CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor

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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
CpG Motive und ausgewählte Toll-like-RezeptorLiganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen
Leukozyten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Julia Dahnke
aus
Schwerte
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung:
PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
1. Gutachter:
PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. vet. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung:
25.11.2003
meiner Mama in Liebe und Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ............................................................................. 8
1 Einleitung und Zielsetzung ................................................................................................ 11
2 Literaturübersicht............................................................................................................... 12
2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem ......................................................................12
2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch Komponenten des
Immunsystems.........................................................................................................................13
2.2.1 Mannose bindendes Lektin (MBL) ....................................................................... 13
2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14) ..................................................................... 14
2.2.3 Toll-like-Rezeptoren ............................................................................................. 14
2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster ..............................................................................22
2.3.1 CpG-Motive........................................................................................................... 22
2.3.2 Lipopolysaccharid (LPS)....................................................................................... 29
2.3.3 Lipoteichonsäure (LTA)........................................................................................ 29
2.4 Bakterielle Superantigene.......................................................................................................30
2.5 Neutrophile Granulozyten ......................................................................................................32
2.5.1 Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten.................................. 32
2.5.2 Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten.............................................. 32
2.5.3 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr............................ 33
2.6 Makrophagen...........................................................................................................................34
2.7 Apoptose und Nekrose ............................................................................................................35
2.7.1 Induktion der Apoptose ......................................................................................... 35
2.7.2 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten.............................................................. 36
3 Geräte, Material und Methoden......................................................................................... 38
3.1 Geräte .......................................................................................................................................38
3.2 Material ....................................................................................................................................39
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
Klinikbedarf........................................................................................................... 39
Laborbedarf ........................................................................................................... 39
Reagenzien ............................................................................................................ 40
Antikörper und Nachweisreagenzien .................................................................... 43
Kulturmedien, Puffer und Lösungen ..................................................................... 44
3.2.6 Tiere....................................................................................................................... 51
3.3 Methoden..................................................................................................................................52
3.3.1 Gewinnung einzelner Zellpopulationen aus bovinem Blut ................................... 52
3.3.2 Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung monozytoider Zellen
des peripheren Blutes (BMDM, blood monocyte derived macrophages) ............. 53
3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen .......................................................................... 57
3.3.4 Durchflusszytometrie ............................................................................................ 58
3.3.5 Zellkultivierung in vitro ........................................................................................ 63
3.3.6 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ....................................................... 69
3.3.7 Statistische Verfahren............................................................................................ 72
4 Ergebnisse........................................................................................................................... 73
4.1 Generierung und Charakterisierung boviner Makrophagen..............................................73
4.1.1 Methodische Vorarbeiten ...................................................................................... 73
4.1.2 Messung der Nitrit-Bildung durch in vitro generierte Makrophagen.................... 77
4.2 Bindung von DNA-Motiven an bovine leukozytäre Zellen und in vitro generierte
Makrophagen ..........................................................................................................................85
4.2.1 Klassischer Bindungsnachweis ............................................................................. 85
4.2.2 Alternativer Bindungsnachweis mittels Amplifikation......................................... 87
4.2.3 Prüfung der Internalisierung biotinylierter DNA-Sequenzen ............................... 92
4.3 Prüfung der Proliferation induzierenden Potenz von CpG-Motiven auf bovine
mononukleäre Zellen in vitro.................................................................................................93
4.3.1 Proliferative Eigenschaften von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA.................. 93
4.3.2 MHC-Klasse-II-Expression in vitro stimulierter boviner mononukleärer Zellen
des Blutes .............................................................................................................. 96
4.4 Das beschleunigte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten in vitro............................98
4.4.1 Effekte von CpG-Motiven, LPS und LTA für reine neutrophile Granulozyten ... 98
4.4.2 Einfluss von CpG-Motiven, LPS und LTA auf neutrophile Granulozyten in
Kokulturen aus PMN und MNC.......................................................................... 100
4.4.3 Einfluss von Kulturüberständen CpG-stimulierter mononukleärer Zellen auf
neutrophile Granulozyten .................................................................................... 102
4.4.4 Einfluss von Kulturüberständen aus allogenen MLCs ........................................ 104
4.4.5 Einfluss von CpG-Motiven auf eosinophile Granulozyten ................................. 105
4.4.6 Abhängigkeit des Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten vom
Progesteronspiegel............................................................................................... 106
4.4.7 CpG-Motive in Kombinationsansätzen aus bovinen Makrophagen und
neutrophilen Granulozyten .................................................................................. 108
4.4.8 Bedeutung der Reaktionslage von neutrophilen Granulozyten für das Ausmaß
ihres Vitalitätsverlustes nach PAMP-Stimulation............................................... 109
4.4.9 Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro Kokultivierung von
PMN und MNC in Anwesenheit von TLR-Liganden ......................................... 113
5 Diskussion......................................................................................................................... 119
5.1.1 Beurteilung der in vitro generierten Makrophagen ............................................. 119
5.1.2 Nachweis der Produktion von NO in MNC und Makrophagen .......................... 120
5.1.3 Bindung und Internalisierung von CpG-Motiven durch Zellen des peripheren
Blutes und Makrophagen..................................................................................... 123
5.1.4 Interaktion von CpG Motiven mit bovinen MNC ............................................... 124
5.1.5 Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit neutrophilen
Granulozyten ....................................................................................................... 126
6 Zusammenfassung............................................................................................................ 133
7 Summary ........................................................................................................................... 135
8 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 137
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb.
ACD-Puffer
ADCC
Aqua tridest.
BoBMDM
BoCD
BoLA
BSA
bspw.
bzw.
C1q
C5a
ca.
CD
CD4+
CD8+
CO2
ConA
CpG
CR
D
DAF-2 DA
DAF-2 T
DNA
DS
E. coli
EDA
EDTA
FACScan®
Fc
FCM
FCS
FITC
FL-1, -2, -3
Abbildung
Acid-Citrate-Dextrose (Citronensäurehydrat-Natriumzitrat-DextrosePuffer)
Antibody Depending Cell Cytoxicity (Antikörperabhängige
Zellzytotoxizität)
Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)
Bovine Bone Marrow Derived Macrophages
Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für bovine Homologe zu
humanen Differenzierungsantigenen mit CD-Nomenklatur
Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für den
Haupthistokompatibilitätskomplex des Rindes
Bovines Serumalbumin
Beispielsweise
Beziehungsweise
Fragment der Komplementkomplemente C1
aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5
Zirka
Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche
exprimieren
Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche
exprimieren
Kohlenstoffdioxid
Concanavalin A
Cytosin-Phosphate-Guanosin
Complement Receptor (Komplementrezeptor)
dies (lateinisch: Tag); D0 = Ausgangsmessung vor einem Versuch, D5,
D6 = 5 bzw. 6 Tage nach Versuchsbeginn
Diaminofluoreszein-2 Diazetat
Diamino Triazolfluoreszein
Desoxyribonukleinsäure
Danger Signal (Gefahrensignal)
Escherichia coli
Extra domain A
Ethylendiamintetraacetat
Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes
Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales
Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)
Flow Cytometer (Durchflusszytometer)
Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum)
Fluoreszeinisothiocyanat
Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz
FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz,
585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
FSC
g
G-CSF
GM-CSF
h
HRP
HSP
I10F+Strep
ICAM
IFN
Ig
IL
i.m.
iNOS
i.p.
l
LBP
LFA-1
LPS
LTA
LTB4
µ
m
M
mAK
MAP
MBL
MDM
MHC
MIF
min
MNC
MW
Mph
N
NaCl
n
NO
Nr.
ODN
P
PAMP
PBS
PD
PE
Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
Gramm
Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor)
Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (GranulozytenMakrophagen-Wachstumsfaktor)
hora (lateinisch: Stunde)
Horse-Radish-Peroxidase
Heat Shock Protein (Hitzeschockprotein)
Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS
intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
Interferon
Immunglobulin
Interleukin
intra muskulär
induzierbare Stickstoffoxid Synthetase
intra peritoneal
Liter
Lipopolysaccharid-Binding Protein
Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1
Lipopolysaccharid
Lipoteichonsäure
Leukotrien B4
mikro (x 10-6)
milli (x 10-3)
Molar (Mol/l)
monoklonale(r) Antikörper
Mitogen Activated Protein
Mannose Binding Lectin (Mannose bindendes Lektin)
Monocyte Derived Macrophages – aus Monozyten gewonnene
Makrophagen
Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
Membranimmunfluoreszenz
Minute(n)
Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)
arithmetischer Mittelwert
Makrophagen
bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen
Natriumchlorid
nano (x 10-9)
Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid)
Nummer
Oligodeoxynukleotide
Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier
Datengruppen
Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern)
Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
Phosphodiester
Phycoerythrin
Pellet
PGE2
PI
PMN
PS
PT
ROS
RT
S
s.
s.c.
s.S.
SDCC
SEA
sek
sog.
SSC
Tab.
TAD
TCR
TIRAP
TIR
TNF
TIR
TOLLIP
TRAF6
TRAMP
u.a.
vgl.
v/v
xg
z.B.
z.T.
Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen
Progesteron E2
Propidiumiodid
Polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten)
Phosphatidylserin
Phosphorothioat
Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies)
Raumtemperatur
Standardabweichung
siehe
sub cutan
siehe Seite
Superantigen Dependent Cellular Cytotoxicity (Superantigen abhängige
zelluläre Zytotoxizität)
Staphylococcus aureus Enterotoxin A
Sekunde(n)
sogenannte(r)
Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
Tabelle
TGF-β-Activated Kinase
T Cell Receptor (T-Zellrezeptor)
TIR-Domain-Containing Adapter Protein
Toll Interacting Receptor
Tumornekrosefaktor
Toll Interacting Protein
Toll interacting Protein
TNR-Receptor-Associated Factor 6
TNF-Receptor Related Apoptosis Mediating Protein
unter anderem
vergleiche
Volumen pro Volumen
multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
zum Beispiel
zum Teil
Einleitung und Zielsetzung
1 Einleitung und Zielsetzung
Zellen des Immunsystems erkennen Erregerbestandteile über sog. „Erreger-assoziierte
molekulare Muster” (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Die PAMPs stellen
eine sehr heterogene, vielfältige Gruppe dar. Unter ihnen befinden sich Moleküle wie das
Lipopolysaccharid Gram negativer Keime, die Lipoteichonsäure Gram positiver Bakterien
und auch nicht-methylierte DNA-Sequenzen, die im Zentrum ein CG-Dinukleotid aufweisen
(CpG-Motive) und nahezu allen Gruppen an Infektionserregern (Viren, Bakterien, Protozoen)
gemeinsam sind.
Zellen des Säuger-Immunsystem besitzt für diese PAMPs Rezeptoren (Toll-like-Rezeptoren),
über die sie die Präsenz von Erregern erkennen. Die TLR sind genetisch determinierte Rezeptoren, die das Bindeglied zwischen dem konstitutiven und adaptiven Immunsystem bilden.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen CpG-Motive, da über ihre Wirkung auf Zellen des
bovinen Immunsystems nur wenig bekannt ist. Für Mensch und Maus sind variable
Wirkungen verschiedener Motive beschrieben, abhängig von den das Zentralmotiv
flankierenden Nukleotiden. Neben stimulatorischen werden ebenso Zellfunktions-hemmende
und wirkungslose Motive beobachtet.
Längerfristiges Ziel solcher Studien ist es, die CpG-Motive in der Prophylaxe (Adjuvans bei
Immunisierungen) und der Therapie (Immunstimulanz, Allergie- und Tumorbekämpfung)
einzusetzen. Vorraussetzung hierfür ist die genaue Charakterisierung ihrer Wirkungsart auf
bestimmte Zelltypen. Wie und in welcher Weise Zellen des bovinen Immunsystems auf
verschiedene CpG-Motive funktionell reagieren ist jedoch erst in Ansätzen bekannt.
Das Promotionsvorhaben soll hierfür einen Beitrag leisten, indem verschiedene CpG-Motive
auf ihre funktionsmodulierende Wirkung für leukozytäre Subpopulationen des Rindes
vergleichend untersucht werden. Im Einzelnen sollte geprüft werden, ob CpG-Motive
präferentiell an bestimmte Zellsubpopulationen binden, ob und in welchem Umfang
verschiedene Motive eine proliferations-modulierende Potenz für lymphoide Zellen aufweisen
und ob sie die Vitalität einer entscheidenen Effektorzellopulation – der neutrophilen
Granulozyten – direkt oder indirekt beeinflussen.
Da eine der ersten Zellen des Immunsystems nach Erregerkontakt, der gewebsständige
Makrophage in der Steuerung der nachfolgenden Immunreaktionen eine zentrale Rolle
einnimmt sollte zudem die Interaktion bakterieller DNA-Motive und weiteren PAMPs (LPS,
LTA) mit Surrogatzellen – den in vitro generierten Makrophagen aus Blutmonozyten –
stellvertretend geprüft werden.
11
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
Nach Infektion mit verschiedenen Erregern reagiert der Säugerorganismus mit einer
Immunantwort (oder verschiedenen Immunmechanismen), die zum Ziel hat, die Ausbreitung
des Erregers zu verhindern, den Erreger zu eliminieren und ein immunologisches Gedächtnis
aufzubauen, das ihm ermöglicht bei erneutem Kontakt mit dem Erreger diesen schneller zu
eliminieren.
Der primäre Kontakt mit dem Erreger und seinen Bestandteilen erfolgt durch Epithelzellen,
Dendritischen Zellen und Gewebsmakrophagen. Diese Zellen stellen die ersten Barrieren
sowie die ersten Signalgeber für das Vorhandensein eines potentiell schädigenden Agens dar.
Da diese Zellen über keine Antigen spezifischen Rezeptoren verfügen und somit nicht im
klassischen Sinn zwischen „Selbst“ und „Fremd“ unterscheiden können, wurde ein weiteres
Paradigma in die Immunologie aufgenommen. Dies besagt, dass es weniger auf die
„Fremdheit“ eines Antigens ankommt um entzündliche oder adaptive Immunantworten
auszulösen, sondern vielmehr, dass das Antigen in der Lage ist, „Gefahr“ für den Organismus
zu signalisieren. Dieses Konzept der „Danger Signals“ wurde erstmalig von MATZINGER
(1994) zur Diskussion gestellt und seit dieser Zeit mit grossem Gewinn für das Verständnis
initialer Immunprozesse ausgiebig diskutiert.
2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem
Das Vorliegen von Danger Signalen führt in verschiedenen Zelltypen des Immunsystems zu
charakteristischen Folgeprozessen, die letztendlich das Startsignal für eine erfolgreiche
Auseinandersetzung mit dem Träger oder Aussender des DS darstellen. DS können sowohl
endogener als auch exogener Herkunft sein (MATZINGER 2002). Exogene DS sind nicht
genau definiert, doch werden Moleküle wie das NiCl2, MnCl2, CoCl2 und SnCl2 zu einer
Gruppe exogener DC-Schadstoffe gezählt. Nach MATZINGER (2002) wirken exogene
Faktoren wie z.B. LPS, Lipoproteine oder CpG Motive als Danger Signals, da sie ebenfalls an
identischen Rezeptoren (CD14, TLR-2, -4, -9) binden. Die exogenen Signale werden von
Zellen des angeborenen Immunsystems, z.B. APC über genetisch determinierte Rezeptoren
erkannt (HALLMAN et al. 2001), aufgenommen, prozessiert und über Oberflächenmoleküle
präsentiert. Weiterhin führen sie zur Ausschüttung kostimulatorischer Signale, die das
adaptive Immunsystem alarmieren (GALLUCCI und MATZINGER 2001, HALLMAN et al.
2001). Die endogenen DS sind Moleküle, die von Zellen unter besonderen Stressverhältnissen
(bis zum abnormen Tod/Nekrose; s. S. 35, 2.7), abgegeben werden. Endogene DS werden
zum einen in wahre „Primale“ bzw. Feedback Signale, welche von APC ausgeschüttet und
12
Literaturübersicht
zum anderen in konstitutiv vorliegende und neusynthetisierte Signale unterteilt (GALLUCCI
und MATZINGER 2001). Zu den „Primalen“ Signalen gehören u.a. Säugetier DNA, CD40ligand, TNF-α und IL-1β, die aber wegen ihrer weiteren Präsenz auch als Feedback Signal
eingeordnet werden. Sie gehören in jedem Fall zu den konstitutiven DS. Induzierbare
„Primale“ Signale sind z.B. Typ I IFN und Reaktive Sauerstoffspezies. Typ I IFN zählt
ebenfalls zu den Feedbacksignalen. HSP (Heatshock Proteine) verbinden die Gruppen der
konstitutiv exprimierten und induzierten Signale.
2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch
Komponenten des Immunsystems
Die Erkennung pathogener Organismen erfolgt meist spezifisch. Ein erster Weg ist die
Erkennung konservierter Strukturen von Pathogenen mittels spezifischer, genetisch
determinierter Rezeptoren (s. 2.2.3). Zu ihnen gehören u.a. die Cluster of Differentiation (CD)
und Toll-like-Rezeptoren. Im adaptiven Immunsystem erkennen T- und B-Zell Rezeptoren
dargebotene, prozessierte Bestandteile. Spezifische Immunglobuline erkennen ebenfalls Agstrukturen und werden ihrerseits über Fc-Rezeptoren erkannt. Auch über die Bindung von
Mannose-bindendem Lektin (MBL) kann es zur Aktivierung der Komplementkaskade
kommen. Auf weitere Möglichkeiten wird in dieser Literaturübersicht nicht eingegangen.
2.2.1
Mannose bindendes Lektin (MBL)
Mannose bindendes Lektin (MBL) gehört zu der Protein-Familie der Kollektine. Es besteht
aus Oligomeren, die jeweils aus drei Peptidketten, mehreren Lektin-Domänen, kollagenen
Strukturen und einer Cystein-reichen N-terminalen Region aufgebaut sind (SASTRY et al.
1989, TAYLOR et al. 1989). Es ist ein Ca2+-abhängiges Lektin, das an 3- und 4Hydroxylgruppen verschiedener Zucker z.B. auf mikrobiellen Oberflächen bindet
(DRICKAMER 1992, WEIS et al. 1992). Nicht nur strukturell, sondern auch funktionell ist
MBL dem C1q sehr ähnlich. Beide Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Komplementaktivierung, der Opsonisierung mikrobieller Bestandteile und der Phagozytose dieser, sowie
apoptotischer Zellen durch Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen). MBL vermittelt
einen dritten Weg der Komplementaktivierung, der parallel zu dem klassischen Weg über
C1q und dem alternativen Weg über Properdin/ Faktor-D läuft. Im humanen System sind 4
MBL Mutanten bekannt, die geographisch voneinander getrennt nur in bestimmten
Bevölkerungsgruppen vorkommen und in Zusammenhang mit dem systemischen Lupus
erythematodes und Rheuma in Verbindung gebracht werden (LIPSCOMBE et al. 1992).
13
Literaturübersicht
2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14)
CD14 ist ein auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten (YANG et al. 1995)
exprimierter Rezeptor, der in hohen Konzentrationen auch solubilisiert vorliegt. Er ist
Bestandteil des TLR-4-Komplexes (Toll-like-Rezeptor 4), dem Rezeptor für LPS (s. S. 16).
Die in Lösung befindlichen Rezeptoren können nach der Bindung an LPS, Zellen, die kein
CD14 exprimieren, aktivieren (HAZIOT et al. 1993). CD14 ist über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) in der Zellmembran verankert, besitzt jedoch in Ermangelung eines
zytoplasmatischen Anteils keine Fähigkeit zytoplasmatische Signale zu transduzieren
(ULEVITCH und TOBIAS 1995). Nach der Bindung des LPS-CD14-Komplexes an TLR-4
wird eine Enzymkaskade in Gang gesetzt, in deren Folge Zytokine wie z.B. Tumor Nekrose
Faktor, IL-1, IL-6 und IL-8 ausgeschüttet (DENTENER et al. 1993, SCHUMANN et al.
1996) und die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle, unter anderem
Adhäsionsmoleküle, akzeleriert werden. Weiterhin ist CD14 für die Differenzierung
apoptotischer und nekrotischer Zellen von Bedeutung (SCHLEGEL et al. 1999). Bei
Makrophagen ist die Qualität der weiteren Reaktion von der Bindung durch CD14 abhängig.
Für den Menschen und die Maus wurde beschrieben, dass LPS sich mit in Serum
befindlichem LBP (Lipopolysaccharid-binding protein) kreuzvernetzen muss, um an CD14
binden zu können (ADEREM und ULEVITCH 2000). LBP ist ein Akute-Phase Protein der
Leber, dessen Konzentration während systemischer Infektionen und der Akute-Phase Antwort
dramatisch steigt. Es ist für die Monomerisierung von LPS-Vesikeln und dem anschließenden
Transport zu den membranständigen CD14-Rezeptoren zuständig (SCHUMANN et al. 1996,
LAMPING et al. 1998) Im Gegensatz zum murinen und humanen System scheint dies im
bovinen System nicht notwendig zu sein (JUNGI et al. 1997).
2.2.3
Toll-like-Rezeptoren
Der Name Toll-like-Rezeptor stammt von der bei der Fruchtfliege Drosophila als erstes
entdeckten Rezeptorfamilie „Toll“ ab, die dem konstitutiven Immunsystem angehört. Sie
bestehen aus einer extrazellulären leukin-reichen Region, einer transmembranalen Region und
einem intrazellulären Bereich, der dem des IL-1 Rezeptors ähnlich ist. Toll besitzt einen
spezifischen Liganden namens Spätzle. Spätzle ist ein durch die Verarbeitung mikrobieller
Bestandteile entstandenes Molekül (MUZIO und MANTOVANI 2001). Tab. 1 gibt einen
Überblick über die bislang identifizierten TLR und mögliche Liganden.
14
Literaturübersicht
Aufgrund der hohen Homologie in Struktur und Gensequenz zu diesen Toll Rezeptoren
konnten bei Mensch und Maus mindestens 10 verschiedene Toll-like-Rezeptoren identifiziert
werden. Zurzeit ist noch kein Pendant zu Spätzle entdeckt worden, doch konnten spezifische
Liganden einzelner TLR definiert werden, die gesamthaft der Gruppe der so genannten
PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) angehören (s. S. 22, 2.3). Diese Strukturen
mit höchst konserviertem Aufbau kommen in einem sehr großen Spektrum von
Mikroorganismen vor (MEDZHITOV et al. 1997). Zu ihnen gehören z.B. Lipoprotein,
Flagellin (TLR-5), unmethylierte DNA-Motive (CpG-Motive) aus Nicht-Vertebraten (TLR9), sowie Mannane und Mannoproteine aus Hefen (s. Tab. 1). Ebenso wie die Rezeptoren der
Toll Familie bei Drosophila bestehen auch die TLRs aus einer extrazellulären und einer
intrazellulären Domaine, die die Zellmembran einmal kreuzt. Der intrazelluläre Anteil ist
sowohl dem IL-1 Rezeptor als auch dem der Toll Rezeptoren sehr ähnlich und wird TIR
(Toll/Interleukin-1 Rezeptor) genannt (GAY und KEITZ 1991). Alle Rezeptoren bis auf TLR9, dessen Lokalisation noch nicht eindeutig geklärt ist, befinden sich an der Oberfläche der
Zellen (ARMANT und FENTON 2002). KRIEG (1999) beschreibt die Bindung und
anschließende Internalisierung von CpG-Motiven von Zellen, die TLR-9 auf der Oberfläche
exprimieren, wohingegen ARMANT und FENTON (2002) von einer intrazellulären
Lokalisierung ausgehen. TLRs sind ein viel versprechendes Bindeglied zwischen den
Erkennungsmechanismen von konstitutivem und adaptivem Immunsystem. Alle TLRs führen
nach Bindung an ihre Liganden durch ähnliche intrazellulär ablaufende Mechanismen im
Endeffekt zur Bildung von NF-κB oder JNK (c-JUN N-terminal kinase). Die Bindung von
spezifischen Liganden an ihren Rezeptoren kann zur Freisetzung von Zytokinen und
kostimulatorischen
Molekülen
und/oder
Veränderung
der
Expression
von
Oberflächenmolekülen führen (MEDZHITOV und JANEWAY 1997).
15
Literaturübersicht
Tab. 1
Toll-like-Rezeptoren und ihre Liganden
Rezeptor
Exogene Liganden
TLR-2 +TLR-1,
Bakt. Lipoproteine,
Peptidoglykane,
Zymosan (Saccharomyces),
GPI anchor (T. cruzi),
LPS von L. interrogans und P. gingivalis,
Lipoarabinomannan (M. tuberculosis),
Phosphatidylinositol (M. tuberculosis)1,
LTA2
+TLR-6
Endogene Liganden
TLR-3
Doppelsträngige DNA3
TLR-4
LPS,
F protein (resp. syncytial virus)1
TLR-5
Flagellin1
TLR-7
Imidazoquinoline4
TLR-9
Unmethylierte CpG-Motive1
Taxol,
HSP60,
Fibronectin EDA
Bislang sind die spezifischen Liganden der Toll-like-Rezeptoren nicht komplett identifiziert. Diese
Tabelle gibt einen Überblick über den derzeitigen Stand der Untersuchungen.
(1Underhill und Ozinsky 2002, 2Muzio und Mantovani 2001, 3Alexopoulou et al. 2001, 4Hemmi et al.
2002) GPI = Glycosylphosphatidylinositol, HSP60 = Heat Shock Protein 60, LPS = Lipopolysaccharid, LTA = Lipoteichonsäure
TLR-4
Der TLR-4 ist der am besten untersuchte Toll-like-Rezeptor. Er wird auf den Zellen des
peripheren Blutsystems und Makrophagen am stärksten exprimiert, kann aber auch auf
anderen Zellen detektiert werden (MEDZHITOV et al. 1997). Sein Hauptligand ist LPS,
Lipopolysaccharid aus der Zellmembran Gram negativer Bakterien. LPS ist allein über die
Bindung an TLR-4 in der Lage, Zellen in geringem Ausmaß anzuregen. Wenn LPS im Serum
an LPS-bindendes Protein bindet, welches dann das LPS an CD14 liefert, und dieser Komplex
eine Bindung mit TLR-4 eingeht, dann entsteht ein stärkerer Effekt. Die genaue Bindung an
den TLR-4 ist derzeitig noch nicht geklärt. KURT-JONES et al. (2000) vermuten im
Gegensatz zu JESSE et al. (1999), dass sowohl CD14 als auch TLR-4 für die Erkennung
notwendig sind. Für eine starke Aktivierung der Zelle ist nach SHIMAZU et al. (1999)
zusätzlich noch die Bindung des Proteins MD-2 notwendig, einem MD-1 Homolog, das die
Aktivierung von RP105 bestimmt. TLR-4 ist auch in der Lage das respiratorische
16
Literaturübersicht
Synzytialvirus über das Fusionsprotein F zu erkennen (KURT-JONES et al. 2000). Taxol,
HSP60 und Fibronectin EDA sind körpereigene Substanzen, die ebenfalls durch TLR-4
erkannt werden. Taxol benötigt ebenso wie LPS auch einen TLR-4-MD-2 – Komplex
(KAWASAKI et al. 2001). Die Bindung durch HSP60 an den TLR-4 scheint ebenfalls MD-2
abhängig zu sein. HSP60 ist jedoch nicht spezifisch für TLR-4, sondern kann auch durch
TLR-2 erkannt werden (VABULAS et al. 2001). Fibronectin EDA (Extra Domain A) entsteht
durch alternatives Splicing bei Gewebsverletzungen. Dieses ruft über TLR-4 in monozytoiden
Zellen inflammatorische Reaktionen hervor, was OKAMURA et al. (2001) zu der Vermutung
geführt hat, dass dieser Mechanismus bei Gewebsschädigungen für die inflammatorische
Wirkung in vivo zuständig ist.
TLR-2, TLR-1 und TLR-6
TLR-2 erkennt hauptsächlich Bestandteile Gram positiver Bakterien (MUZONI und
MANTOVANI 2001). Es gibt Ausnahmen in der Erkennung von LPS, denn TLR-2 bindet
spezifisch LPS von Porphyromonas gingivalis und Leptospira interrogans. Diese Bindung
scheint, wie auch die Bindung von LPS an TLR-4, ebenfalls von CD14 abhängig zu sein
(HIRSCHFELD et al. 2001). Die Hauptliganden sind bakterielle Lipopeptide,
Peptidoglykane, und Zymosan. Ob Lipoteichonsäure (LTA) ein Ligand des TLR-2 oder
TLR-4 ist wird kontrovers diskutiert (SCHWANDNER et al. 1999, YOSHIMURA et al.
1999, TAKEUCHI et al. 1999). Nach SCHRÖDER et al. (2003) bindet LTA von sowohl
Streptokokkus pneumoniae als auch Staphylococcus aureus über LBP und CD14 an TLR-2,
nicht aber an TLR-4. MD-2 hat keine Auswirkungen auf die Effektivität der LTAStimulation. Auch prokaryotisches GPI als Ankermolekül für die Bindung vieler Proteine an
die Membran von Trypanosoma cruzi ist ein spezifischer Ligand für TLR-2 (CAMPOS et al.
2001). Durch strukturelle Unterschiede zwischen Säuger-GPI und dem prokaryotischem GPI
von Mikroorganismen ist eine differentielle Erkennung durch TLR-2 möglich. Ob die
zusätzliche Bindung von CD14 notwendig ist, wurde bislang noch nicht untersucht. Die
direkte Bindung der beschriebenen Liganden an den TLR-2 wurde bislang noch nicht
nachgewiesen.
Entscheidend für die zelluläre Stimulation durch den TLR-2 ist die Ineffizienz monomerer
TLR-2 Rezeptoren, eine Zelle zu aktivieren. Um eine Aktivierung der Zellen zu erreichen, ist
es unabdingbar, dass sich ein Heterodimer aus TLR-2 mit TLR-6 oder mit TLR-1 bildet
(UNDERHILL und OZINSKY 2002). Durch eine einseitige Blockade von TLR-2 oder TLR-6
konnte die Aktivierung muriner Makrophagen durch Gram positive Bakterien sowie Zymosan
verhindert werden (OZINSKI et al. 2000, HAJJAR et al. 2001). Obwohl eine direkte Bindung
17
Literaturübersicht
der Liganden an TLR-2 noch nicht bewiesen wurde, ist es durchaus denkbar, dass nach einer
Primäraktivierung entstehende Moleküle an die TLRs binden und somit auch für die
Notwendigkeit verschiedener TLR-Kombinationen zuständig sind. Für die Aktivierung von
Zellen durch triazylierte bakterielle Proteine ist z.B. keine Heterodimerbildung notwendig
(OZINSKI et al. 2000).
TLR-3
In einer Studie von ALEXOPOULOU et al. (2001) wurde doppelsträngige, virale DNA als
ein Ligand für TLR-3 identifiziert.
TLR-5
Das besondere an seinem derzeitig identifizierten spezifischen Liganden, dem bakteriellen
Flagellin, ist, dass es ein reines Protein ist. Um eine Aktivierung zu initiieren, muss TLR-5
ein Homodimer bilden. Die Bindung des Flagellins induziert in den Zellen über die
Aktivierung der NF-κB die Bildung von TNF-α (HAYASHI et al. 2001).
TLR-7
HEMMI et al. (2002) konnte eine Aktivierung von TLR-7 präsentierenden Zellen durch
kleine anti-virale Bestandteile wie Imidazoquinoline nachweisen, doch bleibt der natürliche
Ligand weiterhin unklar. Die Aktivierung erfolgt ebenfalls über die MyD88-abhängige
Signalkaskade.
TLR-9
TLR-9 bindet spezifisch DNA-Sequenzen. Sowohl DNA-Motive mit einem zentralen CGDinukleotid (CpG-Motive) als auch DNA-Motive mit einem reversen, zentralen Motiv (GpCMotive), ligieren mit dem TLR-9 und werden endosomal bzw. lysosomal internalisiert
(HACKER et al. 1998). Bis heute konnte keine Zellaktivierung durch die reversen Sequenzen
nachgewiesen werden. CD14, MD-1 und MD-2 haben keine Auswirkung auf die Aktivierung
von Zellen durch TLR-9 (BAUER et al. 2001). Die Beobachtungen durch HARTMANN et al.
(2000), dass unterschiedliche CpG-Motive für Maus und Mensch eine optimale Aktivierung
der Zellen hervorrufen, stellte sich auch für BAUER et al. (2001) in der Spezifität humaner
und muriner TLR-9 Rezeptoren für unterschiedliche Sequenzen dar. Zur Aktivierung ist keine
Kreuzvernetzung verschiedener TLR nötig. Die Signalkaskade des TLR-9 scheint nicht
identisch mit dem des IL-1 Rezeptors zu sein, da durch die Blockierung des MyD88 zwar die
18
Literaturübersicht
NF-κB Induktion durch DNA-Sequenzen, nicht aber die Aktivierung durch IL-1 oder TNF
inhibiert werden konnte.
TLR-8 und TLR-10
Zu den Spezifitäten sowie zu den Aktivierungsmechanismen liegen derzeitig noch keine
Daten vor.
Funktionelle Konsequenz einer TLR-vermittelten Zellaktivierung
Nach Bindung der spezifischen Liganden können zwei unterschiedliche Wege der
Aktivierung eingeschlagen werden (s. Abb. 1). Entweder es erfolgt eine Aktivierung von
NF-κB oder der zur AP-1 Familie der Transkriptionsfaktoren gehörenden Proteine JUN und
FOS. NF-κB ist ein wesentlicher Transkriptionsfaktor für die Aktivierung immunrelevanter
Gene, besonders für die induzierte Synthese von entzündungsvermittelnden Zytokinen (z.B.
TNF-α, IL-1) (HATADA et al. 2000) und bakterizider Radikale, wie z.B. NO (SWEET et al.
1998, SHODA et al. 2001a). Nach der Konformationsänderung des TIR, dem
Toll/Interleukin-1 Rezeptor, werden die MyD88 und TOLLIP (Toll interacting protein)
rekrutiert. Anschließend werden die Serin-/Threonin-Kinasen aktiviert, die der IRAK-Familie
(IL-1-receptor-associated kinases) angehören. IRAK-1 und -2 assoziieren mit TRAF6 (TNRreceptor-associated factor 6), einem weiteren Adapterprotein. Der TRAF6 aktiviert sowohl
TAD1 (TGF-β-activated kinase) als auch MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase).
Weiterhin kommt es entweder zur Degradierung von Iκ-B und anschließender Translokation
von NF-κB zum Zellkern oder zur Aktivierung der c-JUN N-terminal kinase (JNK) bzw. der
p38 MAP Kinase. Letztlich können Apoptose sowie ein großes Spektrum an Zytokinen, unter
anderen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α induziert werden (KRUTZIK et al. 2001).
ARBIBE et al. (2000) beobachteten in ihren Untersuchungen eine physikalische Verbindung
zwischen Rac1 und Phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3 Kinase) im Zusammenhang mit
TLR-2. Auch in TLR-4 positiven, MyD88 defizienten Zellen kann nach KAWAI et al. (1999)
eine geringe Induktion von NF-κB beobachtet werden, was zu dem Schluss führt, dass
Signaltransduktion über einen akzessorischen Mechanismus möglich ist. Ein zusätzliches
Molekül namens TIR domain-containing adapter protein (TIRAP) oder MyD88-adapter-like
(MAL) wurde identifiziert. Nach der Bindung wird über auto- bzw. parakrine Mechanismen
IFN-β produziert. IFN-β ist für die Produktion der iNOS (inducible nitric oxide synthase) und
das interferon inducible protein 10 (IP10) notwendig (TOSHCHAKOV et al. 2002).
19
Literaturübersicht
TLR-2
TLR-4
IFN-beta
MyD88
+TOLLIP
MyD88
Jak/Tyk
TIRAP/Mal
+TOLLIP
IFN-beta
TRAF-6
Abb. 1
Tyr(701)
P
+
NF-kappaB
P
P
STAT1
TAK1
MAP kinase
IL-1beta
TNF-alpha
IFNAR
IL-6
P
Ser(727)
INOS
IP-10
Intrazelluläre Signaltransduktion nach Bindung an TLR-2 oder TLR-4
Diese nach ARMANT und FENTON (2002) modifizierte Graphik zeigt die intrazelluläre
Signaltransduktion nach der Bindung spezifischer Liganden an TLR-Rezeptoren. Beispielhaft sind
TLR-2 und TLR-4 genannt.
In den meisten Studien wird ausschließlich über die Spezifität einzelner mikrobieller
Bestandteile, ihre Bindung und Effekte berichtet. Wahrscheinlich liegt jedoch ein Zusammenspiel verschiedener mikrobieller Bestandteile eines Organismus über verschiedene TLR an
einer Zelle vor, die je nach Ligand in angepasste, leicht unterschiedliche Reaktionen münden
(UNDERHILL und OZINSKY 2002). Eine Heterodimerisierung unterschiedlicher TLRs kann
zur Veränderung der Ligandenspezifität der TLRs führen, was an der Interaktion von TLR-2
mit TLR-6 gezeigt werden konnte (OZINSKY et al. 2000, TAKEUCHI et al. 2001).
Bovine Toll-like-Rezeptoren
Die publizierten Studien beziehen sich bisher auf den TLR-2, TLR-4 und TLR-9. Das Gen zu
TLR-4 liegt auf Chromosom 8, das für TLR-2 auf Chromosom 17 (WHITE et al. 2003). Auch
die Gensequenzen zu TLR-2, TLR-3, TLR-4 und TLR-9 sind bekannt. TLR-2 und TLR-4
werden auf Monozyten, Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert (WERLING und
JUNGI 2003). Im Gegensatz zu Monozyten und Makrophagen zeigen Dendritische Zellen
keine Reaktion auf TLR-2/-4 Liganden. Die Studien über TLR-9 beschränken sich
20
Literaturübersicht
hauptsächlich auf die Erforschung der Wirkung von CpG-Motiven auf Zellen des
Immunsystems (Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen). Hier dienten Zytokinproduktion,
Proliferation und die Induktion von iNOS als Kriterien der Aktivierung (BROWN et al. 1998,
SHODA et al. 2001b, PONTAROLLO et al. 2002). Es ist noch nicht bekannt, ob CpG-Motive
über TLR-9 oder einen anderen Weg Dendritische Zellen stimulieren (s. Tab. 2c), obwohl
eine gesteigerte IL-12, TNF und NO Produktion beobachtet wurden (WERLING und JUNGI
2003). Nach Bindung der Liganden wird auch beim Rind NF-κB transloziert. Die bei Mensch
und Maus beschriebenen alternativen Wege des TLR-4 sind beim Rind noch nicht untersucht
worden (s. S. 16).
TLR-vermittelte Makrophagenaktivierung
In den bisherigen Studien zu Makrophagenaktivierung durch TLR-Liganden lag das
Hauptaugenmerk auf der Zytokininduktion. Die Induktion von IL-1β, IL-12 und TNF-α
(BRIGHTBILL et al. 1999, SU et al. 2000, CAMPOS et al. 2001, JONES et al. 2001) konnte
nachgewiesen werden. CAMPOS et al. (2001) zeigte ebenfalls die Induktion der iNOS in
Makrophagen. In LPS-stimulierten Makrophagen konnte über die TLR-4 vermittelte
Aktivierung von NF-κB auch eine Steigerung der induzierbaren Cyclooxygenase-2 (COX-2)
nachgewiesen werden (RHEE und HWANG 2000). Bestimmte TLR-Liganden scheinen in
der Lage zu sein, die MHC-Klasse-II-Expression und die Antigenprozessierung
herabzuregulieren (NOSS et al. 2001). Derzeitig liegen keine weiteren Ergebnisse über
funktionelle Konsequenzen der TLR-vermittelten Makrophagenaktivierung vor.
