Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei THESE zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY -Ph.D.- im Fachgebiet Mikrobiologie durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Sonja Klocke aus Bad Oeynhausen Hannover 2004 Supervisor: PD Dr. Ivo Steinmetz Betreuungsgruppe: PD Dr. Ivo Steinmetz Prof. Dr. Ludwig Haas PD Dr. Thomas Tschernig 1. Gutachten: PD Dr. Ivo Steinmetz (Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover) Prof. Dr. Ludwig Haas (Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) PD Dr. Thomas Tschernig (Zentrum Anatomie II: Funktionelle und angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover) 2. Gutachten: Prof. Dr. Ulrich Vogel (Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg) Datum der mündlichen Prüfung: 11.11.2004 gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft Graduiertenkolleg 745 (Mukosale ErregerWirt-Interaktionen) Für meine Eltern 1. EINLEITUNG........................................................................................................ 11 2. SCHRIFTTUM ...................................................................................................... 13 2.1. Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose ............................................................... 13 2.2. Epidemiologie............................................................................................................................................ 15 2.3. Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei ........................................................................... 17 2.4. Melioidose: Krankheitsbild des Menschen........................................................................................ 20 2.5. Melioidose: Krankheitsbild bei Tieren ................................................................................................ 22 2.7. Antikörper-vermittelte Immunität bei experimenteller Melioidose .............................................. 27 2.9. Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................................................. 33 3. MATERIAL UND METHODEN............................................................................. 34 3.1. Bakterien..................................................................................................................................................... 34 3.1.1. Bakterienstämme .................................................................................................................. 34 3.1.2. Einfrieren und Auftauen von Bakterien .............................................................................. 34 3.1.3. Anzucht von Bakterien ......................................................................................................... 34 3.1.4. Bestimmung der Keimzahl mittels Colony Forming Units (CFU)..................................... 35 3.2. Mausmodelle.............................................................................................................................................. 35 3.2.1. Rechtliche Grundlagen......................................................................................................... 35 3.2.2. Mausstämme ......................................................................................................................... 36 3.2.3. Haltung und Fütterung ......................................................................................................... 37 3.2.4. Narkose .................................................................................................................................. 37 3.3. Zellkultur..................................................................................................................................................... 38 3.3.1. Präparation von Knochenmarkstammzellen aus der Maus.............................................. 38 3.3.2. Differenzierung von Knochenmarkstammzellen zu Makrophagen unter Zellkulturbedingungen ......................................................................................................... 38 3.3.3. Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen.............................................................. 39 3.4. Antikörper................................................................................................................................................... 40 3.4.1. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels ELISA ................................................ 40 3.4.2. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels Proteinbestimmung nach Bradford 41 3.5. Makrophagen Invasions- und Bakterizidie-Assays ......................................................................... 41 3.5.1. Makrophagen Invasions-Assay: Antikörper-vermittelte Phagozytose ............................ 41 3.5.2. Makrophagen Bakterizidie-Assay IFNγ stimulierter und unstimulierter Zellen.............. 43 3.5.3. Makrophagen Bakterizidie-Assay: Hemmung der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) 43 3.6. Infektion und passive Immunisierung im Mausmodell................................................................... 44 3.6.1. Infektions- und Immunisierungsrouten .............................................................................. 44 3.6.1.1. Intranasale Infektion und Immunisierung......................................................................... 44 3.6.1.2. Intratracheale Infektion und Immunisierung .................................................................... 44 3.6.1.3. Intravenöse Immunisierung und Infektion........................................................................ 44 3.6.2. Untersuchung der Mortalität ................................................................................................ 45 3.6.3. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Tiere ............................................................ 45 3.6.4. Neutralisation von IFNγ in vivo ........................................................................................... 45 3.6.5. Statistische Auswertung der in vivo Versuche.................................................................. 46 3.6.6. Histopathologische Untersuchung von Organen infizierter Mäuse ................................ 46 3.7. Messung von NO ...................................................................................................................................... 47 3.7.1. Die Griess Reaktion: Prinzip der Methode ......................................................................... 47 3.7.2. Aussaat der Zellen ................................................................................................................ 48 3.7.3. NO-Messung nach Infektion................................................................................................. 48 3.7.4. NO-Messung nach Stimulation mit Immunkomplexen...................................................... 49 3.7.5. Hemmung von NF-κB bei NO-Stimulation durch Immunkomplexe ................................. 49 3.8. Messung von ROI ..................................................................................................................................... 49 3.8.1. Bestimmung von H2O2 durch Fluoreszenz: Prinzip der Methode .................................... 49 3.8.2. Aussaat der Zellen ................................................................................................................ 50 3.8.3. Messung nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat .................................................. 51 3.8.4. Messung nach Infektion ....................................................................................................... 51 4. ERGEBNISSE ...................................................................................................... 52 4.1. Pathohistologische Veränderungen von Lunge und Nasopharynx verursacht durch Infektionen mit Burkholderia pseudomallei ...................................................................................... 52 4.2. Protektive Wirkung monoklonaler Anti-EPS Antikörper bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei im murinen Pneumoniemodell ................................................................................... 57 4.2.1. Effekt von lokal appliziertem IgG2a .................................................................................... 57 4.2.1.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a ..................................... 57 4.2.1.2. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a 59 4.2.1.3. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intratrachealer passiver Immunisierung mit IgG2a .......................................................................................................................................... 60 4.2.2. Effekt von lokal appliziertem EPS-spezifischem polymerem IgA .................................... 62 4.2.2.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA........................................ 62 4.2.2.2. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA... 63 4.2.3. Effekte von systemisch appliziertem EPS-spezifischem IgG und IgA auf die Mortalität ................................................................................................................................................ 65 4.3. Vergleich der opsonisierenden Eigenschaften verschiedener Isotypen EPS-spezifischer Antikörper bei der Phagozytose von Knochenmarkmakrophagen ............................................. 66 4.4. Bedeutung der Fcγ-Rezeptoren I und III für die protektiven Effekte von EPS-spezifischem IgG2a ........................................................................................................................................................... 68 4.5. Antikörper-vermittelte Effektorfunktionen bei der Abwehr von Burkholderia pseudomallei71 4.5.1. NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen.................................................................. 71 4.5.1.1. Kinetik der NO-Produktion von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen ............................. 71 4.5.1.2. Stimulation der NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei ............................................................................................... 73 4.5.1.3. Stimulation der NO-Produktion durch EPS- Immunkomplexe......................................... 75 4.5.2. Die Rolle von NO in der intrazellulären bakteriziden Aktivität von Knochenmarkmakrophagen ................................................................................................ 77 4.5.2.1. NO-Hemmung bei C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen ................................................. 77 4.5.2.2. Invasion und Bakterizidie bei iNOS-Knock-out-Makrophagen ........................................ 78 4.5.2.3. Antikörper-vermittelte Phagozytose bei iNOS-Knock-out-Makrophagen ........................ 80 4.5.3. Bedeutung von NO in vivo: Suszeptibilität von iNOS-Knock-out-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei.................................................................................................. 81 4.5.3.1. Passive Immunisierung von iNOS-Knock-out-Mäusen ................................................... 82 4.5.4. Stimulation von ROI in Knochenmarkmakrophagen......................................................... 84 4.5.4.1. Kinetik der Sauerstoffradikalproduktion in C57Bl/6- und BALB/cKnochenmarkmakrophagen nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat ..................... 84 4.5.4.2. Stimulation von ROI nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei................................ 85 4.5.5. Bedeutung von ROI in vivo: Suszeptibilität von p47phox-Knock-out-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei.................................................................................................. 88 4.5.6. IFNγ bei Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo ........................................ 89 4.5.6.1. Neutralisierung von IFNγ bei C57Bl/6-Mäusen ............................................................... 89 4.5.6.2. Neutralisierung von IFNγ bei BALB/c-Mäusen ................................................................ 91 4.6. Rolle verschiedener Fcγ-Rezeptoren bei Phagozytose und NO-Produktion von Knochenmarkmakrophagen .................................................................................................................. 92 4.6.1. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain-Knock-out-Makrophagen vermittelt durch verschiedene IgG Isotypen .................................................................................................. 92 4.6.2. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain Knock-outMakrophagen......................................................................................................................... 94 4.6.3. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain/FcγRII-Knock-out vermittelt durch IgG verschiedener Subklassen................................................................................................... 95 4.6.4. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain/FcγRII-Knock-outMakrophagen......................................................................................................................... 96 4.6.5. Rolle von NF-κB bei der Induktion der NO-Produktion durch EPS-Immunkomplexe.... 97 5. DISKUSSION ....................................................................................................... 99 5.1. Vergleich der Bedeutung von EPS-spezifischem IgG und IgA für die Immunität des Respirationstraktes ................................................................................................................................. 99 5.1.1. Die Rolle von Fc-Rezeptoren für die IgG-vermittelte Protektion.................................... 102 5.2. Bedeutung von Immunkomplexen bei der Aktivierung von NO................................................. 105 5.3. Bedeutung von NO bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei in vitro und in vivo...................................................................................................................................... 107 5.4. Bedeutung von ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei ............................ 111 5.5. NO und ROI; redundante Mechanismen bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei?......................................................................................................................................... 113 5.6. Rolle von IFNγ bei Burkholderia pseudomallei Infektionen von C57Bl/6- und BALB/cMäusen...................................................................................................................................................... 115 5.7. Aktivierung intrazellulärer Abwehrmechanismen durch Fcγ-Rezeptoren............................... 118 6. ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY .................................................................. 122 7. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................... 126 8. ANHANG............................................................................................................ 141 8.1. Geräte ........................................................................................................................................................ 141 8.2. Gebrauchsmaterialien ........................................................................................................................... 142 8.3. Medien ....................................................................................................................................................... 143 8.3.1. Medien für die Bakterienanzucht: ..................................................................................... 143 8.3.2. Medien für die Zellkultur..................................................................................................... 143 8.4. Puffer und Lösungen............................................................................................................................. 144 8.5. Chemikalien ............................................................................................................................................. 145 8.6. Antikörper................................................................................................................................................. 147 8.6.1. Antikörper für ELISA........................................................................................................... 147 8.6.2. Monoklonale anti EPS Antikörper gegen B. pseudomallei............................................. 147 8.6.3. Sonstige Antikörper............................................................................................................ 148 8.7. Software.................................................................................................................................................... 148 Danksagungen ................................................................................................................................ 149 Veröffentlichungen: ......................................................................................................................... 151 Eidesstattliche Erklärung................................................................................................................. 152 Abkürzungsverzeichnis: Abb. ADCC °C CFU DCF DCF-DA DMSO ELISA eNOS EPS Fa. Fcµ/αR FCS FcγR g GM-CSF h HE IFNγ iNOS ITAM ITIM KO LB LPS M mAK min. MOI MUG n.d. NED NO nNOS PBS PDTC pIgA PMA RFU ROI SA U WT Abbildung Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity Grad Celsius Colony Forming Units Dichlorofluoreszein Dichlorofluoreszein Diazetat Dimethylsulphoxid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay endotheliale Stickoxid-Synthase Exopolysaccharid Firma Fcµ/α-Rezeptor Fetales Kälber Serum Fcγ-Rezeptor Mittlere Erdbeschleunigung 9,81 m/s2 Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor Stunde(n) Hämatoxilin Eosin Interferon γ induzierbare Stickoxid-Synthase Immunoreceptor Tyrosin-based Activation Motive Immunoreceptor Tyrosin-based Inhibitory Motive Knock-out Luria Bertani Lipopolysaccharid Molar monoklonale Antikörper Minute(n) Multiplicity of Infection Methylumbelliferyl Galactopyranosid nicht detektierbar Naphtyl Ethylendiamin Nitric Oxide (Stickoxid) neuronale Stickoxid-Synthase Phosphate buffered saline Pyrrolidindithiocarbamat polymeres IgA Phorbol Myristat Acetat Relative Fluorescent Unit Reactive Oxygen Intermediate Sulfanilsäure Unit Wildtyp Einleitung 11 1. Einleitung Das gram-negative Bakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der Melioidose, einer lebensbedrohenden Erkrankung. Zu den Endemiegebieten zählen vor allem Regionen mit tropischem und subtropischem Klima. Hier findet sich der saprophytisch lebende Erreger im Erdboden und auf Wasseroberflächen. Das Wirtsspektrum umfasst sowohl den Menschen als auch zahlreiche Tierarten, wobei eine Infektion vor allem über kontaminierte Hautwunden, aber auch durch Inhalation erfolgen kann (White 2003). Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist Burkholderia pseudomallei in der Lage, in verschiedenen Körperzellen, wie zum Beispiel Makrophagen und Epithelzellen, zu überleben und sich sogar zu vermehren (Jones et al. 1996). Melioidose tritt in vielen verschiedenen klinischen Verlaufsformen auf, wobei die häufigste lokalisierte Form eine Pneumonie ist. Dabei sind die Mechanismen der Wirtsabwehr bislang noch größtenteils unbekannt. Intranasale Infektionen bei verschiedenen Mausstämmen mit Burkholderia pseudomallei verursachen eine schwere Pneumonie und dienen so als gutes Modell zur Untersuchung der antibakteriellen Immunität des Respirationstraktes (Liu et al. 2002). Dabei zeigt sich, dass der Mausstamm C57Bl/6 eine deutlich höhere Resistenz gegenüber Burkholderia pseudomallei aufweist als der diesbezüglich hochempfängliche BALB/c-Stamm. Diese Resistenzunterschiede spiegeln sich nicht nur durch ein deutlich schnelleres Versterben der BALB/c-Tiere und höhere Keimzahlen in den inneren Organen in vivo wider (Hoppe et al. 1999), sondern korrelieren auch mit Knochenmarkmakrophagen einer von schlechteren BALB/c- bakteriziden im Funktion Vergleich der zu Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- Mäusen in vitro (Breitbach 2004). Für eine Vielzahl von Bakterien konnte gezeigt werden, dass die Produktion von Stickoxiden (NO) ein wichtiger Mechanismus bei der intrazellulären Abtötung von Erregern in Makrophagen ist und durch IFNγ und LPS stimuliert werden kann. Auch bei Infektionen der Makrophagenzelllinie J774.A1 mit Burkholderia pseudomallei konnte NO als wichtiger Faktor der intrazellulären bakteriziden Aktivität identifiziert werden (Miyagi et al. 1997). Des Weiteren induziert LPS von Burkholderia Einleitung 12 pseudomallei im Vergleich zu Salmonella und Escherichia coli eine geringere und verzögerte Induktion von NO. Diesen Umstand bringt man mit der besonderen LPSStruktur von Burkholderia pseudomallei in Verbindung (Utaisincharoen et al. 2001). Neben LPS und IFNγ spielen auch Antikörper eine wichtige Rolle bei der Stimulation von NO. So konnte zum Beispiel in einem Modell mit Cryptococcus neoformans gezeigt werden, dass die NO-Produktion von Makrophagen durch verschiedene Immunkomplexe stimuliert werden kann (Mozaffarian et al. 1995). Die genauen Mechanismen sind jedoch bislang unbekannt. Eine Beteiligung von Fc-Rezeptoren und des globalen Transkriptionsfaktors NF-κB kann jedoch vermutet werden. Die Bedeutung von Antikörpern bei der Abwehr von Burkholderia pseudomalleiInfektionen ist jedoch noch ungeklärt. Nach experimentellen Infektionen mit Burkholderia pseudomallei wurde die Bildung von Antikörpern verschiedener Isotypen in vivo im Mausmodell induziert (Hoppe et al. 1999). Ihre Rolle in der Abwehr einer Burkholderia pseudomallei-Infektion ist allerdings unklar. In anderen Experimenten führten lokal applizierte monoklonale Antikörper, die gegen Exopolysaccharide (EPS) von Burkholderia pseudomallei spezifisch sind, zu einer Protektion des Respirationstraktes im oben genannten Mausmodell (Breitbach 2004). Experimentelle Daten über die Bedeutung einer IgG- und IgA- vermittelten Immunität bei Infektionen des Respirationstraktes sowie ihrer Verbindung mit der Produktion von NO und anderen Fc-vermittelten Effektorfunktionen liegen bislang jedoch nicht vor. Schrifttum 13 2. Schrifttum 2.1. Burkholderia pseudomallei, der Erreger der Melioidose Melioidose ist eine potenziell tödliche Infektionskankheit, deren Krankheitsbild äußerst vielfältig ist, und die neben dem Menschen auch diverse Säugetiere und Vögel befallen kann. Sie wird vom gram-negativen Erreger Burkholderia pseudomallei verursacht und tritt vor allem in tropischen und subtropischen Regionen der Erde auf. Erstmalig wurde das Krankheitsbild der Melioidose 1912 von dem britischen Militärarzt und Pathologen Alfred Whitmore und seinem indischen Assistenten C.S. Krishnaswami im Ragnoon General Hospital in Burma, dem heutigen Myanmar, beschrieben (Whitmore & Krishnaswami 1912). Im Rahmen von polizeilich routinemäßig durchgeführten Sektionen stellten Whitmore und Krishnaswami fest, dass ein den pathologischen Veränderungen des Pferderotz ähnliches Krankheitsbild eine häufige Todesursache bei morphiumabhängigen Obdachlosen war. Die Veränderungen bestanden in multiplen Abszessen in verschiedenen Organen und der Haut. Es gelang ihnen weiterhin, den verantwortlichen Erreger zu isolieren. Dieser war ähnlich wie Burkholderia mallei, der Erreger des Rotzes bei Pferden, auf Peptonagar zu kultivieren. Im Tierversuch war er für Meerschweinchen tödlich. Im Gegensatz zu Burkholderia mallei zeigte der neu isolierte Erreger ein deutlich schnelleres Wachstum, war zudem nicht in der Lage, die charakteristische Straussreaktion zu induzieren und zeigte mikroskopisch Motilität. Whitmore bezeichnete seinen Erreger deshalb als Bacillus pseudomallei. Der Name Melioidose selbst stammt jedoch von Stanton und Fletcher, die im Jahre 1921 in Kuala Lumpur unabhängig von Whitmore ein dem Pferderotz ähnliches Krankheitsbild beschrieben, ohne jedoch den Erreger zu kennen. Aufgrund der pathologisch-morphologischen Ähnlichkeit mit dem damals in Europa weit verbreiteten Rotz des Pferdes, nannten sie das Krankheitsbild Melioidose. Dieses leitet sich aus dem griechischen melis (Rotz) und eidos (Ähnlichkeit haben mit…) ab (Stanton & Fletcher 1921). Tatsächlich wurde mit modernen Untersuchungsmethoden festgestellt, dass zwischen dem Erreger der Melioidose (Burkholderia pseudomallei) und dem Erreger des Rotz (Burkholderia mallei) eine Schrifttum 14 enge Verwandtschaft besteht. Aus diesem Grunde wird er seit 1992 der neuen Gattung Burkholderia zugeordnet. In diese gehören neben Burkholderia pseudomallei und Burkholderia mallei auch die Keime des so genannten Burkholderia Cepacia-Komplex (Yabuuchi et al. 1992). Burkholderia cepacia ist ein opportunistischer Erreger der Atemwege, speziell bei Mukoviszidose-Patienten (Frangolias et al. 1999; Haussler et al. 2003). Er gliedert sich in mindestens neun Genomovare, welche genotypisch unterscheidbar sind. Bis zur Klassifizierung in die Gattung Burkholderia wechselte Burkholderia pseudomallei mehrmals den Namen Bacillus pseudomallei, Malleomyces pseudomallei und schließlich Pseudomonas pseudomallei sowie auch seine Klassifizierungen - Actinomyces, Actinobacillus und Pseudomonas (Howe et al. 1971), was in älterer Literatur durchaus zu Verwirrung führen kann. Schon in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts deutete sich an, dass die Spezies Burkholderia pseudomallei nicht einheitlich ist. Bei systematischen Untersuchungen wurde festgestellt, dass im Tiermodell virulente und avirulente Stämme genotypische und phänotypische Unterschiede aufweisen. Avirulenz war dabei stets mit der Assimilation von Arabinose assoziiert (Smith et al. 1997). Außerdem besitzen avirulente Stämme Unterschiede in den Genen für 16 S rRNA (Brett et al. 1998), Unterschiede im Flagellingen sowie im Typ III-Sekretionssystem (Winstanley et al. 1998; Winstanley & Hart 2000). Aus diesen Gründen wurden diese avirulenten Stämme als neue Spezies Burkholderia thailandensis benannt (Brett et al. 1998). Schrifttum 15 2.2. Epidemiologie Burkholderia pseudomallei ist ein in tropischen und subtropischen Klimazonen saprophytisch im Erdboden vorkommender Keim, der nur geringe Anforderungen an seine Umwelt stellt. So ist beschrieben, dass er über mehrere Jahre in destilliertem Wasser überleben kann (Wuthiekanun et al. 1995). In den Endemiegebieten kann Burkholderia pseudomallei aus stehenden Gewässern sowie dem Erdboden isoliert werden (Chambon 1955). Die Infektion des Menschen findet in erster Linie über Inokulation des Erregers in kleine Hautwunden statt (Dance 2000). Diesem Infektionsweg besonders ausgesetzt, sind Personen, die in Endemiegebieten häufigen Kontakt zu Boden und offenen Wasserflächen haben, so zum Beispiel Reisbauern. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass auch die Inzidenz der Erkrankung in dieser Berufsgruppe besonders hoch ist (White 2003). Auch der Infektionsweg über erregerhaltige Stäube scheint möglich, da eine relativ hohe Anzahl von Krankheitsfällen unter amerikanischen Hubschrauberbesatzungen auftrat (Howe et al. 1971). Die Evidenz dieser Vermutung ist jedoch gering, da auch eine Infektion über die Haut nicht ausgeschlossen werden kann (Dance 2000). Allerdings sind im Tiermodell intranasale, intravenöse, intraperitoneale und sogar per ingestionem Infektionen mit Burkholderia pseudomallei möglich (Miller et al. 1948). Das Risiko, an Melioidose zu erkranken, wird vor allem durch bereits bestehende Grunderkrankungen wie Diabetes mellitus, Niereninsuffizienzen, Lungen- erkrankungen und Tumoren sowie durch Drogen- und Alkoholmissbrauch erhöht. Deshalb kann Burkholderia pseudomallei durchaus als opportunistischer Erreger eingestuft werden. Allerdings kann eine Melioidose, wenn auch selten, bei völlig Gesunden auftreten und sogar einen letalen Verlauf nehmen (Chaowagul et al. 1989; Currie et al. 2000c; Suputtamongkol et al. 1999). Generell sind alle Altersstufen von der Erkrankung betroffen. Die meisten Erkrankten sind aber im Alter zwischen 40 und 60 Jahren und es sind mehr Männer als Frauen betroffen (Verhältnis 3:2) (Chaowagul et al. 1993; Suputtamongkol et al. 1994a). Als endemisch gilt Burkholderia pseudomallei vor allem in den Gebieten des tropischen Asiens. Klinische Fälle treten gehäuft in Burma, Malaysia, Singapur, Vietnam, Indonesien und den Philippinen auf. Aber auch aus Regionen Chinas, Schrifttum 16 Südamerikas, Afrikas und Australiens sind Berichte über Erkrankungen bekannt (Dance 1991). Am Besten epidemiologisch untersucht, ist die Melioidose jedoch in Thailand und Australien. