Versuch V – Proteine Modul Bio-280 Physiologie und Biochemie der
Werbung
Modul Bio-280 Physiologie und Biochemie der Pflanzen Versuch V – Proteine Elektrophorese „Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld“ Plus-Pol (Anode) qE v= 6πrη Minus-Pol (Kathode) Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von Ladung und Größe der Teilchen Proteine Bei Proteinen ergibt sich die Nettoladung q aus Summe der Ladung aller Seitenketten NH3+ COONH3+ COOCOO- Proteine Isoelektrischer Punkt Der pH-Wert, bei dem die Nettoladung eines Proteins 0 ist, entspricht dessem isoelektrischen Punkt (pI) negative und positive Ladungen der Seitenketten heben sich hier auf Überwiegen saure Aminosäuren im Protein, so ergibt sich ein niedriger pI < 6. Das Protein ist bei neutralem pH–Wert negativ geladen. Überwiegen basische Aminosäuren im Protein, so ergibt sich ein hoher pI > 8. Das Protein ist bei neutralem pH–Wert positiv geladen. Proteine Elektrophoretische Trägermedien Celluloseacetatstreifen Agarosegele Exkurs: Auftrennung nach Molekulargewicht in der SDS-PAGE Das anionische Detergenz SDS bindet an Proteine im Verhältnis 1,4 zu 1. Polyacrylamidgele Entfaltung des Proteins und Maskierung seiner Eigenladung Ladung Protein-SDS-Komplexes ~ Molekulargewicht Proteine Durchführung der Elektrophorese # 1) 2) 3) 4) Startpunkt in der Mitte markieren Kathodenseite markieren markieren, Fingerabdrücke vermeiden Gruppennummer auftragen In Elektrophoresepuffer 30 min inkubieren Lufteinschlüsse vermeiden!!! Proteine Durchführung der Elektrophorese 5) Rechte und Linke Kammer der Apparatur mit Puffer füllen 6) Enden des Streifens in Pufferlösung der Kammern tauchen 7)Proben in der Mitte auftragen, Streifen nicht beschädigen 8)Bromphenolblaumarker auftragen 9) Deckel schließen Kammer an Spannungsgerät anschließen und für 45 min 150 V Spannung anlegen Proteine Proteinfärbung mit Coomassie-Brilliant Blau Die Coomassiefärbung ist wenig aufwendig und detektiert bis zu 50 - 100 ng Protein. Coomassie-Brilliantblau G-250 Triphenylmethanfarbstoff, der an an positiv geladene und unpolare Seitenketten bindet Proteine Durchführung der Proteinfärbung Vor Öffnen der Elektrophoresekammer Spannungsgerät AUSSCHALTEN!!! Proteine Durchführung der Proteinfärbung # 1)Streifen in Färbelösung überführen und UNTER DEM ABZUG 20 min. inkubieren 2)10 min in Entfärbelösung inkubieren 3)Abspülen, Trocknen und Proteinbanden markieren Proteine Auswertung # Notieren Sie Laufrichtung (zur Kathode oder Anode und Laufstrecke der verschiedenen Proteine. ) Berechnen Sie Laufgeschwindigkeiten der einzelnen Flecken in cm/h. (45 min Laufzeit!!!) Proteine Fragen Welche der Proteine sind beim pH-Wert des verwendeten Puffers positiv, welche negativ geladen? positiv geladen. Proteine, die zur Kathode wandern, sind ………….. negativ geladen. Proteine, die zur Anode wandern, sind …………… Welche Rückschlüsse lassen Laufrichtung und Laufgeschwindigkeit auf die Oberflächenladung, die Molekülgröße und die Lage des IEP der jeweiligen Proteine zu? > als der pH-Wert des Puffers. Der IEP der Proteine, die zur Kathode wandern, ist ……… < als der pH-Wert des Puffers. Der IEP der Proteine, die zur Anode wandern, ist ……… schneller