TLR-Expression und Regulation nach Stimulation
TLRs unterliegen einer Expressionsmodulation sowohl durch Pathogene als auch durch
Zytokine. So wurde TLR-2 nach Infektion von murinen Makrophagen mit Mycobacterium
avium heraufreguliert, während die Expressionsdichte von TLR-4 sank (WANG et al. 2000).
Die Induktion einer gesteigerten TLR-2-Expression auf Makrophagen gelang auch nach
Inkubation der Zellen mit verschiedenen Zytokinen (TNF-α, IL-1α, GM-CSF, jedoch nicht
IFN-γ) (WANG et al. 2000). Über die Regulation der Expression von TLRs beim Rind gibt es
bisher keine publizierten Daten.
21
Literaturübersicht
2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster
2.3.1
CpG-Motive
Bereits seit Mitte der 1980er Jahre ist bekannt, dass bakterielle DNA tumorunterdrückende
Wirkung besitzt (TOKUNAGA et al. 1984). TOKUNAGA et al. (1988) beschrieben die
Fähigkeit synthetischer, einzelsträngiger DNA-Sequenzen zur IFN-α, β und γ Produktion
sowie der Vermehrung von NK-Zellen. Erst 1992 veröffentlichten KURAMOTO et al. erste
Vermutungen über die Bedeutung bestimmter sechs-Basen-Palindromen (poly(dG,dC)) für
diese Effekte. Dies geriet in Vergessenheit, bis man Jahre später erneut realisierte, dass
nichtmethylierte Oligodeoxynukleotide (ODNs) immunmodulierend wirken können. Durch
TOKUNAGA et al. (1988), MESSINA et al. (1993) und PARK et al. (1994) wurden
poly(dA,dU) und poly(dG,dC) Sequenzen entdeckt, die sowohl eine tumorsuppressive als
auch eine proliferative Wirkung auf B-Lymphozyten besitzen. Nicht nur in anfänglichen
Studien wurde festgestellt, dass reverse Sequenzen teilweise identische Effekte wie die
Ursprungssequenz zeigen, doch konnte dies nicht für alle Sequenzen gezeigt werden
(TANAKA et al. 1992). In der Schlussfolgerung wurden CG-Dinukleotide als die
entscheidenden Kernelemente der DNA-Sequenzen definiert (KRIEG et al. 1995).
Definition und Vorkommen
CpG-Motive sind nichtmethylierte, einzelsträngige DNA-Sequenzen, die in 5’-3’-Richtung
ein Cytosin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid besitzen. Nichtmethyliert bedeutet, dass am C5Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist (sonst Methylcytosin). Im Vertebratengenom sind die Cytosin Moleküle zumeist methyliert (BIRD 1987). Weiterhin werden CGDinukleotide in Vertebraten soweit unterdrückt, dass sie nur in einem Viertel der erwarteten
Häufigkeit vorkommen (BIRD 1987). Zu unterscheiden ist zwischen natürlich gewonnener
DNA aus Bakterien, Viren (KRIEG et al. 1995) und Parasiten (KARLIN et al. 1994), die ein
Phosphodiester (PD) Rückgrat besitzen und synthetisierten, die entweder ein „natürliches“ PD
oder ein Phosphorothioat (PT) Rückgrat besitzen. Diese Veränderung des Rückgrats hemmt
den schnellen Abbau durch ubiquitär vorkommende Nukleasen (ZHAO et al. 1993) und führt
zu einer schnelleren Aufnahme (SESTER et al. 2000). Von entscheidender Bedeutung für die
biologische Funktion sind in erster Linie die flankierenden zwei Nukleinsäuren in sowohl 3’also auch 5’- Richtung. Es bestehen Speziesunterschiede in der optimalen immunmodulatorischen Sequenz.
22
Literaturübersicht
Die „optimalen“ Sequenzen sind bislang für Mensch, Maus, Rind, Katze und Hund bestimmt
worden (YI et al. 1998a, KRIEG et al. 1999, RANKIN et al. 2001, PONTAROLLO et al.
2002).
Maus:
Mensch/Rind/Katze/Hund:
GACGTT
GTCGTT
Wurden zunächst in den Studien zur Wirkungsweise der Sequenzen Hexamere eingesetzt, so
wurde im Laufe der Zeit deutlich, dass längere Sequenzen, die mehrere CG-Dinukleotiden
enthalten, effektiver wirken. Momentan verwendete Sequenzen enthalten teilweise über
zwanzig Nukleotide. Mehrere hundert Motive sind im humanen und murinen System getestet
worden. Diese längeren Motive können in ihrer Wirkung in immun-stimulatorische und
immun-neutralisierende Sequenzen unterschieden werden. Die flankierenden Basen sind
dafür von entscheidender Bedeutung. Im Vertebratengenom flankieren meist immunneutralisierend wirkende Nukleotide (…CCG… oder …CGG…) das CG-Dinukleotid
(KRIEG et al. 1998b). Solche Sequenzen sind sechsfach häufiger als immun-stimulatorische
Sequenzen. Die biologische Funktion der putativ neutralisierenden Motive ist derzeitig noch
nicht geklärt.
Molekulare Mechanismen der Immunstimulation durch CpG Motive
Über die Bindung an und die Aufnahme der DNA-Sequenzen in die Zellen existieren
verschiedene Hypothesen. LIANG et al. (1996) stellten die Vermutung auf, dass im humanen
System durch die Bindung an einen Oberflächenrezeptor eine Aktivierung der intrazellulären
Signalkaskade ohne die zelluläre Aufnahme des CpG-Motivs induziert wird. Andere Arbeitsgruppen haben im murinen System die Notwendigkeit der Aufnahme der Sequenzen in die
Zelle nachgewiesen (YAMAMOTO et al. 1994b, KRIEG et al. 1995, HACKER et al. 1998,
MACFARLANE und MANZEL 1998). Da die Verhinderung der Azidifizierung von
Endosomen auch den Effekt in der Zelle blockiert, kann davon ausgegangen werden, dass
eine Aufnahme und endosomale Reifung zur Aktivierung von Zellen notwendig ist
(HACKER et al. 1998, MACFARLANE und MANZEL 1998, YI et al. 1998b). Nach KRIEG
(1999) gibt es intrazelluläre Proteine, die sequenzspezifisch ausschließlich an nichtmethylierte
CpG-Motive binden. In Zellen mit internalisierten CpG-Motiven werden innerhalb von 10-15
min verschiedene Folgeprozesse aktiviert. Zu ihnen gehören die Produktion Reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS) und der induzierbaren Nitritoxid Synthetase (iNOS) (SWEET et al.
1998, SHODA et al. 2001a), die Aktivierung von NF-κB (STACEY et al. 1996) und AP-1
Pfade (HACKER et al. 1998) sowie der Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Kinase
23
Literaturübersicht
(YI und KRIEG 1998). Heute ist bekannt, dass CpG-Motive an TLR-9 binden und eine dem
IL-1 Rezeptor ähnliche Signalkaskade aktiviert wird (s 2.2.3).
Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro
CpG-Motive kommen in natürlicher Form mit einem Phosphodiester (PD) Rückgrat vor. Für
eine stärkere Nukleaseresistenz werden synthetische Oligodeoxynukleotide mit einem
Phosphorothioat (PT) Rückgrat hergestellt und eingesetzt. Über die Auswirkungen des PTRückgrats bestehen unterschiedliche Meinungen. HARTMAN und KRIEG (2000)
beschreiben eine erhöhte Aktivierung (B-Zell-Proliferation) beim Menschen. Auch
PISETZSKY und REICH (1993), LIANG et al. (1996) und ZHAO et al. (1996) beschreiben
im murinen System eine Wirkungssteigerung der CpG Motive durch den Austausch des PDRückgrats gegen ein PT-Rückgrat. WERNETTE et al. (2002) erkennen im caninen System
(im Gegensatz zum felinen System) eine aktivierende Wirkung des PT-Rückgrats. BOGGS et
al. (1997) hingegen beschreiben PT-Motive als weniger wirksam bezogen auf die lytische
Kapazität von NK-Zellen. SESTER et al. (2000) weisen darauf hin, dass PD- und PTOligodeoxynukleotide je nach untersuchten Effekten auf verschiedene Zellen stärkere bzw.
schwächere Effekte haben können.
CpG-Motive induzieren vorwiegend die Bildung von Th-1-Zytokinen (s. S. 27). Lediglich die
Produktion von IL-4 durch T-Lymphozyten (PARRONCHI et al. 1999) widerspricht diesem
Grundprinzip. Am weitesten erforscht sind die Effekte von CpG-Motiven auf murine und
humane Immunzellen. Das Spektrum der Effekte ist sehr breit (s. Tab. 2), daher soll im Text
nur auf Besonderheiten eingegangen werden. Manche der in Tab. 2 aufgeführten Effekte
werden durch CpG-Motive indirekt initiiert oder induziert (kursiv dargestellt). Die durch
MACFARLANE und MANZEL (1999) beschriebenen adhärenzmindernden Effekte auf
Makrophagen sind z.B. indirekt initiiert. Sie können nicht durch die Verwendung von
Quinacrine blockiert werden. Ein weiterer Hinweis für die nicht ausschließlich primäre
Wirkung der CpG-Motive ist die Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine (IFN-α, IFN-γ, IL1, IL-4, IL-6, IL-12, TNF-α) die zur Aktivierung anderer Zellenpopulationen führen kann.
24
Literaturübersicht
Tab. 2
Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro
A) Mensch/Affe
Zellen
Oberflächenstrukturen
Funktionell
Zytokinsekretion
B-Zellen
CD86↑ac, CD40↑c ,
Proliferation↑ acd
IL-6↑c, IL-12↑c,
CD54↑ c, MHC-KLASSE-
IFN-α↑b
II↑c
IFN-γ↑d, IL-4↑d,
T-Zellen
Th-1shift d
Dendrit. Zellen
Makrophagen
CD80↑a, CD86↑a,
IFN-γ↑d,
MHC-KLASSE-II↑a
IL-12↑d
Prokoagulationsproteine→e
Adhäsion↓e,
Vitalität→e
Phagozytose→e
Monozyten
CD14↑e,
Diff. zu MPh↓e
MannoseR↓e
NK-Zellen
IL-6↑n, IL12↑n,
TNF-α↑n
CD69↑a
Lyt. Aktivität↑a
B) Maus
Zellen
Oberflächenstrukturen
Funktionell
Zytokinsekretion
B-Zellen
c-myc↑m, egr↑↓ m ,
Proliferation↑am,
IL-6↑k, IL-12↑k
c-jun↑m, c-fos↓m
anti apoptotischm
T-Zellen
Dendrit. Zellen
CD80↑a, CD86↑a
Proliferation↑l,
IFN-γ↑l,
Thymozyten PS↑
IL-10↑l
AG-Präsentation↑a
Milz: IL-6↑a, IL-12↑a,
IFN-γ↑m,
TNF-α↑a,
Makrophagen
MHC-KLASSE-II↓f,
AG-Prozessierung↓f,
TNF-α↑gi, NO↓h, iNOS↑m,
sTNF-α-RI/II↓i, mTNF-α-
AG-Präsenta-tion↓f
verspätet↑g, IL-12↑ k,
RI→/II↑i, CSF-1↓mu
anti apoptotischm
IFN-α/β↑k
IL-6↑o, IL-12↑o, TNF-α↑o
Monozyten
NK-Zellen
Lyt. Aktivität↑aj
IL-12↑j, TypI IFN↑j
25
Literaturübersicht
C) Rind
Zellen
Oberflächenstrukturen
Funktionell
Zytokinsekretion
B-Zellen
IgM↑q, IgG1↑q, IgG2↑q
Proliferation↑ pqr
IFN-γ↑q, IL-6↑t
Proliferation→ p
IFN-γ→p
T-Zellen
IL-12↑st, TNF↑s, NO↑s
Dendrit. Zellen
iNOS-Induktion r
Makrophagen
IL-6↑t,
IL-12 (p40) ↑rt,
TNF-α↑r,
IL-1β↑r
Monozyten
Aktivierung von
Lymphozytenp
IL-6↑t, IL-12↑t
NK-Zellen
a
HARTMANN et al. 2000, bYAMAMOTO et al. 1994a, cHARTMANN und KRIEG 2000,
d
PARRONCHI et al. 1999, eMACFARLANE und MANZEL 1999, fCHU et al. 1999, gCRABTREE et
al. 2001, hGAO et al. 1999, iJIN et al. 2000, jBOGGS et al. 1997, kKLINMAN et al. 1996, lMANNON
et al. 2000, mSESTER et al. 1999, nBAUER et al. 1999, oKRIEG et al. 1998a, pPONTAROLLO et al.
2002, qBROWN et al. 1998, rSHODA et al. 2000, sWERLING und JUNGI 2003, tZHANG et al 2001,
u
SESTER et al. 1999. ↑ = Steigerung, → = kein Einfluß, ↓ = Senkung.
SESTER et al. (2000) sind der Ansicht, dass murine T-Lymphozyten nicht direkt durch CpGMotive aktiviert werden, wohingegen MANNON et al. (2000) die Wirkungsweise als direkt
ansehen. Die NO-Synthese wird ebenfalls konträr beschrieben. Die durch LPS induzierte
Menge wird nach JIN et al. (2000) durch die Zugabe von CpG-Motiven gehemmt. SESTER et
al. (1999) hingegen beschreiben im Zusammenspiel mit IFN-γ eine, wenn auch verzögerte
(CRABTREE et al. 2001) Steigerung der iNOS. Murine Thymozyten werden lediglich durch
CpG-Motive mit einem PT-Rückgrat zur Proliferation angeregt (MANNON et al. 2000). In
vivo konnte nach einmaliger Gabe von CpG-DNA ein zwei- bis vierwöchiger Schutz vor
Infektionen mit Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Bacillus anthracis,
Plasmodium spezies, Leishmania major und Schistosoma mansoni erreicht werden (VAN
DER STEDE et al. 2002). Ebenfalls konnte durch CpG-Gabe eine Steigerung der lytischen
Aktivität von NK-Zellen erzielt werden (BOGGS et al. 1997).
Aus bisherigen Studien über die Interaktion boviner Immunzellen mit CpG-Sequenzen liegen
nur sehr begrenzt Daten vor. Ein Großteil der Untersuchungen wurde mit nativer DNA aus
Bakterien und Protozoen durchgeführt. Diese Ergebnisse sind kursiv in Tab. 2c dargestellt.
Für die Produktion von IL-12, TNF-α und NO durch dendritische Zellen ist noch nicht
26
Literaturübersicht
erwiesen, ob die Aktivierung über den TLR-9 oder anderweitig erfolgt (WERLING und
JUNGI 2003).
Einzelne Studien existieren für weitere Spezies. Über canine und feline Zellen berichten
WERNETTE et al. (2002) über eine Proliferationsinduktion durch verschiedene CpG-Motive
in B-Zellen aus Milz, Lymphknoten und Blut. Porcine Blutmonozyten reagieren mit
Proliferation und Sekretion von IL-6, IL-12 und TNF-α (KAMSTRUP et al. 2001).
JØRGENSEN et al. (2001) beschrieben für den Atlantischen Lachs (Salmo salar L.), dass
durch unterschiedliche CpG-Motive in Kopfnieren-Leukozyten IFN-ähnliche Zytokine
sowohl vom Typ I also auch vom Typ II induziert werden können. Die Differenzierung der
Zellen in adhärente und nicht-adhärente erlaubte den Nachweis der Aktivierung unter den
nicht-adhärenten Zellen. In einer übergreifenden Studie wurde die Proliferation induzierende
Potenz verschiedener CpG Motive in zehn Spezies überprüft (RANKIN et al. 2001). Bei allen
untersuchten Spezies (Cotton Rat, Huhn, Hund, Katze, Kaninchen, Maus, Pferd, Schaf,
Schwein und Ziege) konnte, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, eine Proliferationsinduktion nachgewiesen werden.
Wirkungsspektrum bei unterschiedlichen Spezies in vivo
CpG-Motive als Adjuvans
Durch den Einsatz von CpG-Motiven als Adjuvanzien konnten im Vergleich zu
Aluminiumverbindungen motivabhängig nach der primären Immunisierung bzw. nach der
Boosterimpfung die bis zu 66- bzw. 16-fache Steigerung der antigen-spezifischen
Immunantwort erreicht werden (HARTMANN et al. 2000). Nach der Erstimmunisierung liegt
der Antikörpertiter unter Verwendung der CpG-Motive als Adjuvans demnach bereits in
Bereichen der Boosterimpfung mit herkömmlichem Adjuvans (HARTMANN et al. 2000,
VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002). CpG-Motive initiieren im
Gegensatz zu Aluminiumhydroxid eine humorale und zelluläre Th-1-Antwort. RANKIN et al.
(2002) beschreiben bei kostimulatorischer Gabe die Änderung einer reinen Th-2-Antwort in
eine ausgeglichene Th-2:Th-1-Antwort. Ebenfalls ist bei adulten Tieren (nicht bei
Neugeborenen) die Umkehrung einer primären Th-2-Antwort durch Boosterimpfung mit
CpG-Adjuvans in eine Th-1 Antwort möglich (KOVARIK et al. 1999). Die quantitativ
schwächere Immunreaktion neonataler Säuger auf Impfungen kann zudem durch Zugabe von
CpG-Motiven zum Impfstoff verbessert werden. Schwache Th-2-Antworten konnten bei
Mäusen in eine stärkere Th-1 Antwort mit B-Zell-Proliferation, Th-1-Zytokinsekretion von
Antigen präsentierenden Zellen und vermehrter IgG2a und IgM-Produktion gewandelt
werden (KOVARIK et al. 1999, CHELVARAJAN et al. 1999). Da die Effizienz der
27
Literaturübersicht
Adjuvanzien mit CpG-Motiven in Kombination potenziert wird, können sie in ihrer
Dosierung minimiert und somit die Gewebsreizung vermindert werden. CpG-Motive als
Adjuvans führt auch bei mucosaler Gabe zu einer signifikanten Steigerung der lokalen wie
auch der systemischen Immunantwort (HORNER et al. 2000, MCCLUSKIE und DAVIS
2001, AVIVA et al. 2002). Erste Untersuchungen mit ähnlichen Effekten liegen ebenfalls für
Nutztiere (Schwein, Rind, Schaf und Geflügel) vor (IOANNOU et al. 2002, RANKIN et al.
2002, VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002).
CpG-Motive in DNA-Vakzinen
DNA-Vakzine enthalten in Plasmiden für Antigen kodierende Sequenzen, die im geimpften
Individuum translatiert werden (MCCLUSKIE et al. 2000, LEITNER et al. 2001). Zur
Steigerung der Wirkung werden pro Plasmid bis zu 200 CpG-Dinukleotide eingebaut. Um
eine zu starke Th-1-Reaktion zu verhindern, werden sowohl Immun-stimulatorische (..CCG..)
als auch Immun-neutralisierende (..CGG..) Sequenzen eingebaut.
CpG-Oligodeoxynukleotide in der Therapie von Allergien und Tumoren
Verschiedene CpG-Sequenzen wurden in Kombination mit dem Allergen i.m., s.c., i.p. oder
mucosal appliziert und die Konversion einer bestehenden Th-2-dominierten Immunantwort in
eine Antwort mit Th-1-Charakteristik erzielt. Die Zahl peripherer eosinophiler Granulozyten
sank, ebenso wie die Plasmakonzentration von IL-4. Gesteigert wurden die Konzentrationen
von IFN-γ und IL-12. Durch die Gabe von CpG-Motiven an infantile Säugetiere kann eine
Th-1 dominierte Immunlage erreicht werden, die jedoch zu einem erhöhten Risiko von
Autoimmunerkrankungen führt (WILD und SUR 2001).
WARREN und WEINER (2002) konnten durch CpG-Sequenzen allein keinen, durch
kombinierte Gaben von CpG-Motiven und monoklonalen, tumor-spezifischen Antikörpern
jedoch einen hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum in Mäusen feststellen. Sie
beschrieben sogar eine Heilung stark erkrankter Mäuse. Tumor-Vakzinen mit CpG-DNA in
Kombination mit GM-CSF steigert die T-Zellaktivierung und Typ-I-IFN-Produktion von
Antigen präsentierenden Zellen (HSIN-MING et al. 1998)
Offene Fragen
Bislang liegen kaum Studien über die in vitro Wirkung von CpG-Motiven auf Granulozyten
(neutrophile, eosinophile, basophile) vor. Weiterhin sind die genauen molekularen
Mechanismen der induzierten immun-stimulierenden Effekte noch nicht bekannt. Inwieweit
die Erreger-DNA-Motive nicht nur dem Immunsystem die Präsenz des Erregers anzeigen,
sondern vielmehr über ihre modulatorische Wirkung generell immunsuppressiv wirken
können, ist ebenfalls ein weitgehend ungeklärter Fragenkomplex.
28
Literaturübersicht
2.3.2
Lipopolysaccharid (LPS)
LPS ist ein Endotoxin Gram negativer Bakterien, das aus drei makromolekularen Anteilen
aufgebaut ist. Der extrazelluläre Anteil ist das so genannte O-Antigen gegen das häufig
Antikörper gebildet werden. Er besteht aus drei bis zwanzig Hexosemolekülen, die für die
Speziesspezifität des LPS verantwortlich sind. Das O-Antigen bedingt die Hydrophilie der
Oberfläche. Der zweite Anteil ist das Kernpolysaccharid, das wiederum aus zwei
Untereinheiten zusammengesetzt ist und bei vielen Gram negativen Bakterien identisch ist.
Von den beiden Anteilen (Innerer und Äußerer) ist der Äußere, ein spezifischer Zucker (Ketodesoxy-oktonat), für die Funktion der Zellmembran unentbehrlich. Der für die Virulenz
entscheidende Anteil des LPS ist das Lipid A. Es dient als Verankerung in der Zellwand.
Lipid A ist amphiphil, was durch die hydrophile ß-1-6-glykosidische Verknüpfung von Nacetyl-Glucosamin-Molekülen und die hydrophobe Vier-hydroxy-Fettsäurekette begründet ist
(HAHN et al. 1994).
LPS wird über CD14, LBP und MD-2 an den TLR-4 auf Zellen gebunden und stimuliert über
eine intrazelluläre Reaktionskaskade, die der des IL-1-Rezeptors gleicht, deren Aktivierung
(s. S. 16). Die Stimulation durch LPS resultiert unter anderem in B-Zellproliferation,
vermehrter Produktion von Akut-Phase Proteinen (WONG et al. 2000) sowie der Sekretion
verschiedener Zytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12) in Makrophagen und Monozyten
(CLEVELAND et al. 1996, HOSHINO et al. 1999).
2.3.3
Lipoteichonsäure (LTA)
LTA ist die acetylierte, auf der Zelloberfläche Gram positiver Bakterien exprimierte Form der
Teichonsäure (PESCHEL 2002). Die Lipoteichonsäure ist ebenso wie das LPS kein
spezifisches Molekül, sondern eine Gruppe sehr nah verwandter Moleküle. LTA besitzt eine
Glycerol- oder Ribitolphosphateinheit als Rückgrat und besteht zudem aus Zucker-PhosphatPolymeren mit einer einzelnen Lipidseitenkette (CLEVELAND et al. 1996).
LTA wirkt auf Säugerzellen über den TLR-2. Für die Bindung sind zudem CD14 und LBP
von Bedeutung (s. S. 17). Nach einer intrazellulären Reaktionskaskade mit Aktivierung des
Faktors NF-κB resultiert die Aktivierung von Makrophagen und Monozyten in der
Ausschüttung verschiedner Zytokine. Dazu gehören IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 und
IL-12 (CLEVELAND et al. 1996). Zudem ist LTA in der Lage B-Zelllinien zur Proliferation
anzuregen. Von CLEVELAND et al. (1996) wurde eine Th-1-Entwicklung (Sekretion von
IFN-γ) von Th-0-zellen durch LTA-Stimulation ausgelöst. LTA hemmt zudem kompetetiv die
29
Literaturübersicht
Bindung des IL-2 an den IL-2 Rezeptor auf T-Zellen und vermindert dadurch eine
Proliferationssteigerung (PLITNICK et al. 2001).
2.4 Bakterielle Superantigene
Neben einigen viralen Superantigenen und dem von Mycoplasma arthritidis produzierte
Superantigen MAS (Mycoplasma arthritidis Superantigen) (Übersicht bei SCHERER et al.
1993) bilden bakterielle Proteine die größte Gruppe von Erreger-kodierten Superantigenen.
Diese Proteine (Exotoxine) werden im Wesentlichen von Staphylokokken (S. aureus, S.
intermedius) und von Streptococcus pyogenes gebildet. Die Familie der von Ihnen
produzierten Superantigene ist groß und umfasst bisher 21 identifizierte Mitglieder
(Staphylokokken Enterotoxine, SE(x); Streptococcus Pyogenes Exotoxine, SP(x)) (BOHACH
et al. 1990, MONDAY und BOHACH 1999b, PROFT et al. 1999, ARCUS et al. 2000,
ORWIN et al. 2001, ALOUF und MULLER-ALOUF 2003).
Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor
Generelle Eigenschaft aller Superantigene ist ihre Fähigkeit ohne vorherige intrazelluläre
Prozessierung mit Antigen präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten zu interagieren
(FLEISCHER und SCHREZENMEIER 1988) und diese Zellen zu stimulieren.
Superantigene binden an MHC-Klasse-II-Moleküle außerhalb der Antigenbindungsgrube auf
Antigen präsentierenden Zellen und sind sodann in der Lage an polymorphe Sequenzen der
β-Kette (Vβ-Region) des αßT-Zellrezeptors zu binden (GASCOIGNE 1993). Die einzelnen
Superantigene können zwar an ein breites Spektrum verschiedener alleler MHC-Klasse-IIMoleküle binden, unterscheiden sich aber in ihrer Affinität zu einzelnen Allelen. Überdies
bestehen Unterschiede in der Erkennung verschiedener Vß-Familien (CHINTAGUMPALA et
al. 1991, LABREQUE et al. 1993). Durch die einzigartige Form der Interaktion mit der ßKette des T-Zellrezeptors und MHC-Klasse-II-Molekülen sind Superantigene in der Lage
einen deutlich höheren Prozentsatz vorhandener T-Zellen zu aktivieren als es durch die
Präsentation eines auf herkömmliche Weise prozessierten Antigens erfolgt. So werden nach
herkömmlicher Antigenpräsentation etwa 0,001 bis 0,1% der T-Zellen aktiviert, hingegen
liegt der Prozentsatz nach Superantigenstimulation (in Abhängigkeit von der Frequenz des
„passenden“ Rezeptorsegmentes) bei bis zu 25% aller T-Zellen (FLEISCHER et al. 1991,
HERMAN et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN und GASCOIGNE 1993,
SCHUBERTH 1997).
30
Literaturübersicht
Konsequenzen der Superantigenbindung in vitro
Die Konsequenzen einer Superantigenstimulation sind vielfältig. Sie können zur Aktivierung
und Proliferation sowie zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen
(HERMAN et al. 1991, HUANG und CRISPE 1993, AOUDJIT et al. 1995). Als Folge der
Aktivierung kommt es beispielsweise zur Produktion und Sekretion verschiedener Zytokine
sowie zur Superantigen abhängigen zellulären Zytotoxizität (SDCC) durch aktivierte CD4+
und CD8+ T-Zellen. Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch
Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone (zitiert nach
KRÜGER 2001). HENDRICKS (1998) beschrieb eine über T-Zellen vermittelte Proliferation
boviner B-Lymphozyten, die dosisabhängig auch zur Apoptose der B-Zellen führen kann.
Die Zytokin induzierende Potenz verschiedener Superantigene beim Menschen ist wegen der
unterschiedlichen Methoden nur schwer zu vergleichen. YOKOMIZO et al. (1995) und
SCHUBERTH (1997) beschrieben die Superantigen stimulierte Produktion von IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in bovinen MNC des Blutes. Die Produktion von
Stickstoffmonooxid und Cyclooxygenase abhängigen Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2
in mononukleären Zellen wurde von HENDRICKS (1998) demonstriert.
KRÜGER (2001) beschrieb die indirekte Wirkung der Staphylokokken-Superantigene SEA
und SEB auf die Vitalität von bovinen Granulozyten. Die Überlebensrate reiner neutrophiler
sowie eosinophiler Granulozyten wurde von den Superantigenen nach 24-stündiger Inkubation nicht beeinflusst. In zellulären, Superantigen stimulierten Kokulturen aus Granulozyten
und mindestens 10% bovinen mononukleären Zellen (MNC) sank die Vitalität der
neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Reinkulturen bis auf 10–50%, wohingegen
kein Einfluss auf eosinophile Granulozyten bestand. Der vitalitätsmindernde Effekt wurde
auch ohne Zell-Zell-Kontakt durch Überstände inkubierter MNC vermittelt. Der genaue
Mechanismus ist derzeitig nicht geklärt, doch sind weder TNF-α, das FAS-Molekül,
Stickoxyd, PGE2 noch die durch Brefeldin A zu hemmenden Zytokine für diesen Effekt
verantwortlich. Durch die simultane Inkubation mit Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitoren
wurde der Vitalitätsverlust in Kokulturen, nicht aber in den mit Überständen inkubierten
Granulozyten gehemmt.
31
Literaturübersicht
2.5 Neutrophile Granulozyten
2.5.1
Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten
Die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zählen gemeinsam mit dem
vielgestaltigen, polymorphen Kern zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen
ausgereifter neutrophiler Granulozyten. Andere Bezeichnungen lauten „Neutrophile“ oder
„polymorphkernige Granulozyten“ (PMN, polymorphonuclear cells) (JANEWAY und
TRAVERS 1997). Die aus Knochenmarkzellen durch die koordinative Einwirkung
hämatopoetischer Faktoren über Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und
Metamyelozyten entstehenden jugendlichen Formen besitzen zunächst noch einen
stabförmigen Kern. Die über Chromatinfäden verbundenen Segmente entstehen erst mit der
weiteren Reifung (LIEBICH 1993).
Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym,
Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen.
Sekundäre Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991,
KLEIN 1991).
Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark
etwa um das zehnfache. Die Überlebensdauer für Granulozyten liegt beim Menschen (ZINK
1990) und bei der Ratte (ROITT et al. 1991) bei zwei bis drei Tagen, kann aber durch lokal
produzierte, anti-apoptotische Zytokine verlängert werden (BLISS et al. 1999). Die
Transmigration in Entzündungsgebiete verzögert ebenso die spontane Apoptose von
Neutrophilen (WATSON et al. 1997).
2.5.2
Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten
Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morphologisch denen
anderer Spezies zwar ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die
zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes. Zusätzlich besitzen bovine
neutrophile Granulozyten eine dritte Art zytoplasmatischer Granula, die größer sind und
kationische antibakterielle Proteine, z.B. Baktenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und βDefensin (SELSTED et al. 1992, 1993) enthalten. Diese Proteine wirken selektiv auf
bestimmte Bakterien bakterizid. Obwohl in den bovinen azurophilen Granula viele der
Enzyme enthalten sind, die auch bei anderer Spezies gefunden werden, fehlt ihnen das
Lysozym, eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula (PASTORET et al.
32
Literaturübersicht
1998). Im Gegensatz zu Neutrophilen anderer Spezies, besitzen bovine Neutrophile
offensichtlich Fc-rezeptoren für IgM (PASTORET et al. 1998).
2.5.3
Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr
Entzündungsmediatoren (u.a. Interleukin-8, Leukotrien B4, C5a) wirken chemotaktisch auf
neutrophile Granulozyten. Sie induzieren Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen. Innerhalb
weniger Minuten bis Stunden werden das adhäsive P-Selektin und das E-Selektin, die
Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten erkennen, exprimiert. Das
auf Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der
Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer lokalen Verlangsamung der PMN im
Blutstrom (Margination) sowie einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die
Gefäßwand. IL-8 bewirkt eine Konformationsänderung der physiologischer Weise schwach
bindenden Leukozyten-Integrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1,
CD11a/ CD18) und CR3 (Komplementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt). Ihre
Affinität zu ihren Liganden, den intrazellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell
adhesion molecule, ICAM-1) der Endothelzellen, wird dadurch deutlich erhöht, was eine
Immobilisation der Zellen zur Folge hat. Als Verstärkung dient das Immunglobulin ähnliche
Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule), das sowohl auf
Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird
(JANEWAY und TRAVERS 1997). An den Kontaktstellen dreier Endothelzellen („tricellular
corners“) transmigriert der Hauptteil der Neutrophilen. Nachdem sie die Basalmembran
mithilfe proteolytischer Enzyme passiert haben, gelangen die Zellen entlang eines
Konzentrationsgradienten der Entzündungsmediatoren an deren Entstehungsort.
Granulozyten sind Phagozyten, die der Beseitigung von Erregern und von Zelldetritus dienen.
Die in Phagosomen aufgenommenen Bestandteile werden nach der Verschmelzung mit
Lysosomen in den Phagolysosomen mit Hilfe reaktiver Sauerstoff-metabolite und bakterizider
lysosomaler Enzyme/Polypeptide inaktiviert und getötet (DJEU und BLANCHARD 1987,
JACKSON et al. 1995, CASSATELLA 1996, BELAAOUAJ et al. 1998). Einen Schutz vor
der Selbstschädigung bieten protektive Enzyme, wie z.B. Superoxiddismutase und Katalase
(JANEWAY und TRAVERS 1997). Nicht unerhebliche Mengen der Metaboliten/Enzyme
gelangen in den Extrazellularraum und verursachen dort Zellschäden.
Neutrophile Granulozyten haben neben der Funktion der Phagozytose zusätzlich die Fähigkeit
nach Stimulation (durch z.B. LPS, IL-1, IL-2, TNFα oder GM-CSF) Zytokine freizusetzen
(LLOYD und OPPENHEIM 1992). CASSATELLA (1999) kommt zu dem Schluss, dass
33
Literaturübersicht
PMN über die stimulationsabhängige Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen direkten
Einfluss auf das adaptive Immunsystem nehmen.
2.6 Makrophagen
Makrophagen sind gewebsständige Zellen des Immunsystems. Im peripheren Blut kommen
makrophagoide Zellen nur zu einem sehr geringen Prozentsatz vor. Die gemeinsame Vorläuferzelle im Blut aller Makrophagentypen stellen die Monozyten dar, die nach Auswanderung
in das Gewebe unter dem Einfluss des lokalen Milieus zu residenten Makrophagen
ausdifferenzieren. Sie sollen das Fremdagens erkennen, binden und nach der Internalisierung
(Phagozytose) mit anschließender Prozessierung das adaptive Immunsystem aktivieren. Diese
Aktivierung erfolgt zum einen über die Präsentation der prozessierten Ag und über die
Sekretion von Zytokinen und anderen Mediatoren andererseits.
Gewinnung ausdifferenzierter Makrophagen
Am gebräuchlichsten zum Studium der Makrophagenfunktion und deren Beeinflussung in
vitro oder ex vivo ist die Gewinnung von Peritoneal- oder Alveolarmakrophagen. Nach einer
Injektion mit bspw. Brewer Thioglycolat, Thioglycolat-broth oder ConA (CHU et al. 1999,
JIN et al. 2000, THOMAS et al. 2000, CRABTREE et al. 2001, GAO et al. 2001) können
Peritonealmakrophagen durch eine Bauchhölenwäsche gewonnen werden. MASON et al.
(1996) beschreiben die Gewinnung von Alveolarmakrophagen bei Rindern durch eine Lavage
aus frischen, befundlosen Lungen geschlachteter Tiere.
Generierung von Makrophagen in vitro
Eine Methode zur Generierung von Makrophagen aus Knochenmarksvorläuferzellen
(BoBMDM, Bovine Bone Marrow Derived Macrophages) beschrieben ADLER et al. (1994).
Sie verwendeten Tibien von 6 Monate alten Feten, die nach der Schlachtungen trächtiger
Kühe entnommen wurden. Die aus dem Knochenmark herausgewaschenen Zellen wurden
unter nicht-adhärenten Bedingungen bis zu 18 Tage inkubiert. Nach neun Tagen bestand die
Kultur zu über 83% aus morphologisch identifizierbaren Makrophagen, die zudem Peroxidase
negativ waren. SESTER et al. (1999) generierten Makrophagen aus dem Femur von Mäusen.
Um bovine Makrophagen in großen Mengen von lebenden Tieren zu gewinnen, entwickelten
JUNGI et al. (1997) eine Methode um aus Blutmonozyten Makrophagen zu generieren, so
genannte MDM (Monocyte Derived Macrophages). Dabei wurden die Zellen nach der
Separation über sieben bis zehn Tage wie bei ADLER et al. (1994) unter nicht-adhärenten
34
Literaturübersicht
Bedingungen kultiviert, um sie anschließend über den Stimulus der Adhärenz
ausdifferenzieren zu lassen (s. S. 53, 3.3.2). Aus CD14 positiven mononukleären Zellen
gewannen WERLING et al. (1998) Makrophagen nach einer siebentägigen Inkubationszeit
unter nicht-adhärenten Bedingungen.
2.7 Apoptose und Nekrose
Apoptose wird auch „der programmierte Zelltod“ genannt. Er ist zur embryonalen
Entwicklung sowie zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Gleichgewichtes im Körper
unabdingbar. Ein zellmorphologisches Zeichen der Apoptose ist die Chromatinverdichtung im
schrumpfenden Zellkern (JANEWAY und TRAVERS 1997). Im Rahmen der Apoptose
werden im Gegensatz zur Nekrose Zellbestandteile nicht in den Extrazellularraum abgegeben,
sondern in geschlossenen Vesikeln aus der toten Zelle ausgeschleust. Durch die sonst
mögliche Freisetzung von Enzymen könnte es z.B. bei im Gewebe befindlichen Neutrophilen
zu Schädigungen des Umfeldes kommen (COHEN 1993). Ein frühes Ereignis nach Induktion
der Apoptose ist die Aufhebung der Phospholipidasymmetrie der Zellmembran. Liegen
zunächst Phosphatidylcholin und Sphingomyelin außerhalb und Phosphatidylethanolamin und
Phosphatidylserin innerlich, so wird nach Apoptose-Induktion Phosphatidylserin durch die
Wirkung sog. Flipasen an die Außenseite der Zellmembran transportiert und führt dort zur
verstärkten Bindung an Makrophagen (über ihren Phosphatidylserin-Rezeptor) und
anschließender Phagozytose der apoptotischen Vesikel („apoptotic bodies“) (MCEVOY et al.
1986).
FADOK et al. (1992) beschreibt die Externalisierung des Phosphatidylserins als eine
universelle Veränderung bei Apoptose, unabhängig von der Zellart und dem
„Apoptoseauslöser“. Weitere Erkennungsmöglichkeiten apoptotischer Zellen sind ihre
hydrophobe Oberfläche und ihre negative Ladung (FADOK et al. 1992).
Die Nekrose ist ein durch exogene physikalische oder chemische Einflüsse induzierter
Zelltod. Sie findet meist in Zellgruppen lebenden Gewebes statt. Die Zellrestprodukte werden
frei in den Extrazellularraum durch Zellmembranintegritätsverlust abgegeben und vermitteln
dort eine inflammatorische Schädigung des umliegenden Gewebes.
2.7.1
Induktion der Apoptose
Eine Reihe von Zelloberflächen-Rezeptoren („Todesrezeptoren“) sind in der Lage nach
Ligation entweder zur Zellaktivierung, Zelldifferenzierung oder zum Zelltod zu führen. Die
35
Literaturübersicht
jeweilige Reaktion ist abhängig von der Stärke der Einwirkung sowie dem Zelltyp und ist
während der Differenzierung streng reguliert (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Nach der
Bindung des Liganden kommt es zur Oligomerisation des Rezeptors und daraufhin zu der
Bindung eines Adapterproteins an die Todesdomäne. SCHULZE-OSTHOFF et al. (1998)
liefern eine Übersicht über die bislang fünf bekannten Rezeptoren: der TNF-Rezeptor-1, das
TNF-receptor related apoptosis mediating protein (TRAMP), der TNF-related apoptosisinducing ligand (TRAIL) receptor 1, der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
receptor 2 und das CD95 (alt: Fas oder APO-1).
