherichia coli (P33607), Salmonella typhi (Q8Z528), Klebsiella
pneumoniae (B5XNW4), Yersinia pestis (Q7CJ86), Pseudomonas aeruginosa (Q9I0J1), Methylococcus
capsulatus (Q608Y7), Deinococcus radiodurans (Q9RU98), Geobacter sulfurreducens (Q74G97),
Rhodothermus marinus (G2SEZ7), Myobacterium tuberculosis (O86350), Streptomyces coelicolor (Q9XAR5),
Paracoccus denitrificans (P29924), Rhodobacter capsulatus (P50939), Rickettsia prowazekii (Q9ZCG1),
Aquifex aeolicus (O67340), Bos taurus (P03920), Sus scrofa (Q9TDR1), Canis lupus (Q1HK80), Loxodonta
africana (Q9TA19), Homo sapiens (P03915), Mus musculus (P03921), Gallus gallus (P18940), Xenopus laevis
(P03922), Danio rerio (Q9MIY0), Beta vulgaris (Q9MF46), Nicotiana tabacum (Q5M9Z2), Triticum aestivum
(Q332N5), Arabidopsis thaliana (P29388), Aurelia aurita (Q06LF4), Yarrowia lipolytica (Q9B6D3), Pichia
pastoris (E1UWC6), Neurospora crassa (P05510), Drosophila melanogaster (P18932), Caenorhabditis elegans
(Q65Z29), Acyrthosiphon pisum (B7TYC0), Cooperia oncophora (Q85HP6).
82
4. Ergebnisse
Nachdem bekannt war, dass die horizontale Helix von NuoL für die Translokation von zwei
Protonen essentiell ist, wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und Prof. Dr.
Thorsten Friedrich ein Sequenzvergleich durchgeführt, um konservierte Reste der Helix zu
identifizieren, die möglicherweise für den Protonentransfer von Bedeutung sind (Abb. 4.8). Es
wurden drei Aspartat-Reste gefunden, von denen zwei, D542 und D546 (Nomenklatur nach
E. coli), in Prokaryoten konserviert sind während der dritte, D563, in allen Organismen
konserviert ist. In einigen Organismen ist das Aspartat konservativ durch Glutamat ersetzt.
Saure Reste können protoniert und deprotoniert werden und könnten daher am Transfer von
Protonen in die vermuteten Kanäle in den Antiporter-Untereinheiten beteiligt sein. Für diese
Hypothese spricht, dass sich D542 und D546 in der Nähe einer unterbrochenen TM-Helix von
NuoL befinden, während D563 in der Nähe einer unterbrochenen TM-Helix von NuoM liegt
(Abb. 4.9). Diese unterbrochenen Helices sind Teil der vorgeschlagenen Protonenkanäle. Die
konservierten Aspartat-Reste wurden jeweils gegen das ungeladene aber strukturell sehr
ähnliche Asparagin ausgetauscht. Nach der Aufreinigung der Varianten wurde der Einfluss
der Mutation auf die H+/e--Stöchiometrie untersucht. Nachdem ein Einfluss der Mutation
D563N auf die Stöchiometrie festgestellt wurde, wurde Asp563 zum Vergleich auch gegen
Glutamat, Glutamin und Alanin ausgetauscht und die entsprechenden Varianten
charakterisiert. Zu Teilen dieser Arbeiten wurde Max Willistein im Rahmen seiner BachelorArbeit angeleitet.
Abb. 4.9: Position der konservierten Aspartat-Reste auf der horizontalen Helix von NuoL. NuoL ist türkis,
NuoM gelb, NuoN rot, NuoA grau, NuoJ weiß und NuoK schwarz gefärbt. Die konservierten Reste sind pink
markiert, die unterbrochenen TM Helices von NuoL und NuoM in der Nähe der horizontalen Helix sind violett
hervorgehoben (PDB: 3RKO).
83
4. Ergebnisse
4.2.1 Darstellung der Mutanten
Der in 4.1.1 für die ortsgerichtete Mutagenese verwendete Subklon pCA24N nuoL war über
die ASKA-Bibliothek (Kitagawa et al., 2005) verfügbar. Da auf dem Vektor pBADnuoHis
nuoL::nptIsacRB das gesamte nuoL-Gen durch die Kassette ersetzt ist, hat dieses System den
Nachteil, dass die für die λ-Red-vermittelte Rekombination benötigten homologen Bereiche
stets über die Oligonucleotide eingebracht werden müssen, die zur Amplifikation des
mutierten nuoL-Gens verwendet werden. Derart lange Oligonucleotide sind kostenintensiv
und werden in der Regel nur in geringer Ausbeute erhalten. Da im weiteren Verlauf der
Arbeit eine Vielzahl von Mutationen auf nuoL eingeführt werden sollte, wurde zunächst der
Subklon pETBlue K_nuoL_M dargestellt. Dieser enthält neben dem nuoL-Gen das 3‘-Ende
von nuoK sowie einen Teil der intergenischen Region zwischen nuoL und nuoM. Dies
entspricht den Bereichen, die nuoL bzw. die Selektionskassette auf pBADnuoHis
nuoL::nptIsacRB
flankieren.
Somit
können
lineare
Fragmente
einschließlich
der
Homologiebereiche unter Verwendung der deutlich kürzeren Oligonucleotide nuoK_fwd und
nuoM_rev vom Subklon pETBlue K_nuoL_M amplifiziert werden.
Zur Darstellung des Subklons wurde Marco Janoschke im Rahmen seiner Bachelor-Arbeit
angeleitet. Ein lineares Fragment mit dem nuoL-Gen und den flankierenden Bereichen wurde
unter Verwendung der Oligonucleotide NheI_nuoK_fwd und SmaI_nuoM_rev von dem
Vektor pBADnuoHis amplifiziert. Nach Restriktion des linearen Fragments sowie des Vektors
pETBlue-1 mit NheI und SmaI wurde das lineare Fragment in den Vektor ligiert. Die korrekte
Insertion wurde durch Restriktionsanalyse mit StyI bestätigt (Abb. 4.10).
Abb. 4.10: Restriktionsanalyse des Subklons pETBlue K_nuoL_M mit StyI. Die Größe der Fragmente
(rechte Spur) ist angegeben, zum Vergleich wurde auf der linken Spur der λ-DNA Eco130I (StyI) Marker 16
(Fermentas) aufgetragen.
84
4. Ergebnisse
Abb. 4.11: Restriktionsanalysen der Konstrukte zur Einführung einer Punktmutation auf nuoL. Es sind
die Restriktionsanalysen der Subklone pETBlue K_nuoL_M D542N mit MluI, pETBlue K_nuoL_M D546N mit
Bsp1407I und NcoI, pETBlue K_nuoL_M D563E mit EcoRI und StyI und pETBlue K_nuoL_M D563A mit
Alw44I sowie des Expressionsvektors pBADnuoHis nuoL D563N mit PstI gezeigt. Die Fragmentgrößen der
Ansätze, die auf der rechten Spur aufgetragen wurden, sind jeweils angegeben, zum Vergleich wurde auf der
linken Spur jeweils der λ-DNA Eco130I (StyI) Marker 16 (Fermentas) aufgetragen. Die Größe der
Markerbanden ist auf dem Gel links oben exemplarisch angegeben. Mit den Punktmutationen D563N und
D563Q wurde die selbe stille Mutation eingefügt wie auf dem Subklon pETBlue K_nuoL_M D563E, die
Restriktionsanalyse mit EcoRI und StyI war somit identisch. Alle Expressionsvektoren wurden nach der
Rekombination mit PstI analysiert, um den Austausch der Selektionskassette gegen das mutierte nuoL-Gen
nachzuweisen. Die Restriktionsanalyse des Konstrukts pBADnuoHis nuoL D563N ist stellvertretend gezeigt, die
Bandenmuster der Restriktionen der anderen Konstrukte sahen identisch aus.
Die gewünschten Punktmutationen wurden mit der QuikChange-Methode auf dem Subklon
pETBlue K_nuoL_M unter Verwendung der Primer-Paare nuoL_D542N, nuoL_D546N,
nuoL_D563N, nuoL_D563E, nuoL_D563Q und nuoL_D563A eingeführt. Die Plasmide
85
4. Ergebnisse
wurden mittels Restriktionsanalyse charakterisiert (Abb. 4.11) und die Mutationen durch
Sequenzierung bestätigt.
Das mutierte Gen nuoL wurde jeweils unter Verwendung der Oligonucleotide nuoK_fwd und
nuoM_rev von dem Subklon amplifiziert. Durch λ-Red-vermittelte Rekombination wurde
schließlich die Selektionskassette auf dem Vektor pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB gegen das
lineare Fragment mit der gewünschten Mutation auf nuoL ausgetauscht. Der Austausch der
Selektionskassette wurde durch Restriktionsanalyse mit PstI nachgewiesen (Abb. 4.11) und
die Insertion des mutierten Gens nuoL durch Sequenzierung (s. Anhang) bestätigt.
4.2.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten mit mutierten AspartatResten auf HL
Wie die Varianten mit verkürzter Helix HL wurden die Varianten mit den Punktmutationen
auf HL im Expressionsstamm BW25113Δnuo überproduziert. Eine typische Wachstumskurve
ist in Abb. 4.12 dargestellt. Aus 10 L Medium wurden 30-65 g Zellen erhalten. Zur
Präparation der cytoplasmatischen Membranen wurden 25-35 g Zellen eingesetzt und 4-7 g
Membranen erhalten.
3
OD600
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit [min]
Abb. 4.12: Wachstumskurve des Stammes BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL D546N in 10 L
Autoinduktionsmedium. Es wurden 65 g Zellen erhalten. Das Zellwachstum der anderen Stämme verlief
ähnlich.
86
4. Ergebnisse
Tab. 4.3: Aufreinigung der Komplex I-Variante NuoL D563N aus 28 g (Feuchtgewicht) Zellen des E. coli
Stammes BW25113Δnuo/pBADnuoHis nuoL D563N. Die Präparation der anderen Varianten verlief ähnlich.
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
spezifisch
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
63
430
2770
6.4
100
Detergenzextrakt
61
280
2560
9.2
92
Fractogel TMAE
59
27
890
33
32
Probond Ni2+-IDA
0.2
2.4
310
130
11
350
a)
3000
100
2500
80
250
2000
200
1500
150
1000
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
300
100
500
60
40
50
0
0
0
50
100
150
200
20
250
Volumen [mL]
90
80
400
250
200
300
150
200
100
100
50
70
Imidazol [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
500
b)
300
60
50
40
30
20
10
0
0
0
50
100
Ausbeute
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität /
-1
-1
µmol min mL
Volumen
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität /
-1
-1
µmol min mL
Reinigungsschritt
150
Volumen [mL]
Abb. 4.13: Reinigung der Komplex I-Variante NuoL D563N. a) zeigt das Elutionsprofil der
Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE und b) das der Affinitätschromatographie an Probond
Ni2+-IDA. Gezeigt sind jeweils die Absorbanz bei 280 nm in blau, die Salzkonzentration in grün und die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot. Die Elutionsprofile der Präparationen der anderen Varianten
sehen ähnlich aus.
87
4. Ergebnisse
Nach Extraktion der Membranproteine mit 3% DDM wurden über AnionenaustauschChromatographie an Fractogel TMAE und Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA
2-5 mg Protein erhalten. Der typische Verlauf einer Präparation ist in Tab. 4.3 und in Abb.
4.13 dargestellt. Mittels SDS-PAGE wurden alle Komplex I Untereinheiten anhand ihrer
apparenten molekularen Masse in den Präparationen nachgewiesen (Abb. 4.14).
D542N
D563N
D546N
D563E
D563Q
D563A
NuoGNuoCDNuoFNuoL/NNuoM-NuoH
NuoB/INuoE/JNuoANuoK-
Abb. 4.14: SDS-PAGE der Präparationen der Varianten mit Punktmutation auf HL. Die AspartatVarianten wurden wie angegeben auf die einzelnen Bahnen aufgetragen. Die Zuordnung der Komplex I
Untereinheiten zu den Banden ist angegeben. NuoH wird durch Coomassie Brilliant Blue aufgrund seiner
Hydrophobizität nur schwach gefärbt und ist daher in einigen Spuren nicht sichtbar.
4.2.3 H+/e--Stöchiometrie der Varianten
Zur Bestimmung der H+/e--Stöchiometrie wurden der Komplex I und die Varianten in
Proteoliposomen rekonstituiert. Wie bei den Varianten mit verkürzter Helix HL wurde auch
hier der Anteil an nach außen orientiertem Komplex I zu 50-70% bestimmt. Aliquots
derselben Präparation von Proteoliposomen wurden jeweils für die Bestimmung der
Elektronentransfer-
und
der
Protonentranslokationsaktivität
verwendet.
Die
Protonentranslokation wurde über die Löschung der ACMA-Fluoreszenz gemessen (Abb.
4.15) und jeweils auf die NADH:Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität normiert (Tab. 4.4).
88
4. Ergebnisse
Tab. 4.4: NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase- und Protonentranslokationsaktivität des Komplex I
und der Varianten mit Punktmutation nach Rekonstitution in Proteoliposomen. Jeder Ansatz enthielt 5 µL
Proteoliposomen mit 6.25 µg Protein und 50 µM DecQ. Die Reaktion wurde jeweils mit 150 µM NADH
gestartet. Der Quotient aus Fluoreszenzlöschung und Elektronentransferrate wurde als relatives Maß für die H+/e-Stöchiometrie angesehen, die Stöchiometrie der Varianten wurde durch Vergleich mit der des Wildtyps
abgeschätzt.
Fluoreszenz-
NADH:DecQ
Fluoreszenzlöschung /
löschung
Oxidoreduktaseaktivität
NADH:DecQ
[%]
[µmol min-1 mg-1]
Oxidoreduktaseaktivität
Komplex I Wildtyp
39 ± 5
1.6 ± 0.2
24
4
NuoL D542N
30 ± 5
1.3 ± 0.2
23
3.8
NuoL D546N
35 ± 5
1.5 ± 0.2
23
3.8
NuoL D563N
19 ± 4
1.2 ± 0.2
16
2.7
NuoL D563E
29 ± 5
1.7 ± 0.3
17
2.8
NuoL D563Q
22 ± 3
1.3 ± 0.2
17
2.8
NuoL D563A
32 ± 4
1.9 ± 0.3
17
2.8
Proteoliposomen mit
NADH
NADH
a)
b)
100
Fluoreszenzemission [%]
100
Fluoreszenzemission [%]
H+/2e-
90
80
70
95
90
85
80
75
60
0
50
100
Zeit [s]
150
200
0
100
200
300
400
500
Zeit [s]
Abb. 4.15: Protonentranslokationsaktivität der Aspartat-Varianten. a) zeigt die ACMA-Signale des
Wildtyps (schwarz) und der Varianten D542N (violett), D546N (pink) und D563N (blau); b) zeigt die Signale
der Varianten D563E (rot), D563Q (grün) und D563A (gelb) im Vergleich zur D563N Variante (blau). Alle
Signale waren vollständig sensitiv gegenüber Piericidin A (türkis) und CCCP (orange), die entsprechenden
Kurven der D563N Variante sind in a) exemplarisch dargestellt. Alle Ansätze enthielten Liposomen mit 6.25 µg
Protein, 50 µM Decyl-Ubichinon und 0.2 µM ACMA. Der Zeitpunkt der Zugabe von 150 µM NADH ist mit
einem Pfeil angedeutet. Die Messungen wurden jeweils abgebrochen wenn der Scheitelpunkt der Kurve erreicht
bzw. überschritten war.
89
4. Ergebnisse
Auch bei diesen Messungen waren alle Signale vollständig sensitiv gegenüber Piericidin A
und CCCP (Abb. 4.15). Der Vergleich mit dem Wildtyp zeigt, dass die Stöchiometrie der
Varianten D563N, D563E, D563Q und D563A auf rund 3 H+/2 e- reduziert ist. Hierbei sehen
die Signale der Varianten D563N, D563E und D563A sehr ähnlich aus, während das Signal
der D563Q Variante sowohl eine flachere Anfangssteigung als auch eine geringere maximale
Fluoreszenzlöschung zeigt. Dies geht jedoch mit einer im gleichen Verhältnis verringerten
Elektronentransferrate einher, was letztlich zur gleichen Stöchiometrie führt. Somit ist
Asp563 essentiell für die Translokation von einem der vier Protonen, die von Komplex I pro
oxidiertem NADH über die Membran gepumpt werden. Die Varianten D542N und D546N
weisen hingegen die gleiche Stöchiometrie auf wie der Wildtyp. Dies zeigt, dass diese
Positionen nicht essentiell für die Protonentranslokation sind.
4.2.4 Die Bedeutung des konservierten Restes Tyr594 der Untereinheit NuoL
Der Sequenzvergleich (Abb. 4.8) zeigt, dass neben den sauren Resten D542, D546 und D563
auch der Tyrosinrest 594 in den meisten Spezies, sowohl prokaryotischen als auch
eukaryotischen, konserviert ist.
Abb. 4.16: Ausschnitt aus der Struktur des Membranarms des E. coli Komplex I (PDB: 3RKO). Gezeigt
sind die horizontale Helix und TM 16 von NuoL in türkis und die benachbarte Untereinheit NuoN in rot. Die
weiteren Untereinheiten NuoA, J und K sind blau, weiß und schwarz dargestellt. Das konservierte Tyr594 auf
NuoL ist gelb hervorgehoben, Asp229 auf NuoN ist blau gefärbt. Die Wasserstoffbrücke zwischen den beiden
Resten ist durch eine pinke Linie angedeutet.
90
4. Ergebnisse
Dieser Rest ist Teil der C-terminalen Helix TM16 von NuoL und bildet eine
Wasserstoffbrücke zu D229 der benachbarten Untereinheit NuoN aus (Abb. 4.16). Um zu
überprüfen, ob diese H-Brücke für die Verankerung des C-terminalen Endes von NuoL im
Membranarm essentiell ist, wurde das Tyrosin gegen ein Phenylalanin ausgetauscht und der
Einfluss der Mutation und der damit verbundenen Deletion der H-Brücke auf die H+/e-Stöchiometrie untersucht. Die Mutation wurde analog zu den übrigen Punktmutationen unter
Verwendung des Primer-Paares nuoL_Y594F_fwd/rev auf dem Subklon pETBlue
K_nuoL_M eingeführt und mittels Restriktionsanalyse (Abb. 4.17 a) sowie Sequenzierung (s.
Anhang) verifiziert.
a)
b)
Fluoreszenzemission [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
0
200
400
600
800
1000
Zeit [s]
Abb. 4.17: Restriktionsanalyse des Subklons pETBlue K_nuoL_M Y594F und Aufbau eines
Protonengradienten durch die Y594F-Variante. a) zeigt das Bandenmuster der Restriktionsanalyse des
Konstrukts mit TaqI (linke Spur). Zum Vergleich wurde auf der rechten Spur der λ-DNA Eco130I (StyI) Marker
16 (Fermentas) aufgetragen. Die Größe aller Fragmente des Konstrukts sowie die der relevanten Markerbanden
ist angegeben. b) zeigt die ACMA-Signale von Proteoliposomen mit jeweils 6.25 µg des Wildtyps (schwarz)
bzw. der Y594F-Variante (blau). Nach 180 s wurde die Reaktion durch Zugabe von 150 µM NADH gestartet.
Das mutierte Gen nuoL wurde durch λ-Red vermittelte Rekombination in den
Expressionsvektor
pBADnuoHis
nuoL::nptIsacRB
eingeführt,
der
Expressionsstamm
BW25113Δnuo damit transformiert und die Komplex I-Variante überproduziert. Das
Zellwachstum sowie die anschließende Aufreinigung der Variante verliefen wie für die
übrigen Punktvarianten beschrieben. Mittlerweile war jedoch bekannt, dass sich durch das
91
4. Ergebnisse
dreimalige Aufkonzentrieren und Verdünnen mit A*DM-Puffer am Ende der Präparation, wie
es bis zu diesem Zeitpunkt üblich war, die DDM-Konzentration von 0.1% auf etwa 1% erhöht
(M. Schulte, pers. Mitteilung). Um dies zu verhindern, wurde im Unterschied zu den oben
beschriebenen Präparationen am Ende mit A*-Puffer ohne DDM gewaschen. Nach der
Rekonstitution in Proteoliposomen zeigte die Variante eine stärkere Löschung des ACMASignals als der Wildtyp (63% gegenüber 42%; Abb. 4.17 b). Die NADH:Ubichinon
Oxidoreduktaseaktivität der Proteoliposomen mit der Variante war mit 3.2 µmol·min-1·mg-1
gegenüber dem Wildtyp (2.4 µmol·min-1·mg-1) ebenfalls erhöht. Dies lässt sich damit
erklären, dass die in den bisherigen Präparationen enthaltene hohe DDM-Konzentration die
Stabilität des Komplexes beeinträchtigt. Im Falle der Y594F-Variante wurde die hohe DDMKonzentration vermieden und somit ein größerer Anteil an intaktem Protein erhalten, was
möglicherweise einen besseren Einbau in die Vesikel und somit eine höhere spezifische
Aktivität
zur
Folge
hat.
Das
Verhältnis
der
Fluoreszenzlöschung
und
der
Elektronentransferrate stimmt jedoch bei Variante und Wildtyp im Rahmen der
Messgenauigkeit überein. Die Stöchiometrie der Y594F-Variante ist somit im Vergleich zu
der des Wildtyps unverändert und der Tyrosinrest demnach, obwohl weitestgehend
konserviert, für den Mechanismus nicht von essentieller Bedeutung.
4.3 Cystein-Scanning der horizontalen Helix
Um die Frage zu klären, ob die Redoxreaktion zu Konformationsänderungen der horizontalen
Helix führt und wie eine mögliche Bewegung der Helix aussehen könnte, wurden
Aminosäurereste der Helix individuell gegen Cysteinreste ausgetauscht (Abb. 4.18). Durch
Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff sollte die Zugänglichkeit der jeweiligen Position
im oxidierten und im reduzierten Zustand des Komplexes überprüft werden. Eine veränderte
Markierbarkeit würde auf eine Konformationsänderung zwischen den beiden Zuständen
hinweisen. Außerdem sollten die Cysteinreste mit einer Spinsonde markiert werden. Durch
EPR-Spektroskopie sollte die Beweglichkeit der Sonde an der betreffenden Position
untersucht werden, wobei eine unterschiedliche Beweglichkeit in den beiden Redoxzuständen
ebenfalls ein Hinweis auf eine konformative Änderung wäre. Zu Teilen dieser Arbeiten
wurden Dorothee Krämer und Christian Schnick im Rahmen ihrer Diplomarbeit sowie Sofia
Brander, Hannah Dawitz, Marco Janoschke, Bartlomiej Matlosz, und Franziska Nuber im
Rahmen ihrer Bachelorarbeit angeleitet.
92
4. Ergebnisse
90°
Abb. 4.18: Cysteinmutationen auf der horizontalen Helix von NuoL. Gezeigt ist der Membranarm des E. coli
Komplex I mit den Untereinheiten NuoL (türkis), NuoM (gelb), NuoN (rot), NuoA (grau), NuoJ (weiß) und
NuoK (schwarz) in der Ansicht von oben und von der Seite. Die Aminosäurereste auf der horizontalen Helix, die
gegen Cystein ausgetauscht wurden, sind farblich hervorgehoben; mit TMR markierbare Positionen sind pink
gefärbt und beschriftet, nicht markierbare Positionen sind blau gefärbt (Struktur nach PDB: 3RKO).
4.3.1 Darstellung der Mutanten
Die Punktmutationen R529C, V550C, K551C, P552C, F553C, L554C, L560C, K561C,
R562C, N566C, I571C, P572C, A573C, V574C und Y590C wurden unter Verwendung des
jeweiligen Primer-Paares (Tab. 3.5) auf dem Subklon pETBlue K_nuoL_M eingeführt. In
einigen Fällen war die Transformation des Stammes DH5α mit dem Produkt der QuikChange93
4. Ergebnisse
PCR mittels Elektroporation nicht erfolgreich; es wurde kein Wachstum von Kolonien auf
den Agarplatten beobachtet. In diesen Fällen brachte die Transformation chemisch
kompetenter XL10 Gold Kanr Zellen mittels Hitzeschock jeweils den gewünschten Erfolg.
Die Mutation wurde durch Restriktionsanalyse mit dem jeweils geeigneten Enzym
nachgewiesen und durch Sequenzierung bestätigt (s. Anhang). Das mutierte nuoL-Gen wurde
mit den Oligonucleotiden nuoK_fwd und nuoM_rev von dem Subklon amplifiziert und, wie
die in 4.2.1 beschriebenen Konstrukte, durch λ-Red-vermittelte Rekombination gegen die
Selektionskassette auf dem Vektor pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB ausgetauscht. Im Falle der
P552C-Mutante gelang dies mit zuvor eingefrorenen kompetenten Zellen des Stammes
DH5αΔnuo/pKD46.
Der
Austausch
der
Selektionskassette
wurde
jeweils
durch
Restriktionsanalyse mit PstI nachgewiesen (vgl. Abb. 4.11).
4.3.2 Überproduktion und Reinigung der Komplex I-Varianten mit eingeführtem
Cysteinrest auf der horizontalen Helix
Wie in 4.1.2 und 4.2.2 beschrieben, wurde der Expressionsstamm BW25113Δnuo mit dem
Vektor pBADnuoHis mit mutiertem nuoL transformiert. Die Mutanten wurden in
Autoinduktionsmedium kultiviert; die Extrema der Wachstumskurven sind in Abb. 4.19
dargestellt, die anderen Wachstumskurven variierten unabhängig von der jeweiligen Mutante
zwischen den gezeigten Verläufen. Aus 10 L Medium wurden 30-90 g Zellen erhalten.
