Humane Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infektion und Persistenz

Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Virologie
der Ruhr-Universität Bochum
Ehemaliger Direktor: Prof. Dr. med. H. Werchau
Arbeitsgruppe: PD Dr. med. P. Kiefer
Humane Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infektion und
Persistenz in undifferenzierten und differenzierten HL-60Zellen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Annette Noldes
aus Ahlen
2001
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Priv.-Doz. Dr. med. P. Kiefer
Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. U. Schauer
Tag der mündlichen Prüfung: 23. Oktober 2001
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ___________________________________________________ 1
1.1 Die Pathogenität _________________________________________________ 1
1.2 Das Virus _______________________________________________________ 4
1.3 Die Immunantwort________________________________________________ 6
1.4 Fragestellung____________________________________________________ 9
2 Materialien und Methoden _____________________________________ 10
2.1 Material________________________________________________________ 10
2.1.1 Chemikalien ___________________________________________ 10
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ___________________________________ 11
2.1.3 Geräte________________________________________________ 11
2.1.4 Enzyme _______________________________________________ 12
2.1.5 Lösungen, Puffer und Medien______________________________ 12
2.1.6 Verwendete Zellen und Virusstämme ________________________ 14
2.1.7 Antikörper _____________________________________________ 14
2.1.8 Oligonukleotide _________________________________________ 15
2.1.9 Verwendete Kits ________________________________________ 15
2.2 Methoden der Zell- und Viruskultivierung ___________________________ 15
2.2.1 Zellzucht ______________________________________________ 15
2.2.2 Viruskultivierung ________________________________________ 17
2.3 Nachweis der Virusinfektion ______________________________________ 18
2.3.1 Mikrotitration ___________________________________________ 18
2.3.2 Nachweis der Infektion durch indirekte Immunfluoreszenz________ 18
2.3.3 Isolierung von viraler mRNA aus Zellen ______________________ 19
2.3.4 cDNA-Synthese ________________________________________ 20
2.3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion zu Amplifizierung von DNA ________ 20
2.3.6 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen ____________________ 22
2.4 Apoptose-Untersuchungen _______________________________________ 22
2.4.1 Analyse der DNA-Degradierung ____________________________ 22
2.4.2 3´-OH-End-Markierung (TUNEL-Test) _______________________ 23
2.4.3 Hoechst-Färbung für Apoptose_____________________________ 23
2.5 PCR___________________________________________________________ 24
2.5.1 Prä-PCR-Phase ________________________________________ 24
2.5.2 PCR _________________________________________________ 24
2.5.3 Post-PCR-Phase________________________________________ 25
3 Ergebnisse _________________________________________________ 26
3.1 Standardisierung der Infektion ____________________________________ 26
3.1.1 Vermehrung des Virus ___________________________________ 26
3.1.2 Morphologie infizierter HEp-2- und A549-Zellen ________________ 26
3.1.3 Austestung der Kulturbedingungen__________________________ 28
3.1.4 Nachweis der Infektion ___________________________________ 29
3.1.5 Produktive Infektion _____________________________________ 32
3.1.6 Untersuchung auf Apoptose _______________________________ 32
3.2
Infizierbarkeit
von
humanen
Promyelozyten,
Granulozyten
und
monozytären Leukozyten ____________________________________________ 34
3.2.1 Morphologie der undifferenzierten und differenzierten HL-60-Kultur 34
3.2.2 Untersuchung der Infizierbarkeit mit RSV _____________________ 37
3.2.3 Untersuchung der produktive Infektion mit RSV ________________ 40
3.2.4 Langzeitbeobachtung einer RSV-infizierten HL-60-Zellkultur ______ 40
3.2.5 Untersuchungen zur Apoptose von infizierten Zellen ____________ 42
3.3 Langzeitbeobachtung der RSV-infizierten Makrophagen-Zellinie NR8383 _ 44
3.4 Infektionsnachweis mittels In situ PCR _____________________________ 47
3.4.1 Prä-PCR-Phase ________________________________________ 48
3.4.2 PCR _________________________________________________ 49
3.4.3 Post-PCR-Phase________________________________________ 51
4 Diskussion__________________________________________________ 55
4.1 Standardisierung der Infektion ____________________________________ 56
4.2
Infizierbarkeit
von
humanen
Promyelozyten,
Granulozyten
und
monozytären Leukozyten ____________________________________________ 57
4.3 Infizierbarkeit der Makrophagen-Zellinie-NR8383 _____________________ 59
4.4 In situ RT-PCR __________________________________________________ 60
5 Zusammenfassung ___________________________________________ 63
6 Literaturverzeichnis __________________________________________ 65
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Lokalisation und Funktion der RSV-Proteine
5
Abbildung 2: HEp-2-Zellkultur, 48 Stunden nach Infektion mit 0,1 pfu RSV Long
27
Abbildung 3: HEp-2-Zellkultur, 72 Stunden nach Infektion mit RSV Long
28
Abbildung 4: 24 Stunden infizierte Zelle der Linie A 549, ImmunfluoreszenzReaktion mit dem Antikörper RSV3-NCL und FITC-konjugiertem
sekundären Maus-Antikörper
30
Abbildung 5: Negativkontrolle der Immunfluoreszenz mit nicht infizierten Zellen
31
Abbildung 6: 20 Stunden mit 0,1 pfu RSV Long infizierte Zellen der Linie A 549
33
Abbildung 7: Negativkontrolle des TUNEL-Tests mit nicht RSV infizierten A549Zellen
33
Abbildung 8: Undifferenzierte HL-60-Zellen
35
Abbildung 9: DMSO induzierte HL-60-Zellen
36
Abbildung 10: TPA induzierte HL-60-Zellen
37
Abbildung 11: Undifferenzierte HL-60-Zellen
38
Abbildung 12: DMSO differenzierte HL-60-Zellen, 24 Stunden nach Infektion mit
RSV
39
Abbildung 13: TPA-differenzierte HL-60-Zellen, 24 Stunden nach Infektion mit
RSV
39
Abbildung 14: Drei Wochen mit RSV infizierte HL-60-Zellen
41
Abbildung 15: Nicht infizierte Kontrollzellen
41
Abbildung 16: Hoechst-Reaktion bei HL-60-Zellen, die 24 Stunden mit RSV
infiziert waren
43
Abbildung 17: Kontrolle mit HL-60-Zellen, die nicht infiziert wurden
43
Abbildung 18: Zellen der Linie NR8383
45
Abbildung 19: Zellen der Linie NR8383, 48 Stunden mit RSV infiziert
45
Abbildung 20: Drei Wochen infizierte NR8383
46
Abbildung 21: Kontrolle nach drei Wochen mit nicht infizierten NR8383-Zellen
46
Abbildung 22: In situ RT-PCR mit Zellen der Linie A549
52
Abbildung 23: Negativkontrolle der In situ RT-PCR
53
Abbildung 24: Positiv-Kontrolle der In situ RT-PCR
53
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ATCC
American Type Culture Collection
BCIP
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatat
BSA
Rinderserumalbumin
bp
Basenpaare
cDNA
komplementäre DNA
DEPC
Diethyl-dicarbonat-diethyl-oydiformat
Dig
Digoxigenin
DMEM
Dulbecco´s modified Eagle´s Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
FITC
Fluoresceinisothiocynat
FKS
fötales Kälberserum
h
Stunden
IF
Immunfluoreszenz
min
Minuten
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NBT
Nitro blue tetrazolium
PBS
Phosphat gepufferte Salzlösung
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
pfu
Plaque forming units
RSV
Respiratory Syncytial Virus
RT
Raumtemperatur
Triton X-100
Octophenyl-polyethylenglycolether
ü.N.
über Nacht
1 Einleitung
1.1 Die Pathogenität
Das Respiratory-Synzytial-Virus (RSV) wird aufgrund der Erscheinungen benannt,
die es beim Kranken und in vielen Kulturzellen verursacht: Beim Infizierten
entstehen Entzündungen des Respirationstraktes; in der Zellkultur bilden sich
typische Riesenzellen, Synzytien genannt, aus [1].
Neben den Masern gehört die Infektion mit dem RSV zu den bedeutendsten
Viruskrankheiten des Kindes, wobei Kinder im Alter zwischen sechs Wochen und
sechs Monaten besonders schwer erkranken. Erkrankungen treten während des
ganzen Jahres auf, jedoch finden sich gehäufte Infektionen bis hin zu Epidemien in
den Monaten von Oktober bis Mai, besonders im Januar und Februar. Das Virus tritt
ubiquitär auf und wird wahrscheinlich über Nasensekret, kontaminierte Gegenstände
und durch Tröpfcheninfektionen übertragen. Die Durchseuchung steigt sehr früh an,
so daß am Ende des zweiten Lebensjahres nahezu alle Kinder Antikörper tragen. Die
häufigen Zweitinfektionen verlaufen milder [1;2;3].
Nach einer Inkubationszeit von vier bis sechs Tagen entwickeln sich die klinischen
Symptome. Bei der Infektion von gesunden Kindern im Alter von sechs Wochen bis
zu neun Monaten bewirkt die RSV-Infektion gewöhnlich Symptome einer Infektion
des oberen Respirationstrakts mit leichtem Fieber. Asymptomatische Infektionen
treten gewöhnlich nicht auf. In 25 % bis 40 % der Fälle wird auch der
Respirationstrakt unterhalb des Larynx mitbefallen. Je nach Lebensalter bleibt es bei
einer Tracheobronchitis, oder es entwickelt sich eine Bronchiolitis oder gar
Pneumonie. Durch Verengung bzw. Verlegung der Bronchiolen werden die Kinder
dyspnoeisch, die Atmung wird gepreßt und keuchend, und es stellen sich Zeichen der
Atemnot mit Nasenflügeln und Flankenatmung ein. Fieber und Husten finden sich
fast immer. Es ist eine respiratorische Partial- oder Globalinsuffizienz festzustellen.
Die Erkrankungsdauer beträgt je nach Schwere des Krankheitsbildes ein bis drei
Wochen. Die Infektion kann im Säuglings- und Kleinkindesalter zum Exitus letalis
führen, besonders wenn bakterielle Superinfektionen und Bronchopneumonien sowie
kardiale und pulmonale Vorerkrankungen hinzukommen [3;4]. Infektionen älterer
1
Kinder verlaufen meistens als Tracheobronchitis mit Husten und Fieber. Ein Drittel
aller kranken Kinder entwickelt eine Otitis media, die durch bakterielle
Superinfektionen kompliziert wird [3;5]. Die Otitis media stellt eine relativ häufige
Komplikation dar. Bei älteren Kindern und Erwachsenen verläuft die Infektion
meistens
als
febrile
oder
afebrile
Erkältungskrankheit,
die
mit
einer
Tracheobronchitis einhergehen kann.
Die RSV-Infektion breitet sich auch auf die Konjunktiven aus [6]. Bei alten und
immungeschwächten Patienten kann es zu schweren Pneumonien kommen [7;8].
RSV-Infektionen
scheinen
sehr
selten
für
Meningitiden
und
Myelitiden
verantwortlich zu sein, außerdem selten zu einem flüchtigen Exanthem zu führen [3].
In Fällen von Patienten mit zellulärer Immunschwäche ist eine Virusausbreitung auch
außerhalb des Respirationstaktes in andere Organe, wie Niere, Leber und Myokard,
beobachtet worden [9;10;11]. Weiterhin wird vermutet, daß RSV an der Genese des
Morbus Paget des Knochens beteiligt ist. Die veränderten Osteoklasten der Knochen
erkrankter Patienten exprimieren virale Antigene von RSV [12;13;14;15].
Etwa 40-60 % der Säuglinge und Kleinkinder mit einer RSV-induzierten
Bronchiolitis leiden später an revidierenden obstruktiven Bronchitiden oder an einem
Asthma bronchiale [16]. Bei diesen ist sowohl lokal wie im Serum RSV-spezifisches
IgE nachzuweisen, dessen Konzentration in etwa mit der Schwere der Erkrankung
korreliert [17].
Die Infektion erfolgt über die Schleimhäute des Respirationstrakts mit Ausbreitung
von Zelle zu Zelle ohne nachweisbare Virämie. Als Folge der Virusvermehrung
kommt es zu zytopathogenen Effekten mit Synzytienbildung und epithelialen
Zellnekrosen. Es bildet sich ein peribronchioläres Infiltrat aus, welches sich aus
Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen zusammensetzt. Die Submukosa und
das
umgebende
Bindegewebe
werden
ödematös
aufgetrieben,
und
die
Schleimsekretion steigt. Folge ist eine Obstruktion der kleinen Bronchien, Bronchioli
terminales und respiratorii I bis III, welche zu einem Kollaps oder einem Emphysem
der distalen Segmente der Luftwege führt. Bei Auftreten einer Pneumonie verdicken
sich die interalveolären Wände durch die mononukleäre Zellinfiltration, und die
Alveolen sind mit Schleim ausgefüllt [2;18].
2
Vakzinationsversuche mit abgetötetem RS-Virus in den 60er Jahren zeigten, daß
geimpfte Kinder durch RSV-Antikörper nicht geschützt wurden, sondern an
schweren RSV-Infektionen erkrankten [2]. Das inaktivierte Virus produziert eine THelfer-2-Typ-Antwort, wohingegen lebende Viren eine Antwort vom Typ der THelfer-1-Zellen hervorrufen. Es werden in der Abwehr der Infektion also auch CD4positive Zellen und zytotoxische Lymphozyten gebraucht [3].
Die Diagnose erfolgt hauptsächlich durch das klinische Bild, das Alter des Kindes
und das jahreszeitliche Auftreten der Infektion. Eine virologisch-serologische
Diagnostik ist in jedem Fall durch Isolierung von infektiösem Virus aus Nasensekret
und Nachweis der spezifischen Immunreaktion durch RSV-Antikörpernachweis im
Blut erforderlich [2]. Die Labordiagnose wird durch ELISA oder Immunfluoreszenz
an Nasopharynx-Sekret gestellt [18].
Etwa 1 % der erkrankten Säuglinge und Kleinkinder müssen stationär behandelt
werden. Gute Betreuung in der Intensiv-Abteilung kann den letalen Ausgang der
Bronchiolitis-Pneumonie bei Säuglingen und Kleinkindern verhindern [19;20].
Allgemeine Maßnahmen umfassen die Überwachung des respiratorischen Status,
evtl. eine Beatmung bei Patienten mit Phasen der Apnoe oder Hypoxie oder Azidose.
Die Patienten werden ausreichend hydriert und evtl. parenteral ernährt. Die
symptomatische
Therapie
umfaßt
in
einigen
Kliniken
die
Gabe
von
Bronchodilatatoren und Glukokortikoiden. Ribavirin wird in der antiviralen Therapie
nach Diagnose des Erregers mit Erfolg eingesetzt, ebenso Palivizumab und RSVIGIV, RSV-Immunglobulinen zur intramuskulären oder intravenösen Gabe, bei
Frühgeborenen, Kindern mit bronchopulmonaler Dysplasie und immungeschwächten
Kindern [21;22;23].