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass 80% der thailändischen Kinder bis zum vierten Lebensjahr seropositiv gegenüber Burkholderia pseudomallei getestet werden (Kanaphun et al. 1993). Gegenwärtig werden dort jährlich 2000 bis 3000 Fälle klinischer Melioidose diagnostiziert, was bei einer geschätzten Gesamtbevölkerung von 60 Millionen eine Inzidenz der Erkrankung von 3-5 auf 100.000 Einwohnern entspricht (Leelarasamee 2000). An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass die wahre Inzidenz vermutlich höher anzusiedeln ist, da davon ausgegangen werden muss, dass aufgrund der schlechten medizinischen Infrastruktur vor allem in ländlichen Regionen nur ein gewisser Teil der Fälle von Melioidose auch diagnostiziert wird. Nach weiteren Untersuchungen wird etwa jede fünfte außerhalb des Krankenhauses erworbene Sepsis in Thailand durch Burkholderia pseudomallei verursacht (Chaowagul et al. 1989). Die Mortalität aller an Melioidose erkrankten Patienten in Australien liegt bei etwa 19% (Currie et al. 2000c). Beim Vorliegen einer Septikämie lag die Mortalität nach einer neueren Studie nur noch bei 14–18% (Chetchotisakd et al. 2001). Eine Häufung der Krankheitsfälle ist in Thailand in den Monaten Juni bis November und zwischen November und April in Australien zu verzeichnen. In diesen Zeiträumen treten etwa 80% aller klinischen Fälle auf (Ashdown 1994). Diese Monate fallen in den jeweiligen Ländern genau mit der Regenzeit zusammen. Es kann vermutet werden, dass unter den nassen und warmen Bedingungen der Erreger aus tieferen Erdschichten an die Bodenoberfläche gespült wird und dort optimale Bedingungen für die Replikation vorfindet, sodass es in den Monaten der Regenzeit zu einer erhöhten Exposition mit dem Erreger und Inzidenz an Melioidosefällen kommt (Chaowagul et al. 1989). Tatsächlich besteht eine Korrelation zwischen regionalen Unterschieden der Keimkonzentration im Boden und dem Auftreten von Krankheitsfällen (White 2003). Schrifttum 17 2.3. Virulenzfaktoren von Burkholderia pseudomallei Burkholderia pseudomallei besitzt ein großes Spektrum an potentiellen Virulenzfaktoren, die auf der einen Seite zellassoziiert sind und auf der anderen Seite auch extrazelluläre Komponenten beinhalten. Als gram-negatives bekapseltes Bakterium besitzt es sowohl Lipopolysaccharide (LPS) als auch Exopolysaccharide (EPS), die mit der Bakterienkapsel assoziiert sind (Reckseidler et al. 2001; Steinmetz et al. 1995). LPS, das auch als Endotoxin bezeichnet wird, besteht bei allen gramnegativen Bakterien aus drei Komponenten; Lipid A, das die eigentliche endotoxische Wirkung besitzt und beim Tod der Bakterien freigesetzt wird, das Kernpolysaccharid und die speziesspezifischen O-Antigene. Burkholderia pseudomallei besitzt Typ-1- und Typ-2-O Seitenketten, deren Beitrag zur Virulenz experimentell gezeigt werden konnte. Diese Seitenketten sind strukturell unterschiedlich. Während der Typ-1 ein Homopolymer aus 1,3-verknüpften 2-O- acetylierten 6-Desoxy-β-mannoheptoseeinheiten ist, besteht der Typ-2 aus unverzweigten Glukose- und 6-Desoxytalose-haltigen, sich wiederholenden Einheiten und ist somit ein Heteropolymer (Perry et al. 1995). Transposonmutanten, die einen Defekt in der Produktion von Typ-2-0 Seitenketten besitzen, verlieren ihre Serumresistenz und weisen in verschiedenen Tiermodellen eine um einen Faktor 10-100 erhöhte LD50 auf (DeShazer et al. 1998). In der Produktion von Typ-1-O Seitenketten gestörten Mutanten weisen ebenfalls eine Verminderung der Virulenz um einen Faktor 105 auf, zeigen aber keine Beeinträchtigung der Serumresistenz (Reckseidler et al. 2001). Im Vergleich mit enterobakteriellem LPS zeigt das LPS von Burkholderia pseudomallei jedoch eine schwächere pyrogene Wirkung auf Ratten (Matsuura et al. 1996), sowie eine schlechtere Stimulation von NO und TNFα im Vergleich mit LPS von Escherichia coli und Salmonella Typhi in Makrophagen (Utaisincharoen et al. 2000). Dieser Effekt mag mit der ungewöhnlichen Struktur der säurestabilen Kernpolysaccharide in Verbindung stehen, die mit dem Lipid A assoziiert ist (Kawahara et al. 1992). Neben den Zellwand-assoziierten Lipopolysacchariden gelten auch die bei vielen virulenten gram-negativen Bakterien vorkommenden Kapsel-assoziierten EPS als Virulenzfaktoren. Die Kapsel ist nur schwach immunogen und die Bildung Schrifttum 18 kapselspezifischer Antikörper gering (Pruksachartvuthi et al. 1990). Dieser Umstand und die intrazelluläre Lage von Burkholderia pseudomallei mögen auch ein Grund für die langen Latenzphasen bei Melioidose sein (Brett & Woods 2000). Bei Burkholderia pseudomallei wurde 1995 das EPS I beschrieben (Steinmetz et al. 1995), welches ein unverzweigtes Polymer mit einer molekularen Masse von > 150 kDa darstellt (Nimtz et al. 1997). Die konstitutive Expression und molekulare Konserviertheit dieses EPS konnte durch ELISA und Immunoblot Untersuchungen an Burkholderia pseudomallei-Stämmen aus verschiedenen Teilen der Erde, sowie Kulturen unterschiedlicher Morphologie mit einem für EPS spezifischen monoklonalen Antikörper (3015 IgG1) gezeigt werden (Steinmetz et al. 1995). Hinweise auf ein zweites EPS von Burkholderia pseudomallei wurden im Jahr 2000 gefunden (Steinmetz et al. 2000). Kürzlich wurde auch ein EPS der Gruppe III nachgewiesen, dessen Defekt die LD50 von Burkholderia pseudomallei um den Faktor 104 erhöht (Reckseidler et al. 2001). Weitere zellassozierte Strukturen, die mit bakterieller Virulenz in Verbindung gebracht werden, sind Flagellen (Moens & Vanderleyden 1996; Penn & Luke 1992). Diese verleihen dem Bakterium Beweglichkeit und werden oft mit pathogenen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Von Burkholderia pseudomallei ist bekannt, dass es beweglich ist und zwei bis vier polar angeordnete Flagellen besitzt (DeShazer et al. 1997). Nachdem DeShazer et al. 1997 an motilitätsdefekten Mutanten keine Attenuierung in vivo nachweisen konnte, beschrieben Chua et al. 2003 Flagellen im Mausmodell als entscheidenden Virulenzfaktor. In der Dissertation von B. Fehlhaber konnte für eine Mutante mit einem Defekt im hochkonservierten Flagellingen eine geringgradige Attenuierung im Mausmodell gezeigt werden (Fehlhaber 2002). Neben den Flagellen besitzt Burkholderia pseudomallei auch mindestens zwei verschiedene Arten von Pili, deren Rolle beim Invasionsmechanismus des Erregers in Zellen noch nicht geklärt ist (Woods et al. 1999). Die Vermittlung einer Adhäsion an verschiedene Wirtszellen ist aber wahrscheinlich. Es ist bekannt, dass der Erreger in Epithelzellen, Fibroblasten, Granulozyten und Makrophagen eindringt, intrazellulär überlebt und sich auch vermehren kann (Jones et al. 1996; Pruksachartvuthi et al. 1990), sodass Burkholderia pseudomallei als fakultativ intrazelluläres Bakterium Schrifttum 19 bezeichnet wird. Aktive Aufnahme von der Wirtsseite findet durch Phagozytose in Makrophagen bzw. Endozytose in anderen Zellen statt. Einmal im Zytoplasma, liegt der Erreger offensichtlich in endozytischen Vakuolen, die jedoch nicht mit Lysosomen verschmelzen (Brown et al. 2002). Burkholderia pseudomallei ist in der Lage, aus diesen Vakuolen heraus ins Zytoplasma zu gelangen (Harley et al. 1998), wo der Erreger zelleigenes Aktin polymerisiert und sich auf diese Weise fortbewegt (Breitbach et al. 2003; Kespichayawattana et al. 2000). Vorwärts geschoben von diesem Aktinschweif ist es Burkholderia pseudomallei möglich, die Zellmembran der infizierten Zelle auszustülpen, bis eine Nachbarzelle erreicht wird. Durch Einstülpung deren Zellmembran gelangt der Erreger ins Zytoplasma einer Nachbarzelle und infiziert, diese ohne mit dem extrazellulären Raum in Berührung gekommen zu sein. Neben den beschriebenen zellassoziierten Virulenzfaktoren besitzt Burkholderia pseudomallei eine Reihe von Exoprodukten, die im Verdacht stehen, für die dramatischen Verläufe der septikämischen Melioidose mit verantwortlich zu sein. Beschrieben wurden bislang zwei hitzelabile Toxine, deren letale Wirkung nur bei einem der beiden durch eine proteolytische Aktivität zurückgeführt werden konnte (Heckly 1964; Heckly & Nigg 1958). Daneben konnte noch bei zwei weiteren Proteinen mit der Größe von 31 kDa und 3 kDa eine toxische Wirkung in vitro nachgewiesen werden. Dabei zeigt das kleinere Protein der beiden Hitzestabilität (Haase et al. 1997; Ismail et al. 1987). Burkholderia pseudomallei produziert verglichen mit anderen Bakterien nur wenig Hämolysin, welches hitzestabil, aber nicht besonders toxisch ist (Liu 1957). Dieses ist vermutlich identisch mit einem zytotoxischen hitzestabilen Ramnolipid, dass ebenfalls als Virulenzfaktor in Frage kommt (Haussler et al. 2003). Bei einigen Stämmen wurde noch ein zweites, hitzelabiles Hämolysin entdeckt (Ashdown & Koehler 1990). Burkholderia pseudomallei ist in der Lage, verschiedene Enzyme wie Proteasen, Lipasen, Lecitinasen, Superoxiddismutase und Peroxidase zu sezernieren (Ashdown & Koehler 1990). Einige davon wie eine Protease, Lipase und Phospholipase C werden dabei im Zusammenhang mit einem Typ II-Sekretionsapparat sezerniert, der große Homologien zu dem anderer gram-negativer Bakterien aufweist (DeShazer et al. 1999). Des Weiteren verfügt Burkholderia pseudomallei über einen Typ III-Sekretionsapparat (Rainbow et al. 2002), der große Ähnlichkeit mit den Typ Schrifttum 20 III-Sekretionsapparaten von Salmonellen und Shigellen aufweist. Das Fehlen dieses Sekretionssystems bei den apathogenen Burkholderia thailandensis-Stämmen könnte ein Hinweis auf seine Bedeutung als Virulenzfaktor sein (Winstanley & Hart 2000). Generell muss hinzugefügt werden, dass die Virulenz einzelner Burkholderia pseudomallei-Stämme in vivo sehr variabel ist. So konnten in Studien an klinischenund Umweltisolaten, von denen die LD50 im Mausmodell bestimmt wurde, Schwankungen von bis zu fünf Log-Stufen innerhalb der Spezies festgestellt werden (Ulett et al. 2001). 2.4. Melioidose: Krankheitsbild des Menschen Das Krankheitsbild der Melioidose ist sehr variabel und kann akute, subakute wie auch chronische Formen ausbilden. Nach einer Infektion kann die Erkrankung unmittelbar ausbrechen, typischerweise tritt aber zunächst eine längere Latenzphase auf, die bei einer Verschlechterung der Wirtsabwehr in eine manifeste Krankheit übergeht (Ip et al. 1995). Die Inkubationszeit reicht dabei von zwei Tagen bis zu 26 Jahren (Mays & Ricketts 1975). Im Falle einer akuten Melioidose ist eine Septikämie die am häufigsten auftretende Manifestationsform. Hohes Fieber und Abszessbildung in verschiedenen Organen sind die Folge. Die häufigste Lokalisation der Erkrankung in der akuten Form ist die Lunge, einhergehend mit Bronchitis, disseminierter Bronchopneumonie oder nekrotisierender Lobärpneumonie. Die Infektion der Lunge ist in der Regel jedoch nicht primär pulmonal, sondern die Folge einer hämatogenen Streuung (Chaowagul et al. 1989; Ip et al. 1995). Ein weiteres häufiges Erscheinungsbild einer akuten Melioidose ist eine lokalisierte eitrige Entzündung in verschiedenen Organen. Daneben gibt es allerdings auch noch zahlreiche Berichte über eher exotische Manifestationsorte, wie beispielsweise ein durch Burkholderia pseudomallei verursachtes mykotisches Aortenaneurysma (Steinmetz et al. 1996). Wie die akute Form der Melioidose kann auch die subakute Form lokalisiert oder disseminiert auftreten. Neben asymptomatischen Verlaufsformen sind Fieber, Gewichtsverlust und allgemeine Schwäche typische Symptome bei subakuter Melioidose. Schrifttum 21 Charakteristisch sind weiterhin multiple Abszesse in Haut, Knochenmark, Lymphknoten, Leber und Milz sowie bei Infektionen des Urogenitaltraktes eine Manifestation als Zystitis, Pyelonephritis oder Prostatitis (Dance 1990). Weiterhin wurden Fälle der Ausbreitung des Erregers im zentralen Nervensystem beobachtet, wobei es bei den betroffenen Patienten entweder zu makroskopischen Abszessen oder zu einer Enzephalitis mit entsprechenden neurologischen Ausfallserscheinungen kam (Currie et al. 2000b). Eine charakteristische und fast nur bei Kindern vorkommende Sonderform der subakuten Form der Melioidose sind eitrige Parotitiden, die mit meist unilateraler Abszessbildung einhergehen (Dance et al. 1989a). Ohne Therapie und in fortgeschrittenen Stadien können die Erreger aus Blut, Urin, Eiter sowie anderen Sekreten und Geweben isoliert und kultiviert werden (Walsh & Wuthiekanun 1996). Neben der subakuten Form ist aber vor allem die chronische Form der Melioidose von Bedeutung. Aufgrund der Rückzugsmöglichkeiten des Erregers in den intrazellulären Raum von Makrophagen und Epithelzellen, wo er Monate bis Jahre überleben kann, kommt es häufig nach Infektion oder überstandener Erkrankung zu Rezidiven (Currie et al. 2000a). Dieser Eigenschaft von Burkholderia pseudomallei verdankt die Erkrankung auch den Namen „Vietnam-time-bomb disease“ (Goshorn 1987), welcher aufgrund der erst später auftretenden Melioidosefälle bei Vietnamkriegsveteranen geprägt wurde. Trotz dieser Vielzahl von zum Teil schwersten Manifestationsformen und des besonders in unbehandelten Fällen oft tödlichen Verlaufs der Melioidose darf dennoch nicht vergessen werden, dass es sich bei Burkholderia pseudomallei im Grunde um einen opportunistischen Erreger handelt. So wird vor allem aus serologischen Studien in Endemiegebieten deutlich, dass subklinische und chronische Infektionen vorherrschend sind (Kanaphun et al. 1993). Die Therapie der Melioidose ist langwierig und schwierig sowie bei zu kurzer Therapiedauer von Rezidiven gekennzeichnet. Burkholderia pseudomallei besitzt eine intrinsische Resistenz gegen Penicillin, Cephalosporine der ersten beiden Generationen, Makrolide und Aminoglycoside. Des Weiteren bilden sich unter einer antibiotischen Therapie oft Resistenzen gegen Chloramphenicol, Doxycyclin und Cotrimazol aus (Dance et al. 1989b; Jenney et al. 2001). Nach einer klinischen Studie von White, bei der die Mortalität mit Ceftazidim um 50% gesenkt werden konnte, ist dies heute das Mittel der Wahl in der Behandlung von Melioidose (White Schrifttum 22 et al. 1989). Dabei wird jede systemische Infektion über mindestens 10 Tage mit Ceftazidim (3 x 40 mg/kg parenteral) hochdosiert behandelt. Alternativ stehen Imipenem (3 x 20 mg/kg) oder Meropenem zur Verfügung (Simpson et al. 1999). Die Kombination aus Amoxicillin und Clavulansäure (6 x 27 mg/kg) resultiert in gleich hoher Mortalität, aber höherer Rate an Therapieversagen (Suputtamongkol et al. 1994b). Im Anschluss an die parenterale Therapie folgt eine 20-wöchige orale Behandlung mit der Viererkombination Chloramphenicol (4 x 10 mg/kg), Doxycyclin (2 x 2 mg/kg), Trimethoprim (2 x 5 mg/kg) und Sulfamethoxazol (2 x 25 mg/kg). Hierbei wird Chloramphenicol nur die ersten acht Wochen verabreicht. Zusätzlich sind allgemeine Maßnahmen wie Rehydrierung zur Behandlung eines septischen Schocks, Ausräumung von Abszessen etc., durchzuführen. 2.5. Melioidose: Krankheitsbild bei Tieren Obwohl Melioidose bei Tieren weniger gut untersucht ist als beim Menschen, gibt es doch zahlreiche Berichte über Burkholderia pseudomallei-Infektionen bei den verschiedensten Tierarten wie Nagern, Kaninchen, Sika Wild, Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, Schweinen, Ziegen, Schafen und Kamelen (Bergin & Torenbeeck 1991; Radostis 1997; Sheikh-Omar & Muda 1986). Aber nicht nur bei Säugetieren, sondern auch bei Vögeln, Fischen und Krokodilen konnte der Erreger nachgewiesen werden (Choy et al. 2000). Aufsehen erregt hat vor allem der Fall eines mit Burkholderia pseudomallei infizierten Pandabären im Pariser Zoo, der als Geschenk von Mao Zedong an den französischen Präsidenten Pompidou Ausgangspunkt einer epidemischen Melioidose war und den Tierbestand des Zoos drastisch reduzierte (White 2003). Die Suszeptibilität der verschiedenen Säugerspezies scheint durchaus unterschiedlich zu sein. So gelten Schafe, Ziegen und Kamele beispielsweise als deutlich empfänglicher als Hunde und Katzen (Choy et al. 2000). Auch die klinische Symptomatik ist von Spezies zu Spezies verschieden. So zeigen erkrankte Schafe vor allem Schwäche und Festliegen; sie versterben in der Regel innerhalb einer Woche. Experimentell infizierte Schafe reagierten mit schwerem Fieber in Verbindung mit Anorexie, Lahmheit und exsudativem Nasen- und Augenausfluss. Schrifttum Einige Tiere 23 zeigten auch schwere neurologische Störungen mit Manegebewegungen, Nystagmus, Blindheit, Hyperästhesie und milden tetanischen Konvulsionen. Die Erkrankung endet in der Regel tödlich. Von einer Beteiligung der Haut wurde jedoch nicht berichtet. Ziegen zeigen bei akuter Melioidose eine ähnliche klinische Symptomatik wie Schafe. Generell nimmt hier die Erkrankung aber einen eher chronischen Verlauf. Im Schwein steht die chronische Infektion mit einer Manifestation als zervikale Lymphadenitis im Vordergrund. Bei einigen Ausbrüchen waren aber auch Symptome ähnlich denen anderer Spezies zu finden. Bei solchen Ausbrüchen traten weiterhin leichte Paresen der Hinterhand, mildes Fieber, Husten, Nasen- und Augenausfluss, Anorexie, Aborte sowie einige Todesfälle auf. Pferde dagegen entwickeln oft eine akute Pneumonie, die mit hohem Fieber einhergeht. Auch Kolik, Diarrhöe und Lymphangitis der Beine können auftreten. Auch ein Fall akuter Meningoencephalitis beim Pferd wurde beschrieben (Ladds et al. 1981). Charakteristisch in allen betroffenen Spezies sind multiple Abszesse vor allem in Lunge, Leber, Milz sowie in der Unterhaut (außer beim Schaf) und deren assoziierten Lymphknoten (Radostis 1997). Auch bei Tieren wird eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei aus der Umwelt akquiriert. Der Erreger wird durch Inhalation, Ingestion oder in Assoziation mit Hautwunden über kontaminierte Stäube und Wasser aufgenommen (Thomas et al. 1988a). Ähnlich der Epidemiologie beim Menschen treten auch bei Tieren Fälle von Melioidose hauptsächlich während der Regenzeit auf (Thomas 1981). Anders als bei Burkholderia mallei sind für Burkholderia pseudomallei nur wenige Fälle möglicher Zoonosen beschrieben, dabei handelt es sich um das Auftreten von Ulzerationen oder Abszessen in der Haut bei exponierten Berufsgruppen, wie einem Schlachter, einem Tierarzt und einem Landwirt (Choy et al. 2000). Wenn auch höchst zweifelhaft ist, ob eine zoonotische Übertragung vom Tier auf den Menschen möglich ist, so stellen doch die Tiere ein großes Reservoir für Burkholderia pseudomallei dar. Des Weiteren ist eine Übertragung auf den Menschen über kontaminierte Rohmilch denkbar, da Burkholderia pseudomallei aus Milch an Mastitiden erkrankter Kühe und Ziegen isoliert werden konnte (Mustaffa Babjee & Nor Aidah 1994). Daher wäre in Endemiegebieten eine Pasteurisierung der Milch unbedingt zu empfehlen. Schrifttum 24 Die Therapie von an Melioidose erkrankten Tieren ist oft teuer, langwierig und von zweifelhaftem Erfolg. Für landwirtschaftliche Nutztiere empfehlen sich daher eher Präventionsmaßnahmen wie das Fernhalten der Herden von kontaminierten Weiden und Schlamm sowie eine Haltung auf befestigten Böden. Auch der Zusatz von Chlor zum Trinkwasser hat sich als effektive Präventions- und Kontrollmaßnahme erwiesen (Thomas 1991). Bei Liebhabertieren wie Hunden und Katzen mag eine mit hohen Kosten verbundene intensive Therapie sinnvoll sein. Hierbei kann nach den aus der Humanmedizin empfohlenen Therapieregimen mit Einsatz von Ceftazidim und Carbapenemen entsprechend behandelt werden (Choy et al. 2000). 2.6. Murine Burkholderia pseudomallei Infektionsmodelle Eine Burkholderia pseudomallei Infektion kann wie bereits beschrieben eine Vielzahl unterschiedlicher Verlaufsformen haben, wie das äußerst heterogene klinische Bild zeigt. Dabei scheint der Verlauf der Infektion nicht nur von der Infektionsroute und der jeweiligen Pathogenität des Stammes abhängig zu sein, sondern auch von der Abwehrlage im Wirtsorganismus, wobei Grunderkrankungen das Risiko einer klinischen Melioidose erhöhen, aber nicht Voraussetzung sind (Brett & Woods 2000). Es ist unbekannt, warum manche Menschen eine chronische, andere eine akute und wieder andere nur eine subklinische Form der Melioidose entwickeln. Um die Pathogenese der Erkrankung und die Mechanismen der angeborenen Immunität zu untersuchen, wird daher im Tiermodell mit zwei Inzuchtmausstämmen mit unterschiedlicher Empfänglichkeit gegenüber Burkholderia pseudomallei gearbeitet. Es wurde gezeigt, dass BALB/c-Mäuse hochempfänglich und C57Bl/6-Mäuse relativ resistent gegenüber Infektionen mit virulenten Burkholderia pseudomallei Stämmen sind und somit als Modell für chronische und akute Melioidose eingesetzt werden können (Leakey et al. 1998). Nach einer intravenösen Infektion mit nur 37 Keimen zeigten BALB/c-Mäuse starkes bakterielles Wachstum in Leber und Milz, gefolgt von einer fulminanten Bakteriämie und dem Tod der Tiere innerhalb von 72 bis 96 Stunden post infektionem. C57Bl/6-Mäuse dagegen entwickelten keine Bakteriämie, auch wenn die Tiere bakterielles Wachstum in Leber und Milz zeigten und schließlich Schrifttum 25 ebenfalls verstarben (Leakey et al. 1998). Anhand von Keimzahlbestimmungen in Leber, Lunge und Milz konnten schon 24 Stunden nach einer Infektion signifikante Unterschiede zwischen C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen festgestellt werden (Hoppe et al. 1999). Eine intravenöse Infektion ist zwar ein guter Weg, eine systemische Melioidose zu simulieren, doch der erste Kontakt mit einem Pathogen findet oft über die Schleimhäute statt. Deshalb wurde ein intranasales Infektionsmodell etabliert, das primär zu einer Pneumonie mit anschließender Streuung der Keime in andere Organe führt. Dieses trägt eher zum Verständnis einer mukosalen Immunität bei (Liu et al. 2002). Auch in diesem Infektionsmodell konnte gezeigt werden, dass C57Bl/6-Mäuse etwa 100-mal resistenter gegenüber der Infektion waren als BALB/cMäuse. Auch hier waren deutliche Unterschiede in den Keimzahlen der verschiedenen Organe zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwischen 24 und 72 Stunden nachweisbar (Liu et al. 2002). Die unterschiedliche Fähigkeit der Mausstämme, auch schon zu sehr frühen Zeitpunkten die Infektion zu bekämpfen, weist auf eine entscheidende Bedeutung angeborener Immunmechanismen für die Resistenz gegenüber Burkholderia pseudomallei hin. Das Phänomen der unterschiedlichen Suszeptibilität dieser beiden Mausstämme wurde auch bei diversen anderen Erregern für Studien der Wirtsabwehr genutzt. Dabei ist eine erhöhte Resistenz von C57Bl/6- im Vergleich zu BALB/c-Mäusen nicht generell bei Infektionen mit gram-negativen Erregern vorhanden. Der C57Bl/6-Stamm ist deutlich resistenter gegenüber Yersinia enterocolitica (Hancock et al. 1986), Trypanosoma congolense (Tabel et al. 2000), Brucella abortus (Ho & Cheers 1982) und, wie oben beschrieben, Burkholderia pseudomallei (Leakey et al. 1998). BALB/c-Mäuse dagegen zeigen im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen eine größere Resistenz gegenüber Toxoplasma gondii (Johnson 1984), Pseudomonas aeruginosa (Morissette et al. 1995) und Helicobacter felis (Mohammadi et al. 1996). Für einige Pathogene wie Mycobacterium bovis, Salmonella Typhimurium und Listeria Spezies konnte der Grund einer relativen Resistenz bereits mit dem Vorhandensein des Ity/Lsh/Bcg Lokus auf Chromosom 1 in Verbindung gebracht werden (Vidal et al. 1995). Dieser ist verantwortlich für die Expression von Nramp 1, Schrifttum 26 einer Zink-Metalloprotease, die als Transporter in der Membran von Phagosomen dient (Skamene et al. 1998). Da jedoch sowohl C57Bl/6- wie auch BALB/c-Mäuse einen ItyS Genotyp besitzen und somit Nramp 1-defizient sind, scheidet dieser spezielle Mechanismus als Erklärung für den Unterschied in der Empfänglichkeit gegenüber einer Burkholderia pseudomallei-Infektion aus (Hoppe et al. 1999). Wahrscheinlicher ist, dass dieser auf einer komplexen Regulation verschiedener Gene beruht, da Tiere der F1-Generation aus Verpaarung von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen eine intermediäre Empfänglichkeit besitzen (Leakey et al. 1998). Ein Schlüssel zum Verständnis immunologischer Vorgänge bei der Bekämpfung einer Infektion ist die Messung verschiedener Cytokine sowie Immunglobulinspiegel unter Infektionsbedingungen. So konnte beispielsweise bei Leishmaniose gezeigt werden, dass bei C57Bl/6-Mäusen eine stärkere zellvermittelte Immunabwehr induziert wird, während bei BALB/c-Mäusen eher eine humorale Abwehr stattfindet. Bei Messung verschiedener Cytokine 24 bis 36 Stunden nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei zeigten beide Mausstämme eine Erhöhung von IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12, was keine eindeutige Polarisierung zu einem Th1- oder Th2-Profil zulässt (Ulett et al. 2000a). In einer anderen Studie konnte im Serum systemisch infizierter C57Bl/6-Mäuse ein hoher IgG2a-Spiegel gemessen werden, der vor allem bei einer Th1-Antwort und durch IFNγ induziert wird. Bei BALB/c-Mäusen wurde dagegen vor allem IgG1 nachgewiesen, dessen Produktion durch IL-4 stimuliert wird und welches als typisches Cytokin bei einer Th2-Antwort ausgeschüttet wird (Hoppe et al. 1999). Bei Experimenten mit Yersinia enterocolitica wurde festgestellt, dass T-Zellen aus der Milz der resistenten C57Bl/6-Mäuse nach Infektion mit hitzeinaktivierten Yersinien signifikant höhere Mengen IFNγ produzieren als T-Zellen von BALB/c-Mäusen (Autenrieth et al. 1994). T-Zellen, die der Milz von infizierten C57Bl/c-Mäusen entnommen wurden, waren in der Lage, eine Protektion gegenüber sonst letalen Yersinieninfektionen zu vermitteln, während T-Zellen infizierter BALB/c-Mäuse dazu nicht in der Lage waren. Des Weiteren konnte die Resistenz von BALB/c-Mäusen durch Substitution von rekombinantem IFNγ wie auch durch Behandlung mit anti-IL-4 Antikörpern gesteigert werden (Autenrieth et al. 1994). Auch bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei konnte für IFNγ eine obligate Schrifttum 27 Rolle beim Überleben einer Infektion nachgewiesen werden. Durch eine Hemmung von IFNγ in Taylor-Outbred-Mäusen konnte eine erhebliche Steigerung der Empfänglichkeit induziert werden. Auch die Hemmung von IL-12, einem Stimulans der Produktion von IFNγ und TNFα, führte zu einer erhöhten Empfindlichkeit (Santanirand et al. 1999). In einer anderen Studie konnte an Milzzellen von µMT-Mäusen belegt werden, dass große Mengen IFNγ bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei freigesetzt wurden. Als IFNγ Produzenten wurden neben Natürlichen Killerzellen überraschender Weise auch CD8+ T-Zellen identifiziert (Lertmemongkolchai et al. 2001). Im Vergleich der IFNγ Produktion bei C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen zeigte sich jedoch, dass gerade die hochempfänglichen BALB/c-Mäuse größere Mengen IFNγ mRNA besitzen als C57Bl/6-Mäuse. Dieses Phänomen kann möglicherweise mit der Induktion eines toxischen Schocks in Verbindung gebracht werden, und so den akuten Verlauf der Melioidose in BALB/c-Mäusen erklären. (Ulett et al. 2000a). 