5
OD600
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Zeit [min]
Abb. 4.19: Überproduktion der Cystein-Varianten. Gezeigt sind die Wachstumskurven der Stämme
BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL R562C (schwarz) und BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL V550C (rot). Es
wurden 88 g bzw. 35 g Zellen erhalten. Die Wachstumskurven der anderen Stämme variierten zwischen diesen
extremen Verläufen und lieferten OD600-Werte zwischen 2.5 und 5.
94
4. Ergebnisse
Ausgehend von 25-40 g Zellen wurden 3-8 g cytoplasmatische Membranen präpariert. Nach
Extraktion der Membranproteine mit 3% DDM wurden über AnionenaustauschChromatographie an Fractogel TMAE und Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA
2-9 mg Protein erhalten. Der typische Verlauf einer Präparation ist in Tab. 4.5 und in Abb.
4.20 dargestellt. Mittels SDS-PAGE wurden alle Komplex I Untereinheiten anhand der
350
a)
350
300
2000
300
250
250
1500
200
1000
150
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
2500
200
150
100
100
500
50
50
0
0
0
50
100
150
200
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
apparenten molekularen Masse der Banden in den Präparationen nachgewiesen (Abb. 4.21).
b)
500
500
100
400
80
400
300
300
200
200
100
100
0
0
20
40
60
80
100
120
0
140
Imidazol [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
600
60
40
20
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
Volumen [mL]
Abb 4.20: Reinigung der Komplex I-Variante NuoL R562C. a) zeigt das Elutionsprofil der
Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE und b) das der Affinitätschromatographie an Probond
Ni2+-IDA. Gezeigt sind jeweils die Absorbanz bei 280 nm in blau, die Salzkonzentration in grün und die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot. Die Elutionsprofile der Präparationen der übrigen Varianten
sehen ähnlich aus.
95
4. Ergebnisse
R529C
K551C
R562C
A573C
V574C
Y590C
D187C
I571C
-NuoG
-NuoCD
-NuoF
-NuoL/N
-NuoM
-NuoH
-NuoB/I
-NuoE/J
-NuoA/K
V550C N566C
P572C
P552C
F553C
L554C
L560C
K561C
-NuoG
-NuoCD
-NuoF
-NuoL/N
-NuoM
-NuoH
NuoB/E/
NuoI/J
NuoA/K
Abb. 4.21: SDS-PAGE der Präparationen der Cystein-Varianten. Die Komplex I-Varianten wurden wie
angegeben auf die einzelnen Bahnen aufgetragen. Die Zuordnung der Komplex I Untereinheiten zu den Banden
ist angegeben. NuoH wird durch Coomassie Brilliant Blue aufgrund seiner Hydrophobizität nur schwach gefärbt
und ist daher in einigen Proben nicht sichtbar. Aufgrund unterschiedlicher Qualität der einzelnen SDS-Gele und
unterschiedlicher Laufzeiten sind die Untereinheiten NuoB/I und NuoA/K lediglich in einigen Fällen als separate
Banden zu erkennen.
96
4. Ergebnisse
Tab. 4.5: Aufreinigung der Komplex I-Variante NuoL R562C aus 30 g Zellen (Feuchtgewicht) des E. coli
Stammes BW25113Δnuo/pBADnuoHis nuoL R562C. Die Präparation der anderen Varianten verlief ähnlich.
Unrealistische Werte wie die Zunahme der Proteinmenge von der Membransuspension zum Detergenzextrakt
oder die relativ hohe spezifische Aktivität nach der Chromatographie an Fractogel TMAE sind vermutlich auf
die Ungenauigkeit der Proteinbestimmung zurückzuführen.
Reinigungsschritt
Volumen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
Spezifisch
Ausbeute
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
64
450
6240
14
100
Detergenzextrakt
61
530
5220
9.8
83
Fractogel TMAE
49
41
4290
110
68
Probond Ni2+-IDA
0.3
4.7
440
94
8
4.3.3 Aktivität der Cystein-Varianten
Um sicherzustellen, dass keine der Punktmutationen die Funktion des Komplexes
beeinträchtigt,
wurde
jeweils
die
NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase-
und
die
Protonentranslokations-Aktivität der Varianten bestimmt und mit denen des Wildtyps
verglichen. Wie unter 4.2.4 beschrieben, wurden durch die im Laufe dieser Arbeit eingeführte
Anpassung des Reinigungsprotokolls der Präparationen höhere spezifische Aktivitäten
erhalten, als zu Beginn der Arbeit. Dies führte folgerichtig zunächst zu einer deutlich
stärkeren Fluoreszenzlöschung des ACMA-Signals im Bereich von 60% (vgl. Abb. 4.17).
Proteoliposomen können jedoch nur eine bestimmte Menge an H+ aufnehmen, da die pHDifferenz über die Membran sonst zu groß wird, als dass der Komplex I noch dagegen
arbeiten könnte. Um sicherzustellen, dass das beobachtete ACMA-Signal noch im linearen
Bereich der Messung liegt, wurden Proteoliposomen mit einem geringeren Protein:LipidVerhältnis verwendet. Ansonsten würde eine verringerte Stöchiometrie zur selben maximalen
Fluoreszenzlöschung führen. Außerdem wurde zur Auswertung nicht die maximale
Fluoreszenzlöschung, sondern deren Anfangssteigung herangezogen. Dies ermöglicht eine
exaktere Interpretation der Protonentranslokationsrate (Dr. P. Turina, Universitá di Bologna,
pers. Mitteilung) und schließt aus, dass die Ergebnisse von der H+-Aufnahmekapazität der
Liposomen anstatt von der Reaktionsrate abhängen. Die Reaktionsansätze wurden so
angepasst, dass eine lineare Auswertung der Anfangssteigung möglich war. Hierbei wurde
darauf geachtet, dass die Anfangssteigung der Fluoreszenzlöschung deutlich flacher verlief als
97
4. Ergebnisse
der Signalsprung, der stets unmittelbar bei der Zugabe von NADH zu beobachten ist. 12 µL
Liposomen mit einem Protein:Lipid-Verhältnis von 1:45 und die Zugabe von 150 µM NADH
erwiesen sich in einem 1 mL-Reaktionsansatz als dafür geeignet. Dies entspricht einer
Proteinmenge von 2 µg im Ansatz. Die Erzeugung von Proteoliposomen einheitlicher Größe
mit Hilfe des Extruders erwies sich als essentiell für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im
Rahmen des der Messung inhärenten Fehlers. Die Anfangssteigung variierte bei den meisten
Ansätzen unter diesen Bedingungen im Bereich von 10-20% Fluoreszenzlöschung pro
Minute. Auch die Signale verschiedener Präparationen von Proteoliposomen mit dem Wildtyp
bewegten sich in diesem Bereich. Eine Ausnahme stellt die Variante L560C dar, deren Signal
bei nur 2-3% Fluoreszenzlöschung pro Minute lag. Die typischen Signale einiger
ausgewählter Varianten sind in Abb. 4.22 exemplarisch dargestellt.
Fluoreszenzintensität [%]
100
95
90
85
R562C
80
F553C
Komplex I
75
50
100
150
200
250
Zeit [s]
Abb 4.22: Erzeugung eines Protonengradienten durch Komplex I und die Cystein-Varianten nach
Rekonstitution in Proteoliposomen. 12 µL Proteoliposomen mit 2 µg Protein wurden jeweils 150-175 s bei
konstanter Fluoreszenzemission in Gegenwart von 60 µM Decyl-Ubichinon inkubiert, bevor die Reaktion durch
Zugabe von 150 µM NADH gestartet wurde. Die Signale der Varianten F553C und R562C sind stellvertretend
im Vergleich mit dem Signal des Wildtyps dargestellt. Die Anfangssteigung der Fluoreszenzlöschung ist jeweils
durch eine Tangente angedeutet, die Signale der anderen Varianten wiesen Anfangssteigungen in dem Bereich
zwischen den gezeigten Signalen auf.
Vor der Extrusion variierten die gemessenen Anfangssteigungen zwischen 5% und 60%
Fluoreszenzlöschung pro Minute und die Messwerte lieferten mitunter Aktivitäten der
98
4. Ergebnisse
Varianten, die deutlich über der Aktivität des Wildtyps lagen. Der Bezug zur
NADH:Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Proteoliposomen lieferte weder vor noch nach
der Extrusion verwertbare Ergebnisse, da sich für verschiedene Liposomenpräparationen
desselben Proteins unterschiedliche Werte ergaben. Offensichtlich hängen die gemessenen
Werte von den exakten Bedingungen ab, unter denen die Proteoliposomen im jeweiligen
Experiment hergestellt wurden. Zur Auswertung wurden daher lediglich die in Tab. 4.6
zusammengefassten Elektronentransferraten der Varianten, die im 1:1-Verhältnis mit polaren
Lipiden gemessen wurden, herangezogen. Außerdem wurden die ACMA-Signale der
Proteoliposomen im Vergleich mit den immer parallel als Referenz angesetzen
Proteoliposomen des Wildtyps ausgewertet.
Tab. 4.6: NADH:Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Cystein-Varianten. Zur Bestimmung der
Elektronentransferraten wurde jeweils 5 µg Protein in einem 1:1 (w/w)-Verhältnis mit E. coli polaren Lipiden
gemischt. Die Werte wurden in Gegenwart von 60 µM Decyl-Ubichinon und 150 µM NADH dreifach bestimmt.
NADH:Ubichinon
Variante
Oxidoreduktaseaktivität
NADH:Ubichinon
Variante
[µmol·min-1·mg-1]
Oxidoreduktaseaktivität
[µmol·min-1·mg-1]
Wildtyp
4.2 ± 0.4
K561C
4.1 ± 0.3
R529C
3.6 ± 0.4
R562C
3.4 ± 0.3
V550C
3.1 ± 0.4
N566C
2.9 ± 0.2
K551C
4.2 ± 0.5
I571C
3.4 ± 0.2
P552C
3.7 ± 0.4
P572C
4.7 ± 0.3
F553C
4.4 ± 0.4
A573C
4.3 ± 0.3
L554C
3.9 ± 0.5
V574C
3.6 ± 0.4
L560C
2.1 ± 0.3
Y590C
4.3 ± 0.2
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass der Messung des ACMA-Signals ein gewisser
Fehler durch die jeweils unterschiedlichen Präparationen der Liposomen anhaftet, lässt sich
feststellen, dass die H+/e--Stöchiometrie der meisten Varianten im Rahmen der
Messgenauigkeit im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert ist. Lediglich bei den Varianten
L560C und N566C kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Aktivität im Vergleich zum
Wildtyp insgesamt verringert oder die Präparation instabiler ist.
99
4. Ergebnisse
4.3.4 Fluoreszenzmarkierung der Cystein-Varianten
Die aufgereinigten Varianten wurden im oxidierten sowie im NADH-reduzierten Zustand mit
TMR-Maleimid inkubiert und die Ansätze mittels SDS-PAGE analysiert. Das Fluorogramm
zeigt eine deutliche Fluoreszenz der NuoL-Bande in den Varianten R529C, K551C, R562C,
I571C, A573C, V574C und Y590C, wobei mit Ausnahme der I571C-Variante die Intensität
jeweils bei den Proben stärker ist, die im oxidierten Zustand markiert wurden (Abb. 4.23). Die
Varianten V550C, P552C, F553C, L554C, L560C, K561C, N566C und P572C weisen in
keinem Redoxzustand eine fluoreszierende NuoL-Bande auf und sind somit offensichtlich
nicht mit TMR markierbar (Abb. 4.23). Um den Markierungsgrad der einzelnen Positionen zu
quantifizieren und um zu überprüfen, ob die unterschiedliche Markierung in den
verschiedenen Redoxzuständen auf die reduzierenden Bedingungen oder auf eine
Konformationsänderung zurückzuführen ist, wurden die Intensitäten der fluoreszierenden
Banden ermittelt und miteinander verglichen (Tab. 4.7). Als Referenz wurde die Variante
NuoCD D187C verwendet, die wie die NuoL-Varianten überproduziert und aufgereinigt
wurde. Bei dieser Variante befindet sich der eingeführte Cysteinrest in einer exponierten
Position im hydrophilen Arm des Komplexes und sollte daher einen hohen Markierungsgrad
aufweisen.
Außerdem
legen Strukturdaten
nahe, dass
an
dieser Position
keine
Konformationsänderung bei einem Wechsel des Redoxzustandes stattfindet (Berrisford &
Sazanov, 2009), so dass keine Änderung der Zugänglichkeit zu erwarten ist.
D187CCD
ox.
red.
NuoCD
NuoCD
R529C
ox.
red.
K551C
ox.
red.
R562C
ox.
A573C
red.
ox.
V574C
red.
ox.
Y590C
red.
ox.
red.
NuoL
I571C
ox.
red.
V550C
ox.
red.
P552C
ox.
red.
F553C
ox.
red.
L554C
ox.
red.
L560C
ox.
red.
K561C
ox. red.
NuoL
N566C
ox.
red.
P572C
ox.
red.
NuoL
Abb. 4.23: Fluoreszenzmarkierung von NuoL der verschiedenen Komplex I-Varianten mit TMRMaleimid. Proben der Varianten im Luft-oxidierten und NADH-reduzierten Zustand wurden wie angegeben
aufgetragen. Zur Kontrolle wurde die Fluoreszenz von NuoCD der Variante D187C CD in beiden Redoxzuständen
bestimmt.
100
4. Ergebnisse
Tab. 4.7: Markierungsgrad der Cystein-Varianten mit TMR. Es sind die Fluoreszenzintensitäten der Banden
in den verschiedenen Proben nach TMR-Markierung und SDS-PAGE angegeben. Die Intensität von NuoCD in
der oxidierten Probe von NuoCD D187C wurde auf 100% gesetzt, die relativen Intensitäten der anderen Banden
sind darauf bezogen. Die Intensität von NuoL wurde jeweils gegenüber einer unspezifischen Grundfluoreszenz
korrigiert, indem die Intensität, die diese Bande in der entsprechenden Probe der Referenz D187CCD (oxidiert
bzw. reduziert) aufweist, abgezogen wurde. Da die Absolutwerte der Intensität von den jeweiligen Gelen
abhängig sind, wurden die verwendeten Gele separat ausgewertet und jeweils ein Aliquot der Referenz D187CCD
mit aufgetragen.
Gel 1
Bande
Intensität
korrigierte Intensität
relative Intensität [%]
NuoL in NuoCD D187C oxidiert
1037
0
0
NuoL in NuoCD D187C reduziert
820
0
0
NuoCD in NuoCD D187C oxidiert
4095
4095
100
NuoCD in NuoCD D187C reduziert
2931
2931
72
NuoL R529C oxidiert
2739
1702
42
NuoL R529C reduziert
1065
245
6
NuoL K551C oxidiert
1733
696
17
NuoL K551C reduziert
1048
228
6
NuoL R562C oxidiert
1496
459
11
NuoL R562C reduziert
806
0
0
Intensität
korrigierte Intensität
relative Intensität [%]
NuoL in NuoCD D187C oxidiert
796
0
0
NuoL in NuoCD D187C reduziert
765
0
0
NuoCD in NuoCD D187C oxidiert
4095
4095
100
NuoCD in NuoCD D187C reduziert
2820
2820
69
NuoL A573C oxidiert
1388
592
14
NuoL A573C reduziert
754
0
0
NuoL V574C oxidiert
4013
3217
79
NuoL V574C reduziert
1441
676
17
NuoL Y590C oxidiert
3509
2713
66
NuoL Y590C reduziert
1429
664
16
Intensität
korrigierte Intensität
relative Intensität [%]
NuoL in NuoCD D187C oxidiert
484
0
0
NuoL in NuoCD D187C reduziert
1863
0
0
NuoCD in NuoCD D187C oxidiert
4095
4095
100
NuoCD in NuoCD D187C reduziert
3524
3524
86
NuoL I571C oxidiert
1218
734
18
NuoL I571C reduziert
2612
749
21
Gel 2
Bande
Gel 3
Bande
101
4. Ergebnisse
Die Intensität von NuoCD in der oxidierten Probe der D187CCD-Variante wurde auf 100%
gesetzt und die relative Intensität der anderen Banden darauf bezogen. Da NuoL keine
Oberflächencysteine besitzt, stellt die Fluoreszenz von NuoL in der D187CCD-Variante ein
Maß für die unspezifische Bindung von TMR an NuoL dar. Die Intensität von NuoL in dieser
Probe (oxidiert bzw. reduziert) wurde zur Hintergrundkorrektur jeweils von der Intensität von
NuoL in den Banden der NuoL-Varianten abgezogen. Die Intensität von NuoCD war in der
reduzierten Probe um 30% geringer als in der oxidierten Probe. Dieser Unterschied ist
vermutlich
auf
die
verschiedenen
Reaktionsbedingungen
zurückzuführen.
Da
die
Unterschiede in der Markierung von NuoL in den NuoL-Varianten jedoch deutlich mehr als
30% betragen, ist der veränderte Markierungsgrad der untersuchten Positionen in beiden
Redoxzuständen
als
signifikant
zu betrachten und nicht
ausschließlich auf die
Reaktionsbedingungen zurückzuführen. Als einzige Cystein-Variante von NuoL zeigte I571C
eine stärkere Fluoreszenz von NuoL und somit eine bessere Markierbarkeit im reduzierten
Zustand. Dies zeigt, dass zumindest eine Position auf der horizontalen Helix im reduzierten
Zustand eine höhere Zugänglichkeit aufweist und dass es mit der verwendeten Methode trotz
des Einflusses der Reaktionsbedingungen prinzipiell möglich ist, dies nachzuweisen.
Außerdem zeigte sich, dass Positionen an den Enden der horizontalen Helix einen höheren
Markierungsgrad aufweisen als Positionen in der Mitte. Dies gilt für beide Redoxzustände
und ist möglicherweise durch die gebogene Form der Helix zu erklären (Abb 4.18,
Seitenansicht). Die Positionen in der Mitte der Helix befinden sich tiefer in der Membran und
sind somit schwerer zugänglich als die Reste an den Enden, die weiter aus der Membran
herausragen.
In den SDS-Gelen wurde bei den reduzierten Proben stets eine Fluoreszenz beobachtet, die
über den gesamten unteren Bereich des Gels verschmiert war. Um deren Herkunft zu klären,
wurden Proben des Komplex I sowie freies FMN in oxidiertem und reduziertem Zustand auf
ein Gel aufgetragen und die Fluoreszenz untersucht (Abb. 4.24). In allen Bahnen, die NADH
enthalten, ist eine stark fluoreszierende Bande am unteren Rand des Gels zu erkennen, diese
ist vermutlich auf die Eigenfluoreszenz des NADH zurückzuführen. Die fragliche
verschmierte Fluoreszenz in der unteren Gelhälfte ist jeweils bei der mit NADH reduzierten
Probe des Komplex I und des freien FMN zu erkennen, nicht jedoch bei der mit Dithionit
reduzierten Probe des Komplex I. Dies deutet darauf hin, dass nicht alleine das reduzierte
FMN sondern eventuell das reduzierte FMN im Komplex mit NADH für die beobachtete
Fluoreszenz verantwortlich ist.
102
4. Ergebnisse
Abb. 4.24: Fluorogramm einer SDS-PAGE verschiedener Proben von Komplex I und freiem FMN. Von
Komplex I wurde eine oxidierte, eine mit NADH reduzierte und eine mit Dithionit reduzierte Probe (jeweils
50 µg Protein) wie angegeben aufgetragen. Zum Vergleich wurden weiterhin freies FMN, reines NADH sowie
mit NADH reduziertes FMN aufgetragen, wobei die Mengen an NADH und FMN jeweils den in den Komplex IProben enthaltenen Mengen entsprechen.
4.3.5 Beweglichkeit von MTSL in den mutierten Positionen
Um die konformative Beweglichkeit der untersuchten Positionen auf der horizontalen Helix
zu untersuchen, wurden die mutierten Positionen mit der Spinsonde MTSL markiert. Die
EPR-Spektren der MTSL-markierten Varianten im oxidierten bzw. im reduzierten Zustand
sind in Abb. 4.25 dargestellt. Bei den meisten Varianten führt die Reduktion mit NADH nicht
zu einer Änderung der Linienbreite. Lediglich die Spektren der Varianten R529C, L560C und
Y590C zeigen eine geringfügig breitere zentrale Resonanzlinie im reduzierten Zustand, was
auf eine leicht verringerte Beweglichkeit hindeutet. Dies unterstreicht die geringe
konformative Beweglichkeit der horizontalen Helix an bestimmten Positionen. Bei der
Variante L560C ist zu beachten, dass es aufgrund des schlechten Signal:RauschVerhältnisses, das auf den niedrigen Markierungsgrad an dieser Position zurückzuführen ist,
schwierig ist, eine eindeutige Aussage zu treffen. Die Spektren der D187CCD-Variante
unterscheiden sich nicht in beiden Redoxzuständen, was die Aussage der strukturellen
Untersuchungen bestätigt, dass sich die Konformation dieser Position bei der Reduktion nicht
verändert.
103
4. Ergebnisse
R529C
324
326
V550C
328
330
332
334
336
338
340
342
324
326
328
magnetische Feldstärke [mT]
326
332
334
336
338
340
342
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
K551C
324
330
P552C
328
330
332
334
336
338
340
342
324
326
328
330
332
334
336
338
magnetische Feldstärke [mT]
magnetische Feldstärke [mT]
δ
F553C
L554C
Azz
324
326
328
330
332
334
336
338
340
342
324
magnetische Feldstärke [mT]
326
328
330
332
334
336
338
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
Abb. 4.25: EPR-Spektren der MTSL-markierten Varianten. Die Spektren der oxidierten Proben sind
schwarz, die der reduzierten Proben sind rot dargestellt. EPR-Einstellungen waren: Mikrowellenleistung,
10 mW; Mikrowellenfrequenz, 9.37 GHz; Modulationsamplitude, 0.1 mT; Zeitkonstante, 0.0819; ScanGeschwindigkeit, 10.7 mT/min. Einige Spektren sind von dem Signal von freiem MTSL überlagert. Zum
Vergleich ist das Spektrum von freiem MTSL gezeigt. Die Linienbreite der zentralen Resonanzlinie (δ) und die
Aufspaltung zwischen den äußeren Hyperfeinextrema (Azz), anhand derer die Spektren ausgewertet wurden, sind
im Spektrum der Variante F553C exemplarisch eingezeichnet.
104
4. Ergebnisse
L560C
324
326
328
K561C
330
332
334
336
338
340
342
324
326
328
magnetische Feldstärke [mT]
326
328
330
332
334
336
338
340
342
324
326
328
328
330
332
334
336
338
340
342
324
340
342
330
332
334
336
338
340
342
326
328
330
332
334
336
338
340
342
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
A573C
326
338
P572C
magnetische Feldstärke [mT]
324
336
magnetische Feldstärke [mT]
I571
326
334
N566C
magnetische Feldstärke [mT]
324
332
magnetische Feldstärke [mT]
R562C
324
330
V574C
328
330
332
334
336
338
magnetische Feldstärke [mT]
340
342
324
326
328
330
332
334
336
338
magnetische Feldstärke [mT]
Abb. 4.25: Fortsetzung.
105
4. Ergebnisse
Y590C
324
326
328
D187C
330
332
334
336
338
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
324
326
328
330
332
334
336
338
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
freies MTSL
324
326
328
330
332
334
336
338
340
342
magnetische Feldstärke [mT]
Abb. 4.25: Fortsetzung.
Die geringere Intensität des EPR-Signals im reduzierten Zustand wurde in allen Proben, auch
in der des freien MTSL, beobachtet. Sie wird durch die NADH-Zugabe verursacht, was zu
einer geringeren Konzentration der Spin-Sonde führt, und ist unabhängig von der
Redoxreaktion des Komplex I.
Alle mutierten Positionen waren mit MTSL markierbar. Dies ist mit der höheren
Hydrophobizität der Spinsonde im Vergleich zu TMR-Maleimid erklärbar, aufgrund derer
MTSL auch Positionen markiert, die tiefer in die Membran eingebettet sind. Die
unterschiedliche Intensität der EPR-Signale in Relation zur eingesetzten Proteinmenge wurde
als Maß für den Markierungsgrad angesehen, die Markierbarkeit der einzelnen Positionen mit
MTSL ist in Tab 4.8 zusammengefasst.
106
4. Ergebnisse
Tab 4.8: Markierungsgrad der Cystein-Varianten mit MTSL. Der Markierungsgrad der Variante D187CCD
wurde auf 100% gesetzt. Die Intensität der EPR-Signale der MTSL-markierten NuoL-Varianten im Verhältnis
zu dem der D187CCD-Variante wurde, unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Proteinkonzentrationen in
den Proben, als Maß für den relativen Markierungsgrad verwendet. Es wurde jeweils die Intensität der zentralen
Resonanzlinie der oxidierten Probe ausgewertet.
