Dengue Virus IgM Capture DxSelect
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Dengue Virus IgM Capture DxSelectTM (Auf Deutsch) Dengue Virus IgM BindungsELISA REF EL1500M Rev. T Indirekter enzymgekoppelter und immunadsorbierender Assay (ELISA) zum qualitativen Nachweis humaner IgM Antikörper gegen Dengue Virus Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Ausserhalb der Vereinigten Staaten: Für die in vitro Diagnostik. ANWENDUNGSBEREICH Der Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA von Focus Diagnostics ist ein qualitativer Test zum Nachweis humaner IgM Serumantikörper gegen Dengue Virus und damit zur Unterstützung der Diagnose auf eine akute Dengue Virus Infektion des Menschen bestimmt. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTVERFAHRENS Dengue Fieber (DF) ist eine akute, sich selbst begrenzende, virale Erkrankung, die durch Fieber, Kopfschmerzen, Schmerzen im gesamten Körper, Hautausschläge, Lymphadenopathie und Erschöpfung gekennzeichnet ist. Bei Vorliegen der schlimmsten Form einer Dengue Virus Infektion, dem Haemorrhagischen Dengue Fieber (HDF), leidet der Patient unter hohem Fieber und Nierenversagen, was zum häufig tödlichen Dengue Schock Syndrom (DSS) führt1. Schätzungen zufolge, sind weltweit etwa zwei Milliarden Menschen dem Risiko einer Infektion mit DF ausgesetzt, über eine Million Menschen werden pro Jahr infiziert2. Zusammen mit den hunderttausenden von Fällen an DSS, stellen diese Zahlen den Grund dafür dar, dass Dengue Virus heute weltweit als die wichtigste durch Arboviren hervorgerufene Krankheit gilt2. Dengue Virus (DV) ist ein Flavivirus und eng verwandt zum Gelbfiebervirus, dem Japanischen Enzephalitis Virus und anderen Arboviren der Gruppe B. Die Mitglieder dieser Gruppe bestehen aus einzelsträngiger RNA, umgeben von einem zwanzigflächigen Nukleokapsid, welches mit einer 10nm dicken Lipidschicht bedeckt ist3. Es gibt 4 Dengue Virus Stämme, die sich alle serologisch unterscheiden. Eine Infektion mit einem bestimmten Stamm schützt den Wirt nicht vor einer Infektion mit anderen Stämmen. Vielmehr deutet ein Bericht an, dass HDF und DSS besonders häufig in Personen auftreten, die zuvor durch einen anderen Stamm infiziert worden waren4. Das Vorhandensein zirkulierender, nicht-neutralisierender, kreuzreaktiver DV Antikörper kann die Infektion immunologisch sogar verstärken4. Nichtneutralisierende, kreuzreaktive Antikörper gegen andere nicht-DV Flaviviren bewirken jedoch keine immunologische Verstärkung der Infektion4. In der ganzen Welt wurden regelmäßig Dengue Viren Epidemien gemeldet. Die größten Epidemien fanden im Süden der Vereinigten Staaten (1922; es waren über eine Million Menschen betroffen), in Australien (1925 und 1942), in Griechenland (1927) und in Japan (1942-45) statt2. Von Behörden aus Peru und von der US-CDC wurde ein größerer Ausbruch von DF zwischen März und Juli 1990 gemeldet5. Das epidemiologische Zentrum befand sich in der Gegend um Iquitos, Peru, wobei DV Typ 1 und Typ 4 die Haupterreger darstellten. Dies war das erste Mal, dass eine einheimische Übertragung von Dengue in Peru durch Laborbefunde bestätigt werden konnte5. Dengue Virus kann überall da übertragen werden, wo die Moquitovektoren Aedes aegypti und Aedes albopictus vorkommen. A. aegypti kommt hauptsächlich in den tropischen und subtropischen Gebieten Amerikas vor und ist im Süden der USA heimisch2. In Asien stellt A. albopictus den hauptsächlichen Überträger von Dengue dar. Diese Mosquitoart hat sich erst vor kurzem im Norden der Vereinigten Staaten bis ins zentrale Illinois angesiedelt; dennoch konnte bis jetzt keine Übertragung von DV festgestellt werden2. Bei Verdacht auf DF kann bei den meisten Patienten eine Diagnose innerhalb kurzer Zeit durch serologische Methoden gestellt werden. Haemagglutinationshemmung und der Plaque Test gehören zu den klassischen