Eine effektive Prophylaxe ist nicht bekannt. Die bisherigen Impfungen mit
inaktivierten Vakzinen haben zu keinem Impfschutz geführt, sondern eine höhere
Komplikationsrate nach Wildvirus-Exposition verursacht als Wildvirus-Infektionen
bei nicht Geimpften. Neuere Forschungen richten sich auf die Entwicklung von
Vakzinen
auf
RSV-Glykoprotein-Basis
und
attenuierten
rekombinanten
Lebendimpfstoffen, welche u.a. mit Hilfe der sogenannten "reversen Genetik" durch
Zusammenstellung biologischer Komponenten aus cDNA hergestellt werden
[24;25;26]. Man muß beachten, daß die Erkrankung durch das RS-Virus in den
3
Drittländern ohne entsprechende medizinische Möglichkeiten der Betreuung der
Patienten häufig schwerer verläuft als hierzulande [27].
1.2 Das Virus
RSV wurde erstmals 1956 bei einem erkrankten Laborschimpansen, der Symptome
einer Erkältung zeigte, isoliert. Kurz danach fand man bei einem Kind in Baltimore
mit Pneumonie und einem zweiten mit Krupp das gleiche Virus [18].
RSV gehört zur Familie der Paramyxoviren, die sich in drei Gattungen aufteilen:
Morbilli-Virus, welche das Masern-Virus einschließt, Paramyxo-Virus, zu dem das
Sendai-Virus, das Mumps-Virus und die humanen Parainfluenza-Viren der Typen 1,2
und 3 zählen, und Pneumovirus, welche das Pneumonie-Virus der Maus, das
Truthahn-Rhinotracheitis-Virus und RSV des Menschen, des Kalbes, der Ziege und
das Schafes enthalten [28]. Obwohl es mit den Parainfluenza-Viren verwandt ist,
zeigt RSV einige Unterschiede. RSV besitzt die Eigenschaft, Zellfusionen
auszulösen, aber hämagglutiniert nicht und hat keine Neuraminidase-Aktivität,
welche typisch für andere Paramyxoviren sind [17].
Das Virus ist serologisch einheitlich: Postinfektionssera neutralisieren Stämme in
vitro mit nur geringen (bis zu vierfachen) Unterschieden in der Effektivität. Die
Untersuchung mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern zeigt das
Vorhandensein von zwei Untergruppen, A und B. Zur Untergruppe A gehören die
Stämme Long, A2, S2 und Edinburgh, zur Untergruppe B die Stämme 18537, RSN-2
und 8-60. Viele der viralen Proteine sind gut konservierte Antigene, doch enthalten
einige untergruppenspezifische Unterschiede. Das Glykoprotein ist innerhalb einer
Untergruppe relativ gut konserviert, zeigt allerdings große Unterschiede zwischen
den Untergruppen [18;29]. Beide Virusstämme zirkulieren während der Epidemien,
allerdings variiert das Verhältnis jährlich und regional [3].
RSV bindet an noch nicht identifizierte zelluläre Rezeptoren, und das Nukleokapsid
dringt durch Fusion an der Zelloberfläche in das Zytoplasma ein. Die
Virustranskription und die RNA-Replikation finden ausschließlich im Zytoplasma
statt. Die Viren sammeln sich in der Plasma-Membran der infizierten Zelle und
werden durch sogenanntes Budding freigesetzt, so daß das intrazelluläre
4
Nukleokapsid in eine virale Hülle, die von der infizierten Zelle stammt, verpackt
wird [18].
Abbildung 1: Lokalisation der RSV-Proteine. Elektronenmikroskopische Bilder.
Links: Letztes Stadium des Buddings von RSV an der Zellmembran einer infizierten
Zelle. Rechts: Freies Virus. Verändert nach [24].
RSV besteht aus einem Nukleokapsid, welches von einer Lipidhülle umgeben ist.
RS-Viren besitzen keine einheitliche Form. Sie können Durchmesser von 150 bis 300
nm erreichen, aber auch filamentöse Formen von 60 bis 100 nm im Durchmesser und
bis zu 10 ?m in der Länge annehmen. Die einsträngige (-)-Strang-RNA liegt in Form
eines
helikalen
Nukleokapsids
vor.
Die
Virushülle
besteht
aus
einer
Lipiddoppelschicht, die aus der Zellmembran der befallenen Zelle stammt, und
enthält viruskodierte transmembranale Oberflächenglykoproteine, die als Spikes
gleichmäßig in der Lipidhülle verteilt sind. Die Glykoproteine vermitteln das
Andocken und das Eindringen des Virus in die Zelle [18].
5
Das Genom von RSV kodiert elf Proteine. Das Glykoprotein G und das
Fusionsprotein F sind die Strukturelemente der viralen Spikes. Das F-Protein wird als
F0-Vorläuferprotein synthetisiert, welches in zwei Untereinheiten, die verbunden
bleiben, gespalten wird. Das G-Protein ist für das Andocken an die Zelle
verantwortlich, F vermittelt das Eindringen in die Zelle und die Synzytienbildung. G
und F sind die am stärksten wirksamen Antigene von RSV. Die Bedeutung des
kleinen, hydrophoben Proteins SH ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es könnte
das G- und F-Protein in ihrer Wirkung beeinflussen.
Zwischen Lipidmembran und dem Nukleokapsidknäuel findet man das Matrixprotein
M, welches die Vereinigung von Nukleokapsid und Hülle vermittelt. Die
Matrixproteine M2-1 und M2-2 entstehen aus der M2-mRNA, die zwei offene
Leserahmen
besitzt.
Nukleokapsidproteine,
M2-1
während
fördert
M2-2
die
Transkriptase-Aktivität
möglicherweise
ein
der
negativer
Regulationsfaktor für die Replikation und Transkription darstellt. Das virale
Nukleokapsid besteht aus vRNA und dem Nukleokapsidprotein N, dem
Phosphoprotein P und der großen Untereinheit der RNA-abhängigen RNAPolymerase L. L ist die Hauptuntereinheit der RNA-Polymerase, N besitzt
strukturelle Funktion, und P assoziiert mit freiem N und L, um sie vor der Interaktion
mit dem Nukleokapsid in löslicher Form zu halten.
In den infizierten Zellen, in Spuren auch in den Viren, finden sich die NichtStrukturproteine NS 1 und NS 2, deren Funktion unbekannt ist. NS 2 stellt eventuell
einen negativen Regulationsfaktor für die Replikation und Transkription dar [24].
RSV-mRNA kann erstmals vier bis sechs Stunden nach der Infektion nachgewiesen
werden. Nach 16 Stunden ist der Höhepunkt der mRNA-Bildung erreicht, nach 18
bis 20 Stunden der der Proteinbildung [18].
1.3 Die Immunantwort
Asthma tritt in der Kindheit nach akuter viraler Bronchiolitis im Säuglingsalter
signifikant häufiger auf als bei Kindern, die nicht schwer erkrankten [16;30;31]. Der
kausale Zusammenhang ist noch unklar. Die Thesen über die Verbindung von RSVBronchiolitis und Asthma tendieren zwischen der Meinung, daß die Entwicklung von
Asthma ein Marker für eine Veranlagung zu Atopie ist, und der Meinung, daß der
6
Infektion des unteren Respirationstraktes häufig die Entwicklung von bronchialer
Hyperreagibilität und Asthma folgt [32;33;34;35].
Daran ist zu erkennen, wie groß die Rolle der Immunantwort des Wirtes bei der
Entwicklung der Symptome ist [36;37;38]. So sind die Spiegel von Interleukin-6 und
-8 (IL-6, IL-8) in nasalem und trachealem Sekret erhöht [39]. Sogenannte Th2Zellen, eine Untergruppe der CD4+-Helfer-Zellen, veranlassen eine Überproduktion
von Interleukin-4, -5 und anderen Zytokinen, die einen entzündlichen Prozeß,
begleitet
von
erhöhter
IgE-Produktion
und
Anziehung
von
eosinophilen
Granulozyten in das Gewebe, einleiten [40;41;42]. Auch die Veränderungen im
Lungengewebe bei Asthma sind ein Ergebnis einer übermäßigen Immunantwort vom
Th2-Typ [43;44]. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß das Einbringen von
RSV-G-Protein durch einen viralen Vektor in die tiefen Luftwege eine Th2-Antwort
induziert [45].
Es gibt weiterhin Hinweise darauf, daß eine Viruspersistenz in der Lunge eine
wichtige Ursache für die Entwicklung von Asthma darstellen könnte [46]. Virale
Proteine konnten bei Meerschweinchen noch sechs Wochen nach Infektion
intrazytoplasmatisch in Bronchialepithelzellen nachgewiesen werden [47;48]. In
einer weiteren Studie konnte 60 Tage nach Infektion virales Protein und durch PCR
genomische RNA identifiziert werden, die nur aus lebenden Viren stammen konnte,
da die RNA von inaktivierten Viren durch die Endogene Ribonuklease verdaut
worden wäre [49]. Chronische Persistenz von infektiösem RSV in der Lunge von
Meerschweinchen konnte über 60 Tage beobachtet werden und war verbunden mit
virusspezifischer IgE-Produktion und chronischer Infektion der Luftwege [50].
Alveolarmakrophagen haben in der Infektabwehr der Lunge eine große Bedeutung
[51]. Alveolarmakrophagen werden in vivo während der Infektion mit RSV ebenso
wie
Alveolarepithelzellen
infiziert,
wie
an
Bronchiallavage-Material
von
transplantierten immunsupprimierten Menschen gezeigt werden konnte [52].
Humane Alveolarmakrophagen-Kulturen enthalten Subpopulationen von Zellen,
welche empfänglich für Replikation oder bestehende RSV-Infektionen für Perioden
bis zu 600 Stunden (25 Tage) sind [53]. Aktivierte Makrophagen enthalten weniger
Virus als nicht-aktivierte [54].
7
Es war weiterhin möglich, aus venösem Blut isolierte Monozyten und Lymphozyten
in vitro zu infizieren. In vivo wurden RSV-Antigene und in zirkulierenden
Leukozyten nachgewiesen, allerdings kein infektiöses Virus [55]. RSV-RNA,
genomische wie mRNA, konnte im Blut, gleichzeitig nicht im Serum, detektiert
werden, was bedeutet, daß Zellen des Blutes infiziert sein müssen [56]. Quantitative
Studien zeigten, daß Granulozyten und nicht adhärente Monozyten vergleichsweise
resistent gegen die in vitro-Infektion mit RSV waren, wohingegen adhärente
Monozyten, besonders Monozyten aus Nabelschnurblut und Alveolarmakrophagen,
sich in hohem Maße mit RSV infizieren ließen [57]. Genomische und mRNA
konnten, vermutlich zellgebunden, schon im Blut von Neugeborenen durch PCR
nachgewiesen werden [58]. Differenziertere, zwei bis vier Tage alte Monozyten
produzierten in vitro mehr Virus als frisch isolierte, einen Tag alte Monozyten [59].
Der Mechanismus der Persistenz ist bei RSV noch völlig unbekannt. Mögliche
Strategien des Virus wären die Produktion von nicht-infektiösen Viren, die
homologes infektiöses Virus für die Replikation benötigen (defective interfering
particles) [60] oder die Produktion von Temperatur-sensitiven oder viralen Mutanten
[61;62], welche vom Immunsystem nicht erkannt werden, da wenige oder veränderte
virale Proteine hergestellt werden. Auch von anderen Viren bekannte Strategien wie
Wirtszell-Resistenz gegen lytische Infektionen oder die Einstellung eines
Gleichgewichts zwischen infizierten und nicht-infizierten Wirtszellen könnten für die
Persistenz verantwortlich sein [60]. Das Unvermögen der Wirtszellen, die viralen
Glykoproteine zu prozessieren und somit eine geringere Zahl von Viren zu
produzieren, oder die Produktion von antiviralen Proteinen wie Interferon, die die
Virus-Produktion herabsetzen, könnten eine Rolle spielen. Da die Synzytienbildung
in einigen Studien nicht nachgewiesen werden konnte, mag vielleicht das
uneffiziente Processing des F-Proteins eine Ursache sein [53;63]. Es ist ebenso
möglich, daß Zytokine, die von Alveolarmakrophagen produziert werden, wie
Prostaglandin E2 oder Tumornekrosefaktor, die Virusreplikation modifizieren [53].
Persistente Infektionen konnten auch bei anderen Vertretern der Familie der
Paramyxoviren nachgewiesen werden. Das Sendai Virus infiziert und persistiert in
Nervengewebe der Maus [64]. Masern-Virus kann in Zellen des ZNS und
Lymphozyten persistieren und die Subakute Sklerosierende Panenzephalitis (SSPE)
8
auslösen. Die persistierende Infektion geht hierbei mit deutlich verringerten
Produktion bestimmter Oberflächenproteine einher, die während der akuten Infektion
die Antikörperbildung und die Hämagglutination verhindern [65]. Das Mumps-Virus
kann eine akute Arthritis verursachen und spielt womöglich eine Rolle bei der
Entstehung chronisch-entzündlicher Gelenkerkrankungen. Gemischte Kulturen von
Zellen der Synovialmembran und Chondrozyten konnten produktiv über zwei bis drei
Monate persistent infiziert werden [66].
Hepadnaviren infizieren periphere Blutmonozyten und Leukozyten bei Patienten mit
chronischer Hepatitis B und Serokonversion. Die Infektion dieser Zellen durch HBV
könnte die Immunreaktion gegen das Virus beeinflussen und somit die Persistenz
verursachen [67]. Diese Strategie könnte auch bei der Entwicklung der Persistenz bei
RSV eine Rolle spielen.
1.4 Fragestellung
Ziel dieser Arbeit sollte es sein, Zellen, die möglicherweise die Träger der Persistenz
sind, zu identifizieren. Die Untersuchung anhand der Promyelozyten-Zellinie HL-60
(humane promyelozytische Leukämie-Zellinie) und der Alveolarmakrophagenlinie
NR8383 der Ratte sollte zeigen, wie lange in welchen Zellen der myeloischen
Zellreihe RSV nachweisbar ist. Differenzierte und undifferenzierte HL-60-Zellen
wurden für die Experimente benutzt.
9
2 Materialien und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
4-nitro blue tetrazolium chloride (NBT)
solution
Boehringer Mannheim
5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphatat
(BCIP)
Boehringer Mannheim
Agarose
biozym
BSA
Sigma
DEPC
Sigma
Digoxygenin-markierte dNTP-Nukleotide;
Boehringer Mannheim
Digoxigenin-11-dUTP; Anti-DigoxigeninAntikörper; Fab-Fragment, Alkalische
Phosphatase-konjugiert
DMSO
Sigma
dNTP-Nukleotide
Pharmacia
Dulbecco´s modified Eagle´s medium
Gibco BRL
EDTA
Merck
Ethidiumbromid
Gibco BRL
Formaldehyd
Riedel-de Haen
Fötales Kälberserum
Seromed
Gentamycin
Seromed
Giemsa
Merck
Glyzerin
Merck
10
Ham´s F12-Medium
Gibco BRL
Hoechst 33258
Sigma
NBT
Sigma
Mineralöl
Sigma
Polylysin
Sigma
RPMI-1640-Medium
Gibco BRL
TPA
Sigma
Tris
biomol
Triton X-100
Sigma
Trypsin
Gibco BRL
Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien wurden von den Firmen Baker, Riedel-de
Haen und Sigma bezogen.