Position
Signalintensität
Proteinkonzentration
relativer Markierungsgrad
[mg/mL]
[%]
R529C
0.20
22
34
V550C
0.13
23
21
K551C
0.60
20
110
P552C
0.60
24
93
F553C
0.40
12
126
L554C
0.17
7.6
82
L560C
0.13
8.3
57
K561C
0.15
8.0
69
R562C
0.25
11
85
N566C
0.23
12
72
I571C
0.15
11
49
P572C
0.14
12
44
A573C
0.26
12
82
V574C
0.23
11
74
Y590C
0.55
18
110
D187CCD
0.75
28
100
4.3.6 Molekularbiologische Grundlagen für eine doppelte Spinsondenmarkierung
Durch Einführen eines zweiten Cysteinrestes in geeignetem Abstand von den markierbaren
Positionen auf der horizontalen Helix könnten in zukünftigen Arbeiten mittels doppelter
Spinsondenmarkierung und gepulsten EPR-Messungen Abstandsänderungen zwischen der
Helix und dem Membranarm gemessen und so weitere Erkenntnisse über Art und Umfang der
Konformationsänderungen gewonnen werden. Die Grundlagen für die dazu notwendigen
molekularbiologischen Arbeiten wurden in der vorliegenden Arbeit gelegt. Geeignete
Positionen für das Einbringen eines zweiten Cysteinrestes befinden sich in den LoopRegionen der Untereinheit NuoM. Zum Einbringen von Punktmutationen auf nuoM wird ein
107
4. Ergebnisse
Subklon benötigt, der das nuoM-Gen, flankiert von homologen Bereichen für die λ-Red
vermittelte Rekombination, enthält. Analog zum Subklon pETBlue K_nuoL_M, der für das
Einbringen von Mutationen auf nuoL verwendet wurde, wurde hierzu der Subklon pETBlue
nuoM dargestellt. Hierzu wurde der Vektor pETBlue-1 mit den Restriktionsenzymen NheI
und SmaI geschnitten und der linearisierte Vektor aufgereinigt. Von pBADnuoHis wurde mit
dem Primer-Paar Clone_nuoM_fwd/rev ein lineares Fragment amplifiziert, welches nuoM
sowie die flankierenden Bereiche enthält. Mit Hilfe des In-Fusion HD Enzyme Mix wurde das
lineare Fragment in den linearisierten Vektor kloniert. Nach Transformation von Zellen des
Stammes XL10 Gold Kanr mit dem Reaktionsansatz wurden lediglich 4 Kolonien auf der
Agar-Platte erhalten. Die Restriktionsanalyse mit Eco1301 (StyI) ergab jedoch, dass es sich in
allen vier Fällen um das gewünschte Konstrukt pETBlue nuoM handelte (Abb. 4.26), was die
hohe Effizienz der Klonierung nach Gibson et al. (2009) belegt.
In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass die Position T166M nach Austausch des Threonin
gegen Cystein mit TMR und MTSL markierbar ist (Pohl, 2008). Aus der Struktur des
Membranarms ist ersichtlich, dass diese Position in Abständen von 20-40 Å von den meisten
der in
dieser
Arbeit
als
MTSL-markierbar identifizierten Positionen liegt.
Die
Doppelvarianten wären somit für EPR-spektroskopische Abstandsmessungen geeignet. Um
die Mutation T166CM in das Expressionsplasmid pBADnuoHis mit den entsprechenden
Mutationen auf nuoL einzubringen, wurde sie zunächst auf dem Subklon pETBlue nuoM
eingeführt. Dies wurde mit der QuikChange-Methode unter Verwendung der Oligonucleotide
nuoM_T166C_fwd/rev realisiert. Das Konstrukt pETBlue nuoM T166C wurde mit MluI
analysiert (Abb. 4.26) und die Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt (s. Anhang).
Um die Mutation T166CM durch λ-Red-vermittelte Rekombination in das Expressionsplasmid
einzubringen, muss nuoM auf dem Plasmid gegen eine Selektionskassette ausgetauscht
werden. Für einen ersten Versuch wurde pBADnuoHis nuoL R562C als Vektor ausgewählt.
Die Selektionskassette nptIsacRB, die in vorangegangenen Arbeiten auch anstelle von nuoL
eingebracht wurde, wurde von dem Vektor pVO1100 amplifiziert. Über die verwendeten
Oligonucleotide nuoM_nptIsacRB_fwd/rev wurden die flankierenden Bereiche von nuoM als
Homologieregionen für die λ-Red vermittelte Rekombination eingebracht. Durch die
anschließende Rekombination wurde nuoM auf dem Zielvektor durch die Selektionskassette
ersetzt. Das Konstrukt pBADnuoHis nuoL R562C nuoM::nptIsacRB wurde durch
Restriktionsanalyse mit PstI nachgewiesen (Abb. 4.26) und steht somit bei Bedarf als
unmittelbare Vorstufe für die Darstellung einer Doppelmutante zur Verfügung.
108
4. Ergebnisse
a)
b)
c)
Abb. 4.26: Restriktionsanalysen der Konstrukte von nuoM T166C. a) zeigt die Restriktionsanalyse des
Subklons pETBlue nuoM mit StyI, b) die von pETBlue nuoM T166C mit MluI und c) die von pBADnuoHis
nuoL R562C nuoM::nptIsacRB mit PstI. Die Fragmentgröße ist jeweils angegeben, zum Vergleich wurde auf der
linken Bahn jeweils der λ-DNA Eco130I (StyI) Marker 16 (Fermentas) aufgetragen. Die Größe der
Markerbanden ist in a) exemplarisch angegeben.
4.4 Mutagenese des Ubichinon-Bindemotivs
Die Struktur des Komplex I aus T. thermophilus zeigt, dass die Carbonyl-Sauerstoffatome der
Kopfgruppe von Decyl-Ubichinon über Wasserstoffbrücken an die konservierten Reste His38
und Tyr87 der Untereinheit Nqo4 binden (Abb. 4.27; Baradaran et al., 2013). Um die
Bedeutung dieser Wechselwirkungen für die Bindung und die Reduktion des Ubichinons zu
untersuchen, wurden die homologen Positionen H224 und Y273 der Untereinheit NuoCD im
E. coli Komplex I mutiert und die Aktivität der Varianten bestimmt. Die Positionsnummern
unterscheiden sich zwischen beiden Organismen so deutlich, da nuoC und nuoD in E. coli
fusioniert vorliegen und in T. thermophilus nicht. Um die Ausbildung der Wasserstoffbrücken
zu verhindern, ansonsten aber möglichst geringe strukturelle Veränderungen hervorzurufen,
wurde der Tyrosinrest gegen das strukturell ähnliche Phenylalanin und der Histidinrest gegen
Methionin ausgetauscht.
109
4. Ergebnisse
a)
b)
Abb. 4.27: Ubichinon-Bindestelle des Komplex I aus T. thermophilus bei 3.3 Å Auflösung (Baradaran et
al., 2013). a) zeigt die Struktur mit gebundenem Piericidin A und b) mit gebundenem Decyl-Ubichinon. Die
Reste H38 und Y87, die Wasserstoffbrücken zum Substrat bzw. Inhibitor ausbilden, sowie der Rest D139, der
über eine Wasserstoffbrücke mit H38 wechselwirkt, sind hervorgehoben. Wasserstoffbrücken sind durch
gestrichelte Linien angedeutet und die Längen in Å sind jeweils angegeben.
4.4.1 Darstellung der Mutanten
Die Punktmutationen H224MCD und Y273FCD wurden unter Verwendung der Primer-Paare
nuoCD_H224M_fwd/rev und nuoCD_Y273F_fwd/rev auf dem Subklon pCA24N nuoCD in
das Gen nuoCD eingeführt. Die Mutationen wurden durch Restriktionsanalyse mit dem
jeweils geeigneten Enzym nachgewiesen (Abb. 4.28) und durch Sequenzierung bestätigt. Die
Doppelmutante
H224M/Y273FCD
wurde
mittels
ortsgerichteter
Mutagenese
unter
Verwendung des Primer-Paares nuoCD_Y273F auf dem bereits fertiggestellten Subklon
pCA24N nuoCD H224M dargestellt. Das mutierte Gen nuoCD wurde jeweils mit dem
Primer-Paar nuoCD_fwd/rev amplifiziert und mittels λ-Red-vermittelter Rekombination
gegen die Selektionskassette auf dem Vektor pBADnuoHis nuoCD::nptIsacRB ausgetauscht.
Der Rekombinationserfolg wurde durch Restriktionsanalyse mit PstI überprüft (Abb. 4.28, die
Analyse des Vektors pBADnuoHis nuoCD Y273F ist stellvertretend für alle Konstrukte
gezeigt) und durch Sequenzierung bestätigt (s. Anhang).
110
4. Ergebnisse
Abb. 4.28: Restriktionsanalyse der Konstrukte zur Erzeugung von Punktvarianten der UbichinonBindestelle. Die Vektoren wurden mit den angegebenen Restriktionsenzymen analysiert und wie angegeben
aufgetragen. Die Doppelmutante wurde mit beiden Enzymen analysiert, die erwarteten Banden sind die gleichen
wie bei der jeweiligen Analyse der Einfachmutanten angegeben. Auf der rechten Bahn wurde jeweils der Marker
GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific) aufgetragen, die Größe einiger ausgewählter
Markerbanden ist ganz rechts exemplarisch angegeben. Die mit * markierte Bande ist unerwartet. Da die
erwartete Bande mit einer Länge von 291 bp eine sehr geringe Intensität besitzt, wird vermutet, dass das Enzym
EcoRI an der betreffenden Stelle die DNA nicht vollständig schneidet und sich die unerwartete Bande von etwa
900 bp aus den Fragmenten mit 291 bp und 597 bp zusammensetzt.
4.4.2 Überproduktion der Varianten und Präparation der Cytoplasmamembranen
Der Expressionsstamm BW25113ΔnuoΔndh/Kan wurde jeweils mit dem Vektor pBADnuoHis,
der die verschiedenen Punktmutationen auf nuoCD trägt, transformiert. Die entsprechenden
Komplex I-Varianten wurden in Autoinduktionsmedium überproduziert (Abb. 4.29). Nach
Aufschluss der Zellen wurden die cytoplasmatischen Membranen durch differenzielle
Zentrifugation präpariert. Aus 8-10 g Zellen wurden 1.7-2.4 g Membranen erhalten, die
jeweils 1:1 (w/v) in A*-Puffer resuspendiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur
weiteren Verwendung bei -80°C gelagert wurden.
111
4. Ergebnisse
5
4
OD600
3
2
1
0
0
50
100
150
200
Zeit [min]
Abb.
4.29:
Überproduktion
der
Komplex
I-Variante
Y273FCD
im
400
mL-Maßstab
in
Autoinduktionsmedium. Aus 2 L Medium wurden 10.4 g Zellen des Stammes BW25113ΔnuoΔndh/Kan /
pBADnuoHis nuoCD Y273F erhalten. Das Wachstum der anderen Stämme verlief ähnlich.
4.4.3 NADH Oxidase-Aktivität der Varianten
Die NADH Oxidase-Aktivität der präparierten Cytoplasmamembranen wurde durch
Messungen an der Sauerstoffelektrode bestimmt. Durch die Verwendung von Membranen
des Stammes BW25113ΔnuoΔndh/Kan mit chromosomaler Deletion des nuo-Operons sowie
des Gens für die alternative NADH Dehydrogenase wurde sichergestellt, dass lediglich die
jeweils in dem Stamm überproduzierte Komplex I-Variante die NADH-Oxidation katalysiert.
Zum Vergleich der einzelnen Varianten mit dem Wildtyp wurden die Aktivitäten jeweils auf
die Proteinkonzentration der Membransuspension im Ansatz normiert. Um eventuell
unterschiedliche Anteile des Komplex I an der gesamten Proteinmenge zu berücksichtigen,
wurde
außerdem
die
spezifische
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
der
Membransuspensionen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tab. 4.9 zusammengefasst.
112
4. Ergebnisse
Tab. 4.9: NADH Oxidase-Aktivität von Membranen der nuoCD-Mutanten. Es wurde jeweils die Aktivität
von 5 µL Membransuspension in 2 mL A-Puffer in Gegenwart von 1.25 mM NADH gemessen. Zur Hemmung
wurde 75 µM Piericidin A zugegeben. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität von 5 µL
Membransuspension wurde jeweils in 1 mL A-Puffer in Gegenwart von 1 mM K3[Fe(CN)6] und 0.2 mM NADH
gemessen. Die Fehler wurden aus den Abweichungen der Einzelmessungen abgeschätzt. Zur Bestimmung der
NADH Oxidase-Aktivität wurden alle Werte aus den Messreihen zur Bestimmung des IC 50 herangezogen, was
jeweils 20 Einzelmessungen pro Variante entspricht. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität wurde in
einer Dreifachbestimmung ermittelt. Zum Vergleich der Varianten wurde jeweils die normierte Aktivität als
Quotient aus NADH Oxidase-Aktivität und NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität (jeweils in %)
berechnet.
Membranen mit
NADH Oxidase-
Hemmbarkeit mit
NADH/Ferricyanid
normierte
Aktivität
Piericidin A
Oxidoreduktaseaktivität
Aktivität
-1
Komplex I
H224M
Y273F
CD
CD
H224M/Y273F
CD
-1
-1
-1
[µmol·min ·mg ]
[%]
[%]
[µmol·min ·mg ]
[%]
[%]
0.14 ± 0.02
100
90
0.9 ± 0.1
100
100
0.05 ± 0.01
36
80
0.6 ± 0.1
67
54
0.06 ± 0.01
43
77
0.7 ± 0.1
78
55
0.010 ± 0.005
7
44
0.7 ± 0.1
78
9
Die NADH Oxidase-Aktivität der Varianten H224MCD und Y273FCD ist mit 36% bzw. 43%
gegenüber dem Wildtyp deutlich reduziert. Die ebenfalls verringerte NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität deutet darauf hin, dass dies teilweise, aber nicht vollständig, auf
einen geringeren Anteil von Komplex I in den Membranen der Mutanten zurückzuführen ist.
Dies
wird
insbesondere
deutlich,
wenn
die
NADH
Oxidase-Aktivität
auf
die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität normiert wird, hier ergeben sich für beide
Einfachvarianten Werte von etwa 50% der Wildtyp-Aktivität. Die Aktivität der
Doppelvariante ist mit 7% Restaktivität deutlich verringert. Dies deutet darauf hin, dass beide
Positionen, H224CD und Y273CD, an der Bindung von Ubichinon beteiligt sind, wobei die
Doppelmutation einen stärkeren Einfluss auf die Bindung hat als die Mutation nur eines der
beiden Reste. Ein wesentlicher Unterschied zwischen den Varianten besteht außerdem in der
Hemmbarkeit mit Piericidin A. Während die Aktivität der Einfachvarianten H224MCD und
Y273FCD zu 80% bzw. 77% sensitiv gegenüber dem spezifischen Inhibitor ist, wird die
Aktivität der Doppelvariante zu weniger als 50% inhibiert. Dies deutet darauf hin, dass die
Kombination beider Mutationen die Komplex I-Variante deutlich insensitiver gegenüber dem
spezifischen Inhibitor macht. Um diese Aussage zu bestätigen, müsste die Variante präpariert
und diese Messung mit der intakten Präparation wiederholt werden.
113
4. Ergebnisse
a)
100
Aktivität [%]
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Piericidin A [µM]
80
80
Aktivität [%]
c) 100
Aktivität [%]
b) 100
60
40
20
60
40
20
0
0
0
10
20
30
40
50
Piericidin A [µM]
60
70
80
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Piericidin A [µM]
Abb. 4.30: Bestimmung der IC50-Werte zu Piericidin A. Gezeigt ist die relative NADH Oxidase-Aktivität des
Wildtyps (a), der Variante H224MCD (b) und der Variante Y273FCD (c) bei verschiedenen Konzentrationen von
Piericidin A, jeweils bezogen auf die maximale Aktivität ohne Inhibitor. Diese betrug beim Wildtyp
0.14 µmol·min-1·mg-1, bei der Variante H224MCD 0.05 µmol·min-1·mg-1 und bei der Variante Y273FCD
0.06 µmol·min-1·mg-1. Die Aktivität wurde als Sauerstoffverbrauch bei 30°C an der O2-Elektrode gemessen. Die
Ansätze enthielten 5 µL der jeweiligen Membransuspension in 2 mL A-Puffer. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 1.25 mM NADH gestartet und anschließend mit 0-75 µM Piericidin A inhibiert. Der Kurvenverlauf
wurde als exponentielle Abnahme zweiter Ordnung angepasst (rot), die Hälfte der hemmbaren Aktivität und die
dazugehörige Inhibitorkonzentration sind durch die blauen Linien angedeutet. Die Fehler der ermittelten IC50Werte wurden anhand der Streuung der Messwerte um die Ausgleichskurve abgeschätzt.
Piericidin A bindet in ähnlicher Weise an die Ubichinon-Bindestelle wie das Substrat selbst
(Abb. 4.27). Um den Einfluss der Mutationen auf die Inhibitorbindung zu untersuchen,
wurden jeweils die IC50-Werte der Varianten zu Piericidin A bestimmt. Hierzu wurde die
NADH Oxidase-Aktivität durch Zugabe verschiedener Inhibitorkonzentrationen von 0-75 µM
gehemmt (Abb. 4.30). Als IC50 ist die Inhibitorkonzentration definiert, bei der die
enzymatische Aktivität um die Hälfte verringert ist. Etwa 20% der gemessenen Aktivität
114
4. Ergebnisse
waren auch durch hohe Inhibitorkonzentrationen nicht hemmbar, dieser Anteil wurde bei der
Bestimmung der IC50-Werte nicht berücksichtigt.
Der IC50-Wert der Y273FCD-Variante ist mit 15 ± 5 µM im Vergleich zum
Wildtyp (7 ± 3 µM) etwa verdoppelt, während der Wert der H224MCD-Variante mit 4 ± 3 µM
im Rahmen der Fehlergrenzen unverändert ist. Dies zeigt die Bedeutung von Y273CD für die
Bindung von PicA. Für die Doppelvariante wurde keine Bestimmung durchgeführt, da die
beobachtete Aktivität nicht nur sehr gering, sondern auch nur zu einem geringen Anteil durch
Piericidin A hemmbar war.
4.5 Wechselwirkung des Komplex I mit der induzierbaren Lysin
Decarboxylase LdcI
Die Aufreinigung und Charakterisierung der ΔNuoL-Variante des E. coli Komplex I in
früheren Arbeiten ergab, dass zwei Populationen der Variante existieren. Die erste zeigt, wie
oben erwähnt, eine geringere Stöchiometrie von etwa 2 H+/2e- während der zweiten das
terminale
Fe/S-Zentrum
N2
fehlt,
weshalb
sie
keine
Elektronentransfer-
und
Protonentranslokationsaktivität besitzt (Steimle, 2009). Diese zweite Population ist mit der
induzierbaren Lysin Decarboxylase LdcI, die auch als CadA bezeichnet wird, assoziiert. Um
festzustellen, ob die Wechselwirkung zwischen Komplex I und der Lysin Decarboxylase auch
in vivo auftritt, wurde ein E. coli Stamm dargestellt, in dem beide Enzyme jeweils mit einem
geeigneten fluoreszierenden Protein fusioniert sind. Durch in vivo-FRET-Messungen wurde
eine mögliche Wechselwirkung zwischen der YFP-fusionierten Lysin Decarboxylase und dem
mit mCerulean markierten Komplex I bzw. der ΔNuoL-Variante untersucht.
4.5.1 Darstellung eines FRET-fähigen E. coli Stammes
Zu einem Teil der folgenden Arbeiten wurde Beate Garbers im Rahmen ihrer Bachelorarbeit
angeleitet. Das Expressionsplasmid pBADnuo nuoF-mCerulean, das für den mit dem blau
fluoreszierenden Protein mCerulean markierten Komplex I codiert, war aus früheren Arbeiten
vorhanden (Erhardt, 2008). Durch Einfügen der Selektionskassette nptIsacRB anstelle von
nuoL wurde ein Plasmid dargestellt, das für die mit mCerulean fusionierte ΔNuoL-Variante
codiert. Unter Verwendung der Oligonucleotide nuoJ-fwd und nuoM-rev wurde die
Selektionskassette mit homologen Bereichen für die Rekombination von dem Vektor
115
4. Ergebnisse
pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB amplifiziert. Anschließend wurde sie mittels λ-Red-vermittelter
Rekombination in den Vektor eingefügt und so das gewünschte Expressionsplasmid
pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB erzeugt. Das Konstrukt wurde durch
Restriktionsanalyse mit PstI verifiziert (Abb 4.31).
Abb. 4.31: Nachweis der Konstrukte zur Fluoreszenzmarkierung des Komplex I und der induzierbaren
Lysin Decarboxylase durch Restriktionsanalyse bzw. analytische PCR an ganzen Zellen. Gezeigt sind die
Restriktionsanalysen der Konstrukte pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB mit PstI und pCA24N cadAyfp mit Bsp1407I sowie die Produkte der PCR an ganzen Zellen der Stämme BW25113Δnuo cadA::nptIsacRB
und BW25113Δnuo cadA-yfp. Die Fragmentgröße ist jeweils angegeben, zum Vergleich wurde rechts neben der
Probe jeweils der λ-DNA Eco130I (StyI) Marker 16 (Fermentas) aufgetragen. Die Größe der Markerbanden ist
rechts exemplarisch angegeben.
Die Fusion des für die Lysin Decarboxylase codierenden Gens cadA mit dem Gen des gelb
fluoreszierenden Proteins YFP wurde chromosomal in den Stamm BW25113Δnuo eingeführt.
Durch die Verwendung eines Stammes mit chromosomal deletiertem nuo-Operon wurde, wie
schon bei der Aufreinigung verschiedener Komplex I-Varianten, sichergestellt, dass der
spätere FRET-Stamm ausschließlich den episomal codierten, fluoreszenzmarkierten
Komplex I bzw. die ΔNuoL-Variante produziert.
Die Gene cadA und yfp wurden in dem Vektor pCA24N fusioniert. Das yfp-Gen wurde mit
den Oligonucleotiden NotI_mCerufwd und NotI_mCerurev von dem Plasmid p64YFP
amplifiziert. Die Verwendung der eigentlich für die Amplifikation des mCerulean-Gens
konstruierten Oligonucleotide war hier möglich, da sich die beiden fluoreszierenden Proteine
lediglich im Bereich des Chromophors unterscheiden, an den Termini sind sie und damit auch
ihre Gene identisch. Das PCR-Produkt wurde nach Restriktion mit NotI in den ebenfalls mit
NotI linearisierten Vektor pCA24N cadA ligiert. Das resultierende Konstrukt pCA24N cadA116
4. Ergebnisse
yfp wurde durch Restriktionsanalyse mit Bsp1407I identifiziert (Abb 4.31) und durch
Sequenzierung bestätigt. Es codiert für eine C-terminale Fusion der Lysin Decarboxylase mit
YFP über das Peptid Gly-Leu-Cys-Gly-Arg als Linker.
Um das fusionierte Gen cadA-yfp mittels λ-Red-vermittelter Rekombination ins Chromosom
einzufügen, wurde zunächst das Gen cadA auf dem Chromosom zu einem großen Teil (77%)
durch die Selektionskassette nptIsacRB ersetzt. Die Kassette wurde mit den Oligonucleotiden
cadA-sacRB-fwd und cadA-sacRB-rev von dem Vektor pVO1100 amplifiziert. Für die
Rekombination wurden elektrokompetente Zellen des Stammes BW25113Δnuo/pKD46
hergestellt und mit dem PCR-Produkt transformiert. Positive Klone wurden durch analytische
PCR an ganzen Zellen mit den Oligonucleotiden Check-cadA-fwd und Check-cadA-rev
identifiziert (Abb. 4.31). Das fusionierte Gen cadA-yfp wurde unter Verwendung der
Oligonucleotide CadA-fwd und cadA-eYFP-rev von dem Konstrukt pCA24N cadA-yfp
amplifiziert. Für die λ-Red-vermittelte Rekombination wurden elektrokompetente Zellen des
Stammes BW25113Δnuo cadA::nptIsacRB/pKD46 hergestellt und mit dem PCR-Produkt
transformiert. Positive Klone wurden durch analytische PCR an ganzen Zellen mit den
Oligonucleotiden Check-cadA-fwd und Check-cadA-rev identifiziert (Abb. 4.31) und durch
Sequenzierung des PCR-Produktes bestätigt (s. Anhang).
Die gewünschten FRET-fähigen Stämme wurden durch Transformation des Stammes
BW25113Δnuo cadA-yfp mit dem Expressionsplasmid pBADnuo nuoF-mCerulean bzw.
pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB erzeugt.
4.5.2 Assemblierung des Komplex I in den verwendeten Stämmen
Die Assemblierung des Komplex I und der Variante wurde durch analytische
Zuckergradientenzentrifugation untersucht. Da die Lysin Decarboxylase als mögliches
Chaperon eine Rolle bei der Assemblierung spielen könnte, war es von Interesse festzustellen,
ob durch die Deletion von cadA die Assemblierung des Komplex I gestört wird. Hierzu wurde
der Stamm BW25113 cadA::nptIFRT aus der Keio-Collection (Baba et al., 2006) verwendet, in
dem cadA deletiert, das nuo-Operon jedoch vorhanden ist. Außerdem wurde überprüft, ob in
dem dargestellten FRET-Stamm BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean
nuoL::nptIsacRB die fluoreszenzmarkierte ΔNuoL-Variante produziert wird. Dass die
Überproduktion des vollständig assemblierten, fluoreszenzmarkierten Komplex I von
pBADnuo nuoF-mCerulean möglich ist, wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt (Erhardt,
117
4. Ergebnisse
2008). Die Stämme BW25113 und BW25113 cadA::nptIFRT wurden in Medium G kultiviert.
Für den Stamm BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB
wurde
zur
Überproduktion
der
episomal
codierten
Komplex
I-Variante
Autoinduktionsmedium verwendet. Die Wachstumskurven sind in Abb. 4.32 dargestellt, aus
4×400 mL Medium wurden 9-12 g Zellen erhalten.
5
4
OD600
3
2
1
0
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
Zeit [min]
Abb. 4.32: Wachstumskurven der Stämme BW25113 (schwarz), BW25113 cadA::nptIFRT (rot) und
BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB (blau).