Methoden3. Inzwischen werden jedoch IgM-bindende, enzymgekoppelte und immunadsorbierende Assays (ELISA) am häufigsten verwendet. In den meisten Patienten ist die IgM Antwort gegen DF spezifisch für den jeweiligen Stamm und kann bis zu 90 Tagen persistieren6. IgG Antikörper gegen Dengue Virus konnten bis zu 60 Jahren nach einer Infektion in den Patienten nachgewiesen werden7. Eine einzelne Antikörperbestimmung sollte daher nicht als Grundlage für eine Beurteilung herangezogen werden. Dennoch ist der IgG ELISA als epidemiologisches Hilfsmittel bei der Bestimmung der serologischen Prävalenz von Nutzen. Informationen dieser Art können bei der Untersuchung der Bedeutung einer verstärkten Immunreaktion in DSS hilfreich sein. Wie bei einer Infektion mit den meisten anderen Flaviviren, weist das nach einer DV Infektion gebildete IgG ausgeprägte Kreuzreaktionen zu den anderen Mitgliedern der Flavivirusgruppe auf. Der Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA von Focus Diagnostics ist ein indirekter ELISA, der für den Nachweis von IgM Antikörpern gegen DV, Typ 1–4, bestimmt ist. Der Test ist spezifisch für IgM und verwendet als Substrat Flavivirusgruppen-spezifische, monoklonale Antikörper, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert wurden, sowie TMB. Jede Vertiefung ist mit Anti-human IgM beschichtet. Die Antigenlösung enthält gleiche Anteile an inaktivierten, gereinigten DV, Typ 1-4. Es wurden die folgenden Virusstämme verwendet: Typ 1: TH-Sman; Typ 2: TH-36, Typ 3:H87; und Typ 4: H241. DAS TESTPRINZIP Beim Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA von Focus Diagnostics sind die aus Polystyren gefertigten Vertiefungen mit Antikörpern gegen humanes IgM (µKette) beschichtet. Die verdünnten Serumproben und Kontrollen werden in den Vertiefungen inkubiert, um die Bindung der in den Seren vorhandenen IgM Antikörper an die anti-human IgM Antikörper in den Vertiefungen zu ermöglichen. Unspezifische Präzipitate werden ausgewaschen. Danach wird Dengue Virus (DV) Antigen in die Vertiefungen gegeben und inkubiert; ist anti-DV IgM in den Proben vorhanden, bindet das DV Antigen daran. Ungebundenes DV Antigen wird in einem Waschschritt entfernt. Danach wird Maus anti-DV Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRPO), zugegeben und inkubiert; wurde DV Antigen in den Vertiefungen gebunden, so wird dieses Maus-anti-DV:HPO Konjugat daran gebunden. Überschüssiges Konjugat wird ausgewaschen. Daraufhin werden Enzymsubstrat und Chromogen dazugegeben, um eine Farbreaktion zu erzeugen. Nach Zugabe der Stop-Lösung, wird die Veränderung der Farbe durch spektrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte (OD) bestimmt. Diese ist direkt proportional zu der Menge an antigenspezifischem IgM in der Probe. Zur Auswertung werden die OD-Ergebnisse der Patientenproben mit den OD-Cut-Off Werten der Referenzproben verglichen. Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA Seite 2 HINTERGRUNDSUBSTRAKTION Das Focus Diagnostics Dengue-Virus IgM Capture DxSelect™ Kit verwendet Capture-Wells, die mit Anti-Human-IgM beschichtet sind. Gebundene IgM mit heterophiler Antikörperaktivität könnten eine direkte Bindung mit dem Reporter-Reagens eingehen. Ein Verfahren, um diese falschen Reaktionen abzuschwächen, besteht darin, eine Hintergrundsubtraktion anzuwenden. Publizierte Daten belegen, dass Proben mit einem niedrigen Reaktionsniveau möglicherweise von der Implementierung einer Hintergrundsubtraktion profitieren; allerdings muss jedes Labor für Analyte, die mit µ-Capture-ELISA untersucht wurden, eigene Reflextest-Algorithmen festlegen.11. GELIEFERTES MATERIAL Der Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA von Focus Diagnostics enthält ausreichend Material zur Durchführung von 96 Bestimmungen. Die gelieferten Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Das