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
Plastikwaren (Pipettenspitzen,
Brandt, Greiner, Nunc, Sarstedt, TPP
Reaktionsgefäße, Zellkulturgefäße etc.)
In situ PCR Glass Slides für Gene amp In
Perkin Elmer
situ PCR System 1000
AmpliCover Discs und AmpliCover Clips
Perkin Elmer
wasserabweisender Stift
Polysciences
2.1.3 Geräte
GeneAmp In Situ PCR System 1000:
Perkin Elmer
- Thermal-Cycler
- Assembly Tool
- Disassembly Tool
11
UNO Thermoblock
Biometra
Begasungsbrutbrutschränke
Heraeus
Zellkulturbank HeraSafe
Heraeus
Zentrifuge
für
Zellkultur:
Zentrifuge
Heraeus
Mikrofuge RF
Tischzentrifuge
Beckmann
Feinstwaage SBA 31
Scaltec
Horizontale Gelekektrophoresekammer für
Eurogentec
Agarose-Minigele Mupid 21
2.1.4 Enzyme
DNase I, RNase-frei
M-MuLV-Reverse Transkriptase
Taq-Polymerase
Pepsin
Trypsin
Boehringer Mannheim
Promega
Eurogentec
Sigma
Difco
2.1.5 Lösungen, Puffer und Medien
Alle angegebenen Puffer, Lösungen und Medien wurden - soweit nicht anders
angegeben - in Wasser angesetzt.
Zum Ansetzen von Lösungen oder Medien wurde ausschließlich demineralisiertes
Wasser aus der Reinstwasseranlage Seralpur PRO 90 CN der Firma Seral verwendet.
Für alle RNA-Experimente wurde dieses Wasser zusätzlich mit DECP versetzt und
autoklaviert. DEPC ist ein starker Inhibitor von RNasen.
DEPC-behandeltes Wasser
0,1 % DEPC in H2O, 12 h inkubieren bei 37°C,
autoklavieren oder erhitzen über 100°C, 15 min
12
DNase Verdau-Lösung
verdünnen auf 1 U/µL
in 0,1 M Natriumacetat, pH 5
5 mM MgSO4
frisch ansetzen, auf Eis aufbewahren, innerhalb
einer Stunde gebrauchen
Einfriermedium
40 % FKS in DMEM + 20 % DMSO in DMEM
Ethidiumbromid-Stammlösung
5 mg/ml Ethidiumbromid
Paraformaldehyd, 3,7 %
4 g Paraformaldehyd in 100 ml PBS
NBT/BCIP-Substrat-Lösung
50 µl NBT zu 20 ml Waschpuffer 2, vortexen,
50 µl
BCIP
hinzugeben;
frisch
herstellen,
innerhalb einer Stunde gebrauchen
PBS
130 mM NaCl
10 mM Natriumphosphat, pH 7,4
PCR master mix
1 x PCR-Puffer II
4,5 mM MgCl2
200 µM je dNTP
10 µM Digoxigenin-11-dUTP
0,8 µM je Primer;
aufheizen auf 70°C, dann Zugabe von 200 U/ml
Taq-Polymerase
Pepsin-Lösung
2 mg/mL (zwischen 6000-8000 U/mL)
in 0,01 N HCl
innerhalb einer Sunde gebrauchen
Reverse-Transkriptase-Lösung
1 x PCR Puffer II
5 mM MgCl2
1 mM je dNTP
1 µM pd(T)12-18-Primer
2500 U/ml M-MuLV RT;
frisch herstellen, auf Eis aufbewahren, innerhalb
einer Stunde gebrauchen
13
Stopp-Puffer
0,1 x SSC in 0,2 % BSA
wöchentlich frisch herstellen oder einfrieren
TAE-Puffer
40 mM Tris
5 mM NaOAc
1 mM EDTA
Triton X-100-Lösung
0,2 % Triton X-100 in PBS
Trypsin
2 % (w/v) Trypsin in PBS/EDTA, steril filtrieren
Waschpuffer 1
0,1 M Tris-HCl, pH 7,5
0,15 M NaCl
Waschpuffer 2
0,1 M Tris-HCl, pH 9,5
0,15 M NaCl,
50 mM MgCl2
2.1.6 Verwendete Zellen und Virusstämme
A549, humane Lungenkarzinom-Zellinie
HEp-2, humane Larynxkarzinom-Zellinie
HL-60
NR8383
RSV, Long-Stamm
ATCC-Nummer: CCL-185
ATCC-Nummer: CCL-23
freundl. Gabe von Frau PD Dr.
G. Jaques, Universität Marburg
ATCC
ATCC-Nummer: VR-26
2.1.7 Antikörper
NCL-RSV 3 (monoklonales Maus-
Novo Castra
Antikörpergemisch mit IgG-Antikörpern
gegen das M2-, P-, F- und N-Protein von
RSV gerichtet)
3C4 (monoklonaler Maus-Antikörper, IgG-
in der Abteilung vorhanden
Antikörper gegen das P-Protein gerichtet)
FITC-markierte Sekundärantikörper gegen
Jackson Lab
Maus-Antikörper
14
Texas-Red-markierte Sekundärantikörper
Jackson Lab
gegen Maus-Antikörper
2.1.8 Oligonukleotide
Die Primer wurden vor Gebrauch auf 100 µmol verdünnt.
pd(T)12-18
Pharmacia
N-2-3´-Primer
TCA TCG CTG TAC ATC ATT ATC
N-1-5´-Primer
ACC ATG GCT CTT AGC AAA GTC AAG
P-RSV-3-XHO
TCA GAA ATC TTC AAG TGA TAG ATC
P-RSV-5-XHO
CAT GGA AAA GTT TGC TCC TGA A
RSV3´(NS 1-N)
TTA TGG ATT AAG ATC AAA TCC
RSV5´(NS 1-N)
ACC ATG GGC AGC AAT TCA TTG AGT ATG
RSV-G 3´-RI
CTA CTG GCG TGG TGT GTT GGG TGG
RSV-2-STA
ATG ATA ATC TCA ACT TCA CTT
Alle RSV-Primer wurden von GibcoBRL/Life Technologies bezogen.
2.1.9 Verwendete Kits
In Situ Cell Detection Kit
RNeasy Midi Kit
Boehringer Mannheim
Qiagen
2.2 Methoden der Zell- und Viruskultivierung
2.2.1 Zellzucht
2.2.1.1 HEp-2 und A549
Die eingesetzten Zellinien HEp-2 und A549 wuchsen als einschichtiger Zellrasen
(Monolayer-Kultur) in Gewebekultur-Petrischalen und benötigten Dulbecco´s
Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Kalbserum
(FKS), welchem 50 µg/ml Gentamycin zugesetzt wurde. Die Kulturen wurden bei
15
37°C inkubiert.
Im Abstand von zwei bis drei Tagen erfolgte die Subkultivierung der Zellen durch
mehrmaliges Waschen der Zellen mit PBS und Zugabe von 0,1 % Trypsin in PBS.
Wenn die Zellen begannen sich abzulösen (nach ungefähr fünf Minuten), wurden sie
in Kulturmedium aufgenommen und in einer Verdünnung von 1:3 bis 1:5 wieder
ausgesät.
Die Lagerung von Eukaryontenzellen in flüssigem Stickstoff ermöglicht deren
langfristige Aufbewahrung, ohne daß die Zellen weiter passagiert werden müssen.
Das in dem Einfriermedium enthaltene DMSO verhindert die Bildung von
Eiskristallen und dadurch die Zerstörung der Zellen. Es muß beim Auftauen
möglichst schnell entfernt werden, da es für biologisch aktive Zellen toxisch ist.
Die als Monolayer wachsenden Zellen wurden abtrypsiniert, bei 300 x g zentrifugiert
und das Zellsediment mit 0,5 ml FKS resuspendiert. Danach wurden 0,5 ml
20 % DMSO in DMEM hinzugegeben, resuspendiert, die Zellsuspension in
Cyryogefäße überführt und eingefroren. Eingefrorene Zellen wurden im Cryogefäß
bei 37°C aufgetaut und die Zellsuspension in sterile Zentrifugenröhrchen überführt
und mit DMEM und 5 % FKS versetzt. Nach Zentrifugation bei 300 x g wurde der
Überstand
verworfen,
die
Zellen
resuspendiert
und
zur
Kultivierung in
Zellkulturschalen mit dem entsprechenden Medium gegeben.
2.2.1.2 HL-60
Die Zellen der Linie HL-60 wuchsen in einer Suspensionskultur in RPMI-1640Medium, welchem 10 %iges FKS und 50 µg/ml Gentamycin zugesetzt wurde. Die
Subkultivierung erfolgte durch Umsetzung im Verhältnis 1:5 nach drei bis vier
Tagen.
Die Zelldifferenzierung wurde durch den Zusatz von 1,5 % (210 mM) DMSO oder
10 ng/ml (1,7 x 10-8 M) TPA induziert.
Durch den NBT-Reduktase-Test konnte eine Quantifizierung der reiferen
16
myeloischen Zellen vorgenommen werden.
Die Zellen einer Kulturschale wurden in der Zellkulturzentrifuge pelletiert und
zweimal in RPMI-1640-Medium gewaschen. Danach resuspendierte man die Zellen
in 2 ml RPMI-1640-Medium, welches 0,1 % NBT und 100 ng/ml TPA enthielt.
Diese Zellsuspension wurde 20 min bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden mit Hilfe
einer Zytozentrifuge 10 min mit 100 rpm auf Objektträger zentrifugiert und mit
Giemsalösung gefärbt. Myelozyten, Metamyelozyten, stab- und segmentkernige
Neutrophile
enthielten
intrazellulär
blauschwarze
Ausfällungen,
die
lichtmikroskopisch sichtbar waren.
2.2.1.3 NR8383
NR8383-Zellen wuchsen kontinuierlich in Ham´s F12-Medium mit 15 % FKS und
50 µg/ml Gentamycin. Ungefähr nach sieben Tagen ist die Kultur subkultiviert
worden, indem der vorhandene Zellüberstand auf zwei Kulturschalen verteilt und mit
Medium aufgefüllt wurde.
2.2.2 Viruskultivierung
Am
Vortag
subkultivierte
HEp-2-
oder
A549-Zellen
wurden
mittels
Trypsinbehandlung gewonnen und in einer 2:3 Verdünnung in je 10 ml
Infektionsmedium in neue Petrischalen umgesetzt. Pro Zellkulturschale wurden 0,1
plaque forming unit (pfu) RSV zugesetzt. Die Inkubation erfolgte über 72 Stunden
bei 37°C. Als Infektionsmedium diente mit HEPES versetzte DMEM-Medium mit
1 % FKS und 50 µg/ml Gentamycin, welches nach 24 h gegen Medium mit 10 %
FKS ausgetauscht wurde.
Nach Überführung des virushaltigen Überstandes in sterile Röhrchen wurde dieser
durch Zentrifugation bei 900 x g und 4°C für 10 min von groben Zellbestandteilen
getrennt. Diese Virussuspension wurde aliquotiert und bei -80°C gelagert.
17
2.3 Nachweis der Virusinfektion
2.3.1 Mikrotitration
Die Mikrotitration diente dazu, die Zahl der infektiösen Viren aus geerntetem
Virusüberstand von infizierten HEp-2-Zellen zu bestimmen. Die Maßeinheit für die
Zahl der infektiösen Viren pro ml wird in plaque forming units (pfu) angegeben.
Von der zu untersuchenden Virussuspension wurde eine Verdünnungsreihe von 10-1
bis 10-8 in HEPES versetztem DMEM mit 1 % FKS und Gentamycinzusatz erstellt.
In jede der Vertiefung einer 96-Depot-Gewebekulturplatte wurden je etwa 2 x 104
HEp-2-Zellen in 100 µl Infektionsmedium und je 100 µl der dekadischen
Virusverdünnung gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden erfolgte die
Beurteilung der Morphologie der Zellen.
2.3.2 Nachweis der Infektion durch indirekte Immunfluoreszenz
Bei der indirekten Immunfloreszenz wurden monoklonale Antikörper gegen RSVProteine eingesetzt. Die indirekte Immunfluoreszenz erlaubte eine Vergleichbarkeit
von morphologisch oder durch In situ RT-PCR ermittelten Veränderungen durch die
RSV-Infektion und der Zahl der tatsächlich infizierten Zellen. Benutzt wurde diese
Methode sowohl bei HEp-2- und A549-Zellen als auch bei HL-60- und NR8383Zellen.
Benutzt wurden zum Nachweis sowohl Zellen, die auf mit Polylysin-beschichteten
Deckgläschen (10 %iges Polylysin in PBS, 10 min inkubieren) gewachsen waren, als
auch Suspensionszellen, die mit Hilfe einer Zytozentrifuge 10 min mit 1000 rpm auf
die Objektträger zentrifugiert wurden. Zum Zeitpunkt der Auswertung des jeweiligen
Versuches erfolgte nach mehrmaligem Waschen mit PBS die Fixierung durch 4 %
Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur (RT). Nach mehrmaligem Waschen
mit PBS wurden die Zellen 4 min mit 0,2 % Triton X-100 bei RT permeabilisiert.
Die Deckgläschen bzw. Objektträger wurden in eine feuchte Kammer gegeben und
18
5 min in 3 % BSA in PBS inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen.
Monoklonale Maus Antikörper wurden in PBS mit 3 % BSA verdünnt, auf den
fixierten Monolayer gegeben und für 1 h bei 37°C in einer feuchten Kammer
inkubiert. Zum Entfernen der nicht gebundenen Antikörper wurde der Zellmonolayer
mehrmals mit PBS gewaschen. Nach erneuter Inkubation mit 3 % BSA wurden zum
Nachweis der Antikörper sekundäre FITC- und Texas-Red-konjugierte MausAntikörper benutzt, welche 1:100 in PBS mit 3 % BSA verdünnt bei 37°C für 30
Minuten inkubierten. Texas-Red-konjugierten Antikörper, welche rot fluoreszierten,
zeigten bei der Verwendung mit Zellen der Linie HL-60 eine starke Eigenfluoreszens
der abgestorbenen Zellen, so daß bei dieser Zellinie nur noch FITC-konjugierte
Antikörper, die grün fluoreszierten, verwendet wurden.
Die Mikroskopie und teilweise Photographie wurde an einem Leitz Mikroskop mit
einer Nikon F-601 M-Kamera unter Verwendung von Agfa-Filmen durchgeführt.
2.3.3 Isolierung von viraler mRNA aus Zellen
Zur Isolierung von RNA aus den infizierten Zellen wurde der RNeasy Midi Kit
benutzt, welcher die Extraktion von RNA aus HEp-2-Zellen von zehn Petrischalen
mit dem Durchmesser von 10 cm erlaubt.
Zunächst wurden die Zellen in PBS gewaschen, trypsiniert, in frisches Medium
aufgenommen und in einer Zentrifuge 5 min mit 300 x g pelletiert. Der Überstand
wurde verworfen und die Zellen in 600 µl pro Kulturschale Lyse-Puffer, welcher βMercaptoethanol
enthält,
aufgenommen.
