Fusionsproteine aus Liganden von aktivierenden Rezeptoren

Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik I für Innere Medizin
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek
Fusionsproteine aus Liganden von aktivierenden Rezeptoren
natürlicher Killerzellen mit einzelsträngigen Antikörperfragmenten
(ScFv) in der Immuntherapie von soliden Tumoren
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Ron Daniel Jachimowicz
aus Köln
Promoviert am 23. Februar 2011
Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik I für Innere Medizin
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Hallek
Fusionsproteine aus Liganden von aktivierenden Rezeptoren
natürlicher Killerzellen mit einzelsträngigen Antikörperfragmenten
(ScFv) in der Immuntherapie von soliden Tumoren
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Ron Daniel Jachimowicz
aus Köln
Promoviert am 23. Februar 2011
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2011
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert
2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke
Erklärung:
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus
fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche
kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie der Herstellung des
Manuskripts habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch
genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar geldwerte Leistungen für
Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation
stehen.
Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder
ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht
veröffentlicht.
Köln, 07.07.2010
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir im Labor für
Immuntherapie der Klinik I für Innere Medizin der Universität zu Köln mit
Unterstützung von Frau Professor Dr. rer. nat. Elke Pogge von Strandmann und Herrn
Dr. med. Achim Rothe durchgeführt worden.
Die Klonierung der bispezifischen Proteine ULBP2-BB4, ULBP2-PSMA+15, ULBP2PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 erfolgte ohne meine Mitarbeit
durch Mitarbeiter des Labors für Immuntherapie der Klinik I für Innere Medizin der
Universität zu Köln.
Danksagung
Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Andreas Engert danke ich für die Möglichkeit
und Mittel, diese Arbeit in dem von ihm geleiteten Labor für Immuntherapie
anfertigen zu können.
Besonders danke ich Frau Professor Dr. rer. nat. Elke Pogge von Strandmann und
Herrn Dr. med. Achim Rothe für die Bereitstellung des interessanten Themas, für die
hervorragende wissenschaftliche Betreuung und für die nie erlahmende
Diskussionsbereitschaft, die maßgeblich zum Gelingen der Arbeit beitrugen.
Des Weiteren bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern des Labors für Immuntherapie,
die aufgrund der familiären Integration, der herzlichen Umgangsart, des kollegialen
Arbeitsklimas und einer steten Hilfsbereitschaft bei Problemen die Arbeit leichter
fallen ließen. Namentlich erwähnen möchte ich in diesem Zusammenhang Frau Dr.
rer. medic. Katrin Reiners, Herrn Hermann Straub, Frau Anne Krüssmann, Frau Gisela
Schön und Herrn Samir Tawadros.
Zuletzt möchte ich Herrn Professor Dr. med. Th. Gheorghiu danken.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................ 3
1.1.
Interaktion des Immunsystems mit Tumoren ................................................................................................ 3
1.2.
NK- Zellen ....................................................................................................................................................... 3
1.3.
NK- Zell basierte Immuntherapie.................................................................................................................. 7
1.4. Monoklonale Antikörpertherapie .................................................................................................................. 8
1.4.1. Mechanismen der Vermittlung von Effektorfunktionen durch mAb- „Enhancing effector
functions“ .............................................................................................................................................................. 8
1.4.2. „Direct arming“ ...................................................................................................................................... 9
1.4.3. „Pre-targeting“...................................................................................................................................... 10
1.4.4. „Indirect arming“.................................................................................................................................. 10
1.5. Bispezifische Fusionsproteine aus einzelsträngigen Antikörperfragmenten (ScFv) und aktivierenden
Liganden von Immuneffektorzellen- „Immunoliganden“ ..................................................................................... 12
1.6. PSMA auf Prostata- Tumorzellen als potentielles Ziel einer Immuntherapie mit rekombinanten NKRezeptorliganden ..................................................................................................................................................... 13
1.7.
Oligomerisierung durch Linkerverkürzung ................................................................................................ 14
1.8.
Fragestellung ................................................................................................................................................ 14
2. Materialien und Methoden............................................................................... 16
2.1. Material......................................................................................................................................................... 16
2.1.1. Reagenzien............................................................................................................................................ 16
2.1.2. Chemikalien und Materialien .............................................................................................................. 18
2.1.3. Zelllinien und Mäuse............................................................................................................................ 19
2.1.4. Geräte .................................................................................................................................................... 20
2.1.5. Antikörper ............................................................................................................................................. 20
2.1.6. Software ................................................................................................................................................ 21
2.2. Methoden....................................................................................................................................................... 22
2.2.1. Zellkulturen........................................................................................................................................... 22
2.2.2. Herstellung der Expressionsplasmide ULBP2-PSMAx..................................................................... 22
2.2.3. Transfektion von 293T- Zellen mit den Plasmiden ULBP2-PSMAx, ULBP2-BB4 und BB4 ....... 23
2.2.4. Protein Konzentrierung ........................................................................................................................ 23
2.2.5. Protein Aufreinigung............................................................................................................................ 24
2.2.6. SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .................................................................... 25
2.2.7. Färbung der SDS- PAGE- Gele........................................................................................................... 25
2.2.8. Western Blotting................................................................................................................................... 25
2.2.9. Analytische Gelfiltration...................................................................................................................... 26
2.2.10. Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA) ........................................................................... 27
2.2.11. Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting, FACS) ................................................ 27
2.2.12. Separation mononukleärer Zellen (MNZ) mittels Dichtegradienten- Zentrifugation.................... 29
2.2.13. Magnetische Zelltrennung (magnetic cell sorting) .......................................................................... 29
2.2.14. Cytokine Release Assay mittels ELISA ........................................................................................... 30
2.2.15. Cr51 Europium Release Assay ........................................................................................................... 32
2.2.16. Xenograft Modell am Kolon- Adenokarzinom mit ULBP2-BB4................................................... 33
2.2.17. Transplantat Modell am humanem primären Kolon- Karzinom mit ULBP2-BB4........................ 34
2.2.18. Xenograft Modell am Prostata- Karzinom mit ULBP2-PSMA+2 .................................................. 35
3. Ergebnisse ......................................................................................................... 36
3.1. ULBP2-BB4 verursacht eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums subkutaner LS174TTumoren im Nude- Mausmodell des Kolon- Karzinoms ....................................................................................... 36
3.2. ULBP2-BB4 verursacht eine Reduktion der Tumorgröße von transplantierten primären KolonKarzinomen in der Nude- Maus.............................................................................................................................. 38
3.3.
Klonierung der PSMA positiven Immunoliganden..................................................................................... 39
1
3.4.
Expression..................................................................................................................................................... 40
3.5. Eine Linkerverkürzung oder das Einfügen eines Zipper-Peptids führen zu einer Oligomerisierung der
Immunoliganden ...................................................................................................................................................... 41
3.6.
Die Immunoliganden binden spezifisch an PSMA positive Tumorzellen.................................................. 42
3.7.
An die tumorzellgebundenen Immunoliganden kann gleichzeitig der NKG2D-Rezeptor binden ........... 45
3.8.
Die Immunoliganden binden spezifisch an NKG2D .................................................................................. 46
3.9. Oligomerisierte Immunoliganden aktivieren NK Zellen über den NKG2D Rezeptor.............................. 46
3.9.1. Oligomerisierende Immunoliganden induzieren die vermehrte Sekretion von IFNγ & TNFα ...... 47
3.9.2. Oligomerisierende Immunoliganden steigern die Zytotoxizität........................................................ 49
3.10. ULBP2-PSMA+2 verursacht eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums subkutaner LNCaPTumoren im SCID- Mausmodell des Prostata- Karzinoms .................................................................................. 51
4. Diskussion ......................................................................................................... 53
4.1. Immunoliganden können die Grenzen der NK- Zell basierten Immuntherapie von Karzinomen
überwinden ............................................................................................................................................................... 53
4.2. PSMA- spezifische Immunoliganden unterscheiden sich aufgrund ihres Oligomerisierungsgrades in
ihrer Fähigkeit, NK- Zellen zu aktivieren .............................................................................................................. 55
4.3. Bedeutung des ULBP2-PSMA+2 zur spezifischen immuntherapeutischen Behandlung von soliden
Tumoren am Beispiel des Prostata- Karzinoms .................................................................................................... 56
4.4.
Mögliche Rolle von Immunoliganden und NK- Zellen für die spezifische Immuntherapie ..................... 58
5. Zusammenfassung ............................................................................................ 60
6. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 62
7. Lebenslauf ......................................................................................................... 72
2
1. Einleitung
1.1. Interaktion des Immunsystems mit Tumoren
Nach fast einem Jahrhundert der Diskussion besteht nun ausreichend Evidenz darüber, dass
das Immunsystem eine wichtige Rolle bei der Überwachung von entarteten Zellen ausübt
[114] und Tumoren zum Angriffsziel hat [14, 126].
Eine Beteiligung des Immunsystems wurde erstens angenommen, als man feststellte, dass
sich Tumoren in immunkompetenten Menschen spontan zurückentwickelten und in
Immunsupprimierten eine erhöhte Inzidenz an Neoplasien vorlag. Zweitens kann TumorImmunität in Tierversuchen gezeigt werden. Mäuse, die bestimmte Immundefekte aufweisen,
entwickeln häufiger spontane und induzierte Tumore; werden diese Tumore wiederum in
gesunde Mäuse transplantiert, kommt es häufig zu einer Abstoßungsreaktion [39, 114].
Drittens erkennt das Immunsystem den Tumor, was sich in einer Anreicherung von
Lymphozyten im Tumorgewebe zeigt und mit einer verbesserten Prognose einhergeht [153].
Zuletzt kann unter Zuhilfenahme verbesserter Technologien eine anti- Tumor- Immunantwort
im Patienten direkt nachgewiesen werden.
