Die Rolle der CD44v10-Isoform in kutanen Entzündungsreaktionen
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Institut für Molekularbiologie (Tumorforschung) Die Rolle der CD44v10-Isoform in kutanen Entzündungsreaktionen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. des Fachbereichs Bio- und Geowissenschaften, Landschaftsarchitektur an der Universität Duisburg-Essen vorgelegt von Bettina Gunawardena aus Berlin Dezember 2003 Die der vorliegenden Arbeit zugrundeliegenden Experimente wurden am Institut für Molekularbiologie (Tumorforschung) der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. 1. Gutachter: Prof. Dr. H. Esche 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Opalka Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. H. Schumacher Tag der mündlichen Prüfung: 31. März 2004 Die Wissenschaft richtig verstanden, heilt den Menschen von seinem Stolz; denn sie zeigt ihm seine Grenzen. (Albert Schweitzer, 1875-1965) Für Marianne Lewerich († 03.05.2000), die durch ihre Begeisterung das Interesse an der Biologie in mir weckte und für meinen Sohn Niklas INHALTSVERZEICHNIS I I INHALTSVERZEICHNIS II ABKÜRZUNGEN 1 EINLEITUNG 1 1.1 Das Immunsystem- Ein Überblick 1 1.2 Zelladhäsion und Adhäsionsmoleküle 2 1.2.1 Die Leukozytenmigration 3 1.3 Das Adhäsionsmolekül CD44 4 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 Struktur des CD44-Gens Struktur des CD44-Moleküls CD44-Liganden Signaltransduktionen durch die CD44 zytoplasmatische Domäne Die Funktion von CD44 in der Hämatopoese Die Funktion von CD44 in der Tumorprogression und in der Metastasierung Die Rolle von CD44 in inflammatorischen Prozessen und chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankungen Die CD44v10-Isoform Die Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ oder die Delayed type hypersensitivity (DTH) 4 6 8 9 11 12 1.4 Zielsetzung 18 2 MATERIAL 2.1 Chemikalien 20 2.2 Enzyme 21 2.3 Antikörper 21 2.3.1 Isotypenkontrollen und sekundäre Antikörper 23 2.4 Medien, Reagenzien und Materialien für die Zellkultur 23 2.5 Kits und spezielle Reagenzien 24 2.6 Reagenzien für die Histologie 24 2.7 Besondere Verbrauchsmaterialien 25 2.8 Spezielle Laborgeräte 25 2.9 Puffer und Lösungen 26 1.3.8 1.3.9 I IV 13 15 17 20 INHALTSVERZEICHNIS II 3 METHODEN 29 3.1 Tierversuche 29 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 Tiere Haltungsbedingungen Delayed type hypersensitivity (DTH) Röntgenbestrahlung und Knochenmarktransfer 29 29 29 30 3.2 Histologische Techniken 30 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 Herstellung von Blutausstrichen Herstellung von Gefriergewebeschnitten Herstellung von Paraffingewebeschnitten Grünwald/Pappenheim-Färbung Hämatoxylin/Eosin (HE)-Färbung Naphtol-AS-D-Chloracetat-Esterase-Färbung (ASDCL) In situ Immunfluoreszenz (TUNEL) 30 31 31 31 32 32 32 3.3 Zellkultur-Techniken 33 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 Präparation primärer Einzelzellsuspensionen In vitro Zellstimulation mittels anti-CD3e Antikörper MTT-Proliferationstest In vitro Apoptoseinduktion 33 34 34 35 3.4 Durchflusszytometrie (FACS) 35 3.4.1 3.4.2 Darstellung von Oberflächenmolekülen Detektion apoptotischer Zellen über AnnexinV/PI 36 36 3.5 Analyse von Proteinen 37 3.5.1 3.5.2 Herstellung von Zellproteinextrakten/Zellsuspensionen aus dem Ohrgewebe Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) 37 37 3.6 Molekularbiologische Techniken 38 3.6.1 3.6.2 Präparation genomischer DNA aus dem Knochenmark Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38 38 4 ERGEBNISSE 4.1 Phänotypische Charakterisierung der CD44v10-defizienten Tiere 39 4.1.1 4.1.2 4.1.3 Das Knochenmark Die Milz Thymus und Lymphknoten 40 42 44 39 INHALTSVERZEICHNIS III 4.2 Funktionsanalyse der CD44v10-Isoform im Mausmodell der DTH 4.2.1 4.2.5 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche führt in vivo zu einer signifikant supprimierten DTH-Reaktion Gewebeschnitte der Ohren von sensibilisierten CD44v10-defizienten Tieren weisen eine Reduktion des inflammatorischen Zellinfiltrats auf Bei CD44v10-defizienten Tieren ist die Infiltration der Granulozyten in das inflammatorische Ohrgewebe in den ersten 24 Stunden verzögert Charakterisierung spezifischer Aktivierungs- und Adhäsionsmarker auf Zellen des inflammatorischen Ohrinfiltrats CD44v10-defiziente Zellen sezernieren signifikant mehr IL-1b 4.3 Proliferatives und apoptotisches Verhalten CD44v10-defizienter Zellen 4.3.1 CD44v10-defiziente Lymphozyten zeigen im Gegensatz zu Wildtyp-Zellen in vitro eine gesteigerte Proliferationsrate CD44v10-defiziente Tiere weisen in situ eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen innerhalb des inflammatorischen Bereiches des Ohres auf CD44v10-defiziente Lymphozyten zeigen auch in vitro eine erhöhte Apoptoserate nach TCR-spezifischer Stimulation 64 4.4 DTH-Reaktion in Knochenmark-Chimären 65 5 DISKUSSION 5.1 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche führt zu einer erhöhten Granulopoese im Knochenmark 70 Die Expression der CD44v10-Isoform ist essentiell für die Migration immunkompetenter Zellen in der initialen Phase der DTH-Reaktion 72 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche verändert das apoptotische und proliferative Verhalten von Effektorzellen 75 5.4 CD44v10, ein neuer Zytokinrezeptor? 77 6 ZUSAMMENFASSUNG 82 7 LITERATURVERZEICHNIS 84 8 DANKSAGUNG 96 9 PUBLIKATIONEN 97 10 LEBENSLAUF 98 11 ERKLÄRUNGEN 99 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3.2 4.3.3 5.2 5.3 47 48 51 53 54 58 60 60 62 69 ABKÜRZUNGEN IV ABKÜRZUNGEN Abb. Abs. Ak AP-1 APC APZ AS Bcl-2 Bcl- xL bzw. °C CD CD44s CD44v d Da d. h. DNA dNTP DNFB DNBS DTH ELISA etc. EZM FACS FITC g GAG GM-CSF Gy h HA HE Ig IL IFN-d Kap. l M m MCP-1 MHC min Abbildung Abschnitt Antikörper Activator protein 1 Allophycocyanin antigenpräsentierende Zellen Aminosäuren B-cell CLL/lymphoma 2 B-cell CLL/lymphoma xL beziehungsweise Grad Celcius cluster of differentation (internationale Nomenklatur für Zelloberflächenmarker) CD44-Standardisoform CD44-variante-Isoformen day Dalton (atomare Masseneinheit; 1 Dalton 0 1,66 x 10-24 g) das heißt Desoxyribonukleinsäure 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat 2,4-Dinitrofluorbenzen 2,4-Dinitrobenzolsulfonsäure Delayed type hypersensitivity (Kontaktallergie) Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay et cetera extrazelluläre Matrix Fluorescence Activated Cell Sorting (Durchflusszytometrie) Flouresceinisothiocyanat Gramm Glukosaminoglykan granulocyte-macrophage colony-stimulating factors Gray hour Hyaluronanacid (Hyaluronsäure) Hämatoxylin/Eosin Immunglobulin Interleukin Interferon-d Kapitel Liter Molarität (mol/l) Meter Monocyte chemotatic protein-1 Major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Minute ABKÜRZUNGEN V Macrophage inflammatory protein-1b Matrix-Metalloprotease MOL (Stoffmenge) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium Natürliche Killerzellen Optische Dichte Polymerase Chain Reaction pH-Wert (pH = -log-10 [Protonenkonzentration (mol/l)]) Phythämagglutinine Phycoerythrin Propidiumiodid rheumatoide Arthritis Raumtemperatur Sekunde siehe Tabelle T cell receptor Tumornekrose Faktor-a Tierschutzgesetz Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labelling Unit (Enzym-Aktivitätseinheit; 1U = 1 mol/min) unter anderem Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Volume per volume Wildtyp weight per volume zum Beispiel MIP-1b MMP mol MTS NK-Zellen OD PCR pH PHA PE PI RA RT s s. Tab. TCR TNF-a TShG TUNEL U u. a. VCAM-1 v/v wt w/v z. B. In dieser Arbeit benutzte Vorsätze zur Angaben der Zehnerpotenz, mit der Maßeinheit zu multiplizieren ist: M Mega = 106 K Kilo = 103 c Zenti = 10-2 m Milli = 10-3 µ Mikro = 10-6 n Nano = 10-9 p Piko = 10-12 Etwa bestehende Warenzeichen oder sonst gesetzlich geschützte Bezeichnungen sind nicht gesondert gekennzeichnet. EINLEITUNG 1 1 EINLEITUNG 1.1 Das Immunsystem- Ein Überblick Die Hauptfunktion des Immunsystems ist es, den eigenen Organismus vor Fremdsubstanzen und Krankheitserregern aus der Umwelt zu schützen. Ständig bedrohen verschiedene toxische Substanzen, Bakterien, Viren und Parasiten, deren ungebremste Vermehrung pathologische Folgen haben können, unseren Organismus. Aber auch körpereigene, entartete Zellen stellen eine Gefahr für den Gesamtorganismus dar. Aufgrund dessen hat sich im Laufe der Evolution ein effektives Abwehrsystem entwickelt, das die Fähigkeit besitzt zwischen körpereigenen und körperfremden Bestandteilen zu differenzieren. Das Immunsystem besteht aus zwei funktionellen, synergistisch operierenden Untereinheiten: der angeborenen Immunabwehr und der erworbenen Immunabwehr. Die angeborene Immunabwehr erfordert das direkte Auslösen eines Effektormechanismus (z. B. Komplementsystem) durch den Erreger. Sie greift unmittelbar beim ersten Kontakt mit dem Eindringling ein und ihre Wirksamkeit ist auch bei einer zweiten oder dritten Infektion durch denselben Erreger immer gleich. Sie wird vor allem von Zellen der myeloischen Reihe also Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und natürlichen Killerzellen ausgeführt. Die erworbene Immunabwehr wird insbesondere dann aktiviert, wenn in den Körper eingedrungene Erreger der Zerstörung durch das angeborene Immunsystem entkommen sind. Sie wird überwiegend durch B- und T-Lymphozyten vermittelt und zeichnet sich durch eine hohe Spezifität und die Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses aus, welches dem Organismus eine lebenslange Immunität gegen eine erneute Infektion mit demselben Pathogen verleiht. Bei der zellulären Immunabwehr spielen T-Zellen eine wichtige Rolle; sie sind durch spezifische T-Zellrezeptoren auf die Erkennung von Fremdsubstanzen (Antigene) spezialisiert, die durch antigenpräsentierende Zellen (APZ) präsentiert werden. APZ präsentieren mit Hilfe des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) überwiegend Peptidfragmente von Antigenen, wie Viren oder Tumorproteine. Im Gegensatz dazu basiert die humorale Immunabwehr vor allem auf den von B-Lymphozyten produzierten Antikörpern, die frei zirkulierende fremde Substanzen wie z. B. bakterielle Toxine, für phagozytierende Zellen opsonisieren oder durch Bildung von Aggregaten neutralisieren. Um für den Organismus gefährliche Antigene rechtzeitig zu erkennen, wandern die Lymphozyten fortwährend vom Blut zu den peripheren lymphatischen Organen, wo ihnen mögliche EINLEITUNG 2 Antigene präsentiert werden, und kehren über die Lymphgefäße wieder in den Blutkreislauf zurück. Die drei Haupttypen des peripheren lymphatischen Gewebes sind die Milz, deren immunkompetente Zellen Antigene aus dem Blut aufnehmen, die Lymphknoten, deren APZ Antigene aus Infektionsherden im Gewebe immobilisieren, und die darmassoziierten lymphatischen Gewebe, deren Immunzellen Antigene aus dem Darm internalisieren. Auf diese Weise ist es dem Immunsystem im Zusammenspiel mit den bereits genannten Komponenten möglich eine effektive Abwehr pathogener Antigene im gesamten Organismus zu gewährleisten. 1.2 Zelladhäsion und Adhäsionsmoleküle Adhäsive Interaktionen von Zellen sind für die Proliferation, die Differenzierung und Funktion von Zellen von größter Wichtigkeit. Aber auch bei zellulären Kommunikationen, wie sie in zahlreichen physiologischen Prozessen eines vielzelligen Organismus vorkommen, spielen sie eine bedeutende Rolle (Ruoslathi & Obrink, 1996). Unter Adhäsion versteht man den spezifischen, Rezeptor-vermittelten Kontakt zwischen den Zellen oder zwischen Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM). Diese Interaktionen beinhalten einerseits mechanische Funktionen, die für Elastizität bzw. Zugfestigkeit von Geweben und die Zellwanderung verantwortlich sind, andererseits dienen sie als Signalübermittler (Abb. 1.1). Proliferation Gewebearchitektur Bewegung Zelladhäsion Apoptose Extravasation Differenzierung Abb. 1.1: Die Rolle der Zelladhäsion in vielzelligen Organismen (modifiziert nach Ruoslathi & Obrink, 1996). EINLEITUNG 3 Während Zelladhäsionsmoleküle ursprünglich als stark haftende Verbindungen angesehen wurden, die den Zusammenhalt der Zellen innerhalb eines Gewebes gewährleisten, weiß man heutzutage, dass ihre Hauptfunktion die auf „outside-in“ und „inside-out“ Signalisierung basierende Kommunikation zwischen den Zellen ist (Adams, 1997). Funktionell und strukturell unterscheidet man zwischen den Zelladhäsionsmolekülen und den Substratadhäsionsmolekülen. Substratadhäsionsmoleküle sind Proteine der extrazellulären Matrix und der Basalmembran. Dazu gehören Proteoglykane, Kollagene, Fibronektin und Laminin. Bei den Zelladhäsionsmolekülen handelt es sich um transmembrane Glykoproteine, die eine zentrale Rolle bei der Extravasation von Lymphozyten in das umliegende Gewebe spielen. Insgesamt beinhaltet die Gruppe der Zelladhäsionsmoleküle fünf unterschiedliche Familien: die Cadherine, die Integrine, die Immunoglobulin-Superfamilie, die Selektine und CD44 (Springer, 1994; Ohene-Abuakwa & Pignatelli, 2000). 1.2.1 Die Leukozytenmigration Die Wanderung von Leukozyten aus den Blutgefäßen in das umliegende Gewebe (Extravasation) wird in vier Phasen unterteilt (Abb. 1.2). Unter normalen physiologischen Bedingungen kommt es gelegentlich durch die innerhalb der Blutgefäße vorherrschenden Scheerkräfte zu einer lockeren Anheftung von Leukozyten an das Endothel der Gefäße. Im Falle einer Inflammation vermitteln Selektine den ersten Kontakt zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel. Diese kurzen reversiblen Interaktionen zwischen den P- bzw. E-Selektinen auf den Endothelzellen und den Sialyl-Lewisx–Liganden auf den Leukozyten bewirken das sogenannte „Rollen“ der Leukozyten entlang des Gefäßendothels und leiten die initiale Lokalisation der Zellen bei der Extravasation ein (Elangbam et al., 1997). Die kontinuierliche Aktivierung des Endothels und nun auch der Leukozyten durch lokal produzierte Zytokine (IL-4, TNF-a und IFN-d) und Chemokine (IL-8 und MCP-1) führt zu einer erhöhten Adhäsionskapazität zwischen den exprimierten Mitgliedern der Immunoglobulin-Superfamilie (IgSF) („Intercellular Cell Adhesion Molecule“ (ICAM) und „Vascular Cell Adhesion Molecule“ (VCAM)) auf den Endothelzellen und den Integrinen auf den Leukozyten (CD11/18) (Carlos & Harlan, 1994). Demzufolge heften sich die Leukozyten fest an das Endothel, und das Entlangrollen endet. EINLEITUNG 4 Blutfluss rollende Adhäsion feste Anheftung Selektine Diapedese Integrine und Ig-Superfamilie (IgSF) Leukozyt Endothel Chemokingradient Gewebe Wanderung Abb. 1.2: Schema einer Leukozytenmigration (modifiziert nach Springer, 1994). In der ersten Phase bewirken kurze reversible Interaktionen zwischen den Selektinen auf den Endothelzellen (rot) und den Selektinen auf dem Leukozyt (gelb) das Rollen entlang des Gefäßendothels. In der zweiten Phase führt die erhöhte Adhäsionskapazität zwischen IgSF auf dem Endothel und Integrinen auf dem Leukozyt zur festen Anheftung des Leukozyts an das Endothel. In der dritten Phase (Diapedese), passiert der Leukozyt das Endothel. Im letzten Schritt wandert der Leukozyt, durch Chemotaxis gesteuert, innerhalb des Gewebes zum Ort der Immunantwort. In der dritten Phase, der Diapedese, durchqueren die Leukozyten das Endothel und verlassen die Blutgefäße. Durch homotypische Interaktion mit dem IgSF-Molekül PECAM („Platelet Adhesion Molecule“) erfahren die Leukozyten morphologische Veränderungen, die es ihnen ermöglichen die erweiterten Interzellularspalten zwischen den Endothelzellen zu passieren. Im letzten Schritt der Extravasation wandern die Leukozyten, durch Chemotaxis gesteuert, innerhalb des Gewebes zum Ort der Immunantwort. 1.3 Das Adhäsionsmolekül CD44 1.3.1 Struktur des CD44-Gens CD44 wurde erstmals in seiner Funktion als Adhäsionsmolekül auf Lymphozyten als „Homing-Rezeptor“ beschrieben, der die Interaktionen zwischen Lymphozyten und den hohen endothelialen Venolen vermittelt (Jalkanen et al., 1986). Auf dem 3. internationalen EINLEITUNG 5 Workshop für Leukozyten wurden die unterschiedlichen vorhandenen Synonyme für das Molekül (GP90HERMES, extrazellulärer Matrixrezeptor III, H-CAM („Homing cell adhesion molecule“), phagozytisches Glykoprotein-1, Glykoprotein 85, Ly-24, Hyaluronsäurerezeptor und HUTCH-1) unter der einheitlichen Nomenklatur CD44 zusammengefasst. CD44 wird von einem einzelnen Gen kodiert, das beim Menschen auf dem kurzen Arm des Chromosoms 11 (Goodfellow et al., 1982) und bei der Maus auf Chromosom 2 (Colombatti et al., 1982) lokalisiert ist. Das CD44-Gen (Abb. 1.3) besteht in seiner genomischen Organisation sowohl beim Menschen als auch bei der Maus aus 20 Exons (Screaton et al., 1992; 1993). Exon 1-5 (s1-s5) und Exon 16-20 (s6-s10) bilden das sogenannte Standardgerüst des CD44-Moleküls. Exon 6-15, die varianten Isoformen (v1v10), können durch alternatives Spleißen der nukleären Vorläufer-RNA in unterschiedlichen Kombinationen in die spätere mRNA der Standardisoform zwischen Exon 5 (s5) und 16 (s6) inseriert werden (Dougherty et al., 1991; He et al., 1992; Jackson et al., 1992; Screaton et al., 1992). Beim Menschen wird Exon 6 (v1) nicht exprimiert, da es innerhalb des Leserahmens transmembrane Domäne ein Stopcodon trägt (Screaton et al., 1993). extrazelluläre Region zytoplasmatische Region Exons der Standardisoform (CD44s) 1 2 3 4 5 s1 s2 s3 s4 s5 16 17 18 20 s6 s7 s8 s10 variante Exons 6 7 8 9 10 11 19 12 13 14 15 s9 v1 v2 v3 v4 v5 v6 v7 v8 v9 v10 Beispiele möglicher Isoformenkombinationen CD44v4-5-6 CD44v5-9-10 CD44v8-9-10/CD44E CD44s Abb. 1.3: Schematische Darstellung der CD44-Exonstrukturen (modifiziert nach Günthert, 1996). Das CD44-Gen besteht in seiner genomischen Organisation aus 20 Exons. Exon 1-5 (s1-s5, hellgrün) und Exon 16-20 (s6-s10, hellgrün) bilden das sogenannte Standardgerüst des CD44-Moleküls (CD44s). Exon 6-15, die varianten Isoformen (v1-v10), können durch alternatives Spleißen in unterschiedlichen Kombinationen in die Standardisoform zwischen Exon 5 (s5) und 16 (s6) inseriert werden. EINLEITUNG 6 Durch die Insertion der varianten Exons ist eine enorme Vielfalt von unterschiedlichen Kombinationen (bis zu 1000) an CD44-Isoformen möglich. Derzeit sind jedoch nicht mehr als 100 verschiedene Isoformen bekannt (Günthert, 1996). 1.3.2 Struktur des CD44-Moleküls Die am häufigsten vertretene Isoform, die Standard- oder Hämatopoetische-Isoform (CD44s oder CD44H), bestehend aus 361 (Mensch) bzw. 363 (Maus) Aminosäuren (AS), mit einem Molekulargewicht von 37 kDa (Nottenburg et al., 1989; Screaton et al., 1992; Stamenkovic et al., 1989) enthält keine durch die variablen Exons kodierte Sequenz. v1 v2 v3 v4 v5 v6 v7 v8 v9 v10 GAG GAG C C extrazelluläre Domäne C variante Exons GAG GAG transmembrane Domäne Phospholipidmembran P zytoplasmatische Domäne P P C-Terminus Abb. 1.4: Schematische Darstellung des post-translational modifizierten CD44-Moleküls (modifiziert nach Puré & Cuff, 2001). Das Protein besteht aus drei unterschiedlichen Domänen, einer zytoplasmatischen, einer transmembranen und einer extrazellulären. Die zytoplasmatische Domäne enthält drei Serin-Phosphorylierungsstellen ( ). Innerhalb der N-terminalen Ekto-Domäne befinden sich fünf konservierte N-Glykosylierungstellen ( ) und vier Sulfonierungsstellen ( ). Im Bereich der extrazellulären Region sind mehrere potentielle O-Glykosylierungsstellen ( ) lokalisiert, sowie zwei Serin-Glycin Bereiche, die durch Anhängen von Glukosaminoglykan (GAG) modifiziert werden können. Sechs vorhandene Cysteine (C) in diesem Bereich sind für die Entstehung einer globulären tertiären Proteinstruktur verantwortlich. Weitere GAG-Bindungsstellen weisen die varianten Exonprodukte v3 und v10 auf. Das Protein besteht aus drei unterschiedlichen Domänen, einer 72 AS langen Cterminalen zytoplasmatischen Domäne, einer 21 AS umfassenden transmembranen Domäne und einer 270 AS langen extrazellulären Domäne (Abb. 1.4). Die hoch konservierte zytoplasmatische Region wird durch einen Teil des Exons 18 und durch die Exons 19 und 20 kodiert. Die hydrophobe transmembrane Domäne, kodiert durch Exon 18, ist innerhalb der EINLEITUNG 7 Gruppe der Säugetiere (Mammalia) zu 100% konserviert. Der extrazelluläre Bereich des Proteins kann hingegen in eine konservierte und nicht konservierte Region unterteilt werden. Die N-terminale extrazelluläre Domäne, kodiert durch Exon 1-5, ist ebenfalls hoch konserviert (85%). Sechs vorhandene Cysteine in diesem Bereich sind für die Entstehung einer globulären tertiären Proteinstruktur, durch die Ausbildung von drei intramolekularen Disulfidbrücken, verantwortlich (Goldstein et al., 1989; Nottenburg et al., 1989; Screaton et al., 1992; Stamenkovic et al., 1989). Weiterhin befindet sich in dieser Region eine 100 AS lange Sequenz, die homolog zu anderen Hyaluronsäure-bindenden Molekülen ist. Aufgrund der starken Sequenzähnlichkeit in diesem Bereich wurden diese Proteine unter dem Namen „Link module“ Superfamilie zusammengefasst (Kohda et al., 1996; als Übersicht s. Day & Prestwich, 2002). Die variable Region innerhalb der extrazellulären Domäne beinhaltet die Insertionsstelle (Position AS 223) für die varianten Exons. Der restliche Anteil der extrazellulären Domäne, die membranproximale Region, ist lediglich zu 35% konserviert. Das alternative Einspleißen der varianten Isoformen in das Standardmolekül CD44 ist eine Möglichkeit das CD44-Genprodukt zu verändern. Post-translationale Modifikationen, die die Charakteristik des Proteins stark verändern und somit Einfluss auf dessen Bioaktivität nehmen, stellen eine weitere Möglichkeit dar das CD44-Genprodukt zu modifizieren. Die zytoplasmatische Domäne enthält drei Serin-Phosphorylierungsstellen und Palmitinolierungsstellen (Abb. 1.4). Innerhalb der N-terminalen extrazellulären Domäne befinden sich fünf konservierte N-Glykosylierungstellen, vier Sulfonierungsstellen und zwei Bindungsstellen für Chondroitinsulfat. Im Bereich der membranproximalen Region sind mehrere potentielle O-Glykosylierungsstellen lokalisiert, sowie zwei Serin-Glycin Bereiche, die durch Anhängen von Glukosaminoglykan-Seitenketten (GAG; wie z. B. Heparan- oder Keratansulfat) modifiziert werden können. Diese post-translationalen Modifikationen führen beim CD44s-Molekül zu einem veränderten Molekulargewicht von 80-95 kDa (als Übersicht s. Lesley et al., 1997, Naor et al., 1997 und Goodison et al., 1999). Weitere GAGBindungsstellen weisen die varianten Exonprodukte v3 und v10 auf. So trägt v3 eine Heparansulfat- und v10 eine Chondroitinsulfat-Seitenkette. Die variante Isoform v6 ist mit einer H-Blutgruppenantigen-Seitenkette ausgestattet (Günthert, 1993; Labarriere et al., 1994; Jackson et al., 1995). Die anderen varianten Isoformen enthalten weitere Serin/Threoninreiche Regionen für zusätzliche O-Glykosylierungen und Tyrosin-Sulfonierungs-Bereiche (Goodison et al., 1999). Während CD44s auf nahezu allen Gewebe- und Zelltypen vertreten ist, beschränkt sich die Expression der varianten Isoformen im gesunden Organismus auf Epithelien (CD44E EINLEITUNG 8 = v8-v10), hämatopoetische Vorläuferzellen, Keratinozyten (CD44v3-v10) und lymphatische Gedächtniszellen. Interessanterweise verändert sich das CD44v-Expressionsmuster einer Zelle mit deren unterschiedlichen Reife- oder Aktivierungsstadien. Die Expression der CD44v wird daher insbesonders mit der Teilung und Proliferation von Zellen im Zusammenhang gebracht (Zöller et al., 1997). 