2.7. Antikörper-vermittelte Immunität bei experimenteller Melioidose Es stellt sich nun die Frage, was Antikörper gegen einen Organismus ausrichten können, der so gut an das intrazelluläre Leben adaptiert ist wie Burkholderia pseudomallei. Die klassische Vorstellung, dass antikörper-vermittelte Immunität vor extrazellulären Erregern und zellvermittelte Immunität vor intrazellulären Erregern schützen, ist aber schon seit langem ins Wanken geraten. Für die verschiedensten intrazellulären Erreger konnte gezeigt werden, dass Antikörper den Verlauf der Infektion zugunsten des Wirtes beeinflussen konnten. Darunter sind Cryptococcus neoformans (Dromer et al. 1987), Listeria monozytogenes (Edelson et al. 1999) und Toxoplasma gondii (Kang et al. 2000), sowie noch einige mehr. Der Erfolg einer Protektion hängt aber von verschiedenen Faktoren ab. Spezifische Antikörper sind in der Lage, durch Komplementaktivierung entzündungsfördernd zu wirken. So werden die Faktoren C3a und C5a aktiviert, die stark chemotaktisch wirken und eine Verbindung zwischen angeborener und erworbener Immunität herstellen (Hogarth 2002). Durch Opsonisierung werden die Phagozytose und die Antigenpräsentation Schrifttum 28 verbessert. Somit sind Antikörper auch in der Lage, die zelluläre Immunität zu beeinflussen. Gleichzeitig kommt es zu einer Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptoren, wodurch Signalkaskaden aktiviert werden, die Cytokin- und NO-Freisetzung beeinflussen. Dabei kann eine Kreuzvernetzung der Rezeptoren auf Leukozyten entweder zu einer Inhibition oder Stimulation der Entzündungsprozesse führen, abhängig von der Aktivierung inhibierender oder stimulierender Fc-Rezeptoren (Casadevall & Pirofski 2003). Für den Erfolg einer Protektion ist auch die Antikörpermenge entscheidend. Für Listeria monozytogenes (Edelson et al. 1999) und Cryptococcus neoformans (Dromer et al. 1987) konnte gezeigt werden, dass eine bestimmte Mindestmenge des Antikörpers für eine Protektion notwendig ist. Zu große Mengen Antikörper zeigten einen schlechteren Schutz gegen die Infektion mit Cryptococcus neoformans. Es wird spekuliert, dass zu große Mengen Antikörper mit Wirtsfaktoren für die intrazelluläre bakterizide Aktivität interferieren oder die Zytokinantwort für den Wirt nachteilig beeinflusst wird (Taborda et al. 2003). Weiterhin spielen Affinität, Spezifität, Isotyp und Idiotyp des Antikörpers, sowie genetischer Hintergrund und Immunkompetenz des Wirtes eine wichtige Rolle bei der Protektion (Casadevall 2003). Auch für Burkholderia pseudomallei wurde in verschiedenen passiven Immunisierungsversuchen eine Protektion durch Antikörper beschrieben. So waren beispielsweise polyklonale Seren gegen LPS und Flagellin in einem Tiermodell an diabetischen Ratten protektiv (Brett & Woods 1996). Im Mausmodell an BALB/c-Mäusen zeigten monoklonale Antikörper gegen LPS, Flagellin und EPS bei niedrigen Infektionsdosen ebenfalls einen protektiven Effekt. Bei höheren Infektionsdosen waren dagegen nur die anti-EPS Antikörper protektiv (Jones et al. 2002). Die protektive Wirkung von verschiedenen IgG-Subklassen eines gegen EPS gerichteten Antikörpers nach systemischer und intranasaler Infektion konnte auch im Rahmen zweier Dissertationen gezeigt werden (Breitbach 2004; Hoppe I 1998). Die Induktion einer aktiven Immunität nach Burkholderia pseudomallei-Infektionen ist ebenfalls beschrieben worden. So wurden BALB/c-Mäuse virulenzattenuierten Transposonmutanten, deren Defekt in der Azetolaktat Synthase lag, ausgesetzt und fünf Wochen später mit dem entsprechenden Wildtyp infiziert. Die so aktiv Schrifttum 29 immunisierten Tiere überlebten die Infektion zu 80 -100%, während alle Kontrolltiere verstarben (Atkins et al. 2002). Bei C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen, die zunächst mit einem niedrigvirulenten Stamm von Burkholderia pseudomallei und zwei Wochen später mit einem hochvirulenten Stamm infiziert wurden, konnte ebenso eine geringere Mortalität im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden (Ulett et al. 2002). Dieses weist auf die Möglichkeit der Kreuzreaktivität verschiedener Stämme hin. 2.8. Bedeutung von Fc-Rezeptoren bei der Antikörper-vermittelten Immunität Fc-Rezeptoren sind die Verbindung der antikörper-vermittelten Immunantwort mit zellulären Effektorfunktionen. Für alle Isotypen existieren spezifische Fc-Rezeptoren, die die jeweiligen Immunglobuline an ihren Fc-Teilen erkennen. Sie werden auf allen Zellen des Immunsystems exprimiert. Eine Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptoren auf der Zelle induziert eine Vielzahl intrazellulärer Funktionen, die eine Modulation der Immunantwort bewirken. So sind Fc-Rezeptoren beteiligt an der Phagozytose von Makrophagen, der Antikörper-vermittelten Zytotoxizität von Natürlichen Killerzellen und der Aktivierung von Neutrophilen Granulozyten. Für IgG sind drei verschiedene Klassen von Fc-Rezeptoren beschrieben, die sich in ihrer Affinität für die verschiedenen Subklassen von IgG unterscheiden. Sie weisen speziesspezifisch noch verschiedene Untergruppen auf, die sowohl aktivierende wie auch inhibierende Signale an die jeweiligen Zellen weitergeben. Fcγ-Rezeptoren gehören zu Immunglobulin-Supergen-Familie und bestehen aus oligomeren Komplexen mit verschiedenen oligomeren Untereinheiten, die in Verbindung mit γ und ζ Ketten assoziiert sind. Diese Ketten sind Homo- oder Heterodimere und geben Signale über konservierte zytoplasmatische Tyrosinmotive weiter (Tyrosinebased Activation Motives = ITAM). Die γ-Kette ist dabei außerdem essenziell für die intrazelluläre Zusammenlagerung des Rezeptors und seiner Expression auf der Zelloberfläche. Schrifttum 30 Die Signaltransduktion erfolgt dabei über eine Phosphorylierung des Tyrosins in ITAM infolge einer Kreuzvernetzung der Rezeptoren auf der Zelloberfläche. So wird eine Bindungsstelle für die N-terminale SH2-Domäne des zytoplasmatischen Enzyms Syk, einem Mitglied der Scr-Familie geschaffen. Über die C-terminal gelegene Domäne von Syk können nun weitere Signalproteine aktiviert werden. Dazu gehören zum Beispiel die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3), die zur Produktion von Phosphatidyl Insositol 3-Phosphat (PIP 3) führt. PIP 3 rekrutiert anschließend PH-Domänen enthaltene Moleküle wie Phospholipase Cγ (PLCγ) und Tec-Kinasen, zum Beispiel Bruton´s Tyrosin Kinase (Btk). Die Aktivierung von PLCγ induziert die Bildung von Insositol 3 Phosphat (IP3), Diacylglycerin (DAG) und unterstützt so die Kalziummobilisierung in der Zelle (Ravetch & Bolland 2001). Des Weiteren bestehen Hinweise auf eine Verbindung der Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptor I und II mit der Aktivierung von NF-κB in humanen Monozyten (Drechsler et al. 2002). Abb. 1 Zelluläre Aktivierung durch Fcγ-Rezeptor III Aggregation. Beispiel eines möglichen Signaltransduktionswegs über die FcR ITAM Phosphorylierung (Ravetch und Bolland 2001). Im Folgenden werden nur die Subklassen muriner Fcγ-Rezeptoren beschrieben, da in dieser Studie ausschließlich mit murinen Zellen gearbeitet wurde. Der Fcγ- Schrifttum 31 Rezeptor I (FcγRI) ist ein hochaffiner Rezeptor, der mit zwei γ-Ketten assoziiert ist, und in erster Linie auf Makrophagen zufinden ist. Dabei bindet er IgG2a mit viel höherer Affinität als IgG1, IgG2b und IgG3. Ihm wird vor allem die Phagozytose und Induktion der Antikörper-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) zugeschrieben. Der murine Fcγ-Rezeptor III (FcγRIII) bindet Antikörper mit niedrigerer Affinität als FcγRI, wobei er IgG1, IgG2a und IgG2b gleichermaßen gut bindet, IgG3 aber mit niedrigerer Affinität. Er ist ebenfalls mit zwei γ-Ketten assoziiert und besitzt des Weiteren eine β-Kette sowie eine γζ-Kette und kommt vor allem auf Makrophagen, Mastzellen, Neutrophilen- und Eosinophilen Granulozyten, Natürlichen Killerzellen sowie γδ T-Zellen vor. Er ist beteiligt an Antigenpräsentation, Phagozytose, ADCC, Degranulation von Mastzellen und Mediatorfreisetzung. Der murine Fcγ-Rezeptor II (FcγRII) ist im Gegensatz zu Fcγ-Rezeptor I und III ein Monomer und entspricht in Funktion und Aufbau dem humanen FcγRIIB, der auch bei der Maus in zwei Untergruppen (1 und 2) unterteilt ist. Die Untergruppe 1 kommt vor allem auf B- und T-Zellen vor und vermittelt eine negative Regulation der B-Zellund Mastzellaktivierung sowie Induktion der Apoptose. Die Untereinheit 2 kommt hauptsächlich auf Makrophagen vor und vermittelt Endozytose und Antigenpräsentation, außerdem gibt es Hinweise auf die Vermittlung von Phagozytose opsonisierter Partikel. IgG1, IgG2a und IgG2b werden von diesen Rezeptoren mit gleicher Affinität erkannt, während IgG3 schlechter gebunden wird. FcγRII unterscheidet sich von den anderen beiden Rezeptoren durch zwei Besonderheiten. Zum einen besitzt er keine γ-Kette und zum anderen kein aktivierendes, sondern ein inhibierendes Tyrosinmotiv (Tyrosin-based Inhibition Motive = ITIM) (Gessner et al. 1998). Die Signaltransduktion über ITIM unterscheidet sich von der durch ITAM insofern, als dass nach einer Phosphorylierung des Tyrosins nicht die SH2-Domäne von Syk, sondern das inhibitorische Signaltransduktionsmolekül SHIP (Insositol Polyphosphat 5 -Phosphatase) gebunden wird. Aktiviertes SHIP hydrolysiert PIP3 und bewirkt die Dissoziation von PH-Domänen enthaltener Proteine wie PLCγ und Btk. Durch diesen Mechanismus werden die Freisetzung sowie der Influx von Kalzium in die Zelle verhindert, der aufgrund der Stimulation von ITAM induziert wurde. Darüber hinaus führt eine Phosphorylierung von FcγRIIB zum Abbruch B-Zell-Rezeptor vermittelter Proliferation, die vermutlich durch eine Störung der Aktivierung von MAP-Kinasen induziert wird sowie einer Verhinderung der Rekrutierung der antiapoptotischen Schrifttum 32 Kinase Akt. FcγRIIB übernimmt somit eine negative Kontrolle der Zellaktivierung (Ravetch & Bolland 2001). Abb. 2 Signaltransduktion durch Coligation des BCR-FcγRII. Die zelluläre Aktivierung wird durch die Rekrutierung der Inositol Phosphatase SHIP an das FcγRIIB ITIM inhibiert (Ravetch und Bolland 2001). Bislang war in der Maus kein Rezeptor für IgA bekannt, da der im Menschen vorhandene Fcα-Rezeptor (CD 89) kein Homolog in der Maus besitzt. Kürzlich konnte jedoch in der Maus ein Fc-Rezeptor beschrieben werden, der monomeres und polymeres IgA sowie IgM bindet. Ein Homolog dieses als Fcµ/α-Rezeptor bezeichneten Rezeptors wurde auch im Menschen gefunden (Shibuya et al. 2000). Offenbar besitzt er nur eine Immunglobulin-assoziierte-Domäne, ist aber trotzdem in der Lage, Antikörper hochaffin zu binden. Dieser Rezeptor wurde auf B-Zellen und Makrophagen, jedoch nicht auf Granulozyten, T-Zellen und Natürlichen Killerzellen aus der Milz gefunden. IgM-vermittelte Phagozytose konnte für den Fcµ/α-Rezeptor mit IgM in B-Zellen nachgewiesen werden und eine Induktion der Antigenpräsentation wird vermutet (Shibuya et al. 2000). Die Funktionen dieses Rezeptors in Makropagen sowie die Mechanismen seiner Signaltransduktion konnten bislang jedoch nicht geklärt werden. Schrifttum 33 2.9. Zielsetzung der Arbeit Die Mechanismen und Immunglobulinklassen die bei protektive der Abwehr Bedeutung der bakterieller unterschiedlichen Infektionen des Respirationstraktes sind noch wenig untersucht. Vor Beginn dieser Arbeit gab es erste experimentelle Hinweise, dass eine protektive Funktion bei Infektionen des Respirationstraktes mit Burkholderia pseudomallei durch verschiedene monoklonale Antikörper besteht. Ziel dieses Projektes war es, am Beispiel der Infektion mit dem fakultativ intrazellulären Erreger Burkholderia pseudomallei, die Rolle von IgA und IgG mit Spezifität für EPS hinsichtlich ihrer protektiven Bedeutung und der verwendeten Mechanismen vergleichend zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollte in einem murinen Burkholderia pseudomallei-Pneumoniemodell mit unterschiedlich empfänglichen Mausstämmen in vivo die Bedeutung der Antikörper-vermittelten mukosalen Abwehr durch passive Immunisierung des oberen und unteren Respirationstraktes mit Anti-EPS IgG- und IgA-Isotyp-Switch-Varianten untersucht werden. Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der Mechanismen der Antikörpervermittelten Immunität von Burkholderia pseudomallei sowie die Untersuchung der Bedeutung von Effektormolekülen der intrazellulären bakteriziden Aktivität. Dazu sollten zur Klärung der Bedeutung der Fc-Rezeptoren Fcγ-Ketten defiziente Mäuse (Fcγ-chain-Knock-out) eingesetzt werden; Mäuse mit Defekten der induzierbaren NO-Synthase (iNOS Knock-out) und der NAHPH-Oxidase (p47phox Knock-out) sollten zur Untersuchung der Bedeutung intrazellulärer bakterizider Effektorfunktionen zum Einsatz kommen. In diesen Modellen sollte die Bedeutung von NO und Sauerstoffradikalen (ROI) für eine Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo im Pneumoniemodell und in vitro anhand von Knochenmarkmakrophagen geklärt werden. Material und Methoden 34 3. Material und Methoden 3.1. Bakterien 3.1.1. Bakterienstämme Burkholderia pseudomallei In allen Versuchen mit Burkholderia pseudomallei wurde der Stamm Wildtyp E8 verwendet. Dabei handelt es sich um ein Umweltisolat aus Ubon Ratchatani, Thailand. Dieser Stamm wächst auf Columbia Platten innerhalb von 24 Stunden zu ca. 2 mm großen weißen bis grauen rauen Kolonien heran. Für weitere Versuche wurden folgende Bakterien verwendet: Salmonella Typhimurium Typ 331, ATCC 14028 Pseudomonas aeruginosa PAO I: Wundisolat (DSM 1707) 3.1.2. Einfrieren und Auftauen von Bakterien Zur Herstellung eines in der Keimzahl bestimmten Bakterienstocks wurden Bakterien auf Columbia Platten angeimpft und für 24 Stunden bei 37 °C bebrütet. In mit 10% Glycerin versetztem LB-Medium wurde eine hochkonzentrierte Bakteriensuspension hergestellt, in 0,5 ml Reagiergefäßen á 50 µl aliquotiert und bei -70 °C eingefroren. Zur Bestimmung der Keimzahl wurden mehrere Aliquots aufgetaut und Verdünnungsreihen hergestellt. Von verschiedenen Verdünnungsstufen wurden je 100 µl auf Columbia Platten ausplattiert und nach 24-48 Stunden Bebrütung die Koloniezahl bestimmt. 3.1.3. Anzucht von Bakterien Die in den in vitro-Experimenten verwendeten Bakterien wurden aus dem oben genannten Stock aufgetaut und mittels Platinöse auf Columbia Platten überimpft und bei 37 °C für 24 Stunden bebrütet. Diese Platte wurde bei 4 °C mit Parafilm abgedichtet gelagert und von ihr wiederum Bakterien für weitere Versuche auf Columbia Platten abgeimpft und 24 Stunden bei 37 °C bebrütet. Für die Infektionen in vivo wurden Bakterien aus dem Stock aufgetaut und die gewünschte Infektionsdosis durch Verdünnung in PBS hergestellt. Material und Methoden 35 3.1.4. Bestimmung der Keimzahl mittels Colony Forming Units (CFU) Zur Bestimmung der Keimzahl bei in vivo- und in vitro-Experimenten wurden jeweils 100 µl verschiedener Verdünnungsstufen der Probe in Doppelwerten auf Columbia Platten (für die Bestimmung der Infektionsdosis des Bakterienstocks und von Dosiskontrollen), Müller-Hinton Agar-Platten (Keimzahlbestimmung in Makrophagenassays) oder Ashdown Agar-Platten (Keimzahlbestimmung der in vivoVersuche) ausplattiert. Die Platten wurden 24-48 Stunden bei 37 °C bebrütet und die Koloniezahl bestimmt. Aus Platten der gleichen Verdünnungsstufe wurde das arithmetische Mittel der gezählten Kolonien gebildet und mit dem jeweiligen Verdünnungsfaktor multipliziert. Die absolute Keimzahl wurde durch die Bildung des arithmetischen Mittels der so bestimmten Werte verschiedener Verdünnungsstufen ermittelt. 3.2. Mausmodelle 3.2.1. Rechtliche Grundlagen Die Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche wurde gemäß der geltenden gesetzlichen Bestimmungen von der zuständigen Behörde erteilt und das Versuchvorhaben unter dem Aktenzeichen 509c-42502-99/219 genehmigt. Die Versuche wurden mit Beteiligung von Frau Jessika Garlisch durchgeführt. Vor Beginn der Versuche erfolgte der Nachweis der Sachkunde durch die Teilnahme an einem 40-stündigen Kurs in Versuchstierkunde gemäß den Empfehlungen der FELASA und der GV-SOLAS für die Aus- und Weiterbildung von Personen, die an der Durchführung von Tierversuchen beteiligt sind (Kategorie B – FELASA). Der Kurs wurde vom Institut für Tierschutz und Verhalten der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Material und Methoden 36 3.2.2. Mausstämme Die in dieser Studie verwendeten Mäuse waren weiblich und zwischen 8 und 10 Wochen alt. C57Bl/6 (H-2b Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp) BALB/c (H-2d Haplotyp, Bcg/Tty/Lshs Phänotyp) 129.Sv Imj Die Inzuchtstämme C57Bl/6 und BALB/c wurden von der Firma Charles River Wiga (Sulzfeld) bezogen. Die Tiere des Stammes 129.Sv Imj stellte freundlicherweise die Arbeitsgruppe Gaestel, Institut für Molekularbiologie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung. B6.129P2-Nos2tm1Lau: iNOS-Knock-out B6.129S2-Ncf1tm1shlN14: p47phox-Knock-out B6,129Fcerg1tm1-Fcgr2tm1: Fc-Rezeptor γ-chain/Fc-Rezeptor IIKnock-out Die iNOS-Knock-out Tiere wurden von der Firma Jackson Laboratories, Bar Habour, USA bezogen. Die Knock-out-Stämme p47phox-Knock-out und Fc-Rezeptor γ-chain/Fc-Rezeptor IIKnock-out wurden von der Firma Taconic M & B, Bomholdvej, Dänemark bezogen. Die Fc-Rezeptor γ-chain Knock-out: Fcγ-chain-Knock-out Fcγ-chain-Knock-out Mäuse stellte freundlicherweise die Arbeitsgruppe Gessner, Abteilung für Klinische Immunologie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfügung. Material und Methoden 37 3.2.3. Haltung und Fütterung Die Tiere wurden in Gruppen von maximal 10 Tieren in Makrolonkäfigen Typ III (337 x 215 x 150 mm) bzw. in Gruppen von maximal 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ II (222 x 162 x 144 mm) auf staubfreien Weichholzspänen gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22 +/- 2 °C und die relative Luftfeuchtigkeit betrug 55 +/-5 %. Futter (Haltungsfutter- Ratten/Mäuse von Altromin 1324) und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Tiere waren frei von kontagiösen Ektoparasiten und Endoparasiten, seronegativ gegenüber diversen murinen Viren und spezifischen Pathogenen sowie frei von primären Mauspathogenen. 3.2.4. Narkose Für intranasale und intratracheale Infektionen wurden die Tiere mit einer Kombination aus Xylazin (Rompun® Bayer) und Ketamin (Gräub) durch intraperitoneale Injektion narkotisiert. Für intranasale Infektionen betrug die Dosis 5,56 mg/kg Xylazin und 55,5 mg/kg Ketamin in einem Volumen von 100 µl PBS. Die Dosis bei intratrachealer Infektion betrug 8,33 mg/kg Xylazin und 83,34 mg/kg Ketamin in einem Volumen von 150 µl PBS. Während der Dauer der Narkose erfolgte eine regelmäßige Überwachung der Atmung. Material und Methoden 38 3.3. Zellkultur 3.3.1. Präparation von Knochenmarkstammzellen aus der Maus Zur Präparation von Stammzellen aus dem Knochenmark wurden Tiere der verschiedenen Mausstämme im Alter von 8 -18 Wochen verwendet. Die Tötung der Mäuse erfolgte durch Genickbruch. Vor der Präparation wurden die Tiere mit 70% Ethanol besprüht. Unter sterilen Bedingungen wurden jeweils Femur und Tibia beider Hinterbeine entnommen. Muskel- sowie Bindegewebsteile wurden sorgfältig entfernt und die Knochen anschließend für mindestens 5 min in eine mit 70% Ethanol gefüllte Petrischale gelegt. Anschließend wurden die Knochen zur Entfernung des Alkohols für 2-3 min in eine mit PBS gefüllte Petrischale überführt. Der Knochenmarkkanal wurde mithilfe eines Skalpells eröffnet und die Stammzellen mit 5 ml PBS mit einer Kanüle (27 G) herausgespült. Durch mehrfaches Resuspendieren wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die Zellsuspension aller vier verwendeten Knochen eines Tieres wurde in einem 50-ml-Röhrchen gesammelt und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis aufbewahrt. 3.3.2. Differenzierung von Knochenmarkstammzellen zu Makrophagen unter Zellkulturbedingungen Die aus den Knochen durch Spülen gewonnenen Zellsuspensionen wurden bei 150 g und 4 °C 10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in RPMI-Medium aufgenommen. GM-CSF wurde in einer Konzentration von 33 ng/ml hinzugefügt. Die Zellen eines Tieres wurden in drei 250-ml-Zellkulturflaschen in jeweils 15 ml Medium ausgesät und bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre kultiviert. Unter diesen Bedingungen fand eine Differenzierung und Ausreifung der Stammzellen zu Makrophagen innerhalb von 8–10 Tagen statt. Das aufgrund des Zellstoffwechsels verbrauchte Medium wurde nach 3 bis 4 Tagen zu 2/3 durch frisches Medium ersetzt. Auch im weiteren Verlauf der Kultivierung erfolgte alle 2-3 Tage ein Ersatz verbrauchten Mediums. Dazu wurden 10 ml des alten Mediums abgenommen und 10 ml neues Medium mit stets frisch zugesetztem GM-CSF (33 ng/ml) hinzugefügt. Material und Methoden 39 3.3.3. Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen Zur Bestimmung der Zellzahl wurde ein Aliquot der Zellen aus den entsprechenden Suspensionen entnommen und in einer Neubauer Zählkammer gezählt. Dazu wurden die Zellen im Verhältnis 1:2 mit Trypan Blau verdünnt und auf eine Neubauer Zählkammer pipettiert. Unter dem Mikroskop wurden die vitalen Zellen ausgezählt und mit folgender Formel die Zellzahl bestimmt: Zellzahl in 64 Quadraten x 1000 Zellen / ml = -------------------------------------------------------------------Höhe der Zählkammer x Fläche x Verdünnung x 64 Vereinfachte Formel: Zellzahl x Verdünnungsfaktor Zellzahl x 10 / ml = -----------------------------------------4 Zahl der Großquadrate Am Ende einiger Experimente sollte die Vitalität der adhärenten Zellen im well beurteilt werden. Da die murinen Knochenmarkmakrophagen sich praktisch nicht von den wells in vitaler Form ablösen ließen, wurde die Bestimmung direkt im well durchgeführt. Dazu wurde je ein 20 µl-Tropfen Trypan Blau in ein well pipettiert und 100 Zellen an repräsentativer Stelle ausgezählt. Da sich abgestorbene Zellen in Gegenwart von Trypan Blau anfärben, konnten diese von den vitalen Zellen differenziert werden. Material und Methoden 40 3.4. Antikörper 3.4.1. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels ELISA Antikörperkonzentrationen in Zellkulturüberständen und in aufgereinigten Suspensionen wurden mittels isotypspezifischem Sandwich ELISA bestimmt. 96 well Mikrotiterplatten wurden mit dem jeweiligen Isotyp (5µg/ml PBS und 10 µl pro well) beschichtet und für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden anschließend ausgeschlagen und zweimal mit PBS gewaschen. Eine Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen erfolgte mit 125 µl/well 1% bovinem Serum Albumin (BSA) in PBS für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde das BSA abgeschlagen und wiederum zweimal mit PBS gewaschen. Zur Konzentrationsbestimmung wurde ein entsprechender Isotyp-Standard mit einer Konzentration von 100 ng/ml ausgehend eingesetzt und in einer 1:2-Verdünnungsreihe in BSA aufgetragen. Die zu bestimmende Suspension wurde nach entsprechender Vorverdünnung in BSA ebenfalls in einer 1:2-Verdünnungsreihe aufgetragen. Dabei wurden von Standard und Probe jeweils 20 µl/well eingesetzt und für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden anschließend ausgeschlagen und zweimal mit PBS gewaschen. Als Sekundärantikörper wurde ein an Biotin gekoppelter Antikörper mit Spezifität des jeweiligen Isotyps in einer Verdünnung von 1:1000 bis 1:2000 (je nach Antikörper) verwendet und mit 20 µl/well für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach diesem Schritt wurde ebenfalls zweimal mit PBS gewaschen. Zur Entwicklung des ELISA´s wurde mit Streptavidin β-Galactosidase 1:2400 in BSA für 25–30 min inkubiert und nach nochmaligem Waschen mit PBS 50 µl/well 4-Methylumbelliferyl-β-Galactopyranosid (MUG) dazugegeben. Die Messung der Fluoreszenz wurde im Titertec Fluoscan II bei einer Extinktion von 355 nm und einer Emission von 460 nm durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mithilfe des Programms Mikrowin. Material und Methoden 41 3.4.2. Bestimmung der Antikörperkonzentration mittels Proteinbestimmung nach Bradford Gesamtproteinmengen wurden in aufgereinigten Antikörpersuspensionen mithilfe der Methode nach Bradford bestimmt. Dafür wurde ein bovines γ-Globulin als Standard in einer Konzentration von 200 µg/ml bis 25 µg/ml in PBS eingesetzt. Die Proben wurden nach entsprechender Vorverdünnung in PBS in einer 1:2-Reihe vorbereitet. Jeweils 20 µl von Standard und Probe wurden in einer 96 well Mikrotiterplatte aufgetragen. Zu der Probe und dem Standard wurden anschließend 200 µl/well Bradford Reagenz gegeben und die Messung im Multiscan MCC/340 Messfilter 620 nm und Referenzfilter 492 nm durchgeführt und dem Programm Mikrowin ausgewertet. 3.5. Makrophagen Invasions- und Bakterizidie-Assays 3.5.1. Makrophagen Invasions-Assay: Antikörper-vermittelte Phagozytose Zur Ermittlung der Steigerung der Phagozytosekapazität von primären Knochenmarkmakrophagen durch opsonisierende Antikörper wurden 8–10 Tage alte Knochenmarkmakrophagen in 48 well Platten für adhärente Zellen am Tag vor Versuchsbeginn ausgesät. Dazu wurden die Zellen wie folgt geerntet: Nach Abnehmen des kompletten Mediums wurden die Zellen mit etwa 5 ml PBS pro Flasche zweimal gewaschen. Anschließend wurden pro Flasche 2 ml Trypsin-EDTA zugegeben, die Flasche kurz geschwenkt und das Trypsin-EDTA bis auf einen Rest von 0,5 ml wieder abgenommen und für 10 Minuten bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. 5 ml Medium wurden pro Flasche auf die Zellen gegeben und diese mit einem Zellschaber vorsichtig gelöst. Die Zellen wurden mithilfe der Neubauer Zählkammer gezählt (siehe 3.3.3) und bei 4 °C und 150 g 10 min abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in RPMI Medium aufgenommen und mit 1,8x105 Zellen/400 µl ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Material und Methoden 42 Am Tag des Versuchs wurde das Medium aus den wells abgenommen und die Makrophagen zweimal mit je 500 µl PBS gewaschen. Die Infektion mit opsonisierten Bakterien bzw. Kontrolle erfolgte durch Exposition der Zellen mit infiziertem Medium. Dazu wurden zunächst auf Columbia Platte angezogene Burkholderia pseudomallei WT E8 mit einem sterilen Wattestäbchen in PBS zu einer OD von 0,2–0,4 suspendiert und die Keimzahl dieser Suspension anhand einer Eichkurve nach photometrischer Messung bei 650 nm bestimmt. Die gewünschte Bakterienzahl wurden dann zum RPMI Medium gegeben. Zur Bestimmung Antikörper-vermittelter Phagozytose wurden die jeweiligen Antikörper sowie unspezifische Kontrollantikörper in einer Konzentration von 1 µg/ml zugegeben. Die Infektion erfolgte durch Zugabe von 400 µl dieses Mediums pro well und Inkubation für 30 min bei 37 °C und 5% CO2. Im Anschluss an diese Infektionszeit wurde das Medium wieder abgenommen und die Zellen zweimal mit je 500 µl PBS gewaschen. Zur Abtötung verbliebener extrazellulärer Bakterien erfolgte eine einstündige Inkubation (37 °C und 5% CO2) mit 400 µl/well RPMI, das 250 µg/ml Kanamycin enthielt. Danach wurde das Medium abgenommen und wiederum zweimal mit 500 µl PBS gewaschen. Um eine Lyse der Zellen herbeizuführen und eine Freisetzung der nun ausschließlich intrazellulären Bakterien zu erreichen wurde, in jedes well 150 µl Tergitol 1% gegeben. Nach einer anschließenden Inkubation von 20 min bei 37 °C und 5% CO2 wurde das Tergitol nach kräftigem Mischen aus den wells in 1 ml Reagiergefäße überführt und die Keimzahl über Verdünnungsreihen und CFU Zählung auf Müller-Hinton Agar-Platten bestimmt (siehe 3.1.4). Die absolute intrazelluläre Keimzahl pro well wurde durch folgende Rechnung ermittelt: gezählte Kolonien x Verdünnungsfaktor x 1,5 Die exakte Infektionsdosis wurde aus dem mit Bakterien eingestellten Medium ebenfalls durch CFU-Bestimmung ermittelt. Material und Methoden 43 3.5.2. Makrophagen Bakterizidie-Assay IFNγ-stimulierter und unstimulierter Zellen Zur Durchführung von Makrophagen Bakterizidie-Assays wurden die Zellen entsprechend 3.5.1. geerntet und ausgesät. Je nach Versuchsanforderungen wurde dem Medium beim Aussäen der Zellen 50 U/ml IFNγ zugegeben. Die Infektion der Makrophagen erfolgte entsprechend dem Protokoll der Phagozytose-Assays (3.5.1.). Nach der Infektion wurde auch hier kanamycinhaltiges Medium auf die Zellen gegeben, um eine extrazelluläre Replikation der Bakterien und Reinfektion der Zellen auszuschließen. Zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion wurde das Medium abgenommen, die Zellen zweimal mit 500 µl PBS gewaschen, mit Tergitol lysiert und eine CFU-Bestimmung vorgenommen (siehe 3.5.1.) Als Nullstundenwert wurde dabei die intrazelluläre Keimzahl nach Infektion und einstündiger Inkubation mit kanamycinhaltigem Medium bezeichnet. 3.5.3. Makrophagen Bakterizidie-Assay: Hemmung der induzierbaren NOSynthase (iNOS) Um primär eine Induktion von iNOS zu erreichen, wurde dem Medium beim Aussäen der Zellen 50 U/ml INFγ zugesetzt. Zur Hemmung der induzierbaren NO-Synthase der Makrophagen wurde das Medium beim Aussäen und später bei der Inkubation unter Kanamycin zusätzlich mit 1mM Aminoguanidin versetzt, während den Kontrollen kein Aminoguanidin zugegeben wurde. Das Protokoll der Keimzahlbestimmung entspricht der unter 3.5.1. und 3.5.2. beschriebenen Methode. Material und Methoden 44 3.6. Infektion und passive Immunisierung im Mausmodell 3.6.1. Infektions- und Immunisierungsrouten 3.6.1.1. Intranasale Infektion und Immunisierung Für intranasale Infektionen und passive Immunisierungen wurden die Bakterien aus dem in der Keimzahl bestimmten Stock aufgetaut und in PBS bis zur gewünschten Infektionsdosis verdünnt. Dieser Bakteriensuspension wurde der jeweilige Antikörper in einer Konzentration, die in allen Versuchen 10 µg pro Maus entsprach, zugegeben. Die Tiere wurden narkotisiert und durch Nackengriff fixiert. Die Applikation von Bakterien und Antikörpern erfolgte in einem Gesamtvolumen von 20 µl, das von den Tieren gleichmäßig über beide Nasenlöcher aspiriert wurde. 3.6.1.2. Intratracheale Infektion und Immunisierung Die Bakterien/Antikörper-Suspensionen wurden entsprechend den intranasalen Immunisierungsversuchen vorbereitet (siehe 3.6.1.1.). Die Tiere wurden narkotisiert und auf einer Styroporunterlage fixiert. Zunächst wurde ein kleiner Hautschnitt am Hals in Längsrichtung durchgeführt und die der Trachea anliegende Muskulatur mit einer Pinzette gespreizt, sodass die Trachea frei lag. Ein Venenverweilkatheter der Größe 22G/1 wurde in die Trachea eingeführt und nach Entfernen des Mandrins ein Volumen von 20 µl der Bakterien/Antikörper-Suspension verabreicht, die von den Mäusen aspiriert wurde. Um Reste der Suspension aus dem Katheter zu entfernen, wurden mit einer Pipette 100 µl Luft durch den Katheter appliziert. Nach Entfernen des Katheters wurde der Hautschnitt mit einem monofilen Polypropylenfaden der Stärke 6/0 verschlossen. 3.6.1.3. Intravenöse Immunisierung und Infektion Bei der intravenösen Immunisierung wurden 200 µg Antikörper pro Tier in einem Volumen von jeweils 200 µl in die laterale Schwanzvene der Mäuse mit einer Kanüle (27G) injiziert. Eine Dilatation der Venen wurde dabei durch Wärmeapplikation induziert. Die Tiere wurden 8 Stunden nach der Immunisierung intranasal mit einem Volumen von 20 µl Bakteriensuspension infiziert. Material und Methoden 45 3.6.2. Untersuchung der Mortalität Die Untersuchungen der Mortalität wurden lediglich nach intranasaler Infektion und Immunisierung durchgeführt. Dabei wurden der Zeitpunkt und die Anzahl verstorbener Tiere nach Infektion protokolliert. Der Zeitraum der Untersuchung erstreckte sich dabei über 14 Tage post infectionem. 3.6.3. Keimzahlbestimmung in Organen infizierter Tiere Keimzahlbestimmungen wurden in Lunge, Leber und Milz infizierter und immunisierter Tiere durchgeführt. Dazu wurden die Tiere 48 Stunden post infectionem durch Genickbruch getötet, auf einer Styroporunterlage fixiert und mit 70%igem Ethanol eingesprüht. Das Fell wurde zunächst im Bereich des Bauch- und Brustraums entfernt und das Tier nochmals mit Ethanol desinfiziert. Danach wurde das Peritoneum eröffnet, die Milz entfernt und in 500 µl Tergitol 1% überführt. Die Leber wurde entfernt und in 1 ml Tergitol 1% gelegt. Nach Eröffnung des Thorax wurde auch die Lunge entnommen und in 500 µl Tergitol 1% überführt. Anschließend wurden alle Organe im Tergitol mit einem Organhomogenisator (Ultra Turrax) zu einer homogenen Suspension zerkleinert. Im Anschluss wurden die Organgewichte durch Wiegen der Proben und Abzug des zuvor bestimmten Leerwertes ermittelt. Die Bestimmung der Keimzahl erfolgte mittels CFU-Bestimmung auf Ashdown AgarPlatten, die für ca. 48 Stunden bei 37 °C bebrütet wurden. Zur Berechnung der Keimzahl wurde die gezählte CFU mit dem Verdünnungsfaktor, dem Organgewicht in mg und der eingesetzten Menge Tergiol in ml multipliziert. 3.6.4. Neutralisation von IFNγ in vivo Für diesen Versuchsansatz wurde IFNγ durch intraperitoneale Applikation von 300 µg des gegen murines IFNγ gerichteten Antikörpers R4-6A2 inhibiert. Als Kontrolle wurde ein gleiches Volumen PBS bzw. 300 µg γ-Globulin von Ratten intraperitoneal verabreicht. Die Infektion erfolgte 6 Stunden nach Applikation des Antikörpers durch intranasale Gabe der gewünschten Infektionsdosis. Die Untersuchung der Mortalität und die Bestimmung der Keimzahl der inneren Organe erfolgte wie unter 3.6.3. und 3.6.4. beschrieben. Material und Methoden 46 3.6.5. Statistische Auswertung der in vivo-Versuche Die statistische Auswertung der Keimzahlbestimmungen der inneren Organe erfolgt mit dem Student t-Test, sofern eine Normalverteilung der Werte vorlag. Waren die Werte jedoch nicht normalverteilt, wurde der Mann-Whitney Rank Sum Test eingesetzt. Die Auswertung der Mortalitätsexperimente erfolgt mit dem Programm SPSS durch Anwendung der Statistik für Kaplan Meier Überlebenskurven. 