Proteine mit niedrigem Mw wandern in einem elektrischen Feld …………. als Proteine mit hohem Mw. schneller Bei gleichem Mw wandern Proteine mit hoher Ladungsdichte …………….. als Proteine mit niedriger Oberflächenladung. Proteine Charakteristika der eingesetzten Proteine Glutamat-Dehydrogenase - Enzym des Stickstoffmetabolismus: Katalysiert die Redox-Reaktion von α-Ketoglutarat mit Ammoniak zu Glutamat Albumin - Teil des Blutplasmas Bindet Wasser und verhindert so Austritt ins Gewebe Transportiert wasserunlösliche Substanzen Puffert den pH des Blutes Cytochrom c - Teil der mitochondrialen Atmungskette Elektronencarrier von Komplex III auf Komplex IV Patatin Glykoprotein der Kartoffel , Speicherprotein in der Vakuole (Anteil 40 % am Gesamtprotein) Abwehrreaktion bei Pathogenattacke, Esteraseaktivität, Lipidacylhydrolase Proteine Proteinfällung pH – Fällung (reversible Fällung) Die Löslichkeit eines Proteins hängt von seiner Oberflächenladung ab Diese ist am isoelektrischen Punkt am geringsten Aussalzen (reversible Fällung) Salze entziehen dem Protein Hydratationswasser und vergrößern so hydrophobe Effekte: Proteinaggregation über hydrophobe Wechselwirkungen Häufige Verwendung von Ammoniumsulfat Säurefällung (denaturierende Fällung) Die Säure reagiert mit dem Protein und es entstehen unlösliche Salze Häufige Verwendung von Trichloressigsäure oder Perchlorsäure Proteine Auswertung und Fragen zur Proteinfällung Protokollieren Sie das Verhalten der Proteine unter den verschiedenen Bedingungen und stellen Sie die Ergebnisse übersichtlich in einer Tabelle dar. Erläutern Sie die Hintergründe (d.h. Erklärung der Beobachtungen) Wie erklären Sie die unterschiedliche Größe der Proteinsedimente? Unterschiedliche Prinzipien der Fällung (Neutralsalz, IEP, Enteiweißung) Wodurch kommt die unterschiedliche Trübung der resuspendierten Proteinsedimente zustande? Reversible bzw. irreversibel gefällte Proteine Was können Sie über den mittleren IEP der Kartoffelproteine aussagen? Vergleich der Sedimente bei pH 3.5 und pH 7.5 Das größere Sediment findet sich bei dem pH-Wert, der dem IEP näher liegt Proteine Biuret - Reaktion Hintergrund: Kupfer(II)ionen bilden mit Carbamoylharnstoff (Biuret) einen rotvioletten Komplex entscheidend ist das CO-NH- Motiv: Peptidbindung Die Komplexierung von Kupfer(II)ionen durch Tartrat führt zur charakteristischen, blauen Färbung des Biuretreagenz und verhindert die Bildung von unlöslichem Kupferhydroxid im basischen. Proteine Protokollieren Sie Farbton und Intensität in den Proben Auswertung Biuret - Reaktion Protokollieren Sie Farbton und Intensität in den Proben Kontrolle Probe 4 (Mit HClO4 behandelte Probe) Proteine Fragen Biuret - Reaktion Wie kommt es zur veränderten Färbung der proteinhaltigen Lösung? Kupfer(II)ionen bilden mit Carbamoylharnstoff (Biuret) einen rotvioletten Komplex Komplexierung erfolgt über CO-NH- Motiv (Peptidbindung) Wodurch konnten Sie die mit Perchlorsäure irreversibel gefällten Proteine in denaturierter Form wieder lösen bzw. warum ist das Biuret-Reagenz stark alkalisch? Bei der Denaturierung von Proteinen mit starken Säuren (z.B. Perchlorsäure) bilden sich säureunlösliche Salze mit den Proteinen. Die Ausfällungen