1.3.3 CD44-Liganden Der Hauptligand des CD44s-Moleküls, die Hyaluronsäure (HA), ist ein wesentlicher Bestandteil der EZM vieler Gewebe (Aruffo et al., 1990). Bei der HA handelt es sich um ein lineares Glukosaminoglykan-Polymer, das in viele biologische Prozesse, wie z. B. der Gewebeorganisation, der Inflammation oder der Wundheilung involviert ist (als Übersicht s. Toole et al., 2002). CD44 besitzt drei potentielle HA-Bindungsstellen innerhalb der extrazellulären Domäne. Zum einen das bereits erwähnte „Link module“ und zum anderen zwei überlappende Bindungsregionen im Exonprodukt v5 (Liao et al., 1995). Die HA-Bindungseigenschaften von CD44s sind abhängig vom Zelltyp und des jeweiligen Aktivierungsstatus der CD44sexprimierenden Zelle. Infolge dessen kann CD44s als inaktives Molekül (unfähig HA zu binden), als induzierbares (fähig HA zu binden nach Induktion) und als konstitutiv aktives Molekül (fähig HA zu binden ohne vorangegangene Induktion) vorliegen (Lesley et al., 1995). Die unterschiedlichen Affinitätseigenschaften von CD44 gegenüber HA spielen eine wichtige Rolle in krankhaften Veränderungen, wie sie z. B. bei Autoimmunerkrankungen und bei der Metastasierung von Tumoren vorkommen. Aufgrund der vielfältigen Modifikationen kann das CD44-Molekül unterschiedliche Liganden binden. CD44-exprimierende periphere Blutlymphozyten sind nach Chondroitinsulfat-Modifikation des Exonproduktes v5/v15 in der Lage, Fibronektin oder Lamin zubinden (Jalkanan et al., 1992). Auch die CD44-vermittelte Erkennung von Kollagen I und IV ist auf eine Chondroitinsulfat-Modifikation zurückzuführen (Faassen et al., 1992; Knutson et al., 1996). Allerdings können auch Chondroitinsulfat-Modifikationen der Liganden, wie z. B. der MHC-Klasse-II assoziierten invarianten Kette (Naujokos et al., 1993) oder Serglycin (Toyama-Sorimachi et al., 1995), die Bindungseigenschaften beeinflussen und so unter anderem immunmodulatorische Funktionen von CD44 steuern. Beispiele hierfür sind Studien, in denen die Interaktion von CD44s und Serglycin zur Adhäsion, Aktivierung und zur Aggregation von lymphatischen Zellen führt. Darüber hinaus induziert Serglycin in antiCD44 und anti-CD3 Antikörper (AK) stimulierten zytotoxischen T-Zellen die Produktion und EINLEITUNG 9 Ausschüttung von Granenzym A (Toyama-Sorimachi et al., 1995). Granenzym A ist eine in den Granula von zytotoxischen T- und NK-Zellen gespeicherte Serinesterase, die die Apoptose in den zu eliminierenden Zielzellen induziert. Die MHC Klasse II assoziierte invariante Kette hingegen fungiert nach Chondroitinsulfat-Modifikation als zusätzliches kostimulierendes Molekül auf APZ, das an CD44 auf aktivierten T-Zellen bindet (Naujokos et al., 1993). Weiteren Studien zufolge bindet CD44 auch an das saure Phosphoprotein Osteopontin (Weber et al., 1996). Osteopontin ist ein Zytokin, das u. a. von aktivierten T-Zellen, Osteoklasten und Makrophagen sezerniert wird. Weber und Mitarbeiter (1996) wiesen eine spezifische, Dosis-abhängige Bindung von Osteopontin an CD44 bei CD44 transfizierten Fibroblasten nach. Des Weiteren konnten sie eine Sensitivität dieser Osteopontin-CD44Bindung gegenüber anti-CD44 Ak und HA belegen. Dies spricht einerseits für die Spezifität der Bindung und zeigt andererseits, dass Osteopontin und HA die selben Bindestellen nutzen (Weber et al., 1996). Welche funktionelle Bedeutung die Osteopontin-CD44-Interaktion besitzt, ist nicht genau bekannt. Da Osteopontin auch chemotaktische Aktivität besitzt, könnte eine funktionelle Bedeutung der Osteopontin-CD44-Interaktion in der Rekrutierung von Zellen während eines inflammatorischen Prozesses liegen (Puré & Cuff, 2001). Im allgemeinen weisen die varianten Isoformen eine schwächere Bindungsaffinität gegenüber HA auf, obwohl sie ebenfalls das CD44-Standardgerüst enthalten. Verschiedene Experimente zeigen, dass z. B. die mit Heparan modifizierte Isoform v3 mit hoher Affinität an andere Liganden binden kann, wie die Wachstumsfaktoren b-FGF (FibroblastenWachstumsfaktor; Bennett et al., 1995) und HB-EGF (Heparin-bindender-epidermalerWachstumsfaktor; Sherman et al., 1998). 1.3.4 Signaltransduktionen durch die CD44 zytoplasmatische Domäne Durch Interaktion der zytoplasmatischen Domäne mit zellulären Proteinen ist CD44 in eine Vielzahl von intrazellulären Signalkaskaden involviert. Ein wesentlicher Schritt bei der Aktivierung vieler Signaltransduktionskaskaden besteht in der Rekrutierung zytoplasmatischer Proteine an die Membran, wodurch die Ausbildung funktioneller Signaltransduktionskomplexe erleichtert wird. In Glykosphingolipid-reichen Plasma- membrandomänen menschlicher peripherer Blutlymphozyten, sogenannten „Rafts“, konnte eine Assoziation zwischen CD44 und den Mitgliedern der Src-Kinasen-Familie p56Lck und p59Fyn nachgewiesen werden (als Übersicht s. Ilangumaran et al., 1998). Zudem interagieren CD44 und Lck während der T-Zell Aktivierung miteinander (Taher et al., 1996). Welche EINLEITUNG 10 Rolle CD44 in der Aktivierung von T-Zellen spielt ist aber noch weitestgehend ungeklärt. Neueren Daten nach rekrutieren und aktivieren HA-CD44 Interaktionen die c-Src Kinase, was zu einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung des zytoskelettalen Proteins Cortactin führt. Dies wiederum schwächt die Bindung zwischen Coractin und den Actinfilamenten des Zytoskeletts, was eine Voraussetzung für die Migration von Zellen ist (Zhu et al., 1998; Bourguignon et al., 2001). CD44 interagiert nicht nur mit intrazellulären Tyrosinkinasen. Die zytoplasmatische Domäne des CD44-Moleküls enthält eine weitere Bindungsstelle für das membran-assoziierte zytoskelettale Adapterprotein Ankyrin (Lokeshwar, 1994). Die nicht kovalent an CD44v (CD44v3 und CD44v8-v10) gebundenen Rho-GTPasen RhoA und ROK phosphorylieren z. B. nach Komplexbildung mit HA-aktiviertem CD44v verschiedene zelluläre Proteine einschließlich der zytoplasmatischen CD44v-Domäne, was unter anderem in einer erhöhten Ankyrin-Bindung und einer damit verbundenen Migration von Tumorzellen resultiert (Bourguignon et al., 2000; Oliferenko et al., 2000). Die Bindung von HA an CD44 aktiviert auch die Rac1-Signalkaskade, ein Signalweg, der die Reorganisation des F-Aktin reguliert. Rac-1, ein weiteres Mitglied der Rho-GTPase Familie, ist zusammen mit Cdc42 für die Ausbildung von Lamellipoda und Mikrospikes während der gerichteten Migration von Zellen verantwortlich. Nach Daten von Okamoto und Mitarbeitern (1999) vermitteln die RhoGTPasen die Relokalisation von CD44 innerhalb der Lamellipoda im Verlauf einer Migration. Die zytoskelettalen Membran-Verbindungsproteine Ezrin/Radixin/Moesin (ERM) stellen eine weitere Familie von Proteinen dar, die ebenfalls an der Regulation der Zellmigration beteiligt sind. Der N-Terminus der ERM-Proteine bindet an die ersten 19 AS der zytoplasmatischen CD44-Domäne und der C-Terminus an das Aktinzytoskelett der Zelle (Turley et al., 2002). In diesem Zusammenhang konnten Legg und Mitarbeiter (2002) demonstrieren, dass in unstimulierten Zellen Ezrin N-terminal an den CD44 Serinrest 291 und C-terminal an F-Actin gebunden vorliegt und CD44 am Serinrest 325 phosphoryliert ist. Die Aktivierung der zellulären Protein Kinase C führt zur Dephosphorylierung von Ser325 und gleichzeitig zur Phoshporylierung von Ser291. Dies hat die Dissoziation des F-Actin gebundenen Ezrins zur Folge, was eine Reorganisation des Zytoskeletts ermöglicht und aktivierte Zellen in einem Phorbol-Ester-Gradient durch Chemotaxis gerichtet wandern lässt (Legg et al., 2002). Aus neusten Studien geht hervor, dass auch die Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) und CD44 während der Migration von Zellen miteinander interagieren und innerhalb der Lamellipoda ko-lokalisiert sind (Mori et al., 2002; Weber et al., 2002). Weitere MMPs, die EINLEITUNG 11 anderen Versuchen zufolge CD44s an der Zelloberfläche binden, sind MMP-7 und MMP-9. CD44 scheint nach HA-Bindung durch „Clustering“ eine Art Plattform an der Zelloberfläche auszubilden, insbesondere an der migrierenden Front (Lammellipoda), an welcher sich verschiedene MMPs versammeln (Yu et al., 2002). Diese Komplexität der unterschiedlichen CD44-Funktionen erschwert zunehmend die Aufklärung der den physiologischen Prozessen zugrundeliegenden Reaktionen. 1.3.5 Die Funktion von CD44 in der Hämatopoese Die Hämatopoese bzw. Differenzierung der Stamm- und Vorläuferzellen ist abhängig vom sogenannten hämatopoetischen Mikromilieu im Knochenmark bzw. im Thymus. Dieses Mikromilieu setzt sich aus verschiedenen Arten an Stromazellen, sezernierten und membrangebundenen Zytokinen und einer komplexen extrazellulären Matrix zusammen. Im Falle der Hämatopoese vermittelt CD44 die Adhäsion der lymphatischen oder myeloischen Stammzellen an die Stromazellen des Knochenmarks (als Übersicht s. Zöller, 2000; Rösel et al., 1999). Diese Interaktion ist notwendig für das Überleben und die Differenzierung der Stammzellen. Die frühesten myeloischen Stammzellen, aus denen Megakaryozyten (Monozyten und Makrophagen), Erythrozyten und polymorphkernige Lymphozyten (Granulozyten) hervorgehen, exprimieren große Mengen an CD44. Während sich die Expressionsrate an CD44 innerhalb der Monozyten- und Erythrozytenentwicklung nicht verändert, wird CD44 im Verlauf der Granulopoese vorübergehend schwächer exprimiert (Kansa et al., 1990; Sugimoto et al., 1994). Die CD44-Expression im Verlauf der B- und TZell Entwicklung variiert mit dem Reifestadium der Zellen. In den frühen Stadien sind alle Zellen, einschließlich der Prothymozyten, in der Leber CD44-positiv. Prä-B-Zellen sowie TZellen während der intrathymischen Reifung sind größtenteils CD44-negativ. Reife B- und TZellen hingegen, ebenso wie Monozyten und Mastzellen, exprimieren wiederum CD44 (als Übersicht s. Zöller, 2000). Es hat sich in von einander unabhängigen Versuchansätzen gezeigt, dass CD44 essentiell für die Myelopoese und Lymphopoese ist und sowohl von stromalen Knochenmarkzellen, wie auch stromalen Thymuszellen exprimiert wird. Im Thymus und Knochenmark scheint CD44 eine Rolle bei der initialen Interaktion zwischen Stromazellen und Vorläuferzellen zuspielen (Schwärzler et al., 2001; Zöller, 2000). Aufgrund der oben beschriebenen Funktionen von CD44 während der Hämatopoese ist es nicht verwunderlich, dass CD44 auch an der Entstehung hämatopoetischer Erkrankungen, wie der chronischen myeloischen Leukämie oder der akuten myeloischen Leukämie sowie der akuten lymphatischen Leukämie kausal beteiligt ist (als Übersicht s. Zöller, 2000). EINLEITUNG 12 1.3.6 Die Funktion von CD44 in der Tumorprogression und in der Metastasierung Günthert und Mitarbeitern gelang es 1991 erstmals zu zeigen, dass die Transfektion einer nicht metastasierenden pankreatischen Adenokarziom-Tumorzelllinie aus der Ratte mit CD44v4-7 (pMeta-1) und CD44v6-7 (pMeta-2) dieser metastasierende Eigenschaften verlieh. Heute ist bekannt, dass es sich weder bei pMeta-1 noch bei pMeta-2 um ein universales Metastasierungsgen handelt. Untersuchungen der Auswirkungen einer CD44v6-Expression auf Tumorzellen in Transfektionsstudien legen die Vermutung nahe, dass die Kreuzvernetzung von CD44v6 Molekülen auf der Zelloberfläche Wachstums- und Aktivierungssignale initiiert (als Übersicht s. Sneath & Mangham, 1998). Andererseits wird auch ein inhibierender Einfluss auf die Metastasierung von Tumoren durch CD44 von unterschiedlichen Autoren beschrieben: Guo und Mitarbeiter (1994) demonstrierten eine Inhibierung der metastasierenden Fähigkeit von SMMU2-Melanomzellen in vivo durch den Einsatz von anti-CD44s Antikörpern. Hofmann und Mitarbeiter (1993) beobachteten eine Korrelation zwischen der CD44-Expression und dem mestastasierenden Verhalten von klonierten embryonalen Ratten-Fibroblasten. Mittlerweile existiert eine Fülle von Daten hinsichtlich der Beteiligung von CD44/CD44v an der Tumorentstehung und Progression, die in mehreren Übersichtsartikeln zusammengefasst ist (Günthert, 1996; Zöller, 1996; Naor et al., 1997; Sneath & Mangham, 1998) Die Mestastasierung von Tumorzellen benötigt eine Reihe von Wechselwirkungen zwischen den Tumorzellen und der sie umgebenden EZM bzw. nicht tumorigenen Zellen. Um den Kontakt zu den Nachbarzellen abzubrechen, muss eine Tumorzelle ihre adhäsiven Eigenschaften ändern. Dies kann z. B. durch Veränderung des CD44-Expressionprofils erreicht werden. Zunächst ermöglicht die verminderte Expression oder das RezeptorShedding von CD44 der einzelnen Tumorzelle den Austritt aus dem Zellverband. Eine darauf folgende erneute CD44-Expression erleichtert den Zellen die Fortbewegung entlang HAreicher Oberflächen und eine effizientere Besiedlung neuer Umgebungen (als Übersicht s. Sneath & Mangham, 1998). Eine eindeutige Zuordnung der Funktion von CD44 während der Tumorprogression und der Metastasierung bedarf noch einer Reihe weiterer Untersuchungen. Verschiedene Analysen des CD44-Expressionmusters, im Zusammenhang mit der malignen Transformation von Zellen, belegen eine vermehrte bzw. verminderte Expression von CD44 und CD44-Isoformen auf den Zellen unterschiedlichster Tumore. Ein im Vergleich zum Ursprungsgewebe verändertes Expressionsprofil konnte für Karzinome der Bauchspeicheldrüse, der Blase, der Brust, der Gebärmutter, des Kolons, der Leber, der Lunge, EINLEITUNG 13 des Magens, der Mesothelien, des Kopf- und Nackenplattenepithels, der Prostata und der Schilddrüse nachgewiesen werden (als Übersicht s. Sneath & Mangham, 1998 und Naor et al., 1997). 1.3.7 Die Rolle von CD44 in inflammatorischen Prozessen und chronisch entzündlichen Autoimmunerkrankungen Die frühesten Ereignisse einer entzündlichen Reaktion, die Einwanderung und Rekrutierung von Leukozyten, wird durch die spezifische Bindung der Leukozyten an das Endothel- durch Zelladhäsionsmoleküle und die lokale Produktion von chemotaktischen Mediatoren- ausgelöst und kontrolliert. CD44 ist auf Leukozyten und Endothelzellen konstitutiv exprimiert. Während eines entzündlichen Prozesses wird die CD44-Expression auf aktivierten Zellen durch Zytokine/Chemokine und Interaktionen mit weiteren Zelladhäsionsmolekülen verstärkt induziert. Antigen-stimulierte T-Zellen weisen eine erhöhte Expressionsrate an CD44 auf (DeGrendele et al., 1997a). Dies führt zu einer gesteigerten HA-CD44-Interaktion und ermöglicht so die Rekrutierung aktivierter Zellen entlang eines weitreichenden HANetzwerkes zum Entzündungsort hin. Verschiedene Versuchsansätze zeigen, dass proinflammatorische Zytokine wie TNF-a oder IL-1b in Zellen des vaskulären Endothels eine vermehrte HA-Synthese induzieren (Mohamadzadeh et al., 1998), und dass das Rollen aktivierter T-Zellen und CD44-positiver Zelllinien auf HA-beschichteten Substraten oder endothelialen Zellmonolayern durch anti-CD44 Ak inhibiert werden kann (DeGrendele et al., 1996). Zahlreiche pathologische Prozesse können aber auch die Einwanderung von Leukozyten derart erhöhen, dass es zu Überreaktionen und zum unkontrollierten Angriff der Leukozyten auf ein gesundes Gewebe kommt, ein Vorgang, der sich in Allergien und chronischen Entzündungsprozessen (Autoimmunerkrankungen) manifestieren kann. Analysen der Zelloberflächenmoleküle inflammatorischer Th1-vermittelter Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der Insulin-abhängige Diabetes mellitus, die Multiple Sklerose (MS), die rheumatoide Arthritis (RA), entzündliche Darmerkrankungen und die Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Kontaktallergie) in Mensch und Maus weisen eine Korrelation zwischen dem Krankheitsverlauf und der Expression von CD44 auf. Die MS ist eine entzündlich demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Man geht von einer Attacke autoreaktiver T-Zellen gegen das ZNS aus, was zu einer chronischen Entzündungsreaktion und schließlich zu vorherrschender Destruktion der Myelinscheiden und Oligodendrozyten führt (Storch & Lassmann, 1997). Zu den geläufigsten EINLEITUNG 14 Tiermodellen der MS gehört die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE). Die EAE ist aufgrund der Ähnlichkeit der Läsionen besonders für die Untersuchung immunologischer Mechanismen geeignet. Die Behandlung der Mäuse in diesem Modell mit einem Ak-Gemisch aus CD44v6, v7 und v10 während der Induktionsphase kann die Schwere des Krankheitsverlaufes reduzieren (Laman et al., 1998). Ferner sind anti-panCD44 Ak in der Lage die Blut-Hirnschranke zu überwinden und der Transfer enzephalomyelitischer WildtypSpenderzellen resultiert in einer reduzierten EAE-Inzidenz in CD44v7-defizienten Tieren (Günthert & Johansson, 2000). Gleiche Beobachtungen wurden im Zusammenhang mit dem Mausmodell der RA gemacht. Die RA ist eine entzündliche Erkrankung der Gelenkinnenhaut (Synovia), die zur Erosion, Fehlstellung und Destruktion der Gelenke führt. Nahezu alle Zelltypen (polymorphkernige und im geringen Maße mononukleäre Leukozyten) des inflammatorischen Infiltrats weisen eine erhöhte Expression an CD44 auf (Liao et al., 1995). Der Einsatz von anti-panCD44 Ak im Mausmodell der Kollagen II-induzierten RA führt zu einem vollständigen Rückgang der klinischen Symptome (Gewebeödem, Gelenkschwellung, Gelenksteifheit) und reduziert den Zustrom weiterer inflammatorischer Leukozyten in die Gelenkregionen (Mikecz et al., 1995; Mikecz et al., 1999). Die Reduktion der klinischen Symptome ist auf das durch den Ak verursachte CD44-Rezeptor-Shedding zurückzuführen, da die Zellen durch den Verlust von CD44 auf der Zelloberfläche die Fähigkeit HA zu binden verlieren und infolgedessen nicht mehr in das Gewebe migrieren können (Mikecz et al., 1995; Mikecz et al., 1999). Ergänzende Daten aus murinen RA-Modellen mit CD44 oder CD44v6v7-defizienten Mäusen bestätigen diese Theorie (Stoop et al., 2001; Günthert & Johansson, 2000). Eine Schlüsselfunktion, die eine große Rolle in der Etablierung einer RA spielt, ist die Fähigkeit von Monozyten und Gewebemakrophagen HA via CD44 zu binden (Levesque & Haynes, 2001). Die von T-Zellen stammenden Zytokine IL-2 und IFN-g induzieren die Sekretion von TNF-a aus Monozyten, was mit einer erhöhten Bindung der Monozyten an HA einhergeht (Levesque et al., 2001). Verschiedene Zytokine (IL-1a, IL-1b, IL-3 und GM-CSF) sind in der Lage über einen bisher unbekannten TNF-a-abhängigen Mechanismus die Bindung von Monozyten an HA zu induzieren (Maiti et al., 1998). Im Gegensatz dazu inhibieren IL-4 und IL-13 die CD44-vermittelte Adhäsion an HA (Levesque & Haynes, 2001). IL-2, TNF-a und die Chemokine RANTES, MIP-1b und IL-8 wiederum induzieren die Bindung von T-Zellen an HA (DeGrendele et al., 1997b). Im Falle der T-Zellen fungiert CD44 zusätzlich als ko-stimulierendes Molekül, das die Proliferation initiiert, das Überleben aktivierter T-Zellen sichert und das die Produktion von EINLEITUNG 15 Superoxiden in Granulozyten, sowie die Zell-vermittelte Zytotoxizität durch NK-Zellen anregt (als Übersicht s. Puré & Cuff, 2001). Weitere Th1-vermittelte Autoimmunerkrankungen, in denen die CD44-Moleküle eine wichtige Rolle spielen, sind entzündliche Darmerkrankungen. Bei entzündlichen Darmerkrankungen wie der Kolitis ulcerosa oder dem Morbus-Crohn handelt es sich um eine fehlgesteuerte persistierende Immunantwort gegen Komponenten der normalen Darmflora. Die Gabe von anti-CD44v7 Ak unterbindet die experimentell mit 2,4,6-TrinitrobenzolSulfonsäure (TNBS) ausgelöste Kolitis in Mäusen. Gleiche Ergebnisse konnten mit der Verwendung von CD44v7-defizienten Mäusen in diesem Modell erzielt werden (Wittig et al., 2000). Möglicherweise wird eine ko-stimulierende Funktion der CD44v7-Isoform auf den Zellen durch den Ak oder das Ak-bedingte Shedding blockiert. Hinweise darauf geben Publikationen, in denen die Interaktion von CD40 und CD40-Ligand auf Antigen präsentierenden Zellen die Transkription von CD44-Proteinen induzieren, welche mit einem zurzeit noch nicht identifizierten Liganden interagieren (Guo et al., 1996). Diese Interaktionen haben aller Wahrscheinlichkeit nach die Sekretion von Th1-spezifischen proinflammatorischen Zytokinen zufolge, was die Basis für die Aufrechterhaltung einer chronischen Entzündung darstellt. Eine Beteiligung von CD44v7 an den CD40-CD40L initiierenden ko-stimulierenden Kaskaden könnte eine Erklärung für die Resistenz CD44v7defizienter Tiere sein (Wittig et al., 1998). Neuere Daten weisen eine spezifische Erhöhung der Dichte von CD44v7 auf murinen Lymphozyten durch CD40-CD40L Interaktionen nach (Wittig et al., 2000). Möglicherweise steht dies im Zusammenhang mit einer erhöhten Apoptoserate von Leukozyten innerhalb der entzündlichen Darmregionen CD44v7-defizienter Tiere. CD44v7 scheint aktivierte Leukozyten vor dem aktiv induzierten Zelltod zu schützen (Wittig et al., 2000). Dies verhindert eine schnelle Klärung des entzündlichen Infiltrates und kann ebenfalls eine persistente bzw. chronische Entzündung zur Folge haben. Zahlreiche Studien belegen eine Beteiligung von CD44 oder CD44v an der apoptotischen Signalgebung. Die Kreuzvernetzung von CD44-spezifischen Epitopen führt z. B. zur vermehrten Apoptose von neutrophilen Granulozyten in vitro (Takazoe et al., 2000) und die Ligation von CD44 auf menschlichen Makrophagen induziert die vermehrte Phagozytose apoptotischer neutrophiler Zellen (Hart et al., 1997). 