3.6.6. Histopathologische Untersuchung von Organen infizierter Mäuse Die Sektion der Tiere und Entnahme der Lungen erfolgte analog zu der Präparation der Organe für die Keimzahlbestimmung (siehe 3.6.3.). Die entnommenen Organe wurden in 4% Formalin gelegt und für mindestens 4 Stunden fixiert. Danach wurden die Lungenlappen getrennt (rechte Lunge 4 Lappen; linke Lunge ein Lappen) und in Einbettkapseln gegeben. Dabei wurde für rechte und linke Lunge jeweils eine Einbettkapsel verwendet. Die Einbettkapseln wurden in 60% Ethanol gelegt. Die Köpfe wurden im Bereich der ersten Halswirbel vom Rumpf getrennt, das Fell vollständig entfernt und dann ebenfalls in 4% Formalin gelegt und für mindestens vier Stunden fixiert. Danach wurden die Schädel zum Entkalken für mindestens fünf Stunden in Dekalzifizierer gelegt. Anschließend war es möglich, Querschnitte durch die Nase von 2 bis 3 mm Dicke durchzuführen. Pro Schädel wurden 4 Querschnitte angelegt. Diese 4 Schnitte wurden in eine Einbettkapsel überführt und in 60% Ethanol gelegt. Die weitere Bearbeitung der Organe (Anfertigung der Schnitte und HE-Färbung) erfolgte in Kooperation mit Prof. K. Kamino (Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover). Die gefärbten Präparate wurden mikroskopisch bei unterschiedlichen Vergrößerungen (x63 bis x630) beurteilt. Material und Methoden 47 3.7. Messung von NO 3.7.1. Die Griess Reaktion: Prinzip der Methode Die Halbwertszeit von NO in biologischen Systemen, wie zum Beispiel der Freisetzung von NO in Makrophagen, ist sehr kurz. In der Regel liegt sie unter einer Sekunde, kann jedoch bei Anwesenheit von Hämoglobin bis zu 30 Sekunden betragen. Deshalb werden anstelle von NO selbst oft dessen Reaktionsprodukte Nitrat und Nitrit bestimmt, die durch Oxidation von NO mit freien Sauerstoffen entstehen. Allgemein wird die Messung von Nitrat/Nitrit- Konzentration oder des totalen Nitrat-/Nitrit- Gehaltes als Index für die NO-Produktion angesehen. Eine weit verbreitete Methode der Nitritbestimmung ist die kalorimetrische Messung nach Griess (1879). Dabei handelt es sich um eine zweiphasige Reaktion, bei der zuerst ein diazotisierendes Reagenz (im Allgemeinen Sulfanilsäure (SA)) zur Nitritquelle gegeben wird. Im sauren Milieu entsteht ein transientes Diazoniumsalz. Dieses Intermediärprodukt reagiert in der zweiten Phase der Reaktion mit NaphtyEthylendiamin (NED), welches als Bindungsreagenz fungiert und einen stabilen AzoFarbstoff von intensiv violetter Farbe bildet. Die Absorption dieses Produkts bei 540 nm ist linear proportional zu der Nitritkonzentration in der Probe und erlaubt eine Bestimmung von Konzentrationen bis zu 0,5 µM. Abb. 3 Die Griess Reaktion Material und Methoden 48 3.7.2. Aussaat der Zellen Primäre Knochenmarkmakrophagen der jeweiligen Mausstämme wurden nach einer Kulturdauer von 8-11 Tagen mit einer Dichte von 1,8 x 105 Zellen in einer 48 well Platte in einem Volumen von 400 µl RPMI ausgesät. Dabei wurden die Zellen mit 300 U/ml IFNγ stimuliert. 3.7.3. NO-Messung nach Infektion Am Tag nach der Aussaat der Zellen wurde das Medium abgenommen und zweimal mit 500 µl PBS gewaschen. Für den weiteren Versuchsverlauf wurde nun DMEM als Kulturmedium verwendet, da dieses Medium kein Nitrit enthält. Die gewünschte Infektionsdosis wurde im Medium eingestellt und mit 400 µl pro well für 30 min bei 37 °C und 5% CO2 infiziert. Dabei wurden pro Dosis jeweils zwei wells infiziert. Bei Infektion mit hitzeinaktivierten Bakterien wurden die Bakterien zuvor im Wasserbad bei 70 °C für 5 min erhitzt. Die Inaktivierung wurde durch Ausstreichen der Suspension mit einer Platinöse auf einer Columbia Platte überprüft. Nach der Infektion wurde das Medium abgenommen und die wells zweimal mit PBS gewaschen. Als Positivkontrolle wurde mit 50 ng/ml LPS von Salmonella Minnesota ebenfalls für 30 min stimuliert. Im Folgenden wurde für 24 Stunden mit 200 µl pro well DMEM, dem 250 µg/ml Kanamycin zugegeben wurde, bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurde das Medium der Doppelwerte gesammelt, sterilfiltriert und in 1,5 ml Reagiergefäßen aufgefangen. Die Bestimmung des Nitritgehaltes erfolgte durch Griess Reaktion (3.7.1.). Dazu wurde die Probe gegen einen in DMEM eingestellten Natriumnitritstandard gemessen. Der Standard wurde ausgehend von einer Konzentration von 1 mM in einer 1:2-Verdünnungsreihe mit je 50 µl in Doppelwerten in eine 96 well Mikrotiterplatte pipettiert. Von den Proben wurden ebenfalls je 50 µl als Doppelwerte aufgetragen. Zu der Probe und dem Standard wurden nun je 50 µl Sulfanilsäure 1% und 10 µl Salzsäure 37% gegeben und bei 37 °C und 5% CO2 für 10 min inkubiert. Anschließend wurden noch je 50 µl N(1-Naphty) Ethylendiamin 1% dazugegeben. In Anwesenheit von Nitrit trat nun ein Farbumschlag von blassrosa nach violett auf. Die Auswertung erfolgte durch Bestimmung der optischen Dichte bei 540 nm im Multiscan MCC/340. Die Berechnung der Konzentrationen wurde mithilfe des Programms Mikrowin durchgeführt. Material und Methoden 49 3.7.4. NO-Messung nach Stimulation mit Immunkomplexen Auch hier wurde am Tag nach der Aussaat der Zellen zunächst das Medium abgenommen und zweimal mit 500 µl PBS gewaschen. Die Immunkomplexe bestehend aus aufgereinigtem EPS 1 von Burkholderia pseudomallei und entsprechenden Antikörpern wurden in DMEM hergestellt. Dabei betrug die Konzentration von EPS stets 5 µg/ml und die Antikörperkonzentration 1 µg/ml. Da schon durch EPS allein eine gewisse Stimulation von NO gemessen werden konnte, wurden alle Proben zusätzlich mit 100 µg/ml Polymyxin B versetzt, um LPSKontaminationen zu binden. Die Stimulation erfolgt für 30 min mit 400 µl Medium pro well bei 37 °C und 5% CO2. Anschließend wurde das Medium abgenommen und wiederum zweimal mit 500 µl PBS gewaschen. Danach wurden 200 µl DMEM auf die Zellen gegeben und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 Stunden inkubiert. Die Ermittlung des Nitritgehalts im Zellkulturüberstand erfolgte mittels Griess Reaktion wie unter 3.7.2. beschrieben. 3.7.5. Hemmung von NF-κB bei NO-Stimulation durch Immunkomplexe Die NO-Stimulation mit Immunkomplexen wurde entsprechend 3.7.4. durchgeführt, wobei zur Hemmung von NF-κB dem Medium während der Stimulationsdauer von 30 min sowie der anschließenden 24-stündigen Inkubation 100 µM Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) zugesetzt wurde. 3.8. Messung von ROI 3.8.1. Bestimmung von H2O2 durch Fluoreszenz: Prinzip der Methode Ebenso wie NO besitzen auch ROI nach ihrer Freisetzung beim Respiratory burst nur eine sehr kurze Halbwertszeit in der Zelle. Deshalb erfolgte auch hier eine indirekte Bestimmung durch die Messung von Wasserstoffperoxid, das als Index für die Menge an ROI angesehen werden kann. Eingesetzt wurde hierbei 2´, 7´-Dichlorofluoreszein Diacetat (DCF-DA) welches als primär unpolares Reagenz in der Lage ist frei durch Zellmembranen zu diffundieren (Rosenkranz et al. 1992). Dort wird es Material und Methoden 50 durch intrazelluläre Esterasen zum nicht fluoreszierenden Derivat 2´,7´- Dichlorofluoreszein (DCF) hydrolysiert, dieses ist polar und wird somit in der Zelle gefangen. Werden nun von der Zelle ROI freigesetzt, die nach kurzer Zeit zu Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, wird DCF durch H2O2 zu fluoreszierendem Dichlorofluoreszein oxidiert. Dabei dient zelleigene Peroxidase als Katalysator für die Reaktion. So können selbst noch Peroxidkonzentrationen im picomolaren Bereich bestimmt werden. Extrazellulär im Zellkulturüberstand verbliebenes DCF-DA wird durch Produkte des Respiratory burst zu fluoreszierendem DCF oxidiert, sodass bei diesem Assay sowohl intrazellulär als auch extrazellulär vorliegende Peroxide gemessen werden. Zellmembran + H2O2 + Peroxidase 2,7´-Dichlorofluorescein Diacetat (DCF-DA) 2,7´-Dichlorofluorescein Diacetat (DCF-DA) (nicht fluoreszierend) 2´,7´-Difluorescein (DCF) (fluoreszierend) Abb. 4 Reaktion von DCF-DA mit H2O2 zu fluoreszierendem DCF 3.8.2. Aussaat der Zellen Primäre Knochenmarkmakrophagen der jeweiligen Mausstämme wurden nach einer Kulturdauer von 8-11 Tagen mit einer Dichte von 8-9x104 Zellen in einer 96 well Flachbodenplatte in einem Volumen von 200 µl RPMI ausgesät. Dabei wurden die Zellen je nach Versuchsanforderungen mit 100 U/ml IFNγ stimuliert oder unstimuliert verwendet. Material und Methoden 51 3.8.3. Messung nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat Für die Messung der Sauerstoffradikalbildung nach unspezifischer Stimulation wurden die Knochenmarkmakrophagen am Tag vor dem Versuch ohne Zusatz von IFNγ ausgesät. Am Versuchstag wurden die Zellen zunächst zweimal in je 100 µl PBS pro well gewaschen und anschließend mit 100 µl PBS bei 37 °C und 5% CO2 für 15 min inkubiert. Danach wurde das PBS gegen je 100 µl pro well 5 µM 2´, 7´-Dichlorfluorescein Diacetat (DCF-DA) ausgetauscht und wiederum für 15 min inkubiert. Die Stimulation folgte anschließend durch Zugabe von Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) in einer Endkonzentration von 200 nM. Die Messung erfolgte nach Anregung mit 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm im Fluoscan II in Zeitabständen von 10 min nach Beginn der Stimulation. Die gemessenen Werte wurden im Programm Mikrowin ausgewertet. Dabei wurde der Messwert stimulierter Zellen stets vom Leerwert (unstimulierte Zellen) abgezogen. 3.8.4. Messung nach Infektion Infiziert wurden die Zellen mit Burkholderia pseudomallei WT E8 und Pseudomonas aeruginosa PAO I. Die Bakterien wurden am Tag vor dem Versuch auf Columbia Platten angeimpft und bei 37 °C bebrütet. Am Tag des Versuchs wurde jeweils eine Bakteriensuspension mit einer optischen Dichte von 0,5 bei 650 nm in PBS hergestellt. Für die Infektion mit 10-facher Dosis wurde 1 ml der Bakteriensuspension bei 400 g für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Bakterienpellet in 100 µl PBS resuspendiert. Um eine Hitzeinaktivierung zu erreichen, wurde die Bakteriensuspension für 5 min bei 70 °C im Wasserbad erhitzt. Die primären Makrophagen wurden beim Aussäen mit 100 U/ml IFNγ stimuliert, wie unter 3.8.3 beschrieben vorbereitet und 15 min in PBS sowie 15 min in DCF-DA inkubiert. Die Infektion erfolgte durch Zugabe von 5 µl pro well der jeweiligen Bakteriensuspensionen. Anschließend erfolgte eine Inkubation von 60 min bei 37 °C und 5% CO2. Die Messung der Fluoreszenz wurde im Fluoscan II durchgeführt (siehe 3.8.3.) Um eine Kontamination des Gerätes durch Bakterien zu vermeiden, wurde die 96 well Platte vor der Messung mit einer fluoreszenzdurchlässigen Folie abgeklebt. Ergebnisse 52 4. Ergebnisse 4.1. Pathohistologische Nasopharynx verursacht Veränderungen durch Infektionen von Lunge mit und Burkholderia pseudomallei Die durchgeführten pathohistologischen Untersuchungen von Lunge und Nasopharynx infizierter Tiere sollte zunächst Aufschluss über die Charakteristiken einer durch Burkholderia pseudomallei verursachten Pneumonie bei dem relativ resistenten C57Bl/6-Mausstamm und dem hochempfänglichen BALB/c-Mäusen, sowie bei unterschiedlichen Infektionsstrategien geben. Des Weiteren wurde auch die Lunge passiv immunisierter Tiere untersucht, um einen Eindruck über die Verteilung der Entzündungsherde unter diesen Bedingungen zu gewinnen. Die Lungen (Abb. 5-7) sowie der Nasopharynx (Abb. 8&9) wurden jeweils 48 Stunden nach der Infektion mit Burkholderia pseudomallei präpariert. Zur Beurteilung von Ausbreitung, Grad und Qualität der Infektion wurden histologische Schnitte angefertigt und mit Hämatoxilin Eosin (HE) gefärbt. Insgesamt wurden pro Gruppe drei Tiere untersucht. Ergebnisse 53 A B C57Bl/6 BALB/c freie Alveolen Entzündungsherde „Granulome“ C D BALB/c C57Bl/6 Entzündungszellen Nekrose Abb. 5 Histologie der linken Lunge von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen 48 Stunden nach intranasaler Infektion (5x10³ B. pseudomallei pro Tier). 63-fache Vergrößerung (A+B) und 630-fache Vergrößerung eines Entzündungsherdes (C+D). Ergebnisse 54 A B C57Bl/6 BALB/c Abb. 6 Histologie der linken Lunge von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen 48 Stunden nach intratrachealer Infektion (5x10³ B. pseudomallei pro Tier). 100-fache Vergrößerung A B C57Bl/6 BALB/c Austreten von Entzündungszellen aus Gefäßlumina Abb. 7 Histologie der linken Lunge von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen 48 Stunden nach intranasaler Infektion (5x10³ B. pseudomallei pro Tier) und passiver Immunisierung mit 3015 IgG2a. 63-fache Vergrößerung Ergebnisse 55 Die histologischen Untersuchungen der Lunge ergaben bei allen Tieren eine akute multifokale granulomatoide Bronchiopneumonie mit Nekrosen des Gewebes, wobei die Anzahl der Entzündungsherde im Falle der passiv immunisierten Tiere in der Regel jedoch geringer war. Dort konnte noch der Austritt von Entzündungszellen aus den Gefäßlumina in das Lungengewebe hinein beobachtet werden (Abb. 7). Die Verteilung der Entzündungsherde erstreckte sich über die gesamte Lunge bis hin zu den Spitzenlappen. Während in den Granulomen selbst eine starke Anhäufung von Entzündungszellen (Neutrophile Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen) auftrat, waren die Alveolen in den übrigen Regionen der Lunge frei (Abb. 5). Der Entzündungstyp war dabei sowohl vom jeweiligen Mausstamm als auch davon, ob mit der Infektion auch eine passive Immunisierung stattgefunden hatte, unabhängig (Abb. 5&6). A B Mukus mit Makrophagen Zerstörung des Epithels Abb. 8 Olfaktorisches Epithel und intranasaler Mukus des Nasopharynx einer BALB/c-Maus 48 Stunden nach intranasaler Infektion (5x10³ B. pseudomallei pro Tier). 630-fache Vergrößerung Ergebnisse 56 A B BALB/c C57Bl/6 subepitheliale Einlagerung Mukus mit Makrophagen von Entzündungszellen Abb. 9 Olfaktorisches Epithel und intranasaler Mukus des Nasopharynx von C57Bl/6- und BALB/cMäusen 48 Stunden nach intratrachealer Infektion (5x10³ B. pseudomallei pro Tier). 630-fache Vergrößerung Die Nasen der infizierten Tiere zeigten in den meisten Fällen nur geringgradige pathologische Veränderungen. Es trat eine entzündliche Zerstörung des olfaktorischen Epithels, subepitheliale Infiltration von Entzündungszellen sowie Mukus im Lumen der Nase, der zum Teil Makrophagen und andere Entzündungszellen enthielt, auf (Abb. 8&9). Auffällig war weiterhin, dass es auch bei intratrachealer Infektion (Abb. 9) zu entzündlichen Veränderungen in der Nase kam, was auf eine intakte Funktion des respiratorischen Epithels hinwies. Auch hier bestand bezüglich Art und Verteilung der Entzündung kein Unterschied zwischen beiden Mausstämmen. Ergebnisse 57 4.2. Protektive Wirkung monoklonaler anti-EPS Antikörper bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei im murinen Pneumoniemodell Erste Versuche einer passiven Immunisierung des Respirationstraktes gegen Burkholderia pseudomallei zeigten einen protektiven Effekt monoklonaler Antikörper. Im Folgenden sollte die beobachtete Protektion durch den Einsatz verschiedener Immunglobulinklassen sowie die Durchführung unterschiedlicher Immunisierungsstrategien näher charakterisiert werden. Dazu wurde durch intranasale und intratracheale Infektion von Mäusen des gegenüber Burkholderia pseudomallei relativ resistenten C57Bl/6- und des hochempfänglichen BALB/c-Stammes eine Pneumonie induzierte und die Mortalität der Tiere überwacht bzw. eine Bestimmung der Keimzahlen in der Lunge durchgeführt. Dabei wurde der Effekt einer passiven Immunisierung mit IgG- und IgA-Switch-Varianten des gegen EPS von Burkholderia pseudomallei gerichteten Klons 3015 untersucht. In den folgenden Exprimenten wurde der Isotyp 3015 IgG2a als Repräsentant der IgG-Familie sowie 3015 polymeres IgA (pIgA) eingesetzt. 4.2.1. Effekt von lokal appliziertem IgG2a In der vorliegenden Studie sollte zunächst der protektive Effekt von 3015 IgG2a hinsichtlich seiner Lokalisation und der Effekte auf die pulmonale Keimzahl näher charakterisiert werden. Dazu wurden die beiden Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c eingesetzt. 4.2.1.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a Bei der intranasalen Infektion und passiven Immunisierung wurde eine Suspension aus Bakterien und Antikörpern von den Tieren gleichmäßig durch beide Nasenlöcher aspiriert. Diese Infektions- und Immunisierungstechnik gewährleistet eine Verteilung von Bakterien und Antikörpern sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt. Auf diese Weise ist der gesamte Respirationstrakt, d.h. die Schleimhaut des oberen Respirationstraktes und die der Lunge mit Erregern und Antikörpern konfrontiert, und ein protektiver Effekt ist in beiden Bereichen vorstellbar. Ergebnisse 58 A B 10 14 IgG2a 3015 Kontroll-IgG2a 898 8 3015 IgG2a Kontroll-IgG2a 898 12 lebende Tiere lebende Tiere 10 6 4 2 *p=0,025 0 8 6 *p=0,002 4 2 BALB/c C57Bl/6 0 0 2 4 6 8 Tage p.i. 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tage p.i. Abb. 10 Mortalität nach intranasaler B. pseudomallei-Infektion und passiver Immunisierung mit antiEPS IgG2a 3015. Die Infektionsdosis betrug bei BALB/c-Mäusen 1,8–2,4 x 10² pro Tier, C57Bl/6- Mäuse wurden mit einer Dosis von 4,9–5,8 x 103 pro Tier infiziert. Dargestellt sind die zusammengefassten Daten aus zwei (A) bzw. drei unabhängigen Versuchen (B) (siehe auch Kontrolltiere Abb. 20A und 27A passive Immunisierung Fcγ-chain-KO und iNOS-KO). Wie aus den Abbildungen 10A und 10B ersichtlich ist, induzierte eine intranasale passive Immunisierung mit 3015 IgG2a eine deutlich verzögerte und verminderte Mortalität bei beiden Mausstämmen. Dabei waren die Unterschiede zwischen immunisierter Gruppe und der Kontrollgruppe bei den BALB/c-Mäusen mit einem Wert von p= 0.025 statistisch signifikant. Auch die Unterschiede bei immunisierten und nicht immunisierten C57Bl/6-Mäusen waren mit einem Wert von p=0,002 hochsignifikant. Ergebnisse 4.2.1.2. 59 Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit IgG2a Da durch passive Immunisierung eine verminderte und verzögerte Mortalität induziert werden konnte, sollte in den folgenden Experimenten untersucht werden, inwiefern die Keimzahlen in der Lunge durch eine passive Immunisierung beeinflusst werden konnte. Die Gesamtkeimzahlen wurden exemplarisch in der Lunge von 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 30 15 Ko nt ro ll e * p=0,026 Ig G 2a CFU Lunge (Log 10) C57Bl/6-Mäusen 48 Stunden nach Infektion bestimmt. Abb. 11 Keimzahlen der Lunge von C57Bl/6-Mäusen 48 Stunden nach intranasaler Infektion (2,6–5,2 x 104 pro Tier) und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 IgG2a. Als Kontrollantikörper wurde 898 IgG2a verwendet. Abgebildet sind die Keimzahlen der Einzeltiere und deren Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen. Die Keimzahlbestimmung der Lunge zeigte bei C57Bl/6-Mäusen eine signifikante Reduktion (p=0,026 Rank Sum Test) der bakteriellen Last nach passiver Immunisierung mit 3015 IgG2a. Dabei unterschied sich die mittlere Keimzahl der Gruppen um etwa 5 Log-Stufen. Im Zusammenhang mit den Untersuchungen der Mortalität legt dieses Ergebnis nahe, dass die Reduktion und Verzögerung der Mortalität mit einer geringeren Keimzahl der Lunge korreliert. Ergebnisse 4.2.1.3. 60 Keimzahlbestimmung der Lunge nach intratrachealer passiver Immunisierung mit IgG2a Da es auf dem Weg der intranasalen Infektion und Immunisierung nicht möglich, ist die beobachtete Protektion einem bestimmten Abschnitt des Respirationstraktes zuzuordnen, sollten durch eine intratracheale Applikation von Bakterien und Antikörpern speziell pulmonale Effekte untersucht werden. Dabei wurde die Suspension aus Bakterien und Antikörpern direkt in die Trachea der Tiere injiziert und so der obere Respirationstrakt umgangen. Da bei einer Verabreichung von einer Suspension aus Bakterien und spezifischen Antikörpern die Gefahr der Bildung großer Immunkomplexe besteht, welche möglicherweise über das Flimmerepithel leichter aus der Lunge entfernt werden können, sollte zunächst überprüft werden, ob immunisierte Tiere initial die gleiche Menge Bakterien in der Lunge aufweisen wie die Kontrolltiere. Dazu wurden infizierte und immunisierte Tiere bereits 30 min nach der Infektion getötet und die Keimzahl der Lunge bestimmt, bevor es zu einer Replikation der Bakterien kommen konnte. Die Beurteilung eines Effektes durch passive Immunisierung fand 24 bzw. 48 Stunden nach der Infektion und Immunisierung statt. B 4 3 2 C57Bl/6 30 min p.i. C57Bl/6 48 h p.i. 5 Ig G ro lle Ko nt 30 1 5 Ig G 2a 0 30 1 1 * p=0,008 ro lle 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ko nt CFU Lunge (Log 10) CFU Lunge (Log 10) 6 2a A Abb. 12 Keimzahlen der Lunge von C57Bl/6-Mäusen nach intratrachealer Infektion mit B. pseudomallei und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 IgG2a. Die Infektionsdosis betrug 2,1–2,5 x 104 Bakterien pro Tier. Die Keimzahlbestimmung der Lunge fand nach 30 min (A) und 48 Stunden (B) p.i. statt. Als Kontrollantikörper wurde 898 IgG2a eingesetzt. Dargestellt sind jeweils Keimzahlen der Einzeltiere sowie deren Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten. Ergebnisse 61 * p=0,029 ro lle Ko nt Ig G 2a BALB/c 48 h p.i. 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 30 1 Ig G 5 30 1 nt ro lle BALB/c 24 h p.i. CFU Lunge (Log 10) * p=0,029 Ko 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 B 2a CFU Lunge (Log 10) A Abb. 13 Keimzahlen der Lunge von BALB/c-Mäusen nach intratrachealer Infektion mit B. pseudomallei und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 IgG2a. Die Infektionsdosis betrug 3,9 x 104 (A) und 6,8 x 10³ (B) Keime pro Tier. Die Keimzahl der Lunge wurde nach 24 Stunden (A) bzw. nach 48 Stunden (B) p.i. bestimmt. Als Kontrollantikörper wurde 898 IgG2a eingesetzt. Dargestellt sind jeweils Keimzahlen der Einzeltiere sowie deren Mittelwerte eines Einzelexperimentes. Die Bestimmung der pulmonalen Keimzahlen nach intratrachealer Infektion und passiver Immunisierung mit 3015 IgG2a ergab, dass nur 30 min nach der Infektion noch kein signifikanter Unterschied in der Keimzahl von C57Bl/6-Mäusen bestand. So konnte gezeigt werden, dass sowohl in der immunisierten Gruppe als auch in der Kontrollgruppe gleiche Mengen Bakterien die Lunge erreichen, und keine verminderte Distribution der Bakterien durch große Immunkomplexe der spezifischen Antikörper mit den Bakterien vorliegt. 48 Stunden nach der Infektion zeigte sich bei C57Bl/6-Mäusen nicht nur eine deutliche Erhöhung der Bakteriengesamtzahl um etwa drei bis vier Log-Stufen in der Lunge, sondern auch eine signifikant geringere Keimzahl nach passiver Immunisierung im Vergleich zur Kontrollgruppe (p=0.008) (Abb.12). Auch nach passiver Immunisierung von BALB/c-Mäusen wiesen die mit 3015 IgG2a immunisierten Tiere sowohl nach 24 Stunden (p=0,029) als auch nach 48 Stunden (P=0,029 Rank Sum Test) verminderte Keimzahlen in der Lunge auf (Abb. 13). Ergebnisse 62 4.2.2. Effekt von lokal appliziertem EPS-spezifischem polymerem IgA In der Literatur wird vor allem IgA als auf der Mukosa vorkommender Antikörper beschrieben, und für IgA somit eine wichtige Rolle bei der Protektion von Schleimhäuten postuliert. Aus diesem Grund wurden neben der passiven Immunisierung mit 3015 IgG gleichartige Experimente auch mit der Isotyp-SwitchVariante 3015 polymeres IgA (pIgA) durchgeführt. Hier wurden ebenfalls die Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c verwendet und mit Burkholderia pseudomallei infiziert. 4.2.2.1. Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA A B 5 5 3015 pIgA 10 µg Kontroll-pIgA 3034 3015 pIgA 35 µg Kontroll-pIgA 3034 4 3 lebende Tiere lebende Tiere 4 2 1 3 2 1 0 BALB/c C57Bl/6 0 0 1 2 3 4 Tage p.i. 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tage p.i. Abb. 14 Mortalität nach intranasaler Infektion und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 pIgA. Die Infektionsdosis bei BALB/c-Mäusen betrug 1,7 x 10² (A). Die C57Bl/6 Mäuse wurden mit 1,5 x 105 B. pseudomallei infiziert (B). Im Gegensatz zur Immunisierung mit 3015 IgG2a zeigte 3015 pIgA weder bei BALB/c- noch bei C57Bl/6- Mäusen einen Einfluss auf Morbidität und Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung. Dabei konnte auch durch eine Steigerung der Antikörperdosis von 10 µg/Tier auf 35 µg/Tier kein sichtbarer Effekt erzielt werden. Ergebnisse 4.2.2.2. 63 Keimzahlbestimmung der Lunge nach intranasaler passiver Immunisierung mit pIgA Obwohl bei der Untersuchung der Mortalität nach intranasaler passiver Immunisierung mit 3015 pIgA kein Unterschied nachweisbar war, wäre ein geringer Unterschied in der Gesamtkeimzahl der Lunge, welcher sich nicht auf die Mortalität auswirkt, durchaus vorstellbar. Deshalb wurden hier die Keimzahlen der Lunge im Vergleich von passiv immunisierten Tieren zu den Kontrolltieren 48 Stunden nach der Infektion und Immunisierung untersucht. Ko nt ro lle A lle Ko nt ro pI g 30 15 C57Bl/6 pI g BALB/c 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 30 15 CFU Lunge (Log 10) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 B A CFU Lunge (Log 10) A Abb. 15 Keimzahlen der Lunge 48 Stunden nach intranasaler Infektion und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 pIgA. BALB/c-Mäuse wurden mit 4,0–4,2 x 103 B. pseudomallei (A) und C57Bl/6- Mäuse mit 4,7 x 104 B. pseudomallei (B) intranasal infiziert. Als Kontrollantikörper wurde 3034 pIgA verwendet. Dargestellt sind die Keimzahlen der Einzeltiere und deren Mittelwerte aus je zwei unabhängigen Experimenten. Wie die Werte aus den Abbildungen 15A und 15B zeigen, ist auch in der Gesamtkeimzahl der Lunge bei BALB/c- und C57Bl/6-Mäusen kein Unterschied zwischen der mit 3015 pIgA immunisierten Gruppen und den Kontrolltieren nachweisbar. Somit konnte in diesen Experimenten gezeigt werden, dass 3015 pIgA im Gegensatz zu 3015 IgG2a weder eine Reduktion oder Verzögerung der Mortalität noch eine Verringerung der Keimzahl der Lunge nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei induzierte. Ergebnisse 64 4.2.2.3. Keimzahlbestimmung der Lunge nach intratrachealer passiver Immunisierung mit pIgA Zur Untersuchung der Protektion der Lunge durch 3015 pIgA wurde eine intratracheale Infektion und passive Immunisierung sowie die Keimzahlbestimmung in der Lunge 48 Stunden nach der Infektion mit Burkholderia pseudomallei und passiver Immunisierung durchgeführt. 15 ro lle Ko nt pI gA CFU Lunge (Log 10) C57Bl/6 30 30 15 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ro lle BALB/c Ko nt 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 B pI gA CFU Lunge (Log 10) A Abb. 16 Keimzahl der Lunge 48 Stunden nach intratrachealer Infektion und passiver Immunisierung mit anti-EPS 3015 pIgA. BALB/c-Mäuse wurden mit 4,1–4,7 x104 B. pseudomallei (A) und C57Bl/6- Mäuse mit 1,9–2,7 x104 B. pseudomallei (B) pro Tier infiziert. Als Kontrollantikörper diente 3034 pIgA. Abgebildet sind die Keimzahlen der Einzeltiere und deren Mittelwerte aus je zwei unabhängigen Experimenten. Wie schon bei den Ergebnissen nach intranasaler Infektion und Immunisierung mit 3015 pIgA war auch nach intratrachealer Exposition der Lunge mit Bakterien und Antikörpern kein Unterschied in der Gesamtkeimzahl nachweisbar. Diese Versuche sind eine weitere Bestätigung dafür, dass pIgA in diesem System von passiver Immunisierung und Infektion weder im gesamten noch speziell im unteren Respirationstrakt einen protektiven Effekt bei einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei ausübt. Ergebnisse 65 4.2.3. Effekte von systemisch appliziertem EPS-spezifischem IgG und IgA auf die Mortalität Die Verteilung von Immunglobulinen auf der Mukosa erfolgt in vivo durch spezifische Transporter, wie im Falle von IgA mit Bindung des sekretorischen Stücks an polymeres IgA oder durch Diffusion. Zur weiteren Bestätigung der Ergebnisse der passiven Immunisierungsversuche mit 3015 IgG und 3015 pIgA wurde daher neben der intranasalen und intratrachealen Immunisierungsroute noch ein dritter Inokulationsweg gewählt. Dabei erhielten die Mäuse eine Antikörperdosis von 200 µg/Tier intravenös in die Schwanzvene. Die Infektion mit Burkholderia pseudomallei erfolgte acht Stunden später auf intranasalem Weg. Dieser Versuchsansatz stellte wohl besser die tatsächliche Situation in vivo nach, da die Antikörper über das Blut im Organismus verteilt wurden. Im Folgenden wurde die Mortalität innerhalb der Tiergruppen protokolliert. Diese Versuche wurden exemplarisch nur mit dem Stamm BALB/c durchgeführt. A B 7 7 IgG2a 3015 KontrollIgG2a 898 6 5 lebende Tiere 5 lebende Tiere 3015 pIgA Kontroll-pIgA 3034 6 4 3 2 4 3 2 1 1 0 0 0 2 4 6 8 Tage p.i. 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 Tage p.i. Abb. 17 Mortalität von BALB/c-Mäusen nach intravenöser passiver Immunisierung und intranasaler Infektion mit B. pseudomallei. Den Tieren wurden 8 Stunden vor der Infektion je 200 µg Antikörper in die Schwanzvene injiziert. Die Infektionsdosis betrug 1,9 x 10² (A) bzw. 1,8 x 10² (B). Wie schon in den vorherigen Versuchen zeigte sich auch nach intravenöser Applikation der Antikörper und anschließender intranasaler Infektion nur nach einer Immunisierung mit 3015 IgG2a (Abb. 17A) eine Verzögerung und Reduktion der Ergebnisse 66 Mortalität bei BALB/c Mäusen. Obwohl diese hier mit einem Wert von p=0,085 knapp die statistische Signifikanz verpassten, ist doch zu erwarten, dass durch eine Erhöhung der Tierzahl signifikante Werte erreicht werden könnten. Im Gegensatz dazu zeigten die mit 3015 pIgA (Abb. 17B) immunisierten Tiere keinen Unterschied in der Mortalität gegenüber der Kontrollgruppe. 