Aus 5-6 g Zellen wurden 0.8-1.1 g Membranen isoliert. Die Membranproteine wurden mit
DDM solubilisiert und 300-500 µL der Detergenzextrakte wurden jeweils auf einen 12 mLGradienten von 5-30% Saccharose in A*DM aufgetragen. Nach Ultrazentrifugation wurden die
Gradienten in Fraktionen zu je 600 µL aliquotiert und deren NADH:Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität bestimmt. Die Aktivitätsprofile sind in Abb. 4.33 dargestellt. Der
Komplex I sedimentiert nach etwa zwei Dritteln des Gradienten mit einem Maximum um die
Fraktionen 12-13 (Leif et al., 1995). Ein kleines Aktivitätsmaximum um die Fraktionen 5-6
ist auf die alternative NADH Dehydrogenase sowie auf das NADH Dehydrogenase-Fragment
des Komplex I zurückzuführen, die beide in diesen Fraktionen sedimentieren. Der Vergleich
der Profile zeigt, dass der Komplex I aus dem Stamm BW25113 cadA::nptIFRT in den gleichen
Fraktionen sedimentiert wie der Komplex aus dem Ausgangsstamm BW25113. Dies zeigt,
dass die Deletion der Lysin Decarboxylase keinen Einfluss auf die Assemblierung des
Komplex I hat. Auch die mit mCerulean fusionierte ΔNuoL-Variante sedimentiert in den
118
4. Ergebnisse
gleichen Fraktionen wie der Komplex I. Eine leichte Verschiebung des Maximums von
Fraktion 13 zu Fraktion 12 kann einerseits auf die Unsicherheit der Messung zurückzuführen
sein, ist aber andererseits nicht unerwartet, da die ΔNuoL-Variante trotz der Fusion mit
mCerulean eine geringere molekulare Masse besitzt als der vollständig assemblierte Komplex.
Neben der Aktivität
wurde in den Fraktionen des Gradienten, der mit der
fluoreszenzmarkierten ΔNuoL-Variante beladen wurde, auch die Fluoreszenz von mCerulean
gemessen (Abb 4.33). Das Maximum der Fluoreszenzemission stimmt mit dem Maximum der
Aktivität überein. Dies zeigt, dass die Variante bis auf die Untereinheit NuoL vollständig
assembliert und mit mCerulean fusioniert in der Membran vorliegt. Im Hinblick auf eine
mögliche Wechselwirkung des Komplex I mit der Lysin Decarboxylase wäre auch die
Messung der Fluoreszenz des YFP im Gradienten von Interesse. Falls die mit YFP fusionierte
Lysin Decarboxylase an die mit mCerulean fusionierte ΔNuoL-Variante bindet, wäre ein
Maximum der YFP-Fluoreszenz in den Fraktionen zu erwarten, in denen auch die Maxima
der Fluoreszenz vom mCerulean und der Aktivität auftreten. Die Messung mit einem
Fluoreszenzspektrometer mit einer minimalen Spaltbreite von 10 nm war aufgrund der sich
stark überlagernden Absorptions- und Emissionsspektren von YFP mit einer maximalen
Anregungswellenlänge von 412 nm und einem Emissionsmaximum bei 427 nm jedoch
problematisch. Es wurde in allen Fraktionen eine so hohe Grundintensität beobachtet, dass
2,5
40
2,0
30
1,5
20
1,0
10
0,5
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fluoreszenzemission bei 475 nm
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
eine sinnvolle Interpretation der Messwerte nicht möglich war.
0
20
Fraktion
Abb. 4.33: Zuckergradientenprofile der Detergenzextrakte nach Ultrazentrifugation. Gezeigt sind die
Aktivitätsprofile der Stämme BW25113 (▲), BW25113 cadA::nptIFRT (▲) und BW25113Δnuo cadA-yfp /
pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB (▲). In den Fraktionen des FRET-Stammes wurde auch die
Intensität der Fluoreszenzemission von mCerulean gemessen (Δ).
119
4. Ergebnisse
4.5.3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Zellen
Die mit YFP fusionierte Lysin Decarboxylase und die mit mCerulean fusionierte Komplex IVariante ΔNuoL wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen in
Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und Dr. Felix Dempwolff im Labor von Prof. Dr.
Peter Graumann, Institut für Biologie II, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, lokalisiert. Die
Stämme BW25113Δnuo cadA-yfp und BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean
nuoL::nptIsacRB wurden in S750-Minimalmedium kultiviert und jeweils 3 µL einer Kultur auf
einen mit Agarose (1% (w/v) in S750-Medium) beschichteten Objektträger gegeben. Die
fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen (Abb 4.34) zeigen eine Verteilung der Fluoreszenz
der ΔNuoL-Variante über die gesamte Membran, wie sie in früheren Arbeiten auch für den
fluoreszenzmarkierten Komplex I beobachtet wurde (Erhardt et al., 2014). Die Fluoreszenz
der YFP-markierten Lysin Decarboxylase konzentriert sich hingegen auf ein bis zwei
Bereiche pro Zelle. Diese Bereiche zeigen in den Zellen des Stammes BW25113Δnuo cadAyfp ohne Komplex I eine hohe Mobilität entlang der Membran, während sie in dem FRETStamm mit der überproduzierten ΔNuoL-Variante jeweils an einem Punkt fixiert sind. Dieses
Verhalten deutet eher auf einen generellen Effekt der Deletion von NuoL auf die
Membrandynamik der E. coli Zellen hin. Ein Grund für die Akkumulation der Lysin
Decarboxylase in wenigen Bereichen innerhalb der Zelle ist nicht bekannt. Die Beobachtung
steht jedoch im Einklang mit den Daten in der ASKA-Bibliothek (Kitagawa et al., 2005;
Genobase Datenbank, Nara Institute of Science and Technology, Japan).
a)
b)
Abb. 4.34: Epifluoreszenz des FRET-Stammes BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean
nuoL::nptIsacRB. a) zeigt die Fluoreszenz des mit der Komplex I-Variante ΔNuoL fusionierten mCerulean und
b) die Fluoreszenz des mit der Lysin Decarboxylase fusionierten YFP.
120
4. Ergebnisse
4.5.4 In vivo FRET-Messungen
Eine mögliche Wechselwirkung zwischen der Lysin Decarboxylase und dem Komplex I bzw.
der ΔNuoL-Variante wurde durch in vivo FRET-Messungen im Labor von Prof. Dr. Victor
Sourjik, Zentrum für Molekulare Biologie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, in
Zusammenarbeit mit Dr. Karin Grosse und Dr. Heiko Erhardt untersucht. Die dargestellten
FRET-fähigen Stämme BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean und
BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB wurden in PBMedium angezogen und die Expression der episomal codierten nuo-Gene wurde durch
Zugabe von L-Arabinose induziert. Die Zellen wurden mit Tethering-Puffer gewaschen und es
wurde jeweils ein Tropfen einer Zellsuspension auf einen mit Agarose (1% (w/v) in
Tethering-Puffer) beschichteten Objektträger gegeben. Die Fluoreszenzemission von
mCerulean und YFP wurde für ca. 3-5 min aufgezeichnet (Emvor), bevor das
Akzeptorfluorophor YFP durch einen Laserpuls mit einer Dauer von 20 sec ausgebleicht
wurde (Abb. 4.35).
a)
b)
Abbildung 4.35: In vivo FRET-Messungen zur Untersuchung der Wechselwirkung der Lysin
Decarboxylase mit dem Komplex I bzw. der ΔNuoL-Variante (Erhardt, 2011). Die Emission des
Donorfluorophors mCerulean ist blau, die des Akzeptorfluorophors YFP ist gelb dargestellt. Der graue Bereich
entspricht dem Zeitintervall des Laserpulses, mit dem das Akzeptorfluorophor ausgebleicht wurde. a) zeigt die
Messung mit dem Stamm BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean und b) die Messung mit dem
Stamm BW25113Δnuo cadA-yfp / pBADnuo nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB.
121
4. Ergebnisse
Die Emission der beiden Fluorophore wurde nach dem Laserpuls für weitere 3-5 min
aufgezeichnet (Emnach). Zur Auswertung wurden die Werte vor und nach dem Laserpuls
gemittelt. Die FRET-Effizienz wurde gemäß Gleichung 2-6 berechnet.
Zwischen der Lysin Decarboxylase und der ΔNuoL-Variante wurde eine FRET-Effizienz von
1.7 ± 0.5% bestimmt und somit eine spezifische Wechselwirkung in vivo nachgewiesen. Mit
dem vollständig assemblierten Komplex I ergab sich eine FRET-Effizienz von -0.8 ± 0.2%,
was gegen eine Wechselwirkung zwischen der Lysin Decarboxylase und dem vollständig
assemblierten Komplex I spricht.
4.5.5 Elektronenmikroskopie
Um zu untersuchen, an welcher Stelle die Lysin Decarboxylase an den Komplex I bindet,
wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Heiko Erhardt und Prof. Dr. Bettina Böttcher, University
of Edinburgh, Schottland, elektronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener Komplex IPräparationen angefertigt.
Komplex I bzw. die ΔNuoL-Variante wurden in 10 L Autoinduktionsmedium überproduziert,
es wurden jeweils 45-50 g Zellen erhalten (Abb 4.36). Ausgehend von 25 g Zellen wurden
5-6 g cytoplasmatische Membranen präpariert.
4,0
3,5
3,0
OD600
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Zeit [min]
Abb. 4.36: Wachstumskurven des Stammes BW25113Δnuo / pBADnuoHis (schwarz) und des Stammes
BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB (rot).
122
350
80
300
2000
250
1500
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
100
a)
2500
200
1000
150
100
500
60
40
20
50
0
0
0
50
100
150
200
250
300
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
4. Ergebnisse
500
80
250
400
200
300
150
200
100
50
Imidazol [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
100
b)
300
100
60
40
20
0
0
25
50
75
100
125
150
0
175
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
50
c)
350
Gipfel 1
160
40
300
140
250
Gipfel 2
120
200
100
150
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
180
30
20
80
100
10
60
50
40
0
0
20
40
60
80
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
Volumen [mL]
Abb. 4.37: Aufreinigung der Komplex I-Variante ΔNuoL. a) zeigt das Elutionsprofil der AnionenaustauschChromatographie an Fractogel TMAE, b) zeigt das der Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA und c)
zeigt das der Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q. Die Absorbanz bei 280 nm ist jeweils in blau,
die Salzkonzentration in grün und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot dargestellt. In c) ist die
im Folgenden verwendete Benennung der Populationen angegeben. Die Aufreinigung des Wildtyps verlief
entsprechend, auf die zweite Anionenaustauschchromatographie wurde bei dieser Präparation verzichtet.
123
4. Ergebnisse
Nach Extraktion der Membranproteine mit 3% DDM wurden über AnionenaustauschChromatographie an Fractogel TMAE und Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA
5-6 mg Komplex I bzw. 3-5 mg der ΔNuoL-Variante erhalten. Die beiden Populationen der
Variante wurden durch eine weitere Chromatographie an Source 15Q voneinander getrennt.
Es wurden jeweils 1-2 mg der beiden Populationen, im Folgenden als Gipfel 1 und Gipfel 2
bezeichnet, erhalten. Der Verlauf der Präparation der ΔNuoL-Variante ist in Tab. 4.10 und in
Abb.
4.37
dargestellt.
Die
Präparation
des
Wildtyps
verlief
bis
nach
der
Affinitätschromatographie entsprechend. Lediglich die beiden Populationen der Variante
wurden über eine zweite Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q weiter gereinigt.
Tab.
4.10:
Aufreinigung
der
ΔNuoL-Variante
aus
26
g
Zellen
des
E.
coli
Stammes
BW25113Δnuo/pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB. Die Präparation des Wildtyp Komplex I aus Zellen des
Stammes BW25113Δnuo/pBADnuoHis verlief ähnlich.
Reinigungsschritt
Volumen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
spezifisch
Ausbeute
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
63
700
1390
2.0
100
Detergenzextrakt
61
580
1220
2.1
88
Fractogel TMAE
54
100
700
7.0
51
Probond Ni2+-IDA
1.1
3.9
420
110
30
Um sicherzustellen, dass die Proben für die Elektronenmikroskopie nur vollständig
assemblierten Komplex I bzw. die ΔNuoL-Variante und keine Fragmente enthalten, wurden
die Präparationen auf eine Superose 6 Gelfiltrationssäule aufgetragen. Der Komplex I eluierte
in einem Gipfel bei 11.8 mL mit einer intensiven Schulter der Absorbanz bei 14 mL und einer
kleineren bei 17 mL. Es wurden die Fraktionen um den Gipfel bei 11.8 mL vereinigt und
aufkonzentriert. Gipfel 1 und Gipfel 2 der Präparation der ΔNuoL-Variante eluierten jeweils
in einem Gipfel bei 14 mL. Die Elutionsprofile des Wildtyps und des Gipfel 2 sind in
Abb. 4.38 dargestellt. Das Profil des Gipfel 1 ist aufgrund eines Datenverlusts auf dem
Laborrechner nicht mehr vorhanden und daher nicht gezeigt. Die SDS-PAGE zeigt die
Anwesenheit aller Komplex I Untereinheiten in den Präparationen mit Ausnahme der
deletierten Untereinheit NuoL in beiden Populationen der Variante (Abb. 4.38). Außerdem ist
die Anwesenheit der Lysin Decarboxylase in Gipfel 2 ersichtlich.
124
4. Ergebnisse
a)
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
120
b)
100
*
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Volumen [mL]
Abb. 4.38: Charakterisierung der Präparationen. a) zeigt die Elutionsprofile der Superose 6
Gelfiltrationschromatographie. Das Elutionsprofil des Wildtyps ist schwarz und das von Gipfel 2 der ΔNuoLVariante rot dargestellt. In b) ist das SDS-Gel der Präparationen des Wildtyps und der beiden Populationen der
Variante gezeigt. Einige der hydrophoben Untereinheiten waren nur schwach gefärbt und sind daher in der
Aufnahme nicht zu erkennen. Die Bande der Lysin Decarboxylase in der Probe von Gipfel 2 ist mit einem Stern
(*) markiert.
Abb. 4.39: Elektronenmikroskopische Aufnahme des Komplex I. Gezeigt ist eine typische Aufnahme eines
Kupfernetzes mit dem Wildtyp. Der weiße Balken entspricht einer Länge von 100 nm.
Für die Elektronenmikroskopie wurden jeweils 4 µL Proteinlösung mit Konzentrationen von
5-20 µg/mL auf ein mit einem Kohlefilm beschichtetes Kupfernetz aufgetragen und mit
Uranylacetat kontrastiert. Es wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt und
125
4. Ergebnisse
zur Datenverarbeitung wurden pro Variante 3000-5000 einzelne Partikel aus den Aufnahmen
ausgewählt. Die Aufnahmen zeigen, dass alle Proben sehr inhomogen sind; neben Komplex I
Partikeln mit der typischen L-Form liegen sehr viele unterschiedliche kleinere Fragmente und
Aggregate vor (Abb. 4.39). Die Partikel von Komplex I und Gipfel 1 wurden in 100, die
Partikel von Gipfel 2 in 80 Klassen eingeteilt (Abb. 4.40). Einige Klassen von Gipfel 2 der
ΔNuoL-Variante zeigen zusätzliche Elektronendichte im Bereich der Beuge des L-förmigen
Komplexes. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Lysin Decarboxylase in diesem Bereich
an den Komplex bindet.
Komplex I
ΔNuoL, Peak 1
ΔNuoL, Peak 2
Abb. 4.40: Klassifizierung der Partikel. Die Bilder
der Klassen, die für den Komplex I und die beiden
Populationen der ΔNuoL-Variante aus den einzelnen
Partikeln ermittelt wurden, sind wie angegeben
dargestellt. Klassen des Gipfel 2, die zusätzliche
Elektronendichte im Bereich der Beuge der L-förmigen
Struktur zeigen, sind durch einen roten Rahmen
hervorgehoben. Der Rahmen entspricht 40×40 nm, der
Maßstab ist in allen Teilen der Abbildung gleich.
126
4. Ergebnisse
Allerdings ist zu beachten, dass die Qualität der Aufnahmen zu schlecht ist, um eine
eindeutige Aussage zu treffen. Dies ist auf die Inhomogenität der Probe und auf die Tatsache
zurückzuführen, dass zu viele Partikel ausgewählt wurden, die möglicherweise nicht das
Zielprotein, sondern kleinere Fragmente und Aggregate darstellen. Außerdem wiesen viele
Kupfernetze eine zu hohe Partikeldichte auf, um einzelne Partikel zu selektieren.
Um die Inhomogenität der Komplex I Präparationen, die aus den elektronenmikroskopischen
Aufnahmen ersichtlich wurde, näher zu untersuchen, wurde eine Probe einer Präparation des
Wildtyps mit einer Yarra SEC-4000 Gelfiltrationssäule analysiert. Diese bietet mit 38‘000
theoretischen Böden eine deutlich bessere Trennleistung als die Superose 6 Säule mit 9‘000
Böden. Das Elutionsprofil ist in Abb. 4.41 dargestellt. Der Komplex I eluiert bei einem
Volumen von 8.7 mL, wie es für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 535 kDa zu
erwarten ist. Daneben zeigt das Elutionsprofil einen weiteren Elutionsgipfel bei 9.9 mL.
Elektronenmikroskopie und analytische Gelfiltrationschromatographie zeigen somit, dass die
Komplex I Präparation nicht homogen ist, sondern Fragmente enthält.
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
120
100
80
60
40
0
5
10
15
Volumen [mL]
Abb. 4.41: Analytische Gelfiltration der Komplex I Präparation über eine Yarra SEC-4000
Größenausschlusschromatographie-Säule. Es wurden 150 µg Komplex I in 30 µL A*DM-Puffer aufgetragen.
127
4. Ergebnisse
4.6 Versuche zum Ersatz von NuoL durch die homologe Untereinheit MrpA
Von Moparthi et al. (2011) wurde gezeigt, dass die allein produzierte Untereinheit NuoL des
E. coli Komplex I aus einer NaCl-sensitiven ΔmrpA-Mutante von B. subtilis den
ursprünglichen Phänotyp wieder herstellen kann. Um zu untersuchen, ob es möglich ist, NuoL
in E. coli strukturell und damit auch funktionell durch MrpA zu ersetzen, wurde nuoL in
verschiedenen Ansätzen durch mrpA ersetzt und versucht, die Komplex I-Variante aus dem
jeweiligen Stamm zu isolieren und zu charakterisieren. Der Stamm BW25113
HisnuoF
nuoL::mrpA Bp, in dem die Komplex I-Chimäre chromosomal codiert ist, und das Plasmid
pBADnuoHis nuoL::mrpA Bp zur Überproduktion der Chimäre standen aus früheren Arbeiten
in unserem Labor zur Verfügung (Bajzath, 2009; Stahl, 2012). In diesen Arbeiten wurde das
Gen mrpA aus Bacillus pseudofirmus (Bp) verwendet.
4.6.1 Isolation und Charakterisierung des chimären Komplex I NuoL::MrpA
Zu einem Teil der folgenden Arbeiten wurden Sofia Brander und Isabella Straub im Rahmen
ihrer Masterarbeit angeleitet. Die Aufreinigung der chromosomal codierten Variante schien
zunächst am erfolgversprechendsten, da MrpA in einer solchen Präparation bereits
massenspektrometrisch, wenn auch mit einer geringen Sequenzabdeckung, nachgewiesen
wurde (Stahl, 2012). Aus diesem Grund wurde zunächst versucht, den chimären Komplex aus
dem Stamm BW25113 HisnuoF nuoL::mrpA Bp zu isolieren. Der Stamm wurde in einem 28 L
Fermenter in Autoinduktionsmedium ohne Arabinose angezogen. Die Wachstumskurve ist in
Abb. 4.42 dargestellt, es wurden 350 g Zellen erhalten.
Aus etwa 50 g Zellen wurden 10-11 g cytoplasmatische Membranen isoliert. Nach Extraktion
der Membranproteine mit 3% DDM wurden über Anionenaustauschchromatographie an
Fractogel TMAE und Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA 0.4-5 mg einer
Präparation mit NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität erhalten. Der Verlauf der
Präparation ist in Tab. 4.11 und in Abb. 4.43 dargestellt.
128
4. Ergebnisse
7
6
5
OD600
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit [min]
Abb. 4.42: Wachstumskurven des Stammes BW25113
HisNuoF
nuoL::mrpA Bp (schwarz) und des Stammes
BW25113Δnuo / pBADnuoHis nuoL::mrpA Bp (rot) in 28 L Autoinduktionsmedium. Die Zellen wurden nach
250
200
1000
150
500
0
0
50
100
150
Volumen [mL]
200
50
40
30
100
20
50
10
0
0
350
800
300
250
600
200
400
150
100
200
40
30
20
10
50
0
0
0
20
40
60
80
100
120
0
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
60
1500
50
b)
Imidazol [mM]
300
1000
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
70
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
350
a)
2000
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
190 min bzw. nach 270 min vor dem Eintritt in die stationäre Phase geerntet.
Volumen [mL]
Abb. 4.43: Aufreinigung des Komplex I aus dem Stamm mit chromosomaler nuoL::mrpA Mutation
(Brander, 2013). a) zeigt das Elutionsprofil der Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE und b)
zeigt das der Affinitätschromatographie an Probond Ni 2+-IDA. Die Absorbanz bei 280 nm ist jeweils in blau, die
Salzkonzentration in grün und die NADH:Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot dargestellt.
129
4. Ergebnisse
Tab. 4.11: Aufreinigung des Komplex I aus 50 g Zellen des E. coli Stammes BW25113
HisnuoF
nuoL::mrpA Bp mit der chromosomalen nuoL::mrpA Mutation. Die Zunahme der NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität auf 110% liegt im Bereich der Messungenauigkeit bei der Aktivitätsbestimmung.
Reinigungsschritt
Volumen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
spezifisch
Ausbeute
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
64
440
1100
2.5
100
Detergenzextrakt
59
430
1300
3.0
110
Fractogel TMAE
35
39
610
16
55
Probond Ni2+-IDA
0.6
5.0
200
41
18
Um die Homogenität der Präparation zu überprüfen und um gegebenenfalls verschiedene
Populationen zu trennen, wurde die Präparation auf eine Superose 6 Gelfiltrationssäule
aufgetragen. Ein typisches Elutionsprofil ist in Abb. 4.44 dargestellt. Die analytische
Gelfiltration zeigt, dass die Präparation nicht homogen ist, sondern mindestens drei
Populationen unterschiedlicher molekularer Masse enthält. Die erste Population eluierte in
einem Volumen von 12.5 mL, die zweite in 14.5 mL und die dritte in 16 mL. Für die
vollständig assemblierte Chimäre ist ein ähnliches Retentionsvolumen zu erwarten, wie für
den Komplex I, der in früheren Versuchen bei 11.8 mL eluierte (vgl. Abb. 4.38). Es ist zu
beachten,
dass
das
Retentionsvolumen
eines
Proteins
in
unterschiedlichen
Chromatographieläufen bei Verwendung der gleichen Superose 6 Säule leicht variieren kann.
Somit ist nicht auszuschließen, dass es sich bei der ersten Population um die assemblierte
Chimäre handelt. Das SDS-Gel der Präparation (Abb. 4.44) zeigt, dass die erste Population im
Vergleich zum Wildtyp zusätzliche Banden enthält, jedoch scheinen neben NuoL auch die
Antiporter-Untereinheiten NuoN und NuoM zu fehlen. Die zweite Population enthält weniger
Banden als die erste, was mit dem späteren Retentionsvolumen im Einklang steht. In dieser
Population fehlen eindeutig alle drei Antiporter-Untereinheiten.
130
4. Ergebnisse
a)
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
11
1
10
9
2
8
3
7
6
5
0
5
10
15
20
25
30
Volumen [mL]
Coomassie-Färbung
b)
Wildtyp
1
Silberfärbung
2
Wildtyp
1
2
NuoGNuoCDNuoFNuoL/NNuoMNuoHNuoB/INuoE/JNuoANuoK-
Abb. 4.44: Gelfiltration und SDS-PAGE der Präparation des Komplex I aus Zellen mit der
chromosomalen Mutation nuoL::mrpA. a) zeigt das Elutionsprofil der Gelfiltration über eine Superose 6
Säule. Es wurden 100 µg Protein, das von der Affinitätschromatographie eluierte, aufgetragen. Die im Folgenden
verwendete Benennung der Populationen ist angegeben. b) zeigt das SDS-Gel von Population 1 und 2 im
Vergleich zum Wildtyp. Es ist jeweils die Coomassie-Färbung und die Silberfärbung desselben Gels gezeigt, die
Proben wurden wie angegeben aufgetragen. Die Zuordnung der Komplex I Untereinheiten zu den Banden
anhand der apparenten molekularen Masse ist für den Wildtyp angegeben.
131
4. Ergebnisse
Obwohl
beide
Populationen
eine
NADH:Ubichinon
Oxidoreduktaseaktivität
von
8 ± 2 µmol·min-1·mg-1 bzw. 2 ± 1 µmol·min-1·mg-1 zeigten, war keine der beiden nach der
Rekonstitution in Proteoliposomen in der Lage, einen Protonengradienten über die Membran
aufzubauen. Die dritte Population besitzt mit einem Retentionsvolumen von 16 mL eine
deutlich geringere molekulare Masse, als es für die Chimäre zu erwarten ist. Sie ist nur zu
einem geringen Anteil in der Präparation enthalten, außerdem ist der Elutionsgipfel von dem
der zweiten Population überlagert. Die dritte Population wurde daher nicht separat
charakterisiert.
Da die Aufreinigung des chromosomal codierten Proteins nicht das gewünschte Ergebnis
lieferte und weil für weitere Reinigungsschritte eine höhere Proteinausbeute wünschenswert
ist, wurde versucht, die Komplex I-Variante aus dem Überproduktionsstamm BW25113Δnuo
/ pBADnuoHis nuoL::mrpA Bp zu präparieren. Der Stamm wurde in einem 28 L Fermenter in
Autoinduktionsmedium angezogen, es wurden 300 g Zellen erhalten. Die Wachstumskurve ist
zusammen mit der Anzucht der chromosomalen Mutante in Abb. 4.42 gezeigt. Das
langsamere Wachstum im Vergleich zur chromosomalen Mutante ist vermutlich auf den
Stress zurückzuführen, dem die Zellen durch die Überproduktion des episomal codierten
Komplex I ausgesetzt sind. Aus 60-65 g Zellen wurden 17-19 g cytoplasmatische Membranen
isoliert.