1.3.8 Die CD44v10-Isoform Bei der CD44v10-Isoform handelt es sich um das in das CD44-Standardgerüst (Exon 1-5 und 16-20) integrierte variable Exon 10 (Exon 15). CD44v10 wird unter normalen EINLEITUNG 16 physiologischen Voraussetzungen auf Keratinozyten (CD44v3-v10), Epithelzellen (CD44v8v10) und hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert. Das wissenschaftliche Interesse an dieser CD44-Spleißvariante wurde durch Arbeiten geweckt, die zeigen, dass CD44v10 insbesondere auf Lymphozyten und Epithelien verschiedener Autoimmun- und inflammatorischer Hauterkrankungen stark exprimiert wird. Die Isoform CD44v10 scheint daher ein spezieller „Homing-Rezeptor“ für die Haut zu sein. Expressionsstudien an Haut-assoziierten Autoimmunerkrankungen weisen eine erhöhte Expression von CD44v10 auf peripheren Blutlymphozyten bei Erkrankungen wie den Lupus erythematodes und der Morphaea nach (Seiter et al., 1998). Isolierte Lymphozyten aus Sézary-Syndrom Patienten belegen eine ko-Expression von CD44v10 und einem weiteren Homing-Rezeptor für die Haut, dem kutanen Lymphozyten-Antigen (Wagner et al., 1998). Auch auf Haut-infiltrierenden Lymphozyten der atopischen Dermatitis, sowie des kutanen Lymphoms konnte eine erhöhte Expression von CD44v10 nachgewiesen werden (Seiter et al., 1998; Wagner et al., 1998). Überdies führt die Transfektion von CD44-negativen LeukämieZelllinien mit einer CD44v10-cDNA zu einer signifikant gesteigerten Adhäsion an Epithelzellen (Seiter et al., 1998). Darüber hinaus vermittelt CD44v10 sowohl heterotypische Interaktionen von Lymphozyten mit aktivierten dermalen mikrovaskulären Endothelzellen und Keratinozyten (Weimann et al., 2001), wie auch homotypische Adhäsionen von Lymphozyten an hämatopoetische Tumorzellen (Stamenkovic et al., 1991) bzw. B16F10 Melanomzellen (Shiras et al., 2002). Anderen Publikationen zufolge wird CD44v10 ebenfalls für die Adhäsion von Melanom- und Endothelzellen an HA benötigt (Lokeshwar et al., 1996; Yoshinari et al., 1999). Der Einsatz von anti-CD44 Ak in der frühen Phase des Mausmodells der Th1vermittelten Kontaktallergie vermindert die Bildung eines Granuloms bzw. die dadurch entstehende Ohrschwellung und die Infiltration von Leukozyten in das Ohrgewebe in den Tieren (Camp et al., 1993). Detaillierte Untersuchungen am gleichen Tiermodell mit antiCD44v10 Ak stützen diese Beobachtungen. Vielmehr konnte eine CD44v10-abhängige verzögerte Migration aktivierter Lymphozyten und eine Abwesenheit von Makrophagen im inflammatorischen Ohrinfiltrat nachgewiesen werden (Rösel et al., 1997). Allem Anschein nach fungiert CD44v10 aufgrund seiner zusätzlichen Chondroitinsulfat-Seitenketten insbesondere auf Makrophagen, als ein Rezeptor für Chemokine bzw. Zytokine der einerseits die Migration von aktivierten Lymphozyten und Makrophagen erleichtert und andererseits funktionell an der inflammatorischen Signalgebung beteiligt ist. Im Modell der Alopecia EINLEITUNG 17 Areta inhibiert die Gabe von anti-CD44v10 Ak die Migration von CD8 T-Zellen und führt zu einer Rückbildung des medizinischen Krankheitsbildes (Freyschmidt-Paul et al., 2000). Aufgrund dieser Daten scheint die Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung einer kutanen Entzündung und maligner lymphatischer Erkrankungen zu sein. 1.3.9 Die Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ oder die Delayed type hypersensitivity Bei der Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ, oder auch Delayed type hypersensitivity (DTH) genannt, handelt es sich um eine entzündliche durch Th1-Zellen vermittelte Hautreaktion. Aufgrund der Herkunft des Antigens und dem Weg, über den es in den Körper gelangt, unterscheidet man zwischen zwei Hauptsyndromen: der Hypersensibilität vom verzögerten Typ und der Kontaktsensibilität/Kontaktallergie. Sensibilisierung Kontaktallergie Allergen Allergen Subkutis Epidermis Dermis afferente Lymphgefäße drainierender Lymphknoten inflammatorische Mediatoren naive T-Zellen Antigen induzierte klonale Expansion Entlassung in die periphere Zirkulation Ödembildung sensibilisierte Memory / Effektor T-Zellen Abb. 1.5: Mechanismen der DTH (Ryan et al., 2001). Als Auslöser einer DTH dienen kleine sehr reaktive Antigene, sogenannte Haptene, die über die Subkutis in die Epidermis penetrieren. Die Epidermis enthält Langerhans-Zellen, die die antigenpräsentierenden Zellen der Haut darstellen. Die Bindung des Hapten-Protein-Komplexes an die Langerhans-Zellen induziert eine Kaskade inflammatorischer Zytokine. Anschließend verlassen die Langerhans-Zellen die Epidermis und wandern über die afferenten Lymphgefäße in die drainierenden Lymphknoten, wo sie hapten-spezifische T-Zellen aktivieren. Hat nun ein sensibilisiertes Individuum erneut Kontakt mit dem selben Hapten, kommt es aufgrund der bereits sensibilisierten T-Zellen zu einer unmittelbaren Entzündungsreaktion. EINLEITUNG 18 Wie bereits in Kapitel 1.3.8 beschrieben, scheint die Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche eine entscheidende Rolle bei der Etablierung einer entzündlichen Hauterkrankung, insbesondere bei der DTH, zu spielen. Da die Funktionsanalysen von CD44v10 im Tiermodell der DTH den wesentlichen Bestandteil dieser Arbeit darstellen, soll im Weiteren kurz der Reaktionsmechanismus erläutert werden: Als Auslöser einer DTH dienen kleine sehr reaktive Moleküle, sogenannte Haptene. Normalerweise können Haptene aufgrund ihrer geringen Größe keine Immunantwort auslösen. Sie besitzen daher bestimmte physikalische Eigenschaften, aufgrund derer sie durch kovalente Bindung an die nukleophilen Gruppen epidermaler Proteine ein reaktives Antigen bilden können. Der eigentliche Sensibilisierungsvorgang beginnt mit dem Eintritt des Haptens in die Epidermis (Abb. 1.5). Die Epidermis enthält Langerhans-Zellen, die konstitutiv MHCKlasse-II-Moleküle exprimieren und die die APZ der Haut darstellen. Die Erkennung bzw. Bindung des Hapten-Protein-Komplexes an die Langerhans-Zellen induziert eine Kaskade inflammatorischer Zytokine. Das Zytokin IL-1b scheint als initiales Zytokin von LangerhansZellen selbst gebildet zu werden. Die Reifung und endozytotische Funktion der Zellen wird durch dieses Zytokin sowie durch TNF-a aus den Keratinozyten induziert. Anschließend verlassen die Langerhans-Zellen die Epidermis und wandern über die afferenten Lymphgefäße in die drainierenden Lymphknoten, wo sie hapten-spezifische T-Zellen aktivieren. Hat nun ein sensibilisiertes Individuum erneut Kontakt mit dem selben Hapten, kommt es aufgrund der bereits sensibilisierten T-Zellen zu einer unmittelbaren Entzündungsreaktion und zur Bildung eines gemischtzelligen Entzündungsinfiltrats (Ryan et al., 2001). 1.4 Das Zielsetzung Verständnis der immunologischen Mechanismen, die einer Th1-mediierten inflammatorischen Autoimmunerkrankung oder Entzündungsreaktion zugrunde liegen, ist essentiell für die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien. Aufgrund seiner vielfältigen immunmodulatorischen Eigenschaften bietet das Zelladhäsionsmolekül CD44 einen guten Ansatzpunkt für neue Therapiemöglichkeiten. Die Frage nach der Aufgabe der einzelnen Isoformen und deren physiologischen Konsequenzen ist berechtigt, wenn man die funktionelle Heterogenität der CD44-Familie in den verschiedenen vorgestellten Modellsystemen von Autoimmunerkrankungen betrachtet (s. Kap. 1.3.7 und 1.3.8). Ziel der Arbeit war es (a) die funktionelle Relevanz der CD44v10-Isoform in entzündlichen Th1-vermittelten Prozessen zu untersuchen und (b) eine mögliche Beteiligung EINLEITUNG 19 des Moleküls an zellulären Interaktionen zu analysieren. Diese Fragestellungen sollten mit Hilfe des Einsatzes homozygoter CD44v10-defizienter Mäuse im DTH-Tiermodell geklärt werden. Es wurde zwar bereits eine inhibierende Funktion von CD44v10 in diesem Modell beschrieben (Rösel et al., 1997), jedoch nur anhand anti-CD44v10 Ak vermittelter Studien. Die Verwendung homozygoter CD44v10-defizienter Mäuser im erprobten DTH-Modell ermöglicht eine definierte, gut zugängliche gewebespezifische Untersuchung der Funktion von CD44v10 auf der Zelloberfläche in vivo, ohne die Risiken von biochemischen Artefakten und weiteren Parametern, wie sie auch z. B. durch die Verwendung von Ak (RezeptorShedding) oder in in vitro Systemen auftreten können. Vorrangiges Ziel war eine funktionelle Beteiligung der CD44v10-Isoform an der Entwicklung einer DTH-Reaktion nachzuweisen. Dazu sollte im ersten Schritt die Intensität der DTH-Antwort von CD44v10-defizienten Mäusen und Wildtyp-Tieren verglichen werden. Im Folgenden sollten Knochenmarktransferexperimente im syngenen Tiermodell, einerseits einen Aufschluss über die Funktion von CD44v10 auf Haut-infiltrierenden Lymphozyten und andererseits über den Einfluss auf Zellen des umliegenden Milieus (Endothelzellen, Langerhans-Zellen und Kerationzyten etc.) geben. Mit Hilfe histologischer Studien sollte untersucht werden, inwieweit die fehlende Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche zu Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Infiltrats in den Ohren führt. FACS-Analysen der exprimierten Oberflächenmoleküle auf den Zellen des inflammatorischen Infiltrats der Ohren sollten zudem Auskunft darüber geben, ob diese durch den Verlust von CD44v10 ein verändertes Expressionsprofil verschiedener Adhäsion- und Aktivierungsmarker (CD40, CD54 (ICAM-1), CD62L, CD69,CD80, CD86, CD134L usw.) aufweisen. Durch die Analyse der sezernierten Zytokine innerhalb des inflammatorischen Bereiches der Ohren sollten weitere eventuell vorhandene Unterschiede in Bezug auf die zelluläre Kommunikation herausgearbeitet werden. Verschiedene Proliferations- und Apoptose-Studien sollten einen Hinweis darauf geben, inwieweit CD44v10 diese grundlegenden zellulären Prozesse beeinflussen kann, da nach früheren Erkenntnissen z. B. von Wittig et al., (2000) die CD44v7-Isoform aktivierte Leukozyten vor dem aktiv induzierten Zelltod schützt. MATERIAL 20 2 MATERIAL 2.1 Chemikalien Die in dieser Arbeit verwendeten, hier nicht gesondert aufgeführten Chemikalien ( mit dem Reinheitsgrad „zur Analyse“) sowie nicht erwähnter allgemeiner Laborbedarf wurden in der erforderlichen Qualität im Fachhandel bezogen. Agarose Bioproducts, Dänemark über Biozym, Hameln Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen BSA (Bovine Serum Albumine) Sigma, Deisenhofen Desoxyribonukleotide Roche Molecular Biochemicals, Mannheim DNFB (2,4-Dinitrofluorbenzen) Sigma, Deisenhofen EDTA (Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraacetat) Sigma, Deisenhofen Ethidiumbromid Roche Molecular Biochemicals, Mannheim D(+)-Galaktose Roth, Karlsruhe Glycerin Fluka, Neu-Ulm Natriumazid Sigma, Deisenhofen Natriumchlorid-Lösung (isoton, 0,9 %) Delta-Pharma GmbH, Pfullingen Natriumcitrat Sigma, Deisenhofen Natriumdodecylsulfat (SDS) BioRad, München Natriumnitrit Merck, Darmstadt Neomycinsulfat Sigma, Deisenhofen Tris (Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan) Sigma, Deisenhofen Triton X-100 BioRad, München Tween 20 Sigma, Deisenhofen Xylenxyanol FF Fluka, Neu-Ulm MATERIAL 21 2.2 Enzyme Desoxyribonuklease I (536 Kunitz U/mg) Sigma, Deisenhofen Proteinase K (40 U/ml) Merck, Darmstadt Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl) Sigma, Deisenhofen 2.3 Antikörper Die eingesetzten Antikörper wurden von den Firmen BD Biosciences (Heidelberg) und Serotec (Düsseldorf) bezogen. Spezifität Klon Markierung Subtyp CD2 RM2-5 BIOTIN Ratte IgG2b CD2 RM2-5 FITC Ratte IgG2b CD3e 145-2C11 aufgereinigt Hamster IgG1 CD3e 145-2C11 FITC Hamster IgG1 CD3e 145-2C11 PE Hamster IgG1 CD4 RM4-5 APC Ratte IgG2a CD4 RM4-5 FITC Ratte IgG2a CD8a 53-6.7 APC Ratte IgG2a CD8a 53-6.7 FITC Ratte IgG2a CD8a 53-6.7 PE Ratte IgG2a CD11a 2D7 PE Ratte IgG2a CD11b M1/70 aufgereinigt Ratte IgG2b CD11b M1/70 APC Ratte IgG2b CD11c HL3 APC Hamster IgG1 CD19 1D3 PE Ratte IgG2a CD25 7D4 BIOTIN Ratte IgM CD28 37.51 PE Hamster IgG2 CD40 3/23 BIOTIN Ratte IgG2a CD44 IM7 FITC Ratte IgG2b CD44 IM7 PE Ratte IgG2b MATERIAL 22 CD44v10 K926 aufgereinigt Ratte IgG2a CD45R/B220 Ra3-682 FITC Ratte IgG2a CD54 3E2 PE Hamster IgG1 CD62L Mel 14 APC Ratte IgG2a CD69 H1.2F3 BIOTIN Hamster IgG1 CD80 16-10A1 PE Hamster IgG2 CD86 GL-1 PE Ratte IgG2a CD95 (Fas) Jo2 aufgereinigt Hamster IgG2 CD95 (Fas) Jo2 PE Hamster IgG2 CD134 Ox86 BIOTIN Ratte IgG1 CD134-L RM134L BIOTIN Ratte IgG2b CD205 NLDC-145 FITC Ratte IgG2a C1qRp 493 BIOTIN Ratte IgG2a IgM R6-60.2 BIOTIN Ratte IgG2a F4/80 CI:A3-1 FITC Ratte IgG2b RB6-8C5 APC Ratte IgG2b MHC I (H-2K ) SF1-1.1 PE Maus IgG2a MHC II (I-Ab) M5/114.15.2 PE Ratte IgG2b PAN-NK Dx5 FITC Ratte IgM Ly-6G (Gr-1) d Der Antikörper C1qRp wurde uns freundlicherweise von Prof. Dr. A. Rohlink, Institut für Immunologie, Basel zur Verfügung gestellt. Als Sekundärkonjugat zur Detektion Biotin-gekoppelter Antikörper wurden StreptavidinAPC, FITC und PE Konjugate eingesetzt (Biozol Diagnostica, Molecular Probes und Serotec). MATERIAL 23 2.3.1 Isotypenkontrollen und sekundäre Antikörper Spezifität Markierung Subtyp Goat anti Rat PE Goat IgG (H+L) Goat anti Rat FITC Goat IgG (H+L) aufgereinigt HamsterIgG2 KLH 2.4 Klon Ha4/8 Medien, Reagenzien und Materialien für die Zellkultur 100 x nicht-essentielle Aminosäuren Invitrogen, Niederlande Fötales Kälberserum (FKS) PAA, Marburg L-Glutamin Merck, Darmstadt HEPES (Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure) Sigma, Deisenhofen b-Mercaptoethanol Invitrogen, Niederlande Natriumpyruvat Invitrogen, Niederlande Penicillin G (10000 U/ml) Hoechst, Frankfurt RPMI 1640 Invitrogen, Niederlande Streptomycinsulfat (10000 U/ml) Sigma, Deisenhofen Trypanblau Sigma, Deisenhofen 48-Loch-Zellkulturplatten, Flachboden BD Biosciences, Heidelberg 96-Loch-Zellkulturplatten, Microtest Flachboden BD Biosciences, Heidelberg Nylonsieb (70 µm Porengröße) (Cell-Strainer) BD Biosciences, Heidelberg MATERIAL 24 2.5 Kits und spezielle Reagenzien Annexin-V-FLUOS Roche Molecular Biochemicals, Mannheim Assay Diluent BD Biosciences, Heidelberg Carboxyfluorescein-diacetat-succinimidyl-ester Molecular Probes, Niederlande CellTiter 96â Aqueous, One Solution Reagent Promega, Mannheim DNA-Molekulargewicht-Marker VII Roche Molecular Biochemicals, Mannheim Duo-ELISA-Set (RANTES und IL-1b) R & D Systems, Wiesbaden Interleukin-2 (rekombinant) R & D Systems, Wiesbaden Ketamin (10 %) CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf Olivenöl Caesar & Lorenz GmbH, Hilden OptEIA-ELISA-Set (IFN-g, IL-2 und TNF-a) BD Biosciences, Heidelberg Propidiumjodid (PI) Sigma, Deisenhofen Tetramethylbenzidin Substrat Reagenzien Set BD Biosciences, Heidelberg Xylanzin (2 %) CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf 2.6 Reagenzien für die Histologie Azur-Eosin-Methylenblaulösung (Giemsa) Merck, Darmstadt 5,5-Diäthyl-Barbitursäure Natriumsalz Merck, Darmstadt Dimethylformamid Merck, Darmstadt Eosin Serva, Heidelberg Eosin-Methylenblaulösung (May-Grünwald) Merck, Darmstadt Fluorograd BioRad, München Formalin Merck, Darmstadt Hämalaun nach Mayer Merck, Darmstadt Histoclear Shandon, Frankfurt Histomount Shandon, Frankfurt MATERIAL 25 Kryo-Einbettmedium Leica, Bensheim Naphtol-AS-D-Chloracetat Sigma, Deisenhofen Paraformaldehyd Merck, Darmstadt Pararosanilin Merck, Darmstadt TUNEL-Reagenz Roche Molecular Biochemicals, Mannheim Wasserstoffperoxid (30%) Merck, Darmstadt 2.7 Besondere Verbrauchsmaterialien Adhäsions-Objekträger Histobond, Marienfeld MaxiSorp Immuno, 96-Loch-Platten Invitrogen, Niederlande Medicons (50 µm Porengröße) BD Biosciences, Heidelberg 2.8 Spezielle Laborgeräte Cäsium137-Quelle Cammacell 40-Bestrahlungsgerät Kanada Benchmark Microplate Reader Software: Microplate Manager 4.0 BioRad, München DNA Trio Thermoblock (PCR) Biometra, München Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) Software: CellQuest Pro 2.0 BD Biosciences, Heidelberg Kryostat Leica, Bensheim Laser Scanning Microscope AxioVert LSM 510; Software: LSM 510 2.8 Zeiss, Göttingen Medimachine BD Biosciences, Heidelberg Schermaschine, Golden A5 Oster, Offenbach über Elektro-Schmitz, Köln Springkaliber Oditest (0-10mm) Kroeplin GmbH, Schlüchtern MATERIAL 26 2.9 Puffer und Lösungen Hier nicht aufgeführte Zusammensetzungen von Puffern und Lösungen wurden den Laborhandbüchern „Current Protocols in Immunology“ (Coligan et al., 1990) oder „Current Protocols in Molecular Biology“ (Ausubel et al., 1997) entnommen. Ammoniumchlorid-Lysispuffer (Zellkultur-Techniken) 0,1 mM EDTA 10 mM KHCO3 155 mM NH4Cl mit HCl auf pH 7,2 einstellen, mit H2O auffüllen Betäubungsmittellösung (DTH) 16% (v/v) Ketamin 80% (v/v) Natriumchlorid-Lösung 4% (v/v) Xylanzin Bindungspuffer (10x) (FACS) 18 mM CaCl2 100 mM HEPES, pH 7,4 50 mM KCl 10 mM MgCl2 1,5 mM NaCl DNA-Probenpuffer (6x) (PCR) 0,25% (w/v) Bromphenolblau 150 mM EDTA, pH 8.0 30% (v/v) Glycerin 0,25% (w/v) Xylenxyanol FF dNTP-Mix (PCR) je 1,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP in A. bidest Eosin-Stammlösung (Histologie) 20% (v/v) A. bidest 1% (w/v) Eosin 80% (v/v) Ethanol (96%) FACS-Puffer 0,02% (w/v) Natriumazid 2% (v/v) FKS in 1 l PBS= Formaldehydlösung (4%) (Histologie) 85% (v/v) Formalin (37%) 136 mM NaH2PO4 105 mM NaOH 15% (v/v) NaOH, mit H2O auffüllen pH 7,4 mit NaOH einstellen MATERIAL 27 Giemsa-Pufferlösung (Histologie) 50,4 mM Na2PO4 21,5 mM KH2PO4 mit H2O auf 1L auffüllen Giemsa-Färbelösung (Histologie) 5% (v/v) Giemsa-Lösung 95% (v/v) Giemsa-Pufferlösung Isolations- und Kulturmedium (Zellkultur-Techniken) 90% (v/v) RPMI 1640 10% (v/v) FKS 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren 25 mM HEPES 1 mM Natriumpyruvat 2 mM L-Glutamin 10-6 M b-Mercaptoethanol 1000 U Penicillin/Streptomycin Lysispuffer (nach Greenberger et al., 1995) (ELISA) 1 mM CaCl 1 mM MgCl2 150 mM NaCl 15 mM Tris 0,5% (v/v) Triton X-100 mit NaOH pH 7,4 einstellen mit H2O auffüllen MMTB-Puffer (Genotypisierung) 5 mM EDTA 200 mM NaCl 0,2% (w/v) SDS 100 mM Tris mit H2O auffüllen Naphtol-Chloracetat (Histologie) 10 mg Naphtol-Chloracetat in 1 ml Dimethylformamid 100 µl Pararosanilin (4%) 200 µl Natriumnitrit mit H2O auffüllen PBS (“Phospahte buffered saline”) 2,7 mM KCl 1,4 mM KH2PO4 137 mM NaCl 6,5 mM Na2HPO4 Paraformaldehydlösung (Histologie) 30 mM Galaktose 4% (w/v) Paraformaldehyd 70% (v/v) PBS mit HCl pH 7,4 einstellen MATERIAL 28 Permeabilisierungslösung (Histologie) 0,1% (w/v) Natriumzitrat 0,3% (w/v) Triton X-100 mit PBS auffüllen Propidiumjodidlösung (PI) 5% (w/v) Propidiumjodid in H2O Tris-EDTA-Puffer (TE) (Genotypisierung) 0,1 mM EDTA 10 mM Tris mit H2O auffüllen Veronalacetat-Puffer (Histologie) 5,5 g Diäthyl-Barbitursäure-Na-Salz in 50 ml H2O, pH 6,5 Waschpuffer (Zellkultur-Techniken) 1 mM CaCl 20 mM HEPES 500 mM Glycin (pH 5,0) 5 mM KCl 0,7 mM MgCl2 0,8 mM MgSO4 132 mM NaCl mit H2O auffüllen pH 7,4 mit NaOH einstellen METHODEN 29 3 METHODEN 3.1 Tierversuche Für die Tierversuche lag eine Genehmigung der Bezirksregierung Düsseldorf gemäß §8 Abs. 1 des TShG (G619/01) vor. 3.1.1 Tiere Wildtyp-Tiere Die Wildtyp-Mäuse (Stamm BALB/c) wurden von Harlan-Winkelmann oder Iffa-Credo bezogen. CD44v-defiziente Tiere Die homozygoten CD44v6v7-/-, CD44v7-/- und CD44v10-/- Mäuse wurden freundlicherweise von Frau PD Dr. U. Günthert (Institut für Medizinische Mikrobiologie, Basel) zur Verfügung gestellt. Alle verwendeten Tiere waren homozygot auf BALB/c Hintergrund in der F6Generation zurückgekreuzt. 3.1.2 Haltungsbedingungen Die CD44v-defizienten Tiere wurden in der Nagerabteilung des Zentralen Tierlabors des Universitätsklinikums Essen unter halbsterilen Bedingungen gezüchtet und gehalten. Alle Tiere waren einem täglichen Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 h:12 h ausgesetzt. Standard Futter und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. 3.1.3 Delayed type hypersensitivity (DTH) (Phanuphak et al., 1974) In den DTH-Studien wurden 10-12 Wochen alte homozygote CD44v6v7-/--, CD44v7-/--, CD44v10-/-- und BALB/c-Weibchen eingesetzt. Alle Tiere wurden durch kutane Applikation einer 0,5%igen DNFB-Lösung in Aceton/Öl (4:1) an zwei aufeinanderfolgenden Tagen (0 d und 1 d) auf dem zuvor rasierten Abdomen sensibilisiert. Nach 4 Tagen (5 d) erfolgte eine METHODEN 30 erneute Applikation einer 0,3%igen DNFB-Lösung (in Aceton/Öl) auf das rechte Ohr der Tiere. Als interne Kontrolle wurde zeitgleich das linke Ohr nur mit der Trägersubstanz (Aceton/Öl) allein behandelt. Dabei wurden die Tiere narkotisiert um ein eventuelles Abputzen der Substanz durch die Tiere selbst zu verhindern. Die Kontrollgruppen setzten sich aus Tieren zusammen, denen nur an Tag 5 die 0,3%ige DNFB-Lösung auf das rechte Ohr appliziert wurde und die Trägersubstanz (Aceton/ÖL) auf das linke Ohr. Die entstandene Ohrschwellung wurde über einen Zeitraum von 192 h durch Messung mit einem Springkaliber ermittelt. Die Berechnung der Ohrschwellung erfolgte durch einen Abgleich der entstandenen Schwellung des DNFB-behandelten Ohres gegenüber der internen Kontrolle. Für weiterführende Versuche im Zellkulturbereich (s. Kap. 3.3) wurden die Tiere mit der 0,5%igen DNFB-Lösung kutan sensibilisiert und nach 4 Tagen durch Genickbruch getötet. Die für die jeweiligen Versuche benötigten Organe wurden unter sterilen Bedingungen entnommen und aufgearbeitet. 3.1.4 Röntgenbestrahlung und Knochenmarktransfer Die letale Bestrahlung der Tiere (10-12 Wochen alte Weibchen) erfolgte mit Hilfe einer Cäsium137-Quelle und einer Dosisleistung von 8,5 Gy. Allen Tieren wurden direkt nach der Bestrahlung 5 x 106 Zellen einer syngenen Knochenmarkzellsuspension, resuspendiert in 200 µl PBS (s. Kap. 3.3.1), in die Schwanzvene injiziert. Die Tiere erhielten zusätzlich ab diesem Zeitpunkt in Wasser gelöstes Neomycinsulfat (1,17 g/l). Nach 3 Monaten wurde dann eine DTH-Reaktion ausgelöst. 3.2 Histologische Techniken 3.2.1 Herstellung von Blutausstrichen Zur Herstellung von Blutausstrichen wurde den Mäusen mittels einer Skalpellklinge vorsichtig die Schwanzarterie angeschnitten und jeweils ein Tropfen Blut auf einen Objektträger gegeben. Dieser wurde anschließend mit Hilfe eines zweiten Objektträgers in dünner Schicht ausgestrichen und luftgetrocknet. METHODEN 31 3.2.2 Herstellung von Gefriergewebeschnitten Für die TUNEL-Studien (s. Kap. 3.2.7) wurden den Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der DTH-Reaktion die Ohren abgenommen und Gefriergewebeschnitte angefertigt. Dazu wurden die frisch abgetrennten Ohren in Kryo-Einbettmedium mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert. Mit Hilfe eines Kryostaten wurden bei –20°C Schnittpräparate von 0,5 µm Dicke hergestellt, auf beschichtete Adhäsions-Objektträger aufgebracht und ca. 2 h luftgetrocknet. 3.2.3 Herstellung von Paraffingewebeschnitten Zur Herstellung des histologischen Untersuchungsmaterials wurden die frisch abgetrennten Ohren über Nacht in 4%iger Formalinlösung fixiert und anschließend maschinell in Paraffin eingebettet. Die maschinelle Einbettung setzte sich aus folgenden Arbeitsschritten zusammen: Zunächst wurde das Ohrmaterial erneut in 4%igen Formalin fixiert (45 min, 30°C) und in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei 30°C dehydriert (70% Ethanol, 45 min; 80% Ethanol, 45 min; 96% Ethanol, 60 min; 100% Ethanol, 60 min u. 100% Ethanol, 60 min). Anschließend folgten drei Inkubationen in Rotihistol bei 30°C. Die abschließende Einbettung in Paraplast erfolgte bei 59°C (Paraplast I, 60 min; Paraplast II, 60 min u. Paraplast III, 75 min). Alle beschriebenen Arbeitschritte verliefen unter Vakuum. Es wurden ebenfalls Schnittpräparate von 0,2 µm Dicke angefertigt, auf beschichtete Adhäsions-Objektträger gezogen und bei 37°C über Nacht getrocknet. 3.2.4 Grünwald/Pappenheim-Färbung Die Färbung und Fixierung der luftgetrockneten Blutausstriche erfolgten in einem Schritt durch Inkubation der Schnitte in May-Grünwaldlösung für 5 min. Zur Entfernung restlicher Farbpartikel wurden die Präparate anschließend 5 min in H2O gespült. Danach wurden die Objektträger 15 min in Giemsa-Färbelösung inkubiert und nach Abspülen der überschüssigen Färbelösung mit H2O, luftgetrocknet. Die Auszählung der lichtmikroskopisch in starker Vergrößerung (63-fach) in der Ölimmersion. Präparate erfolgte METHODEN 32 3.2.5 Hämatoxylin/Eosin (HE)-Färbung Zur lichtmikroskopischen Darstellung des Entzündungsbereiches und zur Differenzierung der vorhandenen Zelltypen in dieser Region wurden die Paraffingewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Hämatoxylin, ein positiv geladener Farbstoff, bindet an die negativ geladenen Phosphatgruppen des Chromatins und färbt dieses blau an. Durch Eosin hingegen werden Zellplasma und interzelluläre Substanzen rot gefärbt. Für die HE-Färbung wurden die Paraffinschnitte zunächst entparaffiniert. Dazu wurden die Schnitte jeweils 5 min in 96%igem und 70%igem Isopropanol inkubiert und 5 min in H2O rehydriert. Die Schnittpräparate wurden anschließend 7 min in Hämatoxylin inkubiert und 15 min unter fließendem Leitungswasser zur Stabilisierung der Farbe gebläut. Danach erfolgte eine 30 s Inkubation der Präparate in einer Eosinlösung (Eosin-Stammlösung 1:4 mit 80%igem Ethanol verdünnt und Zugabe von Eisessig bis zum Auftreten einer Opaleszenz). Die Eosin-Reaktion wurde durch zweimaliges kurzes Spülen der Schnitte in 96%igem Isopropanol gestoppt. Mittels einer aufsteigenden Isopropanolreihe wurden die Schnittpräparate erneut dehydriert, zweimal 5 min in Histoclear inkubiert und in Histomount eingedeckt. 