4.3. Vergleich der opsonisierenden Eigenschaften verschiedener Isotypen EPS-spezifischer Antikörper bei der Phagozytose von Knochenmarkmakrophagen Zur Untersuchung der Mechanismen der beobachteten unterschiedlichen protektiven Effekte der verschiedenen Antikörper in vivo wurde die Fähigkeit zur Opsonisierung anhand der Phagozytose von Knochenmarkmakrophagen für IgG- und IgA Isotyp-Switch-Varianten verglichen. Die hier verwendeten Makrophagen stammen aus dem Knochenmark von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen und wurden 8-10 Tagen unter Zellkulturbedingungen ausgereift. In diesem Experiment konnten so nicht nur die opsonisierenden Eigenschaften der Antikörper überprüft, sondern auch die Phagozytosekapazität dieser Zellen beider Mausstämme nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei verglichen werden. Ergebnisse 67 A B 60000 60000 50000 Keimzahl intrazellulär Keimzahl intrazellulär 50000 C57Bl/6 BALB/c 40000 30000 20000 C57Bl/6 BALB/c 40000 30000 20000 10000 10000 0 0 Kontrolle 898 IgG2a 3015 IgG1 3015 IgG2a Kontrolle 3034 pIgA 3015 IgG2b 3015 pIgA Abb. 18 Vergleich der opsonisierenden Eigenschaften von anti-EPS 3015 IgG und pIgA anhand der Phagozytose in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen. Vor Infektion der Zellen wurde B. pseudomallei mit 1 µg/ml des jeweiligen Antikörpers opsonisiert. Die Infektionsdosis betrug 5 Bakterien pro Zelle (MOI 5). Nach einer Infektionsdauer von 30 min und einer einstündigen Inkubation mit kanamycinhaltigem Medium wurde die Keimzahlbestimmung durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifachbestimmungen eines repräsentativ ausgewählten Versuchs (A+B). Abbildung 18A zeigt die Auswertung der opsonisierenden Funktionen verschiedener IgG Isotyp-Switch-Varianten des Antikörpersklons 3015. Aus der Grafik ist zu ersehen, dass durch die Antikörper eine Steigerung der intrazellulären Keimzahl um etwa den Faktor drei bis vier erreicht wurde. Dabei ist im Vergleich der verschiedenen Subklassen untereinander kein signifikanter Unterschied festzustellen. Auch die Phagozytosekapazität der resistenten C57Bl/6- und relativ empfänglichen BALB/c-Makrophagen unterscheidet sich nicht voneinander. Wie Abbildung 18B zeigt, ist nach Antikörper-vermittelter Phagozytose mit 3015 polymerem IgA opsonisierten Burkholderia pseudomallei ebenfalls eine Erhöhung der intrazellulären Keimzahl um einen Faktor drei bis vier im Vergleich zur Kontrolle nachweisbar. Auch nach IgA-vermittelter Phagozytose lässt sich kein Unterschied in der Phagozytosekapazität zwischen den Makrophagen beider Mausstämme feststellen. Ergebnisse 68 4.4. Bedeutung der Fcγ-Rezeptoren I und III für die protektiven Effekte von EPS-spezifischem IgG2a Antikörper-vermittelte Phagozytose wird vor allem über die Fc-Rezeptoren der phagozytierenden Zellen, wie zum Beispiel Makrophagen und Neutrophile Granulozyten vermittelt. Es gibt diverse Fc-Rezeptoren, die eine unterschiedliche Affinität für die verschiedenen Isotypen von Immunglobulinen besitzen. Ein wichtiger Bestandteil der Fcγ-Rezeptoren I und III ist die so genannte γ-Kette oder γ-chain. Sie vermittelt nicht nur Funktionen des Rezeptors wie Phagozytose und Induktion intrazellulärer Signaltransduktion, sondern ist auch für die intrazelluläre Zusammenlagerung und die Expression des Rezeptors an die Zelloberfläche von entscheidender Bedeutung. Der in den hier gezeigten Versuchen eingesetzte Mausstamm besitzt einen gezielten Knock-out für die γ-Kette und ist somit nicht in der Lage, funktionsfähige Fcγ-Rezeptoren der Subklassen I und III auf seinen Zellen zu exprimieren. Im Folgenden sind die Ergebnisse aus Infektions- und Immunisierungsversuchen mit diesem Mausstamm gezeigt. Als Kontrolle wurden stets Tiere des C57Bl/6-Inzuchtstamms verwendet, da die Knock-out-Tiere den genetischen Hintergrund von C57Bl/6 besitzen. Primär sollte zunächst überprüft werden, ob ein genereller Unterschied in der Suszeptibilität gegenüber Burkholderia pseudomallei zwischen C57Bl/6- und Fcγ-chain-Knock-out-Mäusen besteht. Deshalb wurden zwei Gruppen von je 4 Tieren mit einer Dosis von 4,9 x 103 Keimen intranasal infiziert und anschließend die Mortalität dokumentiert. Ergebnisse 69 5 Fc gamma-chain KO C57Bl/6 WT lebende Tiere 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tage p.i. Abb. 19 Mortalität von Fcγ-chain-KO- im Vergleich zu C57Bl/6-WT-Mäusen nach intranasaler Infektion. Infektionsdosis: 4,9 x 10³ B. pseudomallei pro Tier Aus diesem Versuch wird deutlich, dass ein Fehlen der Fcγ-Kette und damit der Fcγ-Rezeptoren I und III primär keine Auswirkung auf die Mortalität nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei besitzt. Dieses ist für die nachfolgenden Experimente zur passiven Immunisierung von großer Bedeutung, da im Falle eines primären Unterschiedes der Suszeptibilität bei Fcγ-chain-Knock-out- und C57Bl/6WT-Mäusen keine Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen bestände. Da es sich um ein präliminares Experiment handelte, wurde auf eine Vergrößerung der Tierzahl pro Gruppen verzichtet. Zur Untersuchung der Bedeutung von Fcγ-Rezeptoren für den protektiven Effekt von EPS-spezifischem IgG wurden passive Immunisierungsexperimente vergleichend an Fcγ-chain-Knock-out- und C57Bl/6-Mäusen durchgeführt. Wie auch schon in den passiven Immunisierungsversuchen mit C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen wurde hier der anti-EPS Antikörper 3015 IgG2a für die passive Immunisierung verwendet. Die Infektion und Immunisierung erfolgte in allen Versuchen intranasal. Als Kontrolle für die immunisierten Fcγ-chain-Knock-out Tiere wurde eine Gruppe C57Bl/6-Mäuse ebenfalls mit 3015 IgG2a immunisiert (Positivkontrolle), während eine andere Gruppe C57Bl/6-Tiere statt 3015 IgG2a den Kontrollantikörper 898 IgG2a in gleicher Dosierung erhielt (Negativkontrolle). Ergebnisse 70 B 6 8 10 12 14 16 KO in ha gc Fc gamma-chain KO + 3015 IgG2a C57Bl/6 + 3015 IgG2a C57Bl/6 Kontrolle + Tage p.i. Ko nt ro lle 4 /6 2 AK 0 m 0 + 1 /6 2 Bl *p=0,013 3 57 4 * * m lebende Tiere 5 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 C 6 Ak CFU Lunge (Log 10) 7 C 57 Bl A Abb. 20 Mortalität (A) und Keimzahlen der Lunge (B) 48 Stunden nach intranasaler passiver Immunisierung von Fcγ-chain-KO- im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen. Fcγ-chain-KO und C57Bl/6- Mäuse wurden passiv immunisiert und mit B. pseudomallei 4,9 x 103 (A) bzw. 4–5,6 x 104 (B) infiziert. Als Kontrollantikörper diente 898 IgG2a. Dargestellt sind ein repräsentatives Einzelexperiment (A) bzw. Keimzahlen der Einzeltiere und deren Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen (B). Bei der Untersuchung der Mortalität (Abb. 20A) wurde deutlich, dass die Fcγ-chain Knock-out Mäuse trotz Immunisierung im Vergleich zu den nicht immunisierten Kontrolltieren nur leicht verzögert verstarben. Am Ende des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen waren alle Knock-out- und nicht immunisierten Kontrolltiere verstorben, während in der immunisierten C57Bl/6-Gruppe noch 5 von 6 Tieren lebten. Dieses entspricht einem signifikanten Unterschied zwischen immunisierten Fcγ-chain-Knock-out- und C57Bl/6-Tieren von p=0,013. Auch bei der Bestimmung der Gesamtkeimzahl der Lungen 48 Stunden nach der Infektion (Abb. 20B) war ein Unterschied zwischen immunisierten Fcγ-chain-Knockout-Tieren und den immunisierten C57Bl/6-Mäusen zu erkennen. Die Fcγ-chainKnock-out-Mäuse trugen signifikant mehr Keime in der Lunge als die Tiere der Positivkontrolle (p=0.043), welche ihrerseits signifikant niedrigere Keimzahlen gegenüber der Negativkontrolle aufwiesen (p=0,023). Ergebnisse 71 4.5. Antikörper-vermittelte Effektorfunktionen bei der Abwehr von Burkholderia pseudomallei Bei der Bekämpfung von intrazellulären Erregern ist vor allem das Auftreten von zwei Stoffklassen von Bedeutung. Die Produktion und Freisetzung von ROI zum einen und zum anderen von NO. Mit den folgenden Versuchen sollte geklärt werden, wie die Produktion von NO und ROI, vor allem im Zusammenhang mit Antikörpervermittelten Effekten, in primären Makrophagen aktiviert werden kann und welche Rolle sie bei der intrazellulären Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei spielt. 4.5.1. NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen Als Erstes wurde die Bedeutung von NO untersucht. Dazu wurde zunächst NO in Makrophagen verschiedener Mausstämme auf unterschiedliche Weise stimuliert und anschließend die NO-Produktion anhand der Nitritkonzentration im Zellkulturüberstand bestimmt. In diesen Versuchsansätzen wurden die Zellen beim Aussäen stets mit IFNγ vorstimuliert, um eine Induktion der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) zu erreichen. Diese Vorstimulation sollte eine Aktivierung der Zelle durch IFNγ induzieren, wie sie auch in vivo im Falle einer Infektion des Organismus stattfinden würde. 4.5.1.1. Kinetik der NO-Produktion von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen Die Erstellung einer Kinetik sollte zu Beginn der Versuchsreihe Auskunft geben, wie schnell eine Stimulation von NO mit LPS von Salmonella Minnesota und durch Infektion mit Burkholderia pseudomallei zu auswertbaren Konzentrationen von Nitrit im Zellkulturüberstand führt. Dazu wurden die ausgereiften Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c Mäusen mit IFNγ stimuliert und ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen in neuem Medium für 30 min stimuliert bzw. infiziert und anschließend das Medium ausgetauscht. Die Bestimmung des Nitritgehaltes erfolgte nach 4, 8, 16 und 24 Stunden aus dem Gesamtüberstand von jeweils zwei wells. Der Überstand wurde zu den jeweiligen Zeitpunkten abgenommen und bis zur Messung durch die Griess Reaktion bei -20 °C Ergebnisse 72 aufbewahrt. Als Negativkontrolle dienten jeweils Zellen, die nicht infiziert bzw. mit LPS stimuliert wurden. A B 120 120 C57Bl/6 unstimuliert BALB/c unstimuliert C57Bl/6 + LPS BALB/c + LPS 100 80 Nitrit (µM) Nitrit (µM) 80 60 40 60 40 20 20 0 0 0 5 10 C57Bl/6 unstimuliert BALB/c unstimuliert C57Bl/6 + Infektion BALB/c + Infektion 100 15 20 25 0 5 10 Zeit (h) 15 20 25 Zeit (h) Abb. 21 Kinetik der NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen nach Stimulation mit LPS (A) und Infektion mit B. pseudomallei (MOI 34) (B). Abgebildet sind gemittelte Doppelwerte der Nitritkonzentration im Zellkulturüberstand eines repräsentativen Versuchs. In Abbildung 21 zeigte sich, dass die Konzentration von Nitrit im Zellüberstand vier Stunden nach Stimulation kaum messbar angestiegen war. Unterschiede zwischen stimulierten/infizierten Zellen und der Negativkontrolle, sowie zwischen den Zellen der verschiedenen Mausstämme waren zu diesem frühen Zeitpunkt noch nicht detektierbar. Im weiteren Verlauf des Versuches stieg der Nitritgehalt im Überstand kontinuierlich an, sodass nach 16 Stunden schon deutliche Unterschiede erkennbar waren, welche sich nach 24 Stunden am besten zeigten. Auf Messungen zu späteren Zeitpunkten wurde jedoch verzichtet, da der Anteil vitaler Zellen in den wells kontinuierlich abnahm, was anhand einer Vitalfärbung der Zellen mit Trypan Blau festgestellt wurde. Aus diesem Grunde wurde bei allen folgenden Versuchen eine Bestimmung des Nitritgehalts 24 Stunden nach der Stimulation vorgenommen. Des Weiteren zeigten die Versuche einen deutlichen Unterschied der NO-Produktion zwischen C57Bl/6-Makrophagen, die deutlich höhere NO-Konzentrationen produzierten, und BALB/c-Makrophagen. Dieses war gleichermaßen in stimulierten wie unstimulierten und infizierten Makrophagen zu beobachten. Im Vergleich der Abbildungen 21A und 21B fällt weiterhin auf, dass eine LPS-Stimulation zu deutlich Ergebnisse höheren 73 Nitritkonzentrationen führte als eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei. 4.5.1.2. Stimulation der NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei Mit diesen Versuchen sollte die Frage geklärt werden, ob ein Unterschied in der Stimulation von NO durch vitale oder hitzeinaktivierte Burkholderia pseudomallei besteht. Da Burkholderia pseudomallei invasiv ist, wäre es möglich, dass der Keim intrazellulär Mechanismen auslöst, oder eigene Mechanismen besitzt, um die NO-Produktion intrazellulär zu beeinflussen. Inaktivierte Bakterien dagegen gelangen nur durch Phagozytose in den intrazellulären Raum und sind sonst lediglich in der Lage, die NO-Produktion Makrophagenoberfläche zu durch Stimulation beeinflussen. Für von Rezeptoren diesen Versuch auf der wurden Knochenmarkmakrophagen von C57BlI6- und BALB/c-Mäusen mit vitalen oder inaktivierten Bakterien verschiedener Infektionsdosen infiziert. Nach 30-minütiger Infektion wurden die Zellen in kanamycinhaltigem Medium zur Bestimmung der intrazellulären Keimzahl 24 Stunden inkubiert. Als Kontrolle wurde dieser Versuch in gleicher Weise auch mit Salmonella Typhimurium durchgeführt, da von Salmonella bekannt ist, dass C57Bl/6- und BALB/c-Mäuse eine etwa gleiche Empfänglichkeit gegenüber einer Infektion besitzen. Als Negativkontrolle wurden je zwei wells mit nicht infizierten Makrophagen verwendet. Ergebnisse 74 A B 80 80 Salmonella Tyhimurium B. pseudomallei C57Bl/6 + vital C57Bl/6 + inaktiviert BALB/c + vital BALB/c + inaktiviert 60 Nitrit (µM) Nitrit (µM) 60 40 20 C57Bl/6 + vital C57Bl/6 + inaktiviert BALB/c + vital BALB/c + inaktiviert 40 20 0 0 ohne 4 19 MOI 59 110 ohne 6 13 54 120 MOI Abb. 22 NO-Stimulation in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen durch Infektion mit vitalen und hitzeinaktivierten B. pseudomallei (A) und Salmonella Typhimurium (B). Abgebildet sind gemittelte Doppelwerte der Nitritkonzentration des Zellkulturüberstandes aus einem repräsentativen Versuch. Nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei (Abb. 22A) wurde deutlich, dass C57Bl/6 Makrophagen unter den gegebenen Bedingungen im Vergleich zu BALB/c-Makrophagen in etwa doppelt so viel NO produzierten. Des Weiteren war die NO-Produktion von der Infektionsdosis abhängig. Sie nahm mit steigender Infektionsdosis zu. Dosen unterhalb einer MOI von 5 schienen dabei die NO-Produktion im Vergleich zur Negativkontrolle nicht zu beeinflussen. Dagegen übte die Vitalität der Bakterien einen deutlichen Einfluss auf die Stimulation von NO aus. Bei allen verschiedenen Infektionsdosen war zu erkennen, dass bei den Makrophagen beider Mausstämme vitale Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu inaktivierten Bakterien zu einer deutlich höheren Nitritkonzentration im Überstand führten. Auch Salmonella Typhimurium zeigte eine dosisabhängige Stimulation der NO-Synthese in primären Makrophagen von C57Bl/6 und BALB/c. Dabei fiel allerdings auf, dass der Unterschied in der NO-Produktion zwischen den Zellen der beiden Mausstämme weniger stark ausgeprägt war. Des Weiteren war nach einer Infektion mit Salmonella schon durch geringe Infektionsdosen ein deutlicher Anstieg Ergebnisse 75 der NO-Produktion induzierbar. Weiterhin war festzustellen, dass inaktivierte Salmonellen bei geringen Infektionsdosen im Gegensatz zu den vitalen Bakterien sogar zu einer höheren NO-Produktion führten und sich dieses Verhältnis erst bei Infektionsdosen von über MOI 50 langsam umkehrte. 4.5.1.3. Stimulation der NO-Produktion durch EPS- Immunkomplexe In diesen Experimenten sollte untersucht werden, inwieweit die NO-Produktion durch Immunkomplexe aus EPS 1 von Burkholderia pseudomallei und verschiedenen Isotyp-Switch Varianten der EPS-spezifischen Antikörperklone 3015 und 3165 stimuliert werden kann. Immunkomplexe vermitteln auf der Oberfläche von Makrophagen eine Kreuzvernetzung von Fc-Rezeptoren und somit eine Aktivierung der Zelle. Da sich in Vorversuchen gezeigt hatte, dass EPS allein schon ein gewisses Potenzial zur NO-Stimulation besitzt, was vermutlich auf eine geringe LPS- Kontamination zurückzuführen war, wurde den Immunkomplexen zusätzlich Polymyxin B zugesetzt. Im Anschluss an die 30-minütige Stimulation mit den EPS-Immunkomplexen wurde das Medium ausgetauscht und 24 Stunden später der Nitritgehalt im Überstand bestimmt. Auch bei diesen Versuchen wurden die Zellen beim Aussäen mit IFNγ Knochenmarkmakrophagen von stimuliert. In C57Bl/6-Mäusen allen Versuchen eingesetzt, da wurden diese auf Stimulation hin eine höhere NO-Produktion zeigten und somit besser auswertbare Ergebnisse erwarten ließen. Als Negativkontrolle wurden zwei wells nur mit Medium behandelt und zu zwei Weiteren, anstelle von EPS-Immunkomplexen, lediglich EPS und Polymyxin B gegeben. Ergebnisse 76 A B 35 80 IgG2a- + IgG2b EPS-Komplex 30 pIgA EPS-Komplex 60 Nitrit (µM) Nitrit (µM) 25 20 15 10 40 20 5 0 0 0 EPS 3015 IgG2a 3015 IgG2b 3165 IgG2a 0 C EPS 3015 IgG2a 3015 pIgA D 35 50 IgG1 EPS-Komplex 30 Antikörper allein (Negativkontrolle) 40 Nitrit (µM) Nitrit (µM) 25 30 20 20 15 10 10 5 0 0 0 EPS 3015 IgG1 0 3165 IgG1 3015 IgG1 3015 IgG2a 3015 IgG2b 3015 pIgA Abb. 23 Stimulation von NO in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6 durch EPS-Immunkomplexe mit verschiedenen Isotypen monoklonaler Antikörper. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichung der Nitritkonzentration des Zellkulturüberstandes aus Dreifach-Werten eines repräsentativen Versuches. NO lässt sich durch EPS-Immunkomplexe von IgG2a und IgG2b der beiden Klone 3015 und 3165 stimulieren (Abb. 23A). Dagegen zeigte eine Stimulation von Knochenmarkmakrophagen mit EPS-Immunkomplexen aus 3015 pIgA keine Erhöhung der NO-Synthese, wie im direkten Vergleich mit 3015 IgG2a deutlich wird (Abb. 23B). Nach Stimulation mit IgG1-EPS-Immunkomplexen zeigte sich, dass offenbar nur der IgG1 Klon von 3165 in der Lage ist, NO zu induzieren, während 3015 IgG1 keine NO-Stimulation auslöst (Abb. 23C). Die Zugabe von Antikörpern Ergebnisse 77 allein (Negativkontrolle, exemplarisch für die Isotypen des Klons 3015 gezeigt) induzierte dagegen keinen Anstieg der NO-Produktion (Abb. 23D). 4.5.2. Die Rolle von NO in der intrazellulären bakteriziden Aktivität von Knochenmarkmakrophagen Die oben abgebildeten Versuche haben gezeigt, dass Knochenmarkmakrophagen sowohl durch Infektion mit vitalen und inaktivierten Burkholderia pseudomallei sowie durch EPS-Immunkomplexe zur Produktion von NO aktiviert werden. Nun stellt sich jedoch die Frage, inwieweit das gebildete NO auch die intrazelluläre Abwehr von Burkholderia pseudomallei beeinflusst und ob diesbezüglich Unterschiede zwischen den Makrophagen der Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c bestehen. Im Folgenden wurde deshalb die intrazelluläre bakterizide Aktivität von Makrophagen in Abwesenheit von NO untersucht. 4.5.2.1. NO-Hemmung bei C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen Im ersten Ansatz wurde die Produktion von NO in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen mit Aminoguanidin gehemmt. Aminoguanidin dient dabei als kompetetiver Inhibitor der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und wurde dem Zellkulturmedium zugesetzt. Der Erfolg der Hemmung der NO-Synthese konnte durch das Fehlen von Nitrit im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden. In diesen Versuchen wurde zunächst die Aufnahme der Bakterien in die Zellen, die beim Aussäen mit IFNγ stimulierten wurden, durch Keimzahlbestimmung 30 min nach der Infektion bestimmt. 24 Stunden später wurde dann erneut eine Keimzahlbestimmung durchgeführt. Ergebnisse 78 A B 7 400 24 Stunden p.i. 6 Keimzahl intrazellulär Keimzahl intrazellulär (Log 10) 0 Stunden p.i. 5 4 3 2 300 200 p=0,001 * 100 1 0 0 BALB/c BALB/c + AG C57Bl/6 C57Bl/6 +AG BALB/c BALB/c + AG C57Bl/6 C57Bl/6 +AG Abb. 24 Aufnahme (A) und Abtötung (B) von B. pseudomallei (MOI 109-164) in INFγ stimulierten Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen nach Hemmung von iNOS mit Aminoguanidin im Vergleich zur iNOS ungehemmten Kontrolle. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifachbestimmung eines repräsentativen Versuchs (A) bzw. aus 8-fach Bestimmung dreier unabhängiger Versuche (B). In diesem Experiment wurde deutlich, dass nach anfänglich gleicher intrazellulärer Aufnahme der Bakterien (Abb. 24A) deutliche Unterschiede der intrazellulären Keimzahl nach 24 Stunden bestanden. Die Makrophagen von BALB/c-Mäusen zeigten nach einer Hemmung von iNOS durch Aminoguanidin eine hochsignifikant erhöhte Keimzahl gegenüber den ungehemmten Zellen (p=0,001). C57Bl/6-Makrophagen besaßen dagegen sowohl in iNOS gehemmten wie ungehemmten Zellen nahezu die gleiche Keimzahl (Abb. 24B). 4.5.2.2. Invasion und Bakterizidie bei iNOS-Knock-out-Makrophagen Da trotz Hemmung von iNOS mit Aminoguanidin noch die Möglichkeit einer Restaktivität des Enzyms besteht, welche möglicherweise noch für eine effektive intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei in C57Bl/6-Makrophagen ausreicht, sollte das Ergebnis aus Abbildung 24B zusätzlich in Knochenmarkmakrophagen von iNOS-Knock-out Mäusen überprüft werden. Mit den Knochenmarkmakrophagen dieser Knock-out-Tiere und einer Kontrolle aus Ergebnisse 79 C57Bl/6-WT-Makrophagen wurden ebenfalls Invasions- und Bakterizidie-Assays durchgeführt. Die Invasion wurde dabei nach einer 30-minütigen Infektion mit Burkholderia pseudomallei bestimmt, während für die Untersuchung der intrazellulären bakteriziden Aktivität eine an die Infektion anschließende 16-stündige Inkubation in kanamycinhaltigem Medium folgte. Diese Versuche wurden zum Vergleich in IFNγ stimulierten und unstimulierten Zellen durchgeführt. A B 5 6 Keimzahl intrazellulär (Log 10) Keimzahl intrazellulär (Log 10) 0 Stunden p.i. 5 4 3 2 1 16 Stunden p.i. 4 3 2 1 0 0 iNOS KO + IFN iNOS KO C57Bl/6 +IFN iNOS KO + IFN C57Bl/6 iNOS KO C57Bl/6 +IFN C57Bl/6 Abb. 25 Aufnahme (A) und Abtötung (B) von B. pseudomallei (MOI 176) in iNOS-KO- und C57Bl/6Knochenmarkmakrophagen mit und ohne vorherige Stimulation durch IFNγ. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifach-Bestimmungen eines repräsentativen Versuchs. Die Untersuchung der Invasion von Burkholderia pseudomallei in iNOS-Knock-outund C57Bl/6-Makrophagen (Abb. 25A) ergab keinen Unterschied in der intrazellulären Keimzahl direkt nach der Infektion. Auch bei IFNγ stimulierten und unstimulierten Zellen war die Invasion der Bakterien in die Zellen gleich. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die zu späteren Zeitpunkten festgestellten Unterschiede ausschließlich auf die bakterizide Aktivität der Zellen zurückzuführen war. 16 Stunden nach der Infektion (Abb. 25B) zeigte sich, dass IFNγ unabhängig von der Anwesenheit von iNOS eine deutliche Verbesserung der Bakterizidie induzierte. Vergleicht man nun aber iNOS-Knock-out Makrophagen mit den Wildtyp- Ergebnisse 80 Makrophagen, so zeigten die Knock-out-Makrophagen sogar einen geringen Vorteil bei der intrazellulären Abtötung der Bakterien. Dieses galt sowohl bei IFNγstimulierten als auch unstimulierten Zellen. 4.5.2.3. Antikörper-vermittelte Phagozytose bei iNOS-Knock-out-Makrophagen Mit diesem Experiment sollte untersucht werden, ob iNOS Knock-out Makrophagen in der Lage sind, Bakterien durch Antikörper-vermittelte Phagozytose genauso gut aufzunehmen wie Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6-Wildtyp-Mäusen. Dieses ist insbesondere für die anschließenden Versuche zur passiven Immunisierung von iNOS-Knock-out-Mäusen von Bedeutung, da eine verbesserte intrazelluläre Aufnahme der Bakterien einen möglichen Mechanismus für die Protektion darstellt. Hier wurden mit IFNγ stimulierte Zellen mit 3015 IgG2a opsonisierten Bakterien infiziert und die intrazelluläre Keimzahl 30 min nach der Infektion bestimmt. Als unspezifischer Kontrollantikörper wurde 898 IgG2a verwendet. Keimzahl intrazellulär 80000 60000 40000 20000 0 iNOS KO iNOS KO + IgG2a C57Bl/6 C57Bl/6 +IgG2a Abb. 26 Anti-EPS 3015 IgG2a-vermittelte Phagozytose von primären iNOS-KO- und C57Bl/6- Knochenmarkmakrophagen bei Infektion mit B. pseudomallei (MOI 50). Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifach-Werten eines repräsentativen Experimentes. Aus den Daten der Abbildung 26 wird ersichtlich, dass iNOS Knock-out Makrophagen in gleicher Weise wie C57Bl/6 Makrophagen in der Lage sind, Ergebnisse 81 opsonisierte Bakterien zu phagozytieren, was sich in einer um den Faktor drei bis vier erhöhten intrazellulären Keimzahl niederschlägt. 4.5.3. Bedeutung von NO in vivo: Suszeptibilität von iNOS-Knock-out-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei Die Ergebnisse aus den in vitro Versuchen sprechen dafür, dass ein Fehlen von NO in C57Bl/6-Makrophagen sich nicht nachteilig auf die intrazelluläre Abwehr von Burkholderia pseudomallei auswirkt. Nun stellt sich jedoch die Frage, ob ein Fehlen der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) in vivo die Fähigkeit des Wirts zur Bekämpfung einer Burkholderia pseudomallei Infektion beeinträchtigt, da NO neben der Funktion der intrazellulären Bakterizidie noch in viele andere Mechanismen des Organismus eingreift. Aus diesem Grund wurden iNOS-Knock-out-Mäuse infiziert und passiv immunisiert. Als Kontrolltiere in diesen Versuchen dienten C57Bl/6-Wildtyp-Mäuse. Zunächst wurde die Bedeutung von iNOS bei einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei untersucht. Dabei wurde die Mortalität nach intranasaler Infektion von iNOS Knock-out- im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen dokumentiert. Im Folgenden wurden die Keimzahlen der Lungen von iNOS-Knock-out- und C57Bl/6-Tieren 48 Stunden nach intranasaler Infektion bestimmt. Ergebnisse 82 B 2 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tage p.i. S 0 l/6 3 57 B 4 O lebende Tiere 5 C iNOS KO C57Bl/6 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 iN 6 CFU Lunge (Log 10) 7 KO A Abb. 27 Vergleich von Mortalität (A) und Keimzahl der Lunge (B) von iNOS-KO- und C57Bl/6-Mäusen nach intranasaler Infektion mit B. pseudomallei (3-3,4 x10³ (A)) bzw. (4-5,4 x104 (B)). Dargestellt sind Daten aus jeweils zwei unabhängigen Versuchen. Im Vergleich der Mortalität (Abb. 27A) zwischen C57Bl/6- und iNOS Knock-out Mäusen zeigten die iNOS-Knock-out Tiere eine geringere Sterblichkeit als die C57Bl/6-Mäuse. Während am Tag fünf nach der Infektion bereits alle sechs C57Bl/6-Mäuse verstorben waren, überlebten vier von sechs iNOS-Knock-out-Tieren die Infektion über den beobachteten Zeitraum von 14 Tagen. Allerdings zeigte die Bestimmung der pulmonalen Keimzahl 48 Stunden nach der Infektion (Abb. 27B) keinen Unterschied der bakteriellen Besiedlung der Lungen mit Burkholderia pseudomallei im Vergleich von iNOS-Knock-out- mit C57Bl/6-Mäusen. 4.5.3.1. Passive Immunisierung von iNOS-Knock-out-Mäusen Da in den vorangegangenen Versuchen der Einfluss von Immunkomplexen auf die NO-Produktion nachgewiesen werden konnte, sollte in den folgenden Versuchen die Wirkung einer passiven Immunisierung mit 3015 IgG2a auf die Mortalität und Keimzahl der Lunge 48 Stunden nach intranasaler Infektion und passiver Immunisierung bei iNOS Knock-out Mäusen untersucht werden. Als Kontrolle dienten dabei C57Bl/6 Mäuse. Die erste Gruppe C57Bl/6 wurde ebenfalls mit 3015 IgG2a Ergebnisse 83 immunisiert (Positivkontrolle), während die zweite Gruppe den unspezifischen Antikörper 898 IgG2a erhielt (Negativkontrolle). A B 3 2 1 12 iNOS KO + 3015 IgG2a C57Bl/6 + 3015 IgG2a C57Bl/6 Kontrolle 14 16 + 10 Ig G 8 Tage p.i. C 57 Bl /6 6 + 4 S 2 iN O 0 Ig G 2a 0 Ko nt ro lle *p=0,034 4 + lebende Tiere 5 * 2a 6 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 C 57 Bl /6 CFU Lunge (Log 10) 7 Abb. 28 Mortalität (A) und Keimzahlen der Lunge (B) 48 Stunden nach passive Immunisierung mit antiEPS 3015 IgG2a und intranasaler Infektion mit B. pseudomallei von iNOS-KO- und C57Bl/6Mäusen. Die Tiere wurden mit 5,1–5,8 x 103 (A) bzw. 4,5–5,6 x 104 (B) Keimen pro Tier infiziert. Als Kontrollantikörper wurde 898 IgG2a verwendet. Abgebildet sind Daten aus jeweils zwei unabhängigen Versuchen. Die Untersuchung der Mortalität (Abb. 28A) nach passiver Immunisierung von iNOS-Knock-out- und C57Bl/6-Mäusen zeigte, dass sowohl iNOS-Knock-out als auch C57Bl/6-Tiere durch Gabe des gegen EPS von Burkholderia pseudomallei gerichteten Antikörpers 3015 IgG2a geschützt werden. Diese Protektion wird durch eine verzögerte sowie eine signifikant verringerte Sterblichkeit der immunisierten Tiere im Vergleich zur Negativkontrolle deutlich. In diesen Versuchen lebten von den immunisierten iNOS-Knock-out Mäusen 14 Tage nach Infektion noch vier von sechs Tieren. Von der immunisierten C57Bl/6-Gruppe überlebten drei von sechs Tieren, während alle Tiere der Negativkontrollgruppe bereits am fünften Tag tot waren. Das bedeutet, dass auch immunisierte iNOS-Knock-out-Mäuse signifikant (p=0,034) besser überlebten als die nicht immunisierten C57Bl/6-Kontrolltiere. Ergebnisse 84 Die geringere Mortalität der immunisierten iNOS-Knock-out-Mäuse korrelierte auch mit einer geringeren Keimzahl der Lunge 48 Stunden nach Infektion und Immunisierung (Abb. 28B). Sowohl die immunisierten iNOS-Knock-out- wie auch C57Bl/6-Tiere trugen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant geringere Keimzahlen in der Lunge (piNOS = 0,049, pC57Bl/6 =0,084). 4.5.4. Stimulation von ROI in Knochenmarkmakrophagen Neben NO ist die Freisetzung von ROI ein Mechanismus der Abwehr intrazellulärer Erreger in Makrophagen. In den folgenden Experimenten sollte untersucht werden, inwiefern ROI durch unspezifische und spezifische Stimulation in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen freigesetzt werden und welche Rolle sie in der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo und in vitro spielen. 4.5.4.1. Kinetik der Sauerstoffradikalproduktion in C57Bl/6- und BALB/cKnochenmarkmakrophagen nach Stimulation mit Phorbol Myristat Acetat Da im Rahmen des Respiratory burst freigesetzte ROI nur eine sehr kurze Halbwertzeit besitzen, ist ihr direkter Nachweis sehr schwierig. Deshalb wurden in den folgenden Versuchen Peroxide, welche ein direktes Reaktionsprodukt der ROI in der Zelle sind, mithilfe der Umsetzung von 2´,7´Dichloroflueszein Diacetat (DCF-DA) in 2´,7´ Dicholorfluoreszein (DCF) und Messung dessen Fluoreszenz nachgewiesen. Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen wurden mit 200 nM Phorbol 12-Myristat 13- Acetat (PMA) stimuliert und die Fluoreszenz gemessen. Von den Messwerten wurde anschließend der Leerwert abgezogen, welcher an Zellen ohne PMA Stimulation bestimmt wurde. Ergebnisse 85 3000 C57Bl/6 BALB/c 2500 RFU 2000 1500 1000 500 0 -500 0 20 40 60 80 Zeit (min) Abb. 29 Stimulation von C57Bl/6- und BALB/c Knochenmarkmakrophagen mit PMA und Messung der Peroxidproduktion. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der relativen Fluoreszenz aus Sechsfach-Bestimmungen eines repräsentativen Versuchs. Zu Beginn des Versuchs waren die Messwerte von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen hinsichtlich der Peroxidproduktion noch nahezu identisch. Im Verlauf der Messung nach Stimulation zeigten C57Bl/6- gegenüber BALB/cMakrophagen einen deutlich höheren Anstieg der Peroxidproduktion. Dies lässt darauf schließen, dass C57Bl/6- im Vergleich zu BALB/c-Makrophagen auf unspezifische Stimulation hin deutlich mehr ROI freisetzen. 