Dieser
Überstand
wurde
in
die
QIAshredder-Säule, welche in einem Eppendorf-Gefäß stand, gegeben und 1 min
zentrifugiert. Das Lysat wurde nach Zugabe von 600 µl 70 % Ethanol auf die RNeasy
spin-Säule gegeben und 15 sec bei 8000 x g zentrifugiert. Die RNA wurde bei
diesem Schritt an die Säule gebunden und Proteine und andere störende Bestandteile
in den folgenden Schritten entfernt. Jeweils 700 µl Waschpuffer RW1 bzw. 500 µl
Waschpuffer RPE, welcher 96 % Ethanol enthält, wurden auf die Säule gegeben und
durch diese zentrifugiert. Aus der Säule konnte im nächsten Schritt durch Zugabe
von 50 µl DEPC behandeltem Wasser die RNA eluiert werden.
19
Die gewonnene RNA konnte bei -20°C bis -70°C gelagert werden.
2.3.4 cDNA-Synthese
Die Synthese von zur viralen RNA komplementären DNA, der cDNA, erfolgte durch
die Reverse Transkriptase von Thermus thermophilus (Tth-Polymerase). Die
Umschreibung der mRNA in cDNA geschah mit oligo(dT)-, RSV-G 3´-RI- und N-23´-Primern unter Verwendung der MMLV-RT, einer RNA-abhängigen DNAPolymerase. Oligo-dT-Primer binden an die polyadenylierten mRNAs. Die
anschließende Amplifikation in 40 Zyklen mit den Primern N-2-3´ und N-1-5´ und
Taq-Polymerase führte zu einem 286 bp großen Produkt, das anschließend im
Ethidiumbromid-Gel nachgewiesen wurde. Bei Amplifikation mit den Primern RSV2-STA und RSV-G 3´-RI konnte ein 756 bp großes Produkt detektiert werden.
Die Reaktion fand in 50 µl-Ansätzen statt, die Inkubation bei unterschiedlichen
Temperaturen wurde im UNO-Thermoblock durchgeführt:
25 µl
Wasser
10 µl
5x EZ-Puffer
1 µl
RNasin
5 µl
dNTP-Mix (10 mM je Nukleotid)
1 µl
je Primer: N-2-3´, N-1-5´
bzw. 2 µl pd(T)12-18
5 µl
RNA
Programm
65°C 5 min
37°C 10 min, Zugabe von 2 µl MMLV-RT (200 U/µl)
37°C 60 min
Die cDNAs wurden ohne weitere Reinigung direkt für die PCR weiterverwendet.
2.3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion zu Amplifizierung von DNA
Um von der cDNA Gene oder Genfragmente zu amplifizieren, wurde die
20
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) verwendet.
Die Reaktion wurde in 50 µl Gesamtvolumen durchgeführt.
x µl
H2O
5 µl
3 µl
5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
5 µl
0,5 µl
10x PCR-Puffer
25 mM MgCl2
DMSO
dNTP-Mix (10 mM je Nukleotid)
5´-Primer (20 µM)
3´-Primer (20 µM)
cDNA
Enzym (Taq-Polymerase)
Der Reaktionsansatz wurde mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet, um ein
Verdunsten der Proben in den Reaktionsgefäßen zu vermeiden. Die Reaktion wurde
im UNO-Thermoblock durchgeführt.
Folgende drei Schritte wurden 40 mal zyklisch wiederholt:
1 min
2 min
3 min
Denaturierung bei 94°C
Primer-Annealing
DNA-Synthese bei 72°C
Die PCR wurde durch eine 10-minütige Inkubation bei 72°C und anschließender
Abkühlung auf 4°C beendet.
Die Schmelztemperatur des Oligonukleotid/DNA-Hybrids ist von der Anzahl und
dem Verhältnis der A/T und G/C Basenpaare im Hybrid abhängig:
TM[°C]=2(A+T)+4(G+C)
Die Annealing-Temperatur liegt um 5-10°C unter der Schmelztemperatur des
Oligonukleotid/DNA-Hybrids.
N-2-3´-Primer
N-1-5´-Primer
RSV3´(NS 1-N)
TM=58°C
TM=70°C
TM=46°C
21
RSV5´(NS 1-N)
TM=68°C
P-RSV-3-XHO
TM=64°C
P-RSV-5-XHO
TM=62°C
RSV-G 3´-RI
TM=86°C
RSV-2-STA
TM=54°C
Die Detektion der PCR-Produkte erfolgte über eine Agarosegel-Elektrophorese.
2.3.6 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen
Die DNA-Fragmente wurden durch eine Horizontal-Elektrophorese in 1 %igem
Agarosegel getrennt.
Die Agarose wurde in TAE-Puffer durch Aufkochen in der Mikrowelle gelöst und
der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) zugegeben. Die
auf
unter
60°C
abgekühlte
Agarose
wurde
in
die
abgedichteten
Elektrophoresekammern gegossen. Die DNA-Proben wurden unter TAE-Puffer in
die Probenauftragstaschen des abgekühlten und erstarrten Gels geladen. Die
Elektrophorese erfolgte bei 80-100 V.
Als Größenstandart wurde mit EcoRI und HindIII geschnittene λ-Phagen-DNA
parallel auf die Gele plaziert. Die Banden dieses Markers sind: 21.226, 5.148, 4.973,
4,268, 3.530, 2.027, 1.904, 1.584, 1.375, 947, 831, 564, 125 bp. Die Detektion der
DNA erfolgte auf einem UV-Transilluminator.
2.4 Apoptose-Untersuchungen
2.4.1 Analyse der DNA-Degradierung
Das Schneiden genomischer DNA durch die Zellen während der Apoptose führt zu
Fragmenten von einer Länge von ungefähr 185 bp. Dieses Phänomen konnte durch
eine Agarosegel-Elektrophorese, in der sich die typische "Leiter" mit Fragmenten von
der Größe eines Mehrfachen von 185 zeigte, nachgewiesen werden.
22
2.4.2 3´-OH-End-Markierung (TUNEL-Test)
Die DNA-Strangbrüche, die während der Apoptose auftreten, können durch die
Markierung der dabei entstehenden freien 3´-OH-Enden mit Fluoreszein-konjugierten
Nukleotiden sichtbar gemacht werden. Die modifizierten Nukleotide werden bei
dieser Reaktion durch die Terminale Deoxynukleotidyl-Transferase (TdT), die die
Polymerisierung von Nukleotiden an freie 3´-OH-DNA-Enden in einer Matrizenunabhängigen Weise katalysiert, angehängt. Verwendung fand für diesen Nachweis
der In Situ Cell Detection Kit der Firma Boehringer Mannheim mit Fluoreszeinkonjugierten Antikörpern.
Die zu untersuchenden Zellen wuchsen auf Polylysin-beschichteten Deckgläschen
oder wurden, da sie in Suspensionskulturen wuchsen, mit Hilfe einer Zytozentrifuge
auf Objektträger zentrifugiert. Die Zellen wurden in 3,7 % Paraformaldehyd fixiert
und mit Triton X-100 permeabilisiert. Nach dem Waschen mit PBS erfolgte die
Zugabe der TUNEL-Reaktionsmixes, welcher 60 min bei 37°C in einer feuchten
Kammer und in Dunkelheit inkubierte. Nach Inkubation wurden die Zellen in PBS
gewaschen.
Die
Detektion
erfolgte
durch
Betrachtung
durch
ein
Fluoreszenzmikroskop.
2.4.3 Hoechst-Färbung für Apoptose
Die Veränderungen des Chromatin im Verlauf der Apoptose (Kondensation,
Veränderung
der
Kernmorphologie)
konnten
durch
die
Hoechst-Reaktion
nachgewiesen werden.
Die untersuchten Zellen wurden mit PBS gewaschen und in 10 %iger eiskalter
Trichloressigsäure für 15 min fixiert und danach in kaltem 70 %igem, 90 % igem und
absolutem Ethanol für jeweils 3 min gewaschen. Die Zellen wurden in PBS
resuspendiert und auf Objektträger zentrifugiert. Die Chromatin-Kondensation und
die Kernmorphologie wurden durch den DNA-Nachweis mit 0,1 µg/ml Hoechst
33258 für 3 min bei RT in der Dunkelheit sichtbar gemacht. Anschließend wurden
die Proben dreimal in PBS gewaschen und mit PBS mit 10 % Glyzerin und 0,02 %
Natriumazid überschichtet. Die apoptotischen Zellen fluoreszierten blau.
23
2.5 PCR
2.5.1 Prä-PCR-Phase
Zur Prä-PCR gehörte die Auswahl der Zellen, die Gewinnung, die Fixierung, das
Auftragen auf den Objektträger, der Andauprozeß und eine DNase-Behandlung.
Die verwendeten Zellen der Linie A549, die 15 h infiziert waren, wurden zunächst in
PBS gewaschen, mit einem Zellschaber von der Petrischale gekratzt und in einer
Zentrifuge bei 4000 rpm sedimentiert. Das Zellpellet wurde in die Fixierungslösung,
das 10 %ige gepufferte Formalin, aufgenommen und für 8 h bei RT inkubiert. Nach
Ablauf der Fixierung wurden die Zellen wieder sedimentiert, in Wasser gewaschen,
sedimentiert und wieder in Wasser aufgenommen. Es wurde eine geeignete Menge
Wasser zugegeben, so daß beim anschließenden Tropfen der Zellen auf einen In situ
PCR-Objektträger die Zellen dicht nebeneinander lagen. Es wurden drei Proben auf
einen Objektträger aufgetragen. Der Tropfen wurde bei RT getrocknet, und mit
einem hydrophoben Stift ein Ring um die Zellhaufen gezogen.
Es folgte der Schritt der Permeabilisierung. 150 µl der Pepsinlösung wurden auf die
Zellhaufen gegeben und 45 min bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.
Die Zellen wurden 1 min in Wasser zur Inaktivierung des Enzyms gewaschen und
100 %iges Ethanol aufgegeben, abgetropft und luftgetrocknet. Nun wurden 50 µl der
DNase-Verdaulösung aufgegeben (für Positivkontrolle ohne Enzym), mit dem
Ampli-Cover-System verschlossen und bei 37°C ü.N. inkubiert. Das AmplicoverSystem besteht aus Plastikscheibchen, welche auf dem Assembly Tool mit einer
Klammer auf dem Objektträger fixiert werden.
Die Zellen wurden am nächsten Tag wieder 1 min in Wasser gewaschen und
getrocknet.
2.5.2 PCR
Es folgte die Reverse Transkription. Dazu wurden 50 µl der RT-Lösung aufgetragen
(für Negativkontrolle ohne Enzym). Nach Verschluß mit dem Ampli-Cover-System
24
erfolgte eine Inkubation bei 42°C für 10 min im GeneAmp In situ PCR System 1000Thermocycler. Die Zellen wurden danach 1 min in Wasser gewaschen und mit
Ethanol getrocknet.
Es folgt die Durchführung einer Hot-start-PCR, welche den Grad der unspezifischen
Primerbindungen reduzierte. In der Reaktion wurden Dig-dUTP im Verhältnis 1:19
zu TTP zugesetzt Für die PCR-Reaktion wurden der PCR master mix auf 70°C
erhitzt, dann die Taq-Polymerase zugegeben und 50 µl auf die auf dem Assembly
Tool auf 70°C vorgeheizten Objektträger gegeben. Nach dem Verschluß mit dem
Ampli-Cover-System wurden die Objektträger im auf 70°C vorgeheizten Cycler
gestellt und das Programm gestartet.
Es wurden 20 Zyklen durchgeführt.
2 min
20 Zyklen: 1 min
2 min
anschließend
94°C
94°C
55°C
4°C
Die Inaktivierung der Enzyme erfolgte mit Stopp-Puffer, welcher eine Temperatur
von 45°C hatte, für 5 min im 45°C-Wasserbad. Anschließend wurde der hydrophobe
Ring um die Zellproben mit dem Hydrophobic pen erneuert.
2.5.3 Post-PCR-Phase
Die Detektion der eingebauten Dig-markierten Nukleotide erfolgte durch Bindung
von mit Alkalischer Phosphatase konjugierten Schaf-Antikörpern. Die anschließende
Farbreaktion wurde mit 4-nitro blue tetrazolium chloride (NBT) und 5-bromo-4chloro-3-indoyl-phosphatat (BCIP) durchgeführt. Dabei bildeten sich blauschwarze
Präzipitate.
50 µl des Anti-Digoxigenin-Antikörpers, 1:200 in Waschpuffer 1 verdünnt, wurden
aufgetragen und in einer feuchten Kammer für 30 min bei RT inkubiert.
Anschließend wurde der Objektträger 5 min in Waschpuffer 2 inkubiert, danach 30
min in NBT/BCIP-Substrat-Lösung belassen.
25
3 Ergebnisse
3.1 Standardisierung der Infektion
3.1.1 Vermehrung des Virus
HEp-2 (Humane Larynxkarzinom-Zellinie, ATCC: CCL 23) und A549 (Humane
Lungenkarzinom-Linie, ATCC: CCL 185) [68], zwei Zellinien, die vom
Respirationsepithel abstammen, wurden für die Vermehrung des Virus und die
Standardisierung der Infektion eingesetzt. Die Standardisierung der Infektion wurde
notwendig, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. HEp-2-Zellen
werden am häufigsten als zelluläres Modell für die RSV-Infektion und zur
Vermehrung des Virus benutzt [69]. Die Zellinie A549 wurde ausgewählt, da sie eine
permanente Zellinie der Typ II-Alveolarepithelzellen der menschlichen Lunge,
welche bei der RSV-Infektion beim Menschen ebenfalls befallen werden, ist [68].
Die Viren des Stammes RSV Long wurden in HEp-2-Zellkulturen vermehrt. Die
subkonfluent
gewachsene
HEp-2-Monolayer-Zellkultur
wurde
mit
einer
Infektionsrate von 0,1 plaque forming units (pfu) pro Zelle infiziert und in DMEMNährmedium kultiviert. Nach drei Tagen haben die Zellen neue infektiöse Viren
hergestellt, und eine große Zahl der Zellen weist zu diesem Zeitpunkt einen
deutlichen zytopathischen Effekt auf. Das Nährmedium, in welchem sich die
freigesetzten Viren befanden, wurde abgenommen und der Virustiter durch
Mikrotitration errechnet.
3.1.2 Morphologie infizierter HEp-2- und A549-Zellen
Der durch RSV Long verursachte zytopathische Effekt bei den Zellen der Linie HEp2 ist charakteristisch für das Virus. Einen Tag nach der Infektion erschien das
Zytoplasma granulär degeneriert, und der Zellkern nahm einen größeren Teil der
Zelle (etwa zur Hälfte) ein als bei nicht infizierten Kontrollzellen. Nach 36 bis 48
Stunden bildeten die Zellen die für RSV typischen Synzytien. Die Zellen konfluierten
und hafteten fest am Boden der Kulturschale; die Zellgrenzen erschienen
26
verschwommen.
Die
Zellkerne
aggregierten
am
Rand
der
großen
Zytoplasmaansammlung (s. Abb. 2).