2.7.2
Apoptose bei neutrophilen Granulozyten
Je nach Bedarf der Situation in vivo kann durch unterschiedliche Mechanismen die
Schädigung des Gewebes durch Hemmung der Neutrophilen verhindert oder die Aktivität der
Neutrophilen verstärkt werden (TSUCHIDA et al. 1995). Bei inflammatorischen Prozessen
kann es von Vorteil sein, dass die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten verlängert wird,
damit bakterielle Erreger effizienter phagozytiert und getötet werden können. Es gibt jedoch
auch Situationen, in denen die Apoptose von Neutrophilen die effektivste Möglichkeit ist,
Zellen ohne pro-inflammatorische Wirkung durch Freisetzung der aktiven Sauerstoffradikale
und Enzyme/Metaboliten zu eliminieren. Die Apoptose kann somit als regulativer
Kontrollmechanismus angesehen werden (FANNING et al. 1999).
Die Apoptose der Neutrophilen wird zum Großteil über Zytokine und Chemokine (s. Tab. 3)
gesteuert (TSUCHIDA et al. 1995). Bereits 1999 beschrieben ALIPRANTIS et al. eine
Induktion der Apoptose verschiedener myeloider Zelllinien durch Makrophagen.
MESZAROS et al. (2000) wiesen eine Induktion über membranständiges TNF-α nach. Mit
löslichem TNF-α gelang die Apoptose-Induktion nicht. LILES et al. (1996) beschreiben die
Möglichkeit des autokrinen Todes von Neutrophilen durch die konstitutive Koexpression von
CD95 (Fas) und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche. Neutrophile sind hochempfindlich
gegenüber einer Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit
einem Antikörper gegen Fas. Durch die Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α
oder Dexamethason kann die Fas-vermittelte Apoptose gehemmt (LILES et al. 1996) werden.
36
Literaturübersicht
Tab. 3
Übersicht über die Wirkung verschiedener Mediatoren, Substanzen und
Mechanismen auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten
Anti-apoptotisch a)
Pro-apoptotisch
16, 7
IL-4, IL-6, IL-8, IL-15, IFN-γ IL-10
Sonderfälle
IL-13
kein Effekt 1
NO
anti-apoptotisch 23
1, 2, 3, 7
GM-CSF, G-CSF 4, 5, 6, 7, 8
ROS 17, 18
pro-apoptotisch 19
LTB4 , PAF, LPS 6, 7, 9, 10
ß2-, ß3-IntegrinKreuzvernetzung 24
PGE2
anti-apoptotisch 9
pro-apoptotisch 22
Na-Butyrat, Dexamethason,
Antioxidantien 15, 11, 12, 13
Cycloheximide 8, 20
FMLP anti-apoptotisch 6
pro-apoptotisch 13, 10
CD11a/11b- oder CD18Kreuzvernetzung 14, 15
CD36, L-SelektinKreuzvernetzung 24, 14
anti-apoptotisch 6, 7
TNF-α pro-apoptotisch 21
kein Effekt 8
Modifiziert nach Krüger 2001 1 GIRARD et al. 1996; 2 BIFFL et al. 1996; 3 KETTRITZ et al. 1998;
4
HU & YASUI 1997; 5 MOULDING et al. 1999; 6 MURRAY et al. 1997; 7 KEEL et al. 1997;
8
SULLIVAN et al. 1996; 9 KOLLER et al. 1997; 10 HEBERT et al. 1996; 11 STRINGER et al. 1996;
12
MEAGHER et al. 1996; 13 WATSON et al. 1996; 14 WATSON et al. 1997; 15 GINIS & FALLER
1997; 16 COX 1996 ; 17 KASAHARA et al. 1997; 18 LUNDQVIST-GUASTAFSSON &
BENGTSSON 1999; 19 FORTENBERRY et al. 1998; 20 WHYTE et al. 1997; 21 GON et al. 1996;
22
WALKER et al. 1997; 23 BANNO et al. 1997; 24 MESZAROS et al. 2000.
Wegen der konträren Angaben über die Einflüsse auf die Apoptose werden die „Induktoren“
tabellarisch dargestellt (s. Tab. 3) und nur auszugsweise beschrieben. Erstaunlicherweise wird
den meisten Stoffen eine eher anti-apoptotische Wirkung zugeschrieben.
KOLLER et al. (1997) fanden heraus, dass Arachidonsäure und verschiedene
Arachidonsäure-Metaboliten (Leukotriene und Prostaglandine) an der Regulation der
Apoptose neutrophiler Granulozyten beteiligt sind. WALKER et al. (1997) konnten einen
anti-apoptotischen Effekt von PGE2 auf neutrophile Granulozyten beobachten. Für NO sind
verschiedene Effekte bei unterschiedlichen Spezies beschrieben (ADLER et al. 1995).
FORTENBERRY et al. (1998) weisen dem NO einen pro-apoptotischen Effekt auf humane
Granulozyten zu. Die Einflüsse von TNF-α werden ebenso konträr dargestellt. Abhängig
davon ob das Zytokin löslich oder membranständig vorliegt konnten MESZAROS et al.
(2000) keinen bzw. einen pro-apoptotischen Effekt feststellen. Andere Arbeitsgruppen zeigen
für lösliches TNF-α sowohl induzierende (GON et al. 1996) als auch hemmende Wirkungen
(KEEL et al. 1997, MURRAY et al. 1997).
37
Geräte, Material und Methoden
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose
Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG
Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“
Autoklav Typ GE406
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung
Centricon®3 – Filtrationssystem
CO2-Flasche zur Sterilfiltration
Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel
pressure vessel“
Eismaschine Typ UBE 30-10
Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®,
mit angeschlossener Computereinheit
Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und
Phasenkontrasteinrichtung
Fluoreszenzphotometer
Folienschweißgerät „Polystar® 100GE“
Heißluftsterilisator „Typ ST5050“
Invertmikroskop
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C)
Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor,
Hochgeschwindigkeitsaufsatz und
Mikrotiterplattenrotor
Laborfeinwaage „B6“
Labor-pH-Meter „766 Calimatic“
Laborwaage „BL310“
Magnetrührer mit Heizplatte
Pinzette, gebogen, anatomisch
Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µl)
Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl,
20-200 µl, 100-1000 µl)
Pipettierhilfe „accu-jet®“
Plastikbox mit Gittereinsatz
Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS)
Reinwerkbank Laminair HL2448
Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“
Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“
Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“
38
(Wasser und Regenerierstation,
Barsbüttel)
(Wasser und Regenerierstation,
Barsbüttel)
(Getinge AB, Getinge/Schweden)
(Heraeus, Hanau)
(Wartewig (6.001.000), Göttingen)
(Amicon, Beverly/MA, USA)
(Kohlensäurewerke Hannover,
Hannover)
(Alloy Products (XX670053))
(Ziegra, Isernhagen)
(Becton Dickinson, Heidelberg)
(Zeiss (476250-9901), Oberkochen)
(Rische und Herfurth, Hamburg)
(Heraeus, Hanau)
(Zeiss, Oberkochen)
(Einzelhandel)
(Heraeus instruments, Osterode)
(Mettler, Zürich/Schweiz)
(Knick, Berlin)
(Sartorius GmbH, Göttingen)
(Janke und Kunkel, Staufen)
(Eickemeyer (170710), Tuttlingen)
(Brand (09U2539), Wertheim)
(Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
(Brand (26404), Wertheim)
(Einzelhandel)
(Heraeus-Christ. Osterode)
(Heraeus-Christ, Hanau)
(ASID, Unterschleißheim)
(ASID, Unterschleißheim)
(Dynatec, Zug/Schweiz)
Geräte, Material und Methoden
Schere, rostfrei
Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten
„Rumo100“
Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor
Tischzentrifuge „Hermle Z230M“
Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“
WinMDI, Auswertungsprogramm für
Durchflusszytometerdaten, Version 2.8
Zählkammer nach Bürker
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“
(Fisher Scientific (9204013),
Schwerte)
(Heidolph (52100), Schwabach)
(Wifug (10209), Bradford/England)
(Hermle, Gosheim)
(GFL, Hannover)
(TROTTER 1997)
(Brand, Wertheim)
(Heraeus instruments, Osterode)
3.2 Material
3.2.1
Klinikbedarf
Einmalspritzen Luer steril 5 ml
Einmalspritzen Luer steril 10 ml
Einmalspritzen Luer steril 50 ml „Plastipak®“
Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Skin®
sensitive“
Kanülen 1,80 x 40 m/m, steril „TSK STERIJECT“
Li-Heparin-Röhrchen (10 ml)
Staukette nach Witte
Vacutainer Brand Luer Adapters
Vacutainerröhrchen, 10 ml, ohne Zusatz
Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA-K2 (18 mg)
Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU)
3.2.2
(AMEFA (302010), Limburg)
(AMEFA (302020), Limburg)
(Becton Dickinson (300865),
Drogheda/Irland)
(Meditrade® (1221R), Kiefersfelden)
(TSK-Supra, Tochigi/Japan)
(Sarstedt (26369), Nürnbrecht)
(Eickemeyer (442015), Tuttlingen)
(Becton Dickinson (367300),
Heidelberg)
(Becton Dickinson (368430),
Heidelberg)
(Becton Dickinson (367525),
Heidelberg)
(Becton Dickinson (368480),
Heidelberg)
Laborbedarf
Combitips 1,25 ml
Combitips 2,5 ml
Einmal-Filter, 0,2µm
Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld
Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung,
24 Vertiefungen
39
(Eppendorf (0030069.420), Hamburg)
(Eppendorf (0030069.447), Hamburg)
(Renner (26146040), Hanau)
(Merck (612F1767), Darmstadt)
(Sarstedt (72699), Nürnbrecht)
(Greiner (616201), Frickenhausen)
(Corning (3524), Wiesbaden)
Geräte, Material und Methoden
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung,
96 Vertiefungen
Flachboden-Zellkultur-Makroplatte mit
Abdeckplatte, 4 Vertiefungen
Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas
Petrischale (Durchmesser 94 mm)
Pipettenspitzen, gelb und blau
Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril,
96 Vertiefungen
Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner
Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml
Saugpipetten (10 ml)
Teflonfolie
Tesafilm-Klebeband
Tiegelzange 400 mm
Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen
(Falcons, steril)
Zellkulturflaschen, 200 ml
Zellkulturflaschen, 75 ml
3.2.3
(Biochrom (P92960), Berlin)
(Greiner (657160), Frickhausen)
(VWR international (215L1516),
Hannover)
(Brand (747720), Wertheim)
(Greiner (633171), Frickenhausen)
(Sarstedt (70/762002) (70/760002),
Frickenhausen)
(Gechno Plastic Products TPP®,
Trasadingen/Schweiz)
(Corning (430791), New York, USA)
(Becton Dickinson (352008),
Heidelberg)
(Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht)
(Angst und Pfister, Zürich/Schweiz)
(Einzelhandel)
(Fisher Scientific (9310240),
Schwerte)
(Corning (430829), Wiesbaden)
(Nunc (156499), Wiesbaden)
(Nunc (136196), Wiesbaden)
Reagenzien
Accutase
Acridin-Orange
Albumin, bovin, Fraktion V, 98% pulverisiert (BSA,
bovines Serumalbumin)
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Annexin V-FITC
DAF-2 DA
D(+)-Glucose (wasserfrei)
DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Rind-Ig, schwere und
leichte Ketten = DTAF – ZgαM – IgG+M (H+L)
(1:50)
Ethanol 641, absolut vergällt
Ethanol absolut
Ethidiumbromid
Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA)
Fetales Kälberserum (FCS) Virus und Mykoplasmen
getestet
40
(PAA (L11-007), Linz/Österreich)
(Sigma (A6014), Steinheim)
(PAA (K41-001-100),
Linz/Österreich)
(Sigma (A4514), Taufkirchen)
(Alexis (AL-209-250-T100),
Grünberg)
(Alexis (AL-850-020-K102),
Grünberg)
(Fluka (49140), Buchs/Schweiz)
(Dianova (115-015-068), Hamburg)
(CG Chemikalien, Laatzen)
(Baker (8228), Deventer/Holland)
(Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim)
(Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim)
(Biochrom (S0 113/431B), Berlin)
Geräte, Material und Methoden
Flow-AMP® Amplification-Kit
Fluoreszein Isothiocyanate (FITC)
Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran®
Iscové®-Trockenmedium
Kaliumchlorid (KCl), kristallin
Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3)
Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat
L-Glutamin
Lipopolysacharid von Escherichia coli Serotyp
O55:B5
Lipoteichonsäure von Staphylokokkus aureus
Lymphozytenseparationsmedium
(Tebu-bio (EAS-B-100), Frankfurt
a.M.)
(Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim)
(Roth (49794.1), Karlsruhe)
(Biochrom (T04610), Berlin)
(Biochrom (T046-10), Berlin)
(Merck (3852), Darmstadt)
(Roth (8174.1), Karlsruhe)
(Biochrom (K0283), Berlin)
(Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim)
(Sigma-Aldrich (L-2515), Steinheim)
(PAA Laboratories (J15-004),
Linz/Österreich)
2-Mercaptoethanol
(J. T. Baker (8683), Groß Gerau)
Natriumazid (NaN3), 10%ig
(Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim)
Natriumchlorid (NaCl)
(Roth (9265.2), Karlsruhe)
Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei
(Sigma-Adrich (S-5881), Steinheim)
G
N - Nitro-D-Arginin
(Calbiochem (483124), Bad Soden)
NG-Nitro-L-Arginin
(Calbiochem (483125), Bad Soden)
N-(1-Naphthyl-)Ethylendiamin-Dihydrochlorid
(Sigma-Aldrich (N9125), Steinheim)
Paraformaldehyd
(Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim)
Penicillin(-G)-Streptomycin
(Biochrom (A2213), Berlin)
TM
Percoll (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml)
(Pharmacia (17089101), Freiburg)
Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)
(Sigma-Aldrich (P-8139), Steinheim)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, (Biochrom (L18210), Berlin)
ohne Ca++/Mg++
Phycoerythrin (PE)
(Dianova (115015068), Hamburg)
Propidiumiodid (PI)
(Calbiochem (537059), Bad Soden)
Salzsäure (HCl), konzentriert (37%)
(Baker (6081), Deventer/Holland)
Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert
(Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim)
Staphylokokken-Lösung, Pansorbin®
(Calbiochem (507858), Bad Soden)
Saponin
(Sigma-Aldrich (S-2149), Steinheim)
Streptavidin-FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)
(Dianova (016-090-084), Hamburg)
Streptavidin-PE (Phycoerythrin)
(DAKO (R0438), Denmark)
Streptomycin (-Sulfat)
(Biochrom (A331-27), Berlin)
To-Pro-3 iodide
(Molecular Probes (T36-05),
Leiden/Holland)
Tri-Natriumcitrat (2xH2O)
(Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim)
Oligodeoxynucleotide
(MWG Biotech, München)
41
Geräte, Material und Methoden
Tab. 4
Übersicht über Name, Sequenz, Effizienz der bisherigen Verwendung der
eingesetzten CpG-Motive
Name
Sequenz
Nutzung
Referenzen
S/SS/NS
CpG-WB
5‘-ggtcaacgttga-3‘
Rind (S)
BROWN et al. (1998)
CpG-WB biot
5‘BIO-ggtcaacgttga-3‘
Rind (S)
GpC-WB
5‘-ggtcaagcttga-3‘
Rind (NS)
GpC-WB biot
5‘Bio-ggtcaagcttga-3‘
Rind (NS)
CpG 1668
5‘-tccatgacgttcctgatgct-3‘
Fische (S)/
Maus (S)
JØRGENSEN et al. (2001),
YI und KRIEG (1998)
CpG 1760
5‘-ataatcgacgttcaagcaag-3‘
Mensch (S)/
Maus (SS)
HARTMANN et al. (2000),
JIN et al. (2000)
CHU et al. (1999)
CpG 1781
5‘-accatggacgttctgtttcccctc-3‘
Mensch (S)/
HARTMANN et al. (2000)
BROWN et al. (1998)
Maus (SS)
CpG 1826
5‘-tccatgacgttcctgacgtt-3‘
Mensch (S)/
HARTMANN et al. (2000),
Maus (SS)
JIN et al. (2000),
WARREN et al. (2000)
CpG 1829
5‘-atgacgttcctgacgtt-3‘
Mensch (S)/
Maus (SS)
HARTMANN et al. (2000)
CpG 2006
5‘-tcgtcgttttgtcgttttgtcgt(t)-3'
Mensch (SS)/
Maus (S)
HARTMANN et al. (2000)
CpG 2007
5‘-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3‘
Mensch (SS)/
Maus (S)
HARTMANN et al. (2000)
S = stimulierend, SS = stark stimulierend, NS = nicht stimulierend. Die Sequenzen wurden mit kleinen
Buchstaben geschrieben, da es sich um Sequenzen mit einem Phosphorothioat-Rückgrat handelt.
Diese Sequenzen wurden aufgrund ihrer bisher beschriebenen Wirkung auf das bovine, murine
und/oder das humane Immunsystem ausgewählt. Dabei wurden sowohl besonders effektiv
stimulierende Sequenzen als auch Sequenzen, die bei einer Spezies keinen großen Effekt zeigten,
gewählt.
42
Geräte, Material und Methoden
3.2.4
Antikörper und Nachweisreagenzien
Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz
Monoklonale Antikörper
Die Hybridome, welche die murinen monoklonalen Antikörper (mAk) Bo116 (IgM), Bo139
(IgG3κ) und Bo1 (IgG1κ) produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen
lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata) hergestellt
(REBESKI 1990, VON DER OSTEN 1990, RÖNSCH 1992). Der mAk Bo139 ist spezifisch
für BoLA-DR-Produkte (LANGE 1995). Der mAk Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse-IMoleküle (SCHUBERTH et al. 1992). Eine Zusammenstellung der in der
Membranimmunfluoreszenz eingesetzten primären, monoklonalen Antikörper, sowie deren
Isotypen und Spezifitäten befindet sich in Tab. 5.
Tab. 5
Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer
Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz
Name
Spezifität
Donor/
Isotyp
Finale
Verdünnung
Referenz
Bo 1
anti MHC-I
Maus/IgG1
1:1
SCHUBERTH (1991)
Bo 139
anti MHCKLASSE-II
Maus/IgG3
1:1
VON DER OSTEN (1990)
IL-A11 a
anti CD4
Maus/IgG2a
1:20.000
HOWARD et al. (1991)
HOWARD und NAESSENS
(1993)
CC-63 a
anti CD8
Maus/IgG2a
1:10.000
HOWARD et al. (1991)
a) Antikörper lagen als Ascites vor. Alle anderen monoklonalen Antikörper lagen als
Zellkulturüberstände vor. Verdünnungen der verwendeten primären Antikörper wurden mit MIFPuffer (s. S. 46) durchgeführt.
Nachweisantikörper
Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz dienten affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörperpräparationen: Ziege-anti-Maus IgG
und IgM (schwere und leichte Ketten) konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat oder
Phycoerythrin (PE) (Dianova (115015068 bzw. 115116146), Hamburg), sowie Ziege-anti-
43
Geräte, Material und Methoden
Hund-Ig (Kirkegarrd & Perry (16-19-06), USA, Gaithirsburg), schwere und leichte Ketten
konjugiert mit Biotin. Beide Sekundärantikörper waren gegen Human-, Rinder- und
Pferdeserumproteine absorbiert. Die eingesetzte Verdünnung betrug für den FITC
konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper in der Regel 1:100 (in MIF-Puffer, s. S. 46), zur
Herstellung von Referenzzellen (s. S. 60) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. Für die
Doppelfluoreszenzen wurde der PE-konjugierte Ziege-anti-Maus Antikörper ebenfalls 1:100
eingesetzt. Der Ziege-anti-Hund-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:1000 für die
Amplifikation der CpG-Bindungsversuche eingesetzt.
3.2.5
Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua
tridest. angesetzt.
Zellkulturmedien und Zusätze
Die Grundmedien wurden als Trockensubstanz bezogen, in Aqua tridest. gelöst und
sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite). Um Komplementaktivität zu zerstören und eventuell
vorhandene Mykoplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS) bei
56°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend erfolgte die weitere Lagerung sowohl des FCS
als auch der Kulturmedien in aliquoten Teilen bei -20°C. Aufgetaute Medien wurden nicht
länger als zehn Tage im Kühlschrank aufbewahrt.
I10F Medium (s. S. 40, 3.2.3)
- Für die Proliferation
Fetales Kälberserum
10 % (v/v)
L-Glutamin
4 mmol
Penicillin
100.000 IU
Streptomycin
10 mg
Aqua tridest. ad
1000 ml
- Für die Makrophagengewinnung und die Versuche zum induzierten Absterben der PMN
(s. S. 53 und S. 65)
Fetales Kälberserum
10 % (v/v)
L-Glutamin
4 mmol
Streptomycin
10 mg
Aqua tridest. ad
1000 ml
44
Geräte, Material und Methoden
Stammlösungen der Superantigene und Mitogene sowie LPS und LTA
Stocklösungen des Superantigens SEA (s. 3.2.3), dem Mitogen Pokeweed Mitogen (PWM;
s. 3.2.3) dem Membranbestandteil Gram negativer Bakterien LPS und Gram positiver
Bakterien LTA wurden in I10F+Strep auf die siebenfache Finalverdünnung eingestellt: SEA
(7 ng/ml); PWM (7 µg/ml); LPS und LTA (70 µg/ml). Diese Stocklösungen wurden in
aliquoten Mengen von 100 – 500 µl bei -20°C gelagert.
Stammlösung der DNA-Motive
DNA-Motive wurden zur Stimulation von MNC und Gemischen aus PMN/MNC sowie
Makrophagen/PMN eingesetzt. Darüber hinaus kamen ein biotinyliertes CpG- und GpCMotiv bei der Membranimmunfluoreszenz und der intrazellulären Fluoreszenz zum Einsatz.
Die Herstellung definierter CpG-Motive wurde in Auftrag gegeben (s. S. 40, 3.2.3). Die
Festsubstanzen wurden in Aqua tridest. gelöst, sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite) und mit
Kulturmedium oder MIF-Puffer (biotinylierte Sequenzen) auf das siebenfache der
Endkonzentration verdünnt. Die finale Konzentration der in den funktionellen Tests
eingesetzten CpG-Motive betrug 5 µg/ml, die biotinylierten Sequenzen wurden in der
Membranimmunfluoreszenzen (MIF) in der doppelten Konzentration (10 µg/ml) eingesetzt.
Die Stammlösungen wurden in aliquoten Teilen bei -20°C vorrätig gehalten.
Material für die Separation von Zellen
Lymphozytenseparationsmedium
Lymphozytenseparationsmedium (s. S. 40, 3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus
Natriumdiatrizoat und eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz des
Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von
1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt
verwendet.
Percoll
Bei Percoll (s. S. 40, 3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C.
Durch Zugabe von 0,81 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%-iges
Percoll). Für die Separation reiner PMN wurde in dieser Arbeit die 100%-ige Stammlösung
mit physiologischer NaCl-Lösung (0,9%-ig) zu einer 70%-igen Lösung verdünnt.
45
Geräte, Material und Methoden
Natriumchloridlösung, 0,9%
NaCl
Aqua tridest. ad
8,77 g
1000
ml
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne EDTA
Die PBS-Trockensubstanz (s. S. 40, 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile
lagen in den folgenden Konzentrationen vor.
NaCl
8,0 g
KCl
1,24 g
Na2HPO4
0,2 g
0,2 g
KH2PO4
Aqua tridest. ad
1000
ml
Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)
Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt und mit Aqua
tridest. auf 1000 ml ergänzt.
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)
bovines Serumalbumin
5,0 g
Natriumazid
0,1 g
PBS ad
1000
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Reagenzien für die Fluoreszenzsteigerung mit dem Flow-AMP-System
Bei diesem Kit (s. S. 40, 3.2.3) handelt es sich um ein speziell auf biotinylierte Primärantikörper abgestimmtes System, dass die Fluoreszenz schwach bindender Antikörper oder
geringgradig exprimierter Oberflächenstrukturen steigert. Die in dem Kit enthaltenen
Stammlösungen werden wie folgt verdünnt.
Staining Buffer
Fetal Calf Serum (FCS)
2
Natriumazid
0,1
PBS ad
100
ml
ml
ml
46
Geräte, Material und Methoden
Staining Buffer ohne Natriumazid
Fetal Calf Serum (FCS)
2
PBS ad
100
ml
ml
Sekundäres Reagenz
Streptavidin konjugierte Meerrettich (Horse-Radish) Peroxidase,
1:50 in Staining Buffer verdünnt
Amplifizierungs Reagenz
1:20 in Amplifizierungsmedium verdünnt
Detektorreagenz
FITC-konjugiertes Streptavidin
1:100 in natriumazidfreiem Staining Buffer verdünnt
Reagenzien für den Nachweis der Apoptose von Zellen durch den Annexin V-FITC-Kit
Binding Buffer
Binding Buffer Stocklösung; 1:4 in Aqua tridest.
Annexin V-FITC
Annexin Stocklösung; 1:2 in Binding Buffer
Propidiumiodidlösung
Propidiumiodidstammlösung; 1:10 in Binding Buffer verdünnt
Reagenzien für die Messung der Nitrit-Produktion
Diaminofluoreszein-2 Diazetat (DAF-2 DA)
Der Feststoff wurde in Aqua tridest. aufgenommen und auf eine Konzentration von 50 µM/ml
verdünnt. Diese Lösung wurde in aliquoten Teilen zu 25 - 50 µl bei -20°C gelagert.
47
Geräte, Material und Methoden
Griess-Reagenz
Sulfanilamid
10
g
N-(1-Naphthyl-)Ethylendiamin-Dihydrochlorid
1
g
H3PO4
25
g
Aqua tridest. ad
1000
ml
Das Reagenz wurde in Dunkelheit bei 4°C und nicht länger als eine Woche gelagert.
L-Arginin
- Stammlösung
L-Arginin
2,107g
PBS ad
10
ml
Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert.
- Gebrauchslösung 2 mM
L-Arginin-Stammlsg.
I10F+Strep ad
100
50
µl
ml
Lösungen zum Fixieren und Auszählen von bovinen Zellen
Formaldehydlösung zum Fixieren der Gesamtleukozytenfraktion für die intrazelluläre
Färbung
Formaldehydlösung (37%) 12,9 ml
PBS ad
50,0 ml
Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen
Paraformaldehyd
40
mg
PBS ad
1000
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Akridinorange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung
Akridinorange
250
mg
Ethidiumbromid
250
mg
PBS ad
100
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
48
Geräte, Material und Methoden
Wasch- und Verdünnungspuffer für die intrazelluläre Immunfluoreszenz (Saponin-Puffer)
Saponin
2,5 g
MIF-Puffer ad
100
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Puffer für die Makrophagengewinnung aus bovinen Monozyten nach Methode 1
ACD-Puffer
Zitronensäure (A. dest.)
14,71 g
Tri-Natriumzitrat (A. bidest.)
29,41 g
Glucose (wasserfrei)
19,82 g
Aqua tridest ad
500 ml
Herstellung bei 10°C, pH-Wert 7,3-7,35. Lagerung bei 4°C nach Sterilfiltration.
Citratpuffer
Zitronensäure (A. dest.) 31,29 g
Glucose (180,16)
4,32 g
KCl
1,15 g
NaCl
29,97 g
Aqua bidest. ad
5000
ml
pH-Werteinstellung mit NaOH auf pH 7,3-7,35; Lagerung bei 4°C nach Sterilfiltration.
Lyse-Puffer
Herstellung der Stammlösungen
- Ammoniumchloridlösung (155 mM)
55,01 g
NH4Cl
Aqua tridest. ad
1000
ml
- Kaliumhydrogencarbonatlösung (10 mM)
KHCO3
20,02 g
Aqua tridest. ad
200
ml
- Ethylendiamintetraacetat (0,1 mM)
EDTA (0,5 M)
29,22 g
Aqua tridest. ad
200
ml
pH-Werteinstellung auf pH 8,0
49
Geräte, Material und Methoden
Lyse-Puffer
NH4Cl (155 mM)
100
ml
KHCO3 (10 mM)
10
ml
EDTA (0,1 M)
1
ml
A. bidest. ad
1000
ml
pH-Werteinstellung auf 7,3–7,35 mit HCl (20%ig); Lagerung bei 4°C nach Autoklavierung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit EDTA
EDTA (0,1M, pH 8)
1,5 ml
PBS ad
500
ml
pH-Werteinstellung auf 7,3–7,35 mit HCl (20%ig); Lagerung bei 4°C nach Autoklavierung.
Lösungen für die Herstellung von Phagozytosepartikeln
FITC-Puffer
Na2CO3
10,6 g
NaCl
5,9 g
Aqua tridest. ad
1000
ml
pH-Werteinstellung auf pH-Wert 9,2 mit HCl (37%-ig)
3 mg FITC wurden in 7 ml FITC-Puffer vollständig gelöst.
Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
FITC-markierte Staphylokokken
Für die hier durchgeführte durchflusszytometrische Messung der Phagozytosekapazität
boviner, in vitro generierter Makrophagen, ist es notwendig den Zellen fluoreszierende
Partikel zur Phagozytose anzubieten. Drei Milliliter der standardisierten Pansorbin®
Staphylokokken-Suspension (s. S. 40, 3.2.3) wurden mit 7 ml des FITC-Puffers unter Lichtabschluss für 20 h bei Raumtemperatur während ständiger Bewegung im Röhrchenschwenker
inkubiert. Um freies FITC zu entfernen schlossen sich drei Waschschritte der Bakteriensuspension mit PBS an (15.000 xg, 1 min). Unter Zuhilfenahme der Zählkammer nach Bürker
(s. S. 38, 3.1) wurde die Suspension in PBS auf eine Konzentration von 2 x 108 Bakterien/ml.
Die Lagerung erfolgt in aliquoten Teilen à 1 ml bei -20°C.
PI-markierte Staphylokokken
Für die intrazelluläre Nitritbestimmung. Zwei Milliliter einer auf 2 x 108 Partikel/ml
eingestellten Pansorbin® Staphylokokken-Suspension (s. S. 40, 3.2.3) wurde mit einer
6 µg/ml PI enthaltenden PBS-Lösung für 3 h bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss
inkubiert. Die Verwendung erfolgte in PBS direkt nach einem Waschgang (15000 xg, 1 min).
50
Geräte, Material und Methoden
Gepooltes Rinderserum zur Opsonisierung der Staphylokokken
Von drei klinisch gesunden Rindern der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover wurde unter sterilen Kautelen unter Verwendung des VacutainerSystems (s. S. 39, 3.2.1) nicht gerinnungsgehemmtes Blut gewonnen (s. S. 52, 3.3.1). Zur
Trennung der korpuskulären Anteile vom Serum wurde das Blut bei Raumtemperatur bis zur
vollständigen Gerinnung gelagert. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation (2000 xg,
15 min, Raumtemperatur (RT)). Noch verbliebene Partikel konnten aus dem mit einer Pipette
entnommenen Überstand durch eine weitere Zentrifugation bei 3500 xg für 10 min entfernt
werden. Die Seren der drei Tiere wurden anschließend zu gleichen Anteilen gemischt
(gepoolt). Das Poolserum wurde 1:10 in PBS verdünnt und in aliquoten Teilen zu je 1 ml bei
-80°C gelagert.
Lösungen für die Durchflusszytometrie
Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystems nach den Messungen mit
sterilfiltriertem Aqua tridest. (Porenweite 0,2 µm, s. S 39, 3.2.2) und 1%-iger Natriumhypochlorit-Lösung gespült.
Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm)
PBS (s. S. 46) mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet.
Propidiumiodidstammlösung
Propidiumiodid: 100 µg/ml gelöst in Trägerflüssigkeit
Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen
wurden der Trägerflüssigkeit 20 µl Propidiumiodidstammlösung/l zugesetzt (Endkonzentration 2 µg/ml).
3.2.6
Tiere
Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um
ausschließlich weibliche Tiere der Rassen „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian.
Das Alter lag zwischen 0,5 und 12 Jahren. Alle verwendeten Tiere waren klinisch gesund und
stammten entweder aus der Klinik für Rinder oder der Arbeitsgruppe Immunologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover.
51
Geräte, Material und Methoden
3.3 Methoden
3.3.1
Gewinnung einzelner Zellpopulationen aus bovinem Blut
Gewinnung gerinnungsgehemmten Blutes
Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung der
Vene mit einer Staukette nach Witte gewonnen. Zur Blutentnahme wurde das Vacutainersystem mit heparinisierten Vacutainern für die Gewinnung von MNC und EDTA
beschichteten Vacutainern für die Gewinnung von PMN verwendet (s. S. 39, 3.2.1). Für die
Kultivierung boviner MDM nach JUNGI (Methode 1) wurde die Blutgewinnung wie unter
3.3.2 auf Seite 53 beschrieben durchgeführt.
Gewinnung boviner mononukleärer Zellen
Das frisch gewonnene heparinisierte Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in
50 ml Röhrchen auf Lymphozytenseparationsmedium® (s. S. 40, 3.2.3) überschichtet. Die
anschließende Zentrifugation (30 min, bei 4°C) wurde bei 1100 xg ohne Bremse
durchgeführt. Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennten sich die einzelnen
Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht wurde durch das
Plasma gebildet. Zwischen dem Plasma und dem Lymphozytenseparationsmedium befand
sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen,
Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die polymorphkernigen Zellen. Die
Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesogen und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 ml) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 30 ml
schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 min, 4°C; 500 xg, 250 xg und 80 xg), um die
Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Zwischen den einzelnen Zentrifugationen wurden
die Zellen durch Aufschütteln aus dem Pellet gelöst und in ca. 40 ml PBS resuspendiert. Mit
dieser Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x 106 MNC/ml Vollblut gewonnen werden.
Gewinnung neutrophiler Granulozyten
Die Blutgewinnung wurde unter Zuhilfenahme von EDTA beschichteten Vacutainern
(s. S. 39, 3.2.1) durchgeführt. Zehn bis fünfzehn Milliliter des Vollblutes wurden in 50 ml
Zentrifugenröhrchen überführt. Durch zwei hypotone Lysen konnten die Erythrozyten
52
Geräte, Material und Methoden
entfernt werden: Im Vollblut erfolte nach Zugabe von ca. 15 ml Aqua tridest. eine Inkubation
für 20 sek (erste Lyse) bzw. 10 sek (zweite Lyse) unter ständigem Schwenken. Um die Lyse
zu stoppen schloss sich die Zugabe der gleichen Menge an zweifach konzentriertem PBS an.
Nach beiden Lysen erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C für 8 min bei 220 xg mit Bremse. Die
Überstände wurden dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen gelöst und in 10 ml
PBS resuspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension über 4 ml 70 %-iges isotones
Percoll (s. S. 40, 3.2.3) in 15 ml Zentrifugenröhrchen geschichtet. Die Zentrifugation erfolgte
bei Raumtemperatur für 20 min bei 750 xg. Nach der Zentrifugation befanden sich die
neutrophilen Granulozyten als Pellet am Boden des Gefäßes, restliche MNC und eosinophile
Granulozyten befanden sich in der Interphase. Der Überstand, die Interphase und das
Separationsmedium wurden mit einer Pipette abgesogen. Es schlossen sich zwei
Waschschritte (je 10 ml PBS, 4°C, 8 min, 220 xg) an. Das letzte Zellpellet wurde in
Kulturmedium (I10F+strep-Medium) aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte
Dichte eingestellt.
Durch dieses Verfahren konnten relativ reine Populationen neutrophiler Granulozyten
separiert werde. Der Anteil an eosinophilen Granulozyten lag bei <5%. Lag der Anteil
kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10% wurde die Zellsuspension nicht
verwendet.
3.3.2
Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung
monozytoider Zellen des peripheren Blutes (BMDM, blood
monocyte derived macrophages)
Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten nach Methode 1
Dieses durch SCHÜMANN (2001) veränderte Verfahren (Methode 1 nach JUNGI et al.
1996) diente der Gewinnung einer in Morphologie, Funktion und biochemischem Verhalten
möglichst homologen, ausgereiften Makrophagenpopulation. Das Blut wurde unter sterilen
Kautelen gewonnen. Dazu wurden die Tiere in gereinigte Räume gebracht. Aus der gestauten
Vena jugularis wurden 90 ml Blut in einer sterilen 200 ml Schottflasche mit Zugabe von
10 ml ACD-Puffer (s. S. 49) zur Gerinnungshemmung unter ständigem Schwenken aufgefangen. Das Blut wurde bei Raumtemperatur einer Stunde stehengelassen.
Während der weiteren Verarbeitung wurden das Blut, bzw. die Zellsuspensionen sukzessiv
auf 4 bis 6°C heruntergekühlt.
53
Geräte, Material und Methoden
In zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden 80 ml des Bluts bei 10°C und 1450 xg für 25 min
ohne Bremse abzentrifugiert um den Buffy Coat, die leukozytenreiche Fraktion, zu gewinnen.
Für diesen Vorgang wurde eine Einmal-Pasteurpipette verwendet. Der Buffy coat wurde zu
100 ml des Citratpuffers (s. S. 49) in eine sterile 200 ml Schottflasche gegeben, mit Citratpuffer auf 160 ml aufgefüllt und die Suspension auf vier 50 ml Röhrchen verteilt. Die
anschließende Zentrifugation erfolgte bei 340 xg für 12 min bei 10°C mit schwacher Bremse.
Die Überstände wurden abgesogen.
Um eine maximale Ausbeute an mononukleären Zellen zu erreichen, wurde zu den
erythrozytenhaltigen Zellpellets das noch nicht verwendete Blut gegeben. Ein weiterer
Zentrifugationsschritt zur Gewinnung eines Buffy Coats wurde angeschlossen. Der so
gewonnene Buffy Coat wurde auf die bereits einmal mit Citratpuffer gewaschenen Zellpellets
aufgeteilt. Nach dem Lösen und der Resuspension der Pellets schloss sich ein weiterer
Zentrifugationsschritt bei 340 xg und 10°C für 12 min an. Dieser Waschvorgang wurde etwa
drei bis vier Mal wiederholt, bis der Überstand nach der Zentrifugation klar erschien.
Nach dem Absaugen des Überstandes bis auf 20 ml und der Aufteilung dieser Überstände auf
zwei 50 ml Röhrchen, wurden 30 ml des kalten Lyse-Puffers (s. S. 49) in jedes Zentrifugenröhrchen gegeben, gut geschwenkt und 5 bis 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die
Farbe sollte sich zu einem klarem Rot-Schwarz ändern. Eine erneute Zentrifugation für
10 min bei 10°C und 340 xg schloss sich an. Wenn das Pellet nach dem Absaugen des
Überstandes leicht rötlich bis beige erschien, war die Lyse erfolgreich. Ein rotes bis
schwarzes Pellet wurde noch einmal dem Lyse-Schritt unterzogen (doch wirkte sich eine
zweite Lyse schädigend auf die Monozyten aus, Daten nicht gezeigt). Durch zügiges
Aufrütteln des Zellpellets und der Resuspension in PBS-EDTA (20 ml), sollte die Adhärenz
der Zellen an den Gefäßwänden vermindern werden.
Anschließend erfolgte eine Separation der Zellen durch Überschichtung des Lymphozytenseparationsmediums® mit der Zellsuspension im Verhältnis von 1:3. Die Dichtezentrifugation
wurde bei 810 xg, 4° C und ohne Bremse für 25 min durchgeführt.