Analog zur Aufreinigung der chromosomal codierten Variante wurden die Membranproteine
mit 3% DDM solubilisiert und über Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE
und
Affinitätschromatographie
an
Probond
Ni2+-IDA
gereinigt.
Nach
der
Affinitätschromatographie wurde die Präparation über eine zweite AnionenaustauschChromatographie an Source 15Q sowie durch Gelfiltration über eine Superose 6 Säule weiter
aufgereinigt. Die Elutionsprofile sind in Abb. 4.45 dargestellt.
Die Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q ergab zwei Hauptelutionsgipfel, die
mit Population A und Population B benannt und weiter analysiert wurden. Daneben sind
weitere Elutionsgipfel mit geringer Intensität zu erkennen. Population A eluierte von der
Superose 6 Gelfiltrationssäule in einem homogenen Gipfel nach 13.5 mL.
132
4. Ergebnisse
a)
b)
c)
d)
e)
Coomassie-Färbung
A
B1
wt
Silberfärbung
B2
A
B1
wt
B2
NuoG
NuoCD
NuoF
NuoL/N
NuoM
NuoH
NuoB/I
NuoE/J
NuoA
NuoK
Abb. 4.45: Aufreinigung des Komplex I aus dem Stamm mit episomaler nuoL::mrpA Mutation (Brander,
2013). a) zeigt das Elutionsprofil der Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE, b) zeigt das der
Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA und c) zeigt das der Anionenaustauschchromatographie an
Source 15Q. Die Absorbanz bei 280 nm ist jeweils blau, die Salzkonzentration grün und die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität rot dargestellt. Auf die Bestimmung der Aktivität wurde in c) verzichtet, da davon
ausgegangen wurde, dass die vereinigten Fraktionen der Affinitätschromatographie überwiegend reinen
Komplex I enthalten. d) zeigt die Elutionsprofile der Gelfiltration über eine Superose 6 Säule, es ist die
Absorbanz bei 280 nm dargestellt. Das Elutionsprofil von Population A ist grün und das von Population B ist
blau dargestellt. Die im Folgenden verwendete Benennung der Populationen ist in c) und d) angegeben. e) zeigt
das SDS-Gel der Präparation im Vergleich zum Wildtyp (wt). Es sind die Coomassie-Färbung und die
Silberfärbung des Gels gezeigt, die Proben wurden wie angegeben aufgetragen. Die Zuordnung der Komplex I
Untereinheiten zu den Banden anhand ihrer molekularen Masse ist angegeben. Gelbereiche, die
massenspektrometrisch analysiert wurden, sind rot eingerahmt.
133
4. Ergebnisse
Das SDS-Gel (Abb. 4.45 e) zeigt, dass bei dieser Population, ähnlich wie bei der
chromosomal codierten Variante, die Antiporter-Untereinheiten NuoL, M und N fehlen. Die
Silberfärbung zeigt in allen Proben eine Bande oberhalb von NuoG, bei Population A sind
hier zwei Banden zu erkennen. Hierbei könnte es sich jeweils um aggregiertes Protein
handeln. Population B ergab in der Gelfiltrationschromatographie zwei Elutionsgipfel nach
12.0 mL (B1) und nach 13.8 mL (B2). Auf dem SDS-Gel (Abb. 4.45 e) sind B1 und B2
untereinander identisch und, mit Ausnahme der dort sichtbaren Abbaubande unterhalb von
NuoG,
auch
mit
dem
Wildtyp.
Das
Retentionsvolumen
von
B1
in
der
Gelfiltrationschromatographie stimmt außerdem nahezu mit dem des Wildtyps überein. Es
wurde daher vermutet, dass es sich bei der Bande, die bei B1 in der Position zu sehen ist, in
der sich beim Wildtyp NuoL befindet, um MrpA handeln könnte.
Diese Vermutung wurde durch eine massenspektrometrische Analyse überprüft. Da MrpA in
früheren Arbeiten (Kajiyama et al., 2007) bei einer apparenten molekularen Masse von
52.5 kDa gefunden wurde, wurde außerdem der gesamte Gelbereich zwischen NuoF und
NuoCD analysiert. In keiner der untersuchten Proben konnte MrpA identifiziert werden.
Deshalb wurde ein Aliquot der gesamten Population B1 ohne vorherige Auftrennung der
Peptide mittels SDS-PAGE massenspektrometrisch analysiert. Es wurde je eine Probe mit
Trypsin bzw. Thermolysin behandelt und die identifizierten Peptide wurden mit einer für
MrpA spezifischen Datenbank verglichen. In der mit Trypsin behandelten Probe konnte
MrpA nicht identifiziert werden, in der mit Thermolysin behandelten wurden drei kleine
Peptide MrpA zugeordnet (Abb. 4.46).
1
51
101
151
201
251
301
351
401
451
501
551
601
651
701
751
MTVLHWATIS
ITSTGGVVEH
YLSKKTESLN
SYWFHREKST
DLVTSSELFL
TMVKAGIYLV
ILAFSTVSQL
TFKGSLFMTA
PFNGFLSKEM
MFFKTFTGKF
IIEPAMQAVL
MKNWAKAAFY
MIVFMILLLG
NKRITAVVVV
LPELRKEEFK
FIENSKELAG
PFLLAILIPF
TIPWVPSLGI
NFYVYLLMFM
YGAQKSMLIT
PAMILVLLGA
ARLTPVFAGS
GLIMTLLGLG
GIIDHETGTR
FFTALLRATE
KPENYDVKVH
PTVLADGELF
MKERDPLNWF
YTMFRYDAFA
GVIGFLLALL
PRFNVLNLII
GYNMVNVILV
LYKYARRIHT
NFTVFVDGLS
GAMLGVVLSD
VFGGFAMLGG
FTKSAQFPFH
AEWFWLLTGF
SAAIYFGESV
DIRKLGGLMA
MNAFNMETFG
EAPIGMLISP
HVNIYMWHGF
YDSSLSGVIT
IDTTNVTEIA
FVVFRAPDLA
SIGVGFFITA
DFRGLDTMLE
GWFVLVLPLV
LLFALLITGI
NLIVLYVFWE
FSLLYVMTGT
IWLPDAMEAP
GVVTLLWGST
DPAFYSFAIM
IMPVTFTVSL
IIIVVLAWIA
VILGSLVIVF
NAELFMTMGV
GSQFVTRIQM
PYIWVITIVF
LTQLLIETVT
IALSSLALGN
VLVLGIAALG
Abb. 4.46: Sequenzabdeckung von MrpA im Massenspektrum.
LFIYFIQYLS
GTLVILYSIF
LTSLASSLLI
FSIRGIIENV
TPVSAYLHSA
SAVRQKDLKG
AAIFHLINHA
IGLASMAGLP
SVFTFLYCLI
GFFPNILAYT
VAAGIILFLM
TGLLRDYFAY
IVATLSIPFI
VLLLMLAFYH
EAGIEPISQF
VIALIKLRMT
Gezeigt ist die vollständige
Aminosäuresequenz von MrpA aus B. pseudofirmus. Die nach der Behandlung von Population B1 mit
Thermolysin im Massenspektrum identifizierten Peptide sind rot hervorgehoben.
134
4. Ergebnisse
Die geringe Sequenzabdeckung lässt die Anwesenheit von MrpA in der Präparation jedoch als
fragwürdig erscheinen. Außerdem deutet die Inhomogenität der Präparation mit mindestens
drei Populationen unterschiedlicher molekularer Masse darauf hin, dass MrpA - wenn
überhaupt - nur substöchiometrisch vorhanden ist.
Population
B1
zeigte
eine
NADH:Ubichinon
Oxidoreduktaseaktivität
von
4.3 ± 0.7 µmol·min-1·mg-1 und war in der Lage, einen Protonengradienten über die Membran
von Proteoliposomen aufzubauen. Da dies jedoch nicht bei allen Messungen reproduzierbar
war und MrpA nicht eindeutig in der Präparation nachgewiesen werden konnte, wurde die
Charakterisierung der Mutante nuoL::mrpA nicht weiter verfolgt.
4.6.2 Fusion von MrpA und NuoL
Basierend auf Sequenzvergleichen und Sekundärstrukturvorhersagen wurde berichtet, dass
MrpA ebenfalls eine horizontale Helix zwischen TM 14 und TM 15 enthält, die jedoch
deutlich kürzer ist als die von NuoL (Virzintiene et al., 2013). Außerdem enthält MrpA
weitere C-terminale TM Helices, die in NuoL nicht vorhanden sind. Dies könnte verhindern,
dass MrpA an die Position von NuoL in den Komplex I integriert wird. Um dieses Problem zu
umgehen, wurde eine Komplex I-Variante dargestellt, bei der lediglich die ersten 14 TM
Helices von NuoL gegen die homologe Sequenz von MrpA aus B. subtilis ausgetauscht sind
(Abb. 4.47).
Abb. 4.47: Partieller Austausch von NuoL gegen MrpA im Membranarm der Komplex I Variante
MrpA’NuoL. Der C-terminale Bereich von NuoL der in der Variante beibehalten wurde ist in cyan gefärbt, der
gegen den homologen Bereich von MrpA ausgetauschte Teil ist pink hervorgehoben (PDB: 3RKO).
135
4. Ergebnisse
Ab Position Pro474 ist MrpA mit dem C-terminalen Teil von NuoL, beginnend mit Gln481,
fusioniert. Die Positionen wurden gewählt, weil sie sich in beiden Proteinen etwa in der Mitte
der Schleife zwischen den TM Helices 14 und 15 befinden und weil in den Arbeiten von
Virzintiene et al. (2013) gezeigt wurde, dass eine Fusion von MrpA mit einem anderen
Protein in Position Pro474 möglich ist. Zu den folgenden Arbeiten wurde Isabella Straub im
Rahmen ihrer Masterarbeit angeleitet.
Zur Darstellung der Mutante wurde der Vektor pETBlue K_nuoL_M über eine PCR mit den
Oligonucleotiden nuoL_abQ481_fwd und vor_nuoL_rev linearisiert. Die DNA-Sequenz der
ersten 474 Aminosäurereste von MrpA aus B. subtilis (Bs) wurde mit den Oligonucleotiden
mrpA_Anfang_fwd und mrpA_abP474_rev von dem Vektor pBAD24 mrpA Bs amplifiziert
und durch ligasefreies Klonieren in den linearisierten Zielvektor eingefügt.
Abb. 4.48: Restriktionsanalyse der Konstrukte mit StyI. Der Subklon pETBlue K_mrpA’nuoL_M und das
Expressionsplasmid pBADnuoHis mrpA’nuoL wurden wie angegeben aufgetragen. Die erwartete Größe der
Fragmente ist angegeben. Auf der linken Seite ist jeweils der GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder aufgetragen; die
Größe der Markerbanden ist ebenfalls angegeben. Die Fragmente erscheinen im Vergleich zum Marker generell
zu groß, die Muster entsprechen jedoch den Erwartungen und die Sequenzierung bestätigte schließlich das
Vorliegen der erwarteten Konstrukte.
136
4. Ergebnisse
Das Konstrukt pETBlue K_mrpA‘nuoL_M wurde durch Restriktionsanalyse mit StyI
identifiziert (Abb. 4.48) und die Fusion der Gene mrpA und nuoL an der gewünschten
Position wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das fusionierte Gen mrpA’nuoL wurde mit den
Oligonucleotiden nuoK_fwd und nuoM_rev amplifiziert und durch λ-Red-vermittelte
Rekombination anstelle der Selektionskassette in den Expressionsvektor pBADnuoHis
nuoL::nptIsacRB eingefügt. Das Konstrukt
pBADnuoHis mrpA‘nuoL wurde durch
Restriktionsanalyse mit StyI identifiziert (Abb. 4.48) und durch Sequenzierung bestätigt (s.
Anhang).
Der Expressionsstamm BW25113Δnuo/pBADnuoHis mrpA’nuoL wurde in Kolben mit je
400 mL Autoinduktionsmedium angezogen. Die Wachstumskurve ist in Abb. 4.49 dargestellt;
aus 4.8 L Medium wurden 58 g Zellen erhalten.
7
6
5
OD600
4
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Zeit [min]
Abb. 4.49: Wachstumskurve des Stammes BW25113Δnuo / pBADnuoHis mrpA’nuoL in 400 mL
Autoinduktionsmedium.
Ausgehend von 55-65 g Zellen wurden 11-15 g cytoplasmatische Membranen präpariert.
Nach Extraktion der Membranproteine mit 3% DDM wurden über AnionenaustauschChromatographie an Fractogel TMAE und Affinitätschromatographie an Probond Ni2+-IDA
2-5 mg Komplex I erhalten (Abb. 4.50 a) + b), Tab. 4.12).
137
350
1200
300
1000
250
800
200
600
150
400
100
200
50
40
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
50
a)
1400
30
20
10
0
0
100
200
300
400
500
0
0
500
35
600
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
4. Ergebnisse
b)
300
30
400
250
200
300
150
200
Imidazol [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
350
100
25
20
15
10
100
50
5
0
0
0
50
100
150
0
200
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol min mL ]
Volumen [mL]
Volumen [mL]
350
c)
300
15
B
250
A
10
200
150
5
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
20
100
0
50
0
0
50
100
150
200
250
300
Volumen [mL]
Abb. 4.50: Aufreinigung der Komplex I-Variante MrpA’NuoL. a) zeigt das Elutionsprofil der
Anionenaustauschchromatographie an Fractogel TMAE, b) zeigt das der Affinitätschromatographie an Probond
Ni2+-IDA und c) zeigt das der Anionenaustauschchromatographie an HiTrap Q HP. Die Absorbanz bei 280 nm
ist jeweils in blau, die Salzkonzentration in grün und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in rot
dargestellt. In c) ist die im Folgenden verwendete Bezeichnung der Populationen angegeben; auf die
Bestimmung der Aktivität wurde in c) verzichtet, da davon ausgegangen wurde, dass die vereinigten Fraktionen
der Affinitätschromatographie überwiegend reinen Komplex I enthalten.
138
4. Ergebnisse
Tab. 4.12: Aufreinigung der Komplex I-Variante MrpA‘NuoL aus 65 g Zellen des E. coli Stammes
BW25113Δnuo / pBADnuoHis mrpA‘nuoL. Die geringe spezifische Aktivität von Gipfel B im Vergleich zu
Gipfel A deutet auf die Inhomogenität von Gipfel B hin.
Reinigungsschritt
Volumen
Protein
[mL]
[mg]
[µmol min-1]
[µmol min-1 mg-1]
[%]
Membransuspension
124
1450
1860
1.3
100
Detergenzextrakt
120
1010
1440
1.4
77
Fractogel TMAE
49
160
440
2.8
24
Probond Ni2+-IDA
0.4
5.4
190
35
10
HiTrap Q, Gipfel A
0.3
0.9
130
150
7
HiTrap Q, Gipfel B
0.3
0.6
25
42
1
CoomassieFärbung
wt
A
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
gesamt
spezifisch
CoomassieFärbung
SilberFärbung
B
wt
A
B
B1
B2
Ausbeute
SilberFärbung
B1
B2
NuoG
NuoCD
NuoF
NuoL/N
NuoM
NuoH
NuoB/I
NuoE/J
NuoA/K
Abb. 4.51: SDS-Gele der Präparation aus Zellen mit der mrpA’nuoL Mutation. Die Populationen A und B,
die bei der Anionenaustauschchromatographie an HiTrap Q erhalten wurden, sowie die Populationen B1 und B2,
in die Population B durch Gelfiltration aufgetrennt wurde, sind wie angegeben aufgetragen. Es sind jeweils die
Coomassie- und die Silber-Färbung der Gele gezeigt. Zum Vergleich wurde mit den Populationen A und B eine
Probe des Komplex I Wildtyps (wt) aufgetragen. Die Zuordnung der Banden zu den Komplex I Untereinheiten
ist am linken Rand angegeben. Banden, die ausgeschnitten und massenspektrometrisch analysiert wurden, sind
rot eingerahmt.
139
4. Ergebnisse
Die Anionenaustauschchromatographie an HiTrap Q HP (Abb. 4.50 c) zeigt, dass, wie bei der
Mutation nuoL::mrpA, auch hier zwei Populationen vorliegen, die im Folgenden mit A und B
bezeichnet werden. Das SDS-Gel zeigt, dass, ähnlich wie bei der Präparation aus der
chromosomalen nuoL::mrpA Mutante (vgl. Abb. 4.44), in beiden Populationen die AntiporterUntereinheiten NuoL, M und N fehlen (Abb. 4.51). Es ist lediglich eine Bande unterhalb der
üblichen Position von NuoM zu erkennen, die bei A in der Silberfärbung stark, bei B nur
schwach hervortritt.
In der analytischen Gelfiltration über eine Yarra SEC-4000 Säule eluierte A in einem
homogenen Gipfel nach 9.5 mL, während B in weitere Populationen aufgetrennt wurde. Diese
eluierten in einem Gipfel nach 8.5 mL bzw. in einem Doppelgipfel mit Maxima bei 9.5 und
10.0 mL (Abb. 4.52) und werden im Folgenden als B1 und B2 bezeichnet. A und B2 eluieren
bei einem höheren Volumen als der Wildtyp (8.7 mL, vgl. Abb. 4.41), was auf eine geringere
molekulare Masse und somit nicht auf eine vollständig assemblierte Chimäre hindeutet. B1
eluiert nahezu beim gleichen Volumen wie der Wildtyp, was darauf hindeutet, dass es sich bei
dieser Population um die vollständig assemblierte Chimäre handeln könnte.
100
a)
A
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
120
100
80
60
40
20
b)
90
80
B2
70
60
B1
50
40
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
Volumen [mL]
12
14
16
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Volumen [mL]
Abb. 4.52: Gelfiltration der Populationen A und B der Präparation des Komplex I aus der mrpA’nuoL
Mutante über eine Yarra SEC-4000 Säule. a) zeigt das Elutionsprofil von Population A und b) das von
Population B aus der Anionenaustauschchromatographie an HiTrap Q HP. Es wurden 150 bzw. 100 µg Protein
aufgetragen. Die im Folgenden verwendete Bezeichnung der Populationen ist angegeben. Da der Doppelgipfel in
b) nicht hinreichend getrennt ist, wurden die entsprechenden Fraktionen vereinigt und als Population B2
behandelt.
Das SDS-Gel zeigt andererseits, dass der Gipfel B2 mehrere Banden im Bereich zwischen
NuoF und NuoB/I enthält, in dem sich beim Wildtyp die Antiporter-Untereinheiten befinden,
140
4. Ergebnisse
während der fragliche Massenbereich des Gipfels B1 nur eine Bande enthält (Abb. 4.51).
Diese Banden wurden mit Thermolysin behandelt und massenspektrometrisch analysiert. Die
Bande mit der geringeren apparenten Masse wurde erneut als NuoH identifiziert, was dem
Ergebnis früherer Analysen entspricht (vgl. Abb. 4.6). In keiner der Banden konnte das
fusionierte Protein MrpA’NuoL oder eine der anderen Antiporter-Untereinheiten identifiziert
werden.
B1
wurde
ohne
vorherige
Auftrennung
mittels
SDS-PAGE
zur
massenspektrometrischen Analyse gegeben, wobei zwar die Antiporter-Untereinheit NuoN,
aber nicht das funsionierte Protein MrpA’NuoL nachgewiesen werden konnte.
Im Zusammenhang mit diesen Arbeiten zeigte sich, dass auch der Komplex I aus dem
Wildtyp-Stamm in einigen Präparationen durch eine Anionenaustauschchromatographie an
Source 15Q in zwei Populationen aufgetrennt wurde (Abb. 4.53 a). Diese zeigten
übereinstimmende
NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase
Aktivitäten
von
jeweils
3.1 µmol·min-1·mg-1. Beide Populationen waren nach der Rekonstitution in Proteoliposomen
in der Lage, einen Protonengradienten aufzubauen und die SDS-PAGE zeigt keinen
offensichtlichen Unterschied (Abb. 4.53 b).
30
D
300
25
2
20
200
15
100
10
5
0
0
50
100
150
Volumen [mL]
200
2
c)
40
300
30
20
200
D
10
100
NaCl [mM]
1
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
b)
1
NaCl [mM]
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
a)
0
0
50
100
150
Volumen [mL]
0
200
Abb. 4.53: Verschiedene Populationen bei der Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q bei der
Aufreinigung des Komplex I aus dem Wildtyp-Stamm. a) zeigt das Elutionsprofil einer Chromatographie, bei
der zwei Populationen auftraten, diese sind mit 1 und 2 bezeichnet. b) zeigt das SDS-Gel der beiden
Populationen. Auf die Angabe der zugeordneten Komplex I Untereinheiten wurde verzichtet, sie entspricht der
Zuordnung in den vorherigen Abbildungen. c) zeigt das Elutionsprofil einer Chromatographie bei der nur eine
Population auftrat, hier wurde im Gegensatz zu a) während der gesamten Aufreinigung auf eine ununterbrochene
Kühlung geachtet. In den Elutionsprofilen sind jeweils die Absorbanz bei 280 nm in blau und die
Salzkonzentration in grün dargestellt. Der Durchfluss beim Auftrag auf die Säule ist jeweils mit D bezeichnet. In
a) wurde die Proteinlösung vor dem Auftrag auf die Säule verdünnt, um die Salzkonzentration zu verringern, in
c) wurde sie mehrfach aufkonzentriert und gewaschen.
141
4. Ergebnisse
Dennoch deutet das Auftreten zweier Populationen auf ein Problem hinsichtlich der Stabilität
der Präparation hin, da der vollständig assemblierte Komplex I Wildtyp in einem einzigen
Gipfel von der Anionenaustausch-Chromatographiesäule eluieren müsste. Eine genauere
Betrachtung der Ergebnisse zeigte, dass zwei Populationen immer dann auftraten, wenn
einzelne Arbeitsschritte während der Aufreinigung wie etwa das Austarieren von
Zentrifugenbechern oder die Überführung der Membranen in den Teflon-in-GlasHomogenisator bei Raumtemperatur erfolgten. Wurden hingegen alle Arbeiten konsequent
bei 4°C bzw. auf Eis ausgeführt, dann lieferte die Anionenaustauschchromatographie an
Source 15Q wie erwartet nur eine Population des Komplex I Wildtyps (Abb. 4.53 c). Dies
zeigt, dass der Komplex I bei Raumtemperatur sehr instabil ist und dass die ununterbrochene
Kühlung essentiell für die Qualität der Präparation ist.
Von der NuoL’MrpA-Variante wurden auch bei sorgfältiger Handhabung stets zwei
Populationen erhalten. Die zeigten NADH:Ubichinon Oxidoreduktaseaktivitäten von
1.0 ± 0.3 µmol·min-1·mg-1 (Population 1) bzw. 0.5 ± 0.3 µmol·min-1·mg-1 (Population 2),
was im Vergleich zum Wildtyp (4.2 ± 0.4 µmol·min-1·mg-1, vgl. 4.3.5) eine deutliche
Verringerung der Aktivität darstellt. Keine der Populationen war nach der Rekonstitution in
Proteoliposomen in der Lage, einen Protonengradienten aufzubauen. Dies deutet darauf hin,
dass die Variante instabiler ist als der Wildtyp und dass die Extraktion aus der Membran und
die chromatographische Aufreinigung der Variante mit den bislang untenommenen Versuchen
nicht möglich ist.
142
5. Diskussion
5. Diskussion
5.1 Die Bedeutung der horizontalen Helix für die Protonentranslokation
Der Mechanismus der Protonentranslokation durch den respiratorischen Komplex I, die Art
der Kopplung zwischen Elektronentransfer und Protonentranslokation, sowie der Umfang in
dem mögliche Kopplungsstellen zur Stöchiometrie von 4H+/2e- beitragen, sind noch
weitgehend
unverstanden.
Es
wurden
redoxgetriebene
(Brandt,
1997)
und
konformationsgetriebene (Brandt et al., 2003) Kopplungsmechanismen vorgeschlagen, sowie
gemischte
Mechanismen,
die
sowohl
redox-
als
auch
konformationsgetriebene
Protonentranslokation einschließen (Friedrich, 2001; Berrisford & Sazanov, 2009). Im
Hinblick auf gemischte Mechanismen wurde diskutiert, dass entweder drei Protonen über eine
indirekte, konformative Kopplung transloziert werden und eines über einen direkten,
redoxgetriebenen Mechanismus (Efremov et al., 2010) oder dass beide Mechanismen jeweils
zur Hälfte zur Stöchiometrie beitragen (Ohnishi et al., 2010b). Seit der erstmaligen
Beschreibung der horizontalen Helix des Membranarms des Komplex I wird insbesondere die
Rolle dieses ungewöhnlichen Strukturelements kontrovers diskutiert. Anhand der 2010
veröffentlichten Struktur, die erstmals die horizontale Helix am C-terminalen Ende der
Untereinheit NuoL zeigte, wurde von Efremov et al. (2010) vorgeschlagen, dass diese Helix
Konformationsänderungen von der Ubichinon-Bindestelle auf die Antiporter-Untereinheiten
NuoL, M und N im Membranarm überträgt. In diesem Zusammenhang wurde die horizontale
Helix von den Autoren mit dem Kolben einer Dampfmaschine verglichen. Dies schien
naheliegend,
da
ein
indirekter
Kopplungsmechanismus
die
Übertragung
von
Konformationsänderungen von der Ubichinon-Bindestelle bis zur über 100 Å entfernten
Untereinheit NuoL am distalen Ende des Membranarms erfordert und die horizontale Helix
ein verbindendes Element darstellt, das fast den gesamten Membranarm durchzieht. Basierend
auf Mutagenesestudien wurde von Belevich et al. (2011) hingegen postuliert, dass die
horizontale Helix nicht an der Protonentranslokation beteiligt ist, sondern lediglich ein
stabilisierendes Element im Membranarm darstellt.
