CpG Motive und ausgewählte Toll-like-Rezeptor
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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover CpG Motive und ausgewählte Toll-like-RezeptorLiganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen Leukozyten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Julia Dahnke aus Schwerte Hannover 2003 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 1. Gutachter: PD Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hewicker-Trautwein Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2003 meiner Mama in Liebe und Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ............................................................................. 8 1 Einleitung und Zielsetzung ................................................................................................ 11 2 Literaturübersicht............................................................................................................... 12 2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem ......................................................................12 2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch Komponenten des Immunsystems.........................................................................................................................13 2.2.1 Mannose bindendes Lektin (MBL) ....................................................................... 13 2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14) ..................................................................... 14 2.2.3 Toll-like-Rezeptoren ............................................................................................. 14 2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster ..............................................................................22 2.3.1 CpG-Motive........................................................................................................... 22 2.3.2 Lipopolysaccharid (LPS)....................................................................................... 29 2.3.3 Lipoteichonsäure (LTA)........................................................................................ 29 2.4 Bakterielle Superantigene.......................................................................................................30 2.5 Neutrophile Granulozyten ......................................................................................................32 2.5.1 Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten.................................. 32 2.5.2 Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten.............................................. 32 2.5.3 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr............................ 33 2.6 Makrophagen...........................................................................................................................34 2.7 Apoptose und Nekrose ............................................................................................................35 2.7.1 Induktion der Apoptose ......................................................................................... 35 2.7.2 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten.............................................................. 36 3 Geräte, Material und Methoden......................................................................................... 38 3.1 Geräte .......................................................................................................................................38 3.2 Material ....................................................................................................................................39 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 Klinikbedarf........................................................................................................... 39 Laborbedarf ........................................................................................................... 39 Reagenzien ............................................................................................................ 40 Antikörper und Nachweisreagenzien .................................................................... 43 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ..................................................................... 44 3.2.6 Tiere....................................................................................................................... 51 3.3 Methoden..................................................................................................................................52 3.3.1 Gewinnung einzelner Zellpopulationen aus bovinem Blut ................................... 52 3.3.2 Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung monozytoider Zellen des peripheren Blutes (BMDM, blood monocyte derived macrophages) ............. 53 3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen .......................................................................... 57 3.3.4 Durchflusszytometrie ............................................................................................ 58 3.3.5 Zellkultivierung in vitro ........................................................................................ 63 3.3.6 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ....................................................... 69 3.3.7 Statistische Verfahren............................................................................................ 72 4 Ergebnisse........................................................................................................................... 73 4.1 Generierung und Charakterisierung boviner Makrophagen..............................................73 4.1.1 Methodische Vorarbeiten ...................................................................................... 73 4.1.2 Messung der Nitrit-Bildung durch in vitro generierte Makrophagen.................... 77 4.2 Bindung von DNA-Motiven an bovine leukozytäre Zellen und in vitro generierte Makrophagen ..........................................................................................................................85 4.2.1 Klassischer Bindungsnachweis ............................................................................. 85 4.2.2 Alternativer Bindungsnachweis mittels Amplifikation......................................... 87 4.2.3 Prüfung der Internalisierung biotinylierter DNA-Sequenzen ............................... 92 4.3 Prüfung der Proliferation induzierenden Potenz von CpG-Motiven auf bovine mononukleäre Zellen in vitro.................................................................................................93 4.3.1 Proliferative Eigenschaften von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA.................. 93 4.3.2 MHC-Klasse-II-Expression in vitro stimulierter boviner mononukleärer Zellen des Blutes .............................................................................................................. 96 4.4 Das beschleunigte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten in vitro............................98 4.4.1 Effekte von CpG-Motiven, LPS und LTA für reine neutrophile Granulozyten ... 98 4.4.2 Einfluss von CpG-Motiven, LPS und LTA auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen aus PMN und MNC.......................................................................... 100 4.4.3 Einfluss von Kulturüberständen CpG-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten .................................................................................... 102 4.4.4 Einfluss von Kulturüberständen aus allogenen MLCs ........................................ 104 4.4.5 Einfluss von CpG-Motiven auf eosinophile Granulozyten ................................. 105 4.4.6 Abhängigkeit des Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten vom Progesteronspiegel............................................................................................... 106 4.4.7 CpG-Motive in Kombinationsansätzen aus bovinen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten .................................................................................. 108 4.4.8 Bedeutung der Reaktionslage von neutrophilen Granulozyten für das Ausmaß ihres Vitalitätsverlustes nach PAMP-Stimulation............................................... 109 4.4.9 Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro Kokultivierung von PMN und MNC in Anwesenheit von TLR-Liganden ......................................... 113 5 Diskussion......................................................................................................................... 119 5.1.1 Beurteilung der in vitro generierten Makrophagen ............................................. 119 5.1.2 Nachweis der Produktion von NO in MNC und Makrophagen .......................... 120 5.1.3 Bindung und Internalisierung von CpG-Motiven durch Zellen des peripheren Blutes und Makrophagen..................................................................................... 123 5.1.4 Interaktion von CpG Motiven mit bovinen MNC ............................................... 124 5.1.5 Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit neutrophilen Granulozyten ....................................................................................................... 126 6 Zusammenfassung............................................................................................................ 133 7 Summary ........................................................................................................................... 135 8 Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 137 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. ACD-Puffer ADCC Aqua tridest. BoBMDM BoCD BoLA BSA bspw. bzw. C1q C5a ca. CD CD4+ CD8+ CO2 ConA CpG CR D DAF-2 DA DAF-2 T DNA DS E. coli EDA EDTA FACScan® Fc FCM FCS FITC FL-1, -2, -3 Abbildung Acid-Citrate-Dextrose (Citronensäurehydrat-Natriumzitrat-DextrosePuffer) Antibody Depending Cell Cytoxicity (Antikörperabhängige Zellzytotoxizität) Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Bovine Bone Marrow Derived Macrophages Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für bovine Homologe zu humanen Differenzierungsantigenen mit CD-Nomenklatur Bovine Cluster of Differentiation, Bezeichnung für den Haupthistokompatibilitätskomplex des Rindes Bovines Serumalbumin Beispielsweise Beziehungsweise Fragment der Komplementkomplemente C1 aktiviertes Fragment der Komplementkomponente C5 Zirka Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen) Zellen, die das Differenzierungsantigen CD4 an der Oberfläche exprimieren Zellen, die das Differenzierungsantigen CD8 an der Oberfläche exprimieren Kohlenstoffdioxid Concanavalin A Cytosin-Phosphate-Guanosin Complement Receptor (Komplementrezeptor) dies (lateinisch: Tag); D0 = Ausgangsmessung vor einem Versuch, D5, D6 = 5 bzw. 6 Tage nach Versuchsbeginn Diaminofluoreszein-2 Diazetat Diamino Triazolfluoreszein Desoxyribonukleinsäure Danger Signal (Gefahrensignal) Escherichia coli Extra domain A Ethylendiamintetraacetat Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg) Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy- terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung) Flow Cytometer (Durchflusszytometer) Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) Fluoreszeinisothiocyanat Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm) FSC g G-CSF GM-CSF h HRP HSP I10F+Strep ICAM IFN Ig IL i.m. iNOS i.p. l LBP LFA-1 LPS LTA LTB4 µ m M mAK MAP MBL MDM MHC MIF min MNC MW Mph N NaCl n NO Nr. ODN P PAMP PBS PD PE Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Gramm Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (GranulozytenMakrophagen-Wachstumsfaktor) hora (lateinisch: Stunde) Horse-Radish-Peroxidase Heat Shock Protein (Hitzeschockprotein) Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) Interferon Immunglobulin Interleukin intra muskulär induzierbare Stickstoffoxid Synthetase intra peritoneal Liter Lipopolysaccharid-Binding Protein Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1 Lipopolysaccharid Lipoteichonsäure Leukotrien B4 mikro (x 10-6) milli (x 10-3) Molar (Mol/l) monoklonale(r) Antikörper Mitogen Activated Protein Mannose Binding Lectin (Mannose bindendes Lektin) Monocyte Derived Macrophages – aus Monozyten gewonnene Makrophagen Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Membranimmunfluoreszenz Minute(n) Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) arithmetischer Mittelwert Makrophagen bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen Natriumchlorid nano (x 10-9) Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) Nummer Oligodeoxynukleotide Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) Phosphodiester Phycoerythrin Pellet PGE2 PI PMN PS PT ROS RT S s. s.c. s.S. SDCC SEA sek sog. SSC Tab. TAD TCR TIRAP TIR TNF TIR TOLLIP TRAF6 TRAMP u.a. vgl. v/v xg z.B. z.T. Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen Progesteron E2 Propidiumiodid Polymorphonuclear Leukocytes (Granulozyten) Phosphatidylserin Phosphorothioat Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies) Raumtemperatur Standardabweichung siehe sub cutan siehe Seite Superantigen Dependent Cellular Cytotoxicity (Superantigen abhängige zelluläre Zytotoxizität) Staphylococcus aureus Enterotoxin A Sekunde(n) sogenannte(r) Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Tabelle TGF-β-Activated Kinase T Cell Receptor (T-Zellrezeptor) TIR-Domain-Containing Adapter Protein Toll Interacting Receptor Tumornekrosefaktor Toll Interacting Protein Toll interacting Protein TNR-Receptor-Associated Factor 6 TNF-Receptor Related Apoptosis Mediating Protein unter anderem vergleiche Volumen pro Volumen multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²) zum Beispiel zum Teil Einleitung und Zielsetzung 1 Einleitung und Zielsetzung Zellen des Immunsystems erkennen Erregerbestandteile über sog. „Erreger-assoziierte molekulare Muster” (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Die PAMPs stellen eine sehr heterogene, vielfältige Gruppe dar. Unter ihnen befinden sich Moleküle wie das Lipopolysaccharid Gram negativer Keime, die Lipoteichonsäure Gram positiver Bakterien und auch nicht-methylierte DNA-Sequenzen, die im Zentrum ein CG-Dinukleotid aufweisen (CpG-Motive) und nahezu allen Gruppen an Infektionserregern (Viren, Bakterien, Protozoen) gemeinsam sind. Zellen des Säuger-Immunsystem besitzt für diese PAMPs Rezeptoren (Toll-like-Rezeptoren), über die sie die Präsenz von Erregern erkennen. Die TLR sind genetisch determinierte Rezeptoren, die das Bindeglied zwischen dem konstitutiven und adaptiven Immunsystem bilden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen CpG-Motive, da über ihre Wirkung auf Zellen des bovinen Immunsystems nur wenig bekannt ist. Für Mensch und Maus sind variable Wirkungen verschiedener Motive beschrieben, abhängig von den das Zentralmotiv flankierenden Nukleotiden. Neben stimulatorischen werden ebenso Zellfunktions-hemmende und wirkungslose Motive beobachtet. Längerfristiges Ziel solcher Studien ist es, die CpG-Motive in der Prophylaxe (Adjuvans bei Immunisierungen) und der Therapie (Immunstimulanz, Allergie- und Tumorbekämpfung) einzusetzen. Vorraussetzung hierfür ist die genaue Charakterisierung ihrer Wirkungsart auf bestimmte Zelltypen. Wie und in welcher Weise Zellen des bovinen Immunsystems auf verschiedene CpG-Motive funktionell reagieren ist jedoch erst in Ansätzen bekannt. Das Promotionsvorhaben soll hierfür einen Beitrag leisten, indem verschiedene CpG-Motive auf ihre funktionsmodulierende Wirkung für leukozytäre Subpopulationen des Rindes vergleichend untersucht werden. Im Einzelnen sollte geprüft werden, ob CpG-Motive präferentiell an bestimmte Zellsubpopulationen binden, ob und in welchem Umfang verschiedene Motive eine proliferations-modulierende Potenz für lymphoide Zellen aufweisen und ob sie die Vitalität einer entscheidenen Effektorzellopulation – der neutrophilen Granulozyten – direkt oder indirekt beeinflussen. Da eine der ersten Zellen des Immunsystems nach Erregerkontakt, der gewebsständige Makrophage in der Steuerung der nachfolgenden Immunreaktionen eine zentrale Rolle einnimmt sollte zudem die Interaktion bakterieller DNA-Motive und weiteren PAMPs (LPS, LTA) mit Surrogatzellen – den in vitro generierten Makrophagen aus Blutmonozyten – stellvertretend geprüft werden. 11 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht Nach Infektion mit verschiedenen Erregern reagiert der Säugerorganismus mit einer Immunantwort (oder verschiedenen Immunmechanismen), die zum Ziel hat, die Ausbreitung des Erregers zu verhindern, den Erreger zu eliminieren und ein immunologisches Gedächtnis aufzubauen, das ihm ermöglicht bei erneutem Kontakt mit dem Erreger diesen schneller zu eliminieren. Der primäre Kontakt mit dem Erreger und seinen Bestandteilen erfolgt durch Epithelzellen, Dendritischen Zellen und Gewebsmakrophagen. Diese Zellen stellen die ersten Barrieren sowie die ersten Signalgeber für das Vorhandensein eines potentiell schädigenden Agens dar. Da diese Zellen über keine Antigen spezifischen Rezeptoren verfügen und somit nicht im klassischen Sinn zwischen „Selbst“ und „Fremd“ unterscheiden können, wurde ein weiteres Paradigma in die Immunologie aufgenommen. Dies besagt, dass es weniger auf die „Fremdheit“ eines Antigens ankommt um entzündliche oder adaptive Immunantworten auszulösen, sondern vielmehr, dass das Antigen in der Lage ist, „Gefahr“ für den Organismus zu signalisieren. Dieses Konzept der „Danger Signals“ wurde erstmalig von MATZINGER (1994) zur Diskussion gestellt und seit dieser Zeit mit grossem Gewinn für das Verständnis initialer Immunprozesse ausgiebig diskutiert. 2.1 „Danger Signals“ (DS) für das Immunsystem Das Vorliegen von Danger Signalen führt in verschiedenen Zelltypen des Immunsystems zu charakteristischen Folgeprozessen, die letztendlich das Startsignal für eine erfolgreiche Auseinandersetzung mit dem Träger oder Aussender des DS darstellen. DS können sowohl endogener als auch exogener Herkunft sein (MATZINGER 2002). Exogene DS sind nicht genau definiert, doch werden Moleküle wie das NiCl2, MnCl2, CoCl2 und SnCl2 zu einer Gruppe exogener DC-Schadstoffe gezählt. Nach MATZINGER (2002) wirken exogene Faktoren wie z.B. LPS, Lipoproteine oder CpG Motive als Danger Signals, da sie ebenfalls an identischen Rezeptoren (CD14, TLR-2, -4, -9) binden. Die exogenen Signale werden von Zellen des angeborenen Immunsystems, z.B. APC über genetisch determinierte Rezeptoren erkannt (HALLMAN et al. 2001), aufgenommen, prozessiert und über Oberflächenmoleküle präsentiert. Weiterhin führen sie zur Ausschüttung kostimulatorischer Signale, die das adaptive Immunsystem alarmieren (GALLUCCI und MATZINGER 2001, HALLMAN et al. 2001). Die endogenen DS sind Moleküle, die von Zellen unter besonderen Stressverhältnissen (bis zum abnormen Tod/Nekrose; s. S. 35, 2.7), abgegeben werden. Endogene DS werden zum einen in wahre „Primale“ bzw. Feedback Signale, welche von APC ausgeschüttet und 12 Literaturübersicht zum anderen in konstitutiv vorliegende und neusynthetisierte Signale unterteilt (GALLUCCI und MATZINGER 2001). Zu den „Primalen“ Signalen gehören u.a. Säugetier DNA, CD40ligand, TNF-α und IL-1β, die aber wegen ihrer weiteren Präsenz auch als Feedback Signal eingeordnet werden. Sie gehören in jedem Fall zu den konstitutiven DS. Induzierbare „Primale“ Signale sind z.B. Typ I IFN und Reaktive Sauerstoffspezies. Typ I IFN zählt ebenfalls zu den Feedbacksignalen. HSP (Heatshock Proteine) verbinden die Gruppen der konstitutiv exprimierten und induzierten Signale. 2.2 Erkennung von Erregern oder deren Bestandteilen durch Komponenten des Immunsystems Die Erkennung pathogener Organismen erfolgt meist spezifisch. Ein erster Weg ist die Erkennung konservierter Strukturen von Pathogenen mittels spezifischer, genetisch determinierter Rezeptoren (s. 2.2.3). Zu ihnen gehören u.a. die Cluster of Differentiation (CD) und Toll-like-Rezeptoren. Im adaptiven Immunsystem erkennen T- und B-Zell Rezeptoren dargebotene, prozessierte Bestandteile. Spezifische Immunglobuline erkennen ebenfalls Agstrukturen und werden ihrerseits über Fc-Rezeptoren erkannt. Auch über die Bindung von Mannose-bindendem Lektin (MBL) kann es zur Aktivierung der Komplementkaskade kommen. Auf weitere Möglichkeiten wird in dieser Literaturübersicht nicht eingegangen. 2.2.1 Mannose bindendes Lektin (MBL) Mannose bindendes Lektin (MBL) gehört zu der Protein-Familie der Kollektine. Es besteht aus Oligomeren, die jeweils aus drei Peptidketten, mehreren Lektin-Domänen, kollagenen Strukturen und einer Cystein-reichen N-terminalen Region aufgebaut sind (SASTRY et al. 1989, TAYLOR et al. 1989). Es ist ein Ca2+-abhängiges Lektin, das an 3- und 4Hydroxylgruppen verschiedener Zucker z.B. auf mikrobiellen Oberflächen bindet (DRICKAMER 1992, WEIS et al. 1992). Nicht nur strukturell, sondern auch funktionell ist MBL dem C1q sehr ähnlich. Beide Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Komplementaktivierung, der Opsonisierung mikrobieller Bestandteile und der Phagozytose dieser, sowie apoptotischer Zellen durch Phagozyten (Neutrophile und Makrophagen). MBL vermittelt einen dritten Weg der Komplementaktivierung, der parallel zu dem klassischen Weg über C1q und dem alternativen Weg über Properdin/ Faktor-D läuft. Im humanen System sind 4 MBL Mutanten bekannt, die geographisch voneinander getrennt nur in bestimmten Bevölkerungsgruppen vorkommen und in Zusammenhang mit dem systemischen Lupus erythematodes und Rheuma in Verbindung gebracht werden (LIPSCOMBE et al. 1992). 13 Literaturübersicht 2.2.2 Cluster of differentiation 14 (CD14) CD14 ist ein auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten (YANG et al. 1995) exprimierter Rezeptor, der in hohen Konzentrationen auch solubilisiert vorliegt. Er ist Bestandteil des TLR-4-Komplexes (Toll-like-Rezeptor 4), dem Rezeptor für LPS (s. S. 16). Die in Lösung befindlichen Rezeptoren können nach der Bindung an LPS, Zellen, die kein CD14 exprimieren, aktivieren (HAZIOT et al. 1993). CD14 ist über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) in der Zellmembran verankert, besitzt jedoch in Ermangelung eines zytoplasmatischen Anteils keine Fähigkeit zytoplasmatische Signale zu transduzieren (ULEVITCH und TOBIAS 1995). Nach der Bindung des LPS-CD14-Komplexes an TLR-4 wird eine Enzymkaskade in Gang gesetzt, in deren Folge Zytokine wie z.B. Tumor Nekrose Faktor, IL-1, IL-6 und IL-8 ausgeschüttet (DENTENER et al. 1993, SCHUMANN et al. 1996) und die Expression verschiedener Oberflächenmoleküle, unter anderem Adhäsionsmoleküle, akzeleriert werden. Weiterhin ist CD14 für die Differenzierung apoptotischer und nekrotischer Zellen von Bedeutung (SCHLEGEL et al. 1999). Bei Makrophagen ist die Qualität der weiteren Reaktion von der Bindung durch CD14 abhängig. Für den Menschen und die Maus wurde beschrieben, dass LPS sich mit in Serum befindlichem LBP (Lipopolysaccharid-binding protein) kreuzvernetzen muss, um an CD14 binden zu können (ADEREM und ULEVITCH 2000). LBP ist ein Akute-Phase Protein der Leber, dessen Konzentration während systemischer Infektionen und der Akute-Phase Antwort dramatisch steigt. Es ist für die Monomerisierung von LPS-Vesikeln und dem anschließenden Transport zu den membranständigen CD14-Rezeptoren zuständig (SCHUMANN et al. 1996, LAMPING et al. 1998) Im Gegensatz zum murinen und humanen System scheint dies im bovinen System nicht notwendig zu sein (JUNGI et al. 1997). 2.2.3 Toll-like-Rezeptoren Der Name Toll-like-Rezeptor stammt von der bei der Fruchtfliege Drosophila als erstes entdeckten Rezeptorfamilie „Toll“ ab, die dem konstitutiven Immunsystem angehört. Sie bestehen aus einer extrazellulären leukin-reichen Region, einer transmembranalen Region und einem intrazellulären Bereich, der dem des IL-1 Rezeptors ähnlich ist. Toll besitzt einen spezifischen Liganden namens Spätzle. Spätzle ist ein durch die Verarbeitung mikrobieller Bestandteile entstandenes Molekül (MUZIO und MANTOVANI 2001). Tab. 1 gibt einen Überblick über die bislang identifizierten TLR und mögliche Liganden. 14 Literaturübersicht Aufgrund der hohen Homologie in Struktur und Gensequenz zu diesen Toll Rezeptoren konnten bei Mensch und Maus mindestens 10 verschiedene Toll-like-Rezeptoren identifiziert werden. Zurzeit ist noch kein Pendant zu Spätzle entdeckt worden, doch konnten spezifische Liganden einzelner TLR definiert werden, die gesamthaft der Gruppe der so genannten PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns) angehören (s. S. 22, 2.3). Diese Strukturen mit höchst konserviertem Aufbau kommen in einem sehr großen Spektrum von Mikroorganismen vor (MEDZHITOV et al. 1997). Zu ihnen gehören z.B. Lipoprotein, Flagellin (TLR-5), unmethylierte DNA-Motive (CpG-Motive) aus Nicht-Vertebraten (TLR9), sowie Mannane und Mannoproteine aus Hefen (s. Tab. 1). Ebenso wie die Rezeptoren der Toll Familie bei Drosophila bestehen auch die TLRs aus einer extrazellulären und einer intrazellulären Domaine, die die Zellmembran einmal kreuzt. Der intrazelluläre Anteil ist sowohl dem IL-1 Rezeptor als auch dem der Toll Rezeptoren sehr ähnlich und wird TIR (Toll/Interleukin-1 Rezeptor) genannt (GAY und KEITZ 1991). Alle Rezeptoren bis auf TLR9, dessen Lokalisation noch nicht eindeutig geklärt ist, befinden sich an der Oberfläche der Zellen (ARMANT und FENTON 2002). KRIEG (1999) beschreibt die Bindung und anschließende Internalisierung von CpG-Motiven von Zellen, die TLR-9 auf der Oberfläche exprimieren, wohingegen ARMANT und FENTON (2002) von einer intrazellulären Lokalisierung ausgehen. TLRs sind ein viel versprechendes Bindeglied zwischen den Erkennungsmechanismen von konstitutivem und adaptivem Immunsystem. Alle TLRs führen nach Bindung an ihre Liganden durch ähnliche intrazellulär ablaufende Mechanismen im Endeffekt zur Bildung von NF-κB oder JNK (c-JUN N-terminal kinase). Die Bindung von spezifischen Liganden an ihren Rezeptoren kann zur Freisetzung von Zytokinen und kostimulatorischen Molekülen und/oder Veränderung der Expression von Oberflächenmolekülen führen (MEDZHITOV und JANEWAY 1997). 15 Literaturübersicht Tab. 1 Toll-like-Rezeptoren und ihre Liganden Rezeptor Exogene Liganden TLR-2 +TLR-1, Bakt. Lipoproteine, Peptidoglykane, Zymosan (Saccharomyces), GPI anchor (T. cruzi), LPS von L. interrogans und P. gingivalis, Lipoarabinomannan (M. tuberculosis), Phosphatidylinositol (M. tuberculosis)1, LTA2 +TLR-6 Endogene Liganden TLR-3 Doppelsträngige DNA3 TLR-4 LPS, F protein (resp. syncytial virus)1 TLR-5 Flagellin1 TLR-7 Imidazoquinoline4 TLR-9 Unmethylierte CpG-Motive1 Taxol, HSP60, Fibronectin EDA Bislang sind die spezifischen Liganden der Toll-like-Rezeptoren nicht komplett identifiziert. Diese Tabelle gibt einen Überblick über den derzeitigen Stand der Untersuchungen. (1Underhill und Ozinsky 2002, 2Muzio und Mantovani 2001, 3Alexopoulou et al. 2001, 4Hemmi et al. 2002) GPI = Glycosylphosphatidylinositol, HSP60 = Heat Shock Protein 60, LPS = Lipopolysaccharid, LTA = Lipoteichonsäure TLR-4 Der TLR-4 ist der am besten untersuchte Toll-like-Rezeptor. Er wird auf den Zellen des peripheren Blutsystems und Makrophagen am stärksten exprimiert, kann aber auch auf anderen Zellen detektiert werden (MEDZHITOV et al. 1997). Sein Hauptligand ist LPS, Lipopolysaccharid aus der Zellmembran Gram negativer Bakterien. LPS ist allein über die Bindung an TLR-4 in der Lage, Zellen in geringem Ausmaß anzuregen. Wenn LPS im Serum an LPS-bindendes Protein bindet, welches dann das LPS an CD14 liefert, und dieser Komplex eine Bindung mit TLR-4 eingeht, dann entsteht ein stärkerer Effekt. Die genaue Bindung an den TLR-4 ist derzeitig noch nicht geklärt. KURT-JONES et al. (2000) vermuten im Gegensatz zu JESSE et al. (1999), dass sowohl CD14 als auch TLR-4 für die Erkennung notwendig sind. Für eine starke Aktivierung der Zelle ist nach SHIMAZU et al. (1999) zusätzlich noch die Bindung des Proteins MD-2 notwendig, einem MD-1 Homolog, das die Aktivierung von RP105 bestimmt. TLR-4 ist auch in der Lage das respiratorische 16 Literaturübersicht Synzytialvirus über das Fusionsprotein F zu erkennen (KURT-JONES et al. 2000). Taxol, HSP60 und Fibronectin EDA sind körpereigene Substanzen, die ebenfalls durch TLR-4 erkannt werden. Taxol benötigt ebenso wie LPS auch einen TLR-4-MD-2 – Komplex (KAWASAKI et al. 2001). Die Bindung durch HSP60 an den TLR-4 scheint ebenfalls MD-2 abhängig zu sein. HSP60 ist jedoch nicht spezifisch für TLR-4, sondern kann auch durch TLR-2 erkannt werden (VABULAS et al. 2001). Fibronectin EDA (Extra Domain A) entsteht durch alternatives Splicing bei Gewebsverletzungen. Dieses ruft über TLR-4 in monozytoiden Zellen inflammatorische Reaktionen hervor, was OKAMURA et al. (2001) zu der Vermutung geführt hat, dass dieser Mechanismus bei Gewebsschädigungen für die inflammatorische Wirkung in vivo zuständig ist. TLR-2, TLR-1 und TLR-6 TLR-2 erkennt hauptsächlich Bestandteile Gram positiver Bakterien (MUZONI und MANTOVANI 2001). Es gibt Ausnahmen in der Erkennung von LPS, denn TLR-2 bindet spezifisch LPS von Porphyromonas gingivalis und Leptospira interrogans. Diese Bindung scheint, wie auch die Bindung von LPS an TLR-4, ebenfalls von CD14 abhängig zu sein (HIRSCHFELD et al. 2001). Die Hauptliganden sind bakterielle Lipopeptide, Peptidoglykane, und Zymosan. Ob Lipoteichonsäure (LTA) ein Ligand des TLR-2 oder TLR-4 ist wird kontrovers diskutiert (SCHWANDNER et al. 1999, YOSHIMURA et al. 1999, TAKEUCHI et al. 1999). Nach SCHRÖDER et al. (2003) bindet LTA von sowohl Streptokokkus pneumoniae als auch Staphylococcus aureus über LBP und CD14 an TLR-2, nicht aber an TLR-4. MD-2 hat keine Auswirkungen auf die Effektivität der LTAStimulation. Auch prokaryotisches GPI als Ankermolekül für die Bindung vieler Proteine an die Membran von Trypanosoma cruzi ist ein spezifischer Ligand für TLR-2 (CAMPOS et al. 2001). Durch strukturelle Unterschiede zwischen Säuger-GPI und dem prokaryotischem GPI von Mikroorganismen ist eine differentielle Erkennung durch TLR-2 möglich. Ob die zusätzliche Bindung von CD14 notwendig ist, wurde bislang noch nicht untersucht. Die direkte Bindung der beschriebenen Liganden an den TLR-2 wurde bislang noch nicht nachgewiesen. Entscheidend für die zelluläre Stimulation durch den TLR-2 ist die Ineffizienz monomerer TLR-2 Rezeptoren, eine Zelle zu aktivieren. Um eine Aktivierung der Zellen zu erreichen, ist es unabdingbar, dass sich ein Heterodimer aus TLR-2 mit TLR-6 oder mit TLR-1 bildet (UNDERHILL und OZINSKY 2002). Durch eine einseitige Blockade von TLR-2 oder TLR-6 konnte die Aktivierung muriner Makrophagen durch Gram positive Bakterien sowie Zymosan verhindert werden (OZINSKI et al. 2000, HAJJAR et al. 2001). Obwohl eine direkte Bindung 17 Literaturübersicht der Liganden an TLR-2 noch nicht bewiesen wurde, ist es durchaus denkbar, dass nach einer Primäraktivierung entstehende Moleküle an die TLRs binden und somit auch für die Notwendigkeit verschiedener TLR-Kombinationen zuständig sind. Für die Aktivierung von Zellen durch triazylierte bakterielle Proteine ist z.B. keine Heterodimerbildung notwendig (OZINSKI et al. 2000). TLR-3 In einer Studie von ALEXOPOULOU et al. (2001) wurde doppelsträngige, virale DNA als ein Ligand für TLR-3 identifiziert. TLR-5 Das besondere an seinem derzeitig identifizierten spezifischen Liganden, dem bakteriellen Flagellin, ist, dass es ein reines Protein ist. Um eine Aktivierung zu initiieren, muss TLR-5 ein Homodimer bilden. Die Bindung des Flagellins induziert in den Zellen über die Aktivierung der NF-κB die Bildung von TNF-α (HAYASHI et al. 2001). TLR-7 HEMMI et al. (2002) konnte eine Aktivierung von TLR-7 präsentierenden Zellen durch kleine anti-virale Bestandteile wie Imidazoquinoline nachweisen, doch bleibt der natürliche Ligand weiterhin unklar. Die Aktivierung erfolgt ebenfalls über die MyD88-abhängige Signalkaskade. TLR-9 TLR-9 bindet spezifisch DNA-Sequenzen. Sowohl DNA-Motive mit einem zentralen CGDinukleotid (CpG-Motive) als auch DNA-Motive mit einem reversen, zentralen Motiv (GpCMotive), ligieren mit dem TLR-9 und werden endosomal bzw. lysosomal internalisiert (HACKER et al. 1998). Bis heute konnte keine Zellaktivierung durch die reversen Sequenzen nachgewiesen werden. CD14, MD-1 und MD-2 haben keine Auswirkung auf die Aktivierung von Zellen durch TLR-9 (BAUER et al. 2001). Die Beobachtungen durch HARTMANN et al. (2000), dass unterschiedliche CpG-Motive für Maus und Mensch eine optimale Aktivierung der Zellen hervorrufen, stellte sich auch für BAUER et al. (2001) in der Spezifität humaner und muriner TLR-9 Rezeptoren für unterschiedliche Sequenzen dar. Zur Aktivierung ist keine Kreuzvernetzung verschiedener TLR nötig. Die Signalkaskade des TLR-9 scheint nicht identisch mit dem des IL-1 Rezeptors zu sein, da durch die Blockierung des MyD88 zwar die 18 Literaturübersicht NF-κB Induktion durch DNA-Sequenzen, nicht aber die Aktivierung durch IL-1 oder TNF inhibiert werden konnte. TLR-8 und TLR-10 Zu den Spezifitäten sowie zu den Aktivierungsmechanismen liegen derzeitig noch keine Daten vor. Funktionelle Konsequenz einer TLR-vermittelten Zellaktivierung Nach Bindung der spezifischen Liganden können zwei unterschiedliche Wege der Aktivierung eingeschlagen werden (s. Abb. 1). Entweder es erfolgt eine Aktivierung von NF-κB oder der zur AP-1 Familie der Transkriptionsfaktoren gehörenden Proteine JUN und FOS. NF-κB ist ein wesentlicher Transkriptionsfaktor für die Aktivierung immunrelevanter Gene, besonders für die induzierte Synthese von entzündungsvermittelnden Zytokinen (z.B. TNF-α, IL-1) (HATADA et al. 2000) und bakterizider Radikale, wie z.B. NO (SWEET et al. 1998, SHODA et al. 2001a). Nach der Konformationsänderung des TIR, dem Toll/Interleukin-1 Rezeptor, werden die MyD88 und TOLLIP (Toll interacting protein) rekrutiert. Anschließend werden die Serin-/Threonin-Kinasen aktiviert, die der IRAK-Familie (IL-1-receptor-associated kinases) angehören. IRAK-1 und -2 assoziieren mit TRAF6 (TNRreceptor-associated factor 6), einem weiteren Adapterprotein. Der TRAF6 aktiviert sowohl TAD1 (TGF-β-activated kinase) als auch MKK6 (mitogen-activated protein kinase kinase). Weiterhin kommt es entweder zur Degradierung von Iκ-B und anschließender Translokation von NF-κB zum Zellkern oder zur Aktivierung der c-JUN N-terminal kinase (JNK) bzw. der p38 MAP Kinase. Letztlich können Apoptose sowie ein großes Spektrum an Zytokinen, unter anderen IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α induziert werden (KRUTZIK et al. 2001). ARBIBE et al. (2000) beobachteten in ihren Untersuchungen eine physikalische Verbindung zwischen Rac1 und Phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI3 Kinase) im Zusammenhang mit TLR-2. Auch in TLR-4 positiven, MyD88 defizienten Zellen kann nach KAWAI et al. (1999) eine geringe Induktion von NF-κB beobachtet werden, was zu dem Schluss führt, dass Signaltransduktion über einen akzessorischen Mechanismus möglich ist. Ein zusätzliches Molekül namens TIR domain-containing adapter protein (TIRAP) oder MyD88-adapter-like (MAL) wurde identifiziert. Nach der Bindung wird über auto- bzw. parakrine Mechanismen IFN-β produziert. IFN-β ist für die Produktion der iNOS (inducible nitric oxide synthase) und das interferon inducible protein 10 (IP10) notwendig (TOSHCHAKOV et al. 2002). 