Von nun an wurde, um Zelladhärenz zu vermeiden, auf Eis gearbeitet. Die gewonnenen
MNC-reichen Interphasen wurden auf zwei Röhrchen mit je 20 ml kalter PBS-Vorlage (ohne
EDTA) aufgeteilt und die Röhrchen mit PBS auf je 50 ml aufgefüllt. Zentrifugiert wurde nun
bei 310 xg (4°C, 10 min). Nach Abnahme des Überstandes wurden die Zellen durch
mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in Iscové-Medium (s. S. 44, 3.2.5) aufgenommen und
nach Zellzählung auf 6 x 106 Zellen/ml eingestellt.
54
Geräte, Material und Methoden
Diese Suspension wurde in Teflonbeutel überführt und die enthaltene Luft vor dem
Verschweißen entfernt. Die Teflonbeutel mit einem Fassungsvolumen von ca. 20 ml sollten
immer zwei hintereinander liegende Schweißnähte haben. Doppeltes bis dreifaches
Verschweißen mit Kontrolle auf Dichte der Schweißnähte erwies sich als sinnvoll. Um einer
Kontamination vorzubeugen, wurden die Nähte mit Alkohol eingesprüht, bevor sie in
Petrischalen über sieben bis zehn Tage in einem Brutschrank bei 37°C und 8% CO2 (in Luft)
inkubiert wurden.
Die Gewinnung der Makrophagenvorläuferzellen erfolgte nach der Kontrolle auf Hefen- oder
Pilzkontamination unter einem Invertmikroskop. Kontaminierte Beutel wurden verworfen.
Nach Abkühlung der Beutel und nachdem die Zellen von der Unterseite durch Fingerklopfen
gelöst worden waren, wurde der Inhalt jeweils zweier Beutel in ein 50 ml Röhrchen überführt.
Die weitere Behandlung der Zellen erfolgte auf Eis. Die Zellen wurden mindestens zweimal
mit PBS gewaschen (s.o.). Zum Zählen und Einstellen der Suspension auf 2,5 x 106
Makrophagenvorläufer/ml wurde das Zellpellet in 10 ml kaltem Iscové-Medium ohne Zusatz
von Antibiotikum aufgenommen. Bei der mikroskopischen Betrachtung konnten ca. 20-30 %
der Zellen als Makrophagenvorläufer angesprochen werden. Von dieser Zellsuspension wurde
pro Kavität einer 6-well Makrotiterplatte ca. 1 ml eingesät. Um eine gleichmäßige Verteilung
der Zellen zu erreichen, wurden die Platten direkt nach Zugabe von 5 ml Medium/Vertiefung
geschwenkt. Zur Ermöglichung der Zelladhärenz wurden die Kulturplatten drei bis vier
Stunden im Brutschrank gelagert.
Zu Beginn der Ernte der Makrophagen wurden die einzelnen Vertiefungen sieben Mal mit
warmem PBS gewaschen (Zugabe, Schwenken und vorsichtiges Abpipettieren aus der schräg
gehaltenen Platte). Dieser Arbeitsschritt diente der Entfernung von Lymphozyten und dem
FCS aus dem Medium, da FCS den im Folgenden verwendeten Enzymcocktail Accutase®
(s. S. 40, 3.2.3) inaktiviert. Je Kavität wurden 500 µl körperwarmer Accutase® zugegeben, die
Platte 10 sek geschwenkt und wieder abpipettiert. Nach Zugabe von 1000 µl Accutase®
erfolgte eine 10-minütige Inkubation im Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft). Durch
Klopfen an den Behältnisböden wurde die Ablösung unterstützt. Nach Kontrolle der
Ablösung wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium gestoppt. Die Zellen
wurden in 15 ml Röhrchen überführt und mit Medium aufgefüllt. Die Makrophagen wurden
anschließend bei 4°C und 250 xg für 10 min zentrifugiert, in I10F+Strep aufgenommen, gezählt
und im Medium auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt.
55
Geräte, Material und Methoden
Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten in Zellkulturflaschen (Methode 2)
Dieses Verfahren wurde als zeitsparende Alternative zu der oben beschriebenen Methode 1
entwickelt. Geprüft werden sollte, ob sich die hiermit generierten Makrophagen
morphologisch, phänotypisch und funktionell identisch zu den nach dem obigen Verfahren
gewonnenen MDM verhalten.
Für die Makrophagengeneration in Zellkulturflaschen wurden wie unter 3.3.1 beschrieben pro
Tier 150 ml heparinisiertes Blut gewonnen. Die Bearbeitung der Zellen geschah unter sterilen
Bedingungen unter einer Reinluftarbeitsbank mit autoklavierten Mehrweg- oder sterilen
Einwegmaterialien. Das Blut wurde mit PBS verdünnt (1:2) und in 50 ml Röhrchen im
Verhältnis 1:3 über Lymphozytenseparationsmedium® (s. S. 40, 3.2.3) geschichtet. Nach der
Zentrifugation (1100 xg, 30 min, 4°C ohne Bremse) schloss sich die Entnahme der Interphase
mit Überführung in 50 ml Röhrchen (mit 10 ml vorgelegtem PBS) an. Nach dreimaligem
Waschen (s. S. 52) wurden die letzten Zellpellets in einem Röhrchen zusammengefasst und in
Iscové-Medium mit 10% FCS und Streptomycin (I10F+Strep) aufgenommen, auf 5 x 106
Zellen/ml eingestellt und in Zellkulturflaschen überführt. In 200 ml Zellkulturflaschen
wurden ca. 25–30 ml und in 70 ml Flaschen 7–10 ml Zellsuspension transferiert. Die
Inkubation erfolgte bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft) für 6 Tage. Nach drei Tagen wurden 1520 ml frisches Medium zugegeben und am fünften Tag das Medium durch abgießen und
Zugabe frischen Mediums ersetzt.
Vor der Ernte der Zellen fand eine Kontrolle der Ansätze im Invertmikroskop auf mögliche
Kontamination mit Bakterien oder Hefen sowie auf Adhärenz der Makrophagen statt. Der
Inhalt kontaminierter Flaschen wurde nicht verwendet.
Die Ernte der Zellen erfolgte unter sterilen Kautelen. Das Medium mit nichtadhärenten Zellen
wurde abgegossen. Vier Waschschritte mit 25 ml 37°C warmen PBS (Zugabe, schwenken und
abgießen) schlossen sich zur Entfernung der restliche Bestandteiles des Mediums und
Zelldetritus an. Den Flaschen wurde je 1ml auf 38,5°C erwärmte Accutase® (s. S. 40, 3.2.3)
zugefügt, durch Schwenken (10 sek) über die Oberfläche verteilt und wieder abgegossen.
Anschließend wurden 4 ml der Accutase® zugegeben und für 10 min bei 38,5°C inkubiert.
Die Ablösung der Zellen vom Boden konnte durch Klopfen mit den Fingern am Boden der
Flaschen nach 5 min unterstützt werden. Zumeist konnten ca. 80% der adhärenten Zellen
(nach mikroskopischer Einschätzung) abgelöst werden. Die Zellsuspension wurde in 50 ml
Röhrchen überführt. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Die Zellen wurden
abzentrifugiert (250 xg, 4°C, 7 min), in 2 ml Medium (I10F+Strep) resuspendiert und gezählt.
Abb. 2 zeigt die so gewonnenen Makrophagen nach durchflusszytometrischer Analyse.
56
80%
20%
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Geräte, Material und Methoden
Rotfluoreszenz (FL-3)
Abb. 2
93%
6%
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Analyse der Vitalität und Reinheit aus Blutmonozyten generierter
Makrophagen nach durchflusszytometrischer Erfassung
Makrophagen wurden mit dem Zellkulturflaschen-Verfahren aus Blutmonozyten generiert und
durchflusszytometrisch charakterisiert. Das linke Dichtediagramm (FL-3/SSC) zeigt den relativ hohen
Anteil PI-positiver = toter Zellen). Das rechte Dichtediagramm zeigt die korrelierte Darstellung
Grösse/Komplexität (FSC/SSC) nach Ausschluss der toten Zellen. Makrophagen (93%) stellen sich als
homogene Wolke mit relativ hohem SSC-Wert und höherem FSC-Wert dar. Der Anteil
kontaminierender lymphoider Zellen beträgt hier 6%.
Besonderheiten beim Vergleich der beiden Verfahren zur Gewinnung boviner
Makrophagen
Das Protokoll zur Generierung der Makrophagen nach JUNGI et al. (1996) (Methode 1)
wurde genau befolgt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde das Protokoll der Methode 2
dahingehend verändert, dass die Temperatur auf 37°C und der CO2-Gehalt auf 8% angepasst
wurden. Es erfolgten immer von zwei Tieren parallel beiden Verfahren der Makrophagengewinnung.
3.3.3
Vitalitätsbestimmung von Zellen
Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung nach Akridinorange/Ethidiumbromid-Färbung
Zellsuspensionen wurden zu gleichen Teilen mit einer Akridinorange/EthidiumbromidLösung (s. S. 44, 3.2.5) versetzt, in einer Bürker-Zählkammer gezählt und deren Vitalität
beurteilt. Akridinorange dringt in die Zelle ein und interkaliert mit der doppelsträngigen
DNA. Der Kern erscheint unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikroskops (s. S. 38, 3.1) mit
UV-Anregung grün fluoreszierend. Das rot fluoreszierende Ethidiumbromid kann nur in
57
Geräte, Material und Methoden
Zellen mit geschädigter Membran eindringen, wo es dann ebenfalls mit der DNA interkaliert.
Die Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert in toten Zellen die Grünfluoreszenz des
Akridinorange.
Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie
Weist die Zellmembran Schädigungen auf, so kann das Fluorochrom PI in die Zelle
eindringen und mit der DNA interkalieren. Tote Zellen sind nach durchflusszytometrischer
Analyse im FL-3-Kanal (Rotfluoreszenz) erfassbar und können dadurch von ungeschädigten
Zellen unterschieden werden. Zellen nach Separation oder Zellen nach Kultivierung wurden
in Durchflusszytometerröhrchen überführt in denen Sheath mit PI (2 µg/ml final) vorgelegt
war (s. S. 51).
3.3.4
Durchflusszytometrie
Hier werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei
geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so
genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als
Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe
des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität
(Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden
aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses
Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und
gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992).
Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein
FACScan® (s. S. 38, 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm
erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm;
Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jeder Partikel
wird folglich durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3)
charakterisiert und als ein Messereignis festgehalten.
Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder
mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die
Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenz-
58
Geräte, Material und Methoden
detektoren abhängt wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen
Geräteeinstellungen erfasst wurden.
Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der
Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum
Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. So wurden bspw. in Mischungen aus
PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSCPunktediagramm identifiziert (R1: Region 1) und im FL-3/SSC-Punktediagramm die vitalen
Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale
PMN.
In einer Zwei-Parameter-Darstellung FSC/SSC lassen sich morphologisch ähnliche
Zellpopulationen, wie zum Beispiel eosinophile und neutrophile Granulozyten nicht
voneinander unterscheiden (s. Abb. 3). Um dies zu ermöglichen wurden die Zellen im FL1/SSC Punktediagramm angezeigt in dem sich die eosinophilen Granulozyten durch eine
höhere Autofluoreszenz darstellen (s. Abb. 3).
R5
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
R1
R3
R4
R2
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Abb. 3
Grünfluoreszenz (FL-1)
Differenzierung leukozytärer Zellpopulationen des bovinen Blutes durch
morphologische und Autofluoreszenz Charakteristika nach durchflusszytometrischer Analyse
Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 10.000 Ereignissen im Durchflusszytometer.
Linkes Diagramm: Darstellung der Morphologie (Größe gegen Komplexität), R1: Granulozyten mit
größerer Komplexität (SSC) sind von mononukleären Zellen (R2, lymphoide Zellen) und
monozytoiden Zellen (R3) zu unterscheiden. Rechtes Diagramm: Unterscheidung neutrophiler
Granulozyten (R5) von eosinophilen Granulozyten (R4) aufgrund der Autofluoreszenz, gemessen im
Kanal FL-1 (Grünfluoreszenz).
59
Geräte, Material und Methoden
Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers
(Referenzzellmethode)
Während der Inkubation starb ein Teil der eingesäten Zellen durch die Kulturbedingungen
oder die Stimulatoren ab. Durch eine Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid
(Fluoreszenz in der FL-3) war es möglich, diese von den lebendigen Zellen zu unterscheiden.
Eine bestimmte Anzahl Partikel, die sich von den zu untersuchenden Zellen unterscheiden,
aber dennoch mit den gleichen Geräteeinstellungen zu messen sind, werden den Proben
zugegeben. Anhand dieser kann eine Evaluation der lebendigen Zellen vorgenommen werden.
In diesem Fall wurden bovine Zellen (Referenzzellen) zugesetzt. Werden die gemessenen
Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl
ermittelt werden.
Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen
Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen
Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAK Bo1, s. S. 43, Tab. 5) und
anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (s. S. 43). Eine
längere Lagerung konnte durch eine Fixation mittels Paraformaldehyd ermöglicht werden.
Die toten und fixierten Zellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (s. S. 51) in der
FL-1 und in der FL-3.
Herstellung von Referenzzellen
Referenzzellen wurden immer in größeren Mengen hergestellt und nach Fixation bei 4°C
unter Lichtabschluss gelagert.
Zur Färbung wurden jeweils 2 x 107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes
in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 xg für 5 min und 4°C abzentrifugiert. Nach dem
Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit
demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen AKs Bo1 (s. S.) für 15 min bei 4°C
inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 ml MIF-Puffer (s. S. 44, 3.2.5) Zentrifugation über 7 min bei 80 xg und 4°C, Abgießen des Überstandes. Das resuspendierte
Zellpellet wurde nun mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus
Antikörpers (s. S. 43) versetzt und über 20 min unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert.
Es schloss sich ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 ml PBS an. Nach
der Überführung der Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen wurde das Zentrifugenröhrchen mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert. Die
60
Geräte, Material und Methoden
Resuspension des Zellpellets erfolgte in 30 ml einer 4%-igen Paraformaldehyd-Lösung. Die
Zellen inkubierten 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss. Anschließend wurden die Zellen 15 min
bei Raumtemperatur abzentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen.
Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PI-haltigen Trägerflüssigkeit aufgenommen
und auf 4 x 105 Zellen/ml eingestellt. (Die Konzentration wurde vor Einsatz kontrolliert und
gegebenenfalls korrigiert).
Vorbereitung der Proben für die Messung
Zum Ende der Inkubationszeit wurden die Mikrotiterplatten für ca. 15 min auf Eis gelagert,
um adhärente Zellen zu lösen. Kurzes Rütteln half bei diesem Vorgang. Eine Durchmischung
und nahezu vollständige Ablösung der Zellen wurde durch vielmaliges Auf- und
Abpipettieren erreicht. Die Ansätze wurden in 5 ml Röhrchen für die Durchflusszytometrie
(s. S. 39, 3.2.2) überführt. Es schloss sich eine Kontrolle der Platten auf residuale Zellen an.
Vor der Messung erfolgte eine Zugabe von 150 µl einer PI-haltigen Trägerflüssigkeit
(Endkonzentration des PI 2 µg/ml, s. S. 51).
Ermittlung der Zahl vitaler Zellen
Je nach Anzahl der Populationen wurden 10.000–30.000 Zellen erfasst. Die Morphologie der
Referenzzellen blieb durch die Fixation mit Paraformaldehyd weitgehend erhalten, was dazu
führte, dass die Zellen im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht nicht eindeutig von den frisch
separierten oder kultivierten mononukleären Zellen, wohl aber von polymorphkernigen Zellen
zu differenzieren waren. Durch ihre Fluoreszenz in der FL-1 (Grünfluoreszenz) gab es aber
ein eindeutiges Unterscheidungskriterium (s. Abb. 4). Die Auswertung der Messung eines
Gemisches aus Kultur- und Referenzzellen erfolgte durch die Darstellung verschiedener
Parameter einer Messung gegeneinander (s. Abb. 4). Einzelpopulationen konnten durch
Setzen von Fenstern markiert und gezielt in weiteren Diagrammen angezeigt werden. Die
einzelnen Messereignisse (Events, E) werden mittels einer Quadrantenanalyse registriert. Die
Quadrantenanalyse gibt die Zahl der Messereignisse, den mittleren Wert auf der x- und yAchse sowie prozentuale Anteile an sowohl den gezeigten, als auch den Gesamtereignissen
an. Da immer eine definierte Menge Referenzzellen (ZREF) den einzelnen Messungen
zugesetzt wird, war es möglich aus den gemessenen Ereignissen der vitalen Kulturzellen
(EVIT) und den gemessenen Messereignissen der Referenzzellen (EREF) die Zahl vitaler
Kulturzellen (ZVIT) in dem Ansatz mit folgender Formel zu berechnen:
61
Geräte, Material und Methoden
Z VIT =
E VIT x Z REF
E REF
Die Angabe des Parameters „Zahl vitaler Zellen (ZVIT)“ erfolgte als Mittelwert der
berechneten Werte dreier Ansätze.
R1
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Wegen der großen interindividuellen Schwankungen der Zahl vitaler Zellen sowohl in den
Proliferationsversuchen als auch in den Versuchen zum induzierten Sterben der neutrophilen
Granulozyten, wurden keine absoluten Zellzahlen angegeben, sondern als Prozent der
individuellen Kontrollansätze (=100%) ausgedrückt.
A
C
Rotfluoreszenz (FL-3)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
B
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Rotfluoreszenz FL-3
R3
Grünfluoreszenz FL-1
Abb. 4
R2
D
R4
Grünfluoreszenz FL-1
Evaluation der absoluten Zellzahl mittels Referenzzellmethode in der
Durchflusszytometrie
Für die Bestimmung der Vitalität boviner Granulozyten nach eintägiger Inkubation wurde die absolute
Zellzahl bestimmt. Zu den einzelnen Proben wurde vor der Messung eine definierte Menge
Referenzzellen zugegeben. In den Abbildungen A-D sind unterschiedliche Parameter einer Messung
gegeneinander aufgetragen. In Abb. A sind alle Events dieser Messung dargestellt. Da durch Zugabe
von PI die toten Zellen in der FL-3 positiv sind und daher rechts in dieser Darstellung liegen, wird
durch die Region R1 der Focus auf die lebendigen Zellen gelegt. In Abb. B werden ausschließlich die
in R1 liegenden, vitalen Zellen in der morphologischen Darstellung gezeigt. In der hier gesetzten
Region R2 befinden sich sowohl neutrophile als auch eosinophile Granulozyten. Zu unterscheiden
62
Geräte, Material und Methoden
sind diese beiden Populationen in der Darstellung FL-1 gegen SSC (Abb. C), da die eosinophilen
Granulozyten (R3) eine höhere Autofluoreszenz besitzen und deshalb weiter rechts als die
neutrophilen Granulozyten liegen. In Abb. D sind die Referenzzellen zu sehen, die von den
Granulozyten schon durch ihre Morphologie und von den vitalen MNC durch ihre stärkere
Fluoreszenz in den FL-1 und FL-3 zu unterscheiden sind.
3.3.5
Zellkultivierung in vitro
Für die Zellkultivierung wurden mit Ausnahme der Kultivierung der mononukleären Zellen
zur Generierung von Makrophagen, die in Zellkulturflaschen (Fassungsvermögen 70 und
200 ml, s. S. 39, 3.2.2) erfolgte, ausschließlich Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gewählt. Pro Ansatz betrug die Gesamtzahl der eingesäten Zellen mindestens 1 x 105,
in der Regel jedoch 2 x 105 Zellen. Wenn zwei verschiedene Zellpopulationen als Kokultur
Verwendung fanden, dann wurden bei der Kombination aus MNC und neutrophilen
Granulozyten pro Population 1 x 105 Zellen und bei der Kombination aus Makrophagen und
neutrophilen Granulozyten bzw. mononukleären Zellen 2 x 104 Makrophagen pro 1 x 105 der
jeweils anderen Population eingesät. Abweichungen von diesen Angaben werden bei den
Beschreibungen der entsprechenden Versuche genannt. Die meisten Ansätze erfolgten in
Triplikaten.
Das Gesamtvolumen der Einzelansätze betrug 175 µl, die sich wie folgt zusammensetzen. Pro
Vertiefung wurden 100 µl der Zellsuspension mit jeweils 25 µl der einzelnen Stimuli
pipettiert. Das Volumen wurde dann mit Medium bis auf 175 µl Gesamtvolumen aufgefüllt.
In den Kontrollansätzen zur Negativ-Kontrolle, wurde das fehlende Volumen der
Stimulatoren ebenfalls durch Medium ersetzt.
Die Inkubation erfolgte in einem Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 über 30 min bis zu
sechs Tagen. Die Platten wurden in feuchten Kammern mit gesättigter Kupfersulfatlösung
(Boden bedeckend) inkubiert, um den Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung zu minimieren.
Die dafür verwendeten Boxen waren mit einem durchlöcherten Deckel ausgestattet. Der
Kontakt der Zellkulturplatten mit der Lösung wurde durch ein Tragegestell verhindert.
63
Geräte, Material und Methoden
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Medium
SEA
R2
R2
R1
R1
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Abb. 5
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Prinzip der durchflusszytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen
Mononukleäre Zellen eines Rindes wurden 6 Tage in vitro ohne Stimulus (linke Abbildung) oder mit
dem Superantigen SEA (1 ng/l) (rechte Abbildung) stimuliert. Dargestellt sind korrelierte
Punktediagramme (FSC/SSC). Blastisch transformierte Zellen lassen sich über die Zunahme der
Zellgröße (höherer FSC-Wert) und der Komplexität (höherer SSC-Wert) von kleinen zytoiden Zellen
unterscheiden.
Kultivierung von Lymphozyten in vitro
Die Mehrzahl der Ansätze mit mononukleäre Zellen waren Ansätze in Monokulturen. Auf die
Ansätze in Kokulturen mit PMN – jeweils 1 x 105 Zellen – wird auf Seite 65 eingegangen.
Bestimmt werden sollte in diesen Ansätzen die durch CpG-Motive induzierbare Proliferation
boviner Lymphozyten. Die Inkubation erfolgte über vier bis sechs Tage in 96-WellRundbodenplatten (s. S. 39, 3.2.2) im Brutschrank. Die Negativ-Kontrolle zur Überprüfung
der spontanen Proliferation bestand in der Inkubation der Zellen in Medium. Als PositivKontrolle, der Überprüfung, ob unter Zugabe eines bekannt wirksamen Stimulus Proliferation
induziert werden kann, diente die Zugabe von final 1 ng/ml SEA (s. S. 40, 3.2.3). CpGMotive wurden allein, sowie in Kombination mit SEA zur Stimulation genutzt. Die finale
Konzentration der CpG-Motive lag bei 5 µg/ml. Es wurden Messungen zwischen Tag zwei
und Tag sechs durchgeführt, wobei die meisten Messungen nach vier und sechs Tagen
erfolgten. Die Vorbereitung der Proben wurde wie auf Seite 61 beschrieben durchgeführt.
Die eingesäten Zellen befanden sich in einem Ruhezustand, traten aber durch die Behandlung
und Kultivierung in den Zellzyklus ein, in dem sie alle Phasen durchlaufen. Im Verlauf des
Zyklus kam es zu einer starken Vergrößerung des Zellvolumens und einer geringgradigen
Steigerung der Komplexität, an die sich die Verdoppelung der DNA anschloss. Im
64
Geräte, Material und Methoden
Durchflusszytometer konnten derartige Vorgänge durch Zellen mit einem wesentlich
größeren FSC und einem gesteigerten SSC erkannt werden (s. Abb. 5). Durch die Verwendung der Referenzzellmethode konnte die absolute Zahl der zytoiden und blastoiden Zellen
bestimmt werden. Diese Veränderungen wurden als blastische Transformation angesprochen.
Zusätzlich wurden Ansätze aus Reinkulturen mononukleärer Zellen in Triplikaten zur eintägigen Inkubation durchgeführt. Die Stimulation erfolgte wie schon beschrieben mit SEA,
den CpG-Motiven sowie Kombinationen aus beiden. Nach 22 h bis 24 h wurden jeweils 75 µl
der Überstände gewonnen und ohne weitere Behandlung Granulozytenkulturen zugegeben,
um ihren Einfluss auf die Vitalität der PMN nach einer weiteren eintägigen Inkubation in
vitro zu prüfen.
Zur Gewinnung PAMP freier möglichst Zytokinhaltiger MLC-Überstände, wurden allogene
MNC zweier Tiere über drei Tage in einer Konzentration von jeweils 2 x 106 Zellen/ml bei
38,5°C und 5% CO2 inkubiert. Die Überstände wurden kollektiert und in aliquoten Teilen bei
-20°C bis zu Verwendung als Stimuli für reine PMN-Kulturen gelagert.
Kultivierung von Granulozyten in vitro
Die über Percoll® separierten neutrophilen Granulozyten wurden entweder als Monokultur in
einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ ml oder in Kokulturen mit MNC in einem Verhältnis
von 1:1 à 1 x 106 Zellen der einzelnen Populationen pro Milliliter eingesetzt. Außerdem
wurden zusätzlich noch Kokulturen aus Mph und PMN in einem Verhältnis von 1:5 angesetzt,
da Makrophagen zu neutrophilen Granulozyten in vivo in einem Verhältnis von 1:5 vorliegen.
Dabei wurde außer Acht gelassen, dass bereits erste Reaktionen bei einem Verhältnis von
1:10 auftraten. Alle Ansätze wurden in Triplikaten erstellt. Sämtliche CpG-Motive (s. S. 45),
SEA, LPS und LTA in den unter 3.2.5 beschriebenen Gebrauchsverdünnungen dienten
entweder als Einzelstimuli oder in Kostimuli aus jeweils einem CpG-Motiv und SEA oder
LPS bzw. LTA. Wegen der geringen MHC-Klasse-II-Dichte auf Makrophagen wurden die
Kokulturen aus Mph und PMN nicht mit SEA, sondern mit LPS, LTA und CpG 2006, sowie
Kombinationen aus dieser durchgeführt. Jeweils 100 µl der Zellsuspension wurden mit 25 µl
der Stimuli in der Gebrauchskonzentration (s. S. 45) versetzt. Eine weitere Stimulation der
PMN-Reinkulturen bestand in der Zugabe von 75 µl der nach eintägiger Inkubation mit
konditionierten Überstände von stimulierten MNC (s. S. 64). Die Überstände der allogenen
MLC wurden ebenfalls als Stimuli verwendet. Dabei wurden jeweils 50 µl entweder mit oder
ohne Zusatz von PAMPs den PMN-Reinkulturen zugesetzt. Die Inkubation erfolgte über 22 h
bei 38,5°C und 5% CO2. Die Vorbereitung der Proben für die Messung wurde wie auf Seite
61 beschrieben durchgeführt.
65
Geräte, Material und Methoden
Nachweis der Apoptose von Zellen durch Annexin V-Bindung
Die Membran apoptotischer Zellen ist in der Frühphase des induzierten Zelltodes dadurch
charakterisiert, dass Phosphatidylserin (PS) – normalerweise an der Innenseite der Zellmembran – durch die Wirkung sog. Flippasen an die Außenseite der Zellmembran gebracht wird.
Annexin V, ein Phospholipid bindendes Protein, das aus der anti-koagulativ wirkenden
Familie der Annexine stammt, ist dann in der Lage, Ca2+-abhängig an das PS zu binden. Zum
Nachweis der Annexinbindung wird Fluorochrom markiertes Annexin V (Annexin V-FITC)
eingesetzt. Zellen, die Annexin positiv sind – bei gleichzeitiger Integrität der Zellmembran
(Propidiumiodid negativ) – werden hier als apoptotische Zellen angesehen.
Hier ging es um den Nachweis, ob es sich bei dem durch PAMPs induzierten Vitalitätsverlust
der neutrophilen Granulozyten um die Induktion der Apoptose, der Nekrose oder um einen
primär apoptotischen Vorgang mit anschließender sekundärer Nekrose handelt.
Die Zellgewinnung wurde wie in 3.3.1 beschrieben durchgeführt. Die neben einem
Kontrollansatz in Medium erfolgten Stimulationen wurden mit CpG 2007 (finale Konzentration 5 µg/ml) sowie LTA und LPS (10 µg/ml) durchgeführt. Die Messungen erfolgten zu
den Zeitpunkten 30 min, 4 h, 12 h und 22 h nach Kulturbeginn. Dabei wurden zum Vergleich
in Parallelansätze die absolute Zellzahl mit der Referenzzellmethode (s. S. 60) bestimmt.
Das mitgelieferte Protokoll wurde weitestgehend befolgt. Die Färbung der Zellen erfolgte erst
zum Erntezeitpunkt. Nach der Entnahme der Mikrotiterplatten aus dem Brutschrank, wurden
die Zellen abzentrifugiert (200 xg, 4 min und 10°C), dekantiert und mit PBS gewaschen, um
das Medium mit den Stimuli komplett zu entfernen. Im Anschluss wurden 195 µl des
verdünnten Bindungspuffers (s. S. 47) zu dem aufgerüttelten Zellpellet gegeben. Nach der
Zugabe von 10 µl der Annexin V-FITC Lösung und erneuten Rüttelns schloss sich eine
Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss an. Vor der erneuten
Zugabe von 190 µl Bindungspuffer, wurden die Granulozyten zwei Mal mit PBS gewaschen.
10 µl PI wurden dazu pipettiert. Nach dreiminütiger Inkubation erfolgte die vollständige
Überführung der Inhalte der Vertiefungen zu Messung in 5 ml Röhrchen (s. S. 39, 3.2.2).
Bestimmung der Phagozytosekapazität boviner Makrophagen in vitro
Die Phagozytosekapazität aus Blutmonozyten generierter Makrophagen wurde mit einer
modifizierten Methode nach ZERBE (1994) durchgeführt. Um die Phagozytose aktiven
Zellen erkennen zu können, wurden FITC-markierte Staphylokokken (s. S. 50) eingesetzt.
Die in 1 ml Aliquots eingefrorenen Bakterien wurden zur Verwendung aufgetaut und zu
gleichen Teilen auf zwei 1,5 ml Eppendorfcups (s. S. 39, 3.2.2) aufgeteilt. Nach der
66
Geräte, Material und Methoden
Zentrifugation für 45 sek bei 15.000 xg, wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert. Zu den
resuspendierten Bakterien wurden entweder 1 ml 10%-iges natives, Komplement inaktiviertes
Rinderpoolserum (s. S. 50, 3.2.5) zur Opsonisierung oder 1 ml PBS, um native Bakterien zu
behalten, zugegeben und für 15 min bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
In eine 96-Well-Rundbodenplatte wurde jede Kavität mit 50 µl einer 2 x 106 Makrohagen/ml
enthaltenden Zellsuspension in PBS beschickt. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von
entweder 50 µl der opsonisierten oder nicht opsonisierten Bakterien, sowie PBS in der
Negativkontrolle. Das Verhältnis der Bakterien zu Makrophagen betrug somit ungefähr 1:100.
Nachdem die Platten gerüttelt worden waren, schloss sich eine 45-minütige Inkubation in
einer feuchten Kammer bei 37°C mit 5% CO2 an. Während der Inkubation wurde die Platte
einmalig erneut aufgerüttelt. Vor der Entnahme der Ansätze erfolgte eine 10-minütige Lagerung auf Eis unter Lichtabschluss zur Beendigung der Reaktion. Durch mehrmaliges Auf- und
Abpipettieren konnte eine nahezu vollständige Ablösung und Entnahme der Makrophagen aus
den Kavitäten erreicht werden. Den Ansätzen wurden nach der Überführung in 5 ml Röhrchen
(s. S. 39, 3.2.2) 100 µl einer Sheath-PI-Lösung (final 2 µg PI/ml) zugesetzt.
Die Geräteeinstellungen am Durchflusszytometer wurden so gewählt, dass die Makrophagen
mit ihrer gemäßigten Autofluoreszenz in der FL-1 eine Fluoreszenzintensität von 100 und 101
zeigten. Die Phagozytose aktiven Zellen zeigen je nach Menge der ingestierten FITCmarkierten Staphylokokken eine in Abstufungen höhere Fluoreszenz.
Nach der Messung wurden zur Auswertung nur die vitalen Zellen herangezogen. Die
Makrophagen der Ansätze mit Bakterien, die eine ähnliche Fluoreszenz wie die der Ansätze
ohne Bakterien aufwiesen, wurden als nicht phagozytierend angesehen.
Intrazelluläres Verfahren zur Ermittlung der Basis- und Induzierten-Produktion von NO
(Stickstoffmonoxid) mittels DAF-2 DA (Diaminofluoreszein -2 Diazetat)
DAF-2 DA ist ein Fluorochrom mit dem es möglich ist, intrazellulär mittels durchflusszytometrischer Verfahren NO nachzuweisen. NO entsteht durch Konversion von L-Arginin
zu L-Zitrullin. DAF-2 DA ist membrangängig und kann somit in die Zelle eindringen.
Intrazellulär wird es durch in nahezu allen Zellen enthaltene Esterasen zu dem nicht mehr
membrangängigen DAF-2 hydrolysiert (KOJIMA et al. 1998). Dieses wiederum reagiert mit
einem aktiven Intermediärprodukt der Oxidation von NO zu NO2. Dabei entsteht das
Triazolfluoreszein DAF-2 T. DAF-2 und DAF-2 T unterscheiden sich sehr stark in ihrer
intrazellulären Fluoreszenz (Faktor 100), wobei ihre maximal zu erreichende
Fluoreszenzstärke identisch ist. Die Hintergrundfluoreszenz des DAF-2 ist, da nur ca. 1%
umgesetzt wird und somit immer nahezu die gleiche Menge bestehen bleibt, zu
67
Geräte, Material und Methoden
vernachlässigen. 0,1 µM DAF-2 können 200 nM NO (N2O3) umsetzen. Auch beim Einsatz
von 0,1 nM DAF-2 ist nicht mit einer Limitierung zu rechnen. (LEIKERT et al. 2001)
Die nach sechstägiger Inkubation geernteten Makrophagen wurden in Iscové-Medium
(s. S. 44) aufgenommen, auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt und je
100 µl dieser Suspension in jede Vertiefung vorgelegt. 25 µl eines CpG-Motivs, LPS, PWM
(s. S. 40, 3.2.3) oder 50 µl einer Suspension PI-markierter Bakterien dienten als Stimuli. Es
wurden jeweils Triplikate mit 0,1 µM bzw. 1 µM oder ohne DAF-2 DA angesetzt. Das
Gesamtvolumen betrug 175 µl. Je drei Stunden vor der durchflusszytometrischen
Bestimmung wurden 300 µl des Überstandes der Triplikate gepoolt und in Eppendorfcups bei
-20°C gelagert. In den Überständen ohne DAF-2 DA erfolgte die Bestimmung des extrazellulären NO mittels Griess-Reagenz. Das Medium wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS
(Zugabe von 100 µl PBS - Zentrifugation bei 200 xg, 4°C für 4 min – Dekantieren – Rütteln –
Zugabe von 150 µl PBS und erneute Zentrifugation) entfernt. Nach der Aufnahme in 150 µl
PBS erfolgte die Zugabe von 25 µl DAF-2 DA (s. S. 47) in Endkonzentrationen von 0,1 bis
1 µM. Eine Inkubations von 3 h schloss sich an. Die Proben wurden anschließend unter
Zusatz von 2 µg/ml PI final zügig in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt und
gemessen.
Bei Stimulation der Makrophagen mit Bakterien betrug die Inkubationszeit 45 min. Nach
diesem Zeitraum wurde das Medium mit den Bakterien abzentrifugiert. Eine eintägige
Inkubation im Brutschrank bei 38,5°C schloss sich an. Nach einem Waschvorgang mit PBS
wurden entweder 100 µl der L-Arginin-Lösung (s. S. 40, 3.2.3) oder PBS mit 25 µl der DAF2 DA-Verdünnung und 50 µl To-Pro-3, einem Fluoreszenzfarbstoff, der im FL-4-Kanal (blau)
darzustellen ist, und 25 µl Sheath zugegeben. Vor der Überführung und anschließenden
Messung erfolgte eine 15-minütige Inkubation.
Nitritmessung in Kulturüberständen mit dem Griess-Reagenz
Die Nitrit (NO2-)- Konzentration in den Kulturüberständen in vitro generierter und kultivierter
boviner Makrophagen diente als indirekter Parameter der NO-Produktion. Diese Methode
diente zum einen der Überprüfung der Aktivierbarkeit der Makrophagen, als auch dem
Vergleich mit der Methode der intrazellulären NO-Messung mit einem etablierten Verfahren.
Die Überstände wurden wie auf Seite 67 beschrieben, gewonnen. Nach dem Auftauen wurden
in Triplikaten jeweils 100 µl der Überstände in Kavitäten einer 96-Well-Flachboden
Mikrotiterplatte gegeben. Zehn Minuten nach Zusatz von jeweils 100 µl Griess-Reagenz
(s. S. 47) erfolgte die Messung des Farbumschlags spektralphotometrisch bei einer
Wellenlänge von 570 nm.
68
Geräte, Material und Methoden
Um aus den Extinktionen den NO2--Gehalt berechnen zu können, wurden Standardkurven
mittels Verdünnungen einer Natriumnitritlösung in I10F+strep Medium erstellt. Die NO2Konzentrationen wurden, wenn nicht anders angegeben, als Differenzwerte zu den
Mediumkontrollen (Zellansätze ohne Stimulus) ausgedrückt.
3.3.6
Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Die indirekte Membranimmunfluoreszenz ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression
von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper (s. S. 43, Tab.
5) an Strukturen, die ihrerseits von einem zweiten, Fluorochrom markierten Antikörper
(s. S. 43) erkannt werden.
Durchführung der Membranimmunfluoreszenz
Pro Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte wurden 2 x 105 Zellen frisch
separierter oder in vitro kultivierter Zellen pipettiert. Platten mit kultivierten Zellen wurden
10 min auf Eis inkubiert um adhärente Zellen leichter herauspipettieren zu können. Ansätze
mit Makrophagen erfolgten mit 1 x 105 Zellen pro Ansatz. Die Zellen wurden zentrifugiert
(200 xg; 4 min, 4°C) und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in
175 µl MIF-Puffer (s. S. 49) gewaschen – Resuspension, Zentrifugation, Abschlagen der
Überstände, Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µl des verdünnten
spezifischen primären Antikörpers (s. S. 43, Tab. 5) erfolgte eine 20-minütige Inkubation
(4°C). Danach wurden die Zellen zwei Mal mit 175 µl MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µl des
sekundären FITC- oder PE-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers versetzt und unter
Lichtabschluss bei 4°C für 20 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen
in 150 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/ml Propidiumiodid) aufgenommen, in Röhrchen für die
Durchflusszytometrie überführt und durchflusszytometrisch erfasst.
Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden
sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen Anstelle des ersten
Antikörpers 25 µl MIF-Puffer bzw. ein irrelevanter monoklonaler Antikörper des gleichen
Isotyps wie der spezifische mAk den Zellen zugesetzt wurden.
Membranfluoreszenz zum Nachweis der Bindung von DNA-Motiven
Das Verfahren folgte im Wesentlichen dem oben beschriebenen. Anstelle spezifischer
monoklonaler Antikörper wurden 20 µl biotinylierter CpG-Motive (s. S. 42, Tab. 4) in einer
69
Geräte, Material und Methoden
finalen Konzentration von 10 µg/ml verwendet. Die erste Inkubation erfolgte für 30 min auf
Eis. Zur Fluoreszenzmarkierung wurden 20 µl PE-konjugiertes Streptavidin verwendet,
welches spezifisch an Biotinmoleküle bindet. Die Proben wurden lichtgeschützt bei 4°C für
20 min inkubiert.
Zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität wurde in einigen Versuchen 25 µl eines zweiten,
sekundären biotinylierten Antikörpers (Ziege-anti-Hund biot, IgG (H+L), s. S. 43) zugegeben
(1:1000 verdünnt). Dieses biotinylierte Molekül sollte an freie Valenzen des Streptavidins
binden und, gefolgt von einer weitere Inkubation mit Streptavidin-PE (20 µl, 20 min, 4°C),
die Sensitivität des Nachweises erhöhen.