sind irreversibel. In stärker alkalischen Lösungen können die denaturierten Proteine wieder gelöst werden, ohne dass ihre native Faltung wiederhergestellt wird. Wozu dient das Tartrat im Biuret-Reagenz? Die Komplexierung von Kupfer(II)ionen durch Tartrat verhindert die Bildung von unlöslichem Kupferhydroxid. Proteine Protokolle Allgemein Protokolle Allgemein Formulieren Sie selbst und schreiben Sie nicht aus dem Internet ab. Sehen Sie sich die angegebenen Quellen an. Beachten Sie im Skript die Lernziele & Fragen. Seminarvortrag Modul Bio-280 Physiologie und Biochemie der Pflanzen Versuch VI – PhotosynthesePigmente Pigmentextraktion Aceton Photosynthesepigmente Programmablauf Je 1 Gruppenmitglied bereitet DC-Kammer und Chromatographiestreifen vor. Die anderen beiden extrahieren die Pigmente aus dem Spinat. Extraktion erfolgt unter dem Abzug. Filtrat des Extraktes muss klar sein. Die Pigmente sind lichtempfindlich. Daher Proben im Unterschrank aufbewahren. Proben beschriften und nach dem Versuch im Lösungsmittelabfall entsorgen. Programmablauf Pigmentextrakt auf die DC-Platten auftragen. DC starten. Chlorophyllabbau untersuchen Absorptionsspektrum des Extraktes messen während die DC läuft. Wenn die DC fertig ist: Fluoreszenz ansehen. Schutzbrille !!! Absorptionsspektren verschiedener Pigmente 1 = Bacteriochlorophyll a 2 = Chlorophyll a 3 = Chlorophyll b 4 = Phycoerythrin 5 = β-Carotin Photosynthesepigmente Und welche Pigmente sind in Spinat? 430 nm 662 nm Aylin Aras, Jörn Panteleit Photosynthesepigmente Und welche Pigmente sind in Spinat? 430 nm Chlorophyll a 662 nm Photosynthesepigmente Und welche Pigmente sind in Spinat? 430 nm Chlorophyll a 454 nm Chlorophyll b 662 nm 643 nm Und welche Pigmente sind in Spinat? 430 nm Chlorophyll a 454 nm Chlorophyll b 662 nm 643 nm Grünlücke Was lässt sich noch aus diesem Spektrum ableiten? 430 nm Chlorophyll a 454 nm Chlorophyll b 662 nm 643 nm Grünlücke Was lässt sich noch aus diesem Spektrum ableiten? 430 nm Viel mehr Chlorophyll … als Chlorophyll … Chlorophyll a 454 nm Chlorophyll b 662 nm 643 nm Grünlücke Was lässt sich noch aus diesem Spektrum ableiten? 430 nm Viel mehr Chlorophyll a als Chlorophyll b Chlorophyll a 454 nm Chlorophyll b 662 nm 643 nm Grünlücke Chlorophylle Photosynthesepigmente Chemische Reaktionen des Chlorophylls Behandlung mit Säure Austausch des Mg-Zentralatoms gegen 2 H+ führt zu Phaeophytin Farbänderung nach Gelbbraun/Braun Substitution durch andere Me2+ möglich Behandlung mit Lauge Die Abspaltung des Phytolschwanzes (Esterhydrolyse) verändert das Lösungsverhalten, weil das entstandene Chlorophyllid hydrophil ist. keine Farbänderung Photosynthesepigmente Chlorophyllabbau 1 2 NaOH HCl grün braungelb 3 4 HCl H2O CuSO4 blaugrün grün Chlorophyllabbau 1 2 3 4 Saubere Reagenzgläser nehmen NaOH grün HCl braungelb HCl H2O CuSO4 blaugrün grün Ergebnisse: Tabelle Probe Experiment Farbe 1 NaOH tiefgrün 2 HCl braun-gelb 3 HCl, CuSO4 blau-grün 4 H2O (Kontrolle) tiefgrün Ergebnisse: Tabelle Probe Experiment Farbe 1 NaOH tiefgrün 2 HCl braun-gelb 3 HCl, CuSO4 blau-grün 4 H2O (Kontrolle) tiefgrün In Tabellen und im Text immer auch dazu schreiben, was in den Proben ist. Lassen Sie die Leser nicht