Testsysteme zur Bestimmung der Aktvitaet verschiedener Enzyme

F II – Praktikum SS 2005
Gruppe 3
06. – 10.06.2005
Testsysteme zur Bestimmung der Aktivität verschiedener Enzyme
Einleitung:
Das Ziel der Versuche ist es, Enzymaktivitäten verschiedener Stoffwechselwege in Geweben zu
messen und dadurch Rückschlüsse auf die Art des Stoffwechsels und deren Kapazität machen zu
können.
Bei den Geweben handelt es sich um Gehirn, Skelettmuskel, Leber und Herz der Maus. Auch die
Untersuchung von Bienensperma wird durchgeführt.
Für die Messung der Maximalaktivitäten auf einzelne Enzyme werden verschiedene Testsysteme (vgl.
Skript) angewandt. Die Aktivitäten der Enzyme werden durch Photometrie bestimmt.
Wegen der großen Anzahl der Enzyme behandelt jede Gruppe nur drei Enzyme, führt also auch nur
drei Testsysteme durch.
Unsere
Gruppe
beschäftigte
sich
mit
der
(Glycerinaldehyddehydrogenase), Citratsynthase (CS)
Untersuchung
von
GAPDH
und HOADH (ß-Hydroxyacyl – CoA-
dehydrogenase). Die gesamten Beobachtungen konzentrieren sich somit hauptsächlich auf diese
Enzyme. In der Diskussion werden aber die gesamten Daten berücksichtigt.
Material / Methode / Durchführung:
Für die Bestimmung der Aktivität eines Enzyms durch Photometrie benötigt man eine Reaktion, deren
Änderung von Edukten zu Produkten eine Änderung der Extinktion mit sich bringt. Dafür werden die
zu untersuchenden Reaktionen oft mit Reaktionen gekoppelt, deren Produkte man photometrisch
nachweisen kann. Bei den hier verwendeten Testsystemen wird entweder die Zu- bzw. Abnahme der
Extinktion von NADH (Absorption bei 340 nm) oder von einem Farbstoff (DTNB-CoA-Komplex),
der eine Absorption bei 412nm aufweist, quantitativ festgehalten.
Es handelt sich dabei um die Extinktionsänderung pro Zeit (∆E / min).
Um sicher zustellen, daß das zu untersuchende Enzym der begrenzende Faktor ist und nicht etwa das
Hilfsenzym, werden unterschiedliche Konzentrationen des zu untersuchenden Gewebes (und somit des
Enzyms) eingesetzt und auf Proportionalität untersucht. Eine vorhandene Proportionalität bestätigt
somit die korrekte Funktion des Testsystems.
Bei
den
gemessenen
Cytochromoxidase).
Aktivitäten
Dies
wird
handelt
durch
es
optimale
sich
um
Maximalaktivitäten
Versuchsbedingungen
(pH,
(Ausnahme
Temperatur,
Substratkonzentration) sichergestellt.
Die Testsysteme sind im Skript auf den Seiten 21, 28 und 30 für die GAPDH, CS und HOADH
beschrieben.
Auch die eingesetzten Volumina der Stoffe sind dort in tabellarischer Form zu finden.
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Gruppe 3
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Änderungen in der eingesetzten Menge an Gewebeextrakten fordern ein unterschiedliches Volumen an
Wasser, um auf das Gesamtvolumen von 500µl zu kommen. Dies wird bei den unterschiedlichen
Versuchansätzen nicht weiter beschrieben werden.
Die Ansätze werden direkt in die Küvette gegeben und dann gemessen. Das Hinzufügen der „StarterReagenz“ erfolgt erst nach einem sich nicht mehr verändernden Vorlauf. Gegebenfalls auftauchende
Extinktionsänderungen von Nebenreaktionen werden von der eigentlich gemessenen Extinktion
abgezogen.
Die Tests wurden bei einer gleich bleibenden Temperatur von 25°C durchgeführt.
Um die generelle Funktion der Testsysteme sicherzustellen, werden vorab alle Enzymtests mit
aufgereinigten Enzymen durchgeführt. Im Anschluß daran werden die zu untersuchenden Gewebe
eingesetzt.
Zur Herstellung der Gewebsextrakte wird eine Maus getötet und die entsprechenden Organe
entnommen. Diese werden in Homogenisationspuffer homogenisiert, zentrifugiert und in Pellet und
Überstand getrennt den Gruppen zur Verfügung gestellt.
Ergebnisse:
Die gemachten Beobachtungen finden sich in grafischer Form in den angefügten Schreiberausdrucken.
Desweiteren sind die berechneten Werte in der angefügten Tabelle eingetragen.
Die Angaben in der Tabelle sind in Substratumsatz (µmol) pro min und g Frischgewicht = U/g FG.