Nachweis der Bindung von CpG-Motiven an Zellmembranen durch ein
fluoreszenzsteigerndes System
Dieser Versuch wurde unter der Verwendung des Systems Flow-AMP® (s. S. 46)
durchgeführt. Das enthaltene Sekundärreagenz, eine an Streptavidin konjugierte HorseRadish-Peroxidase (HRP), bindet an biotinylierte Moleküle. Durch die HRP wird ein in dem
Amplifizierungsreagenz enthaltenes Substrat umgesetzt. Bei dieser Reaktion entstehen
biotinylierte Tyramidradikale, die kovalent an Tyrosin- oder Tryptophanreste binden. Beide
Aminosäuren kommen sowohl in den Antigenen als auch in Zellmembranen vor. Die
Biotinylierung findet somit im Umkreis der gebundene HRP statt. Das anschließend
zugegebene FITC-konjugierte Streptavidin hat somit wesentlich mehr Bindungsmöglichkeiten, was zu einer bis zu 100-fach stärkeren Fluoreszenz führen kann.
Zellen (frisch separierte mononukleäre Zellen, Makrophagen, je 2 x 105/Vertiefung einer
Rundboden-Mikrotiterplatte) wurden bei 400 xg, 4°C für 4 min zentrifugiert. Die Überstände
wurden dekantiert und die Zellen aufgerüttelt. Es schloss sich ein Waschschritt mit 200 µl
Staining Buffer (s. S. 46) und abermaliger Zentrifugation an. Auf das dekantierte und
resuspendierte Zellpellet wurden 20 µl des biotinylierten CpG-Motivs (10 µg/ml) gegeben
und 30 min bei 4°C inkubiert. Zwei weitere Waschschritte schlossen sich an. Zu dem
resuspendierten Zellpellet wurden 20 µl der Gebrauchsverdünnung des sekundären Reagenz
pipettiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei den sich nun anschließenden vier
Waschschritten war es besonders wichtig den natriumazidfreien Staining Buffer zu
verwenden. Vor dem nächsten Inkubationsschritt wurde ein weiterer Waschschritt mit PBS
durchgeführt, die Platte abgedeckt und 5 min im Brutschrank bei 37°C erwärmt. Nun wurden
20 µl des verdünnten Amplifizierungsreagenz zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Daran schlossen sich zwei weitere Waschschritte mit azidfreiem Staining Buffer an.
70
Geräte, Material und Methoden
Zum Schluss wurden die Zellen 10 min mit 10 µl der Detektorverdünnung inkubiert. Bevor
die Zellen in 150 µl Sheath (2 µg/ml PI) für die durchflusszytometrische Analyse aufgenommen wurden, mussten sie noch zwei Mal in azidfreiem Staining Buffer gewaschen werden.
Doppelte Membranfluoreszenz
Dieses Verfahren wurde ebenfalls in Kombination mit der Markierung durch
Zellsubpopulationsspezifische monoklonale Antikörper eingesetzt (Doppelfluoreszenz) zum
Nachweis, ob CpG-Motive selektiv an bestimmte Zellpopulationen binden. Hierfür wurden
die Zellen vor der Inkubation mit dem Detektor mit den monoklonalen Antikörpern inkubiert
(s. S. 69). Da der Detektor des Flow-AMP®-Systems FITC-gekoppelt ist, wurde als
sekundärer Antikörper ein PE-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper verwendet. Der letzte
Inkubationsschritt erfolgte sowohl mit dem Detektor als auch dem sekundären Antikörper.
Prüfung der Internalisierung von DNA durch intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung
Die intrazelluläre Fluoreszenz wurde mit Leukozyten aus Vollblut nach hypotoner Lyse der
Erythrozyten durchgeführt. Pro Ansatz wurden 2 x 106 Zellen in 100 µl Medium in eine
Vertiefung einer auf 38,5°C vorgewärmten 96-Well Mikrotiterplatte pipettiert. Nun wurden
25 µl der verdünnten biotinylierten CpG-Motive - CpG-WB biot und GpC-WB biot - bzw.
Medium zugesetzt. Parallelansätze wurden 5, 15 oder 30 Minuten bei 38,5°C inkubiert.
Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet zwei
Mal mit PBS gewaschen (s. S. 69). Anschließend erfolgte die Resuspension des Bodensatzes
in 100 µl kaltem PBS. Nach der Zugabe von 100 µl 4%-iger Paraformaldehydlösung wurden
die Zellen gerüttelt, 30 min bei Raumtemperatur fixiert und danach zwei Mal mit 200 µl PBS
gewaschen. Zwischen den beiden sich anschließenden Waschschritten mit MIF-SaponinPuffer erfolgte eine 30-minütige Inkubation. Nun erfolgte die Zugabe von 50 µl StreptavidinPE in MIF-Saponin-Puffer (45 min bei RT). Vor der Resuspension der Zellen in Sheath für
die durchflusszytometrische Messung wurden die Zellen noch weitere drei Mal mit MIFSaponin-Puffer gewaschen.
Auswertung der Membranimmunfluoreszenz nach durchflusszytometrischer Messung
Für die Messungen einer zusammengehörenden Versuchsreihe wurden immer identische
Geräteeinstellungen gewählt. Tote Zellen wurden anhand ihrer Fluoreszenzintensität im FL-3Kanal (durch Aufnahme von PI) mittels eines Fensters aus der Auswertung ausgeschlossen.
Phycoerythrin (PE) war bei einer Emmissionswellenlänge von 564-606 nm in FL-2-Kanal
71
Geräte, Material und Methoden
und Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) bei 515-545 nm Emmissionswellenlänge im FL-1-Kanal
erfassbar. Zur Auswertung einfacher Fluoreszenzen wurden immer korrelierte Darstellungen
mit den Parametern FL-1 (oder FL-2) gegen SSC verwendet, in denen eine Quadrantenanalyse durchgeführt wurde. Für die Auswertung der Doppelfluoreszenzen wurden korrelierte
Darstellungen der beiden Fluoreszenzen gewählt. Bei den Geräteeinstellungen ist darauf zu
achten, dass die in nur einem Wellenbereich positiven Zellpopulationen in der Darstellung der
beiden Fluoreszenzen gegeneinander in einem rechten Winkel aufeinander stehen.
Ausgewertet wurde das Verhältnis Fluoreszenz positiver zu Fluoreszenz negativen Zellen
sowie die mittlere Fluoreszenzintensität. Die absolute Zahl Fluoreszenz positiver Zellen ergab
sich aus der in parallelen Kulturen durch die Referenzzellmethode ermittelten Zahl vitaler
Zellen multipliziert mit den prozentualen Anteilen Membranfluoreszenz positiver Zellen.
3.3.7
Statistische Verfahren
Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden
der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (STEEL & TORRIE 1980)
eingesetzt.
Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich
verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test
zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen
Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute
Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu
erwarten. Daher wurden in dieser Arbeit Interassayvarianzen nur punktuell bestimmt.
Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der
Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die
Messwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen
voneinander abweichen. Für die mit der Referenzzellmethode ermittelte Gesamtzahl vitaler
Zellen (s. S. 60) ergab sich für die Einzelansätze von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein
Varianzkoeffizient zwischen 2% bis 10%. Dies gilt sowohl für die Zahl vitaler Zellen in
Versuchen, in denen das PAMP-induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten
untersucht wurde, als auch für die in den Stimulationsversuchen erhaltenen Zahlen kleiner
oder blastisch transformierter Lymphozyten.
72
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Generierung und Charakterisierung boviner Makrophagen
4.1.1
Methodische Vorarbeiten
Vergleich zweier Methoden zur Generierung boviner Makrophagen aus Blutmonozyten
Die durch zwei Verfahren gewonnenen Makrophagen (s. S. 53, 3.3.2) wurden mittels
Durchflusszytometrie morphologisch (s. Abb. 6), phänotypisch (s. Abb. 7) sowie funktionell
verglichen.
Ausbeute und Reinheit der Makrophagen
Trotz der fünf Waschschritte mit PBS vor der Ablösung der Makrophagen mit Accutase®
konnten die Lymphozyten selten komplett entfernt werden. Ihr Anteil lag in der Regel ≥ 5%.
Um reinere Makrophagen zu gewinnen, wurden zwischenzeitlich ohne Verbesserung der
Reinheit bis zu sieben Waschschritte durchgeführt. Makrophagen mit mehr als 15%
Lymphozytenanteil wurden nicht für weitere Versuche verwendet. Zwischen den beiden
verwendeten Methoden (s. S. 53, 3.3.2) waren weder in der Ausbeute der MDM pro
Blutvolumen noch in der Reinheit, noch in der Vitalität nennenswerte Unterschiede zu
erkennen (Daten nicht gezeigt).
Vergleich der Morphologie
Die makrophagoiden Zellen beider Gewinnungsverfahren waren in ihrer Morphologie
vergleichbar (s. Abb. 6, obere rechte Quadranten). Durch die Generierung nach Methode 1
(linke Spalte) divergierten die Zellen in der Größe nicht so weit wie die nach Methode 2
(rechte Spalte) gewonnenen. Im Mittel waren die MDM der Methode 1 marginal größer. In
der Granularität lag kein Unterschied vor.
Interindividuell bestanden Schwankungen in der Größe sowie in der Komplexität (s. Abb. 6).
Die makrophagoiden Zellen von Tier 2 waren bspw. im Durchschnitt zwar größer, in der
Granularität jedoch geringer als die von Tier 1 (Vergleich der Reihen in Abb. 6).
73
Ergebnisse
Methode 1
Methode 2
A) Tier 1
88%
Seitwärtsstreulicht (SSC)
72%
Makrophagen
Lymphozyten/
Detritus
Vorwärtsstreulicht (FSC)
B) Tier 2
85%
Seitwärtsstreulicht (SSC)
77%
Makrophagen
Lymphozyten/
Detritus
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Abb. 6
Vergleichende morphologische Darstellung der nach zwei Verfahren
gewonnenen bovinen Makrophagen
Dargestellt sind Dichteplots nach durchflusszytometrischer Analyse von in vitro generierten
Makrophagen zweier Tiere. Die Bilder der linken Spalte zeigen makrophagoide Zellen (obere rechte
Quadranten), die nach Methode 1 gewonnen wurden (s. S. 53), die rechte Spalte die nach Methode 2
(s. S. 56) generierten. Die Population im unteren linken Quadranten besteht zum Großteil aus
Lymphozyten sowie Detritus. In diesen Diagrammen werden ausschließlich PI-negative Ereignisse
gezeigt.
Phänotypische Charakterisierung
Die nach beiden Verfahren generierten Makrophagen exprimierten in gleicher (relativer)
Stärke MHC-Klasse-I-Moleküle (im Vergleich zur Isotypkontrolle etwa die zehnfache
mittlere Fluoreszenzintensität), MHC-Klasse-II-Moleküle (schwach exprimiert) und das
Molekül CD14 (im Vergleich zur Isotypkontrolle etwa die dreifache mittlere
Fluoreszenzintensität (s. Abb. 7)).
74
Isotypkontrolle
IgG 1
MHC-I
(mAk Bo 1)
MHC-II
(mAk Bo 139)
Methode 2
Seitwärtsstreulicht (SSC)
75
Grünfluoreszenz (FL-1)
Isotypkontrolle
IgG 3
Methode 1
Grünfluoreszenz (FL-1)
Grünfluoreszenz (FL-1)
CD 14
(mAk VPM 65)
Ergebnisse
Vergleich
beider Methoden
Messereignisse
Ergebnisse
Abb. 7
Vergleich der Immunphänotypen der durch zwei unterschiedliche Methoden
gewonnenen Makrophagen
Von zwei Tieren wurden am gleichen Tag Makrophagen mittels zwei verschiedener Verfahren
gewonnen (s. S. 53, 3.3.2). In der oberen Zeile werden nach der Methode 1 und in der mittleren Reihe
nach der Methode 2 gewonnene MDM eines Tieres in einem Dichtediagramm jeweils in der
Korrelation der FL-1 gegen die Komplexität dargestellt. In der unteren Reihe werden überlagerte
Histogramme der reinen Makrophagen gezeigt, wobei die solide graue Kurve die nach der Methode 1
generierten MDM repräsentiert.
Funktionelle Charakterisierung der Makrophagen
Bestimmung der Phagozytosekapazität der Makrophagen
Von zwei Tieren wurden am gleichen Tag über beide Verfahren Makrophagen generiert. Die
nach Methode 1 kultivierten MDM phagozytierten zu 8% nicht-opsonisierte Staphylokokken,
wohingegen 13% der über Methode 2 gewonnenen Zellen Phagozytose positiv waren (s. Abb.
8). Durch die Zugabe der gleichen Konzentration opsonisierter Bakterien (s. S. 50) wurde die
Phagozytosekapazität deutlich gesteigert: Sie stieg auf 26% (Methode 1) und 35% (Methode
2).
Abschließend ist festzustellen, dass sich die nach den verschiedenen Verfahren gewonnenen
MDM in den hier untersuchten morphologischen, phänotypischen und funktionellen Charakteristika kaum unterschieden. Wegen des geringeren Arbeitsaufwandes und der höheren
Praktikabilität wurden in den Folgeversuchen die nach der Methode 2 (s. S. 53, 3.3.2)
generierten MDM eingesetzt.
76
Ergebnisse
Nicht
Opsonisierte Bakterien
Ohne Bakterien
Opsonisierte Bakterien
A) Methode 1
0%
92%
8%
74%
26%
13%
65%
35%
Seitwärtsstreulicht (SSC)
100%
Grünfluoreszenz (FL-1)
B) Methode 2
87%
Seitwärtsstreulicht (SSC)
100%
Grünfluoreszenz (FL-1)
Abb. 8
Vergleich der Phagozytosekapazität von Makrophagen, die mittels zweier
Verfahren generiert wurden
Am selben Tag wurden Makrophagen aus Blutmonozyten eines Tieres durch zwei verschiedene
Methoden gewonnen (s. S. 53, 3.3.2). In der oberen Reihe werden nach Methode 1 und in der unteren
Reihe nach Methode 2 gewonnene MDM eines Tieres in einem Dichtepot dargestellt. Um schwach
phagozytierende Zellen von nicht-phagozytierenden Zellen unterscheiden zu können, wurde eine
Kontrolle unter Zugabe eines Puffers (PBS) durchgeführt (linke Spalte). Zur Phagozytose wurden
nicht-opsonisierte (mittlere Spalte) oder opsonisierte (rechte Spalte) FITC-markierte Staphylokokken
(s. S. 50) eingesetzt. Die Dichtediagramme zeigen im oberen linken Quadranten die nichtphagozytierenden und im oberen rechten Quadranten die phagozytierenden Makrophagen.
4.1.2
Messung der Nitrit-Bildung durch in vitro generierte Makrophagen
Methodische Vorarbeiten zur Nitritmessung auf Einzelzellebene
Für diese Testreihe wurde ein membrangängiges Fluorochrom eingesetzt, welches für
derartige Studien hier zum ersten Mal Verwendung fand. Die Vorarbeiten wurden
hauptsächlich an MNC durchgeführt (s. S. 67). Zunächst sollte die optimal einzusetzende
Konzentration des Fluorochroms DAF-2 DA ermittelt werden (geprüft wurden 0,1 µM bis
10 µM DAF-2 DA). Bei einer maximalen Inkubationsdauer von 3 h (38,5°C, 5% CO2)
77
Ergebnisse
erfolgten Messungen der zellulären Fluoreszenz nach einer, zwei und drei Stunden. Als
Kriterium dienten die eindeutige Differenzierung der nicht gefärbten Zellen von den mit
DAF-2 DA inkubierten Zellen sowie ein deutlicher Unterschied stimulierter und unstimulierter Zellen in der Fluoreszenz. In Abb. 9 sind in überlagerten Histogrammen beispielhaft
die Fluoreszenzintensitäten der MNC eines Tieres dargestellt, die mit unterschiedlichen DAF2 DA-Konzentrationen inkubiert wurden.
Messereignisse
0,1 µM
0 µM
1 µM
10 µM
Grünfluoreszenz (FL-1)
Abb. 9
Fluoreszenzintensitäten boviner MNC nach der Inkubation mit verschiedenen
DAF-2 DA Konzentrationen
Frisch isolierte mononukleäre Zellen des Blutes wurden über 60 min A) ohne, B) mit 0,1 µM, C) mit
1 µM oder D) mit 10 µM DAF-2 DA inkubiert. Dieses Histogramm zeigt die mittlere
Fluoreszenzintensität der vitalen Zellen. Die Fluoreszenzintensität nativer Zellen liegt bei einer
relativen Stärke von eins 60 min nach der Zugabe von 0,1 µM DAF liegt die mittlere Fluoreszenz bei
41, bei 1 µM DAF bei 330 und nach Zugabe von 10 µM DAF bei 799.
Die Aufnahme von DAF-2 DA erfolgte rasch und erreichte ein Maximum nach etwa 20 min
(s. Abb. 10). Dies galt sowohl für Monozyten als auch für Lymphozyten und war unabhängig
von der eingesetzten Konzentration (s. Abb. 10). Nach Inkubation der Zellen mit 10 µM
DAF-2 DA schien bei längerer Inkubation (>50 min) die Fluoreszenz der monozytoiden
Zellen wieder zu sinken (s. Abb. 10). Aus den Ergebnissen dieses Versuchs wurde die
Nutzkonzentration von DAF-2 DA von 0,1 µM bis 1 µM gewählt.
78
Ergebnisse
Fluoreszenzintensität
Monozyten
Lymphozyten
1000
1000
100
100
10
10
1
0
10
20
30
40
50
1
60
Minuten
0
10
20
30
40
50
60
Minuten
10 µM
1µM
0,1 µM
Abb. 10 Konzentrations- und zeitabhängige Fluoreszenzintensitäten von Monozyten
und Lymphozyten nach Inkubation mit dem Fluorochrom DAF-2 DA
Die Zellen wurden unstimuliert in Medium aufgenommen und unter Zugabe dreier Konzentrationen
DAF-2 DA bei 38,5°C in einem Gesamtvolumen von 2 ml für verschiedene Zeiten inkubiert. Die
durchflusszytometrischen Messungen erfolgten in Unikaten. Über die Geräteeinstellungen wurde die
Fluoreszenz der Zellen in der Messung zum Zeitpunkt 0 min zwischen 100 und 101 eingeregelt.
Obwohl ausschließlich das ursprüngliche DAF-2 DA zellwandpermeabel sein soll, können
umgesetzte Fluorochrome durch die geschädigte Zellwand nekrobiotischer Zellen diffundieren. Bei Inkubationszeiten von 24 h oder länger wurde dazu übergegangen, identische
Ansätze vergleichsweise zum einen sofort oder erst drei Stunden vor der Messung mit dem
Fluorochrom zu versetzen. Dadurch sollte die Aufnahme schon umgesetzten Fluorochroms so
gering wie möglich gehaltenwerden. Wie in Abb. 10 gezeigt, war eine Stunde ausreichend,
um DAF-2 DA in ausreichendem Maß in die Zellen diffundieren zu lassen. Vor der Zugabe
des Fluorochroms wurden die Ansätze zunächst zentrifugiert und dekantiert. Im Anschluss
erfolgte ein Waschvorgang (Resuspension, Zentrifugation – 200 xg, 4 min, 4°C – Dekantierung) mit 150 µl PBS. Die Zellen wurden erneut in 150 µl PBS resuspendiert. Die Zugabe des
Fluorochroms erfolgte nun so, wie auf Seite 67 beschrieben. Die damit maximal erreichte
Fluoreszenz solcher parallel angesetzter Zellkulturen war nahezu identisch (s. Abb. 11).
Allerdings erschienen die über drei Stunden mit dem Fluorochrom inkubierten MNC einiger
Tiere als zwei unterschiedlich stark fluoreszierende Populationen (s. Abb. 11, graue Linie),
79
Ergebnisse
was im Fall der Dauerinkubation nicht beobachtet werden konnte (s. Abb. 11, schwarze
Linie).
SEA
Ereignisse
Medium
Fluoreszenzintesiät
Abb. 11 Fluoreszenz unstimulierter und stimulierter MNC nach der Inkubation mit
DAF-2 DA über unterschiedliche Zeiträume
In diesen zwei Histogrammen wird die mittlere Fluoreszenz boviner Makrophagen nach der
Inkubation über unterschiedliche Dauer mit DAF-2 DA dargestellt. Die Gesamtinkubationszeit betrug
24 h, wobei die Zugabe des Fluorochroms DAF-2 DA entweder sofort (schwarze Linien) oder drei
Stunden vor der Messung erfolgte (graue Linien). In der linken Abbildung werden die
Fluoreszenzintensitäten der unstimulierten und in der rechten die SEA-stimulierten Zellen aufgeführt.
Um zu prüfen ab welchem Zeitpunkt nach in vitro Stimulation sich durchflusszytometrisch
eine NO-Bildung nachweisen lässt, wurden MNC eines Tieres ein bis drei Tage in vitro
stimuliert (s. Abb. 12) Da sich die Monozyten während der dreitägigen Inkubationszeit
morphologisch so veränderten, dass sie nicht mehr als einheitliche Population vorlagen,
wurden ausschließlich Lymphozyten durchflusszytometrisch ausgewertet. Die Stimuli PWM
und SEA bewirkten zu allen drei Zeitpunkten eine messbare Steigerung der
Fluoreszenzintensität (NO-Synthese) gegenüber den unstimulierten Ansätzen; am deutlichsten
war dies an Tag drei nach PWM-Stimulation zu beobachten.
80
Ergebnisse
Grünfluoreszenz (FL-1)
25
20
15
10
5
0
D1
D2
D3
Inkubationszeit
Ohne Stimulus
PWM
SEA
Abb. 12 Fluoreszenzintensität stimulierter Lymphozyten nach Inkubation mit 1 µM
DAF-2 DA
Bovine MNC (1 x 105) wurden in vitro mit SEA (1 ng/ml) oder mit PWM (1 µg/ml) stimuliert. Zellen
ohne Stimulus dienten als Kontrolle. Jeweils 3 Stunden vor der Messung an Tag 1 (D1), Tag 2 (D2)
oder Tag 3 (D3) wurden die Zellen abzentrifugiert und mit 1 µM DAF-2 DA inkubiert. Die
durchflusszytometrische Messung der Lymphozytenfluoreszenz erfolgte mit identischen
Geräteeinstellungen. Mittelwerte ± S aus Triplikaten.
Nitritbestimmung auf Einzelzellebene in Makrophagen
Aus den Vorversuchen wurden die Kulturbedingungen zur Bestimmung der NO-Bildung von
Makrophagen abgeleitet. Es wurden 100 µl einer Zellsuspension (1 x 106 Zellen/ml) pro
Ansatz in die Vertiefungen pipettiert. Der Zusatz von jeweils 25 µl der einzelnen Stimuli
erfolgte anschließend. Parallel wurden Ansätze mit und ohne DAF-2 DA durchgeführt. Die
eingesetzten DAF-2 DA Konzentrationen betrugen 0,1 µM und 1 µM. Drei Stunden vor der
Ernte wurden die Überstände der ohne DAF-2 DA inkubierten Zellkulturen gewonnen und in
aliquoten Teilen zu je 300 µl in Eppendorfcups bei -20°C gelagert. Zu den Ansätzen ohne
DAF-2 DA wurden nach einmaligem Waschen (Resuspension, Zentrifugation – 220 xg,
4 min, 4°C – Dekantierung) mit PBS und anschließender Resuspension in 150 µl PBS 25 µl
des Fluorochroms zugesetzt.
81
Ergebnisse
A) Phagozytose
400
Rotfluoreszenz (FL-3)
350
300
250
200
150
100
50
0
Medium
Medium
+l-Arginin
Bakterien
Bakterien
+l-Arginin
B) NO-Produktion
Grünfluoreszenz (FL-1)
700
650
600
550
500
450
Tier 1
Tier 2
Tier 3
Tier 4
400
350
300
Medium
Medium
+l-Arginin
Bakterien
Bakterien
+l-Arginin
Abb. 13 Vergleich der durchflusszytometrisch erfassten Phagozytose von
Staphylokokken an Hand der NO-Produktion durch bovine Makrophagen
Makrophagen wurden 18 h mit opsonisierten, PI-markierten Bakterien bei 38,5°C und 5% CO2 in vitro
inkubiert. Parallelansätze enthielten keine Bakterien. Einem Teil der Ansätze wurde L-Arginin
zugesetzt (1 mM) A) Die Phagozytose rotfluoreszierender Staphylokokken wurde durchflusszytometrisch im FL-3-Kanal erfasst. B) stellt den Vergleich zur Extinktion grünfluoreszierenden
Lichts durch umgewandeltes DAF-2 DA nach Bindung an NO dar. Zellen wurden nach Zentrifugation
in 175 µ1 DAF-2 DA (1 µM) aufgenommen und für 3 h bei 38,5°C und 5% CO2 inkubiert. Die
Fluoreszenzintensität der Zellen wurde im FL-1-Kanal erfasst.
Durch die Stimulation boviner MDM mit PI-markierten, opsonisierten Bakterien wurde eine
Steigerung der Fluoreszenzintensität erreicht, die Bakterien wurden demnach phagozytiert
(s. Abb. 13 A). Zugegebenes L-Arginin hatte darauf keinen erkennbaren Einfluss. Die parallel
dazu durchgeführte intrazelluläre NO-Messung wies nur einen leichten Anstieg der NOProduktion bei phagozytierenden Makrophagen auf (s. Abb. 13 B). Zwei von vier Tieren
82
Ergebnisse
reagierten wesentlich stärker auf den Stimulus. Hier hatte auch L-Arginin, das zu NO
umgesetzt wird, auf die Menge des gebildeten fluoreszierenden DAF-2 T (Triazolfluoreszein,
s. S. 67) einen stärkeren Einfluss als bei den anderen beiden Tieren. Makrophagen scheinen
also nach eintägiger Inkubationsdauer NO gebildet zu haben, wobei die Zugabe eines
Stickstoff-Donors auf die Menge förderlich zu wirken scheint.
In einem vergleichbaren Ansatz mit Makrophagen zweier Tiere konnte eine NO-Bildung nach
bis zu zweitägiger Stimulation mit CpG-WB, CpG 1668 oder SEA (s. S. 45) nicht
nachgewiesen werden. Auffallend war das generelle Absinken der Fluoreszenz (der umgesetzten DAF-2 DA Menge) nach eintägiger Inkubation im Vergleich zu den 3 h inkubierten
Zellen (s. Tab. 6). Nach zweitägiger Inkubation lag die durchschnittliche Fluoreszenz wieder
im Bereich der nach drei Stunden gemessenen Ansätze (3 h unstimuliert: 56 Einheiten; D2
unstimuliert: 62 Einheiten). Eine Steigerung der Fluoreszenz durch Stimulation konnte
lediglich nach eintägiger Inkubation erreicht werden. Hier stieg sie von 18 Einheiten im
Kontrollansatz bis auf 32 Einheiten nach CpG 1668-Zugabe. Zum letzten Messzeitpunkt lag
durch die Stimulation mit CpG 1668 eine Senkung um ein Drittel der Extinktion der
Mediumkontrolle vor. Ein eindeutiger Nachweis der CpG- oder SEA-vermittelten NOProduktion in bovinen Makrophagen war somit nicht zu erbringen.
Tab. 6
Durchflusszytometrischer Nachweis von NO in Makrophagen nach
Stimulation mit CpG-Motiven und SEA
Stimulus
Medium
CpG-WB
CpG 1668
SEA
3h
56±23
51±19
56±23
55±23
24 h
18±11
23±10
32±18
26±13
48 h
61±28
60±24
40±7
67±29
Stimulationsdauer
In vitro generierte Makrophagen wurden über unterschiedliche Zeiträume mit zwei CpG-Motiven
(5 µg/ml) oder SEA (1 ng/ml) stimuliert. Die DAF-2 DA-Zugabe erfolgte jeweils 3 h vor der
Messung. Mittelwerte ± S (von Triplikaten) der mittleren Fluoreszenzintensitäten; einem Maß für die
durch NO umgesetzte Menge an DAF-2 DA werden als Differenz zum Kontrollansatz ohne Stimulus
(Mediumkontrolle) angegeben.
83
Ergebnisse
Nitritbestimmung in Überständen durch Griess-Reagenz im Vergleich zur
Einzelzellmessung mit DAF-2 DA
Um die Zuverlässigkeit der Methode der intrazellulären Nitritbestimmung mittels DAF-2 DA
beurteilen zu können wurden Überstände der Proben mit Griess-Reagenz auf Nitrit untersucht
(s. S. 68). Es wurden ausschließlich Proben, die ohne das Fluorochrom inkubiert waren,
verwendet. In den Überständen unstimulierter Mediumkontrollen wurden zwischen 0,1 µM
und 0,2 µM Nitrit nachgewiesen (s. Tab. 7). Dieser Wert stieg nach SEA-Stimulation der
Zellen auf das Doppelte. Die mittlere Fluoreszenz der Lymphozyten wies keinen
kontinuierlichen Anstieg mit der Inkubationszeit auf. Bei allen drei untersuchten Tieren lag
die mittlere Fluoreszenzintensität der Lymphozyten an D2 unter der an D1 und D3 (s. Tab. 7).
Dennoch lässt sich gegenüber der Mediumkontrolle in den SEA-stimulierten Ansätzen
ebenfalls eine Verdopplung der Werte an Tag drei der in vitro Kultur feststellen. Die Korrelation zur Nitrit-Messung im Überstand hat auch Bestand wenn die Werte von D1 und D3
miteinander vergleichen werden. Ein etwa vierfacher Anstieg der Nitritbildung in den SEAstimulierten Ansätzen spiegelte sich in einem vierfachen Anstieg der Fluoreszenzintensität
wieder.
Tab. 7
Vergleich der zwei Methoden der NO-Bestimmung
DAF-2 DA
FL der Lymphozyten
Griess-Reagenz
Anteil der FL-starken
NO2 (µM)
Lymphozyten (%)
D1
D2
D3
D1
D2
D3
D1
D2
D3
Med
12±4
4±1
35±15
17±19
10±12
19±26
0,1±0,1
0,2±0,2
0,2±0,2
SEA
14±4
7±2
58±12
21±23
17±20
34±38
0,1±0,0
0,2±0,1
0,4±0,2
Von drei Tieren wurden frisch isolierte MNC mit 1 ng/ml SEA oder ohne Stimulus (Med) über ein bis
drei Tage inkubiert. Die DAF-2 DA-Zugabe erfolgte jeweils 3 h vor der Messung. Gezeigt werden die
mittlere Fluoreszenzintensität, der Anteil stark fluoreszierender Lymphozyten an der
Gesamtpopulation und die mit dem Griess-Reagenz gemessenen Nitritgehalte der Überstände. Die
Überstände wurden 3 h vor der Messung gewonnen und bis zur photometrischen Auswertung bei
-20°C gelagert (s. S. 81). FL = Fluoreszenzintensität.
Insgesamt ließen sich in vitro generierte Makrophagen und MNC nur zu einer geringen NOProduktion anregen. Weder durch CpG-Motive noch durch das Superantigen SEA konnten
signifikante Differenzen der produzierten Mengen nachgewiesen werden. Die hier entwickelte
Methode des intrazellulären Nachweises von NO mittels eines Fluorochroms erwies sich als
84
Ergebnisse
nicht empfindlich genug, um geringe Mengen induzierten NOs verlässlich und reproduzierbar
zu erfassen.
4.2 Bindung von DNA-Motiven an bovine leukozytäre Zellen und
in vitro generierte Makrophagen
Ausgangspunkt für diese initialen Studien waren CpG-Motive, die als immunstimulatorisch
für das Rind beschrieben wurden (BROWN et al. 1998). Es sollte ein Verfahren verwendet
werden, das schnell zu zuverlässigen Ergebnissen führt und einen ersten Eindruck vermittelt,
mit welchen Zellen des bovinen Immunsystems eine direkte Interaktion der CpG-Motive
erwartet werden kann.
4.2.1
Klassischer Bindungsnachweis
Hier wurde geprüft, ob die verwendeten CpG-Sequenzen (biotin-gekoppelt) eine Bindung an
selektive zelluläre Populationen aufweisen. Dafür wurde eine an DNA-Motive angepasste
Methode der klassischen Membranimmunfluoreszenz verwendet (s. S. 69).
Es konnte eine Bindung von CpG-Motiven an alle getesteten Zellarten gezeigt werden.
Lymphozyten wiesen unterschiedlich starke Bindungspotentiale auf: unterschieden werden
konnten stark und schwach positive Fraktionen. Eine eindeutige Trennung war nicht möglich,
da mit steigender Konzentration des biotinylierten CpG-Motivs (CpG-WB biot) die
Populationen ineinander übergingen (Abb. 14). Schon ab 5 µg/ml CpG-WB biot war eine
Steigerung der mittleren Fluoreszenz zu erkennen (Tab. 8). Gegenüber den Kontrollansätzen
stieg bei einer Konzentration von 10 µg/ml die stark positive Fraktion um das Doppelte an,
bei 50 µg/ml auf etwa das Dreifache (Tab. 8). Die CpG-Bindungskapazität von Monozyten
schien stärker als die der Lymphozyten zu sein (Abb. 14). Neutrophile Granulozyten banden
ebenfalls das biotinylierte CpG-Motiv (s. Tab. 8, Abb. 14). Eosinophile Granulozyten wiesen
wegen ihre höheren Eigenfluoreszenz durch die Bindung von CpG-WB biot keine gesteigerte
Fluoreszenz auf (s. Tab. 8).
85
Ergebnisse
Tab. 8
Bindungsstärke eines biotinylierten CpG-Motivs an einzelne bovine
Zellpopulationen
Bindungs-
Konzen-
stark positive
partner
tration
Zellen (%)
mittlere Fluoreszenzintensität
Lymphozyten
Monozyten
Neutrophile
Eosinophile
ohne
8±2
3±0
2±0
20±3
Konjugat
8±2
3±0
2±0
15±2
5 µg/ml
10±4
4±1
3±1
16±2
10 µg/ml
12±5
5±1
4±1
16±2
15 µg/ml
14±6
7±1
4±1
16±2
20 µg/ml
15±4
8±1
5±1
17±2
25 µg/ml
15±4
8±2
5±1
17±2
50 µg/ml
21±4
13±4
7±2
18±2
CpG-WB biot
Es wurden Mittelwerte ± S (Zellen von 5 Tieren) der Anteile stark positiver Lymphozyten oder die
mittleren Fluoreszenzintensitäten von Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen dargestellt.
Ohne = Zellen ohne CpG-Motiv und Streptavidin-PE; Konjugat = Ansätze mit Streptavidin-PE allein.
Um die Spezifität der Bindung für CpG-Motive zu testen, wurden Zellen mit 10 µg/ml nichtbiotinyliertem CpG-WB oder GpC-WB für 30 min vorinkubiert, bevor das biotinylierte CpGMotiv (10 µg/ml) dazugegeben wurde. Als Kontrollen dienten nicht vorinkubierte bzw. nur
mit Konjugat inkubierte Zellen. Sowohl CpG-WB als auch GpC-WB schienen die Bindung
des biotinylierten CpG-Motivs auf Monozyten und PMN zu hemmen: Die
Fluoreszenzintensität wurde bei Monozyten von 14 auf 9 gegenüber den nicht vorinkubierten
Zellen gesenkt, wobei die Fluoreszenz der Konjugatkontrollen bei 4 lag (Daten nicht gezeigt).
Aufgrund der geringen Tierzahl können diese Werte nicht als gesichert angesehen werden.
86
Ergebnisse
Konjugat
5 µg/ml
A)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
CpG-WB biot
20 µg/ml
50 µg/ml
Fluoreszenzintensität
B)
Fluoreszenzintensität
Abb. 14 Fluoreszenzintensitäten einzelner boviner Zellpopulationen nach Inkubation
mit einem biotinyliertem CpG-Motiv (CpG-WB biot)
Durchflusszytometrische Analyse (Punktediagramme; FL-2/SSC) boviner mononukleärer Zellen (A)
und Granulozyten (B) nach Membranfluoreszenztest mit unterschiedlichen Konzentrationen eines
biotinylierten CpG-Motivs. A) oben: Monozyten; unten: lymphoide Zellen. B) links: neutrophile
Granulozyten; rechts: eosinophile Granulozyten. Konjugat: Kontrollansatz mit Streptavidin-PE.
4.2.2
Alternativer Bindungsnachweis mittels Amplifikation
Da sich die Bindung des biotinylierten CpG-Motivs als schwach erwies wurde ein
kommerzielles Amplifizierungsverfahren (Flow-AMP®, s. S. 70) eingesetzt.
Methodische Vorarbeiten
Mit dem Originalverfahren (laut Herstellerangaben) konnte eine Steigerung der Fluoreszenz
gegenüber der herkömmlichen Membranfluoreszenz um das 10- bis 100-fache erreicht
werden (s. Tab. 9). Eine mittlere Fluoreszenzintensität der Monozyten von 3 nach klassischer
Inkubation mit CpG-WB biot/Streptavidin-PE wurde beispielsweise durch das Flow-AMP®
System auf 299 steigert.
Weil das Originalverfahren nur eine geringe Ausbeute an Ansätzen zuließ und zusätzlich das
Verfahren in den großen Behältnissen relativ material- und arbeitsaufwendig war, wurde das
87
Ergebnisse
Originalverfahren verändert. Durch das modifizierte Verfahren konnte eine dem Originalprotokoll ähnliche Amplifikation erreicht werden (s. Tab. 9), obgleich die mittleren Fluoreszenzintensitäten zumeist niedriger lagen (Fluoreszenzsteigerung der Monozyten von 4 auf
lediglich 147).
Tab. 9
Vergleich der Fluoreszenzintensität nach klassischer Membranfluoreszenz
und alternativer Verwendung des Flow-AMP-Systems
Lymphozyten
Protokoll:
Original
A)
B)
Konjugat
Monozyten
Modifiziert
Original
A)
B)
A)
2±0
2±0
Modifiziert
B)
A)
B)
4±0
5±0
Kontrolle
2±0
2±1
2±0
2±0
3±0
13±0
4±0
5±0
CpG-WB biot
2±0
96±10
2±0
48±45
3±0
299±23
4±0
147±113
Frisch isolierte MNC wurden parallel mit der klassischen Membranfluoreszenz (A) und dem FlowAMP-System (B) entweder nach dem Original- oder dem modifizierten Protokoll (s. S. 70) auf die
Fähigkeit der Bindung von DNA-Sequenzen untersucht (Mittelwerte ± S der Fluoreszenzintensitäten
von 2 Tieren). Kontrolle = Inkubation mit einem irrelevanten, biotinylierten Sekundärantikörper
(Ziege-anti-Hund IgG)
Bestimmung der CpG-bindenden Zellpopulationen mit dem Flow-AMP®-System
Nach der Etablierung der Methode wurden die mononukleären Zellen des Blutes auf ihre
Kapazität zur Bindung von CpG-Motiven (CpG-WB und GpC-WB) getestet. Die mittlere
Fluoreszenzintensität der Lymphozyten konnte nun um 20 Einheiten durch CpG-WB
gegenüber der Isotypkontrolle gesteigert werden (s. Tab. 10). GpC-WB wurde in identischem
Ausmaß gebunden. Die CpG-Bindungskapazität boviner Monozyten erwies sich wiederum
stärker als die der lymphoiden Zellen. Dies äußerte sich sowohl in einer stärkeren mittleren
Fluoreszenzintensität der Gesamtpopulation als auch in einem höheren Anteil der stark
positiven Zellen.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass sowohl Lymphozyten als auch Monozyten CpG-WB
und das reverse GpC-Motiv binden, wobei die Bindungsstärke der Monozyten größer ist, als
die der Lymphozyten.