Aus früheren Arbeiten in unserer Gruppe war bekannt, dass die ΔNuoL-Variante des E. coli
Komplex I, in der die gesamte Untereinheit NuoL deletiert ist, eine im Vergleich zum
Wildtyp halb so große Stöchiometrie von 2H+/2e- aufweist (Steimle, 2009). Dies war ein
erster Hinweis darauf, dass der anhand der Struktur von Efremov et al. (2010) vorgeschlagene
Mechanismus nicht korrekt ist und dass NuoL nur an der Translokation von zwei der vier
143
5. Diskussion
Protonen beteiligt ist. Um die Rolle der horizontalen Helix im Membranarm weiter zu klären,
wurden in der vorliegenden Arbeit Komplex I-Varianten erzeugt, präpariert und
charakterisiert, denen Teile dieser horizontalen Helix fehlen. Zum damaligen Zeitpunkt war
lediglich die Struktur des Komplex I aus T. thermophilus verfügbar, deren Auflösung von
3.9 Å für die Identifizierung einzelner Aminosäurereste nicht ausreichend war. Daher wurden
geeignete Positionen für die Einführung der gewünschten Mutationen anhand von
Sekundärstrukturvorhersagen und Sequenzvergleichen abgeschätzt. Durch Austausch des
Codons für T516 auf nuoL gegen ein Stop-Codon wurde eine Variante erzeugt, der die
gesamte horizontale Helix sowie die C-terminale TM Helix 16 fehlen. Die 2011
veröffentlichte Struktur des Membranarms des E. coli Komplex I mit einer Auflösung von
3.0 Å zeigt, dass sich die gewählte Position exakt am Übergang von der horizontalen Helix
zur TM Helix 15 befindet (vgl. Abb 4.1). Als Mitte der horizontalen Helix wurde die Position
Y544 abgeschätzt; der Vergleich mit der Struktur zeigt, dass der Variante Y544Stop etwas
mehr als die Hälfte der horizontalen Helix fehlt und dass die verkürzte Helix bis auf die Höhe
der Grenzfläche zwischen NuoL und NuoM reicht. In der Variante W592Stop schließlich ist
die gesamte horizontale Helix vorhanden; bei dieser Variante wurde die C-terminale TM
Helix 16 mit Ausnahme der ersten drei helicalen Aminosäuren deletiert.
Das Auftreten zweier Populationen bei der Präparation der Stop-Varianten, die wie bei der
Präparation der ΔNuoL-Variante durch eine Anionenaustausch-Chromatographie an Source
15Q aufgetrennt wurden, ließ zunächst vermuten, dass es sich bei dem aufgereinigten Protein
ebenfalls um eine ΔNuoL-Variante handelt. Es wäre denkbar, dass die horizontale Helix und
die TM Helix 16 als eine Art Anker benötigt werden, über den NuoL an den Rest des
Membranarmes bindet und dass die kürzere Helix dazu führt, dass NuoL vom Komplex
abdissoziiert. SDS-PAGE und massenspektrometrische Analyse der Präparationen bestätigten
jedoch die Anwesenheit der verkürzten Untereinheit NuoL zumindest in der ersten
Population, während der zweiten Population offensichtlich einige hydrophobe Untereinheiten
fehlen. Für die weiteren Untersuchungen wurde daher die erste Population (Gipfel 1)
verwendet.
Zur Abschätzung der H+/e--Stöchiometrie der Varianten wurden die Präparationen in
Proteoliposomen rekonstituiert und die Erzeugung eines Protonengradienten über die
Messung der ACMA-Fluoreszenz verfolgt. Hierbei zeigten Proteoliposomen mit Komplex I
im Mittel eine Fluoreszenzlöschung von 40% während Proteoliposomen mit den Varianten
W592Stop und Y544Stop 14% bzw. 12% Fluoreszenzlöschung zeigten. In den
144
5. Diskussion
Proteoliposomen liegen je nach Präparation 50-70% des Proteins mit der NADH-Bindestelle
nach außen orientiert vor. Um unterschiedliche Anteile an nach außen orientiertem und
gegebenenfalls auch an aktivem Protein zu berücksichtigen, wurde die NADH:Ubichinon
Oxidoreduktaseaktivität jedes Rekonstitutionsansatzes bestimmt und das beobachtete ACMASignal darauf normiert. Dies ist sinnvoll, da ausschließlich aktives und mit der NADHBindestelle nach außen orientiertes Protein zum Aufbau des Protonengradienten beiträgt. Eine
geringere Fluoreszenzlöschung bei ebenfalls verringerter Elektronentransferrate bedeutet
demnach keine reduzierte H+/e--Stöchiometrie, sondern weist auf einen höheren Anteil an
nach innen orientiertem oder inaktivem Protein hin. Eine geringere Fluoreszenzlöschung bei
gleicher Elektronentransferrate deutet hingegen auf eine reduzierte Stöchiometrie hin. In
diesem Sinne ist es nicht überraschend, dass die Absolutwerte von Fluoreszenzlöschung und
Elektronentransferrate von Messung zu Messung stark variierten, während das Verhältnis der
beiden Werte für eine Variante jeweils über alle Messungen hinweg konstant blieb. Der
Vergleich mit dem Wildtyp ergab, unter der Annahme dass dieser die allgemein anerkannte
Stöchiometrie von 4H+/2e- (Wikström, 1984; Bogachev et al., 1996; Galkin et al., 2006)
aufweist, für die W592Stop-Variante rechnerisch eine Stöchiometrie von 1.6 und für die
Y544Stop-Variante eine von 1.5 H+/2e-. Da nur ganzzahlige Werte sinnvoll sind, entspricht
dies am wahrscheinlichsten einer Stöchiometrie beider Varianten von 2 H+/2e-, da die H+/e-Stöchiometrie experimentell eher unterschätzt wird. Es ist anzunehmen, dass nicht alle
Proteoliposomen vollständig undurchlässig für Protonen sind und dass ein geringer Teil des
Proteins nicht rekonstituiert wurde, sondern noch in Lösung vorliegt. Dieses Protein würde
zur Elektronentransferrate, jedoch nicht zum Protonengradienten beitragen und somit eine
geringere Stöchiometrie vortäuschen. Die Varianten mit verkürzter Helix weisen somit die
gleiche H+/e--Stöchiometrie auf wie die ΔNuoL-Variante. Dies zeigt, dass NuoL an der
Translokation von zwei Protonen beteiligt ist und dass die C-terminale TM Helix 16 für die
Funktion von NuoL essentiell ist. Fehlt diese Helix, so kann die Untereinheit NuoL ihre
Funktion offensichtlich nicht mehr erfüllen. Die Deletion von TM 16 hat dieselbe
Auswirkung auf die Stöchiometrie wie die Deletion der gesamten Untereinheit. Es scheint
plausibel, dass die transmembrane Helix auf Konformationsänderungen reagiert, die von der
Ubichinon-Bindestelle ausgehen und dass diese Änderungen über die horizontale Helix an die
Antiporter-Untereinheiten NuoL und NuoM weitergeleitet werden. Die dritte AntiporterUntereinheit NuoN befindet sich im Gegensatz zu NuoL und NuoM auch ohne die horizontale
Helix in direktem Kontakt mit den weiteren Untereinheiten NuoA, NuoJ und NuoK, die
wiederum die Verbindung zur Ubichinon-Bindestelle herstellen. Somit ist es denkbar, dass die
145
5. Diskussion
konformationsgetriebene Protonentranslokation über NuoN durch die Deletion des Cterminalen Endes von NuoL nicht beeinträchtigt wird.
Eine Protonentranslokation von Proteoliposomen mit der T516Stop-Variante konnte nicht
gemessen werden, obwohl deren Elektronentransferrate geringfügig über der von
Proteoliposomen mit dem Wildtyp lag. Es ist denkbar, dass der Komplex ohne „Anker“ im
Membranarm instabil ist und während der Aufreinigung bzw. der Rekonstitution
kontinuierlich zerfällt. Allerdings wäre dann zumindest die geringere Stöchiometrie der
ΔNuoL-Variante zu messen gewesen. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass das Fehlen
des möglichen Kopplungselements in Form der horizontalen Helix zu einem zufälligen
Öffnen und Schließen von Protonenkanälen im Membranarm führt, wodurch der Aufbau eines
Protonengradienten verhindert wird. Auch für diese Erklärung gilt aber, dass derselbe Effekt
auch für die ΔNuoL-Variante zu erwarten wäre. Am wahrscheinlichsten erscheint, dass
aufgrund der Instabilität der T516Stop-Variante ein inhomogenes Gemisch aus intaktem und
teilweise dissoziiertem Komplex vorliegt, was die Ausbildung intakter Proteoliposomen
erschwert.
5.2 Die Rolle konservierter Reste auf der horizontalen Helix
Nachdem gezeigt wurde, dass die horizontale Helix des Membranarms des Komplex I für die
Translokation von zwei Protonen essentiell ist, sollte untersucht werden, ob einzelne
Aminosäurereste für ihre Funktion benötigt werden. In der Literatur wurde postuliert, dass die
Sequenz der horizontalen Helix keine konservierten Reste enthält (Efremov & Sazanov, 2011;
Bridges et al., 2011) während an anderer Stelle von der Existenz konservierter Aminosäuren
berichtet wird (Belevich et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit wurden Sequenzvergleiche
von Homologen der Untereinheit NuoL aus Prokaryoten und Eukaryoten erstellt und die
resultierenden Vergleiche miteinander verglichen. Es wurden zwei konservierte Aspartatreste,
D542 und D546 in E. coli, identifiziert, die ausschließlich in Prokaryoten konserviert sind und
ein weiterer, D563 in E. coli, der in allen Spezies konserviert ist. Interessanterweise befinden
sich all diese Reste in der Nachbarschaft von diskontinuierlichen TM Helices; D542 und
D546 liegen in der Nähe einer unterbrochenen Helix in NuoL und D563 befindet sich nahe
einer solchen Helix in NuoM. Es wurde berichtet, dass diskontinuierliche Helices mit einem
hydrophilen Bereich in der Mitte der Membran eine entscheidende Rolle bei der
Ionentranslokation durch Antiporter spielen (Screpanti & Hunte, 2007). Konservierte saure
146
5. Diskussion
Reste sind von besonderem Interesse, da diese protoniert und deprotoniert werden können und
somit möglicherweise an der Protonentranslokation beteiligt sind.
Um die Bedeutung der konservierten Aspartatreste für die Protonentranslokation zu
untersuchen, wurden diese jeweils gegen Asparagin ausgetauscht. Asparagin ist im Gegensatz
zu Aspartat nicht protonierbar, diesem aber strukturell sehr ähnlich. Dadurch sollte
ausgeschlossen werden, dass ein möglicher Einfluss der Mutation auf die Aktivität auf
strukturelle Veränderungen zurückzuführen ist. Die Asparagin-Varianten wurden präpariert
und
in
Proteoliposomen
rekonstituiert.
Die
Elektronentransferrate
und
die
+
Protonentranslokationsaktivität der Proteoliposomen wurde bestimmt und die H /e-Stöchiometrie im Vergleich zum Wildtyp abgeschätzt. Es zeigte sich, dass die Stöchiometrie
der D563N-Variante um ein Viertel auf 3H+/2e- reduziert ist. Derselbe Effekt wurde auch bei
den ebenfalls untersuchten Varianten D563E, D563Q und D563A beobachtet. Dies zeigt, dass
der konservierte Rest Asp563 für die Translokation von einem Proton essentiell ist. Dass auch
die Variante D563E eine verringerte Stöchiometrie aufweist deutet außerdem darauf hin, dass
nicht nur die protonierbare funktionelle Gruppe in der Seitenkette entscheidend ist, sondern
auch deren Länge. Offensichtlich ist die horizontale Helix an der betreffenden Position nicht
so flexibel, dass die ebenfalls protonierbare, aber längere Seitenkette von Glutamat die
Fuktion übernehmen könnte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wurde berichtet, dass
die Insertion von sechs oder sieben Aminosäuren an der Position P552 zu einer reduzierten
Stöchiometrie führt (Belevich et al., 2011). Durch das Einfügen zusätzlicher Aminosäuren in
die horizontale Helix wird vermutlich die Position von Asp563 relativ zum Membranarm
verändert, so dass der konservierte Rest nicht mehr an einer für die Protonentranslokation
benötigten Position zur Verfügung steht. Es ist denkbar, dass der konservierte Aspartatrest
Teil eines Wasserstoffbrückennetzwerks ist, über das Protonen in den Kanal in der AntiporterUntereinheit NuoM transportiert werden.
Die Mutationen D542N und D546N hatten keinen Einfluss auf die H+/e--Stöchiometrie, somit
sind diese Aminosäuren offensichtlich nicht an der Protonentranslokation beteiligt. Die
unveränderte Aktivität der D542N-Variante steht ebenfalls im Einklang mit den Ergebnissen
von Belevich et al. (2011). Die Position D546 wurde von den Autoren nicht als konserviert
beurteilt und daher nicht weiter untersucht. Weitere konservierte Reste in der Nähe der
diskontinuierlichen Helix von NuoL konnten auch in der vorliegenden Arbeit nicht
identifiziert werden. Es besteht die Möglichkeit, dass die verschiedenen Protonenkanäle im
Membranarm des Komplex I mit unterschiedlichen Mechanismen arbeiten. Diese Theorie
147
5. Diskussion
stimmt damit überein, dass die nicht essentiellen Reste Asp542 und Asp546 lediglich in
Prokaryoten vorkommen, während der essentielle Rest Asp563 in allen Spezies konserviert
ist. Denkbar ist auch, dass für den Mechanismus der Protonentranslokation lediglich ein
Wasserstoffbrückennetzwerk benötigt wird, die daran beteiligten Reste jedoch nicht in jedem
Fall konserviert sein müssen.
Durch den Sequenzvergleich wurde neben den sauren Resten Asp542, Asp546 und Asp563
auch Tyr594 als konservierter Rest identifiziert. Dieser Rest, der in den meisten Prokaryoten
und Eukaryoten vorkommt, ist Teil der C-terminalen TM Helix 16 von NuoL und bildet eine
Wasserstoffbrücke zu dem Rest Asp229 der benachbarten Untereinheit NuoN aus. Es wurde
vermutet, dass diese Wechselwirkung für die Verankerung des C-terminalen Endes von NuoL
im Membranarm notwendig sein könnte und dass die Deletion der H-Brücke die
Wechselwirkung von NuoL mit dem Rest des Membranarms abschwächen könnte. In
Analogie zur W592Stop-Variante wäre in diesem Fall eine verringerte H+/e--Stöchiometrie zu
erwarten. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurde das Tyrosin gegen ein Phenylalanin mit
geringen strukturellen Auswirkungen ausgetauscht und der Einfluss der Mutation und des
damit verbundenen Verlusts der H-Brücke auf die H+/e--Stöchiometrie untersucht. Die
Vermutung wurde jedoch nicht bestätigt, die Y594F-Variante zeigte im Vergleich zum
Wildtyp keine verringerte Aktivität. Somit ist die erwähnte Wasserstoffbrücke nicht
essentiell, vermutlich bestehen weitere Wechselwirkungen der TM Helix 16 von NuoL mit
der benachbarten Untereinheit NuoN, die für die Anbindung der Helix an den Membranarm
ausreichend sind.
5.3 Cystein-Scanning der horizontalen Helix
Um Art und Umfang einer möglichen Bewegung der horizontalen Helix zu untersuchen,
wurde ein Cystein-Scanning durchgeführt. Es wurden 15 Komplex I-Varianten dargestellt und
charakterisiert, bei denen jeweils eine Aminosäure auf der horizontalen Helix gegen Cystein
ausgetauscht wurde. Die selektive Markierung eingeführter Cysteinreste ist möglich, da der
E. coli Komplex I von Natur aus keine Oberflächencysteine besitzt (Pohl et al., 2010). Die
Markierung mit TMR-Maleimid gefolgt von der Analyse mittels SDS-PAGE wurde als
schnell durchzuführender Test auf die Markierbarkeit der untersuchten Positionen eingesetzt.
Das Ausmaß der Markierung im oxidierten sowie im reduzierten Zustand des Enzyms sollte
darüber hinaus Aufschluss über eine mögliche Konformationsänderung geben. Ein
148
5. Diskussion
unterschiedlicher Markierungsgrad in beiden Redoxzuständen würde auf eine veränderte
Zugänglichkeit der untersuchten Position und somit auf eine konformative Änderung an der
betreffenden Stelle hindeuten. Die Markierung mit der Spinsonde MTSL und der Vergleich
der EPR-Spektren in den beiden Redoxzuständen sollten weitere Hinweise auf mögliche
Konformationsänderungen liefern. Die Linienbreite des EPR-Signals von MTSL ist abhängig
von der Beweglichkeit der Spinsonde an der markierten Position. Eine veränderte Linienbreite
wäre somit ein Hinweis auf eine veränderte Beweglichkeit der Spinsonde aufgrund von
konformativen Änderungen in ihrer Umgebung.
Die zu mutierenden Positionen wurden anhand der Struktur des Membranarms des E. coli
Komplex I ausgewählt. An zwei Stellen wurde mit vier bzw. fünf aufeinanderfolgenden
Aminosäureresten jeweils eine komplette Umdrehung der horizontalen Helix untersucht,
weitere Positionen wurden aufgrund ihrer Orientierung ausgewählt.
Cytosol
Cytosol
b)
Membranarm
Membranarm
a)
Membran
Membran
Abb. 5.1 Darstellung ausgewählter Bereiche der horizontalen Helix in einer Helical Wheel-Projektion. Die
Blickrichtung weist vom distalen Ende des Membranarms aus entlang der Achse der Helix zur UbichinonBindestelle hin, die relative Orientierung zum Cytosol, zur Membran und zum Membranarm des Komplexes ist
angedeutet. a) zeigt die Projektion der Reste V550-S567 und b) die Projektion der Reste N566-L583. Die in der
vorliegenden Arbeit untersuchten Positionen sind benannt, die mit TMR markierbaren Reste sind pink
hervorgehoben. Es sind nur α-helicale Bereiche der Helix dargestellt, in denen sich mehrere untersuchte
Positionen befinden, die ebenfalls mit TMR markierbaren Positionen R529, R562 und Y590 fehlen daher in der
Abbildung. Der unterschiedliche Markierungsgrad der Positionen mit MTSL ist durch die Schriftgröße
angedeutet.
149
5. Diskussion
Es wurde angenommen, dass Reste der Helix, die in das Cytosol weisen, am ehesten
markierbar sein würden. Von den 15 untersuchten Positionen waren 7 mit TMR markierbar,
ihre Position relativ zum Membranarm ist in Abb 5.1 in Form einer Helical Wheel-Projektion
dargestellt. Es zeigte sich, dass die Annahme richtig war; es wurden überwiegend Positionen
markiert, die sich an der äußeren Seite der Helix befinden und die in Richtung Cytosol
weisen.
NuoM
NuoN
NuoL
NuoA
NuoK
NuoJ
R529
K551
R562 I571 A573 V574 Y590
oxidiert
42
17
11
18
14
79
66
reduziert
6
6
0
21
0
17
16
Abb. 5.2: Übersicht über die untersuchten Positionen der horizontalen Helix des Komplex I aus E. coli
(PDB: 3RKO). Die mit TMR markierbaren Positionen sind pink hervorgehoben und beschriftet. Die
Zahlenwerte geben den Markierungsgrad im oxidierten bzw. reduzierten Zustand in % an. Mutierte Positionen,
die nicht mit TMR markierbar waren, sind dunkelblau gefärbt.
Eine Übersicht über den Markierungsgrad der untersuchten Positionen ist in Abb. 5.2
dargestellt. Auffällig ist, dass die Positionen am Anfang und am Ende der horizontalen Helix
stärker markiert werden, als die in der Mitte. Dies gilt in beiden Redoxzuständen und ist
vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Helix eine gekrümmte Form besitzt, wodurch die
Positionen am Anfang und am Ende der Helix stärker dem Cytosol exponiert sind, während
die Helix in der Mitte wie eine schlecht gespannte Wäscheleine durchhängt und somit tiefer in
150
5. Diskussion
die Membran eingebettet ist. Alle markierbaren Positionen mit Ausnahme von I571C wiesen
einen höheren Markierungsgrad im oxidierten als im reduzierten Zustand auf. Dies deutet
einerseits darauf hin, dass tatsächlich eine Konformationsänderung der horizontalen Helix
beim Wechsel des Redoxzustands auftritt, andererseits schließt es einige mögliche
Bewegungen aus. Eine horizontale Verschiebung wie von Efremov et al. (2010)
vorgeschlagen scheint wenig plausibel, da sich in diesem Fall die Zugänglichkeit einzelner
Positionen nicht so gravierend ändern würde. Auch eine Drehung der Helix erscheint
unwahrscheinlich, da lediglich eine Position identifiziert wurde, die im reduzierten Zustand
besser zugänglich ist, obwohl mit den Positionen V550-L554 und I571-V574 zwei volle
Umdrehungen der Helix untersucht wurden. Bei einer Drehung müssten mehr Positionen
vorhanden sein, die im reduzierten Zustand eine besser zugängliche Lage einnehmen.
Denkbar ist ein Spannen bzw. Entspannen der Helix im Zuge der Redoxreaktion. Der
Vergleich der Strukturen des E. coli und des T. thermophilus Komplex I zeigt, dass der
gesamte Membranarm einschließlich der horizontalen Helix in E. coli stärker gekrümmt ist.
Möglicherweise stellen die unterschiedlichen Strukturen verschiedene Zustände des Enzyms
dar und die Helix wird durch die Redoxreaktion gestreckt. Falls dies zutrifft, ist anzunehmen,
dass im reduzierten Zustand die stärker gekrümmte und im oxidierten Zustand die
ausgestreckte Form vorliegt, was die unterschiedliche Zugänglichkeit der Positionen erklären
würde.
Da zunächst nur Positionen gefunden wurden, die im oxidierten Zustand besser mit TMR
markierbar waren, wurde ein Kontrollexperiment durchgeführt, um auszuschließen, dass der
bis zu diesem Zeitpunkt stets höhere Markierungsgrad im oxidierten Zustand auf die
unterschiedlichen Reaktionsbedingungen zurückzuführen ist. Aus früheren Arbeiten in
unserer Gruppe war die Komplex I-Variante NuoCD D187C vorhanden (Glessner, 2011).
Hier befindet sich der eingeführte Cysteinrest in einer exponierten Position im peripheren
Arm des Komplexes. Diese sollte besonders gut zugänglich sein und wurde daher als
Referenz für den relativen Markierungsgrad der untersuchten Positionen im Membranarm
verwendet. Außerdem ist aus röntgenkristallographischen Untersuchungen bekannt, dass die
Position D187 auf NuoCD im Zuge der Redoxreaktion keine Konformationsänderung
ausführt (Berrisford & Sazanov, 2009). Überraschenderweise wurde bei dieser Variante
dennoch ein verringerter Markierungsgrad im reduzierten Zustand beobachtet, somit kann
nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Effekt teilweise auf die Reaktionsbedingungen
zurückzuführen ist. Allerdings betrug der Unterschied zwischen den beiden Redoxzuständen
bei der Kontrollvariante nie mehr als 50% während der Markierungsgrad der NuoL-Varianten
151
5. Diskussion
im reduzierten Zustand relativ zum oxidierten stets um deutlich mehr als die Hälfte verringert
war. Somit ist die verringerte Markierbarkeit der untersuchten Positionen auf der horizontalen
Helix als signifikant zu betrachten. Die Markierung der I571C-Variante zeigte schließlich,
dass ein höherer Markierungsgrad im reduzierten Zustand ebenfalls möglich ist. Der
Unterschied zwischen den beiden Zuständen ist mit 18% bzw. 21% zwar nicht allzu groß, da
aufgrund des Kontrollexperiments jedoch im reduzierten Zustand ein um 15-30% verringerter
Markierungsgrad erwartet wurde, ist eine Zunahme um 3% als bedeutend einzuschätzen.
Alle 15 Varianten waren mit der Spinsonde MTSL markierbar, was damit zu erklären ist, dass
MTSL hydrophober ist als TMR-Maleimid und somit auch Positionen markiert, die tiefer in
die Membran eingebettet sind. Die EPR-Spektren der MTSL-markierten Varianten R529C,
L560C und Y590C zeigten geringe Unterschiede in der Linienbreite zwischen den beiden
Redoxzuständen. Die Breite der zentralen Resonanzlinie nimmt jeweils im reduzierten
Zustand leicht zu, was eine geringfügig eingeschränkte Beweglichkeit der Spinsonde
andeutet. Bei den restlichen NuoL-Varianten sowie bei der Variante NuoCD D187C ist kein
Unterschied zu erkennen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mittels EPRSpektroskopie lediglich geringfügige Konformationsänderungen einiger Positionen detektiert
wurden. Eine lokale Beweglichkeit bestimmter Reste erscheint daher wahrscheinlicher als
eine umfassende kolbenartige Bewegung der gesamten Helix wie sie von Efremov et al.
(2010) vorgeschlagen wurde. Lokale Konformationsänderungen auf der horizontalen Helix
könnten die Übertragung konformativer Änderungen über die hydrophile Achse in der Mitte
des Membranarms unterstützen, wie es kürzlich von derselben Gruppe vorgeschlagen wurde
(Baradaran et al., 2013). Solche lokalen Bewegungen einzelner Reste könnten auch zum
Transfer von Protonen in die Translokationskanäle beitragen, was mit der zuvor gezeigten
Bedeutung des konservierten Asp563 im Einklang stehen würde.