gesamte gelieferte Material ist ungeöffnet und bei einer Lagerung bei 2 bis 8°C bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Antigen, Lyophilisiert REF EL1522 Ag Antigen, Lyophilized 2 Fläschchen mit inaktiviertem, lyophilisiertem Dengue Virus Antigen (gleiche Anteile an DV Typ 1–4). Mit dem Inhalt jedes 6mL Antigenfläschchens können etwa 60 Tests durchgeführt werden. Zur Rekonstitution des Antigens, genau 6 mL der mitgelieferten Rekonstitutionslösung zugeben. AUF KEINEN FALL DESTILLIERTES WASSER ODER EINE ANDERE LÖSUNG ALS DIE MITGELIEFERTE REKONSTITUTIONSLÖSUNG VERWENDEN, DA DIE TESTERGEBNISSE SONST NICHT AUSWERTBAR SIND! Das Antigen vor Gebrauch eine Stunde bei Raumtemperatur rehydrieren lassen: das Antigen muss vor dem Gebrauch vollständig gelöst sein. Nach Rekonstitution kann nicht verwendetes Antigen bei 2 bis 8°C bis zu 30 Tage gelagert werden. Soll das verbleibende Antigen nicht innerhalb von 30 Tagen verwendet werden, in kleinen Mengen bei mindestens –70°C einfrieren. Nur einmal auftauen. Antigen Rekonstitutionslösung, 13 mL REF Antigen Reconstitution Solution, 13 mL Ein Fläschchen mit Zellkulturwasser, oberflächenaktiven Substanzen und 0.1% Natriumazid. EL1523 SOLV Ag Reaktionsvertiefungen zur IgM-Bindung, 96 Stück REF EL1521 Ab IgM IgM Capture Wells, 96 wells 12 Streifen mit je acht Reaktionsvertiefungen aus Polystyren auf einer Halterung. Jede Vertiefung ist mit anti-human IgM beschichtet. Zur kosteneffektiven Nutzung können die einzelnen Vertiefungen jedes Streifens abgetrennt und individuell verwendet werden. Zur Vermeidung von Kondensation, versiegelte Mikroreaktionsbehälter vor dem Öffnen der Packung auf Raumtemperatur erwärmen lassen. IgM Konjugat, 16 mL REF EL1502 CONJ IgM Conjugate, 16 mL Ein Röhrchen mit affinitätsgereinigtem und peroxidasekonjugiertem Maus-anti-Flavivirus. Enthält Protein, Puffer und Konservierungsmittel. IgM IgM-Nachweisbare Kontrolle, 0.30 mL REF EL1515 CONTROL > IgM Detectable Control, 0.30 mL Ein Fläschchen Humanserum. Enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsstoff. Muss vor der Verwendung verdünnt werden (siehe Vorbereitung der Proben, Kontrollen und Kalibratoren, unten). Nicht nachweisbare Kontrolle, 0.30 mL REF EL1512 CONTROL < Non-Detectable Control, 0.30 mL Je ein Röhrchen mit Humanserum entsprechend den Kontrollen für verschiedene Positivitätsgrade. Enthält 0.1% Natriumazid zur Konservierung. Vor Gebrauch verdünnen (siehe Vorbereitung der Proben, Kontrollen und des Kalibrators, unten). IgM Cut-Off Kalibrator, 0.30 mL REF EL1503 CONTROL CAL IgM Cut-Off Calibrator, 0.30 mL Ein Röhrchen mit Humanserum. Enthält 0.1% Natriumazid zur Konservierung. Vor Gebrauch verdünnen (siehe Vorbereitung der Proben, Kontrollen und des Kalibrators, unten). Probenverdünnungspuffer, 100 mL REF Sample Diluent, 100 mL Ein Röhrchen mit Protein, oberflächenaktiven Substanzen und Konservierungsmittel in PBS. EL1608 DIL SPE 10X Waschpuffer, 100 mL REF EL0405 BUF WASH 10X Wash Buffer, 100 mL Ein Röhrchen mit einer oberflächenaktiven Substanz in PBS mit Konservierungsmittel. Vor Gebrauch eine einfach konzentrierte (1X) Waschpufferlösung ansetzen. Für eine 1X Waschpufferlösung, 100 mL 10X Waschpuffer mit 900 mL destilliertem oder deionisiertem Wasser mischen und dabei die Kristalle aus dem Röhrchen vollständig auswaschen. Nur hochgereinigtes Wasser verwenden. In manchen Fällen wurde die Qualität des Tests durch mindergereinigtes Wasser beeinträchtigt. Gut mischen, bis sich alle Kristalle gelöst haben. Substratreagenz, 16 mL REF EL0009 SUBS TMB Substrate Reagent, 16 mL Ein Röhrchen mit gepuffertem Tetramethylbenzidin (TMB) und Meerrettichperoxid in Puffer. Dunkle Blaufärbung der Lösung zeigt Kontamination mit Peroxidase an; in diesem Fall ein frisches Röhrchen verwenden. Gebrauchsfertig. Stop Reagenz, 16 mL Stop Reagent, 16 mL Ein Röhrchen mit 1 M