88
Ergebnisse
Tab. 10
CpG- und GpC-WB Bindungskapazität durch Lymphozyten und Monozyten
Lymphozyten
Monozyten
MFI
stark positive (%)
MFI
stark positive (%)
Konjugat
7±8
6±8
15±3
10±10
Kontrolle
7±5
11±4
16±3
26±10
CpG-WB biot
27±32
25±5
81±9
60±15
GpC-WB biot
26±27
26±4
77±9
57±13
Mononukleäre Zellen des Blutes wurden mit dem Flow-AMP®-System nach der Inkubation mit einem
CpG- oder einem reversen GpC-Motiv gefärbt. Dargestellt sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten
(MFI) ± S (vier Tiere) der Gesamtpopulation, sowie der Anteil stark bindender Subpopulationen.
Kontrolle = Inkubation mit einem irrelevanten, biotinyliertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Hund
IgG)
In vitro generierte Makrophagen konnten in zwei Populationen unterschieden werden, die in
unterschiedlicher Stärke DNA banden (s. Tab. 11). Die negative Population hatte nach der
Inkubation mit GaM biot (Kontrollansatz) eine mittlere Fluoreszenzintensität von 12. Nach
Inkubation mit CpG-WB biot oder GpC-WB biot stieg die mittlere Fluoreszenz um das dreibzw. vierfache an (s. Tab. 11). Durch beide Sequenzen leuchteten 12% bzw. 13% der
Makrophagen eindeutig stärker, als die Kontrollen. Ihre Fluoreszenz stieg maximal bis auf
328 (CpG-WB biot).
Tab. 11
DNA-Bindungskapazität boviner in vitro generierter Makrophagen
Mittlere Fluoreszenzintensität
(MFI)
stark positive
(%)
Gesamtpopulation
neg. Mph
pos. Mph
Kontrolle
12±3
12±4
101±15
0
CpG-WB biot
58±38
49±35
328±235
12±4
GpC-WB biot
38±10
31±11
176±24
13±3
In vitro generierte Makrophagen wurden nach 6-tägiger Inkubation gewonnen und mit dem
modifizierten Verfahren des Flow-AMP®-Systems auf die Fähigkeit, DNA-Sequenzen zu binden,
untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S von zwei Tieren. Kontrolle = Inkubation mit einem
irrelevanten, biotinyliertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Hund IgG).
89
Ergebnisse
Doppelfluoreszenz
Mittels Doppelfluoreszenz-Ansätzen sollten die zur Bindung der CpG-Motive befähigten
Subpopulationen genauer bestimmt werden. Besonderer Wert wurde dabei auf die
verschiedenen Teilpopulationen der Lymphozyten gelegt.
Nach Inkubation mit Bo139 war ein Anteil von 40% der Lymphozyten MHC-Klasse-II
positiv. 30% dieser Zellen banden CpG-WB biot. GpC-WB biot wurde lediglich von 17% der
MHC-Klasse-II exprimierenden Zellen gebunden (s. Abb. 15). Monozyten banden zu 36%
sowohl CpG-WB bzw. 21% GpC-WB als auch Bo139 (Daten nicht gezeigt). Auch eine
Subpopulation der CD4+ positiven Zellen band DNA-Motive. Zwischen 31% und 41% der
MNC banden in dieser Studie IL-A11. Ca. 19% der CD4+ positiven Zellen banden CpG-WB
und sogar 35% dieser das reverse GpC-Motiv (s. Abb. 15). Die nicht CD4+ exprimierenden
Lymphozyten wiesen eine CpG-Bindung von 11% und eine GpC-Bindung von 22% auf. In
den Monozyten spiegelte sich die stärkere Bindung des GpC-Motivs ebenfalls wieder. Hier
waren 24% der Zellen sowohl CD4+ exprimierend als auch GpC-WB bindend (Daten nicht
gezeigt). Es lag somit eine tendenziell stärkere CpG-Bindung an MHC-Klasse-II positiven
Zellen vor. Eine selektive Bindung des GpC-Motivs war nicht festzustellen.
90
Ergebnisse
A)
34%
5%
2%
2%
IL-A11
(anti-CD4)
Bo139
(anti-MHC-Klasse II)
39%
5%
GaM biot (Kontrollansatz)
B)
33%
12%
11%
8%
IL-A11
(anti-CD4)
Bo139
(anti-MHC-Klasse II)
28%
7%
CpG-WB biot
C)
7%
10%
20%
11%
IL-A11
(anti-CD4)
Bo139
(anti-MHC-Klasse II)
33%
15%
GpC-WB biot
Abb. 15 Durchflusszytometrische Analyse von Doppelfluoreszenzen nach Markierung
lymphoider Zellen mit MHC-Klasse-II- oder CD4-spezifischen Antikörpern
und biotinyliertem CpG- oder GpC-Motiv
Diese Punktediagramme zeigen A) Kontrollansätze mit Ziege anti-Maus-IgG biot B) Doppelfluoreszenzen mit CpG-WB biot C) Doppelfluoreszenzen mit dem reversen GpC-WB biot, die entweder mit
dem mAk Bo139 (MHC-Klasse-II-spezifisch) oder mAk IL-A11 (CD4-spezifisch) inkubiert wurden.
91
Ergebnisse
4.2.3
Prüfung der Internalisierung biotinylierter DNA-Sequenzen
Gebundene DNA-Motive konnten rasch internalisiert werden. Um dies zu prüfen wurden
intrazelluläre Fluoreszenztests nach 5 bis 30-minütiger Inkubation der Zellen mit den Motiven
durchgeführt (s. S. 71).
Die DNA-Motive wurden von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten internalisiert. Ein
Unterschied zwischen dem CpG-Motiv und dem reversen GpC-Motiv bestand nicht (s. Tab.
12). Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der positiven Lymphozyten stiegen bspw.
gegenüber dem Kontrollansatz von 30 auf etwa 50; bei Monozyten von 50 auf bis zu 80
(s. Tab. 12). Die Aufnahme durch Granulozyten zeigte sich in einer Verdopplung der
mittleren Fluoreszenzintensität der Gesamtpopulation (s. Tab. 12). Die Aufnahme erfolgte
rasch - bereits nach 5 min (Monozyten, Granulozyten), spätestens nach 15 min
(Lymphozyten) waren die Werte durch eine weitere Verlängerung der Inkubationszeiten nicht
mehr zu steigern.
Tab. 12
Mittlere Fluoreszenzintensitäten nach Inkubation leukozytärer Zellen für
verschiedene Zeiten mit biotinylierten DNA-Sequenzen und intrazellulärer
Fluoreszenz
Fluoreszenzintensität
der Gesamtpopulation
Pos. Subpopulation (%)
5
15
30
5
15
30
Kontrolle
2±1
2±0
2±0
26±1
32±1
33±9
CpG-WB biot
3±1
2±0
2±0
44±2
49±4
48±4
GpC-WB biot
3±1
3±1
2±0
46±7
57±16
52±8
Kontrolle
3±0
3±1
3±1
45±5
55±10
55±23
CpG-WB biot
8±3
13±4
13±3
71±3
66±9
63±7
GpC-WB biot
8±2
9±4
9±2
79±3
80±9
73±8
Kontrolle
4±1
3±0
4±0
26±4
27±4
24±7
CpG-WB biot
7±1
8±2
8±0
27±1
25±1
23±1
GpC-WB biot
6±0
7±2
6±0
30±3
27±1
27±2
Minuten:
Lymphozyten
Monozyten
Granulozyten
Die intrazelluläre Fluoreszenz wurde nach Inkubation der Zellen für verschiedene Zeiten wie auf Seite
71 beschrieben durchgeführt. Dargestellt sind die Mittlerwerte ± S aus zwei Tieren. Kontrolle:
biotinylierter Ziege anti-Maus-IgG.
92
Ergebnisse
4.3 Prüfung der Proliferation induzierenden Potenz von CpGMotiven auf bovine mononukleäre Zellen in vitro
Ausgehend von der Beobachtung, dass CpG-Motive bovine B-Zellen in vitro stimulieren
(BROWN et al. 1998) wurde im Folgenden geprüft, inwieweit sich verschiedene Motive in
ihrer Proliferation induzierenden Potenz unterscheiden und in welchem Ausmaß interindividuelle Unterschiede in der Stimulierbarkeit durch CpG-Motive zu beobachten sind. Das
Read-Out-System der funktionellen Prüfung bestand in der durchflusszytometrischen
Erfassung der Proliferationsinduktion mononukleärer Zellen und der Quantifizierung blastisch
transformierter Zellen (s. S. 64 und Abb. 5). Die Konzentrationen der verwendeten CpGMotive lag bei 5 µg/ml.
4.3.1
Proliferative Eigenschaften von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA
Weder durch das Superantigen SEA noch durch die eingesetzten DNA-Motive wurde nach
viertägiger in vitro Kultur die Gesamtzahl vitaler Zellen gegenüber den unstimulierten
Ansätzen verändert. Allenfalls war eine marginale Steigerung auf 105% bis 108% durch die
drei verwendeten CpG-Motive zu erkennen. Nach sechs Tagen in vitro galt dies weiterhin für
die DNA-Motive, während nach SEA-Stimulation ein deutlicher Anstieg auf 121%±24 zu
beobachten war.
Waren SEA und DNA-Motive gleichzeitig anwesend, so konnten zwei StimulusKombinationen (SEA+GpC-WB und SEA+CpG 1668) die Vitalität gegenüber der Mediumkontrolle an Tag vier und alle drei verwendeten Kombinationen (auch SEA+CpG-WB) an
Tag sechs signifikant steigern. Zudem führten die beiden erstgenannten
Stimuluskombinationen ebenfalls gegenüber der SEA-Stimulation zu einem signifikanten
Anstieg der Zahl vitaler Zellen (s. Tab. 13).
93
Ergebnisse
Tab. 13
Zahl vitaler Zellen nach 4- und 6-tägiger Inkubation mit CpG-Motiven und
dem Superantigen SEA
4-tägige Inkubation
MW±S
P1
6-tägige Inkubation
P2
MW±S
P1
P2
Medium
100
100
CpG-WB
105±11
103±8
GpC-WB
106±13
103±7
CpG1668
108±17
107±9
0,020
SEA
102±11
121±24
0,008
SEA+ CpG-WB
110±21
130±27
0,002
SEA+ GpC-WB
116±21
0,02
0,04
128±27
0,003
0,04
SEA+ CpG1668
117±23
0,02
0,05
138±37
0,003
0,04
Die Zahl vitaler Zellen in der Mediumkontrolle nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultivierung der
mononukleären Zellen wurde gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Zellen in den
Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt. Mittelwerte ± S (13 Tiere). P1 = Signifikanz berechnet
zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur Stimulation mit SEA.
Die relative, im Vergleich zur Mediumkontrolle ermittelte Blastenzahl wurde durch alle
eingesetzten DNA-Motive, SEA und die Kombinationen aus SEA und DNA-Motiven nach
vier- und sechstägiger Kultur signifikant gesteigert (s. Tab. 14). Im Vergleich zum
Superantigen erwiesen sich die DNA-Motive allerdings als nur schwach Blasten induzierend.
So lag beispielsweise an Tag vier eine Steigerung durch SEA auf 596% vor (s. Tab. 14),
während die eingesetzten CpG-Motive zu einer Steigerung auf lediglich 138% bis 196%
führten. Die Effekte der Koinkubation von Zellen mit SEA und CpG-Motiven erwiesen sich
in der Regel als additiv. Führte SEA an Tag sechs zu einer Steigerung der Blastenzahl auf
1019% (im Vgl. zur Mediumkontrolle) und das CpG-Motiv 1668 zu einer Steigerung auf
146%, so führte die Koinkubation mit SEA und dem CpG-Motiv zu einer Steigerung auf
1346%.
Steigerte sich die SEA-induzierte Blastogenese von Tag vier nach Tag sechs um das
Doppelte, so konnte nur durch das Motiv CpG-WB eine marginal Steigerung von 196% auf
241% beobachtet werden (s. Tab. 14).
94
Ergebnisse
Tab. 14
Zahl vitaler Blasten nach 4- und 6-tägiger Inkubation mit CpG-Motiven und
dem Superantigen SEA
4-tägige Inkubation
MW±S
P1
6-tägige Inkubation
P2
MW±S
P1
P2
Medium
100±00
100±0
CpG-WB
196±55
< 0,0001
241±113
< 0,0008
GpC-WB
138±15
< 0,0001
131±16
< 0,0001
CpG1668
147±34
< 0,0004
146±34
< 0,0004
SEA
596±157
< 0,0001
1091±652
< 0,0001
SEA+ CpG-WB
674±249
< 0,0001
1177±728
< 0,0002
SEA+ GpC-WB
702±221
< 0,0001
1171±686
< 0,0001
0,04
SEA+ CpG1668
739±257
< 0,0001
1346±921
<0,0004
0,03
0,03
Die Zahl vitaler Blasten in der Mediumkontrolle nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultivierung der
mononukleären Zellen wurde gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Blasten in den
Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt. Der Anteil Blasten an D4 in den Kontrollansätzen betrug
zwischen 3 und 8% aller vitalen Zellen und zwischen 4 und 12% an D6. Mittelwerte ± S (13 Tiere).
P1 = Signifikanz berechnet zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur SEA-Stimulation.
Um Aktivierungsprozesse zu erfassen, die sich nach vier bis sechs Tagen in vitro nicht in
einer Blastogenese äußern, wurde über die Messung des Parameters FSC die mittlere Größe
der vitalen mononukleären Zellen bestimmt.
Sowohl nach vier als auch nach sechs Tagen waren signifikante Größenzunahmen der
Gesamtpopulation nach CpG-Stimulation erkennbar (s. Tab. 15), die jedoch schwächer waren,
als die durch SEA induzierten. An D6 bspw. hatten die unstimulierten MNC eine relative
Größe von 376 Einheiten. CpG-WB inkubierte Zellen wiesen ein durchschnittliches
Vorwärtsstreulicht von 402 und SEA-inkubierte von 515 auf. Kombinationsansätze aus SEA
und DNA-Motiven zeigten keinen signifikanten Unterschied zu Ansätzen mit SEA allein.
(s. Tab. 15). Eine statistische Relevanz war an Tag vier lediglich nach Kostimulation mit
SEA+CpG 1668 zu verzeichnen.
95
Ergebnisse
Tab. 15
Veränderung der durchschnittlichen Zellgröße (FSC) nach 4- und 6-tägiger
Inkubation mit CpG-Motiven und dem Superantigen SEA
4-tägige Inkubation
MW±S
P1
6-tägige Inkubation
P2
MW±S
P1
Medium
377±08
CpG-WB
397±14
< 0,0002
402±18
< 0,0001
GpC-WB
385±12
< 0,0003
383±17
< 0,0001
CpG1668
385±09
< 0,0002
385±20
< 0,0005
SEA
469±38
< 0,0001
515±33
< 0,0001
SEA+ CpG-WB
469±37
< 0,0001
512±38
< 0,0001
SEA+ GpC-WB
470±36
< 0,0001
516±26
< 0,0001
SEA+ CpG1668
478±41
< 0,0001
524±45
< 0,0001
P2
376±15
0,03
Nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultur wurden die Zellen durchflusszytometrisch erfasst und die
mittlere Größe der vitalen Zellen anhand des Vorwärtsstreulichtsignals bestimmt Mittelwerte ± S
(13 Tiere). P1 = Signifikanz berechnet zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur SEAStimulation.
4.3.2
MHC-Klasse-II-Expression in vitro stimulierter boviner
mononukleärer Zellen des Blutes
Durch die Bestimmung der MHC-Klasse-II-Expression auf vier bis sechs Tage mit
unterschiedlichen Stimuli inkubierten Lymphozyten sollte zum einen der Einfluss der Stimuli
auf die Expressionsdichte und zum anderen die proliferierende Subpopulation bestimmt
werden.
Sowohl nach vier- als auch nach sechstägiger Inkubationsdauer konnten in den unstimulierten
und CpG-stimulierten Ansätzen stark und schwach MHC-Klasse-II-exprimierende Zellen
unterschieden werden. Eine Teilpopulation der fluoreszenzschwachen Zellen wies an Tag vier
nach CpG-Stimulation eine höhere Expressionsstärke auf, wohingegen die fluoreszenzstarken
Zellen unbeeinflusst blieben (s. Abb. 16 A). An Tag sechs wiesen die stark MHC-Klasse-IIexprimierenden Zellen eine Steigerung der Fluoreszenzstärke auf. Nach Stimulation mit SEA
verschwanden an Tag vier die stark MHC-Klasse-II positiven Zellen (s. Abb. 16 B). Der
kostimulatorische Einsatz von SEA und CpG-Motiven führte zu einer deutlichen Steigerung
der MHC-Expression sowohl an Tag vier und Tag sechs der in vitro Kultur (s. Abb. 16 B).
96
Ergebnisse
Tag 4
Tag 6
Messereignisse
A)
Fluoreszenzintesität
Messereignisse
B)
Fluoreszenzintesität
Abb. 16 MHC-Klasse-II-Expression boviner MNC nach 4- bzw. 6-tägiger in vitro
Stimulation mit CpG-Motiven und SEA, sowie Kombinationen
Nach 4-tägiger (linke Spalte) und 6-tägiger Inkubation (rechte Spalte) mononukleärer Zellen wurde
mittels Membranimmunfluoreszenz die MHC-KLASSE-II-Expression bestimmt (mAk Bo139). A)
Zur Stimulation wurden einzelne CpG-Motive (CpG-WB, GpC-WB und CpG 1668) eingesetzt. Das
gefüllte Histogramm repräsentiert das Expressionsmuster unstimulierter Zellen. B) Hier wurde SEA
(gefülltes Histogramm) oder Kombinationen aus SEA und den einzelnen CpG-Motiven zur
Stimulation eingesetzt (überlagerte Linien). Exemplarisch wird das Expressionsmuster der Zellen
eines Tieres dargestellt.
97
Ergebnisse
4.4 Das beschleunigte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten
in vitro
Im Folgenden sollten geprüft werden, ob CpG-Motive und andere PAMPs (LTA, LPS) einen
direkten und/oder einen indirekten Einfluss auf neutrophile Granulozyten haben. Für diese
Studien wurde eine breitere Palette an DNA-Motiven eingesetzt und zudem das Superantigen
SEA als Referenzstimulus (KRÜGER 2001) verwendet. Aus Vorversuchen mit 10 µg/ml bis
1000 µg/ml LTA und LPS ergab sich eine generell eingesetzte Konzentration von 10 µg/ml
LTA und LPS.
Monokulturen aus PMN mit einem Höchstgehalt von 10% MNC wurden wie auf Seite 65
beschrieben mit PAMPs über 22 h inkubiert. Wegen der interindividuell starken Schwankungen der vitalen Zellen wurden alle Zahlen vitaler PMN auf die Zahl vitaler Zellen in den
Mediumkontrollen bezogen und in Prozent ausgedrückt.
Weiterhin wurde auf die Veränderung der Zellmorphologie geachtet um diesen Parameter als
Maß für eine Interaktion der Neutrophilen mit PAMPs heranziehen zu können.
4.4.1
Effekte von CpG-Motiven, LPS und LTA für reine neutrophile
Granulozyten
Wurden reine Granulozyten (≤ 10% MNC, ≤ 2% Eosinophile) mit CpG-Motiven und SEA
inkubiert, so führte dies bei 9 Tieren im Mittel zu einem Vitalitätsverlust von maximal 10%
(s. Tab. 16). Die stärksten Effekte wurden durch CpG 2007 und SEA erreicht (s. Tab. 16).
In den kostimulatorischen Ansätzen aus SEA und einzelnen CpG-Motiven erwiesen sich die
Vitalitätsverluste als prononcierter und erreichten bis zu 27% (Restvitalität von 73% bei
Einsatz von SEA+CpG 2007, Tab. 16). Die Vitalität der Zellen in sämtlichen kostimulatorischen Ansätzen war signifikant geringer als in der Mediumkontrolle.
Die Komplexität/Granularität der Zellen war nach Inkubation mit den CpG-Motiven
gegenüber den unstimulierten in der Regel unverändert oder nur marginal gesteigert (s. Tab.
16). Bei kombiniertem Einsatz von SEA und den CpG-Motiven divergierten die Effekte.
CpG-WB und GpC-WB inkubierte Neutrophile hatten in Kombination mit SEA eine
geringere Granularität als SEA und Medium inkubierte Zellen. Der Unterschied
kostimulatorisch stimulierter Zellen mit SEA und CpG-WB war signifikant zu SEA
inkubierten Zellen. Weitere Unterschiede waren nicht signifikant.
98
Ergebnisse
Tab. 16
Stimulusabhängiger Vitalitätsverlust und morphologische Veränderungen
reiner Neutrophiler und Neutrophiler in Kokultur mit MNC
Reinkultur PMN
Kokultur PMN/MNC
Vitalität
Granularität
Größe
Vitalität
Granularität
Größe
Medium
100±0 a
535±204 a
294±183 a
100±0 a
523±163 a
374±193 a
CpG-WB
95±13 a
539±206 a
290±175 a
81±13 b
519±159 a
376±184 a
GpC-WB
97±5 a
534±200 a
290±182 a
85±12 b
523±166 a
380±188 a
CpG 1760
96±4 b
541±206 a
296±191 a
71±12 b
518±161 a
380±184 a
CpG 1781
98±9 a
539±203 a
296±191 a
74±14 b
523±162 a
386±192 a
CpG 1826
99±13 a
541±206 a
299±186 a
65±15 b
522±155 a
385±181 a
CpG 1829
97±16 a
538±208 a
300±198 a
67±16 b
526±162 a
390±185 a
CpG 2006
94±6 b
540±209 a
304±198 a
68±14 b
526±164 a
388±185 a
CpG 2007
90±14 a
543±209 a
306±185 a
64±15 b
519±160 a
390±184 a
SEA
90±16 a
542±205 a
287±184 a
52±20 b
492±138 a
366±148 a
SEA+CpG-WB
91±14 b
531±205 b
280±158 a
36±17 c
488±129 b
374±142 a
SEA+GpC-WB
86±17 b
533±200 a
275±142 a
38±17 c
489±131 b
376±144 a
SEA+CpG 1760
86±14 b
538±201 a
289±171 a
32±17 c
485±133 b
375±145 a
SEA+CpG 1781
80±15 c
536±194 a
311±182 a
32±18 c
493±130 b
381±153 a
SEA+CpG 1826
76±20 c
541±190 a
308±178 a
31±17 c
490±129 b
378±141 a
SEA+CpG 1829
81±23 b
545±202 a
307±163 a
30±18 c
496±125 a
380±142 a
SEA+CpG 2006
81±20 c
548±202 a
319±180 b
31±17 c
496±133 a
373±140 a
SEA+CpG 2007
73±23 c
546±204 a
316±161 a
28±20 c
489±131 b
381±147 a
Neutrophile wurden entweder in Reinkultur oder in Kombination mit MNC über 22 h inkubiert und
durchflusszytometrisch quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S der Restvitalität (in Prozent
der Mediumkontrolle), der Granularität (Seitwärtsstreulichtwerte) und der Zellgröße (Vorwärtsstreulichtwerte) von 9 Tieren. Verschiedene Kleinbuchstaben geben die Signifikanzen (p < 0,05)
innerhalb einer Spalte zwischen Mediumkontrolle und stimulierten Ansätzen sowie zwischen SEA und
kostimulatorisch inkubierten Ansätzen.
Die relative Zellgröße stieg durch einige CpG-Sequenzen leicht, aber nicht signifikant an
(s. Tab. 16). SEA besaß einen leicht verkleinernden Effekt. In den kostimulatorischen
Ansätzen wiesen die Effekte die gleiche Richtung auf, wie durch Einzelstimulation. Alleinig
99
Ergebnisse
die Kombination aus CpG 2006 und SEA bewirkte eine signifikante Steigerung gegenüber
sowohl Medium als auch SEA inkubierten Neutrophilen auf 319 Einheiten.
Da verschiedene mikrobielle Moleküle, die sowohl im humanen, als auch im bovinen System
an verschiedenen Rezeptoren binden, gleichgerichtete vitalitäts-mindernde Effekte auf PMN
induzieren, wurden weitere Pathogen-assoziierte Muster geprüft .
Die Überlebensrate von Neutrophilen in reinen PMN-Kulturen unterlag durch LTA keinen
Veränderungen (s. Abb. 17, Monokultur). LPS verminderte die Zahl vitaler Zellen im Mittel
um 14% im Vergleich zur Mediumkontrolle. Kostimulatorische Ansätze mit LPS und CpG
2007 senkten die Restvitalität der reinen Neutrophilen signifikant auf 60%. Andere
kostimulatorische Ansätze besaßen demgegenüber eine weit schwächere vitalitäts-mindernde
Wirkung (s. Abb. 17). Die Granularität und Größe der Neutrophilen wurden durch LTA und
LPS kaum beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
4.4.2
Einfluss von CpG-Motiven, LPS und LTA auf neutrophile
Granulozyten in Kokulturen aus PMN und MNC
In Anwesenheit von MNC reduzierten die eingestetzten CpG-Motiven die Vitalität der
Granulozyten auf bis zu 64% im Vergleich zur Mediumkontrolle (s. Tab. 16). Eine Änderung
der Granularität wurde durch CpG-Motive weit weniger induziert als durch das Superantigen
SEA (CpG 1760: Absekung um 5 Einheiten; SEA: Absenkung um 31 Einheiten, s. Tab. 16).
Wurde die Zellgröße durch die CpG-Motive eher leicht erhöht (bis 16 Einheiten durch CpG
1829 und 2007, s. Tab. 16), so wurde sie durch SEA verringert. Keine der beobachteten
morphologischen Veränderungen erwies sich jedoch als signifikant unterschiedlich zur
Mediumkontrolle (≥0,05).
Alle CpG-Motive führten in Kombination mit SEA zu einer Summierung der zytotoxischen
Effekte für Granulozyten. Die Restvitalitäten der Neutrophilen Granulozyten bewegten sich
über alle geprüften Kombinationsansätze zwischen 28% (SEA+CpG 2007) und 38%
(SEA+GpC-WB) (s. Tab. 16).
Durch LPS wurde die Vitalität der neutrophilen Granulozyten im gleichen Maße wie durch
SEA bzw. CpG 2007 signifikant gesenkt (Restvitalitäten zwischen 69% und 76%; s. Abb. 17,
Kokultur). LTA zeigte keinen Effekt. Wurde mit LTA und CpG 2007 gleichzeitig stimuliert,
so lag die Restvitalität im gleich Bereich der alleinigen CpG 2007 Stimulation (s. Abb. 17,
Kokultur). Die Kombination aus LPS und CPG 2007 erwies sich am potentesten bezüglich
des induzierten Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten (s. Abb. 17), wobei dies im
100
Ergebnisse
Gegegnsatz zu den anderen Stimulus-Kombination bereits in PMN Monokulturen zu
beobachten war (s. Abb. 17, PMN Monokultur).
Vitale Zellen
in % zur Mediumkontrolle
PMN Monokultur
Kokultur (PMN/MNC)
140
140
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
07
20
pG 07
+C 20
A G 7
SE +Cp 200
A G
LT +Cp
S
LP
A
SE
A
LT
S 07
LP 20
G
Cp
07
20
pG 07
+C 20
A G 7
SE +Cp 200
A G
LT +Cp
S
LP
A
SE
A
LT
S 07
LP 20
G
Cp
Abb. 17 Beeinflussung der Vitalität Neutrophiler in PMN Monokulturen und Kokulturen mit MNC nach Stimulation mit PAMPs und PAMP-Kombinationen
Percoll-separierte bovine Granulozyten (1 x 105) wurden in Rein- oder Kokultur mit mononukleären
Zellen (MNC 1 x 105) desselben Tieres in vitro für 22 h inkubiert. Parallelansätze wurden mit SEA,
CpG 2007, LTA bzw. LPS oder mit CpG 2007 kombiniert mit LPS, LTA und SEA zur Stimulation
eingesetzt. Ansätze ohne Stimulus dienten als Kontrolle. Die hierin nach 22 h in vitro ermittelten
Zahlen vitaler Zellen wurden gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Zellen aus den
Stimulationansätzen dazu in Bezug gesetzt (Mittelwerte ± S von 7 Tieren).
101
Ergebnisse
4.4.3
Einfluss von Kulturüberständen CpG-stimulierter mononukleärer
Zellen auf neutrophile Granulozyten
Um zu prüfen ob lösliche Faktoren stimulierter MNC für das beschleunigte Sterben
neutrophiler Granulozyten verantwortlich sind wurden PMN mit Kulturüberständen PAMPaktiverter MNC inkubiert („konditionierte Überstände“).
Alle verwendeten Stimuli (oder Stimuluskombinationen) induzierten in Kulturen stimulierter
MNC die Produktion löslicher Faktoren (s. Tab. 17B). Diese führten zu einem verstärkten
Absterben der Neutrophilen, das vergleichbar dem Absterben der Neutrophilen in PAMPstimulierten Kokulturen aus PMN und MNC war (s. Tab. 17C). Dabei wirkte GpC-WB am
schwächsten - mit einem Vitalitätsverlust von 12% - und die Kombination aus SEA und CpG
2007 am stärksten (63% Verlust). Quantitativ waren die Effekte nach Inkubation reiner PMN
mit PAMP konditionierten Überständen marginal schwächer als die, der Kokulturen; die
Unterschiede erweisen sich jedoch als nicht signifikant.
In der Summe lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass der PAMP-vermittelte
beschleunigte Zelltod neutrophiler Granulozyten nicht von einer Zell-Zell-Interaktion
zwischen Granulozyten und mononukleären Zellen abhängt, sondern durch lösliche Produkte
mononukleärer Zellen vermittelt wird.
102
Ergebnisse
Tab. 17
Vergleich des akzellerierten Zelltods neutrophiler Granulozyten in A)
Reinkulturen mit direkter PAMP-Zugabe, bzw. B) Zugabe konditionierter
Überstände oder C) in PMN/MNC Kokulturen mit direkter PAMP-Zugabe
PMN
PMN/MNC
Reinkulturen
Kokulturen
Zusatz von:
A) Stimulus
B) konditionierte
MNC-Überstände
C) Stimulus
Stimulus
MW±S
MW±S
MW±S
Medium
100±0
100±0
100±0
CpG-WB
103±6
81±11
GpC-WB
99±5
CpG 1760
P1
P2
85±12
0,006
0,024
88±10
89±9
0,028
97±3
82±10
80±12
0,022
0,032
CpG 1781
99±4
83±7
82±12
0,004
0,014
CpG 1826
102±12
76±7
77±16
0,007
0,044
CpG 1829
93±9
81±6
80±15
0,035
CpG 2006
96±6
87±6
80±12
0,047
CpG 2007
94±14
80±12
73±17
SEA
89±12
64±11
65±16
0,010
0,031
SEA+CpG-WB
90±17
48±14
46±16
0,001
0,013
SEA+GpC-WB
89±18
53±19
48±17
0,002
0,013
SEA+CpG 1760
78±16
48±22
41±18
0,009
0,013
SEA+CpG 1781
73±21
41±12
39±18
0,001
0,023
SEA+CpG 1826
78±24
44±17
37±18
0,003
0,008
SEA+CpG 1829
80±24
46±19
38±18
0,007
0,011
SEA+CpG 2006
80±22
47±22
40±17
0,008
0,012
SEA+CpG 2007
72±17
37±24
37±21
0,005
0,008
0,006
0,049
Reine PMN wurden mit den angegebenen Stimuli 22 h in vitro kultiviert (A). Parallelansätze reiner
PMN wurden mit Kulturüberstanden identisch stimulierter MNC inkubiert (B). Die gleichen StimulusKombinationen wurden in Kokulturen von PMN und MNC eingesetzt (C). Vitale PMN wurden
durchflusszytometrisch quantifiziert und auf die ermittelten Zahlen in der Mediumkontrolle (=100%)
bezogen. Mittelwerte ± S von 7 Tieren. P1 = Signifikanz der Unterschiede zwischen A) und B). P2 =
Signifikanz der Unterschiede zwischen A) und C). Unterschiede zwischen B) und C) waren statistisch
nicht signifikant.
103
Ergebnisse
4.4.4
Einfluss von Kulturüberständen aus allogenen MLCs
Um Überstände stimulierter MNC zu gewinnen die keine PAMPs enthalten wurden allogene
MLCs drei Tage in vitro kultiviert. Die an Tag drei (D3-konditioniert) gewonnen Überstände
wurden zu reinen PMN gegeben und induzierten allein in in vitro Kulturen bereits einen
deutlichen Vitalitätsverlust neutrophiler Granulozyten (Restvitalitäten von 42%, Abb. 18).
Die zusätzliche Stimulation reiner PMN mit CpG 1826, LTA oder der Kombination aus LTA
und CpG 1826 konnte den Vitalitätsverlust in Anwesenheit der D3-konditionierten
Überstände sogar noch verstärken (s. Abb. 18).
Vitale Neutrophile (x 10-3)
300
250
200
150
100
50
0
pG
+C
A
LT
A
LT
26
18
26
18
26
18
us
ul
im
St
pG
C
S+
LP
S
LP
pG
C
e
hn
O
ohne konditionierten Überstand
mit D3-konditioniertem Überstand
Abb. 18 Vitalitätsverlust neutrophiler Granulozyten in Anwesenheit von Kulturüberständen aus allogenen MLCs und gleichzeitiger Stimulation mit PAMPs
Reine PMN wurden 22 h in vitro kultiviert. Zugesetzt wurden Überstände aus allogenen gemischten
Lymphozytenkulturen (D3-konditionierter Überstands). In parallelen Ansätzen erfolgte zusätzlich die
Zugabe der angegebenen PAMPs oder PAMP-Kombinationen. Nach 22 h in vitro wurden die vitalen
Neutrophilen durchflusszytometrisch quantifiziert (Mittelwerte ± S von acht Tieren).
104
Ergebnisse
4.4.5
Einfluss von CpG-Motiven auf eosinophile Granulozyten
Einige Präparationen reiner PMN enthielten bis zu 10% eosinophile Granulozyten. Über ihre
Eigenfluoreszenz (in der FL-1) war es möglich sie durchflusszytometrisch zu identifizieren.
In reinen PMN Kulturen führte die Stimulation mit CpG-Motiven, SEA oder der Kombination
aus SEA mit einzelnen CpG-Motiven nicht zu einer Beeinflussung der Vitalität eosinophiler
Granulozyten (s. Abb. 19). Die leichten vitalitätsfördernden Effekte der kombinierten Stimuli
auf Reinkulturen waren statistisch nicht signifikant (s. Abb. 19).
In Kokulturen aus Granulozyten und mononukleären Zellen ereignete sich ein leichter
Vitalitätsverlust der Eosinophilen; er betrug bis zu 18%. Signifikante Unterschiede zur
Mediumkontrolle konnten nach Einsatz von SEA in Kombination mit CpG 1760 und 1829
beobachtet werden.
Vitale Zellen
in % zur Mediumkontrolle
150
125
100
75
50
25
0
07
20
pG 0 6
+C 20
EA G
S Cp 829
+
1
EA G
S Cp 826
A+ G 1
SE Cp 781
+
A G1
SE Cp 760
+
A G1
S E Cp B
+
A C- W
SE G p B
+
A G -W
S E Cp
A+
SE
A 7
SE 00
2
G 6
Cp 00
2
G 9
Cp 82
1
pG 6
C 182
pG 8 1
C
17
pG 0
C 176
G
Cp W B
pC
G WB
G
Cp
Ansätze mit reinen PMN
Ansätze mit PMN und MNC
Abb. 19 Vitalität eosinophiler Granulozyten nach 22-stündiger Inkubation mit
unterschiedlichen Stimuli
Kulturen reiner Granulozyten und Mischkulturen aus Granulozyten und MNC wurden in vitro mit
verschiedenen CpG-Motiven, SEA und Kombinationen aus SEA und CpG-Motiven 22 h inkubiert.
Die Zahl vitaler Eosinophiler in den Stimulationsansätzen (nach durchflusszytometrischer Analyse)
wurde in Prozent der Mediumkontrolle (Ansätze ohne Stimulus = 100%) ausgedrückt. Mittelwerte ± S
von 8 Tiere.
105
Ergebnisse
Demnach wurde durch PAMPs ein weit geringerer Vitalitätsverlust boviner eosinophiler
Granulozyten hervorgerufen, als er bei den autologen neutrophilen Granulozyten beobachtet
werden konnte.
4.4.6
Abhängigkeit des Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten vom
Progesteronspiegel
Um über die intraindividuelle Abhängigkeit des Absterbens neutrophiler Granulozyten eine
Aussage treffen zu können, wurde bei zwei Tieren während zweier Brunstzyklen jeweils zwei
Mal im Östrus (Progesteron kleiner 1 ng/ml) und im Interöstrus (Progesteron größer 5 ng/ml)
wiederholt der vitalitätsvermindernde Effekt verschiedener Stimuli untersucht. Die Tiere
waren zu den Messzeitpunkten jeweils in gegensätzlichen Zyklusphasen (s. Tab. 18).
Tab. 18
Verlauf des Progesteronspiegels bei der wiederholten Vitalitätsbestimmung
der PMN zweier Tiere
Messzeitpunkt 1
Messzeitpunkt 2
Messzeitpunkt 3
Messzeitpunkt 4
Tier I
Interöstrus 1
Östrus 1
Interöstrus 2
Östrus 2
Tier II
Östrus 1
Interöstrus 1
Östrus 2
Interöstrus 2
Die neutrophilen Granulozyten der Tiere reagierten auf die beiden verwendeten CpG-Motive
CpG 1760 und 1826, LPS und LTA trotz interindividueller Unterschiede mit einer
reproduzierbaren Quantität des Vitalitätsverlusts der Neutrophilen. Dabei konnte keine
Abhängigkeit vom Zyklusstand festgestellt werden (s. Abb. 20). Eine Ausnahme bildete die
Stimulation mit LTA, die sowohl zur Vitalitätssteigerung (s. Abb. 20, Tier II, Interöstrus1,
Östrus 2) als auch zu einer Vitalitätsminderung führen konnte (Abb. 20, Tier II, Östrus 1).
Auch diese Unterschiede waren nicht durch einen bestimmten Hormonspiegel (Zyklusstand)
zu erklären.
106
Ergebnisse
Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle
Einzelstimulation
Kostimulation
120
120
110
110
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
120
120
110
110
100
100
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
Östrus1
Östrus2
Interöstrus1
Interöstrus2
CpG 1760
Tier I
Tier II
Östrus1
Östrus2
Interöstrus1
Interöstrus2
LPS+CpG 1760
LTA+CpG 1760
CpG 1826
LPS+CpG 1826
LPS
LTA
LTA+CpG 1826
Abb. 20 Effekte von TLR-Liganden auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen aus
PMN und MNC in Abhängigkeit vom Zyklusstand der Tiere
Granulozyten (PMN) zweier Tiere wurden in Kokulturen mit mononukleären Zellen für 22 h an vier
unterschiedlichen Zeitpunkten bei hormonell bestimmten Zyklusstadien in vitro kultiviert. Der Zyklus
der beiden Tiere verlief asynchron. Die Kulturen enthielten entweder CpG 1760, 1826, LPS, LTA oder
Kombinationen aus jeweils einem CpG-Motiv und LPS oder LTA. Nach 22 h wurden die Zellen
durchflusszytometrisch quantifiziert und in Prozent der Mediumkontrollen (=100%, horizontale
Linien) ausgedrückt. Die beiden oberen Graphiken zeigen die Werte von Tier I und die unteren von
Tier II. In den linken Graphiken sind die Effekte der Einzelstimuli und in den rechten die Effekte der
Kombinationsansätze dargestellt.