Zellen der angeborenen Immunität, z.B. Natürliche Killer- (NK) Zellen und Makrophagen,
erkennen frühe Warnsignale einer Zelle, wie sie bei einer malignen Entartung entstehen. Eine
Entzündungsreaktion kann so induziert werden, die wiederum weitere zur Lyse fähige Zellen,
z.B. NK- Zellen aktiviert und antigenpräsentierende Zellen (APC), wie z.B. dendritische
Zellen (DC) stimuliert. Letztere prozessieren die tumorabhängigen Antigene, migrieren zu
den Lymphknoten und aktivieren B- und T- Zellen und geben damit den Impuls zur adaptiven
Immunantwort.
1.2. NK- Zellen
NK- Zellen spielen bei der primären Immunabwehr eine entscheidende Rolle. Sie können
anders als die T- Zellen, die zur Aktivierung prozessierte Antigenfragmente benötigen, ohne
vorherige Stimulation zur spezifischen Lyse von Virus- infizierten und neoplastischen Zellen
führen [62, 77].
NK- Zellen repräsentieren ca. 10% der Lymphozyten und kommen im lymphatischen- und
Blutgefäßsystem vor [43]. Die Mehrzahl zirkuliert als ruhende Zellen im Blut, um mögliche
Pathogene ausfindig zu machen. Nach einer Aktivierung mittels Zytokinen und Chemokinen
migrieren sie durch die Gefäßwand und können jegliches Gewebe infiltrieren, um an den
Wirkort zu gelangen [109].
3
Anhand von spezifischen Oberflächenantigenen werden NK- Zellen als CD3-CD56+
Lymphozyten
charakterisiert.
Eine
weitere
Unterteilung
ist
aufgrund
der
Antigenbeschaffenheit und Funktion anhand der Durchflussfotometrie in CD56bright und
CD56dim möglich. CD56bright NK- Zellen wirken über die Produktion von Zytokinen
immunregulatorisch, während CD56dim NK- Zellen als Effektorzellen der Zytotoxizität
dienen [26]. Letztere exprimieren darüber hinaus CD16, einen Fc-Rezeptor für IgG, und
können
mit
IgG opsonisierte Zellen
lysieren
(antikörperabhängige zellvermittelte
Zytotoxizität, ADCC).
Die immunregulatorischen CD56bright NK- Zellen brauchen keine direkte Aktivierung durch
MHC1 Moleküle [2]. Eine Stimulation durch IL2, IL12, CD16 Ligation oder eine TumorzellAntigen Erkennung führt zur Proliferation der NK-Effektorzellen, welche wiederum
Interferon (IFN) γ, Tumornekrose Faktor (TNF) α, Granulozyten-Makrophagen colony
stimulating factor (GM-CSF), IL5, IL10 und IL13 sezernieren. Zunächst werden die Zytokine
IL4 und IL13 produziert, die für die T-Helferzellen 2 (TH2) Antwort essentiell sind, während
sie mit fortschreitender Differenzierung ausschließlich IFNγ für eine TH1 Antwort zu
sezernieren beginnen [89]. NK- Zellen besitzen mehrere aktivierende Rezeptortypen. Die
wichtigsten sind die ‚natural cytotoxicity receptors’ (NCRs) NKp30, NKp44 und NKp46 der
Fc- Rezeptor für IgG und NKG2D [94, 118, 137].
IFNγ hat vielfältige Wirkmechanismen. Durch IFNγ werden MHC 1 und 2 Moleküle
hochreguliert. Es werden vermehrt Antigene präsentiert, die wiederum Leukozyten befähigen
Interaktionen mit dem Endothel einzugehen, Zellproliferation zu kontrollieren, Apoptose zu
induzieren, Phagozyten zu aktivieren und die Tumor Angiogenese zu unterdrücken. Bereits
verwendete ungerichtete Tumor- Immuntherapeutika wie IL12 oder α- Galactosylceramid (αGalCer) machen sich diese Effekte zu Nutzen, in dem sie die IFNγ Sekretion aus NK- Zellen
steigern
[60,
119,
151].
TNFα
hat
auch
eine
wichtige
Rolle
innerhalb
der
immunregulatorischen NK- Zell Funktion, indem es chemotaktisch auf NK- Zellen wirkt und
diese an Orten der Entzündung und in Tumoren anreichert [103, 121].
Zytotoxische NK- Zellen verfügen über zwei bisher bekannte Mechanismen Zielzellen zu
zerstören. Entweder durch Exozytose von zytotoxischen Vesikeln oder durch die Aktivierung
der sogenannten Todesrezeptoren.
Es werden drei entscheidende Mediatoren des Zelltodes in die für die Exozytose bestimmten
Vesikel verpackt: die Proteine Perforin, Granzym und Granulysin. Hervorzuheben ist
Granzym B, welches direkt oder durch Aktivierung von Kaspasen zur Apoptose der Zielzelle
führt. Perforine bilden Poren in der Zellmembran. Granulysine sind zytolytische Proteine, die
4
sich durch ihre positive Eigenladung zu negativ geladenen Tumor- oder virusinfizierten
Zellen orientieren [47, 123].
Angehörige der TNF Zytokin- Familie, (TNF)- related apoptosis- inducing ligand (TRAIL)
und Fas- Ligand (FasL), werden an der Oberfläche von NK- Zellen exprimiert. Sie bilden
Liganden für TRAIL- R1 und - R2 und Fas- Rezeptoren, die nach Bindung zur Aktivierung
von Kaspasen und folglich zur Apoptose der Zielzelle führen [32, 113]. Die Expression von
Liganden auf NK- Zellen, wie auch die der Rezeptoren auf den Zielzellen obliegt einer
Regulation durch IFNγ. Nur wenn IFNγ durch die NK- Zelle sezerniert wird, kommt es zur
Apoptose über den Todesrezeptor-Weg [29, 113, 122, 129].
Die Aktivierung von NK- Zellen wird über ein komplexes Zusammenspiel zwischen
aktivierenden und inhibierenden Signalen gesteuert, die über NK- Oberflächenrezeptoren
kontrolliert werden. Bekannt sind drei inhibierende Rezeptorfamilien: die „killer cell Ig-like
receptors“ (KIR) im Menschen, die „Ly49 lectin like receptors“ in Mäusen und die
„CD94/NKG2A lectin like receptors“
in Mensch und Maus [83, 152]. Diese
Rezeptorfamilien interagieren mit MHC1 oder MHC1- verwandten Molekülen, die auf allen
kernhaltigen Zellen des Organismus exprimiert werden. Außerdem führen sie über
gemeinsame intrazytoplasmatische Domänen, sog. Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory
motifs (ITIMs), die nach der Ligation phosphoriliert werden und ein inhibierendes Signal
weiterleiten, zu einer Blockade der Effektorfunktion der NK- Zellen.
Verliert eine Zelle, z.B. durch Mutation, die Fähigkeit MHC1 Antigene auf ihrer Oberfläche
zu präsentieren, werden NK- Zellen durch das fehlende inhibitorische Signal aktiviert und
führen zu einer Zerstörung dieser Zellen („Missing self“ - Hypothese).
Stimulierende Rezeptoren sind essenziell für die initiale Aktivierung von NK- Zellen.
Überwiegen aktivierende- gegenüber inhibitorischen Signalen, so verschiebt sich das
Gleichgewicht von der ruhenden Zelle zugunsten der aktivierten NK- Zelle. Eine reduzierte
Expression von MHC1 Molekülen ist folglich nicht notwendig, um die NK- Zellen zu
aktivieren. Über die Vermittlung von NK- Zell aktivierenden Signalen wird angenommen,
dass auch normal MHC1 exprimierende Virus- infizierte Zellen oder Tumorzellen zerstört
werden können.
Das dieser Arbeit zugrunde liegende Zielmolekül der NK-Zell Aktivierung ist der NKG2DRezeptor. In jüngster Zeit ist gezeigt worden, dass NKG2D entscheidend an der ImmunÜberwachung von Tumoren und deren Entstehung beteiligt ist [55]. Der NKG2D- Rezeptor
spielt darüber hinaus eine Schlüsselrolle in der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Er
wird nicht nur auf NK- Zellen sondern auch auf γδ+T- Zellen und CD8+ αβT- Zellen
5
exprimiert [73]. NKG2D wird durch die Liganden MHC- class I chain-related A (MICA) oder
–B MICB, die zur Gruppe der MHC1 Moleküle gehören, aktiviert. Gesunde Zellen
exprimieren diese Liganden nur selten. Auf Tumorzellen und Tumorzelllinien, als auch auf
einigen infizierten Zellen sind sie jedoch häufig hochreguliert [17, 52, 53, 101]. Ein zugrunde
liegender
Mechanismus
für
die
Hochregulation
in
präkanzerösen
Läsionen
und
fortgeschrittenen Tumoren ist der „DNA- damage response pathway“ [9, 48, 51]. NKG2DLiganden tragende Zellen aktivieren NK- Zellen in vitro und werden auch in vivo über den
NKG2D- vermittelten Mechanismus zerstört [17, 18, 35, 36].
Die Signalverarbeitung über den NKG2D- Rezeptor geschieht in der Maus über zwei
unterschiedliche Wege. Sie ist abhängig von zwei Splice- Varianten des NKG2D, der kurzen
Variante NKG2D-S und der langen Variante NKG2D-L, sowie zwei unterschiedlichen
Adapter- Proteinen, dem DAP10 und DAP12. Das NKG2D-L wird konstitutiv auf NK- Zellen
exprimiert und assoziiert mit dem DAP10; das NKG2D-S wird nur auf aktivierten NK- Zellen
exprimiert und assoziiert mit DAP10 oder DAP12 [37]. Der NKG2D-L-DAP10 Komplex
vermittelt ausschließlich Zytotoxizität, während der NKG2D-S-DAP10/12 Komplex hingegen
zusätzlich die Zytokin Produktion stimuliert [154].