Schwefelsäure. Abdeckfolie Drei Bögen Abdeckfolie. REF EL0105 SOLN STOP Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA Seite 3 BENÖTIGTE MATERIALIEN, DIE NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN SIND 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Destilliertes Wasser 250 oder 500 mL Waschflasche 1 L – Eichzylinder Teströhrchen für die Serumverdünnung 10 µL Pipettoren mit Einwegspitzen 100 µL Pipettoren mit Einwegspitzen (bei Tests mit 48 Mikroreaktionsbehältern wird die Benutzung eines 100 µL 8-Kanal Pipettor empfohlen) 1 mL Pipettor oder Dispenser 5 mL Pipette Stoppuhr Papiertücher oder absorbierendes Papier Abflussbecken Vortex oder ähnliches Probenmischgerät Spektrophotometer für die Messung von ELISA-Platten, Wellenlänge = 450 nm HALTBARKEITSDAUER UND HANDHABUNG DER KITS 1. 2. 3. 4. Alle Komponenten sind stabil bis zum Monatsende des Verfallsdatums bei einer Lagerung bei 2 bis 8°C. Testausrüstung und deren Bestandteile nur bis Ablauf des Verfalldatums verwenden. Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation vor starkem Lichteinfall schützen. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. WARNUNGEN UND SICHERHEITSVORKEHRUNGEN 1. Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Außerhalb der USA ist dieser Kit für den diagnostischen Gebrauch in vitro bestimmt. 2. Alle Blutprodukte sollten als potentiell infektiös angesehen werden. Das Ursprungsmaterial dieses Produktes (einschließlich der Kontrollen), ist mit USFDA-anerkannten Methoden auf HBs-Antigen, Hepatitis C-Antikörper und HIV-1/2 (AIDS) Antikörper getestet und für negativ befunden worden. Dennoch gewährleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie dafür, daß Produkte, die aus menschlichem Blut gewonnen wurden, die genannten oder andere infektiöse Krankheiten nicht übertragen können. Alle Kontrollen, Serumproben und Geräte, die in Kontakt mit den Proben kommen, sollten daher als potentiell infektiös angesehen und durch entsprechende Sicherheitsmaßnahmen dekontaminiert oder beseitigt werden.9,10 3. Das lyophilisierte Antigen enthält inaktivierte Dengue Virus Antigene aus 4 Stämmen; dennoch sollten die Platten als potentiell infektiös angesehen und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen für den Umgang damit getroffen werden. 4. Die Stop-Reagenz enthält Schwefelsäure. Kontakt mit Augen und Haut verhindern. Bei Kontakt mit großen Mengen an fliessendem Wasser abspülen. 5. Zur Verbesserung ihrer Haltbarkeit enthalten einige Reagenzien 0.1% Natriumazid. Um die Ansammlung explosiver Metallazide in Abflussrohren aus Blei und Kupfer zu vermeiden, sollte nach dem Ausgießen der Kontrollen in den Abfluss mit ausreichenden Mengen fließendem Wasser nachgespült werden. Nach Möglichkeit blei - und kupferfreie Abfluss-Systeme benutzen. Abfluss regelmäßig mit 10% Natriumhydroxid (VORSICHT: ätzend) dekontaminieren, 10 Minuten einwirken lassen und mit ausreichenden Mengen fließendem Wasser nachspülen. 6. Reagenzien nicht durch Komponenten anderer Packungschargen oder durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzen. 7. Nur die Protokolle auf diesem Beipackzettel verwenden. Veränderung der angegebenen Inkubationszeiten oder Temperaturen kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. 8. Kreuzkontaminationen von Patientenproben können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Patientenproben und Reagenzien daher vorsichtig in die IgM Mikroreaktionsbehälter geben, um ein Zusammenmischen benachbarter Reaktionsfelder zu vermeiden. Kontamination des Konjugates mit Substrat vermeiden. 9. Bakterielle Kontamination von Serumproben oder Reagenzien kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Zur Vermeidung sterile Arbeitstechniken benutzen. 10. Den Test bei Raumtemperatur durchführen (cirka 20 bis 25°C). 