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VIREN-II Systematik der Viren IV. Systematik - VIRUSFAMILIEN Baltimore-Klassen Herpesviren Adenoviren dsDNA Papillomviren DNA-Viren Poxviren ssDNA dsRNA RNA-Viren (+)ssRNA Parvoviren Reoviren Picornaviren Orthomyxoviren 1 (-)ssRNA Rhabdoviren Retroviren (+)ssRNA RT-Viren dsDNA Hepadnaviren FOLIE 1 Baltimore-Klassen Die Viren sind in Familien eingeteilt. Die Familen können in 3 grosse Gruppen eingeteilt werden: (1) DNA-Viren, (2) RNA-Viren, und (3) RT-Viren (RT: reverse Transkriptase). Die weiteren Gruppen sind in der Abbildung gezeigt. Nach David Baltimore nennen wir die Gruppen über Familien als Baltimore-Klassen. FOLIE 2, 3 HERPESVIREN: Die Herpesviren können in 3 Subfamilien eingeteilt werden: (1) -Herpesviridae: Herpes simplex Virus Typ 1 und 2 (HSV-1,-2), Varicella-Zoster Virus (VZV) (2) -Herpesviridae: Humaner Zytomegalovirus (HCMV) (3) -Herpesviridae: Epstein-Barr Virus (EBV) HSV-1: verursacht Lesionen am Gesicht, Auge und Lippen HSV-2: genitale Lesionen; VZV: Windpocken und Gürtelrose; HCMV: infektiöse Mononukleose EBV: spielt bei der Entstehung bestimmter Tumoren eine Rolle. Wir kennen mehr als 1oo unterschiedliche Herpesviren, die Wirtsorganismen von welchen Säugetiere, Vögel, Fische, Reptilien, Amphibien und Weichtiere sein können. Acht EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © VIREN-II menschenpathogene Herpesviren sind bekannt. Ihre wichtige Eigenschaft ist, dass sie im Wirtsorganismus eine lebenslang persistierende Infektion verursachen (Latenz), nachdem sie es einmal infiziert haben. Sowohl die primäre Infektion, als auch die Infektion aus dem latenten Stadium können einen unterschiedlichen Ablauf haben: symptomlose, oder wechselvoll ernsthaftige Krankheiten verursachende Infektionen. Der Ablauf der Infektion hängt von der Wechselwirkung zwischen dem Wirt und dem gegebenen Virus ab, hauptsächtlich wird es vom Immunstatus des Wirtes beeinflusst. Die meissten Erwachsenen sind mit diesen Viren infiziert, generell sind die aber in einem latenten Stadium im Organismus. Die Herpes simplex Viren Typ 1 und 2 (HSV-1 und HSV-2) infizieren erstmal die Zellen der Mund- und genitalen Schleimhaut und die Epithelzellen der Hornhaut. Demnächst kann der Virus in die Apophysen der dortigen Neuronen gelangen und in die Richtung ihrer Zellkerne transportiert werden, wo sie latente Infektion ausbilden kann. HSV-1 infiziert am häufigsten Säuglinge zwischen dem Alter von 6 und 18 Monaten durch die Schleimhaut oder Haut des Mundes und der Nase. Aus dem latenten Stadium kann der Virus im Fall der Schwäche des Immunsystems des Wirtes oder im Fall von Stress reaktiviert werden. Während der Reaktivation (Wechsel von dem latenten Stadium auf produktive Infektion) werden neue Viren produziert, die dann zur urprünglichen Stelle der Infektion transportiert werden, wo sie die produktive Infektion der Epithelzellen verursachen, das ist der wohl bekannte Herpes. In Kranken mit einem geschwächten Immunsystem können auch solche schwere Komplikationen vorkommen, wie zB. Enkephalitis (Hirnmassenentzündung), welche im Fall einer späten Diagnose zum Tod führen kann. HSV-2 ist eine auf dem sexuellen Weg verbreitete Krankheit, Ursache des genitalen Herpes. Bei Neugeborenen kann es schwere Komplikationen verursachen. Der Varicella-Zoster Virus infiziert Kinder, die dadurch verursachte Krankheit ist Windpocken. Während der Infektion gelangt der Erreger in den Blutkreis und verursacht Exanthemen. Der Virus gelangt auch in die Neuronen, wo es eine latente Infektion ausbilden kann. Der im sensorischen Ganglion steckender Virus wird im Fall der Schwäche des Immunsystems reaktiviert, und es verursacht kleine, blasige Veränderungen an der Haut, charakteristisch in einem Streifen an einer Seite. Dieses Symtom nennen wir Gürtelrose, welche meisstens am Körper oder am Mund erscheint. Die Infektion durch den humanen Cytomegalovirus ist meisstens symptomlos oder nur milde Symptome erscheinen. Im Fall von Schwangerschaft kann es aber gefährlich werden: es kann durch die Plazenta durchkommen und den Embryo infizieren, was für den Embryo lebensgefährlich sein kann. Wenn der Embryo die Infektion überlebt, Gehörschädigung und mentale Retardation können zurückbleiben. Im Fall der Schwäche des Immunsystems (AIDS-Krankheit, transplantierte Patienten, Krebskranken) kann es sich in solchen schweren Formen manifestieren, wie Lungenentzündung oder Hepatitis. Der Epstein-Barr Virus (EBV) wird durch Speichel verbreitet, und infiziert erstmal die Oberhautzellen, dann wird es auf B-Zellen verbreitet, in welchen es eine lebenslange Latenz ausbildet. 90% der Menschen sind infiziert, die meissten treffen sich im ersten Lebensjahr mit dem Virus, wenn es keine oder nur milde Symptome verursacht. In den entwickelten Ländern kommt es vor, dass die Person sich erst während dem Teenageralter oder später mit dem Virus trifft, in diesem Fall verursacht es infektiöse Mononukleose (anders Kussfieber). Die langstreckige Persistenz des Virus ist gefährlich, es spielt bei der Herausbildung von mehreren Tumoren eine Rolle. FOLIE 4 Virion des Herpesvirus Herpesviren haben ein relativ komplexes Virion, welches aus vielerleien Proteinen aufgebaut wird. Das Virion selbst besteht sich aus drei gut separierten Einheiten: Nukleokapsid (Kapsid + DNA), Tegument und Hülle. Das Virusgenom ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül, die Grösse von welchem zwischen 125 und 240 kb ist, abhängig von dem Herpesvirusart (HSV: 150 kb – 1 kb = 1000 Basen). Die virale DNA befindet sich innerhalb dem ikosaedrischen Kapsid (Ikosaeder = eine durch 20 regelmässigen Dreiecken begrenzte Struktur). Ausserhalb dem Kapsid befindet sich das Tegument, welches mindestens fünfzehnerleie Proteine und einige virale mRNAs enthält. Die äusserste Schicht des Virions ist die Hülle, an welcher sich eine grosse Anzahl von aus 10 oder mehreren Proteinen bestehenden Stacheln befindet (die Stachel sind von dem Virus kodierte Glükoproteinmoleküle). Der grosse Teil der Strukturproteine wurden VP (Virusprotein) genannt. Im Fall von HSV-1 bestehen sich die Kapsomere aus VP5: das Penton bilden 5, das Hexon bilden 6 VP5 Moleküle. Die Triplexe bestehen sich aus zwei Proteinen, ihre Funktion ist die Verknüpfung von VP5 und VP6 Molekülen. EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 2 VIREN-II FOLIE 5 HSV-1 Genomorganisation Das HSV Genom besteht sich aus zwei individuellen Sequenzen, an der Grenze der beiden gibt es eine sich zweimal wiederholende Region. Die zwei individuellen Regionen sind unterschiedlich lang, die kürzere nennen wir US (unique short), während die längere wird UL (unique long) genannt. Von dem Genom des HSV-1 werden mRNAs transkribiert, die 74 unterschiedliche Proteine kodieren, nicht translatierte RNAs sind aber auch bekannt. Auch die wiederholenden Regionen enthalten Gene, welche dadurch im Genom in zwei Kopien vorhanden sind. FOLIE 6-11 Replikation des HSV-1 Der Wirtsorganismus des HSV ist ausschliesslich der Mensch, im Laboratorium können aber auch unterschiedliche andere Spezies damit infiziert werden. FOLIE 6 Adsorption und Penetration Im Fall einer Infektion bindet das HSV-1 Virion zuerst an Heparan-Sulphat (Teil der Zelloberflächenproteoglykane), dann zum Hauptrezeptor der Penetration. Die letzteren können vielerleie Zelloberflächenmoleküle sein, meisstens Nektine, welche Zelladhesionsmoleküle sind. Nach der Bindung verschmilzt die Hülle mit der Plasmamembran (Fusion). Nach der Penetration gelangen das Tegument und das Nukleokapsid ins Cytoplasma und werden in die Richtung des Zellkerns weiter transportiert, wo die Virusreplikation erfolgt. Wenn die Wirtszelle ein Neuron ist, dann ist der Weg lang, trotzdem wird das Nukleokapsid mit einer überraschenden Geschwindigkeit entlang der Mikrotubuli in die Nähe der Kernpore transportiert. Demnächst gelangt die lineare virale DNA in den Zellkern, wo es sich zu einem kovalent geschlossenen