Eine weitere wichtige Gruppe von NKG2D- Liganden sind die UL16- binding proteins
(ULBPs). ULBP1 wurde als Bindungspartner des humanen Cytomegalovirus (CMV)
Glykoprotein UL16 identifiziert [27]. Das ULBP2 und das ULBP3 weisen hohe Homologien
auf und wurden ebenfalls als Bindungspartner bestätigt. ULBPs besitzen die Fähigkeit
ruhende NK- Zellen über den NKG2D- Rezeptor zu aktivieren. Die Aktivierung ist vor allem
abhängig vom Verhältnis zwischen aktivierenden und inhibitorischen Rezeptoren auf der
Oberfläche von NK- Zellen. Alle ULBPs vermitteln Signale über den gleichen Signalweg.
Das ULBP bindet an den NKG2D/DAP10 Komplex und führt zur intrazellulären CalciumFreisetzung und Aktivierung der Phosphatidyl- Inositol 3 Kinase (PI3-K), die wiederum durch
weitere Phophorilierungen NK- Zellen im Hinblick auf Zytotoxizität und Zytokin- Produktion
aktiviert. Sezerniert werden u.a. IFNγ, TNFα oder GM-CSF, die chemotaktisch weitere NKZellen, Makrophagen und andere Zellen des Immunsystems aktivieren.
Die NK- Zell vermittelte Zerstörung von Tumorzellen wird durch ein Netz von Interaktionen
mit weiteren immunkompetenten Zellen, wie z.B. dendritischen Zellen (DC) und
zytotoxischen CD8+ T Zellen (CTL), CD4+ T- Helferzellen und vermutlich auch B-Zellen
ergänzt, die jedoch nicht Gegenstand dieser Arbeit sind.
6
1.3. NK- Zell basierte Immuntherapie
In den frühen 80iger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden klinische Studien mit IL2
aktivierten NK- Zellen zur Behandlung von soliden oder metastasierten Tumoren
durchgeführt [111]. IL2 ist ein Wachstumsfaktor für reife NK- und deren Vorläuferzellen und
induziert die Produktion von NK- Effektormolekülen, die sie zu einer verbesserten
Lysefunktion befähigt. Die subkutane Injektion von IL2 in therapeutischen Dosen oder die
Gabe von bereits aktivierten NK- Zellen (adoptiver Transfer lymphokin-aktivierter
Killerzellen- LAK) zeigte in 15-30% einen positiven Effekt bei Patienten mit
fortgeschrittenem Nierenzell- Karzinom (RCC) oder Melanom (MEL) [90]. Bedauerlicher
Weise kann
die
systemische IL2
Gabe
mit
einer
lebensbedrohlichen
Toxizität
vergesellschaftet sein, die sich in einem „Capillary-leak“- Syndrom äußert [42]. Ein weiterer
limitierender Faktor ist, dass IL2- aktivierte NK- Zellen bei Kontakt mit Gefäßendothel eine
erhöhte Sensitivität zur Apoptose aufweisen, was in einer verminderten Migration von NKZellen in Tumoren resultiert [110].
Aus diesen Erfahrungen versuchte man weitere Zytokin- Therapien zu entwickeln. IL15 trägt
zur Entwicklung der NK- Zellen in vivo bei [142]. Es hat eine Schlüsselrolle bei der
Differenzierung, Proliferation, Aktivierung und dem Überleben der NK- Zellen [34, 40].
Darüber hinaus wirkt IL15 synergistisch mit dem Flt3- Liganden, einem Stammzellfaktor, in
der Induktion von CD56bright NK- Zellen. Die systemische IL15 Therapie zeigte jedoch
ebenfalls eine hohe Toxizität, da man hohe Zytokindosen verabreichen musste, um einen
signifikanten anti- Tumor- Effekt zu beobachten. Derzeit wird eine Strategie angestrebt, bei
der IL15 zu NK- Zellen zugeführt wird, die den IL15Rα- Rezeptor exprimieren (TransPräsentation). Man vermutet, dass die biologische Aktivität des IL15 deutlich erhöht ist und
man auf niedrigere Dosen zurückgreifen kann [79]. Alternativ applizierte man den Flt3Liganden. Er induziert eine Proliferation von NK- Zellen und DCs, zeigte jedoch keine
Effektivität bei Tumorpatienten [115].
Auch die NK- Zell Stimulation durch IL12 resultierte in einer erhöhten IFNγ Produktion
durch NK- Zellen und sollte in der Immuntherapie genutzt werden. IFNγ supprimiert die
Tumor Angiogenese und induziert eine Hochregulation von Fas- und TRAIL-Rezeptoren auf
der Oberfläche von einer Vielzahl von Tumorzellen, was sie für eine verstärkte Apoptose
durch NK- Zellen empfindlich macht [22, 122]. Eine vermehrte Lebertoxizität stellte jedoch
einen limitierenden Faktor dar.
IFNγ induziert darüber hinaus die Typ I Immunität, die aktiv daran beteiligt ist, die EvasionsMechanismen der Tumoren zu verhindern. In diesem Sinne ist IL21 ein weiteres
7
vielversprechendes Zytokin. IL21 begünstigt die Expression von Typ I Immunitätsassoziierten Genen und treibt die terminale Differenzierung der hoch zytotoxischen
CD56dim/CD16+ NK- Zell Population voran. Diese sind in der Lage über die CD16- Fc
Ligation eine ADCC Antwort auf Tumorzellen auszulösen [12, 99, 125].
KIR- Rezeptoren scheinen auch einen Einfluss auf Tumoren zu haben, vor allem wenn die
Tumoren mit einer viralen Infektion vergesellschaftet sind, wie das Zervixkarzinom. Sie
gehen mit einer erhöhten Expression von KIR- Genotypen einher [16]. Eine Hemmung von
KIR stellt einen Punkt intensiver Forschung dar [130].
Der Einsatz von tumorspezifischen monoklonalen Antikörpern (mAb) bietet eine weitere
Möglichkeit NK- abhängige ADCC gegen Tumorzellen auszulösen [15, 23]. Diese
immuntherapeutische Strategie wird in der Folge näher erläutert.
1.4. Monoklonale Antikörpertherapie
Vor einem Jahrhundert stellte Paul Ehrlich die Hypothese auf, dass zukünftig „magic bullets“
zur spezifischen Addressierung von Krankheiten erfunden würden. Diese Vision wurde mit
der Entwicklung der Hybridom- Technologie durch Kohler und Milstein zur Realität [80].
Erstmalig konnten monoklonale Antikörper (mAb) hergestellt werden, die eine spezifische
Bindung mit ihrem Antigen eingingen. Der klinische Einsatz der ersten Generation mAb war
jedoch durch ihren murinen Ursprung limitiert. Es kam zu einer humanen anti- MausAntikörper Bildung (HAMA) bei gleichzeitig nur eingeschränkter Rekrutierung von
Immuneffektor- Reaktionen [3, 76]. Dieses Hindernis wurde durch die Generierung von
chimeren und humanisierten mAb überwunden. Diese Generation der mAb besitzt ein
humanes IgG als Grundgerüst (Backbone). Ihre Zielspezifität wird entweder durch den
Austausch muriner variabler Regionen (chimere Ab), oder durch das schrittweise
Austauschen einzelner Aminosäuren hin bis zu gesamten Leicht- oder schweren Ketten
(Humanisierung) beibehalten. Humanisierte Antikörper sind den humanen Antikörpern
ähnlicher als den Chimären.
1.4.1. Mechanismen der Vermittlung von Effektorfunktionen durch
mAb- „Enhancing effector functions“
Heutzutage finden therapeutische mAb Einsatz in vielen Bereichen der Medizin, wie der
Rheumatologie, Kardiologie, Diagnostik und Tumortherapie. Der Schwerpunkt dieser Arbeit
liegt in der Tumortherapie, weshalb auf die anderen Gebiete nicht eingegangen wird. Die
8
meisten mAb, speziell die Isotypen IgG1 und IgG3, unterstützen zum einen die Komplement
vermittelte Zytotoxizität (CDC) und zu anderem die ADCC. Die ADCC wird durch die
Interaktion der Fc- Region des Antikörpers mit
dem Fcγ- Rezeptor von Neutrophilen,
Makrophagen und NK- Zellen ausgelöst. Die CDC hingegen wird durch den
Komplementfaktor C1q initiiert, welcher simultan an die Fc- Region des IgG und an eine
Tumorzelle bindet. Die Wichtigkeit der Fc- Fcγ- Rezeptor- Interaktion bei der Anti- TumorWirkung wurde bei den klinisch wichtigen Antikörpern Herceptin© und Rituxan© gezeigt
[23]. In FcγRI und FcγRIII defizienten Mäusen war der Anti- Tumor- Effekt durch Herceptin©
und Rituxan© deutlich eingeschränkt. Eine Mutation im kodierenden Gen für den
inhibierenden Rezeptor FcγRIIB verstärkte die Anti- Tumor- Wirkung.
1.4.2. „Direct arming“
Die am weitesten verbreitete Strategie zur Verbesserung einer Anti- Tumor- Wirkung von
Antikörpern ist die direkte Kopplung mit einer Effektordomäne, z.B. einem Toxin oder
Radionuklid [41]. In klinischen Studien zeigten solche Immunkonjugate jedoch häufig eine
inakzeptable Toxizität. Erst kürzlich erlebten diese Antikörper mit der Genehmigung von
zwei
Radioimmunokonjugaten,
dem
Ibritumomab
Tiuxetan
(Zevalin®)
und
dem
Tositumomab (Bexxar®) und einem Toxinkonjugat, dem Gemtuzumab Ozogamicin
(Myelotarg®) eine Renaissance [148].
Small molecule Toxin- Konjugate
Antikörper können mit konventionellen Chemotherapeutika, wie z.B. Doxorubicin, konjugiert
werden [133]. Toxin- Konjugate führten aber durch eine insuffiziente Anreicherung des
Antikörpers im Tumor, verbunden mit einer niedrigen Toxizität des Chemotherapeutikums,
zu mehr unerwünschten Wirkungen als positiven Effekten [132]. Man entwickelte „small
molecule“- Toxine, die eine bis zu 1000 fache Potenz gegenüber herkömmlichen
Chemotherapeutika aufwiesen. Zu diesen gehören Calicheamizine und Maytansinoide [63,
116].