107
Ergebnisse
4.4.7
CpG-Motive in Kombinationsansätzen aus bovinen Makrophagen
und neutrophilen Granulozyten
Für diese Versuche wurden Makrophagen im Verhältnis 1:6 mit PMN kokultiviert. Dieses
Verhältnis ergab sich aus Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) und ermöglichte bei einer
genügend großen Restvitalität der PMN mögliche additive oder überadditive Effekte der mit
kombinierten PAMPs stimulierten Ansätze zu erfassen.
In den Kokulturen ergaben sich deutliche Vitalitätsverluste von Neutrophilen, wenn mit
Kombinationen aus CpG-Motiv mit LPS oder CpG-Motiv mit LTA stimuliert wurde. Hier
betrug die Restvitalität im Vergleich zur Mediumkontrolle 50%. Auch CpG 2006 allein führte
zu einem deutlichen, signifikanten Vitalitätsverlust um 35% während LPS nur zu einem
Verlust von 15% führte (s. Abb. 21).
Obgleich bei diesen Versuchen ebenfalls in den PMN Reinkulturen ein leichter Vitalitätsverlust nach Stimulation mit kombinierten PAMPs zu beobachten war (s. Abb. 21A), so
führte die Anwesenheit von Makrophagen zu einem deutlich prononcierteren Absterben der
Neutrophilen (s. Abb. 21B). Somit führten PAMP-stimulierte Makrophagen zu einem
beschleunigten Absterben neutrophiler Granulozyten.
A) Monokultur
110
B) Kokultur
100
100
Vitale Zellen
in % zur Mediumkontrolle
Vitale Zellen
in % zur Mediumkontrolle
110
90
80
70
60
50
40
30
90
80
70
60
50
40
30
20
20
10
10
A+
LT
pG
G
Cp
C
S+
A
LT
LP
hn
G
Cp
pG
20
06
06
06
20
20
06
20
S
LP
06
20 us
G
ul
Cp tim
S
e
O
A+
LT
C
S+
A
LT
LP
hn
S
LP
06
20 us
G
ul
Cp tim
S
e
O
Abb. 21 PAMP induzierter, durch Makrophagen vermittelter Vitalitätsverlust
neutrophiler Granulozyten
Percoll®-separierte, reine PMN (A), sowie Kombinationsansätze aus Makrophagen und PMN in einem
Verhältnis von 1:5 (B) wurden mit LPS oder LTA über 22 h inkubiert. Ansätze ohne Stimulus dienten
als Konrolle. Dargestellt sind % vitaler PMN im Vergleich zur Mediumkontrolle (=100%)
(Mittelwerte von drei untersuchten Tieren).
108
Ergebnisse
4.4.8
Bedeutung der Reaktionslage von neutrophilen Granulozyten für
das Ausmaß ihres Vitalitätsverlustes nach PAMP-Stimulation
Das Ausmaß des induzierten Vitalitätsverlustes von Neutrophilen konnte interindividuell
stark schwanken (s. 4.4.2). Dies könnte darauf beruhen, dass die MNC oder die in vitro
generierten Makrophagen einzelner Tiere unterschiedlich stark durch die PAMPs stimuliert
wurden. Eine weitere Möglichkeit bestand in der individuell unterschiedlichen
Reaktionsbereitschaft der Neutrophilen einzelner Tiere.
Um diese beiden Hypothesen zu prüfen wurde der induzierte Vitalitätsverlust in autologen
Ansätzen mit dem in allogenen Ansätzen verglichen. Dies erfolgte sowohl mit MNC/PMNAnsätzen, als auch mit Makrophagen/PMN-Ansätzen.
Granulozyten von drei und mononukleäre Zellen von vier Tieren wurden in allen
Kombinationen gemeinsam inkubiert, um die Zuständigkeit einer Zellpopulation für die
Effekte zu bestimmen. Aus den neun unterschiedlichen Kombinationen war in drei bis acht
Fällen keiner Zellpopulation die Funktion des Haupteffektors zuzuordnen (s. Tab. 20,
„AUsREISSER“), da die Effektivität der Stimuli hier entweder wesentlich höher oder
niedriger war, als die der autologen Ansätze.
Eine Dominanz der MNC über die Effekte konnte bei CpG 2007-Stimulation in vier Fällen
festgestellt werden (s. Tab. 20), die Reaktionsbereitschaft der PMN spielte in keinem Fall eine
Rolle. Ähnliches konnte nach Stimulation mit LTA und CpG 2007 beobachtet werden: Drei
der Ansätze waren hauptsächlich MNC, einer PMN und zwei der Ansätzen durch beide
Populationen bedingt.
Tab. 19 verdeutlicht die Vorgehensweise und die Interpretation dieser Versuche: wurde mit
LTA stimuliert, so ergab dies bei Tier 1 (autolog) eine Restvitalität von 60%, bei Tier 2
(autolog) von 116% und in der allogenen Kombination (MNC von Tier 1 und PMN von
Tier 2 eine Restvitalität 105%. In diesem Fall waren die PMN (und ihre Reaktionsbereitschaft) für das Ausmaß des Absterben die ausschlaggebende Population („Haupteffektor“).
Wenn, wie bei LPS, sowohl bei Tier 1 als auch bei Tier 2 eine vergleichbare Restvitalität
vorliegt, aber im allogenen Ansatz die Vitalität stark abweicht, wurde der Haupteffektor mit
„AUSREISSER“ angegeben (s. Bei einer äquidistant zwischen den beiden autologen
Ansätzen einzuordnenden Vitalität wurden beide Populationen angegeben (PMN/MNC
gleichbedeutend).
109
Ergebnisse
Granulozyten von drei und mononukleäre Zellen von vier Tieren wurden in allen
Kombinationen gemeinsam inkubiert, um die Zuständigkeit einer Zellpopulation für die
Effekte zu bestimmen. Aus den neun unterschiedlichen Kombinationen war in drei bis acht
Fällen keiner Zellpopulation die Funktion des Haupteffektors zuzuordnen (s. Tab. 20,
„AUSREISSER“), da die Effektivität der Stimuli hier entweder wesentlich höher oder
niedriger war, als die der autologen Ansätze.
Eine Dominanz der MNC über die Effekte konnte bei CpG 2007-Stimulation in vier Fällen
festgestellt werden (s. Tab. 20), die Reaktionsbereitschaft der PMN spielte in keinem Fall eine
Rolle. Ähnliches konnte nach Stimulation mit LTA und CpG 2007 beobachtet werden: Drei
der Ansätze waren hauptsächlich MNC, einer PMN und zwei der Ansätzen durch beide
Populationen bedingt.
Tab. 19
Prinzip der Auswertung autolog/allogener Apoptose-Versuche
Autolog
Allogen
Tier 1: MNC
Tier 2: MNC
Tier1: MNC
Haupteffektor
Tier 1: PMN
Tier 2: PMN
Tier2: PMN
Medium
100±9
100±3
100±4
CpG 2007
75±5
97±1
80±3
MNC
LPS
57±2
43±7
112±6
AUSREISSER
LPS+CpG 2007
14±2
51±4
65±5
PMN
LTA
60±2
116±9
105±3
PMN
LTA+CpG 2007
26±16
88±2
43±5
MNC
PMN wurden in Kokulturen (Spalten Tier 1 und Tier 2 sind autologe Ansätze) mit den aufgeführten
PAMPs inkubiert. Für den allogenen Ansatz Tier 1/Tier 2 wurden MNC von Tier 1 und PMN von Tier
2 verwendet. Die letzte Spalte gibt an, welche Zellpopulation wahrscheinlich ausschlaggebend für die
Quantität des Vitalitätsverlustes ist. Aufgeführt sind die Mittelwerte ± S aus Triplikaten.
Andere PAMPs oder PAMP-Kombinationen als Stimulatoren resultierten in einem
gemischten Bild: je nach Herkunft der MNC oder der PMN konnte die eine oder andere
Population über das Absterbeverhalten der PMN dominieren (s. Tab. 20).
Die meisten „Ausreisser“ ergaben sich nach Stimulation mit LPS. Nur einmalig konnten die
PMN als Haupteffektoren angesehen werden. In den anderen acht Kombinationen lag die
110
Ergebnisse
Vitalität der PMN im Vergleich zu den autologen Ansätzen wesentlich höher. In all diesen
Ansätzen war die Vitalität ebenfalls größer als in den unstimulierten Ansätzen (Daten nicht
gezeigt). Ein ähnliches Bild ergab sich durch die Stimulation mit LPS und CpG 2007 (s. Tab.
20). In zwei Kombinationen lag auch hier die Vitalität über 100%, in allen anderen Fällen
zumindest höher, als in den autologen Ansätzen (Daten nicht gezeigt).
Sechs der neun LTA-stimulierten, allogenen Kombinationen führten zu einem deutlich
größeren Vitalitätsverlust als es in den autologen Ansätzen der Fall war. Der Abstand lag
zwischen 7% und 51% zu dem autologen Ansatz mit der niedrigeren Restvitalität (Daten nicht
gezeigt).
Tab. 20
Dominierende Zellpopulation für das induzierte Absterben neutrophiler
Granulozyten nach Analyse autologer und allogener PMN/MNC Kokulturen
Haupteffektor
MNC
PMN
PMN und MNC
Ausreißer
CpG 2007
4
0
0
5
LPS
0
1
0
8
LPS+CpG 2007
1
2
0
6
LTA
2
2
0
5
LTA+CpG 2007
3
1
2
3
Medium
PMN wurden in autologen und allogenen Kokulturen mit den aufgeführten PAMPs und PAMPKombinationen für 22 h in vitro inkubiert. Nach Analyse des Absterbeverhaltens von PMN in
autologen und allogenen Kokulturen wurden die Zellpopulationen bestimmt, die für das Ausmaß des
induzierten Absterbens der PMN hauptverantwortlich sind (Erläuterung siehe im Text).
Die PMN zweier Tier wurden zusätzlich in autologen und allogenen Kombinationen mit
Makrophagen zweier Tiere inkubiert.
Bei dem Vergleich der Vitalität der PMN zwischen dem autologen Ansatz von Tier 1 und
dem nebenstehenden allogenen Ansatz (Tier2:MPh/Tier1:PMN) war abhängig vom Stimulus
ein um 6%-15% stärkeres Absterben der PMN in der allogenen Kombination zu vermerken
(s. Tab. 21). Ein ähnliches Bild ergab sich im Vergleich der Kombinationen
Tier2:MPh/Tier3:PMN und Tier1:MPh/Tier3:PMN. In beiden Kombinationen war ein
stärkerer Vitalitätsverlust der PMN durch die Inkubation mit Makrophagen von Tier 2 zu
verzeichnen. Hier betrug der Unterschied 6%-25%. Die Sterberate der PMN wurde demnach
111
Ergebnisse
durch die Makrophagen maßgeblich beeinflusst, die individuell eine unterschiedliche
Aktivierungsbereitsschaft zu besitzen scheinen.
In Kokulturen mit Makrophagen konnte gezeigt werden, dass die Reaktionsbereitschaft der
PMN ebenfalls wesentlich zu deren Absterbeverhalten beiträgt. Dies wurde deutlich, wenn
die gleichen Makrophagen mit PMN unterschiedlicher Tiere inkubiert wurden. So führte LPS
in der Kombination Tier1:Mph/Tier1PMN zu einer Restvitalität der PMN von 86%; in der
Kombination Tier1:Mph/Tier3PMN zu einer Restvitalität von 65%. Ein weiteres, inverses
Beispiel wäre die niedrigere Restvitalität von 47% in LTA+CpG 2007-stimulierten Ansätzen
von Tier1:Mph/Tier1PMN im Vergleich zu einer höheren Restvitalität von 58% in Ansätzen
von Tier1:Mph/Tier3PMN.
Tab. 21
Einfluss der PMN auf die Quantität ihres Sterbens nach in vitro Stimulation
autologer und allogener Makrophagen/PMN-Kombinationen mit PAMPs und
PAMP-Kombinationen
Tier 1: MPh
Tier 2: MPh
Tier 2: MPh
Tier 1: MPh
Tier 1: PMN
Tier 1: PMN
Tier 3: PMN
Tier 3: PMN
Medium
100±0
100±0
100±0
100±0
CpG 2007
62±0
52±0
42±3
65±1
LPS
86±1
77±1
52±0
65±1
LPS+CpG 2007
45±0
30±1
32±10
45±1
LTA
90±0
84±1
76±1
82±0
LTA+CpG 2007
47±1
33±2
33±1
58±1
PMN zweier Tiere wurden mit in vitro generierten Makrophagen von 2 Tieren in einer autologen und
drei allogenen Kokulturen mit den aufgeführten PAMPs für 22 h inkubiert. Ansätze ohne Zusatz von
PAMPs dienten als Kontrolle (Medium). Die Zahl vitaler PMN in den Kontrollansätzen wurde gleich
100% und die Zahl vitaler PMN in den Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt (Mittelwerte ± S
von Triplikaten).
Somit konnte gezeigt werden, dass die Absterberate von Neutrophilen in Kokulturen sowohl
von der individuell unterschiedlichen Induktion mononukleärer Mediatoren als auch von der
individuell unterschiedlichen Reaktionsbereitschaft der Neutrophilen abhängen kann.
112
Ergebnisse
4.4.9
Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro
Kokultivierung von PMN und MNC in Anwesenheit von TLRLiganden
Das akzelerierte Sterben der neutrophilen Granulozyten in vitro nach Koinkubation mit MNC
und TLR-Liganden (CpG-Motive, LTA oder LPS) könnte auf der Induktion einer Apoptose
beruhen oder (unter den gewählten in vitro Bedingungen) auf der Induktion einer primären
Nekrose. Um dies zu prüfen, wurde die Entstehung apoptotischer Zellen in vitro durch eine
Membranfluoreszenz mit Annexin V-FITC (s. S. 65) über die Zeit der in vitro Kultur (bis 22 h
nach Beginn des Ansatzes) verfolgt.
Nach 22 h in vitro konnten unterschiedlich stark Annexin V-FITC positive Zellpopulationen
identifiziert werden (Abb. 22B, Region 2 und 5) die nicht (Region 5) oder nur schwach
(Region 2) Propidiumiodid positiv waren.
In Region 1 befanden sich der Definition nach vitale (FL-3 negativ), nicht apoptotische (FL-1
negativ) Zellen. In der Region 2 liegen Zellen, die eine geringgradig gesteigerte Fluoreszenz
sowohl in der FL-3 als auch in der FL-1 aufweisen. Sie können somit als apoptotische Zellen
angesprochen werden. In der Region 4 befinden sich stark FL-3 und FL-1 postitive Zellen.
Die in Region 5 Annexin V-FITC positiven und Propidiumiodid negativen Zellen wiesen
keine Veränderungen der Morphologie im Vergleich zu den in Region 1 befindlichen Zellen
auf.
Die Masse der Zellen mit veränderter morphologischer Charakteristik (s. Abb. 22A, unterer
rechter Quadrant) befand sich unter den schwach Annexin V-FITC positiven Zellen wieder
(vgl. Abb. 22 C2 Abb. 22A). Annexin V-FITC schwach positve/Propidiumiodid stark positive
Zellen (Abb. 22B, Region 3) wiesen hingegen eine deutlich geringere Zellgröße auf
(vgl. Abb. 22 C3 und Abb. 22A).
Es zeigte sich, dass das vom Hersteller empfohlene Färbeprotokoll mit Annexin V den Anteil
einzelner Zellpopulationen im Vergleich zur Ausgangspopulation verändert (s. Abb. 23). So
erhöhte sich der Anteil an PI-negativen Granulozyten nach der Annexin V-FITC-Färbung z.T.
deutlich gegenüber der Messung, wenn sie direkt nach der Kultivierung im
Durchflusszytometer durchgeführt wurde (s. Abb. 23; nach 4 h von 44% auf 55%). Parallel
zur relativen Zunahme der vitalen Granulozyten wurden nach Annexin V-FITC-Färbung
deutliche Verluste an Zellen beobachtet deren Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm
der von apoptotischen mononukleären Zellen entsprach (s. Abb. 23; nach 12 h und 22 h, Pfeilmarkiert).
113
Ergebnisse
B)
Annexin V-FITC
Granularität (SSC)
A)
5
4
3
2
1
Größe (FSC)
C)
Propidiumiodid
Granularität (SSC)
1
2
4
3
5
Größe (FSC)
Abb. 22 Morphologische Eigenschaften und Fluoreszenzcharakteristika von Zellen
(PMN/MNC Gemisch) nach Annexin V-FITC- und Propidiumiodid-Färbung
Neutrophile Granulozyten und mononukleäre Zellen wurden im Verhältnis 1:1 22 h in vitro inkubiert.
Darstellung einer Einzelmessung. A) Vorwärts-/Seitwärtsstreulicht-Punktediagramm nach Ausschluss
von Zelldebris. B) Korrelierte Darstellung der Fluoreszenzen FL-3 (Propidiumiodid)/ FL-1 (Annexin
V-FITC). In B) wurden anhand unterschiedlicher Fluoreszenzen 5 Regionen definiert. C)
Morphologische Darstellung der Zellen in den Regionen 1-5 (aus B).
114
Ergebnisse
55%
60%
Zeit nach Beginn
der In-vitro-Kokultivierung
30 min
Seitwärtsstreulicht (SSC)
44%
55%
4h
27%
35%
12h
31%
34%
22h
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Abb. 23 Änderung der Zellzusammensetzung nach Färbung in vitro stimulierter
PMN/MNC Kokulturen mit Annexin V-FITC
Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Tieres wurden im Verhältnis 1:1 bis zu 22 h
in vitro kultiviert (s. S. 65). Alle Ansätze enthielten Lipoteichonsäure und CpG 2007. Nach den
angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische direkt durchflusszytometrisch analysiert
(linke Spalte). Parallelansätze wurden nach Färbung mit Annexin V-FITC durchflusszytometrisch
analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Dichteplots nach dem Ausschluss stark PI-positiver
Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die Prozentsätze stellen den Anteil der Granulozyten an allen
dargestellten Messereignissen dar (oberer linker Quadrant). Die Pfeile deuten auf eine eingekreiste
Population an Zellen, die nach Annexin V-Färbung deutlich reduziert auftritt.
115
Ergebnisse
Das zeitabhängige Auftreten von Annexin V-FITC positiven Zellen nach Stimulation von
MNC/PMN-Gemischen mit TLR-Liganden ist exemplarisch in Abb. 24 dargestellt.
Nach vierstündiger Inkubation in vitro ließen sich in allen Ansätzen, auch in der
Mediumkontrolle ohne Zusatz, Annexin V positive Zellen darstellen (Kasten in B, F und J),
die sich unter den mononukleären Zellen finden. Nach 12 h war eine Veränderung in der
Morphologie der Granulozyten zu erkennen, die nur in den Ansätzen mit CpG 2007 und dem
Kombinationsansatz CPG 2007+LTA auftrat: Teile der Zellen sanken deutlich in ihrem
Seitwärtsstreulichtsignal (s. Abb. 24, Kasten in C, G und K). Diese Zellen, wie auch die
Granulozyten mit intakt erscheinender Morphologie wiesen jedoch keine erhöhte Annexin VFITC-Bindung auf. Erst nach 22 h ließen sich deutlich Annexin V-FITC positive Zellen
nachweisen (s. Abb. 24, Kasten in D, H und L). Deren Anteil war jedoch, gemessen an der
Masse der erfassten Zellen relativ klein.
Granulozyten, deren Granularität stimulationsabhängig sank (s. Abb. 24, Kasten in C, G und
K) stellten sich im FL-3/SSC Punktediagramm als gemischte Population aus schwach und
stark Propidiumiodid gefärbten Zellen dar (s. Abb. 25, Region 2). Damit ist zu diesem
Zeitpunkt der Kultur bereits ein Nebeneinander von Apoptose (PI schwach positiv) und
Nekrose (PI stark positv) festzustellen.
116
Ergebnisse
Zusatz zum Kulturmedium
Ohne Stimulus
CpG 2007
A
LTA+CpG 2007
E
Zeit nach Beginn
der In-vitroKokultivierung
I
30 min
Seitwärtsstreulicht (SSC)
B
F
J
4h
C
G
K
12 h
D
H
L
22 h
Annexin V-FITC (FL-1)
Abb. 24 Auftreten Annexin V-FITC positiver Zellen nach Stimulation von MNC/PMN
Kokulturen mit CpG 2007 oder der Kombination CpG 2007+LTA
Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Rindes wurden im Verhältnis 1:1 bis zu
22 h in vitro kultiviert (s. S. 65). Die Ansätze erfolgten in Triplikaten ohne Zusatz (A bis D), mit
CpG 2007 (E-H) oder ein Gemisch aus Lipoteichonsäure und dem CpG 2007 (I-L). Nach den
angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische mit Annexin V-FITC gefärbt und
durchflusszytometrisch analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Punktediagramme (FL-1/SSC) nach
dem Ausschluss stark PI-positiver Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die X-Achse der Zweiparameterdarstellungen entspricht der relativen Annexin V-FITC-Bindungsstärke.
117
Ergebnisse
A)
D)
G)
E)
H)
F)
I)
Medium
R1
89%
Messereignisse
B)
CpG 2007
Seitwärtsstreulicht (SSC)
R2
11%
LTA + CpG 2007
C)
Annexin V-FITC (FL-1)
Propidiumiodid (FL-3)
Abb. 25 Aufschlüsselung der morphologisch veränderten und Annexin V-FITC
teilpositiven PMN in der Rotfluoreszenz
Percoll®-separierte PMN wurden in einem Verhältnis von 1:1 mit autologen MNC über 12 h in vitro
inkubiert. Neben unstimulierten Ansätzen (Medium) wurden Parallelansätze mit CpG 2007 oder einem
Gemisch aus LTA+CpG 2007 stimuliert. Nach Annexin V-FITC Färbung wurden die Zellen in
Anwesenheit von Propidiumiodid durchflusszytometrisch anaylsiert. In den Punktediagrammen
(Annexin V-FITC-Fluoreszenz gegen die Granularität) wurden 2 Regionen auf Zellen mit
unterschiedlicher Seitwärtsstreuung gesetzt. Die Rotfluoreszenz (FL-3) der Zellpopulationen in den
eingezeichneten Regionen wird in den nebenliegenden Histogrammen dargestellt (linkes Histogramm:
Rotfluoreszenz der Zellen in Region 1; rechtes Histogramm: Rotfluoreszenz der Zellen in Region 2).
118
Diskussion
5 Diskussion
Relativ wenige Studien befassten sich gezielt mit Konsequenzen für bovine Zellen des
Immunsystems, die mit CpG-Motiven unmittelbar oder mittelbar in Kontakt treten. Hier
setzte die vorliegende Arbeit an, in der gefragt wurde, ob und wie bovine leukozytäre Zellen
von DNA-Motiven beeinflusst werden. Da CpG-Motive nur eine Klasse der
Erregerspezifischen molekularen Muster darstellen und die Zellen des Immunsystems nach
Erregerkontakt in der Regel einem Gemisch verschiedener Erregermuster gegenüberstehen,
wurde besonderes Augenmerk auf die kombinierte Wirkung derartiger PAMPs für bovine
Immunzellen gelegt.
Um die Studien ebenso mit Zellen durchzuführen, die im Gewebe den Erregern und ihren
molekularen Mustern mit als erste gegenüberstehen, wurden überdies in vitro Makrophagen
generiert.
5.1.1 Beurteilung der in vitro generierten Makrophagen
Ziel der Entwicklung einer alternativen Methode zur Generierung boviner, aus
Blutmonozyten gewonnenen Makrophagen war es, mit möglichst geringem Zeit- und
Materialaufwand ruhende und homogene Makrophagenpopulationen zu erzeugen. Vergleicht
man die morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der nach den
zwei Verfahren hergestellten Makrophagen, so lassen sich keine wesentlichen Unterschiede
feststellen (s. 4.1.1). Dies steht etwas in Kontrast zu den Ergebnissen von SCHÜMANN
(2001), die das Zellkulturflaschenverfahren deshalb kritisierte, da sich die so generierten
Makrophagen bezüglich der Infizierbarkeit mit M. avium sp. inhomogener verhielten als die
Makrophagen, die mit dem Teflonbeutel-Verfahren erzeugt wurden.
Bezüglich der hier geprüften Phagozytosefähigkeit verhielten sich die Makrophagen ebenfalls
inhomogen, jedoch unterschieden sich die nach den beiden Methoden generierten Zellen nicht
in diesem Phänomen. Wichtiger erschien, dass beide Makrophagenpopulationen ein
vergleichbares Expressionsmuster (CD14, MHC-Klasse-II) aufwiesen, und insbesondere die
relativ schwache MHC-Klasse-II-Expression die Zellen als ruhende Makrophagen auswies.
Es sei betont, dass es sich bei den hier generierten Makrophagen um Surrogatzellen für die
Gewebsmakrophagen handelt. Da die in vitro generierten Zellen nicht gewebetypische
Differenzierungsschritte nach Interaktion mit residenten Gewebezellen erlebten, kann nicht
ausgeschlossen werden, dass sich die in vitro generierten Zellen in einigen Aspekten
119
Diskussion
funktionell von Gewebsmakrophagen unterscheiden können. Dennoch wurden sie hier zur
exemplarischen Prüfung der Stimulierbarkeit durch PAMPs eingesetzt.
Viele Zytokine und Mediatoren können die Differenzierung von in vitro aus Blutmonozyten
generierten Zellen beeinflussen. Beispielsweise können IFN-γ, IL-6, IL-10 und GM-CSF die
Entwicklung zu Makrophagen und die Kombination aus GM-CSF und IL-4 die Entwicklung
zu Dendritischen Zellen induzieren (SANTIN et al. 1999, ALLAVENA et al. 1998,
CHOMARAT et al. 2000, DELNESTE et al. 2003).
In ihrer Morphologie unterschieden sich in den Zellkulturflaschen nach der Inkubation kleine
nichtadhärente Zellen (Lymphozyten) von zwei Gruppen größerer, adhärenter Zellen. Beide
Populationen besaßen Granula. Die einen erschienen rund, wohingegen die anderen Ausläufer
besaßen und dem schematischen Bild von Dendritischen Zellen glichen. SANTIN et al.
(1999) beschrieben, dass dendritische Zellen im Gegensatz zu Makrophagen keine Adhärenz
entwickeln, was zu dem Schluss führt, dass es sich bei beiden adhärenten Populationen um
Makrophagen handelt. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass nach dem
Vorgang der enzymatischen Ablösung keine morphologische Unterscheidung – weder
mikroskopisch noch durchflusszytometrisch – der Zellen mehr möglich war. Bei den
Ausläufern handelt es sich demnach wahrscheinlich um der Adhärenz dienende
Pseudopodien. Über die phänotypische Charakterisierung war eine Unterscheidung zu
Dendritischen Zellen möglich, da diese eine starke MHC-Klasse-II-Expression zeigen
(SANTIN et al. 1999). Die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen kann nicht als
Unterscheidungsmerkmal dienen, da sie auf beiden Zelltypen stark exprimiert wurden
(SANTIN et al. 1999). Wie von ADLER et al. (1994) für murine aus dem Knochenmark ex
vivo generierte Makrophagen und von WERLING et al. (1998) an bovinen MDM gezeigt
wurde, exprimieren Makrophagen CD14 stärker als Dendritische Zellen. Phänotypisch und
morphologisch zeigen sowohl die Makrophagen aus Zellkulturflaschen als auch die aus
Teflonbeuteln die Charakteristik ruhender Makrophagen.
5.1.2 Nachweis der Produktion von NO in MNC und Makrophagen
Die Stickoxid-Produktion aktivierter Makrophagen wird üblicherweise anhand des GesamtNitritgehaltes im Überstand gemessen (MASON et al. 1996, HENDRICKS 1998 und
SHODA et al. 2001b). Dieser summarische Wert berücksichtigt allerdings nicht, dass bei
heterogenen Zellpopulationen nur einzelne Populationen NO produzieren können und erlaubt
überdies nicht, die NO-Produktion auf Einzelzellebene zu prüfen. Um dies zu ermöglichen
und um der Frage nachzugehen, ob PAMPs nach Interaktion mit Makrophagen die Bildung
120
Diskussion
von immunmodulatorischem NO induzieren, wurde versucht ein sehr sensitives, durchflusszytometrisches Verfahren zu etablieren (s. S. 77), das auf dem Zusatz eines NO-sensitiven
Fluorochroms zu den Zellen basierte.
Während der Vorversuche fiel auf, dass sich nach Zugabe des Fluorochroms die Farbe des
Mediums von Rot zu Orange-Rot änderte. Die gemessenen pH-Werte wiesen alkalische
Werte auf (pH 7,82 bis 8,27). Dies schloss aus, dass es sich bei der Farbänderung um einen
pH-bedingten Farbumschlag des Phenolrotes handelte, da dieses bei sauren Bedingungen von
Rot zu Orange wechselt. Wahrscheinlicher ist, dass das zugegebene Fluorochrom DAF-2 DA
durch Inhaltstoffe des Iscové-Mediums umgesetzt wurde. Dies wird dadurch bestärkt, dass
DAF-2 DA schon durch die Verdünnung in PBS zu einem Teil zu reagieren schien. Deutlich
wird diese Reaktion durch eine Gelbfärbung bereits direkt nach der Zugabe in das
Verdünnungsmedium (PBS).
Bei Zugabe des Fluorochroms zu Beginn der Inkubation wurde eine einheitliche
Fluoreszenzintensität der Zellen erreicht. Im Falle des Zusatzes drei Stunden vor der Messung
konnte bei vielen Tieren eine stärker und eine schwächer fluoreszierende Population
unterschieden werden. Die Ursache für diese Differenz könnte darin liegen, dass N2O3
(Nitritanhydrid), das Reaktionsprodukt, das mit dem DAF-2 DA reagiert, nicht in der Zelle
gespeichert wird, sondern sich in einem ständigen Umbauprozess zwischen NO,
Nitritanhydrid und Peroxynitrit befindet (NAKATSUBO et al. 1998). Weiterhin wird es
kontinuierlich in den Extrazellularraum abgegeben. Die früh zugegebenen Fluorochrome
können während der gesamten Inkubationsdauer mit dem N2O3 reagieren, was zu einem
höheren Umsatz auch in weniger aktiven Zellen führen kann. Bei später Zugabe hingegen
kann das DAF-2 T lediglich mit dem in den drei Stunden vorliegenden N2O3 reagieren. Die
Zellen, die in dieser Zeitspanne weniger aktiv sind, zeigen dann wahrscheinlich eine
schwächere Fluoreszenz als diejenigen, die sich in einem hohen Aktivitätsstatus befinden. Die
späte Zugabe des Fluorochroms gibt demnach wahrscheinlich einen genaueren Aufschluss
über die derzeitig aktiven Zellen, wohingegen bei einer Langzeitinkubation ein summarisches
Ergebnis der gesamten Inkubationsdauer erreicht wird.
Die Fluoreszenzintensität von DAF-2 T in Makrophagen wurde nach Stimulation nur gering
erhöht. Die hohe Eigenfluoreszenz von Makrophagen in der FL-1 könnte ein Grund für die
schlechte Diskriminierung zwischen DAF-2 T schwach positiven und stark positiven Zellen
sein. Es wäre wahrscheinlich sinnvoller, ein Fluorochrom in den Händen zu haben, welches in
einem anderen Wellenbereich emittiert. ADLER et al. (1994) bemerkten dies bereits im
Rahmen der phänotypischen Charakterisierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper in der
Membranimmunfluoreszenz, die dann bessere Ergebnisse lieferte, wenn ein PE-konjugierter
121
Diskussion
Sekundärantikörper (Emissionsmaximum in der FL-2) anstelle eines FITC-konjugierten
Sekundärantikörpers (Emissionsmaximum in der FL-1) eingesetzt wurde.
Die Induktion intrazellulären NOs (N2O3) ist mittels DAF-2 DA nachzuweisen
Die verwendeten MNC wiesen wie die Makrophagen einen kontinuierlichen, stimulationsabhängigen Anstieg der DAF-2 T Fluoreszenz auf (Phagozytosepartikel, PWM, SEA,
CpG-Motive). Allerdings bestehen trotz der Verwendung gleicher Fluorochromkonzentrationen innerhalb einer Zellpopulation große Fluoreszenzunterschiede, die nach derzeitigem
Erkenntnisstand nicht eindeutig zu erklären sind (s. Abb. 12, Abb. 13 und Tab. 6).
Bei alleiniger Zugabe von Substrat (L-Arginin) konnte die NO-Produktion in gleichem Maße
wie durch Phagozytosepartikel gesteigert werden. Eine Deutung der stimulusabhängigen NOBildung wurde dadurch erschwert.
Wie von HENDRICKS (1998) beschrieben, war an Tag 3 in den Überständen kultivierter
MNC ein Plateau der Nitritkonzentration erreicht. Daraus lässt sich folgern, dass intrazellulär
spätestens zu diesem Zeitpunkt ebenfalls NO in gesteigerter Menge vorliegen muss. Wie in
Abb. 12 ersichtlich war durch Stimulation mit PWM und SEA eine Akzeleration der NOProduktion in bovinen Lymphozyten induzierbar. Eine stimulationsabhängige Steigerung der
Nitritkonzentration in den Überständen war zu erkennen. Die Ergebnisse der Nitritmessung in
den Überständen sind somit mit den durchflusszytometrisch bestimmten Fluoreszenzintensitäten korrelierend, auch wenn eine Umrechnung des intrazellulären NO-Gehaltes nicht
möglich ist.
Insgesamt scheint die Induktion der NO-Bildung durch die verwendeten PAMPs in MNC und
Makrophagen kein besonders dominierendes Ereignis zu sein. In einer Studie von STICH et
al. (1998) wurde beschrieben, dass sich bovine Makrophagen von bakteriellen Proteinen
(pelletierte Zellorganellen und –membranen) nur unter kostimulatorischer Gabe von IFN-γ
zur Produktion von NO anregen lassen. Da IFN-γ ein essentieller Kostimulus für die
Produktion von NO durch PAMP-stimulierte Makrophagen zu sein scheint, verwundert es
nicht, dass nicht nur die hier ermittelte niedrige NO-Produktion deutlich unter den bei PAMPstimulierten murinen Makrophagen liegt (JUNGI et al. 1996). ADLER et al. (1995)
beschrieben die Stimulation zur iNOS und NO-Produktion nach Stimulation mit Salmonella
dublin oder LPS, wiesen aber darauf hin, dass sich bovine Makrophagen hinsichtlich ihrer
benötigten Signale für die Produktion von NO deutlich von Makrophagen anderer Spezies
unterscheiden. Durch keine Kombination der geprüften Zytokine bzw. ihre Gabe als
Einzelstimulus konnte die NO-Produktion induziert werden. JUNGI et al. (1996) bestätigen
122
Diskussion
die Wirksamkeit der verwendeten bakteriellen Stimuli von ADLER et al. (1995) und weisen
zusätzlich darauf hin, dass Gram negative Bakterien potentere Induktoren sind, als Gram
positive. In vitro aus Monozyten generierte humane Makrophagen besitzen nach Aussage von
FANG und VAZQUEZ-TORRES et al. (2002) ebenfalls keine Fähigkeit auf diverse Stimuli
mit der Produktion von NO zu reagieren, obwohl eine konstitutive Produktion vorläge. Nur in
vivo stimulierte Makrophagen produzieren ihrer Aussage nach NO in vitro. Auch in humanen
Makrophagen wird wesentlich weniger NO und iNOS als in murinen Zellen produziert
(FANG und VAZQUEZ-TORRES et al. 2002).
5.1.3 Bindung und Internalisierung von CpG-Motiven durch Zellen des
peripheren Blutes und Makrophagen
CpG- und GpC-Motive binden an allen untersuchten Zellpopulationen
Die Modulation von Zellen über CpG-Motive setzt voraus, dass diese Strukturen zunächst an
Zellen binden. Der direkte Bindungsnachweis von CpG-Motiven an Zelloberflächen wurde
bisher noch nicht gezeigt - insbesondere nicht an normale leukozytäre Zellen klinisch
gesunder Individuen. Studien die zeigen, dass CpG-Motive an den TLR-9 binden
(TAKESHITA et al. 2001, UNDERHILL und OZINSKY 2002) wurden im Wesentlichen mit
TLR-9 transfizierten Zelllinien durchgeführt oder (indirekter Nachweis der TLR-9
Bedeutung) über die fehlende Wirkung von CpG-Motiven mit Zellen von TLR-9 knock-out
Mäusen.
In dieser Arbeit konnte nach Einsatz biotinylierter DNA-Motive und eines erstmals
eingesetzten Verstärkersystems (Flow-AMP®) eine Bindung sowohl eines CpG-Motivs als
auch des reversen GpC-Motivs an Teilpopulationen aller untersuchter Zellpopulationen
(Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten und in vitro generierte Makrophagen)
nachgewiesen werden (s. S. 87, 4.2.2). Doppelfluoreszenzanalysen geben Hinweise darauf,
das zumindest dies eine geprüfte CpG-Motiv selektiver in seiner Bindung ist: Der Anteil
markierter, stark MHC-Klasse-II positiver lymphoider Zellen (B-Zellen) war höher als nach
Inkubation der Zellen mit dem GpC-Motiv (s. Abb. 15). Ob dies mit einer differentiellen
Expression des TLR-9 auf B-Zell-Subpopulationen korreliert, kann hier nicht beantwortet
werden. Zumindest zeigen diese Studien beim Rind, dass CpG- oder allgemeiner ErregerDNA-Motive an alle leukozytären Zellen binden können was indirekt durch den Nachweis der
TLR-9 mRNA-Expression in einer Vielzahl leukozytärer Zellpopulationen (Lymphozyten,
Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Granulozyten) bestätigt wird (KRUTZIK et
al. 2001, HAYASHI et al. 2003).
123
Diskussion
Das Postulat, dass die Interaktion von CpG-Motiven mit dem TLR-9 erst intrazellulär nach
Internalisierung der CpG-Motive erfolgt, kann durch die eigenen Versuche jedoch weder
bestätigt noch widerlegt werden. Die nachgewiesene Bindung an Zellen in Kälte (und damit
der Verhinderung der Internalisierung) schließt nicht aus, dass CpG-Motive initial an andere
Liganden als den TLR-9 auf Zelloberflächen binden.
CpG- und GpC-Motive werden internalisiert
Die Bindung der CpG-Motive an bovine Zellen führte ebenso zu einer raschen (5 Minuten
nach Zugabe) Internalisierung unter geeigneten in vitro Bedingungen (s. S. 92, 4.2.3). Dies
stellt einen weiteren Hinweis auf die potentiellen immunmodulatorischen Effekte dieser
Motive beim Rind dar, da die Hypothese besteht, dass CpG-vermittelte Effekte erst nach
Internalisierung zu beobachten sind: MANZEL und MACFARLANE (1999) haben dies mit
eleganten Versuchen zeigen können, in denen die Aufnahme blockiert wurde. Allerdings gilt
diese Hypothese nicht mehr generell, da HAYASHI et al. (2003) nach Studien mit CpGMotiven und humanen neutrophilen Granulozyten eine Internalisierung für initiale
Zellreaktionen nicht als zwingend notwendig erachten. Ebenso folgerten BYLUND et al.
(2002) aus ihren Untersuchungen, dass aufgrund der nach kurzer Inkubationsdauer zu
messenden Effekten bei Neutrophilen die Bindung an spezifische Rezeptoren für die
Aktivierung von neutrophilen Granulozyten ausreicht.
5.1.4 Interaktion von CpG Motiven mit bovinen MNC
CpG Motive besitzen eine Vitalitätssteigernde und schwach proliferative Wirkung auf
bovine MNC in vitro
Ein klassischer Weg um die Beeinflussung mononukleärer Zellen über Stimuli nachzuweisen,
stellt die Proliferationsinduktion dar. Bereits BROWN et al. (1998) verwendeten dieses
Verfahren um zu zeigen, dass ein CpG-Motiv zur selektiven Proliferation von B-Zellen führt,
nicht hingegen das reverse GpC-Motiv. Allerdings wurde dort mit aufgereinigten B-Zellen
gearbeitet, um selektiv die B-Zell proliferative Reaktion anhand des Einbaus von 3HThymidins in aktivierte Zellen zu zeigen.
Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Verfahren basierte hingegen auf der Erfassung
vitaler Zellen und vitaler Blasten. Diese Messungen belegen, dass CpG-Motive (inklusiv des
reversen GpC-Motivs aus der Studie von BROWN et al. 1998) zu einer messbaren,
wenngleich sehr schwachen proliferativen Antwort bei bovinen mononukleären Zellen führen
124
Diskussion
(s. 4.3.1). Dies zeigte sich insbesondere im Vergleich mit dem hier verwendeten Superantigen
SEA, welches zu einer starken Vermehrung der Zahl vitaler Blasten führte. Die Befunde
stehen etwas in Kontrast zu dem rein CpG-spezifischen Effekt von BROWN et al. (1998) allerdings wurden dort zwischen 20 bis 40 µg/ml DNA-Sequenz eingesetzt, demnach die vierbis achtfachen Konzentration der in der vorliegenden Arbeit verwendeten.
PONTAROLLO et al. (2002) beschrieben unter anderem die proliferationsinduzierende
Potenz der Motive CpG 2006 und 2007 für bovine Zellen, nicht jedoch von CpG 1760 und
1826. Die Daten der hier vorliegenden Studie widersprechen dem dahingehend, dass auch
durch CpG 2006 noch 2007 keine statistisch relevante Proliferationsinduktion nachgewiesen
werden kann. Allerdings lassen sich auch hier die Ergebnisse nicht direkt vergleichen, da sich
die Methodiken zur Erfassung der Proliferation unterschieden.
So ist es durchaus vorstellbar, dass die hier nachgewiesene Blastogenese der Zellen nicht mit
einer signifikanten Neusynthese von DNA einhergeht. Vielmehr besteht die Möglichkeit, dass
CpG-Motive zu einer Induktion anti-apoptotischer Faktoren führen, die das Absterben von
Zellen (Zyten und Blasten) verhindern oder die Kinetik des Absterbens der Zellen
verlangsamt. Gestützt wird diese These durch den nachgewiesenen (allerdings schwachen)
Anstieg der Zahl vitaler Zellen nach in vitro Stimulation mit CpG-Motiven (Tab. 13) und die
von KRIEG et al. (1995) beschriebenen anti-apoptotischen und proliferativen Effekte von
CpG-Motiven auf Lymphozyten.
Aufgrund der relativ geringen, CpG-induzierten Blastenzahl wurde nicht versucht die
proliferierende Subpopulation näher zu charakterisieren. Eine alleinige Aktivierung und
Proliferation von B-Zellen scheint jedoch nicht gegeben zu sein. Nach Analyse der MHCKlasse-II Expression auf in vitro kultivierten Zellen (s. Abb. 16) ließ sich eine leichte
Steigerung der Expression auf vorher MHC-Klasse-II negativen Zellen feststellen. Dies kann
als Beleg dafür gelten, dass die in vitro Stimulation der Zellen durch CpG-Motive nicht nur
die stark MHC-Klasse-II positiven B-Zellen anspricht, sondern auch andere
lymphoide/monozytoide Zellen. PONTAROLLO et al. (2002) wiesen zwar daraufhin, dass BZellen die primär proliferierende Subpopulation darstellen, eine optimale in vitro Stimulation
der lymphoiden Zellen jedoch unabdingbar von vorhandenen (aktivierten) Monozyten
abhängt, über die weitere Zellpopulationen zur Proliferation angeregt werden können.
Die hier nachgewiesen Modulation der MHC-Klasse-II-Expression durch CpG-Motive beim
Rind findet ihre Parallele in der CpG-vermittelten Steigerung der MHC-Klasse-II-Expression
auf humanen B-Zellen und Dendritischen Zellen (HARTMANN et al. 2000, HARTMANN
und KRIEG 2000).
125
Diskussion
Die Proliferationsinduktion scheint trotz des häufigen Einsatzes nicht die empfindlichste und
zuverlässigste Methode zum Nachweis CpG-vermittelter Effekte beim Rind zu sein. Zum
einen ist die Proliferationsreaktion eher schwach, zum anderen bestehen offensichtlich
erhebliche interindividuelle Unterschiede. Dies führt je nach betrachteter Tiergruppe dazu,
dass Unterschiede zur Mediumkontrolle nachgewiesen werden können oder nicht (vergleiche
die Tab. 13, Tab. 14 und Tab. 15).
Ein Grund für die beobachteten individuellen Unterschiede könnte darin liege, dass je nach
untersuchtem Tier sowohl proliferationsinduzierende als auch hemmende Prozesse induziert
werden können. So führen CpG-Motive nicht zwangsläufig immer zu einer Proliferation von
B-Zellen, sondern können ebenso zur Apoptose der Zellen führen, wie es YI et al. (1998b) für
die CpG-induzierte Apoptose muriner, aus der Milz stammender B-Lymphozyten beschrieben
haben und wie es für Superantigen stimulierte bovine B-Zellen (Proliferation/Apoptose) von
HENDRICKS (1998) gezeigt wurde.
5.1.5 Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit
neutrophilen Granulozyten
Nachdem gezeigt wurde, dass CpG-Motive an neutrophile Granulozyten binden wurde
untersucht ob diese Interaktion eine funktionelle Konsequenz besitzt. Ein schnell, leicht und
zuverlässig zu erfassender Parameter stellte die durchflusszytometrische Erfassung der
Zellvitalität dar. Die Veränderungen der Zellgröße (Vorwärtsstreulicht) und der Granularität
(Seitwärtsstreulicht) waren trotz der teilweise statistisch relevanten Unterschiede nicht stark
ausgeprägt.
Diese Interaktion wurde nur von einer leichten Vitalitätsminderung neutrophiler Granulozyten
in Reinkultur begleitet. Einzig für zwei der geprüften CpG-Motive (CpG 1760 und 2006) war
dieser Effekt signifikant (s. S. 98, 4.4.1). Dieser Effekt war relativ schwach und könnte
ebenfalls einen indirekten Effekt darstellen, da die PMN-Präparationen zwischen 2% und
10% MNC enthielten. In jedem Fall scheinen nur neutrophile Granulozyten derart
beeinflussbar gewesen zu sein, da dieser Effekt nicht bei eosinophilen Granulozyten
nachgewiesen werden konnte (s. S. 105, 4.4.5).
Allerdings waren diese Effekte stärker ausgeprägt wenn PMN in Reinkultur gemeinsam mit
SEA und CpG-Motiven inkubiert wurden (s. Tab. 16). Nach KRÜGER (2001) war dieser
Effekt durch Superantigeneinsatz allein nicht zu sehen. HAYASHI et al. (2003) haben an
humanen Neutrophilen keine direkte Aktivierung durch CpG-Motive feststellen können. Ein
direkter Einfluss jedoch besteht ihrer Aussage nach durch LPS und einen TLR-2-Liganden
126
Diskussion
(Pam3CSK4 TLR-2/-1 und Zymosan TLR-2/-6). In den hier beschriebenen Studien waren die
Vitalitätsverluste durch LPS zwar bei einigen Individuen sehr hoch, doch wurden keine
statistisch relevanten Unterschiede erreicht (s. Abb. 17). Durch Vorinkubation der
Neutrophilen mit GM-CSF konnten sie eine Aktivierbarkeit durch CpG-Motive nachweisen.
BYLUND et al. (2002) konnten eine Stimulation humaner PMN mit PT-Motiven,
wohingegen die gleichen Sequenzen mit einem PD-Rückgrat keinen Einfluss hatten. Eine
direkte Aktivierung von PMN ist somit nicht auszuschließen, auch wenn sie durch den
Parameter „Zahl vitaler Zellen“ statistisch nicht konsequent nachzuweisen ist.
Der Zelltod in vitro; Kritik des methodischen Ansatzes
Viele Arbeitsgruppen verwenden apoptotische Merkmale als Nachweis für eine
Vitalitätsverminderung. LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) bedienten
sich der durchflusszytometrischen Bestimmung der verminderten Zellgröße als Maß für die
Apoptose. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von Annexin V-FITC, das an
Phosphatidylserin bindet (FADOK et al. 1992). ALAM et al. (1999) hingegen verwendeten
Fluorochrom markierte Caspase-Substrate, um die Caspase-Aktivität während der
Apoptoseinduktion durchflusszytometrisch zu quantifizieren.
Apoptotische Zellen gehen in vitro jedoch schnell durch eine sekundäre Nekrose zugrunde
(WALSH et al. 1998). Der Zeitraum in dem der Nachweis einer primären Apoptose-Induktion
möglich ist, ist demnach nur kurz und bei der Verwendung verschiedener Stimuli nicht
unbedingt Zeitgleich. Apoptotische, noch membranintakte Zellen, die sich durch sekundäre
Nekrose als Propidiumiodid positiv darstellen, verlieren rasch ihre Membran- und
Kernintegrität, was eine eindeutige Zuordnung ebenfalls erschwert. Durch Wahl eines
falschen Messzeitpunktes besteht zudem die Gefahr der falsch positiven oder negativen
Bestimmung. Unterstützt wird diese Hypothese durch eigene Beobachtungen, die sowohl
einen selektiven Zellverlust der morphologisch veränderten Granulozytenpopulation (s. Abb.
23) sowie PI-positiver Zellen (s. Abb. 23) durch ein Verfahren der PS-Bindung erfassen.
Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der quantitative, durchflusszytometrische
Nachweis der Modulation der Zellvitalität eingesetzt, der zuverlässig die noch vitalen Zellen
erfasst, jedoch keine Aussage über die Art des Zelltodes zulässt.
PAMPs senken die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit MNC
Durch die Stimulation von Kokulturen boviner PMN mit MNC oder Makrophagen mit CpGMotiven, LTA und LPS konnte nach 22-stündiger Inkubation in vitro ein selektives,
127
Diskussion
akzeleriertes Absterben der neutrophilen Granulozyten (s. S. 100, 4.4.2) beobachtet werden.
Dieser PAMP-vermittelte Effekt in bovinen PMN/MNC Mischkulturen wurde erstmal von
KRÜGER (2001) nach Einsatz von Superantigenen beschrieben. Der Superantigen vermittelte
Effekt konnte in dieser Arbeit reproduziert werden (s. S. 100, 4.4.2) und erwies sich als
stärker als der gleichgerichtete Effekt verschiedener weiterer PAMPs (CpG-Motive, LPS,
LTA).
Interessant in diesem Zusammenhang ist jedoch die Tatsache, dass bisher alle beim Rind
untersuchten PAMPs, gleich an welche Rezeptoren sie an Zelloberflächen binden, den selben
Vitalitäts-mindernden Effekt für neutrophile Granulozyten aufweisen. Dies scheint somit ein
generelles Phänomen der Wirkungsweise von Erregermustern darzustellen.
Überdies wurde gezeigt, dass der kostimulatorische Einsatz von PAMPs (CpG-Motive+SEA
oder CpG-Motive+LPS/LTA) in additiver Art und Weise die Vitalität neutrophiler
Granulozyten negativ beeinflusst (Tab. 16, Abb. 17). Dies erfolgte so stark, dass Unterschiede
zwischen den CpG-Motiven (wie sie bei alleinigem Einsatz noch beobachtet werden können)
nach Einsatz in Kombination mit SEA nicht mehr zutage traten. Ob die einzelnen
Stimulatoren (SEA und PAMPs) über unterschiedliche Mechanismen/Mediatoren wirken, ist
nicht bekannt, doch beschrieben HALLMANN et al. (2001) sowie UNDERHILL und
OZINSKY (2002) die Aktivierung der gleichen intrazellulären Signalkaskade mit der finalen
Translokation von NF-κB für alle TLR. SEA hingegen bindet an MHC-Klasse-II-Moleküle
sowie T-Zellrezeptoren und wirkt wahrscheinlich über andere, intrazellulär induzierte
Mechanismen. KRÜGER (2001) beschrieb, dass bei der Stimulation mit 1 ng/ml SEA ein
Plateau des induzierbaren Vitalitätsverlustes erreicht ist und zudem selbst bei logarithmischer
Konzentrationssteigerung des Stimulators kein weiterer Effekt erreicht werden konnte. Damit
kann ausgeschlossen werden, dass nach Kostimulation mit CpG-Motiven und SEA einzig
mehr von den relevanten, Apoptose fördernden Mediatoren aus stimulierten MNC freigesetzt
wurden. Vielmehr scheint wahrscheinlich, dass CpG-Motive die Sekretion anderer, ebenfalls
pro-apoptotischer Mediatoren – zusätzlich zu den SEA-induzierten – bewirken.
Neben dem Verlust vitaler Granulozyten wurde durch den kostimulatorischen Einsatz von
PAMPs die Granularität der Zellen im Mittel vermindert (s. Tab. 16 und Abb. 17). Dieser
Granularitätsverlust kann als Parameter einer Zellaktivierung interpretiert werden, die sich in
der Verschmelzung der Granula mit der Zellmembran zur Abgabe der Inhalte in den
Extrazellularraum äußert: BYLUND et al. 2002 beschrieben einen Granularitätsverlust
humaner Granulozyten nach 45-minütiger Stimulation mit PT-CpG-Motiven über die
Messung von Gelatinase und Vitamin B12 in den Kulturüberständen. Dies schien nach
BYLUND et al. (2002) bereits bei CpG-stimulierten PMN in Reinkulturen der Fall zu sein; in
128
Diskussion
dieser Arbeit wurden nur marginale Granularitätsveränderungen boviner neutrophiler
Granulozyten gesehen. Diese Unterschiede mögen wiederum in der Verwendung
unterschiedlicher Verfahren und dem Einsatz unterschiedlicher finaler Konzentrationen der
verwendeten CpG-Motive begründet sein.
Lösliche Faktoren von mononukleären Zellen sind für das akzelerierte Sterben boviner
neutrophiler Granulozyten verantwortlich
Ein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen MNC und PMN scheint nicht für den Tod
neutrophiler Granulozyten essentiell zu sein, da auch Überstände PAMP-aktivierter
mononukleärer Zellen das Sterben der PMN in ähnlichem Ausmaß induzieren (s. Tab. 17).
Diese konditionierten Überstände enthielten sowohl MNC-Mediatoren als auch die zur
Stimulation verwendeten CpG-Motive was nicht ausschließen lässt, dass CpG-Motive und
MNC-Mediatoren gleichzeitig nötig sind um zum akzelerierten Sterben der Neutrophilen zu
führen.
In der Summe kann der hier nachgewiesene CpG-induzierte Vitalitätsverlust boviner
neutrophiler Granulozyten ebenfalls als sehr empfindlicher und zuverlässigerer Parameter
einer MNC-Aktivierung angesehen werden. Zur Induktion des akzelerierten Sterbens boviner
PMN scheint eine deutliche Proliferationsreaktion der MNC nicht unabdingbar zu sein. Trotz
der sehr viel geringeren proliferationsinduzierenden Potenz von CpG-Motiven im Vergleich
zu SEA liegt der CpG-induzierte Vitalitätsverlust wesentlich näher an dem SEA-induzierten
(s. Tab. 13, Tab. 14 und Tab. 16). Noch deutlicher wird dies durch die zeitgleich zu den unter
4.4.3 beschriebenen Versuchen durchgeführten parallelen Proliferationsansätzen der selben
Tiere, in denen keine signifikanten Effekte durch CpG-Motive erzielt werden konnten (Daten
nicht gezeigt).
Es bestehen keine an den Progesteron- und Östrogenspiegel gekoppelten Unterschiede in
der Quantität des induzierten Zelltodes
Trotz des generellen Effektes der untersuchten PAMPs auf PMN in Kokultur mit MNC fiel
die hohe interindividuelle Varianz auf. Um sich den Ursachen zu nähern, wurde unter der
Hypothese, dass die Expression von PAMP-Rezeptoren (TLRs) hormonreguliert ist bei zwei
Tieren die Abhängigkeit des Zyklusstandes (Hormonstatus) dei differentiellen Reaktivität der
Zellen untersucht. Dies lag nahe, da verschiedene Autoren von einer Beeinträchtigung der
PMN-Funktionen durch physiologische Veränderungen der Sexualsteroide berichteten
(Steigerung der PMN-Zahl im Blut; stärkere Phagozytosefähigkeit in Abhängigkeit von
Östrogen; verringerte Fähigkeit zur ADCC durch hohe Progesteronspiegel) (ROTH et al.
1983, HOEDEMAKER et al. 1992, WESSENDORF et al. 1998).
129
Diskussion
Jedoch konnte bei zwei Tieren im Verlauf zweier Zyklen nur durch LTA ein qualitativer
Unterschied der induzierten Effekte auf bovine PMN in Kokulturen festgestellt werden
(s. S. 106, 4.4.6). Die quantitativen Unterschiede des Vitalitätsverlustes der vier Messzeitpunkte stehen in keinem Verhältnis zu den Progesteron- und Östrogenspiegeln im Blut.
Der Zustand der PMN entscheidet über den MNC-vermittelten Vitalitätsverlust mit
Bisher wurde für den Effekt nur die in MNC unterschiedlich stark induzierten proapoptotischen Mediatoren für die individuell unterschiedliche Apoptoserate der Neutrophilen
und damit für die individuellen Unterschiede verantwortlich gemacht. Gleichwohl müssen
PMN in der Lage sein mit entsprechenden Rezeptoren diese Signale zu erkennen. Somit kann
die individuell unterschiedliche Ausstattung der PMN mitentscheidend für ihren
Vitalitätsverlust sein.
Diese Hypothese bestätigte sich nach Analyse des Vergleichs autologer und allogener
PMN/MNC Kombinationen. Fälle in denen autologe Kombinationen unterschiedlich starke
Apoptoseraten der PMN aufwiesen (bei identischem Stimulus) sowie die PMN (in den
allogenen Ansätzen mit MNC andere Tiere) ähnliche Apoptoseraten aufwiesen, ließen nur
den Schluss zu, dass die Reaktionslage der PMN über deren Apoptose mitentscheidend ist. (s.
S. 108).
Im Gegensatz zu B- und T-Zellen bspw. exprimieren neutrophile Granulozyten konstitutiv
CD137, einen Rezeptor der TNF/NGF (nerve growth factor) Rezeptor Superfamilie, dem
jedoch die Todesdomaine fehlt (SIMON 2003). Durch denselben Autor wurde auch das
funktionelle Vorliegen von FAS Rezeptoren und FAS Liganden beschrieben. Diese
Rezeptoren und Liganden scheinen jedoch nicht für die spontane Apoptose neutrophiler
Zellen in vitro verantwortlich zu sein. Über die Regulation der Rezeptorexpression bestehen
bislang noch keine Kenntnisse, doch kann davon ausgegangen werden, dass nicht nur die antiund pro-apoptotischen Mediatoren, sondern auch die Rezeptoren einer Regulation
unterliegen. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass obwohl die Apoptose neutrophiler
Granulozyten durch in vitro Aktivierung von Mitgliedern der TNF/NGF Rezeptorfamilie
gesteigert werden kann, die spontane Apoptose der Neutrophilen letztendlich nicht
kalkulierbar ist (SIMON 2003).
Vergleichbare autolog/allogenen Kombinationen unter Verwendung von Makrophagen
anstelle der MNC lassen bislang im Wesentlichen den Schluss zu, dass die Makrophagen
(mehr als die PMN) und deren Stimulierbarkeit durch die verwendeten PAMPs
entscheidenden Einfluss auf die PMN innehaben. (s. Tab. 21). Endgültige Aussagen hierüber
130
Diskussion
bleiben allerdings weiterführenden Untersuchungen vorbehalten, da die Anzahl der Versuche
zu diesem Themenkomplex nur initiale Anhaltspunkte liefert.
PAMP-stimulierte MNC und Makrophagen sowie stimulierte Zellen aus allogenen MLCAnsätzen sezernieren offenbar Faktoren, die zum Vitalitätsverlust boviner Neutrophiler
führen, sei es allein oder im Konzert mit zusätzlich anwesenden PAMPs.
Geht man davon aus, dass es sich um die Induktion der Apoptose handelt, führt die Suche
nach verantwortlichen Faktoren im wesentlichen zu einer Vielzahl Apoptose hemmender
Zytokine und anderer Mediatoren. Nur wenige Berichte beschreiben rein Apoptose fördernde
Faktoren für Neutrophile (s. Tab. 3). Das Stickoxid-Radikal (NO, FORTENBERRY et al.
1998), der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), das Prostaglandin E2 (PGE2) und Fas-FasLInteraktionen (LILES et al. 1996) sind die wenigen bislang beschriebenen Mediatoren, wobei
für TNF-α und PGE2 sowohl pro- als auch anti-apoptotische Effekte beschrieben wurden
(s. Tab. 3). KRÜGER (2001) versuchte das Superantigen vermittelte beschleunigte Sterben
der Neutrophilen näher zu analysieren und konnte eine Bedeutung von TNF-α, von FasL und
PGE2 nicht nachvollziehen. Einzig für das Stickoxid (NO) konnte indirekt eine Beteiligung
an der Apoptoseinduktion nachgewiesen werden. FUCS et al. (1992) beschrieben die
vermehrte Produktion von IL-2, IL-4 und IL-3/GM-CSF in allogenen und syngenen MLCs.
Über IL-4 und GM-CSF ist jedoch bekannt, dass sie eine anti-apoptotische Wirkung auf
Neutrophile besitzen, und somit nicht als Induktoren für den Vitalitätsverlust in Betracht zu
ziehen sind (s. Tab. 3).
Ist Apoptose oder Nekrose für das akzelerierte PMN-Sterben verantwortlich?
Für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten wird von
vielen Arbeitsgruppen (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996,
WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998) generell die Induktion der Apoptose
verantwortlich gemacht. Dennoch blieb die Möglichkeit einer induzierten primären Nekrose
zu prüfen. Um sich dieser Frage in dieser Arbeit zu nähern wurde engmaschig über die Zeit
der in vitro Kultur eine Anfärbung der Zellen mit Annexin V-FITC durchgeführt
Der Anteil Annexin V-FITC-markierter Zellen stieg mit der Zeit nach Ansatz der in vitro
Kultur an, wobei die Fluoreszenzintensität unterschiedlich stark ausgeprägt war (s. Abb. 22).
Viele PMN wiesen nur eine schwache Bindung auf. Die Propidiumiodid und stark FL-1
positiven Zellen sind per definitionem im Übergang von einem primär apoptotischen in einen
sekundär nekrotischen Vorgang, in dem bereits ein Integritätsverlust der Zellmembran
vorliegt (s. Abb. 22). Ein primär nekrotischer Vorgang ist für diese schwach FL-1 positiven
131
Diskussion
Zellen denkbar, da sie im Gegensatz zu den stark FL-1 positiven Zellen auch eine schwache
Rotfluoreszenz aufwiesen. Über eine Permeabilisierung der Zellemembran kann sowohl PI als
auch Annexin V-FITC vermehrt in die Zelle eindringen und somit eine sich verstärkende
Fluoreszenz erklärt werden. Eine Abnahme der PI-Färbung der schwach zu den stark
fluoreszierenden Zellen ist nicht wahrscheinlich (Abb. 22 R2 und 5), was die Hypothese der
primär nekrotischen Vorgänge der FL-1 schwach positiven PMN unterstützt. Alle FL-3
positiven Zellen weisen einen starken Größen- und Granularitätsverlust auf (s. Abb. 22), was
zu der Vermutung führt, dass sie zu späteren Zeitpunkten nicht mehr als Zelle zu erkennen
sind, sondern als Detritus vorliegen. Da durch den Färbevorgang mit Annexin V-FITC die
Population mit diesen morphologischen Veränderungen selektiv depletiert wird, ist zu
erklären, dass im Verlauf der 22 h der Anteil PI positiver Zellen nicht in dem Maße steigt, wie
die Zahl vitaler Zellen ohne morphologische Veränderungen in den Parallelansätzen fällt
(Daten nicht dargestellt). Von KÖNIG (2003) wurden ebenfalls bovine PMN mit Annexin VFITC inkubiert. In dieser Arbeit war eine Unterscheidung der apoptotischen von den
nekrotischen Granulozyten eindeutig gegeben, wobei zu beachten ist, dass die Zellen mit
anderen Stimuli inkubiert wurden.
132
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Julia Dahnke:
CpG Motive und ausgewählte TOLL-like-Rezeptor-Liganden: Ihre
modulatorische Interaktion mit bovinen Leukozyten
Zellen des Immunsystems erkennen über Toll-like-Rezeptoren Molekulare Muster von
Erregern (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Zu der heterogenen Gruppe der
PAMPs gehören Moleküle wie das LPS Gram negativer Keime, die Lipoteichonsäure Gram
positiver Bakterien sowie nichtmethylierte DNA-Sequenzen mit einem CG-Dinukleotid im
Zentrum (CpG-Motive). In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob und in welcher Weise
Zellen des bovinen Immunsystems (lymphoide Zellen, in vitro generierte Makrophagen und
Granulozyten) durch verschiedene PAMPs, insbesondere CpG-Motive moduliert werden.
Mit Hilfe eines biotinylierten CpG- und eines GpC-Motivs konnte in der Membranfluoreszenz nach Einsatz eines amplifizierenden Systems gezeigt werden, dass DNA-Motive
Bindungsstellen auf allen untersuchten Zellpopulationen besitzen (Lymphozyten, Monozyten,
neutrophile und eosinophile Granulozyten sowie Makrophagen). Die Bindungskapazität
unterschied sich sowohl zwischen den Zellpopulationen als auch innerhalb einer bestimmten
Zellpopulation. Das CpG-Motiv band stärker an eine Subpopulation MHC-Klasse-II positiver
B-Zellen als das reverse GpC-Motiv. Mit Hilfe der intrazellulären Fluoreszenz konnte
nachgewiesen werden, dass eine Internalisierung der DNA-Motive bereits nach 5-minütiger
Inkubation boviner Zellen stattfindet.
Die von CpG-Motiven induzierte, durchflusszytometrisch erfasste Blastogenese von
lymphoiden Zellen erwies sich gegenüber einem potenten Stimulus (Superantigen SEA) als
schwach aber signifikant. Der kostimulatorische Einsatz von CpG-Motiven und SEA erwies
sich als additiv. Die Stimulierung boviner lymphoider Zellen durch CpG-Motive in vitro
führte zu einer gesteigerten MHC-Klasse-II-Expression.
Keines der untersuchten PAMPs (CpG-Motive, LPS und LTA) besaß einen markanten
Einfluss auf die Vitalität eosinophiler oder neutrophiler Granulozyten in reinen PMNKulturen. Der Vitalitätsverlust lag bei der Stimulation durch jeweils einen Stimulus bei
maximal 10%. In Kokulturen von PMN und frisch isolierten MNC konnte durch alle
untersuchten Stimuli mit Ausnahme des LTA ein Vitalitätsverlust der Neutrophilen induziert
werden. Die signifikant erniedrigten Restvitalitäten (im Vergleich zur Mediumkontrolle)
neutrophiler Granulozyten betrugen nach Stimulation mit einzelnen CpG-Motiven zwischen
64% und 85%, nach Stimulation mit dem Superantigen SEA (52%±20) mit LPS (75%±24)
und mit LTA 96%±26. Unterschiede zwischen verschiedenen CpG-Motiven konnten
133
Zusammenfassung
ebenfalls nicht festgestellt werden. Bei kombiniertem Einsatz von CpG-Motiven mit anderen
Erregermustern (dem Superantigen SEA, dem LPS oder dem LTA) addierten sich die
Vitalitätsmindernden Effekte der Einzelstimuli. Bei Verwendung der potentesten
Stimuluskombination betrug die Restvitalität der neutrophilen Granulozyten 28%. Das
PAMP-induzierte Sterben der Granulozyten erwies sich als selektiv für neutrophile
Granulozyten, die Vitalität eosinophiler Granulozyten blieb unbeeinflusst. Für den
Vitalitätsverlust waren hauptsächlich die von MNC sezernierten löslichen Faktoren
verantwortlich, da durch Inkubation der PMN mit Kulturüberständen stimulierter MNC einen
vergleichbaren Vitalitätsverlust aufwiesen.
Um die Interaktion von PAMPs mit in vitro generierten Makrophagen zu untersuchen, wurde
ein Alternativverfahren zur Generierung dieser Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes
etabliert. Das Verfahren unter Verwendung von Zellkulturflaschen erwies sich als effizienter
als das Verfahren in Teflonbeuteln (bei vergleichbaren morphologischen, phänotypischen und
funktionellen Eigenschaften der generierten Makrophagenpopulationen) und wurde für die
nachfolgenden Versuche vorgezogen.
Nach Etablierung einer durchflusszytometrischen Methode zur Erfassung der Stickoxidbildung auf Einzelzellebene mit Hilfe des NO-sensitiven Fluorochroms DAF-2 DA zeigte
sich, dass CpG-Motive allenfalls eine schwache NO-Bildung von Makrophagen induzierte.
PAMP-stimulierte Makrophagen führten hingegen in sehr effizienter Weise ebenfalls zu
einem selektiven Vitalitätsverlust von neutrophilen Granulozyten in Kokulturen aus
Makrophagen und PMN.
Der Vergleich autologer (PMN und MNC/Makrophagen vom selben Tier) mit allogenen
Stimulationsansätzen (PMN und MNC/Makrophagen von verschiedenen Tieren) belegte, dass
neben der Stimulierbarkeit der MNC/Makrophagen ebenso die individuelle Reaktionslage der
PMN mitentscheidend für den indirekt induzierten Zelltod der neutrophilen Granulozyten ist.
Letztere scheint zumindest nicht Progesteron-/Östrogengesteuert zu sein, da der Zyklusstand
eines Tieres keinen erkennbaren Einfluss auf die Reaktionsbereitschaft der neutrophilen
Granulozyten erkennen ließ.
Der PAMP-vermittelte, Vitalitäts-mindernde Effekt für neutrophile Granulozyten scheint
generell durch verschiedenste Erregermuster durch Stimulation von MNC und Makrophagen
induziert zu werden. Dies kann für den pathogenen Organismus einen Vorteil darstellen, da er
über seine Erregermuster Effektorzellen eliminiert. Ebenso bleibt denkbar, dass dieses
Phänomen eine Schutzreaktion des Wirtes gegen zu viele und zu stark aktivierte neutrophile
Granulozyten darstellt.
134
Summary
7 Summary
Julia Dahnke:
CpG-motifs
and
selected
Toll-like-receptor-ligands:
their
modulatory interaction with bovine leukocytes
Immune cells recognize Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) with Toll-likereceptors. Examples for members of this heterogeneous group of PAMPs are the
lipopolysaccharide of Gram negative bacteria, the lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
as well as non-methylated DNA sequences containing a central CG dinucleotide (CpG
motifs). In this study it was evaluated, whether and how bovine immune cells (lymphocytes,
in vitro generated macrophages and granulocytes) are modulated by different PAMPs,
especially by different CpG-motifs.
Membrane fluorescence studies under amplifying conditions utilizing a biotinylated CpG and
GpC motif could show that DNA motifs have binding sites on all investigated cell populations
(lymphocytes, monocytes, neutrophils and eosinophils). The binding capacity for DNA motifs
differed between the cell types as well as within a distinct cell population. The CpG motif
bound stronger to a subpopulation of MHC class II positive B cells compared to the reverse
GpC motif. Intracellular fluorescence assays proved, that internalization of DNA motifs
occurs rapidly already beginning after 5 minutes of incubation.
Compared to a potent stimulus (superantigen SEA), CpG motifs induced only a weak
(although significant) proliferative response of blood mononuclear cells (MNC). Combined
stimulation of MNC with SEA and CpG motifs resulted in an additive effect. CpG stimulation
of bovine lymphocytes resulted also in an enhanced MHC class II expression.
None of the studied PAMPs (CpG motifs, LPS, LTA) clearly affected the viability of pure
bovine neutrophilic granulocytes: compared to controls, 90% of stimulated granulocytes
remained viable. However, in co-cultures of PMN and freshly isolated MNC, the addition of
the PAMPS (except LTA) resulted in a loss of neutrophil viability. The percentages of
remaining viable neutrophils ranged between 64% and 85% after stimulation with CpG
motifs, (52%±20) after stimulation with SEA, (76%±24) due to LPS stimulation and 96%±26
after stimulation with LTA.
Differences between distinct CpG motifs were not observed. The combined stimulation of
PMN/MNC co-cultures with CpG motifs and other stimuli (SEA, LPS or LTA) resulted in an
additive effect. Using the most potent stimulus combination (SEA+CpG 2007) the remaining
viability of neutrophils was 28%. Killing of granulocytes was selective for neutrophils,
eosinophils remained unaffected. Direct cell interactions between PMN and MNC were not
135
Summary
necessary for the killing of neutrophils since culture supernatants of stimulated MNCs
induced the same degree of neutrophil viability loss.
To study the interaction of PAMPs with in vitro generated macrophages, first an alternative
method to generate macrophages from blood monocytes was established. The method using
cell culture flasks proved to be more efficient compared to the usage of teflon bags and
resulted in the generation of macrophages with comparable morphological, phenotypical and
functional properties.
The flow cytometric determination of nitric oxide generation on single cell level using the
fluorochrome DAF-2 DA showed, that CpG motifs only slightly induce NO generation in
bovine macrophages.
However, stimulation of macrophages with PAMPs also resulted in a very efficient killing of
simultaneously present neutrophils.
Comparisons between autologous (PMN and MNC/macrophages from the same animal) and
allogeneic (PMN and MNC/macrophages from different animals) stimulation assays showed,
that killing of neutrophils is also governed by the physiological status of PMN. This doesn’t
seem to be regulated by either progesterone or estrogen since the cycle stage of an animal had
no apparent influence on the degree of losing viability among neutrophils.
The PAMP-mediated, viability-depressing effect for neutrophils generally appears to be
induced by a large variety of pathogen associated patterns. This may reflect an advantageous
mechanism induced by pathogens, which eliminates effector cells directed against them. It
may also be that this observed phenomenon is a reaction of the infected host, which protects it
from tissue damage by to many activated neutrophilic granulocytes.
136
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Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „CpG Motive und ausgewählte
TOLL-like-Rezeptor-Liganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen Leukozyten“
selbständig verfasst habe. Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden folgende Hilfsmittel
und Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
− Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie zur Verfügung
gestellt.
− Die Zubereitung der Zellkulturmedien erfolgte durch Frau Silke Schöneberg und Herrn
Hans-Udo Rabe.
− Der Vergleich zweier Methoden zur Gewinnung und Kultivierung von aus Monozyten
generierten Makrophagen geschah in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Torge König von der
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
− Die Bestimmung der Blut-Progersteron- und Blut-Östrogen-Konzentrationen wurde durch
das Endokrinologische Labor der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule
Hannover durchgeführt.
Ich habe die Dissertation an folgender wissenschaftlichen Einrichtung angefertigt:
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
_____________________________________
(Julia Dahnke)
Hannover, 25.08.2003
Danksagung
Zuerst möchte ich Herrn PD Dr. H.-J. Schuberth für die Überlassung des Themas und die
herzliche Aufnahme in der Immunologie danken. Ohne seine allzeit „auf Anklopfen“ offene
Tür, sowie die nahezu aufopfernde Art mit seinem Wissen zur Seite zu stehen, wäre die
Erstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Auch nach dem x-ten Bericht einer
Niederlage im Forscheralltag konnte nach einem kurzen, das Institut erschütternden Schrei
mit aufbauenden und hilfreichen Worten gerechnet werden - Danke dafür. Durch sein
Vermögen auch bei fachlichen Diskussionen und Erläuterungen seinen Humor nicht zu
verlieren, war ein Segen für die Zusammenarbeit. Auch bei den kleinen oder großen
alltäglichen Problemen mit meinen kleinen Freunden, den Computern, konnte fast immer eine
Lösung durch ihn gefunden werden.
Herrn Prof. Dr. W. Leibold danke ich sehr herzlich für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes,
das stets offene Ohr und die jederzeit gern beigesteuerten Gedankengänge und Einwände.
Lilli und ich möchten uns dafür bedanken, dass wir nun gemeinsam ein erfülltes und
abwechslungsreiches Leben verbringen dürfen.
Ebenfalls zu herzlichem Dank verpflichtet bin ich Herrn Dr. H. Zerbe, der immer für die
Lösung von Problemen praktischer Natur mit den Rindern zur Stelle war. Ihm ist es zu
verdanken, dass in dieser Arbeit die hormonellen Einflüsse auf die Reaktion des bovinen
Immunsystems einbezogen werden konnte. Seine Ideen und Diskussionsbeiträge haben
ebenfalls entscheidenden Anteil an der Entwicklung der alternativen Makrophagengenerierung beigetragen.
Ein großer Dank gilt auch den fleißigen Heinzelmännchen des Labors der Arbeitsgruppe
Immunologie: Frau Sonja Kordex, Frau Silke Schöneberg und Herrn Udo Rabe, denn nur
durch ihr Wissen, ihre Ausdauer, ihre ständige Hilfsbereitschaft und unerschöpfliche Gedult
mit den allgegenwärtigen „Problemen“ der Doktoranden haben sie nicht nur die praktische
Durchführung der Laborarbeit ermöglicht.
Wenn auch die Arbeit im Labor so manches Mal zu laut ausgesprochenen Flüchen geführt
hat, so war es doch eine schöne Zeit in der Arbeitsgruppe Immunologie, denn ihr wart ja da.
Ihr, meine Leidensgefährten und Mitdoktoranden, die ihr das gleiche Schicksal wie ich
durchleidet oder durchlitten habt. Ich danke Euch für das angenehme Arbeitsklima, die
offenen Ohren, die fachliche Unterstützung und notwendige Diskussion.
Nein, Herr Dr. Torge König, dich habe ich natürlich nicht vergessen. Dir möchte ich nicht nur
für die unermüdliche und zu guter Letzt immer erfolgreiche und angenehme Zusammenarbeit
danken. Ohne dich hätte ich wahrscheinlich niemals einen „Fixateur“ für Wilma und Betty
gehabt.
Mein Dank gilt ebenfalls den stehts zu Diensten stehenden Tierpflegern und Auszubildenden
der Klinik für Rinder – Thomas und Kara Euch Danke ich besonders.
Dir Mama möchte ich für deine seelische und nicht zu vergessen die finanzielle Unterstützung
danken, denn ohne sie wäre ich mit Sicherheit nicht so weit gekommen.
Meiner WG danke ich; denen, die einmal dazugehörten (Maike Granel und Angela Borchers)
und mich während der langen Laborzeit nach den immer wiederkehrenden Niederschlägen
(„schon wieder kontaminiert“) und Sarah Winkelsett, die bis jetzt mit mir leidet und immer
wieder einen Weg findet mich abzulenken.
Frau Dr. Ingrid Vervuert danke ich für Ihren Einsatz mir mit viel Geduld durch die
statistischen Irrungen und Wirrungen zu helfen.
Schließlich gilt mein Dank meinen Korrekturlesern Frau Hilke Winkler, Herrn Rolf Reil und
Herrn Arnold Schnermann für ihre Bereitschaft, unter wiedrigsten Bedingungen das Chaos in
der Orthographie zu beseitigen und so zur äußeren Form dieser Arbeit beizutragen, obwohl
manche Absätze mit Sicherheit an Verständlichkeit und Spannung zu überbieten sind.
Vielen vielen Dank Dir Jens, für den unerschütterlichen Langmut den du mir gegenüber
während der ganzen Zeit aufgebracht, mit dem Du meine Launen ertragen und es trotz großer
Beharrlichkeit meinerseits es Dir schwer zu machen, es immer wieder geschafft hast mich auf
aus den unzähligen Tälern der Zweifel herauszuholen.
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