19 Literaturübersicht TLR-2 TLR-4 IFN-beta MyD88 +TOLLIP MyD88 Jak/Tyk TIRAP/Mal +TOLLIP IFN-beta TRAF-6 Abb. 1 Tyr(701) P + NF-kappaB P P STAT1 TAK1 MAP kinase IL-1beta TNF-alpha IFNAR IL-6 P Ser(727) INOS IP-10 Intrazelluläre Signaltransduktion nach Bindung an TLR-2 oder TLR-4 Diese nach ARMANT und FENTON (2002) modifizierte Graphik zeigt die intrazelluläre Signaltransduktion nach der Bindung spezifischer Liganden an TLR-Rezeptoren. Beispielhaft sind TLR-2 und TLR-4 genannt. In den meisten Studien wird ausschließlich über die Spezifität einzelner mikrobieller Bestandteile, ihre Bindung und Effekte berichtet. Wahrscheinlich liegt jedoch ein Zusammenspiel verschiedener mikrobieller Bestandteile eines Organismus über verschiedene TLR an einer Zelle vor, die je nach Ligand in angepasste, leicht unterschiedliche Reaktionen münden (UNDERHILL und OZINSKY 2002). Eine Heterodimerisierung unterschiedlicher TLRs kann zur Veränderung der Ligandenspezifität der TLRs führen, was an der Interaktion von TLR-2 mit TLR-6 gezeigt werden konnte (OZINSKY et al. 2000, TAKEUCHI et al. 2001). Bovine Toll-like-Rezeptoren Die publizierten Studien beziehen sich bisher auf den TLR-2, TLR-4 und TLR-9. Das Gen zu TLR-4 liegt auf Chromosom 8, das für TLR-2 auf Chromosom 17 (WHITE et al. 2003). Auch die Gensequenzen zu TLR-2, TLR-3, TLR-4 und TLR-9 sind bekannt. TLR-2 und TLR-4 werden auf Monozyten, Makrophagen und Dendritischen Zellen exprimiert (WERLING und JUNGI 2003). Im Gegensatz zu Monozyten und Makrophagen zeigen Dendritische Zellen keine Reaktion auf TLR-2/-4 Liganden. Die Studien über TLR-9 beschränken sich 20 Literaturübersicht hauptsächlich auf die Erforschung der Wirkung von CpG-Motiven auf Zellen des Immunsystems (Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen). Hier dienten Zytokinproduktion, Proliferation und die Induktion von iNOS als Kriterien der Aktivierung (BROWN et al. 1998, SHODA et al. 2001b, PONTAROLLO et al. 2002). Es ist noch nicht bekannt, ob CpG-Motive über TLR-9 oder einen anderen Weg Dendritische Zellen stimulieren (s. Tab. 2c), obwohl eine gesteigerte IL-12, TNF und NO Produktion beobachtet wurden (WERLING und JUNGI 2003). Nach Bindung der Liganden wird auch beim Rind NF-κB transloziert. Die bei Mensch und Maus beschriebenen alternativen Wege des TLR-4 sind beim Rind noch nicht untersucht worden (s. S. 16). TLR-vermittelte Makrophagenaktivierung In den bisherigen Studien zu Makrophagenaktivierung durch TLR-Liganden lag das Hauptaugenmerk auf der Zytokininduktion. Die Induktion von IL-1β, IL-12 und TNF-α (BRIGHTBILL et al. 1999, SU et al. 2000, CAMPOS et al. 2001, JONES et al. 2001) konnte nachgewiesen werden. CAMPOS et al. (2001) zeigte ebenfalls die Induktion der iNOS in Makrophagen. In LPS-stimulierten Makrophagen konnte über die TLR-4 vermittelte Aktivierung von NF-κB auch eine Steigerung der induzierbaren Cyclooxygenase-2 (COX-2) nachgewiesen werden (RHEE und HWANG 2000). Bestimmte TLR-Liganden scheinen in der Lage zu sein, die MHC-Klasse-II-Expression und die Antigenprozessierung herabzuregulieren (NOSS et al. 2001). Derzeitig liegen keine weiteren Ergebnisse über funktionelle Konsequenzen der TLR-vermittelten Makrophagenaktivierung vor. TLR-Expression und Regulation nach Stimulation TLRs unterliegen einer Expressionsmodulation sowohl durch Pathogene als auch durch Zytokine. So wurde TLR-2 nach Infektion von murinen Makrophagen mit Mycobacterium avium heraufreguliert, während die Expressionsdichte von TLR-4 sank (WANG et al. 2000). Die Induktion einer gesteigerten TLR-2-Expression auf Makrophagen gelang auch nach Inkubation der Zellen mit verschiedenen Zytokinen (TNF-α, IL-1α, GM-CSF, jedoch nicht IFN-γ) (WANG et al. 2000). Über die Regulation der Expression von TLRs beim Rind gibt es bisher keine publizierten Daten. 21 Literaturübersicht 2.3 Pathogen assoziierte molekulare Muster 2.3.1 CpG-Motive Bereits seit Mitte der 1980er Jahre ist bekannt, dass bakterielle DNA tumorunterdrückende Wirkung besitzt (TOKUNAGA et al. 1984). TOKUNAGA et al. (1988) beschrieben die Fähigkeit synthetischer, einzelsträngiger DNA-Sequenzen zur IFN-α, β und γ Produktion sowie der Vermehrung von NK-Zellen. Erst 1992 veröffentlichten KURAMOTO et al. erste Vermutungen über die Bedeutung bestimmter sechs-Basen-Palindromen (poly(dG,dC)) für diese Effekte. Dies geriet in Vergessenheit, bis man Jahre später erneut realisierte, dass nichtmethylierte Oligodeoxynukleotide (ODNs) immunmodulierend wirken können. Durch TOKUNAGA et al. (1988), MESSINA et al. (1993) und PARK et al. (1994) wurden poly(dA,dU) und poly(dG,dC) Sequenzen entdeckt, die sowohl eine tumorsuppressive als auch eine proliferative Wirkung auf B-Lymphozyten besitzen. Nicht nur in anfänglichen Studien wurde festgestellt, dass reverse Sequenzen teilweise identische Effekte wie die Ursprungssequenz zeigen, doch konnte dies nicht für alle Sequenzen gezeigt werden (TANAKA et al. 1992). In der Schlussfolgerung wurden CG-Dinukleotide als die entscheidenden Kernelemente der DNA-Sequenzen definiert (KRIEG et al. 1995). Definition und Vorkommen CpG-Motive sind nichtmethylierte, einzelsträngige DNA-Sequenzen, die in 5’-3’-Richtung ein Cytosin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid besitzen. Nichtmethyliert bedeutet, dass am C5Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist (sonst Methylcytosin). Im Vertebratengenom sind die Cytosin Moleküle zumeist methyliert (BIRD 1987). Weiterhin werden CGDinukleotide in Vertebraten soweit unterdrückt, dass sie nur in einem Viertel der erwarteten Häufigkeit vorkommen (BIRD 1987). Zu unterscheiden ist zwischen natürlich gewonnener DNA aus Bakterien, Viren (KRIEG et al. 1995) und Parasiten (KARLIN et al. 1994), die ein Phosphodiester (PD) Rückgrat besitzen und synthetisierten, die entweder ein „natürliches“ PD oder ein Phosphorothioat (PT) Rückgrat besitzen. Diese Veränderung des Rückgrats hemmt den schnellen Abbau durch ubiquitär vorkommende Nukleasen (ZHAO et al. 1993) und führt zu einer schnelleren Aufnahme (SESTER et al. 2000). Von entscheidender Bedeutung für die biologische Funktion sind in erster Linie die flankierenden zwei Nukleinsäuren in sowohl 3’also auch 5’- Richtung. Es bestehen Speziesunterschiede in der optimalen immunmodulatorischen Sequenz. 22 Literaturübersicht Die „optimalen“ Sequenzen sind bislang für Mensch, Maus, Rind, Katze und Hund bestimmt worden (YI et al. 1998a, KRIEG et al. 1999, RANKIN et al. 2001, PONTAROLLO et al. 2002). Maus: Mensch/Rind/Katze/Hund: GACGTT GTCGTT Wurden zunächst in den Studien zur Wirkungsweise der Sequenzen Hexamere eingesetzt, so wurde im Laufe der Zeit deutlich, dass längere Sequenzen, die mehrere CG-Dinukleotiden enthalten, effektiver wirken. Momentan verwendete Sequenzen enthalten teilweise über zwanzig Nukleotide. Mehrere hundert Motive sind im humanen und murinen System getestet worden. Diese längeren Motive können in ihrer Wirkung in immun-stimulatorische und immun-neutralisierende Sequenzen unterschieden werden. Die flankierenden Basen sind dafür von entscheidender Bedeutung. Im Vertebratengenom flankieren meist immunneutralisierend wirkende Nukleotide (…CCG… oder …CGG…) das CG-Dinukleotid (KRIEG et al. 1998b). Solche Sequenzen sind sechsfach häufiger als immun-stimulatorische Sequenzen. Die biologische Funktion der putativ neutralisierenden Motive ist derzeitig noch nicht geklärt. Molekulare Mechanismen der Immunstimulation durch CpG Motive Über die Bindung an und die Aufnahme der DNA-Sequenzen in die Zellen existieren verschiedene Hypothesen. LIANG et al. (1996) stellten die Vermutung auf, dass im humanen System durch die Bindung an einen Oberflächenrezeptor eine Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade ohne die zelluläre Aufnahme des CpG-Motivs induziert wird. Andere Arbeitsgruppen haben im murinen System die Notwendigkeit der Aufnahme der Sequenzen in die Zelle nachgewiesen (YAMAMOTO et al. 1994b, KRIEG et al. 1995, HACKER et al. 1998, MACFARLANE und MANZEL 1998). Da die Verhinderung der Azidifizierung von Endosomen auch den Effekt in der Zelle blockiert, kann davon ausgegangen werden, dass eine Aufnahme und endosomale Reifung zur Aktivierung von Zellen notwendig ist (HACKER et al. 1998, MACFARLANE und MANZEL 1998, YI et al. 1998b). Nach KRIEG (1999) gibt es intrazelluläre Proteine, die sequenzspezifisch ausschließlich an nichtmethylierte CpG-Motive binden. In Zellen mit internalisierten CpG-Motiven werden innerhalb von 10-15 min verschiedene Folgeprozesse aktiviert. Zu ihnen gehören die Produktion Reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der induzierbaren Nitritoxid Synthetase (iNOS) (SWEET et al. 1998, SHODA et al. 2001a), die Aktivierung von NF-κB (STACEY et al. 1996) und AP-1 Pfade (HACKER et al. 1998) sowie der Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Kinase 23 Literaturübersicht (YI und KRIEG 1998). Heute ist bekannt, dass CpG-Motive an TLR-9 binden und eine dem IL-1 Rezeptor ähnliche Signalkaskade aktiviert wird (s 2.2.3). Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro CpG-Motive kommen in natürlicher Form mit einem Phosphodiester (PD) Rückgrat vor. Für eine stärkere Nukleaseresistenz werden synthetische Oligodeoxynukleotide mit einem Phosphorothioat (PT) Rückgrat hergestellt und eingesetzt. Über die Auswirkungen des PTRückgrats bestehen unterschiedliche Meinungen. HARTMAN und KRIEG (2000) beschreiben eine erhöhte Aktivierung (B-Zell-Proliferation) beim Menschen. Auch PISETZSKY und REICH (1993), LIANG et al. (1996) und ZHAO et al. (1996) beschreiben im murinen System eine Wirkungssteigerung der CpG Motive durch den Austausch des PDRückgrats gegen ein PT-Rückgrat. WERNETTE et al. (2002) erkennen im caninen System (im Gegensatz zum felinen System) eine aktivierende Wirkung des PT-Rückgrats. BOGGS et al. (1997) hingegen beschreiben PT-Motive als weniger wirksam bezogen auf die lytische Kapazität von NK-Zellen. SESTER et al. (2000) weisen darauf hin, dass PD- und PTOligodeoxynukleotide je nach untersuchten Effekten auf verschiedene Zellen stärkere bzw. schwächere Effekte haben können. CpG-Motive induzieren vorwiegend die Bildung von Th-1-Zytokinen (s. S. 27). Lediglich die Produktion von IL-4 durch T-Lymphozyten (PARRONCHI et al. 1999) widerspricht diesem Grundprinzip. Am weitesten erforscht sind die Effekte von CpG-Motiven auf murine und humane Immunzellen. Das Spektrum der Effekte ist sehr breit (s. Tab. 2), daher soll im Text nur auf Besonderheiten eingegangen werden. Manche der in Tab. 2 aufgeführten Effekte werden durch CpG-Motive indirekt initiiert oder induziert (kursiv dargestellt). Die durch MACFARLANE und MANZEL (1999) beschriebenen adhärenzmindernden Effekte auf Makrophagen sind z.B. indirekt initiiert. Sie können nicht durch die Verwendung von Quinacrine blockiert werden. Ein weiterer Hinweis für die nicht ausschließlich primäre Wirkung der CpG-Motive ist die Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine (IFN-α, IFN-γ, IL1, IL-4, IL-6, IL-12, TNF-α) die zur Aktivierung anderer Zellenpopulationen führen kann. 24 Literaturübersicht Tab. 2 Wirkungsspektrum von CpG-Motiven bei unterschiedlichen Spezies in vitro A) Mensch/Affe Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen CD86↑ac, CD40↑c , Proliferation↑ acd IL-6↑c, IL-12↑c, CD54↑ c, MHC-KLASSE- IFN-α↑b II↑c IFN-γ↑d, IL-4↑d, T-Zellen Th-1shift d Dendrit. Zellen Makrophagen CD80↑a, CD86↑a, IFN-γ↑d, MHC-KLASSE-II↑a IL-12↑d Prokoagulationsproteine→e Adhäsion↓e, Vitalität→e Phagozytose→e Monozyten CD14↑e, Diff. zu MPh↓e MannoseR↓e NK-Zellen IL-6↑n, IL12↑n, TNF-α↑n CD69↑a Lyt. Aktivität↑a B) Maus Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen c-myc↑m, egr↑↓ m , Proliferation↑am, IL-6↑k, IL-12↑k c-jun↑m, c-fos↓m anti apoptotischm T-Zellen Dendrit. Zellen CD80↑a, CD86↑a Proliferation↑l, IFN-γ↑l, Thymozyten PS↑ IL-10↑l AG-Präsentation↑a Milz: IL-6↑a, IL-12↑a, IFN-γ↑m, TNF-α↑a, Makrophagen MHC-KLASSE-II↓f, AG-Prozessierung↓f, TNF-α↑gi, NO↓h, iNOS↑m, sTNF-α-RI/II↓i, mTNF-α- AG-Präsenta-tion↓f verspätet↑g, IL-12↑ k, RI→/II↑i, CSF-1↓mu anti apoptotischm IFN-α/β↑k IL-6↑o, IL-12↑o, TNF-α↑o Monozyten NK-Zellen Lyt. Aktivität↑aj IL-12↑j, TypI IFN↑j 25 Literaturübersicht C) Rind Zellen Oberflächenstrukturen Funktionell Zytokinsekretion B-Zellen IgM↑q, IgG1↑q, IgG2↑q Proliferation↑ pqr IFN-γ↑q, IL-6↑t Proliferation→ p IFN-γ→p T-Zellen IL-12↑st, TNF↑s, NO↑s Dendrit. Zellen iNOS-Induktion r Makrophagen IL-6↑t, IL-12 (p40) ↑rt, TNF-α↑r, IL-1β↑r Monozyten Aktivierung von Lymphozytenp IL-6↑t, IL-12↑t NK-Zellen a HARTMANN et al. 2000, bYAMAMOTO et al. 1994a, cHARTMANN und KRIEG 2000, d PARRONCHI et al. 1999, eMACFARLANE und MANZEL 1999, fCHU et al. 1999, gCRABTREE et al. 2001, hGAO et al. 1999, iJIN et al. 2000, jBOGGS et al. 1997, kKLINMAN et al. 1996, lMANNON et al. 2000, mSESTER et al. 1999, nBAUER et al. 1999, oKRIEG et al. 1998a, pPONTAROLLO et al. 2002, qBROWN et al. 1998, rSHODA et al. 2000, sWERLING und JUNGI 2003, tZHANG et al 2001, u SESTER et al. 1999. ↑ = Steigerung, → = kein Einfluß, ↓ = Senkung. SESTER et al. (2000) sind der Ansicht, dass murine T-Lymphozyten nicht direkt durch CpGMotive aktiviert werden, wohingegen MANNON et al. (2000) die Wirkungsweise als direkt ansehen. Die NO-Synthese wird ebenfalls konträr beschrieben. Die durch LPS induzierte Menge wird nach JIN et al. (2000) durch die Zugabe von CpG-Motiven gehemmt. SESTER et al. (1999) hingegen beschreiben im Zusammenspiel mit IFN-γ eine, wenn auch verzögerte (CRABTREE et al. 2001) Steigerung der iNOS. Murine Thymozyten werden lediglich durch CpG-Motive mit einem PT-Rückgrat zur Proliferation angeregt (MANNON et al. 2000). In vivo konnte nach einmaliger Gabe von CpG-DNA ein zwei- bis vierwöchiger Schutz vor Infektionen mit Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Plasmodium spezies, Leishmania major und Schistosoma mansoni erreicht werden (VAN DER STEDE et al. 2002). Ebenfalls konnte durch CpG-Gabe eine Steigerung der lytischen Aktivität von NK-Zellen erzielt werden (BOGGS et al. 1997). Aus bisherigen Studien über die Interaktion boviner Immunzellen mit CpG-Sequenzen liegen nur sehr begrenzt Daten vor. Ein Großteil der Untersuchungen wurde mit nativer DNA aus Bakterien und Protozoen durchgeführt. Diese Ergebnisse sind kursiv in Tab. 2c dargestellt. Für die Produktion von IL-12, TNF-α und NO durch dendritische Zellen ist noch nicht 26 Literaturübersicht erwiesen, ob die Aktivierung über den TLR-9 oder anderweitig erfolgt (WERLING und JUNGI 2003). Einzelne Studien existieren für weitere Spezies. Über canine und feline Zellen berichten WERNETTE et al. (2002) über eine Proliferationsinduktion durch verschiedene CpG-Motive in B-Zellen aus Milz, Lymphknoten und Blut. Porcine Blutmonozyten reagieren mit Proliferation und Sekretion von IL-6, IL-12 und TNF-α (KAMSTRUP et al. 2001). JØRGENSEN et al. (2001) beschrieben für den Atlantischen Lachs (Salmo salar L.), dass durch unterschiedliche CpG-Motive in Kopfnieren-Leukozyten IFN-ähnliche Zytokine sowohl vom Typ I also auch vom Typ II induziert werden können. Die Differenzierung der Zellen in adhärente und nicht-adhärente erlaubte den Nachweis der Aktivierung unter den nicht-adhärenten Zellen. In einer übergreifenden Studie wurde die Proliferation induzierende Potenz verschiedener CpG Motive in zehn Spezies überprüft (RANKIN et al. 2001). Bei allen untersuchten Spezies (Cotton Rat, Huhn, Hund, Katze, Kaninchen, Maus, Pferd, Schaf, Schwein und Ziege) konnte, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß, eine Proliferationsinduktion nachgewiesen werden. Wirkungsspektrum bei unterschiedlichen Spezies in vivo CpG-Motive als Adjuvans Durch den Einsatz von CpG-Motiven als Adjuvanzien konnten im Vergleich zu Aluminiumverbindungen motivabhängig nach der primären Immunisierung bzw. nach der Boosterimpfung die bis zu 66- bzw. 16-fache Steigerung der antigen-spezifischen Immunantwort erreicht werden (HARTMANN et al. 2000). Nach der Erstimmunisierung liegt der Antikörpertiter unter Verwendung der CpG-Motive als Adjuvans demnach bereits in Bereichen der Boosterimpfung mit herkömmlichem Adjuvans (HARTMANN et al. 2000, VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002). CpG-Motive initiieren im Gegensatz zu Aluminiumhydroxid eine humorale und zelluläre Th-1-Antwort. RANKIN et al. (2002) beschreiben bei kostimulatorischer Gabe die Änderung einer reinen Th-2-Antwort in eine ausgeglichene Th-2:Th-1-Antwort. Ebenfalls ist bei adulten Tieren (nicht bei Neugeborenen) die Umkehrung einer primären Th-2-Antwort durch Boosterimpfung mit CpG-Adjuvans in eine Th-1 Antwort möglich (KOVARIK et al. 1999). Die quantitativ schwächere Immunreaktion neonataler Säuger auf Impfungen kann zudem durch Zugabe von CpG-Motiven zum Impfstoff verbessert werden. Schwache Th-2-Antworten konnten bei Mäusen in eine stärkere Th-1 Antwort mit B-Zell-Proliferation, Th-1-Zytokinsekretion von Antigen präsentierenden Zellen und vermehrter IgG2a und IgM-Produktion gewandelt werden (KOVARIK et al. 1999, CHELVARAJAN et al. 1999). Da die Effizienz der 27 Literaturübersicht Adjuvanzien mit CpG-Motiven in Kombination potenziert wird, können sie in ihrer Dosierung minimiert und somit die Gewebsreizung vermindert werden. CpG-Motive als Adjuvans führt auch bei mucosaler Gabe zu einer signifikanten Steigerung der lokalen wie auch der systemischen Immunantwort (HORNER et al. 2000, MCCLUSKIE und DAVIS 2001, AVIVA et al. 2002). Erste Untersuchungen mit ähnlichen Effekten liegen ebenfalls für Nutztiere (Schwein, Rind, Schaf und Geflügel) vor (IOANNOU et al. 2002, RANKIN et al. 2002, VAN DER STEDE et al. 2002, VLEUGELS et al. 2002). CpG-Motive in DNA-Vakzinen DNA-Vakzine enthalten in Plasmiden für Antigen kodierende Sequenzen, die im geimpften Individuum translatiert werden (MCCLUSKIE et al. 2000, LEITNER et al. 2001). Zur Steigerung der Wirkung werden pro Plasmid bis zu 200 CpG-Dinukleotide eingebaut. Um eine zu starke Th-1-Reaktion zu verhindern, werden sowohl Immun-stimulatorische (..CCG..) als auch Immun-neutralisierende (..CGG..) Sequenzen eingebaut. CpG-Oligodeoxynukleotide in der Therapie von Allergien und Tumoren Verschiedene CpG-Sequenzen wurden in Kombination mit dem Allergen i.m., s.c., i.p. oder mucosal appliziert und die Konversion einer bestehenden Th-2-dominierten Immunantwort in eine Antwort mit Th-1-Charakteristik erzielt. Die Zahl peripherer eosinophiler Granulozyten sank, ebenso wie die Plasmakonzentration von IL-4. Gesteigert wurden die Konzentrationen von IFN-γ und IL-12. Durch die Gabe von CpG-Motiven an infantile Säugetiere kann eine Th-1 dominierte Immunlage erreicht werden, die jedoch zu einem erhöhten Risiko von Autoimmunerkrankungen führt (WILD und SUR 2001). WARREN und WEINER (2002) konnten durch CpG-Sequenzen allein keinen, durch kombinierte Gaben von CpG-Motiven und monoklonalen, tumor-spezifischen Antikörpern jedoch einen hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum in Mäusen feststellen. Sie beschrieben sogar eine Heilung stark erkrankter Mäuse. Tumor-Vakzinen mit CpG-DNA in Kombination mit GM-CSF steigert die T-Zellaktivierung und Typ-I-IFN-Produktion von Antigen präsentierenden Zellen (HSIN-MING et al. 1998) Offene Fragen Bislang liegen kaum Studien über die in vitro Wirkung von CpG-Motiven auf Granulozyten (neutrophile, eosinophile, basophile) vor. Weiterhin sind die genauen molekularen Mechanismen der induzierten immun-stimulierenden Effekte noch nicht bekannt. Inwieweit die Erreger-DNA-Motive nicht nur dem Immunsystem die Präsenz des Erregers anzeigen, sondern vielmehr über ihre modulatorische Wirkung generell immunsuppressiv wirken können, ist ebenfalls ein weitgehend ungeklärter Fragenkomplex. 28 Literaturübersicht 2.3.2 Lipopolysaccharid (LPS) LPS ist ein Endotoxin Gram negativer Bakterien, das aus drei makromolekularen Anteilen aufgebaut ist. Der extrazelluläre Anteil ist das so genannte O-Antigen gegen das häufig Antikörper gebildet werden. Er besteht aus drei bis zwanzig Hexosemolekülen, die für die Speziesspezifität des LPS verantwortlich sind. Das O-Antigen bedingt die Hydrophilie der Oberfläche. Der zweite Anteil ist das Kernpolysaccharid, das wiederum aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt ist und bei vielen Gram negativen Bakterien identisch ist. Von den beiden Anteilen (Innerer und Äußerer) ist der Äußere, ein spezifischer Zucker (Ketodesoxy-oktonat), für die Funktion der Zellmembran unentbehrlich. Der für die Virulenz entscheidende Anteil des LPS ist das Lipid A. Es dient als Verankerung in der Zellwand. Lipid A ist amphiphil, was durch die hydrophile ß-1-6-glykosidische Verknüpfung von Nacetyl-Glucosamin-Molekülen und die hydrophobe Vier-hydroxy-Fettsäurekette begründet ist (HAHN et al. 1994). LPS wird über CD14, LBP und MD-2 an den TLR-4 auf Zellen gebunden und stimuliert über eine intrazelluläre Reaktionskaskade, die der des IL-1-Rezeptors gleicht, deren Aktivierung (s. S. 16). Die Stimulation durch LPS resultiert unter anderem in B-Zellproliferation, vermehrter Produktion von Akut-Phase Proteinen (WONG et al. 2000) sowie der Sekretion verschiedener Zytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12) in Makrophagen und Monozyten (CLEVELAND et al. 1996, HOSHINO et al. 1999). 2.3.3 Lipoteichonsäure (LTA) LTA ist die acetylierte, auf der Zelloberfläche Gram positiver Bakterien exprimierte Form der Teichonsäure (PESCHEL 2002). Die Lipoteichonsäure ist ebenso wie das LPS kein spezifisches Molekül, sondern eine Gruppe sehr nah verwandter Moleküle. LTA besitzt eine Glycerol- oder Ribitolphosphateinheit als Rückgrat und besteht zudem aus Zucker-PhosphatPolymeren mit einer einzelnen Lipidseitenkette (CLEVELAND et al. 1996). LTA wirkt auf Säugerzellen über den TLR-2. Für die Bindung sind zudem CD14 und LBP von Bedeutung (s. S. 17). Nach einer intrazellulären Reaktionskaskade mit Aktivierung des Faktors NF-κB resultiert die Aktivierung von Makrophagen und Monozyten in der Ausschüttung verschiedner Zytokine. Dazu gehören IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12 (CLEVELAND et al. 1996). Zudem ist LTA in der Lage B-Zelllinien zur Proliferation anzuregen. Von CLEVELAND et al. (1996) wurde eine Th-1-Entwicklung (Sekretion von IFN-γ) von Th-0-zellen durch LTA-Stimulation ausgelöst. LTA hemmt zudem kompetetiv die 29 Literaturübersicht Bindung des IL-2 an den IL-2 Rezeptor auf T-Zellen und vermindert dadurch eine Proliferationssteigerung (PLITNICK et al. 2001). 2.4 Bakterielle Superantigene Neben einigen viralen Superantigenen und dem von Mycoplasma arthritidis produzierte Superantigen MAS (Mycoplasma arthritidis Superantigen) (Übersicht bei SCHERER et al. 1993) bilden bakterielle Proteine die größte Gruppe von Erreger-kodierten Superantigenen. Diese Proteine (Exotoxine) werden im Wesentlichen von Staphylokokken (S. aureus, S. intermedius) und von Streptococcus pyogenes gebildet. Die Familie der von Ihnen produzierten Superantigene ist groß und umfasst bisher 21 identifizierte Mitglieder (Staphylokokken Enterotoxine, SE(x); Streptococcus Pyogenes Exotoxine, SP(x)) (BOHACH et al. 1990, MONDAY und BOHACH 1999b, PROFT et al. 1999, ARCUS et al. 2000, ORWIN et al. 2001, ALOUF und MULLER-ALOUF 2003). Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle und den T-Zellrezeptor Generelle Eigenschaft aller Superantigene ist ihre Fähigkeit ohne vorherige intrazelluläre Prozessierung mit Antigen präsentierenden Zellen und T-Lymphozyten zu interagieren (FLEISCHER und SCHREZENMEIER 1988) und diese Zellen zu stimulieren. Superantigene binden an MHC-Klasse-II-Moleküle außerhalb der Antigenbindungsgrube auf Antigen präsentierenden Zellen und sind sodann in der Lage an polymorphe Sequenzen der β-Kette (Vβ-Region) des αßT-Zellrezeptors zu binden (GASCOIGNE 1993). Die einzelnen Superantigene können zwar an ein breites Spektrum verschiedener alleler MHC-Klasse-IIMoleküle binden, unterscheiden sich aber in ihrer Affinität zu einzelnen Allelen. Überdies bestehen Unterschiede in der Erkennung verschiedener Vß-Familien (CHINTAGUMPALA et al. 1991, LABREQUE et al. 1993). Durch die einzigartige Form der Interaktion mit der ßKette des T-Zellrezeptors und MHC-Klasse-II-Molekülen sind Superantigene in der Lage einen deutlich höheren Prozentsatz vorhandener T-Zellen zu aktivieren als es durch die Präsentation eines auf herkömmliche Weise prozessierten Antigens erfolgt. So werden nach herkömmlicher Antigenpräsentation etwa 0,001 bis 0,1% der T-Zellen aktiviert, hingegen liegt der Prozentsatz nach Superantigenstimulation (in Abhängigkeit von der Frequenz des „passenden“ Rezeptorsegmentes) bei bis zu 25% aller T-Zellen (FLEISCHER et al. 1991, HERMAN et al. 1991, MOLLICK et al. 1991, IRWIN und GASCOIGNE 1993, SCHUBERTH 1997). 30 Literaturübersicht Konsequenzen der Superantigenbindung in vitro Die Konsequenzen einer Superantigenstimulation sind vielfältig. Sie können zur Aktivierung und Proliferation sowie zur Induktion von Apoptose und/oder Anergie der Zellen führen (HERMAN et al. 1991, HUANG und CRISPE 1993, AOUDJIT et al. 1995). Als Folge der Aktivierung kommt es beispielsweise zur Produktion und Sekretion verschiedener Zytokine sowie zur Superantigen abhängigen zellulären Zytotoxizität (SDCC) durch aktivierte CD4+ und CD8+ T-Zellen. Eine polyklonale Aktivierung vieler Vβ-reaktiver T-Zellen durch Superantigene führt unter Umständen zur Expansion autoreaktiver T-Zellklone (zitiert nach KRÜGER 2001). HENDRICKS (1998) beschrieb eine über T-Zellen vermittelte Proliferation boviner B-Lymphozyten, die dosisabhängig auch zur Apoptose der B-Zellen führen kann. Die Zytokin induzierende Potenz verschiedener Superantigene beim Menschen ist wegen der unterschiedlichen Methoden nur schwer zu vergleichen. YOKOMIZO et al. (1995) und SCHUBERTH (1997) beschrieben die Superantigen stimulierte Produktion von IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ und TNF-α in bovinen MNC des Blutes. Die Produktion von Stickstoffmonooxid und Cyclooxygenase abhängigen Arachidonsäure-Metaboliten wie PGE2 in mononukleären Zellen wurde von HENDRICKS (1998) demonstriert. KRÜGER (2001) beschrieb die indirekte Wirkung der Staphylokokken-Superantigene SEA und SEB auf die Vitalität von bovinen Granulozyten. Die Überlebensrate reiner neutrophiler sowie eosinophiler Granulozyten wurde von den Superantigenen nach 24-stündiger Inkubation nicht beeinflusst. In zellulären, Superantigen stimulierten Kokulturen aus Granulozyten und mindestens 10% bovinen mononukleären Zellen (MNC) sank die Vitalität der neutrophilen Granulozyten im Vergleich zu den Reinkulturen bis auf 10–50%, wohingegen kein Einfluss auf eosinophile Granulozyten bestand. Der vitalitätsmindernde Effekt wurde auch ohne Zell-Zell-Kontakt durch Überstände inkubierter MNC vermittelt. Der genaue Mechanismus ist derzeitig nicht geklärt, doch sind weder TNF-α, das FAS-Molekül, Stickoxyd, PGE2 noch die durch Brefeldin A zu hemmenden Zytokine für diesen Effekt verantwortlich. Durch die simultane Inkubation mit Caspase-1- und Caspase-2-Inhibitoren wurde der Vitalitätsverlust in Kokulturen, nicht aber in den mit Überständen inkubierten Granulozyten gehemmt. 31 Literaturübersicht 2.5 Neutrophile Granulozyten 2.5.1 Morphologische Eigenschaften neutrophiler Granulozyten Die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zählen gemeinsam mit dem vielgestaltigen, polymorphen Kern zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter neutrophiler Granulozyten. Andere Bezeichnungen lauten „Neutrophile“ oder „polymorphkernige Granulozyten“ (PMN, polymorphonuclear cells) (JANEWAY und TRAVERS 1997). Die aus Knochenmarkzellen durch die koordinative Einwirkung hämatopoetischer Faktoren über Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Metamyelozyten entstehenden jugendlichen Formen besitzen zunächst noch einen stabförmigen Kern. Die über Chromatinfäden verbundenen Segmente entstehen erst mit der weiteren Reifung (LIEBICH 1993). Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrolasen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen. Sekundäre Granula enthalten zudem noch Lactoferrin und Kollagenasen (GEMSA et al. 1991, KLEIN 1991). Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das zehnfache. Die Überlebensdauer für Granulozyten liegt beim Menschen (ZINK 1990) und bei der Ratte (ROITT et al. 1991) bei zwei bis drei Tagen, kann aber durch lokal produzierte, anti-apoptotische Zytokine verlängert werden (BLISS et al. 1999). Die Transmigration in Entzündungsgebiete verzögert ebenso die spontane Apoptose von Neutrophilen (WATSON et al. 1997). 2.5.2 Besonderheiten boviner neutrophiler Granulozyten Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morphologisch denen anderer Spezies zwar ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes. Zusätzlich besitzen bovine neutrophile Granulozyten eine dritte Art zytoplasmatischer Granula, die größer sind und kationische antibakterielle Proteine, z.B. Baktenecin (ROMEO et al. 1988), Indolicin und βDefensin (SELSTED et al. 1992, 1993) enthalten. Diese Proteine wirken selektiv auf bestimmte Bakterien bakterizid. Obwohl in den bovinen azurophilen Granula viele der Enzyme enthalten sind, die auch bei anderer Spezies gefunden werden, fehlt ihnen das Lysozym, eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula (PASTORET et al. 32 Literaturübersicht 1998). Im Gegensatz zu Neutrophilen anderer Spezies, besitzen bovine Neutrophile offensichtlich Fc-rezeptoren für IgM (PASTORET et al. 1998). 2.5.3 Aufgaben der Granulozyten im Rahmen der Infektionsabwehr Entzündungsmediatoren (u.a. Interleukin-8, Leukotrien B4, C5a) wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren Adhäsionsmoleküle auf Endothelzellen. Innerhalb weniger Minuten bis Stunden werden das adhäsive P-Selektin und das E-Selektin, die Kohlenhydratepitope verschiedener Glykoproteine auf Leukozyten erkennen, exprimiert. Das auf Leukozyten exprimierte L-Selektin unterstützt das „Rollen“ der Zellen entlang der Gefäßwand. Diese Wechselwirkungen führen zu einer lokalen Verlangsamung der PMN im Blutstrom (Margination) sowie einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäßwand. IL-8 bewirkt eine Konformationsänderung der physiologischer Weise schwach bindenden Leukozyten-Integrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Komplementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt). Ihre Affinität zu ihren Liganden, den intrazellulären Zelladhäsionsmolekülen (intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1) der Endothelzellen, wird dadurch deutlich erhöht, was eine Immobilisation der Zellen zur Folge hat. Als Verstärkung dient das Immunglobulin ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM: platelet endothelial cell adhesion molecule), das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (JANEWAY und TRAVERS 1997). An den Kontaktstellen dreier Endothelzellen („tricellular corners“) transmigriert der Hauptteil der Neutrophilen. Nachdem sie die Basalmembran mithilfe proteolytischer Enzyme passiert haben, gelangen die Zellen entlang eines Konzentrationsgradienten der Entzündungsmediatoren an deren Entstehungsort. Granulozyten sind Phagozyten, die der Beseitigung von Erregern und von Zelldetritus dienen. Die in Phagosomen aufgenommenen Bestandteile werden nach der Verschmelzung mit Lysosomen in den Phagolysosomen mit Hilfe reaktiver Sauerstoff-metabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide inaktiviert und getötet (DJEU und BLANCHARD 1987, JACKSON et al. 1995, CASSATELLA 1996, BELAAOUAJ et al. 1998). Einen Schutz vor der Selbstschädigung bieten protektive Enzyme, wie z.B. Superoxiddismutase und Katalase (JANEWAY und TRAVERS 1997). Nicht unerhebliche Mengen der Metaboliten/Enzyme gelangen in den Extrazellularraum und verursachen dort Zellschäden. Neutrophile Granulozyten haben neben der Funktion der Phagozytose zusätzlich die Fähigkeit nach Stimulation (durch z.B. LPS, IL-1, IL-2, TNFα oder GM-CSF) Zytokine freizusetzen (LLOYD und OPPENHEIM 1992). CASSATELLA (1999) kommt zu dem Schluss, dass 33 Literaturübersicht PMN über die stimulationsabhängige Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen direkten Einfluss auf das adaptive Immunsystem nehmen. 2.6 Makrophagen Makrophagen sind gewebsständige Zellen des Immunsystems. Im peripheren Blut kommen makrophagoide Zellen nur zu einem sehr geringen Prozentsatz vor. Die gemeinsame Vorläuferzelle im Blut aller Makrophagentypen stellen die Monozyten dar, die nach Auswanderung in das Gewebe unter dem Einfluss des lokalen Milieus zu residenten Makrophagen ausdifferenzieren. Sie sollen das Fremdagens erkennen, binden und nach der Internalisierung (Phagozytose) mit anschließender Prozessierung das adaptive Immunsystem aktivieren. Diese Aktivierung erfolgt zum einen über die Präsentation der prozessierten Ag und über die Sekretion von Zytokinen und anderen Mediatoren andererseits. Gewinnung ausdifferenzierter Makrophagen Am gebräuchlichsten zum Studium der Makrophagenfunktion und deren Beeinflussung in vitro oder ex vivo ist die Gewinnung von Peritoneal- oder Alveolarmakrophagen. Nach einer Injektion mit bspw. Brewer Thioglycolat, Thioglycolat-broth oder ConA (CHU et al. 1999, JIN et al. 2000, THOMAS et al. 2000, CRABTREE et al. 2001, GAO et al. 2001) können Peritonealmakrophagen durch eine Bauchhölenwäsche gewonnen werden. MASON et al. (1996) beschreiben die Gewinnung von Alveolarmakrophagen bei Rindern durch eine Lavage aus frischen, befundlosen Lungen geschlachteter Tiere. Generierung von Makrophagen in vitro Eine Methode zur Generierung von Makrophagen aus Knochenmarksvorläuferzellen (BoBMDM, Bovine Bone Marrow Derived Macrophages) beschrieben ADLER et al. (1994). Sie verwendeten Tibien von 6 Monate alten Feten, die nach der Schlachtungen trächtiger Kühe entnommen wurden. Die aus dem Knochenmark herausgewaschenen Zellen wurden unter nicht-adhärenten Bedingungen bis zu 18 Tage inkubiert. Nach neun Tagen bestand die Kultur zu über 83% aus morphologisch identifizierbaren Makrophagen, die zudem Peroxidase negativ waren. SESTER et al. (1999) generierten Makrophagen aus dem Femur von Mäusen. Um bovine Makrophagen in großen Mengen von lebenden Tieren zu gewinnen, entwickelten JUNGI et al. (1997) eine Methode um aus Blutmonozyten Makrophagen zu generieren, so genannte MDM (Monocyte Derived Macrophages). Dabei wurden die Zellen nach der Separation über sieben bis zehn Tage wie bei ADLER et al. (1994) unter nicht-adhärenten 34 Literaturübersicht Bedingungen kultiviert, um sie anschließend über den Stimulus der Adhärenz ausdifferenzieren zu lassen (s. S. 53, 3.3.2). Aus CD14 positiven mononukleären Zellen gewannen WERLING et al. (1998) Makrophagen nach einer siebentägigen Inkubationszeit unter nicht-adhärenten Bedingungen. 