Ring bildet. Die Proteine des Teguments spielen eine wichtige Rolle in dieser frühen Phase der Virusinfektion, zB. sie verursachen die Verringerung der DNA-, RNAund Proteinsynthese des Wirtes. Das eine bekannte Protein (virion host shut-off, VHS) degradiert zB. die mRNAs des Wirtes. Andere Tegumentproteine, zB. das VP16 Protein (verantwortlich für die Aktivation der Virusgene) wird in den Zellkern transportiert und knüpft die virale DNA an. FOLIE 7 Transkription und Translation Die Gene der Herpesviren können an Hand dem Zeitpunkt ihrer Expression in drei Gruppen eingeteilt werden: sofortige frühe (immediate early; IE), frühe (early; E) und späte (late; L) Gene. (1) IE Gene Diese Gene werden von VP16 aktiviert, und nämlich so, dass es zu einem Oct-1 enthaltenden Zellproteinkomplex bindet, welcher zur in den Promotern von allen IE Genen vorhandenen TAATGARAT Sequenz bindet. Nach der Bindung funktioniert VP16 als Transkriptionsfaktor und zieht das RNAPolymerasemolekül des Wirtes und andere für das Initiationskomplex nötige, zusätzliche Proteine (Oct-1 bildet die DNA-bindende Untereinheit des entstandenen Transkriptionsfaktors, während das virale VP16 die Transaktivatoruntereinheit ist) zu allen IE Genen herbei. Alle IE Gene kodieren Transkriptionsfaktoren, ihre Rolle ist die Regulierung der Transkription von frühen und späten Genen, vorwiegend haben sie einen die Transkription stimulierenden, aber in einigen Fällen einen hemmenden Effekt. (2) E Gene Die Aufgabe von einem Teil der frühen Proteine ist die Sicherung der DNA-Replikation. (3) L Gene Die Mehrheit der späten Proteine sind Strukturproteine des Virus. FOLIE 8-10 Genomreplikation Die Replikation des Virusgenoms wird von den Produkten der E Gene verwirklicht. Das origo-bindende Protein bindet in eine der ori (origin) Stellen ein (es gibt drei ori Stellen im Virusgenom), und mit Hilfe ihrer Helikaseaktivität trennt es die doppelsträngige DNA, welche dadurch einzelsträngig wird. Das ssDNA-bindende Protein schütz vor der Wiedervereinigung der beiden Stränge. Demnächst bindet ein sich aus drei Proteinen bestehender Komplex zur ori Stelle, welches als Helikase funktionierend die DNA kontinuierlich entspiralisiert und die Replikationsgabel erzeugt. Zu einem Strang der so entstandenen, entspiralisierten DNA bindet derselbe Komplex, diesmal kommt aber seine Primaseaktivität im Vorfeld, wodurch es ein kurzes, mit der DNA komplementäres RNA-Molekül bildet. Das RNA-Molekül funktioniert in der DNA-Synthese als Primer. EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 3 VIREN-II Die Replikation des zirkulären Genoms ist anfänglich Theta (θ) Typ, mit der erst etwa 30-40 Kopien synthetisiert werden, dann wechselt der Virus auf Sigma (σ) Typ Replikation, anders auch als „rollender Ring” Mechanismus genannt, als Ergebnis von welchem ein langer, das Genom in mehreren Kopien enthaltender DNA-Strang (Konkatamer) gefertigt wird. Zusammenbau und Freisetzung Die Hüllenproteine des Virus werden im rauen endoplasmatischen Retikulum gebildet, und dann zum Golgi-Komplex transportiert, während andere Proteine, wie VP5, im Replikationskompartment im Zellkern - wo das Vorkapsid hergestellt wird - vervielfältigt werden. Die strukturelle Integrität des Vorkapsids ist durch die stützenden Proteine gesichert, so ähnelt es sich viel mehr an eine Kugel als das reife Kapsid. Die stützended Proteine werden von einer viruskodierten Protease vor oder während der Einpackung der DNA entfernt. In alle Virione passt ein genomlanges DNA-Molekül ein, welches aus dem Konkatamer herausgeschnitten wird. Der Schnitt erfolgt beim Schnitts-und Einpackungssignal, welches sich an der Grenze von zwei Genomkopien befindet. Die DNA gelangt durch das sich an einer Spitze der ikosaedrischen Struktur befindende Tor ins Vorkapsid. Demnächst zieht das Nukleokapsid die Tegumentproteine zu sich an, wird durch die Transportvesikel des Golgi-Apparats eingepackt, dann wird das fertige Virion aus der Zelle so freigesetzt, dass ihre äussere Hülle mit der Zellmembran fusioniert. Viele Details von diesen komplexen Prozessen sind noch nicht bekannt. Man vermutet die Reihenfolge der folgenden Schritte: (1) Das Nukleokapsid nimmt sich an der inneren Membran des Zellkerns mit einer vorübergehenden Hülle um. (2) Demnächst, wenn die vorübergehende Hülle durch die äussere Membran des Zellkerns gelangt, fusioniert es mit der äusseren Kernmembran, so gelangt das Nukleokapsid ins Cytoplasma. (3) Das Nukleokapsid zieht das VP16 Protein und andere Komponenten des Teguments zu sich an. (4) Das Nukleokapsid gelangt in ein Transportvesikel des Golgi-Komplexes, dadurch wird seine Hülle erzeugt. (5) Die äussere Membran des Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, und das reife Virion wird aus der Zelle freigesetzt, fertig auf weitere Infektion. Auf der Oberfläche der Hülle befinden sich Glükoproteine. Diese Glükoproteine tragen zur Fusion der infizierten und nicht infizierten Zellen bei, und bilden sie dadurch eine, mit der Verschmelzung von mehreren Zellen entstehende Riesenzelle namens Syntitium (das ist ein alternativer Weg der Virusinfektion: Zell-Zell Infektion im Gegenteil der auf der Zellmembranfusion basierenden Penetration). FOLIE 11 Latente Herpesvirus-Infektion Von dem Genom des latenten Virus erfolgt – abgesehen von wenigen Ausnahmen – keine Transkription. Die während der Latenz gebildeten RNAs nennen wir latenz-verbundene Transkripte (LAT; das ist eine nicht kodierende RNA). Die unreifen Transkripte werden von dem LAT Gen transkribiert, welches sich in der terminalen wiederholenden Region des Virusgenoms befindet. LATs untergehen Splicing, und es ist bekannt mindestens über ein LAT, dass es die Apoptose hemmt, was das Neuron während der latenten Virusinfektion (welche auch lebenslang sein kann) im Leben hält. Im Fall von EBV ist die Situation unterschiedlich. Dieser Virus persistiert nämlich in sich teilenden Zellen, so muss es dementsprechend Virusproteine synthetisieren, um die Virusinfektion zu erhalten. Die Wahrscheinlichkeit der Herausbildung der produktiven Infektion, also der Reaktivation (Wechsel von einem latenten Zustand auf produktive Infektion) wächst parallel mit dem Verderb oder provisorischer Verringerung von dem Immunstatus des Wirtes. FOLIE 12 Die Adenoviren Das Genom der Adenoviren wird von einem linearen, doppelsträngigen DNAMolekül gebildet, die Länge von welchem ändert sich abhängig von der Gruppe, est ist 30-48,000 bp und fähig zur Kodierung von 30-40 Gene. Die Replikation der Adenoviren wird in eine frühe und eine späte Phase aufgeteilt, der Anfang der späten Phase kongruiert mit dem Anfang der DNA-Replikation. Das Anknüpfen des Virus an der Zelle ist ein langsamer Prozess, welcher sogar mehrere Stunden in Anspruch nehmen kann, bis es sein Maximum erreicht. Die Aufnahme des Virus ist ein Prozess aus zwei Schritten, erstmal bindet ein Fadenprotein an den spezifischen Rezeptoren der Zelle, was die rezeptorvermittelte Endocytose, also die Internalisation des Virus anlässt. Der Virus gelangt in ein Phagosom, dann verursacht die toxische Aktivität des Pentons den EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 4 VIREN-II Zusammenbruch der Phagosommembranstruktur, demfolge gelangt das Viruspartikel ins Cytoplasma. Nach der Freisetzung aus dem Phagosom dissoziiert das Penton von dem Viruskern, so kommt ein halb-belegtes Partikel ins Cytoplasma. Demnächst gelangt der Viruskern zum Zellkern, die DNA gelangt in den Zellkern durch die Kernporen, und der DNA-Histon Komplex entsteht. Vor der Genomreplikation - und unabhängig davon - beginnt die Synthese der sofortigen frühen (IE) und frühen (E) mRNAs von der DNA. Die Genomtranskription der Adenoviren wird von viruskodierten Regulationsfaktoren gesteuert. Die Produkte der IE-Gene regulieren die Expression der E-gene. Es ist wichtig zu merken, dass der Mechanismus des Splicing in Adenoviren entdeckt wurde (Philip Sharp, NobelPreis: 1993). Bei Adenoviren