In der Struktur des Komplex I aus E. coli fällt auf, dass zumindest eine Windung der
horizontalen Helix an eine π-Helix erinnert, obwohl lediglich eine einzige π-artige
Wasserstoffbrücke zwischen Asp546 und Lys551 vorliegt. Es wurde berichtet, dass
peristaltische Verschiebungen von π-Helices eine funktionale Rolle in Proteinen spielen
(Cooley et al., 2010). Gegen eine solche Funktion des π-helicalen Bereichs auf der
horizontalen Helix spricht allerdings, dass beide Reste, die die π-artige Wasserstoffbrücke
ausbilden, in der vorliegenden Arbeit ohne Einfluss auf die Funktion des Komplexes mutiert
wurden. Eine ebenfalls mögliche Konformationsänderung wäre das Winden bzw. Entwinden
bestimmter Bereiche der α-Helix. Die horizontale Helix ist durch kurze, nicht-helicale
152
5. Diskussion
Bereiche unterbrochen, die sich in E. coli und T. thermophilus jedoch an unterschiedlichen
Stellen befinden. Die Struktur des Komplex I aus E. coli weist einen nicht-helicalen Bereich
bestehend aus den Resten Lys561 und Arg562 auf, während die Helix in T. thermophilus an
der entsprechenden Stelle nicht unterbrochen ist. Es ist denkbar, dass sich verschiedene
Bereiche der horizontalen Helix während der Redoxreaktion aufwinden, was auch die
unterschiedliche Krümmung der Helix in den verschiedenen Strukturen erklären würde.
Die Aktivität der meisten Cystein-Varianten war im Rahmen der Messgenauigkeit im
Vergleich zum Wildtyp unverändert, eine Ausnahme stellen lediglich die Varianten L560C
und N566C dar. Beide zeigten eine verringerte Elektronentransferrate und die L560CVariante zeigte zudem eine deutlich verringerte Protonentranslokationsaktivität. Somit kann
nicht ausgeschlossen werden, dass diese Positionen für den Mechanismus von Bedeutung sind
oder dass diese Mutationen den Komplex im Gegensatz zu den anderen Mutationen
strukturell destabilisieren.
Ursprünglich war geplant, eine doppelte Spinsondenmarkierung des Membranarms
einzuführen, um eine mögliche Bewegung der horizontalen Helix über EPR-spektroskopische
Abstandsmessungen näher zu untersuchen. Dies wurde jedoch verworfen, nachdem die TMRMarkierung und die EPR-Spektren der einfach spinsondenmarkierten Varianten gezeigt
hatten, dass nur geringe lokale Konformationsänderungen stattfinden. Sollte die doppelte
Markierung in zukünftigen Arbeiten dennoch von Interesse sein, so können die Konstrukte,
die im Rahmen dieser Arbeit dargestellt wurden, dafür als Grundlage verwendet werden. In
früheren Arbeiten wurde die Position T166 auf NuoM als geeignete Position für den
Austausch gegen Cystein und die Markierung mit einer Spinsonde identifiziert (Pohl, 2008).
Der Subklon pETBlue nuoM, der das nuoM Gen mit den flankierenden Bereichen enthält, die
für die λ-Red vermittelte Rekombination benötigt werden, sowie das Konstrukt pETBlue
nuoM T166C mit der gewünschten Mutation wurden hergestellt. Auf dem Expressionsvektor
pBADnuoHis nuoL R562C wurde das nuoM-Gen gegen die Selektionskassette nptIsacRB
ausgetauscht. Somit könnte das mutierte nuoM T166C bei Bedarf vom Subklon amplifiziert
und gegen die Kassette auf dem Zielvektor pBADnuoHis nuoL R562C nuoM::nptIsacRB
ausgetauscht werden. Das Gleiche müsste gegebenenfalls auch mit weiteren nuoL-Mutanten
durchgeführt werden. Das Einfügen der Selektionskassette auf nuoL hatte sich bereits in
früheren Arbeiten als problematisch erwiesen, da die Rekombination stets Konkatamere
lieferte, die in weiteren Arbeitsschritten getrennt werden mussten (Bajzath, 2009). Das
gleiche Problem trat auch in der vorliegenden Arbeit auf, wohingegen der Austausch von
153
5. Diskussion
nuoM gegen die Selektionskassette problemlos möglich war. Somit erscheint es im Hinblick
auf zukünftige Arbeiten in dieser Richtung sinnvoll, von den bereits dargestellten nuoLMutanten auszugehen und die Rekombination auf nuoM durchzuführen.
5.4 Stabilität der Komplex I Präparationen und Zuverlässigkeit der
ACMA-Messung
Die Komplex I Präparationen für die Elektronenmikroskopie wurden zusätzlich über eine
Superose 6 Gelfiltrationssäule aufgereinigt, um teilweise dissoziiertes Protein vom vollständig
assemblierten Komplex abzutrennen. Hierbei wurde ein Elutionsmaximum bei 12 mL
beobachtet, was dem Retentionsvolumen des vollständig assemblierten Komplex I entspricht.
Weiterhin zeigte das Elutionsprofil eine Schulter bei höherem Volumen (Abb. 4.38). Für die
elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden ausschließlich die Fraktionen unmittelbar um
das Elutionsmaximum verwendet. Dennoch zeigen die Aufnahmen eine sehr inhomogene
Präparation mit vielen kleineren Fragmenten. Dies spricht dafür, dass die Komplex I
Präparationen auch bei sorgsamer Handhabung nur mäßig stabil sind und während der
Aufbewahrung auf Eis, während der Probenvorbereitung und insbesondere beim Einfrieren
und Auftauen sukzessive zerfallen.
NMR-spektroskopische Untersuchungen an Komplex I, der nach dem in unserer Gruppe
etablierten Protokoll aufgereinigt wurde, zeigten, dass die Präparation nicht die in den Puffern
verwendete Menge von 0.1% DDM enthielt sondern etwa 1% (M. Schulte, pers. Mitteilung).
Es wird vermutet, dass die Membran der zur Ultrafiltration verwendeten Konzentratoren das
Detergenz zurückhält und sich dieses in der Präparation anreichert. Aufgrund dieser
Beobachtung wurde das Reinigungsprotokoll dahingehend angepasst, dass die Präparationen
nach der Affinitätschromatographie dreimal mit Puffer ohne Detergenz gewaschen wurden.
Dass durch diese Maßnahme die Stabilität der Präparation verbessert wird, zeigt die
spezifische NADH:Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität, die mit 4.2 µmol·min-1·mg-1 im
Vergleich zu 3 µmol·min-1·mg-1 bei früheren Präparationen (Pohl et al. 2007c; Steimle, 2009)
deutlich erhöht ist. Als essentiell für die Stabilität der Präparation erwies sich außerdem die
ununterbrochene Handhabung auf Eis bzw. bei 4°C. Wurden einzelne Arbeitsschritte während
der Aufreinigung auch nur für wenige Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, dann
wurden bei einer Anionenaustauschchromatographie an Source 15Q im Anschluss an die
Affinitätschromatographie zwei Populationen erhalten. Wurden hingegen alle Arbeitsschritte
154
5. Diskussion
konsequent bei 4°C durchgeführt, so wurde lediglich eine Population erhalten, wie es für eine
stabile, homogene Präparation zu erwarten ist. Dies deutet darauf hin, dass bereits eine leichte
Erwärmung während der Aufreinigung dazu führt, dass die Präparation teilweise zerfällt.
Trotz der Maßnahmen zur Verbesserung der Proteinstabilität zeigen auch neuere
elektronenmikroskopische Aufnahmen ähnlich inhomogene Präparationen wie die in der
vorliegenden Arbeit gezeigten (D. Kreuzer Deković, B. Böttcher, pers. Mitteilung). Auch die
analytische Größenausschlusschromatographie über eine Yarra SEC-4000 Säule zeigt
deutlich, dass in der Präparation neben dem vollständig assemblierten Komplex I Fragmente
mit geringerer molekularer Masse enthalten sind. Diese Erkenntnisse sind insbesondere bei
zukünftigen Untersuchungen an Komplex I und Varianten zu berücksichtigen.
Bei der Messung des ACMA-Signals zur Bestimmung der Protonentranslokationsaktivität fiel
auf, dass Proteoliposomen mit den nach der neuen Vorschrift aufgereinigten CysteinVarianten eine deutlich stärkere Fluoreszenzlöschung zeigten als Proteoliposomen mit den
früheren Präparationen der Stop- und Aspartat-Varianten. Dies ist einerseits plausibel, da
Präparationen, die nach dem modifizierten Protokoll erhalten wurden, auch eine höhere
Elektronentransferrate
aufweisen.
Andererseits
ist
dies
aber
problematisch,
da
Proteoliposomen nur eine begrenzte Menge Protonen aufnehmen können, bevor der pHGradient zu groß wird um redox-getrieben weitere Protonen entgegen den Gradienten zu
translozieren. Außerdem sind die Proteoliposomen nicht vollständig protonen-undurchlässig,
so dass ein Rückfluss von Protonen entlang des Gradienten auftritt (D’Alessandro et al.,
2008). Somit ist die Methode durch einen maximal messbaren pH-Gradienten limitiert, der
nicht von der Aktivität des untersuchten Proteins abhängt, sondern von der Kapazität der
Proteoliposomen. In zahlreichen Untersuchungen zur Protonentranslokation durch Komplex I
wird nicht die maximale Fluoreszenzlöschung sondern die Anfangssteigung des Signals zur
Auswertung herangezogen (Amarneh & Vik, 2003; Euro et al., 2008; Nakamaru-Ogiso et al.,
2010; Belevich et al., 2011). Diese stellt ein Maß für die Protonentranslokationsrate dar und
ist unabhängig von der Kapazität der Liposomen. Die Auswertung der Anfangssteigung lässt
außerdem einen exakteren Vergleich der gemessenen Aktivitäten zu als die Interpretation der
maximalen Fluoreszenzlöschung (P. Turina, pers. Mitteilung). Um sicher zu stellen, dass der
Protonengradient nicht zu schnell aufgebaut wird und das beobachtete Signal nicht von der
Reaktionszeit des ACMA abhängt, wurden Proteoliposomen mit einem geringeren
Proteingehalt verwendet. Aus diesem Grund wurde das Protein:Lipid-Verhältnis bei der
155
5. Diskussion
Herstellung der Proteoliposomen für die Aktivitätsmessungen mit den Cystein-Varianten von
1:6 auf 1:45 reduziert.
Zur Bestimmung der H+/e--Stöchiometrie wurde in Analogie zu den Stop- und AspartatVarianten zunächst versucht, das Verhältnis aus Anfangssteigung des ACMA-Signals und
Elektronentransferrate zu berechnen und durch Vergleich mit dem Wildtyp die Stöchiometrie
der Varianten abzuschätzen. Es zeigte sich, dass die Anfangssteigung der unterschiedlichen
Präparationen zwischen 5 und 60 % Fluoreszenzlöschung pro Minute variierte, was eine
quantitative Auswertung unmöglich macht. Ein Problem bei der Herstellung von
Proteoliposomen ist die Entstehung von Liposomen unterschiedlicher Größe. In früheren
Arbeiten wurde der Durchmesser von Proteoliposomen, die nach dem hier verwendeten
Protokoll hergestellt wurden, zu 100-1000 µm bestimmt (Stolpe, 2003). Durch Passieren der
Präparation durch eine Membran mit Hilfe eines Extruders können Liposomen einheitlicher
Größe erzeugt und somit die Reproduzierbarkeit der Messungen verbessert werden (Mui et
al., 2003). Nach der Extrusion von Proteoliposomen mit dem Wildtyp lag die gemessene
Anfangssteigung der Fluoreszenzlöschung zwischen 10 und 20% pro Minute, was eine
deutliche Verbesserung der Methode darstellt. Für die quantitative Bestimmung der H+/e-Stöchiometrie ist die Varianz der Messwerte, die mit unterschiedlichen Präparationen
desselben Proteins erhalten wurden, dennoch zu groß. Dies steht im Einklang damit, dass die
ACMA-Messung allgemein eher als qualitative Methode betrachtet wird (Amarneh & Vik,
2003; Belevich et al., 2011). Hinzu kommt die Problematik der oben diskutierten
Inhomogenität der Präparationen. Es ist möglich, dass die unterschiedliche Homogenität der
in den einzelnen Experimenten eingesetzten Präparationen einen Einfluss auf die Bildung der
Proteoliposomen hat. Aus diesen Gründen wurde bei den Cystein-Varianten auf die
Berechnung der Stöchiometrie verzichtet. Die meisten der untersuchten Varianten waren in
der Lage, unter gleichen Versuchsbedingungen ein Anfangssignal zu erzeugen, das im
gleichen Bereich lag wie das des Wildtyps. Im Rahmen der Messgenauigkeit wurde die H+/e-Stöchiometrie dieser Varianten im Vergleich zum Wildtyp als unverändert betrachtet.
Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, wie verlässlich die berechneten Stöchiometrien
der Stop- und Aspartat-Varianten sind. Es ist jedoch zu beachten, dass dort in mehreren
Einzelmessungen mit unterschiedlichen Präparationen für jede Variante stets dasselbe
Verhältnis zwischen Elektronentransferrate und Fluoreszenzlöschung beobachtet wurde. Die
maximale Fluoreszenzlöschung lag mit Werten von 20-40% auch deutlich unterhalb des
156
5. Diskussion
maximal messbaren Wertes. Dies und die gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse spricht
dafür, dass die ermittelten Stöchiometrien zutreffend sind.
Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde in Betracht gezogen, zum ursprünglichen Protokoll für
die Proteinreinigung zurückzukehren und die Protonentranslokationsaktivität der CysteinVarianten analog zu den Stop- und Aspartat-Varianten zu bestimmen. Dies wurde jedoch
verworfen, da die Verwendung von Protein mit erwiesenermaßen eingeschränkter Aktivität
für die Aktivitätsmessung nicht erstrebenswert ist.
5.5 Die Bedeutung konservierter Reste an der Ubichinon-Bindestelle
Die Mutagenese von Aminosäureresten in der Umgebung der Chinon-Kopfgruppe ergab, dass
die Mutation der konservierten Reste His224 und Tyr273 der Untereinheit NuoCD zu einer
deutlich verringerten Aktivität führt. Die aufgrund der Kristallstruktur (Baradaran et al.,
2013)
zu
erwartende
Bedeutung
dieser
Reste,
die
Wasserstoffbrücken
zu
den
Carbonylgruppen des Ubichinon-Kopfes ausbilden, wurde somit experimentell bestätigt. Im
Hinblick auf die Position Tyr273 steht dies im Einklang mit den Ergebnissen von Tocilescu et
al. (2010). Es zeigte sich, dass die Einfachmutationen H224M und Y273F jeweils zu einer im
Vergleich zum Wildtyp um etwa 50% verringerten NADH Oxidase-Aktivität führen. Werden
beide Positionen mutiert, so liegt die Aktivität im Vergleich zum Wildtyp unter 10%. Somit
wurde gezeigt, dass die Substratbindung durch den Austausch eines der koordinierenden
Reste beeinträchtigt, aber noch möglich ist. Der Austausch beider Reste führt hingegen zu
einem nahezu vollständigen Verlust der Aktivität. Durch die Auswahl möglichst
konservativer Mutationen sollte sichergestellt werden, dass die beobachteten Effekte
ausschließlich auf den Verlust der H-Brücken zurückzuführen sind und nicht etwa auf
weiterreichende strukturelle Änderungen.
Der IC50-Wert für den spezifischen Inhibitor Piericidin A wurde durch die Mutation Y273F
im Vergleich zum Wildtyp etwa verdoppelt, was auf eine geringere Affinität der Variante
nicht nur zum Substrat Ubichinon sondern auch zum Inhibitor Piericidin A hindeutet und
somit die funktionelle Bedeutung des Restes Tyr273 unterstreicht. Die Mutation H224M
hingegen hatte keinen Einfluss auf den IC50-Wert. Dies könnte darauf zurückzuführen sein,
dass der Inhibitor in ähnlicher, aber nicht auf exakt dieselbe Weise bindet wie das Substrat.
Piericidin A besitzt nur eine Carbonylgruppe; diese bindet an Tyr273, weshalb die Mutation
157
5. Diskussion
von His224 keinen Effekt hat. Ubichinon besitzt zwei Carbonylgruppen und bindet an beide
konservierte Reste, somit haben beide Mutationen einen Einfluss auf die Substratbindung.
Um die bisher gewonnenen Erkenntnisse zu verifizieren, ist der Austausch der fraglichen
Reste gegen weitere Aminosäuren sowie die Charakterisierung der isolierten Varianten von
Interesse. Dies ist Teil momentaner Arbeiten in unserem Arbeitskreis (I. Psarjow, pers.
Mitteilung).
5.6 Wechselwirkung des Komplex I mit der induzierbaren Lysin
Decarboxylase
In früheren Arbeiten war beobachtet worden, dass die Präparation der Komplex I-Variante
ΔNuoL in zwei Populationen vorliegt. Eine dieser Populationen enthält alle Kofaktoren und
weist eine Stöchiometrie von 2H+/2e- auf. Der zweiten Population fehlt das terminale Fe/SZentrum
N2,
sie
zeigt
dementsprechend
keine
Elektronentransfer-
und
Protonentranslokationsaktivität. In dieser Präparation ist stets die induzierbare Lysin
Decarboxylase LdcI in annähernd stöchiometrischer Menge vorhanden (Steimle, 2009).
Durch in vivo FRET-Messungen sollte untersucht werden, ob eine Wechselwirkung zwischen
LdcI und dem Komplex I bzw. der ΔNuoL-Variante auch unter physiologischen Bedingungen
in der Zelle auftritt oder ob die Anwesenheit von LdcI in der Präparation der Variante
lediglich ein Artefakt der Aufreinigung ist.
Hierzu wurde in der vorliegenden Arbeit ein E. coli Stamm erzeugt, in dem das Gen cadA, das
für die induzierbare Lysin Decarboxylase codiert, chromosomal mit dem Gen des gelb
fluoreszierenden Proteins YFP fusioniert ist. Das Plasmid pBADnuo nuoF-mCerulean zur
Überproduktion des mit dem blau fluoreszierenden Protein mCerulean fusionierten Komplex I
war aus früheren Arbeiten vorhanden (Erhardt, 2008). Zur Überproduktion der mit mCerulean
fusionierten ΔNuoL-Variante wurde nuoL auf dem vorhandenen Plasmid durch die nptIsacRB
Resistenzkassette ersetzt. Durch Transformation des dargestellten Stammes BW25113Δnuo
cadA-yfp mit dem entsprechenden Plasmid wurde jeweils ein FRET-fähiger E. coli Stamm
erzeugt, in dem die LdcI mit YFP und der Komplex I bzw. die ΔNuoL-Variante mit
mCerulean fusioniert ist. Das Paar mCerulean/YFP wird in der Literatur als für FRETMessungen geeignet beschrieben (Miyawaki & Tsien, 2000; Kentner & Sourjik, 2009).
158
5. Diskussion
Durch analytische Zuckergradientenzentrifugation wurde gezeigt, dass die Fusion mit
mCerulean die Assemblierung der Komplex I-Variante ΔNuoL nicht beeinträchtigt. Für den
entsprechend markierten Komplex I Wildtyp war dies in früheren Arbeiten bereits gezeigt
worden (Erhardt et al., 2014). Außerdem wurde gezeigt, dass die Assemblierung des
Komplex I in einem Stamm mit chromosomaler Deletion des cadA Gens ebenfalls nicht
signifikant beeinträchtigt ist. Anhand der Ergebnisse aus der vorliegenden Arbeit erscheint
eine mögliche Rolle der induzierbaren Lysin Decarboxylase als Chaperon für die
Assemblierung des Komplexes somit eher unwahrscheinlich. Dies steht im Widerspruch zu
früheren Arbeiten in unserem Arbeitskreis, in denen der Komplex I aus dem Deletionsstamm
BW25113 cadA::nptIFRT in früheren Fraktionen des Zuckergradienten sedimentierte als der
Komplex aus dem Referenzstamm BW25113, was gegen eine vollständige Assemblierung
spricht (Erhardt, 2011). Die Maxima der Aktivität lagen bei den Arbeiten von Erhardt (2011)
in Fraktion 14 bzw. 12 während in der vorliegenden Arbeit das Maximum der Aktivität in den
Gradienten beider Stämme in Fraktion 13 lag. Hierbei ist zu beachten, dass die Aktivität in
den benachbarten Fraktionen oft nur geringfügig unter dem Maximum liegt und dass die
Messung der NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität mit einem gewissen Fehler behaftet
ist. Somit ist fraglich, ob eine Verschiebung des Maximums um eine Fraktion im Rahmen der
Messgenauigkeit als signifikant anzusehen ist. Vollständig ausgeschlossen werden kann eine
Rolle von LdcI als Chaperon unter Berücksichtigung aller Ergebnisse nicht, sie wurde jedoch
auch nicht eindeutig nachgewiesen.
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der dargestellten Stämme zeigten eine Verteilung der
ΔNuoL-Variante über die gesamte Membran, wie sie in früheren Arbeiten auch für den
Komplex I beschrieben wurde (Erhardt et al., 2014), während sich die Lysin Decarboxylase
hauptsächlich auf wenige spots pro Zelle konzentriert. Diese Bereiche zeigten in den Zellen
des Stammes BW25113Δnuo cadA-yfp ohne Komplex I eine hohe Mobilität entlang der
Membran, während sie in dem FRET-Stamm mit der überproduzierten ΔNuoL-Variante
jeweils an einem Punkt an der Membran fixiert sind. Die auffallende Akkumulation der
chromosomal codierten LdcI in wenigen Bereichen innerhalb der Zelle wurde sowohl in
Abwesenheit des Komplex I als auch in Gegenwart der überproduzierten ΔNuoL-Variante
beobachtet und wird in der ASKA-Bibliothek auch für Zellen mit überproduzierter LdcI und
physiologischen Mengen an Komplex I beschrieben (Kitagawa et al., 2005; Genobase
Datenbank, Nara Institute of Science and Technology, Japan). Der Grund hierfür ist nicht
bekannt, ein offensichtlicher Zusammenhang mit dem Komplex I oder der Überproduktion
eines der beiden Proteine ist jedoch nicht festzustellen. Die unterschiedliche Dynamik der
159
5. Diskussion
LdcI in den verschiedenen E. coli Stämmen deutet auf einen allgemeinen Effekt der
Überproduktion bzw. der Mutation auf die Membran-Dynamik hin. Aus diesem Grund soll
die Co-Lokalisation in zukünftigen Arbeiten in Stämmen mit ausschließlich chromosomal
codierten Varianten untersucht werden (D. Kreuzer Deković, pers. Mitteilung).
Durch FRET-Messungen wurde eine Wechselwirkung der LdcI mit der Komplex I-Variante
ΔNuoL in vivo nachgewiesen. Die FRET-Effizienz lag bei 1.7 ± 0.5% und somit deutlich
höher als der Grenzwert für eine spezifische Wechselwirkung, der bei 0.5% liegt (Kentner &
Sourjik, 2009). Zwischen der LdcI und dem vollständig assemblierten Komplex I lag die
FRET-Effizienz bei -0.8 ± 0.2%, somit wurde hier keine Wechselwirkung nachgewiesen. Es
ist zu beachten, dass die Methode zwar keine falsch positiven Ergebnisse liefert, falsch
negative sind jedoch nicht auszuschließen. Ein zu großer Abstand der Fluorophore innerhalb
des Komplexes ist als Fehlerquelle zu vernachlässigen, da bei der Variante eine
Wechselwirkung nachzuweisen war und die Bindestelle der LdcI an den Komplex I bzw. die
Variante dieselbe sein sollte. Neben dem Abstand ist jedoch auch die Orientierung der
Fluorophore zueinander von Bedeutung (Förster, 1948) und es kann nicht ausgeschlossen
werden, dass konformative Unterschiede zwischen dem vollständig assemblierten Komplex I
und der Variante zu einer günstigeren Orientierung der Fluorophore führen und somit ein
positives Signal bei der FRET-Messung ermöglichen. Eine Wechselwirkung der LdcI auch
mit dem vollständig assemblierten Komplex ist aufgrund der vorliegenden Daten somit
unwahrscheinlich, aber nicht ausgeschlossen. Weiterhin ist zu beachten, dass ein Einfluss der
Überproduktion des Komplex I bzw. der ΔNuoL-Variante auf die Wechselwirkung mit der
LdcI nicht ausgeschlossen werden kann. Aufgrund der geringen Kopienzahl des physiologisch
produzierten Komplex I in der Zelle ist seine Überproduktion für die FRET-Messungen
jedoch unumgänglich.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen der ΔNuoL-Variante lieferten erste Hinweise auf eine
mögliche Bindestelle der LdcI an den Komplex I. Einige Klassen von Bildern, die aus
Aufnahmen der einzelnen Partikel ermittelt wurden, deuten eine zusätzliche Elektronendichte
im Bereich der Beuge der L-förmigen Struktur an. Somit würde die Bindestelle im Bereich
der Untereinheit NuoB liegen, was insofern interessant ist, als diese Untereinheit das Fe/SZentrum N2 enthält, das in der Population der ΔNuoL-Variante, die mit LdcI wechselwirkt,
fehlt. Dies könnte auf eine Rolle der LdcI im Zusammenhang mit dem Einbau des Fe/SZentrums oder als Marker für eine fehlerhafte Assemblierung hindeuten. Insgesamt ist die
Qualität der elektronenmikroskopischen Aufnahmen jedoch nicht ausreichend, um eine
160
5. Diskussion
zuverlässige Aussage über eine mögliche LdcI-Bindestelle an den Komplex I zu treffen. Dies
ist in erster Linie auf die bereits diskutierte mangelnde Homogenität der Präparationen
zurückzuführen.
Abschließend ist festzustellen, dass eine Wechselwirkung der induzierbaren Lysin
Decarboxylase mit der ΔNuoL-Variante, jedoch nicht mit dem vollständig assemblierten
Komplex I, in vivo nachgewiesen wurde. Art und Bedeutung dieser Wechselwirkung bleiben
ungeklärt, sie wurden auch im Zusammenhang mit weiteren Arbeiten in unserer Gruppe zu
diesem Thema diskutiert (Erhardt, 2011) und bleiben Gegenstand aktueller Untersuchungen
(D. Kreuzer Deković, pers. Mitteilung).