2.7 Apoptose und Nekrose Apoptose wird auch „der programmierte Zelltod“ genannt. Er ist zur embryonalen Entwicklung sowie zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Gleichgewichtes im Körper unabdingbar. Ein zellmorphologisches Zeichen der Apoptose ist die Chromatinverdichtung im schrumpfenden Zellkern (JANEWAY und TRAVERS 1997). Im Rahmen der Apoptose werden im Gegensatz zur Nekrose Zellbestandteile nicht in den Extrazellularraum abgegeben, sondern in geschlossenen Vesikeln aus der toten Zelle ausgeschleust. Durch die sonst mögliche Freisetzung von Enzymen könnte es z.B. bei im Gewebe befindlichen Neutrophilen zu Schädigungen des Umfeldes kommen (COHEN 1993). Ein frühes Ereignis nach Induktion der Apoptose ist die Aufhebung der Phospholipidasymmetrie der Zellmembran. Liegen zunächst Phosphatidylcholin und Sphingomyelin außerhalb und Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin innerlich, so wird nach Apoptose-Induktion Phosphatidylserin durch die Wirkung sog. Flipasen an die Außenseite der Zellmembran transportiert und führt dort zur verstärkten Bindung an Makrophagen (über ihren Phosphatidylserin-Rezeptor) und anschließender Phagozytose der apoptotischen Vesikel („apoptotic bodies“) (MCEVOY et al. 1986). FADOK et al. (1992) beschreibt die Externalisierung des Phosphatidylserins als eine universelle Veränderung bei Apoptose, unabhängig von der Zellart und dem „Apoptoseauslöser“. Weitere Erkennungsmöglichkeiten apoptotischer Zellen sind ihre hydrophobe Oberfläche und ihre negative Ladung (FADOK et al. 1992). Die Nekrose ist ein durch exogene physikalische oder chemische Einflüsse induzierter Zelltod. Sie findet meist in Zellgruppen lebenden Gewebes statt. Die Zellrestprodukte werden frei in den Extrazellularraum durch Zellmembranintegritätsverlust abgegeben und vermitteln dort eine inflammatorische Schädigung des umliegenden Gewebes. 2.7.1 Induktion der Apoptose Eine Reihe von Zelloberflächen-Rezeptoren („Todesrezeptoren“) sind in der Lage nach Ligation entweder zur Zellaktivierung, Zelldifferenzierung oder zum Zelltod zu führen. Die 35 Literaturübersicht jeweilige Reaktion ist abhängig von der Stärke der Einwirkung sowie dem Zelltyp und ist während der Differenzierung streng reguliert (SCHULZE-OSTHOFF et al. 1998). Nach der Bindung des Liganden kommt es zur Oligomerisation des Rezeptors und daraufhin zu der Bindung eines Adapterproteins an die Todesdomäne. SCHULZE-OSTHOFF et al. (1998) liefern eine Übersicht über die bislang fünf bekannten Rezeptoren: der TNF-Rezeptor-1, das TNF-receptor related apoptosis mediating protein (TRAMP), der TNF-related apoptosisinducing ligand (TRAIL) receptor 1, der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und das CD95 (alt: Fas oder APO-1). 2.7.2 Apoptose bei neutrophilen Granulozyten Je nach Bedarf der Situation in vivo kann durch unterschiedliche Mechanismen die Schädigung des Gewebes durch Hemmung der Neutrophilen verhindert oder die Aktivität der Neutrophilen verstärkt werden (TSUCHIDA et al. 1995). Bei inflammatorischen Prozessen kann es von Vorteil sein, dass die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten verlängert wird, damit bakterielle Erreger effizienter phagozytiert und getötet werden können. Es gibt jedoch auch Situationen, in denen die Apoptose von Neutrophilen die effektivste Möglichkeit ist, Zellen ohne pro-inflammatorische Wirkung durch Freisetzung der aktiven Sauerstoffradikale und Enzyme/Metaboliten zu eliminieren. Die Apoptose kann somit als regulativer Kontrollmechanismus angesehen werden (FANNING et al. 1999). Die Apoptose der Neutrophilen wird zum Großteil über Zytokine und Chemokine (s. Tab. 3) gesteuert (TSUCHIDA et al. 1995). Bereits 1999 beschrieben ALIPRANTIS et al. eine Induktion der Apoptose verschiedener myeloider Zelllinien durch Makrophagen. MESZAROS et al. (2000) wiesen eine Induktion über membranständiges TNF-α nach. Mit löslichem TNF-α gelang die Apoptose-Induktion nicht. LILES et al. (1996) beschreiben die Möglichkeit des autokrinen Todes von Neutrophilen durch die konstitutive Koexpression von CD95 (Fas) und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche. Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber einer Induktion einer Fas-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas. Durch die Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason kann die Fas-vermittelte Apoptose gehemmt (LILES et al. 1996) werden. 36 Literaturübersicht Tab. 3 Übersicht über die Wirkung verschiedener Mediatoren, Substanzen und Mechanismen auf die Apoptose neutrophiler Granulozyten Anti-apoptotisch a) Pro-apoptotisch 16, 7 IL-4, IL-6, IL-8, IL-15, IFN-γ IL-10 Sonderfälle IL-13 kein Effekt 1 NO anti-apoptotisch 23 1, 2, 3, 7 GM-CSF, G-CSF 4, 5, 6, 7, 8 ROS 17, 18 pro-apoptotisch 19 LTB4 , PAF, LPS 6, 7, 9, 10 ß2-, ß3-IntegrinKreuzvernetzung 24 PGE2 anti-apoptotisch 9 pro-apoptotisch 22 Na-Butyrat, Dexamethason, Antioxidantien 15, 11, 12, 13 Cycloheximide 8, 20 FMLP anti-apoptotisch 6 pro-apoptotisch 13, 10 CD11a/11b- oder CD18Kreuzvernetzung 14, 15 CD36, L-SelektinKreuzvernetzung 24, 14 anti-apoptotisch 6, 7 TNF-α pro-apoptotisch 21 kein Effekt 8 Modifiziert nach Krüger 2001 1 GIRARD et al. 1996; 2 BIFFL et al. 1996; 3 KETTRITZ et al. 1998; 4 HU & YASUI 1997; 5 MOULDING et al. 1999; 6 MURRAY et al. 1997; 7 KEEL et al. 1997; 8 SULLIVAN et al. 1996; 9 KOLLER et al. 1997; 10 HEBERT et al. 1996; 11 STRINGER et al. 1996; 12 MEAGHER et al. 1996; 13 WATSON et al. 1996; 14 WATSON et al. 1997; 15 GINIS & FALLER 1997; 16 COX 1996 ; 17 KASAHARA et al. 1997; 18 LUNDQVIST-GUASTAFSSON & BENGTSSON 1999; 19 FORTENBERRY et al. 1998; 20 WHYTE et al. 1997; 21 GON et al. 1996; 22 WALKER et al. 1997; 23 BANNO et al. 1997; 24 MESZAROS et al. 2000. Wegen der konträren Angaben über die Einflüsse auf die Apoptose werden die „Induktoren“ tabellarisch dargestellt (s. Tab. 3) und nur auszugsweise beschrieben. Erstaunlicherweise wird den meisten Stoffen eine eher anti-apoptotische Wirkung zugeschrieben. KOLLER et al. (1997) fanden heraus, dass Arachidonsäure und verschiedene Arachidonsäure-Metaboliten (Leukotriene und Prostaglandine) an der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten beteiligt sind. WALKER et al. (1997) konnten einen anti-apoptotischen Effekt von PGE2 auf neutrophile Granulozyten beobachten. Für NO sind verschiedene Effekte bei unterschiedlichen Spezies beschrieben (ADLER et al. 1995). FORTENBERRY et al. (1998) weisen dem NO einen pro-apoptotischen Effekt auf humane Granulozyten zu. Die Einflüsse von TNF-α werden ebenso konträr dargestellt. Abhängig davon ob das Zytokin löslich oder membranständig vorliegt konnten MESZAROS et al. (2000) keinen bzw. einen pro-apoptotischen Effekt feststellen. Andere Arbeitsgruppen zeigen für lösliches TNF-α sowohl induzierende (GON et al. 1996) als auch hemmende Wirkungen (KEEL et al. 1997, MURRAY et al. 1997). 37 Geräte, Material und Methoden 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“ Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“ Autoklav Typ GE406 Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Centricon®3 – Filtrationssystem CO2-Flasche zur Sterilfiltration Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel pressure vessel“ Eismaschine Typ UBE 30-10 Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®, mit angeschlossener Computereinheit Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Phasenkontrasteinrichtung Fluoreszenzphotometer Folienschweißgerät „Polystar® 100GE“ Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ Invertmikroskop Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor Laborfeinwaage „B6“ Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Laborwaage „BL310“ Magnetrührer mit Heizplatte Pinzette, gebogen, anatomisch Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µl) Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl) Pipettierhilfe „accu-jet®“ Plastikbox mit Gittereinsatz Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) Reinwerkbank Laminair HL2448 Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ 38 (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) (Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) (Getinge AB, Getinge/Schweden) (Heraeus, Hanau) (Wartewig (6.001.000), Göttingen) (Amicon, Beverly/MA, USA) (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) (Alloy Products (XX670053)) (Ziegra, Isernhagen) (Becton Dickinson, Heidelberg) (Zeiss (476250-9901), Oberkochen) (Rische und Herfurth, Hamburg) (Heraeus, Hanau) (Zeiss, Oberkochen) (Einzelhandel) (Heraeus instruments, Osterode) (Mettler, Zürich/Schweiz) (Knick, Berlin) (Sartorius GmbH, Göttingen) (Janke und Kunkel, Staufen) (Eickemeyer (170710), Tuttlingen) (Brand (09U2539), Wertheim) (Gilson, Villers Le Bel/Frankreich) (Brand (26404), Wertheim) (Einzelhandel) (Heraeus-Christ. Osterode) (Heraeus-Christ, Hanau) (ASID, Unterschleißheim) (ASID, Unterschleißheim) (Dynatec, Zug/Schweiz) Geräte, Material und Methoden Schere, rostfrei Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten „Rumo100“ Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ WinMDI, Auswertungsprogramm für Durchflusszytometerdaten, Version 2.8 Zählkammer nach Bürker Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ (Fisher Scientific (9204013), Schwerte) (Heidolph (52100), Schwabach) (Wifug (10209), Bradford/England) (Hermle, Gosheim) (GFL, Hannover) (TROTTER 1997) (Brand, Wertheim) (Heraeus instruments, Osterode) 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf Einmalspritzen Luer steril 5 ml Einmalspritzen Luer steril 10 ml Einmalspritzen Luer steril 50 ml „Plastipak®“ Einmal-Untersuchungs-Handschuhe „Gentle Skin® sensitive“ Kanülen 1,80 x 40 m/m, steril „TSK STERIJECT“ Li-Heparin-Röhrchen (10 ml) Staukette nach Witte Vacutainer Brand Luer Adapters Vacutainerröhrchen, 10 ml, ohne Zusatz Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA-K2 (18 mg) Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU) 3.2.2 (AMEFA (302010), Limburg) (AMEFA (302020), Limburg) (Becton Dickinson (300865), Drogheda/Irland) (Meditrade® (1221R), Kiefersfelden) (TSK-Supra, Tochigi/Japan) (Sarstedt (26369), Nürnbrecht) (Eickemeyer (442015), Tuttlingen) (Becton Dickinson (367300), Heidelberg) (Becton Dickinson (368430), Heidelberg) (Becton Dickinson (367525), Heidelberg) (Becton Dickinson (368480), Heidelberg) Laborbedarf Combitips 1,25 ml Combitips 2,5 ml Einmal-Filter, 0,2µm Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 ml Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 24 Vertiefungen 39 (Eppendorf (0030069.420), Hamburg) (Eppendorf (0030069.447), Hamburg) (Renner (26146040), Hanau) (Merck (612F1767), Darmstadt) (Sarstedt (72699), Nürnbrecht) (Greiner (616201), Frickenhausen) (Corning (3524), Wiesbaden) Geräte, Material und Methoden Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen Flachboden-Zellkultur-Makroplatte mit Abdeckplatte, 4 Vertiefungen Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Petrischale (Durchmesser 94 mm) Pipettenspitzen, gelb und blau Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen Röhrchen, 15 ml, Polypropylen Greiner Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml Saugpipetten (10 ml) Teflonfolie Tesafilm-Klebeband Tiegelzange 400 mm Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen (Falcons, steril) Zellkulturflaschen, 200 ml Zellkulturflaschen, 75 ml 3.2.3 (Biochrom (P92960), Berlin) (Greiner (657160), Frickhausen) (VWR international (215L1516), Hannover) (Brand (747720), Wertheim) (Greiner (633171), Frickenhausen) (Sarstedt (70/762002) (70/760002), Frickenhausen) (Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz) (Corning (430791), New York, USA) (Becton Dickinson (352008), Heidelberg) (Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht) (Angst und Pfister, Zürich/Schweiz) (Einzelhandel) (Fisher Scientific (9310240), Schwerte) (Corning (430829), Wiesbaden) (Nunc (156499), Wiesbaden) (Nunc (136196), Wiesbaden) Reagenzien Accutase Acridin-Orange Albumin, bovin, Fraktion V, 98% pulverisiert (BSA, bovines Serumalbumin) Ammoniumchlorid (NH4Cl) Annexin V-FITC DAF-2 DA D(+)-Glucose (wasserfrei) DTAF-Ziegen-Antikörper-anti-Rind-Ig, schwere und leichte Ketten = DTAF – ZgαM – IgG+M (H+L) (1:50) Ethanol 641, absolut vergällt Ethanol absolut Ethidiumbromid Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA) Fetales Kälberserum (FCS) Virus und Mykoplasmen getestet 40 (PAA (L11-007), Linz/Österreich) (Sigma (A6014), Steinheim) (PAA (K41-001-100), Linz/Österreich) (Sigma (A4514), Taufkirchen) (Alexis (AL-209-250-T100), Grünberg) (Alexis (AL-850-020-K102), Grünberg) (Fluka (49140), Buchs/Schweiz) (Dianova (115-015-068), Hamburg) (CG Chemikalien, Laatzen) (Baker (8228), Deventer/Holland) (Sigma-Aldrich (E87A51), Steinheim) (Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim) (Biochrom (S0 113/431B), Berlin) Geräte, Material und Methoden Flow-AMP® Amplification-Kit Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran® Iscové®-Trockenmedium Kaliumchlorid (KCl), kristallin Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3) Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat L-Glutamin Lipopolysacharid von Escherichia coli Serotyp O55:B5 Lipoteichonsäure von Staphylokokkus aureus Lymphozytenseparationsmedium (Tebu-bio (EAS-B-100), Frankfurt a.M.) (Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim) (Roth (49794.1), Karlsruhe) (Biochrom (T04610), Berlin) (Biochrom (T046-10), Berlin) (Merck (3852), Darmstadt) (Roth (8174.1), Karlsruhe) (Biochrom (K0283), Berlin) (Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim) (Sigma-Aldrich (L-2515), Steinheim) (PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich) 2-Mercaptoethanol (J. T. Baker (8683), Groß Gerau) Natriumazid (NaN3), 10%ig (Sigma-Aldrich (S-2002), Steinheim) Natriumchlorid (NaCl) (Roth (9265.2), Karlsruhe) Natriumhydroxyd-Pellets, wasserfrei (Sigma-Adrich (S-5881), Steinheim) G N - Nitro-D-Arginin (Calbiochem (483124), Bad Soden) NG-Nitro-L-Arginin (Calbiochem (483125), Bad Soden) N-(1-Naphthyl-)Ethylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma-Aldrich (N9125), Steinheim) Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim) Penicillin(-G)-Streptomycin (Biochrom (A2213), Berlin) TM Percoll (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) (Pharmacia (17089101), Freiburg) Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) (Sigma-Aldrich (P-8139), Steinheim) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, (Biochrom (L18210), Berlin) ohne Ca++/Mg++ Phycoerythrin (PE) (Dianova (115015068), Hamburg) Propidiumiodid (PI) (Calbiochem (537059), Bad Soden) Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) (Baker (6081), Deventer/Holland) Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert (Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim) Staphylokokken-Lösung, Pansorbin® (Calbiochem (507858), Bad Soden) Saponin (Sigma-Aldrich (S-2149), Steinheim) Streptavidin-FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) (Dianova (016-090-084), Hamburg) Streptavidin-PE (Phycoerythrin) (DAKO (R0438), Denmark) Streptomycin (-Sulfat) (Biochrom (A331-27), Berlin) To-Pro-3 iodide (Molecular Probes (T36-05), Leiden/Holland) Tri-Natriumcitrat (2xH2O) (Sigma-Aldrich (S-4641), Steinheim) Oligodeoxynucleotide (MWG Biotech, München) 41 Geräte, Material und Methoden Tab. 4 Übersicht über Name, Sequenz, Effizienz der bisherigen Verwendung der eingesetzten CpG-Motive Name Sequenz Nutzung Referenzen S/SS/NS CpG-WB 5‘-ggtcaacgttga-3‘ Rind (S) BROWN et al. (1998) CpG-WB biot 5‘BIO-ggtcaacgttga-3‘ Rind (S) GpC-WB 5‘-ggtcaagcttga-3‘ Rind (NS) GpC-WB biot 5‘Bio-ggtcaagcttga-3‘ Rind (NS) CpG 1668 5‘-tccatgacgttcctgatgct-3‘ Fische (S)/ Maus (S) JØRGENSEN et al. (2001), YI und KRIEG (1998) CpG 1760 5‘-ataatcgacgttcaagcaag-3‘ Mensch (S)/ Maus (SS) HARTMANN et al. (2000), JIN et al. (2000) CHU et al. (1999) CpG 1781 5‘-accatggacgttctgtttcccctc-3‘ Mensch (S)/ HARTMANN et al. (2000) BROWN et al. (1998) Maus (SS) CpG 1826 5‘-tccatgacgttcctgacgtt-3‘ Mensch (S)/ HARTMANN et al. (2000), Maus (SS) JIN et al. (2000), WARREN et al. (2000) CpG 1829 5‘-atgacgttcctgacgtt-3‘ Mensch (S)/ Maus (SS) HARTMANN et al. (2000) CpG 2006 5‘-tcgtcgttttgtcgttttgtcgt(t)-3' Mensch (SS)/ Maus (S) HARTMANN et al. (2000) CpG 2007 5‘-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3‘ Mensch (SS)/ Maus (S) HARTMANN et al. (2000) S = stimulierend, SS = stark stimulierend, NS = nicht stimulierend. Die Sequenzen wurden mit kleinen Buchstaben geschrieben, da es sich um Sequenzen mit einem Phosphorothioat-Rückgrat handelt. Diese Sequenzen wurden aufgrund ihrer bisher beschriebenen Wirkung auf das bovine, murine und/oder das humane Immunsystem ausgewählt. Dabei wurden sowohl besonders effektiv stimulierende Sequenzen als auch Sequenzen, die bei einer Spezies keinen großen Effekt zeigten, gewählt. 42 Geräte, Material und Methoden 3.2.4 Antikörper und Nachweisreagenzien Antikörper für den Einsatz in der Membranimmunfluoreszenz Monoklonale Antikörper Die Hybridome, welche die murinen monoklonalen Antikörper (mAk) Bo116 (IgM), Bo139 (IgG3κ) und Bo1 (IgG1κ) produzieren, wurden in der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach der Immunisierung von Mäusen mit bovinen lymphoblastoiden Zellen des Rindes (nach Transformation mit Theileria annulata) hergestellt (REBESKI 1990, VON DER OSTEN 1990, RÖNSCH 1992). Der mAk Bo139 ist spezifisch für BoLA-DR-Produkte (LANGE 1995). Der mAk Bo1 erkennt bovine MHC-Klasse-IMoleküle (SCHUBERTH et al. 1992). Eine Zusammenstellung der in der Membranimmunfluoreszenz eingesetzten primären, monoklonalen Antikörper, sowie deren Isotypen und Spezifitäten befindet sich in Tab. 5. Tab. 5 Verwendete monoklonale Antikörper zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen in der Membranimmunfluoreszenz Name Spezifität Donor/ Isotyp Finale Verdünnung Referenz Bo 1 anti MHC-I Maus/IgG1 1:1 SCHUBERTH (1991) Bo 139 anti MHCKLASSE-II Maus/IgG3 1:1 VON DER OSTEN (1990) IL-A11 a anti CD4 Maus/IgG2a 1:20.000 HOWARD et al. (1991) HOWARD und NAESSENS (1993) CC-63 a anti CD8 Maus/IgG2a 1:10.000 HOWARD et al. (1991) a) Antikörper lagen als Ascites vor. Alle anderen monoklonalen Antikörper lagen als Zellkulturüberstände vor. Verdünnungen der verwendeten primären Antikörper wurden mit MIFPuffer (s. S. 46) durchgeführt. Nachweisantikörper Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz dienten affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörperpräparationen: Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten) konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat oder Phycoerythrin (PE) (Dianova (115015068 bzw. 115116146), Hamburg), sowie Ziege-anti- 43 Geräte, Material und Methoden Hund-Ig (Kirkegarrd & Perry (16-19-06), USA, Gaithirsburg), schwere und leichte Ketten konjugiert mit Biotin. Beide Sekundärantikörper waren gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine absorbiert. Die eingesetzte Verdünnung betrug für den FITC konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper in der Regel 1:100 (in MIF-Puffer, s. S. 46), zur Herstellung von Referenzzellen (s. S. 60) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. Für die Doppelfluoreszenzen wurde der PE-konjugierte Ziege-anti-Maus Antikörper ebenfalls 1:100 eingesetzt. Der Ziege-anti-Hund-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:1000 für die Amplifikation der CpG-Bindungsversuche eingesetzt. 3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest. angesetzt. Zellkulturmedien und Zusätze Die Grundmedien wurden als Trockensubstanz bezogen, in Aqua tridest. gelöst und sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite). Um Komplementaktivität zu zerstören und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS) bei 56°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend erfolgte die weitere Lagerung sowohl des FCS als auch der Kulturmedien in aliquoten Teilen bei -20°C. Aufgetaute Medien wurden nicht länger als zehn Tage im Kühlschrank aufbewahrt. I10F Medium (s. S. 40, 3.2.3) - Für die Proliferation Fetales Kälberserum 10 % (v/v) L-Glutamin 4 mmol Penicillin 100.000 IU Streptomycin 10 mg Aqua tridest. ad 1000 ml - Für die Makrophagengewinnung und die Versuche zum induzierten Absterben der PMN (s. S. 53 und S. 65) Fetales Kälberserum 10 % (v/v) L-Glutamin 4 mmol Streptomycin 10 mg Aqua tridest. ad 1000 ml 44 Geräte, Material und Methoden Stammlösungen der Superantigene und Mitogene sowie LPS und LTA Stocklösungen des Superantigens SEA (s. 3.2.3), dem Mitogen Pokeweed Mitogen (PWM; s. 3.2.3) dem Membranbestandteil Gram negativer Bakterien LPS und Gram positiver Bakterien LTA wurden in I10F+Strep auf die siebenfache Finalverdünnung eingestellt: SEA (7 ng/ml); PWM (7 µg/ml); LPS und LTA (70 µg/ml). Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 100 – 500 µl bei -20°C gelagert. Stammlösung der DNA-Motive DNA-Motive wurden zur Stimulation von MNC und Gemischen aus PMN/MNC sowie Makrophagen/PMN eingesetzt. Darüber hinaus kamen ein biotinyliertes CpG- und GpCMotiv bei der Membranimmunfluoreszenz und der intrazellulären Fluoreszenz zum Einsatz. Die Herstellung definierter CpG-Motive wurde in Auftrag gegeben (s. S. 40, 3.2.3). Die Festsubstanzen wurden in Aqua tridest. gelöst, sterilfiltriert (0,22 µm Porenweite) und mit Kulturmedium oder MIF-Puffer (biotinylierte Sequenzen) auf das siebenfache der Endkonzentration verdünnt. Die finale Konzentration der in den funktionellen Tests eingesetzten CpG-Motive betrug 5 µg/ml, die biotinylierten Sequenzen wurden in der Membranimmunfluoreszenzen (MIF) in der doppelten Konzentration (10 µg/ml) eingesetzt. Die Stammlösungen wurden in aliquoten Teilen bei -20°C vorrätig gehalten. Material für die Separation von Zellen Lymphozytenseparationsmedium Lymphozytenseparationsmedium (s. S. 40, 3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdiatrizoat und eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet. Percoll Bei Percoll (s. S. 40, 3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C. Durch Zugabe von 0,81 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%-iges Percoll). Für die Separation reiner PMN wurde in dieser Arbeit die 100%-ige Stammlösung mit physiologischer NaCl-Lösung (0,9%-ig) zu einer 70%-igen Lösung verdünnt. 45 Geräte, Material und Methoden Natriumchloridlösung, 0,9% NaCl Aqua tridest. ad 8,77 g 1000 ml Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne EDTA Die PBS-Trockensubstanz (s. S. 40, 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile lagen in den folgenden Konzentrationen vor. NaCl 8,0 g KCl 1,24 g Na2HPO4 0,2 g 0,2 g KH2PO4 Aqua tridest. ad 1000 ml Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS) Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt und mit Aqua tridest. auf 1000 ml ergänzt. Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) bovines Serumalbumin 5,0 g Natriumazid 0,1 g PBS ad 1000 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Reagenzien für die Fluoreszenzsteigerung mit dem Flow-AMP-System Bei diesem Kit (s. S. 40, 3.2.3) handelt es sich um ein speziell auf biotinylierte Primärantikörper abgestimmtes System, dass die Fluoreszenz schwach bindender Antikörper oder geringgradig exprimierter Oberflächenstrukturen steigert. Die in dem Kit enthaltenen Stammlösungen werden wie folgt verdünnt. Staining Buffer Fetal Calf Serum (FCS) 2 Natriumazid 0,1 PBS ad 100 ml ml ml 46 Geräte, Material und Methoden Staining Buffer ohne Natriumazid Fetal Calf Serum (FCS) 2 PBS ad 100 ml ml Sekundäres Reagenz Streptavidin konjugierte Meerrettich (Horse-Radish) Peroxidase, 1:50 in Staining Buffer verdünnt Amplifizierungs Reagenz 1:20 in Amplifizierungsmedium verdünnt Detektorreagenz FITC-konjugiertes Streptavidin 1:100 in natriumazidfreiem Staining Buffer verdünnt Reagenzien für den Nachweis der Apoptose von Zellen durch den Annexin V-FITC-Kit Binding Buffer Binding Buffer Stocklösung; 1:4 in Aqua tridest. Annexin V-FITC Annexin Stocklösung; 1:2 in Binding Buffer Propidiumiodidlösung Propidiumiodidstammlösung; 1:10 in Binding Buffer verdünnt Reagenzien für die Messung der Nitrit-Produktion Diaminofluoreszein-2 Diazetat (DAF-2 DA) Der Feststoff wurde in Aqua tridest. aufgenommen und auf eine Konzentration von 50 µM/ml verdünnt. Diese Lösung wurde in aliquoten Teilen zu 25 - 50 µl bei -20°C gelagert. 47 Geräte, Material und Methoden Griess-Reagenz Sulfanilamid 10 g N-(1-Naphthyl-)Ethylendiamin-Dihydrochlorid 1 g H3PO4 25 g Aqua tridest. ad 1000 ml Das Reagenz wurde in Dunkelheit bei 4°C und nicht länger als eine Woche gelagert. L-Arginin - Stammlösung L-Arginin 2,107g PBS ad 10 ml Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. - Gebrauchslösung 2 mM L-Arginin-Stammlsg. I10F+Strep ad 100 50 µl ml Lösungen zum Fixieren und Auszählen von bovinen Zellen Formaldehydlösung zum Fixieren der Gesamtleukozytenfraktion für die intrazelluläre Färbung Formaldehydlösung (37%) 12,9 ml PBS ad 50,0 ml Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen Paraformaldehyd 40 mg PBS ad 1000 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Akridinorange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung Akridinorange 250 mg Ethidiumbromid 250 mg PBS ad 100 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. 48 Geräte, Material und Methoden Wasch- und Verdünnungspuffer für die intrazelluläre Immunfluoreszenz (Saponin-Puffer) Saponin 2,5 g MIF-Puffer ad 100 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C. Puffer für die Makrophagengewinnung aus bovinen Monozyten nach Methode 1 ACD-Puffer Zitronensäure (A. dest.) 14,71 g Tri-Natriumzitrat (A. bidest.) 29,41 g Glucose (wasserfrei) 19,82 g Aqua tridest ad 500 ml Herstellung bei 10°C, pH-Wert 7,3-7,35. Lagerung bei 4°C nach Sterilfiltration. Citratpuffer Zitronensäure (A. dest.) 31,29 g Glucose (180,16) 4,32 g KCl 1,15 g NaCl 29,97 g Aqua bidest. ad 5000 ml pH-Werteinstellung mit NaOH auf pH 7,3-7,35; Lagerung bei 4°C nach Sterilfiltration. Lyse-Puffer Herstellung der Stammlösungen - Ammoniumchloridlösung (155 mM) 55,01 g NH4Cl Aqua tridest. ad 1000 ml - Kaliumhydrogencarbonatlösung (10 mM) KHCO3 20,02 g Aqua tridest. ad 200 ml - Ethylendiamintetraacetat (0,1 mM) EDTA (0,5 M) 29,22 g Aqua tridest. ad 200 ml pH-Werteinstellung auf pH 8,0 49 Geräte, Material und Methoden Lyse-Puffer NH4Cl (155 mM) 100 ml KHCO3 (10 mM) 10 ml EDTA (0,1 M) 1 ml A. bidest. ad 1000 ml pH-Werteinstellung auf 7,3–7,35 mit HCl (20%ig); Lagerung bei 4°C nach Autoklavierung. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit EDTA EDTA (0,1M, pH 8) 1,5 ml PBS ad 500 ml pH-Werteinstellung auf 7,3–7,35 mit HCl (20%ig); Lagerung bei 4°C nach Autoklavierung. Lösungen für die Herstellung von Phagozytosepartikeln FITC-Puffer Na2CO3 10,6 g NaCl 5,9 g Aqua tridest. ad 1000 ml pH-Werteinstellung auf pH-Wert 9,2 mit HCl (37%-ig) 3 mg FITC wurden in 7 ml FITC-Puffer vollständig gelöst. Die Lagerung erfolgte bei -20°C. FITC-markierte Staphylokokken Für die hier durchgeführte durchflusszytometrische Messung der Phagozytosekapazität boviner, in vitro generierter Makrophagen, ist es notwendig den Zellen fluoreszierende Partikel zur Phagozytose anzubieten. Drei Milliliter der standardisierten Pansorbin® Staphylokokken-Suspension (s. S. 40, 3.2.3) wurden mit 7 ml des FITC-Puffers unter Lichtabschluss für 20 h bei Raumtemperatur während ständiger Bewegung im Röhrchenschwenker inkubiert. Um freies FITC zu entfernen schlossen sich drei Waschschritte der Bakteriensuspension mit PBS an (15.000 xg, 1 min). Unter Zuhilfenahme der Zählkammer nach Bürker (s. S. 38, 3.1) wurde die Suspension in PBS auf eine Konzentration von 2 x 108 Bakterien/ml. Die Lagerung erfolgt in aliquoten Teilen à 1 ml bei -20°C. PI-markierte Staphylokokken Für die intrazelluläre Nitritbestimmung. Zwei Milliliter einer auf 2 x 108 Partikel/ml eingestellten Pansorbin® Staphylokokken-Suspension (s. S. 40, 3.2.3) wurde mit einer 6 µg/ml PI enthaltenden PBS-Lösung für 3 h bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Die Verwendung erfolgte in PBS direkt nach einem Waschgang (15000 xg, 1 min). 50 Geräte, Material und Methoden Gepooltes Rinderserum zur Opsonisierung der Staphylokokken Von drei klinisch gesunden Rindern der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde unter sterilen Kautelen unter Verwendung des VacutainerSystems (s. S. 39, 3.2.1) nicht gerinnungsgehemmtes Blut gewonnen (s. S. 52, 3.3.1). Zur Trennung der korpuskulären Anteile vom Serum wurde das Blut bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Gerinnung gelagert. Im Anschluss erfolgte eine Zentrifugation (2000 xg, 15 min, Raumtemperatur (RT)). Noch verbliebene Partikel konnten aus dem mit einer Pipette entnommenen Überstand durch eine weitere Zentrifugation bei 3500 xg für 10 min entfernt werden. Die Seren der drei Tiere wurden anschließend zu gleichen Anteilen gemischt (gepoolt). Das Poolserum wurde 1:10 in PBS verdünnt und in aliquoten Teilen zu je 1 ml bei -80°C gelagert. Lösungen für die Durchflusszytometrie Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystems nach den Messungen mit sterilfiltriertem Aqua tridest. (Porenweite 0,2 µm, s. S 39, 3.2.2) und 1%-iger Natriumhypochlorit-Lösung gespült. Trägerflüssigkeit (Sheath fluid) Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS (s. S. 46) mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet. Propidiumiodidstammlösung Propidiumiodid: 100 µg/ml gelöst in Trägerflüssigkeit Die Stammlösung wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit 20 µl Propidiumiodidstammlösung/l zugesetzt (Endkonzentration 2 µg/ml). 3.2.6 Tiere Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich um ausschließlich weibliche Tiere der Rassen „Deutsche Schwarzbunte“, Typ Holstein-Friesian. Das Alter lag zwischen 0,5 und 12 Jahren. Alle verwendeten Tiere waren klinisch gesund und stammten entweder aus der Klinik für Rinder oder der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. 51 Geräte, Material und Methoden 3.3 Methoden 3.3.1 Gewinnung einzelner Zellpopulationen aus bovinem Blut Gewinnung gerinnungsgehemmten Blutes Das Blut wurde durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung der Vene mit einer Staukette nach Witte gewonnen. Zur Blutentnahme wurde das Vacutainersystem mit heparinisierten Vacutainern für die Gewinnung von MNC und EDTA beschichteten Vacutainern für die Gewinnung von PMN verwendet (s. S. 39, 3.2.1). Für die Kultivierung boviner MDM nach JUNGI (Methode 1) wurde die Blutgewinnung wie unter 3.3.2 auf Seite 53 beschrieben durchgeführt. Gewinnung boviner mononukleärer Zellen Das frisch gewonnene heparinisierte Blut wurde im Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in 50 ml Röhrchen auf Lymphozytenseparationsmedium® (s. S. 40, 3.2.3) überschichtet. Die anschließende Zentrifugation (30 min, bei 4°C) wurde bei 1100 xg ohne Bremse durchgeführt. Bei der hier angewendeten Dichteseparation trennten sich die einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Die oberste Schicht wurde durch das Plasma gebildet. Zwischen dem Plasma und dem Lymphozytenseparationsmedium befand sich die so genannte Interphase mit mononukleären Zellen (MNC; lymphoide Zellen, Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion. Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die polymorphkernigen Zellen. Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesogen und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 ml) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 30 ml schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 min, 4°C; 500 xg, 250 xg und 80 xg), um die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Zwischen den einzelnen Zentrifugationen wurden die Zellen durch Aufschütteln aus dem Pellet gelöst und in ca. 40 ml PBS resuspendiert. Mit dieser Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x 106 MNC/ml Vollblut gewonnen werden. Gewinnung neutrophiler Granulozyten Die Blutgewinnung wurde unter Zuhilfenahme von EDTA beschichteten Vacutainern (s. S. 39, 3.2.1) durchgeführt. Zehn bis fünfzehn Milliliter des Vollblutes wurden in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Durch zwei hypotone Lysen konnten die Erythrozyten 52 Geräte, Material und Methoden entfernt werden: Im Vollblut erfolte nach Zugabe von ca. 15 ml Aqua tridest. eine Inkubation für 20 sek (erste Lyse) bzw. 10 sek (zweite Lyse) unter ständigem Schwenken. Um die Lyse zu stoppen schloss sich die Zugabe der gleichen Menge an zweifach konzentriertem PBS an. Nach beiden Lysen erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C für 8 min bei 220 xg mit Bremse. Die Überstände wurden dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen gelöst und in 10 ml PBS resuspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension über 4 ml 70 %-iges isotones Percoll (s. S. 40, 3.2.3) in 15 ml Zentrifugenröhrchen geschichtet. Die Zentrifugation erfolgte bei Raumtemperatur für 20 min bei 750 xg. Nach der Zentrifugation befanden sich die neutrophilen Granulozyten als Pellet am Boden des Gefäßes, restliche MNC und eosinophile Granulozyten befanden sich in der Interphase. Der Überstand, die Interphase und das Separationsmedium wurden mit einer Pipette abgesogen. Es schlossen sich zwei Waschschritte (je 10 ml PBS, 4°C, 8 min, 220 xg) an. Das letzte Zellpellet wurde in Kulturmedium (I10F+strep-Medium) aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Dichte eingestellt. Durch dieses Verfahren konnten relativ reine Populationen neutrophiler Granulozyten separiert werde. Der Anteil an eosinophilen Granulozyten lag bei <5%. Lag der Anteil kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10% wurde die Zellsuspension nicht verwendet. 