irgendwelche Probennummern auswendig lernen! Diskussion Probe Experiment Farbe 1 NaOH tiefgrün NaOH verändert die Farbe nicht => kein Einfluss auf den Porphyrinring Chlorophylle Photosynthesepigmente Diskussion Probe Experiment Farbe 2 HCl braun-gelb Diskussion Probe Experiment Farbe 2 HCl braun-gelb HCl löst Mg2+ aus dem Ring => Phaeophytin Diskussion Probe Experiment Farbe 3 HCl, CuSO4 blau-grün Diskussion Probe Experiment Farbe 3 HCl, CuSO4 blau-grün Cu2+ wird im Porphyrinring koordiniert => neue Farbe Ausschütteln mit Benzin: Was passiert? Petroleumbenzin 0,65 g/cm3 Trennung der Pigmente Aceton 0,79 g/cm3 Ausschütteln mit Benzin: Was passiert? Benzin ist leichter als Aceton und bildet die obere Phase aus. Benzin löst die hydrophoben (unpolaren) Stoffe. Aceton löst die hydrophilen (polaren) Stoffe. Ergebnisse: Tabelle Probe Experiment Acetonphase Benzinphase 1 NaOH tiefgrün gelb 2 HCl blassgrün-gelb braun-gelblich 3 HCl, CuSO4 gelb blau-grün 4 H2O (Kontrolle) gelb grün Diskussion: Was ist passiert? Probe Experiment Acetonphase Benzinphase 1 NaOH tiefgrün gelb 2 HCl blassgrün-gelb braun-gelblich 3 HCl, CuSO4 gelb blau-grün 4 H2O (Kontrolle) gelb grün Probe Experiment Acetonphase Benzinphase 1 NaOH tiefgrün gelb Abspaltung des Phytolrestes (Esterhydrolyse) ändert das Lösungsverhalten des Chlorophylls das entstandene Chlorophyllid ist stärker polar. Grünfärbung der polaren Acetonphase durch Chlorophyllid. Gelbfärbung der hydrophoben Benzinphase durch β-Carotin Carotenoid: β-Carotin und Xanthophylle Photosynthesepigmente Diskussion: Was ist passiert? Probe Experiment Acetonphase Benzinphase 1 NaOH tiefgrün gelb 2 HCl blassgrün-gelb braun-gelblich 3 HCl, CuSO4 gelb blau-grün 4 H2O (Kontrolle) gelb grün • Chlorophyll (4) bzw. -derivate (2 und 3) haben hydrophoben Phytolrest gebunden und lösen sich in der Benzinphase. • Gelbfärbung der Acetonphase in 2, 3 und 4 durch Xanthophylle (stärker polar als Carotine). • In Probe 2 und 3 durch saure Esterhydrolyse Grünfärbung der Acetonphase möglich. Dünnschichtchromatographie Laufmittelfront Das Trennprinzip beruht auf der unterschiedlicher Affinität der Pigmente zur β-Carotin polaren, stationären Phase (Kieselgel) und zur unpolaren, mobilen Phase (Laufmittel). Phaeophytin a Chlorophyll a Chlorophyll b Lutein Violaxanthin Neoxanthin Photosynthesepigmente DC-Kammer Die Kammer muss mit LM äquilibriert sein. Die DC-Platten dürfen sich nicht berühren. Dünnschichtchromatographie Einzeichnen: dünne Startlinie Proben auftupfen. Nicht das DC-Material beschädigen. Nach jeder Spur kurz trocken. Spuren möglichst dünn halten. Photosynthesepigmente Dünnschichtchromatographie Nach dem Lauf: Sofort (!) Laufmittelfront einzeichnen. Banden mit Bleistift umfahren. Die LF trocknet schnell. Auswertung: Rf = Wanderungsstrecke der Bande/Wanderungstrecke der Laufmittelfront Bande Laufmittel Photosynthesepigmente Nutzung der Anregungsenergie Photosynthesepigmente Dünnschichtchromatographie Fluoreszierende Banden mit Bleistift markieren Welche Pigmente zeigen Fluoreszenz? Bande Laufmittel Photosynthesepigmente Quellen Weiler, Nover Allgemeine und molekulare Botanik, Thieme Verlag 2008 Taiz, Zeiger Plant Physiology, Sinauer Verlag 2006