entstehen mehrerleie Proteine von einem Gen mit Hilfe des alternativen Splicings. FOLIE 13 PAPILLOMVIREN: Die humanen Papillomviren werden im Vortrag „Molekularbiologie der Tumoren besprochen. FOLIE 14 POXVIREN Zu den Poxviren gehört der Pocken verursachende Virus, welcher im Mittelalter grosse Epidemien ausgelöst hat, aber zum Glück konnte die Eradikation des Virus im XX. Jahrhundert verwirklicht werden. Über das Vakzinierungsprogramm von Jenner gegen Pocken werden sie mehr im Vortrag „Vakzinen”) hören. Die Poxviren haben eine Hülle, ihre Form ändert sich abhängig von der Spezies, am meissten erinnern sie uns an Ziegelsteine, oder Ziegelsteine mit abgerundeten Ecken. Das Virion ist aussergewöhnlich gross, mit einem Durchmesser von 200 nm und einer Länge von 300 nm. Ihr Genom kommt in einer Kopie vor, es ist lineare, doppelsträngige DNA, ihre Replikation läuft in mehreren Schritten ab. Während der Infektion bindet der Virus erstmal durch die Glükosamioglykane der Zelloberfläche an die Zelle. Nach der Adsorption penetriert der Virus die Zelle, wo es die Hülle abnimmt (Dekapsidierung). Die Dekapsidierung erfolgt in zwei Schritten, erstmal verlässt der Virus seine äussere Membran, wenn es durch die Zellmembran fortfährt (Fusion), dann das Viruspartikel ohne äussere Hülle „federt sich” weiter, und am Ende kommt der Viruskern ins Cytoplasma. Alleine unter den DNAViren, kodieren die Poxviren den grossen Teil der für ihre RNA-Synthese benötigten Enzyme selbst. Diese Eigenschaft ermöglicht eine Replikation im Cytoplasma. Sie kodieren selbst die aus mehreren Untereinheiten aufgebaute RNA-Polymerase und die genspezifischen Transkriptions- und Terminationsfaktoren. Das virale RNAPolymerase Gen ähnelt sich an die eukaryotische RNA-Polymerase, offenbar hat ein Urpoxvirus es von einer Zelle gestohlen. Die Transkription der Poxviren läuft in drei Schritten ab. (1) In der ersten, frühen Transkriptionsphase werden die Gene überschrieben, welche für die Synthese der viralen DNA, für die zwischenliegende Genexpression und für die Beeinflussung der antiviralen Antworte des Wirtes verantwortlich sind. Man vermutet, dass während dieser Phase, noch vor der DNA-Replikation die Hälfte des Virusgenoms transkribiert wird. (2) Während der zweiten, oder zwischenliegenden Phase, gleich nach der DNA-Replikation werden sehr wenige Gene umgeschrieben, die Mehrheit von denen die Transaktivatoren der Expression von den späten Genen sind. (3) Die dritte, oder späte Klasse der Poxvirusgene kodieren hauptsächlich strukturelle Proteine und die für die Transkription der frühen Gene benötigten Proteine, damit sie ins Kapsid eingepackt werden können, und während der nächsten Infektion gleich mit der Erfüllung ihrer Aufgabe beginnen können. Am Ende erfolgt der Zusammenbau am Cytoskeleton der Zelle. Die Tatsache beachtend, dass es sich um einen riesigen und komplexen Virus handelt, ist es interessant, dass die Replikation trotzdem relativ schnell ist, es beansprucht nur 12 Stunden, während dieser Zeit vernichten die Viren die Zelle und werden in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die Replikation der Poxviren ist also ungewöhnlich, da es – obwohl sie doppelsträngige DNA-Viren sind – im Cytoplasma abläuft und der Apparat der Zelle wird nicht dazu gebraucht, da der Virus die für die Genomtranskription benötigten Enzyme selbst kodiert. Andere doppelsträngige DNA-Viren müssen in den Zellkern gelangen, wo sie den Transkriptionsapparat der Zelle für die Produktion ihrer eigenen mRNAs benutzen. FOLIE 14, 15 PARVOVIREN sind mit ihren 18-26 nm grossen Virionen die kleinsten bekannten Viren, ihr Kapsid mit ikosaedrischer Symmetrie verpackt ein einzelsträngiges DNA-Genom. Für die Replikation der Dependoviren ist auch die Infektion durch einen Helfer (helper) Virus nötig, da das Genom der Dependoviren wenige Gene hat. Solche Parvoviren, die nicht so ein Helfervirus brauchen, nennen wir autonome (selbstständige) Parvoviren. Als Helfervirus können generell andere DNA-Viren in Frage kommen, zB. Herpesviren und Adenoviren. Dependoviren sind auf Gentransfer geeignete Vektoren (dieses Thema wird im Vortrag „Gentherapie” bearbeitet). Das Genom der Parvoviren ist ein lineares, etwa 4-6 kb langes DNA-Molekül. Am Ende des Genoms von einigen Parvoviren befindet sich eine verkehrte Wiederholung (ITR; inverted terminal repeat), wo die eine Sequenz mit der Sequenz am anderen Ende komplentär ist. Reoviren wurden aus dem respiratorischen (R) und enteralen (E) Trakt isoliert, und es gibt auch Viren mit unidentifizierten Herkunft (orphan = Waise; O), daraus stammt der Name REO. Ihr Kapsid zeigt eine ikosaedrische Symmetrie, ihr Genom ist doppelsträngige RNA. Viele ähnliche Viren hat man in Säugetieren, Vögeln, Fischen, Insekten, Pflanzen und Pilzen gefunden. FOLIE 16 Die FOLIE 17-20 PICORNAVIREN Mitglieder der Familie von Picornaviren kommen in Säugetieren und Vögeln vor. Picornaviren: Hepatitis A, Poliovirus, Rhinoviren, Virus der Maulund Klauenseuche. Der Poliovirus war der erste Virus, der in einer Zellkultur kultiviert werden konnte. Das Genom der Picornaviren besteht sich aus 7-8 kb langer, einzelsträngiger EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 5 VIREN-II RNA. Am 5’-Ende der RNA ist ein kovalent gebundenes Protein (genomgebundenes Virusprotein) angeknüpft, die vermutliche Funktion von dem ist die Förderung der Transkription (nach dem Anfang der Transkription dissoziiert es von der RNA). Bis 1910 hat der grösste Teil der Welt diese dramatische Krankheit kennengelernt, die häufigen Epidemien wurden gewöhnlich in grösseren Städten, besonders während den Sommermonaten. Die Epidemien, die tausende von gelähmten Kindern und Erwachsenen (eiserne Lunge) hintergelassen haben, haben einen grossen Stoss dem „Grossen Wettkampf” gegeben, das Ziel von welchem die Entwicklung einer Vakzine gegen Kinderlähmung war. Im Jahre 1950 ist es gelungen, eine weltweite Impfungsserie zu starten, als Ergebnis von welcher die Infektion aus Europa eradiziert werden konnte, und die jährliche Gesamtanzahl der Fälle auf der Welt von hunderttausenden auf etwa tausend gesunken hat. FOLIE 21-24 ORTHOMYXOVIREN INFLUENSAVIREN Drei grosse Influensaepidemien sind aus den letzten 100 Jahren bekannt: die spanische Grippe in 1918, die asiatische Grippe in 1957 und die Hong Kong Grippe in 1968. Die spanische Grippe hat 50 Millionen, während die anderen zwei Epidemien 2 und 1 Million Todesopfer verlangt. Weiterhin muss es bemerkt werden, dass diese Viren jährlich immer noch den Tod von 250-500 Tausend Menschen verursachen und 3-4 Millionen Menschen leiden unter schweren Krankheiten im Folge der Influensa, so ist es klar, dass es als ein besonders wichtiges Pathogen betrachtet ist. Der im Jahre 1997 plötzlich aufgetauchte, stark pathogene H5N1 Virus mit 50% Mortalität (Vogelinfluensa, entgegen der Ängste wurde es nicht fähig, von Mensch auf Mensch verbreitet werden zu können) hat die Erneuerung der Influensaforschung motiviert. Der Kampf gegen Influensa erwies sich aber schwer, und die Lage ist dadurch erschwert, dass der H1N1 Subtyp (auch die spanische Grippe wurde von einem Virus aus solchem Serotyp verursacht) vor kurzem wiederaufgetaucht hat. Beim Mensch ist zwar der Ablauf der Krankheit relativ mild, es wird aber sehr schnell und leicht verbreitet, so hat WHO eine neue Influensaepidemie festgestellt. Die Angst ist da, dass wenn H1N1 sich mit den hochpathogenen Stämmen des H5N1 vermischt, so kann es von H5N1 Lethalität steigernde Eigenschaften sammeln, was zur Entstehung einer späteren, zerstörerischen Pandemie führen kann. Man hat das Neuauftauchen des Virus prognostiziert, bislang (November, 2011) ist es aber nicht passiert. Influensavirus A Diese Gattung beinhaltet nur eine Spezies, und das ist die Influensa A. Die natürlichen Wirte von diesen Viren mit riesiger Variabilität sind wilde Wasservögel. Es kann aber vorkommen, dass der Virus andere Spezies infiziert, so verursacht es zerstörende