3.3.2 Generierung von Makrophagen durch in vitro Kultivierung monozytoider Zellen des peripheren Blutes (BMDM, blood monocyte derived macrophages) Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten nach Methode 1 Dieses durch SCHÜMANN (2001) veränderte Verfahren (Methode 1 nach JUNGI et al. 1996) diente der Gewinnung einer in Morphologie, Funktion und biochemischem Verhalten möglichst homologen, ausgereiften Makrophagenpopulation. Das Blut wurde unter sterilen Kautelen gewonnen. Dazu wurden die Tiere in gereinigte Räume gebracht. Aus der gestauten Vena jugularis wurden 90 ml Blut in einer sterilen 200 ml Schottflasche mit Zugabe von 10 ml ACD-Puffer (s. S. 49) zur Gerinnungshemmung unter ständigem Schwenken aufgefangen. Das Blut wurde bei Raumtemperatur einer Stunde stehengelassen. Während der weiteren Verarbeitung wurden das Blut, bzw. die Zellsuspensionen sukzessiv auf 4 bis 6°C heruntergekühlt. 53 Geräte, Material und Methoden In zwei 50 ml Zentrifugenröhrchen wurden 80 ml des Bluts bei 10°C und 1450 xg für 25 min ohne Bremse abzentrifugiert um den Buffy Coat, die leukozytenreiche Fraktion, zu gewinnen. Für diesen Vorgang wurde eine Einmal-Pasteurpipette verwendet. Der Buffy coat wurde zu 100 ml des Citratpuffers (s. S. 49) in eine sterile 200 ml Schottflasche gegeben, mit Citratpuffer auf 160 ml aufgefüllt und die Suspension auf vier 50 ml Röhrchen verteilt. Die anschließende Zentrifugation erfolgte bei 340 xg für 12 min bei 10°C mit schwacher Bremse. Die Überstände wurden abgesogen. Um eine maximale Ausbeute an mononukleären Zellen zu erreichen, wurde zu den erythrozytenhaltigen Zellpellets das noch nicht verwendete Blut gegeben. Ein weiterer Zentrifugationsschritt zur Gewinnung eines Buffy Coats wurde angeschlossen. Der so gewonnene Buffy Coat wurde auf die bereits einmal mit Citratpuffer gewaschenen Zellpellets aufgeteilt. Nach dem Lösen und der Resuspension der Pellets schloss sich ein weiterer Zentrifugationsschritt bei 340 xg und 10°C für 12 min an. Dieser Waschvorgang wurde etwa drei bis vier Mal wiederholt, bis der Überstand nach der Zentrifugation klar erschien. Nach dem Absaugen des Überstandes bis auf 20 ml und der Aufteilung dieser Überstände auf zwei 50 ml Röhrchen, wurden 30 ml des kalten Lyse-Puffers (s. S. 49) in jedes Zentrifugenröhrchen gegeben, gut geschwenkt und 5 bis 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Farbe sollte sich zu einem klarem Rot-Schwarz ändern. Eine erneute Zentrifugation für 10 min bei 10°C und 340 xg schloss sich an. Wenn das Pellet nach dem Absaugen des Überstandes leicht rötlich bis beige erschien, war die Lyse erfolgreich. Ein rotes bis schwarzes Pellet wurde noch einmal dem Lyse-Schritt unterzogen (doch wirkte sich eine zweite Lyse schädigend auf die Monozyten aus, Daten nicht gezeigt). Durch zügiges Aufrütteln des Zellpellets und der Resuspension in PBS-EDTA (20 ml), sollte die Adhärenz der Zellen an den Gefäßwänden vermindern werden. Anschließend erfolgte eine Separation der Zellen durch Überschichtung des Lymphozytenseparationsmediums® mit der Zellsuspension im Verhältnis von 1:3. Die Dichtezentrifugation wurde bei 810 xg, 4° C und ohne Bremse für 25 min durchgeführt. Von nun an wurde, um Zelladhärenz zu vermeiden, auf Eis gearbeitet. Die gewonnenen MNC-reichen Interphasen wurden auf zwei Röhrchen mit je 20 ml kalter PBS-Vorlage (ohne EDTA) aufgeteilt und die Röhrchen mit PBS auf je 50 ml aufgefüllt. Zentrifugiert wurde nun bei 310 xg (4°C, 10 min). Nach Abnahme des Überstandes wurden die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in Iscové-Medium (s. S. 44, 3.2.5) aufgenommen und nach Zellzählung auf 6 x 106 Zellen/ml eingestellt. 54 Geräte, Material und Methoden Diese Suspension wurde in Teflonbeutel überführt und die enthaltene Luft vor dem Verschweißen entfernt. Die Teflonbeutel mit einem Fassungsvolumen von ca. 20 ml sollten immer zwei hintereinander liegende Schweißnähte haben. Doppeltes bis dreifaches Verschweißen mit Kontrolle auf Dichte der Schweißnähte erwies sich als sinnvoll. Um einer Kontamination vorzubeugen, wurden die Nähte mit Alkohol eingesprüht, bevor sie in Petrischalen über sieben bis zehn Tage in einem Brutschrank bei 37°C und 8% CO2 (in Luft) inkubiert wurden. Die Gewinnung der Makrophagenvorläuferzellen erfolgte nach der Kontrolle auf Hefen- oder Pilzkontamination unter einem Invertmikroskop. Kontaminierte Beutel wurden verworfen. Nach Abkühlung der Beutel und nachdem die Zellen von der Unterseite durch Fingerklopfen gelöst worden waren, wurde der Inhalt jeweils zweier Beutel in ein 50 ml Röhrchen überführt. Die weitere Behandlung der Zellen erfolgte auf Eis. Die Zellen wurden mindestens zweimal mit PBS gewaschen (s.o.). Zum Zählen und Einstellen der Suspension auf 2,5 x 106 Makrophagenvorläufer/ml wurde das Zellpellet in 10 ml kaltem Iscové-Medium ohne Zusatz von Antibiotikum aufgenommen. Bei der mikroskopischen Betrachtung konnten ca. 20-30 % der Zellen als Makrophagenvorläufer angesprochen werden. Von dieser Zellsuspension wurde pro Kavität einer 6-well Makrotiterplatte ca. 1 ml eingesät. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen, wurden die Platten direkt nach Zugabe von 5 ml Medium/Vertiefung geschwenkt. Zur Ermöglichung der Zelladhärenz wurden die Kulturplatten drei bis vier Stunden im Brutschrank gelagert. Zu Beginn der Ernte der Makrophagen wurden die einzelnen Vertiefungen sieben Mal mit warmem PBS gewaschen (Zugabe, Schwenken und vorsichtiges Abpipettieren aus der schräg gehaltenen Platte). Dieser Arbeitsschritt diente der Entfernung von Lymphozyten und dem FCS aus dem Medium, da FCS den im Folgenden verwendeten Enzymcocktail Accutase® (s. S. 40, 3.2.3) inaktiviert. Je Kavität wurden 500 µl körperwarmer Accutase® zugegeben, die Platte 10 sek geschwenkt und wieder abpipettiert. Nach Zugabe von 1000 µl Accutase® erfolgte eine 10-minütige Inkubation im Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft). Durch Klopfen an den Behältnisböden wurde die Ablösung unterstützt. Nach Kontrolle der Ablösung wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium gestoppt. Die Zellen wurden in 15 ml Röhrchen überführt und mit Medium aufgefüllt. Die Makrophagen wurden anschließend bei 4°C und 250 xg für 10 min zentrifugiert, in I10F+Strep aufgenommen, gezählt und im Medium auf die gewünschte Zellkonzentration eingestellt. 55 Geräte, Material und Methoden Makrophagengewinnung aus bovinen Blutmonozyten in Zellkulturflaschen (Methode 2) Dieses Verfahren wurde als zeitsparende Alternative zu der oben beschriebenen Methode 1 entwickelt. Geprüft werden sollte, ob sich die hiermit generierten Makrophagen morphologisch, phänotypisch und funktionell identisch zu den nach dem obigen Verfahren gewonnenen MDM verhalten. Für die Makrophagengeneration in Zellkulturflaschen wurden wie unter 3.3.1 beschrieben pro Tier 150 ml heparinisiertes Blut gewonnen. Die Bearbeitung der Zellen geschah unter sterilen Bedingungen unter einer Reinluftarbeitsbank mit autoklavierten Mehrweg- oder sterilen Einwegmaterialien. Das Blut wurde mit PBS verdünnt (1:2) und in 50 ml Röhrchen im Verhältnis 1:3 über Lymphozytenseparationsmedium® (s. S. 40, 3.2.3) geschichtet. Nach der Zentrifugation (1100 xg, 30 min, 4°C ohne Bremse) schloss sich die Entnahme der Interphase mit Überführung in 50 ml Röhrchen (mit 10 ml vorgelegtem PBS) an. Nach dreimaligem Waschen (s. S. 52) wurden die letzten Zellpellets in einem Röhrchen zusammengefasst und in Iscové-Medium mit 10% FCS und Streptomycin (I10F+Strep) aufgenommen, auf 5 x 106 Zellen/ml eingestellt und in Zellkulturflaschen überführt. In 200 ml Zellkulturflaschen wurden ca. 25–30 ml und in 70 ml Flaschen 7–10 ml Zellsuspension transferiert. Die Inkubation erfolgte bei 38,5°C und 5% CO2 (in Luft) für 6 Tage. Nach drei Tagen wurden 1520 ml frisches Medium zugegeben und am fünften Tag das Medium durch abgießen und Zugabe frischen Mediums ersetzt. Vor der Ernte der Zellen fand eine Kontrolle der Ansätze im Invertmikroskop auf mögliche Kontamination mit Bakterien oder Hefen sowie auf Adhärenz der Makrophagen statt. Der Inhalt kontaminierter Flaschen wurde nicht verwendet. Die Ernte der Zellen erfolgte unter sterilen Kautelen. Das Medium mit nichtadhärenten Zellen wurde abgegossen. Vier Waschschritte mit 25 ml 37°C warmen PBS (Zugabe, schwenken und abgießen) schlossen sich zur Entfernung der restliche Bestandteiles des Mediums und Zelldetritus an. Den Flaschen wurde je 1ml auf 38,5°C erwärmte Accutase® (s. S. 40, 3.2.3) zugefügt, durch Schwenken (10 sek) über die Oberfläche verteilt und wieder abgegossen. Anschließend wurden 4 ml der Accutase® zugegeben und für 10 min bei 38,5°C inkubiert. Die Ablösung der Zellen vom Boden konnte durch Klopfen mit den Fingern am Boden der Flaschen nach 5 min unterstützt werden. Zumeist konnten ca. 80% der adhärenten Zellen (nach mikroskopischer Einschätzung) abgelöst werden. Die Zellsuspension wurde in 50 ml Röhrchen überführt. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Die Zellen wurden abzentrifugiert (250 xg, 4°C, 7 min), in 2 ml Medium (I10F+Strep) resuspendiert und gezählt. Abb. 2 zeigt die so gewonnenen Makrophagen nach durchflusszytometrischer Analyse. 56 80% 20% Seitwärtsstreulicht (SSC) Seitwärtsstreulicht (SSC) Geräte, Material und Methoden Rotfluoreszenz (FL-3) Abb. 2 93% 6% Vorwärtsstreulicht (FSC) Analyse der Vitalität und Reinheit aus Blutmonozyten generierter Makrophagen nach durchflusszytometrischer Erfassung Makrophagen wurden mit dem Zellkulturflaschen-Verfahren aus Blutmonozyten generiert und durchflusszytometrisch charakterisiert. Das linke Dichtediagramm (FL-3/SSC) zeigt den relativ hohen Anteil PI-positiver = toter Zellen). Das rechte Dichtediagramm zeigt die korrelierte Darstellung Grösse/Komplexität (FSC/SSC) nach Ausschluss der toten Zellen. Makrophagen (93%) stellen sich als homogene Wolke mit relativ hohem SSC-Wert und höherem FSC-Wert dar. Der Anteil kontaminierender lymphoider Zellen beträgt hier 6%. Besonderheiten beim Vergleich der beiden Verfahren zur Gewinnung boviner Makrophagen Das Protokoll zur Generierung der Makrophagen nach JUNGI et al. (1996) (Methode 1) wurde genau befolgt. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde das Protokoll der Methode 2 dahingehend verändert, dass die Temperatur auf 37°C und der CO2-Gehalt auf 8% angepasst wurden. Es erfolgten immer von zwei Tieren parallel beiden Verfahren der Makrophagengewinnung. 3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung nach Akridinorange/Ethidiumbromid-Färbung Zellsuspensionen wurden zu gleichen Teilen mit einer Akridinorange/EthidiumbromidLösung (s. S. 44, 3.2.5) versetzt, in einer Bürker-Zählkammer gezählt und deren Vitalität beurteilt. Akridinorange dringt in die Zelle ein und interkaliert mit der doppelsträngigen DNA. Der Kern erscheint unter Zuhilfenahme eines Fluoreszenzmikroskops (s. S. 38, 3.1) mit UV-Anregung grün fluoreszierend. Das rot fluoreszierende Ethidiumbromid kann nur in 57 Geräte, Material und Methoden Zellen mit geschädigter Membran eindringen, wo es dann ebenfalls mit der DNA interkaliert. Die Rotfluoreszenz des Ethidiumbromids überlagert in toten Zellen die Grünfluoreszenz des Akridinorange. Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie Weist die Zellmembran Schädigungen auf, so kann das Fluorochrom PI in die Zelle eindringen und mit der DNA interkalieren. Tote Zellen sind nach durchflusszytometrischer Analyse im FL-3-Kanal (Rotfluoreszenz) erfassbar und können dadurch von ungeschädigten Zellen unterschieden werden. Zellen nach Separation oder Zellen nach Kultivierung wurden in Durchflusszytometerröhrchen überführt in denen Sheath mit PI (2 µg/ml final) vorgelegt war (s. S. 51). 3.3.4 Durchflusszytometrie Hier werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem Laserstrahl vorbei geleitet. Gestreutes Licht einer Wellenlänge (hier 488 nm) wird in Richtung des Strahls als so genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert. Die Signale werden aufgefangen und an den angeschlossenen Computer weitergeleitet. Mit Hilfe dieses Computers werden die Geräteeinstellungen kontrolliert, Messereignisse erfasst und gespeichert (ORMEROD 1990, RADBRUCH 1992). Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer handelt es sich um ein FACScan® (s. S. 38, 3.1) mit einem Argonlaser, der Licht einer Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren (FL-1, FL-2, FL-3) Fluoreszenzlichtemissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (Grünfluoreszenz: 515-545 nm; Orangefluoreszenz: 564-606 nm; Rotfluoreszenz: >650 nm). Jede Zelle oder jeder Partikel wird folglich durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1, FL-2, FL-3) charakterisiert und als ein Messereignis festgehalten. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ (TROTTER 1999) erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden einparametrisch als Histogramm oder mehrparametrisch als korrelierte Punkte-, Dichte- oder Konturdiagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark von den Einstellungen für die FSC, SSC und Fluoreszenz- 58 Geräte, Material und Methoden detektoren abhängt wurden nur solche Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der Messung software-gestützt elektronische „Fenster“ (so genannte „Gates“) gesetzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. So wurden bspw. in Mischungen aus PMN und MNC die PMN anhand ihrer charakteristischen Morphologie im FSC/SSCPunktediagramm identifiziert (R1: Region 1) und im FL-3/SSC-Punktediagramm die vitalen Zellen (R2: Region 2). Eine Verknüpfung von R1 und R2 bot somit ein „Fenster“ auf vitale PMN. In einer Zwei-Parameter-Darstellung FSC/SSC lassen sich morphologisch ähnliche Zellpopulationen, wie zum Beispiel eosinophile und neutrophile Granulozyten nicht voneinander unterscheiden (s. Abb. 3). Um dies zu ermöglichen wurden die Zellen im FL1/SSC Punktediagramm angezeigt in dem sich die eosinophilen Granulozyten durch eine höhere Autofluoreszenz darstellen (s. Abb. 3). R5 Seitwärtsstreulicht (SSC) Seitwärtsstreulicht (SSC) R1 R3 R4 R2 Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 3 Grünfluoreszenz (FL-1) Differenzierung leukozytärer Zellpopulationen des bovinen Blutes durch morphologische und Autofluoreszenz Charakteristika nach durchflusszytometrischer Analyse Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 10.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. Linkes Diagramm: Darstellung der Morphologie (Größe gegen Komplexität), R1: Granulozyten mit größerer Komplexität (SSC) sind von mononukleären Zellen (R2, lymphoide Zellen) und monozytoiden Zellen (R3) zu unterscheiden. Rechtes Diagramm: Unterscheidung neutrophiler Granulozyten (R5) von eosinophilen Granulozyten (R4) aufgrund der Autofluoreszenz, gemessen im Kanal FL-1 (Grünfluoreszenz). 59 Geräte, Material und Methoden Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) Während der Inkubation starb ein Teil der eingesäten Zellen durch die Kulturbedingungen oder die Stimulatoren ab. Durch eine Färbung der toten Zellen mit Propidiumiodid (Fluoreszenz in der FL-3) war es möglich, diese von den lebendigen Zellen zu unterscheiden. Eine bestimmte Anzahl Partikel, die sich von den zu untersuchenden Zellen unterscheiden, aber dennoch mit den gleichen Geräteeinstellungen zu messen sind, werden den Proben zugegeben. Anhand dieser kann eine Evaluation der lebendigen Zellen vorgenommen werden. In diesem Fall wurden bovine Zellen (Referenzzellen) zugesetzt. Werden die gemessenen Referenzzellen und die vitalen Zellen ins Verhältnis gesetzt, kann die absolute Zellzahl ermittelt werden. Um die verwendeten bovinen mononukleären Referenzzellen von den in Kultur befindlichen Zellen eindeutig unterscheiden zu können, erfolgte eine Markierung mit einem monoklonalen Antikörper gegen bovine MHC-Klasse-I-Moleküle (mAK Bo1, s. S. 43, Tab. 5) und anschließend mit einem fluorochromgekoppelten Ziege-anti-Maus-Antikörper (s. S. 43). Eine längere Lagerung konnte durch eine Fixation mittels Paraformaldehyd ermöglicht werden. Die toten und fixierten Zellen fluoreszieren nach Zugabe von Propidiumiodid (s. S. 51) in der FL-1 und in der FL-3. Herstellung von Referenzzellen Referenzzellen wurden immer in größeren Mengen hergestellt und nach Fixation bei 4°C unter Lichtabschluss gelagert. Zur Färbung wurden jeweils 2 x 107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80 xg für 5 min und 4°C abzentrifugiert. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen AKs Bo1 (s. S.) für 15 min bei 4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 ml MIF-Puffer (s. S. 44, 3.2.5) Zentrifugation über 7 min bei 80 xg und 4°C, Abgießen des Überstandes. Das resuspendierte Zellpellet wurde nun mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten Ziege-Anti-Maus Antikörpers (s. S. 43) versetzt und über 20 min unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert. Es schloss sich ein weiterer Waschschritt mit Resuspension der Zellen in 5 ml PBS an. Nach der Überführung der Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen wurde das Zentrifugenröhrchen mit PBS auf 50 ml aufgefüllt und die Zellen erneut abzentrifugiert. Die 60 Geräte, Material und Methoden Resuspension des Zellpellets erfolgte in 30 ml einer 4%-igen Paraformaldehyd-Lösung. Die Zellen inkubierten 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss. Anschließend wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in PBS gewaschen. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PI-haltigen Trägerflüssigkeit aufgenommen und auf 4 x 105 Zellen/ml eingestellt. (Die Konzentration wurde vor Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert). Vorbereitung der Proben für die Messung Zum Ende der Inkubationszeit wurden die Mikrotiterplatten für ca. 15 min auf Eis gelagert, um adhärente Zellen zu lösen. Kurzes Rütteln half bei diesem Vorgang. Eine Durchmischung und nahezu vollständige Ablösung der Zellen wurde durch vielmaliges Auf- und Abpipettieren erreicht. Die Ansätze wurden in 5 ml Röhrchen für die Durchflusszytometrie (s. S. 39, 3.2.2) überführt. Es schloss sich eine Kontrolle der Platten auf residuale Zellen an. Vor der Messung erfolgte eine Zugabe von 150 µl einer PI-haltigen Trägerflüssigkeit (Endkonzentration des PI 2 µg/ml, s. S. 51). Ermittlung der Zahl vitaler Zellen Je nach Anzahl der Populationen wurden 10.000–30.000 Zellen erfasst. Die Morphologie der Referenzzellen blieb durch die Fixation mit Paraformaldehyd weitgehend erhalten, was dazu führte, dass die Zellen im Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht nicht eindeutig von den frisch separierten oder kultivierten mononukleären Zellen, wohl aber von polymorphkernigen Zellen zu differenzieren waren. Durch ihre Fluoreszenz in der FL-1 (Grünfluoreszenz) gab es aber ein eindeutiges Unterscheidungskriterium (s. Abb. 4). Die Auswertung der Messung eines Gemisches aus Kultur- und Referenzzellen erfolgte durch die Darstellung verschiedener Parameter einer Messung gegeneinander (s. Abb. 4). Einzelpopulationen konnten durch Setzen von Fenstern markiert und gezielt in weiteren Diagrammen angezeigt werden. Die einzelnen Messereignisse (Events, E) werden mittels einer Quadrantenanalyse registriert. Die Quadrantenanalyse gibt die Zahl der Messereignisse, den mittleren Wert auf der x- und yAchse sowie prozentuale Anteile an sowohl den gezeigten, als auch den Gesamtereignissen an. Da immer eine definierte Menge Referenzzellen (ZREF) den einzelnen Messungen zugesetzt wird, war es möglich aus den gemessenen Ereignissen der vitalen Kulturzellen (EVIT) und den gemessenen Messereignissen der Referenzzellen (EREF) die Zahl vitaler Kulturzellen (ZVIT) in dem Ansatz mit folgender Formel zu berechnen: 61 Geräte, Material und Methoden Z VIT = E VIT x Z REF E REF Die Angabe des Parameters „Zahl vitaler Zellen (ZVIT)“ erfolgte als Mittelwert der berechneten Werte dreier Ansätze. R1 Seitwärtsstreulicht (SSC) Seitwärtsstreulicht (SSC) Wegen der großen interindividuellen Schwankungen der Zahl vitaler Zellen sowohl in den Proliferationsversuchen als auch in den Versuchen zum induzierten Sterben der neutrophilen Granulozyten, wurden keine absoluten Zellzahlen angegeben, sondern als Prozent der individuellen Kontrollansätze (=100%) ausgedrückt. A C Rotfluoreszenz (FL-3) Seitwärtsstreulicht (SSC) B Vorwärtsstreulicht (FSC) Rotfluoreszenz FL-3 R3 Grünfluoreszenz FL-1 Abb. 4 R2 D R4 Grünfluoreszenz FL-1 Evaluation der absoluten Zellzahl mittels Referenzzellmethode in der Durchflusszytometrie Für die Bestimmung der Vitalität boviner Granulozyten nach eintägiger Inkubation wurde die absolute Zellzahl bestimmt. Zu den einzelnen Proben wurde vor der Messung eine definierte Menge Referenzzellen zugegeben. In den Abbildungen A-D sind unterschiedliche Parameter einer Messung gegeneinander aufgetragen. In Abb. A sind alle Events dieser Messung dargestellt. Da durch Zugabe von PI die toten Zellen in der FL-3 positiv sind und daher rechts in dieser Darstellung liegen, wird durch die Region R1 der Focus auf die lebendigen Zellen gelegt. In Abb. B werden ausschließlich die in R1 liegenden, vitalen Zellen in der morphologischen Darstellung gezeigt. In der hier gesetzten Region R2 befinden sich sowohl neutrophile als auch eosinophile Granulozyten. Zu unterscheiden 62 Geräte, Material und Methoden sind diese beiden Populationen in der Darstellung FL-1 gegen SSC (Abb. C), da die eosinophilen Granulozyten (R3) eine höhere Autofluoreszenz besitzen und deshalb weiter rechts als die neutrophilen Granulozyten liegen. In Abb. D sind die Referenzzellen zu sehen, die von den Granulozyten schon durch ihre Morphologie und von den vitalen MNC durch ihre stärkere Fluoreszenz in den FL-1 und FL-3 zu unterscheiden sind. 3.3.5 Zellkultivierung in vitro Für die Zellkultivierung wurden mit Ausnahme der Kultivierung der mononukleären Zellen zur Generierung von Makrophagen, die in Zellkulturflaschen (Fassungsvermögen 70 und 200 ml, s. S. 39, 3.2.2) erfolgte, ausschließlich Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gewählt. Pro Ansatz betrug die Gesamtzahl der eingesäten Zellen mindestens 1 x 105, in der Regel jedoch 2 x 105 Zellen. Wenn zwei verschiedene Zellpopulationen als Kokultur Verwendung fanden, dann wurden bei der Kombination aus MNC und neutrophilen Granulozyten pro Population 1 x 105 Zellen und bei der Kombination aus Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bzw. mononukleären Zellen 2 x 104 Makrophagen pro 1 x 105 der jeweils anderen Population eingesät. Abweichungen von diesen Angaben werden bei den Beschreibungen der entsprechenden Versuche genannt. Die meisten Ansätze erfolgten in Triplikaten. Das Gesamtvolumen der Einzelansätze betrug 175 µl, die sich wie folgt zusammensetzen. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Zellsuspension mit jeweils 25 µl der einzelnen Stimuli pipettiert. Das Volumen wurde dann mit Medium bis auf 175 µl Gesamtvolumen aufgefüllt. In den Kontrollansätzen zur Negativ-Kontrolle, wurde das fehlende Volumen der Stimulatoren ebenfalls durch Medium ersetzt. Die Inkubation erfolgte in einem Brutschrank bei 38,5°C und 5% CO2 über 30 min bis zu sechs Tagen. Die Platten wurden in feuchten Kammern mit gesättigter Kupfersulfatlösung (Boden bedeckend) inkubiert, um den Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung zu minimieren. Die dafür verwendeten Boxen waren mit einem durchlöcherten Deckel ausgestattet. Der Kontakt der Zellkulturplatten mit der Lösung wurde durch ein Tragegestell verhindert. 63 Geräte, Material und Methoden Seitwärtsstreulicht (SSC) Medium SEA R2 R2 R1 R1 Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 5 Vorwärtsstreulicht (FSC) Prinzip der durchflusszytometrischen Erfassung der Blastogenese mononukleärer Zellen Mononukleäre Zellen eines Rindes wurden 6 Tage in vitro ohne Stimulus (linke Abbildung) oder mit dem Superantigen SEA (1 ng/l) (rechte Abbildung) stimuliert. Dargestellt sind korrelierte Punktediagramme (FSC/SSC). Blastisch transformierte Zellen lassen sich über die Zunahme der Zellgröße (höherer FSC-Wert) und der Komplexität (höherer SSC-Wert) von kleinen zytoiden Zellen unterscheiden. Kultivierung von Lymphozyten in vitro Die Mehrzahl der Ansätze mit mononukleäre Zellen waren Ansätze in Monokulturen. Auf die Ansätze in Kokulturen mit PMN – jeweils 1 x 105 Zellen – wird auf Seite 65 eingegangen. Bestimmt werden sollte in diesen Ansätzen die durch CpG-Motive induzierbare Proliferation boviner Lymphozyten. Die Inkubation erfolgte über vier bis sechs Tage in 96-WellRundbodenplatten (s. S. 39, 3.2.2) im Brutschrank. Die Negativ-Kontrolle zur Überprüfung der spontanen Proliferation bestand in der Inkubation der Zellen in Medium. Als PositivKontrolle, der Überprüfung, ob unter Zugabe eines bekannt wirksamen Stimulus Proliferation induziert werden kann, diente die Zugabe von final 1 ng/ml SEA (s. S. 40, 3.2.3). CpGMotive wurden allein, sowie in Kombination mit SEA zur Stimulation genutzt. Die finale Konzentration der CpG-Motive lag bei 5 µg/ml. Es wurden Messungen zwischen Tag zwei und Tag sechs durchgeführt, wobei die meisten Messungen nach vier und sechs Tagen erfolgten. Die Vorbereitung der Proben wurde wie auf Seite 61 beschrieben durchgeführt. Die eingesäten Zellen befanden sich in einem Ruhezustand, traten aber durch die Behandlung und Kultivierung in den Zellzyklus ein, in dem sie alle Phasen durchlaufen. Im Verlauf des Zyklus kam es zu einer starken Vergrößerung des Zellvolumens und einer geringgradigen Steigerung der Komplexität, an die sich die Verdoppelung der DNA anschloss. Im 64 Geräte, Material und Methoden Durchflusszytometer konnten derartige Vorgänge durch Zellen mit einem wesentlich größeren FSC und einem gesteigerten SSC erkannt werden (s. Abb. 5). Durch die Verwendung der Referenzzellmethode konnte die absolute Zahl der zytoiden und blastoiden Zellen bestimmt werden. Diese Veränderungen wurden als blastische Transformation angesprochen. Zusätzlich wurden Ansätze aus Reinkulturen mononukleärer Zellen in Triplikaten zur eintägigen Inkubation durchgeführt. Die Stimulation erfolgte wie schon beschrieben mit SEA, den CpG-Motiven sowie Kombinationen aus beiden. Nach 22 h bis 24 h wurden jeweils 75 µl der Überstände gewonnen und ohne weitere Behandlung Granulozytenkulturen zugegeben, um ihren Einfluss auf die Vitalität der PMN nach einer weiteren eintägigen Inkubation in vitro zu prüfen. Zur Gewinnung PAMP freier möglichst Zytokinhaltiger MLC-Überstände, wurden allogene MNC zweier Tiere über drei Tage in einer Konzentration von jeweils 2 x 106 Zellen/ml bei 38,5°C und 5% CO2 inkubiert. Die Überstände wurden kollektiert und in aliquoten Teilen bei -20°C bis zu Verwendung als Stimuli für reine PMN-Kulturen gelagert. Kultivierung von Granulozyten in vitro Die über Percoll® separierten neutrophilen Granulozyten wurden entweder als Monokultur in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ ml oder in Kokulturen mit MNC in einem Verhältnis von 1:1 à 1 x 106 Zellen der einzelnen Populationen pro Milliliter eingesetzt. Außerdem wurden zusätzlich noch Kokulturen aus Mph und PMN in einem Verhältnis von 1:5 angesetzt, da Makrophagen zu neutrophilen Granulozyten in vivo in einem Verhältnis von 1:5 vorliegen. Dabei wurde außer Acht gelassen, dass bereits erste Reaktionen bei einem Verhältnis von 1:10 auftraten. Alle Ansätze wurden in Triplikaten erstellt. Sämtliche CpG-Motive (s. S. 45), SEA, LPS und LTA in den unter 3.2.5 beschriebenen Gebrauchsverdünnungen dienten entweder als Einzelstimuli oder in Kostimuli aus jeweils einem CpG-Motiv und SEA oder LPS bzw. LTA. Wegen der geringen MHC-Klasse-II-Dichte auf Makrophagen wurden die Kokulturen aus Mph und PMN nicht mit SEA, sondern mit LPS, LTA und CpG 2006, sowie Kombinationen aus dieser durchgeführt. Jeweils 100 µl der Zellsuspension wurden mit 25 µl der Stimuli in der Gebrauchskonzentration (s. S. 45) versetzt. Eine weitere Stimulation der PMN-Reinkulturen bestand in der Zugabe von 75 µl der nach eintägiger Inkubation mit konditionierten Überstände von stimulierten MNC (s. S. 64). Die Überstände der allogenen MLC wurden ebenfalls als Stimuli verwendet. Dabei wurden jeweils 50 µl entweder mit oder ohne Zusatz von PAMPs den PMN-Reinkulturen zugesetzt. Die Inkubation erfolgte über 22 h bei 38,5°C und 5% CO2. Die Vorbereitung der Proben für die Messung wurde wie auf Seite 61 beschrieben durchgeführt. 65 Geräte, Material und Methoden Nachweis der Apoptose von Zellen durch Annexin V-Bindung Die Membran apoptotischer Zellen ist in der Frühphase des induzierten Zelltodes dadurch charakterisiert, dass Phosphatidylserin (PS) – normalerweise an der Innenseite der Zellmembran – durch die Wirkung sog. Flippasen an die Außenseite der Zellmembran gebracht wird. Annexin V, ein Phospholipid bindendes Protein, das aus der anti-koagulativ wirkenden Familie der Annexine stammt, ist dann in der Lage, Ca2+-abhängig an das PS zu binden. Zum Nachweis der Annexinbindung wird Fluorochrom markiertes Annexin V (Annexin V-FITC) eingesetzt. Zellen, die Annexin positiv sind – bei gleichzeitiger Integrität der Zellmembran (Propidiumiodid negativ) – werden hier als apoptotische Zellen angesehen. Hier ging es um den Nachweis, ob es sich bei dem durch PAMPs induzierten Vitalitätsverlust der neutrophilen Granulozyten um die Induktion der Apoptose, der Nekrose oder um einen primär apoptotischen Vorgang mit anschließender sekundärer Nekrose handelt. Die Zellgewinnung wurde wie in 3.3.1 beschrieben durchgeführt. Die neben einem Kontrollansatz in Medium erfolgten Stimulationen wurden mit CpG 2007 (finale Konzentration 5 µg/ml) sowie LTA und LPS (10 µg/ml) durchgeführt. Die Messungen erfolgten zu den Zeitpunkten 30 min, 4 h, 12 h und 22 h nach Kulturbeginn. Dabei wurden zum Vergleich in Parallelansätze die absolute Zellzahl mit der Referenzzellmethode (s. S. 60) bestimmt. Das mitgelieferte Protokoll wurde weitestgehend befolgt. Die Färbung der Zellen erfolgte erst zum Erntezeitpunkt. Nach der Entnahme der Mikrotiterplatten aus dem Brutschrank, wurden die Zellen abzentrifugiert (200 xg, 4 min und 10°C), dekantiert und mit PBS gewaschen, um das Medium mit den Stimuli komplett zu entfernen. Im Anschluss wurden 195 µl des verdünnten Bindungspuffers (s. S. 47) zu dem aufgerüttelten Zellpellet gegeben. Nach der Zugabe von 10 µl der Annexin V-FITC Lösung und erneuten Rüttelns schloss sich eine Inkubationszeit von 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss an. Vor der erneuten Zugabe von 190 µl Bindungspuffer, wurden die Granulozyten zwei Mal mit PBS gewaschen. 10 µl PI wurden dazu pipettiert. Nach dreiminütiger Inkubation erfolgte die vollständige Überführung der Inhalte der Vertiefungen zu Messung in 5 ml Röhrchen (s. S. 39, 3.2.2). Bestimmung der Phagozytosekapazität boviner Makrophagen in vitro Die Phagozytosekapazität aus Blutmonozyten generierter Makrophagen wurde mit einer modifizierten Methode nach ZERBE (1994) durchgeführt. Um die Phagozytose aktiven Zellen erkennen zu können, wurden FITC-markierte Staphylokokken (s. S. 50) eingesetzt. Die in 1 ml Aliquots eingefrorenen Bakterien wurden zur Verwendung aufgetaut und zu gleichen Teilen auf zwei 1,5 ml Eppendorfcups (s. S. 39, 3.2.2) aufgeteilt. Nach der 66 Geräte, Material und Methoden Zentrifugation für 45 sek bei 15.000 xg, wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert. Zu den resuspendierten Bakterien wurden entweder 1 ml 10%-iges natives, Komplement inaktiviertes Rinderpoolserum (s. S. 50, 3.2.5) zur Opsonisierung oder 1 ml PBS, um native Bakterien zu behalten, zugegeben und für 15 min bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. In eine 96-Well-Rundbodenplatte wurde jede Kavität mit 50 µl einer 2 x 106 Makrohagen/ml enthaltenden Zellsuspension in PBS beschickt. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von entweder 50 µl der opsonisierten oder nicht opsonisierten Bakterien, sowie PBS in der Negativkontrolle. Das Verhältnis der Bakterien zu Makrophagen betrug somit ungefähr 1:100. Nachdem die Platten gerüttelt worden waren, schloss sich eine 45-minütige Inkubation in einer feuchten Kammer bei 37°C mit 5% CO2 an. Während der Inkubation wurde die Platte einmalig erneut aufgerüttelt. Vor der Entnahme der Ansätze erfolgte eine 10-minütige Lagerung auf Eis unter Lichtabschluss zur Beendigung der Reaktion. Durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren konnte eine nahezu vollständige Ablösung und Entnahme der Makrophagen aus den Kavitäten erreicht werden. Den Ansätzen wurden nach der Überführung in 5 ml Röhrchen (s. S. 39, 3.2.2) 100 µl einer Sheath-PI-Lösung (final 2 µg PI/ml) zugesetzt. Die Geräteeinstellungen am Durchflusszytometer wurden so gewählt, dass die Makrophagen mit ihrer gemäßigten Autofluoreszenz in der FL-1 eine Fluoreszenzintensität von 100 und 101 zeigten. Die Phagozytose aktiven Zellen zeigen je nach Menge der ingestierten FITCmarkierten Staphylokokken eine in Abstufungen höhere Fluoreszenz. Nach der Messung wurden zur Auswertung nur die vitalen Zellen herangezogen. Die Makrophagen der Ansätze mit Bakterien, die eine ähnliche Fluoreszenz wie die der Ansätze ohne Bakterien aufwiesen, wurden als nicht phagozytierend angesehen. Intrazelluläres Verfahren zur Ermittlung der Basis- und Induzierten-Produktion von NO (Stickstoffmonoxid) mittels DAF-2 DA (Diaminofluoreszein -2 Diazetat) DAF-2 DA ist ein Fluorochrom mit dem es möglich ist, intrazellulär mittels durchflusszytometrischer Verfahren NO nachzuweisen. NO entsteht durch Konversion von L-Arginin zu L-Zitrullin. DAF-2 DA ist membrangängig und kann somit in die Zelle eindringen. Intrazellulär wird es durch in nahezu allen Zellen enthaltene Esterasen zu dem nicht mehr membrangängigen DAF-2 hydrolysiert (KOJIMA et al. 1998). Dieses wiederum reagiert mit einem aktiven Intermediärprodukt der Oxidation von NO zu NO2. Dabei entsteht das Triazolfluoreszein DAF-2 T. DAF-2 und DAF-2 T unterscheiden sich sehr stark in ihrer intrazellulären Fluoreszenz (Faktor 100), wobei ihre maximal zu erreichende Fluoreszenzstärke identisch ist. Die Hintergrundfluoreszenz des DAF-2 ist, da nur ca. 1% umgesetzt wird und somit immer nahezu die gleiche Menge bestehen bleibt, zu 67 Geräte, Material und Methoden vernachlässigen. 0,1 µM DAF-2 können 200 nM NO (N2O3) umsetzen. Auch beim Einsatz von 0,1 nM DAF-2 ist nicht mit einer Limitierung zu rechnen. (LEIKERT et al. 2001) Die nach sechstägiger Inkubation geernteten Makrophagen wurden in Iscové-Medium (s. S. 44) aufgenommen, auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt und je 100 µl dieser Suspension in jede Vertiefung vorgelegt. 