Die Werte werden nach der im Skript abgedruckten Formel berechnet (Seite 11):
(∆E/min * V * H) / (ελ * d * X) = Substratumsatz in µmol * min-1 * g-1
Citratsynthase (CS) Herz Sediment:
delta E / min = 0,09
Küvetteninhalt (V) = 500µl
Extinktionskoeffizient = 13 cm^2 /µmol
Homogenisationsfaktor = 20 ml / g
Schichtdicke = 1 cm
Eingesetzte Extraktmenge (X) = 20µl
(0,09 * 500µl * 20 ml / g) / (13 cm^2/µmol * 1cm * 20µl) = 3,461 µmol / min / g (1:10 Verdünnung)
Æ 34, 61 µmol / min / g
Es werden immer Doppelbestimmungen mit unterschiedlicher Enzymkonzentration durchgeführt. Aus
den erhaltenen Werten wird dann der Mittelwert gebildet und dieser in die Tabelle eingetragen.
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Gruppe 3
U / g FG
Ü
P
Ü
Herz
P
Ü
Leber
P
Ü
Skelettmuskel
P
Ü
Bienensperma
P
Gehirn
HK
Total
0,6
6,4
2,7
0,5
0,5
n.n.
1,2
n.n.
29,8
15,2
7
3,2
0,5
1,2
45
GPase
Total
1,2
1,2
n.n.
8
8
n.n.
1,2
2,8
1,6
33
33
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
PFK
Total
12
12
n.n.
16
16
n.n.
3,8
3,8
n.n.
46,1
46,1
n.n.
4,5
4,5
n.n.
GAP-DH
Total
50,6
71,1
20,5
59,9
59,9
n.n.
56,7
56,7
n.n.
271,3
327,6
56,3
59,2
107,8
48,6
06. – 10.06.2005
LDH
Total
51,4
51,4
n.n.
112,5
112,5
n.n.
225,1
225,1
n.n.
323,6
323,6
n.n.
8,9
51,7
42,8
FBPase
Total
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
9
9
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
CS
Total
8,1
6,4
63,6
34
7,7
4,4
5,6
6,4
6,5
33,9
CytOx
n.n.
5,2
n.n.
97,6
23
n.n.
12,1
18
n.n.
12
5
n.n.
40,4
5,2
14,5
5,2
23
18
5
5,2
HOADH
Total
n.n.
n.n.
n.n.
5,1
5,1
n.n.
6
9,7
3,7
1,4
1,4
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
G-6-PDH
Total
0,9
0,9
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
1,4
1,4
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
CK
Total
160
186,5
26,5
316
376
60
n.n.
n.n.
n.n.
184
204
(?)
20
6
88
82
(Arginin
Kinase)
Tab. 1: Enzymaktivität in U / g Frischgewicht verschiedener Enzyme in unterschiedlichen Extrakten
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Diskussion:
GAP-DH:
Die Aktivität der GAPDH ist im Vergleich zu z.B. PFK sehr hoch. Dies liegt daran,
dass die GAP-DH eine Reaktion katalysiert, die nahe am Gleichgewicht gehalten
werden muss, damit die Hin- und Rückreaktion möglich ist, während die PFK nur die
Hinreaktion katalysiert und Fluxlimitierend wirkt!
Dies gilt insbesondere für die Leber, da dort auch Gluconeogenese stattfindet (vgl.
FBPase)
Die höchsten Werte für die GAP-DH findet man im Skelettmuskel, da dort
vorzugsweise Glycogen zu Substrat verstoffwechselt wird.
Die geringe Ausbeute an ATP bei der Substratgärung im Vergleich zur oxidativen
Phosphorylierung erfordert eine hohe Fluxrate der Glykogenolyse, um eine gleich
hohe ATP-Ausbeute zu erreichen.
CS:
Die Citratsynthase ist ein Enzym des Citratzyklus. Sie katalysiert dort die Bildung
von Citrat aus Oxalacetat und Acetyl-CoA.
Im Muskel findet man nur geringe Mengen des Enzyms, da es dort nur im
Ruhezustand benötigt wird.
Da das Herz sehr stark auf die oxidative Phosphorylierung ausgerichtet ist, findet sich
dort ein entsprechend hoher Wert an CS.
HOADH:
Die ß-Hydroxyacyl – CoA-dehydrogenase ist ein Enzym des Fettabbaus.
Es findet sich bei den untersuchten Organen ausschließlich in Herz, Leber und
Skelettmuskel, wobei der Wert in der Leber der höchste ist. Dieses Ergebnis korreliert
auch mit den wichtigen Funktionen der Leber im Fettstofwechsel.
Das Gehirn besitzt keine Fett abbauenden Enzyme, da die Gefahr sonst zu hoch wäre,
dass die Enzyme auch die Membranlipide der Nervenzellen und anderer wichtiger
Strukturen angreifen.
HK:
Die Hexokinase ist das erste Enzym der Glycolyse.
In der Leber findet sich ein relativ niedriger Wert, da dort ein anderes Isoenzym
vorliegt, das mit unserem Test nicht erfasst wird.
Es lassen sich teils hohe Pellet Werte (Gehirn) nachweisen, da die Hexokinase mit der
Cytoplasmamembran und der mitochondrialen Membran assoziiert ist.
