Morphologische und funktionelle Veränderungen peribronchialer

Kapitel 5
ZUSAMMENFASSUNG
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) wurde erstmals 1956 isoliert. Es ist eine der Hauptursachen
für Bronchiolitiden und Pneumonien bei Säuglingen und Kleinkindern. Die Infektion kann in
schweren Fällen zum Tode führen. Betroffene Kleinkinder klagen über zunehmenden Husten,
vermehrte Schleimbildung und Fieber. Eine dauerhafte Immunität besteht nicht. Die frühe
kindliche Rs-Virusinfektion scheint in der Pathogenese des intrinsischen Asthma bronchiale und
chronisch obstruktiver Atemwegserkrankungen von außerordentlicher Bedeutung zu sein [60]. Bei
Erwachsenen verläuft eine Rs-Virus Infektion zumeist asymptomatisch. Für Menschen mit
reduzierter Immunitätslage nimmt auch hier die Bedeutung solcher viraler Infektionen wieder zu.
Die Assoziation dieses Erregers mit dem Respirationstrakt und der in der Zellkultur scheinbar
typische zytopathische Effekt der Synzytienbildung haben diesem Virus seinen Namen gegeben.
Um die Grundlagen für die Wechselwirkungen zwischen Virusinfektion und bakterieller
Superinfektion zu ermitteln, gliedert sich die experimentelle Untersuchung in 4 Phasen.
Phase 1: Kultivierung peribronchialer Drüsenepitelzellen. Organisation und Etablierung eines
geeigneten In-vitro Systems.
Phase 2: Infektion mit RSV von peribronchialen Drüsenepithelzellen und Darstellung der
morphologischen und funktionellen Veränderungen.
Phase 3: Stimulation der sekretorischen Aktivität infizierter und nicht-infizierter peribronchialer
Drüsenepithelzellen.
Phase 4: Exploration der Sekretion von antioxidativen Enzymen am Beispiel der Katalase von
peribronchialen Drüsenepithelzellen.
In Phase 1 steht die Organisation und Etablierung eines geeigneten In-vitro Systems, wie das der
peribronchialen Drüsenepithelzellkultur im Vordergrund. Das etablierte System der Primärkulturen
eignet sich dazu tierexperimentelle Befunde In-vitro an den humanen bronchialen
Drüsenepithelzellen zu verifizieren. Sie bietet den Vorteil, daß sie ein immer beschaffbares und
zuverlässiges Substrat für Experimente darstellt. Die Infektion mit RSV kann systematisch über
einen Zeitraum von bis zu 72 Stunden beobachtet und die ultrastrukturellen Veränderungen an den
PDEZ mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie und der konfokalen Laser-Raster
Mikroskopie (CLSM) dokumentiert werden.
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In der Phase 2 werden die morphologischen und funktionellen Veränderungen an infizierten und
nicht-infizierten Zellen untersucht Im Vordergrund stehen die morphologischen Zellveränderungen im Verlauf der Virusinfektion zu verschiedenen Zeitpunkten (0 - 48 h post
infectionem). Der Einsatz verschiedener immunologischer und morphologischer Techniken erlaubt
die Rekonstruktion der Interaktion der Viren mit den Wirtszellen und den daraus folgenden
Störungen der Zellfunktion. Es werden monoklonale Antikörper aus der Maus gegen das F-, G-,
M2, P- und N- Protein in mehreren Infektionsreihen zu unterschiedlichen Zeitpunkten (1, 4, 8, 12,
24, 36 und 48 h post infectionem) an der peribronchialen Zellkultur getestet. Nicht-infizierte
peribronchiale Drüsenepithelzellen bilden unter Kulturbedingungen einen zusammenhängenden,
monomorphen Zellrasen aus. Sie haben eine zylindrische bis ovaläre Gestalt mit zentral gelegenem
Zellkern. Nach 8 bis 16 Stunden Inkubation mit dem Rs-Virus wird eine zunehmende
Vakulosierung des Zytoplasmas und eine
zunehmend rundere Gestalt beobachtet. Das
monomorphe Bild der Anordnung ist aufgehoben. Die Zellgrenzen verwischen langsam und
scheinen in einander überzugehen. Nach 24 Stunden Inkubationszeit haben sich erste Riesenzellen
ausgebildet. Nach 36 Stunden Inkubationszeit sind die physiologischen Funktionen der Zellen sehr
stark beeinträchtigt, was sich aus immunhistochemischen Untersuchungen zur sekretorischen
Aktivität der PDEZ ergeben hat. Des weiteren findet sich ein sehr großer Anteil (2/3) an
Riesenzellen nach 36 Stunden Inkubation in der infizierten Kultur wieder. Teilweise sind die Zellen
nekrotisch. Nach 48 Stunden dominieren die mehrkernigen Riesenzellen das histomorphologische
Bild. Die Zellen sind massiv aufgetrieben und vakuolisiert, eine Stimulation der sekretorischen
Aktivität ist nicht mehr möglich. Der Zelltod steht kurz bevor. Perivakuolär finden sich ringförmige
Strukturen, die in den fluoreszenz-mikroskopischen Aufnahmen als Virusfabriken identifiziert
wurden (siehe Abb.27).