25 µl eines CpG-Motivs, LPS, PWM (s. S. 40, 3.2.3) oder 50 µl einer Suspension PI-markierter Bakterien dienten als Stimuli. Es wurden jeweils Triplikate mit 0,1 µM bzw. 1 µM oder ohne DAF-2 DA angesetzt. Das Gesamtvolumen betrug 175 µl. Je drei Stunden vor der durchflusszytometrischen Bestimmung wurden 300 µl des Überstandes der Triplikate gepoolt und in Eppendorfcups bei -20°C gelagert. In den Überständen ohne DAF-2 DA erfolgte die Bestimmung des extrazellulären NO mittels Griess-Reagenz. Das Medium wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS (Zugabe von 100 µl PBS - Zentrifugation bei 200 xg, 4°C für 4 min – Dekantieren – Rütteln – Zugabe von 150 µl PBS und erneute Zentrifugation) entfernt. Nach der Aufnahme in 150 µl PBS erfolgte die Zugabe von 25 µl DAF-2 DA (s. S. 47) in Endkonzentrationen von 0,1 bis 1 µM. Eine Inkubations von 3 h schloss sich an. Die Proben wurden anschließend unter Zusatz von 2 µg/ml PI final zügig in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt und gemessen. Bei Stimulation der Makrophagen mit Bakterien betrug die Inkubationszeit 45 min. Nach diesem Zeitraum wurde das Medium mit den Bakterien abzentrifugiert. Eine eintägige Inkubation im Brutschrank bei 38,5°C schloss sich an. Nach einem Waschvorgang mit PBS wurden entweder 100 µl der L-Arginin-Lösung (s. S. 40, 3.2.3) oder PBS mit 25 µl der DAF2 DA-Verdünnung und 50 µl To-Pro-3, einem Fluoreszenzfarbstoff, der im FL-4-Kanal (blau) darzustellen ist, und 25 µl Sheath zugegeben. Vor der Überführung und anschließenden Messung erfolgte eine 15-minütige Inkubation. Nitritmessung in Kulturüberständen mit dem Griess-Reagenz Die Nitrit (NO2-)- Konzentration in den Kulturüberständen in vitro generierter und kultivierter boviner Makrophagen diente als indirekter Parameter der NO-Produktion. Diese Methode diente zum einen der Überprüfung der Aktivierbarkeit der Makrophagen, als auch dem Vergleich mit der Methode der intrazellulären NO-Messung mit einem etablierten Verfahren. Die Überstände wurden wie auf Seite 67 beschrieben, gewonnen. Nach dem Auftauen wurden in Triplikaten jeweils 100 µl der Überstände in Kavitäten einer 96-Well-Flachboden Mikrotiterplatte gegeben. Zehn Minuten nach Zusatz von jeweils 100 µl Griess-Reagenz (s. S. 47) erfolgte die Messung des Farbumschlags spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 570 nm. 68 Geräte, Material und Methoden Um aus den Extinktionen den NO2--Gehalt berechnen zu können, wurden Standardkurven mittels Verdünnungen einer Natriumnitritlösung in I10F+strep Medium erstellt. Die NO2Konzentrationen wurden, wenn nicht anders angegeben, als Differenzwerte zu den Mediumkontrollen (Zellansätze ohne Stimulus) ausgedrückt. 3.3.6 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) Die indirekte Membranimmunfluoreszenz ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper (s. S. 43, Tab. 5) an Strukturen, die ihrerseits von einem zweiten, Fluorochrom markierten Antikörper (s. S. 43) erkannt werden. Durchführung der Membranimmunfluoreszenz Pro Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte wurden 2 x 105 Zellen frisch separierter oder in vitro kultivierter Zellen pipettiert. Platten mit kultivierten Zellen wurden 10 min auf Eis inkubiert um adhärente Zellen leichter herauspipettieren zu können. Ansätze mit Makrophagen erfolgten mit 1 x 105 Zellen pro Ansatz. Die Zellen wurden zentrifugiert (200 xg; 4 min, 4°C) und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in 175 µl MIF-Puffer (s. S. 49) gewaschen – Resuspension, Zentrifugation, Abschlagen der Überstände, Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µl des verdünnten spezifischen primären Antikörpers (s. S. 43, Tab. 5) erfolgte eine 20-minütige Inkubation (4°C). Danach wurden die Zellen zwei Mal mit 175 µl MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µl des sekundären FITC- oder PE-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers versetzt und unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 150 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/ml Propidiumiodid) aufgenommen, in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt und durchflusszytometrisch erfasst. Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen Anstelle des ersten Antikörpers 25 µl MIF-Puffer bzw. ein irrelevanter monoklonaler Antikörper des gleichen Isotyps wie der spezifische mAk den Zellen zugesetzt wurden. Membranfluoreszenz zum Nachweis der Bindung von DNA-Motiven Das Verfahren folgte im Wesentlichen dem oben beschriebenen. Anstelle spezifischer monoklonaler Antikörper wurden 20 µl biotinylierter CpG-Motive (s. S. 42, Tab. 4) in einer 69 Geräte, Material und Methoden finalen Konzentration von 10 µg/ml verwendet. Die erste Inkubation erfolgte für 30 min auf Eis. Zur Fluoreszenzmarkierung wurden 20 µl PE-konjugiertes Streptavidin verwendet, welches spezifisch an Biotinmoleküle bindet. Die Proben wurden lichtgeschützt bei 4°C für 20 min inkubiert. Zur Verstärkung der Fluoreszenzintensität wurde in einigen Versuchen 25 µl eines zweiten, sekundären biotinylierten Antikörpers (Ziege-anti-Hund biot, IgG (H+L), s. S. 43) zugegeben (1:1000 verdünnt). Dieses biotinylierte Molekül sollte an freie Valenzen des Streptavidins binden und, gefolgt von einer weitere Inkubation mit Streptavidin-PE (20 µl, 20 min, 4°C), die Sensitivität des Nachweises erhöhen. Nachweis der Bindung von CpG-Motiven an Zellmembranen durch ein fluoreszenzsteigerndes System Dieser Versuch wurde unter der Verwendung des Systems Flow-AMP® (s. S. 46) durchgeführt. Das enthaltene Sekundärreagenz, eine an Streptavidin konjugierte HorseRadish-Peroxidase (HRP), bindet an biotinylierte Moleküle. Durch die HRP wird ein in dem Amplifizierungsreagenz enthaltenes Substrat umgesetzt. Bei dieser Reaktion entstehen biotinylierte Tyramidradikale, die kovalent an Tyrosin- oder Tryptophanreste binden. Beide Aminosäuren kommen sowohl in den Antigenen als auch in Zellmembranen vor. Die Biotinylierung findet somit im Umkreis der gebundene HRP statt. Das anschließend zugegebene FITC-konjugierte Streptavidin hat somit wesentlich mehr Bindungsmöglichkeiten, was zu einer bis zu 100-fach stärkeren Fluoreszenz führen kann. Zellen (frisch separierte mononukleäre Zellen, Makrophagen, je 2 x 105/Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte) wurden bei 400 xg, 4°C für 4 min zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und die Zellen aufgerüttelt. Es schloss sich ein Waschschritt mit 200 µl Staining Buffer (s. S. 46) und abermaliger Zentrifugation an. Auf das dekantierte und resuspendierte Zellpellet wurden 20 µl des biotinylierten CpG-Motivs (10 µg/ml) gegeben und 30 min bei 4°C inkubiert. Zwei weitere Waschschritte schlossen sich an. Zu dem resuspendierten Zellpellet wurden 20 µl der Gebrauchsverdünnung des sekundären Reagenz pipettiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei den sich nun anschließenden vier Waschschritten war es besonders wichtig den natriumazidfreien Staining Buffer zu verwenden. Vor dem nächsten Inkubationsschritt wurde ein weiterer Waschschritt mit PBS durchgeführt, die Platte abgedeckt und 5 min im Brutschrank bei 37°C erwärmt. Nun wurden 20 µl des verdünnten Amplifizierungsreagenz zugegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Daran schlossen sich zwei weitere Waschschritte mit azidfreiem Staining Buffer an. 70 Geräte, Material und Methoden Zum Schluss wurden die Zellen 10 min mit 10 µl der Detektorverdünnung inkubiert. Bevor die Zellen in 150 µl Sheath (2 µg/ml PI) für die durchflusszytometrische Analyse aufgenommen wurden, mussten sie noch zwei Mal in azidfreiem Staining Buffer gewaschen werden. Doppelte Membranfluoreszenz Dieses Verfahren wurde ebenfalls in Kombination mit der Markierung durch Zellsubpopulationsspezifische monoklonale Antikörper eingesetzt (Doppelfluoreszenz) zum Nachweis, ob CpG-Motive selektiv an bestimmte Zellpopulationen binden. Hierfür wurden die Zellen vor der Inkubation mit dem Detektor mit den monoklonalen Antikörpern inkubiert (s. S. 69). Da der Detektor des Flow-AMP®-Systems FITC-gekoppelt ist, wurde als sekundärer Antikörper ein PE-konjugierter Ziege-anti-Maus-Antikörper verwendet. Der letzte Inkubationsschritt erfolgte sowohl mit dem Detektor als auch dem sekundären Antikörper. Prüfung der Internalisierung von DNA durch intrazelluläre Fluoreszenzmarkierung Die intrazelluläre Fluoreszenz wurde mit Leukozyten aus Vollblut nach hypotoner Lyse der Erythrozyten durchgeführt. Pro Ansatz wurden 2 x 106 Zellen in 100 µl Medium in eine Vertiefung einer auf 38,5°C vorgewärmten 96-Well Mikrotiterplatte pipettiert. Nun wurden 25 µl der verdünnten biotinylierten CpG-Motive - CpG-WB biot und GpC-WB biot - bzw. Medium zugesetzt. Parallelansätze wurden 5, 15 oder 30 Minuten bei 38,5°C inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet zwei Mal mit PBS gewaschen (s. S. 69). Anschließend erfolgte die Resuspension des Bodensatzes in 100 µl kaltem PBS. Nach der Zugabe von 100 µl 4%-iger Paraformaldehydlösung wurden die Zellen gerüttelt, 30 min bei Raumtemperatur fixiert und danach zwei Mal mit 200 µl PBS gewaschen. Zwischen den beiden sich anschließenden Waschschritten mit MIF-SaponinPuffer erfolgte eine 30-minütige Inkubation. Nun erfolgte die Zugabe von 50 µl StreptavidinPE in MIF-Saponin-Puffer (45 min bei RT). Vor der Resuspension der Zellen in Sheath für die durchflusszytometrische Messung wurden die Zellen noch weitere drei Mal mit MIFSaponin-Puffer gewaschen. Auswertung der Membranimmunfluoreszenz nach durchflusszytometrischer Messung Für die Messungen einer zusammengehörenden Versuchsreihe wurden immer identische Geräteeinstellungen gewählt. Tote Zellen wurden anhand ihrer Fluoreszenzintensität im FL-3Kanal (durch Aufnahme von PI) mittels eines Fensters aus der Auswertung ausgeschlossen. Phycoerythrin (PE) war bei einer Emmissionswellenlänge von 564-606 nm in FL-2-Kanal 71 Geräte, Material und Methoden und Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) bei 515-545 nm Emmissionswellenlänge im FL-1-Kanal erfassbar. Zur Auswertung einfacher Fluoreszenzen wurden immer korrelierte Darstellungen mit den Parametern FL-1 (oder FL-2) gegen SSC verwendet, in denen eine Quadrantenanalyse durchgeführt wurde. Für die Auswertung der Doppelfluoreszenzen wurden korrelierte Darstellungen der beiden Fluoreszenzen gewählt. Bei den Geräteeinstellungen ist darauf zu achten, dass die in nur einem Wellenbereich positiven Zellpopulationen in der Darstellung der beiden Fluoreszenzen gegeneinander in einem rechten Winkel aufeinander stehen. Ausgewertet wurde das Verhältnis Fluoreszenz positiver zu Fluoreszenz negativen Zellen sowie die mittlere Fluoreszenzintensität. Die absolute Zahl Fluoreszenz positiver Zellen ergab sich aus der in parallelen Kulturen durch die Referenzzellmethode ermittelten Zahl vitaler Zellen multipliziert mit den prozentualen Anteilen Membranfluoreszenz positiver Zellen. 3.3.7 Statistische Verfahren Zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit von Differenzen zwischen Datengruppen wurden der zweiseitige Student´s t-Test oder der gepaarte t-Test (STEEL & TORRIE 1980) eingesetzt. Die Interassayvarianz ist ein Maß für die Streuung der Messwerte eines Parameters in zeitlich verschiedenen Untersuchungen und beschreibt die Wiederholbarkeit der Ergebnisse von Test zu Test. Für ein biologisches System, dessen Reaktionslage in Abhängigkeit von vielen Faktoren prinzipiell inter- und intraindividuell zu Schwankungen neigt, war eine gute Reproduzierbarkeit der Werte für die einzelnen Parameter unterschiedlicher Tests nicht zu erwarten. Daher wurden in dieser Arbeit Interassayvarianzen nur punktuell bestimmt. Die Intraassayvarianz innerhalb einer Untersuchung ist ein Maß für die Streuung der Messwerte innerhalb desselben Probenansatzes. Dabei wird untersucht, wie stark die Messwerte bei mehrfacher Messung eines Parameters derselben Probe in Parallelansätzen voneinander abweichen. Für die mit der Referenzzellmethode ermittelte Gesamtzahl vitaler Zellen (s. S. 60) ergab sich für die Einzelansätze von Triplikaten innerhalb eines Ansatzes ein Varianzkoeffizient zwischen 2% bis 10%. Dies gilt sowohl für die Zahl vitaler Zellen in Versuchen, in denen das PAMP-induzierte Absterben der neutrophilen Granulozyten untersucht wurde, als auch für die in den Stimulationsversuchen erhaltenen Zahlen kleiner oder blastisch transformierter Lymphozyten. 72 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Generierung und Charakterisierung boviner Makrophagen 4.1.1 Methodische Vorarbeiten Vergleich zweier Methoden zur Generierung boviner Makrophagen aus Blutmonozyten Die durch zwei Verfahren gewonnenen Makrophagen (s. S. 53, 3.3.2) wurden mittels Durchflusszytometrie morphologisch (s. Abb. 6), phänotypisch (s. Abb. 7) sowie funktionell verglichen. Ausbeute und Reinheit der Makrophagen Trotz der fünf Waschschritte mit PBS vor der Ablösung der Makrophagen mit Accutase® konnten die Lymphozyten selten komplett entfernt werden. Ihr Anteil lag in der Regel ≥ 5%. Um reinere Makrophagen zu gewinnen, wurden zwischenzeitlich ohne Verbesserung der Reinheit bis zu sieben Waschschritte durchgeführt. Makrophagen mit mehr als 15% Lymphozytenanteil wurden nicht für weitere Versuche verwendet. Zwischen den beiden verwendeten Methoden (s. S. 53, 3.3.2) waren weder in der Ausbeute der MDM pro Blutvolumen noch in der Reinheit, noch in der Vitalität nennenswerte Unterschiede zu erkennen (Daten nicht gezeigt). Vergleich der Morphologie Die makrophagoiden Zellen beider Gewinnungsverfahren waren in ihrer Morphologie vergleichbar (s. Abb. 6, obere rechte Quadranten). Durch die Generierung nach Methode 1 (linke Spalte) divergierten die Zellen in der Größe nicht so weit wie die nach Methode 2 (rechte Spalte) gewonnenen. Im Mittel waren die MDM der Methode 1 marginal größer. In der Granularität lag kein Unterschied vor. Interindividuell bestanden Schwankungen in der Größe sowie in der Komplexität (s. Abb. 6). Die makrophagoiden Zellen von Tier 2 waren bspw. im Durchschnitt zwar größer, in der Granularität jedoch geringer als die von Tier 1 (Vergleich der Reihen in Abb. 6). 73 Ergebnisse Methode 1 Methode 2 A) Tier 1 88% Seitwärtsstreulicht (SSC) 72% Makrophagen Lymphozyten/ Detritus Vorwärtsstreulicht (FSC) B) Tier 2 85% Seitwärtsstreulicht (SSC) 77% Makrophagen Lymphozyten/ Detritus Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 6 Vergleichende morphologische Darstellung der nach zwei Verfahren gewonnenen bovinen Makrophagen Dargestellt sind Dichteplots nach durchflusszytometrischer Analyse von in vitro generierten Makrophagen zweier Tiere. Die Bilder der linken Spalte zeigen makrophagoide Zellen (obere rechte Quadranten), die nach Methode 1 gewonnen wurden (s. S. 53), die rechte Spalte die nach Methode 2 (s. S. 56) generierten. Die Population im unteren linken Quadranten besteht zum Großteil aus Lymphozyten sowie Detritus. In diesen Diagrammen werden ausschließlich PI-negative Ereignisse gezeigt. Phänotypische Charakterisierung Die nach beiden Verfahren generierten Makrophagen exprimierten in gleicher (relativer) Stärke MHC-Klasse-I-Moleküle (im Vergleich zur Isotypkontrolle etwa die zehnfache mittlere Fluoreszenzintensität), MHC-Klasse-II-Moleküle (schwach exprimiert) und das Molekül CD14 (im Vergleich zur Isotypkontrolle etwa die dreifache mittlere Fluoreszenzintensität (s. Abb. 7)). 74 Isotypkontrolle IgG 1 MHC-I (mAk Bo 1) MHC-II (mAk Bo 139) Methode 2 Seitwärtsstreulicht (SSC) 75 Grünfluoreszenz (FL-1) Isotypkontrolle IgG 3 Methode 1 Grünfluoreszenz (FL-1) Grünfluoreszenz (FL-1) CD 14 (mAk VPM 65) Ergebnisse Vergleich beider Methoden Messereignisse Ergebnisse Abb. 7 Vergleich der Immunphänotypen der durch zwei unterschiedliche Methoden gewonnenen Makrophagen Von zwei Tieren wurden am gleichen Tag Makrophagen mittels zwei verschiedener Verfahren gewonnen (s. S. 53, 3.3.2). In der oberen Zeile werden nach der Methode 1 und in der mittleren Reihe nach der Methode 2 gewonnene MDM eines Tieres in einem Dichtediagramm jeweils in der Korrelation der FL-1 gegen die Komplexität dargestellt. In der unteren Reihe werden überlagerte Histogramme der reinen Makrophagen gezeigt, wobei die solide graue Kurve die nach der Methode 1 generierten MDM repräsentiert. Funktionelle Charakterisierung der Makrophagen Bestimmung der Phagozytosekapazität der Makrophagen Von zwei Tieren wurden am gleichen Tag über beide Verfahren Makrophagen generiert. Die nach Methode 1 kultivierten MDM phagozytierten zu 8% nicht-opsonisierte Staphylokokken, wohingegen 13% der über Methode 2 gewonnenen Zellen Phagozytose positiv waren (s. Abb. 8). Durch die Zugabe der gleichen Konzentration opsonisierter Bakterien (s. S. 50) wurde die Phagozytosekapazität deutlich gesteigert: Sie stieg auf 26% (Methode 1) und 35% (Methode 2). Abschließend ist festzustellen, dass sich die nach den verschiedenen Verfahren gewonnenen MDM in den hier untersuchten morphologischen, phänotypischen und funktionellen Charakteristika kaum unterschieden. Wegen des geringeren Arbeitsaufwandes und der höheren Praktikabilität wurden in den Folgeversuchen die nach der Methode 2 (s. S. 53, 3.3.2) generierten MDM eingesetzt. 76 Ergebnisse Nicht Opsonisierte Bakterien Ohne Bakterien Opsonisierte Bakterien A) Methode 1 0% 92% 8% 74% 26% 13% 65% 35% Seitwärtsstreulicht (SSC) 100% Grünfluoreszenz (FL-1) B) Methode 2 87% Seitwärtsstreulicht (SSC) 100% Grünfluoreszenz (FL-1) Abb. 8 Vergleich der Phagozytosekapazität von Makrophagen, die mittels zweier Verfahren generiert wurden Am selben Tag wurden Makrophagen aus Blutmonozyten eines Tieres durch zwei verschiedene Methoden gewonnen (s. S. 53, 3.3.2). In der oberen Reihe werden nach Methode 1 und in der unteren Reihe nach Methode 2 gewonnene MDM eines Tieres in einem Dichtepot dargestellt. Um schwach phagozytierende Zellen von nicht-phagozytierenden Zellen unterscheiden zu können, wurde eine Kontrolle unter Zugabe eines Puffers (PBS) durchgeführt (linke Spalte). Zur Phagozytose wurden nicht-opsonisierte (mittlere Spalte) oder opsonisierte (rechte Spalte) FITC-markierte Staphylokokken (s. S. 50) eingesetzt. Die Dichtediagramme zeigen im oberen linken Quadranten die nichtphagozytierenden und im oberen rechten Quadranten die phagozytierenden Makrophagen. 4.1.2 Messung der Nitrit-Bildung durch in vitro generierte Makrophagen Methodische Vorarbeiten zur Nitritmessung auf Einzelzellebene Für diese Testreihe wurde ein membrangängiges Fluorochrom eingesetzt, welches für derartige Studien hier zum ersten Mal Verwendung fand. Die Vorarbeiten wurden hauptsächlich an MNC durchgeführt (s. S. 67). Zunächst sollte die optimal einzusetzende Konzentration des Fluorochroms DAF-2 DA ermittelt werden (geprüft wurden 0,1 µM bis 10 µM DAF-2 DA). Bei einer maximalen Inkubationsdauer von 3 h (38,5°C, 5% CO2) 77 Ergebnisse erfolgten Messungen der zellulären Fluoreszenz nach einer, zwei und drei Stunden. Als Kriterium dienten die eindeutige Differenzierung der nicht gefärbten Zellen von den mit DAF-2 DA inkubierten Zellen sowie ein deutlicher Unterschied stimulierter und unstimulierter Zellen in der Fluoreszenz. In Abb. 9 sind in überlagerten Histogrammen beispielhaft die Fluoreszenzintensitäten der MNC eines Tieres dargestellt, die mit unterschiedlichen DAF2 DA-Konzentrationen inkubiert wurden. Messereignisse 0,1 µM 0 µM 1 µM 10 µM Grünfluoreszenz (FL-1) Abb. 9 Fluoreszenzintensitäten boviner MNC nach der Inkubation mit verschiedenen DAF-2 DA Konzentrationen Frisch isolierte mononukleäre Zellen des Blutes wurden über 60 min A) ohne, B) mit 0,1 µM, C) mit 1 µM oder D) mit 10 µM DAF-2 DA inkubiert. Dieses Histogramm zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität der vitalen Zellen. Die Fluoreszenzintensität nativer Zellen liegt bei einer relativen Stärke von eins 60 min nach der Zugabe von 0,1 µM DAF liegt die mittlere Fluoreszenz bei 41, bei 1 µM DAF bei 330 und nach Zugabe von 10 µM DAF bei 799. Die Aufnahme von DAF-2 DA erfolgte rasch und erreichte ein Maximum nach etwa 20 min (s. Abb. 10). Dies galt sowohl für Monozyten als auch für Lymphozyten und war unabhängig von der eingesetzten Konzentration (s. Abb. 10). Nach Inkubation der Zellen mit 10 µM DAF-2 DA schien bei längerer Inkubation (>50 min) die Fluoreszenz der monozytoiden Zellen wieder zu sinken (s. Abb. 10). Aus den Ergebnissen dieses Versuchs wurde die Nutzkonzentration von DAF-2 DA von 0,1 µM bis 1 µM gewählt. 78 Ergebnisse Fluoreszenzintensität Monozyten Lymphozyten 1000 1000 100 100 10 10 1 0 10 20 30 40 50 1 60 Minuten 0 10 20 30 40 50 60 Minuten 10 µM 1µM 0,1 µM Abb. 10 Konzentrations- und zeitabhängige Fluoreszenzintensitäten von Monozyten und Lymphozyten nach Inkubation mit dem Fluorochrom DAF-2 DA Die Zellen wurden unstimuliert in Medium aufgenommen und unter Zugabe dreier Konzentrationen DAF-2 DA bei 38,5°C in einem Gesamtvolumen von 2 ml für verschiedene Zeiten inkubiert. Die durchflusszytometrischen Messungen erfolgten in Unikaten. Über die Geräteeinstellungen wurde die Fluoreszenz der Zellen in der Messung zum Zeitpunkt 0 min zwischen 100 und 101 eingeregelt. Obwohl ausschließlich das ursprüngliche DAF-2 DA zellwandpermeabel sein soll, können umgesetzte Fluorochrome durch die geschädigte Zellwand nekrobiotischer Zellen diffundieren. Bei Inkubationszeiten von 24 h oder länger wurde dazu übergegangen, identische Ansätze vergleichsweise zum einen sofort oder erst drei Stunden vor der Messung mit dem Fluorochrom zu versetzen. Dadurch sollte die Aufnahme schon umgesetzten Fluorochroms so gering wie möglich gehaltenwerden. Wie in Abb. 10 gezeigt, war eine Stunde ausreichend, um DAF-2 DA in ausreichendem Maß in die Zellen diffundieren zu lassen. Vor der Zugabe des Fluorochroms wurden die Ansätze zunächst zentrifugiert und dekantiert. Im Anschluss erfolgte ein Waschvorgang (Resuspension, Zentrifugation – 200 xg, 4 min, 4°C – Dekantierung) mit 150 µl PBS. Die Zellen wurden erneut in 150 µl PBS resuspendiert. Die Zugabe des Fluorochroms erfolgte nun so, wie auf Seite 67 beschrieben. Die damit maximal erreichte Fluoreszenz solcher parallel angesetzter Zellkulturen war nahezu identisch (s. Abb. 11). Allerdings erschienen die über drei Stunden mit dem Fluorochrom inkubierten MNC einiger Tiere als zwei unterschiedlich stark fluoreszierende Populationen (s. Abb. 11, graue Linie), 79 Ergebnisse was im Fall der Dauerinkubation nicht beobachtet werden konnte (s. Abb. 11, schwarze Linie). SEA Ereignisse Medium Fluoreszenzintesiät Abb. 11 Fluoreszenz unstimulierter und stimulierter MNC nach der Inkubation mit DAF-2 DA über unterschiedliche Zeiträume In diesen zwei Histogrammen wird die mittlere Fluoreszenz boviner Makrophagen nach der Inkubation über unterschiedliche Dauer mit DAF-2 DA dargestellt. Die Gesamtinkubationszeit betrug 24 h, wobei die Zugabe des Fluorochroms DAF-2 DA entweder sofort (schwarze Linien) oder drei Stunden vor der Messung erfolgte (graue Linien). In der linken Abbildung werden die Fluoreszenzintensitäten der unstimulierten und in der rechten die SEA-stimulierten Zellen aufgeführt. Um zu prüfen ab welchem Zeitpunkt nach in vitro Stimulation sich durchflusszytometrisch eine NO-Bildung nachweisen lässt, wurden MNC eines Tieres ein bis drei Tage in vitro stimuliert (s. Abb. 12) Da sich die Monozyten während der dreitägigen Inkubationszeit morphologisch so veränderten, dass sie nicht mehr als einheitliche Population vorlagen, wurden ausschließlich Lymphozyten durchflusszytometrisch ausgewertet. Die Stimuli PWM und SEA bewirkten zu allen drei Zeitpunkten eine messbare Steigerung der Fluoreszenzintensität (NO-Synthese) gegenüber den unstimulierten Ansätzen; am deutlichsten war dies an Tag drei nach PWM-Stimulation zu beobachten. 80 Ergebnisse Grünfluoreszenz (FL-1) 25 20 15 10 5 0 D1 D2 D3 Inkubationszeit Ohne Stimulus PWM SEA Abb. 12 Fluoreszenzintensität stimulierter Lymphozyten nach Inkubation mit 1 µM DAF-2 DA Bovine MNC (1 x 105) wurden in vitro mit SEA (1 ng/ml) oder mit PWM (1 µg/ml) stimuliert. Zellen ohne Stimulus dienten als Kontrolle. Jeweils 3 Stunden vor der Messung an Tag 1 (D1), Tag 2 (D2) oder Tag 3 (D3) wurden die Zellen abzentrifugiert und mit 1 µM DAF-2 DA inkubiert. Die durchflusszytometrische Messung der Lymphozytenfluoreszenz erfolgte mit identischen Geräteeinstellungen. Mittelwerte ± S aus Triplikaten. Nitritbestimmung auf Einzelzellebene in Makrophagen Aus den Vorversuchen wurden die Kulturbedingungen zur Bestimmung der NO-Bildung von Makrophagen abgeleitet. Es wurden 100 µl einer Zellsuspension (1 x 106 Zellen/ml) pro Ansatz in die Vertiefungen pipettiert. Der Zusatz von jeweils 25 µl der einzelnen Stimuli erfolgte anschließend. Parallel wurden Ansätze mit und ohne DAF-2 DA durchgeführt. Die eingesetzten DAF-2 DA Konzentrationen betrugen 0,1 µM und 1 µM. Drei Stunden vor der Ernte wurden die Überstände der ohne DAF-2 DA inkubierten Zellkulturen gewonnen und in aliquoten Teilen zu je 300 µl in Eppendorfcups bei -20°C gelagert. Zu den Ansätzen ohne DAF-2 DA wurden nach einmaligem Waschen (Resuspension, Zentrifugation – 220 xg, 4 min, 4°C – Dekantierung) mit PBS und anschließender Resuspension in 150 µl PBS 25 µl des Fluorochroms zugesetzt. 81 Ergebnisse A) Phagozytose 400 Rotfluoreszenz (FL-3) 350 300 250 200 150 100 50 0 Medium Medium +l-Arginin Bakterien Bakterien +l-Arginin B) NO-Produktion Grünfluoreszenz (FL-1) 700 650 600 550 500 450 Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 400 350 300 Medium Medium +l-Arginin Bakterien Bakterien +l-Arginin Abb. 13 Vergleich der durchflusszytometrisch erfassten Phagozytose von Staphylokokken an Hand der NO-Produktion durch bovine Makrophagen Makrophagen wurden 18 h mit opsonisierten, PI-markierten Bakterien bei 38,5°C und 5% CO2 in vitro inkubiert. Parallelansätze enthielten keine Bakterien. Einem Teil der Ansätze wurde L-Arginin zugesetzt (1 mM) A) Die Phagozytose rotfluoreszierender Staphylokokken wurde durchflusszytometrisch im FL-3-Kanal erfasst. B) stellt den Vergleich zur Extinktion grünfluoreszierenden Lichts durch umgewandeltes DAF-2 DA nach Bindung an NO dar. Zellen wurden nach Zentrifugation in 175 µ1 DAF-2 DA (1 µM) aufgenommen und für 3 h bei 38,5°C und 5% CO2 inkubiert. Die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde im FL-1-Kanal erfasst. Durch die Stimulation boviner MDM mit PI-markierten, opsonisierten Bakterien wurde eine Steigerung der Fluoreszenzintensität erreicht, die Bakterien wurden demnach phagozytiert (s. Abb. 13 A). Zugegebenes L-Arginin hatte darauf keinen erkennbaren Einfluss. Die parallel dazu durchgeführte intrazelluläre NO-Messung wies nur einen leichten Anstieg der NOProduktion bei phagozytierenden Makrophagen auf (s. Abb. 13 B). Zwei von vier Tieren 82 Ergebnisse reagierten wesentlich stärker auf den Stimulus. Hier hatte auch L-Arginin, das zu NO umgesetzt wird, auf die Menge des gebildeten fluoreszierenden DAF-2 T (Triazolfluoreszein, s. S. 67) einen stärkeren Einfluss als bei den anderen beiden Tieren. Makrophagen scheinen also nach eintägiger Inkubationsdauer NO gebildet zu haben, wobei die Zugabe eines Stickstoff-Donors auf die Menge förderlich zu wirken scheint. In einem vergleichbaren Ansatz mit Makrophagen zweier Tiere konnte eine NO-Bildung nach bis zu zweitägiger Stimulation mit CpG-WB, CpG 1668 oder SEA (s. S. 45) nicht nachgewiesen werden. Auffallend war das generelle Absinken der Fluoreszenz (der umgesetzten DAF-2 DA Menge) nach eintägiger Inkubation im Vergleich zu den 3 h inkubierten Zellen (s. Tab. 6). Nach zweitägiger Inkubation lag die durchschnittliche Fluoreszenz wieder im Bereich der nach drei Stunden gemessenen Ansätze (3 h unstimuliert: 56 Einheiten; D2 unstimuliert: 62 Einheiten). Eine Steigerung der Fluoreszenz durch Stimulation konnte lediglich nach eintägiger Inkubation erreicht werden. Hier stieg sie von 18 Einheiten im Kontrollansatz bis auf 32 Einheiten nach CpG 1668-Zugabe. Zum letzten Messzeitpunkt lag durch die Stimulation mit CpG 1668 eine Senkung um ein Drittel der Extinktion der Mediumkontrolle vor. Ein eindeutiger Nachweis der CpG- oder SEA-vermittelten NOProduktion in bovinen Makrophagen war somit nicht zu erbringen. Tab. 6 Durchflusszytometrischer Nachweis von NO in Makrophagen nach Stimulation mit CpG-Motiven und SEA Stimulus Medium CpG-WB CpG 1668 SEA 3h 56±23 51±19 56±23 55±23 24 h 18±11 23±10 32±18 26±13 48 h 61±28 60±24 40±7 67±29 Stimulationsdauer In vitro generierte Makrophagen wurden über unterschiedliche Zeiträume mit zwei CpG-Motiven (5 µg/ml) oder SEA (1 ng/ml) stimuliert. Die DAF-2 DA-Zugabe erfolgte jeweils 3 h vor der Messung. Mittelwerte ± S (von Triplikaten) der mittleren Fluoreszenzintensitäten; einem Maß für die durch NO umgesetzte Menge an DAF-2 DA werden als Differenz zum Kontrollansatz ohne Stimulus (Mediumkontrolle) angegeben. 83 Ergebnisse Nitritbestimmung in Überständen durch Griess-Reagenz im Vergleich zur Einzelzellmessung mit DAF-2 DA Um die Zuverlässigkeit der Methode der intrazellulären Nitritbestimmung mittels DAF-2 DA beurteilen zu können wurden Überstände der Proben mit Griess-Reagenz auf Nitrit untersucht (s. S. 68). Es wurden ausschließlich Proben, die ohne das Fluorochrom inkubiert waren, verwendet. In den Überständen unstimulierter Mediumkontrollen wurden zwischen 0,1 µM und 0,2 µM Nitrit nachgewiesen (s. Tab. 7). Dieser Wert stieg nach SEA-Stimulation der Zellen auf das Doppelte. Die mittlere Fluoreszenz der Lymphozyten wies keinen kontinuierlichen Anstieg mit der Inkubationszeit auf. Bei allen drei untersuchten Tieren lag die mittlere Fluoreszenzintensität der Lymphozyten an D2 unter der an D1 und D3 (s. Tab. 7). Dennoch lässt sich gegenüber der Mediumkontrolle in den SEA-stimulierten Ansätzen ebenfalls eine Verdopplung der Werte an Tag drei der in vitro Kultur feststellen. Die Korrelation zur Nitrit-Messung im Überstand hat auch Bestand wenn die Werte von D1 und D3 miteinander vergleichen werden. Ein etwa vierfacher Anstieg der Nitritbildung in den SEAstimulierten Ansätzen spiegelte sich in einem vierfachen Anstieg der Fluoreszenzintensität wieder. Tab. 7 Vergleich der zwei Methoden der NO-Bestimmung DAF-2 DA FL der Lymphozyten Griess-Reagenz Anteil der FL-starken NO2 (µM) Lymphozyten (%) D1 D2 D3 D1 D2 D3 D1 D2 D3 Med 12±4 4±1 35±15 17±19 10±12 19±26 0,1±0,1 0,2±0,2 0,2±0,2 SEA 14±4 7±2 58±12 21±23 17±20 34±38 0,1±0,0 0,2±0,1 0,4±0,2 Von drei Tieren wurden frisch isolierte MNC mit 1 ng/ml SEA oder ohne Stimulus (Med) über ein bis drei Tage inkubiert. Die DAF-2 DA-Zugabe erfolgte jeweils 3 h vor der Messung. Gezeigt werden die mittlere Fluoreszenzintensität, der Anteil stark fluoreszierender Lymphozyten an der Gesamtpopulation und die mit dem Griess-Reagenz gemessenen Nitritgehalte der Überstände. Die Überstände wurden 3 h vor der Messung gewonnen und bis zur photometrischen Auswertung bei -20°C gelagert (s. S. 81). FL = Fluoreszenzintensität. Insgesamt ließen sich in vitro generierte Makrophagen und MNC nur zu einer geringen NOProduktion anregen. Weder durch CpG-Motive noch durch das Superantigen SEA konnten signifikante Differenzen der produzierten Mengen nachgewiesen werden. Die hier entwickelte Methode des intrazellulären Nachweises von NO mittels eines Fluorochroms erwies sich als 84 Ergebnisse nicht empfindlich genug, um geringe Mengen induzierten NOs verlässlich und reproduzierbar zu erfassen. 4.2 Bindung von DNA-Motiven an bovine leukozytäre Zellen und in vitro generierte Makrophagen Ausgangspunkt für diese initialen Studien waren CpG-Motive, die als immunstimulatorisch für das Rind beschrieben wurden (BROWN et al. 1998). Es sollte ein Verfahren verwendet werden, das schnell zu zuverlässigen Ergebnissen führt und einen ersten Eindruck vermittelt, mit welchen Zellen des bovinen Immunsystems eine direkte Interaktion der CpG-Motive erwartet werden kann. 4.2.1 Klassischer Bindungsnachweis Hier wurde geprüft, ob die verwendeten CpG-Sequenzen (biotin-gekoppelt) eine Bindung an selektive zelluläre Populationen aufweisen. Dafür wurde eine an DNA-Motive angepasste Methode der klassischen Membranimmunfluoreszenz verwendet (s. S. 69). Es konnte eine Bindung von CpG-Motiven an alle getesteten Zellarten gezeigt werden. Lymphozyten wiesen unterschiedlich starke Bindungspotentiale auf: unterschieden werden konnten stark und schwach positive Fraktionen. Eine eindeutige Trennung war nicht möglich, da mit steigender Konzentration des biotinylierten CpG-Motivs (CpG-WB biot) die Populationen ineinander übergingen (Abb. 14). Schon ab 5 µg/ml CpG-WB biot war eine Steigerung der mittleren Fluoreszenz zu erkennen (Tab. 8). Gegenüber den Kontrollansätzen stieg bei einer Konzentration von 10 µg/ml die stark positive Fraktion um das Doppelte an, bei 50 µg/ml auf etwa das Dreifache (Tab. 8). Die CpG-Bindungskapazität von Monozyten schien stärker als die der Lymphozyten zu sein (Abb. 14). Neutrophile Granulozyten banden ebenfalls das biotinylierte CpG-Motiv (s. Tab. 8, Abb. 14). Eosinophile Granulozyten wiesen wegen ihre höheren Eigenfluoreszenz durch die Bindung von CpG-WB biot keine gesteigerte Fluoreszenz auf (s. Tab. 8). 85 Ergebnisse Tab. 8 Bindungsstärke eines biotinylierten CpG-Motivs an einzelne bovine Zellpopulationen Bindungs- Konzen- stark positive partner tration Zellen (%) mittlere Fluoreszenzintensität Lymphozyten Monozyten Neutrophile Eosinophile ohne 8±2 3±0 2±0 20±3 Konjugat 8±2 3±0 2±0 15±2 5 µg/ml 10±4 4±1 3±1 16±2 10 µg/ml 12±5 5±1 4±1 16±2 15 µg/ml 14±6 7±1 4±1 16±2 20 µg/ml 15±4 8±1 5±1 17±2 25 µg/ml 15±4 8±2 5±1 17±2 50 µg/ml 21±4 13±4 7±2 18±2 CpG-WB biot Es wurden Mittelwerte ± S (Zellen von 5 Tieren) der Anteile stark positiver Lymphozyten oder die mittleren Fluoreszenzintensitäten von Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen dargestellt. Ohne = Zellen ohne CpG-Motiv und Streptavidin-PE; Konjugat = Ansätze mit Streptavidin-PE allein. Um die Spezifität der Bindung für CpG-Motive zu testen, wurden Zellen mit 10 µg/ml nichtbiotinyliertem CpG-WB oder GpC-WB für 30 min vorinkubiert, bevor das biotinylierte CpGMotiv (10 µg/ml) dazugegeben wurde. Als Kontrollen dienten nicht vorinkubierte bzw. nur mit Konjugat inkubierte Zellen. Sowohl CpG-WB als auch GpC-WB schienen die Bindung des biotinylierten CpG-Motivs auf Monozyten und PMN zu hemmen: Die Fluoreszenzintensität wurde bei Monozyten von 14 auf 9 gegenüber den nicht vorinkubierten Zellen gesenkt, wobei die Fluoreszenz der Konjugatkontrollen bei 4 lag (Daten nicht gezeigt). Aufgrund der geringen Tierzahl können diese Werte nicht als gesichert angesehen werden. 