Immuntoxine
Die meisten Immuntoxin- Antikörper sind entweder mit einem Pflanzentoxin wie dem RicinA oder mit Pseudomonas Toxin konjugiert. Es gibt einige wenige Beispiele mit einer
erfolgreichen Anti- Tumor- Wirkung bei Patienten [81, 98]. Häufig kommt es zu toxischen
Nebenwirkungen wie dem „Vascular- leak“- Syndrom.
9
Radioimmunkonjugate
Radioimmunkonjugate sind Antikörper, die mit β- Strahlen emittierenden Molekülen (z.B.
131Iod, 90 Yttrium) fusioniert werden. Ihre emittierte Strahlung befähigt sie alle Zellen des
direkten Umfeldes zu zerstören. Vieler dieser Radionuklide emittieren zusätzlich γ- Strahlung,
welche über eine größere Distanz wirkt, und eignen sich dadurch auch zu bildgebenden
Verfahren und Radionuklid-Uptake Quantifizierungen [74]. Die Vorteile der zytotoxischen
Strahlung, die über mehrere Zelldurchmesser effektiv wirkt, sind zu einem, dass direkt
benachbarte Tumorzellen abgetötet werden, und zu anderem, dass schlecht vaskularisierte und
größere Tumoren effektiver behandelt werden können [31]. Die vielversprechendste
Indikation zur Therapie sind diffus wachsende oder kleine Tumoren. Das bereits oben
erwähnte Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin©) und Tositumomab/131I-Tositumomab (Bexxar©)
sind die einzigen zugelassenen Radioimmuntherapeutika.
Immunzytokine
Eine Alternative zu Radioimmunkonjugaten, Immuntoxinen und systemischer Zytokingabe ist
die Fusionierung von mAb mit Zytokinen. Man erhofft sich eine hohe lokale Anreicherung
der Immunzytokine im Tumor, die dann eine Immunantwort auslösen, verbunden mit einer
geringen systemischen Toxizität. Ein mAb fusioniert mit IL2, der im Mausmodell einen
Effekt zeigte, zerstört Tumormetastasen durch eine Expansion von Immuneffektor- Zellen
[87, 88].
1.4.3. „Pre-targeting“
Antikörper abhängige Enzymvermittelte Prodrug Therapie (ADEPT) benutzt mAb um ein
Enzym spezifisch an den Tumor zu dirigieren. Dieses katalysiert die Reaktion eines
systemisch applizierten Prodrugs zu seiner aktiven Form und resultiert in einer hohen
Konzentration des aktiven Metaboliten am Tumor. In einer Phase I Studie konnte keine
Tumorregression gezeigt werden, man konnte aber feststellen, dass es zu einer nur geringen
allgemeinen Myelotoxizität kam [45].
1.4.4. „Indirect arming“
Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper (BsAb) sind rekombinante Konstrukte, die an zwei unterschiedliche
Epitope auf unterschiedlichen Antigenen binden. BsAb können Immuneffektorzellen zu
Tumorzellen dirigieren. Sie binden gleichzeitig an Tumor- assoziierte Antigene und
stimulierende Rezeptoren von Immuneffektorzellen und bewirken durch die Aktivierung der
10
Immuneffektorzellen die Lyse der Tumorzellen. Der wesentliche Unterschied zwischen dem
Gebrauch von mAb und BsAb besteht nicht in der Verbesserung der natürlich existierenden
Anti- Tumor- Immunantwort, sondern in einer Re- Direktion von Immunzellen zu Tumoren,
die sich der Immunüberwachung entzogen haben.
CD3 auf T- Zellen, Fcγ- RI (CD64) auf Granulozyten und Monozyten, Fcγ- RIII (CD16) auf
NK- Zellen und Fcα- RI (CD89) auf Makrophagen sind die häufigsten adressierten Antigene
auf Immuneffektorzellen [135]. Initial wurden BsAb durch die Hybridisierung von zwei
Antikörper- produzierenden Zellen, oder durch crosslinking von zwei unterschiedlichen mAbs
generiert. Bispezifische Antikörpermoleküle zeigten allerdings häufig eine geringe
Wirksamkeit bei gleichzeitig schwerer unerwünschter Arzneimittelwirkung [127]. Der FcTeil, der im IgG Molekül für eine Halbwertszeit im Serum von ca. 10 Tagen sorgt, vermittelte
durch das massive Aktivieren der Effektorzellen das Zytokin- Sturm- Syndrom [127].
In den letzten Jahren wurden unterschiedliche Formate von BsAb entwickelt, die die
Probleme der klassischen mAb umgehen sollen. Das am häufigsten benutze Format sind
Diabodies, Abkömmlinge von zwei ScFv Fragmenten. ScFv- Antikörper wurden unabhängig
voneinander von Huston [68] und Bird [10] beschrieben. Sie bestehen aus den variablen
Domänen der schweren und leichten Ketten sowie einem Peptidlinker. Der Peptidlinker
verbindet dabei in der Regel den Carboxyterminus von VH mit dem Aminoterminus von VL.
Das Linkerpeptid besteht meist aus repetitiven Glyzin- und Serinresten der Folge (Gly4Ser)x.
Diese Struktur ermöglicht hinreichende Beweglichkeit und Löslichkeit, um die Assoziation
der variablen Domänen nicht zu behindern. ScFv sind kleine Moleküle (~28kD), die eine
zuverlässige Antigenerkennung gewährleisten [65]. Da es durch die Monovalenz der ScFv zu
einem Affinitätsverlust kommt, liegt es nahe, bivalente Konstrukte zu generieren, um durch
die erhöhte Avidität die Bindungseigenschaften zu verbessern. Der bispezifsche Antikörper
Blinatumomab stellt ein gutes Beispiel hierfür dar. Über die duale Spezifität für CD19 und
CD3 aktiviert Blinatumomab zytotoxische T-Zellen, um Tumorzellen zu lysieren. In einer
interdisziplinären Phase I/II Studie bei der Behandlung des therapierefraktären B- Zell NonHodgkin Lymphom erreichten vier von 38 Patienten eine komplette- und weitere sieben
Patienten eine partielle Remission [7].
11
1.5. Bispezifische
Fusionsproteine
aus
einzelsträngigen
Antikörperfragmenten (ScFv) und aktivierenden Liganden von
Immuneffektorzellen- „Immunoliganden“
Die in dieser Arbeit eingesetzten bispezifischen Konstrukte bestehen aus einem ScFv, das ein
Zell- spezifisches Antigen auf soliden Tumoren bindet, verknüpft mit einem aktivierenden
Liganden des NK- Rezeptors NKG2D, dem ULBP2 – genannt „Immunoliganden“. Die
Wirksamkeit eines Immunoliganden wurde bereits mit dem ULBP2-BB4 gegen einen
hämatologischen Tumor gezeigt [138]. BB4 ist der Bindungspartner von CD138, das unter
anderem auf Multiplen Myelom Zellen überexprimiert wird [147]. ULBP2-BB4 induziert die
IFNγ Sekretion von NK- Zellen und bewirkt eine Lyse der Multiplen Myelom Zelllinie
RPMI-8226 in vitro und in vivo [138]. Die Immunoliganden haben eine Molekülmasse von
~65 kD, vergleichbar mit Diabodies aus zwei ScFv- Fragmenten. Über Diabodies weiss man,
dass sie gegenüber einzelnen ScFv- Fragmenten eine verbesserte Pharmakokinetik besitzen.
Ihre Größe bedingt eine verminderte Clearance durch die Nieren und ihre höhere Avidität
eine wesentlich bessere Retention und Anreicherung im Tumor [1]. Noch größere Moleküle
zeigen aufgrund der längeren Serumhalbwertszeit eine noch höhere absolute Anreicherung im
Tumor, mit einem jedoch geringeren Tumor- Blut- Verhältnis [131]. Kleine Moleküle haben
aufgrund des erhöhten interstitiellen Druckes in soliden Tumoren und der heterogenen
Blutgefäßpermeabilität Vorteile bei der Penetration in solide Tumoren [72]. Sie sind
außerdem weniger immunogen. Röntgenkristallographisch ist gezeigt worden, dass die
unterschiedlichen Bindungsstellen der Diabodies an entgegengesetzten Enden liegen, und
dass der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen ausreicht, um zwei Zellen miteinander
zu verbinden [102]. Offner et al. zeigten mittels Konfokal- Mikroskopie am Beispiel des
EpCAMxCD3- Diabodys, dass eine sekretorische Synapse zwischen CD8+ Lymphozyten und
Tumorzellen induziert werden konnte, die morphologisch von der physiologischen Synapse
nicht zu unterscheiden war [96].
Ziel dieser Arbeit ist es einen tumorspezifischen Immunoliganden zu entwickeln, der in der
Behandlung von soliden Tumoren angewandt werden kann. PSMA stellt ein für das ProstataKarzinom spezifisches Tumorantigen dar und eignet sich als Zielantigen für eine NK- Zell
basierte Immuntherapie.
12
1.6. PSMA
auf
Prostata-
Tumorzellen
als
potentielles
Ziel
einer
Immuntherapie mit rekombinanten NK- Rezeptorliganden
Das Prostata- Karzinom ist eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Mannes. Allein
in Deutschland werden pro Jahr ca. 50 000 Neuerkrankungen und 10 000 Todesfälle
registriert, womit es in der Todesursachenstatistik des Mannes auf Platz zwei rangiert, hinter
den Herz- Kreislauf Erkrankungen. Die Inzidenz ist stark altersabhängig. Das Risiko eines
50jährigen Mannes, zu Lebzeiten ein Prostata- Karzinom zu entwickeln, liegt bei ca. 40%.