3.2.6 Naphtol-AS-D-Chloracetat-Esterase-Färbung (ASDCL) Die Analyse der Granulozyten in der entzündlichen Region des Ohres erfolgte durch Nachweis des Granulozytenenzyms Chloracetat-Esterase. Zunächst wurden die Schnittpräparate entparaffiniert und für 30 min in einer Veronalacetat-Naphtol-AS-DChloracetat-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte 30 s in Hämatoxylin gegeben, 10 min in warmem Leitungswasser zur Stabilisierung der Farbe gebläut und in Histomount eingedeckt. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch durch Auszählen der angefärbten Granulozyten innerhalb einer definierten Fläche von 0,3 mm2. 3.2.7 In situ Immunfluoreszenz (TUNEL) (Wijsman et al., 1993) Zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen in apoptotischen Zellen mittels TUNEL-Assay wurden die Gefrierschnittpräparate der Ohren verwendet (s. Kap. 3.2.2). Bei dieser Methode werden die DNA-Strangbrüche durch den Einbau FITC-markierter dUTPs an den freien 3’OH-Enden durch die Terminale-Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) detektiert. Zur Fixierung wurden die Gefrierschnitte 10 min bei RT in einer 4%igen Paraformaldehydlösung METHODEN 33 inkubiert und zweimal 5 min in PBS gewaschen. Um die endogenen Peroxydasen zu blockieren wurden die Schnitte anschließend in 0,6%igem H2O2 10 min inkubiert und zweimal 5 min in PBS gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation der Präparate in einer Permeabilitätslösung für 15 min und zweimaliges Waschen in PBS für 5 min. Nach dem Auftropfen der TUNEL-Reaktionslösung (5 µl TdT und 45 µl TUNEL-Färbelösung/Schnitt) wurden die Schnitte unter Lichtausschluss 1 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert, erneut gewaschen und in Fluorogard eingedeckt. Die Auswertung erfolgte anschließend mit der konfokalen „Laser Scanning Mikroscopie“. Als Positivkontrolle dienten Schnitte, die vor der TUNEL-Reaktion 10 min mit einer 0,1 µg/ml DNAse-Lösung unter Lichtausschluss bei 37°C behandelt worden waren. Negativkontrollen wurden nur mit TUNEL-Färbelösung ohne TdT inkubiert. 3.3 Zellkultur-Techniken Das Arbeiten mit Säugerzellen erfolgte unter sterilen Bedingungen. Lösungen und Materialien wurden bei 121°C und 1 bar autoklaviert. Lösungen mit hitzeempfindlichen Komponenten wurden sterilfiltriert. 3.3.1 Präparation primärer Einzelzellsuspensionen Milz-, Lymphknoten- und Thymuszellsuspensionen Zur Gewinnung primärer Einzelzellsuspensionen wurden den Mäusen die entsprechenden Organe unter sterilen Bedingungen entnommen. In einigen Fällen fand die Entnahme nach Sensibilisierung bzw. Auslösen der DTH (s. Kap. 3.1.3) statt. Die frisch präparierten Organe wurden durch ein engmaschiges Nylonsieb (70 µm) gerieben und bei 1300 U/min für 10 min abzentrifugiert. Bei den Präparationen der Zellsuspensionen besonders aus der Milz war es notwendig die Erythrozyten zu lysieren. Dazu wurde das Zellpellet in 2 ml ACK-Puffer resuspendiert und 4 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Isolationsmedium hinzugegeben, um die Lysereaktion zu stoppen. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen zur Abtrennung von Bindegewebs- und Fettresten durch Gaze filtriert und die Anzahl lebender Zellen mittels Trypanblau in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt. METHODEN 34 Knochenmarkzellsuspensionen Um Knochenmarkzellen zu isolieren, wurde den Mäusen Femur und Tibia entnommen. Anschließend wurden Gelenk- und Knorpelreste an beiden Enden der Knochen entfernt. Aus der so entstandenen Knochenröhre wurde mit Hilfe einer Kanüle das Knochenmark mittels PBS herausgespült. Die weitere Präparation der Zellen erfolgte wie oben beschrieben. Zellsuspensionen aus dem Ohr Zur Charakterisierung von exprimierten Oberflächenproteinen auf den Zellen während der DTH mittels der Durchflusszytometrie (s. Kap. 3.4.1) wurden den Tieren, nach dem Auslösen der DTH-Reaktion, zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Ohren abgenommen. Anschließend wurden die zuvor zerkleinerten Ohren in PBS maschinell mit der Medimachine aufgearbeitet. Zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile wurde die gewonnene Zellsuspension durch Gaze filtriert, abzentrifugiert und in den benötigten Volumina aufgenommen. Alle beschriebenen Arbeitsschritte erfolgten, soweit nicht anders vermerkt, auf Eis bzw. bei 4°C. 3.3.2 In vitro Zellstimulation mittels anti-CD3e Antikörper Eine direkte Stimulation der gewonnenen Milzzellen und Lymphozyten in vitro wurde durch immobilisierte, mitogene anti-CD3e Ak erreicht. Dazu wurden 96-Loch-Zellkulturplatten mit einer Verdünnungsreihe (0,1 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 0,75 µg/ml; 1 µg/ml; 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 7,5 µg/ml; 10 µg/ml; 25 µg/ml; und 50 µg/ml) des Maus-spezifischen anti-CD3e Ak durch Inkubation im Brutschrank für 1 h bei 37°C beschichtet. Für unstimulierte Kontrollen wurden die Vertiefungen mit PBS inkubiert. 2 x 105 Zellen einer Einzelzellsuspension in 200 µl Zellkulturmedium wurden pro Vertiefung für 48 h in Kultur genommen. Alle Versuchsansätze erfolgten als Dreifachbestimmungen. Die Auswertungen der in vitro Zellstimulationen erfolgten mittels des MTTProliferationstests. 3.3.3 MTT-Proliferationstest MTS ist eine lösliche, gelbe Tetrazoliumsalz-Verbindung, die in lebenden Zellen durch die mitochondriale Succinatdehydrogenase zu einem bläulichen Formazansalz umgesetzt wird METHODEN 35 und daher als Indikator für die Vitalität der Zellen genutzt werden kann. Die Intensität der entstehenden Färbung korreliert mit der Anzahl an vitalen Zellen und erlaubt so eine indirekte Quantifizierung. 4 Stunden vor Ablauf der Inkubationszeit wurden 20 µl einer MTS-Lösung den mit anti-CD3e Ak stimulierten Zellen hinzugefügt und diese weiterhin bei 37°C im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurde die Farbstoffkonzentration spektrophotometrisch in einem „Microplate Reader“ bei einer Wellenlänge von 490 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm quantifiziert. Der Nullabgleich erfolgte durch Messung reinen Kulturmediums. 3.3.4 In vitro Apoptoseinduktion Anti-CD3e Ak Stimulation Eine direkte Aktivierung gewonnener Milzzellen und Lymphozyten in vitro wurde durch immobilisierte, mitogene anti-CD3e Ak erreicht. Dazu wurden 48-Loch-Zellkulturplatten mit 5 µg/ml anti-CD3e Ak über Nacht bei 4°C beschichtet. Für unstimulierte Kontrollen wurden die Vertiefungen mit PBS inkubiert. 1 x 106 Zellen einer Einzelzellsuspension in 200 µl Zellkulturmedium wurden pro Vertiefung für 48 h in Kultur genommen und anschließend für 24 h mit 50 U/ml IL-2 kultiviert. Nach dem Auswaschen des IL-2 aus den Ansätzen wurden die Zellen mit 10 µg/ml anti-CD3e Ak für 24 h oder 48 h restimuliert. Die Auswertung erfolgte mittels AnnexinV/PI Färbung (s. Kap. 3.4.2). 3.4 Durchflusszytometrie (FACS) Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können Zellpopulationen aufgrund ihrer Morphologie, der Expression von Oberflächen- und intrazellulären Molekülen über Fluoreszenzfarbstoffkonjugierte Antikörper analysiert und sortiert werden. Die Analyse von Oberflächenproteinen erfolgte mit dem „FACScan Calibur“ Gerät und den entsprechenden Puffern der Firma Becton-Dickinson. Dabei wurden zunächst über die Parameter Vor- und Seitwärtsstreulicht lebende Zellen ausgewählt und mindestens 10.000 Signale aufgenommen. Die Bearbeitung der Rohdaten erfolgte mit dem Analyseprogramm CellQuest Pro. METHODEN 36 3.4.1 Darstellung von Oberflächenmolekülen Für die FACS-Analysen wurden 1 x 105-1 x 106 Zellen einer Einzelzellsuspension (s. Kap. 3.3.1) in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen, in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte überführt und bei 2800 U/min für 1 min abzentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden in Suspensionen, die unterschiedliche Konzentrationen an Fluorochrom- oder Biotin-gekoppeltem Ak in FACSPuffer enthielten, resuspendiert und die Ansätze für 30 min unter Lichtausschluss auf Eis inkubiert. Die Proben wurden nach einmaligem Waschen in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und im FACS-Gerät analysiert. Bei der Anwendung eines sekundären Ak (z. B. nach Verwendung Biotin-gekoppelter Erst-Antikörper) erfolgte nach dem Waschen ein weiterer Inkubationsschritt für 30 min. 3.4.2 Detektion apoptotischer Zellen über AnnexinV/PI Zur Ermittlung der Apoptoserate bzw. zur Differenzierung von apoptotischen und nekrotischen Zellen, wurden die Zellen nach Induktion der Apoptose (s. Kap. 3.3.4) mit AnnexinV/PI angefärbt. Das Protein AnnexinV (AV) bindet Calcium2+-abhängig spezifisch an die negative Ladung von Phosphatidylserin (PS). PS, das unter normalen Bedingungen in vitalen Zellen auf der cytoplasmatischen Innenseite der Plasmamembran lokalisiert ist, tritt bei Verlust der Asymmetrie der Plasmamembran, einem frühen Anzeichen der Apoptose, vermehrt in der nach außen gerichteten Membranseite auf. Da auch bei nekrotischen Zellen aufgrund der permeabilisierten Membran AV binden kann, muss gleichzeitig eine Ausschlussfärbung mit PI durchgeführt werden. Für die Färbung wurden die Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit AV (1 µg/ml Endkonzentration) und PI (5 µg/ml Endkonzentration) in Bindungspuffer für 15 min auf Eis inkubiert und anschließend im FACS analysiert. METHODEN 37 3.5 Analyse von Proteinen 3.5.1 Herstellung von Zellproteinextrakten/Zellsuspensionen aus dem Ohrgewebe Zur Isolierung von gesamtzellulären Proteinen wurden den Tieren nach Auslösen der DTHReaktion zu unterschiedlichen Zeitpunkten die Ohren abgenommen und das Nassgewicht bestimmt. Anschließend wurden die Ohren in Lysispuffer maschinell mit der „Medimachine“ homogenisiert. Zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile wurde das Homogenat durch Gaze filtriert und bei -80°C gelagert. 3.5.2 Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) Mit Hilfe eines ELISA-Assays können von Zellen sezernierte Substanzen, in diesem Fall IL1b; IL-2; IFN-g; TNF-a und RANTES nachgewiesen und quantifiziert werden. Das Prinzip des ELISA-Assays beruht darauf, dass das gesuchte Zytokin oder Chemokin durch einen spezifischen immobilisierten Antikörper an die Oberfläche einer 96-Loch-Mikrotiterplatte gebunden wird. Detektiert wird das so immobilisierte Protein mit einem weiteren spezifischen, biotinylierten Antikörper, an den eine Streptavidin-gekoppelte MeerrettichPeroxidase bindet. Die Zugabe des Peroxidase-Substrates führt zu einer Farbreaktion, deren Intensität proportional zur Menge des vorhandenen Proteins ist. Die Quantifizierung der Zytokine bzw. Chemokine in den Homogenaten erfolgte unter Anwendung des „OptEIA-ELISA-Set“ (BD Biosciences) und „Duo-ELISA-Set“ (R & D Systems) nach Anleitung der Hersteller. Die gesammelten Homogenate wurden unverdünnt, 1:10 und 1:100 verdünnt eingesetzt. Als Substrat für die Farbentwicklung wurden 100 µl Tetramethylbenzidin pro Vertiefung hinzugegeben und die Reaktion nach 20 min durch Zugabe von 50 µl 2 N H2SO4-Lösung abgestoppt. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 655 nm mit einem „Microplate Reader“ bestimmt. Anhand einer Eichkurve mittels rekombinanten murinen Zyto- und Chemokinen wurde die Menge an vorhandenem Protein in den Homogenaten quantifiziert. Alle Messungen wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt. METHODEN 38 3.6 Molekularbiologische Techniken 3.6.1 Präparation genomischer DNA aus dem Knochenmark (Sambrook et al., 1989) Zur abschließenden Genotypisierung der in den Knochenmarktransfer-Versuchen eingesetzten Mäusen wurden den Tieren nach Versuchsabschluss Tibia und Femur entnommen und das Knochenmark präpariert (s. Kap. 3.3.1). Das Pellet wurde zum proteolytischen Verdau in 500 µl MMTB und 10 µl Proteinase K-Lösung aufgenommen und für mindestens 2 h bei 55°C in einem Thermoblock inkubiert. Zum Fällen der DNA wurden 500 µl Isopropanol dazu pipettiert. Die ausgefallene genomische DNA wurde anschließend in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 70%igem Ethanol gewaschen, abzentrifugiert, luftgetrocknet und in 200 µl TE resuspendiert. Nach erneuter Inkubation bei 55°C für 30 min wurde die DNA-Lösung bei -20°C gelagert oder direkt in die PCR eingesetzt. 3.6.2 Zur Polymerasekettenreaktion (PCR) Überprüfung einer erfolgreichen Rekonstitution der Tiere mit syngenen Knochenmarkzellen wurde die gewonnene DNA durch PCR analysiert. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 15 µl durchgeführt. Der Ansatz enthielt 1 ng genomische DNA, je 6 pmol Oligonukleotide (12466: 5`-CD44v10; 5`- CCCCTTCCTCAGAGGTAGATCC-3’ und 12467: 3’-CD44v10; 5’-CCTTTACTTGGTGGTGGACTGATTGG-3`), 1,5 µl dNTPMix, 1,5 µl PCR-Puffer und 0,2 µl Taq-Polymerase (5 U/µl). Die PCR-Reaktion wurde mit der ersten Denaturierung bei 96°C gestartet. Die Reaktion erfolgte über 30 Zyklen nach folgendem Programm: Denaturierung 10 Sekunden 96°C Hybridisierung der Oligonukleotide 15 Sekunden 60°C DNA-Strangsynthese 60 Sekunden 72°C Zur letzten vervollständigenden Strangsynthese wurde der Reaktionsansatz nach dem letzten Zyklus für 10 Minuten bei 72°C inkubiert. Je 10 µl eines Ansatzes wurden durch AgaroseGelelektrophorese analysiert. ERGEBNISSE 39 4 ERGEBNISSE Zelluläre Interaktionen, die über das Adhäsionsmolekül CD44v10 verlaufen, spielen eine essentielle Rolle bei der Entwicklung und Persistenz kutaner Entzündungsreaktionen und maligner lymphatischer Erkrankungen (Camp et al., 1993; Seiter et al., 1998). Zu Beginn meiner Untersuchungen waren bereits inhibierende Funktionen von CD44v10 in kutanen entzündlichen Prozessen anhand des DTH-Tiermodelles durch die Applikation spezifischer CD44v10-Antikörper beschrieben worden (Rösel et al., 1997). Genauere Analysen der funktionellen Relevanz in kutanen Entzündungsreaktionen und zellulären Interaktionen lagen jedoch nicht vor (s. Kap. 1.3.8). Aus diesem Grund wurden detailliertere Untersuchungen der CD44v10 relevanten Funktionen in einer Th1-vermittelten kutanen Entzündungsreaktion mit Hilfe von homozygoten CD44v10-defizienten Mäusen im Modell der Kontaktallergie (Delayed type hypersensitivity (DTH)) vorgenommen. 4.1 Phänotypische Charakterisierung der CD44v10-defizienten Tiere Eines der aussagekräftigsten Modelle, um die Funktion eines Genproduktes in vivo untersuchen zu können, stellen Null-Mutanten („Knock outs“) dar, die ein entsprechendes Gen nicht mehr exprimieren können. Da der einzige Unterschied zwischen Null-Mutanten und Wildtyp-Tieren in dem Verlust eines Gens liegt, können phänotypische Veränderungen, die im Vergleich zum Wildtyp auftreten, allein auf den Verlust dieses Gens zurückgeführt werden und erlauben letztlich Rückschlüsse auf die physiologischen Funktionen der von diesem Gen kodierten Proteine. In Übereinstimmung mit bereits publizierten Daten von Tieren mit einer NullMutation im CD44-Lokus (Protin et al., 1999; Schmits et al., 1997) oder im CD44v6v7- und CD44v7-Lokus (Wittig et al., 2000), wiesen auch die in dieser Arbeit verwendeten homozygoten CD44v10-defizienten Tiere (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Frau PD Dr. U. Günthert, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Basel) analog zu den WildtypTieren keine makroskopischen sowie morphologischen phänotypischen Abnormalitäten auf. Sie waren vital und fertil. ERGEBNISSE 40 4.1.1 Das Knochenmark Das Knochenmark ist als Ort der Hämatopoese entscheidend für die Bildung immunkompetenter Leukozyten. Da im Falle der Hämatopoese eine Beteiligung des Oberflächenmoleküls CD44v10 an der initialen Interaktion zwischen Stromazellen und Stammzellen nachgewiesen werden konnte (als Übersicht s. Zöller, 2000) wurde im ersten Schritt eine vergleichende Analyse der im Knochenmark von CD44v10-defizienten und Wildtyp-Tieren vorhandenen Zellpopulationen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden aus den Knochen Femur und Tibia Einzelzellsuspensionen präpariert und anschließend mit fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert (s. Kap. 3.4.1). Teil A der Abbildung 4.1 zeigt aufgrund der Streuung und Beugung des Lichts durch die Zellen in der Vorwärtsstreuung (FSC) die relative Größe und in der Seitwärtsstreuung (SSC) die relative Granularität der Zellen. Dadurch ist eine Unterscheidung zwischen einzelnen Zellpopulationen möglich. Region 1 (R1) beinhaltet hierbei alle vitalen Zellen. Die kleinste Population (R2) bilden die Lymphozyten, gefolgt von den übrigen kernhaltigen Zellen, den Monozyten und Granulozyten einschließlich erythroider und myeloider Vorläufer (R3). Diese vorläufige Einteilung der Zellpopulationen aus dem Knochenmark ließ zunächst keinen Unterschied zwischen Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren erkennen. Obwohl CD44v10 in die Signalkaskade der B-Zell Reifung involviert ist (Rösel et al., 1999), zeigte die Analyse der B220int/IgM+ unreifen (Abb. 4.1, B; R4) und B220+/IgM+ reifen B-Zellpopulationen (R5), dass der Verlust der Isoform CD44v10 nicht mit der Lymphopoese der B-Zellen interferiert. Die Analysen der myeloiden Zellreihen (R3) fanden über die Oberflächenexpressionsmarker Mac-1 (CD11b) und F4/80 (Monozyten) oder Gr-1 (Ly6G) und Mac-1 (Granulozyten) statt. Im Gegensatz zur Analyse der Monozytenpopulation, die ebenfalls keine Abweichungen zwischen Wildtyp und CD44v10-/- Tieren zeigte (Daten nicht gezeigt), konnte ein erhöhter Anteil an Mac-1/Gr-1 doppeltpositiven Zellen (Granulozyten) von 12% in den CD44v10-defizienten Tieren nachgewiesen werden (Abb. 4.1, C). ERGEBNISSE 41 A C B 2,5% 43,6% 44,6% 6,3% 2,7% 55,2% 36,9% 5,2% +/+ 6,8% 2,7% 7,6% Gr-1 IgM SSC 2,9% 7,6% 2,9% -/FSC B220 Mac-1 Abb. 4.1: Durchflusszytometrische Analyse der Zellpopulationen aus dem Knochenmark von Wildtyp(+/+) und CD44v10-/-- (-/-) Tieren. A: Morphologische Darstellung aller Knochenmarkzellen aus Wildtyp- und CD44v10-/--Mäusen, mit Ausnahme der Erythrozyten, über die Intensität des Vorwärts- (FSC) und Seitwärtsstreulichts (SSC). Region 1 (R1) beinhaltet alle vitalen Zellen, Region 2 (R2) die Lymphozyten und Region 3 (R3) die Granulozyten, Makrophagen und Monozyten. B: Anfärbung der Knochenmarkzellen mit B220 FITCgekoppelten und IgM PE-konjugierten Ak innerhalb von R1. Diese Analyse ermöglicht die differenzierte Darstellung der unreifen (R4) und reifen (R5) B-Zellen. C: Färbung der Zellen mit Gr-1 (APC) und Mac-1 (FITC) Ak innerhalb von R1. Bei den Mac-1+/Gr-1+ Zellen handelt es sich um die Granulozytenpopulation, die in CD44v10-/--Tieren um 12% erhöht ist. Die Mac-1-/Gr-1- Zellpopulation hingegen beinhaltet die unreifen Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten und Promonozyten. Die prozentuale Verteilung der einzelnen Zellpopulationen entsprechend den Quadraten ist im Kreuz angegeben. Dargestellt ist eine exemplarische Messung aus vier unabhängigen Analysen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde weiterführend untersucht, ob die erhöhte Granulopoese im Knochenmark Auswirkungen auf die zelluläre Zusammensetzung der Leukozytenpopulation im peripheren Blut hat. Die Differentialblutbildanalyse ergab einen signifikant (p= 0,004; Mann-Whitney-Test) erhöhten Gehalt an neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut der CD44v10-/--Tiere im Gegensatz zum Wildtyp (Tab. 4.1). Zudem konnte eine signifikante (p= 0,001; Mann-Whitney-Test) Reduktion der Lymphozytenpopulation beobachtet werden. Demnach führt der Verlust der CD44v10-Isoform zu einer Verschiebung ERGEBNISSE 42 innerhalb der Leukozytenpopulation des peripheren Blutes, zugunsten der neutrophilen Granulozyten. Tab. 4.1: Lichtmikroskopische Auswertung des Differentialblutbildes von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-(-/-) Tieren. Das gewonnene Blut aus der Schwanzarterie von Wildtyp- und CD44v10-/--Mäusen wurde auf Objektträgern ausgestrichen, getrocknet und nach Grünwald-Pappenheim gefärbt. Die Auszählung und die Bestimmung von jeweils 100 Zellen erfolgte nach zellmorphologischen Kriterien (Größe, Kernform und Färbung). Angegeben ist jeweils der Mittelwert mit Standardabweichung von sechs unabhängigen Analysen. CD44v10-/--Tiere weisen einen signifikant (**p= 0,004; Mann-Whitney-Test) erhöhten Anteil an neutrophilen Granulozyten und einen signifikant (*p= 0,001; Mann-Whitney-Test) reduzierten Anteil an Lymphozyten im peripheren Blut auf. Lymphozyten neutrophile eosinophile basophile Granulozyten Granulozyten Granulozyten Monozyten +/+ 87 ± 3 10 ± 1 1,5 ± 1 ---- 1,5 ± 1 -/- 79 ± 4* 18 ± 2** 2 ± 1 ---- 1 4.1.2 Die Milz Im Gegensatz zum Menschen ist die murine Milz in adulten Tieren gleichfalls Ort der Hämatopoese. Da bereits eine gesteigerte Granulopoese im Knochenmark der CD44v10defizienten Tiere nachgewiesen werden konnte und die fehlende Expression von CD44 nicht nur zu einer Akkumulation von Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen im Knochenmark führt, sondern parallel dazu auch eine Reduktion der selbigen in der Milz verursacht (Schmits et al., 1997), wurde zunächst untersucht, welchen Einfluss die fehlende Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche auf die Granulozytenpopulation in der Milz hat. Tatsächlich bestätigten durchflusszytometrische Analysen eine Veränderung in der Anzahl an vitalen Granulozyten in der Milz von CD44v10-negativen Tieren im Gegensatz zum Wildtyp. Es zeigte sich, dass die Population der Granulozyten (Mac-1+/Gr-1+ Zellen) in CD44v10-defizienten Tieren um 6,9% reduziert ist (Abb. 4.2, A). Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass wahrscheinlich die fehlende Expression von CD44v10 im Zellkompartiment der Milz zu einer Störung in der Granulopoese führt und dieser Defekt wiederum durch die erhöhte Granulopoese im Knochenmark kompensiert wird. Die durchflusszytometrischen Analysen der T-Zellpopulationen erfolgten anhand der Expression der Oberflächenmoleküle CD4 und CD8. Um die Zellpopulation der NK-T Zellen auszugrenzen, die ebenfalls das Oberflächenmolekül CD4 exprimieren (Bendelac, 1995; ERGEBNISSE 43 +/+ -/- Gr-1 A B 16,4% 4,2% 33,8% 41,2% 29,6% 56,6% MAC-1 ungefärbt Zellzahl ungefärbt ungefärbt ungefärbt CD3e CD4 C D C1Rq 9,6% 8,5% 23,7% 0,3% 21,1% 0,2% 69,8% 6,2% 72,2% 6,4% CD8 15,5% 21,4% 27% 19% B220 Abb. 4.2: Durchflusszytometrische Analyse der Zellpopulationen in der Milz von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-- (-/-) Tieren. Färbung vom Einzelzellsuspensionen aus der Milz von Wildtyp- und CD44v10-/--Mäusen mit fluorochrom-gekoppelten Ak. A: Anfärbung der Granulozytenpopulation (Mac-1+/Gr-1+). In CD44v10-/--Tieren ist die Anzahl an Granulozyten im Gegensatz zum Wildtyp um 6,9% reduziert. Die Mac-1-/Gr-1- Zellpopulation beinhaltet Lymphozyten, dendritische Zellen und NK-Zellen. Monozyten, Makrophagen und einige dendritische Zellen sowie NK-Zellen, die ebenfalls Mac-1 exprimieren können, befinden sich in der Mac-1+/Gr-1- Zellpopulation. B: Darstellung von ungefärbten und ERGEBNISSE 44 gefärbten Milzzellen. Positive Selektion der T-Zellen über CD3e-Ak (R2). C: Expressionsprofil CD3epositiv selektionierter CD4/CD8 markierter T-Zellen. D: Analyse der unreifen (R3) und reifen (R4) BZellpopulationen, die eine Verschiebung der reifen B-Zellen zugunsten der unreifen B-Zellpopulation in den CD44v10-/--Tieren zeigt. Die Zahlen im Kreuz geben die prozentuale Verteilung der einzelnen Zellpopulationen wieder. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel von vier unabhängigen Messungen. Shevach, 2000), wurden die zu analysierenden T-Zellpopulationen zuvor über einen spezifischen, gegen den T-Zellrezeptorkomplex gerichteten, CD3e-Antikörper positiv selektioniert (R2 in Abb. 4.2, B). Wie der Abbildung 4.2, C zu entnehmen ist, entspricht das Expressionsprofil der CD4 und CD8 T-Zellen in der Milz der CD44v10-defizienten Tieren dem der Wildtyp-Tiere. Bei der Analyse der B-Zellpopulation (Abb. 4.2 D) anhand der linienspezifischen Marker B220 und C1qRp (493) fiel jedoch bei den CD44v10-/--Tieren eine Verschiebung der reifen B-Zellen (B220+/C1qRp-; R4) zugunsten der unreifen B-Zellpopulation (B220+/C1qRp+; R3) auf. Dies könnte in Zusammenhang mit der Funktion der CD44v10Isoform als Signalmolekül in der B-Zell Reifung stehen (Rösel et al., 1999; s. Diskussion). Somit würde sich auch die in der Differentialblutbildanalyse beobachtete signifikante Reduktion der Lymphozyten in den CD44v10-/--Tieren erklären. Da im Falle der B-Zellen eine Kompensation durch das Knochenmark nicht nachgewiesen werden konnte (Abb. 4.1, B) ist davon auszugehen, dass durch die geringere Anzahl an reifen B-Zellen in der Milz auch weniger B-Zellen von dort aus in die Peripherie entlassen werden. 4.1.3 Thymus und Lymphknoten Veränderungen in der Entwicklung von Thymozyten spiegeln sich meist in einer Verschiebung des Mengenverhältnisses zwischen den einzelnen Subpopulationen im CD4/CD8 Bild wieder. Wie aus Abbildung 4.3 ersichtlich, kommt es durch die fehlende Expression der Isoform CD44v10 im Zellkompartiment des Thymus, im Gegensatz zu den vorangegangenen Untersuchungen, zu keiner nachweisbaren Veränderung in den CD4+ oder CD8+ Zellpopulationen. Während die Analyse der Thymozyten Aufschluss über entwicklungsbedingte Veränderungen gibt, können anhand isolierter Zellen aus den Lymphknoten insbesondere die reifen, sich in der Peripherie der Lymphe befindlichen T-Zellen, untersucht werden. Hierzu wurden, um eine ausreichende Anzahl an Zellen für die Analyse zu erhalten, Einzelzellsuspensionen der zervikalen, mandibularen, axilären und inguinalen Lymphknoten vereinigt (s. Kap. 3.3.1) und im Durchflusszytometer analysiert (s. Kap. 3.4.1). ERGEBNISSE 45 CD4 +/+ -/- 10,9% 83,4% 10,1% 81,3% 3,5% 2,2% 3,9% 4,7% CD8 Abb. 4.3: Expressionsprofil der CD4/CD8 T-Zellpopulationen im Thymus von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-- (-/-) Tieren. Färbung isolierter Thymozyten aus Wildtyp- und CD44v10-/--Mäusen mit anti-CD4 (APC) und antiCD8 (FITC) Ak nach positiver Selektion über die Expression von CD3e. Dargestellt ist die relative Verteilung der einzelnen Subpopulationen von CD4+, CD8+ und CD4+/CD8+ Zellen. Die prozentuale Verteilung der Populationen entsprechend den Quadranten ist im Kreuz angegeben. Gezeigt ist eine repräsentative Darstellung aus vier von einander unabhängigen Messungen. Die Ergebnisse der Analysen sind in Abbildung 4.4 wiedergegeben. Es ergab sich für die Zellpopulationen in den untersuchten Lymphknoten aus den Wildtyp-Tieren wie auch aus den CD44v10-/--Tieren ein Verhältnis der T- zu B-Zellen von ungefähr 70% zu 20%, wobei das Verhältnis der CD4 zu CD8 T-Zellen ca. 2:1 war. Diese Daten stehen auch im Einklang mit Untersuchungen von Foster et al. (2002). Ein direkter Vergleich der prozentualen Verteilung der CD4+ bzw. CD8+ T-Zellpopulation (Abb. 4.4, A) sowie der B220+/IgM+ B-Zellpopulation (Abb. 4.4, B) bestätigt noch einmal die unter Kap. 4.1.2 getroffene Annahme, dass die im Blutbild der CD44v10-defizienten Tiere bestehende signifikante Reduktion der Lymphozyten auf eine verminderte Anzahl an reifen B-Zellen in der Peripherie des Blutes zurück zuführen ist. Im nächsten Schritt wurde die Anzahl an Gedächtniszellen innerhalb der CD4 positiven T-Zellpopulation bestimmt, die durch das phänotypische Profil CD62Llow und CD44high gekennzeichnet sind (Sprent & Tough, 1994). Für die Analyse wurden zunächst aus den CD4/CD44/CD62L Tri-Colour angefärbten Zellen alle positiven CD4 T-Zellen ausgewählt (Abb. 4.5 A, R2) und anschließend die Expression von CD62L und CD44 untersucht (Abb. 4.5, B). Sowohl die Anzahl an CD62Lhigh/CD44low (R3) bzw. naiven TZellen, wie auch die Anzahl an Gedächtniszellen (CD62Llow/CD44high ; R4) in Wildtyp und CD44v10-defizienten Tieren unterschied sich nicht. ERGEBNISSE 46 A +/+ -/- CD4 53,3% 30% 2,6% 53,3% 3% 18,2% 25,7% 18% CD8 B 22,3% IgM 22,4% B220 Abb. 4.4: Darstellung der Lymphozytenpopulationen in den Lymphknoten von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-- (-/-) Tieren. Anfärbung der gewonnenen Einzelzellsuspensionen aus Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren mit fluorochrom-gekoppelten Ak. A: Differenzierte Analyse der T-Zellpopulation durch Anfärben mit antiCD4 (APC) und anti-CD8 (FITC) Ak. Das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ ist ca. 2:1. Die Zahlen im Kreuz geben die prozentuale Verteilung der einzelnen Populationen wieder. B: Darstellung der BZellpopulation im Lymphknoten über die Expression der Oberflächenmarker B220 (FITC) und IgM (PE). Ungefähr 20% der sich im Lymphknoten befindlichen Zellen stellen reife B-Zellen dar, ca. 70% die T-Zellen. Gezeigt ist eine exemplarische Messung aus vier unabhängigen Analysen. Zusammenfassend bleibt für die phänotypische Analyse der lymphatischen Organe festzuhalten, dass einerseits eine erhöhte Granulopoese im Knochenmark der CD44v10defizienten Tiere stattfindet, die zu einem signifikanten Anstieg der neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut führt. Andererseits konnte eine Verschiebung der reifenzugunsten der unreifen B-Zellpopulation in der Milz von CD44v10-/--Tieren beobachtet werden, was anscheinend zu einer signifikanten Reduktion der Lymphozytenpopulation in der Peripherie des Blutes führt. Bei allen weiteren, insbesondere für die Kontaktallergie (DTH) wichtigen Zellpopulationen (z. B. CD4- und CD8-Zellen), konnten keine Abweichungen in der Anzahl oder Verteilung innerhalb der analysierten Organe zwischen Wildtyp-Tieren und CD44v10-defizienten Tieren nachgewiesen werden. ERGEBNISSE 47 A -/- +/+ ungefärbt Zellzahl ungefärbt CD4 B 4,4% CD44 3,5% 69,8% 65,4% CD62L Abb. 4.5: Analyse der CD4+-Gedächtniszellen in den Lymphknoten von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-(-/-) Tieren. Dargestellt ist das CD44/CD62L-Expressionsprofil auf CD4 T-Zellen aus Wildtyp- und CD44v10-/-Mäusen. A: Selektion der CD4+-Zellpopulation durch anti-CD4 Ak (R2). B: Naive, ruhende T-Zellen weisen eine hohe CD62L-Expression bei gleichzeitig niedriger CD44-Expression auf (R3), während Gedächtniszellen das entgegengesetzte (CD62Llow/CD44high) Profil zeigen (R4). Die gezeigten Daten sind repräsentativ für vier von einander unabhängigen Analysen. 4.2 Funktionsanalyse der CD44v10-Isoform im Mausmodell der DTH Die DTH ist eine entzündliche Erkrankung bzw. allergische Reaktion der Haut vom verzögerten Typ (Typ IV; s. Kap. 1.3.9), die reproduzierbar und äußerst spezifisch durch Kontaktallergene ausgelöst werden kann. Im Zentrum dieser zellvermittelten Immunreaktion steht der T-Lymphozyt. Als Haupteffektorzellen der Reaktion dienen CD4+-und CD8+-Zellen (Th1-Zellen). Wie bereits in der Einleitung beschrieben, gibt es Hinweise darauf, dass die Isoform CD44v10 bei der Rekrutierung von aktivierten Leukozyten in die Haut eine derzeit noch unbekannte Funktion ausübt (Rösel et al., 1997; Seiter et al., 1998; Wagner et al., 1998). ERGEBNISSE 48 Daher bildeten den Schwerpunkt der Funktionsanalyse Untersuchungen am in vivo Modell der DTH. 4.2.1 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche führt in vivo zu einer signifikant supprimierten DTH-Reaktion Aus den Ergebnissen der phänotypischen Analyse der lymphatischen Organe (s. Kap. 4.1) ging hervor, dass beide Genotypen (CD44v10+/+ und CD44v10-/-) die gleiche Ausgangsbasis an immunkompetenten CD4- und CD8-Zellen für die Ausbildung einer DTH vorweisen. Bereits Rösel und Mitarbeiter (1997) konnten zeigen, dass die Blockade der CD44v10Isoform mit einem v10-spezifischen Antikörper zu einer supprimierten DTH-Reaktion in Wildtyp-Tieren führt. Aufgrund dieser Daten wurden von mir im ersten Schritt vergleichbare Untersuchungen im Mausmodell der DTH mit homozygoten CD44v10-defizienten Tieren durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die Tiere (10-12 Wochen alt) im Abstand von 24 Stunden mit dem Hapten 2,4-Dinitrofluorbenzen (0,5% DNFB in Aceton/Olivenöl) am Abdomen sensibilisiert und nach vier Tagen wiederholt mit einer 0,3%igen DNFB-Lösung am rechten Ohr behandelt. Als interne Kontrolle wurde das linke Ohr nur mit der Trägersubstanz (Aceton/Olivenöl) behandelt. Nach einem Zeitraum von 24 Stunden erfolgte die Messung der sich entwickelnden Ohrschwellung durch einen Abgleich der Schwellung des DNFB-behandelten Ohres gegenüber der internen Kontrolle, mittels eines Springkalibers (s. Kap. 3.1.3). Zunächst sollte der Einsatz verschiedener homozygoter CD44v-defizienter Mäuse im DTH-Modell Aufschluss über eine möglicherweise vorhandene Spezifität der CD44v10Isoform für kutane Reaktionen im Gegensatz zu anderen Spleißvarianten geben. Abbildung 4.6 zeigt das Reaktionsprofil der unterschiedlichen Genotypen CD44v6v7-/-, CD44v7-/-, CD44v10-/- und des Wildtyps. Wie erwartet bestätigten die ermittelten Messwerte, 24 Stunden nach Induktion der DTH-Reaktion, dass vor allem der Verlust der CD44v10-Isoform zu einer signifikant reduzierten Reaktionsantwort (p= 0,01; Mann-Whitney-Test) im Vergleich zum Wildtyp führt. Daher ist folgerichtig anzunehmen, dass die bereits in diesen ersten Versuchansätzen ermittelte signifikant verminderte Reaktionsbereitschaft der CD44v10defizienten Tiere im Vergleich zum Wildtyp und den CD44v6v7-/-- und CD44v7-/--Isoformen auf eine spezifische Funktion dieser varianten Isoform in kutanen Entzündungsreaktionen, wie der DTH, zurück zuführen ist. Da keine erkennbaren Unterschiede zwischen weiblichen und männlichen Tieren in der Ausbildung der Reaktionsstärke festgestellt werden konnten (Daten nicht gezeigt), wurden ERGEBNISSE 49 aufgrund der einfacheren Haltungsbedingungen für alle nachfolgenden Versuche nur noch weibliche Tiere verwendet. 25 Ohrschwellung (x10 -3cm) 20 15 * 10 5 0 wt CD44v7-/- CD44v6v7-/- CD44v10-/- Abb. 4.6: Bestimmung der Reaktionsbereitschaft verschiedener CD44v-Genotypen und des Wildtyps (wt) im Mausmodell der DTH. Die Tiere (vier pro Gruppe) wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit einer DNFB-Lösung (0,5% in Aceton/Olivenöl) am Abdomen und nach vier Tagen am rechten Ohr wiederholt mit einer DNFB-Lösung (0,3%) sensibilisiert. Das linke Ohr wurde zeitgleich, als interne Kontrolle, nur mit der Trägersubstanz (Aceton/Olivenöl) behandelt. Die Messung der Ohrschwellung erfolgte 24h nach Applikation der 0,3%igen DNFB-Lösung. Die gemessene Reaktionsstärke ergibt sich aus der Ohrschwellung des DNFB-behandelten Ohres abzüglich der Schwellung der internen Kontrolle. Die ermittelten Reaktionsstärken der CD44v6v7-/-- und CD44v7-/--Tiere zeigen, dass nur der Verlust der CD44v10-Isoform zu einer signifikant (*p= 0,01; Mann-Whitney-Test) reduzierten DTH-Reaktion im Vergleich zum Wildtyp führt. Dargestellt ist der Median einer beispielhaften Messung dreier unabhängiger Versuchsreihen mit Standardfehlerabweichung. Um genauere Hinweise über den Verlauf der DTH-Reaktion in den CD44v10-defizienten Tieren zu erlangen, wurden im Gegensatz zu den ersten Versuchsansätzen die Messungen der Hauptversuchsreihe über einen Zeitraum von 192 Stunden erhoben. Interessanterweise führt der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche in den ersten 48 Stunden, d. h. innerhalb der maximalen Reaktionszeit der DTH (als Übersicht s. Black, 1999), zu einer signifikant (24h p= 0,01; 48h p= 0,04; Mann-Whitney-Test) supprimierten DTH-Reaktion (Abb. 4.7, A). Zur Bestimmung der basalen Reaktionsstärke wurden, ergänzend zu der internen Kontrolle, im Hauptversuch zusätzlich Kontrolltiere mit einbezogen. Diese Gruppe wurde vorab nicht mit einer DNFB-Lösung am Abdomen sensibilisiert sondern zeitgleich mit den Versuchstieren am Ohr mit der DNFB-Lösung behandelt. Die Kontrolltiergruppen beider Genotypen zeigten einen vergleichbaren Reaktionsverlauf, welcher bis 120 Stunden nach Induktion der DTH deutlich unter der Reaktionsstärke der Versuchstiergruppen lag (Abb. 4.7, A+B). ERGEBNISSE 50 Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Expression der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche im Verlauf einer DTH-Reaktion von Bedeutung ist. Die hier durchgeführten Studien deuten zudem an, dass das CD44v10-Molekül eher in der initialen Phase der DTHReaktion relevante Funktionen ausübt, da die Abklingphase der Reaktion nicht durch den Verlust der CD44v10-Isoform beeinflusst wird (Abb. 4.7, A+B). A CD44v10-/33 Ohrschwellung (x10 -3 cm) 30 27 24 21 * 18 ** 15 12 9 6 3 0 0 12 24 48 72 96 120 144 168 192 168 192 Stunden Kontrollgruppe B Versuchsgruppe Wildtyp 33 Ohrschwellung (x10 -3 cm) 30 27 24 21 18 15 12 9 6 3 0 0 12 24 48 72 96 120 144 Stunden Kontrollgruppe Versuchsgruppe Abb. 4.7: Der Verlust der CD44v10-Isoform führt in vivo zu einer signifikant supprimierten DTHReaktion in CD44v10-/--Tieren. Die Versuchstiere (sechs pro Gruppe) wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit einer DNFB-Lösung (0,5% in Aceton/Olivenöl) am Abdomen sensibilisiert und nach vier Tagen am rechten Ohr wiederholt mit einer DNFB-Lösung (0,3%) behandelt. Das linke Ohr wurde gleichzeitig, als interne Kontrolle, nur mit der Trägersubstanz (Aceton/Olivenöl) behandelt. Kontrolltiere (vier pro Gruppe) wurden nicht am Abdomen sensibilisiert aber zeitgleich mit den Versuchstieren am Ohr. Die gemessene Reaktionsstärke ergibt sich aus der Ohrschwellung des DNFB-behandelten Ohres abzüglich der Schwellung der internen Kontrolle. Die ermittelten Reaktionsstärken der Kontrolltiergruppen verlaufen nahezu identisch. CD44v10-/--Tiere (A) zeigen im Vergleich zum Wildtyp (B) innerhalb der ersten 24h und 48h eine signifikant reduzierte Reaktionsantwort (*p= 0,01; **p= 0,04; Mann-Whitney-Test). Dargestellt ist der Median einer exemplarischen Messung von fünf unabhängigen Versuchsreihen mit Standardfehlerabweichung. ERGEBNISSE 51 4.2.2 Gewebeschnitte der Ohren von sensibilisierten CD44v10-defizienten Tieren weisen eine Reduktion des inflammatorischen Zellinfiltrats auf Bei der DTH handelt es sich um eine allergische, epidermale Hautreaktion, die durch die Ausbildung eines lokalen Ödems (Auflockerung des Bindegewebes durch die Ansammlung wässriger Flüssigkeit in den Gewebespalten) und die Ansammlung infiltrierender mononukleärer Zellen im Bereich der Epidermis und Dermis (als Übersicht s. Black, 1999) charakterisiert ist. Um detailliertere Anhaltspunkte über einen möglichen Funktionsmechanismus von CD44v10 zu erhalten, wurden Paraffingewebeschnitte (s. Kap. 3.2.3) der Ohren zu verschiedenen Zeitpunkten nach Induktion der DTH-Reaktion angefertigt und für eine histologische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin (HE) angefärbt (s. Kap. 3.2.5). Wie erwartet führt die fehlende Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche ebenso wie der Einsatz von spezifischen anti-CD44 Antikörpern im Tiermodell der DTH zu einer reduzierten Ausbildung eines lokalen Ödems und einem verringerten zellulären Infiltrat. Das Ohrgewebe des Wildtyps (Abb. 4.8, A) ist im Gegensatz zum Ohrgewebe der CD44v10-/-Tiere (Abb. 4.8, B) stark ödematisiert und von zahlreichen Zellen infiltriert, was zu einer Auflockerung des Bindegewebes und einer daraus resultierenden Ausdehnung der Dermis führt, infolgedessen es zu einer verstärkten Anschwellung des Ohres kommt. Vergleichbare Beobachtungen wurden auch an Schnittpräparaten der Ohren gemacht, die 48 Stunden nach Induktion der DTH angefertigt wurden (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der Gewebeschnitte, 72 Stunden nach Beginn der DTH-Reaktion, ergab jedoch ein völlig anderes Bild. Hier konnten nur noch geringfügige Unterschiede in Bezug auf die Größe des Ödems und der Größe des Zellinfiltrats zwischen den Ohrpräparaten des Wildtyps und der CD44v10defizienten Tiere beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Die Gewebeschnitte (Abb. 4.8, C + D) der internen Kontrollen verdeutlichen noch einmal, dass die DTH DNFB-spezifisch ist und die Trägersubstanz alleine nicht in der Lage ist, in sensibilisierten Tieren eine DTH-Reaktion zu induzieren. Des Weiteren wird anhand der Schnittpräparate der Kontrolltiergruppen (Abb. 4.8, E + F) deutlich, dass ohne eine vorangegangene Sensibilisierung der Tiere eine DTH-Reaktion nicht ausgelöst werden kann. Diese Daten belegen, dass das Oberflächenmolekül CD44v10 durch derzeit noch unbekannte Interaktionen in die Rekrutierung von immunkompetenten Effektorzellen in die Haut involviert ist. ERGEBNISSE 52 e Zellinfiltrat Epidermis f -/- +/+ Ödem A B Dermis B Knorpel Keratinschicht 0,1 mm 0,1 mm C D 0,1 mm 0,1 mm E 0,1 mm F 0,1 mm Abb. 4.8: Hämatoxylin und Eosin gefärbte Ohrgewebeschnitte einer DTH-Läsion 24h nach Induktion von Wildtyp- (+/+) und CD44v10-/-- (-/-) Tieren. Lichtmikroskopische Aufnahmen von Schnittpräparaten des Wildtyps (A, C, E) und CD44v10-/--Tieren (B, D, F) in 10-facher Vergrößerung. In der HE-Färbung stellen sich alle basophilen Zell- und Gewebestrukturen (Knorpel u. Zellkerne) blau dar, die übrigen azidophilen Bestandteile wie zytoplasmatische Bereiche und das Bindegewebe in verschiedenen Rotabstufungen. Das Gewebe des, mit DNFB sensibilisierten, wt-Ohres (A) ist im Gegensatz zum CD44v10-/--Gewebe (B) im Bereich der Dermis stark ödematisiert und weist ein deutlich ausgedehnteres Zellinfiltrat auf. Gewebeschnitte (C + D) der internen Kontrollen (Behandlung nur mit der Trägersubstanz Aceton/Öl) zeigen, dass die Trägersubstanz alleine nicht in der Lage ist in sensibilisierten Tieren eine DTH-Reaktion zu induzieren. Die Schnittpräparate der Kontrolltiergruppen (E + F) verdeutlichen noch einmal, dass ohne eine zuvor erfolgte Sensibilisierung der Tiere eine Induktion der DTH nicht möglich ist. ERGEBNISSE 53 4.2.3 Bei CD44v10-defizienten Tieren ist die Infiltration der Granulozyten in das inflammatorische Ohrgewebe in den ersten 24 Stunden verzögert Aus den präsentierten Ergebnissen der Hämatoxylin/Eosin–Studie an Gewebeschnitten der Ohren ging hervor, dass die Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche essentiell für die Rekrutierung von Effektorzellen in der initalen Phase einer DTH-Reaktion ist. Die Population der neutrophilen Granulozyten gehört zu den ersten Zellarten, die in der initialen Phase einer DTH-Reaktion in das Gewebe einwandern (Buchanan et al., 1997; Sebastiani et al., 2002). Zudem konnte in vorangegangenen Untersuchungen gezeigt werden, dass der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche Veränderungen in der Anzahl an Granulozyten im peripheren Blut verursacht (s. Kap. 4.1.1). Es stellte sich demnach die Frage, ob es mögliche Unterschiede in der Anzahl an rekrutierten Granulozyten in den entzündlichen zellulären Infiltraten der Ohren von CD44v10-defizienten und Wildtyp-Tieren gibt. Zur Klärung der Fragestellung war es daher wichtig die Verteilung bzw. die Anzahl an Granulozyten in den Zellinfiltraten zu analysieren. Für die spezifische Anfärbung der Granulozyten (s. Kap. 3.2.6) wurden Paraffinschnitte des Ohrgewebes zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der DTHReaktion angefertigt. Die Auswertung der Schnittpräparate erfolgte mit dem Lichtmikroskop durch Auszählen der ASDCL-angefärbten Granulozyten innerhalb einer definierten Fläche von 0,3 mm2. Tab. 4.2: Auszählung ASDCL-angefärbter Granulozyten in Paraffinschnitten des Ohrgewebes von Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren während der DTH-Reaktion. Die Auszählung der angefärbten Granulozyten erfolgte innerhalb einer definierten Fläche von 0,3 mm2. CD44v10-/--Tiere zeigen 12h nach Induktion der DTH-Reaktion eine signifikant (*p= 0,014; Mann-Whitney-Test) reduzierte Anzahl an Granulozyten. Angegeben ist jeweils der Mittelwert einer 5-fachen Bestimmung einer repräsentativen Auszählung von insgesamt zwei Experimenten. Tiere 12h Versuchstier 50551 92,6 ± 30,1 12h Kontrolltier 24h Versuchstier 39,3 ± 5,5* 145 ± 20,1 48h Versuchstier 39,3 ± 5,5* 20,2 ± 2 24h Kontrolltier 12,2 ± 2,9 128 ± 23 26,5 ± 5,9 125,4 ± 26,7 48h Kontrolltier 72h Versuchstier CD44v10-/- wt 3,8 ± 1,5 122,8 ± 32,2 3,5 ± 0,5 118 ± 26,1 4,4 ± 3,2 105 ± 21,1 ERGEBNISSE 54 In der immunhistologischen Analyse konnte ein verzögerter Einstrom der Granulozyten in den ersten 24 Stunden in das Ohrgewebe der CD44v10-defizienten Tieren beobachtet werden (Tab. 4.2). 12 Stunden nach Induktion der DTH-Reaktion ist eine um 63,8% signifikant (p= 0,014; Mann-Whitney-Test) reduzierte Anzahl an Granulozyten im Zellinfiltrat innerhalb des Ohrgewebes der CD44v10-/--Tiere vorzufinden. Nach 24 Stunden verringert sich diese Differenz auf nur noch 21,7%. Dies lässt die Vermutung zu, dass CD44v10 in primäre Adhäsionsmechanismen, bei der Migration der Granulozyten in die Haut, involviert ist. Im weiteren Verlauf der Reaktion scheint dieser Defekt durch sekundäre Adhäsionsmechanismen kompensiert zu werden, da in den Schnittpräparaten der 48 und 72 Stundenwerte nur noch geringfügige Unterschiede zwischen Wildtyp und CD44v10-/--Tieren bezüglich der Anzahl an infiltrierten Granulozyten im Ohrgewebe nachgewiesen werden konnten. 