86 Ergebnisse Konjugat 5 µg/ml A) Seitwärtsstreulicht (SSC) CpG-WB biot 20 µg/ml 50 µg/ml Fluoreszenzintensität B) Fluoreszenzintensität Abb. 14 Fluoreszenzintensitäten einzelner boviner Zellpopulationen nach Inkubation mit einem biotinyliertem CpG-Motiv (CpG-WB biot) Durchflusszytometrische Analyse (Punktediagramme; FL-2/SSC) boviner mononukleärer Zellen (A) und Granulozyten (B) nach Membranfluoreszenztest mit unterschiedlichen Konzentrationen eines biotinylierten CpG-Motivs. A) oben: Monozyten; unten: lymphoide Zellen. B) links: neutrophile Granulozyten; rechts: eosinophile Granulozyten. Konjugat: Kontrollansatz mit Streptavidin-PE. 4.2.2 Alternativer Bindungsnachweis mittels Amplifikation Da sich die Bindung des biotinylierten CpG-Motivs als schwach erwies wurde ein kommerzielles Amplifizierungsverfahren (Flow-AMP®, s. S. 70) eingesetzt. Methodische Vorarbeiten Mit dem Originalverfahren (laut Herstellerangaben) konnte eine Steigerung der Fluoreszenz gegenüber der herkömmlichen Membranfluoreszenz um das 10- bis 100-fache erreicht werden (s. Tab. 9). Eine mittlere Fluoreszenzintensität der Monozyten von 3 nach klassischer Inkubation mit CpG-WB biot/Streptavidin-PE wurde beispielsweise durch das Flow-AMP® System auf 299 steigert. Weil das Originalverfahren nur eine geringe Ausbeute an Ansätzen zuließ und zusätzlich das Verfahren in den großen Behältnissen relativ material- und arbeitsaufwendig war, wurde das 87 Ergebnisse Originalverfahren verändert. Durch das modifizierte Verfahren konnte eine dem Originalprotokoll ähnliche Amplifikation erreicht werden (s. Tab. 9), obgleich die mittleren Fluoreszenzintensitäten zumeist niedriger lagen (Fluoreszenzsteigerung der Monozyten von 4 auf lediglich 147). Tab. 9 Vergleich der Fluoreszenzintensität nach klassischer Membranfluoreszenz und alternativer Verwendung des Flow-AMP-Systems Lymphozyten Protokoll: Original A) B) Konjugat Monozyten Modifiziert Original A) B) A) 2±0 2±0 Modifiziert B) A) B) 4±0 5±0 Kontrolle 2±0 2±1 2±0 2±0 3±0 13±0 4±0 5±0 CpG-WB biot 2±0 96±10 2±0 48±45 3±0 299±23 4±0 147±113 Frisch isolierte MNC wurden parallel mit der klassischen Membranfluoreszenz (A) und dem FlowAMP-System (B) entweder nach dem Original- oder dem modifizierten Protokoll (s. S. 70) auf die Fähigkeit der Bindung von DNA-Sequenzen untersucht (Mittelwerte ± S der Fluoreszenzintensitäten von 2 Tieren). Kontrolle = Inkubation mit einem irrelevanten, biotinylierten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Hund IgG) Bestimmung der CpG-bindenden Zellpopulationen mit dem Flow-AMP®-System Nach der Etablierung der Methode wurden die mononukleären Zellen des Blutes auf ihre Kapazität zur Bindung von CpG-Motiven (CpG-WB und GpC-WB) getestet. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Lymphozyten konnte nun um 20 Einheiten durch CpG-WB gegenüber der Isotypkontrolle gesteigert werden (s. Tab. 10). GpC-WB wurde in identischem Ausmaß gebunden. Die CpG-Bindungskapazität boviner Monozyten erwies sich wiederum stärker als die der lymphoiden Zellen. Dies äußerte sich sowohl in einer stärkeren mittleren Fluoreszenzintensität der Gesamtpopulation als auch in einem höheren Anteil der stark positiven Zellen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass sowohl Lymphozyten als auch Monozyten CpG-WB und das reverse GpC-Motiv binden, wobei die Bindungsstärke der Monozyten größer ist, als die der Lymphozyten. 88 Ergebnisse Tab. 10 CpG- und GpC-WB Bindungskapazität durch Lymphozyten und Monozyten Lymphozyten Monozyten MFI stark positive (%) MFI stark positive (%) Konjugat 7±8 6±8 15±3 10±10 Kontrolle 7±5 11±4 16±3 26±10 CpG-WB biot 27±32 25±5 81±9 60±15 GpC-WB biot 26±27 26±4 77±9 57±13 Mononukleäre Zellen des Blutes wurden mit dem Flow-AMP®-System nach der Inkubation mit einem CpG- oder einem reversen GpC-Motiv gefärbt. Dargestellt sind die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) ± S (vier Tiere) der Gesamtpopulation, sowie der Anteil stark bindender Subpopulationen. Kontrolle = Inkubation mit einem irrelevanten, biotinyliertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Hund IgG) In vitro generierte Makrophagen konnten in zwei Populationen unterschieden werden, die in unterschiedlicher Stärke DNA banden (s. Tab. 11). Die negative Population hatte nach der Inkubation mit GaM biot (Kontrollansatz) eine mittlere Fluoreszenzintensität von 12. Nach Inkubation mit CpG-WB biot oder GpC-WB biot stieg die mittlere Fluoreszenz um das dreibzw. vierfache an (s. Tab. 11). Durch beide Sequenzen leuchteten 12% bzw. 13% der Makrophagen eindeutig stärker, als die Kontrollen. Ihre Fluoreszenz stieg maximal bis auf 328 (CpG-WB biot). Tab. 11 DNA-Bindungskapazität boviner in vitro generierter Makrophagen Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) stark positive (%) Gesamtpopulation neg. Mph pos. Mph Kontrolle 12±3 12±4 101±15 0 CpG-WB biot 58±38 49±35 328±235 12±4 GpC-WB biot 38±10 31±11 176±24 13±3 In vitro generierte Makrophagen wurden nach 6-tägiger Inkubation gewonnen und mit dem modifizierten Verfahren des Flow-AMP®-Systems auf die Fähigkeit, DNA-Sequenzen zu binden, untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S von zwei Tieren. Kontrolle = Inkubation mit einem irrelevanten, biotinyliertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Hund IgG). 89 Ergebnisse Doppelfluoreszenz Mittels Doppelfluoreszenz-Ansätzen sollten die zur Bindung der CpG-Motive befähigten Subpopulationen genauer bestimmt werden. Besonderer Wert wurde dabei auf die verschiedenen Teilpopulationen der Lymphozyten gelegt. Nach Inkubation mit Bo139 war ein Anteil von 40% der Lymphozyten MHC-Klasse-II positiv. 30% dieser Zellen banden CpG-WB biot. GpC-WB biot wurde lediglich von 17% der MHC-Klasse-II exprimierenden Zellen gebunden (s. Abb. 15). Monozyten banden zu 36% sowohl CpG-WB bzw. 21% GpC-WB als auch Bo139 (Daten nicht gezeigt). Auch eine Subpopulation der CD4+ positiven Zellen band DNA-Motive. Zwischen 31% und 41% der MNC banden in dieser Studie IL-A11. Ca. 19% der CD4+ positiven Zellen banden CpG-WB und sogar 35% dieser das reverse GpC-Motiv (s. Abb. 15). Die nicht CD4+ exprimierenden Lymphozyten wiesen eine CpG-Bindung von 11% und eine GpC-Bindung von 22% auf. In den Monozyten spiegelte sich die stärkere Bindung des GpC-Motivs ebenfalls wieder. Hier waren 24% der Zellen sowohl CD4+ exprimierend als auch GpC-WB bindend (Daten nicht gezeigt). Es lag somit eine tendenziell stärkere CpG-Bindung an MHC-Klasse-II positiven Zellen vor. Eine selektive Bindung des GpC-Motivs war nicht festzustellen. 90 Ergebnisse A) 34% 5% 2% 2% IL-A11 (anti-CD4) Bo139 (anti-MHC-Klasse II) 39% 5% GaM biot (Kontrollansatz) B) 33% 12% 11% 8% IL-A11 (anti-CD4) Bo139 (anti-MHC-Klasse II) 28% 7% CpG-WB biot C) 7% 10% 20% 11% IL-A11 (anti-CD4) Bo139 (anti-MHC-Klasse II) 33% 15% GpC-WB biot Abb. 15 Durchflusszytometrische Analyse von Doppelfluoreszenzen nach Markierung lymphoider Zellen mit MHC-Klasse-II- oder CD4-spezifischen Antikörpern und biotinyliertem CpG- oder GpC-Motiv Diese Punktediagramme zeigen A) Kontrollansätze mit Ziege anti-Maus-IgG biot B) Doppelfluoreszenzen mit CpG-WB biot C) Doppelfluoreszenzen mit dem reversen GpC-WB biot, die entweder mit dem mAk Bo139 (MHC-Klasse-II-spezifisch) oder mAk IL-A11 (CD4-spezifisch) inkubiert wurden. 91 Ergebnisse 4.2.3 Prüfung der Internalisierung biotinylierter DNA-Sequenzen Gebundene DNA-Motive konnten rasch internalisiert werden. Um dies zu prüfen wurden intrazelluläre Fluoreszenztests nach 5 bis 30-minütiger Inkubation der Zellen mit den Motiven durchgeführt (s. S. 71). Die DNA-Motive wurden von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten internalisiert. Ein Unterschied zwischen dem CpG-Motiv und dem reversen GpC-Motiv bestand nicht (s. Tab. 12). Die mittleren Fluoreszenzintensitäten der positiven Lymphozyten stiegen bspw. gegenüber dem Kontrollansatz von 30 auf etwa 50; bei Monozyten von 50 auf bis zu 80 (s. Tab. 12). Die Aufnahme durch Granulozyten zeigte sich in einer Verdopplung der mittleren Fluoreszenzintensität der Gesamtpopulation (s. Tab. 12). Die Aufnahme erfolgte rasch - bereits nach 5 min (Monozyten, Granulozyten), spätestens nach 15 min (Lymphozyten) waren die Werte durch eine weitere Verlängerung der Inkubationszeiten nicht mehr zu steigern. Tab. 12 Mittlere Fluoreszenzintensitäten nach Inkubation leukozytärer Zellen für verschiedene Zeiten mit biotinylierten DNA-Sequenzen und intrazellulärer Fluoreszenz Fluoreszenzintensität der Gesamtpopulation Pos. Subpopulation (%) 5 15 30 5 15 30 Kontrolle 2±1 2±0 2±0 26±1 32±1 33±9 CpG-WB biot 3±1 2±0 2±0 44±2 49±4 48±4 GpC-WB biot 3±1 3±1 2±0 46±7 57±16 52±8 Kontrolle 3±0 3±1 3±1 45±5 55±10 55±23 CpG-WB biot 8±3 13±4 13±3 71±3 66±9 63±7 GpC-WB biot 8±2 9±4 9±2 79±3 80±9 73±8 Kontrolle 4±1 3±0 4±0 26±4 27±4 24±7 CpG-WB biot 7±1 8±2 8±0 27±1 25±1 23±1 GpC-WB biot 6±0 7±2 6±0 30±3 27±1 27±2 Minuten: Lymphozyten Monozyten Granulozyten Die intrazelluläre Fluoreszenz wurde nach Inkubation der Zellen für verschiedene Zeiten wie auf Seite 71 beschrieben durchgeführt. Dargestellt sind die Mittlerwerte ± S aus zwei Tieren. Kontrolle: biotinylierter Ziege anti-Maus-IgG. 92 Ergebnisse 4.3 Prüfung der Proliferation induzierenden Potenz von CpGMotiven auf bovine mononukleäre Zellen in vitro Ausgehend von der Beobachtung, dass CpG-Motive bovine B-Zellen in vitro stimulieren (BROWN et al. 1998) wurde im Folgenden geprüft, inwieweit sich verschiedene Motive in ihrer Proliferation induzierenden Potenz unterscheiden und in welchem Ausmaß interindividuelle Unterschiede in der Stimulierbarkeit durch CpG-Motive zu beobachten sind. Das Read-Out-System der funktionellen Prüfung bestand in der durchflusszytometrischen Erfassung der Proliferationsinduktion mononukleärer Zellen und der Quantifizierung blastisch transformierter Zellen (s. S. 64 und Abb. 5). Die Konzentrationen der verwendeten CpGMotive lag bei 5 µg/ml. 4.3.1 Proliferative Eigenschaften von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA Weder durch das Superantigen SEA noch durch die eingesetzten DNA-Motive wurde nach viertägiger in vitro Kultur die Gesamtzahl vitaler Zellen gegenüber den unstimulierten Ansätzen verändert. Allenfalls war eine marginale Steigerung auf 105% bis 108% durch die drei verwendeten CpG-Motive zu erkennen. Nach sechs Tagen in vitro galt dies weiterhin für die DNA-Motive, während nach SEA-Stimulation ein deutlicher Anstieg auf 121%±24 zu beobachten war. Waren SEA und DNA-Motive gleichzeitig anwesend, so konnten zwei StimulusKombinationen (SEA+GpC-WB und SEA+CpG 1668) die Vitalität gegenüber der Mediumkontrolle an Tag vier und alle drei verwendeten Kombinationen (auch SEA+CpG-WB) an Tag sechs signifikant steigern. Zudem führten die beiden erstgenannten Stimuluskombinationen ebenfalls gegenüber der SEA-Stimulation zu einem signifikanten Anstieg der Zahl vitaler Zellen (s. Tab. 13). 93 Ergebnisse Tab. 13 Zahl vitaler Zellen nach 4- und 6-tägiger Inkubation mit CpG-Motiven und dem Superantigen SEA 4-tägige Inkubation MW±S P1 6-tägige Inkubation P2 MW±S P1 P2 Medium 100 100 CpG-WB 105±11 103±8 GpC-WB 106±13 103±7 CpG1668 108±17 107±9 0,020 SEA 102±11 121±24 0,008 SEA+ CpG-WB 110±21 130±27 0,002 SEA+ GpC-WB 116±21 0,02 0,04 128±27 0,003 0,04 SEA+ CpG1668 117±23 0,02 0,05 138±37 0,003 0,04 Die Zahl vitaler Zellen in der Mediumkontrolle nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultivierung der mononukleären Zellen wurde gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Zellen in den Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt. Mittelwerte ± S (13 Tiere). P1 = Signifikanz berechnet zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur Stimulation mit SEA. Die relative, im Vergleich zur Mediumkontrolle ermittelte Blastenzahl wurde durch alle eingesetzten DNA-Motive, SEA und die Kombinationen aus SEA und DNA-Motiven nach vier- und sechstägiger Kultur signifikant gesteigert (s. Tab. 14). Im Vergleich zum Superantigen erwiesen sich die DNA-Motive allerdings als nur schwach Blasten induzierend. So lag beispielsweise an Tag vier eine Steigerung durch SEA auf 596% vor (s. Tab. 14), während die eingesetzten CpG-Motive zu einer Steigerung auf lediglich 138% bis 196% führten. Die Effekte der Koinkubation von Zellen mit SEA und CpG-Motiven erwiesen sich in der Regel als additiv. Führte SEA an Tag sechs zu einer Steigerung der Blastenzahl auf 1019% (im Vgl. zur Mediumkontrolle) und das CpG-Motiv 1668 zu einer Steigerung auf 146%, so führte die Koinkubation mit SEA und dem CpG-Motiv zu einer Steigerung auf 1346%. Steigerte sich die SEA-induzierte Blastogenese von Tag vier nach Tag sechs um das Doppelte, so konnte nur durch das Motiv CpG-WB eine marginal Steigerung von 196% auf 241% beobachtet werden (s. Tab. 14). 94 Ergebnisse Tab. 14 Zahl vitaler Blasten nach 4- und 6-tägiger Inkubation mit CpG-Motiven und dem Superantigen SEA 4-tägige Inkubation MW±S P1 6-tägige Inkubation P2 MW±S P1 P2 Medium 100±00 100±0 CpG-WB 196±55 < 0,0001 241±113 < 0,0008 GpC-WB 138±15 < 0,0001 131±16 < 0,0001 CpG1668 147±34 < 0,0004 146±34 < 0,0004 SEA 596±157 < 0,0001 1091±652 < 0,0001 SEA+ CpG-WB 674±249 < 0,0001 1177±728 < 0,0002 SEA+ GpC-WB 702±221 < 0,0001 1171±686 < 0,0001 0,04 SEA+ CpG1668 739±257 < 0,0001 1346±921 <0,0004 0,03 0,03 Die Zahl vitaler Blasten in der Mediumkontrolle nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultivierung der mononukleären Zellen wurde gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Blasten in den Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt. Der Anteil Blasten an D4 in den Kontrollansätzen betrug zwischen 3 und 8% aller vitalen Zellen und zwischen 4 und 12% an D6. Mittelwerte ± S (13 Tiere). P1 = Signifikanz berechnet zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur SEA-Stimulation. Um Aktivierungsprozesse zu erfassen, die sich nach vier bis sechs Tagen in vitro nicht in einer Blastogenese äußern, wurde über die Messung des Parameters FSC die mittlere Größe der vitalen mononukleären Zellen bestimmt. Sowohl nach vier als auch nach sechs Tagen waren signifikante Größenzunahmen der Gesamtpopulation nach CpG-Stimulation erkennbar (s. Tab. 15), die jedoch schwächer waren, als die durch SEA induzierten. An D6 bspw. hatten die unstimulierten MNC eine relative Größe von 376 Einheiten. CpG-WB inkubierte Zellen wiesen ein durchschnittliches Vorwärtsstreulicht von 402 und SEA-inkubierte von 515 auf. Kombinationsansätze aus SEA und DNA-Motiven zeigten keinen signifikanten Unterschied zu Ansätzen mit SEA allein. (s. Tab. 15). Eine statistische Relevanz war an Tag vier lediglich nach Kostimulation mit SEA+CpG 1668 zu verzeichnen. 95 Ergebnisse Tab. 15 Veränderung der durchschnittlichen Zellgröße (FSC) nach 4- und 6-tägiger Inkubation mit CpG-Motiven und dem Superantigen SEA 4-tägige Inkubation MW±S P1 6-tägige Inkubation P2 MW±S P1 Medium 377±08 CpG-WB 397±14 < 0,0002 402±18 < 0,0001 GpC-WB 385±12 < 0,0003 383±17 < 0,0001 CpG1668 385±09 < 0,0002 385±20 < 0,0005 SEA 469±38 < 0,0001 515±33 < 0,0001 SEA+ CpG-WB 469±37 < 0,0001 512±38 < 0,0001 SEA+ GpC-WB 470±36 < 0,0001 516±26 < 0,0001 SEA+ CpG1668 478±41 < 0,0001 524±45 < 0,0001 P2 376±15 0,03 Nach 4- und 6-tägiger in vitro Kultur wurden die Zellen durchflusszytometrisch erfasst und die mittlere Größe der vitalen Zellen anhand des Vorwärtsstreulichtsignals bestimmt Mittelwerte ± S (13 Tiere). P1 = Signifikanz berechnet zur Mediumkontrolle, P2 = Signifikanz berechnet zur SEAStimulation. 4.3.2 MHC-Klasse-II-Expression in vitro stimulierter boviner mononukleärer Zellen des Blutes Durch die Bestimmung der MHC-Klasse-II-Expression auf vier bis sechs Tage mit unterschiedlichen Stimuli inkubierten Lymphozyten sollte zum einen der Einfluss der Stimuli auf die Expressionsdichte und zum anderen die proliferierende Subpopulation bestimmt werden. Sowohl nach vier- als auch nach sechstägiger Inkubationsdauer konnten in den unstimulierten und CpG-stimulierten Ansätzen stark und schwach MHC-Klasse-II-exprimierende Zellen unterschieden werden. Eine Teilpopulation der fluoreszenzschwachen Zellen wies an Tag vier nach CpG-Stimulation eine höhere Expressionsstärke auf, wohingegen die fluoreszenzstarken Zellen unbeeinflusst blieben (s. Abb. 16 A). An Tag sechs wiesen die stark MHC-Klasse-IIexprimierenden Zellen eine Steigerung der Fluoreszenzstärke auf. Nach Stimulation mit SEA verschwanden an Tag vier die stark MHC-Klasse-II positiven Zellen (s. Abb. 16 B). Der kostimulatorische Einsatz von SEA und CpG-Motiven führte zu einer deutlichen Steigerung der MHC-Expression sowohl an Tag vier und Tag sechs der in vitro Kultur (s. Abb. 16 B). 96 Ergebnisse Tag 4 Tag 6 Messereignisse A) Fluoreszenzintesität Messereignisse B) Fluoreszenzintesität Abb. 16 MHC-Klasse-II-Expression boviner MNC nach 4- bzw. 6-tägiger in vitro Stimulation mit CpG-Motiven und SEA, sowie Kombinationen Nach 4-tägiger (linke Spalte) und 6-tägiger Inkubation (rechte Spalte) mononukleärer Zellen wurde mittels Membranimmunfluoreszenz die MHC-KLASSE-II-Expression bestimmt (mAk Bo139). A) Zur Stimulation wurden einzelne CpG-Motive (CpG-WB, GpC-WB und CpG 1668) eingesetzt. Das gefüllte Histogramm repräsentiert das Expressionsmuster unstimulierter Zellen. B) Hier wurde SEA (gefülltes Histogramm) oder Kombinationen aus SEA und den einzelnen CpG-Motiven zur Stimulation eingesetzt (überlagerte Linien). Exemplarisch wird das Expressionsmuster der Zellen eines Tieres dargestellt. 97 Ergebnisse 4.4 Das beschleunigte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten in vitro Im Folgenden sollten geprüft werden, ob CpG-Motive und andere PAMPs (LTA, LPS) einen direkten und/oder einen indirekten Einfluss auf neutrophile Granulozyten haben. Für diese Studien wurde eine breitere Palette an DNA-Motiven eingesetzt und zudem das Superantigen SEA als Referenzstimulus (KRÜGER 2001) verwendet. Aus Vorversuchen mit 10 µg/ml bis 1000 µg/ml LTA und LPS ergab sich eine generell eingesetzte Konzentration von 10 µg/ml LTA und LPS. Monokulturen aus PMN mit einem Höchstgehalt von 10% MNC wurden wie auf Seite 65 beschrieben mit PAMPs über 22 h inkubiert. Wegen der interindividuell starken Schwankungen der vitalen Zellen wurden alle Zahlen vitaler PMN auf die Zahl vitaler Zellen in den Mediumkontrollen bezogen und in Prozent ausgedrückt. Weiterhin wurde auf die Veränderung der Zellmorphologie geachtet um diesen Parameter als Maß für eine Interaktion der Neutrophilen mit PAMPs heranziehen zu können. 4.4.1 Effekte von CpG-Motiven, LPS und LTA für reine neutrophile Granulozyten Wurden reine Granulozyten (≤ 10% MNC, ≤ 2% Eosinophile) mit CpG-Motiven und SEA inkubiert, so führte dies bei 9 Tieren im Mittel zu einem Vitalitätsverlust von maximal 10% (s. Tab. 16). Die stärksten Effekte wurden durch CpG 2007 und SEA erreicht (s. Tab. 16). In den kostimulatorischen Ansätzen aus SEA und einzelnen CpG-Motiven erwiesen sich die Vitalitätsverluste als prononcierter und erreichten bis zu 27% (Restvitalität von 73% bei Einsatz von SEA+CpG 2007, Tab. 16). Die Vitalität der Zellen in sämtlichen kostimulatorischen Ansätzen war signifikant geringer als in der Mediumkontrolle. Die Komplexität/Granularität der Zellen war nach Inkubation mit den CpG-Motiven gegenüber den unstimulierten in der Regel unverändert oder nur marginal gesteigert (s. Tab. 16). Bei kombiniertem Einsatz von SEA und den CpG-Motiven divergierten die Effekte. CpG-WB und GpC-WB inkubierte Neutrophile hatten in Kombination mit SEA eine geringere Granularität als SEA und Medium inkubierte Zellen. Der Unterschied kostimulatorisch stimulierter Zellen mit SEA und CpG-WB war signifikant zu SEA inkubierten Zellen. Weitere Unterschiede waren nicht signifikant. 98 Ergebnisse Tab. 16 Stimulusabhängiger Vitalitätsverlust und morphologische Veränderungen reiner Neutrophiler und Neutrophiler in Kokultur mit MNC Reinkultur PMN Kokultur PMN/MNC Vitalität Granularität Größe Vitalität Granularität Größe Medium 100±0 a 535±204 a 294±183 a 100±0 a 523±163 a 374±193 a CpG-WB 95±13 a 539±206 a 290±175 a 81±13 b 519±159 a 376±184 a GpC-WB 97±5 a 534±200 a 290±182 a 85±12 b 523±166 a 380±188 a CpG 1760 96±4 b 541±206 a 296±191 a 71±12 b 518±161 a 380±184 a CpG 1781 98±9 a 539±203 a 296±191 a 74±14 b 523±162 a 386±192 a CpG 1826 99±13 a 541±206 a 299±186 a 65±15 b 522±155 a 385±181 a CpG 1829 97±16 a 538±208 a 300±198 a 67±16 b 526±162 a 390±185 a CpG 2006 94±6 b 540±209 a 304±198 a 68±14 b 526±164 a 388±185 a CpG 2007 90±14 a 543±209 a 306±185 a 64±15 b 519±160 a 390±184 a SEA 90±16 a 542±205 a 287±184 a 52±20 b 492±138 a 366±148 a SEA+CpG-WB 91±14 b 531±205 b 280±158 a 36±17 c 488±129 b 374±142 a SEA+GpC-WB 86±17 b 533±200 a 275±142 a 38±17 c 489±131 b 376±144 a SEA+CpG 1760 86±14 b 538±201 a 289±171 a 32±17 c 485±133 b 375±145 a SEA+CpG 1781 80±15 c 536±194 a 311±182 a 32±18 c 493±130 b 381±153 a SEA+CpG 1826 76±20 c 541±190 a 308±178 a 31±17 c 490±129 b 378±141 a SEA+CpG 1829 81±23 b 545±202 a 307±163 a 30±18 c 496±125 a 380±142 a SEA+CpG 2006 81±20 c 548±202 a 319±180 b 31±17 c 496±133 a 373±140 a SEA+CpG 2007 73±23 c 546±204 a 316±161 a 28±20 c 489±131 b 381±147 a Neutrophile wurden entweder in Reinkultur oder in Kombination mit MNC über 22 h inkubiert und durchflusszytometrisch quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S der Restvitalität (in Prozent der Mediumkontrolle), der Granularität (Seitwärtsstreulichtwerte) und der Zellgröße (Vorwärtsstreulichtwerte) von 9 Tieren. Verschiedene Kleinbuchstaben geben die Signifikanzen (p < 0,05) innerhalb einer Spalte zwischen Mediumkontrolle und stimulierten Ansätzen sowie zwischen SEA und kostimulatorisch inkubierten Ansätzen. Die relative Zellgröße stieg durch einige CpG-Sequenzen leicht, aber nicht signifikant an (s. Tab. 16). SEA besaß einen leicht verkleinernden Effekt. In den kostimulatorischen Ansätzen wiesen die Effekte die gleiche Richtung auf, wie durch Einzelstimulation. Alleinig 99 Ergebnisse die Kombination aus CpG 2006 und SEA bewirkte eine signifikante Steigerung gegenüber sowohl Medium als auch SEA inkubierten Neutrophilen auf 319 Einheiten. Da verschiedene mikrobielle Moleküle, die sowohl im humanen, als auch im bovinen System an verschiedenen Rezeptoren binden, gleichgerichtete vitalitäts-mindernde Effekte auf PMN induzieren, wurden weitere Pathogen-assoziierte Muster geprüft . Die Überlebensrate von Neutrophilen in reinen PMN-Kulturen unterlag durch LTA keinen Veränderungen (s. Abb. 17, Monokultur). LPS verminderte die Zahl vitaler Zellen im Mittel um 14% im Vergleich zur Mediumkontrolle. Kostimulatorische Ansätze mit LPS und CpG 2007 senkten die Restvitalität der reinen Neutrophilen signifikant auf 60%. Andere kostimulatorische Ansätze besaßen demgegenüber eine weit schwächere vitalitäts-mindernde Wirkung (s. Abb. 17). Die Granularität und Größe der Neutrophilen wurden durch LTA und LPS kaum beeinflusst (Daten nicht gezeigt). 4.4.2 Einfluss von CpG-Motiven, LPS und LTA auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen aus PMN und MNC In Anwesenheit von MNC reduzierten die eingestetzten CpG-Motiven die Vitalität der Granulozyten auf bis zu 64% im Vergleich zur Mediumkontrolle (s. Tab. 16). Eine Änderung der Granularität wurde durch CpG-Motive weit weniger induziert als durch das Superantigen SEA (CpG 1760: Absekung um 5 Einheiten; SEA: Absenkung um 31 Einheiten, s. Tab. 16). Wurde die Zellgröße durch die CpG-Motive eher leicht erhöht (bis 16 Einheiten durch CpG 1829 und 2007, s. Tab. 16), so wurde sie durch SEA verringert. Keine der beobachteten morphologischen Veränderungen erwies sich jedoch als signifikant unterschiedlich zur Mediumkontrolle (≥0,05). Alle CpG-Motive führten in Kombination mit SEA zu einer Summierung der zytotoxischen Effekte für Granulozyten. Die Restvitalitäten der Neutrophilen Granulozyten bewegten sich über alle geprüften Kombinationsansätze zwischen 28% (SEA+CpG 2007) und 38% (SEA+GpC-WB) (s. Tab. 16). Durch LPS wurde die Vitalität der neutrophilen Granulozyten im gleichen Maße wie durch SEA bzw. CpG 2007 signifikant gesenkt (Restvitalitäten zwischen 69% und 76%; s. Abb. 17, Kokultur). LTA zeigte keinen Effekt. Wurde mit LTA und CpG 2007 gleichzeitig stimuliert, so lag die Restvitalität im gleich Bereich der alleinigen CpG 2007 Stimulation (s. Abb. 17, Kokultur). Die Kombination aus LPS und CPG 2007 erwies sich am potentesten bezüglich des induzierten Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten (s. Abb. 17), wobei dies im 100 Ergebnisse Gegegnsatz zu den anderen Stimulus-Kombination bereits in PMN Monokulturen zu beobachten war (s. Abb. 17, PMN Monokultur). Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle PMN Monokultur Kokultur (PMN/MNC) 140 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 07 20 pG 07 +C 20 A G 7 SE +Cp 200 A G LT +Cp S LP A SE A LT S 07 LP 20 G Cp 07 20 pG 07 +C 20 A G 7 SE +Cp 200 A G LT +Cp S LP A SE A LT S 07 LP 20 G Cp Abb. 17 Beeinflussung der Vitalität Neutrophiler in PMN Monokulturen und Kokulturen mit MNC nach Stimulation mit PAMPs und PAMP-Kombinationen Percoll-separierte bovine Granulozyten (1 x 105) wurden in Rein- oder Kokultur mit mononukleären Zellen (MNC 1 x 105) desselben Tieres in vitro für 22 h inkubiert. Parallelansätze wurden mit SEA, CpG 2007, LTA bzw. LPS oder mit CpG 2007 kombiniert mit LPS, LTA und SEA zur Stimulation eingesetzt. Ansätze ohne Stimulus dienten als Kontrolle. Die hierin nach 22 h in vitro ermittelten Zahlen vitaler Zellen wurden gleich 100% gesetzt und die Zahlen vitaler Zellen aus den Stimulationansätzen dazu in Bezug gesetzt (Mittelwerte ± S von 7 Tieren). 101 Ergebnisse 4.4.3 Einfluss von Kulturüberständen CpG-stimulierter mononukleärer Zellen auf neutrophile Granulozyten Um zu prüfen ob lösliche Faktoren stimulierter MNC für das beschleunigte Sterben neutrophiler Granulozyten verantwortlich sind wurden PMN mit Kulturüberständen PAMPaktiverter MNC inkubiert („konditionierte Überstände“). Alle verwendeten Stimuli (oder Stimuluskombinationen) induzierten in Kulturen stimulierter MNC die Produktion löslicher Faktoren (s. Tab. 17B). Diese führten zu einem verstärkten Absterben der Neutrophilen, das vergleichbar dem Absterben der Neutrophilen in PAMPstimulierten Kokulturen aus PMN und MNC war (s. Tab. 17C). Dabei wirkte GpC-WB am schwächsten - mit einem Vitalitätsverlust von 12% - und die Kombination aus SEA und CpG 2007 am stärksten (63% Verlust). Quantitativ waren die Effekte nach Inkubation reiner PMN mit PAMP konditionierten Überständen marginal schwächer als die, der Kokulturen; die Unterschiede erweisen sich jedoch als nicht signifikant. In der Summe lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass der PAMP-vermittelte beschleunigte Zelltod neutrophiler Granulozyten nicht von einer Zell-Zell-Interaktion zwischen Granulozyten und mononukleären Zellen abhängt, sondern durch lösliche Produkte mononukleärer Zellen vermittelt wird. 102 Ergebnisse Tab. 17 Vergleich des akzellerierten Zelltods neutrophiler Granulozyten in A) Reinkulturen mit direkter PAMP-Zugabe, bzw. B) Zugabe konditionierter Überstände oder C) in PMN/MNC Kokulturen mit direkter PAMP-Zugabe PMN PMN/MNC Reinkulturen Kokulturen Zusatz von: A) Stimulus B) konditionierte MNC-Überstände C) Stimulus Stimulus MW±S MW±S MW±S Medium 100±0 100±0 100±0 CpG-WB 103±6 81±11 GpC-WB 99±5 CpG 1760 P1 P2 85±12 0,006 0,024 88±10 89±9 0,028 97±3 82±10 80±12 0,022 0,032 CpG 1781 99±4 83±7 82±12 0,004 0,014 CpG 1826 102±12 76±7 77±16 0,007 0,044 CpG 1829 93±9 81±6 80±15 0,035 CpG 2006 96±6 87±6 80±12 0,047 CpG 2007 94±14 80±12 73±17 SEA 89±12 64±11 65±16 0,010 0,031 SEA+CpG-WB 90±17 48±14 46±16 0,001 0,013 SEA+GpC-WB 89±18 53±19 48±17 0,002 0,013 SEA+CpG 1760 78±16 48±22 41±18 0,009 0,013 SEA+CpG 1781 73±21 41±12 39±18 0,001 0,023 SEA+CpG 1826 78±24 44±17 37±18 0,003 0,008 SEA+CpG 1829 80±24 46±19 38±18 0,007 0,011 SEA+CpG 2006 80±22 47±22 40±17 0,008 0,012 SEA+CpG 2007 72±17 37±24 37±21 0,005 0,008 0,006 0,049 Reine PMN wurden mit den angegebenen Stimuli 22 h in vitro kultiviert (A). Parallelansätze reiner PMN wurden mit Kulturüberstanden identisch stimulierter MNC inkubiert (B). Die gleichen StimulusKombinationen wurden in Kokulturen von PMN und MNC eingesetzt (C). Vitale PMN wurden durchflusszytometrisch quantifiziert und auf die ermittelten Zahlen in der Mediumkontrolle (=100%) bezogen. Mittelwerte ± S von 7 Tieren. P1 = Signifikanz der Unterschiede zwischen A) und B). P2 = Signifikanz der Unterschiede zwischen A) und C). Unterschiede zwischen B) und C) waren statistisch nicht signifikant. 103 Ergebnisse 4.4.4 Einfluss von Kulturüberständen aus allogenen MLCs Um Überstände stimulierter MNC zu gewinnen die keine PAMPs enthalten wurden allogene MLCs drei Tage in vitro kultiviert. Die an Tag drei (D3-konditioniert) gewonnen Überstände wurden zu reinen PMN gegeben und induzierten allein in in vitro Kulturen bereits einen deutlichen Vitalitätsverlust neutrophiler Granulozyten (Restvitalitäten von 42%, Abb. 18). Die zusätzliche Stimulation reiner PMN mit CpG 1826, LTA oder der Kombination aus LTA und CpG 1826 konnte den Vitalitätsverlust in Anwesenheit der D3-konditionierten Überstände sogar noch verstärken (s. Abb. 18). Vitale Neutrophile (x 10-3) 300 250 200 150 100 50 0 pG +C A LT A LT 26 18 26 18 26 18 us ul im St pG C S+ LP S LP pG C e hn O ohne konditionierten Überstand mit D3-konditioniertem Überstand Abb. 18 Vitalitätsverlust neutrophiler Granulozyten in Anwesenheit von Kulturüberständen aus allogenen MLCs und gleichzeitiger Stimulation mit PAMPs Reine PMN wurden 22 h in vitro kultiviert. Zugesetzt wurden Überstände aus allogenen gemischten Lymphozytenkulturen (D3-konditionierter Überstands). In parallelen Ansätzen erfolgte zusätzlich die Zugabe der angegebenen PAMPs oder PAMP-Kombinationen. Nach 22 h in vitro wurden die vitalen Neutrophilen durchflusszytometrisch quantifiziert (Mittelwerte ± S von acht Tieren). 104 Ergebnisse 4.4.5 Einfluss von CpG-Motiven auf eosinophile Granulozyten Einige Präparationen reiner PMN enthielten bis zu 10% eosinophile Granulozyten. Über ihre Eigenfluoreszenz (in der FL-1) war es möglich sie durchflusszytometrisch zu identifizieren. In reinen PMN Kulturen führte die Stimulation mit CpG-Motiven, SEA oder der Kombination aus SEA mit einzelnen CpG-Motiven nicht zu einer Beeinflussung der Vitalität eosinophiler Granulozyten (s. Abb. 19). Die leichten vitalitätsfördernden Effekte der kombinierten Stimuli auf Reinkulturen waren statistisch nicht signifikant (s. Abb. 19). In Kokulturen aus Granulozyten und mononukleären Zellen ereignete sich ein leichter Vitalitätsverlust der Eosinophilen; er betrug bis zu 18%. Signifikante Unterschiede zur Mediumkontrolle konnten nach Einsatz von SEA in Kombination mit CpG 1760 und 1829 beobachtet werden. Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle 150 125 100 75 50 25 0 07 20 pG 0 6 +C 20 EA G S Cp 829 + 1 EA G S Cp 826 A+ G 1 SE Cp 781 + A G1 SE Cp 760 + A G1 S E Cp B + A C- W SE G p B + A G -W S E Cp A+ SE A 7 SE 00 2 G 6 Cp 00 2 G 9 Cp 82 1 pG 6 C 182 pG 8 1 C 17 pG 0 C 176 G Cp W B pC G WB G Cp Ansätze mit reinen PMN Ansätze mit PMN und MNC Abb. 19 Vitalität eosinophiler Granulozyten nach 22-stündiger Inkubation mit unterschiedlichen Stimuli Kulturen reiner Granulozyten und Mischkulturen aus Granulozyten und MNC wurden in vitro mit verschiedenen CpG-Motiven, SEA und Kombinationen aus SEA und CpG-Motiven 22 h inkubiert. Die Zahl vitaler Eosinophiler in den Stimulationsansätzen (nach durchflusszytometrischer Analyse) wurde in Prozent der Mediumkontrolle (Ansätze ohne Stimulus = 100%) ausgedrückt. Mittelwerte ± S von 8 Tiere. 105 Ergebnisse Demnach wurde durch PAMPs ein weit geringerer Vitalitätsverlust boviner eosinophiler Granulozyten hervorgerufen, als er bei den autologen neutrophilen Granulozyten beobachtet werden konnte. 4.4.6 Abhängigkeit des Vitalitätsverlustes neutrophiler Granulozyten vom Progesteronspiegel Um über die intraindividuelle Abhängigkeit des Absterbens neutrophiler Granulozyten eine Aussage treffen zu können, wurde bei zwei Tieren während zweier Brunstzyklen jeweils zwei Mal im Östrus (Progesteron kleiner 1 ng/ml) und im Interöstrus (Progesteron größer 5 ng/ml) wiederholt der vitalitätsvermindernde Effekt verschiedener Stimuli untersucht. Die Tiere waren zu den Messzeitpunkten jeweils in gegensätzlichen Zyklusphasen (s. Tab. 18). Tab. 18 Verlauf des Progesteronspiegels bei der wiederholten Vitalitätsbestimmung der PMN zweier Tiere Messzeitpunkt 1 Messzeitpunkt 2 Messzeitpunkt 3 Messzeitpunkt 4 Tier I Interöstrus 1 Östrus 1 Interöstrus 2 Östrus 2 Tier II Östrus 1 Interöstrus 1 Östrus 2 Interöstrus 2 Die neutrophilen Granulozyten der Tiere reagierten auf die beiden verwendeten CpG-Motive CpG 1760 und 1826, LPS und LTA trotz interindividueller Unterschiede mit einer reproduzierbaren Quantität des Vitalitätsverlusts der Neutrophilen. Dabei konnte keine Abhängigkeit vom Zyklusstand festgestellt werden (s. Abb. 20). Eine Ausnahme bildete die Stimulation mit LTA, die sowohl zur Vitalitätssteigerung (s. Abb. 20, Tier II, Interöstrus1, Östrus 2) als auch zu einer Vitalitätsminderung führen konnte (Abb. 20, Tier II, Östrus 1). Auch diese Unterschiede waren nicht durch einen bestimmten Hormonspiegel (Zyklusstand) zu erklären. 106 Ergebnisse Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle Einzelstimulation Kostimulation 120 120 110 110 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 120 120 110 110 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 Östrus1 Östrus2 Interöstrus1 Interöstrus2 CpG 1760 Tier I Tier II Östrus1 Östrus2 Interöstrus1 Interöstrus2 LPS+CpG 1760 LTA+CpG 1760 CpG 1826 LPS+CpG 1826 LPS LTA LTA+CpG 1826 Abb. 20 Effekte von TLR-Liganden auf neutrophile Granulozyten in Kokulturen aus PMN und MNC in Abhängigkeit vom Zyklusstand der Tiere Granulozyten (PMN) zweier Tiere wurden in Kokulturen mit mononukleären Zellen für 22 h an vier unterschiedlichen Zeitpunkten bei hormonell bestimmten Zyklusstadien in vitro kultiviert. Der Zyklus der beiden Tiere verlief asynchron. Die Kulturen enthielten entweder CpG 1760, 1826, LPS, LTA oder Kombinationen aus jeweils einem CpG-Motiv und LPS oder LTA. Nach 22 h wurden die Zellen durchflusszytometrisch quantifiziert und in Prozent der Mediumkontrollen (=100%, horizontale Linien) ausgedrückt. Die beiden oberen Graphiken zeigen die Werte von Tier I und die unteren von Tier II. In den linken Graphiken sind die Effekte der Einzelstimuli und in den rechten die Effekte der Kombinationsansätze dargestellt. 