Im weiteren Verlauf retrahierten sich die Synzytien. Es konnten schmale
Ausziehungen beobachtet werden, das verbleibende Zytoplasma verdichtete sich um
die Kerne, und die Zellgrenzen wurden gut bestimmbar. Nach 72 Stunden begann die
Abrundung und Ablösung der Zellen. Es fanden sich Aussparungen im Zellrasen und
viele Zellen im Überstand. Später lösten sich Synzytien in großen Schollen ab (s.
Abb. 3).
Nach 120 Stunden zeigten etwa die Hälfte der noch adhärenten einzeln stehenden
Zellen und fast alle Synzytien eine starke vakuolisierende Degeneration und große
Granula.
Abbildung 2: HEp-2-Zellkultur, 48 Stunden nach Infektion mit 0,1 pfu RSV Long.
Es finden sich die für RSV typischen Synzytien, deren Zellkerne rosettenförmig am
Rand der Zytoplasmaansammlung aggregieren. In den Zellkernen sind Nukleoli zu
erkennen. (x 40)
27
Abbildung 3: HEp-2-Zellkultur, 72 Stunden nach Infektion mit RSV Long. Es sind
Synzytien zu erkennen. Ein Teil der Zellen zeigt schmale Ausziehungen oder eine
Abrundung. (x 40)
Der zytopathische Effekt bei Infektion von Zellen der Linie A549 ist dem bei
Infektion von HEp-2-Zellen vergleichbar. HEp-2-Zellen bilden früher und stärker
Synzytien als Zellen der Linie A549. Während alle Zellen der Linie A549 nach
sieben Tagen abgestorben waren, fanden sich bei den HEp-2-Zellen auch nach zwei
Wochen noch adhärente, lebende Zellen.
Die Morphologie der nicht infizierten Kontrollzellen änderte sich nicht. Sie zeigten
über den Beobachtungszeitraum eine vollständige Konfluenz.
3.1.3 Austestung der Kulturbedingungen
Die folgenden Versuche dienten der Steigerung und Optimierung der Infektionsrate
der Zellen. Vergleiche mit unterschiedlich zusammengesetztem Zellmedium ergaben,
daß die Infektion mit RSV am erfolgreichsten in DMEM-Medium mit Zusatz von nur
1 %igem fetalen Kälberserums (FKS) ist und zur weiteren Kultivierung der Zellen
ein Austausch des Mediums nach 24 Stunden mit 10 %igem erfolgen sollte. Der
28
Anteil von FKS muß während der Adsorptionsperiode des Virus möglichst gering
sein, da FKS die Absorption des Virus an die Zelle hemmt und somit die
Infektionsrate verschlechtert. Der Austausch des Mediums erfolgte, um einem
Absterben der Zellen mangels Nährstoffen vorzubeugen, da 1 %iges Serum nicht
zum Überleben genügt. Die Proliferationsrate der Zellen wäre ohne Ersatz des
Serums gesunken.
Untersuchungen ergaben, daß infizierte und nicht infizierte HEp-2-Zellen in 1 %igem
Medium nach zwei Tagen Zeichen des Absterbens aufwiesen. Sowohl die infizierten
wie die nicht infizierten Zellen in 1 %igem Medium kugelten sich zum Teil ab oder
zeigten eine schollige Degeneration. Es fanden sich deutlich mehr abgestorbene
Zellen im Zellüberstand. Die Zellen konfluierten nur zu 60 %, während die Zellen,
die nach Wechsel in 10 %iges Medium unter ansonst gleichen Bedingungen
wuchsen, vollständig konfluent waren.
Der Einfluß des pH-Wertes auf die Infektionsrate wurde durch den Vergleich von
infizierten HEp-2-Zellkulturen mit CO2-Begasung oder Pufferung mit HEPES
untersucht. Um dies zu überprüfen, wurden HEp-2-Zellen in Medium mit HEPESZusatz (25 mM) und ohne CO2-Begasung oder ohne HEPES-Medium mit CO2Begasung gehalten. Die CO2-Begasung hatte keinen Einfluß auf die Infektionsrate,
wie mit Hilfe von Immunfluoreszenz überprüft wurde.
3.1.4 Nachweis der Infektion
3.1.4.1 Nachweis des zytopathischen Effekts
Der Nachweis der Infektion kann am einfachsten durch die Beobachtung der
Zellmorphologie geführt werden. Die Zellen zeigen nach 36 bis 48 Stunden den für
das Virus charakteristischen zytopathischen Effekt, die Synzytienbildung. Etwa 72
Stunden nach der Infektion beginnt die Abrundung und Ablösung der infizierten
Zellen aus dem Zellverband.
29
3.1.4.2 Nachweis des Antigens
Die Infektion der Zellen während der Infektionsversuche wurde mit Hilfe der
indirekten Immunfluoreszenz festgestellt.
Bei der Benutzung eines Antikörpergemisches aus monoklonalen Antikörpern gegen
die M2-, P-, F- und N-Proteine der Firma Loxo (RSV3-NCL) fand man eine
zytoplasmatische Färbung (s. Abb. 4 und Abb. 5). Eine Färbung mit dem Antikörper
3C4 [70], ein in der Abteilung vorhandener monoklonaler Maus-Antikörper (IgKlasse 1) gegen das P-Protein von RSV-Long, war in erster Linie in
intrazytoplasmatischen Einschlußkörpern der infizierten Zellen zu erkennen. Als
sekundäre Antikörper wurden FITC- und Texas-Red-konjugierte Maus-Antikörper
benutzt, welche grün bzw. rot fluoreszierten.
Abbildung 4: 24 Stunden infizierte Zelle der Linie A549, ImmunfluoreszenzReaktion mit dem Antikörper RSV3-NCL und FITC-konjugiertem sekundären MausAntikörper. Es ist eine ausgeprägte Färbung des Zytoplasmas zu erkennen, der
Zellkern bleibt ausgespart. (x 100)
30
Abbildung 5: Negativkontrolle der Immunfluoreszenz mit nicht infizierten Zellen.
(x 100)
Texas-Red-konjugierten Antikörper zeigten bei der Verwendung mit Zellen der Linie
HL-60 eine starke Eigenfluoreszenz der abgestorbenen Zellen, so daß bei dieser
Zellinie nur noch FITC-konjugierte Antikörper verwendet wurden. Kontrollen der
übrigen Zellenlinien zeigten, daß die Antikörper praktisch nicht mit unspezifischen
Strukturen reagierten. Die Zellen waren nicht gefärbt. Das beste Ergebnis konnte mit
dem monoklonalen Antikörpergemisch der Firma Loxo (RSV3-NCL) erzielt werden.
Der Antikörper 3C4 erbrachte ebenfalls gute Ergebnisse.
3.1.4.3 Nachweis der Nukleinsäure
Der Nachweis von RNA des Virus wurde unter Zuhilfenahme der PolymeraseKetten-Reaktion mit den Primern für das G-Gen und die Gene NS 1, NS 2 und N
durchgeführt. Das amplifizierte Produkt hatte eine Länge von 756 bp bei Benutzung
der G-Primer und 2268 bp bei Benutzung der NS 1-N-Primer.
31
3.1.5 Produktive Infektion
Da das Virus in HEp-2-Zellkulturen vermehrt wurde und der gewonnene RSVhaltige Zellüberstand wiederum andere HEp-2-Zellkulturen infizieren konnte, kann
dies als Nachweis für eine Bildung voll infektiöser Partikel gelten. Auch die
Überstände von A549-Zellen waren infektiös und infizierten HEp-2-Zellen.
3.1.6 Untersuchung auf Apoptose
Drei Tage infizierte HEp-2-Zellen zeigten minimal Apoptose. Dies konnte durch
DNA-Fragmentierung, nachgewiesen anhand der typischen DNA-Leiter im AgaroseGel, demonstriert werden [71].
A549-Zellen lassen ebenfalls Apoptose erkennen. Es wurden Zellen der Linie A549
mit RSV-Long (ungefähr 0,1 PFU/Zelle) infiziert. Die Infektionsrate und die
Apoptose wurden nach 4,5 Stunden, 20 Stunden und 40 Stunden kontrolliert. Der
TUNEL-Test erfolgte mit dem In Situ Cell Detection Kit der Firma Boehringer
Mannheim mit Fluoreszein-konjugierten Antikörpern. Zur Überprüfung der Infektion
wurde ein Immunfluoreszensnachweis mit dem Antikörpergemisch der Firma Loxo
durchgeführt. Nach 6 Stunden zeigte sich, daß 1-2 % der Zellen infiziert waren und
der Apoptose unterliefen. Nach 20 Stunden waren ungefähr 20-30 % der Zellen
infiziert, 1-5 % zeigten Zeichen von Apoptose (s. Abb. 6 und Abb. 7). 48 Stunden
nach Infektion waren 80-90 % der Zellen infiziert, und nur 5 % wurden durch den
TUNEL-Test markiert. Nicht-infizierte Kontrollzellen zeigten keine Apoptose.
32
Abbildung 6: 20 Stunden mit 0,1 pfu RSV Long infizierte Zellen der Linie A549.
Die Zellen, welche der Apoptose unterliefen, sind mit dem TUNEL-Test durch
Immunfluoreszenz markiert. (x 63)
Abbildung 7: Negativkontrolle des TUNEL-Tests mit nicht RSV infizierten A549Zellen. (x 63)
33
3.2 Infizierbarkeit
von
humanen
Promyelozyten,
Granulozyten und monozytären Leukozyten
Wie in der Einleitung schon ausgeführt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden,
inwieweit auch Zellen des humanen Monozyten-Makrophagen-Systems mit RSV
infizierbar sind und ob diese Infektion möglicherweise auch persistent ist. Dazu
dienten undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen (humane promyelozytische
Leukämie-Zellinie) [72;73].
3.2.1 Morphologie der undifferenzierten und differenzierten HL-60Kultur
Die Zellinie HL-60 wurde 1977 von peripheren Blutleukozyten eines Patienten mit
akuter Promyelozytenleukämie etabliert. Die Mehrzahl der Zellen in einer Kultur
sind Promyelozyten, etwa 10 % der Zellen sind reifer und zeigen die
morphologischen Merkmale von Myelozyten, Metamyelozyten und stabkernigen und
segmentkernigen neutrophilen Granulozyten.
Der Zusatz unterschiedlicher Substanzen löst die myeloische Differenzierung der
Zellen ähnlich der Differenzierung von humanen myeloischen Zellen in vivo aus.
Dimethylsulfoxid (DMSO) veranlaßt die Zellen, sich in reifere Granulozyten zu
differenzieren,
hingegen
12-O-Tetradecanoylphorbal-13-Acetat
(TPA)
eine
Entwicklung in monozytenähnliche Zellen bewirkt [73;74;75].
Die Zellen der Linie HL-60 wiesen im undifferenzierten Zustand typische Merkmale
von Promyelozyten auf, wie einen großen runden Zellkern mit zwei bis vier Nukleoli
und aufgelockertes Chromatin bei einem hohen Kern/Plasma-Verhältnis. Die Zellen
wuchsen nahezu ausschließlich in Suspension. Im schmalen Zytoplasmasaum
befanden sich prominente Granula (s. Abb. 8).
34
Abbildung 8: Undifferenzierte HL-60-Zellen, die zum größten Teil Promyelozyten
ähneln. Die Zellen besitzen einen großen runden Zellkern mit mehreren Nukleoli.
Die Zellen sind rund mit einem granulierten Zytoplasma. Die Zellen wachsen
ausschließlich in Suspension und wurden durch Zytospin auf den Objektträger
zentrifugiert. (x 100)
DMSO-Zusatz bewirkte nach zwei Tagen erste morphologische Änderungen,
während die reifen Granulozyten nach vier Tagen zu beobachten waren. Reifere
Myelozyten, Metamyelozyten und neutrophile Granulozyten waren kleiner, besaßen
einen kleineren runden oder segmentierten Kern mit verdichtetem Chromatin,
weniger oder keine sichtbaren Nukleoli und ein niedriges Kern/Plasma-Verhältnis,
und viel weniger prominente zytoplasmatische Granula (s. Abb. 9).
Durch den NBT-Reduktase-Test konnte eine Quantifizierung der reiferen
myeloischen Zellen vorgenommen werden. Der NBT-Reduktase-Test ist ein
sensitiver und einfacher Test für differenzierte HL-60-Zellen und untersucht die
Fähigkeit zur Reduktion von NBT, welche bei Myelozyten, Metamyelozyten,
stabkernigen und segmentkernigen Neutrophilen vorhanden ist [76]. Es zeigte sich,
daß nach drei Tagen 90 % der DMSO-differenzierten Zellen reifere Stadien der
35
myeloische Zellreihe waren.
Abbildung 9: DMSO induzierte HL-60-Zellen, die reifen Granulozyten gleichen.
Diese Zellen wurden drei Tage mit DMSO induziert. Es sind kleine Zellen mit
rundem oder segmentiertem Kern zu sehen. Die Zellen besitzen ein niedrigeres
Kern/Plasma-Verhältnis als die undifferenzierten Zellen. (x 100)
TPA-behandelte Zellen differenzierten sich zu monozytären Zellen, welche als
Einschichtzellkultur wuchsen. Nach TPA-Zugabe konnten schon zwölf Stunden
später Veränderungen im Sinne von Zelladhärenz an der Petrischalen-Oberfläche
beobachtet werden; nach 48 Stunden sind nahezu alle Zellen adhärent. Der Zellkern
nahm eine nierenähnliche oder unregelmäßige Form an mit ein oder zwei
prominenten Nukleoli. Die Zellen zeigten ein niedrigeres Kern/Plasmaverhältnis. Im
Zytoplasma fanden sich kleine und dichte Vakuolen. Die Zellen wirkten flach und
entwickelten schmale Fortsätze (s. Abb. 10).
36
Abbildung 10: TPA induzierte HL-60-Zellen, welche die Merkmale von Monozyten
aufweisen. Drei Tage inkubierten die HL-60-Zellen in TPA. Die Zellen wachsen
adhärent. Der Zellkern ist nierenförmig oder unregelmäßig mit prominenten
Nukleoli. Bei einem hohen Kern/Plasma-Verhältnis sind im Zytoplasma kleine und
dichte Vakuolen zu sehen. (x 100)
3.2.2 Untersuchung der Infizierbarkeit mit RSV
Die Infizierbarkeit humaner Promyelozyten bzw. reifer Granulozyten und
monozytärer Leukozyten konnte mit Hilfe der undifferenzierten oder seit drei Tagen
mit TPA bzw. DMSO differenzierten HL-60-Zellkulturen untersucht werden.
Die Infektion von undifferenzierten HL-60-Zellen mit RSV-Long führte zu
charakteristischen lichtmikroskopischen Veränderungen der Zellmorphologie. Drei
Tage nach der Infektion zeigten die Zellen eine sehr unregelmäßige Zellbegrenzung,
das Zytoplasma war granuliert und die Zellen unregelmäßig groß. Einige infizierte
Zellen wuchsen adhärent. Im Zytoplasma waren viele größere Vakuolen zu
beobachten. Der Zellkern zeigte weniger prominente Nukleoli und war von einem
hellen Saum umgeben. Das Kern/Plasmaverhältnis war geringer, die Zellgröße
entsprach jedoch den nicht infizierten Kontrollzellen (s. Abb. 11).