Wird die Erkrankung in einem organbegrenzten Stadium (T1/T2 nach TNM Klassifikation)
diagnostiziert, kann der Tumor durch radikale chirurgische Resektion oder Strahlentherapie
behandelt werden. Es wird ein 5- Jahres- Überleben von über 90% erreicht. Da das ProstataKarzinom im Anfangsstadium oft symptomlos bleibt, werden bei einem Großteil der
Patienten bei Diagnosestellung bereits ein Tumor >T2 oder gar Metastasen festgestellt. Für
dieses Patientenkollektiv und diejenigen, die nach Therapie ein Rezidiv erleiden, gibt es nur
noch palliative Methoden der Behandlung. Sie erhalten eine intermittierende Hormontherapie,
an die sich bei Versagen eine Chemotherapie anschließt. Die mittlere Überlebenszeit beträgt
3-4 Jahre. Die Notwendigkeit neuer Therapiestrategien resultiert aus den sehr eingeschränkten
Therapiemöglichkeiten für diese Patientengruppe.
Die Immunoliganden sollen über ihre ULBP2- Bindungsstelle NK- Zellen aktivieren und
über ihre zweite Bindungsstelle spezifisch an Prostata- Tumorzellen binden und deren Zelltod
induzieren. Tumorspezifische Antigene zeichnen sich durch ihr Vorhandensein allein auf
entarteten Zellen aus und eignen sich hervorragend als Zielantigene. Für die vorliegende
Arbeit ist das prostataspezifische Membran- Antigen (PSMA) als Zielantigen ausgewählt
worden, da sich dieses als besonders geeignet für einen immuntherapeutischen Ansatz
erwiesen hat [33, 143].
PSMA ist ein integrales Typ II Membranprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 100
kD mit einem zytosolischen Anteil von 19 Aminosäuren, einem Membrananteil von 24
Aminosäuren und einem extrazellulären Anteil von 707 Aminosäuren [71]. Der extrazelluläre
Anteil ist stark glykosyliert, so dass der Oligodaccharidanteil 20% des Molekulargewichts
ausmacht [67]. Alle zehn Glykosylierungsstellen sind N- glykosidisch mit Oligosacchariden
verknüpft [8]. Welche Rolle die Glykosylierung für die Faltung des Proteins, den
subzellulären Transport und die Enzymfunktion besitzt, ist allerdings noch nicht vollständig
geklärt. Die Expression von PSMA erfolgt in allen Stadien des Prostata- Karzinoms und ist
besonders hoch in fortgeschrittenen, hormonrefraktären Tumoren und Metastasen [128, 134,
149], was für eine gezielte Therapie ausgenutzt werden kann. Vorteilhaft ist auch, dass es als
13
Membranantigen nicht sezerniert wird [50, 75]. Darüber hinaus findet sich PSMA in größerer
Dichte in neu gebildeten Gefäßen von zahlreichen malignen Tumoren wie z.B. von Niere,
Darm, Pankreas und Mamma, wodurch sich dessen Nutzung auch in der Anti- AngiogeneseTherapie anbietet [21, 117].
1.7. Oligomerisierung durch Linkerverkürzung
Eine Linkerverkürzung des beschriebenen Glyzin- Serin- Linkers innerhalb eines ScFv hat
eine Oligomerisierung zur Folge [38, 66, 69, 100, 106]. Das oben beschriebene ULBP2-BB4
Konstrukt verfügt über eine solche Mutation im ScFv- Linker, die zu einer Oligomerisierung
des Immunoliganden führte. Diese kann die therapeutische Effektivität beeinflussen.
1.8. Fragestellung
Das Konzept eines tumorspezifischen Immunoliganden, das in der Behandlung von soliden
Tumoren angewandt werden kann, soll validiert werden, indem im ersten Teil dieser Arbeit
herausgefunden werden soll, ob ein bereits etablierter Immunoligand, ULBP2-BB4, dessen
Wirksamkeit bereits in der Therapie von hämatologischen Erkrankungen gezeigt wurde, seine
Wirkung auch an soliden Tumoren entfalten kann. Dazu werden zwei unterschiedliche
Tierversuche am Nacktmausmodell mit subkutan wachsenden Kolon- Karzinomen, die
CD138 auf ihrer Oberfläche exprimieren, durchgeführt.
Im nächsten Schritt sollen für das Prostata- Karzinom tumorspezifische Immunoliganden mit
unterschiedlich langen Linkerpeptiden konstruiert, in 293T- Zellen exprimiert und
aufgereinigt werden, um den Einfluss einer Linkerverkürzung auf die Immunoliganden
festzustellen. Es soll validiert werden, dass eine Verkürzung des ScFv-Linkers zu einer
Oligomerisierung des gesamten Immunoliganden führt. Hierzu wurden drei Immunoliganden
mit unterschiedlich langen Peptid- Linkern generiert. Zusätzlich wurde ein Immunoligand mit
einem Isoleuzin- Zipper- Linker generiert, da auch dieser zu einer Oligomerisierung führen
kann [58, 59]. Es soll der Einfluß der Oligomerisierung auf die therapeutische Effektivität der
Immunoliganden charakterisiert werden. Speziell werden die Immunoliganden im Hinblick
auf ihre Fähigkeit, NK- Zellen über ihren NKG2D- Rezeptor in vitro zu aktivieren und eine
spezifische Lyse zu induzieren, untersucht.
Zur Klärung der klinischen Relevanz der in vitro Untersuchungen der PSMAImmunoliganden soll ein Tierversuch am SCID- Mausmodell des Prostata- Karzinoms
durchgeführt werden, um die Effektivität der Konstrukte in vivo zu prüfen.
14
Fragestellung im Einzelnen:
1. Entfalten NK- Zellen vermittelt durch den Immunoliganden ULBP2-BB4 gegen einen
soliden Tumor einen Effekt?
2. Gelingt die Expression der in ihrer Linkerbeschaffenheit unterschiedlichen PSMAImmunoliganden in 293T Zellen, die Aufreinigung und der Nachweis ihrer
Bindungsfähigkeit an PSMA positive Tumorzelllinien mit gleichzeitiger Bindung an
NK- Zellen?
3. Bewirkt eine Linkerverkürzung in den Immunoliganden eine Oligomerisierung und ist
diese notwendig in der Aktivierung von NK- Zellen in vitro?
4. Sind PSMA- spezifische Immunoliganden gemeinsam mit NK- Zellen dazu in der
Lage, das Wachstum subkutaner LNCaP- Prostata- Tumoren zu beeinflussen?
15
2. Materialien und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Reagenzien
Blotpuffer
3,55
g/l
in
Blot- Waschpuffer
Na2HPO4
H2O
0,1
%
Tween 20
0,1
%
BSA
in
PBS
ELISA-
10
%
Assay Diluent
in
ELISA-
8,4
g/l
NaHCO3
Coating Puffer
3,56
g/l
Na2CO3
PBS, pH 7
in
ELISA-
FCS
H2O, pH 9,5
2
N
H2SO4
ELISA-
0,05
%
Tween- 20
Waschpuffer
in
Elutionspuffer
50
mM
NaH2PO4
300
mM
NaCl
250
mM
Imidazol
Stop Solution
PBS
in
Gold- Waschpuffer
0,3
H2O, pH 8,0
%
in
Inkubationspuffer 4x
PBS
200
mM
NaH2PO4
1,2
M
NaCl
20
mM
Imidazol
in
Labelling Puffer
Tween- 20
H2O, pH 8,0
50
mM
Hepes
93
mM
NaCl
5
mM
KCl
2
mM
MgCl2, pH 7,4; steril
10:1 verdünnen in
2
DTPA
mM
Europium Chlorid
16
MACS- Puffer
0,5
%
BSA
2
mM
EDTA
in
Natriumazid-Puffer
PBS
0,1
%
Natriumazid
0,2
%
BSA
in
PBS
Natriumhydrogen-
0,5
M
Carbonat-Puffer
in
PBS
0,14
M
NaCl
2,7
mM
KCl
8,1
mM
Na2HPO4
1,5
mM
KH2PO4, pH 7,4
H2O
in
SDS-PAGE-
625
NaHCO3, pH 9,5
H2O
µl
Sammelgel
Sammelgelpuffer
(0,5M Tris HCl,
pH 6,8)
315
µl
Acrylamidlösung
1,5
ml
H2O
25
µl
SDS- Lösung
(10% in H2O)
25
µl
APS- Lösung
(10% in H2O)
SDS-PAGE-
2,5
µl
TEMED
1,25
ml
Trenngelpuffer
Trenngel (10%)
(1,5 M Tris HCl,
pH 8,8)
1,24
ml
Acrylamidlösung
2,4
ml
H2O
50
µl
SDS- Lösung
(10% in H2O)
50
µl
APS- Lösung
(10% in H2O)
5
µl
TEMED
17
Tesca Puffer
50
mM
TES
0,36
mg
CaCl
in
H2O, pH 7,4 bei
37°C
Waschpuffer
50
mM
NaH2PO4
300
mM
NaCl
10
mM
Imidazol
in
H2O, pH 8,0
2.1.2. Chemikalien und Materialien
40% Acrylamid/Bisacrylamid Solution,
Bio-Rad Laboratories GmbH
29:1 (3,3%)
Amphotericin B
Bristol-Myers Squibb
APS (Ammoniumpersulfat)
Carl Roth GmbH & Co
BioSafe Comassie G250 Stain Färbelösung
Bio-Rad Laboratories GmbH
BSA (bovines Serum- Albumin)
Sigma Aldrich Chemie GmbH
Colloidal Gold Total Protein Stain
Bio-Rad Laboratories GmbH
Cyprofloxacin
Bayer AG
DTPA (Fluka 32318)
Sigma Aldrich Chemie GmbH
ECL- Western blotting detection reagent
Amersham Biosciences UK limited
Enhancement Solution
Perkin Elmer
Europium Chlorid (Fluka 46130)
Honeywell Riedel-de Häen
FACS- Flow
Becton-Dickinson
FCS (fetal calf serum, fetales Kälberserum)