Zweck der 3. Phase ist die Stimulation der sekretorischen Aktivität der peribronchialer Drüsenepithelzellen. Sekret bzw. Sekretbestandteile sind wichtige Teilkomponenten der bronchialen
Reinigungs- und Abwehrmechanismen. Es kann durch Infektionen des Bronchialepithels zum
Versagen der mukoziliären Clearance kommen. Unspezifische und spezifische Abwehrreaktionen
unterhalten z.B. durch Entzündungsmediatoren die Entzündungsreaktion. Entzündungsmediatoren
wirken nicht nur lokal, sondern evtl. auch auf die sich in der subepithelialen Bindegewebsschicht
befindlichen peribronchialen Drüsen. Phase 3 untersucht die stimulatorische Wirkung u.a. von
Histamin und Acetylcholin auf die sekretorische Aktivität peribronchialer Drüsenepithelzellen
(PDEZ). Morphologisch zeigt sich nach einer Infektion der PDEZ mit einem RSV Stamm der
Gruppe Long A und einer Stimulation mit Histamin (10-2 M), Terbutalin (10-3 M) und Acetylcholin
(10-3 M), eine Sekretbläschenbildung in der Peripherie der Zellen. Die Stimulantien wirken an den
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PDEZ unterschiedlich schnell. Histamin bewirkt eine schnelle und kurze Reaktion an der Zielzelle.
Parasympatikomimetika (Acetylcholin) und Sympatikomimetika (Terbutalin) haben die gleiche
Wirkung an den Zielzellen. Es dauert jedoch im Verlauf der Stimulation zeitlich länger, bis es zu
einer Reaktion an der Zielzelle kommt..
In Phase 4 wird die Sekretion antioxidativer Enzyme exploriert. Zusammen mit dem GlutathionRedox-Zyklus und der Myeloperoxidase besteht die Hauptaufgabe des Metalloproteins Katalase
darin, H2O2 durch die Umwandlung in H2O und O2 zu eliminieren Neben der Stimulation der
sekretorischen Aktivität wird auch der Einfluß der viralen Infektion auf die Bildung antioxidativer
Enzyme untersucht. Dabei spricht man vom sogenannten „oxidativen Streß“. Als oxidativen Streß
wird die Imbalance zwischen Oxidantien und Antioxidantien zugunsten der Oxidantien bezeichnet.
Diese Situation führt zur Inaktivierung von Antiproteinasen, zur Destruktion des
Atemwegsepithels, zur Hypersekretion von Mukus, gesteigertem Influx von neutrophilen
Granulozyten in die Lungen, zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und Genexpression von
proinflammatorischen Mediatoren. Das Leitenzym der Peroxisomen - die Katalase- ist an der
Eliminierung zytotoxischer Sauerstoffradikale beteiligt. Dabei stellte sich in den Untersuchungen
heraus, daß peribronchiale Drüsenepithelzellen in Abhängigkeit von der Dauer der Virusinfektion
in unterschiedlichem Maße Katalase produzieren bzw. sezernieren.
Es zeigt sich, daß die Konzentration an messbarer extrazellulärer Katalase (semiquantitativer
Nachweis mit ELISA) nur bei den infizierten PDEZ ansteigt. Bei den nicht infizierten, nichtstimulierten bzw. stimulierten PDEZ gab es keine messbare Erhöhung der Katalase.
Möglichweise bedeutet das, daß erst ein externer Stimulus (virale Infektion, bakterielle
Kontamination,
Schadstoffbelastung)
dazu
führt,
daß
die
Zelle
antioxidative
Abwehrmechanismen in Gang setzt.
Peribronchiale Drüsenepithelzellen lassen sich mit dem Rs-Virus infizieren. Die Virusreduplikation bzw. die Bildung viraler Proteine läßt sich morphologisch erfassen. Die
Virusinfektion führt zur Veränderung (Hyper- und Hypokrinie) der sekretorischen Aktivität
peribronchialer Drüsenepithelzellen. Die Bildung und die Sekretion von antioxidativen
Substanzen wird durch die Virusinfektion beeinträchtigt.
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