11. Geeignete Pipettiertechniken verwenden und während der Durchführung des gesamten Tests beibehalten, um optimale und reproduzierbare Werte zu erhalten. PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG Serum ist die bevorzugte Probenquelle. Es wurde nicht untersucht, ob auch andere Proben mit diesem Test untersucht werden können. Hyperlipaemische, hitzeinaktivierte, hämolysierte oder kontaminierte Seren können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen und ihr Gebrauch sollte daher vermieden werden. Probenentnahme und Handhabung Blutproben aseptisch unter Anwendung standardisierter Blutabnahme-Techniken entnehmen. Vor dem Zentrifugieren bei Zimmertemperatur koagulieren lassen. Sterile Abnahme und Aufbewahrung des Serums in einem fest verschließbaren, sterilen Behälter für die Lagerung bei 2 bis 8°C. Kann der Test erst nach mehr als 5 Tagen durchgeführt werden, sollten die Proben bei mindestens –20°C eingefroren und erst kurz vor Gebrauch wieder aufgetaut und gut durchmischt werden. Vorbereitung der Proben, Kontrollen und des Kalibrators. Alle Proben,. Kontrollen und die Kalibratorlösung 1:101 wie folgt verdünnen: Beschriften Sie die Röhrchen und 1 mL der Probenverdünnungslösung in jedes beschriftetes Röhrchen geben. 10 µL Probe, Kontrolle oder Kalibratorlösung dazu geben und auf dem Vortex gut mischen. DAS TESTVERFAHREN Der Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA von Focus Diagnostics kann auf zweierlei Arten verwendet werden. Im klassischen CDC-Protokoll findet ein Über Nacht-Inkubationsschritt zur Antigenbindung statt; alternativ kann dieser Inkubationsschritt auf 1 Stunde bei Raumtemperatur abgekürzt werden. 1. 2. 3. 4. Vor Gebrauch alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Das Päckchen mit den IgM-Reaktionsvertiefungen aus dem Kühlschrank nehmen und zur Vermeidung von Kondensation vor dem Öffnen Raumtemperatur annehmen lassen. Falls nicht die ganze Platte verwendet werden soll, unbenutzte Streifen zurück in das Päckchen geben und mit einem Exsikkans vollständig wiederverschlossen bei 2 bis 8°C aufbewahren. (Bemerkung: Nach Beendigung des Tests, Halterung für weitere Tests aufbewahren). Die Antigenlösung ansetzen (es sollte sichergestellt werden, dass die Reagenzien Raumtemperatur angenommen haben). Wird der Kit zum ersten Mal verwendet, ausreichend Antigen ansetzen (siehe geliefertes Material, oben). Vertiefungen mit 1X Waschpuffer füllen (siehe geliefertes Material, oben) und für 5 Minuten einwirken lassen. Flüssigkeit aus den Vertiefungen ausgießen oder absaugen. Zur vollständigen Entfernung des Waschpuffers, die Vertiefungen auf Papiertüchern oder absorbierendem Papier ausklopfen. 100 µL der Probenverdünnungslösung in die Leerproben-Vertiefungen und jeweils 100 µL der verdünnten Proben oder Kontrollen (siehe Vorbereitung der Proben und Kontrollen, oben) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen geben. (Bemerkung: Bei Tests, in denen mehr als 48 Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA Seite 4 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Vertiefungen verwendet werden, sollte zuerst 250 µL der verdünnten Proben in eine leere Mikrotiterplatte gegeben werden, bei der die jeweilige Vertiefung derjenigen auf der ELISA-Platte entspricht. Mit Hilfe einer 8 bis 12 Kanal Pipette können dann jeweils 100 µL der Seren auf einmal in die Antigenvertiefungen überführt werden). Die Platten mit Versiegelungsfolie abdecken oder in eine feuchte Kammer stellen und 60 ± 1 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) inkubieren. Versiegelungsfolie entfernen oder Vertiefungen aus der feuchten Kammer nehmen und den Inhalt der Vertiefungen in ein Waschbecken oder einen anderen Container ausgießen. Jede Vertiefung über dem Abflussbecken vorsichtig mit einem steten Strahl 1X Waschpuffer aus einer Spritzflasche waschen, und den Inhalt der Reaktionsvertiefungen in ein Waschbecken