PAA Laboratories GmbH
Ficoll Isopaque Lösung
Amersham Biosciences UK limited
Gel- Filtration Standard
Bio-Rad Laboratories GmbH
Hyaluronidase
Sigma Aldrich Chemie GmbH
Hydrokortison
Panpharma
Insulin
Sigma Aldrich Chemie GmbH
Kollagenase I
Sigma Aldrich Chemie GmbH
LipofectAmine2000
Invitrogen Corporation
Matrigel
BD Biosciences
Ni- NTA- Superflow
Qiagen
18
NK Cell Isolation Kit II
Miltenyi Biotec
Roti- Block- Lösung
Carl Roth GmbH & Co
Opti-MemI
Invitrogen Corporation
Refobacin
Merck Pharma GMBH
Rekombinantes humanes IFN
BD Biosciences
Rekombinantes humanes TNF
BD Biosciences
RPMI 1640- Medium
PAA Laboratories GmbH
SDS
Merck KGaA
SDS-PAGE Protein Standard
Bio-Rad Laboratories GmbH
SDS-PAGE-Puffer
Bio-Rad Laboratories GmbH
Sodiumselenit
Sigma Aldrich Chemie GmbH
Substrate Solution
BD Biosciences
TEMED
Sigma- Aldrich Chemie GmbH
Transferrin
Sigma Aldrich Chemie GmbH
Tris HCl
Sigma- Aldrich Chemie GmbH
Triton X-100
Sigma- Aldrich Chemie GmbH
Trypanblau- Lösung
Sigma- Aldrich Chemie GmbH
Tween- 20
Bio- Rad Laboratories GmbH
Vancomycin
Ratiopharm GmbH
2.1.3. Zelllinien und Mäuse
MCF7
Humane Mamma Adenokarzinom- Zelllinie, stabil mit PSMA
transfiziert
LNCaP
Humane Prostatakarzinom- Zelllinie, PSMA positiv
LS174T
Humane kolorektale Adenokarzinom- Zelllinie
NK- Zellen MACS
aus Patientenblut isoliert
PC3
Humane Prostatakarzinom- Zelllinie, PSMA negativ
293T / HEK 293
Humane embryonale Nierenkarzinom- Zelllinie
SCID
Charles & River Laboratories
NUDE
Charles & River Laboratories
19
2.1.4. Geräte
Brutschränke
Heraeus
Cellstrainer
BD Biosciences
FACS- Cytofluorometer FACSCalibur
Becton-Dickinson
FACS- Röhrchen
Becton-Dickinson
GelAirDryer
Bio-Rad Laboratories GmbH
Easyjet Pulsgerät
Peqlab
ELISA Reader
Molecular Devices
Elektrophorese- und Blotapparatur
Bio-Rad Laboratories GmbH
Europium Reader: 1232 Delfia Fluorometer
Pharmacia
Küvetten 300 µl
Amaxa Biosystems
Leukosep Röhrchen
Greiner bio-one GmbH
Magnetic Cell Sorter
Miltenyi Biotec
Mikroskop
Zeiss
Pipetten verschieden Volumens
Eppendorf
Spritzen- Filter 45 µm, 25mm Durchmesser
Sartorius Stedim Biotech S.A.
Tischzentrifuge
Eppendorf
VarioMACS
Miltenyi Biotec
Zellkulturflaschen
Life Technologies GmbH
Zellulose- Membran 30.000 MWCO
Sartorius Stedim Biotech S.A.
Zentrifuge
Heraeus
Zentrifugen- Röhrchen (50ml)
Labcon
24- Loch- Kulturplatte
Life Technologies GmbH
96- Loch- Mikrotiter- Platte
Life Technologies GmbH
2.1.5. Antikörper
Anti-CD16 mAb
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland
Anti-CD56 mAb
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland
Anti-NKG2D mAb
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland
Anti-CD138 mAb
Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland
Anti-NKG2D Ig FITC
Clone 1D11, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland
Anti-Penta-His mAb
Qiagen, Hilden, Deutschland
20
Anti-CD3 mAb
BD Biosciences
Goat-anti mouse Ig FITC BD Biosciences
IL2R-Fc
BD Biosciences
ULBP2-PSMA+15
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
ULBP2-PSMA+5
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
ULBP2-PSMA+2
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
ULBP2-IleZip-
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
PSMA+15
ULBP2-BB4
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
BB4-scfv
Labor für Immuntherapie, Uniklinik zu Köln
Anti- human IFN
BD Biosciences
Anti- human TNF
BD Biosciences
Streptavidin- horseradish BD Biosciences
peroxidase conjugate
2.1.6. Software
Graph Pad Prism 5
Graph Pad, USA
Excel (Office 2003)
Microsoft, USA
21
2.2. Methoden
2.2.1. Zellkulturen
Die Zielzellen wurden bei 37°C, einem CO2- Gehalt von 5% und einer relativen
Luftfeuchtigkeit von 100% in mit 10% FCS angereichertem RPMI-1640 Medium kultiviert.
NK- Zellen erhielten zusätzlich 10U/ml rekombinantes humanes IL2. Mindestens dreimal pro
Woche wurden die Zellen in neues Medium überführt, bei zu dichtem Wachstum ausgedünnt.
Im Vorfeld von Versuchen wurde versucht, die Zellen in einer immer ähnlichen, nicht zu
großen Dichte zu halten. Zur Vitalitätskontrolle wurde die Trypanblau- Methode angewendet.
Hierbei wurden 10 µl der Zellsuspension in 10 µl Trypanblau gemischt und anschließend die
lebenden Zellen unter dem Mikroskop in einer Neubauer- Zählkammer ausgezählt. Dabei
wurde die Anzahl der Zellen in zwei schräg gegenüber liegenden Quadraten addiert und die
Summe mit 104 multipliziert, um die Zellzahl pro Milliliter zu erhalten.
2.2.2. Herstellung der Expressionsplasmide ULBP2-PSMAx
Die Klonierung von ULBP2 wurde bereits vorher beschrieben [138]. Die Klonierung der
Expressionsplasmide ist nicht Bestandteil dieser Arbeit, wird aber vollständigkeitshalber
aufgeführt. Das anti- PSMA ScFv wurde von einer Maus Hybrid-Myelom-Zelle, die den antiPSMA mAb produziert, hergeleitet (G. Fracasso, Abteilung für Pathologie, Universität zu
Verona, Italien). Die ScFv VH und VL Region wurde individuell mit Hilfe der Polymerase
Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und mittels „splicing-by-overlap-extension“ PCR ligiert.
Der Standard 15mer (Glyzin4-Serin)3- Linker wurde entweder durch einen 5mer (Glyzin4Serin)- Linker oder einen kurzen 2mer Glyzin-Serin- Linker ersetzt. Die Restrikton des
gesamten ScFv erfolgte mit SfiI und NotI und das Produkt wurde in die entsprechende
Lokalisation des ULBP-pMS Expressionsvektors kloniert [108, 124]. Die resultierenden
rekombinanten Konstrukte pMS-ULBP2-PSMA+15, pMS-ULBP2-PSMA+5 und pMSULBP2-PSMA+2 enthalten das humane Ig kappa Leichtketten Signalpeptid am 5’ Ende und
ein 6xHis-tag Epitop am 3’ Ende des anti- PSMA ScFv. Für die Generierung des ULBP2Isoleuzin-Zipper-PSMA+15
(ULBP2-IleZip-PSMA+15)
Konstruktes
wurde
das
32
Aminosäuren große Isoleuzin mittels „splicing-by-overlap-extension“ PCR amplifiziert [58,
59]. Folgende Primerpaare wurden benutzt:
(IleZip-fwd:
5’-
atgaaaggtattgaggacaagATCGAGGAAATACTCTCCAAGATATATCATATTGAG-3’,
IleZip-rev:
5’22
cgttccccgatcagcttcTTAATTCGAGCAATCTCGTTCTCAATATGATATATC-3’).
Das Zipperpeptid wurde nach einem Restriktionsverdau downstream des ULBP2 und
upstream
des
gesamten
PSMA-
ScFv
in
einem
zweistufigen
Ligations-
and
Amplifizierungsprozess eingefügt und anschließend zu dem ULBP2-IleZip-PSMA+15
kloniert, wie oben beschrieben.
2.2.3. Transfektion von 293T- Zellen mit den Plasmiden ULBP2PSMAx, ULBP2-BB4 und BB4
293T- Zellen wurden mit 6 verschiedenen Konstrukten transfiziert:
-
ULBP2-PSMA+15
-
ULBP2-PSMA+5
-
ULBP2-PSMA+2
-
ULBP2-IleZip-PSMA+15
-
ULBP2-BB4
-
BB4
Methode:
1.
2x105 Zellen/ Loch in einer 24-well Platte aussähen und über Nacht
kultivieren. Vor der Transfektion sollen die adhärenten Zellen zu 90-95 %
konfluieren.
2.
DNA (0,8 µg/ 50 µl OptiMemI) und Lipofectamine (2 µl/ 48 µl OptiMemI)
getrennt für 5 min inkubieren.
3.
DNA- und Lipofectamine- Lösung vermengen und 30 min inkubieren.
4.
400 µl OptiMemI zu den Zellen vorlegen und das DNA- Lipofectamine
Gemisch zugeben und bei 37°C für 24-48 h inkubieren.
5.
Nach 24-48 h Kontrolle der Transfektion unter dem Fluoreszenzmikroskop
anhand des pCS-CMV-GFP im pc3.1 Ansatz.
2.2.4. Protein Konzentrierung
Die Konzentrierung der Immunoliganden im Zellüberstand erfolgte durch Einengung über
eine regenerierte Zellulose- Membran.
Methode:
1.
Zellüberstand zwei Minuten mit 2000 U/min zentrifugieren.
2.
Überstand mit 45 µm Filter filtrieren.
23
3.
30.000 MWCO Zellulose- Membran zuerst mit H2O, dann mit PBS spülen; je
15 Minuten.
4.
Die Anlage bei 2-4 bar N2 laufen lassen. Die Membran darf dabei nicht trocken
laufen.
5.