Epidemien unter Hausgeflügel und weltweite Epidemien unter Menschen. Die Influensa vom A-Typ ist der meisst virulente Menschenpathogen unter den drei Typen, und diese verursacht auch die schlimmste Krankheit. Influensa A kann in mehrere Serotypen an Hand den unterschiedlichen Typen des gegen ihr produzierten Antikörpers eingeteilt werden. Die folgenden Serotypen wurden in Menschen nachgewiesen, aufgelistet in der Reihe der Morbidität von den durch ihnen verursachten Epidemien: H1N1, spanische Grippe 1918, „Schweinegrippe” (später umgennant als neue Grippe) 2009 H2N2, asiatische Grippe 1957 H3N2, Hong Kong Influensa 1968 H5N1, Vogelinfluensa 2004 H7N7, mit einem ungewöhnlichen zoonotischen Potential (Möglichkeit der Verbreitung vom Tier auf Mensch) H1N2, humane, Schwein- und Vogelendemie* (lokale Epidemie) H9N2 H7N2 H7N3 H10N7 Influensavirus B Diese Gattung hat auch nur ein Mitglied, die Influensa B. Der Virus infiziert ausschliesslich Menschen und ist viel seltener als Influensa A. Ihre Mutationsrate ist 2-3mal niedriger, als die von Influensa A, deshalb – und weil es nur ein Influensa B Serotyp gibt - ist auch ihre genetische Diversität kleiner. Imfolge des EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 6 VIREN-II Mangels an Antigendiversität wird die Immunität gegen Influensa schon im frühen Lebensstadium entwickelt, wegen den häufigen Mutationen ist aber die Erwerbung einer lebenslangen Immunität nicht möglich. Die niedrige Möglichkeit des Antigenwechsels zusammen mit der Einschränkung an Wirtsspezies sichern, dass Influensa B keine Pandemie verursacht. Influensavirus C Diese Gattung enthält auch nur eine Spezies (Influensa C), welche lokale Epidemien verursachend Menschen, Hunde und Schweine infiziert. Glücklicherweise ist es aber seltener, als die anderen zwei Typen und verursacht nur eine milde Krankheit, hauptsächlich in Kindern. FOLIE 21 Struktur, Charaktereigenschaften, Subtyp-Nomenklatur Die Subtypen der Influensaviren A, B und C ähneln sich sehr an einander. Der Durchmesser der Virione kann zwischen 80-120 Nanometer liegen. Virione sind meisstens kugelförmig, aber filamentöse Formen können auch vorkommen, am häufigsten beim Typ C, wo die Filamente 500 Mikrometer lange Bündel an der Oberfläche der infizierten Zelle bilden können. Trotz ihrer wechselvollen Formen sind die Partikel der unterschiedlichen Viren in ihrem Aufbau ähnlich. Innen gibt es einen zentralen Kern, welcher von einer sich aus zwei Arten von Glükoproteinen bestehender Hülse umgegeben ist. Der zentrale Kern besteht sich aus dem Erbmaterial des Virus, was RNA ist, und es ist von weiteren viralen Proteinen eingepackt und geschützt. Die RNA ist generell einzelsträngig, in speziellen Fällen kommt aber auch doppelsträngiges Erbmaterial vor. Eine weitere Besonderheit des Genoms ist, dass abweichend von den anderen Viren es sich nicht aus einem einzigen, zusammenhängenden RNA-Strang besteht, sondern, abhängig von der Spezies, aus 7 oder 8 minussträngigen RNA-Molekülen, alle von welchen ein oder zwei Gene enthalten. Influensa A hat zum Beispiel 11 Gene auf 8 Segmenten, die 11 Proteine kodieren. Die wichtigsten sind die zwei, sich auf der Oberfläche der Viruspartikeln befindenden grossen Glükoproteine, das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA). HA ist ein Lektinmolekül, welches die Bindung des Virus an der Zielzelle sichert und auch das Gelangen des viralen Genoms in die Zelle hilft. NA dagegen spielt eine Rolle bei der Freisetzung des Virus aus der Zelle dadurch, dass es die zu den unreifen Viren gebundenen Zuckermoleküle spaltet. Da diese zwei Moleküle wichtig für die Virusinfektion sind, diese sind die Hauptzielpunkte der antiviralen Therapie. HA und NA lösen aber die Produktion von unterschiedlichen Antikörpern aus, darauf basierend können die Typen der Influensa A in sogenannte Serotypen aufgeteilt werden. Insgesamt sind 16 A und 9 N Subtypen bekannt, die häufigsten sind die Typen 1, 2, und 3 von H und die Typen 1 und 2 von N. FOLIE 22 Replikation Die Influensainfektion und Replikation findet in mehreren Schritten statt. Der Virus bindet zuerst an der Zelloberfläche, dann penetriert es in die Zelle, demnächst wird das Genom zur entsprechenden Stelle transportiert, wo die Bildung der neuen viralen Proteine und RNAs beginnt. Aus den so gebildeten Komponenten wird das neue Virion zusammengebaut, welches am Ende die Zelle verlässt. Die Infektion beginnt typisch in der Nase, im Rachen und in der Lunge der Säugetieren und Vögeln. (1) Die Influensaviren binden durch HA zu den Zuckern mit Sialsäure, die sich auf der Oberfläche der Epithelzellen befinden. Demnächst schneidet eine Protease HA, und die Zelle nimmt den Virus durch Endocytose auf. Die saure Sphäre des Endosoms verursacht zwei Änderungen: erstmal vereinigt sich die Virushülle mit der Endosommembran mit Hilfe von HA; dann gelangen Protone durch die M2 Ionenkanälen der Virushülle in die Nähe des Kerns, was zur Übersäurung und Zerfall des Kerns führt, dann werden die viralen RNAs und die Kernproteine des Virus freigesetzt. (2) Demnächst gelangen die viralen RNAs (vRNA), die akzessorischen Proteine und die RNA-abhängige RNA-Polymerase ins Cytoplasma. Der M2 Ionenkanal kann mit der Substanz Amantadin blockiert werden, was die Vorbeugung der Verbreitung der Infektion hilft. (3a+3b) Der Komplex der Kernproteine und der vRNAs gelangen in den Zellkern, wo die RNA-abhängige RNA-Polymerase mit der Transkription beginnt und dadurch plussträngige RNAs bildet. (4) Die vRNAs bleiben entweder im Zellkern (diese werden eingepackt), oder werden ins Cytoplasma transportiert (diese werden in Proteine translatiert). (5b) Die neu gebildeten Virusproteine werden entweder durch den Golgi-Apparat auf die EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 7 VIREN-II Zelloberfläche transportiert, wie zB. NA und HA, oder (5a) sie gelangen zurück in den Zellkern, wo sie mit den vRNAs neue Viruspartikel bilden. Andere Proteine haben mehrerleie Funktionen, zB. sie bauen die zellulären mRNAs ab und steuern die dadurch freigesetzte Nukleotide zur vRNA-Synthese, oder sie hemmen die Translation der mRNAs des Wirtes. Die als Erbmaterial der gebildeten Viren dienende, minussträngige vRNA, die RNA-abhängige RNA-Polymerase und die weiteren viralen Proteine stehen zum Virion zusammen. HA und NA formen an einer Stelle eine kleine Vorstülpung in der Zellmembran. (6) Die vRNA und die viralen Kernproteine verlassen den Zellkern und gelangen in diese Vorstülpung. (7) Das reife Virion wird aus der Zelle freigesetzt, dabei trägt es den vorstülpten Membranstück, und damit auch die HA und NA Moleküle mit sich. Ebenso wie im Fall von HA, auch die NA bindet die Zelloberfläche durch Zuckern mit Sialsäure, dies muss auch abgeschnitten werden, damit der Virus aus der Zelle freigesetzt werden kann. Die NA-hemmenden Substanzen, wie zB. Oseltamivir, verringern die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung aus der Zelle, und halten dadurch die Fortpflanzung des Virus an. Nach der Freisetzung der neuen Viren stirbt die Wirtszelle. FOLIE 23 Antigendrift und Antigenshift Die RNA-Polymerase hat keine Korrekturleseaktivität (proofreading), deshalb wird etwa jedes zehntausendste Nukleotid falsch eingebaut, dies entspricht etwa der kompletten Länge des Influensavirus. Also alle neue Viren werden ungefähr eine Mutation tragen. Diese Mutation verursacht das sogenannte Antigendrift, dessen Ergebnis die langsame Veränderung der Virusoberflächenantigene ist. Die Segmentiertheit des Virusgenoms kann die Quelle einer weiteren Variabilität sein, wenn nämlich eine einzige Zelle von mehrerleien Viren gleichzeitig infiziert wird, können die Segmente ausgetauscht werden. Die so entstehenden, schnellen Antigenveränderungen werden in der Virusgenetik als Antigenschift bezeichnet. Das Antigenschift bedeutet eigentlich die Kombinierung der Antigene von zwei Virusstämmen, was sich im Fall von einem Epidemie-verursachenden Virus