Diese Bindung findet sich aber nicht bei allen Organen.
Da der Muskel Glucose nur im Ruhezustand zur Energiegewinnung verwendet, ist
der Wert entsprechend niedrig.
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Gruppe 3
GPase:
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Die Glycogenphosphorylase katalysiert den Abbau von Glycogen zu
Glucose-1-Phosphat.
Da der Skelettmuskel bei Belastung glycogenabhängig arbeitet sind die Werte hier
sehr hoch. Damit ist der Muskel dann auch relativ unabhängig von der
Blutversorgung, da sich in der Zelle Glycogenspeicher befinden.
Bei den Spermien findet man keine GPase Aktivität. Daraus lässt sich schließen,
dass die Spermien auf extrazelluläre Kohlenhydrate angewiesen sind.
PFK:
Die Phosphofructokinase ist ein Enzym der Glycolyse. Sie katalysiert die Reaktion
von Fructose-6-Phosphat zu Fructose-1,6-Bisphosphat.
Das Enzym findet sich in allen betrachteten Geweben, da es sowohl für den
Glycogen- als auch für den Glucosestoffwechsel benötigt wird.
Das Herz weist einen hohen PFK Gehalt auf, damit es bei einem auftretenden
Sauerstoffmangel ausschließlich aus Kohlenhydraten ATP gewinnen kann.
LDH:
Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Reaktion von Pyruvat zu Laktat und kann
damit zur NADH Regeneration genutzt werden.
Die Werte für das Enzym liegen relativ hoch, da es sich hier auch um eine Reaktion
handelt, die sehr nahe am Gleichgewicht liegt.
Die höchste Enzymaktivität findet sich im Muskel, da er auch anaerob Energie
gewinnen kann.
In der Leber finden sich ebenfalls hohe Werte, da die Leber u.a. das Laktat, das in den
Muskeln entsteht, in einer Rückreaktion wieder umsetzen kann.
FBPase:
Die Fructose-1,6-Bisphosphatase ist ein Enzym der Gluconeogenese.
Sie bildet Fructose-6-Phosphat aus Fructose-1,6-Bisphosphat.
Aufgrund ihrer Funktion in der Gluconeogenese findet man die FBPase
ausschließlich in der Leber.
CytOx:
Die Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette.
Sie findet sich in allen untersuchten Geweben, besonders in Herz und Leber.
Als membranassoziiertes Protein findet sie sich ausschließlich im Pellet.
Aufgrund des Versuchsprinzips (Messbereich) kann bei diesem Versuch nicht
die Maximalaktivität gemessen werden. Daher kann aus den gemessenen Werten
keine klare Aussage getroffen werden.
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Gruppe 3
G6PDH:
06. – 10.06.2005
Die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase ist ein Enzym des Pentosephosphat
Stoffwechsels. Sie findet sich ausschließlich im Überstand der Extrakte von
Leber und Gehirn. Das Enzym wird für alle reduktiven Synthesen benötigt.
Dazu zählen die Nucleinsäuresynthesen in der Leber und Lipidsynthesen im
Gehirn. Zudem erfüllt das Enzym einen Schutzmechanismus in dem es
eine erhöhte Konzentration an oxidierten Molekülen bzw. Radikale
unschädlich machen kann.
CK:
Die Creatinkinase ist Teil eines ATP-regenerierenden Systems.
Sie katalysiert die Reaktion von Creatin zu Creatinphosphat.
Creatinphosphat und damit auch die CK ist als schneller Energielieferant
fast überall vorhanden. In der Leber findet sie sich jedoch nicht.
Der Wert im Sklettmuskel muss jedoch weitaus höher liegen.
Die untersuchten Enzyme im Bienenspermium lassen schon erste Rückschlüsse auf deren
Energiestoffwechsel zu.
Somit kann man zusammenfassend sagen, daß die Spermien auf äußere Kohlenhydrate angewiesen
sind, da kein Glycogenstoffwechsel stattfindet, weil die dafür benötigten Enzyme nicht vorhanden
sind. Die Enzyme der Glycolyse dagegen sind vorhanden. Auch die des Citratzyklus und die der
Atmungskette. Somit kann man festhalten, daß die Spermien oxidativ ATP erzeugen können. Auffällig
ist, daß viele Enzyme im Sediment gefunden wurden.
Die Untersuchungen anderer Spermien
unterstützen diese Beobachtung, da die Enzyme dort oft membrangebunden aufzufinden sind.
Als Energiequelle scheiden auch Fette aus, da keinerlei HOADH gefunden wurde. Auch findet
keinerlei Gluconeogenese statt. Auch fehlen Enzyme des Pentosephosphatzykluses. Somit fehlen
jegliche Enzyme von anabolen Stoffwechselwegen. Dies könnte darauf hinweisen, daß die Spermien
in der Königin fertig entwickelt vorliegen. Genauere Vermutungen müssen nun durch weitere
Untersuchungen folgen und können anhand der Ergbnisse hier noch nicht gemacht werden.
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