oder einen anderen Container abgießen. Wasch-Schritt 7 noch 2 Mal wiederholen. Dabei beim zweiten Waschschritt die Waschlösung vor dem Ausgießen 5 Minuten einwirken lassen. Vertiefungen auf absorbierendem Papier kräftig ausklopfen, um Überreste des 1X Waschpuffers zu entfernen. Zur vollständigen Entfernung des Waschpuffers, die Vertiefungen auf Papiertüchern oder absorbierendem Papier ausklopfen. Mit Hilfe einer 8–12 Kanal-Pipette, jeweils 100 µL der vorbereiteten Antigenlösung (siehe Schritt 2, oben) in alle Vertiefungen geben. Die Platten mit Versiegelungsfolie bedecken und inkubieren. 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) inkubieren. Wasch-Schritte 6 bis 9 wiederholen. Mit Hilfe einer 8–12 Kanal-Pipette, 100 µL IgM Konjugat in jede Vertiefung geben. Die Platten mit Versiegelungsfolie bedecken und inkubieren. 30 ± 1 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) inkubieren. Waschschritte 6 bis 9 wiederholen. Mit Hilfe einer 8–12 Kanal-Pipette, 100 µL Substratreagenz in jede Vertiefung geben. Die Zeit ab der Zugabe der Substratreagenz in die erste Vertiefung stoppen. (Bemerkung: Unter keinen Umständen dasselbe Reservoir zum Pipettieren des Konjugats und der Substratreagenz verwenden). 10 ± 1 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) inkubieren. Mit Hilfe einer 8–12 Kanal-Pipette, Reaktion durch Zugabe von je 100 µL Stop Reagenz pro Vertiefung stoppen. Stopreagenz in der gleichen Weise und in der gleichen Reihenfolge wie das Substrat zugeben. In antikörperpositiven Vertiefungen sollte die Farbe sich von blau nach gelb verändern. Die Aussenseite der Vertiefungen vorsichtig abtupfen, um Tropfen, die das Ablesen im Spektrophotometer behindern können, zu entfernen. Oberfläche nicht durch zu starkes Reiben zerkratzen (Bemerkung: Große Blasen auf der Oberfläche der Flüssigkeit können die Auswertung der O.D. beeinflussen). Die Absorption in jeder Vertiefung innerhalb einer Stunde nach Anhalten der Reaktion messen. Das Spektrophotometer auf 450 nm einstellen. Leerwert durch Messung der Leerwert-Vertiefungen bestimmen. IgM ELISA Durchführung (Kurzfassung) 1. Verdünnen der Proben 1:101 in Probenverdünner (z.B. 10 µL + 1000 µL). 2. Inkubieren der Kammern für 5 Minuten mit 1X Waschpuffer, dekantieren. 3. 100 µL der Proben und inkubieren für 60 Minuten, dekantieren. Optionale Hintergrundsubstraktion: In beide Vertiefungen werden 100 µL verdünnte Probe gegeben. Eine Vertiefung (die „Antigenvertiefung“) erhält in Schritt 5 DV-Antigen und die andere Vertiefung (die „Verdünnungsmittelvertiefung“) erhält in Schritt 5 den Probenverdünner. Wichtiger Hinweis: Die Hintergrundsubtraktion ermöglicht den Nachweis heterophiler Antikörper in positiven Proben. Die Hintergrundsubtraktion sollte daher nur mit zunächst positiven Patientenproben durchgeführt werden. 4. Dreimal waschen. 5. 100 µL des Antigens und inkubieren für 60 Minuten, dekantieren. Optionale Hintergrundsubstraktion: In die Antigenvertiefung 100 µL Antigen geben und in die Verdünnungsmittelvertiefung 100 µL Probenverdünner geben und 60 Minuten inkubieren. 6. Dreimal waschen. 7. 100 µL des Konjugates und inkubieren für 30 Minuten, dekantieren. 8. Dreimal waschen. 9. 100 µL der Substratreagenz und inkubieren für 10 Minuten. 10. 100 µL der Stoppreagenz, messen bei λ = 450 nm. Einzelheiten siehe Abschnitt “Durchführung des Tests". QUALITÄTSKONTROLLE Jeder Testlauf (egal ob Platte, Streifen oder Vertiefungen einer einzelnen Platte) muss den Kalibrator zur Bestimmung der Ausschlussgrenze (Cut-Off Kalibrator) und beide Kontrollen enthalten. Bei Verwendung mehrerer Platten auf einmal, sollte jede Platte den Cut-Off Kalibrator und beide Kontrollen enthalten. Bis der Anwender mit dem Test vertraut ist, sollten für alle Proben, Kontrollen und den Cut-Off Kalibrator Doppelbestimmungen durchgeführt werden, wobei der Cut-Off