in der Erscheinung eines neuen Antigens manifestiert. Die Antigenshifts helfen dem Virus beim Wechsel der Wirtspezies, beziehungsweise die Viren können als Effekt der RNA-Vermischung der Attacke des Immunsystems leichter ausweichen, deshalb sind die Antigenschifts bei der plötzlichen Erscheinung der Weltepidemien, Pandemien sehr wichtig. FOLIE 24 Neue Stämme des Influensa A Virus Von Zeit zu Zeit erscheinen neue Kombinationen von HA und NA Gene enthaltende Virusstämme, die weltweite Epidemien verursachen. Die natürlichen Wirte der Influensa A sind haupsächlich Wasservögel (Enten, Gänse, Möwen), welche durch Einatmen oder Schlucken die Viren besorgen, die dann ihre Atmungs- bzw. Verdauungssystem infizieren. Die meissten Stämme des Virus verursachen keine Krankheit oder nur einige milde Symptome. Es gibt aber auch solche Stämme, welche sehr pathogen sind und den Tod der Vögel verursachen. Durch ihre Wanderung übermitteln die Vögel den Virus ins neue, noch nicht infizierte Gebiete. Ausser Vögel können sie auch Säugetiere, hauptsächlich Schweine, Pferde und Menschen infizieren; in diesen Spezies ist das Atmungssystem der primäre Fortpflanzungsort des Virus. Menschen werden am häufigsten durch Virustypen H 1, 2 und 3 und N 1 und 2 infiziert. Die Krankheit kann sehr schwer sein und sich mit dem Tod enden. Der Tod wird durch die Virusinfektions selbst, oder durch die sekundären Infektionen, die nach der Beschädigung der Oberhaut des Atmugssystems entstehen, verursacht; zB. im Fall der spanischen Grippe hat die Influensa nur 10% der Todesfälle direkt verursacht, in 90% der Fälle wurden die Patienten von Lungenentzündung getötet, welche von Bakterien verursacht worden ist, die die von dem Virus verursachten Lesionen infizierten. Einige Stämme der Influensa A sind sehr pathogen an Vögel. Die wilden Tiere können es auf ihre verwandten Hausgeflügel übertragen, die es dann auf die Menschen übertragen können. Diese Lage entstand im 1997 in Hong Kong, wenn ein H5N1 die schwere Krankheit der Geflügel verursachte. Die H5N1 Viren erschienen in mehreren asiatischen EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 8 VIREN-II Ländern in 2003, im Europa in 2005 und im Afrika in 2006. Millionen von Enten, Hühner und Truthähne starben oder wurden zwangsgeschlachtet im Folge der Krankheit. Der H5N1 Virus wurde auch auf Menschen übertragen, wo es schlimme Atmugssystem-Krankheit und in einem grossen prozentuellen Anteil Tod verursacht hat. Ein paar Mal ist auch der H9N2 Typ in Asien erschienen, wo es ebenso Vögel infiziert hat, von denen der Virus auch auf Menschen übertragen wurde. Die meissten, wenn nicht alle von H5N1 und H9N2 verursachten Erkrankungen haben solche Menschen betroffen, die sich mit Vögeln oder mit ihrem Exkrement eingelassen haben. Zum Glück werden diese Vogelviren von Mensch zu Mensch nicht verbreitet. Im Kreis der Experten hat man aber Angst vor so einem Virus, welcher neben einer grossen Virulenz auch die Fähigkeit hat, von Mensch zu Mensch verbreitet werden zu können. FOLIE 25, 26 Das Genom der RHABDOVIREN ist 11-15,000 lange, minussträngige RNA. Ihr Namen stammt aus dem griechischen Wort rhabdos, was Stäbchen bedeutet. Die Pflanzen-infizierende Rhabdoviren sind stäbchenförmig mit einem abgerundeten Ende, während die tierischen Rhabdoviren auch stäbchenförmig sind, aber mit einem projektilförmigen Ende. Rhabdoviren haben ein breites Wirtsspektrum, zu ihren Wirten gehören die Säugetiere, Fische, Pflanzen und Insekten. Viele Rhabdoviren haben so ein breites Wirtsspektrum, dass sie sich sowohl in pflanzlichen, als auch in tierischen Zellen replizieren können, wie zB. die „pflanzlichen” Rhabdoviren, die sich auch in Insekten vermehren können. Der Rabies-Virus, also der Virus der Tollwut kann besonders vielerleie Lebewesen infizieren. Der Virus penetriert meisstens durch verletzte Haut, wenn es zB. im Fall von einem Biss aus dem virushaltigen Speichel in die Wunde, und dann in die dortigen Nervenendungen kommt. Von da aus werden die Viren in die Richtung des zentralen Nervensystems transportiert, wo sie auch die anderen Neurone infizieren und dann in die Speicheldrüsen gelangen, wo sie in den Speichel sekretiert werden. Die Virione sind gehüllt und aus etwa fünferleien Proteinen aufgebaut. Die RNA ist mit Nukleoprotein bedeckt, auf ein Protein fallen neun Nukleotide, so entsteht die helikale Struktur. Akzessorische Proteine sind noch die Phosphoproteine (P) und die grossen (L) Proteine. Das grosse Protein ist ihrem Namen treu, da sein Gen etwa die Hälfte des genetischen Materials ausmacht. Das L Protein ist ein Protein mit multiplen Funktionen. Das Matrixprotein füllt den Raum zwischen dem Nukleokapsid und der Hülle aus, und aus der Hülle wölben sich Trimere der Glükoproteine aus. FOLIE 27 RETROVIREN Die Retroviren sind solche (einzelsträngige) RNA-Viren, die ihr Genom durch einen DNA-Intermediär vervielfältigen. Bevor diese Viren entdeckt worden sind, hat die Behauptung, dass der Weg des Informationsflusses ausschliesslich von der DNA in die Richtung der RNA möglich ist, als ein Dogma gelebt. Die Entdeckung, dass es solche Viren gibt, die auf die Transkription auch umgekehrt fähig sind (reverse Transkription), hat eine kleinere Revolution in der Wiisenschaft ausgelöst. Später stellte es sich heraus, dass nicht nur diese RNA-Viren die reverse Traskription verwenden, sonder auch einige DNA-Viren (Hepadnaviridae), und der Prozess läuft mit Hilfe der von den Retrotransposonen kodierten reversen Transkriptase auch in nicht infizierten Zellen ab. Zahlreiche Retroviren können im Wirtsorganismus Krebs verursachen (HIV nur selten und eventuell), dieses Thema wird im Vortrag „Molekularbiologie von Krebs” in Details bearbeitet. Das Virion enthält ihr Erbmaterial in zwei Kopien (die einzelsträngige RNAs sind), sie können also als diploid betrachtet werden. Das Virion enthält nicht nur virale RNA, sondern auch aus der Wirtszelle stammende tRNA, welche nach dem Zusammenbau des Kapsids ins Virion gelangt. Die tRNAs binden beide Kopien der viralen RNA durch Basenpaarungen. Unterschiedliche Retroviren enthalten unterschiedliche tRNAs. Auch zahlreiche virale Proteine binden die RNA. In der grössten Menge ist das Nukleokapsidprotein, welches die RNA umgibt, vorhanden, ausser diesem befinden sich aber viele andere, mit Enzymaktivität verfügende Proteine in weit kleineren Mengen. Die RNA und die akzessorischen Proteine sind von dem aus Kapsidproteinen bestehenden Kapsid (CA) umgegeben. Abhängig von dem Virus kann das Kapsid kugel-, zylinder- oder kegelförmig sein. Zwischen dem Kapsid und Hülle befindet sich die Matrix (MA). Die Virusprotein-kodierenden Gene befinden sich in den drei Hauptregionen des Genoms: • gag (group-specific antigen – gruppenspezifisches Antigen) – innere Strukturproteine • pol (Polymerase) – Enzyme • env (envelope – Hülle) – Hüllenproteine EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 9 VIREN-II Die Schritte im Lebenszyklus der Retroviren sind die folgenden: 1. Adsorption; 2. Penetration in die Zelle; 3. Reverse Transkription; 4. Transkription; 5. Translation; 6. Genomreplikation; 7. Zusammenbau; 8. Freisetzung aus der Zelle. Die Replikation vom HIV wird in Details besprochen. FOLIE 28 FOLIE 29-31 Der humane Immunodefizienzvirus (HIV) gehört zur Familie Retroviridae, und innerhalb dieser Familie in die Gattung der Lentiviren. Der humane Immundefizienzvirus hat zwei Typen (HIV-1 und HIV-2), beide haben sich aus dem entsprechenden Immundefizienzvirus der Affen (simian, SIV) im XX. Jahrhundert entwickelt. Im Gegenteil zum SIV, welcher keine schwere Krankheit in den natürlichen Wirten verursacht, die HIV-Infektion beschädigt das Immunsystem und vergrössert die Empfänglichkeit des Organismus auf Infektionen durch andere Erreger. Die vom HIV ausgelöste Krankheit nennen wir erworbenes Immunmangelsyndrom (acquired immune deficiency syndrome, AIDS). HIV-1 ist viel häufiger als HIV-2, HIV-1 ist für die Infektionen in