107 Ergebnisse 4.4.7 CpG-Motive in Kombinationsansätzen aus bovinen Makrophagen und neutrophilen Granulozyten Für diese Versuche wurden Makrophagen im Verhältnis 1:6 mit PMN kokultiviert. Dieses Verhältnis ergab sich aus Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) und ermöglichte bei einer genügend großen Restvitalität der PMN mögliche additive oder überadditive Effekte der mit kombinierten PAMPs stimulierten Ansätze zu erfassen. In den Kokulturen ergaben sich deutliche Vitalitätsverluste von Neutrophilen, wenn mit Kombinationen aus CpG-Motiv mit LPS oder CpG-Motiv mit LTA stimuliert wurde. Hier betrug die Restvitalität im Vergleich zur Mediumkontrolle 50%. Auch CpG 2006 allein führte zu einem deutlichen, signifikanten Vitalitätsverlust um 35% während LPS nur zu einem Verlust von 15% führte (s. Abb. 21). Obgleich bei diesen Versuchen ebenfalls in den PMN Reinkulturen ein leichter Vitalitätsverlust nach Stimulation mit kombinierten PAMPs zu beobachten war (s. Abb. 21A), so führte die Anwesenheit von Makrophagen zu einem deutlich prononcierteren Absterben der Neutrophilen (s. Abb. 21B). Somit führten PAMP-stimulierte Makrophagen zu einem beschleunigten Absterben neutrophiler Granulozyten. A) Monokultur 110 B) Kokultur 100 100 Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle Vitale Zellen in % zur Mediumkontrolle 110 90 80 70 60 50 40 30 90 80 70 60 50 40 30 20 20 10 10 A+ LT pG G Cp C S+ A LT LP hn G Cp pG 20 06 06 06 20 20 06 20 S LP 06 20 us G ul Cp tim S e O A+ LT C S+ A LT LP hn S LP 06 20 us G ul Cp tim S e O Abb. 21 PAMP induzierter, durch Makrophagen vermittelter Vitalitätsverlust neutrophiler Granulozyten Percoll®-separierte, reine PMN (A), sowie Kombinationsansätze aus Makrophagen und PMN in einem Verhältnis von 1:5 (B) wurden mit LPS oder LTA über 22 h inkubiert. Ansätze ohne Stimulus dienten als Konrolle. Dargestellt sind % vitaler PMN im Vergleich zur Mediumkontrolle (=100%) (Mittelwerte von drei untersuchten Tieren). 108 Ergebnisse 4.4.8 Bedeutung der Reaktionslage von neutrophilen Granulozyten für das Ausmaß ihres Vitalitätsverlustes nach PAMP-Stimulation Das Ausmaß des induzierten Vitalitätsverlustes von Neutrophilen konnte interindividuell stark schwanken (s. 4.4.2). Dies könnte darauf beruhen, dass die MNC oder die in vitro generierten Makrophagen einzelner Tiere unterschiedlich stark durch die PAMPs stimuliert wurden. Eine weitere Möglichkeit bestand in der individuell unterschiedlichen Reaktionsbereitschaft der Neutrophilen einzelner Tiere. Um diese beiden Hypothesen zu prüfen wurde der induzierte Vitalitätsverlust in autologen Ansätzen mit dem in allogenen Ansätzen verglichen. Dies erfolgte sowohl mit MNC/PMNAnsätzen, als auch mit Makrophagen/PMN-Ansätzen. Granulozyten von drei und mononukleäre Zellen von vier Tieren wurden in allen Kombinationen gemeinsam inkubiert, um die Zuständigkeit einer Zellpopulation für die Effekte zu bestimmen. Aus den neun unterschiedlichen Kombinationen war in drei bis acht Fällen keiner Zellpopulation die Funktion des Haupteffektors zuzuordnen (s. Tab. 20, „AUsREISSER“), da die Effektivität der Stimuli hier entweder wesentlich höher oder niedriger war, als die der autologen Ansätze. Eine Dominanz der MNC über die Effekte konnte bei CpG 2007-Stimulation in vier Fällen festgestellt werden (s. Tab. 20), die Reaktionsbereitschaft der PMN spielte in keinem Fall eine Rolle. Ähnliches konnte nach Stimulation mit LTA und CpG 2007 beobachtet werden: Drei der Ansätze waren hauptsächlich MNC, einer PMN und zwei der Ansätzen durch beide Populationen bedingt. Tab. 19 verdeutlicht die Vorgehensweise und die Interpretation dieser Versuche: wurde mit LTA stimuliert, so ergab dies bei Tier 1 (autolog) eine Restvitalität von 60%, bei Tier 2 (autolog) von 116% und in der allogenen Kombination (MNC von Tier 1 und PMN von Tier 2 eine Restvitalität 105%. In diesem Fall waren die PMN (und ihre Reaktionsbereitschaft) für das Ausmaß des Absterben die ausschlaggebende Population („Haupteffektor“). Wenn, wie bei LPS, sowohl bei Tier 1 als auch bei Tier 2 eine vergleichbare Restvitalität vorliegt, aber im allogenen Ansatz die Vitalität stark abweicht, wurde der Haupteffektor mit „AUSREISSER“ angegeben (s. Bei einer äquidistant zwischen den beiden autologen Ansätzen einzuordnenden Vitalität wurden beide Populationen angegeben (PMN/MNC gleichbedeutend). 109 Ergebnisse Granulozyten von drei und mononukleäre Zellen von vier Tieren wurden in allen Kombinationen gemeinsam inkubiert, um die Zuständigkeit einer Zellpopulation für die Effekte zu bestimmen. Aus den neun unterschiedlichen Kombinationen war in drei bis acht Fällen keiner Zellpopulation die Funktion des Haupteffektors zuzuordnen (s. Tab. 20, „AUSREISSER“), da die Effektivität der Stimuli hier entweder wesentlich höher oder niedriger war, als die der autologen Ansätze. Eine Dominanz der MNC über die Effekte konnte bei CpG 2007-Stimulation in vier Fällen festgestellt werden (s. Tab. 20), die Reaktionsbereitschaft der PMN spielte in keinem Fall eine Rolle. Ähnliches konnte nach Stimulation mit LTA und CpG 2007 beobachtet werden: Drei der Ansätze waren hauptsächlich MNC, einer PMN und zwei der Ansätzen durch beide Populationen bedingt. Tab. 19 Prinzip der Auswertung autolog/allogener Apoptose-Versuche Autolog Allogen Tier 1: MNC Tier 2: MNC Tier1: MNC Haupteffektor Tier 1: PMN Tier 2: PMN Tier2: PMN Medium 100±9 100±3 100±4 CpG 2007 75±5 97±1 80±3 MNC LPS 57±2 43±7 112±6 AUSREISSER LPS+CpG 2007 14±2 51±4 65±5 PMN LTA 60±2 116±9 105±3 PMN LTA+CpG 2007 26±16 88±2 43±5 MNC PMN wurden in Kokulturen (Spalten Tier 1 und Tier 2 sind autologe Ansätze) mit den aufgeführten PAMPs inkubiert. Für den allogenen Ansatz Tier 1/Tier 2 wurden MNC von Tier 1 und PMN von Tier 2 verwendet. Die letzte Spalte gibt an, welche Zellpopulation wahrscheinlich ausschlaggebend für die Quantität des Vitalitätsverlustes ist. Aufgeführt sind die Mittelwerte ± S aus Triplikaten. Andere PAMPs oder PAMP-Kombinationen als Stimulatoren resultierten in einem gemischten Bild: je nach Herkunft der MNC oder der PMN konnte die eine oder andere Population über das Absterbeverhalten der PMN dominieren (s. Tab. 20). Die meisten „Ausreisser“ ergaben sich nach Stimulation mit LPS. Nur einmalig konnten die PMN als Haupteffektoren angesehen werden. In den anderen acht Kombinationen lag die 110 Ergebnisse Vitalität der PMN im Vergleich zu den autologen Ansätzen wesentlich höher. In all diesen Ansätzen war die Vitalität ebenfalls größer als in den unstimulierten Ansätzen (Daten nicht gezeigt). Ein ähnliches Bild ergab sich durch die Stimulation mit LPS und CpG 2007 (s. Tab. 20). In zwei Kombinationen lag auch hier die Vitalität über 100%, in allen anderen Fällen zumindest höher, als in den autologen Ansätzen (Daten nicht gezeigt). Sechs der neun LTA-stimulierten, allogenen Kombinationen führten zu einem deutlich größeren Vitalitätsverlust als es in den autologen Ansätzen der Fall war. Der Abstand lag zwischen 7% und 51% zu dem autologen Ansatz mit der niedrigeren Restvitalität (Daten nicht gezeigt). Tab. 20 Dominierende Zellpopulation für das induzierte Absterben neutrophiler Granulozyten nach Analyse autologer und allogener PMN/MNC Kokulturen Haupteffektor MNC PMN PMN und MNC Ausreißer CpG 2007 4 0 0 5 LPS 0 1 0 8 LPS+CpG 2007 1 2 0 6 LTA 2 2 0 5 LTA+CpG 2007 3 1 2 3 Medium PMN wurden in autologen und allogenen Kokulturen mit den aufgeführten PAMPs und PAMPKombinationen für 22 h in vitro inkubiert. Nach Analyse des Absterbeverhaltens von PMN in autologen und allogenen Kokulturen wurden die Zellpopulationen bestimmt, die für das Ausmaß des induzierten Absterbens der PMN hauptverantwortlich sind (Erläuterung siehe im Text). Die PMN zweier Tier wurden zusätzlich in autologen und allogenen Kombinationen mit Makrophagen zweier Tiere inkubiert. Bei dem Vergleich der Vitalität der PMN zwischen dem autologen Ansatz von Tier 1 und dem nebenstehenden allogenen Ansatz (Tier2:MPh/Tier1:PMN) war abhängig vom Stimulus ein um 6%-15% stärkeres Absterben der PMN in der allogenen Kombination zu vermerken (s. Tab. 21). Ein ähnliches Bild ergab sich im Vergleich der Kombinationen Tier2:MPh/Tier3:PMN und Tier1:MPh/Tier3:PMN. In beiden Kombinationen war ein stärkerer Vitalitätsverlust der PMN durch die Inkubation mit Makrophagen von Tier 2 zu verzeichnen. Hier betrug der Unterschied 6%-25%. Die Sterberate der PMN wurde demnach 111 Ergebnisse durch die Makrophagen maßgeblich beeinflusst, die individuell eine unterschiedliche Aktivierungsbereitsschaft zu besitzen scheinen. In Kokulturen mit Makrophagen konnte gezeigt werden, dass die Reaktionsbereitschaft der PMN ebenfalls wesentlich zu deren Absterbeverhalten beiträgt. Dies wurde deutlich, wenn die gleichen Makrophagen mit PMN unterschiedlicher Tiere inkubiert wurden. So führte LPS in der Kombination Tier1:Mph/Tier1PMN zu einer Restvitalität der PMN von 86%; in der Kombination Tier1:Mph/Tier3PMN zu einer Restvitalität von 65%. Ein weiteres, inverses Beispiel wäre die niedrigere Restvitalität von 47% in LTA+CpG 2007-stimulierten Ansätzen von Tier1:Mph/Tier1PMN im Vergleich zu einer höheren Restvitalität von 58% in Ansätzen von Tier1:Mph/Tier3PMN. Tab. 21 Einfluss der PMN auf die Quantität ihres Sterbens nach in vitro Stimulation autologer und allogener Makrophagen/PMN-Kombinationen mit PAMPs und PAMP-Kombinationen Tier 1: MPh Tier 2: MPh Tier 2: MPh Tier 1: MPh Tier 1: PMN Tier 1: PMN Tier 3: PMN Tier 3: PMN Medium 100±0 100±0 100±0 100±0 CpG 2007 62±0 52±0 42±3 65±1 LPS 86±1 77±1 52±0 65±1 LPS+CpG 2007 45±0 30±1 32±10 45±1 LTA 90±0 84±1 76±1 82±0 LTA+CpG 2007 47±1 33±2 33±1 58±1 PMN zweier Tiere wurden mit in vitro generierten Makrophagen von 2 Tieren in einer autologen und drei allogenen Kokulturen mit den aufgeführten PAMPs für 22 h inkubiert. Ansätze ohne Zusatz von PAMPs dienten als Kontrolle (Medium). Die Zahl vitaler PMN in den Kontrollansätzen wurde gleich 100% und die Zahl vitaler PMN in den Stimulationsansätzen dazu in Bezug gesetzt (Mittelwerte ± S von Triplikaten). Somit konnte gezeigt werden, dass die Absterberate von Neutrophilen in Kokulturen sowohl von der individuell unterschiedlichen Induktion mononukleärer Mediatoren als auch von der individuell unterschiedlichen Reaktionsbereitschaft der Neutrophilen abhängen kann. 112 Ergebnisse 4.4.9 Kinetik der Entstehung apoptischer Zellen durch in vitro Kokultivierung von PMN und MNC in Anwesenheit von TLRLiganden Das akzelerierte Sterben der neutrophilen Granulozyten in vitro nach Koinkubation mit MNC und TLR-Liganden (CpG-Motive, LTA oder LPS) könnte auf der Induktion einer Apoptose beruhen oder (unter den gewählten in vitro Bedingungen) auf der Induktion einer primären Nekrose. Um dies zu prüfen, wurde die Entstehung apoptotischer Zellen in vitro durch eine Membranfluoreszenz mit Annexin V-FITC (s. S. 65) über die Zeit der in vitro Kultur (bis 22 h nach Beginn des Ansatzes) verfolgt. Nach 22 h in vitro konnten unterschiedlich stark Annexin V-FITC positive Zellpopulationen identifiziert werden (Abb. 22B, Region 2 und 5) die nicht (Region 5) oder nur schwach (Region 2) Propidiumiodid positiv waren. In Region 1 befanden sich der Definition nach vitale (FL-3 negativ), nicht apoptotische (FL-1 negativ) Zellen. In der Region 2 liegen Zellen, die eine geringgradig gesteigerte Fluoreszenz sowohl in der FL-3 als auch in der FL-1 aufweisen. Sie können somit als apoptotische Zellen angesprochen werden. In der Region 4 befinden sich stark FL-3 und FL-1 postitive Zellen. Die in Region 5 Annexin V-FITC positiven und Propidiumiodid negativen Zellen wiesen keine Veränderungen der Morphologie im Vergleich zu den in Region 1 befindlichen Zellen auf. Die Masse der Zellen mit veränderter morphologischer Charakteristik (s. Abb. 22A, unterer rechter Quadrant) befand sich unter den schwach Annexin V-FITC positiven Zellen wieder (vgl. Abb. 22 C2 Abb. 22A). Annexin V-FITC schwach positve/Propidiumiodid stark positive Zellen (Abb. 22B, Region 3) wiesen hingegen eine deutlich geringere Zellgröße auf (vgl. Abb. 22 C3 und Abb. 22A). Es zeigte sich, dass das vom Hersteller empfohlene Färbeprotokoll mit Annexin V den Anteil einzelner Zellpopulationen im Vergleich zur Ausgangspopulation verändert (s. Abb. 23). So erhöhte sich der Anteil an PI-negativen Granulozyten nach der Annexin V-FITC-Färbung z.T. deutlich gegenüber der Messung, wenn sie direkt nach der Kultivierung im Durchflusszytometer durchgeführt wurde (s. Abb. 23; nach 4 h von 44% auf 55%). Parallel zur relativen Zunahme der vitalen Granulozyten wurden nach Annexin V-FITC-Färbung deutliche Verluste an Zellen beobachtet deren Morphologie im FSC/SSC-Punktediagramm der von apoptotischen mononukleären Zellen entsprach (s. Abb. 23; nach 12 h und 22 h, Pfeilmarkiert). 113 Ergebnisse B) Annexin V-FITC Granularität (SSC) A) 5 4 3 2 1 Größe (FSC) C) Propidiumiodid Granularität (SSC) 1 2 4 3 5 Größe (FSC) Abb. 22 Morphologische Eigenschaften und Fluoreszenzcharakteristika von Zellen (PMN/MNC Gemisch) nach Annexin V-FITC- und Propidiumiodid-Färbung Neutrophile Granulozyten und mononukleäre Zellen wurden im Verhältnis 1:1 22 h in vitro inkubiert. Darstellung einer Einzelmessung. A) Vorwärts-/Seitwärtsstreulicht-Punktediagramm nach Ausschluss von Zelldebris. B) Korrelierte Darstellung der Fluoreszenzen FL-3 (Propidiumiodid)/ FL-1 (Annexin V-FITC). In B) wurden anhand unterschiedlicher Fluoreszenzen 5 Regionen definiert. C) Morphologische Darstellung der Zellen in den Regionen 1-5 (aus B). 114 Ergebnisse 55% 60% Zeit nach Beginn der In-vitro-Kokultivierung 30 min Seitwärtsstreulicht (SSC) 44% 55% 4h 27% 35% 12h 31% 34% 22h Vorwärtsstreulicht (FSC) Abb. 23 Änderung der Zellzusammensetzung nach Färbung in vitro stimulierter PMN/MNC Kokulturen mit Annexin V-FITC Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Tieres wurden im Verhältnis 1:1 bis zu 22 h in vitro kultiviert (s. S. 65). Alle Ansätze enthielten Lipoteichonsäure und CpG 2007. Nach den angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische direkt durchflusszytometrisch analysiert (linke Spalte). Parallelansätze wurden nach Färbung mit Annexin V-FITC durchflusszytometrisch analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Dichteplots nach dem Ausschluss stark PI-positiver Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die Prozentsätze stellen den Anteil der Granulozyten an allen dargestellten Messereignissen dar (oberer linker Quadrant). Die Pfeile deuten auf eine eingekreiste Population an Zellen, die nach Annexin V-Färbung deutlich reduziert auftritt. 115 Ergebnisse Das zeitabhängige Auftreten von Annexin V-FITC positiven Zellen nach Stimulation von MNC/PMN-Gemischen mit TLR-Liganden ist exemplarisch in Abb. 24 dargestellt. Nach vierstündiger Inkubation in vitro ließen sich in allen Ansätzen, auch in der Mediumkontrolle ohne Zusatz, Annexin V positive Zellen darstellen (Kasten in B, F und J), die sich unter den mononukleären Zellen finden. Nach 12 h war eine Veränderung in der Morphologie der Granulozyten zu erkennen, die nur in den Ansätzen mit CpG 2007 und dem Kombinationsansatz CPG 2007+LTA auftrat: Teile der Zellen sanken deutlich in ihrem Seitwärtsstreulichtsignal (s. Abb. 24, Kasten in C, G und K). Diese Zellen, wie auch die Granulozyten mit intakt erscheinender Morphologie wiesen jedoch keine erhöhte Annexin VFITC-Bindung auf. Erst nach 22 h ließen sich deutlich Annexin V-FITC positive Zellen nachweisen (s. Abb. 24, Kasten in D, H und L). Deren Anteil war jedoch, gemessen an der Masse der erfassten Zellen relativ klein. Granulozyten, deren Granularität stimulationsabhängig sank (s. Abb. 24, Kasten in C, G und K) stellten sich im FL-3/SSC Punktediagramm als gemischte Population aus schwach und stark Propidiumiodid gefärbten Zellen dar (s. Abb. 25, Region 2). Damit ist zu diesem Zeitpunkt der Kultur bereits ein Nebeneinander von Apoptose (PI schwach positiv) und Nekrose (PI stark positv) festzustellen. 116 Ergebnisse Zusatz zum Kulturmedium Ohne Stimulus CpG 2007 A LTA+CpG 2007 E Zeit nach Beginn der In-vitroKokultivierung I 30 min Seitwärtsstreulicht (SSC) B F J 4h C G K 12 h D H L 22 h Annexin V-FITC (FL-1) Abb. 24 Auftreten Annexin V-FITC positiver Zellen nach Stimulation von MNC/PMN Kokulturen mit CpG 2007 oder der Kombination CpG 2007+LTA Mononukleäre Zellen und neutrophile Granulozyten eines Rindes wurden im Verhältnis 1:1 bis zu 22 h in vitro kultiviert (s. S. 65). Die Ansätze erfolgten in Triplikaten ohne Zusatz (A bis D), mit CpG 2007 (E-H) oder ein Gemisch aus Lipoteichonsäure und dem CpG 2007 (I-L). Nach den angegebenen Kulturzeiten in vitro wurden die Zellgemische mit Annexin V-FITC gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (rechte Spalte). Dargestellt sind Punktediagramme (FL-1/SSC) nach dem Ausschluss stark PI-positiver Ereignisse sowie zellulärem Debris. Die X-Achse der Zweiparameterdarstellungen entspricht der relativen Annexin V-FITC-Bindungsstärke. 117 Ergebnisse A) D) G) E) H) F) I) Medium R1 89% Messereignisse B) CpG 2007 Seitwärtsstreulicht (SSC) R2 11% LTA + CpG 2007 C) Annexin V-FITC (FL-1) Propidiumiodid (FL-3) Abb. 25 Aufschlüsselung der morphologisch veränderten und Annexin V-FITC teilpositiven PMN in der Rotfluoreszenz Percoll®-separierte PMN wurden in einem Verhältnis von 1:1 mit autologen MNC über 12 h in vitro inkubiert. Neben unstimulierten Ansätzen (Medium) wurden Parallelansätze mit CpG 2007 oder einem Gemisch aus LTA+CpG 2007 stimuliert. Nach Annexin V-FITC Färbung wurden die Zellen in Anwesenheit von Propidiumiodid durchflusszytometrisch anaylsiert. In den Punktediagrammen (Annexin V-FITC-Fluoreszenz gegen die Granularität) wurden 2 Regionen auf Zellen mit unterschiedlicher Seitwärtsstreuung gesetzt. Die Rotfluoreszenz (FL-3) der Zellpopulationen in den eingezeichneten Regionen wird in den nebenliegenden Histogrammen dargestellt (linkes Histogramm: Rotfluoreszenz der Zellen in Region 1; rechtes Histogramm: Rotfluoreszenz der Zellen in Region 2). 118 Diskussion 5 Diskussion Relativ wenige Studien befassten sich gezielt mit Konsequenzen für bovine Zellen des Immunsystems, die mit CpG-Motiven unmittelbar oder mittelbar in Kontakt treten. Hier setzte die vorliegende Arbeit an, in der gefragt wurde, ob und wie bovine leukozytäre Zellen von DNA-Motiven beeinflusst werden. Da CpG-Motive nur eine Klasse der Erregerspezifischen molekularen Muster darstellen und die Zellen des Immunsystems nach Erregerkontakt in der Regel einem Gemisch verschiedener Erregermuster gegenüberstehen, wurde besonderes Augenmerk auf die kombinierte Wirkung derartiger PAMPs für bovine Immunzellen gelegt. Um die Studien ebenso mit Zellen durchzuführen, die im Gewebe den Erregern und ihren molekularen Mustern mit als erste gegenüberstehen, wurden überdies in vitro Makrophagen generiert. 5.1.1 Beurteilung der in vitro generierten Makrophagen Ziel der Entwicklung einer alternativen Methode zur Generierung boviner, aus Blutmonozyten gewonnenen Makrophagen war es, mit möglichst geringem Zeit- und Materialaufwand ruhende und homogene Makrophagenpopulationen zu erzeugen. Vergleicht man die morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der nach den zwei Verfahren hergestellten Makrophagen, so lassen sich keine wesentlichen Unterschiede feststellen (s. 4.1.1). Dies steht etwas in Kontrast zu den Ergebnissen von SCHÜMANN (2001), die das Zellkulturflaschenverfahren deshalb kritisierte, da sich die so generierten Makrophagen bezüglich der Infizierbarkeit mit M. avium sp. inhomogener verhielten als die Makrophagen, die mit dem Teflonbeutel-Verfahren erzeugt wurden. Bezüglich der hier geprüften Phagozytosefähigkeit verhielten sich die Makrophagen ebenfalls inhomogen, jedoch unterschieden sich die nach den beiden Methoden generierten Zellen nicht in diesem Phänomen. Wichtiger erschien, dass beide Makrophagenpopulationen ein vergleichbares Expressionsmuster (CD14, MHC-Klasse-II) aufwiesen, und insbesondere die relativ schwache MHC-Klasse-II-Expression die Zellen als ruhende Makrophagen auswies. Es sei betont, dass es sich bei den hier generierten Makrophagen um Surrogatzellen für die Gewebsmakrophagen handelt. Da die in vitro generierten Zellen nicht gewebetypische Differenzierungsschritte nach Interaktion mit residenten Gewebezellen erlebten, kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich die in vitro generierten Zellen in einigen Aspekten 119 Diskussion funktionell von Gewebsmakrophagen unterscheiden können. Dennoch wurden sie hier zur exemplarischen Prüfung der Stimulierbarkeit durch PAMPs eingesetzt. Viele Zytokine und Mediatoren können die Differenzierung von in vitro aus Blutmonozyten generierten Zellen beeinflussen. Beispielsweise können IFN-γ, IL-6, IL-10 und GM-CSF die Entwicklung zu Makrophagen und die Kombination aus GM-CSF und IL-4 die Entwicklung zu Dendritischen Zellen induzieren (SANTIN et al. 1999, ALLAVENA et al. 1998, CHOMARAT et al. 2000, DELNESTE et al. 2003). In ihrer Morphologie unterschieden sich in den Zellkulturflaschen nach der Inkubation kleine nichtadhärente Zellen (Lymphozyten) von zwei Gruppen größerer, adhärenter Zellen. Beide Populationen besaßen Granula. Die einen erschienen rund, wohingegen die anderen Ausläufer besaßen und dem schematischen Bild von Dendritischen Zellen glichen. SANTIN et al. (1999) beschrieben, dass dendritische Zellen im Gegensatz zu Makrophagen keine Adhärenz entwickeln, was zu dem Schluss führt, dass es sich bei beiden adhärenten Populationen um Makrophagen handelt. Diese Hypothese wird durch die Tatsache unterstützt, dass nach dem Vorgang der enzymatischen Ablösung keine morphologische Unterscheidung – weder mikroskopisch noch durchflusszytometrisch – der Zellen mehr möglich war. Bei den Ausläufern handelt es sich demnach wahrscheinlich um der Adhärenz dienende Pseudopodien. Über die phänotypische Charakterisierung war eine Unterscheidung zu Dendritischen Zellen möglich, da diese eine starke MHC-Klasse-II-Expression zeigen (SANTIN et al. 1999). Die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen kann nicht als Unterscheidungsmerkmal dienen, da sie auf beiden Zelltypen stark exprimiert wurden (SANTIN et al. 1999). Wie von ADLER et al. (1994) für murine aus dem Knochenmark ex vivo generierte Makrophagen und von WERLING et al. (1998) an bovinen MDM gezeigt wurde, exprimieren Makrophagen CD14 stärker als Dendritische Zellen. Phänotypisch und morphologisch zeigen sowohl die Makrophagen aus Zellkulturflaschen als auch die aus Teflonbeuteln die Charakteristik ruhender Makrophagen. 5.1.2 Nachweis der Produktion von NO in MNC und Makrophagen Die Stickoxid-Produktion aktivierter Makrophagen wird üblicherweise anhand des GesamtNitritgehaltes im Überstand gemessen (MASON et al. 1996, HENDRICKS 1998 und SHODA et al. 2001b). Dieser summarische Wert berücksichtigt allerdings nicht, dass bei heterogenen Zellpopulationen nur einzelne Populationen NO produzieren können und erlaubt überdies nicht, die NO-Produktion auf Einzelzellebene zu prüfen. Um dies zu ermöglichen und um der Frage nachzugehen, ob PAMPs nach Interaktion mit Makrophagen die Bildung 120 Diskussion von immunmodulatorischem NO induzieren, wurde versucht ein sehr sensitives, durchflusszytometrisches Verfahren zu etablieren (s. S. 77), das auf dem Zusatz eines NO-sensitiven Fluorochroms zu den Zellen basierte. Während der Vorversuche fiel auf, dass sich nach Zugabe des Fluorochroms die Farbe des Mediums von Rot zu Orange-Rot änderte. Die gemessenen pH-Werte wiesen alkalische Werte auf (pH 7,82 bis 8,27). Dies schloss aus, dass es sich bei der Farbänderung um einen pH-bedingten Farbumschlag des Phenolrotes handelte, da dieses bei sauren Bedingungen von Rot zu Orange wechselt. Wahrscheinlicher ist, dass das zugegebene Fluorochrom DAF-2 DA durch Inhaltstoffe des Iscové-Mediums umgesetzt wurde. Dies wird dadurch bestärkt, dass DAF-2 DA schon durch die Verdünnung in PBS zu einem Teil zu reagieren schien. Deutlich wird diese Reaktion durch eine Gelbfärbung bereits direkt nach der Zugabe in das Verdünnungsmedium (PBS). Bei Zugabe des Fluorochroms zu Beginn der Inkubation wurde eine einheitliche Fluoreszenzintensität der Zellen erreicht. Im Falle des Zusatzes drei Stunden vor der Messung konnte bei vielen Tieren eine stärker und eine schwächer fluoreszierende Population unterschieden werden. Die Ursache für diese Differenz könnte darin liegen, dass N2O3 (Nitritanhydrid), das Reaktionsprodukt, das mit dem DAF-2 DA reagiert, nicht in der Zelle gespeichert wird, sondern sich in einem ständigen Umbauprozess zwischen NO, Nitritanhydrid und Peroxynitrit befindet (NAKATSUBO et al. 1998). Weiterhin wird es kontinuierlich in den Extrazellularraum abgegeben. Die früh zugegebenen Fluorochrome können während der gesamten Inkubationsdauer mit dem N2O3 reagieren, was zu einem höheren Umsatz auch in weniger aktiven Zellen führen kann. Bei später Zugabe hingegen kann das DAF-2 T lediglich mit dem in den drei Stunden vorliegenden N2O3 reagieren. Die Zellen, die in dieser Zeitspanne weniger aktiv sind, zeigen dann wahrscheinlich eine schwächere Fluoreszenz als diejenigen, die sich in einem hohen Aktivitätsstatus befinden. Die späte Zugabe des Fluorochroms gibt demnach wahrscheinlich einen genaueren Aufschluss über die derzeitig aktiven Zellen, wohingegen bei einer Langzeitinkubation ein summarisches Ergebnis der gesamten Inkubationsdauer erreicht wird. Die Fluoreszenzintensität von DAF-2 T in Makrophagen wurde nach Stimulation nur gering erhöht. Die hohe Eigenfluoreszenz von Makrophagen in der FL-1 könnte ein Grund für die schlechte Diskriminierung zwischen DAF-2 T schwach positiven und stark positiven Zellen sein. Es wäre wahrscheinlich sinnvoller, ein Fluorochrom in den Händen zu haben, welches in einem anderen Wellenbereich emittiert. ADLER et al. (1994) bemerkten dies bereits im Rahmen der phänotypischen Charakterisierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper in der Membranimmunfluoreszenz, die dann bessere Ergebnisse lieferte, wenn ein PE-konjugierter 121 Diskussion Sekundärantikörper (Emissionsmaximum in der FL-2) anstelle eines FITC-konjugierten Sekundärantikörpers (Emissionsmaximum in der FL-1) eingesetzt wurde. Die Induktion intrazellulären NOs (N2O3) ist mittels DAF-2 DA nachzuweisen Die verwendeten MNC wiesen wie die Makrophagen einen kontinuierlichen, stimulationsabhängigen Anstieg der DAF-2 T Fluoreszenz auf (Phagozytosepartikel, PWM, SEA, CpG-Motive). Allerdings bestehen trotz der Verwendung gleicher Fluorochromkonzentrationen innerhalb einer Zellpopulation große Fluoreszenzunterschiede, die nach derzeitigem Erkenntnisstand nicht eindeutig zu erklären sind (s. Abb. 12, Abb. 13 und Tab. 6). Bei alleiniger Zugabe von Substrat (L-Arginin) konnte die NO-Produktion in gleichem Maße wie durch Phagozytosepartikel gesteigert werden. Eine Deutung der stimulusabhängigen NOBildung wurde dadurch erschwert. Wie von HENDRICKS (1998) beschrieben, war an Tag 3 in den Überständen kultivierter MNC ein Plateau der Nitritkonzentration erreicht. Daraus lässt sich folgern, dass intrazellulär spätestens zu diesem Zeitpunkt ebenfalls NO in gesteigerter Menge vorliegen muss. Wie in Abb. 12 ersichtlich war durch Stimulation mit PWM und SEA eine Akzeleration der NOProduktion in bovinen Lymphozyten induzierbar. Eine stimulationsabhängige Steigerung der Nitritkonzentration in den Überständen war zu erkennen. Die Ergebnisse der Nitritmessung in den Überständen sind somit mit den durchflusszytometrisch bestimmten Fluoreszenzintensitäten korrelierend, auch wenn eine Umrechnung des intrazellulären NO-Gehaltes nicht möglich ist. Insgesamt scheint die Induktion der NO-Bildung durch die verwendeten PAMPs in MNC und Makrophagen kein besonders dominierendes Ereignis zu sein. In einer Studie von STICH et al. (1998) wurde beschrieben, dass sich bovine Makrophagen von bakteriellen Proteinen (pelletierte Zellorganellen und –membranen) nur unter kostimulatorischer Gabe von IFN-γ zur Produktion von NO anregen lassen. Da IFN-γ ein essentieller Kostimulus für die Produktion von NO durch PAMP-stimulierte Makrophagen zu sein scheint, verwundert es nicht, dass nicht nur die hier ermittelte niedrige NO-Produktion deutlich unter den bei PAMPstimulierten murinen Makrophagen liegt (JUNGI et al. 1996). ADLER et al. (1995) beschrieben die Stimulation zur iNOS und NO-Produktion nach Stimulation mit Salmonella dublin oder LPS, wiesen aber darauf hin, dass sich bovine Makrophagen hinsichtlich ihrer benötigten Signale für die Produktion von NO deutlich von Makrophagen anderer Spezies unterscheiden. Durch keine Kombination der geprüften Zytokine bzw. ihre Gabe als Einzelstimulus konnte die NO-Produktion induziert werden. JUNGI et al. (1996) bestätigen 122 Diskussion die Wirksamkeit der verwendeten bakteriellen Stimuli von ADLER et al. (1995) und weisen zusätzlich darauf hin, dass Gram negative Bakterien potentere Induktoren sind, als Gram positive. In vitro aus Monozyten generierte humane Makrophagen besitzen nach Aussage von FANG und VAZQUEZ-TORRES et al. (2002) ebenfalls keine Fähigkeit auf diverse Stimuli mit der Produktion von NO zu reagieren, obwohl eine konstitutive Produktion vorläge. Nur in vivo stimulierte Makrophagen produzieren ihrer Aussage nach NO in vitro. Auch in humanen Makrophagen wird wesentlich weniger NO und iNOS als in murinen Zellen produziert (FANG und VAZQUEZ-TORRES et al. 2002). 5.1.3 Bindung und Internalisierung von CpG-Motiven durch Zellen des peripheren Blutes und Makrophagen CpG- und GpC-Motive binden an allen untersuchten Zellpopulationen Die Modulation von Zellen über CpG-Motive setzt voraus, dass diese Strukturen zunächst an Zellen binden. Der direkte Bindungsnachweis von CpG-Motiven an Zelloberflächen wurde bisher noch nicht gezeigt - insbesondere nicht an normale leukozytäre Zellen klinisch gesunder Individuen. Studien die zeigen, dass CpG-Motive an den TLR-9 binden (TAKESHITA et al. 2001, UNDERHILL und OZINSKY 2002) wurden im Wesentlichen mit TLR-9 transfizierten Zelllinien durchgeführt oder (indirekter Nachweis der TLR-9 Bedeutung) über die fehlende Wirkung von CpG-Motiven mit Zellen von TLR-9 knock-out Mäusen. In dieser Arbeit konnte nach Einsatz biotinylierter DNA-Motive und eines erstmals eingesetzten Verstärkersystems (Flow-AMP®) eine Bindung sowohl eines CpG-Motivs als auch des reversen GpC-Motivs an Teilpopulationen aller untersuchter Zellpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten und in vitro generierte Makrophagen) nachgewiesen werden (s. S. 87, 4.2.2). Doppelfluoreszenzanalysen geben Hinweise darauf, das zumindest dies eine geprüfte CpG-Motiv selektiver in seiner Bindung ist: Der Anteil markierter, stark MHC-Klasse-II positiver lymphoider Zellen (B-Zellen) war höher als nach Inkubation der Zellen mit dem GpC-Motiv (s. Abb. 15). Ob dies mit einer differentiellen Expression des TLR-9 auf B-Zell-Subpopulationen korreliert, kann hier nicht beantwortet werden. Zumindest zeigen diese Studien beim Rind, dass CpG- oder allgemeiner ErregerDNA-Motive an alle leukozytären Zellen binden können was indirekt durch den Nachweis der TLR-9 mRNA-Expression in einer Vielzahl leukozytärer Zellpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Granulozyten) bestätigt wird (KRUTZIK et al. 2001, HAYASHI et al. 2003). 123 Diskussion Das Postulat, dass die Interaktion von CpG-Motiven mit dem TLR-9 erst intrazellulär nach Internalisierung der CpG-Motive erfolgt, kann durch die eigenen Versuche jedoch weder bestätigt noch widerlegt werden. Die nachgewiesene Bindung an Zellen in Kälte (und damit der Verhinderung der Internalisierung) schließt nicht aus, dass CpG-Motive initial an andere Liganden als den TLR-9 auf Zelloberflächen binden. CpG- und GpC-Motive werden internalisiert Die Bindung der CpG-Motive an bovine Zellen führte ebenso zu einer raschen (5 Minuten nach Zugabe) Internalisierung unter geeigneten in vitro Bedingungen (s. S. 92, 4.2.3). Dies stellt einen weiteren Hinweis auf die potentiellen immunmodulatorischen Effekte dieser Motive beim Rind dar, da die Hypothese besteht, dass CpG-vermittelte Effekte erst nach Internalisierung zu beobachten sind: MANZEL und MACFARLANE (1999) haben dies mit eleganten Versuchen zeigen können, in denen die Aufnahme blockiert wurde. Allerdings gilt diese Hypothese nicht mehr generell, da HAYASHI et al. (2003) nach Studien mit CpGMotiven und humanen neutrophilen Granulozyten eine Internalisierung für initiale Zellreaktionen nicht als zwingend notwendig erachten. Ebenso folgerten BYLUND et al. (2002) aus ihren Untersuchungen, dass aufgrund der nach kurzer Inkubationsdauer zu messenden Effekten bei Neutrophilen die Bindung an spezifische Rezeptoren für die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten ausreicht. 5.1.4 Interaktion von CpG Motiven mit bovinen MNC CpG Motive besitzen eine Vitalitätssteigernde und schwach proliferative Wirkung auf bovine MNC in vitro Ein klassischer Weg um die Beeinflussung mononukleärer Zellen über Stimuli nachzuweisen, stellt die Proliferationsinduktion dar. Bereits BROWN et al. (1998) verwendeten dieses Verfahren um zu zeigen, dass ein CpG-Motiv zur selektiven Proliferation von B-Zellen führt, nicht hingegen das reverse GpC-Motiv. Allerdings wurde dort mit aufgereinigten B-Zellen gearbeitet, um selektiv die B-Zell proliferative Reaktion anhand des Einbaus von 3HThymidins in aktivierte Zellen zu zeigen. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Verfahren basierte hingegen auf der Erfassung vitaler Zellen und vitaler Blasten. Diese Messungen belegen, dass CpG-Motive (inklusiv des reversen GpC-Motivs aus der Studie von BROWN et al. 1998) zu einer messbaren, wenngleich sehr schwachen proliferativen Antwort bei bovinen mononukleären Zellen führen 124 Diskussion (s. 4.3.1). Dies zeigte sich insbesondere im Vergleich mit dem hier verwendeten Superantigen SEA, welches zu einer starken Vermehrung der Zahl vitaler Blasten führte. Die Befunde stehen etwas in Kontrast zu dem rein CpG-spezifischen Effekt von BROWN et al. (1998) allerdings wurden dort zwischen 20 bis 40 µg/ml DNA-Sequenz eingesetzt, demnach die vierbis achtfachen Konzentration der in der vorliegenden Arbeit verwendeten. PONTAROLLO et al. (2002) beschrieben unter anderem die proliferationsinduzierende Potenz der Motive CpG 2006 und 2007 für bovine Zellen, nicht jedoch von CpG 1760 und 1826. Die Daten der hier vorliegenden Studie widersprechen dem dahingehend, dass auch durch CpG 2006 noch 2007 keine statistisch relevante Proliferationsinduktion nachgewiesen werden kann. Allerdings lassen sich auch hier die Ergebnisse nicht direkt vergleichen, da sich die Methodiken zur Erfassung der Proliferation unterschieden. So ist es durchaus vorstellbar, dass die hier nachgewiesene Blastogenese der Zellen nicht mit einer signifikanten Neusynthese von DNA einhergeht. Vielmehr besteht die Möglichkeit, dass CpG-Motive zu einer Induktion anti-apoptotischer Faktoren führen, die das Absterben von Zellen (Zyten und Blasten) verhindern oder die Kinetik des Absterbens der Zellen verlangsamt. Gestützt wird diese These durch den nachgewiesenen (allerdings schwachen) Anstieg der Zahl vitaler Zellen nach in vitro Stimulation mit CpG-Motiven (Tab. 13) und die von KRIEG et al. (1995) beschriebenen anti-apoptotischen und proliferativen Effekte von CpG-Motiven auf Lymphozyten. Aufgrund der relativ geringen, CpG-induzierten Blastenzahl wurde nicht versucht die proliferierende Subpopulation näher zu charakterisieren. Eine alleinige Aktivierung und Proliferation von B-Zellen scheint jedoch nicht gegeben zu sein. Nach Analyse der MHCKlasse-II Expression auf in vitro kultivierten Zellen (s. Abb. 16) ließ sich eine leichte Steigerung der Expression auf vorher MHC-Klasse-II negativen Zellen feststellen. Dies kann als Beleg dafür gelten, dass die in vitro Stimulation der Zellen durch CpG-Motive nicht nur die stark MHC-Klasse-II positiven B-Zellen anspricht, sondern auch andere lymphoide/monozytoide Zellen. PONTAROLLO et al. (2002) wiesen zwar daraufhin, dass BZellen die primär proliferierende Subpopulation darstellen, eine optimale in vitro Stimulation der lymphoiden Zellen jedoch unabdingbar von vorhandenen (aktivierten) Monozyten abhängt, über die weitere Zellpopulationen zur Proliferation angeregt werden können. Die hier nachgewiesen Modulation der MHC-Klasse-II-Expression durch CpG-Motive beim Rind findet ihre Parallele in der CpG-vermittelten Steigerung der MHC-Klasse-II-Expression auf humanen B-Zellen und Dendritischen Zellen (HARTMANN et al. 2000, HARTMANN und KRIEG 2000). 125 Diskussion Die Proliferationsinduktion scheint trotz des häufigen Einsatzes nicht die empfindlichste und zuverlässigste Methode zum Nachweis CpG-vermittelter Effekte beim Rind zu sein. Zum einen ist die Proliferationsreaktion eher schwach, zum anderen bestehen offensichtlich erhebliche interindividuelle Unterschiede. Dies führt je nach betrachteter Tiergruppe dazu, dass Unterschiede zur Mediumkontrolle nachgewiesen werden können oder nicht (vergleiche die Tab. 13, Tab. 14 und Tab. 15). Ein Grund für die beobachteten individuellen Unterschiede könnte darin liege, dass je nach untersuchtem Tier sowohl proliferationsinduzierende als auch hemmende Prozesse induziert werden können. So führen CpG-Motive nicht zwangsläufig immer zu einer Proliferation von B-Zellen, sondern können ebenso zur Apoptose der Zellen führen, wie es YI et al. (1998b) für die CpG-induzierte Apoptose muriner, aus der Milz stammender B-Lymphozyten beschrieben haben und wie es für Superantigen stimulierte bovine B-Zellen (Proliferation/Apoptose) von HENDRICKS (1998) gezeigt wurde. 5.1.5 Die Interaktion zwischen DNA-Motiven, LPS und LTA mit neutrophilen Granulozyten Nachdem gezeigt wurde, dass CpG-Motive an neutrophile Granulozyten binden wurde untersucht ob diese Interaktion eine funktionelle Konsequenz besitzt. Ein schnell, leicht und zuverlässig zu erfassender Parameter stellte die durchflusszytometrische Erfassung der Zellvitalität dar. Die Veränderungen der Zellgröße (Vorwärtsstreulicht) und der Granularität (Seitwärtsstreulicht) waren trotz der teilweise statistisch relevanten Unterschiede nicht stark ausgeprägt. Diese Interaktion wurde nur von einer leichten Vitalitätsminderung neutrophiler Granulozyten in Reinkultur begleitet. Einzig für zwei der geprüften CpG-Motive (CpG 1760 und 2006) war dieser Effekt signifikant (s. S. 98, 4.4.1). Dieser Effekt war relativ schwach und könnte ebenfalls einen indirekten Effekt darstellen, da die PMN-Präparationen zwischen 2% und 10% MNC enthielten. In jedem Fall scheinen nur neutrophile Granulozyten derart beeinflussbar gewesen zu sein, da dieser Effekt nicht bei eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden konnte (s. S. 105, 4.4.5). Allerdings waren diese Effekte stärker ausgeprägt wenn PMN in Reinkultur gemeinsam mit SEA und CpG-Motiven inkubiert wurden (s. Tab. 16). Nach KRÜGER (2001) war dieser Effekt durch Superantigeneinsatz allein nicht zu sehen. HAYASHI et al. (2003) haben an humanen Neutrophilen keine direkte Aktivierung durch CpG-Motive feststellen können. Ein direkter Einfluss jedoch besteht ihrer Aussage nach durch LPS und einen TLR-2-Liganden 126 Diskussion (Pam3CSK4 TLR-2/-1 und Zymosan TLR-2/-6). In den hier beschriebenen Studien waren die Vitalitätsverluste durch LPS zwar bei einigen Individuen sehr hoch, doch wurden keine statistisch relevanten Unterschiede erreicht (s. Abb. 17). Durch Vorinkubation der Neutrophilen mit GM-CSF konnten sie eine Aktivierbarkeit durch CpG-Motive nachweisen. BYLUND et al. (2002) konnten eine Stimulation humaner PMN mit PT-Motiven, wohingegen die gleichen Sequenzen mit einem PD-Rückgrat keinen Einfluss hatten. Eine direkte Aktivierung von PMN ist somit nicht auszuschließen, auch wenn sie durch den Parameter „Zahl vitaler Zellen“ statistisch nicht konsequent nachzuweisen ist. Der Zelltod in vitro; Kritik des methodischen Ansatzes Viele Arbeitsgruppen verwenden apoptotische Merkmale als Nachweis für eine Vitalitätsverminderung. LUNDQVIST-GUSTAFSSON & BENGTSSON (1999) bedienten sich der durchflusszytometrischen Bestimmung der verminderten Zellgröße als Maß für die Apoptose. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von Annexin V-FITC, das an Phosphatidylserin bindet (FADOK et al. 1992). ALAM et al. (1999) hingegen verwendeten Fluorochrom markierte Caspase-Substrate, um die Caspase-Aktivität während der Apoptoseinduktion durchflusszytometrisch zu quantifizieren. Apoptotische Zellen gehen in vitro jedoch schnell durch eine sekundäre Nekrose zugrunde (WALSH et al. 1998). Der Zeitraum in dem der Nachweis einer primären Apoptose-Induktion möglich ist, ist demnach nur kurz und bei der Verwendung verschiedener Stimuli nicht unbedingt Zeitgleich. Apoptotische, noch membranintakte Zellen, die sich durch sekundäre Nekrose als Propidiumiodid positiv darstellen, verlieren rasch ihre Membran- und Kernintegrität, was eine eindeutige Zuordnung ebenfalls erschwert. Durch Wahl eines falschen Messzeitpunktes besteht zudem die Gefahr der falsch positiven oder negativen Bestimmung. Unterstützt wird diese Hypothese durch eigene Beobachtungen, die sowohl einen selektiven Zellverlust der morphologisch veränderten Granulozytenpopulation (s. Abb. 23) sowie PI-positiver Zellen (s. Abb. 23) durch ein Verfahren der PS-Bindung erfassen. Aus diesen Gründen wurde in dieser Arbeit der quantitative, durchflusszytometrische Nachweis der Modulation der Zellvitalität eingesetzt, der zuverlässig die noch vitalen Zellen erfasst, jedoch keine Aussage über die Art des Zelltodes zulässt. PAMPs senken die Vitalität neutrophiler Granulozyten in Kokultur mit MNC Durch die Stimulation von Kokulturen boviner PMN mit MNC oder Makrophagen mit CpGMotiven, LTA und LPS konnte nach 22-stündiger Inkubation in vitro ein selektives, 127 Diskussion akzeleriertes Absterben der neutrophilen Granulozyten (s. S. 100, 4.4.2) beobachtet werden. Dieser PAMP-vermittelte Effekt in bovinen PMN/MNC Mischkulturen wurde erstmal von KRÜGER (2001) nach Einsatz von Superantigenen beschrieben. Der Superantigen vermittelte Effekt konnte in dieser Arbeit reproduziert werden (s. S. 100, 4.4.2) und erwies sich als stärker als der gleichgerichtete Effekt verschiedener weiterer PAMPs (CpG-Motive, LPS, LTA). Interessant in diesem Zusammenhang ist jedoch die Tatsache, dass bisher alle beim Rind untersuchten PAMPs, gleich an welche Rezeptoren sie an Zelloberflächen binden, den selben Vitalitäts-mindernden Effekt für neutrophile Granulozyten aufweisen. Dies scheint somit ein generelles Phänomen der Wirkungsweise von Erregermustern darzustellen. Überdies wurde gezeigt, dass der kostimulatorische Einsatz von PAMPs (CpG-Motive+SEA oder CpG-Motive+LPS/LTA) in additiver Art und Weise die Vitalität neutrophiler Granulozyten negativ beeinflusst (Tab. 16, Abb. 17). Dies erfolgte so stark, dass Unterschiede zwischen den CpG-Motiven (wie sie bei alleinigem Einsatz noch beobachtet werden können) nach Einsatz in Kombination mit SEA nicht mehr zutage traten. Ob die einzelnen Stimulatoren (SEA und PAMPs) über unterschiedliche Mechanismen/Mediatoren wirken, ist nicht bekannt, doch beschrieben HALLMANN et al. (2001) sowie UNDERHILL und OZINSKY (2002) die Aktivierung der gleichen intrazellulären Signalkaskade mit der finalen Translokation von NF-κB für alle TLR. SEA hingegen bindet an MHC-Klasse-II-Moleküle sowie T-Zellrezeptoren und wirkt wahrscheinlich über andere, intrazellulär induzierte Mechanismen. KRÜGER (2001) beschrieb, dass bei der Stimulation mit 1 ng/ml SEA ein Plateau des induzierbaren Vitalitätsverlustes erreicht ist und zudem selbst bei logarithmischer Konzentrationssteigerung des Stimulators kein weiterer Effekt erreicht werden konnte. Damit kann ausgeschlossen werden, dass nach Kostimulation mit CpG-Motiven und SEA einzig mehr von den relevanten, Apoptose fördernden Mediatoren aus stimulierten MNC freigesetzt wurden. Vielmehr scheint wahrscheinlich, dass CpG-Motive die Sekretion anderer, ebenfalls pro-apoptotischer Mediatoren – zusätzlich zu den SEA-induzierten – bewirken. Neben dem Verlust vitaler Granulozyten wurde durch den kostimulatorischen Einsatz von PAMPs die Granularität der Zellen im Mittel vermindert (s. Tab. 16 und Abb. 17). Dieser Granularitätsverlust kann als Parameter einer Zellaktivierung interpretiert werden, die sich in der Verschmelzung der Granula mit der Zellmembran zur Abgabe der Inhalte in den Extrazellularraum äußert: BYLUND et al. 2002 beschrieben einen Granularitätsverlust humaner Granulozyten nach 45-minütiger Stimulation mit PT-CpG-Motiven über die Messung von Gelatinase und Vitamin B12 in den Kulturüberständen. Dies schien nach BYLUND et al. (2002) bereits bei CpG-stimulierten PMN in Reinkulturen der Fall zu sein; in 128 Diskussion dieser Arbeit wurden nur marginale Granularitätsveränderungen boviner neutrophiler Granulozyten gesehen. Diese Unterschiede mögen wiederum in der Verwendung unterschiedlicher Verfahren und dem Einsatz unterschiedlicher finaler Konzentrationen der verwendeten CpG-Motive begründet sein. Lösliche Faktoren von mononukleären Zellen sind für das akzelerierte Sterben boviner neutrophiler Granulozyten verantwortlich Ein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen MNC und PMN scheint nicht für den Tod neutrophiler Granulozyten essentiell zu sein, da auch Überstände PAMP-aktivierter mononukleärer Zellen das Sterben der PMN in ähnlichem Ausmaß induzieren (s. Tab. 17). Diese konditionierten Überstände enthielten sowohl MNC-Mediatoren als auch die zur Stimulation verwendeten CpG-Motive was nicht ausschließen lässt, dass CpG-Motive und MNC-Mediatoren gleichzeitig nötig sind um zum akzelerierten Sterben der Neutrophilen zu führen. In der Summe kann der hier nachgewiesene CpG-induzierte Vitalitätsverlust boviner neutrophiler Granulozyten ebenfalls als sehr empfindlicher und zuverlässigerer Parameter einer MNC-Aktivierung angesehen werden. Zur Induktion des akzelerierten Sterbens boviner PMN scheint eine deutliche Proliferationsreaktion der MNC nicht unabdingbar zu sein. Trotz der sehr viel geringeren proliferationsinduzierenden Potenz von CpG-Motiven im Vergleich zu SEA liegt der CpG-induzierte Vitalitätsverlust wesentlich näher an dem SEA-induzierten (s. Tab. 13, Tab. 14 und Tab. 16). Noch deutlicher wird dies durch die zeitgleich zu den unter 4.4.3 beschriebenen Versuchen durchgeführten parallelen Proliferationsansätzen der selben Tiere, in denen keine signifikanten Effekte durch CpG-Motive erzielt werden konnten (Daten nicht gezeigt). Es bestehen keine an den Progesteron- und Östrogenspiegel gekoppelten Unterschiede in der Quantität des induzierten Zelltodes Trotz des generellen Effektes der untersuchten PAMPs auf PMN in Kokultur mit MNC fiel die hohe interindividuelle Varianz auf. Um sich den Ursachen zu nähern, wurde unter der Hypothese, dass die Expression von PAMP-Rezeptoren (TLRs) hormonreguliert ist bei zwei Tieren die Abhängigkeit des Zyklusstandes (Hormonstatus) dei differentiellen Reaktivität der Zellen untersucht. Dies lag nahe, da verschiedene Autoren von einer Beeinträchtigung der PMN-Funktionen durch physiologische Veränderungen der Sexualsteroide berichteten (Steigerung der PMN-Zahl im Blut; stärkere Phagozytosefähigkeit in Abhängigkeit von Östrogen; verringerte Fähigkeit zur ADCC durch hohe Progesteronspiegel) (ROTH et al. 1983, HOEDEMAKER et al. 1992, WESSENDORF et al. 1998). 129 Diskussion Jedoch konnte bei zwei Tieren im Verlauf zweier Zyklen nur durch LTA ein qualitativer Unterschied der induzierten Effekte auf bovine PMN in Kokulturen festgestellt werden (s. S. 106, 4.4.6). Die quantitativen Unterschiede des Vitalitätsverlustes der vier Messzeitpunkte stehen in keinem Verhältnis zu den Progesteron- und Östrogenspiegeln im Blut. Der Zustand der PMN entscheidet über den MNC-vermittelten Vitalitätsverlust mit Bisher wurde für den Effekt nur die in MNC unterschiedlich stark induzierten proapoptotischen Mediatoren für die individuell unterschiedliche Apoptoserate der Neutrophilen und damit für die individuellen Unterschiede verantwortlich gemacht. Gleichwohl müssen PMN in der Lage sein mit entsprechenden Rezeptoren diese Signale zu erkennen. Somit kann die individuell unterschiedliche Ausstattung der PMN mitentscheidend für ihren Vitalitätsverlust sein. Diese Hypothese bestätigte sich nach Analyse des Vergleichs autologer und allogener PMN/MNC Kombinationen. Fälle in denen autologe Kombinationen unterschiedlich starke Apoptoseraten der PMN aufwiesen (bei identischem Stimulus) sowie die PMN (in den allogenen Ansätzen mit MNC andere Tiere) ähnliche Apoptoseraten aufwiesen, ließen nur den Schluss zu, dass die Reaktionslage der PMN über deren Apoptose mitentscheidend ist. (s. S. 108). Im Gegensatz zu B- und T-Zellen bspw. exprimieren neutrophile Granulozyten konstitutiv CD137, einen Rezeptor der TNF/NGF (nerve growth factor) Rezeptor Superfamilie, dem jedoch die Todesdomaine fehlt (SIMON 2003). Durch denselben Autor wurde auch das funktionelle Vorliegen von FAS Rezeptoren und FAS Liganden beschrieben. Diese Rezeptoren und Liganden scheinen jedoch nicht für die spontane Apoptose neutrophiler Zellen in vitro verantwortlich zu sein. Über die Regulation der Rezeptorexpression bestehen bislang noch keine Kenntnisse, doch kann davon ausgegangen werden, dass nicht nur die antiund pro-apoptotischen Mediatoren, sondern auch die Rezeptoren einer Regulation unterliegen. Schlussfolgernd ist festzustellen, dass obwohl die Apoptose neutrophiler Granulozyten durch in vitro Aktivierung von Mitgliedern der TNF/NGF Rezeptorfamilie gesteigert werden kann, die spontane Apoptose der Neutrophilen letztendlich nicht kalkulierbar ist (SIMON 2003). Vergleichbare autolog/allogenen Kombinationen unter Verwendung von Makrophagen anstelle der MNC lassen bislang im Wesentlichen den Schluss zu, dass die Makrophagen (mehr als die PMN) und deren Stimulierbarkeit durch die verwendeten PAMPs entscheidenden Einfluss auf die PMN innehaben. (s. Tab. 21). Endgültige Aussagen hierüber 130 Diskussion bleiben allerdings weiterführenden Untersuchungen vorbehalten, da die Anzahl der Versuche zu diesem Themenkomplex nur initiale Anhaltspunkte liefert. PAMP-stimulierte MNC und Makrophagen sowie stimulierte Zellen aus allogenen MLCAnsätzen sezernieren offenbar Faktoren, die zum Vitalitätsverlust boviner Neutrophiler führen, sei es allein oder im Konzert mit zusätzlich anwesenden PAMPs. Geht man davon aus, dass es sich um die Induktion der Apoptose handelt, führt die Suche nach verantwortlichen Faktoren im wesentlichen zu einer Vielzahl Apoptose hemmender Zytokine und anderer Mediatoren. Nur wenige Berichte beschreiben rein Apoptose fördernde Faktoren für Neutrophile (s. Tab. 3). Das Stickoxid-Radikal (NO, FORTENBERRY et al. 1998), der Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α), das Prostaglandin E2 (PGE2) und Fas-FasLInteraktionen (LILES et al. 1996) sind die wenigen bislang beschriebenen Mediatoren, wobei für TNF-α und PGE2 sowohl pro- als auch anti-apoptotische Effekte beschrieben wurden (s. Tab. 3). KRÜGER (2001) versuchte das Superantigen vermittelte beschleunigte Sterben der Neutrophilen näher zu analysieren und konnte eine Bedeutung von TNF-α, von FasL und PGE2 nicht nachvollziehen. Einzig für das Stickoxid (NO) konnte indirekt eine Beteiligung an der Apoptoseinduktion nachgewiesen werden. FUCS et al. (1992) beschrieben die vermehrte Produktion von IL-2, IL-4 und IL-3/GM-CSF in allogenen und syngenen MLCs. Über IL-4 und GM-CSF ist jedoch bekannt, dass sie eine anti-apoptotische Wirkung auf Neutrophile besitzen, und somit nicht als Induktoren für den Vitalitätsverlust in Betracht zu ziehen sind (s. Tab. 3). Ist Apoptose oder Nekrose für das akzelerierte PMN-Sterben verantwortlich? Für den spontanen und den induzierten Zelltod polymorphkerniger Granulozyten wird von vielen Arbeitsgruppen (HASLETT et al. 1985, PAYNE et al. 1994, GASMI et al. 1996, WALZOG et al. 1997, HANNAH et al. 1998) generell die Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht. Dennoch blieb die Möglichkeit einer induzierten primären Nekrose zu prüfen. Um sich dieser Frage in dieser Arbeit zu nähern wurde engmaschig über die Zeit der in vitro Kultur eine Anfärbung der Zellen mit Annexin V-FITC durchgeführt Der Anteil Annexin V-FITC-markierter Zellen stieg mit der Zeit nach Ansatz der in vitro Kultur an, wobei die Fluoreszenzintensität unterschiedlich stark ausgeprägt war (s. Abb. 22). Viele PMN wiesen nur eine schwache Bindung auf. Die Propidiumiodid und stark FL-1 positiven Zellen sind per definitionem im Übergang von einem primär apoptotischen in einen sekundär nekrotischen Vorgang, in dem bereits ein Integritätsverlust der Zellmembran vorliegt (s. Abb. 22). Ein primär nekrotischer Vorgang ist für diese schwach FL-1 positiven 131 Diskussion Zellen denkbar, da sie im Gegensatz zu den stark FL-1 positiven Zellen auch eine schwache Rotfluoreszenz aufwiesen. Über eine Permeabilisierung der Zellemembran kann sowohl PI als auch Annexin V-FITC vermehrt in die Zelle eindringen und somit eine sich verstärkende Fluoreszenz erklärt werden. Eine Abnahme der PI-Färbung der schwach zu den stark fluoreszierenden Zellen ist nicht wahrscheinlich (Abb. 22 R2 und 5), was die Hypothese der primär nekrotischen Vorgänge der FL-1 schwach positiven PMN unterstützt. Alle FL-3 positiven Zellen weisen einen starken Größen- und Granularitätsverlust auf (s. Abb. 22), was zu der Vermutung führt, dass sie zu späteren Zeitpunkten nicht mehr als Zelle zu erkennen sind, sondern als Detritus vorliegen. Da durch den Färbevorgang mit Annexin V-FITC die Population mit diesen morphologischen Veränderungen selektiv depletiert wird, ist zu erklären, dass im Verlauf der 22 h der Anteil PI positiver Zellen nicht in dem Maße steigt, wie die Zahl vitaler Zellen ohne morphologische Veränderungen in den Parallelansätzen fällt (Daten nicht dargestellt). Von KÖNIG (2003) wurden ebenfalls bovine PMN mit Annexin VFITC inkubiert. In dieser Arbeit war eine Unterscheidung der apoptotischen von den nekrotischen Granulozyten eindeutig gegeben, wobei zu beachten ist, dass die Zellen mit anderen Stimuli inkubiert wurden. 132 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Julia Dahnke: CpG Motive und ausgewählte TOLL-like-Rezeptor-Liganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen Leukozyten Zellen des Immunsystems erkennen über Toll-like-Rezeptoren Molekulare Muster von Erregern (PAMP, Pathogen Associated Molecular Pattern). Zu der heterogenen Gruppe der PAMPs gehören Moleküle wie das LPS Gram negativer Keime, die Lipoteichonsäure Gram positiver Bakterien sowie nichtmethylierte DNA-Sequenzen mit einem CG-Dinukleotid im Zentrum (CpG-Motive). In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob und in welcher Weise Zellen des bovinen Immunsystems (lymphoide Zellen, in vitro generierte Makrophagen und Granulozyten) durch verschiedene PAMPs, insbesondere CpG-Motive moduliert werden. Mit Hilfe eines biotinylierten CpG- und eines GpC-Motivs konnte in der Membranfluoreszenz nach Einsatz eines amplifizierenden Systems gezeigt werden, dass DNA-Motive Bindungsstellen auf allen untersuchten Zellpopulationen besitzen (Lymphozyten, Monozyten, neutrophile und eosinophile Granulozyten sowie Makrophagen). Die Bindungskapazität unterschied sich sowohl zwischen den Zellpopulationen als auch innerhalb einer bestimmten Zellpopulation. Das CpG-Motiv band stärker an eine Subpopulation MHC-Klasse-II positiver B-Zellen als das reverse GpC-Motiv. Mit Hilfe der intrazellulären Fluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass eine Internalisierung der DNA-Motive bereits nach 5-minütiger Inkubation boviner Zellen stattfindet. Die von CpG-Motiven induzierte, durchflusszytometrisch erfasste Blastogenese von lymphoiden Zellen erwies sich gegenüber einem potenten Stimulus (Superantigen SEA) als schwach aber signifikant. Der kostimulatorische Einsatz von CpG-Motiven und SEA erwies sich als additiv. Die Stimulierung boviner lymphoider Zellen durch CpG-Motive in vitro führte zu einer gesteigerten MHC-Klasse-II-Expression. Keines der untersuchten PAMPs (CpG-Motive, LPS und LTA) besaß einen markanten Einfluss auf die Vitalität eosinophiler oder neutrophiler Granulozyten in reinen PMNKulturen. Der Vitalitätsverlust lag bei der Stimulation durch jeweils einen Stimulus bei maximal 10%. In Kokulturen von PMN und frisch isolierten MNC konnte durch alle untersuchten Stimuli mit Ausnahme des LTA ein Vitalitätsverlust der Neutrophilen induziert werden. Die signifikant erniedrigten Restvitalitäten (im Vergleich zur Mediumkontrolle) neutrophiler Granulozyten betrugen nach Stimulation mit einzelnen CpG-Motiven zwischen 64% und 85%, nach Stimulation mit dem Superantigen SEA (52%±20) mit LPS (75%±24) und mit LTA 96%±26. Unterschiede zwischen verschiedenen CpG-Motiven konnten 133 Zusammenfassung ebenfalls nicht festgestellt werden. Bei kombiniertem Einsatz von CpG-Motiven mit anderen Erregermustern (dem Superantigen SEA, dem LPS oder dem LTA) addierten sich die Vitalitätsmindernden Effekte der Einzelstimuli. Bei Verwendung der potentesten Stimuluskombination betrug die Restvitalität der neutrophilen Granulozyten 28%. Das PAMP-induzierte Sterben der Granulozyten erwies sich als selektiv für neutrophile Granulozyten, die Vitalität eosinophiler Granulozyten blieb unbeeinflusst. Für den Vitalitätsverlust waren hauptsächlich die von MNC sezernierten löslichen Faktoren verantwortlich, da durch Inkubation der PMN mit Kulturüberständen stimulierter MNC einen vergleichbaren Vitalitätsverlust aufwiesen. Um die Interaktion von PAMPs mit in vitro generierten Makrophagen zu untersuchen, wurde ein Alternativverfahren zur Generierung dieser Zellen aus Monozyten des peripheren Blutes etabliert. Das Verfahren unter Verwendung von Zellkulturflaschen erwies sich als effizienter als das Verfahren in Teflonbeuteln (bei vergleichbaren morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der generierten Makrophagenpopulationen) und wurde für die nachfolgenden Versuche vorgezogen. Nach Etablierung einer durchflusszytometrischen Methode zur Erfassung der Stickoxidbildung auf Einzelzellebene mit Hilfe des NO-sensitiven Fluorochroms DAF-2 DA zeigte sich, dass CpG-Motive allenfalls eine schwache NO-Bildung von Makrophagen induzierte. PAMP-stimulierte Makrophagen führten hingegen in sehr effizienter Weise ebenfalls zu einem selektiven Vitalitätsverlust von neutrophilen Granulozyten in Kokulturen aus Makrophagen und PMN. Der Vergleich autologer (PMN und MNC/Makrophagen vom selben Tier) mit allogenen Stimulationsansätzen (PMN und MNC/Makrophagen von verschiedenen Tieren) belegte, dass neben der Stimulierbarkeit der MNC/Makrophagen ebenso die individuelle Reaktionslage der PMN mitentscheidend für den indirekt induzierten Zelltod der neutrophilen Granulozyten ist. Letztere scheint zumindest nicht Progesteron-/Östrogengesteuert zu sein, da der Zyklusstand eines Tieres keinen erkennbaren Einfluss auf die Reaktionsbereitschaft der neutrophilen Granulozyten erkennen ließ. Der PAMP-vermittelte, Vitalitäts-mindernde Effekt für neutrophile Granulozyten scheint generell durch verschiedenste Erregermuster durch Stimulation von MNC und Makrophagen induziert zu werden. Dies kann für den pathogenen Organismus einen Vorteil darstellen, da er über seine Erregermuster Effektorzellen eliminiert. Ebenso bleibt denkbar, dass dieses Phänomen eine Schutzreaktion des Wirtes gegen zu viele und zu stark aktivierte neutrophile Granulozyten darstellt. 134 Summary 7 Summary Julia Dahnke: CpG-motifs and selected Toll-like-receptor-ligands: their modulatory interaction with bovine leukocytes Immune cells recognize Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) with Toll-likereceptors. Examples for members of this heterogeneous group of PAMPs are the lipopolysaccharide of Gram negative bacteria, the lipoteichoic acid of Gram positive bacteria as well as non-methylated DNA sequences containing a central CG dinucleotide (CpG motifs). In this study it was evaluated, whether and how bovine immune cells (lymphocytes, in vitro generated macrophages and granulocytes) are modulated by different PAMPs, especially by different CpG-motifs. Membrane fluorescence studies under amplifying conditions utilizing a biotinylated CpG and GpC motif could show that DNA motifs have binding sites on all investigated cell populations (lymphocytes, monocytes, neutrophils and eosinophils). The binding capacity for DNA motifs differed between the cell types as well as within a distinct cell population. The CpG motif bound stronger to a subpopulation of MHC class II positive B cells compared to the reverse GpC motif. Intracellular fluorescence assays proved, that internalization of DNA motifs occurs rapidly already beginning after 5 minutes of incubation. Compared to a potent stimulus (superantigen SEA), CpG motifs induced only a weak (although significant) proliferative response of blood mononuclear cells (MNC). Combined stimulation of MNC with SEA and CpG motifs resulted in an additive effect. CpG stimulation of bovine lymphocytes resulted also in an enhanced MHC class II expression. None of the studied PAMPs (CpG motifs, LPS, LTA) clearly affected the viability of pure bovine neutrophilic granulocytes: compared to controls, 90% of stimulated granulocytes remained viable. However, in co-cultures of PMN and freshly isolated MNC, the addition of the PAMPS (except LTA) resulted in a loss of neutrophil viability. The percentages of remaining viable neutrophils ranged between 64% and 85% after stimulation with CpG motifs, (52%±20) after stimulation with SEA, (76%±24) due to LPS stimulation and 96%±26 after stimulation with LTA. Differences between distinct CpG motifs were not observed. The combined stimulation of PMN/MNC co-cultures with CpG motifs and other stimuli (SEA, LPS or LTA) resulted in an additive effect. Using the most potent stimulus combination (SEA+CpG 2007) the remaining viability of neutrophils was 28%. Killing of granulocytes was selective for neutrophils, eosinophils remained unaffected. Direct cell interactions between PMN and MNC were not 135 Summary necessary for the killing of neutrophils since culture supernatants of stimulated MNCs induced the same degree of neutrophil viability loss. To study the interaction of PAMPs with in vitro generated macrophages, first an alternative method to generate macrophages from blood monocytes was established. The method using cell culture flasks proved to be more efficient compared to the usage of teflon bags and resulted in the generation of macrophages with comparable morphological, phenotypical and functional properties. The flow cytometric determination of nitric oxide generation on single cell level using the fluorochrome DAF-2 DA showed, that CpG motifs only slightly induce NO generation in bovine macrophages. However, stimulation of macrophages with PAMPs also resulted in a very efficient killing of simultaneously present neutrophils. Comparisons between autologous (PMN and MNC/macrophages from the same animal) and allogeneic (PMN and MNC/macrophages from different animals) stimulation assays showed, that killing of neutrophils is also governed by the physiological status of PMN. This doesn’t seem to be regulated by either progesterone or estrogen since the cycle stage of an animal had no apparent influence on the degree of losing viability among neutrophils. The PAMP-mediated, viability-depressing effect for neutrophils generally appears to be induced by a large variety of pathogen associated patterns. This may reflect an advantageous mechanism induced by pathogens, which eliminates effector cells directed against them. It may also be that this observed phenomenon is a reaction of the infected host, which protects it from tissue damage by to many activated neutrophilic granulocytes. 136 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis ADEREM A. & R. J. 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Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York 163 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „CpG Motive und ausgewählte TOLL-like-Rezeptor-Liganden: Ihre modulatorische Interaktion mit bovinen Leukozyten“ selbständig verfasst habe. Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden folgende Hilfsmittel und Hilfen Dritter in Anspruch genommen: − Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie zur Verfügung gestellt. − Die Zubereitung der Zellkulturmedien erfolgte durch Frau Silke Schöneberg und Herrn Hans-Udo Rabe. − Der Vergleich zweier Methoden zur Gewinnung und Kultivierung von aus Monozyten generierten Makrophagen geschah in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Torge König von der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. − Die Bestimmung der Blut-Progersteron- und Blut-Östrogen-Konzentrationen wurde durch das Endokrinologische Labor der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Ich habe die Dissertation an folgender wissenschaftlichen Einrichtung angefertigt: Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. _____________________________________ (Julia Dahnke) Hannover, 25.08.2003 Danksagung Zuerst möchte ich Herrn PD Dr. H.-J. Schuberth für die Überlassung des Themas und die herzliche Aufnahme in der Immunologie danken. Ohne seine allzeit „auf Anklopfen“ offene Tür, sowie die nahezu aufopfernde Art mit seinem Wissen zur Seite zu stehen, wäre die Erstellung dieser Arbeit nicht möglich gewesen. Auch nach dem x-ten Bericht einer Niederlage im Forscheralltag konnte nach einem kurzen, das Institut erschütternden Schrei mit aufbauenden und hilfreichen Worten gerechnet werden - Danke dafür. Durch sein Vermögen auch bei fachlichen Diskussionen und Erläuterungen seinen Humor nicht zu verlieren, war ein Segen für die Zusammenarbeit. Auch bei den kleinen oder großen alltäglichen Problemen mit meinen kleinen Freunden, den Computern, konnte fast immer eine Lösung durch ihn gefunden werden. Herrn Prof. Dr. W. Leibold danke ich sehr herzlich für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes, das stets offene Ohr und die jederzeit gern beigesteuerten Gedankengänge und Einwände. Lilli und ich möchten uns dafür bedanken, dass wir nun gemeinsam ein erfülltes und abwechslungsreiches Leben verbringen dürfen. Ebenfalls zu herzlichem Dank verpflichtet bin ich Herrn Dr. H. Zerbe, der immer für die Lösung von Problemen praktischer Natur mit den Rindern zur Stelle war. Ihm ist es zu verdanken, dass in dieser Arbeit die hormonellen Einflüsse auf die Reaktion des bovinen Immunsystems einbezogen werden konnte. Seine Ideen und Diskussionsbeiträge haben ebenfalls entscheidenden Anteil an der Entwicklung der alternativen Makrophagengenerierung beigetragen. Ein großer Dank gilt auch den fleißigen Heinzelmännchen des Labors der Arbeitsgruppe Immunologie: Frau Sonja Kordex, Frau Silke Schöneberg und Herrn Udo Rabe, denn nur durch ihr Wissen, ihre Ausdauer, ihre ständige Hilfsbereitschaft und unerschöpfliche Gedult mit den allgegenwärtigen „Problemen“ der Doktoranden haben sie nicht nur die praktische Durchführung der Laborarbeit ermöglicht. Wenn auch die Arbeit im Labor so manches Mal zu laut ausgesprochenen Flüchen geführt hat, so war es doch eine schöne Zeit in der Arbeitsgruppe Immunologie, denn ihr wart ja da. Ihr, meine Leidensgefährten und Mitdoktoranden, die ihr das gleiche Schicksal wie ich durchleidet oder durchlitten habt. Ich danke Euch für das angenehme Arbeitsklima, die offenen Ohren, die fachliche Unterstützung und notwendige Diskussion. Nein, Herr Dr. Torge König, dich habe ich natürlich nicht vergessen. Dir möchte ich nicht nur für die unermüdliche und zu guter Letzt immer erfolgreiche und angenehme Zusammenarbeit danken. Ohne dich hätte ich wahrscheinlich niemals einen „Fixateur“ für Wilma und Betty gehabt. Mein Dank gilt ebenfalls den stehts zu Diensten stehenden Tierpflegern und Auszubildenden der Klinik für Rinder – Thomas und Kara Euch Danke ich besonders. Dir Mama möchte ich für deine seelische und nicht zu vergessen die finanzielle Unterstützung danken, denn ohne sie wäre ich mit Sicherheit nicht so weit gekommen. Meiner WG danke ich; denen, die einmal dazugehörten (Maike Granel und Angela Borchers) und mich während der langen Laborzeit nach den immer wiederkehrenden Niederschlägen („schon wieder kontaminiert“) und Sarah Winkelsett, die bis jetzt mit mir leidet und immer wieder einen Weg findet mich abzulenken. Frau Dr. Ingrid Vervuert danke ich für Ihren Einsatz mir mit viel Geduld durch die statistischen Irrungen und Wirrungen zu helfen. Schließlich gilt mein Dank meinen Korrekturlesern Frau Hilke Winkler, Herrn Rolf Reil und Herrn Arnold Schnermann für ihre Bereitschaft, unter wiedrigsten Bedingungen das Chaos in der Orthographie zu beseitigen und so zur äußeren Form dieser Arbeit beizutragen, obwohl manche Absätze mit Sicherheit an Verständlichkeit und Spannung zu überbieten sind. Vielen vielen Dank Dir Jens, für den unerschütterlichen Langmut den du mir gegenüber während der ganzen Zeit aufgebracht, mit dem Du meine Launen ertragen und es trotz großer Beharrlichkeit meinerseits es Dir schwer zu machen, es immer wieder geschafft hast mich auf aus den unzähligen Tälern der Zweifel herauszuholen.