Kalibrator in damit insgesamt 4 Vertiefungen wiederholt getestet werden sollte. Werden einzelne Vertiefungen verwendet, sollten für den Cut-Off Kalibrator Dreifachbestimmungen durchgeführt werden. Wenigstens 1 Leerprobe (nur mit Probenverdünnungspuffer gefüllt) zur Kalibrierung des Gerätes verwenden. Der Cut-Off Kalibrator ermöglicht durch seine Zusammensetzung eine Unterscheidung zwischen negativen und positiven Seren. Nach Subtraktion der Leerwerte beträgt die Ziel-OD des Cut-Off Kalibrators etwa 0.250 OD Einheiten. Obwohl der Absorptionswert je nach Test und Labor unterschiedlich sein kann, sollte der Durchschnittswert in den Vertiefungen mit dem Cut-Off Kalibrator im Bereich zwischen 0.100 und 0.500 O.D. liegen. Alle O.D. Werte des Cut-Off Kalibrators sollten ausgehend von den Durchschnittswerten innerhalb von 0.100 Absorptionseinheiten liegen. Die Testeigenschaften und die Genauigkeit der Ergebnisse hängen von den Indexwerten der Kontrollen, und nicht nur von den absoluten OD Werten des Cut-Off Kalibrators ab. Die Ergebnisse als Indexwerte relativ zum O.D. Wert des Cut-Off Kalibrators einstufen. Zur Berechnung der Indexwerte, die auf den Leerwert korrigierten O.D. Werte der Proben durch den korrigierten, durchschnittlichen O.D. Wert des Cut-Off Kalibrators dividieren. 1. 2. Der Indexwert der Nachweisbare Kontrolle sollte betragen ≥1.5 und ≤3.5. Der Indexwert der Nicht nachweisbare Kontrolle sollte betragen <0.8. Weichen die Kontrollergebnisse oder die des Kalibrators von diesen Angaben ab, sollten die Patiententests als ungültig betrachtet und der Test wiederholt werden. Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA Seite 5 Berechnung der Ergebnisse nach Hintergrundsubtraktion Schritt 1. Der Index der Kontrollen wird berechnet, indem die OD der Kontrollen durch die Cut-off OD dividiert wird. Index der Kontrollen (Cut-off und Kontrollindex) = OD der „Antigenvertiefung“/Cut-off OD Schritt 2. Der Index der Patientenproben wird berechnet, indem zunächst die Netto-Patienten-OD berechnet (durch Subtraktion der OD der„Verdünnungsmittelvertiefung“ von der OD der „Antigenvertiefung“) und dann durch die Cut-off OD (CO-OD) dividiert wird. Netto-Patienten-OD = OD der „Antigenvertiefung“ – OD der „Verdünnungsmittelvertiefung“ Index der Patientenproben = Netto-Patienten-OD /CO-OD Schritt 3. Auswertung der Ergebnisse anhand der im Abschnitt Auswertung angegebenen Wertebereiche (z.B. negativ < 1,00 und positiv > 1,00). Beispielberechnung für Ergebnisse nach optionale Hintergrundsubstratktion OD* ID Ag-OD Schritt 1 Schritt 2 Kontroll-OD durch SD-OD von Netto-OD durch CutCut-offOD dividieren Ag-OD subtrahieren off OD dividieren SD-OD Ag OD/CO OD = Index für Kontrollen Nicht nachweisbare Kontrolle 0,008 0,02 Cut-off 0,400 1,00 Ag OD – SD OD = Netto-OD für Patienten Netto-OD/CO – OD = Index für Patienten Schritt 3 Auswertung IgM-Nachweisbare Kontrolle 1,200 Probe A 0,860 0,020 3,00 0,840 2,10 POS Probe B 0,890 0,010 0,880 2,20 POS 0,760 Probe C 0,720 * Die Leerwert-OD ist von jedem Ergebnis bereits subtrahiert. 0,040 0,10 NEG Diskussion der Ergebnisberechnung nach Hintergrundsubtraktion Probe A und B können als IgM-positiv interpretiert werden, da der Index nach Subtraktion des Hintergrundes immer noch höher ist als 1,00 (die Vertiefungen ohne Antigen waren nicht reaktiv). Probe C beweist die Wichtigkeit der Hintergrundsubtraktion. Probe C war selbst dann reaktiv, wenn anstatt des Dengue Fieber-Antigens Probenverdünner dazugegeben wurde; dies weist darauf hin, dass die IgM-Capture-Antikörper und das monoklonale Konjugat durch Antikörper in der Probe vernetzt worden sind. Probe C ist daher als IgM-negativ einzustufen, da der Wert nach Subtraktion des Hintergrunds bei 0,10 und damit unter 1,00 lag (d.h. im Wertebereich der negativen Ergebnisse). INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE Die Patientenprobenergebnisse als Indexwerte relativ zum O.D. Wert des Cut-Off Kalibrators einstufen. Zur Berechnung der Indexwerte, die auf den Leerwert korrigierten O.D. Werte der Proben durch den korrigierten, durchschnittlichen O.D. Wert des Cut-Off Kalibrators dividieren. >1.00 <1.00 Positiv. Negativ. Ein Indexwert von >1.00 gilt als vorläufiger Nachweis für das Vorhandensein von IgM Antikörpern gegen Dengue Virus. Ein Indexwert von <1.00 zeigt an, dass keine IgM Antikörper gegen Dengue Virus nachgewiesen wurden. EINSCHRÄNKUNGEN 1. 