allen Regionen der Welt verantwortlich, während das Vorkommen vom HIV-2 beschränkt sich auf West-Afrika. In den ersten Jahren des XXI. Jahrhunderts wurden etwa 5 Millionen Menschen mit HIV infiziert, und AIDS hat 3 Millionen Opfer verlangt, damit ist es am vierten Platz auf der Rangliste der führenden Todesursachen (in bestimmten Teilen von Afrika ist es an einem vornehmeren Platz). Wegen der Grösse des Problems hat man riesige Geldquellen für die Forschung der Viren mobilisiert, der Ziel davon war hauptsächlich die Entwicklung von neuen Medikamenten und Vakzinen. Das Genom von HIV-1 und HIV-2 ist etwa 9,3 kb lang. Sie gehören zu den komplexen Retroviren, weil neben den gag, pol und env Genen sie auch akzessorische Gene kodieren. Ein akzessorisches Gen kann mehrere Aufgaben haben. Zu diesen Aufgaben gehört auch die Regulierung der Genexpression, der Transport der Viruskomponenten innerhalb der Zelle und die Beeinflussung der Immunantwort des Wirtes. Sie benutzen alle drei Leseraster und es gibt auch bedeutende Überlappungen zwischen denen, zB. ein Teil des im 2. Leseraster seienden vpu Gens überlappt mit dem im 3. Leseraster seienden env Gen. Die tat und rev Transkripte untergehen Splicing. FOLIE 32 Adsorption und Penetration Der HIV-1 bindet das CD4 Rezeptor* der T-Helfer Zellen. Die Verbindung zwischen dem Virus und der Zelle erfolgt, wenn das gp120 Protein des Virus die äussere Domäne von CD4 erkennt. Demnächst muss HIV auch zu einem KoRezeptor binden, welcher ein Chemokinrezeptor* mit 7 Transmembrandomänen ist. Die meissten Stämme von HIV-1 benutzen den CCR5 Chemokinrezeptor als Ko-Rezeptor, diese nennen wir R5 Stämme. Man hat es beobachtet, dass es solche, mehrmals zur HIV-1 Exposition exponierte Menschen gibt, die nicht infiziert worden sind. Der Grund dafür ist eine 32 Nukleotid lange Deletion im CCR5 Gen. Menschen die auf die Mutation homozygotisch sind, exprimieren keine CCR5 Moleküle an der Zelloberfläche, deshalb sind sie völlig resistent gegen die Infektion, während die Heterozygoten eine erhöhte Reistenzebene haben. Die Mutation des CCR5 Gens wurde hauptsächlich in europäischen Menschen nachgewiesen. Es gibt solche HIV-1 Stämme, welche CXCR als Ko-Rezeptor benutzen, diese nennen wir X4 Stämme, und es gibt auch solche Stämme, die beide benutzen können, diese sind die R5X4 Stämme. Alle drei Stämme infizieren auch die Gedächtnis-T-Zellen, während die nativen TZellen nur von den X4 und R5X4 Stämmen infiziert werden können. Die Bindung des gp120 zum Rezeptor und Ko-Rezeptor verursacht eine dramatische Veränderung in der Struktur von gp41, im Folge von dem das Virion und die Zellmembran fusionieren. Der sich aus Erbmaterial und Proteine bestehende Inhalt der Virushülle gelant ins Cytoplasma, wo ein sich aus MA, Vpr, RT und IN Proteinen bestehender reverse Transkriptionskomplex entsteht. FOLIE 33 Reverse Transkription und Transport in den Zellkern Nach der Penetration in die Zelle bindet der reverse Transkriptionskomplex gleich an Mikrotubuli. Die reverse Transkription wird durch eine Lysin-transportierende tRNA (tRNAlys-3) eingeleitet. Nachdem die reverse Transkription sich beendet hat, der Zell- und Virusproteine enthaltende PräIntegrationskomplex wird entlang der Mikrotubuli in die Richtung des Zellkerns transportiert. Die meissten Retroviren müssen auf den Zerfall der Zellkernmembran warten, damit sie in EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 10 VIREN-II den Zellkern gelangen können, HIV-1 kann aber die Zellkernmembran durchkehren und in den intakten Zellkern gelangen, so kann es auch im Ruhestand seiende T-Zellen und Makrophagen infizieren. FOLIE 34-36 Frühe Genexpression Die Transkription wird von zellulären Faktoren initiiert durch ihre Bindung zu den im upstreamen LTR des Virus lokalisierten Enhancer und Silencer Regionen. Die Transkription endet in der 3’ LTR Region, wo die mRNAs einen poly-A Schwanz bekommen. Die längste mRNA ist so lang wie das Genom; die kleineren Transkripte können in zwei Gruppen eingeteilt werden: es gibt solche, bei denen ein einziges Splicing gescheht, diese sind etwa 4-5 kb lang, und es gibt solche, die mehrere Splicings untergehen, diese sind etwa 2 kb lang. Der Virus hat mehrere Splice Donor- und Akzeptorstellen, diese sichern das alternative Splicing, während dessen so mehr als 30erleie RNAs entstehen. In der frühen Phase der Infektion gehen die primären Transkripte mehrere Splicings durch, diese mRNAs werden zu Nef, Tat und Rev Proteine translatiert. Das Nef (negativer regulatorischer Faktor) hat seinen Namen so bekommen, dass man früher gedacht hat, dass es die Replikation des HIV hemmt, später hat es sich aber herausgestellt, dass im Gegenteil es eben die Replikation hilft. In den infizierten Zellen verändert Nef den Transportweg des Endosoms, so verringert es die Anwesenheit von CD4, MHCI und MHCII an der Zelloberfläche. Diese Veränderungen helfen dem HIV aus dem Immunsystem auszuweichen. Das Tat (Transaktivator der Transkription) Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Stimulierung der Transkription. Das nukleäre Lokalisationssignal (NLS) steuert Tat in den Zellkern, wo es zur sogenannten TAR (transactivator response element) Sequenz am 5’ Ende der unreifen viralen mRNA bindet. Zu TAR können auch zelluläre Proteine binden. Eins von diesen ist eine Kinase, welche die Komponenten des RNA-Polymerase-Komplexes phosphoryliert, was die Progression des Enzyms am Templat steigert. Tat wird deshalb als so ein ungewöhnlicher Transkriptionsfaktor betrachtet, welcher nicht zur DNA, sondern zur RNA bindet. Das andere frühe Protein, Rev (Regulator der Expression von Proteinen) besitzt auch NLS, so wird es im Zellkern akkumuliert und hilft dem Klassenwechsel der frühen und späten Gene so, dass es zu einem RNA-Abschnitt, dem Rev-responsiven Element (RRE) bindet. FOLIE 37 Expression der späten Gene Die mRNA Moleküle von Gag und Gag-Pol untergehen keinen Splicing, Gag-Pol wird produziert wenn eine sogenannte ribosomale Leserasterverschiebung entsteht. Dies passiert in ca. 5% der Fälle, wo so das Ribosom über die UUUUUUA Sequenz laufen kann. Diese „rutschige” Sequenz ist zuständig für das verrutschen des Ribosoms (nicht-vollkommener polyA Signal), welches so vom ersten Leseraster auf die dritte geringt. Ist diese Verschiebung zu Stande gekommen, wird die Translation in der pol-Region fortgesetzt und so Gag-Pol Protein produziert. Die restlichen Virusproteine (Vif, Vpr, Vpu und Env) werden von einmal gespleissten Transkriptomen produziert. Vpu und Env werden im rauen ER (granuläres ER), durch bicistronische RNAMoleküle produziert. Das Protein Env wird in grossem Masse glykosiliert. Der Env Trimer wird noch bevor dem Zerschnitt von gp120 und gp41 Hüllenproteine geformt; der Schnitt wird von Furin erledigt, welches ein sich im Golgi Komplex befindenden Wirtsprotein ist. Vpu ist ein membrangebundenes Protein, welches nötig ist damit sich das Virion vom Plasmamembran trennen kann. FOLIE 38 Zusammenbau und Freisetzung Die Bildung der 2, dem neuen Virion als Genom stehenden RNA-Moleküle wird mit Hilfe der Schlinge des sich am 5’ Ende der RNAs zu findenden Dimerisation-Initiationsstellen gesichert, indem sich die Komplementärsequenzen dieser Stellen paaren. Die Gag und Gag-Pol Moleküle nehmen eine geregelte Struktur auf und ihre Domänen werden an das Virusgenom und an andere, das Virion bildende Proteine gebunden. Es werden Gag-Pol Dimere gebildet, welche nachher zerschneidet werden (sie katalisieren sich selbst) und so die Enzyme des Virus – wie z.B. die Protease mit dimerer EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 11 VIREN-II Struktur – gebildet werden können. Danach werden die Gag Polyproteine durch die Protease zerschnitten, und die Aufbauelemente des reifen Virions gebildet. FOLIE 39, 40 Zusammenfassung: siehe Folien FOLIE 41 Strategie: Variabilität des HIV Genoms Eine sehr wichtige Eigenschaft von HIV ist die genetische Variabilität, welche zwei