37
Abbildung 11: Undifferenzierte HL-60-Zellen, 24 Stunden nach Infektion mit
1 pfu/Zelle. Die Zellen sind granulierter, die Zellgröße variiert. Es finden sich
größere Vakuolen im Zytoplasma. Die Zellkerne sind von einem hellen Saum
umgeben. (x 100)
Bei den DMSO-differenzierten und drei Tage lang infizierten HL-60-Zellen konnten
keine lichtmikroskopisch erkennbaren Veränderungen beobachtet werden (s. Abb.
12). Drei Tage lang infizierte TPA-differenzierte HL-60-Zellen wiesen eine rundere
Form, granuliertes und vakuolenreiches Zytoplasma und einen hellen Hof um den
Zellkern auf. Das Kern/Plasma-Verhältnis änderte sich im Vergleich mit den nicht
infizierten Zellen nicht, jedoch erschien der Zellkern segmentiert mit aufgelockerten
Chromatin (s. Abb. 13).
Die morphologischen Veränderungen der undifferenzierten und TPA-differenzierten
HL-60-Zellen durch Infektion mit RSV betrafen nahezu alle Zellen der Kultur. Nur
etwa zehn Prozent der Zellen waren durch Immunfluoreszenz nachweisbar infiziert
(ohne Abbildung). Es ist anzunehmen, daß einige der beobachteten Veränderungen
nicht nur auf die Infektion der Zelle mit dem Virus, sondern auch auf parakrine
Effekte zurückzuführen sind. Nach Exposition von RSV produzieren humane
neutrophile Granulozyten und periphere Monozyten Interleukin-8 und-6 (IL-8, IL-6)
[36;37;38].
38
Abbildung 12: DMSO differenzierte HL-60-Zellen, 24 Stunden nach Infektion mit
RSV. Es ist keine Änderung der Morphologie zu erkennen. (x 100)
Abbildung 13: TPA-differenzierte HL-60-Zellen, 24 Stunden nach Infektion mit
RSV. Die Zellen sind rund mit granuliertem und vakuolenreichem Zytoplasma. Um
den Zellkern hat sich ein heller Saum gebildet. (x 100)
39
3.2.3 Untersuchung der produktive Infektion mit RSV
Nach dem Nachweis der Infizierbarkeit von HL-60 wurde untersucht, ob diese
Zellinie infektiöses Virus produziert und freisetzt. Undifferenzierte und differenzierte
HL-60-Kulturen wurden über Nacht infiziert, am nächsten Tag gewaschen, nach zwei
bis drei Tagen wieder gewaschen und der Zellüberstand am folgenden Tag
abgenommen. Der Zellüberstand wurde zentrifugiert, filtriert (0,45 µm-Filter) und
auf Zellen der Linie A549 gegeben. Das Ergebnis der am Folgetag durchgeführten
Immunfluoreszenz zeigte, daß die undifferenzierten, die mit TPA und die mit DMSO
differenzierten HL-60-Kulturen infektiöses RSV herstellen und andere Zellkulturen
infizieren können (ohne Abbildung).
3.2.4 Langzeitbeobachtung einer RSV-infizierten HL-60-Zellkultur
Undifferenzierte HL-60-Kulturen wurden mit RSV infiziert und über drei Wochen
beobachtet. Eine Kontrolle drei Tage nach Infektion zeigte durch Immunfluoreszenz,
daß die Zellkulturen infiziert waren und einzelne apoptotische Zellen vorhanden
waren.
Die infizierten HL-60-Zellen zeigten nach drei Wochen eine deutliche Änderung
ihrer Morphologie. Sie besaßen ein deutlich grob granuliertes Zytoplasma mit vielen
Vakuolen unterschiedlicher Größe. Die Zytoplasmamembran gestaltete sich
unregelmäßig mit einzelnen kugeligen Fortsätzen. Das Kern-Plasmaverhältnis
änderte sich nicht. Die Zellkerne erschienen grobkörnig, Nukleoli waren nicht zu
erkennen (s. Abb. 14 und 15).
Nach drei Wochen konnten weder durch RT-PCR mit den Primern NS 1-N
virusspezifische RNA noch durch Immunfluoreszenz mit RSV3-NCL-Antikörper
virusspezifische Proteine nachgewiesen werden.
Aus diesen Ergebnissen ist die Schlußfolgerung zu ziehen, daß die Viren bzw. die
virusinfizierten Zellen unter die Nachweisgrenze der Untersuchungen gefallen sind.
Mit RSV infizierte HL-60-Zellpopulationen wuchsen langsamer als nicht infizierte
oder starben ab. So ist es möglich, daß im Verlauf des Versuches durch die
Überwucherung der infizierten Zellen durch die nicht infizierten und regelmäßige
40
Teilung der Kultur die Zahl der infizierten Zellen unter die Nachweisgrenze
gesunken ist. Möglicherweise ist eine durch RSV induzierte Apoptose die Ursache
für die geringere Zellzahl.
Abbildung 14: Drei Wochen mit RSV infizierte HL-60-Zellen. Man beobachtet ein
grob granuliertes Zytoplasma mit vielen Vakuolen. Die Zellmembran ist
unregelmäßig mit runden Fortsätzen. (x 100)
41
Abbildung 15: Nicht-infizierte Kontrollzellen. (x 100)
3.2.5 Untersuchungen zur Apoptose von infizierten Zellen
Um festzustellen, in welchem Ausmaß in RSV-infizierten HL-60-Zellkulturen
Apoptose stattfindet, wurden die Zellen mit Hilfe der Hoechst-Färbung untersucht.
Die
Hoechst-Färbung
macht
die
Chromatin-Veränderungen
(Kondensation,
Kernmorphologie) während der Apoptose durch Fluoreszenz des gefärbten Kernes
sichtbar [77].
In den undifferenzierten und mit TPA differenzierten HL-60-Kulturen fanden sich 24
Stunden nach Infektion mit Hilfe der Hoechst-Färbung apoptotische Zellen, wobei
hinzugefügt werden muß, daß TPA selbst in nicht infizierten Kulturen ebenfalls bei
einem geringeren Anteil der Zellen ebenfalls Apoptose hervorruft. In der DMSOdifferenzierten Kultur war keine Apoptose nachweisbar (s. Abb. 16 und Abb. 17).
In der Langzeit-Kultur der RSV-infizierten HL-60-Zellen war der Nachweis von
Apoptose drei Wochen nach Infektion negativ. Somit ist festzustellen, daß durch
Apoptose das Virus mit den RSV-infizierten Zellen aus der Kultur verschwindet.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß sowohl undifferenzierte, humanen
Promyelozyten entsprechende, HL-60-Kulturen wie auch TPA-differenzierte,
42
monozytären Zellen ähnliche, und DMSO-differenzierte, mehr Granulozyten
entsprechende, HL-60-Kulturen mit RSV infizierbar sind und neues, infektiöses
Virus bilden. In undifferenzierten und TPA-differenzierten HL-60-Kulturen ist eine
Änderung der Zellmorphologie nach RSV-Infektion zu beobachten, DMSOdifferenzierte Zellen zeigen keine Änderung im Aussehen. RSV induziert in
undifferenzierten und TPA-differenzierten HL-60-Zellen Apoptose, jedoch nicht in
DMSO-differenzierten Kulturen. In HL-60-Zellkulturen konnten nach Infektion mit
RSV nach drei Wochen durch Immunfluoreszens- und PCR-Methoden keine
infizierten Zellen nachgewiesen werden. Daraus ergibt sich, daß in HL-60-Kulturen
die RSV-infizierten Zellen durch Apoptose zerstört werden.
Abbildung 16: Hoechst-Reaktion bei HL-60-Zellen, die 24 Stunden mit RSV
infiziert waren. (x 40)
43
Abbildung 17: Kontrolle mit HL-60-Zellen, die nicht infiziert wurden. (x 40)
3.3 Langzeitbeobachtung der RSV-infizierten MakrophagenZellinie NR8383
Als weiteres Modell für die Infizierbarkeit von Makrophagen stand die RattenAlveolarmakrophagen-Zellinie NR8383 zur Verfügung [78]. Diese erwiesen sich als
infizierbar. Unter den üblichen Infektionsbedingungen (0,1 pfu/Zelle) waren 20 %
der Zellen durch Immunfluoreszenz nachweisbar infiziert.
Die Zellen der Linie NR8383 sind polymorph und wachsen sowohl in Suspension
wie als Einschichtzellkultur. Sie besitzen einen kleinen, runden, dunklen, manchmal
etwas eingebuchteten Kern von unregelmäßiger Struktur, in dem teilweise Nukleoli
zu erkennen sind. Das Zytoplasma ist gut gegen die Umgebung abgegrenzt. Es finden
sich in ihm reichlich Vakuolen und dunkle Körnchen. Die Zelloberfläche ist durch
zahlreiche plumpe Zellfortsätze reichlich gegliedert (s. Abb. 18).
Nach zwei Tagen hat sich bei infizierten NR8383-Zellen ein niedrigeres KernPlasmaverhältnis als bei nicht infizierten Zellen gebildet. Das Zytoplasma enthält
44
mehr Granula. Nach Infektion der Zellen verringerte sich der Anteil der adhärenten
Zellen zugunsten der Zellen in Suspension (s. Abb. 19).
Drei Wochen nach Infektion von Kulturen der Linie NR8383 ist RSV noch
nachweisbar. In der Immunfluoreszenz zeigte eine Anteil von 10 - 20 % eine positive
Reaktion. Es konnten Banden der erwarteten Größe in der RT-PCR mit den NS 1-NPrimern beobachtet werden. Die Morphologie der infizierten Zellen unterschied sich
deutlich von der nicht infizierter Kontrollzellen. Die Zellen wiesen ein niedrigeres
Kern-Plasmaverhältnis auf. Das Zytoplasma war mit Vakuolen unterschiedlicher
Größe angefüllt. Der Zellkern erscheint grob gekörnt und weist ein einem Teil der
Zellen einen Nukleolus auf. Apoptotische Zellen waren nur wenige vorhanden, wie
durch die Hoechst-Reaktion gezeigt werden konnte (s. Abb. 20 und Abb. 21).
Abbildung 18: Zellen der Linie NR8383. Die Zellen besitzen einen kleinen, runden,
dunklen, manchmal etwas eingebuchteten Kern, in dem teilweise Nukleoli zu
erkennen sind. Im Zytoplasma finden sich Vakuolen und dunkle Granula. (x 100)
45
Abbildung 19: Zellen der Linie NR8383, 48 Stunden mit RSV infiziert. Die Zellen
besitzen ein niedrigeres Kern/Plasma-Verhältnis als nicht infizierte Zellen. Im
Zytoplasma sind mehr Granula zu erkennen. (x 100)
Abbildung 20: Drei Wochen infizierte NR8383-Zellen, welche ein niedrigeres
Kern/Plasma-Verhältnis aufweisen. Das Zytoplasma ist vakuolenreich, der Zellkern
ist grob gekörnt und zeigt teilweise einen Nukleolus. (x 100)
46
Abbildung 21: Kontrolle nach drei Wochen mit nicht infizierten NR8383-Zellen.
(x 100)
3.4 Infektionsnachweis mittels In situ PCR
Es konnte in dieser Arbeit bisher gezeigt werden, daß RSV verschiedene Zellinien
des Leukozyten-Makrophagen-Systems in vitro infizierten kann. Außerdem wies
Panuska an Bronchiallavage-Material von transplantierten immunsupprimierten
Menschen nach, daß Alveolarmakrophagen in vivo infiziert werden, während
Domurat in zirkulierenden Leukozyten RSV-Antigene fand [53;55]. Eine
Ausbreitung von RSV in Niere, Leber, Myokard und Knochen kann nicht
ausgeschlossen werden [9;10;11;13].
Um die persistent RSV infizierten Zellen im Gewebe nachweisen und
charakterisieren zu können, ist eine sensible und zellgebundene Nachweismethode
erforderlich. In der Immunfluoreszenz sind die infizierten Zellen nur nachweisbar,
wenn sie in ausreichender Menge RSV-Proteine herstellen. In persistent infizierten
Zellen ist die Menge nachweisbaren Proteins möglicherweise gemindert [79]. Ein
sehr sensitiver Nachweis der mRNA wird durch die RT-PCR geführt, welche aber
nicht die Infektion einzelner Zellen dokumentieren kann. Direkte zelluläre
47
Lokalisation von RNA ist durch die In situ Hybridisierung möglich, wobei allerdings
Schwierigkeiten wegen der relativ hohen Nachweisgrenze für die Zahl der DNA- und
RNA-Kopien bestehen. Virale RNAs und mRNA sind häufig in Mengen enthalten,
die unter der Nachweisgrenze der In situ Hybridisierung liegen. So bietet sich als
adäquate Methode die In situ RT-PCR an.
Nach Fixierung von Zellen oder Gewebeschnitten und Herstellung von cDNA
spezifischer Abschnitte der RNA wird durch Zugabe von DNA-Polymerase die
cDNA vermehrt und nachgewiesen. Die einzelne Zelle dient somit als
"Reaktionsgefäß" für die PCR.
Die In situ RT-PCR für RSV war noch nicht etabliert. Für unterschiedliche Zellinien
sind unterschiedliche Versuchsbedingungen notwendig, und gute Ergebnisse sind nur
bei optimal abgestimmtem Protokoll zu erzielen [80]. Das verwendete In Situ RTPCR-Protokoll basiert auf einem Protokoll von Nuovo [81], welche an die
Versuchsbedingungen angepaßt und optimiert wurde.
3.4.1 Prä-PCR-Phase
Zur Prä-PCR gehörte die Auswahl der Zellen, die Gewinnung, die Fixierung, das
Auftragen auf den Objektträger, der Andauprozeß und eine DNase-Behandlung.
Die verwendeten Zellen der Linie A549, nicht infizierte Kontrollzellen und Zellen,
die 15 Stunden mit RSV-Long infiziert waren, wurden in 10 %iges gepuffertes
Formalin aufgenommen. Nach Fixierung wurden die Zellen auf Objektträger
getropft, getrocknet und die verwendeten Lösungen zum Andauen und zur DNaseBehandlung auf die Zellhaufen gegeben.
Verwendung fanden silanisierte Objektträger, da man davon ausgeht, daß die
Absorption von Enzymen an die Oberfläche das Ergebnis beeinträchtigt [82].
Die Fixierung der Zellen und deren Permeabilisierung nehmen großen Einfluß auf
das Ergebnis. Es gibt kreuzvernetzende Fixierungsmittel wie Formalin und
Paraformaldehyd
und
fällende,
nicht-kreuzvernetzende
wie
48
Ethanol/Essigsäuremischungen
oder
Azeton
[83].