2. 3. Dengue Virus ist ein Flavivirus. Zu den anderen Migliedern dieser Gruppe gehören das Banzi Virus, das Bussuquara Virus, das Iiheus Virus, das Japanische Enzephalitis Virus, das St. Louis Encephalitis Virus, das Murray Valley Enzephalitis Virus, das Rocio Virus, das Kunjin Virus, das Spondweni Virus, das Sepik Virus, das Westliche Nilvirus, das Gelbfiebervirus, das Zika Virus, das Wesselsbron Virus, das Rio Bravo Virus, das Mitteleuropäische Enzephalitis Virus, das Russische Frühling-Sommer Virus, das Kyasanur Forest Disease Virus, das Louping ill Virus, das Negishi Virus, das OmskHaemorrhagisches-Fieber-Virus und das Powassan Virus. Während die Mehrzahl dieser Viren nur in seltenen Fällen Erkrankungen des Menschen verursachen oder auf bestimmte geographische Regionen begrenzt sind, treten häufig Kreuzreaktionen zwischen den Mitgliedern der Flaviridae auf. Bevor eine endgültige Diagnose auf Dengue Fieber gestellt wird, sollten die Testergebnisse daher vorsichtig interpretiert werden. Tests dieser Art sind kein Ersatz für die klinische Einschätzung eines Arztes. Alle Ergebnisse aus dieser und anderen Serologien, sollten zur Diagnose einer Dengue Virus Infektion mit der klinischen Anamnese, epidemiologischen Daten und anderen Informationen, die dem behandelnden Arzt vorliegen, korreliert werden. Ergibt sich ein negatives Ergebnis, obwohl aufgrund der epidemiologischen und klinischen Daten der Verdacht auf Dengue Fieber besteht, sollte 7 bis 10 Tage später erneut Blut abgenommen und das Serum auf IgM Antikörper getestet werden. ZU ERWARTENDE BEFUNDE Einer nicht-veröffentlichten Studie zufolge, waren in 90% der bestätigten Dengue Fieber Fälle 7 Tage nach der Manifestation IgM Antikörper vorhanden, die im ELISA nachweisbar waren. 10 Tage nach Manifestation waren in 93% der Fälle IgM Antikörper vorhanden, die im ELISA nachweisbar waren8. Für Seren von Patienten ohne Anzeichen, Symptomen oder vorangegangener Infektion mit Dengue Fieber sollte sich in diesem Test ein negatives Ergebnis ergeben. BESONDERE TESTEIGENSCHAFTEN An Kunden ausserhalb der Vereinigten Staaten werden Angaben zu den besonderen Testeigenschaften getrennt geliefert. Dengue Virus IgM Bindungs-ELISA Seite 6 LITERATUR 1. Halstead, SB. 1980. Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p.107-173. In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York. 2. Gubler, DJ. 1989. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990’s: top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40:571-578. 3. Henchal, EA and JR Putnak. 1990. The Dengue Viruses. Clin. Micro. Rev. #:376-396. 4. Halstead, SB. 1989. Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev. of Inf. Dis. 11:S830-S839. 5. MMWR. 1991. 40:v9:145. 6. Gubler, DJ. 1989. Dengue, p.223-260. In T.P. Monath (ed.) 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Clinical and Vaccine Immunology. 15:v8:1304-1306. AUTORISIERTE REPRÄSENTANT mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71, 30855 Langenhagen-Hannover, Deutschland BESTELLINFORMATIONEN Telefon: (562) 240-6500 (International) Fax: (562) 240-6510 PI.EL1500M.OUS-DE Rev. T Erstellungdatum: 11 Februar 2011 TECHNISCHE HILFE Telefon: (562) 240-6500 (International) Fax: (562) 240-6526 Besuchen Sie unsere Webseite: www.focusdx.com Cypress, California 90630, U.S.A.
