Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
I
1 EINLEITUNG
1
1.1
1
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
1.1.1
PNEUMOLYSE
4
1.1.2
PNEUMOKOKKALES H202
5
1.2
ZELLULÄRE STRESSANTWORTEN
6
1.2.1
UNFOLDED PROTEIN RESPONSE (UPR)
1.2.2
OXIDATIVE STRESS ANTWORT
10
1.2.3
AUTOPHAGIE
10
1.2.4
MITOGEN AKTIVIERTE PROTEINKINASEN (MAPK)
12
STRESSANTWORTEN IN DER INFEKTION
13
1.2.5
6
1.3
ENDOSOMALES RECYCLING
15
1.4
ZIELSETZUNG
18
2 MATERIAL & METHODEN
20
2.1
MATERIAL
20
2.1.1
GERÄTE
20
2.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
21
2.1.3
CHEMIKALIEN
22
2.1.4
KOMPLETTAUSRÜSTUNGEN
24
2.1.5
ANTIKÖRPER
24
2.1.6
PRIMER
25
LÖSUNGEN
26
2.1.7
2.2
METHODEN
2.2.1
2.2.1.1
2.2.1.2
2.2.1.3
2.2.1.4
2.2.1.5
2.2.1.6
2.2.1.7
2.2.2
2.2.2.1
ARBEITEN MIT BAKTERIEN
Aufbewahrung der Bakterien
Vorbereitung der Bakterien für Infektion
Herstellung bakteriellen Überstandes
Präzipitation von Proteinen aus dem bakteriellen Überstand
Wasserstoffperoxid-Assay
Hämolysintitertest
Aufreinigung von Pneumolysin
ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLEN
Lagerung der Zellen
http://d-nb.info/1063738555
29
29
29
30
30
31
31
31
32
32
33
2.2.2.2
2.2.2.3
2.2.2.4
2.2.2.5
2.2.2.6
2.2.2.7
2.2.2.8
2.2.2.9
2.2.2.10
2.2.3
Infektion und Toxinbehandlung
Aussäen der H441 Zellen auf Transwells
Kryoimmun-Elektronenmikroskopie
Morphometrische Analyse der ER-Expansion
Transmissionselektronen-Mikroskopie (TEM): Epon-Einbettung
Messung der mitochondrialen ROS-Produktion
Bestimmung der Zellviabilität
Fluoreszenzmikroskopie
Messung in der Ussingkammer
ARBEITEN MIT PROTEINEN
2.2.3.1
2.2.3.2
2.2.3.3
2.2.3.4
2.2.3.5
2.2.3.6
2.2.3.7
Lyse der Zellen mit RIPA
Lyse der Zellen mit Bicine/CHAPS
Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA- Assay
Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
Western Blot & Immunoblot
Isoelektrische Fokussierung mittels SimpleWestern™
ARBEITEN MIT RNA
2.2.4
2.2.4.1
2.2.4.2
2.2.4.3
2.2.4.4
2.2.5
RNA Isolation aus eukaryotischen Zellen
Analyse der RNA Qualität
Reverse Transkription
Quantitative Real-Time PCR
STATISTIK
3 ERGEBNISSE
3.1
33
34
34
35
36
37
37
37
38
39
39
39
39
40
40
41
42
43
43
44
44
45
45
46
INDUKTION ZELLULÄRER STRESSANTWORTEN DURCH DIE INFEKTION MIT
S.PNEUMONIAE
INFEKTION MIT S.PNEUMONIAE FÜHRT ZUR UPR INDUKTION
3.1.1
3.1.1.1
3.1.1.2
3.1.1.3
46
46
Induktion des ATF6-UPR-Signalweges in A549 Zellen durch PLY
46
Induktion des PERK-UPR Signalweges durch pneumokokkales H202 in H441
Zellen
49
Aktivierung des PERK- und ATF6-UPR-Signalweges in P388D1 Zellen durch
PLY und pneumokokkales H202
59
3.1.2
INFEKTION MIT S.PNEUMONIAE FOHRT ABHÄNGIG VON PNEUMOKOKKALEM H202ZUR
AKTIVIERUNG DER AUTOPHAGIE
62
3.1.3
INDUKTION VON OXIDATIVEN STRESS DURCH S.PNEUMONIAE INFEKTION
3.1.4
AKKUMULATION VON PNEUMOKOKKALEM H202 INDUZIERT DIE AKTIVIERUNG VON
MAP KINASEN
66
3.1.5
S.PNEUMOWME-VERMITTELTE STRESSINDUKTION GEHT EINHER MIT DER
AKTIVIERUNG EINER IMMUNANTWORT
67
JNK UND ERK REGULIEREN DIE AKTIVIERUNG VON PERK-ZIELGENEN UND
INTERLEUKINEN SOWIE DEN S.PNEUMONME-VERMITTELTEN ZELLTOD
69
3.1.6
3.2
64
STÖRUNG DES ENDOSOMALEN RECYCLINGSYSTEMS DURCH DIE INFEKTION MIT
S.PNEUMONIAE
73
3.2.1
AUSBILDUNG VON MIKROVILLUSEINSCHLUSSKÖRPERCHEN NACH INFEKTION MIT
S. PNEUMONIAE
73
3.2.2 S.PNEUMONIAE INFEKTION FÜHRT ZUR REDUKTION OER MY05B TRANSKRIPTION 75
3.2.3
S.PNEUMONIAE INFEKTION FÜHRT ZUM VERLUST
3.2.4
BEHANDLUNG MIT H202 REDUZIERT DIE ENAC AKTIVITÄT
DER CFTR-EXPRESSION
4 DISKUSSION
4.1
S.PNEUMONIAE INFEKTION AKTIVIERT MITTELS PLY UND
77
79
81
H202 VERSCHIEDENE UPR-
SlGNALWEGE
81
4.2
PNEUMOKOKKALES H202 INDUZIERT GLOBALE STRESSINDUKTION
83
4.3
INDUKTION EINER IMMUNANTWORT DURCH STRESSINDUKTION
86
4.4
S.PNEUMONIAE INFEKTION FÜHRT ZUR STÖRUNG DES ENDOSOMALEN
4.5
TRANSPORTSYSTEMS
90
PNEUMOKOKKALES H202 = VERGESSENER VIRULENZFAKTOR?
95
4.6 AUSBLICK
96
5 ZUSAMMENFASSUNG
102
6 SUMMARY
103
7
104
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
8 ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS
108
8.1
ABBILDUNGEN
108
8.2
TABELLEN
109
9 LITERATURVERZEICHNIS
110
LISTE DER PUBLIKATIONEN UND TAGUNGSBEITRÄGE
125
EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG
126
DANKSAGUNG
127