Es
wurde
10 %iges
Paraformaldehyd unter der Vorstellung ausgewählt, daß es die Diffusion der
Produkte aus den Zellen wirksamer unterbinden und die Zellmorphologie besser
erhalten sollte. Da diese über eine Quervernetzung von Proteinen und Nucleinsäuren
wirken, machte dies eine Proteolyse der Zellen vor der PCR notwendig. Es wurde
Pepsin gewählt, da es sein Temperaturoptimum bei 37°C hat und weniger
Peptidbindungen spaltet als zum Beispiel Proteinase K, was zu einer stärkeren
Veränderung der Morphologie geführt hätte. Die Länge des Verdaus mit
Pepsinlösung mußte im Versuch optimiert werden. Eine zu kurze Einwirkung hätte
dazu geführt, daß die "Löcher" in der Zellwand nicht groß genug gewesen wären, um
ein ungehindertes Eindiffundieren der Enzyme zu ermöglichen. Außerdem führt eine
zu kurze Einwirkdauer zu einem inadäquaten DNA-Verdau (s.u.), da das Enzym
DNase durch zu starken Proteinvernetzung sterisch behindert wird. Ein zu langer
Verdau hätte zum Verlust des Produktes aus den Zellen geführt [84;85]. Es stellte
sich heraus, daß eine Fixierung über acht Stunden zu einem gut reproduzierbaren
Grad der Proteinvernetzungen führte. Permeabilisiert wurde mit einer Pepsin/HClLösung, wobei sich eine 45 minütige Inkubation bei 37°C als optimal herausgestellt
hat.
Eine anschließende Behandlung über 15 Stunden mit RNase-freier DNase
verminderte die Möglichkeit einer unspezifischen Amplifikation von zellulärer DNA
durch Mispriming und DNA-Reparaturmechanismen, da vor der Reversen
Transkription die DNA beseitigt wird und in der PCR-Reaktion nur noch die
vervielfältigte cDNA vorhanden ist. Ohne DNase-Behandlung ist der Anteil falschpositiver Zellen signifikant erhöht [86;87]. In suboptimal permeabilisierten Zellen
scheint der Anteil primer-unspezifischer Signale während der PCR anzusteigen, da
der
anschließende
DNase-Verdau
durch
die
verbleibenden
Protein-DNA
Kreuzvernetzungen die totale Degenerierung der DNA insuffizient wird [87].
3.4.2 PCR
Die PCR umfaßt die Auswahl, die Konstruktion und das Testen von Primern
einerseits, sowie die Auswahl der Reversen Transkriptase und der DNA-Polymerase
49
andererseits.
Als RT-Primer wurde ein oligo-(dT) Primer benutzt. Für die Auswahl der PCRPrimer galt, daß die zu amplifizierende Länge nicht zu groß sein sollte, da man von
einer teilweisen Degradierung der mRNA, auch durch die Fixierung, ausgehen mußte
[85]. Zu kurze Amplifikate führen allerdings zu erhöhtem Verlust und Artefakten
durch Diffusion [80]. Durch die gewählten Primer für die mRNA des P-Gens ergab
sich ein Produkt von der Länge 727 bp. Verwendet wurde für die Reverse
Transkription die M-MuLV Reverse Transkriptase, welche zusammen mit dem RTPrimer und dem dNTP-Gemisch auf die Zellen gegeben wurde und 30 Minuten bei
42°C inkubierte.
Nach der Reversen Transkription mit MMLV-RT folgte eine Hot-start-PCR, d.h. die
Lösungen und das Gerät wurden vor dem Auftragen der verwendeten TaqPolymerase auf 70°C vorgeheizt, um den Grad der unspezifischen Primerbindungen
zu verringern [84]. Die Annealing-Temperatur der Primer-Zielsequenz-Paarung
sollte, um unspezifische Bindung der Primer zu vermindern, wie bei der
herkömmlichen PCR über dem Schmelzpunkt der Primer-nicht Zielsequenz-Paarung
liegen. Im ersten Zyklus wird dies durch die Hot-start-Methode erzielt.
Es wurden 20 Zyklen durchgeführt. Zeiten und Temperaturen wurde vorher in der
konventionellen PCR überprüft und optimiert. Die Zeiten für die Denaturierung, das
Annealing und die Extension stellten einen guten Kompromiß zwischen einer
möglichst kurzen Zeit, um eine Schädigung der Pufferkomponenten, besonders der
DNA-Polymerase, zu verhindern, aber auch einer genügend langen Zeit, um eine
gleichmäßige Erhitzung des Objektträgers zu erreichen. Die Zyklenzahl sollte unter
30 liegen, da mit der Zahl der Zyklen die Gefahr von Diffusionsartefakten steigt [80].
Verglichen mit der traditionellen PCR ist die In situ PCR weniger effizient. Die
Amplifikationsrate ist 50- bis 300-fach nach 30 Zyklen [88;89]. Eine mögliche
Ursache mag die Adsorption der Taq-Polymerase an die Oberfläche des
Objektträgers sein, welche durch Benutzung von silanisierten Objektträgern und
DMSO-Zugabe versucht wurde zu verhindern. Eine gleichmäßige und relativ zügige
Temperaturregelung ist ebenfalls nötig. Für die gleichmäßige Temperaturregulation
50
bei der PCR wurde ein PCR-Gerät der Firma Perkin-Elmer mit beheizbaren
Metallplatten, zwischen denen die Objektträger lagen, benutzt. Die mit einer
Plastikkappe und einem Clip verschlossenen Objektträger beugen auf diese Weise
Verdunstungsverlusten der Lösungen vor [86].
3.4.3 Post-PCR-Phase
Der Nachweis des PCR-Produkts erfolgt bei der hier durchgeführten direkten In situ
PCR durch Nachweis von direkt eingebauten Digoxigenin-markierten Nukleotiden,
die einen immunhistochemischen Nachweis der amplifizierten Sequenzen erlauben.
Benutzt wurde Digoxigenin-11-dUTP, das im Verhältnis 1:19 zu TTP zugesetzt
wurde. Für die Detektion wurden mit Alkalischer Phosphatase-konjugierte SchafAntikörper benutzt. Die anschließende Farbreaktion wurde mit Nitro blue tetrazolium
(NBT) und 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphatat (BCIP) durchgeführt. Durch den
Einbau der Digoxigenin-markierten dUTP bildeten sich in den virusinfizierten Zellen
blauschwarze Präzipitate (s. Abb. 22a und Abb. 22b).
Die Digoxigenin-Markierung bot im Vergleich zur indirekten In situ PCR, bei der
Hybridisierung durch markierte DNA-Sonden durchgeführt wird, den Vorteil eines
sehr sensitiven Nachweises auch kleinerer Mengen DNA. Bei der direkten Zugabe
von Dig-markierten dUTP kann die Zahl der Zyklen gesenkt werden, bei der
konventionellen PCR bis auf fünf, wie im Southern-Blot mit Peroxidase-konjugierten
anti-Dig-Antikörpern und Farbreaktion nachzuweisen war. Die Menge war geringer
als jene, die man gebraucht hätte, um markierte Hybridisierungssonden herzustellen.
Zudem ist diese Methode sensitiver, da aufgrund der räumlichen Gegebenheiten nicht
viele Sonden in die Zelle diffundieren können. Radioaktiv markierte Sonden bringen
Schwierigkeiten bei der Handhabung der radioaktiven Substanzen, wie z.B. die
Benutzung eines gesonderten Arbeitsplatzes, mit sich. Außerdem ist die direkte In
situ PCR von kurzer Dauer, preiswerter, erfordert weniger Manipulation der Zellen
und beugt damit den Verlust dieser vor [85].
Neben der Probe wurden auf jeden Objektträger zwei Kontrollproben aufgetragen.
Sie
sollten
dazu
dienen,
falsch-positive
und
falsch-negative
Ergebnisse
51
auszuschließen. Eine wurde nicht mit Reverser Transkriptase behandelt, so daß für
die PCR keine zu amplifizierende Vorlage vorhanden war. Hiermit konnte überprüft
werden, ob die Färbung durch noch vorhandene DNA ausgeschlossen ist. Sie stellte
die Negativkontrolle dar. Die Positivkontrolle wurde nicht mit DNase behandelt, so
daß diese auf jeden Fall viele positive Zellen aufweisen mußte, verursacht durch
DNA-Reparaturmechanismen unter Einbau von Dig-dUTP [87] (s. Abb. 23 und Abb.
42).
Die Spezifität der amplifizierten Produkte wurde durch den Southern Blot, in dem
nur die Bande der gewünschten Größe zu erkennen war, bestätigt. Artefakte durch
DNA-Reparaturmechanismen und unspezifisches Priming der zellulären DNA
konnten durch den RT-PCR vorausgehendem DNase Verdau verhindert werden.
Erhöhtem Grad von DNA-Reparaturmechanismen durch ungenügenden DNase
Verdau wurde durch lange DNase-Inkubationszeit vorgebeugt [82].
Durch die Immunfluoreszenz waren 15 Stunden nach Infektion ungefähr 25 % der
Zellen nachweislich infiziert. In der In situ RT-PCR waren 40 % der Zellen positiv
für den Infektionsnachweis.
52
Abbildung 22a und 22b: In situ RT-PCR mit Zellen der Linie A549, welche 15
Stunden mit RSV infiziert waren. In den infizierten Zellen bilden sich blauschwarze
Präzipitate. (x 100)
53
Abbildung 23: Negativkontrolle der In situ RT-PCR, bei der die Reverse
Transkriptase fortgelassen wurde. (x 100)
Abbildung 24: Positiv-Kontrolle der In situ RT-PCR, bei der die keine DNaseEinwirkung stattfand. (x 100)
54
4 Diskussion
Respiratory Syncytial Virus ist die häufigste Ursache einer akuten Infektion der
unteren Luftwege in der Kindheit, und viele epidemiologische Studien zeigen, daß
diese Infektionen zu der Entwicklung von rezidivierenden Episoden von Dyspnoe
und Asthma in der Kindheit beitragen [16;30;31;34;46;90].
Die reversible Obstruktion der Luftwege und die bronchiale Hyperreagibilität, die
das Asthma charakterisiert, ist mit einer chronischer Entzündung der Luftwege
korreliert. Allerdings ist über die Auslösung dieses Entzündungsprozesses durch
RSV erst wenig bekannt [34;40]. Ein möglicher Mechanismus für die Entwicklung
von postbronchiolitischer Dyspnoe und Asthma ist eine chronische Persistenz von
RSV in der Lunge, welche einen möglichen Stimulus für die chronische Entzündung
der Luftwege durch eine Quelle von körperfremdem Protein darstellen könnte
[91;92].
Genomische RNA und Protein von RSV konnten noch 60 Tage nach Infektion von
Meerschweinchen in den Lungen nachgewiesen werden. Das Vorhandensein von
RSV-RNA und -Protein wurde von exzessiven bronchiolären Infiltraten von
Neutrophilen Granulozyten begleitet [91]. Das Vorhandensein von intrapulmonaler
viraler genomischer RNA zeigt, daß RSV über 60 Tage überlebt, denn RNA von
inaktivierten Viren würde durch die Endogene Ribonuklease verdaut werden.
Bramley konnte über 100 Tage virale Proteine in einigen Zellen der Lunge von
Meerschweinchen nachweisen, welche mit einer Hyperreagibilität und einer
Eosinophilie der Luftwege einherging [92].
Die Frage, welche Zellen der Lunge persistent infiziert werden, ist noch nicht
beantwortet.
Der
Ausbreitungsmechanismus
des
Virus
vom
oberen
in
den
unteren
Respirationstrakt ist noch unklar. Angenommen wird eine Ausbreitung von Zellen zu
Zelle über das respiratorische Epithel oder durch aspiriertes Sekret, allerdings ist das
Trachealepithel nur gering infiziert. RSV ist auch im Blut [58] und in zirkulierenden
Monozyten infizierter Menschen gefunden worden [55]. Somit wäre eine Infektion
55
des unteren Respirationstraktes durch das Blut bzw. seiner Zellen denkbar.
Die Art der Zellen, welche eine Ausbreitung über den Blutweg von oberen zu unteren
Respirationstrakt verursachen, ist noch nicht bekannt.
Bei Patienten mit schwerem Immundefekt sind systemische Infektionen in anderen
Organen wie der Nieren, der Leber und dem Myokard beobachtet worden [9;10;11].
So scheint RSV auch an der Genese des Morbus Paget des Knochens beteiligt zu sein
[12;13;14;15].
Wie das Virus sich in die außerrespiratorischen Organe ausbreitet, ist nicht geklärt.
Ein möglicher Weg der Infektion könnte die Infektion von Stammzellen sein.
Stammzellen entstehen durch Teilung im Knochenmark. Sie zirkulieren von dort aus
im peripheren Blut, um danach in das Knochenmark zurück zu kehren. Sie besitzen
die Fähigkeit, sich in verschiedene Zellarten zu differenzieren, u. a. zu Osteoklasten.
In dieser Arbeit wurden zunächst Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems auf
ihre Infizierbarkeit mit dem Respiratory Syncytial Virus (RSV) untersucht.
Verwendet wurden undifferenzierte und differenzierte HL 60-Zellen, welche in der
Lage sind, sich von Promyelozyten in reife Granulozyten und Monozyten zu
differenzieren. Außerdem wurde die Makrophagenzellinie NR8383 benutzt.
4.1 Standardisierung der Infektion
Zunächst erfolgte die Standardisierung der Infektion der verwendeten Zellinien mit
dem Virus, um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Es wurde
der Virusstamm RSV Long ausgewählt, da dieser Stamm, neben RSV-A2 und B
18357, zu den etabliertesten Stämmen gehört. RSV Long besitzt bekannte
Wachstumseigenschaften und ist auch in anderen Eigenschaften gut charakterisiert.
Für die Vermehrung und Standardisierung wurden Zellen der Linien HEp-2 und
A549 ausgewählt. Beide Zellinien stammen von Respirationsepithel ab. HEp-2 ist
eine Humane Larynxkarzinom-Zellinie, die am häufigsten als zelluläres Modell für
die RSV-Infektion und zu Vermehrung des Virus benutzt wird [69]. A549 ist eine
56
Humane
Lungenkarzinom-Linie,
Alveolarepithelzellen
der
deren
Zellen
menschlichen
Eigenschaften
Lunge
besitzen
der
[68].
Typ
II-
Typ
II-
Alveolarepithelzellen der Lunge werden bei der RSV-Infektion des Menschen
ebenfalls befallen.
Optimale Infektionsraten ließen sich durch die Verwendung von 1 %igem fetalen
Kälberserum, welches nach 24 Stunden durch 10 %iges ersetzt wurde, erzielen. Es
zeigte sich, daß der pH-Wert keinen Einfluß auf die Infektionsrate hatte.
Der Virusnachweis war durch unterschiedliche Methoden zu führen. Die für RSV
typische Synzytienbildung erbrachte allein durch Betrachtung der Zellen den
Nachweis der Infektion. In Fällen, in denen ein quantitativer Nachweis infizierter
Zellen erforderlich war, bewährte sich die Immunfluoreszenz. Sowohl das benutzte
Antikörpergemisch RSV3-NCL, mit monoklonalen Antikörpern gegen die M2-, P-,
F- und N-Proteine und der Antikörper 3C4, ein monoklonaler Maus-Antikörper
gegen das P-Protein, eigneten sich in Kombination mit FITC-konjugierten
Antikörpern zum Infektionsnachweis.