4.5.4.2. Stimulation von ROI nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei Im Anschluss an die Messung von Peroxiden nach unspezifischer Stimulation sollte auch der Einfluss einer Infektion auf die Freisetzung von ROI in C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen untersucht werden. Dabei wurden Knochenmarkmakrophagen beider Mausstämme beim Aussäen mit IFNγ stimuliert, am nächsten Tag infiziert und die Peroxidproduktion 60 min nach Infektion bestimmt. Da Burkholderia pseudomallei eine bakterielle Katalase besitzt, die in der Lage ist Peroxide abzubauen, wurde der Effekt von vitalen und hitzeinaktivierten Bakterien auf die Peroxidproduktion verglichen. Neben Burkholderia pseudomallei WT E8 wurde auch Pseudomonas aeruginosa PAO I untersucht. Im Gegensatz zu Burkholderia pseudomallei handelt es sich bei Pseudomonas aeruginosa um einen nicht invasiven Erreger, der lediglich extrazellulär auf die Zellen einwirken kann. Die Infektionsdosen bei Ergebnisse 86 C57Bl/6-Makrophagen lagen für Burkholderia pseudomallei bei MOI 0,28 und für Pseudomonas aeruginosa bei MOI 5,3. Da bei BALB/c-Makrophagen in diesen niedrigen Dosen kein Effekt auf die Peroxidbildung sichtbar war, lagen hier die Dosen bei MOI 12 für Burkholderia pseudomallei und MOI 22,5 für Pseudomonas aeruginosa. A B 20000 4000 3000 15000 2000 10000 RFU RFU vital inaktiviert BALB/c vital inaktiviert C57Bl/6 1000 0 5000 0 -1000 -5000 B. pseudomallei PAO I B. pseudomallei PAO I Abb. 30 Peroxidproduktion in Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen durch Infektion mit vitalen und hitzeinaktivierten B. pseudomallei und P. aeruginosa . Die Messwerte wurden jeweils vom Leerwert abgezogen. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der relativen Fluoreszenz aus Vierfach-Werten eines repräsentativen Experimentes. Nach Infektion von C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen mit den oben genannten Erregern zeigte sich, dass im Gegensatz zu vitalen Burkholderia pseudomallei vitale Pseudomonas aeruginosa in der Lage waren, die Sauerstoffradikalfreisetzung zu stimulieren. Die Messwerte von Burkholderia pseudomallei lagen sogar noch unter den Leerwerten, was auf einen effektiven Abbau der Peroxide durch die bakteriellen Katalasen hindeuten könnte, der möglicherweise durch die intrazelluläre Lage der Erreger begünstigt würde. Nach Infektion der Zellen mit hitzeinaktivierten Bakterien stimulierten sowohl Burkholderia pseudomallei als auch Pseudomonas aeruginosa die Sauerstoffradikalfreisetzung. Ergebnisse 87 4.5.4.3. Intrazelluläre Bakterizidie von p47phox-Knock-out- im Vergleich zu C57Bl/6-Makrophagen Nachdem Burkholderia pseudomallei offenbar in der Lage ist, Peroxide abzubauen, sollte dennoch die Bedeutung von ROI für die intrazelluläre Abwehr von Burkholderia pseudomallei an Knochenmarkmakrophagen von p47phox-Knock-out-Mäusen auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6-Mäusen untersucht werden. Bei p47phox handelt es sich um eine katalytische Untereinheit des NADPH-Oxidase Komplexes, welcher in der Membran von Phagosomen lokalisiert und für die Bildung von ROI verantwortlich ist. Durch den Knock-out von p47phox fehlt den Tieren also die Fähigkeit zur Produktion und Freisetzung von ROI. In den folgenden Versuchen wurden Knochenmarkmakrophagen von p47phox-Knock-out- und C57Bl/6-Mäusen mit und ohne Zugabe von IFNγ ausgesät. Am nächsten Tag erfolgte die Infektion mit Burkholderia pseudomallei für 30 min und die Bestimmung der intrazellulären Keimzahl zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. A B 6 MOI 95 6 Keimzahl intrazellulär (Log 10) Keimzahl intrazellulär (Log 10) 7 5 4 3 2 p47phox KO +IFN C57Bl/6 +IFN 1 MOI 60 5 4 3 2 p47 phox KO p47phox KO + IFN C57Bl/6 C57Bl/6 + IFN 1 0 0 0 1 2 3 4 0 5 Zeit (h) 5 10 15 20 25 30 Zeit (h) Abb. 31 Vergleich der intrazellulären Bakterizidie IFNγ stimulierter (A+B) und unstimulierter (B) Knochenmarkmakrophagen von p47phox-KO- und C57Bl/6-Mäusen nach Infektion mit B. pseudomallei. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Sechsfach-Werten aus zwei unabhängigen Versuchen (A) bzw. Dreifach-Werte eines repräsentativen Versuchs (B). Ergebnisse 88 Wie in den Abbildungen 31A und 31B zu sehen ist, besteht zwischen C57Bl/6- und p47phox-Knock-out-Makrophagen kein Unterschied bezüglich der Invasion von Burkholderia pseudomallei in die Zellen. Im Verlauf der Infektion deutete sich zwar in der Frühphase bis vier Stunden nach der Infektion (Abb. 31A) eine geringgradig bessere Abtötung der C57Bl/6-Makrophagen an, dieses bestätigte sich jedoch im weiteren Verlauf des Versuchs bis zu einem Zeitpunkt von 24 Stunden nach der Infektion (Abb. 31B) nicht. Ebenso wie die Abwesenheit von NO besitzt auch das Fehlen von ROI, unabhängig von IFNγ, keinen Einfluss auf die intrazelluläre bakterizide Aktivität von C57Bl/6-Makrophagen. 4.5.5. Bedeutung von ROI in vivo: Suszeptibilität von p47phox-Knock-outMäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei Aufgrund der vielfältigen Funktionen von ROI in vivo kann aufgrund der Beobachtung, dass kein Zusammenhang zwischen intrazellulärer Abtötung von Burkholderia pseudomallei in Makrophagen und der Anwesenheit von ROI besteht, trotzdem ein Einfluss von ROI in vivo vermutet werden. Deshalb wurden p47phox-Knock-out- und C57Bl/6-Mäuse intranasal mit Burkholderia pseudomallei infiziert und die Mortalität beider Gruppen über einen Zeitraum von 14 Tagen verglichen. 10 phox KO C57Bl/6 lebende Tiere 8 6 4 2 * p= 0,002 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tage p.i. Abb. 32 Mortalität von p47phox-KO- und C57Bl/6-Mäusen nach intranasaler Infektion mit 3,2 – 4,5 x 103 Burkholderia pseudomallei pro Tier. Dargestellt sind zusammengefasste Daten aus zwei unabhängigen Experimenten. Ergebnisse 89 Die Untersuchung der Mortalität von C57Bl/6- und p47phox-Knock-out-Mäusen zeigte einen deutlichen Unterschied in der Suszeptibilität zwischen beiden Gruppen. Während alle Tiere der Knock-out-Gruppe schon am Tag drei verstorben waren, überlebten drei Tiere der C57Bl/6-Gruppe die Infektion über den Zeitraum von 14 Tagen. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war mit einem Wert von p=0,002 statistisch signifikant. 4.5.6. IFNγ bei Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei in vivo Im Rahmen der Wirtsabwehr spielt IFNγ eine wichtige Rolle bei der Abwehr vor allem intrazellulärer Erreger. IFNγ wird unter anderem von Natürlichen Killer Zellen nach Stimulation durch IL-12 und IL-18 sezerniert und dient der Aktivierung von Abwehrfunktionen in Immunzellen, wie etwa der Stimulation von Makrophagen. Die vorherigen Experimente haben gezeigt, das IFNγ eine verbesserte intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei unabhängig von NO und ROI induziert. Hier sollte nun untersucht werden, welche Auswirkungen eine Neutralisation von IFNγ im Organismus von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen auf eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei hat. In den folgenden Experimenten wurde deshalb IFNγ durch intraperitoneale Gabe eines neutralisierenden Antikörpers (Subklasse IgG1) gebunden, sodass es dem Immunsystem nicht mehr zur Verfügung stand. Die Gabe des Antikörpers erfolgte sechs Stunden vor der Infektion, um eine gute Distribution im Organismus zu erreichen. Da IgG im Körper von Säugetieren eine Halbwertszeit von mehreren Tagen besitzt, wurde die einmalige Gabe von 300 µg pro Tier für den Untersuchungszeitraum für ausreichend erachtet. 4.5.6.1. Neutralisierung von IFNγ bei C57Bl/6-Mäusen Zunächst wurden die Folgen einer in vivo-Neutralisierung von IFNγ bei C57Bl/6-Mäusen untersucht. Dabei wurden zum einen die Mortalität nach intranasaler Infektion mit Burkholderia pseudomallei und zum anderen die Gesamtkeimzahlen in Lunge, Leber und Milz der Tiere 48 Stunden nach Infektion bestimmt. Ergebnisse 90 A B 8 7 IFN inhibiert Kontrolle 7 4 3 1 2 0 1 M ilz 0 G 2 16 Le be r 14 G 1 Tage p.i. 12 2 10 Lu ng e 8 G 6 M ilz 4 1 2 G 2 0 G *p=0,001 2 5 Le be r 3 6 1 4 Lu ng e lebende Tiere 5 G CFU (Log 10) 6 Abb. 33 Mortalität (A) und Keimzahlen der inneren Organe (B) nach Neutralisierung von INFγ bei C57Bl/6-Mäusen und intranasale Infektion mit B. pseudomallei. 6 Stunden vor Infektion wurde IFNγ durch intraperitoneale Injektion von 300 µg/Tier R4-6A2 IgG1 gehemmt (Gruppe 1). Die Kontrolltiere (Gruppe 2) erhielten PBS oder γ-Globulin der Ratte in gleicher Menge und Volumen. Die Infektion erfolgte mit einer Dosis von 1,8–2 x 10² (A) und 1,9 x 10² (B). Dargestellt sind zusammengefasste Daten aus jeweils 2 unabhängigen Versuchen. In diesen Versuchen wird deutlich, dass die Neutralisierung von IFNγ zu einer dramatisch erhöhten Mortalität bei C57Bl/6-Mäusen führt. Schon sechs Tage nach der Infektion waren alle Tiere dieser Gruppe verstorben, während in der Kontrollgruppe fünf von insgesamt sechs Tieren die Infektion überlebten, was einem statistisch signifikanten Unterschied von p=0,001 entspricht. Die erhöhte Mortalität nach Neutralisation von IFNγ korrelierte auch mit einer erhöhten Gesamtkeimzahl in Lunge, Leber und Milz dieser Tiere. In allen drei Organen war die Keimzahl der IFNγ gehemmten Gruppe signifikant höher (Lunge p=0,05, Leber p=0,034, Milz p=0,025) als in der Kontrollgruppe. Die totalen Keimzahlen unterschieden sich dabei um etwa zwei Log-Stufen. Die deutlicheren Signifikanzunterschiede von Milz und Leber sprechen womöglich für eine zusätzlich größere Streuung der Keime nach einer Neutralisierung von IFNγ. Ergebnisse 91 4.5.6.2. Neutralisierung von IFNγ bei BALB/c-Mäusen Es gibt aus der Literatur Hinweise darauf, dass BALB/c-Mäuse generell weniger IFNγ produzieren als C57Bl/6-Mäuse. Deshalb wurde die Bedeutung von IFNγ bei Burkholderia pseudomallei Infektionen in vivo analog zu den Versuchen mit C57Bl/6- auch an BALB/c-Mäuse untersucht. Auch bei diesem Mausstamm wurden Mortalität sowie Gesamtkeimzahlen in Lunge, Leber und Milz 48 Stunden nach intranasaler Infektion bestimmt. A B 7 8 7 CFU (Log 10) 6 lebende Tiere 5 4 3 2 IFN inhibiert Kontrolle 1 6 5 4 3 2 1 ilz r 2 M be 2 G G Le ng ilz G 2 1 Lu M be G 16 r e 14 Le 12 1 10 ng 8 Tage p.i. G 6 Lu 4 1 2 G 0 e 0 0 Abb. 34 Mortalität (A) und Keimzahlen der inneren Organe (B) nach Neutralisierung von INFγ bei BALB/c-Mäusen und intranasale Infektion mit B. pseudomallei. 6 Stunden vor Infektion wurde IFNγ durch intraperitoneale Injektion von 300 µg/Tier R4-6A2 IgG1 gehemmt (Gruppe 1). Die Kontrolltiere (Gruppe 2) erhielten PBS in gleichem Volumen. Die Infektion erfolgte mit einer Dosis von 4,2–9,3 (A) und 6,6–14,7 (B). Dargestellt sind zusammengefasste Daten aus jeweils 2 unabhängigen Versuchen. Im Gegensatz zu C57Bl/6- zeigten BALB/c-Mäuse nach einer Hemmung von IFNγ nur ein geringgradig schnelleres Versterben gegenüber den Kontrolltieren. Die Zahl überlebender Tiere nach einem Beobachtungszeitraum von 14 Tagen betrug in beiden Gruppen insgesamt drei von sechs Tieren. Auch im Vergleich der Keimzahlen der Organe von IFNγ neutralisierten und nicht neutralisierten Tieren ergaben sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich der bakteriellen Besiedlung von Lunge, Leber und Milz. Ergebnisse 92 4.6. Rolle verschiedener Fcγ-Rezeptoren bei Phagozytose und NOProduktion von Knochenmarkmakrophagen Wie schon in den in Abbildung 23 gezeigt wurde, sind EPS-Immunkomplexe der verschiedenen Subklassen von IgG in der Lage, die intrazelluläre NO-Produktion in Knochenmarkmakrophagen zu stimulieren. Zur näheren Charakterisierung dieses Phänomens sollte hier untersucht werden, welche der drei verschiedenen Fcγ-Rezeptoren an dieser Stimulation beteiligt, und welche für eine Stimulation essenziell notwendig sind. Untersucht wurde dieses mit IgG2a- und IgG2b-EPS-Immunkomplexen, da diese eine besonders effektive NO-Stimulation gezeigt hatten. Im Folgenden wurden nun Zellen mit verschiedenen Fcγ-RezeptorKnock-outs infiziert bzw. durch EPS-Immunkomplexe die NO-Produktion induziert. 4.6.1. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain-Knock-out-Makrophagen vermittelt durch verschiedene IgG Isotypen Zunächst wurden Knochenmarkmakrophagen von Fcγ-chain Knock-out Mäusen verwendet, dabei handelte es sich um dieselben Tiere, die auch schon in den passiven Immunisierungsversuchen eingesetzt wurden. Da den Zellen durch den Knock-out der γ-Kette die Fcγ-Rezeptoren I und III fehlen, sollte zunächst die Kapazität der Zellen zur IgG- und pIgA-vermittelten Phagozytose untersucht werden. Hierzu wurden die Isotyp-Switch-Varianten des Klons 3015 eingesetzt sowie der Kontrollantikörper 3034 IgG1. Die Infektionsdauer mit den so opsonisierten Burkholderia pseudomallei betrug 30 min zuzüglich einer einstündigen Inkubation in kanamycinhaltigem Medium. Im Anschluss wurde die intrazelluläre Keimzahl bestimmt. Ergebnisse 93 A B 50000 40000 Keimzahl intrazellulär Keimzahl intrazellulär 40000 50000 Fc gamma-chain KO C57Bl/6 30000 20000 10000 Fc gamma-chain KO C57Bl/6 30000 20000 10000 0 0 Kontrolle Kontrolle 3015 pIgA IgG1 IgG2a IgG2b Abb. 35 Vergleich der Phagozytosekapazität von Fcγ-chain-KO- und C57Bl/6-Makrophagen durch Infektion mit B. pseudomallei (MOI 5 (A) und MOI 6 (B) und Opsonisierung mit verschiedenen Isotypen des EPS-spezifischen Antikörperklons 3015. Abgebildet sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifach-Werten eines repräsentativen Versuchs. Im Vergleich mit Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6 besaßen die Makrophagen von Fcγ-chain-Knock-out-Mäusen keine reduzierte Phagozytosekapazität für die Isotypen pIgA, IgG1 und IgG2b des Klons 3015. Allerdings fiel auf, dass nach Opsonisierung der Bakterien mit 3015 IgG2a weniger Keime phagozytiert wurden. Obwohl dieser Effekt in dem abgebildeten Versuch (Abb. 35B) nicht in signifikant reduzierten intrazellulären Keimzahlen resultierte, war er doch bei allen Reproduktionen des Versuchs vorhanden. Dennoch ist auch die IgG2a-vermittelte Phagozytose in der Lage, die intrazelluläre Keimzahl im Vergleich mit dem unspezifischen Kontrollantikörper um mehr als das Doppelte zu erhöhen. Ergebnisse 94 4.6.2. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain Knockout-Makrophagen Zur Untersuchung der Funktion der Fcγ-chain für die Stimulation von NO wurden Fcγ-chain-Knock-out- und stimuliert. den Wie in C57Bl/6-Makrophagen anderen Versuchen mit zur EPS-Immunkomplexen NO-Stimulation mit EPS-Immunkomplexen wurde auch hier dem EPS 100 µg/ml Polymyxin B zugegeben, um LPS-Kontaminationen zu binden. 60 50 Fc gamma-chain KO C57Bl/6 Nitrit (µM) 40 30 20 10 0 0 EPS IgG2a IgG2b Abb. 36 NO-Stimulation durch 3015 IgG2a- und 3015 IgG2b EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain KO- und C57Bl/6 Makrophagen. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung des Nitritgehaltes im Zellkulturüberstand aus Dreifach-Werten eines repräsentativen Experiments. Aus Abbildung 36 wird ersichtlich, dass durch ein Fehlen der γ-Kette in Makrophagen und somit der Fcγ-Rezeptoren I und III eine Stimulation der NO-Synthese durch 3015 IgG2a nicht mehr möglich ist. Im Gegensatz dazu war nach Stimulation mit Immunkomplexen aus 3015 IgG2b weiterhin Nitrit, wenn auch in geringerer Konzentration als bei C57Bl/6-Makrophagen, im Überstand nachweisbar. Dieser Effekt fand nicht nur bei dem Klon 3015 statt, sondern konnte auch beim Einsatz von 3165 IgG2b-Komplexen gezeigt werden. Dieses lässt auf eine Beteiligung des noch auf den Zellen vorhandenen Fcγ-Rezeptors II an der NO-Stimulation schließen. Ergebnisse 95 4.6.3. Phagozytosekapazität von Fcγ-chain/FcγRII-Knock-out vermittelt durch IgG verschiedener Subklassen Um die Frage zu klären, in welcher Weise der Fcγ-Rezeptor II an der Antikörpervermittelten Phagozytose beteiligt ist, wurden für die folgenden Experimente Knochenmarkmakrophagen von Mäusen mit einem Doppel-Knock-out von Fcγ-chain und Fcγ-Rezeptor II eingesetzt. Somit sind auf ihren Makrophagen keine Fcγ-Rezeptoren mehr vorhanden. Da die eingesetzten Doppel-Knock-out-Mäuse nicht auf den genetischen Hintergrund von C57Bl/6 zurückgekreuzt waren, wurden als Kontrollmakrophagen neben C57Bl/6 auch Makrophagen des Mausstammes 129.Sv eingesetzt. Die Fähigkeit zur Antikörper-vermittelten Phagozytose der Zellen wurde anhand verschiedener Isotypen des Antikörperklons 3015 untersucht. Dazu wurden die Zellen für 30 min mit opsonisierten Burkholderia pseudomallei infiziert. Die intrazelluläre Keimzahl wurde auch hier nach einer an die Infektion anschließenden einstündigen Inkubation mit kanamycinhaltigem Medium ermittelt. A B 250000 12000 Fc gamma/FcRII KO C57Bl/6 200000 Keimzahl intrazellulär Keimzahl intrazellulär 10000 8000 6000 4000 Fc Rezeptor KO C57Bl/6 129.Sv 150000 100000 50000 2000 0 0 Kontrolle 3015 pIgA Kontrolle 3015 IgG1 3015 IgG2a 3015 IgG2b Abb. 37 Vergleich der Phagozytosekapazität von Fcγ-chain/FcγRII-KO-, 129.Sv- und C57Bl/6- Makrophagen bei Infektion mit B. pseudomallei (MOI 6 (A) und MOI 35 (B) und Opsonisierung mit verschiedenen Subklassen des EPS-spezifischen Antikörperklons 3015. Als Kontrollantikörper wurden 3034 pIgA (A) und 898 IgG2a (B) verwendet. Abgebildet sind Mittelwert und Standardabweichung der intrazellulären Keimzahl aus Dreifach-Werten eines repräsentativen Versuchs. Ergebnisse 96 Aus diesen Versuchen wurde ersichtlich, dass bei der Invasion der Bakterien in die Zellen in Anwesenheit eines unspezifischen Antikörpers keine Unterschiede zwischen den Makrophagen der verschiedenen Mausstämme und des Knock-outStammes bestanden. Bei der Antikörper-vermittelten Phagozytose sah man jedoch, dass in den Knock-out-Makrophagen lediglich die Opsonisierung mit pIgA zu einer deutlichen Erhöhung der intrazellulären Keimzahl führte. Im Gegensatz dazu waren 3015 IgG1, IgG2a und IgG2b bei einem Fehlen aller drei Fcγ-Rezeptoren nicht mehr in der Lage, eine Erhöhung der intrazellulären Keimzahl zu induzieren. 4.6.4. Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe bei Fcγ-chain/FcγRIIKnock-out-Makrophagen Um die Funktion des Fcγ-Rezeptors II für die Stimulation von NO durch IgG2b EPS-Immunkomplexe zu untersuchen, wurden auch in den folgenden Versuchen die unter 4.6.3. genannten Doppel-Knock-out-Mäuse eingesetzt. Zur Immunkomplexstimulation wurden Komplexe aus 3015 IgG2a, 3015 IgG2b und 3165 IgG2b und EPS wie unter 4.5.1.3. beschrieben, verwendet. 35 30 Fc-Rezeptor KO C57Bl/6 Nitrit (µM) 25 20 15 10 5 0 0 EPS 3015 IgG2a 3015 IgG2b 3165 IgG2b Abb. 38 NO Stimulation durch 3015 IgG2a und IgG2b sowie 3165 IgG2b EPS-Immunkomplexe bei Fcγchain/FcγRII-KO- im Vergleich zu C57Bl/6-Makrophagen. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung des repräsentativen Experiments. Nitritgehaltes im Zellkulturüberstand aus Dreifach-Werten eines Ergebnisse 97 In diesem Versuch wird deutlich, dass ohne das Vorhandensein von Fcγ-Rezeptoren auf der Makrophagenoberfläche keine NO-Stimulation mehr über EPS-Immunkomplexe mit den IgG Subklassen 2a und 2b stattfindet. In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz dazu nach Stimulation mit LPS kein Unterschied in der NO-Produktion zwischen C57Bl/6- und Knock-out-Makrophagen besteht, was verdeutlicht, dass in den Fcγ-Rezeptor-Knock-out-Makrophagen die NO-Produktion nicht generell vermindert ist. 4.6.5. Rolle von NF-κB bei der Induktion der NO-Produktion durch EPSImmunkomplexe Es ist aus der Literatur bekannt, dass LPS vermittelte NO-Induktion über den globalen Transkriptionsfaktor NF-κB induziert wird. Zur Untersuchung des intrazellulären Mechanismus der Induktion von NO durch Immunkomplexe wurde der Transkriptionsfaktor NF-κB bei IFNγ stimulierten Knochenmarkmakrophagen von C57Bl/6-Mäusen durch Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) gehemmt und die Zellen mit EPS-Immunkomplexen stimuliert. Die NO-Produktion wurde 24 Stunden nach Stimulation bestimmt. A B 50 20 ohne PDTC ohne PDTC mit PDTC nicht detektierbar (n.d.) mit PDTC nicht detektierbar (n.d.) 40 30 Nitrit (µM) Nitrit (µM) 15 20 10 5 10 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0 0 LPS EPS 3165 IgG2a 3165 IgG2b EPS 3015 IgG2b 3165 IgG2b Abb. 39 Hemmung von NF-κB durch PDTC an C57Bl/6-Makrophagen (A) und Fcγ-chain-KOMakrophagen (B) bei NO Stimulation durch EPS-Immunkomplexe. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung des Nitritgehaltes repräsentativen Experimentes. im Zellkulturüberstand aus Dreifach-Werten eines Ergebnisse 98 Wie in Abbildung 39 zu sehen ist, kann nach einer Hemmung von NF-κB durch PDTC keine NO-Produktion nach Stimulation durch EPS-Immunkomplexe in C57Bl/6- und Fcγ-chain Knock-out Makrophagen mehr nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass auch bei einer Aktivierung der NO-Produktion über die Fcγ-Rezeptoren I, II und III NF-κB als verantwortlicher Regulator fungiert. Diskussion 99 5. Diskussion 5.1. Vergleich der Bedeutung von EPS-spezifischem IgG und IgA für die Immunität des Respirationstraktes Experimentelle Daten über die Bedeutung einer IgA- und IgG-vermittelten Immunität bei Infektionen des Respirationstraktes mit Burkholderia pseudomallei liegen bislang nicht vor. Generell ist über die Rolle von sekretorischem IgA (SIgA) für die antibakterielle Immunität der Mukosa des Respirationstraktes bislang nur wenig bekannt. Vorstellungen über die entscheidende Bedeutung von SIgA basieren in erster Linie auf der beobachteten Korrelation zwischen dem Vorhandensein von spezifischem IgA und einer Protektion vor Mukosainfektionen (Brandtzaeg 1992). Die Bedeutung von ebenfalls in signifikanten Mengen aus dem Serum durch Diffusion und, wie kürzlich berichtet wurde, auch über aktiven Transport (Spiekermann et al. 2002) in und auf der Mukosa vorkommendem IgG ist bislang wenig untersucht. Aktive Immunisierungsversuche mit bakteriellen Antigenen zeigten, dass eine Immunisierung der Mukosa des Respirationstraktes nicht nur zur Produktion von spezifischem IgA führt, sondern auch zur Induktion von systemischem IgG. Auf der anderen Seite wurde nach systemischer Immunisierung nicht nur IgG im Serum, sondern auch SIgA auf den Mukosaoberflächen nachgewiesen. Das bedeutet, dass durch aktive Immunisierung die Frage nach der Bedeutung der einzelnen Immunglobulinklassen im Rahmen der Antikörper-vermittelten Immunität nicht präzise untersucht werden kann. Genauere Kenntnisse über die Funktionen der einzelnen Isotypen können z.B. über passive Immunisierungsexperimente gewonnen werden. Dies ist notwendig, um gezielt aktive Immunisierungsstrategien zu entwickeln. In der Literatur sind dabei nur wenige passive Immunisierugsexperimente mit monoklonalem IgA beschrieben. Die meisten davon behandeln die IgA-induzierte Protektion gegenüber Viren. Für das Respiratorische Syncytial Virus (RSV) konnte gezeigt werden, dass intranasal verabreichtes monoklonales IgA, welches gegen F-Glycoprotein gerichtet war, zu einer signifikanten Reduktion der Virustiter in Lunge und Nase von Mäusen führte (Weltzin et al. 1994). Bei Infektionen mit dem Sendai Diskussion 100 Virus konnte der Virustiter durch passive Immunisierung mit IgA gesenkt werden (Mazanec et al. 1987), ebenso bei Infektionen mit Influenza Virus (Renegar & Small, Jr. 1991). Der Einfluss einer passiven Immunisierung mit IgA bei einer bakteriellen Infektion wurde lediglich bei Infektionen mit Shigellen, Streptokokken und Mycobakterien untersucht. Nach intranasaler Infektion mit Shigella flexneri konnte ein protektiver Effekt durch eine passive intranasale Gabe von monoklonalem IgA bei BALB/c-Mäusen erzielt werden (Phalipon et al. 1995). Bei Infektion mit dem Streptokokkus-Stamm S43/192 konnte eine verringerte Keimzahl im Respirationstrakt durch intranasal appliziertes sekretorisches IgA in BALB/c-nu/Mäusen gezeigt werden (Bessen & Fischetti 1988). Auch bei Infektionen mit Mycobakterium tuberculosis konnte durch intranasal verabreichtes monomeres und polymeres IgA eine Verringerung der Keimzahlen der Lunge bei BALB/c-Mäusen erreicht werden (Williams et al. 2004). Die protektive Bedeutung von IgG bei einer passiven Immunisierung und experimenteller Infektion ist neben diversen anderen bakteriellen und viralen Erregern auch bei Burkholderia pseudomallei untersucht worden. So induzierte ein intravenös verabreichte Mischung aus sieben verschiedenen monoklonalen IgG-Antikörpern, wovon drei gegen EPS, drei gegen unbekannte bakterielle Proteine und einer gegen LPS von Burkholderia pseudomallei gerichtet waren, eine verminderte Mortalität nach intraperitonealer Infektion von BALB/c-Mäusen. Wurden die Antikörper nach ihren Spezifitäten getrennt eingesetzt, so zeigten die gegen EPS gerichteten Antikörper die beste Protektion (Jones et al. 2002). Auch bei intravenöser passiver Immunisierung von diabetischen Ratten mit der polyklonalen IgG-Fraktion aus Kaninchenserum, welches mit Flagellin und LPS von Burkholderia pseudomallei reagierte, und anschließender intravenöser Infektion konnte eine deutliche Reduktion der Mortalität beobachtet werden (Brett & Woods 1996). Darüber hinaus wurde eine verminderte Mortalität nach mukosaler Verabreichung von IgG-Isotyp-SwitchVarianten und anschließender intranasaler Infektion bei C57Bl/6-Mäusen gezeigt (Breitbach 2004). Offen bleibt jedoch die Frage nach den protektiven Eigenschaften Diskussion 101 von IgA im Vergleich zu IgG, insbesondere im Zusammenhang mit mukosalen Burkholderia pseudomallei-Infektionen. Ziel dieser Studie war es zunächst, bei einer Infektion des Respirationstraktes mit Burkholderia pseudomallei die Rolle von EPS-spezifischen monoklonalen SwitchVarianten der Immunglobulinklassen IgG und IgA hinsichtlich der von ihnen vermittelten Protektion bei Mausstämmen von unterschiedlicher Suszeptibilität zu untersuchen. In den durchgeführten Versuchen konnte eine Protektion des Respirationstraktes durch monoklonales IgG2a gezeigt werden. Neben der Protektion nach intravenöser Gabe und intranasaler Infektion konnte auch eine Verminderung von Mortalität und der Keimzahl der Lunge nach intranasaler und intratrachealer Gabe nachgewiesen werden. Dabei wurden parallel die Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c untersucht, welche sich durch eine stark unterschiedliche Suszeptibilität gegenüber dem Erreger auszeichnen (Hoppe et al. 1999; Liu et al. 2002). Bei beiden Mausstämmen konnte unabhängig von ihrer angeborenen Resistenz gegenüber Burkholderia pseudomallei eine Protektion festgestellt werden. Diese Protektion zeigte sich nicht nur nach intranasaler Immunisierung und Infektion, wobei eine Lokalisation des Effektes innerhalb des Respirationstraktes nicht bestimmt werden konnte, sondern auch spezifisch in der Lunge, wie durch eine intratracheale Immunisierung und Infektion gezeigt wurde. Entgegen den Erwartungen zeigte der polymere IgA-Isotyp des gleichen Antikörperklons keine Protektion im gleichen Modell. Weder intranasale noch intratracheale Immunisierung beeinflussten Mortalität und Keimzahlen in der Lunge bei beiden Mausstämmen. Diese Resultate sind nicht damit zu erklären, dass aufgrund der Immunisierungsstrategie polymeres IgA ohne das physiologischerweise vorhandene sekretorische Stück auf der Mukosa vorliegt. Es konnte gezeigt werden, dass eine intravenöse Gabe des Antikörpers, bei der er über den Transportmechanismus des poly-Ig-Rezeptors auf die Schleimhaut gelangte, keine Verminderung der Mortalität erzielen konnte. Aufgrund dieser Ergebnisse kann darauf geschlossen werden, dass IgA in diesem Modell keine protektive Wirkung im Respirationstrakt entfaltet. Dies kann möglicherweise damit begründet werden, dass Diskussion 102 hier im Vergleich zu den Immunisierungsversuchen mit anderen Erregern wesentlich geringere Antikörperdosen verabreicht wurden. Eine weitere Erklärung für eine fehlende Protektion durch IgA in diesem Modell könnte in einem Unterschied bei der opsonisierenden Funktion der Antikörper und somit der Phagozytosekapazität liegen. Bei Untersuchungen zur Antikörper-vermittelten Phagozytose von Isotyp-SwitchVarianten, die gegen ein Kapselpolysaccharid von Cryptococcus neoformans gerichtet waren, wurde herausgefunden, dass IgG2a zu höheren intrazellulären Keimzahlen führte als IgG1 und IgG2b. Allerdings wurde IgA in dieser Studie nicht untersucht (Schlageter & Kozel 1990). Als Erklärung für die isotypspezifischen Unterschiede in vivo ist in der vorliegenden Studie eine unterschiedliche intrazelluläre Keimzahl, die aus unterschiedlicher Kapazität zur Antikörper-vermittelter Phagozytose der einzelnen Isotypen resultiert, allerdings unwahrscheinlich. In vitro-Experimente zur Antikörper-vermittelten Phagozytose ergaben hier keine Unterschiede in der Phagozytosekapazität der Makrophagen der verschiedenen Mausstämme bei Opsonisierung von Burkholderia pseudomallei mit den verschiedenen Isotypen. 