4.2.4 Charakterisierung spezifischer Aktivierungs- und Adhäsionsmarker auf Zellen des inflammatorischen Ohrinfiltrats Die Kreuzvernetzung von CD44 mit anti-CD44 Antikörper auf der Zelloberfläche von Fibroblasten-ähnlichen Synovialzellen aus Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis führt in vitro zu einer autokrinen Hochregulierung des Adhäsionsmoleküls VCAM-1 (als Übersicht s. Naor & Nedvetzki, 2003). Daher war es im Weiterem wichtig zu analysieren, ob es durch die Abwesenheit von CD44v10 auf der Zelloberfläche zu einem veränderten Expressionsprofil weiterer Adhäsions- und Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche der infiltrierten Effektorzellen und der antigenpräsentierenden Zellen kommt. Hierzu wurden Einzelzellsuspensionen aus dem inflammatorischen Ohrgewebe gewonnen (s. Kap. 3.3.1), mit fluorochrom-gekoppelten Antikörpern angefärbt (s. Kap. 3.4.1) und durch FACS-Analysen die Expression verschiedener Adhäsions- und Aktivierungsmarker analysiert. Zunächst wurde die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle auf CD3+/CD4+ und CD3+/CD8+ T-Zellen untersucht. In Abbildung 4.9 sind die zusammengefassten Ergebnisse repräsentativer Analysen der Oberflächenmarker CD62L (L-Selektin) und CD69 mehrerer unabhängiger Versuchsreihen mit jeweils 4 Tieren dargestellt. CD62L vermittelt als Adhäsionsmolekül im Falle einer Inflammation den ersten Kontakt zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel (Springer, 1994). Vergleichende Untersuchungen des Expressionsprofils von CD62L auf den CD3+/CD4+ und CD3+/CD8+ T-Zellen (Abb. 4.9, A+B) aus Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren zeigten in Hinblick auf die Expressionsstärke des Moleküls keine nachweisbaren Differenzen. Ähnliches gilt für CD69, einem frühen Aktivierungsmarker auf T-Zellen (Jenkins et al., 2001), der insbesondere auf infiltrierenden ERGEBNISSE 55 inflammatorischen Th1-Zellen exprimiert wird (Abb. 4.9, C+D). Bei keinem der weiterhin analysierten Adhäsions- und Aktivierungsmarker (CD28, CD44, CD95 (FAS) und CD134 (Ox-40)) konnte ein eindeutiger Unterschied zwischen Wildtyp- und CD44v10-defizienten Zellen detektiert werden (Daten nicht gezeigt). CD4+ T-Zellen CD8+ T-Zellen A B CD62L-Expression 45 45 40 40 35 35 % positive Zellen % positive Zellen CD62L-Expression 30 25 20 15 10 30 25 20 15 10 5 5 0 0 6 12 24 48 6 12 Stunden wt v10-/- wt 48 v10-/- D C CD69-Expression CD69-Expression 25 25 20 20 % positive Zellen % positive Zellen 24 Stunden 15 10 5 15 10 5 0 0 6 12 24 Stunden wt 48 6 12 24 48 Stunden v10-/- wt v10-/- Abb. 4.9: Expressionsprofil des Adhäsionsmoleküls CD62L und des frühen Aktivierungsmarkers CD69 auf T-Zellen von Wildtyp- (wt) und CD44v10-/--Tieren im Verlauf einer DTH-Reaktion. Die TZellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten auf der x-Achse aus den Einzelzellsuspensionen des Ohres gewonnen, mittels der Marker CD3/CD4 und CD3/CD8 positiv selektioniert und auf die Expression von CD62L und CD69 untersucht. A: Zeitabhängige Expression von CD62L auf CD4 TZellen. B: Zeitabhängige Expression von CD62L auf CD8 T-Zellen. In beiden Analysen konnten keine Differenzen in der Expressionsstärke des Moleküls auf Wildtyp- und CD44v10-/--Zellen beobachtet werden. C: Zeitabhängige Expression von CD69 auf CD4 T-Zellen. D: Zeitabhängige Expression von CD69 auf CD8 T-Zellen. Dargestellt ist der Median mehrerer unabhängiger Versuchreihen mit jeweils 4 Tieren. ERGEBNISSE 56 Epidermale Langerhans-Zellen und Makrophagen stellen die antigenpräsentierenden Zellen einer DTH-Reaktion dar (s. Kap. 1.3.9). Durch die Expression verschiedener kostimulatorischer Moleküle und die Sekretion von Zytokinen sorgen sie für die Aufrechterhaltung der Immunreaktion. Deswegen wurde im Folgenden auch die Expression unterschiedlicher Adhäsions- und Aktivierungsmarker auf diesen Zellpopulationen betrachtet. Wildtyp sowie CD44v10-defiziente CD11b+/F4-80+-Makrophagen und CD205+/CD11c+-Langerhans-Zellen wiesen einen vergleichbaren Expressionsverlauf der MHC-Klasse-I-Moleküle (Abb. 4.10, A+B) und MHC-Klasse-II-Moleküle auf (Daten nicht gezeigt). Zudem konnte eine ansteigende Expression an MHC-Klasse-I-Molekülen in Abhängigkeit von der Zeit beobachtet werden, was auf eine intakte Antigenpräsentation der Langerhans-Zellen und Makrophagen in CD44v10-defizienten und Wildtyp-Tieren schließen lässt. Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche der Makrophagen und Langerhans-Zellen führte zu keiner signifikanten Veränderung des Expressionsprofils der kostimulierenden Aktivierungsmarker der TNF-Familie CD40 und CD134L (Ox40-Ligand). Diese beiden Oberflächenmoleküle waren insofern von Interesse, da CD40 sowie CD134L als ko-stimulierende Moleküle auf Makrophagen bzw. Langerhans-Zellen, ähnlich CD28 auf TZellen, durch Bindungen an CD40L (T-Zellen) wie auch CD134 (T-Zellen) die Produktion von Zytokinen und die Expression weiterer Adhäsionsmoleküle auf T-Zellen induzieren können. Für alle nachfolgenden analysierten Adhäsions- und Aktivierungsmarker (CD44, CD54 (ICAM-1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD95 (FAS)) konnten vergleichbare Ergebnisse ermittelt werden (Daten nicht gezeigt). Es kann daher weitestgehend ausgeschlossen werden, dass der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche einen Einfluss auf die Expressionsstärke der untersuchten Adhäsionsund Aktivierungsmarker hat. ERGEBNISSE 57 Langerhans-Zellen Makrophagen A B MHC-Klasse-I-Molekül-Expression 20 20 18 18 16 16 14 14 % positive Zellen % positive Zellen MHC-Klasse-I-Molekül-Expression 12 10 8 6 12 10 8 6 4 4 2 2 0 0 6 12 24 48 6 12 Stunden wt v10-/- wt C v10-/- CD134L-Expression 20 20 18 18 16 16 14 14 % positive Zellen % positive Zellen 48 D CD134L-Expression 12 10 8 6 12 10 8 6 4 4 2 2 0 0 6 12 24 6 48 12 wt 24 48 Stunden Stunden v10-/- wt E v10-/- F CD40-Expression CD40-Expression 20 20 18 18 16 16 14 14 % positive Zellen % positive Zellen 24 Stunden 12 10 8 6 12 10 8 6 4 4 2 2 0 0 6 12 24 Stunden wt 48 6 12 24 48 Stunden v10-/- wt v10-/- Abb. 4.10: Expressionsprofil der MHC-Klasse-I-Moleküle und der Aktivierungsmarker CD134L und CD40 auf Makrophagen und Langerhans-Zellen von Wildtyp- (wt) und CD44v10-/--Tieren im Verlauf einer DTH-Reaktion. Makrophagen und Langerhans-Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten auf der x-Achse aus den gewonnenen Einzelzellsuspensionen des Ohres über FACSAnalysen positiv selektioniert und anschließend auf die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, CD134L und CD40 untersucht. A: Zeitabhängige Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf Makrophagen. B: Zeitabhängige Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf Langerhans-Zellen. Wildtyp- sowie CD44v10-/--Zellen weisen einen vergleichbaren Expressionsverlauf von MHC-Klasse-IMolekülen auf. C: Zeitabhängige Expression von CD134L auf Makrophagen. D: Zeitabhängige Expression von CD134L auf Langerhans-Zellen. E: Zeitabhängige Expression von CD40 auf ERGEBNISSE 58 Makrophagen. F: Zeitabhängige Expression von CD40 auf Langerhans-Zellen. CD44v10-/-Makrophagen und Langerhans-Zellen zeigen einen gleichbleibenden Expressionsverlauf von CD134L und CD40. Dargestellt ist der Median mehrerer unabhängiger Versuchreihen mit jeweils 4 Tieren. 4.2.5 CD44v10-defiziente Zellen sezernieren signifikant mehr IL-1b Es hat sich in verschiedenen Studien gezeigt, dass durch die Kreuzvernetzung des CD44Moleküls auf der Zelloberfläche in vitro die Sekretion von verschiedenen Zytokinen induzieren werden kann (als Übersicht s. Naor et al., 1997). Dies führte zu der Überlegung, ob das CD44v10-Molekül die Migration der Granulozyten in die Haut möglicherweise durch Interaktionen, die die Induktion oder Inhibierung von Zytokinen betreffen, steuern könnte. Zur Klärung der Fragestellung wurde ein zeitabhängiges Expressionsprofil der für eine DTH-Reaktion charakteristischen Zytokine IL-1b, IL-2, IFN-g, TNF-a und des Chemokins RANTES erstellt. Der Gehalt an sezernierten Zytokinen innerhalb des inflammatorischen Bereiches wurde im ELISA-Sandwich-Verfahren (s. Kap. 3.5.2) in zellfreien Überständen des homogenisierten Ohrgewebes bestimmt. Die Quantifizierung der Zytokin-Konzentrationen erfolgte über eine Verdünnungsreihe mit dem jeweiligen rekombinanten Zytokin. Die Analyse ergab, dass Wildtyp-Zellen im Vergleich zu CD44v10-defizienten Zellen eine relativ, jedoch nicht signifikant, erhöhte Menge an TNF-a im Verlauf der DTH-Reaktion sezernieren (Abb. 4.11, A). Interessanterweise zeigen aber Studien an humanen Monozyten, dass die Sekretion von TNF-a durch immobilisierte anti-CD44 Antikörper stimuliert werden kann (Webb et al., 1990). Dies lässt die Vermutung zu, dass die CD44v10-Isoform möglicherweise in der Signalgebung der TNF-a Sekretion involviert ist. Erste Hinweise hierfür lieferten bereits die Ergebnisse der Granulozytenanalyse innerhalb des inflammatorischen Infiltrats (s. Kap. 4.2.3), in denen eine verzögerte Migration der Granulozytenpopulation beobachtet werden konnte, die unter anderem durch die Sekretion von TNF-a rekrutiert wird (Girolomoni et al., 2001). Die Sekretion an IL-2 erreicht 12 bis 24 Stunden nach Beginn der DTH-Reaktion, sowohl bei Wildtyp-Zellen als auch bei CD44v10-defizienten Zellen, das Maximum. Signifikante Unterschiede in der sezernierten Menge an IL-2 im Infiltrat konnten nicht festgestellt werden (Abb. 4.11, B). Vergleichbare Ergebnisse zeigten auch die Analysen des Chemokins RANTES (Daten nicht gezeigt). Obwohl im Falle des Zytokins IFN-g die CD44v10-defizienten Zellen deutlich mehr IFN-g freisetzen als die Wildtyp-Zellen, ist die sezernierte Menge an IFN-g aus CD44v10defizienten gegenüber den Wildtyp-Zellen nicht signifikant (Abb. 4.11, D). ERGEBNISSE 59 B A TNF-alpha IL-2 80 2500 70 60 pg/g Ohrgewebe pg/g Ohrgewebe 2000 1500 1000 50 40 30 20 500 10 0 0 0 2 4 6 12 24 48 0 72 2 4 12 Stunden wt wt v10-/- C 24 48 72 48 72 v10-/- D IL-1-beta IFN-gamma 10000 1600 * 9000 1400 8000 1200 7000 pg/g Ohrgewebe pg/g Ohrgewebe 6 Stunden 6000 5000 4000 3000 1000 800 600 400 2000 200 1000 0 0 0 2 4 6 12 24 48 72 0 2 4 6 12 Stunden Stunden wt wt v10-/- 24 v10-/- Abb. 4.11: Vergleichendes Zytokinprofil im Verlauf einer DTH-Reaktion im Ohrgewebe von Wildtyp(wt) und CD44v10-/--Tieren. Der Gehalt an sezernierten Zytokinen im inflammatorischen Bereich der Ohren von Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren wurde mit Hilfe des ELISA-Sandwich Verfahrens in zellfreien Überständen des homogenisierten Ohrgewebes zu unterschiedlichen Zeitpunkten quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte von fünf unabhängigen Messungen mit Standardfehlerabweichungen. A: Wt-Zellen sezernieren im Vergleich zu CD44v10-/--Zellen eine relativ erhöhte Menge an TNF-a im Verlauf der DTH. B: Wildtyp- und CD44v10-/--Zellen sezernieren vergleichbare Mengen an IL-2. C: Die Sekretion von IL-1b aus CD44v10-/--Zellen ist, 24 Stunden nach Induktion der DTH-Reaktion, signifikant (*p= 0,016; Mann-Whitney-Test) erhöht. D: CD44v10-/--Zellen setzen 24 Stunden nach Beginn der Reaktion mehr IFN-g frei als Wildtyp-Zellen. Die sezernierte Menge an IFN-g ist jedoch nicht signifikant erhöht. Im Gegensatz dazu ergab die Überprüfung der IL-1b Sekretion, dass 24 Stunden nach Induktion der DTH-Reaktion CD44v10-defiziente Zellen signifikant (p= 0,016; MannWhitney-Test) mehr IL-1b freisetzen als Wildtyp-Zellen (Abb. 4.11, C). Dies steht im ERGEBNISSE 60 Gegensatz zu Ergebnissen von Webb et al. (1990) und Haegel-Kronenberger et al. (1998), die eine Induktion der IL-1b Sekretion durch anti-CD44- oder anti-CD44v9 Antikörper in humanen Monozyten und in von Monozyten abstammenden dendritischen Zellen zeigen. Die signifikant erhöhte IL-1b-Sekretion aus CD44v10-defizienten Zellen könnte demnach ein Indiz dafür sein, dass CD44v10 eine wichtige Rolle bei der Regulation der Expression und Sekretion dieses Zytokins aus Zellen, wie den Monozyten oder Langerhans-Zellen, spielen könnte. 4.3 Proliferatives und apoptotisches Verhalten CD44v10defizienter Zellen Zwei grundlegende und zugleich wichtige Prozesse, die unter anderem eine Immunantwort regulieren, sind die Proliferation und der programmierte Zelltod (Apoptose) immunkompetenter Zellen. Aus Studien von McKallip und Mitarbeitern (2002) geht hervor, dass Lymphknotenzellen, deren CD44-Gen vollständig deletiert wurde, eine gesteigerte und verlängerte Proliferationsantwort nach Restimulation mit Staphylokokken-Enterotoxin A zeigen. Anderen Publikationen zufolge, schütz der Verlust des CD44-Moleküls Zellen vor dem aktiv induzierten Zelltod (Chen et al., 2001; Fujita et al., 2002). Aufgrund dieser Daten sollte im nächsten Schritt überprüft werden, inwieweit die fehlende Expression der CD44v10Isoform die proliferativen und apoptotischen Eigenschaften der Zellen während einer Immunreaktion verändert. 4.3.1 CD44v10-defiziente Lymphozyten zeigen im Gegensatz zu WildtypZellen in vitro eine gesteigerte Proliferationsrate Die Tatsache, dass die klonale Expansion aktivierter, antigenspezifischer T-Zellen eine essentielle Voraussetzung für eine erfolgreiche Immunantwort ist, führte zu der Fragestellung, ob als mögliche Ursache, neben der verzögerten Migration der Granulozyten, für die supprimierte DTH-Reaktion ein verändertes proliferatives Verhalten der CD44v10defizienten Zellen in Frage kommt. In in vitro Systemen kann die Stimulation naiver T-Zellen und die daraus resultierende klonale Expansion der Zellen durch die Kreuzvernetzung des TCR/CD3-Rezeptorkomplexes mit spezifischen Antikörpern simuliert werden. Daher wurden zur Beantwortung der Fragestellung Lymphozyten und Milzzellen aus Wildtyp- und CD44v10-defizienten Tieren ERGEBNISSE 61 mit unterschiedlichen Konzentrationen an immobilisierten anti-CD3e Antikörpern stimuliert (s. Kap. 3.3.2) und die Proliferationsrate der Zellen mit Hilfe des MTT-Proliferationstestes bestimmt (s. Kap. 3.3.3). B A Milzzellen Lymphknotenzellen 20 40 18 35 16 * 30 Zellzahl x10 5 14 Zellzahl x10 5 * 12 10 8 6 25 20 15 10 4 5 2 0 0 0 5 7,5 10 µg/ml anti-CD3 wt v10-/- 25 50 0 5 7,5 10 25 50 µg/ml anti-CD3 wt v10-/- Abb. 4.12: Bestimmung der Proliferationsrate von Wildtyp- (wt) und CD44v10-/--Zellen nach Stimulation mit anti-CD3e Ak in vitro. Isolierte Lymphknoten- und Milzzellen aus Wildtyp- und CD44v10-/-Tieren wurden mit verschiedenen Konzentrationen an anti-CD3e Ak stimuliert. Nach 48 Stunden in Kultur wurde MTS dazugegeben und die Intensität der entstandenen Färbung als Maß für die Proliferation gemessen. Die Absorption unbehandelter Zellen wurde gleich der Ausgangszahl von 200.000 Zellen gesetzt. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch dreier unabhängiger Experimente. Angegeben sind die Mittelwerte einer Dreifachbestimmung mit Standardfehlerabweichung mehrerer unabhängiger Versuchreihen. A: Vergleich der Proliferationsrate von Milzzellen aus Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren. B: Proliferationsrate von Lymphknotenzellen aus Wildtyp- und CD44v10-/--Tieren. CD44v10-/--Zellen zeigen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen bei einer Konzentration von 7,5 und 10 µg/ml an anti-CD3e Ak eine signifikant (*p= 0,014; Mann-Whitney-Test) gesteigerte Proliferationsrate. Durch den Verlust von CD44v10 kommt es nach spezifischer Aktivierung über den TZellrezeptor zu keinen nachweisbaren Veränderungen im proliferativen Verhalten von Milzzellen (Abb. 4.12, A). Diese Beobachtungen stehen in Übereinstimmung mit Daten anderer Arbeitsgruppen (s. z. B. Chen et al., 2001). Interessanterweise führte die Stimulation der Lymphozyten jedoch zu einer signifikant (*p= 0,014; Mann-Whitney-Test) gesteigerten Proliferationsrate der CD44v10-defizienten Lymphozyten bei einer Konzentration von 7,5µg/ml und 10 µg/ml an anti-CD3e Antikörper (Abb. 4.12, B). Eine Erklärungsmöglichkeit hierfür wäre, dass CD44v10 überwiegend in Proliferationsmechanismen, die die T-Zellen betreffen, involviert ist. Dafür sprechen auch die Daten der Analyse der Zellpopulationen aus den Lymphknoten, die zeigten, dass 70% der Zellen T-Zellen sind (s. Kap. 4.1.3). Die ERGEBNISSE 62 Induktion der Proliferation in CD44v10-defizienten Lymphozyten ist jedoch bei einer Stimulation der Zellen mit höheren Antikörperkonzentrationen rückläufig Zusammenfassend kann aus diesen Ergebnissen geschlossen werden, dass neben der CD44-Standardisoform (Föger et al., 2000) auch die variante Isoform CD44v10 möglicherweise relevante Funktionen als „Bystander-Rezeptor“ in der Signalkaskade der CD3-induzierten Proliferationen auf T-Zellen ausübt (s. Diskussion). 4.3.2 CD44v10-defiziente Tiere weisen in situ eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen innerhalb des inflammatorischen Bereiches des Ohres auf Eine erhöhte klonale Expansion oder die Hyperaktivität von T-Zellen führt meist zu einer gezielten Eliminierung (Apoptose) dieser Zellen, um die Aufrechterhaltung der immunologischen Homöostase im Organismus zu gewährleisten. Da die Daten der Proliferationsstudie zeigten, dass CD44v10-defiziente Zellen nach Stimulation über den TCR/CD3-Rezeptor verstärkt proliferieren und verschiedene Publikationen belegen, dass die Signalgebung durch das CD44-Standardmolekül Zellen vor einer gezielten Apoptose schützen kann (Ayroldi et al., 1995; Bates et al., 1998), wurde im nachfolgenden die apoptotische Aktivität innerhalb der inflammatorischen Läsionen untersucht. Der charakteristische Abbau der DNA in apoptotischen Zellen bildet die Grundlage für deren Identifizierung in situ. Ein mögliches Verfahren hierfür ist der TUNEL-Assay („TdT-dependent dUTP nick end labeling“). Dabei fügt ein Enzym, die terminale Desoxyribonukleotidyl-Transferase (TdT), FITC-markierte Nukleotide an die freien 3’-OHEnden der entstandenen DNA-Fragmente an. Mittels der konfokalen „Laser Scanning Mikroscopie“ können die TUNEL-positiven fluoreszierenden Zellen detektiert werden (s. Kap. 3.2.7). Für den TUNEL-Assay wurden Gefrierschnitte des Ohrgewebes (s. Kap. 3.2.2) zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Verlauf der DTH-Reaktion angefertigt. Wie erwartet konnte im Ohrgewebe der CD44v10-defizienten Tiere (Abb. 4.13, A), 48 Stunden nach Induktion der DTH-Reaktion, eine eindeutig erhöhte Anzahl an positiven bzw. apoptotischen Nuklei im Gegensatz zum Wildtyp (Abb. 4.13, B) beobachtet werden. ERGEBNISSE 63 A CD44v10-/- B wt 0,1 mm 0,1 mm C D 0,1 mm 0,1 mm E 0,1 mm Abb. 4.13: Nachweis apoptotischer Zellen in situ im Ohrgewebe von Wildtyp- (wt) und CD44v10-/- Tieren. Dargestellt sind TUNEL-Anfärbungen von Gefriergewebeschnitten der Ohren 48h nach Induktion der DTH-Reaktion in 10-facher Vergrößerung. CD44v10-/--Tiere (A) zeigen im Gegensatz zum Wildtyp (B) eine erhöhte Rate an apoptotischen Nuklei bzw. Zellen innerhalb der inflammatorischen Region. (C) CD44v10-/- und Wildtyp (D) Negativkontrollen derselben Schnittpräparate (A+B) nur mit TUNELReagenz inkubiert ohne TdT. (E) TUNEL-Positivkontrolle eines zusätzlich mit DNAse-I behandelten Schnittes eines DNFB-unbehandelten Kontrolltieres. ERGEBNISSE 64 In Abbildung 4.13, C (CD44v10-/-) und 4.13, D (Wildtyp) sind die jeweiligen Negativkontrollen von Schnittpräparaten des selben Gewebes (A und B) dargestellt. Abbildung 4.13 E zeigt als Positivkontrolle einen Gewebeschnitt eines DNFB-unbehandelten Wildtyp-Tieres, der vor der eigentlichen TUNEL-Reaktion zusätzlich mit DNAse-I behandelt worden war. Aus den Daten geht hervor, dass die supprimierte DTH-Antwort in den CD44v10defizienten Tieren nicht nur Folge einer verzögerten Migration der Granulozyten (s. Kap. 4.2.3) sowie eines veränderten Zytokinprofils (s. Kap. 4.2.5) ist, sondern auch auf einer erhöhten apoptotischen Aktivität innerhalb des inflammatorischen Bereiches beruht. Zudem verdeutlichen die Ergebnisse in welchem komplexen Zusammenhang die unterschiedlichen Funktionen der CD44v10-Isoform stehen, die zu einer reduzierten DTH-Reaktion führen. 4.3.3 CD44v10-defiziente Lymphozyten zeigen auch in vitro eine erhöhte Apoptoserate nach TCR-spezifischer Stimulation Die Daten der TUNEL-Assay-Studie gaben den Anlass für eine detailliertere Analyse des apoptotischen Verhaltens CD44v10-defizienter Zellen in vitro. Dazu wurden naive Lymphozyten und Milzzellen mit immobilisiertem anti-CD3e Antikörper für 48 Stunden stimuliert und anschließend für 24 Stunden mit rekombinatem IL-2 kultiviert. Nach dem Auswaschen des IL-2 aus den Ansätzen erfolgte eine Reexposition der Zellen in anti-CD3e Antikörper für 24 oder 48 Stunden (s. Kap. 3.3.4). Für die Durchflusszytometrie wurden die Zellen mit AnnexinV-(AV) FITC-Konjugaten und Propidiumiodid (PI) inkubiert. Propidiumiodid dient dazu, zwischen früh und spät apoptotischen Zellen zu unterscheiden, da es nur in Zellen mit nicht mehr intakter Zellmembran eindringen kann und als DNA-interkalierender Farbstoff nur spät apoptotische Zellen anfärbt. Auch in diesen Analysen bestätigte sich, dass der Verlust von CD44v10, 48 Stunden nach Restimulation der Zellen, zu einem deutlichen Anstieg an früh apoptotischen Lymphozyten führt. Während beim Wildtyp (Abb. 4.14, A) durchschnittlich 32 % früh apoptotische Zellen detektiert wurden, konnte für CD44v10-defiziente Lymphozyten ein Gesamtanstieg auf 50 % an früh apoptotischen Zellen verzeichnet werden (Abb. 4.14, B). Die Anzahl an spät apoptotischen Lymphozyten blieb hingegen konstant. Ebenso war bei der Analyse der Milzzellen (Abb. 4.14, C + D) kein Unterschied nachweisbar. Diese Daten bestätigen die in den TUNEL-Assay-Studien gemachten Beobachtungen. ERGEBNISSE 65 A PI Lympho -zyten Milzzellen wt B CD44v10-/- 0,4% 47,9% 1,3% 42,4% 19,4% 32,3% 7,3% 50,2% C D 1,7% 34,6% 1,2% 29,5% 29,4% 34,3% 29,6% 39,6% AnnexinV Abb. 4.14: FACS-Analyse apoptotischer Wildtyp- (wt) und CD44v10-/--Zellen nach Aktivierung in vitro. Anfärbung von Lymphknoten- (A+B) bzw. Milzzellen (C+D) mit AV-FITC und PI, 48h nach zweimaliger Aktivierung mit immobilisiertem anti-CD3e Ak. Die prozentuale Verteilung der einzelnen Apoptosestadien ist im Kreuz angegeben. Dabei sind früh apoptotische Zellen nur AV positiv, spät apoptotische oder nekrotische Zellen AV und PI doppelpositiv und bereits tote Zellen wiederum nur PI positiv. A: Wildtyp-Lymphozyten weisen eine Apoptoserate von 32 % an früh apoptotischen Zellen auf. B: Der Verlust von CD44v10 auf der Zelloberfläche führt zu einem deutlichen Anstieg (50 %) an früh apoptotischen Lymphozyten. C + D: Milzzellen aus Wildtyp-Tieren (C) und CD44v10-/--Tieren (D) weisen keinen nachweisbaren Unterschied im apoptotischen Verhalten nach Restimulation in vitro auf. Gezeigt ist eine repräsentative Darstellung dreier unabhängiger Messungen. 