4.2 Infizierbarkeit
von
humanen
Promyelozyten,
Granulozyten und monozytären Leukozyten
HL-60, eine humane leukämische Zellinie, wurde aus peripheren Blutleukozyten
eines Patienten mit akuter promyelozytischen Leukämie etabliert [93]. Diese Zellinie
zeigt bestimmte morphologische und histochemische Verbindungen zur myeloischen
Differenzierung. Die Behandlung dieser Zellen mit einer Vielzahl von Chemikalien
löst ein Programm einer myeloischen Differenzierung aus, welche in vielen Aspekten
der Differenzierung von normalen myeloischen Zellen ähnelt. Die kultivierten Zellen
sind überwiegend Promyelozyten, aber die Zugabe von DMSO (Dimethylsulfoxid)
zur Zellkultur induziert diese, sich in Myelozyten, Metamyelozyten und stabkernige
und segmentkernige Neutrophile zu differenzieren [72;74]. Nach Exposition von
TPA (12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Azetat) zeigen die Zellen Eigenschaften von
Monozyten [75]. Der Differenzierungsprozeß enthält einen irreversiblen Schritt,
57
welcher sich 48 Stunden nach Exposition durch DMSO und 12 Stunden nach
Exposition von TPA ereignet [73].
Die Promyelozyten bzw. reifen Granulozyten und monozytären Leukozyten wurden
auf ihre Infizierbarkeit mit RSV getestet. Alle Zellen waren mit RSV infizierbar. In
der Immunfluoreszenz waren ungefähr zehn Prozent der Zellen nachweisbar infiziert.
Bei den TPA-differenzierten, monozytenähnlichen Zellen ließen sich keine
lichtmikroskopischen
Veränderungen
beobachten.
Die
morphologischen
Veränderungen der undifferenzierten und DMSO-differenzierten, granulozytären HL60-Zellen durch Infektion mit RSV betrafen nahezu alle Zellen der Kultur. Es war
keine Bildung von Synzytien zu beobachten.
Die veränderten Zellen der undifferenzierten und TPA-differenzierten Kultur war
nicht alle mit dem Virus infiziert. Möglicherweise könnten Interleukin-8 und -6,
welche aus infizierten mononukleären Zellen des Blutes und Granulozyten bei RSVInfektion vermehrt freigesetzt werden, über parakrine Effekte auch nicht infizierte
Zellen beeinflussen [38].
Daß nicht nur phagozytiertes Material in der Immunfluoreszenz nachgewiesen
wurde, bestätigt der Nachweis der produktiven Infektion mit RSV. Gefilterter
Zellüberstand der infizierten, undifferenzierten und differenzierten HL-60-Kulturen
infizierte, auf A549 Kulturen gegeben, andere Zellen. Damit wurde gezeigt, daß die
infizierten Zellen produktives Virus frei setzten.
Midulla konnte ebenfalls eine gute Infizierbarkeit von Blutmonozyten und
Alveolarmakrophagen in vitro feststellen, während Lymphozyten nur zu einem
geringen Teil infiziert wurden. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit erbrachten
Ergebnissen zeigten die aus dem Blut isolierten neutrophilen Granulozyten keine
Infizierbarkeit [57,94].
Es wurde nachgewiesen, daß RSV-infizierte undifferenzierte HL-60-Kulturen
apoptotisch wurden und granulozytär differenzierte infizierte HL-60-Zellen nicht der
Apoptose unterlagen. Monozytär differenzierte HL-60-Zellen zeigten Apoptose,
58
wobei sich der Anteil der apoptotischen Zellen nach Infektion mit RSV noch erhöhte.
Nach drei Wochen war durch RT-PCR und Immunfluoreszenz keine Infektion mehr
nachweisbar. Jedoch führte die Infektion von HL-60-Kulturen mit RSV zur Induktion
einer massiven Apoptose, die in der drei Wochen alten Kultur nicht mehr
nachweisbar war, so daß der Schluß nahe liegt, daß RSV infizierte Zellen durch
Apoptose vollständig aus der Kultur entfernt wurden.
Somit konnte Die These, daß eine persistente Infektion von Blutzellen der
myeloischen Zellreihe zur chronischen Infektion der Lunge beiträgt, widerlegt
werden.
4.3 Infizierbarkeit der Makrophagen-Zellinie-NR8383
Die Alveolarmakrophagen-Zellinie der Ratte NR8383 dient als homogenes Model, an
welchem zahlreiche funktionelle Makrophagenantworten untersucht werden können
[95]. Die Alveolarmakrophagen zeigten nach RSV-Infektion eine deutliche
morphologische Änderung. Auch drei Wochen nach der Infektion dieser Zellen mit
RSV waren noch viele infizierte Zellen mit unterschiedlichen Methoden
nachweisbar. Auch einige wenige apoptotische Zellen waren vorhanden.
Diese Ergebnisse sind mit den Ergebnissen vergleichbar, die anhand von humanen
Alveolarmakrophagen aus Bronchiallavage-Material gewonnen wurden. Panuska
wies nach, daß humane Alveolarmakrophagen in vitro und in vivo infizierbar sind
[52;53]. RSV-infizierte Alveolarmakrophagen produzierten und setzten infektiöses
Virus bis 25 Tage nach Infektion in den Zellüberstand frei [53]. Nur eine stabile
Subpopulation von humanen Alveolarmakrophagen, welche durch Lavage gewonnen
wurde, ist infizierbar [54;96]. Nicht vollkommen vereinbar mit dem Ergebnis aus den
Infektionsversuchen mit den NR8383-Zellkulturen ist, daß die RSV-infizierten
Alveolarmakrophagen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollkulturen keine
Zeichen des Absterbens oder der Synzytienbildung zeigen, sondern im Verlauf
weniger Virus freisetzen und zum größten Teil die Virusproduktion abzubrechen
schienen [53;54;96;97].
59
Damit würde eine der drei Bedingungen, die für eine Langzeit-Persistenz Infektion
gelten, erfüllt. Ein Virus kann nur in einer Wirtszelle überleben, wenn es nicht die
Zelle oder den Wirt tötet. Weiterhin müssen Mechanismen vorhanden sein, die das
Verbleiben des viralen Genoms in der Wirtszelle, z.B. bei Zellteilung, sicherstellen.
Drittens muß das Virus mehr oder weniger effektiv die Reaktion des Immunsystems
des Wirtes abwehren können [98].
Eine mögliche Beteiligung von RSV durch Persistenz an der Pathogenese des
Morbus Paget wird durch die Existenz von Paramyxoviren im menschlichen
Knochenmark unterstützt [99]. Parainfluenza-Virus 1 (Sendai-Virus) als ein Vertreter
der Familie der Paramyxoviren infiziert persistent Nervengewebe [64]. Die
Persistenz bzw. Latenz von Masern-Virus im Nervengewebe und in Lymphozyten ist
schon länger bekannt [65;98]. Mumps-Virus kann in Synovialgewebe persistieren
[66]. RSV-Proteine sind nachgewiesen worden [14], der Nachweis von RSV-Genom
fehlt.
Auch die Frage, auf welchem Weg RSV in das Knochengewebe gelangt, ist
ungeklärt. Eine mögliche Variante wäre eine Ausbreitung über zirkulierende
Stammzellen, welche in der Lunge oder in Lymphknoten infiziert werden und in den
Knochen einwandern, um sich dort in Osteoklasten zu differenzieren. In Zellen und
Plasma von Neugeborenen und Säuglingen mit RSV-Infektion sind genomische und
mRNA nachgewiesen worden [58]. Während einer akuten Infektion konnten mRNA
und genomische RNA in zirkulierenden Monozyten nachgewiesen werden [56].
Leukozyten von erkrankten Kindern exprimierten virales Antigen; eine produktiver
Infektion war allerdings nicht nachweisbar [55]. Produktive Infektion von Alveolarund Blutmakrophagen in vitro über 25 Tage konnte ebenfalls nachgewiesen werden
[53].
4.4 In situ RT-PCR
Viele Aspekte der RSV-Infektion sind mit den herkömmlichen Methoden nicht
hinreichend zu untersuchen. Es wäre aber sinnvoll, die einzelne befallene Zelle
(Blutmonozyt, möglicherweise persistent infizierter Osteoklast, infizierter Subtyp der
60
infizierten Alveolarmakrophagen etc.) nachweisen und charakterisieren zu können,
auch wenn eine persistente, d.h. Virusreplikation auf niedrigem Niveau, oder latente,
d.h. Präsenz von viralem Genom ohne Replikation eines kompletten Virus, Infektion
vorliegt.
Akute lytische Infektionen durch RSV können zellgebunden durch In situ
Hybridisierung oder gar Immunfluoreszenz nachgewiesen werden, denn hier ist viel
RNA bzw. Virusprotein vorhanden. Eine persistente oder latente Infektion wäre mit
den herkömmlichen Methoden nicht nachweisbar. Außerdem ist zu fordern, daß der
Nachweis zellgebunden ist.
Um die persistent RSV infizierten Zellen im Gewebe nachweisen und
charakterisieren zu können, ist eine sensible Nachweismethode erforderlich [100]. In
persistent infizierten Zellen ist die Menge nachweisbaren Proteins möglicherweise
gemindert [79]. Deshalb ist die Immunfluoreszenz-Methode nicht anwendbar. Die In
situ Hybridisierung ist wegen der relativ hohen Nachweisgrenze für die Zahl der
DNA- und RNA-Kopien ebenfalls erschwert, da in persistent infizierten Zellen nur
geringe Menge an viraler genomischer und mRNA vorhanden ist. Ein sehr sensitiver
Nachweis der mRNA wird durch die RT-PCR geführt, welche die Infektion nicht
zellgebunden dokumentieren kann. So bietet sich die In situ RT-PCR an.
Die PCR ist eine schon lange etablierte Methode, die eine enzymatische
Amplifikation von kleinsten Mengen DNA ermöglicht, welche zuvor aus den zu
untersuchenden Zellen extrahiert wurde. RT-PCR ermöglicht durch die Herstellung
einer cDNA durch eine Reverse Transkriptase und anschließender Vervielfältigung
durch eine DNA-abhängige DNA-Polymerase auch eine Vervielfachung von RNA
bzw. mRNA. Diese Reaktion geschieht bei der In situ RT-PCR in den Zellen eines
Gewebes, Zellen in Suspension oder Zellen, welche auf einem Objektträger fixiert
sind. Nachgewiesen wird das amplifizierte Produkt durch den Einbau von Haptenkonjugierten Nukleotiden oder markierten DNA-Sonden, welche immunenzymatisch,
fluoreszenzmikroskopisch oder radiographisch nachgewiesen werden.
Die in dieser Arbeit untersuchten RSV-infizierten Zellen der Linie A549 zeigten in
61
20 % der untersuchten Zellen eine positive Reaktion. Diese Zahl entsprach der durch
Immunfluoreszenz ermittelten Zahl der infizierten Zellen. Es stellte sich heraus, daß
der Schritt der Fixierung und des anschließenden Andaus mit Proteinase sehr genau
optimiert werden mußte, um einerseits einen befriedigenden Nachweis des Produktes
zu erhalten, andererseits falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu
verhindern.
Mit der Methode der In situ RT-PCR ist es also möglich, RSV infizierte Zellen
nachzuweisen.
Zunächst
wurden
Zellen
einer
A549-Zellkultur
untersucht.
Interessante Anwendung für diese neu etablierte Methode sind die Charakterisierung
der Untergruppen infizierter Zellen im Blut oder Knochenmark und die
Untersuchung von Gewebeschnitten, beispielsweise der Lunge, der Lymphknoten
oder des Knochens.
62
5 Zusammenfassung
Die Ursache von postbronchiolitischer Dyspnoe und Asthma bei Patienten nach
RSV-Infektion der unteren Atemwege ist noch unbekannt. Eine RSV-Infektion in
bestimmten Zellen der Lunge, welche durch Persistenz eine chronische Entzündung
der Luftwege hervorruft, ist ein möglicher Mechanismus.
Eine Ausbreitung der Infektion in andere Organe des Körpers wird möglicherweise
durch die Infektion von Zellen des Blutes vermittelt.
Ziel dieser Arbeit sollte es sein, Zellen, die möglicherweise durch RSV infiziert
werden, zu identifizieren und eine sensible Nachweismethode zu entwickeln.
Bei den Infektionsversuchen konnte gezeigt werden, daß RSV promyelozytäre,
granulozytäre und monozytäre HL-60-Zellen infiziert. Eine Ausbreitung der Infektion
über granulozytäre und monozytäre Zellen in Lymphknoten und die Infektion von
promyelozytären Zellen kann bei der Pathogenese der Erkrankung also nicht
ausgeschlossen werden.
In den Langzeitkulturen infizierter HL-60-Zellen wurde zu Anfang der Infektion
deutlich
Apoptose
nachgewiesen.
Nach
drei
Wochen
waren
durch
Immunfluoreszens- und PCR-Methoden keine infizierten Zellen mehr nachweisbar,
aber auch keine Apoptose. Daraus ergibt sich, daß in HL-60-Kulturen die RSVinfizierten Zellen durch Apoptose zerstört werden. Daher konnte die These, daß eine
persistente Infektion von Blutzellen der myeloischen Zellreihe zur chronischen
Infektion der Lunge beiträgt, widerlegt werden.
Hingegen waren Alveolarmakrophagen der Zellinie NR8383 nach drei Wochen noch
nachweisbar infiziert. Somit bleibt die Möglichkeit offen, daß Alveolarmakrophagen
möglicherweise Träger der Persistenz sind.
Hieraus ergibt sich die Forderung nach einem zellgebundene Nachweis der Infektion,
in Zellen des Blutes wie auch in Geweben wie z.B. der Lunge oder Lymphknoten.
63
Die In situ RT-PCR bietet diese Möglichkeit. Durch das entwickelte Protokoll
konnten einzelne infizierte Zellen einer A549-Zellkultur nachgewiesen werden.
64
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Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Paul Kiefer für die Überlassung des
interessanten Themas und die engagierte und geduldige Betreuung.
Herrn Prof. Dr. Hermann Werchau danke ich für die Rahmenbedingungen, die diese
Promotionsarbeit ermöglicht haben.
Ich danke allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe, Frau Dr. Marianne Antoine, Frau
Tanja Knickenberg, Frau Dr. Kerstin Reimers-Fadhlaoui, Herrn Dr. Volker Blecken,
Herrn Dr. Roman Köhl und Herrn Dipl.-Biochem. Christian Roder für die
angenehme Atmosphäre im Labor und ihre Unterstützung bei der Durchführung der
Arbeit.
Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir das Studium durch
ihre Unterstützung ermöglicht haben.
Nicht zuletzt möchte ich Frau Susanne Götz und Herrn Olaf Schulemann für ihren
freundschaftlichen Rückhalt danken.
81
Lebenslauf
Anschrift
Cruismannstr. 8
44807 Bochum
Persönliche Daten
Geburt
Familienstand/Kinder
05.02.1974 in Ahlen
ledig/keine
Schulbildung
1979-1984
1984-1993
Kardinal-von-Galen-Grundschule in Sendenhorst
Gymnasium St. Michael in Ahlen, Abitur
Studium
1993-2000
1995
1996
1999
1999-2000
Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität Bochum
Ärztliche Vorprüfung
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr: Knappschaftskrankenhaus BochumLangendreer
06.11.2000
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Berufliche Tätigkeit
seit 01.01.2001
Ärztin im Praktikum in der Frauenklinik des St.Johannes-Hospitals in Dortmund
82