Gründe hat. (1) Antigendrift Hauptgrund dieser ist, dass das Enzym reverse Transkriptase RNA zu DNA mit einer sehr hohen Fehlerhäufigkeit konvertiert (10 Punktmutation/Replikation + Deletionen, Insertionen). Die Mutationen betreffen hauptsächlich das env Gen, offensichtlich aus dem Grund, dass eine Immunantwort in erster Linie gegen die Oberflächenproteine gegeben wird. Die - im Hinsicht zu anderen Gene – relativ erhöhte Mutationsrate des env Gens wird nicht unbedingt durch die öfter vorkommenden Mutationen verursacht, sondern vermutlich durch die Wirkung der Selektion ausgeübt. Die im Wirt vorkommenden Virusvarianten werden quasi-Spezies genannt, zwischen welchen der genetische Unterschied das env Gen betreffend ca. 2-5% beträgt. (2) Antigenshift Ein weniger bedeutender Fall der genetischen Variabilität ist die Rekombination zwischen den verschiedenen HIV-1 Populationen, welche ein Mosaikgenom resultiert. Die zwei Populationen stammen nicht unbedingt aus zwei unabhängigen Infektionen, die Rekombination zwischen Virusvarianten die im selben Organismus gebildet wurden ist offensichtlich ein viel öfter vorkommendes Phänomen. FOLIE 42 Nobel-Preise (1) Für die Provirus-Theorie der Retroviren bekam Howard Temin den Nobel-Preis. Laut der Provirus-Theorie bauen sich die Retroviren in der DNA-Form ins Wirtsgenom ein und bilden während der Replikation keine komplementäre RNA von einem RNA-Templat wie vorher vermutet. Kurz nach der Veröffentlichung der Hypothese wurde das Enzym reverse Transkriptase entdeckt, welches die Hypothese unterstützt hat. (2) Einer der grössten Debatten in der Geschichte der Medizin ergab sich die Entdeckung des HIV im Jahre 1983 folgenden Jahrzehnt. Die Forscher konnten in bloss zwei Jahren nach der Erscheinung des ersten Patienten sicherstellen, was die AIDS-Krankheit verursacht. Trotzdem hat die Presse einen endlosen Streit über die Frage losgelegt, welche aus zwei Gruppen – eine französische und eine aus der USA – als erste den Virus entdeckt hat. Debattiert wurde darüber, welcher Gruppe es zuerst gelungen ist, den Erreger zu identifizieren, welche zuerst den Test patentiert hat und wer passende Virusproben hatte. Leiter der einer Gruppe – aus dem National Cancer Institute in Bethesda - war Robert Gallo, Luc Montaigner war Leiter der Gruppe aus dem Pasteur Institute in Paris. Der Streit wurde neu angefangen, da der Nobel-Preis Komittee nur die Gruppe aus Paris belohnt hat (Montanier und sein Kollege Barré-Sinoussi), Gallo wurde ausgelassen. FOLIE 43 Verbreitung von HIV siehe Folie. FOLIE 44, 45 DIE HEPADNAVIREN verursachen Hepatitis, und verfügen über ein DNAGenom, wovon sie auch den Namen bekommen haben. Es ist gut zu merken, dass die anderen Viren, die Hepatitis verursachen, in andere Familien gehören. Die Hepadnaviren können sowohl Säugetiere als auch Vögel infizieren. Der meisstbekannte humanpathogene Hepadnavirus ist der Hepatitis B Virus (HBV), welcher wegen seiner Verbreitung und Pathogenität aus medizinischer Hinsicht äusserst wichtig ist. Die Hepadnaviren sind insbesondere aus zwei Gründen interessant: (1) Obwohl sie über ein sehr kleines Genom verfügen, können sie sehr gut daraus handeln; (2) ihr DNA-Genom wird durch einen RNA Intermediär repliziert. Mit anderen Worten verwenden sie zur Replikation reverse Transkription, welche so wesentlich von der herrkömlichen DNA-DNA Replikation abweicht. Keiner weiss die genaue Zahl der HBV-infizierten Personen, laut Forschungen werden 400 Millionen geschätzt. Die meissten Fälle werden aus Asien berichtet aber es kommt auch häufig in Afrika vor. Der Virus ist im Blut und Sperma der Patienten zu finden, die Art der Übertragung ist im Allgemeinen mit der des HIV identisch. Ungefähr werden pro Jahr 5 Millionen neue Fälle registriert, meisstens Neugeborene die die Infektion von der Mutter bekommen. Mehr als 8 Millionen Fälle ergeben sich aus der Neuverwendung der Nadeln und Spritzen - vor allem ein Problem in der aufkommenden Welt. Viele HBV-Infektionen sind symptomlos oder produzieren nur schwache Symptome, vor allem in Kindern. Leider entwickeln sich 90% der Infektionen von Kindern in eine persistierende Form, im Gegensatz zu den Erwachsenen, wo diese Zahl nur 5-10% ist. Die persistierende Infektion ist sehr hinterlistig, da es zwar vorkommt, dass der Patient bis zum Lebensende gesund bleibt, aber es kann Zyrrhose (Leberschrumpfung) verursachen, was letztendlich zum Leberkrebs führen kann. Die durch HBV-Infektion verursachten Todesfälle betragen jährlich eine Million. Das Genom des HBV ist sehr klein – 3.2 kb - obwohl es EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 12 VIREN-II auch Viren mit kleineren Genomen gibt. Es verfügt über vier ORFs, von welchen sieben Proteine transkribiert werden. Das wird vom Virus geschafft, indem es alle Nukleotide zum kodieren benutzt. ORF „P” bildet 80% des Genoms, lappt mit den ORFs „C” und „X” über und enthält den kompletten ORF „S”. Der Virus maximalisiert die Kodierungskapazität auch so, dass das Protein „L” in zwei Konformationen exprimiert wird. In der einen Konformation funktioniert das Molekül „L” als Virusverbindungsprotein, während in der anderen Konformation es die Hülle zum Kapsid bindet. Da das ganze Genom kodiert, befinden sich die cis-Regulatorsregionen auch in der kodierenden Region. FOLIE 46 DIE BAKTERIOPHAGEN sind die Viren von Bakterien. Für die Entdeckung der Replikation und der genetischen Aufbau der Phagen bekamen drei Forscher den Nobel-Preis (Max Delbrück, Alfred Hershey, und Salvador Luria). Über diese Viren wird in der Vorlesung „Bakterien” geredet. 13 EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © VIREN-II FOLIE 47 Riesige Viren und ihre Parasiten DER MIMIVIRUS (Acanthamoeba polyphaga) wurde 1992 aus in einem Wasserturm in England lebenden Amöbenart isoliert. Die unter den Viren als riesig zählende Grösse nahm den Forschern den Atem. Der Durchmesser ist 0,5 Mikrometer und kann so – im Gegensatz zu anderen Viren – auch unter Lichtmikroskop gesichtet werden. Der Virus verfügt über ein 1,2 Mb (Megabasen) grosses Genom, welches viele verschiedene Proteine kodiert, z.B. Polysaccharid-abbauende Enzyme, Translationsproteine, sogar 6 tRNA-Moleküle. Der Mimivirus infiziert in erster Linie Amöben, aber es besteht die Möglichkeit, dass es auch als menschlichen Krankheitserreger agieren kann, da in einigen in Lungenentzündung erkrankten Patienten die gegen den Virus produzierte Antikörper detektiert wurden. DER MAMAVIRUS ist ebenfalls ein riesiger Virus, grösser als viele Bakterien (z.B. Mycoplasma) und kann auch von anderen Viren (Sputnik-Virophage) infiziert werden. Obwohl sie in 1991 entdeckt wurden, wurden sie gefriert aufbewahrt, da man sie für Bakterien hielt. Man berichtete erst in 2003, dass es sich um Viren handelt. Sie sind warscheinlich Verwandten der Mimiviren. FOLIE 48 DER SPUTNIK-VIROPHAGE ist ein ikosaedrischer subviraler Agent (kleiner als ein Virus, aber einige Eigenschaften virushaftig); mit einer Grösse von 50 Nanometern. Der Sputnik kann allein die Zelle nicht infizieren, ein anderer Virus (Mimi- oder Mamavirus) muss auch infizieren, welcher schliesslich vom Sputnik vernichtet wird. Interessant ist, dass sie auch im inneren der riesigen Viren zusammengebaut werden können und so mit diesen zusammen infizieren. Der Sputnik enthält doppelsträngiges DNA-Molekül. FOLIE 49 Viren im Ozean Vor allem durch die Untersuchungen von Craig Venter wurde bekannt, dass die Ozeane eine riesige Menge von Viren enthalten, auch in einer geringen Menge von Wasser. Diese Viren sind nicht nur in den Wirtszellen zu finden sondern auch frei im Wasser. Der Grossteil der in den Ozeanen gefundenen Viren war bislang völlig unbekannt, es wird also die Beschreibung völlig neuer Familien erwartet. Riesige Viren wurden auch in den Ozeanen gefunden. Keine Folie 14 Neu auftauchende (emergens) Viren Der Begriff “neu auftauchende Viren” kann in zwei Sinnen benutzt werden: ein Virus infiziert einen neuen