Zellüberstand bis auf 3-4% des Ausgangsvolumens einengen.
2.2.5. Protein Aufreinigung
Die
Proteinaufreinigung
basierte
auf
der
Immobilisierten-
Metall-
Affinitäts-
Chromatographie (IMAC). Die Methode nutzt die ladungsbedingte Affinität von HistidinClustern (His-Tag) in Proteinen zu Ni2+- Ionen [105]. Mittels Ni-NTA Superflow- Beads
können die Immunoliganden durch ihr His-Tag an immobilisierte Ni2+- Ionen gebunden
werden [30]. Die Elution der Proteine erfolgt mit Imidazol, das mit Histidin um die
Bindungsstellen kompetiert.
Methode:
1.
300 µl Ni- NTA- Superflow wird zwei Mal mit 1 ml PBS gewaschen und 1
Minute bei 2000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
2.
Zum eingeengten Zellüberstand wird 4-fach Inkubationspuffer (1/4 der
Gesamtmenge) und der Ni- NTA Superflow dazugegeben und drei Stunden
bei 4°C unter Rühren inkubiert.
3.
Der Zellüberstand wird fünf Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert, der
Überstand verworfen.
4.
Die Beads werden drei Mal mit Waschpuffer gewaschen, fünf Minuten bei
2000 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
5.
Zu den Beads werden 500 µl Eluationspuffer gegeben und einige Minuten
geschwenkt.
6.
Anschließend wird 1 Minute bei 2000 U/min zentrifugiert und der Überstand
abgenommen.
7.
Die Schritte 5. & 6. werden zwei weitere Male wiederholt.
Der aufgereinigte Immunoligand wurde anschließend gegen PBS, bis zu einer ImidazolKonzentration von ≤ 1:1x109 mM, dialysiert, da Imidazol auf Zellen toxisch wirkt.
Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Bradford- Verfahrens bestimmt und die
Reinheit der Konstrukte mit der SDS-PAGE überprüft.
24
2.2.6. SDS- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Das Molekulargewicht der Immunoliganden in den Eluaten wurde aus der SDS-PAGE
ermittelt. Die Durchführung erfolgte in einem diskontinuierlichem Puffersystem. Zur
Molekulargewichtsbestimmung wurde eine kommerzielle SDS- PAGE- Markermischung
verwendet.
Methode:
1.
Proben im Verhältnis 1:1 mit Ladungspuffer vermischen und bei 95°C fünf
Minuten inkubieren.
2.
Die Proben in die Taschen des Gels füllen und bei konstanter Spannung von
175 mV 45 min bei Raumtemperatur laufen lassen.
Im Anschluss an die Elektrophorese wurden die Gele entweder gefärbt (siehe 2.2.7) oder dem
Western Blotting (siehe 2.2.8) unterzogen.
2.2.7. Färbung der SDS- PAGE- Gele
1.
Das Gel drei Mal fünf Minuten in H2O wässern.
2.
Anschließend eine Stunde in Comassie Stain Färbelösung schwenkend
inkubieren.
3.
Das Gel zwei Mal 20 min in H2O wässern.
4.
Zwei Zelophanfolien in 10%ige Glycerollösung ca. 30 min einlegen.
Gele vorsichtig in Zelophan einschweißen und im GelAirDryer zur besseren Lagerung
trocknen lassen.
2.2.8. Western Blotting
Zum spezifischen Nachweis der Immunoliganden wurden die Proteine im Western Blotting
mittels Antikörpern auf einer Nitrozellulosemembran nachgewiesen.
Methode:
1.
Die Nitrozellulosemembran blasenfrei auf SDS- Gel, in dem die Proteine
aufgetrennt wurden, transferieren, in Sandwich- Technik mit Whatmanpapier
und Schwämmchen abdecken.
2.
Unter Wasserkühlung 1,2 Stunden bei konstantem Strom (250 mA) blotten
lassen.
25
3.
Die Nitrozellulosemembran zwei Mal fünf Minuten in Blot- Waschpuffer
schwenken.
4.
Anschließend die Membran auf dem Schüttler für mindestens eine Stunde mit
Roti- Blockierlösung absättigen.
5.
Dann drei Mal zehn Minuten mit Blot- Waschpuffer waschen.
6.
Eine Stunde in Anti- Penta- His Ak- Lösung schwenkend inkubieren lassen.
7.
Danach drei Mal zehn Minuten mit Blot- Waschpuffer waschen.
8.
Die Membran eine Stunde in Donkey- Anti- Maus- Pod Ak- Lösung
schwenken lassen.
9.
Dann drei Mal zehn Minuten mit Blot- Waschpuffer waschen.
10.
Anschließend eine Minute in ECL- Lösung inkubieren.
11.
Röntgenfilm entsprechend der Strahlung zehn Sekunden bis fünf Minuten mit
der Zellulosemembran belichten
12.
Membran eine Stunde in Gold- Waschpuffer schwenken.
13.
Einige Minuten in Goldfärbelösung inkubieren und Membran trocknen lassen.
Das Gesamtproteinbild der Goldfärbung lässt sich mit den durch Antikörper spezifisch
markierten Banden des Western Blots vergleichen und qualitativ analysieren.
2.2.9. Analytische Gelfiltration
Die Analytische Gelfiltration diente zur Untersuchung der Reinheit der Konstrukte und der
Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichtes. Für die Durchführung der Gelfiltration
wurde eine Superdex- 200 Säule verwendet. Die Säule wurde an die FPLC angeschlossen,
und solange mit Waschpuffer äquilibriert, bis eine stabile Basislinie vorlag. Die Flussrate
wurde auf 1 ml/min gesetzt. Die Proteine wurden über eine 200 µl-Schleife injiziert und auf
die Säule aufgetragen. Die Detektion erfolgte mit einem UV/vis-Monitor und die Absorption
wurde bei 280 nm gemessen und aufgezeichnet. Das System wurde mit dem Gel- FiltrationsStandard kalibriert. Die Proteinmarker haben eine bekannte molare Masse und werden nach
Größe absteigend zeitlich eluiert. Mit Hilfe des erzeugten Diagrammes können die eluierten
Konstrukte auf ihre molekulare Größe geschätzt werden.
Methode:
1.
System mit Waschpuffer spülen bis sich eine stabile Basislinie einstellt;
Flussrate 1ml/min.
2.
Proteinstandard in System injizieren, mit Elutionspuffer spülen (Flussrate
26
1ml/min) und Elutionskurve aufzeichnen.
3.
Schritt 1. wiederholen.
4.
Immunoligand in das System injizieren, mit Elutionspuffer spülen (Flussrate
1ml/min) und Elutionskurve aufzeichnen.
2.2.10.
Enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA)
Um die Bindung zwischen den Immunoliganden und dem NKG2D- Rezeptor nachzuweisen
wurde ein ELISA durchgeführt.
Methode:
1.
NKG2D- Fc (100µg/ml) und IL2R- Fc (50 µg/ml) werden über Nacht auf eine
Maxi- Sorb Platte gecoatet.
2.
Anschließend wird die Platte mit 5% BSA für 1 Stunde blockiert.
3.
ULBP2-BB4 (5 µg), die PSMA- Immunoliganden (je 5 µg) und GFP werden
für eine Stunde hinzugefügt.
4.
Dreimaliges Waschen mit ≥ 300 µl Waschpuffer.
5.
Hinzugabe von 100 µl anti- penta- His Antikörper und Inkubation für eine
Stunde.
6.
Dreimaliges Waschen mit ≥ 300 µl Waschpuffer.
7.
Detektion mit 100 µl sekundärem Alkalinphosphatase anti- Maus- Antikörper
für 1 Stunde.
8.
Zugabe von 100 µl Substrate Solution / well. Inkubation der Platte für 15
Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
9.
Stoppen der Entwicklung durch Hinzugabe von 50 µl Stop Solution / well.
10.
Messung der Intensität mit einem ELISA- Reader bei 450 nm innerhalb von 30
Minuten nach Abstoppen der Entwicklungsphase.
2.2.11.
Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting,
FACS)
In der Durchflusszytometrie wird die Immunfluoreszenz von Einzelzellen mit einem
Antikörper gemessen, an dem ein fluoreszierender Farbstoff gekoppelt ist. Die Antikörper
waren entweder direkt mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Fluorescin Isozyanat, FITC)
gekoppelt (primärer Antikörper), nach der ersten Inkubation erfolgte eine zweite,
gegebenenfalls auch eine dritte Inkubation der Zellen mit einem FITC- markierten goat- anti27
mouse Ig (sekundärer Antikörper) gegen den ersten Antikörper bei 4°C. Prinzipiell kann so
jedes Oberflächenantigen einer Zelle markiert werden. Dabei fließen die Zellen einzeln durch
einen fokussierten Lichtstrahl und erzeugen durch die farbstoffmarkierten Antigene Signale,
indem diese das Licht streuen oder Fluoreszenz emittieren. Die Signale werden in einem
Zytometer gemessen und an eine angeschlossene Computereinheit weitergegeben. Die
Datenausgabe kann einerseits numerisch in Form von statistischen Messgrößen (Mittelwert,
Median, etc.), andererseits in graphischer Form als Histogramm oder Punktewolke erfolgen.
Zur Akquirierung und Analyse der Daten wurde das Programm Cellquest Pro (Becton
Dickinson) verwendet.
Für Kompetitionsansätze wurde mit der zehnfachen Menge des Antikörpers inkubiert, um
Bindungen über den blockierten Rezeptor ausschließen zu können. Die markierten Zellen
wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie untersucht.
Methode:
1x105 Zellen (in 100-200 µl Medium) in FACS- Röhrchen vorlegen:
1.
Zellen zweimal zum Waschen in Natriumazid- Puffer suspendieren und zwei
Minuten bei 300g oder 2000U/min zentrifugieren. Überstand verwerfen und
Zellpellet kurz vortexen.
2.
10 µl der primären Antikörper- Lösung hinzupipettieren und 20 Minuten auf
Eis inkubieren. Antikörperverdünnungen werden vorher angesetzt.