4.4 DTH-Reaktion in Knochenmark-Chimären Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Reduktion des zellulären Infiltrats in den Ohren der CD44v10-defizienten Tiere unter anderem auf eine gesteigerte Proliferation und eine daraus resultierende erhöhte Apoptoserate der Zellen zurückzuführen ist, sollte im Weiteren geklärt werden, welchen Einfluss die fehlende Expression der CD44v10-Isoform auf der Oberfläche von Zellen des umliegenden Milieus im Ohrgewebe (z. B. Endothel-, Langerhans-Zellen und Keratinozyten etc.) haben könnte. Erste Hinweise für eine relevante Funktion von CD44v10 ERGEBNISSE 66 auf diesen Zellen lieferten bereits die Untersuchungen der Zytokinprofile (s. Kap. 4.2.5), in denen eine signifikant gesteigerte Sekretion an IL-1b beobachtet werden konnte. IL-1b initiiert unter anderem die Reifung und Aktivierung der antigenpräsentierenden LangerhansZellen (Cumberbatch et al., 1997). Zur Klärung der Fragestellung wurde das hämatopoetische System CD44v10defizienter Tiere durch das des Wildtyps ersetzt und vice versa. Hierzu wurden die Tiere letal bestrahlt und anschließend mit syngenem Knochenmark rekonstituiert (s. Kap. 3.1.4). Drei Monate nach dem Knochenmarktransfer wurde eine DTH-Reaktion ausgelöst. Als Kontrolle wurden Wildtyp-Tiere mit CD44v10+/+-Knochenmark und CD44v10-defiziente Tiere mit CD44v10-/--Knochenmark rekonstituiert. Für jede rekonstituierte Tiergruppe dienten Tiere, die nicht vorab mit einer DNFB-Lösung am Abdomen sensibilisiert, sondern zeitgleich mit der Versuchsgruppe nur an den Ohren mit der DNFB-Lösung behandelt worden waren, als interne Kontrollen. Erstaunlicherweise verhielten sich die Wildtyp-Chimären (Abb. 4.15, A), die CD44v10-/- Knochenmark erhielten, in ihrer DTH-Reaktion wie der Wildtyp, der als Kontrolle mit Wildtyp-Knochenmark rekonstituiert wurde (Abb. 4.15, C). Überraschenderweise führte jedoch die Rekonstitution der CD44v10-defizienten Tiere mit Wildtyp-Knochenmark (Abb. 4.15, B) zu einer signifikant (p= 0,046; Mann-Whitney-Test) supprimierten DTH-Antwort in den ersten 96 Stunden. Die CD44v10-/-/CD44v10-defizienten Chimären (Abb. 4.15, D) zeigten die übliche signifikant (p= 0,045; Mann-Whitney-Test) reduzierte DTH-Reaktion (s. Kap. 4.2.1). Um sicherzustellen, dass die Knochenmarkrekonstitution der Tiere erfolgreich war, wurden zusätzlich zu den KontrollChimären alle Tiere nach Beendigung des Experimentes getötet, und PCR-Analysen der entsprechenden CD44v10-DNA Sequenzen an Zellen aus dem Knochenmark durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Tiere zu 90 % erfolgreich rekonstituiert waren (Daten nicht gezeigt). Die aus diesem Experiment erhaltenen Daten sind ein erstes wichtiges Indiz dafür, dass nicht nur die Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche der Effektorzellen eine wichtige Rolle in der initialen Phase und Etablierung einer DTH-Reaktion spielt, sondern auch auf den Zellen des umliegenden Ohrgewebes (z. B. Endothel-, Langerhans-Zellen und Keratinozyten etc.). ERGEBNISSE 67 A B Wildtyp in CD44v10-/- 40 40 35 35 Ohrschwellung (x10 -3cm) Ohrschwellung (x10 -3cm) CD44v10-/- in Wildtyp 30 25 20 15 10 5 30 25 20 15 10 5 0 0 12 24 48 72 96 120 144 168 192 12 24 48 72 Stunden Kontrollgruppe Versuchsgruppe Kontrollgruppe C 120 144 168 192 168 192 Versuchsgruppe D Wildtyp in Wildtyp CD44v10-/- in CD44v10-/- 40 40 35 35 Ohrschwellung (x10 -3cm) Ohrschwellung (x10 -3cm) 96 Stunden 30 25 20 15 10 5 30 25 20 15 10 5 0 0 12 24 48 72 96 120 144 Stunden Kontrollgruppe Versuchsgruppe 168 192 12 24 48 72 96 120 144 Stunden Kontrollgruppe Versuchsgruppe Abb. 4.15: DTH-Reaktion in Knochenmark-Chimären. Die Tiere wurden letal bestrahlt und mit syngenem Knochenmark rekonstituiert. Drei Monate nach dem Knochenmarktransfer wurde eine DTH-Reaktion ausgelöst. Als interne Kontrolle dienten Tiere, die nicht vorab mit DNFB am Abdomen sensibilisiert, sondern zeitgleich mit der Versuchsgruppe nur an den Ohren mit DNFB behandelt worden waren. A: Wildtyp-Tiere, die mit CD44v10-/--Knochenmark rekonstituiert worden waren, zeigten einen normalen Reaktionsverlauf. B: Die Rekonstitution von CD44v10-/--Tieren mit Wildtyp-Knochenmark hingegen führt zu einer signifikant (p= 0,046; Mann-Whintney-Test) supprimierten DTH-Antwort. C + D: Kontrollgruppen. Wildtyp-Tiere, die Wildtyp-Knochenmark erhielten, verhielten sich normal. Die Reaktionsantwort der mit CD44v10-/--Knochenmarkzellen rekonstituierten CD44v10-/--Tiere ist wiederum signifikant (p= 0,045; Mann-Whitney-Test) reduziert. Gezeigt ist eine exemplarische Messung zweier unabhängiger Experimente mit Standardfehlerabweichung. ERGEBNISSE 68 Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine Reihe an weiteren Experimenten durchgeführt darunter z. B. die in vivo Stimulation von Lymphozyten und Milzzellen mit Dinitrobenzolsulfonsäure (DNBS) und anschließender Restimulation in vitro der Zellen mit DNBS oder anti-CD3e Antikörpern; FACS-Analysen der CD95-Expression (FAS) auf der Zelloberfläche restimulierter Lymphozyten; Induktion der Apoptose in vitro über anti-CD95 Ak in PHAstimulierten Lymphozyten und Milzzellen, deren Ergebnisse ich in meiner Dissertation nicht dokumentiert habe, da sie zu keiner elementaren Aussage bezüglich eines Mechanismus der CD44v10-Isoform beigetragen hätten. Dennoch werden einige Ergebnisse in der Diskussion miterörtert. DISKUSSION 69 5 DISKUSSION Adhäsive Interaktionen von Zellen spielen in zahlreichen physiologischen Prozessen, wie z. B. in der Proliferation, der Apoptose und der Migration von Zellen eine entscheidende Rolle. Vermittelt werden diese Interaktionen über Zelloberflächenmoleküle, die durch die Bindung eines spezifischen Liganden oder weiterer Oberflächenmoleküle verschiedene Signalkaskaden in den Zellen, auf denen sie exprimiert sind, initiieren können. Wie meine Untersuchungen belegen, ist das Zelloberflächenmolekül CD44v10, eine Spleißvariante des Zelldhäsionsmoleküls CD44, insbesondere in adhäsive Interaktionen involviert, die die Manifestierung Th1-mediierter kutaner Entzündungsreaktionen betreffen. Kutane Entzündungsreaktionen entstehen durch fehlgesteuerte Überreaktionen von Effektorzellen (Leukozyten) im Zuge einer Immunantwort. Diese Fehlfunktionen sind meistens auf eine Überexpression einzelner Adhäsionsmoleküle zurückzuführen, deren anhaltende Stimulation in einer permanenten Induktion spezifischer Signalkaskaden innerhalb der Zellen resultiert. Nach bisher publizierten Daten wird die CD44v10-Isoform auf Hautinfiltrierenden Lymphozyten der atopischen Dermatitis sowie des kutanen Lymphoms stark exprimiert (Seiter et al., 1998; Wagner et al., 1998). Überdies führt die intravenöse Injektion von anti-CD44v10 Antikörpern in der frühen Phase des Tiermodells der Th1-vermittelten DTH zu einer Suppression der Reaktionsantwort durch eine verzögerte Migration aktivierter Lymphozyten (Rösel et al., 1997). Es stellte sich daher die Frage, welche spezifischen Interaktionen des Zelloberflächenmoleküls CD44v10 entscheidend für die Rekrutierung von Effektorzellen in die Haut sind. Zur Aufklärung der relevanten Funktionen des CD44v10Moleküls, die zur Rekrutierung der immunkompetenten Effektorzellen in einer Th1mediierten Entzündungsreaktion führen, wurden detaillierte Untersuchungen mit Hilfe von homozygoten CD44v10-defizienten Mäusen im Modell der DTH vorgenommen. Anhand der Analysen in diesem Tiermodell konnte ich im wesentlichen zeigen: 1. dass die Reaktionsantwort der DTH in CD44v10-defizienten Tieren infolge eines verringerten inflammatorischen Zellinfiltrats und einer reduzierten Ausbildung eines lokalen Ödems supprimiert ist. Zudem ist eine Expression von CD44v10 im Zuge einer inflammatorischen Reaktion essentiell für die Migration immunkompetenter Granulozyten in die Haut. DISKUSSION 70 2. dass die CD44v10-Isoform in der Signaltransduktionskaskade des TCR/CD3Rezeptorkomplexes und in apoptotischen Signalkaskaden involviert ist. 3. dass die Expression des CD44v10-Moleküls auf Zellen des umliegenden Gewebes (z. B. Endothel-, Langerhans-Zellen und Keratinozyten etc.) eine entscheidende Rolle für die Manifestierung einer kutanen Hautreaktion spielt. 5.1 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche führt zu einer erhöhten Granulopoese im Knochenmark Einer der hilfreichsten Ansätze der modernen Molekularbiologie, um Informationen über die Funktion eines Genproduktes in vivo zu erhalten, stellt die Generierung sogenannter NullMutanten („Knock outs“) der Maus dar. Durch den gezielten Verlust eines einzelnen Gens in der Keimbahn können verschiedene phänotypische Veränderungen entstehen. Daher war eine grundlegende Voraussetzung für die funktionelle Analyse der CD44v10-Isoform im DTHModell zu zeigen, dass CD44v10-defiziente Tiere analog zum Wildtyp ein vergleichbares Potential an immunkompetenten Zellen aufweisen. Die durchgeführten phänotypischen Analysen der lymphatischen Organe ergaben, dass die CD44v10-Isoform im Prozess der Granulopoese von funktioneller Bedeutung ist. Dabei scheint die fehlende Expression der CD44v10-Isoform im Knochenmark die Bildung vitaler ausdifferenzierter Granulozyten zu begünstigen (s. Kap. 4.1.1), während sie im Zellkompartiment der Milz zu einer Reduktion der Granulozytenpopulation führt (s. Kap. 4.1.2). Offensichtlich ist in dieser Umgebung eine ausreichende Bildung von Granulozyten aus Vorläuferzellen durch den Verlust von CD44v10 nicht möglich. Bezüglich der reduzierten Anzahl an Granulozyten in der Milz von CD44v10-defizienten Tieren stellt sich aber die Frage, ob der in der phänotypischen Analyse ermittelte Unterschied von 6,9% zwischen Wildtyp- und CD44v10-defizienten Tieren aussagekräftig genug ist. Da ich jedoch in mehreren voneinander unabhängigen Versuchsreihen reproduzierbar die nahezu gleiche Differenz im Hinblick auf die Verteilung der Granulozytenpopulation in der Milz von Wildtyp- und CD44v10-defizienten Tieren nachweisen konnte, muss man davon ausgehen, dass die erhobenen Daten von Bedeutung sind. Da im Gegensatz zum Menschen die murine Milz in adulten Tieren gleichfalls Ort der Hämatopoese ist, lassen die Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der gesteigerten Granulopoese im Knochenmark wahrscheinlich um einen kompensatorischen Effekt handelt, der dem Ausgleich der verminderten Produktion an Granulozyten in der Milz DISKUSSION 71 dient. Die Daten der Differentialblutbildanalyse, die eine erhöhte Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der Peripherie des Blutes von CD44v10-defizienten Tieren nachweisen (s. Kap. 4.1.1), sprechen nicht nur für eine kompensatorische Funktion des Knochenmarks, sondern weisen auch daraufhin, dass möglicherweise eine Überproduktion an Granulozyten im Knochenmark stattfindet. Die Ursache hierfür könnte wie bei CD44-defizienten Tieren eine Akkumulation von Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen im Knochenmark sein (Schmits et al., 1997). Die Hämatopoese bzw. Differenzierung der Stamm- und Vorläuferzellen ist abhängig vom sogenannten hämatopoetischen Mikromilieu im Knochenmark bzw. im Thymus. Dieses Mikromilieu besteht aus verschiedenen Arten von Stromazellen, sezernierten und membrangebundenen Zytokinen und einer komplexen extrazellulären Matrix. Im Falle der Hämatopoese vermittelt CD44 die Adhäsion der lymphatischen oder myeloischen Stammzellen an die Stromazellen des Knochenmarks (als Übersicht s. Zöller, 2000; Rösel et al., 1999). Daher wäre es denkbar, dass eine mögliche Funktion von CD44v10 unter normalen physiologischen Voraussetzungen, entweder in der Regulation der Adhäsion der Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen an die Stromazellen des Knochenmarks bzw. der Milz oder in der Vermittlung der Migration der Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen aus dem Knochenmark liegt. Für die erstere Möglichkeit spricht, dass der Einsatz eines CD44v10-Rezeptorglobulins mit dem exprimierten CD44v10-Molekül auf der Zelloberfläche bei der Interaktion von Stromazellen und lymphoiden Vorläuferzellen während der B-Zell Reifung interferiert (Rösel et al., 1999). Des Weiteren belegen die durchgeführten phänotypischen Analysen der Milz eine Verschiebung der reifen B- zugunsten der unreifen BZellpopulation in CD44v10-defizienten Tieren (s. Kap. 4.1.2), infolgedessen es zu einer signifikanten Reduktion der Lymphozyten in der Peripherie des Blutes kommt (s. Kap. 4.1.1). Welche CD44v10-mediierten Mechanismen aber im Einzelnen eine relevante Funktion im Prozess der Hämatopoese ausüben, ist gegenwärtig noch nicht untersucht und bedarf noch einer Reihe weiterer Analysen, die nicht Schwerpunkt dieser Arbeit waren. In Übereinstimmung mit publizierten Daten wird das Verhältnis der TZellsubpopulationen im Thymus (s. Kap. 4.1.3) sowie in den Lymphknoten (s. Kap. 4.1.3) und der Milz (s. Kap. 4.1.2) durch den Verlust von CD44v10 auf der Zelloberfläche nicht negativ beeinflusst, wie es auch für CD44-defiziente Tiere nachgewiesen wurde (Protin et al., 1999; Stoop et al., 2001). Demzufolge ist davon auszugehen, dass CD44v10-defiziente Tiere das nötige Potential an immunkompetenten Zellen besitzen, um eine Th1-mediierte Entzündungsreaktion ausbilden zu können. DISKUSSION 72 5.2 Die Expression der CD44v10-Isoform ist essentiell für die Migration immunkompetenter Zellen in der initialen Phase der DTH-Reaktion Der Einsatz verschiedener homozygoter CD44v-defizienter Mäuse im Mausmodell der DTH ergab, dass nur die CD44v10-Isoform eine signifikante Funktion in der Entwicklung einer kutanen Immunreaktion besitzt (s. Kap. 4.2.1). Bei der varianten Isoform CD44v10 scheint es sich daher um eine Haut-spezifische Spleißvariante des Adhäsionsmoleküls CD44 zu handeln, während CD44v-Isoformen, wie z. B. CD44v7, eher relevante Funktionen in Darmassoziierten Erkrankungen ausüben (Wittig et al., 1998). Dies lässt die Annahme zu, dass sich im Laufe der Zeit die varianten CD44-Isoformen sehr wahrscheinlich, aufgrund des starken evolutionären Drucks, auf unterschiedliche spezifische Funktionsspektren spezialisiert haben. Im Gegensatz zu aktuell publizierten Daten der Arbeitsgruppe von McKallip (2002), in denen die vollständige Deletion des CD44-Gens in C57BL/6 Mäusen zu einer erhöhten Reaktionsantwort im Modell der DTH führt, belegen meine Untersuchungen an diesem Modell, dass es infolge der fehlenden Expression der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche in CD44v10-defizienten Tieren zu einer signifikant supprimierten Reaktionsantwort kommt (s. Kap. 4.2.1). Eine Erklärungsmöglichkeit für diese Abweichung könnte in der Verwendung unterschiedlicher Mausrassen liegen. Mäuse der Rasse C57BL/6 exprimieren nur eines der beiden vorhandenen CD44-Allele, während BALB/c Mäuse, wie sie auch in dieser Arbeit verwendet wurden, beide Allele exprimieren. Die Expression nur eines CD44-Allels führt folglich in den Tieren zu einer erniedrigten Expressionsrate an CD44Molekülen auf der Zelloberfläche. Daher ist es vorstellbar, dass in C57BL/6 Mäusen kompensatorische Mechanismen oder Signalkaskaden existieren, die in CD44-defizienten Tieren dieser Rasse im Verlauf einer Immunantwort zu einer Überreaktion führen. Zudem decken sich meine experimentellen Daten mit Studien von Kaya und Mitarbeitern (1999) die wiederum zeigen, dass transgene Mäuse mit einem Keratinozyten-spezifischen Expressionsdefekt von CD44 nicht in der Lage sind, eine DTH-Reaktion auszubilden. Da ich aber für die Kombination der Spleißvarianten CD44v6v7 ebenfalls einen Einfluss auf die DTH-Reaktion zeigen konnte (s. Kap 4.2.1) und bisher eindeutige Funktionen der anderen varianten Isoformen noch weitgehend unbekannt sind, wäre es weiterhin denkbar, dass der komplette Verlust aller Isoformen zu einem vollkommen neuen Reaktionsverlauf der DTH führt. Wie meine Ergebnisse zeigen, ist die supprimierte DTH-Reaktion in den CD44v10defizienten Tieren auf ein verringertes zelluläres, inflammatorisches Infiltrat und eine reduzierte Ausbildung eines lokalen Ödems (s. Kap. 4.2.2) zurückzuführen. DISKUSSION 73 In Übereinstimmung mit diesen Daten wurden in unterschiedlichen Studien an inflammatorischen Erkrankungen, wie z. B. der Kollagen II-induzierten rheumatoiden Arthritis (Mikecz et al., 1999), ein kausaler Zusammenhang zwischen der Expression der CD44-Moleküle bzw. bestimmter Spleißvarianten auf der Zelloberfläche und der Ausbildung eines verringerten inflammatorischen Infiltrats nachgewiesen (Camp et al., 1993; Wittig et al., 1998). Das lässt die Schlussfolgerung zu, dass die CD44v10-Isoform auch relevante Interaktionen bei der Migration von Effektorzellen in die Haut vermittelt. Möglicherweise besteht eine spezifische Funktion der CD44v10-Isoform darin, die primäre Rekrutierung und Extravasation von Granulozyten zu regulieren. Hinweise darauf geben die histologischen Analysen der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Infiltrats (s. Kap. 4.2.3). Hier konnte ich zeigen, dass die Migration der Granulozyten in der initialen Phase der DTHReaktion durch den Verlust der varianten Isoform CD44v10 auf der Zelloberfläche verzögert wird. Aufgrund der Tatsache, dass eine Depletion von neutrophilen Granulozyten zu einer 60%-80% reduzierten DTH-Antwort führt (Tumpey et al., 2002), könnte man des Weiteren spekulieren, dass insbesondere die Extravasation der neutrophilen Granulozyten durch CD44v10 vermittelt wird. Dafür spricht auch eine beobachtete Akkumulation von neutrophilen Granulozyten im Blut von unsensibilisierten CD44v10-defizienten Tieren (s. Kap. 4.1.1). Bezüglich dieser Annahme wird jedoch in der gegenwärtigen Literatur postuliert, dass die Rekrutierung und Migration von Monozyten und Makrophagen in einer inflammatorischen Reaktion CD44v10- bzw. CD44-mediiert ist (DeGrendele et al., 1997b; Rösel et al., 1997; Leemans et al., 2003). Allerdings wurde im Zuge dieser Studien die Verteilung der Granulozyten im inflammatorischen Zellinfiltrat nicht genauer analysiert. Dies mag darin begründet sein, dass der klassischen Ansicht nach mononukleäre Zellen die erste Zellpopulation darstellen, die zu Beginn einer entzündlichen Reaktion in das Gewebe einwandert. Im Gegensatz dazu belegen aber aktuellere Studien, dass gerade bei einer DTHReaktion neutrophile Granulozyten die erste Front an Effektorzellen bilden, gefolgt von den mononukleären Zellen (Buchanan et al., 1997; Sebastiani et al., 2002). Eine ungeklärte und interessante Frage, die es in diesem Zusammenhang zu klären gilt, ist, ob die defekte Rekrutierung und Migration der Monozyten /Makrophagen eine Folge der fehlenden Expression von CD44 bzw. CD44v10 auf der Zelloberfläche ist oder ob sie auf die verzögerte Migration der neutrophilen Granulozyten zurückzuführen ist. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass das veränderte migratorische Verhalten der neutrophilen Granulozyten die Rekrutierung und Migration weiterer Effektorzellen beeinflusst. Anderseits wird im Unterschied zu anderen Isoformen des CD44-Moleküls gerade die CD44v10-Isoform DISKUSSION 74 auf aktivierten Makrophagen hoch exprimiert (Hart et al., 1997). Ferner führt der Zellkontakt zwischen Monozyten/Makrophagen und aktivierten T-Zellen zu einer Überproduktion an IL1b (Burger et al., 1998). Da ich in der Analyse des inflammatorischen Zytokinprofils im Ohrgewebe eine signifikant erhöhte Sekretion an IL-1b nachweisen konnte (s. Kap. 4.2.5), ist es ebenfalls nicht auszuschließen, dass auch die Expression von CD44v10 auf dieser Zellpopulation eine wesentliche Rolle bei der Etablierung einer DTH-Reaktion spielen könnte. Derzeit geht meine Arbeitshypothese aber davon aus, dass die CD44v10-Isoform in erster Linie essentiell für die Migration der Granulozyten ist. Interessanterweise beschränkt sich der Einfluss des CD44v10-Moleküls bei der Extravasation der Granulozyten nur auf die initiale Phase der Reaktion. Im weiteren Verlauf scheinen sekundäre Adhäsionsmechanismen den Verlust des Moleküls auf der Zelloberfläche zu kompensieren. Hierfür könnten z. B. weitere Mitglieder der „Link module“ Superfamilie (s. Kap. 1.3.2) oder das Oberflächenmolekül CLA („cutaneous lymphocyte-associated antigen“) in Frage kommen. Gestützt wird diese Vermutung durch die Tatsache, dass zahlreiche Arbeiten eine Beteiligung von CD44s bzw. der CD44-Spleißvarianten an den unterschiedlichsten Entwicklungsprozessen u. a. während der Embryogenese belegen (als Übersicht s. Naor et al., 1997 und Referenzen hierin), die vollständige Deletion des CD44Gens dagegen aber nicht letal ist (Protin et al., 1999; Rafi-Janajreh et al., 1999). Die hier präsentierten Ergebnisse verdeutlichen das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren, die für die Manifestierung einer DTH-Reaktion verantwortlich sind. Die vielfältigen Funktionen der einzelnen CD44-Moleküle, die teilweise durch kompensatorische Mechanismen überbrückt werden können und die Beteiligung dieser Moleküle an einer Vielzahl von unterschiedlichen Signalkaskaden erschweren die Zuordnung einer eindeutigen Funktion der CD44v10-Isoform, die zu einer reduzierten DTH-Antwort führt. So konnte unter anderem gezeigt werden, dass das CD44s-Molekül durch die Signalgebung über NF-kB (Noble et al., 1996) die Produktion von IFN-g regulieren kann (Blass et al., 2001). Dies ist insofern interessant, da im inflammatorischen Infiltrat der Ohren von CD44v10-defizienten Tieren eine erhöhte Produktion an IFN-g detektiert werden konnte (s. Kap. 4.2.5). IFN-g ist nicht nur ein pro-inflammatorisches Zytokin, es besitzt zusätzlich die Fähigkeit Suppressorzellen zu aktivieren, die eine DTH-Reaktionsantwort unterdrücken können (als Übersicht s. Billiau, 1996 und Referenzen hierin). Jedoch sind auch widersprüchliche Daten publiziert, die eine Suppression der IFN-g-Expression und Sekretion in den drainierenden Lymphknoten von bzw. mit anti-CD44v10 Ak behandelten Tieren vorweisen (Seiter et al., 1999). Hier muss aber erwähnt werden, dass die Zytokinverhältnisse DISKUSSION 75 innerhalb des inflammatorischen Infiltrats nicht analysiert wurden, und dass die Verwendung von Ak unter anderem zu einem Konformationswechsel des CD44-Oberflächenmoleküls führen kann, wie es z. B. für den CD44-Ak IRAWB14 (Lesley et al., 1993) beschrieben worden ist. Inwieweit das CD44v10-Molekül tatsächlich mit pro-inflammatorischen Zytokinen interagiert bzw. deren Expression und Sekretion induzieren oder reprimieren kann, bleibt vorerst noch spekulativ. 5.3 Der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche verändert das apoptotische und proliferative Verhalten von Effektorzellen Die funktionelle Spezifität des CD44-Moleküls im Prozess der Apoptose von Effektorzellen wird immer wieder von neuem in der Literatur kontrovers diskutiert. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit ermittelten Ergebnissen und den publizierten Daten anderer Arbeitsgruppen, die eine suppressive Funktion von CD44 in der induktiven Signalkaskade der Apoptose belegen (Ayroldi et al., 1995; Bates et al., 1998; Wittig et al., 2000), weisen Studien von Takazoe et al. (2000) und Föger et al. (2000) eine Induktion der Apoptose durch die Signalgebung von CD44 nach. Eine Erklärungsmöglichkeit für diese Diskrepanzen könnte die Existenz der vielfältigen Spleißvarianten des CD44-Moleküls sein. Das alternative Einspleißen von bis zu 10 varianten Exons in die extrazelluläre Domäne des CD44-Standardmoleküls bietet die Möglichkeit, eine Reihe an unterschiedlichen Isoformen auf der Zelloberfläche zu exprimieren (s. Kap. 1.3.1.). Die Expression einzelner Isoformen oder deren Kombination scheinen sowohl anti-apoptotische wie auch pro-apoptotische Signalkaskaden verstärken zu können. In Übereinstimmung mit dieser Vermutung konnte ich zeigen, dass aktivierte CD44v10-defiziente Effektorzellen des inflammatorischen Infiltrats der Ohren in einer DTHReaktion eine erhöhte Sensitivität gegenüber apoptotischen Mechanismen aufweisen (TUNEL-Studie; s. Kap. 4.3.2). Die stabile Transfektion der Lungenkrebszelllinie NCI-H82 mit der CD44-Isoform CD44E, die die Spleißvarianten v8-v10 enthält, führt hingegen zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einer durch Etoposid indzuzierten Apoptose (Fujita et al., 2002). Welche spezifischen Signalübertragungswege durch die Expression der CD44v10Isoform im Einzelnen beeinflusst werden, ist gegenwärtig noch nicht untersucht. Entscheidend ist jedoch, dass durch eine erhöhte Apoptoserate innerhalb des inflammatorischen Bereiches der Ohren eine Manifestierung der DTH-Reaktion weitgehend verhindert wird. Die Apoptose aktivierter T-Zellen ist für die Aufrechterhaltung der immunologischen Homöostase nach einer erfolgreichen Immunantwort von größter Bedeutung. In den meisten DISKUSSION 76 Fällen erfolgt die Eliminierung der Zellen über das Fas/Fas-Liganden System, also dem aktiv induzierten Zelltod. Im Einklang mit Daten über die CD44v7-Isoform (Marhaba et al., 2003) induziert oder reduziert der Verlust der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche aktivierter Lymphozyten weder die Expressionsrate des Fas-Rezeptors noch die seines Liganden (Daten nicht gezeigt). Dass eine Expression des CD44v10-Moleküls im Vergleich zum CD44s (Chen et al., 2001) im Fas/Fas-Liganden Signalübertragungsweg nicht von Bedeutung ist, zeigen zudem Untersuchung des apoptotischen Verhaltens an stimulierten Zellen. In den von mir durchgeführten Analysen war es nicht möglich, sowohl in PHA-aktivierten CD44v10defizienten Lymphozyten wie auch Milzzellen durch die Gabe von anti-Fas Ak eine erhöhte Apoptoserate zu induzieren (Daten nicht gezeigt). Dennoch könnte eine mögliche Funktion von CD44v10 in der Signalkaskade des aktiv induzierten Zelltods in einer gesteigerten Rekrutierung an anti-apoptotischen Molekülen (z. B. Bcl-xL und Bcl-2) liegen, wie es erst kürzlich für die CD44v7-Isoform gezeigt wurde (Marhaba et al., 2003). Alternativ dazu könnte das CD44v10-Oberflächenmolekül aber auch als ein „Bystander-Rezeptor“ des TCR/CD3-Rezeptorkomplexes in Frage kommen. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass sowohl die Induktion der T-Zell Proliferation wie auch der Apoptose über den TCR/CD3-Komplex durch sekundäre Signale weiterer ko-stimulierdender Moleküle verstärkt werden kann (Schwartz, 1992). In diesen Zusammenhang konnte ich den Nachweis erbringen, dass bei der spezifischen Aktivierung von Lymphozyten über den TCR/CD3-Komplex in vitro, die fehlende Expression der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche zu einer gesteigerten Proliferationsrate führt (s. Kap. 4.3.1). Weitere eigene Untersuchungen zeigten aber, dass nur in naiven und nicht in zuvor mit DNBS in vivo stimulierten Lymphozyten eine erhöhte Proliferationsantwort über den TCR/CD3-Komplex in vitro induziert werden kann (Daten nicht gezeigt). Auch eine Restimulation in vitro von bereits in vivo stimulierten Lymphozyten mit dem spezifischen Antigen (DNBS), führte zu keinem veränderten proliferativen Verhalten CD44v10-defizienter Lymphozyten im Gegensatz zum Wildtyp (Daten ebenfalls nicht gezeigt). Meine Ergebnisse lassen somit die Schlussfolgerung zu, dass CD44v10 als möglichem „Bystander-Rezeptor“ des TCR/CD3Rezeptorkomplexes nur eine Bedeutung bei der primären Stimulation bzw. Aktivierung von naiven Lymphozyten zukommt. Im Gegensatz dazu konnte aber durch die Restimulation CD44v10-defizienter Lymphozyten über den TCR/CD3-Komplex eine erhöhte Sensitivität dieser Zellen gegenüber apoptotischen Mechanismen erzielt werden (s. Kap. 4.3.3). Hiernach wäre aber die CD44v10Isoform nicht ein induktiver, sondern bei vorhandener Expression auf der Zelloberfläche DISKUSSION 77 vielmehr ein repressiver „Bystander-Rezeptor“. Diese Hypothese wird durch Untersuchungen von Föger et al. (2000) unterstützt. Wie ihre Analysen zeigen, kann die Kreuzvernetzung von CD44s auf der Zelloberfläche von T-Zellen nicht nur aktivierende, sondern auch apoptotische Signale durch die Rekrutierung von spezifischen Signaltransduktionsmolekülen an die zytoplasmatische Domäne des TCR/CD3-Komplexes induzieren. Zudem weist CD44 über seine zytoplasmatische Domäne eine konstitutive Assoziation mit den Src-Kinasen p56lck und p59fyn auf (s. Kap. 1.3.4). Daher wird zunehmend postuliert, dass CD44 durch die Rekrutierung von Phosphokinasen die Initiationschwelle der TCR/CD3-Signaltransduktion erniedrigt. Zusammengefasst favorisieren diese Daten die Annahme, dass es sich bei der CD44v10-Isoform um einen repressiven „Bystander-Rezeptor“ für die TCR/CD3Signaltransduktionskaskade handeln könnte. Obwohl wir bisher nur geringfügige Hinweise für eine Funktion von CD44v10 als „Bystander-Rezeptor“ auf T-Zellen besitzen, würde dies erklären, warum der Verlust von CD44v10 auf der Zelloberfläche gleichzeitig zu einer induzierenden Signalübertragung für die Proliferation und die Apoptose von mit anti-CD3 Ak stimulierten T-Zellen führen kann. Zukünftige Experimente sollen hier die näheren Zusammenhänge klären. 5.4 CD44v10, ein neuer Zytokinrezeptor? Im Falle einer Inflammation wird CD44v10 gleichermaßen stark auf Leukozyten und Epithelien bzw. Endothelien exprimiert (Rösel et al., 1997; Wagner et al., 1998). Daher war eine noch offene Frage, die es zu beantworten galt, welche Bedeutung die Expression von CD44v10 auf Endothelien für die Migration aktivierter Effektorzellen in ein Gewebe haben könnte. Untersuchungen von Wittig und Mitarbeitern (2000) an CD44v7/Wildtyp und Wildtyp/CD44v7 Knochenmark-Chimären erbrachten den Nachweis, dass nur die Expression der CD44v7-Isoform auf hämatopoetischen Zellen und nicht auf Zellen des Darmepithels für die Etablierung einer Kolitis in Mäusen von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich erstmals zeigen, dass die Expression von CD44v10 auf dem Endothel ausschlaggebend ist für die Manifestierung einer DTH-Reaktion. Dabei führte die Rekonstitution von CD44v10defizienten Tieren mit CD44v10-positivem Wildtyp-Knochenmark zu einer signifikant supprimierten DTH-Antwort und der Transfer von CD44v10-defizientem Knochenmark in CD44v10-positive Wildtyptiere zu einer normalen Reaktionsantwort (s. Kap. 4.4). Durch PCR-Analysen der zellulären genomischen DNA aus dem Knochenmark der Tiere konnte hierbei eine unzureichende Rekonstitution als Ursache ausgeschlossen werden. Diese DISKUSSION 78 Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass derzeit noch unbekannte Interaktionen zwischen CD44v10 auf dem Endothel und den Effektorzellen eine zentrale Rolle für die Migration der Zellen spielen. Nach dem heutigen Wissensstand könnten folgende mögliche Interaktionen, die über das CD44v10-Molekül verlaufen, in Betracht gezogen werden: (i) Die Expression von CD44v10 auf aktivierten Endothelzellen führt über die Bindung eines bisher unbekannten Liganden zu einer indirekten Induktion weiterer für die Migration von Effektorzellen wichtigen Zelloberflächenmolekülen. (ii) Durch den Verlust von CD44v10 auf dem Endothel ist eine homotypische oder heterotypische Adhäsion zwischen Effektorzellen und dem Endothel nicht mehr gewährleistet, was möglicherweise eine Voraussetzung für die Migration der Zellen ist. (iii) CD44v10 könnte auf dem Endothel als Rezeptor für Zytokine fungieren. Im Einklang mit meinen vorgestellten Ergebnissen und Daten von Camp et al. (1993) führt der Verlust von CD44v10 auf der Zelloberfläche weder zu einer Induktion noch zu einer Repression weiterer Aktivierungs- oder Adhäsionsmarker auf T-Zellen, Makrophagen und Langerhans-Zellen (s. Kap. 4.2.4). Die Vermutung scheint daher eher fraglich, dass CD44v10 durch ko-modulatorische Fähigkeiten die Expression weiterer Zelloberflächenmoleküle induziert und so die Migration von aktivierten Effektorzellen erleichtert. Verschiedene Untersuchungen belegen, dass CD44v10 in der Lage ist sowohl heterotypische wie auch homotypische adhäsive Interaktionen zwischen Lymphozyten und aktivierten dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (Weimann et al., 2001), wie auch homotypische Adhäsionen an hämatopoetische Tumorzellen (Stamenkovic et al., 1991) bzw. B16F10 Melanomzellen (Shiras et al., 2002) zu vermitteln. Hiernach könnten möglicherweise heterotypische Adhäsionsmechanismen zwischen dem Endothel und den Effektorzellen über CD44v10 für eine supprimierte DTH-Reaktion in den CD44v10+/+/CD44v10-defizienten Chimären in Frage kommen. Unwahrscheinlich ist, dass homotypische Interaktionen eine wesentliche Funktion bei der Migration der Zellen ausüben. Hinweise darauf geben die Ergebnisse der Knochenmarktransferstudie. Wären homotypische Interaktionen zwischen den Effektorzellen und dem Endothel essentiell für die Extravasation der Zellen, hätten CD44v10positive Wildtyptiere, die CD44v10-negatives Knochenmark erhielten, keine DTH-Reaktion zeigen dürfen (s. Kap. 4.4). Welchen Einfluss heterotypische Interaktionen über CD44v10 tatsächlich auf die Migration von Zellen haben könnten, soll in zukünftigen Experimenten geklärt werden. DISKUSSION 79 Die frühesten Ereignisse einer entzündlichen Reaktion, die Einwanderung und Rekrutierung von Leukozyten, wird durch die spezifische Bindung der Leukozyten an das Endothel- durch Zelladhäsionsmoleküle und die lokale Produktion von chemotaktischen Mediatoren- ausgelöst und kontrolliert. Um eine effektive, hohe lokale Konzentration an Zytokinen für passierende Effektorzellen zu gewährleisten, wird ein Teil der Zytokine an Proteoglykane gebunden und auf der Zelloberfläche des Endothels präsentiert (Robert & Kupper, 1999). Durch diese Immobilisierung wird ein Fortwaschen der Zytokine durch den Blutstrom verhindert. Denkbar wäre, dass CD44v10 in diesem Fall als möglicher Rezeptor für die Präsentation von Zytokinen auf den Endothelzellen fungiert. Für diese Annahme spricht: (1) dass CD44v10 in Kombinationen mit den Isoformen CD44v8 und v9 als CD44E-Isoform konstitutiv auf Epi- und Endothelien exprimiert wird und sich die Expression bei Aktivierung des Endothels erhöht (als Übersicht s. Naor et al., 1997). (2) dass CD44s an der Adhäsion von T-Zellen an aktivierte Endothelzellen (DeGrendele et al., 1996; DeGrendele et al., 1997b) und die CD44v10Isoform an der Extravasation von Granulozyten im Zuge einer inflammatorischen Hautreaktion (s. Kap. 4.2.3) beteiligt ist. (3) dass es sich bei CD44v10 um ein Proteoglykan handelt, welches durch post-translationale Modifikationen mit einer Chondroitinsulfat-Seitenkette modifiziert ist (s. Kap. 1.3.1). Das vorhandene GAG-Motiv stellt eine potentielle Bindungsstelle für Zytokine dar ( als Übersicht s. Tanka et al., 1993a und Referenzen hierin). Zudem führt eine ko-Immobilisierung des Integrin-Liganden VCAM-1 und CD44s zur Bindung des Chemokins MIP1b an CD44 (Tanaka et al., 1993b). Weiteren Studien zufolge interagiert auch das saure Phosphoprotein Osteopontin, das ebenfalls chemotaktische Aktivität besitzt, mit CD44 (Weber et al., 1996). (4) dass im inflammatorischen Infiltrat der Ohren eine signifikant gesteigerte Sekretion an IL-1b detektiert wurde (s. Kap. 4.2.5). IL-1b ist in der Lage über den Transkriptionsfaktor AP-1 die Expression von CD44 auf aortalen Muskelzellen von Ratten zu modulieren (Foster et al., 2000). Ferner induziert IL-1 als parakrines Signal die Aktivierung dermaler Endothelzellen und die Expression von Selektinen (Romero et al., 1997; Wyble et al., 1997). Des Weiteren dient es für Lymphozyten als Chemoattraktant, das deren Extravasation initiiert (Nourshargh et al., 1995; DISKUSSION 80 Santamaria Babi et al., 1995). Inwiefern der Überschuss an IL-1b im inflammatorischen Infiltrat der Ohren von CD44v10-defizienten Tieren eventuell einen kompensatorischen Mechanismus darstellt, um z. B. den Verlust von CD44v10 auf den Endothelzellen durch eine erhöhte Dichte an Selektinen auszugleichen, ist zurzeit noch unklar. Fasst man die von mir vorgestellten Ergebnisse und die oben genannten Daten zusammen, kann folgendes hypothetische Modell für eine mögliche CD44v10 Funktion auf aktivierten Endothelzellen während einer inflammatorischen Hautreaktion erstellt werden: Die Aktivierung des Endothels über IL-1b führt zur Modulation einer erhöhten Expression von CD44v10 über AP-1 auf der Zelloberfläche. Infolge dessen binden lokal produzierte Zytokine über das GAG-Motiv der Chondroitinsulfat-Seitenketten an das CD44v10-Molekül. Dies führt zu einer gesteigerten Konzentration an Zytokinen auf der Oberfläche des Endothels. Passierende aktivierte Lymphozyten können nun an den Gefäßwänden bzw. dem Endothel akkumulieren und ins Gewebe migrieren. Das heißt, der Verlust der CD44v10-Isoform auf dem Endothel führt zu einer reduzierten Konzentration an lokalen Zytokinen, wodurch es zu einer verminderten Adhäsionskapazität zwischen dem Endothel und den Effektorzellen kommt (s. Kap. 1.2.1). In erster Linie ist dabei die Population der neutrophilen Granulozyten betroffen, da sie die ersten Effektorzellen vor Ort sind. Ein möglicher Einfluß auf die Rekrutierung und Extravasation der Monozyten bzw. Makrophagen ist hierbei aber nicht auszuschließen. Im weiteren Verlauf der Reaktion scheinen dann kompensatorische Mechanismen zu greifen, die eine, wenn auch nur teilweise erfolgreiche, Immunreaktion sichern. Die hier präsentierten Ergebnisse geben neue Einblicke in die Funktion der CD44v10-Isoform im Prozess einer inflammatorischen Hautreaktion. Die CD44v10-Isoform wurde dabei als eine Haut-spezifische Variante des Zelladhäsionsmoleküls CD44 identifiziert, die essentiell für die Rekrutierung und Extravasation aktivierter Granulozyten in die Haut ist. Ferner wurden neue Erkenntnisse über funktionelle Interaktionen von CD44v10 auf der Zelloberfläche des Endothels mit aktivierten Leukozyten in der initialen Phase einer DTHReaktion gewonnen. Mit der Fähigkeit, die proliferativen und apoptotischen Eigenschaften von aktivierten T-Zellen beeinflussen zu können, steht CD44v10 ein bisher für diese Isoform unbekannter neuer Mechanismus zur Modulation von proliferativen und apoptotischen Signaltrans-duktionskaskaden als „Bystander-Rezeptor“ zur Verfügung. DISKUSSION 81 Ausgehend von meinen Ergebnissen soll zukünftig detailliert untersucht werden, welche spezifischen Interaktionen über das CD44v10-Molekül im Einzelnen die Rekrutierung und Extravasation von aktivierten Effektorzellen, insbesondere der Granulozyten, in die Haut steuern. Als Modellsystem zum Studium dieser Mechanismen soll das von mir in dieser Arbeit etablierte Knochenmarktransfer-Modell dienen. Ein weiteres Ziel ist die Aufklärung der Mechanismen, über die CD44v10 in der Signaltransduktionkaskade des TCR/CD3Rezeptorkomplexes involviert ist. Durch diese Untersuchungen erhoffen wir nicht nur neue Erkenntnisse über die vielfältigen Interaktionen der CD44v10-Isoform zu erhalten, sondern auch über die hier dargelegten Ergebnisse hinaus, weitere Einblicke in eine eindeutige spezifische Funktion der CD44-Spleißvariante CD44v10 zu gewinnen. ZUSAMMENFASSUNG 82 6 ZUSAMMENFASSUNG Die CD44v10-Isoform ist für die Etablierung und Manifestierung einer kutanen, inflammatorischen Reaktion wie der DTH mitverantwortlich. Eine zentrale Rolle spielen hierbei die CD44v10-vermittelten adhäsiven Interaktionen zwischen Effektorzellen, insbesondere den Granulozyten, und dem Endothel in der initialen Phase der Reaktion. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass die Expression von CD44v10 auf den Zellen des Endothels von essentieller Bedeutung für die Rekrutierung und Extravasation von aktivierten Effektorzellen in die Haut ist. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich phänotypische Analysen der lymphatischen Organe vorgenommen. Diese Analysen ergaben, dass die CD44v10-Isoform im Prozess der Granulopoese von funktioneller Bedeutung ist und zu einer erhöhten Produktion an Granulozyten im Knochenmark von CD44v10-defizienten Tieren führt. Im Gegensatz dazu konnte ich im Zellkompartiment der Milz eine Reduktion der Granulozytenpopulation nachweisen und eine Verschiebung der reifen zugunsten der unreifen B-Zellpopulation, infolgedessen es zu einer signifikanten Reduktion der Lymphozyten in der Peripherie des Blutes der CD44v10-defizienten Tieren kommt. Den zweiten Teil und Schwerpunkt dieser Arbeit bildeten Untersuchungen zur Funktion von CD44v10 im DTH-Modell. Dabei konnte ich nachweisen, dass die fehlende Expression von CD44v10 auf der Zelloberfläche eine signifikant supprimierte DTH-Reaktion zur Folge hat. Histologische Untersuchungen zeigten, dass die supprimierte Reaktion auf ein verringertes zelluläres, inflammatorisches Infiltrat und eine reduzierte Ausbildung eines lokalen Ödems sowie eine verzögerte Migration der Granulozyten zurückzuführen ist. In den Analysen bezüglich einer funktionellen Beteilung von CD44v10 an proliferativen wie auch apoptotischen Signaltransduktionskaskaden zeigte ich einen Zusammenhang zwischen der Expression von CD44v10 auf Lymphozyten und einer erhöhten Sensitivität der Zellen gegenüber apoptotischen Mechanismen, die u. a. zu einer erhöhten Apoptoserate im inflammatorischen Bereich der Ohren führt. Ich konnte weiterhin belegen, dass es bei der spezifischen Aktivierung von Lymphozyten über den TCR/CD3-Komplex, durch die fehlende Expression der CD44v10-Isoform auf der Zelloberfläche, zu einer gesteigerten Proliferationsrate kommt; diese Daten weisen daraufhin, dass CD44v10 als ein „BystanderRezeptor“ des TCR/CD3-Rezeptorkomplexes auf T-Zellen fungieren könnte. ZUSAMMENFASSUNG 83 Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit konnte ich eine vollkommen neue funktionelle Bedeutung von CD44v10 auf Zellen des Endothels ermitteln. So zeigen meine Untersuchungen an Knochenmark-Chimären erstmalig, dass nur die Expression von CD44v10 auf dem Endothel für eine erfolgreiche DTH-Reaktion notwendig ist. In den von mir durchgeführten Knochenmarktransferstudien führte die Rekonstitution von CD44v10defizienten Tieren mit CD44v10-positivem Wildtyp-Knochenmark zu einer signifikant supprimierten DTH-Antwort und der Transfer von CD44v10-defizientem Knochenmark in CD44v10-positive Wildtyptiere zu einer normalen Reaktionsantwort. Dadurch konnte der Nachweis erbracht werden, dass die Expression von CD44v10 auf den Effektor- bzw. hämatopoetischen Zellen nicht allein essentiell für die Ausbildung einer kutanen DTHReaktion ist, sondern auch die Expression des Moleküls auf den Zellen des Endothels. Meine Daten der Analysen des Zytokinprofils innerhalb des inflammatorischen Bereiches der Ohren verdeutlichen des Weiteren, dass die Interaktionen von CD44v10 mit Zytokinen bzw. die Induktion oder Repression der Expression und/oder Sekretion über CD44v10 eine weitere entscheidende Rolle in einer DTH-Reaktion spielen. LITERATUR 84 7 LITERATURVERZEICHNIS Adams, J.C. 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Esche und Frau Priv. Doz. Dr. U. Günthert bedanken, die es mir ermöglicht haben, diese Arbeit fertig zustellen. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H. Esche für seine engagierte Unterstützung und ständige Diskussionsbereitschaft. Weiterhin möchte ich ihm für seine intensive Betreuung und Bemühungen sowie seine objektive wissenschaftliche Kritik danken. Ulla danke ich vor allem für ihren unermüdlichen Einsatz zum Vollenden und Gelingen dieser Arbeit. Des Weiteren möchte ich ihr für ihre anregenden und fachlichen Diskussionen, für ihre intensiven Bemühungen jeglicher Art und für ihre Gastfreundschaft sehr herzlich danken. Danken möchte ich Herrn Priv. Doz. Dr. S.N. Wagner für die Bereitstellung des Themas. Ganz herzlich danke ich meinen Laborkollegen Katja, Rozita und Silke für die angenehme Arbeitsatmosphäre. Ebenfalls danken möchte ich allen Angehörigen des Instituts für Zellbiologie für die gute Kooperation und für die gelegentliche Nutzung einiger Geräte. Besonderer Dank gilt Raif und Lothar für die Bereitstellung fehlender Materialien und ihre anregende Diskussionsbereitschaft. Insbesondere danke ich Claudine Kühn für ihren moralischen Zuspruch in allen Lebenslagen und ihre Bemerkungen, die jedes ergebnislose Experiment zu einem Gewinn machten. Ulla Schmücker danke ich für ihre tatkräftigen Unterstützungen bei den verschiedensten Dingen und ihre herzliche Art, die mich jeden Tag gern zur Arbeit gehen ließen. Des Weiteren danke ich Silvia Davies für ihre Bemühungen bei allen administrativen Angelegenheiten während meiner Promotion und für ihre immerwährende Hilfsbereitschaft sowie Freundlichkeit mir gegenüber. Margrit Weidenbach danke ich für unsere kleinen „privaten Raucherpausen“. Ganz besonders danken möchte ich meinem ehemaligen Kollegen Dr. Oliver, der mehr Leid als Freud mit mir teilte und mich immer wieder zum Durchhalten gebracht hat. Zudem danke ich ihm für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Prof. Dr. E. Gulbins danke ich sehr für seine engagierte Unterstützung und Diskussionsbereitschaft zur Lösung so mancher Probleme. Seiner Arbeitsgruppe danke ich für die immense Hilfsbereitschaft und die witzigen Stunden zwischendurch. Herrn Prof. Dr. Schmid, Frau Linker und Frau Bellenberg danke ich für die Kooperation und die fachliche Unterstützung. Meiner eifrigen Korrekturleserin, Frau Gisela Grothus, danke ich für ihre Bemühungen, meine Arbeit zu korrigieren. Meiner Mutter und Elke Bessert danke ich dafür, dass sie sich mit soviel Liebe um Niklas kümmerten, wenn ich mal wieder stundenlang am Computer saß. Danken möchte ich auch meinem Lebensgefährten und Vater von Niklas, Peter Bessert, der durch seine Geduld und sein Verständnis mir stets einen Weg aus einer gedachten Sackgasse wies und immer an mich geglaubt hat. Mein tiefster Dank gilt aber meinem, Sohn Niklas für die wundervollen, aufmunternden und liebevollen Augenblicke, die er mir schenkte und die mich so unendlich viel Kraft schöpfen ließen im tristen Alltag des Zusammenschreibens. PUBLIKATIONEN 97 9 PUBLIKATIONEN Lehmkühler, O., Gunselmann, F., Gunawardena, B., Esche, H. und Brockmann, D. (2002): Evasion of adenovirus-transformed cells from the host`s immune system. Curr Top Virol 2:141-9. Lehmkühler, O., Kühn, C., Gunawardena, B., Esche, H. und Brockmann, D. (2002): A point mutation in the first splice donor leads to reduced oncogenic properties of the adenovirus serotype 12 E1A gene. Intervirology 46:1-16. LEBENSLAUF 98 10 LEBENSLAUF Persönliche Daten ______________________________________________ Name Bettina Gunawardena Geburtsdatum 09.05.1972 Geburtsort Berlin Familienstand ledig, ein Sohn Anschrift Virchowstr. 157, 46047 Oberhausen Schulausbildung ______________________________________________ 1978-1982 Grundschule im Hinsberg, Recklinghausen 1982-1991 Gesamtschule, Marl-Mitte Juni 1991 Allgemeine Hochschulreife Hochschulausbildung ______________________________________________ 10/1991-09/1997 Studium der Biologie, Ruhr-Universität Bochum 07/1996 Mündliche Diplomprüfung 08/1996-09/1997 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie, Ruhr-Universität Bochum 03.11.1997 Abschluss: Diplom Biologin seit September 1998 Wissenschaftliche Angestellte und Promotion am Institut für Molekularbiologie (Tumorforschung), Universität DuisburgEssen Oberhausen, den 06.12.2003 ERKLÄRUNGEN 99 11 ERKLÄRUNGEN Erklärung zu § 6, Abs. 2, Nr. 7: Hiermit erkläre ich, gem. § 6, Abs. 2, Nr. 7 der Promotionsordnung der Fachbereiche 6 bis 9 zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich das Arbeitsgebiet, dem das Thema „Die Rolle der CD44v10-Isoform in kutanen Entzündungsreaktionen“ zuzuordnen ist, in Forschung und Lehre vertrete und den Antrag von Frau Bettina Gunawardena befürworte. Essen, den ______________ ___________________________ (Prof. Dr. H. Esche) Erklärung zu § 6, Abs. 2, Nr. 6: Hiermit erkläre ich, gem. § 6, Abs. 2, Nr. 6 der Promotionsordnung der Fachbereiche 6 bis 9 zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient habe. Essen, den ______________ ___________________________ (Bettina Gunawardena) Erklärung zu § 6, Abs. 2, Nr. 8: Hiermit erkläre ich, gem. § 6, Abs. 2, Nr. 8 der Promotionsordnung der Fachbereiche 6 bis 9 zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw. Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe und dass diese Arbeit von keiner anderen Fakultät abgelehnt worden ist. Essen, den ______________ ___________________________ (Bettina Gunawardena)