Wirtsorganismus, oder der Virus taucht an einem neuen, von ihm bislang unberührten Ort der Welt auf, oder auch beide Ereignisse können gleichzeitig vorkommen. Der Begriff „neu auftauchend” kann für die Viren auch in dem Fall verwendet werden, wenn ein Virus Zeit zu Zeit wieder und wieder erscheint. Der Virus der Maul- und Klauenseuche taucht zB. Zeit zu Zeit im Vereinigten Königreich auf. Die Wahrscheinlichkeit vom Neu- oder Wiederauftauchen der Viren wird durch das menschliche Verhalten und solche menschliche Tätigkeiten vergrössert, wie zB. fliegen und enger Kontakt mit Tieren, inklusive Jagd auf menschenähnliche Säugetiere und die Verzehrung von ihrem Fleisch. Es ist bewiesen, dass der SIV im Fleisch der Tiere vorhanden sein kann, und die Menschen können damit während der Verarbeitung oder Verzehrung des Fleisches infiziert werden. Die Übertragung von Schimpanse auf Mensch passierte zweimal, so sind HIV-1 und HIV2 aus ihren SIV-Vorläufern enstanden. Wenn ein Virus eine neue Wirtspezies findet, geht es in der Regel schnelle evolutionäre Änderungen (Mutationen, Selektion) durch, so kann ein neuer Virus entstehen. FILOVIREN Im Jahre 1967 wurden in der Stadt Marburg, Deutschland einige Laboratoriumsarbeiter an hämorrhagischen (blutenden) Fieber erkrankt. Wie es sich herausgestellt hat, haben sich die Kranken mit dem Blut, Organen oder der daraus erzeugten Zellkultur von aus Uganda stammenden, afrikanischen grünen Affen eingelassen. Die Untersuchungen haben ermittelt, dass die Affen einen Virus getragen haben, welcher sich dann auf die Mitarbeiter des Laboratoriums und von denen dann auf das Krankenhauspersonal verbreitet hat. Der Virus wurde Marburg-Virus bezeichnet und in die Familie Filoviridae eingeordnet, welche den Namen aus dem lateinischen Wort „filum” – Faser bekam. Im Jahre 1967 ist eine ähnliche Epidemie im afrikanischen Land Sudan entlang dem Fluss Ebola ausgebrochen. Aus den Kranken wurde ein mit dem Marburg-Virus ähnlicher Virus isoliert und Ebola genannt. Seitdem sind von den Marburg- und Ebolaviren verursachten Epidemien mehrmals in Afrika ausgebrochen, von Elfenbeinküste bis Kenya, in Mittelafrika und auch südwärts bis Angola. Die Ursache der Epidemienausbrüche ist nicht bekannt, nach einigen Vermutungen entwickeln sie, wenn der Mensch sich mit dem EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © VIREN-II Blut von infizierten menschenähnlichen Säugetieren einlässt. Es wurde herausgefunden, dass der Ebolavirus auch Schimpanzen und Gorillas infizieren kann. Die Ebola- und Marburg-Viren zirkulieren also in den Blutgefässen der infizierten Tiere, und der Kontakt mit dem Fleisch der während der Jägde getöteten Tiere kann die Übertragung der Viren auf Menschen verursachen. Die Verbreitung von Mensch zu Mensch erfolgt auch durch infiziertes Blut. In Afrika, mehrere Stämme des Ebola-Virus sind vorhanden. Weitere Spezies haben in den USA und in Italien aufgetaucht, sie gelangen in diese Länder mit Affen aus den Philippinen. Es gibt serologische Beweise auf die Infiziertheit der Affenbetreuer, eine Krankheit in Menschen verusachen sie aber nicht. Man vermutet, dass als Reservoiren von Marburg- und Ebolaviren auch andere Tiere dienen können, in welchen die Infektion keine, oder nur wenige Symptome verursacht. Mehrere Expeditionen wurden gestartet, um die potenziellen Reservoiren aufzuspüren, bis heute aber mit wenig Erfolg. SARS CORONAVIRUS Im Jahre 2002 hat eine neue menschliche respiratorische Krankheit im südlichen Teil von China aufgetaucht. Nächstes Jahr ist ein Arzt, der die Patienten behandelt hat, nach Hong Kong gereist, wo er krank wurde und gestorben ist. Demfolge, die Leute, die in demselben Hotel residierten, wie der Arzt, haben den Virus in manche Stellen der Welt (Singapur, Vietnam, Kanada, USA) mitgetragen. Das schwere, akute respiratorische Syndrom (SARS) hat sich also verbreitet. Obwohl 90% der Kranken sich gesundet sind, die Infektion erwies sich tödlich für die Anderen. Die Todesopfer hatten meisstens solche Grundkrankheiten, wie Diabetes, Herzkrankheit oder Immunmangel. Zuerst scheint SARS eine Krankheit der Atmungswege zu sein, aber es wird leicht in andere Teile des Körpers verbreitet. Als Erreger hat man einen Coronavirus identifiziert, das natürliche Reservoir von welchem nicht gefunden wurde. Die Weiterverbreitung von SARS konnte mit Quarantänemassnahmen verhindert werden, bislang hat es aber schon 8000 Kranken und fast 800 Todesopfer hinter sich gelassen. WEST-NIL VIRUS Im Jahre 1999 wurden in New York mehrere Menschen offensichtlich von viraler Encephalitis erkrankt, und einige sind auch daran gestorben. In derselben Zeit wurden Tiergartenvögel erkrankt, und der Tod von Wildvögeln, meisstens Krähe wurde gemeldet. Die Testergebnisse zeigten, dass sowohl die Menschen, als auch die Vögel von dem sogenannten West-Nil Virus infiziert worden sind. NEU AUFTAUCHENDE VIREN Der Virus von Masern und Mumps gehört zur Familie der Paramyxoviren, beide sind wichtige Pathogene, besonders die Masern, welche in den aufkommenden Ländern zu den führenden Todesursachen gehört. Bis zum Ende der 1990-er Jahre haben Masern und Mumps im Folge der weitverbreiteten Verwendung der MMR (Mumps, morbilli=Masern, rubeola=Röteln) Vakzine eine absteigende Tendenz gezeigt, dann hat aber das Impffieber der vakzinierten Kinder Zweifel über die Sicherheit der Vakzine erweckt. Als Folge hat die Vakzinierungsfrequenz nachgelassen, deshalb begann die Anzahl der Masern-, aber hauptsächlich der Mumpsfälle zu wachsen, hunderte von Masernfälle und tausende von Mumpsfällen erschienen. FOLIE 50 PRIONE Prione (keine Viren!) sind eigentlich infektionsfähige Agentien ohne Erbmaterial, ihr Name stammt auch daraus: Prion – protein only (nur Protein). In der Wirklichkeit handelt es sich um so ein Protein, welches in zwei Konformationen existieren kann, die eine ist ein pathologisches, während die andere ein normales Proteinmolekül. Die Kuriosität der Sache ist, dass das Protein mit der inkorrekten Konformation die Proteine mit korrekter Konformation zu inkorrekt umwandeln kann, so kann es sich praktisch vermehren. Die Verbreitung ist nicht genau bekannt, es wird durch das Verzehren von allerleien Geweben verbreitet, die mit dem Nervensystem in Beziehung sind, und es kann auch spontan entstehen, wenn das Gen mutiert, welches das Protein kodiert. Das Gen ist übrigens essentiell (grundlegend wichtig), wenn es in Experimenttieren mit genetischen Methoden ausgeschlagen wird, sterben sie. Leider können wir uns bis heute nicht gegen die Krankheit verteidigen, und wegen der langen Inkubationszeit ist auch ihre Erforschung schwer. Solche Krankheit ist z.B. die schwammartige Hirnkrankheit der Rinder und die Creutzfeld-Jacob Krankheit bei Menschen. Wörterbuch CD4 Rezeptor (cluster of differentiation 4): befindet sich an der Oberfläche der T-Helfer Zellen, Monozyten, Makrophagen und dentritischen Zellen. CD4 verstärkt das von dem T-Zell-Rezeptor generierte Signal dadurch, dass es Tyrosin-Kinase Enzyme in die Nähe des zum Signalmolekül bindenden Rezeptors rekrutiert (CD4 funktioniert also als Ko-Rezeptor des T-Zell-Rezeptors) (siehe Vortrag „Signalwege”). Chemokin-Rezeptor: eine G-Protein-gekoppelte Rezeptorart (siehe Vortrag „Zellkommunikation”). Diese Rezeptoren binden ursprünglich die als Teil der Immunantwort freigesetzten Chemokine, und initiieren dadurch die Differenzierung der T-Zellen und die Wanderung der Leukozyten. Die Chemokine werden in zwei Hauptklassen eingeteilt, abhängig davon, wie die Einordnung der Cysteine am N-Terminus ist: es gibt C-C und C-X-C Klasen (C: Cystein, X: jegliche andere Aminosäure). So werden die Chemokinrezeptore als CCR und EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt © 15 VIREN-II CXCR bezeichnet. Viele Moleküle unter denen, meisstens CCR5 und CXCR4 benehmen sich als KoRezeptoren des HIV-1. NOTIZEN: 16 EXTRA ANFORDERUNG – Abschnitte mit kleinen Buchstaben sind fakultativ! Vortrag 11. Boldogkői Zsolt ©