5.1.1. Die Rolle von Fc-Rezeptoren für die IgG-vermittelte Protektion Nun stellt sich die Frage, wie genau die protektive Wirkung von IgG vermittelt wird und warum passive Immunisierung mit IgA hier keine Protektion vermittelt. In diesem Fall kommen verschiedene Mechanismen in Betracht, die eine Protektion durch Antikörper vermitteln. Zum einen eine Antikörper-vermittelte Aktivierung des Komplementsystems und zum anderen durch die Aktivierung intrazellulärer Abwehrmechanismen und Phagozytose, welche über die Fc-Rezeptoren der Zellen des Immunsystems induziert werden. Welcher der beiden Mechanismen die entscheidende Bedeutung besitzt, hängt dabei wahrscheinlich zum einen vom Erreger selbst und zum anderen von der Immunisierungsstrategie ab. Beipielsweise wurde in einer Studie an Streptococcus pneumoniae gezeigt, dass ein Tripel Knock-out von Fcγ-Rezeptor I, II und III in C57Bl/6-Mäusen in vivo keinen Einfluss auf eine Antikörper-vermittelte Protektion besitzt. Dagegen führte aber ein Knock-out des Komplementfaktors C1q und ein Doppel Knock-out von C2/Faktor B Diskussion 103 im gleichen Modell zu einem Ausbleiben der Protektion durch mAK IgG1, was in diesem Fall für eine essenzielle Rolle des Komplementsystems spricht (Saeland et al. 2003). Auch bei experimentellen Malariainfektionen spielten Fcγ-Rezeptoren keine Rolle für den Erfolg einer passiven Immunisierung (Rotman et al. 1998). Dagegen konnte bei passiver Immunisierung mit IgG gegen Cryptococcus neoformans die Bedeutung der Fcγ-Kette nachgewiesen werden (Yuan et al. 1998), während C3 keine Rolle bei der Vermittlung passiver Immunität spielte (Shapiro et al. 2002). Burkholderia pseudomallei ist allerdings gegenüber den Komplementfaktoren im Serum allein, wie auch in Verbindung mit spezifischen Antikörpern resistent (Egan & Gordon 1996). Somit kann eine extrazelluläre Bekämpfung des Erregers durch den membranattackierenden Komplex kaum zu einer Elimination beitragen. Allerdings aktiviert Burkholderia pseudomallei das Komplementsystem auf dem alternativen Weg. Eine Beeinflussung des Infektionsverlaufs über proinflammatorische und chemotaktische Eigenschaften der einzelnen Komplementfaktoren und somit einer Anlockung von Makrophagen und Leukozyten, die wiederum zur Induktion der Produktion spezifischer Antikörper beitragen, wäre vorstellbar. Ebenso kann es zu einer Opsonisierung des Erregers mit Komplementfaktoren kommen, die eine Erkennung durch spezifische Antikörper ermöglichen (Egan & Gordon 1996). Der Schwerpunkt dieser Studie lag auf einer Untersuchung der Bedeutung von Fcγ-Rezeptoren für die passiv erworbene Immunität. Wie auch bei den Versuchen mit Cyptococcus neoformans gezeigt (Yuan et al. 1998), war bei Burkholderia pseudomallei die primäre Resistenz gegenüber dem Erreger nicht durch ein Fehlen der Fcγ-Kette beeinträchtigt. Nach passiver Immunisierung mit IgG2a in Fcγ-Kettendefizienten Mäusen war eine deutliche Reduktion der protektiven Eigenschaften des Antikörpers nachweisbar, was für die essenzielle Bedeutung der Fcγ-Kette bei einer passiven Immunisierung gegen Burkholderia pseudomallei spricht. Auch in diesem Fall ist unwahrscheinlich, dass dieser Effekt auf einer verminderten intrazellulären Keimzahl beruht, da in vorangegangenen Versuchen nur ein geringer Rückgang der Phagozytosekapazität der Knochenmarkmakrophagen Fcγ-Kettendefizienter Tiere festgestellt werden konnte. Diese Beobachtung legt nahe, dass die IgG2a vermittelte Protektion zu einer Aktivierung der Zelle über Fcγ-Rezeptoren und damit zu einer effektiveren intrazellulären Bekämpfung der Infektion führt. Für andere Erreger wurde bereits Diskussion 104 gezeigt, dass Immunkomplexe zu einer Induktion von Zytokinen führen, die die Immunantwort zu einer Th1-Antwort modifizierten. Dieses trifft auch auf IgG2a-Komplexe zu. Beispielsweise waren in einem Chlamydienmodell antigenpräsentierende Zellen in Anwesenheit von Immunkomplexen in der Lage, T-Zellen zu einer erhöhten IFNγ-Produktion zu stimulieren. Dieser Effekt war vom Vorhandensein von Fcγ-Rezeptoren auf den antigenpräsentierenden Zellen abhängig und vor allem durch IgG2a und IgA induzierbar (Moore et al. 2003). Ebenso konnten durch IgG1-Immunkomplexe von kapselspezifischen Antikörpern gegen Cryptococcus neoformans Monozyten zur Produktion von IL-1β, IL-2 und TNFα angeregt werden, während die Produktion von IL-10 reduziert war (Vecchiarelli et al. 1998). Eine derartige Beeinflussung der Immunantwort hin zu einem Th1-Profil, und somit verstärkter intrazellulärer Abtötung des Erregers, wäre auch für Burkholderia pseudomallei denkbar. Denn eine Infektion allein lässt keine klare Polarisierung zu einem Th1- oder Th2-Profil erkennen und eine zellvermittelte Abwehr gegen einen fakultativ intrazellulären Erreger würde wahrscheinlich einen Vorteil bieten. Allerdings liefert dieser Ansatz noch keine Erklärung für ein Versagen einer IgA-vermittelten Protektion, da auch IgA in der Lage ist, die Wirtsabwehr in Richtung einer Th1-Antwort zu beeinflussen (Moore et al. 2003). Ein weiterer Hinweis auf Fcγ-vermittlelte Effekte ist, dass die Phagozytose über IgG2a zu einer verbesserten intrazellulären Abtötung der Erreger im Vergleich zu den Isotypen IgG1, IgG2b und IgA führt. Diese ihrerseits konnte keine verbesserte intrazelluläre Abtötung induzieren, verglichen mit den zur Kontrolle nicht opsonisiert aufgenommenen Bakterien (Breitbach 2004). In polymorphkernigen Leukozyten konnte ebenfalls eine Stagnation des Wachstums von Burkholderia pseudomallei festgestellt werden, wenn diese mit spezifischen Antikörpern oder Komplement opsonisiert waren (Egan & Gordon 1996). Weiterhin war jedoch unklar, welche Mechanismen in Makrophagen Antikörpervermittelt aktiviert werden, die zu einer intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei führen. Diskussion 105 5.2. Bedeutung von Immunkomplexen bei der Aktivierung von NO NO wird durch die Stickoxid-Synthasen (NOS) produziert, welche L-Arginin zu L-Zitrullin und NO umbauen. Bis heute konnten drei Isoformen des Enzyms im Säugerorganismus nachgewiesen werden. Zwei dieser Isoformen sind Ca2+- Calmodulin abhängig, wobei sie nach dem Ort ihres jeweiligen Vorkommens als neuronale NO-Synthase (nNOS) (Bredt et al. 1991) und als endotheliale NO-Synthase (eNOS) (Lamas et al. 1992) benannt wurden. Die dritte Isoform ist die induzierbare NO-Synthase (iNOS). Sie ist Ca2+-unabhängig, benötigt aber auch Calmodulin als Cofaktor (Cho et al. 1992). iNOS ist in verschiedenen Zelltypen induzierbar, wie zum Beispiel in Makrophagen, wobei sie in ruhenden Zellen nicht vorkommt und erst auf bestimmte Stimuli hin induziert wird. Eine direkte Induktion kann dabei durch LPS (Stuehr & Marletta 1985), IFNγ (Ding et al. 1988) und den Migration-inhibierenden-Faktor (MIF) (Cunha et al. 1993) eingeleitet werden sowie durch eine Kombination dieser Stimuli, die einen synergistischen Effekt besitzen. IFNγ wurde als der Hauptfaktor für eine Vorstimulation identifiziert, wenn LPS und TNFα als Costimulatoren fungierten (Amber et al. 1991). IFNγ induziert dabei die NO-Synthese über die Aktivierung von GTPasen sowie verschiedene andere Proteine wie zum Beispiel den IFN-regulierenden-Faktoren (IRF) (Shtrichman & Samuel 2001). Die Stimulation der NO-Synthese durch LPS erfolgt über die Aktivierung des Toll-like Rezeptors 4, der wiederum zu einer Aktivierung des Globalen Transkriptionsfaktors NF-κB führt. NF-κB ist in der Lage, an einer spezifischen Region des iNOS-Promotors zu binden und somit eine Aktivierung zu induzieren (Xie et al. 1994). Ein weiterer Weg der Aktivierung der NO-Synthese ist eine Induktion über Immunkomplexe. Ein Zusammenhang zwischen NO-Produktion und Antikörpern konnte bislang unter anderem mit Trypanosoma concolense (Kaushik et al. 1999) und Brucella suis (Gross et al. 1998) gezeigt werden. Immunkomplexe aus den Isotypen IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 mit einem Kapselpolysaccharid von Cryptococcus neoformans konnten ebenfalls die Produktion von NO induzieren (Mozaffarian et al. 1995). Diskussion 106 In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch Immunkomplexe der verschiedenen IgG Isotyp-Switch-Varianten mit EPS von Burkholderia pseudomallei eine Freisetzung von NO in Knochenmarkmakrophagen induzieren. Dabei wurden IgG1, IgG2a, IgG2b und polymeres IgA des Klons 3015 sowie IgG1 und IgG2b des Klons 3165 gestetet. IgG2a und IgG2b beider Klone waren in der Lage, NO zu induzieren, während NO durch IgG1 nur vom Klon 3165 induziert wurde. Polymeres IgA vom Klon 3015 dagegen war nicht in der Lage NO, zu induzieren. Eine IgA vermittelte Induktion von NO ist auch in der Literatur nicht untersucht worden, sodass es hier keinen Vergleich mit der NO-Stimulation durch IgA-Immunkomplexe bei anderen Organismen gibt. Zu diesem Zeitpunkt der Arbeit war diese Beobachtung eine mögliche Erklärung für das Fehlen eines protektiven Effekts durch IgA in vivo. Der Mechanismus, über den eine immunkomplexvermittelte Aktivierung von iNOS gesteuert wird, ist bislang nicht geklärt. Allerdings gibt es Hinweise, die eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-κB wahrscheinlich machen. So konnte bereits gezeigt werden, dass die Kreuzvernetzung von FcγRI und II, aber nicht von FcγRI und FcγRIII auf humanen Monozyten eine Expression von NF-κB induzieren (Drechsler et al. 2002). Des Weiteren konnte die NO-Produktion durch IgE-Immunkomplexe in Makrophagen in Zusammenhang mit dem IgεRII (CD23) und NF-κB-Aktivierung gebracht werden (Bayon et al. 1998). Durch eine Hemmung von NF-κB mit Pyrrolidindithiocarbamat bei gleichzeitiger NO-Stimulation durch EPS-Immunkomplexe konnte hier keine NO-Produktion mehr nachgewiesen werden, was erstmals auf eine entscheidende Rolle des Transkriptionsfaktors NF-κB auch bei der NO-Induktion über die Fcγ-Rezeptoren hinweist. Offen blieb jedoch die Rolle von NO bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei. Eine funktionelle Bedeutung von NO bei der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei konnte bereits 1997 in J774.A1-Makrophagen gezeigt werden. Im Vergleich mit ROI konnte NO dort die vorherrschende Rolle bei der Abtötung von Burkholderia pseudomallei zugesprochen werden (Miyagi et al. 1997). Diskussion 107 5.3. Bedeutung von NO bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei in vitro und in vivo Bevor die Funktion von NO bei der intrazellulären Bekämpfung untersucht wurde, wurde zunächst die Fähigkeit von Burkholderia pseudomallei zu NO-Stimulation bestimmt. In der Literatur ist Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu anderen Erregern als schlechter NO-Stimulator bekannt. Es wird beschrieben, dass NO-vermittelte Bakterizidie in RAW 264.7 Makrophagen nur nach vorheriger Stimulation der Zellen mit IFNγ oder einer Costimulation mit IFNβ stattfand (Utaisincharoen et al. 2003; Utaisincharoen et al. 2004). In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die NO-Freisetzung in mit IFNγ vorstimulierten Knochenmarkmakrophagen mit zunehmender Infektionsdosis ansteigt. Weiterhin war die NO-Freisetzung bei vitalen Bakterien im Vergleich zu hitzeinaktivierten Burkholderia pseudomallei deutlich höher. Dieses Ergebnis unterstützt die These, dass LPS von Burkholderia pseudomallei ein schlechter NO-Stimulator ist. Bei inaktiven Bakterien steht die NO-Stimulation über den LPS/Toll-like-Rezeptor 4 Weg wohl im Vordergrund, während vitale Bakterien durch ihre Fähigkeit zur Invasion und Replikation in Zellen offensichtlich NO noch auf eine andere, bislang unbekannte, Weise stimulieren. Dass es sich hierbei um einen möglicherweise spezifischen Mechanismus handelt, legen die vergleichenden Experimente mit Salmonella Typhimurium nahe, wo der Unterschied in der Induktion hitzeinaktivierter und vitaler Bakterien geringer ausgeprägt war. Des Weiteren bietet die Fähigkeit zur Induktion der NO-Produktion auch einen möglichen Schlüssel zur Erklärung der unterschiedlichen Resistenzlage bei den Mausstämmen C57Bl/6 und BALB/c. Obwohl bei Infektion von Knochenmarkmakrophagen mit Burkholderia pseudomallei die NO-Produktion sowohl in C57Bl/6- als auch in BALB/c-Makrophagen erhöht wird, zeigte sich ein deutlicher quantitativer Unterschied zwischen beiden Stämmen. Makrophagen von BALB/c-Mäusen produzierten generell weniger NO als Makrophagen von C57Bl/6-Mäusen. Die gleiche Beobachtung wurde auch in Versuchen zur NO-Stimulation mit Trypanosoma concolense gemacht (Kaushik et al. Diskussion 108 1999). Auffallend ist dabei, dass bei Infektionen mit Trypanosomen, genau wie bei Burkholderia pseudomallei, C57Bl/6 der resistentere und BALB/c der empfänglichere Mausstamm ist. Im Vergleich dazu wurde in dieser Studie gezeigt, dass bei gleichartigen Versuchen mit Salmonella Typhimurium, gegen die C57Bl/6- und BALB/c-Mäuse etwa die gleiche Resistenz aufweisen, der Unterschied in der NO-Freisetzung geringer ausgeprägt war. Die bis zu diesem Zeitpunkt gewonnenen Erkenntnisse ließen vermuten, dass NO ein Faktor für die höhere Resistenz von C57Bl/6-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu BALB/c-Mäusen ist, da in allen Versuchen C57Bl/6-Makrophagen zur Freisetzung größerer Mengen NO in der Lage waren, als BALB/c-Makrophagen. Zur Stützung diese These trägt weiterhin bei, dass Knochenmarkmakrophagen von BALB/c-Mäusen eine schlechtere Fähigkeit zur intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei besitzen als Makrophagen von C57Bl/6-Mäusen (Breitbach 2004). Zur Untersuchung des Einflusses von NO auf die intrazelluläre bakterizide Aktivität wurde iNOS mit Aminoguanidin, einem kompetitiven Hemmer, in mit IFNγ vorstimulierten Knochenmarkmakrophagen inhibiert. Anschließend wurde die NO-abhängige intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei auf den verschiedenen genetischen Hintergründen von C57Bl/6 und BALB/c bestimmt. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass eine Hemmung von NO nur in BALB/c-Knochenmarkmakrophagen zu einer Erhöhung der intrazellulären Keimzahl führte, während C57Bl/6-Makrophagen ohne NO bezüglich der intrazellulären Abtötung des Erregers nicht beeinträchtigt waren. Dieses ließ sich auch durch die Untersuchung der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei in Makrophagen von iNOS-Knock-out-Mäusen mit dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6 bestätigen. Das hier vorliegende Ergebnis widerspricht einerseits den Untersuchungen von Miyagi et al. (1997) und Utaisinchanroen et al. (2000), die NO eine wichtige Rolle in der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei zugesprochen hatten, Diskussion 109 andererseits jedoch nicht, insofern auch die Makrophagenzelllinen J774.A1 und RAW 264.7 ursprünglich aus BALB/c-Mäusen isoliert wurden. Vergleicht man die Untersuchungen von Miaygi et al. (1997) mit der Vorliegenden, fällt auf, dass J774.A1 Zellen noch in viel größerem Maße von NO als Effektormolekül abhängig sind, als die primären Zellen von BALB/c-Mäusen, was auch durch eigene präliminare Versuche mit der Zelllinie J774.A1 bestätigt werden konnte. Selbst eine aus C57Bl/6-Mäusen isolierte Makrophagenzelllinie zeigte eine durch NO-Hemmung geringgradig verschlechterte intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei (Bruns 2004). Deshalb kann darauf geschlossen werden, dass primäre Zellen noch andere redundante Mechanismen besitzen, die eine wichtige Rolle für die intrazelluläre Abtötung spielen. Diese scheinen in Makrophagen von C57Bl/6Mäusen noch effektiver oder zahlreicher zu sein als in BALB/c-Makrophagen. Nun spielt NO nicht nur für die intrazelluläre Bekämpfung von Erregern eine Rolle, sondern auch für die parakine Kommunikation (Schmidt & Walter 1994). Wie bereits erwähnt wird iNOS, unter anderem über den globalen Transkriptionfaktor NF-κB reguliert, der auch mit der Expression vieler in der Immun- und Entzündungsantwort assozierter Gene in Verbindung steht (Kim et al. 1997; Xie et al. 1994). NO ist hier in der Lage, abhängig von seiner Konzentration ein positives oder negatives Feedback auf NF-κB auszuüben und so in das Entzündungsgeschehen einzugreifen (Connelly et al. 2001). In vivo beeinflusst eine Inhibition von NO-Synthasen bei Infektionen mit Bakterien, Viren, Pilzen und Protozoen den Verlauf einer Infektion negativ. Dieses konnte unter anderem für Leishmania major, Cryptococcus neoformans, Trypanosoma crucei, Coxsackievirus und auch für Mycobacterium tuberkulosis gezeigt werden. Im Gegensatz dazu sind einige Fälle beschrieben, in denen die Hemmung von NO einen positiven Einfluss auf den Verlauf der Infektion nahm. Dazu zählen Trypanosoma brucei sowie das Frühsommer-Menigitis-Encephalitis-Virus (FMSE-V). Bei dem ebenfalls fakultativ intrazellulären Erreger Listeria monozytogenes dagegen gibt es sowohl Berichte über einen positiven als auch negativen Einfluss von NO auf den Verlauf der Infektion (MacMicking et al. 1997). Die Frage für diese Studie war nun, ob NO in vivo einen Einfluss auf den Verlauf einer Burkholderia pseudomallei-Infektion nimmt, obwohl in vitro kein Einfluss auf die Diskussion 110 intrazelluläre bakterizide Aktivität festgestellt werden konnte. Zu diesem Zweck wurden Mäuse auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6 eingesetzt, die einen Knockout der induzierbare NO-Synthase besaßen. Eine Infektion mit Burkholderia pseudomallei überlebten diese Knock-out-Tiere im Vergleich zur Wildtypgruppe länger, was einen Vorteil vermuten ließ. Dennoch wiesen die Keimzahlen der Lungen beider Gruppen 48 Stunden nach der Infektion keinen Unterschied auf. Nach passiver Immunisierung war eine Protektion durch IgG2a unabhängig von NO vorhanden, was sowohl durch verringerte Mortalität als auch signifikant geringere Keimzahlen der Lunge bestätigt werden konnte. Einen Hinweis auf Antikörper-vermittelte NO-unabhängige Mechanismen der intrazellulären Abtötung in Makrophagen lieferten auch Untersuchungen mit Cryptoccus neoformans, wo ebenfalls eine Protektion in vivo durch passive Immunisierung gezeigt werden konnte (Feldmesser & Casadevall 1997). In den vorangegangenen in vitro-Experimenten war zwar ein direkter Zusammenhang zwischen Antikörpervermittelter Phagozytose mit mAk IgG1 und verbesserter intrazellulärer bakterizider Aktivität in J774.16-Zellen gezeigt worden, dieser war aber unabhängig von der Anwesenheit von NO sowie ROI (Mukherjee et al. 1996). Die Rolle von iNOS auf dem genetischen Hintergrund von BALB/c-Mäusen bleibt weiterhin unklar, da in vitro der Einfluss einer Hemmung von iNOS auf die intrazelluläre Keimzahl nachgewiesen werden konnte. Eine Bestätigung in vivo ist jedoch schwierig, da Tiere mit einem entsprechenden iNOS-Knock-out zurzeit kommerziell nicht erhältlich sind. Lediglich eine pharmakologische Inhibition von iNOS in vivo wäre vorstellbar, wobei die Gefahr einer unvollständigen Hemmung besteht und somit die in den in vitro-Versuchen angedeuteten geringen Effekte möglicherweise nicht detektierbar wären. Diskussion 111 5.4. Bedeutung von ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei Da NO vor allem auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6-Mäusen keine Rolle bei der Bekämpfung von intrazellulärem Burkholderia pseudomallei spielt, sollte die zweite bedeutende Komponente der intrazellulären Abtötung in Makrophagen, die Sauerstoffradikale, untersucht werden. Sauerstoffradikale werden im angloamerikanischen Sprachgebrauch als Reactive Oxygen Intermediates (ROI) bezeichnet. Dieser Begriff bezieht sich auf die intermediären Reaktionsprodukte von Sauerstoff, nämlich Superoxide, Wasserstoffperoxid und Hydroxylradikale sowie Reaktionsprodukte dieser mit Aminen und Haliden. Generell können diese von allen aeroben Zellen produziert werden. Die Phagozyten von Säugetieren sind allerdings auf eine besonders hohe Produktion von ROI spezialisiert, wobei polymorphkernige Leukozyten die höchste und Makrophagen die zweithöchste Kapazität zur Produktion und Freisetzung von ROI besitzen (Nathan & Shiloh 2000). Produziert werden ROI von der NADPH-Oxidase, welche in der Plasmamembran verankert ist und die aus sechs verschiedenen katalytischen Untereinheiten besteht. Beim Defekt einer dieser Untereinheiten ist das Enzym funktionsunfähig, wie es zum Beispiel bei der Erkrankung der Chronischen Granulomatose der Fall ist (Vignais 2002). Ferner gibt es Hinweise, dass ROI neben der Funktion der intrazellulären Abtötung von Pathogenen auch an der Modulation der Entzündungsantwort durch eine Anlockung von Neutrophilen Granulozyten und Induktion der Zytokinproduktion beteiligt sind. Diese widerum sind abhängig vom globalen Transkriptionsfaktor NF-κB (Forman & Torres 2002). Die Bedeutung von ROI in der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei ist bislang kaum untersucht. Lediglich in den Untersuchungen von Miyagi wurde ein geringer Einfluss auf die Bekämpfung von intrazellulären Burkholderia pseudomallei in J774.A1-Makrophagen nach einer Hemmung der Produkte der ROI durch Katalase und Superoxiddismutase beschrieben (Miyagi et al. 1997). Für Burkholderia cepacia, einem weniger pathogenen Verwandten von Burkholderia pseudomallei und einem Diskussion 112 der Hauptpathogene der Chronischen Granulomatose, konnte eine Resistenz gegen extrazelluläre ROI, aber eine in Abhängigkeit vom Stamm hohe Variabilität in der Suszeptibilität gegenüber intrazellulären ROI festgestellt werden (Lefebre & Valvano 2001). Ferner spielen ROI die essenzielle Rolle bei der Bekämpfung von Burkholderia cepacia in vivo, wo gezeigt werden konnte, dass Mäuse mit einem Defekt in der Produktion von ROI (p47phox-Knock-out) nach Infektion mit Burkholderia cepacia verstarben, während ein iNOS-Knock-out keinen Einfluss auf den Verlauf der Infektion hatte (Segal et al. 2003). Auch bei anderen Infektionserregern spielen ROI eine wichtige Rolle bei der Wirtsabwehr. So konnte gezeigt werden, dass die Produktion von ROI essenziell für eine Bekämpfung von Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus und Aspergillus fumigatus ist und den Verlauf von Infektionen mit Listeria monozytogenes und Mycobacterium tuberculosis ungünstig beeinflusst (Nathan & Shiloh 2000). Aus diesem Grund sollte in dieser Studie auch die Bedeutung von ROI für die Wirtsabwehr bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei untersucht werden. Dabei sollte zunächst geklärt werden, welchen Einfluss ROI auf die intrazelluläre Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei besitzen. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit einem Knock-out für die katalytische Untereinheit p47phox des NADPH-Oxidase Komplexes verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass auch das Fehlen von ROI die bakterizide Kapazität der Zellen nicht beeinflusst. Die Erklärung dafür liegt möglicherweise darin, dass vitale Burkholderia pseudomallei in der Lage, sind eine Freisetzung der ROI zu verhindern oder durch die bakterielle Katalase die Reaktionsprodukte der Radikale wie Wasserstoffperoxid abzubauen. Kürzlich konnte die durch oxidativen Stress induzierte Hochregulation des Gens katG durch den funktionellen Regulator Oxy A in Burkholderia pseudomallei nachgewiesen werden. KatG ist ein bifunktionales Enzym, das als Katalase und Peroxidase fungiert, und eine wichtige Rolle beim Schutz des Keims vor ROI spielt (Loprasert et al. 2003b). Einen Hinweis darauf liefern auch die nicht nachweisbaren Wasserstoffperoxide nach Infektion mit vitalen Burkholderia pseudomallei, während inaktivierte Bakterien sehr wohl zu messbaren Diskussion H2O2-Konzentrationen 113 führen. Es ist also möglich, dass ROI unter Infektionsbedingungen nur in geringem Maße in die intrazelluläre Abtötung eingreifen können. Überraschender Weise zeigten Untersuchungen in vivo, bei denen die Mortalität von Mäusen mit einem Knock-out für p47phox mit C57Bl/6-Wildtyptieren nach einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei verglichen wurde, einen bedeutenden Einfluss der ROI. Ein Fehlen von ROI resultierte dabei in einer dramatisch beschleunigten und erhöhten Mortalität der p47phox-Knock-out Tiere. Dieses gibt einen Hinweis auf eine Rolle von ROI in vivo, die unabhängig von der direkten Funktion der intrazellulären Abtötung ist und womöglich eher die oben genannten regulatorischen Aufgaben beinhaltet. 5.5. NO und ROI; redundante Mechanismen bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei? Da es sich bei der Freisetzung von NO und ROI um redundante Systeme handelt, von denen angenommen wird, dass beim Fehlen des einen Effektors der andere einspringt, kann nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Mechanismus auch in diesem Fall greift. Diese These wird vor allem dadurch gestützt, dass Mäuse mit einem Knock-out beider Komponenten mit großer Inzidenz an spontan erworbenen Infektionen mit kommensalen Organismen versterben, während dieses bei Tieren mit nur einem Knock-out kaum vorkommt (Shiloh et al. 1999). In der gleichen Studie wurde der Einfluss von Infektionen mit Salmonellen und Listerien auf Tiere mit diesem Doppel-Knock-out im Vergleich zu den jeweiligen Einzel-Knock-outs und dem Wildtyp in vivo und an Knochenmarkmakrophagen untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass ROI vor allem für die Bekämpfung der Infektion mit Salmonella in vivo und in vitro von Bedeutung sind. Mäuse sowie Zellen mit einem Doppel-Knock-out konnten eine Infektion aber am schlechtesten abwehren. Bei Infektionen mit Listerien dagegen übernahm NO die Hauptaufgabe in der Bekämpfung der Infektion während, zwischen gp91phox-Knock-out und Wildtyp kein Unterschied bestand. Hier war die Infektionsabwehr in der Gruppe der infizierten Diskussion 114 Doppel-Knock-out-Tiere nicht eindeutig. Während die eine Hälfte Keimzahlen entsprechend denen des Wildtyps besaß, zeigten die anderen Tiere signifikant höhere Keimzahlen. Im Gegensatz dazu war auf Ebene der Knochenmarkmakrophagen die intrazelluläre bakterizide Aktivität bei gp91phox-Knockout und dem Doppel-Knock-out schlechter als beim iNOS Knock-out allein. Diese Studie zeigt, dass die Bedeutung von NO und ROI in vivo mit ihrer Bedeutung für die Makrophagenfunktion übereinstimmen kann, wie bei Salmonella, aber nicht muss, wie es bei Listeria der Fall ist. Ausreichende Klarheit über die Rolle von NO und ROI bei der Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei-Infektionen können also nur in Versuchen in vivo und in vitro vergleichend mit iNOS-Knock-out, funktionellem NADPH-Oxidase Knock-out und einem Doppel-Knock-out von iNOS und NADPH-Oxidase erzielt werden. Die bisherigen Ergebnisse können aber auch durchaus so gedeutet werden, dass beide Komponenten bei C57Bl/6-Mäusen eine untergeordnete Rolle spielen, beziehungsweise in ihrer Abwesenheit andere Mechanismen die Steuerung der intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei übernehmen. Andererseits ist es möglich, dass NO und ROI generell nur einen geringen Einfluss auf Burkholderia pseudomallei besitzen, zumal auch Burkholderia pseudomallei seine Resistenzmechanismen der jeweiligen intrazellulären Situation anpassen kann. Beispielsweise führt ein Knock-out des Gens für Katalase/Peroxidase katG in Burkholderia pseudomallei zu einer OxyA induzierten kompensatorisch erhöhten Expression des Alkyl-Hydroperoxidase-Reduktase-Gens ahpA, was eine Protektion gegenüber NO induziert (Loprasert et al. 2003a). Jedoch können so nicht die Unterschiede auf der Wirtsseite erklärt werden. Alternativ zu NO und ROI kommen hier zum Beispiel auch lysosomale Proteine, hydrolytische Enzyme, Cathepsin B sowie Proteine und Peptide, die in der Lage sind Mikroorganismen zu binden und bakterielle Prozesse und Strukturen zu stören, wie etwa das bakterizide Permeabilität-erhöhende-Protein, in Frage (Thomas et al. 1988b). Diskussion 115 5.6. Rolle von IFNγ bei Burkholderia pseudomallei Infektionen von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass mit IFNγ stimulierte Zellen unabhängig vom Vorhandensein von NO oder ROI eine bessere Fähigkeit zur intrazellulären Abtötung von Burkholderia pseudomallei besitzen, als unstimulierte Makrophagen. Dieses weist auf IFNγ als eine wichtige Komponente in der Bekämpfung des Erregers auf Makrophagenebene hin, die im Folgenden näher charakterisiert werden sollte. Unter Infektionsbedingungen wird IFNγ von Makrophagen auf einen Stimulus mit IL-12 und IL-18 aus Natürlichen Killerzellen und T-Zellen hin ausgeschüttet. Es wirkt wiederum auf Makrophagen ein, versetzt diese in einen aktivierten Zustand und erleichtert beispielsweise eine Freisetzung von NO und ROI (siehe 5.2.). Wie hier gezeigt werden konnte, induziert eine Stimulation der Makrophagen mit IFNγ, unabhängig von den intrazellulären Effektormolekülen NO und ROI eine verbesserte intrazelluläre Abtötung von Burkholderia pseudomallei. Somit ist IFNγ ein wichtiges Zytokin bei der zellvermittelten Immunantwort (Th1-Antwort), die vor allem durch intrazelluläre Erreger induziert wird und verbessert so die Wirtsabwehr gegen den Erreger. IFNγ besitzt auch eine direkte Wirkung auf die Phagosomen. Bei Listeria monozytogenes konnte gezeigt werden, dass eine Resistenz von IFNγ stimulierten Peritonealmakrophagen in ursächlichem Zusammenhang mit einer Blockade des Entkommens des Bakteriums aus dem Phagosom steht (Portnoy et al. 1989). Da auch Burkholderia pseudomallei in der Lage, ist Phagosomen zu verlassen (Harley et al. 1998), könnte auch hier eine Ursache für die verbesserte intrazelluläre Abtötung liegen. Über den Einfluss von IFNγ auf die Fusion von Phagosomen mit Lysosomen liegen unterschiedliche Beobachtungen vor. Bei Trypanosoma cruzi und Toxoplasma gondii wurde die Fusion beschleunigt (Kielian & Cohn 1981), während sie bei Listeria monozytogenes verzögert war (Tsang et al. 2000). Welcher Mechanismus bei Burkholderia pseudomallei zutrifft und welche Auswirkungen er auf die intrazelluläre Bekämpfung des Erregers hat, muss allerdings noch untersucht werden. Bekannt ist jedoch, dass IFNγ sowohl in den resistenten C57Bl/6- wie auch in den empfänglichen Diskussion 116 BALB/c-Makrophagen die intrazelluläre Abtötung signifikant verbessern. Dennoch reicht IFNγ allein nicht aus, um die Unterschiede in der intrazellulären Bakterizidie beider Mausstämme zu erklären. Da sowohl mit als auch ohne vorherige Stimulation beider Makrophagenpopulationen mit IFNγ noch ein Unterschied in der Abtötungskapazität zwischen C57Bl/6- und BALB/c-Makrophagen besteht (Breitbach 2004). Nicht nur auf zellulärer Ebene sondern auch in vivo konnte die Bedeutung von IFNγ bei der Bekämpfung diverser Erreger nachgewiesen werden. Das Fehlen von IFNγ in vivo kann den Verlauf viraler, bakterieller, Protozoen- und Pilz-Infektionen negativ beeinflussen. Dieses wurde unter anderem bei Herpes simplex Virus Typ 1 (Fujioka et al. 1999), Listeria monozytogenes (Buchmeier & Schreiber 1985), Trypanosoma cruzi (McCabe et al. 1991) und Histoplasma capsulatum (Clemons et al. 2000) nachgewiesen. Auch bei der Bekämpfung einer Burkholderia pseudomallei Infektion konnte IFNγ eine entscheidende Rolle zugewiesen werden. Eine Neutralisierung von IFNγ in Taylor-Outbred-Mäusen erhöhte die Suszeptibilität gegenüber dem Erreger dramatisch (Santanirand et al. 1999). Nun stellt sich die Frage, ob IFNγ eine Rolle für die Unterschiede der Resistenz von C57Bl/6- und BALB/c-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei spielt. Einen Hinweis darauf geben zum Beispiel Studien mit dem extrazellulären Erreger Yersinia enterocolitica, für den ebenfalls C57Bl/6-Mäuse resistent und BALB/c-Mäuse hochempfänglich sind. Dort konnte durch eine Neutralisierung von IFNγ eine deutlich erhöhte Suszeptibilität von C57Bl/6-Mäusen im Vergleich zur Kontrolle erreicht werden. Eine Hemmung von IFNγ bei BALB/c-Mäusen besaß dageben nur geringe Auswirkungen auf die Mortalität und keine Wirkung auf die Keimzahlen der Lunge. Eine Supplementation mit IFNγ oder eine Gabe von anti-IL-4-Antikörpern verbesserte die Resistenz von BALB/c-Mäusen effizient (Autenrieth et al. 1994). Dieser Effekt wird mit der unterschiedlichen Kapazität von T-Zellen beider Mausstämme zur Produktion von IFNγ in Verbindung gebracht, die bei C57Bl/6-Mäusen deutlich höher ist. Hieraus wird auf eine Tendenz der C57Bl/6-Mäuse zu eher zellvermittelter Immunität geschlossen, während BALB/c-Mäuse eher zu humoraler Immunität und Diskussion 117 somit zu einer Polarisierung zu einer Th2-Antwort tendieren. Gleiches konnte auch bei Versuchen mit Leishmania major nachgewiesen werden (Mosmann et al. 1986). Die mit Burkholderia pseudomallei durchgeführten Versuche ergaben ähnliche Ergebnisse wie die Studien mit Yersinia enterocolitica. Dennoch sind die Studien nur bedingt vergleichbar, da es sich bei Burkholderia pseudomallei zum einen um einen intrazellulären Erreger handelt und zum anderen die CFU-Bestimmung bereits zwei Tage nach der Infektion durchgeführt wurde, während bei den Untersuchungen mit Yersinia enterocolitica die Keimzahlbestimmung erst sechs Tage nach der Infektion stattfand. In diesem Fall ist nach einem so kurzen Zeitraum eine T-Zell-vermittelte Abwehr unwahrscheinlich. Dennoch induzierte auch in dieser Studie eine Neutralisierung von IFNγ bei C57Bl/6-Mäusen eine deutliche Verschlechterung der Wirtsabwehr, was sich sowohl in einer Erhöhung der Mortalität als auch in erhöhten intrazellulären Keimzahlen widerspiegelte. Bei BALB/c-Mäusen dagegen veränderte eine Neutralisierung von IFNγ die Immunität kaum. Als Begründung kommt bei der Abwehr einer Infektion entweder eine geringere Rolle von IFNγ durch ausbleibende Polarisierung der Immunantwort über den Beobachtungszeitraum der Mortalität, oder einer generell schlechteren Produktion von IFNγ bei diesen Tieren in Frage. Da bei einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei aber weder in C57Bl/6- noch in BALB/c-Mäusen eine eindeutige Polarisierung zu einer Th1- oder Th2-Antwort nachgewiesen werden konnte (Ulett et al. 2000a), ist dieses Ergebnis, anders als bei Yersinia, eher nicht auf eine unterschiedliche Polarisierung der Immunantwort zurückzuführen. Vielmehr lässt sich eher ein absoluter Mangel an IFNγ bei BALB/c-Mäusen vermuten. In diesem Fall könnte eine Supplementation von IFNγ zu einer Steigerung der Resistenz von BALB/c-Mäusen gegenüber Burkholderia pseudomallei führen. Im Kontrast dazu steht allerdings die Tatsache, dass bei C57Bl/6-Mäusen nur ein langsamer Anstieg der proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6 und TNFα gemessen wurde, während bei einer akuten Infektion von BALB/c-Mäusen die Werte deutlich höher lagen. Hieraus kann geschlossen werden, dass gerade der fulminante Anstieg von Zytokinen im direkten Zusammenhang mit der Immunpathogenese der Diskussion 118 akuten und septischen Melioidose stehen, wie sie in BALB/c-Mäusen zu beobachten ist (Ulett et al. 2000b). Auch in einer klinischen Studie an Melioidose-Patienten konnten hohe Plasmakonzentrationen von IFNγ mit der Entstehung einer Sepsis in Verbindung gebracht werden (Lauw et al. 1999). Es kann jedoch festgehalten werden, dass IFNγ ein unablässig wichtiger Faktor bei der Bekämpfung einer Infektion mit Burkholderia pseudomallei in vivo wie in vitro auf dem genetischen Hintergrund von C57Bl/6-Mäusen sein muss, während die Rolle in BALB/c-Mäusen in vivo noch unklar ist. Auf Makrophagenebene ist IFNγ in der Lage, die intrazelluläre bakterizide Aktivität der Zellen beider Mausstämme signifikant zu verbessern. Die Funktion von IFNγ in C57Bl/6-Makrophagen ist dabei unabhängig von Antikörpern, NO und ROI. 5.7. Aktivierung intrazellulärer Abwehrmechanismen durch FcγRezeptoren Bei den Untersuchungen zur Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe konnte in dieser Studie festgestellt werden, dass bei Makrophagen mit einem Knock-out der Fcγ-Kette die NO-Stimulation durch Immunkomplexe mit IgG2a nicht vorhanden war. Auch Versuche zur Induktion der Antikörperproduktion durch Immunkomplexe verschiedener Antikörper-Isotypen ergaben, dass Mäuse mit einem Knock-out von FcγRIII eine normale Antwort auf Immunkomplexe mit IgG1, IgG2a und IgG2b besaßen, während Mäuse mit einem Knock-out der Fcγ-Kette auf Immunkomplexe nicht mit einer Induktion der Antikörperproduktion reagierten (Wernersson et al. 1999). Da der FcRI ein hochaffiner Rezeptor ist, der IgG2a besser als andere IgG- Subklassen erkennt, kann vermutet werden, dass auch die IgG2a-vermittelte Induktion von NO im Wesentlichen auf die Anwesenheit dieses Rezeptors zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu EPS-Immunkomplexen mit IgG2a war bei einer Stimulation von NO durch EPS-Immunkomplexe, die IgG2b enthielten, weiterhin eine messbare NO-Produktion gegeben. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass für eine Stimulation durch IgG2a die Fcγ-Kette von essenzieller Bedeutung ist, während IgG2b-Komplexe über einen anderen Weg NO stimulieren können. Hierfür kommt vor Diskussion 119 allem der auf den Zellen noch vorhandene Fcγ-Rezeptor II in Frage. Allerdings ist bei der Maus dieser Rezeptor nur als Subgruppe Fcγ-Rezeptor IIB vorhanden, welcher kein aktivierendes, sondern nur ein inhibierendes Tyrosinmotiv besitzt. Zur Klärung der Hypothese, dass der eigentlich inhibierende FcγRIIB eine Stimulation der NO-Synthese induziert, wurden Knochenmarkmakrophagen von Tieren mit einem Doppel-Knock-out von Fcγ-Kette und FcγRIIB eingesetzt. In diesen Zellen wurde die Induktion von NO durch IgG2b EPS-Immunkomplexe überprüft und es zeigte sich, dass keine Induktion über EPS-Immunkomplexe mehr möglich war. Diese Beobachtung spricht dafür, dass tatsächlich eine Stimulation von den FcγRIIB ausgeht, die die Produktion von NO in Makrophagen induziert. Die Frage ist nun, wie diese Stimulation zustande kommt. Da eine Induktion von NO im Zusammenhang mit den verschiedenen Typen von Fc-Rezeptoren bislang noch nicht untersucht wurde, gibt es keine Hinweise aus der Literatur. Auch die meisten Untersuchungen, die zur Funktion des FcγRIIB durchgeführt wurden, wiesen ausschließlich auf seine inhibitorischen Funktionen hin. Dabei ist die Vermittlung inhibitorischer Funktionen von FcγRIIB am besten in B-Zellen untersucht. Dort gibt es drei verschiedene Möglichkeiten des Rezeptors zur Inhibition von Zellfunktionen. Zum einen kommt es über eine Kreuzvernetzung von FcγRIIB mit einem ITAM gekoppelten Rezeptor, was zu einer Inhibition der ITAM-vermittelten Kalziummobilisation führt, die Funktionen wie Zytokinausschüttung und eine proinflammatorische Aktivierung der Zelle auslöst. Zum zweiten kann eine Kreuzvernetzung des FcγRIIB mit dem B-Zellrezeptor (BCR) zu einer Inaktivierung von Proliferation und Aktivierung der Zelle führen. Drittens induziert eine Homoaggregation des FcγRIIB ein proapoptotisches Signal, welches jedoch nicht durch ITIM, sondern durch Transmembransequenzen gesteuert wird. In vivo wurden FcγRIIB vor allem eine gewisse Suppression der zellulären Funktionen zugeschrieben, die eine Kontrolle der Immunantwort bewirkt (Ravetch & Bolland 2001). So konnte bei FcγRIIB Knock-out-Mäusen demonstriert werden, dass diese eine Infektion mit Staphylococcus aureus im Vergleich zu Wildtyptieren länger überleben. Ferner zeigten die Knock-out-Tiere eine höhere Produktion von IgG-Immunglobulinen, die gegen den Erreger gerichtet waren sowie ein Zytokinprofil, das auf eine Th2-Antwort gerichtet war, also eine humorale Wirtsabwehr induziert. Diskussion 120 Bisherige Veröffentlichungen geben keinerlei Hinweis auf eine aktivierende Funktion des FcγRIIB. Daher ist es möglich, dass über die Induktion von NO ein bislang unbekannter Weg der Zellaktivierung beschritten wird. Die hier vorgelegten Ergebnisse weisen des Weiteren auf eine Beteiligung der Fcγ-Kette und vor allem des FcγRIIB an der Antikörper-vermittelten Phagozytose hin. Bei der ersten Charakterisierung der Funktionen muriner Makrophagen mit einer Deletion der Fcγ-Kette wurde festgestellt, dass diese in der Lage sind, opsonisierte Erythrozyten zu binden, jedoch nicht zu phagozytieren (Takai et al. 1994). In Untersuchungen an Cryptokokken konnte zudem gezeigt werden, dass in Alveolarmakrophagen von Mäusen die γ-Kette eine entscheidende Bedeutung für die Phagozytose spielt, denn bei Knock-out-Tieren konnte eine Abwesenheit der Antikörper-vermittelten Phagozytose und Antikörper-vermittelten Adhärenz der Zellen nachgewiesen werden. Bezüglich der bakteriellen Adhärenz an den Zellen waren Makrophagen mit einem Doppel-Knock-out von Fcγ-Kette und FcγRII mit den Fcγ-Ketten-Knock-out-Zellen vergleichbar (Yuan et al. 1998). Dieses Ergebnis steht jedoch im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Studie. Hier konnte in Fcγ-Ketten-defizienten Mäusen eine kaum reduzierte Antikörper-vermittelte Phagozytose nachgewiesen werden, während in Knochenmarkmakrophagen mit einem Doppel-Knock-out der Fcγ-Kette und des FcγRII keine Antikörper-vermittelte Phagozytose mehr stattfand. Bei der Interpretation muss jedoch bedacht werden, dass es sich bei Burkholderia pseudomallei um einen invasiven Organismus handelt. Dieser kann möglicherweise nach einer durch Antikörper vermittelten Bindung an Fc-Rezeptoren in die Zellen eindringen, auch wenn diese nicht mehr in der Lage sind, eine Phagozytose zu induzieren. Daraus resultiert eine erhöhte intrazelluläre Keimzahl. Sollte bei einem Knock-out der Fcγ-Kette eine Bindung an die Rezeptoren I und III nicht mehr möglich sein, so kann immer noch der FcγRIIB opsonisierte Bakterien binden, die anschließend in die Zellen eindringen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit der Endozytose über diesen Rezeptor. In humanen Makrophagen, die neben dem inhibitorischen FcγRIIB auch den aktivierenden FcγRIIA besitzen, ist bekannt, dass FcγRIIB über sein inhibitorisches Tyrosinmotiv die FcγRIIA vermittelte Phagozytose inhibiert (Hunter et al. 1998). Im Gegensatz dazu gibt es bei murinen Diskussion 121 Makrophagen jedoch den Hinweis, dass FcγRIIB auch direkt an der Phagozytose beteiligt ist (Daeron et al. 1993). In Makrophagen ohne Fcγ-Rezeptoren ist die Invasion von Burkholderia pseudomallei also durch fehlende Bindung an der Zelloberfläche zum einen erschwert und zum anderen fällt eine aktive Aufnahme durch die Zelle weg, was sich in einer gleichen intrazellulären Aufnahme von opsonisierten und nicht opsonisierten Bakterien widerspiegelt. Die hier gewonnenen Erkenntnisse lassen also darauf schließen, dass dem sonst nur inhibitorische Funktionen zugeschriebenen FcγRIIB durchaus eine Beteiligung an der Induktion von NO durch IgG2b EPS-Immunkomplexe sowie der Antikörpervermittelten Phagozytose von Burkholderia pseudomallei zuzuschreiben ist. Zusammenfassung/Summary 122 6. Zusammenfassung/Summary Sonja Klocke Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei Burkholderia pseudomallei ist ein gram-negatives fakultativ intrazelluläres Bakterium, welches ätiologisch für den Krankheitskomplex der Melioidose verantwortlich ist. Das Wirtsspektrum umfasst den Menschen, aber auch zahlreiche Tierarten. Die Erkrankung tritt in verschiedenen klinischen Verlaufsformen auf, wobei die häufigste lokalisierte Form eine Pneumonie ist. Die Mechanismen der Wirtsabwehr gegen diesen Erreger sind bislang weitgehend unbekannt. Insbesondere die Mechanismen und die Bedeutung von IgG im Vergleich zu IgA für die mukosale Protektion des Respirationstraktes bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei sind bislang wenig untersucht. Ziel dieses Projektes war es, am Beispiel der Infektion mit Burkholderia pseudomallei die Rolle von IgA und IgG mit Spezifität für Exopolysaccharid (EPS) dieses Erregers hinsichtlich ihrer protektiven Bedeutung und der verwendeten Mechanismen vergleichend zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde in einem murinen Burkholderia pseudomallei- Pneumoniemodell mit unterschiedlich empfänglichen Mausstämmen in vivo die Bedeutung der Antikörper-vermittelten mukosalen Abwehr durch passive Immunisierung des Respirationstraktes mit Anti-EPS IgG- und IgA-Isotyp-SwitchVarianten untersucht. Um die Bedeutung der Fc-Rezeptoren in diesem Modell aufzuklären, wurden in diesen Experimenten auch Fcγ-Ketten-defiziente Mäuse eingesetzt. Hier konnte gezeigt werden, dass eine passive Protektion im murinen Respirationstrakt durch EPS-spezifisches IgG zu einer verringerten und verzögerten Mortalität bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei führt, die auch mit einer geringeren Keimzahl in der Lunge korreliert. Die IgG-vermittelte Protektion war dabei an das Vorhandensein der Fcγ-Rezeptoren I und III gekoppelt. Im Gegensatz dazu Zusammenfassung/Summary 123 zeigte die entsprechende polymere IgA (pIgA) -Isotyp-Switch-Variante keine protektiven Effekte in diesem Modell. Da Burkholderia pseudomallei als fakultativ intrazelluläres Pathogen in der Lage ist, z.B. in Makrophagen zu überleben und sich sogar zu vermehren, wurden zur weiteren Charakterisierung wirtsspezifischer Protektion die klassischen Mechanismen der intrazellulären bakteriziden Aktivität von Makrophagen, Stickoxid (NO) -Produktion und Freisetzung reaktiver Sauerstoffe (ROI), vor allem in Verbindung mit Antikörper-vermittelten Effekten untersucht. Zum einen zeigte sich, dass die Knochenmarkmakrophagen des resistenten Mausstamms C57Bl/6 wesentlich höhere Mengen NO und ROI freisetzen, als die Makrophagen aus dem hochempfänglichen BALB/c-Stamm. Des Weiteren waren lediglich IgG- jedoch nicht pIgA-EPS-Immunkomplexe in der Lage, die NO-Produktion von Knochenmarkmakrophagen zu stimulieren. Dabei erfolgte die Stimulation durch IgG2a-Immunkomplexe ausschließlich über die Fcγ-Rezeptoren I und III und durch IgG2b-Immunkomplexe auch über den Fcγ-Rezeptor IIB, wobei in jedem Fall die Aktivierung des globalen Transskriptionsfaktors NF-κB essenziell für die NO-Produktion war. Diese Beobachtungen ließen vermuten, dass die Fc-vermittelte NO-Produktion der entscheidende Faktor bei der Bekämpfung einer Burkholderia pseudomallei Infektion auf Makrophagenebene ist und lieferten scheinbar sowohl eine Erklärung für die unterschiedlichen Resistenzen beider Mausstämme, als auch für die fehlende Protektion durch IgA in vivo. Untersuchungen an iNOS-Knock-out Mäusen zeigten jedoch bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei im Vergleich zu C57Bl/6-Mäusen weder eine höhere Suszeptibilität dieser Tiere noch eine Beeinträchtigung der IgG-vermittelten Protektion nach passiver Immunisierung in vivo. Auch die intrazelluläre Bakterizidie primärer iNOS Knock-out-Makrophagen war durch das Fehlen von NO in vitro nicht beeinträchtigt. Im Gegensatz zu iNOS zeigten p47phox-Knock-out Mäuse in vivo eine deutlich höhere Suszeptibilität gegenüber Burkholderia pseudomallei als C57Bl/6-Mäuse. Beim Vergleich der intrazellulären bakteriziden Funktionen der Makrophagen in vitro war allerdings kein Unterschied zu beobachten. Dies lässt darauf schließen, dass reaktive Sauerstoffe in vivo eine entscheidende Rolle für die Bekämpfung von Burkholderia pseudomallei-Infektionen spielen, die über die reine Funktion der intrazellulären Bakterizidie hinausgeht, wobei C57Bl/6-Mäuse auf Makrophagenebene offenbar über ein redundantes System verschiedener Mechanismen zur bakteriellen Abwehr verfügen. Zusammenfassung/Summary 124 Sonja Klocke Mechanisms of antibody mediated immunity in Burkholderia pseudomallei infection of the respiratory tract The gram-negative and facultative intracellular bacterium Burkholderia pseudomallei is the causative agent of Melioidosis. The host spectrum reaches from men to various animals. The disease occurs in different clinical manifestations, whereas the most common local form is a pneumonia. The mechanisms of host defence against this pathogen are mainly unknown so far. Especially the mechanisms and protective importance of IgG compared to IgA in mucosal protection of the respiratory tract in bacterial infection are rarely examined. Aim of this project was to determine and compare the protective value and used mechanisms in host protection of IgG and IgA with specificity for Exopolysaccharide (EPS) on the example of a Burkholderia pseudomallei infection. Therefore a murine Burkholderia pseudomallei pneumonia model with mouse strains of different susceptibility was used. The role of antibody mediated mucosal immunity after passive immunisation oft the respiratory tract with anti-EPS IgG- and IgA-isotype switch-variants was examined in vivo. In order to clarify the importance of Fc-receptors in this model the experiments were also performed with Fcγ-chain deficient mice. In this study was demonstrated that passive protection in the murine respiratory tract by EPS specific IgG induced a reduced and delayed mortality after infection with Burkholderia pseudomallei, which was also correlated with a lower bacterial burden in the lung. This IgG mediated protection was dependent on the Fcγ-receptors I and III. In contrast the corresponding IgA isotype showed no protective effect in this model. Burkholderia pseudomallei is a facultative intracellular pathogen and able to survive and multiply intracellularly e.g. in macrophages. The classical substances of intracellular killing in macrophages are nitric oxide (NO) and reactive oxygen intermediates (ROI). For further characterisation of hostspecific protection the production of NO and ROI, especially in connection with antibody mediated effects have been examined. On the one hand it turned out that bone marrow derived Zusammenfassung/Summary 125 macrophages of the resistant C57Bl/6 strain produced significantly higher amounts of NO and ROI compared to macrophages of the highly susceptible BALB/c mice. On the other hand only EPS-immune-complexes of IgG isotypes were able to induce nitric oxide production in bone marrow derived macrophages while IgA immunecomplexes were not. This stimulation was mediated in the case of IgG2a-complexes by the Fcγ-receptors I and III only while IgG2b-complexes stimulated NO also via Fcγ-receptor IIB. In all cases the global transcription factor NF-κB was essential for EPS-immune-complex mediated stimulation of NO. From these observations one can conclude that Fcγ-mediated NO-production is a major factor in the defence of Burkholderia pseudomallei infection on the level of macrophages, and may serve as an explanation for the different susceptibilities of both mouse strains as well as for the missing protection via IgA in vivo. Surprisingly investigations on iNOS knock-out mice revealed no difference in susceptibility and protection by passive immunisation with IgG after Burkholderia pseudomallei infection compared to C57Bl/6 mice in vivo. Also the intracellular bactericidal function of primary iNOS knock-out macrophages was not impaired by the absence of NO. In contrast to that p47phox knock-out mice showed a higher susceptibility compared to C57Bl/6 mice in vivo after Burkholderia pseudomallei infection. Nevertheless the intracellular bactericidal function of macrophages from p47phox knock-out and C57Bl/5 wildtyp mice showed no difference in vitro. This lead to the impression that ROI plays a major role in host defence against Burkholderia pseudomallei in vivo which goes beyond the pure function of intracellular killing, whereas C57Bl/6 mice seem to possess a redundant system of different mechanisms of intracellular killing on the level of macrophages. Literaturverzeichnis 126 7. Literaturverzeichnis Amber, I. J., Hibbs, J. B., Jr., Parker, C. J., Johnson, B. B., Taintor, R. R. & Vavrin, Z. 1991. Activated macrophage conditioned medium: identification of the soluble factors inducing cytotoxicity and the L-arginine dependent effector mechanism. J.Leukoc.Biol. 49: 610-620. Ashdown, L. R. 1994. In Hoeprich PD, Jordan MC & Ronald AR (Eds) Infectious diseases, a treatise of infectious process (pp. 1312-1316). Ashdown, L. R. & Koehler, J. M. 1990. Production of hemolysin and other extracellular enzymes by clinical isolates of Pseudomonas pseudomallei. J.Clin.Microbiol. 28: 2331-2334. Atkins, T., Prior, R. 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IKA Labortechnik Minishaker, IKA Labortechnik Neuberg Zählkammer, Brand Phasenkontrastmikroskop, Fa. Zeiss pH-Meter 761 Calimatic, Fa. Knick Photometer Ultrospec III, Fa. Pharmacia LKB Pipetboy, Integra Bioscience Pipetman, Gilson Pipette variable 0,5 – 10 µl, Abimed HC Schüttelinkubator (Incubator Shaker Model G 25), New Brunswick Scientific Co. Inc. NJ, USA Schüttler Vari-Mix M487220-33, Fa. Thermolyne Schüttler Rocky, Fa. LTF Labortechnik Sterilwerkbänke, Fa. Heraeus Tischzentrifuge, Fa. Bachofer Tischzentrifuge Biofuge 13, Fa. Heraeus Vortexer, Fa. Heidolph REAX 2000 Waage PL 1200, Mettler Zentrifuge Minifuge GL, Fa. Heraeus Zentrifuge Modell J2-21, Fa. Beckmann Anhang 142 8.2. Gebrauchsmaterialien Artikel Firma Best. Nr. Columbia Blutplatten Beckton Dickenson 254071 Combitip, 10 ml Eppendorf 0030.069.463 Combitip, 2,5 ml Eppendorf 0030.069.447 Combitip,1ml Eppendorf 0030.069.234 Einfrierröhrchen Corning 430658 Einmalskalpell, Nr. 21 Feather 02.001.30.021 Einmalspritze, 1ml BBraun 9161309V Einmalspritze, 5 ml BBraun 4906051V Falcontubes, 15 ml Greiner Cellstar 188261 Falcontubes, 50 ml Greiner Cellstar 227261 Fluoreszenzfolie Greiner 676001 Injektionskanüle, 27G BBraun 4665406 Küvetten Sarstedt 67.742 Nadel-Faden Kombination Johnson Johnson 8697 6/0 Parafilm Pechiney PM-996 Petrischale Ø 9 cm Sarstedt 82.1473 Pipettenspitzen, blau Sarstedt 70.761 Pipettenspitzen, gelb Sarstedt 70.760.002 Pipettenspitzen, kristall Gilson HUG2/09627 PS-Mikroplatte, 96K Greiner Cellstar 650101 PS-Röhrchen, 14 ml Greiner 191160 PS-Röhrchen, 4,5 ml Greiner 120160 Reagiergefäße, 0,5 ml Sarstedt 72.699 Reagiergefäße, 1,5 ml Sarstedt 72.690 Sterilfilter, 0,22 µm Millipore SLGV013NL TC Platte, 96 well Greiner Cellstar 655180 Anhang 143 TC Platte, 48 well Greiner Cellstar 677180 Venenverweilkatheter, BBraun 4252098B Wattestäbchen Wiros 891 Zellkulturflasche, 250 ml Greiner Cellstar 658170 Zellschaber, 30 cm TPP 99003 22G/1 8.3. Medien 8.3.1. Medien für die Bakterienanzucht: Müller-Hinton-Agar (Difco) 30% Rinderinfusion, 1.75% Casamino Acids, 0.15% Stärke, 1.7% Agar, pH 7.3 LB-Medium (Difco) 1% Bacto-Trypton, 0.5% Bacto-Hefeextrakt, 0.5% NaCl, pH 7.5 Ashdown- Agar 1% Trypton-Soja-Broth, 1.5% Agar, 3.48% Glycerin, 0.0005% Kristallviolett, 0.005% Neutralrot, 5 µg/ml Gentamycin 8.3.2. Medien für die Zellkultur DMEM (Biochrom) 3,7 g/l Na HCO3 4,5 g/l D-Glucose 1,028 g/l Glutamin + 10 % FCS Anhang 144 RPMI (Biochrom) 2 g/l Na HCO3 0,532 g/l N-Acethyl-L-Alaniyl-L-Glutamin + 10 % FCS + 50 µM 2-Mercaptoethanol + 33 nM GM-CSF 8.4. Puffer und Lösungen Dichlorofluoreszein Diacetat 10 mM Natriumhydrogenphosphat/ Natriumdihydrogenphosphat pH 6,9 0,004% MUG 0,04% DMSO 1 %ige Lösung in einfach PBS 0,15% Coomassie Blue 66,6% Phosphorsäure 85 % 33,3% Ethanol 97 % eingesetzt: 15% in H2O 5 µM in PBS N (1-Naphtyl) Etylendiamin Natriumnitrit Phorbol 12-myristat 13-acetat Phosphate Buffered Saline (PBS): 10 mM, pH 7,4 Streptavidin-β-Galaktosidase Sulfanilsäure Tergitol 1% in Methanol (96%) 1 mM in DMEM 200 nM in PBS 10 mM Natriumphosphatpuffer, 140 mM NaCl, 2 mM KCl, pH 7,4 1:2400 in BSA 1% 1% in 4 N HCl 1 % in einfach PBS, 0,5 % BSA 4-Methylumbelliferyl-β-DGalaktopyranosid (MUG) β-Galaktosidase-Puffer: Bovines Serum Albumin (BSA): Bradford Reagenz Anhang 145 8.5. Chemikalien Substanz Firma Best. Nr. 1640 RPMI Biochrom AG FG 1215 2,-Mecaptoethanol Sigma M-7522 2´,7´Dichlorofluoreszein Sigma D-6883 Sigma M-1633 Agar Difco 214530 Albumin Fraktion V (BSA) AppliChem A 1391,0100 Aminoguanidin Sigma A-7259 Coomassie Blue G Sigma B1131 Cyclophosphamid Sigma C-7397 Di- Merck 1.05099.10000 Dimethylsuphoxide (DMSO) Sigma D-2650 DMEM Biochrom AG FG 0435 Ethanol J.T. Baker 8006 Diazetat 4-Methylumbelliferyl-β-DGallactopyranosid (MUG) Kaliumhydrogenphosphat Fetales Kälber Serum Biochrom S 0115 (FCS) Gentamycin Sigma G-1397 Gentamycin Sigma G-1397 Glycerin Merck 1.04093.1000 Glycerin Merk 1.04093.1000 GM-CSF Wurde zur Verfügung gestellt AG Weiss GBF Braunschweig IFN γ Roche 1276905 Kaliumdihydrogenphosphat Merck 1.04873.1000 Kanamycin Sigma K-4000 Anhang 146 Ketamin Gräub 05.6099712 Kristallviolett Schmidt GmbH 42555 LB-Broth-Base Difco 12780-052 Lipopolysaccharid von Sigma L-6261 Salmonella Minnesota Methanol J.T. Baker 8045 Müller Hinton Agar Difco 225220 N-(1-Naphtyl) Ethylendiamin Sigma N-9125 Natriumchlorid Merk 106.404.5000 Natriumdihydrogenphosphat Merk 1.06346.1000 Natriumhydrogenphosphat J.T. Baker 0326 Natriumnitrit Sigma S2252 Neutralrot Schmidt GmbH 50040 N-Methyl-L-Arginin Sigma M-7033 Ammonium Sigma P 8765 PDTC Pyrrolidindithiocarbamat Phorbol 12-Myristat Sigma P-8139 Phosphorsäure 85 % Merk 572 Polymyxin B Sigma P-1004 Rompun, 2% Bayer PZN-1320422 Salzsäure 37 % Riedel-de Haen 30721 Streptavidin Böhringer Mannheim 1112481 Sulfanilsäure Sigma S-5263 Tergitol Fluka 86452 Trypsin EDTA Biochrom AG L 2143 Tryptan-Blau-Lsg 0,4% Sigma T-8154 Tryptone Soya Broth Oxoid 29680 13-Acetat Proteinreagenz Bradford β-Galactosisdase Anhang 147 8.6. Antikörper 8.6.1. Antikörper für ELISA Antikörper Goat α Mouse IgG1 Goat α Mouse IgG2a Rabbit α Mouse IgG2b Goat α Mouse IgA Goat α Mouse IgA Goat α Mouse IgG1 Rabbit α Mouse IgG2b Goat α Mouse IgG2a Mouse IgG1, 100 ng/ml Mouse IgG2a, 100 ng/ml Mouse IgG2b, 100 ng/ml Mouse IgA, 100 ng/ml Firma SBA Best. Nr. 1070-01 X SBA 1080-01 X Zymed 61-0300 X SBA SBA Zymed 1040-01 1040-08 610140 X biotinyliert biotinyliert Zymed 610-0140 biotinyliert SBA 1080-08 biotinyliert SBA 01002-01 Standard SBA 01003-01 Standard SBA 01004-01 Standard SBA 01006-01 Standard 8.6.2. Monoklonale anti EPS Antikörper gegen B. pseudomallei Klon Isotyp 3015 3015 3015 3015 3015 3165 3165 3165 IgG1 IgG2a IgG2b IgA polymer IgA monomer IgG1 IgG2a IgG2b Bestimmt mit… Bradford Bradford ELISA ELISA ELISA Bradford Bradford Bradford Anhang 148 8.6.3. Sonstige Antikörper Antikörper R4-6A2 Herkunft Ratte Spezifität Murines IFNγ Gamma Globulin Gamma Globulin 898 IgG2a 3034 IgG1 Ratte Rind Maus Maus 3034 IgA polymer Maus X X E. coli pKT 146 Bp Salmonella Typhimulium Salmonella Typhimurium Einsatz In vivo IFNγ-Hemmung In vivo Kontrolle Standard Bradford Isotyp Kontrolle Isotyp Kontrolle Isotyp Kontrolle 8.7. Software Zur Anfertigung dieser Dissertation wurden die Programme Microsoft Office, SigmaPlot 2001, SigmaStat 2.0, SPSS 7.0, GraphPad Prism 3.03 und Mikrowin verwendet. 149 Danksagungen Diese Arbeit wurde am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Dem ehemaligen Direktor des Instituts Herrn Prof. Dr. Bitter-Suermann und dem jetzigen Direktor Prof. Dr. Suerbaum, möchte ich dafür danken, dass ich die Arbeit in diesem vielfältigen wissenschaftlichen Umfeld durchführen durfte. Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. Ivo Steinmetz für die Überlassung des Themas, die wissenschaftliche Betreuung und seine stets kreativen Ideen bei der Lösung großer und kleiner Probleme während dieser Arbeit. Des Weiteren möchte ich den Mitgliedern meiner Ph.D. – Betreuungsgruppe Herrn Prof. Dr. Haas und PD Dr. Tschernig für Unterstützung danken. Ich möchte den Betreuern und Studenten des DFG Graduiertenkolleg 745 „Mukosale Erreger-Wirt-Interaktionen“ danken, die stets für fachliche und auch weniger fachliche Gespräche zur Verfügung standen, und so die Arbeit sehr erleichtert haben. Insbesondere danke ich auch Frau Faber, die für eine optimale Organisation aller Termine gesorgt hat, und auch auf alle Fragen zu den für mich manchmal verwirrenden Richtlinien und Formalien des Graduiertenkollegs und des Ph.D.Studiums stets eine Antwort hatte, und uns auch sonst mit Rat und Tat zur Seite stand. Mein Dank gilt der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Finanzierung diser Arbeit. Ein weiteres Dankeschön gilt Herrn Prof. Dr. K. Kamino und Herrn Arndt aus dem Institut für Pathologie der MHH für die Unterstützung bei der histopathologischen Bearbeitung und Diagnostik der Mausexperimente. 150 Der Arbeitsgruppe Klinische Immunologie der MHH, PD Dr. Gessner und insbesondere Dr. Stephanie Konrad danke ich, dass sie mir die Fcγ-chain Knock-out Mäuse zur Verfügung gestellt haben. Mein Dank gilt weiterhin der Prof. Dr. Authenrith vom Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg für die Bereitstellung des Hybridomalklons R4-6A2. Ohne das Know how meiner Arbeitgruppe wäre diese Arbeit nicht zustande gekommen. Deshalb gilt mein besonderer Dank Birgit Brenneke für ihre Unterstützung bei den alltäglichen Problemen im Labor sowie ihrer Geduld bei Verhandlungen mit den Kollegen aus dem Tierhaus der MHH, Jessika Garlisch danke ich für ihr Geschick als Mäusedompteuse und für die vielen anderen kleinen und großen Hilfestellungen bei meiner Arbeit. Kathrin Breitbach möchte ich für die Einarbeitung in die Geheimnisse der primären Knochenmarkmakrophagen danken. Aber das waren noch längst nicht alle, denn was wäre die interessanteste Forschung ohne nette Kollegen: Holger Bruns, Meike Diedrich, Franz von Götz, Nadine Hein, Doris Jordan, Dagmar Löns, André Strüßmann, Sabine Pilatz, Ralf Vonberg, Verena Wild, Isabel Ziegler. Leute, ich danke euch für eure Freundschaft, euer Verständnis und der praktischen und moralischen Hilfe bei mancher Durststrecke, den vielen gemeinsamen Abenden bei Brot, Wein, und was sonst noch dazugehört und den vielen Lachanfällen, die ich mit euch erlitten habe. Mein besonderer Dank gilt auch Uta Digtes, Dr. Beate Fehlhaber und Verena Wild für das Korrekturlesen meiner Arbeit. Ebenso möchte ich mich bei allen anderen Kollegen des Instituts herzlich für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre und die mir von allen Seiten entgegengebrachte Hilfsbereitschaft bedanken. 151 Veröffentlichungen: Breitbach, K., Rottner, K., Klocke, S., Rohde, M., Jenzora, A., Wehland, J. & Steinmetz, I. 2003. Actin-based motility of Burkholderia pseudomallei involves the Arp 2/3 complex, but not N-WASP and Ena/VASP proteins. Cell Microbiol. 5: 385393. Klocke, S. et al. Anti-Expopolysaccharide Monoclonal Antibody-Mediated Protection in Murine Pulmonary Burkholderia pseudomallei Infection (Manuskript in Vorbereitung) 152 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Mechanismen der Antikörper-vermittelten Immunität im Respirationstrakt bei Infektionen mit Burkholderia pseudomallei“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Institut für medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. ................................................ eigenhändige Unterschrift