5.7 Austausch von NuoL gegen die homologe Untereinheit MrpA
Von Moparthi et al. (2011) wurde berichtet, dass die Überproduktion der Untereinheit NuoL
des E. coli Komplex I aus dem Na+-sensitiven Phänotyp einer B. subtilis ΔmrpA-Mutante den
ursprünglichen Phänotyp wieder herstellen kann. In früheren Arbeiten in unserer Gruppe
wurde der Versuch unternommen, NuoL in E. coli strukturell durch MrpA zu ersetzen
(Bajzath, 2009; Stahl, 2012). Es wurden Systeme mit einer chromosomal wie auch mit einer
episomal codierten Komplex I Chimäre verwendet, außerdem wurde ein gemischtes System
mit einer chromosomal codierten ΔNuoL-Variante und dem episomal codierten MrpA
eingesetzt (Stahl, 2012). In diesen Arbeiten wurden zunächst die mrpA-Gene aus Bacillus
subtilis und aus Bacillus pseudofirmus verwendet, in Versuchen zur Überproduktion und
Aufreinigung der Chimäre wurde jedoch ausschließlich mit MrpA aus B. pseudofirmus
gearbeitet. Ein Grund hierfür wird nicht genannt, vermutlich wurde bei den entsprechenden
molekularbiologischen Arbeiten das gewünschte Konstrukt mit dem mrpA-Gen aus B.
pseudofirmus (mrpA Bp) eher erhalten, so dass damit weiter gearbeitet wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Sofia Brander und Isabella Straub dazu
angeleitet, die vorangegangenen Arbeiten fortzuführen. Die Aufreinigung der chromosomal
codierten Chimäre erschien zunächst am erfolgversprechendsten, da MrpA in einer solchen
Präparation bereits nachgewiesen worden war (Stahl, 2012). Die Gelfiltration der Präparation
lieferte drei Populationen, von denen keine nach der Rekonstitution in Proteoliposomen
Protonentranslokationsaktivität zeigte. Aufgrund der bisherigen Ergebnisse wäre selbst für
den Fall, dass der Komplex I bis auf die deletierte Untereinheit NuoL assembliert und
lediglich MrpA nicht eingebaut wird, eine Stöchiometrie von 2H+/2e- zu erwarten, wie sie für
161
5. Diskussion
die ΔNuoL-Variante gemessen wurde. Offensichtlich ist die Präparation nicht hinreichend
stabil oder homogen.
Um für die weitergehende Auftrennung verschiedener Populationen der genetischen Chimäre
ausreichend Protein zur Verfügung zu haben, wurde diese überproduziert und aufgereinigt.
Die Anionenaustausch-Chromatographie an Source 15Q lieferte zwei Populationen. Die erste
eluierte in der Gelfiltration in einem homogenen Gipfel, während die zweite wiederum in
zwei Populationen aufgetrennt wurde. Lediglich bei einer der drei Populationen deuteten das
Retentionsvolumen und die Untereinheitenzusammensetzung der Präparation darauf hin, dass
es sich um die vollständig assemblierte Chimäre handeln könnte. Nachdem MrpA in
massenspektrometrischen Analysen einzelner Banden nicht nachgewiesen werden konnte,
wurde die gesamte Probe der fraglichen Population analysiert. Hierzu wurde neben Trypsin
auch das für hydrophobe Proteine geeignetere Thermolysin eingesetzt (S. Wiese, pers.
Mitteilung). MrpA wurde schließlich mit einer Sequenzabdeckung von 2% identifiziert, was
jedoch im Vergleich mit dem erwarteten Massenspektrum ein sehr niedriger Wert und somit
nicht als eindeutiger Nachweis anzusehen ist (S. Wiese, pers. Mitteilung). Die fragliche
Population zeigte zwar eine Elektronentransferrate, die der des Komplex I entspricht und
einige Präparationen waren auch in der Lage, nach der Rekonstitution in Liposomen einen
Protonengradienten aufzubauen. Diese Ergebnisse erwiesen sich jedoch als schlecht
reproduzierbar. Da außerdem die stöchiometrische Anwesenheit von MrpA nicht eindeutig
nachgewiesen werden konnte, wurde die Aufreinigung und Charakterisierung der Chimäre
NuoL::MrpA nicht weiter verfolgt.
In der Literatur wurde beschrieben, dass MrpA im Vergleich zu NuoL eine kürzere
horizontale Helix enthält (Virzintiene et al., 2013). Andererseits enthält MrpA zusätzliche Cterminale TM Helices, die in NuoL nicht vorkommen. Dies könnte den Einbau von MrpA
anstelle von NuoL in den Komplex I verhindern. Um dieses Problem zu umgehen, wurde eine
Komplex I-Variante dargestellt, bei der lediglich die ersten 14 TM Helices von NuoL gegen
die homologe Sequenz von MrpA aus B. subtilis ausgetauscht sind. Die horizontale Helix
sowie die benachbarten TM Helices 15 und 16 von NuoL wurden in der Fusionsvariante
MrpA’NuoL beibehalten. Auch dieser Ansatz lieferte bei der Präparation jedoch drei
Populationen der Variante, von denen keine in der Lage war, einen Protonengradienten
aufzubauen. Eine der Populationen kam anhand ihres Retentionsvolumens bei der
Gelfiltration als vollständig assemblierte Chimäre in Frage, eine weitere anhand ihrer
Untereinheiten-Zusammensetzung laut SDS-PAGE. Durch massenspektrometrische Analyse
162
5. Diskussion
konnte jedoch in keiner der Populationen die fusionierte Untereinheit MrpA’NuoL
nachgewiesen werden.
Von Moparthi et al. (2011) wurde bezweifelt, dass NuoL einen Komplex mit den MrpProteinen in B. subtilis bildet. Im E. coli Komplex I ist NuoL jedoch in einen komplexen
Mechanismus der Protonentranslokation involviert. Sollte MrpA in der Lage sein, NuoL in
E. coli funktionell zu ersetzen, so scheint dies nur möglich, wenn es auch dessen Position im
Gesamtkomplex einnimmt. Dass die Aufreinigung eines solches chimären Komplexes nicht
möglich war, könnte darauf zurückzuführen sein, dass er für die Extraktion aus der Membran
zu instabil ist. Aus diesem Grund soll in zukünftigen Arbeiten untersucht werden, ob mittels
analytischer Zuckergradientenzentrifugation eine vollständig assemblierte Chimäre in der
Membran nachzuweisen ist. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass, wie von
Moparthi et al. (2011) postuliert, NuoL unter gewissen Bedingungen die Funktion von MrpA
als Na+-Transporter in B. subtilis auch ohne Komplexbildung übernehmen kann, während
MrpA umgekehrt nicht in der Lage ist, die komplexe Rolle von NuoL im Mechanismus des
Komplex I zu übernehmen. Unabhängig davon ist festzustellen, dass die von Moparthi et al.
(2011)
publizierten
Daten
nicht
ausreichen,
um
Aussagen
über
eine
mögliche
Substratspezifität der Antiporter-Untereinheiten zu treffen. Beide Deletionsstämme, ΔmrpA
und ΔmrpD, sind Na+- und pH-sensitiv. Dass im Fall der ΔmrpA-Mutante nur durch
Produktion von MrpA oder NuoL und im Fall der ΔmrpD-Mutante nur durch Produktion von
MrpD oder NuoN der ursprüngliche Phänotyp wieder hergestellt werden kann, könnte darauf
hindeuten, dass sich die Antiporter-Untereinheiten aufgrund unterschiedlicher struktureller
Übereinstimmung nicht in beliebiger Kombination ersetzen können. Eine unterschiedliche
Funktion der Antiporter-Untereinheiten kann daraus jedoch nicht abgeleitet werden, da in
beiden Fällen durch Komplementation mit dem entsprechenden Protein der Na+- und pHinsensitive Phänotyp wieder hergestellt werden konnte.
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179
Anhang
Anhang
A.1 Sequenzierungen
Im Folgenden sind die Ergebnisse der DNA-Sequenzierung der in dieser Arbeit dargestellten
Konstrukte gezeigt. Es ist jeweils ein Ausschnitt des Chromatogramms gezeigt, der die
eingeführte Mutation enthält. Wenn nicht anders angegeben, ist das mutierte Codon rot
eingerahmt.
A-1: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL T516Stop mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-2: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL Y544Stop mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-3: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL W592Stop mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
I
Anhang
A-4: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D542N mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-5: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D546N mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-6: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D563N mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-7: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D563E mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-8: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D563Q mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
II
Anhang
A-9: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL D563A mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-10: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL Y594F mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-11: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL R529C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-12: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL V550C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-13: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL K551C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
III
Anhang
A-14: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL P552C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-15: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL F553C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-16: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL L554C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-17: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL L560C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
IV
Anhang
A-18: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL K561C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-19: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL R562C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-20: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL N566C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-21: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL I571C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
V
Anhang
A-22: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL P572C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-23: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL A573C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-24: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL V574C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
A-25: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoL Y590C mit dem Oligonucleotid nuoL_midi.
VI
Anhang
A-26: Sequenzierung des Vektors pETBlue nuoM T166C mit dem Oligonucleotid nuoM_sub_fwd.
A-27: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoCD H224M mit dem Oligonucleotid nuoCD_seq.
A-28: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoCD Y273F mit dem Oligonucleotid nuoCD_seq.
yfp
Arg Gly Cys Leu Gly
cadA
A-29: Sequenzierung der vom Chromosom des Stammes BW25113Δnuo cadA-yfp amplifizierten
Genfusion cadA-yfp mit dem Oligonucleotid Check-cadA-rev. Gezeigt ist der Ausschnitt des
Chromatogramms, der die Nahtstelle zwischen den fusionierten Genen enthält.
VII
Anhang
a)
b)
A-30: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis nuoCD H224M Y273F mit dem Oligonucleotid nuoCD_seq.
a) zeigt den Ausschnitt des Chromatogramms mit der Mutation H224M und b) zeigt den Ausschnitt mit der
Mutation Y273F.
nuoK
mrpA
A-31: Sequenzierung des Vektors pBADnuoHis mrpA‘nuoL mit dem Oligonucleotid nuoKseq. Gezeigt ist
der Ausschnitt des Chromatogramms, der den Anfang des in den Vektor eingefügten mrpA-Gens enthält. Rot
eingerahmt ist das Threonin-Codon das eingefügt wurde, um trotz Überlappung mit dem nuoK-Gen die
ribosomale Bindestelle und das Leseraster zu erhalten. Das Ende des nuoK-Gens ist blau eingezeichnet.
VIII
Anhang
Die für die Sequenzierungen verwendeten Oligonucleotide sind in Tab. A1 angegeben.
Tab. A1: Liste der für die Sequenzierungen verwendeten Oligonucleotide.
Oligonucleotid
Sequenz
Check-cadA-rev
5’-AAGCCAGCCGCCGAGAATAG-3’
nuoCD_seq
5‘-CGAACGCTAACTGGTATGAG-3‘
nuoKseq
5‘-GGTGAAGTGCTGAGCAATCG-3‘
nuoL_midi
5‘-CGTGAAAGGGGTAACTCAC-3‘
nuoM_sub_fwd
5‘-ACGTAGGTCGGATAAGCCGCCTTC-3‘
A.2 Vektorkarten
Die Vektorkarten der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Plasmide sind in den
Abbildungen A32-A50 dargestellt. Die codierten Strukturgene sind jeweils rot, regulatorische
Gene
und
Promotoren
grün,
Gene
für
Antibiotikaresistenzen
dunkelblau
und
Replikationsursprünge hellblau dargestellt. Restriktionsschnittstellen, die für die Klonierung
verwendet wurden, sind angegeben. Von den Plasmiden pCA24N nuoL, pCA24N nuoCD-gfp,
pETBlue K_nuoL_M und pBADnuoHis ist jeweils die Vektorkarte des Ausgangsplasmids
stellvertretend für alle Konstrukte gezeigt. Da sich durch das Einfügen einer Punktmutation
die Lage der Gene und somit die Vektorkarte nicht ändert, sind die Karten der dargestellten
Mutanten nicht separat dargestellt.
IX
Anhang
A-32: Vektorkarte des Plasmids pKD46. Gezeigt sind die λ-Red Gene gam, bet und exo, der ArabinosePromotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC, der Replikationsursprung R101 und das Gen bla, das für
die β-Lactamase codiert und eine Ampicillin-Resistenz vermittelt.
A-33: Vektorkarte des Plasmids p64YFP. Gezeigt sind das Gen des gelb fluoreszierenden Proteins yfp, der
Xylose-Promotor Pxyl und der Replikationsursprung ColE1. Das Gen bla codiert für die β-Lactamase und
vermittelt eine Ampicillin-Resistenz, cat codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine
Chloramphenicol-Resistenz.
X
Anhang
A-34: Vektorkarte des Plasmids pCA24N cadA. Gezeigt sind das Gen cadA, das für die Lysin Decarboxylase
codiert, der T5-lac Promotor mit dem regulatorischen Gen lacI, der Replikationsursprung ColE1 und das Gen
cat, das für die Chloramphenicol-Acetyltransferase codiert und eine Chloramphenicol-Resistenz vermittelt.
Neben der für die Klonierung verwendeten NotI-Schnittstelle ist auch die Bsp1407I-Schnittstelle dargestellt, die
zur Identifikation des Plasmids mittels Restriktionsanalyse verwendet wurde.
A-35: Vektorkarte des Plasmids pCA24N cadA-yfp. Das fusionierte Gen cadA-yfp codiert für die Fusion der
Lysin Decarboxylase mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP. Außerdem sind der T5-lac Promotor mit dem
regulatorischen Gen lacI und der Replikationsursprung ColE1 gezeigt. Das Gen cat codiert für die
Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Neben den für die
Klonierung verwendeten NotI-Schnittstellen sind auch die Bsp1407I-Schnittstellen dargestellt, die zur
Identifikation des Plasmids mittels Restriktionsanalyse verwendet wurden.
XI
Anhang
A-36: Vektorkarte des Plasmids pCA24N nuoCD-gfp. Gezeigt sind die Gene nuoCD und gfp, der T5-lac
Promotor mit dem regulatorischen Gen lacI und der Replikationsursprung ColE1. Das Gen cat codiert für die
Chloramphenicol-Acetyltransferase
und
vermittelt
eine
Chloramphenicol-Resistenz.
Die
Restriktionsschnittstellen für EcoRI und StyI, die zur Unterscheidung des Ausgangsplasmids von den
Punktmutanten verwendet wurden, sind dargestellt.
A-37: Vektorkarte des Plasmids pCA24N nuoL. Gezeigt sind das Gen nuoL, der T5-lac Promotor mit dem
regulatorischen Gen lacI und der Replikationsursprung ColE1. Das Gen cat codiert für die ChloramphenicolAcetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz.
XII
Anhang
A-38: Vektorkarte des Plasmids pETBlue-1. Gezeigt sind der T7-lac Promotor sowie das Gen lacZ alpha, das
unter der Kontrolle des tet-Promotors steht und für das Blue-White-Screening bei der Klonierung verwendet
werden kann. Außerdem sind die Replikationsursprünge pUC und f1 dargestellt. Das Gen bla codiert für die βLactamase und vermittelt eine Ampicillin-Resistenz.
A-39: Vektorkarte des Plasmids pETBlue K_nuoL_M. Gezeigt sind Teile des Gens lacZ alpha, in das bei der
Klonierung das Gen nuoL sowie ein Teil des Gens nuoK insertiert wurden. Außerdem sind der T7-lac Promotor
und der tet-Promotor sowie die Replikationsursprünge pUC und f1 dargestellt. Das Gen bla codiert für die βLactamase und vermittelt eine Ampicillin-Resistenz.
XIII
Anhang
A-40: Vektorkarte des Plasmids pETBlue nuoM. Gezeigt sind Teile des Gens lacZ alpha, in das bei der
Klonierung das Gen nuoM insertiert wurde. Außerdem sind der T7-lac Promotor und der tet-Promotor sowie die
Replikationsursprünge pUC und f1 dargestellt. Das Gen bla codiert für die β-Lactamase und vermittelt eine
Ampicillin-Resistenz. Neben den für die Klonierung verwendeten Schnittstellen für NheI und SmaI sind auch die
MluI-Schnittstellen gezeigt, die zur Unterscheidung des Ausgangsplasmids von der Punktmutante pETBlue
nuoM T166C verwendet wurden.
A-41: Vektorkarte des Plasmids pVO1100. Gezeigt sind das Gen nptI, das für die NeomycinPhosphotransferase codiert und eine Kanamycinresistenz vermittelt und das Gen lev, das für die Levansucrase
codiert und eine Saccharose-Sensitivität vermittelt. Zusammen bilden die beiden Gene die nptIsacRBSelektionskassette. Das Gen bla codiert für die β-Lactamase und vermittelt eine Ampicillin-Resistenz.
XIV
Anhang
A-42: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der Arabinose-Promotor
ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das Gen cat codiert für die
Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die PstI-Schnittstellen, die
zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet wurden, sind dargestellt.
A-43: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoCD::nptIsacRB. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das nuoCDGen wurde teilweise durch die nptIsacRB-Kassette, bestehend aus den Genen nptI und lev, ersetzt. Das Gen cat
codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die PstISchnittstellen, die zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet wurden,
sind dargestellt.
XV
Anhang
A-44: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das nuoLGen wurde durch die nptIsacRB-Kassette, bestehend aus den Genen nptI und lev, ersetzt. Das Gen cat codiert für
die Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die PstI-Schnittstellen,
die zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet wurden, sind
dargestellt.
A-45: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoL R562C nuoM::nptIsacRB. Gezeigt sind die Strukturgene
nuoA-N, der Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a.
Das nuoM-Gen wurde durch die nptIsacRB-Kassette, bestehend aus den Genen nptI und lev, ersetzt. Das Gen cat
codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die PstISchnittstellen, die zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet wurden,
sind dargestellt.
XVI
Anhang
A-46: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoF-mCerulean. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das nuoFGen ist mit dem Gen des blau fluoreszierenden Proteins mCerulean fusioniert. Das Gen cat codiert für die
Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die PstI-Schnittstellen, die
zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet wurden, sind dargestellt.
A-47: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoF-mCerulean nuoL::nptIsacRB. Gezeigt sind die
Strukturgene nuoA-N, der Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der
Replikationsursprung p15a. Das nuoF-Gen ist mit dem Gen des blau fluoreszierenden Proteins mCerulean
fusioniert. Das nuoL-Gen wurde durch die nptIsacRB-Kassette, bestehend aus den Genen nptI und lev, ersetzt.
Das Gen cat codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz.
Die PstI-Schnittstellen, die zur Analyse von Konstrukten nach der λ-Red vermittelten Rekombination verwendet
wurden, sind dargestellt.
XVII
Anhang
A-48: Vektorkarte des Plasmids pBAD mrpA Bs. Gezeigt sind das Gen mrpA aus Bacillus subtilis (Bs), der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung pBR322. Das Gen
bla codiert für die β-Lactamase und vermittelt eine Ampicillin-Resistenz.
A-49: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis nuoL::mrpA. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das nuoLGen wurde durch mrpA aus Bacillus pseudofirmus (Bp) ersetzt. Das Gen cat codiert für die ChloramphenicolAcetyltransferase und vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz.
XVIII
Anhang
A-50: Vektorkarte des Plasmids pBADnuoHis mrpA‘nuoL. Gezeigt sind die Strukturgene nuoA-N, der
Arabinose-Promotor ParaBAD mit dem regulatorischen Gen araC und der Replikationsursprung p15a. Das nuoLGen wurde teilweise durch mrpA ersetzt. Das Gen cat codiert für die Chloramphenicol-Acetyltransferase und
vermittelt eine Chloramphenicol-Resistenz. Die StyI-Schnittstellen, die zur Unterscheidung des Konstrukts vom
Ausgangsplasmid pBADnuoHis nuoL::nptIsacRB verwendet wurden, sind dargestellt.
XIX
Danksagung
Diese Arbeit entstand in der Zeit von 2010-2014 im Labor von Prof. Dr. Thorsten Friedrich
im Insitut für Biochemie an der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg. An dieser Stelle
möchte ich allen danken, die in vielfältiger Weise zum Gelingen der Arbeit beigetragen
haben.
Meinem Doktorvater Prof. Dr. Thorsten Friedrich danke ich für die Möglichkeit, nach meiner
Diplomarbeit in seinem Arbeitskreis weiter an dem interessanten Thema zu arbeiten.
Außerdem danke ich ihm für die angenehme Arbeitsatmosphäre und dafür, dass er in seinem
stets vollen Terminkalender trotzdem immer Zeit für ein freundliches und konstruktives
Gespräch fand, wenn das jeweilige Projekt dies erforderte.
Prof. Dr. Oliver Einsle danke ich für die Übernahme des Korreferats sowie die gute
Zusammenarbeit und seine Unterstützung während meiner Doktorarbeit, von der
Mitbenutzung seiner Laborausstattung bis zur Möglichkeit zur Teilnahme am Rhine-KneeMeeting 2013.
Ein herzliches Dankeschön geht auch an die guten Geister des Instituts, die einen
reibungslosen Laborbetrieb möglich machen und mir immer wieder hilfreich zur Seite
standen. Dies sind die Sekretärinnen Angelika Massler, Véronique Ragot, Linda Williams und
Christiane Zähringer-Steffens, die Techniker Manuel Grandy und Helmut Hamacher sowie
die technischen Angestellten Antonio Espin, Elke Gerbig-Smentek, Helga Lay, Philipp Lewe,
Dörte Thiel und Ulrike Weiser.
Dr. Daniel Wohlwend danke ich für die organisatorische Arbeit im Hintergrund, für hilfreiche
Tipps insbesondere zur Chromatographie und viele gute Gespräche zu fachlichen ebenso wie
zu fachfremden Themen.
Dr. Stefan Gerhardt gilt mein Dank für die gute Zusammenarbeit bei der Gestaltung,
Organisation und Betreuung der Praktika.
Einige der Experimente in dieser Arbeit wurden in Zusammenarbeit mit verschiedenen
Kooperationspartnern durchgeführt, denen ich herzlich danken möchte: Prof. Dr. Bettina
Böttcher an der University of Edinburgh für ihre freundliche und umfangreiche Unterstützung
bei der Elektronenmikroskopie, Prof. Dr. Victor Sourjik und Dr. Karin Grosse am Zentrum
für Molekulare Biologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg für die in vivo FRETMessungen sowie Prof. Dr. Peter Graumann und Dr. Felix Dempwolff am Institut für
Biologie II der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg für die Fluoreszenzmikroskopie. Mein
besonderer Dank gilt meinem Kollegen Dr. Heiko Erhardt, der an allen drei Projekten
mitgearbeitet und mich auf den Dienstreisen begleitet hat. In diesem Zusammenhang danke
ich auch den Mitarbeitern der Lufthansa, die nach längerer und nervenaufreibender
Diskussion schließlich doch bereit waren, die Proteinproben auf Trockeneis zu transportieren.
Den Mitarbeitern des Zentrums für Biosystemanalyse (ZBSA) der Albert-LudwigsUniversität Freiburg, Dr. Andreas Schlosser, Dr. Sebastian Wiese, Sarah Eitel, Stephanie
Lamer und Ulrike Lanner, danke ich für die Durchführung der massenspektrometrischen
Analysen und die freundliche Unterstützung bei der Auswertung der Daten. Mein Dank gilt
außerdem Prof. Dr. Susana Andrade, Nikola Schwarzer und Tobias Wacker aus unserem
Institut für die Unterstützung bei den Elektrophysiologie-Versuchen und der Extrusion von
Liposomen. Dr. Paola Turina von der Universitá di Bologna danke ich für hilfreiche Tipps zu
den ACMA-Messungen.
Christina Kress-Metzler danke ich für die netten und abwechslungsreichen Gespräche im
Kaffeeraum und für manchen Wegweiser durch den bürokratischen Dschungel.
Ein herzliches Dankeschön geht an Stefanie Bussenius von der IGA für ihre freundliche und
zuvorkommende Unterstützung bei der Bewerbung und der zweimaligen Verlängerung
meines Promotionsstipendiums.
Ich danke meinen Mitdoktoranden Sabrina Burschel, Katerina Dörner, Heiko Erhardt, Udo
Glessner, Emmanuel Gnandt, Jo Hoeser, Sascha Jurkovic, Doris Kreuzer Deković, Klaudia
Morina, Ina Psarjow, Marius Schulte und Marta Vranas sowie allen Studenten und
Praktikanten, die über die Jahre unseren Arbeitskreis bereichert haben. Mein besonderer Dank
gilt denjenigen Studenten, die zu Teilen dieser Arbeit beigetragen haben. Dies sind die
Diplomanden Vinzenz Bothe, Dorothee Krämer und Chris Schnick, die Masterstudenten Sofia
Brander, Stephanie Henrich und Isabella Straub, die Bachelorstudenten Hannah Dawitz, Beate
Garbers, Marco Janoschke, Bartlomiej Matlosz, Franziska Nuber und Max Willistein sowie
die Mitarbeiterpraktikanten Jennifer Beck, Anja Eichler, Mads Grüninger, Patricia Hegger,
Katharina Maurer und Jacob Schäfer.
Ein besonders herzliches Dankeschön geht an die Freunde und Kollegen aus den
Arbeitsgruppen Einsle und Andrade, mit denen ich weniger zusammen gearbeitet habe, aber
um so mehr Spaß neben der Arbeit hatte. Egal ob beim gemeinsamen Mittagessen, einem
Feierabendbier im CT oder bei der Sendung mit der Maus, unsere gemeinsamen
Unternehmungen waren immer eine schöne und willkommene Abwechslung vom
Arbeitsalltag. Mein besonderer Dank gilt Julia Schlesier, Simon Netzer, Eva-Maria Burger,
Nikola Schwarzer, Florian Kemper und Anton Brausemann. Dank euch waren es vier sehr
schöne Jahre, auf die ich immer gerne zurückblicken werde.
Der größte Dank gebührt meinen Eltern Irmgard und Karl Steimle, die mir das Studium und
die Promotion ermöglicht und mich dabei stets unterstützt haben. Danke für alles !