3.
Danach die Zellen zwei Mal in Natriumazid- Puffer suspendieren,
abzentrifugieren und den Überstand verwerfen.
4.
Schritt 2. & 3. wiederholen, wenn Zwischeninkubationen erforderlich sind, wie
z. B. bei der Darstellung der ULBP2-PSMAx Konstrukte mithilfe von AntiPenta-His Antikörper und Goat- Anti Mouse Ig FITC.
5.
Zellen mit einer sättigenden Menge (2µl) sekundärem Antikörper mischen und
20 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.
6.
Erneut die Zellen im Natriumazid- Puffer suspendieren, zentrifugieren und den
Überstand verwerfen.
7.
Zellen in 500 µl Puffer aufnehmen und bis zur Messung vor Licht schützen.
8.
Pro Ansatz 2500 lebende Zellen im FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ) messen.
Kontrollen pro Messung: Eichansatz (nur Zellen), Negativkontrollansatz (Zellen &
Antikörper), Positivkontrollansatz (Zellen & Kontrollsubstrat & Antikörper).
28
2.2.12.
Separation
mononukleärer
Zellen
(MNZ)
mittels
Dichtegradienten- Zentrifugation
Um NK- Zellen für funktionelle Untersuchungen zur Charakterisierung der Immunoliganden
zu isolieren, wurden zunächst MNZ aus Buffy Coats von gesunden Blutspendern gewonnen.
Methode:
1.
15 ml Ficoll Isopaque Lösung in 4 x 60 ml Leukosep- Röhrchen vorlegen.
2.
1 Minute bei 2000 U/min und Raumtemperatur zentrifugieren, das Ficoll
Isopaque befindet sich danach unterhalb der Filterscheibe.
3.
Defibriniertes oder mit einem Gerinnungshemmer versehenes Blut (Buffy Coat
enthält 60 ml Blut) im Verhältnis 1:2 mit NaCl verdünnen und je 30 ml auf vier
Röhrchen vorsichtig verteilen.
4.
20 Minuten bei 2000 U/min und Raumtemperatur zentrifugieren.
5.
Nach dem Zentrifugieren ergibt sich von oben nach unten folgende Schichtung:
Plasma / MNZ / Ficoll / Isopaque / Filterscheibe / Ficoll- Isopaque /
Erythrozyten. Den Hauptanteil an Plasma abpippetieren und verwerfen.
6.
Die MNZ können unter Zuhilfenahme einer Pipette aus dem Röhrchen
transferiert werden.
7.
MNZ durch vorsichtiges Ansaugen mit einer Pipette 10 ml NaCl
resuspendieren. 10 min bei 1500 U/min und Raumtemperatur zentrifugieren.
8.
Schritt 7. zwei Male wiederholen.
2.2.13.
Magnetische Zelltrennung (magnetic cell sorting)
Bei der negativen Selektion werden humane NK- Zellen durch Aussortieren der übrigen
peripheren Blutzellen (z.B. T- Zellen, B- Zellen, Dendritische Zellen, Monozyten,
Granulozyten) isoliert. Nicht- NK- Zellen werden zur primären Markierung mit einem
Cocktail Biotin- konjugierter monoklonaler Antikörper indirekt magnetisch gekennzeichnet.
Sekundär erfolgt eine Kopplung an Anti- Biotin monoklonale Antikörper, welche an
sogenannte MicroBeads gebunden sind. Über die MicroBeads werden die Nicht- NK- Zellen
über ein Magnetfeld an der MACS- Säule festgehalten. Die unmarkierten NK- Zellen können
ungehindert passieren.
Die Auftrennung erfolgte mittels NK- cell Isolation Kit II. Die Biotin- konjugierten
Antikörper richten sich gegen CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36, CD123 und gegen
29
Glykophorin A. Mit dem magnetischen Labelling kann ein sehr hoher Reinheitsgrad der NKZellen erreicht werden.
Die Gewinnung der NK- Zellen war Voraussetzung für die Erhebung der Aktivität der
Immunoliganden in Cytokine release assays und in Europium release assays.
Methode:
1.
Zellzahl bestimmen. Bei den Ansätzen wurden 5x107 bis 1x108 Zellen
eingesetzt.
2.
Zellsuspension bei 1500 U/min für 10 min zentrifugieren. Überstand
vollständig abnehmen.
3.
Zellpellet in 40 µl MACS- Puffer je 107 Zellen resuspendieren.
4.
10 µl Biotin- Antikörper- Cocktail je 107 Zellen hinzufügen.
5.
Gut mischen und für 10 min bei 4-8°C inkubieren.
6.
30 µl MACS- Puffer je 107 Zellen hinzugeben.
7.
20 µl Anti- Biotin MicroBeads je 107 Zellen hinzupipettieren.
8.
Gut mischen und für weitere 15 min bei 4-8°C inkubieren.
9.
Zellen mit der zehn bis zwanzigfachen Menge MACS- Puffer waschen und bei
1500 U/min für 10 Minuten zentrifugieren. Den Überstand vollständig
entfernen.
10.
Bis zu 108 Zellen in 500 µl MACS- Puffer resuspendieren.
11.
Durchführen der magnetischen Seperation am Magnetic Cell Sorter.
12.
Aufgereinigte NK- Zellen bei 1500 U/min für 10 min zentrifugieren und
Zellpellet in RPMI1640 Medium, versetzt mit 10 U/ml IL2, resuspendieren.
13.
1x106 NK- Zellen je ml und well in eine 12-well Platte setzen.
5-10 % der eingesetzten PBLs ergaben sich als reiner NK- Zell output. Die Stimulation der
NK- Zellen erfolgte für die Cytokine release assays und Europium release assays mit 10U/ml
IL2 über Nacht. Die NK- Zellen wurden am Folgetag für weitere Experimente verwendet,
nachdem sie anhand ihrer Marker CD16, CD56 durchflusszytometrisch identifiziert und die
NKG2D- Rezeptor Positivität bestätigt wurde.
2.2.14.
Cytokine Release Assay mittels ELISA
Nach Inkubation von NK- Zellen mit den Immunoliganden wurde in den Überständen die
Menge an sezernierten IFNγ und TNFα mittels ELISA bestimmt. Für die Zytokinmessungen
von IFNγ und TNFα wurden kommerziell erhältliche ELISA Kits verwendet.
30
Methode:
1.
100 µl Konstrukt / well (1 µg/ml verdünnt in Standard Bikarbonat Puffer) über
Nacht bei 4°C auf eine Maxisorb- Platte coaten.
2.
5x104 NK- Zellen / 200 µl Medium / gecoatetes well hinzugeben. Im zweiten,
löslichen Ansatz, werden 100 µl Konstrukt / well (1 µg/ml verdünnt in
Medium) und 5x104 NK- Zellen / 100 µl Medium / well gleichzeitig auf eine
96-well Platte gegeben und beide Platten 48 Stunden im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Als Kontrollen dienen NK- Zellen alleine und das BB4-ScFv.
3.
Die ELISA- Microtestplatte wird mit 100 µl Capture Antikörper 1:250
verdünnt mit Coating Puffer / well über Nacht bei 4°C inkubiert.
4.
Die ELISA- Platte wird drei Mal mit ≥ 300 µl Waschpuffer gewaschen.
5.
Anschließend wird die ELISA- Platte mit ≥ 200 µl Assay Diluent für eine
Stunde bei Raumtemperatur blockiert.
6.
Schritt 4. wiederholen.
7.
Die beiden Platten mit gecoatetem und löslichem Konstrukt werden bei 1500
U/min fünf Minuten zentrifugiert und die Proben, verdünnt in Assay Diluent,
in Triplikaten in die ELISA- Platte pipettiert. Für die Ermittlung einer
Standardkurve wird eine Verdünnungsreihe des jeweiligen Zytokinstandards
als 8-fache Bestimmung aufgetragen. Die Platte wird zwei Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert.
8.
Schritt 4. wiederholen, aber mit fünf Waschgängen.
9.
100 µl Working Detector (Detection Antikörper + Sav- HRP 1:250 verdünnt in
Assay Diluent) hinzugeben / well und eine Stunde bei Raumtemperatur
inkubieren.
10.
Schritt 4. wiederholen, aber mit sieben Waschgängen.
11.
Zugabe von 100 µl der Substrate Solution / well. Inkubation der Platte für 15
Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
12.
Stoppen der Entwicklung durch Hinzugabe von 50 µl Stop Solution / well.
13.
Messung der Intensität mit einem ELISA- Reader bei 450 nm innerhalb von 30
Minuten nach Abstoppen der Entwicklungsphase.
Die Zytokinmengen wurden jeweils in pg/ml angegeben und die Ergebnisse mit ±
Standardabweichung angezeigt.
31
2.2.15.
Cr51 Europium Release Assay
Nach Elektroporation der MCF7- und LNCaP- Targetzellen kann deren Lyse über die
freiwerdende Menge an Europiumchlorid im Europium Reader quantitativ bestimmt werden.
Die Lyse erfolgt durch Spender NK- Zellen als Effektorzellen, die aus Buffy Coats gewonnen
wurden. Unter Einsatz der unterschiedlichen Immunoliganden soll deren Wirkung auf eine
verbesserte Lyse untersucht werden.
Methode:
1.
Zellen zwei Mal in sterilem PBS waschen, 10ml PBS, 5 min bei 1100 U/min.
Am Tage zuvor Mediumwechsel.
2.
Einstellen auf 3x106/ml Zellen und Aufnehmen in Labelling Puffer.
3.
In 300 µl Küvetten umpipettieren und auf Eis lagern.
4.
Elektroporation mit 200 V und 1500 µF durchführen (Pulsdauer < 10 ms)
5.
Umschichtung auf vorgewärmtes RPMI 1640 + 20% hitzeinaktiviertes FCS im
50 ml Röhrchen.
6.
Fünf Minuten bei 1500 U/min zentrifugieren und auf 15 ml FCS umschichten.
7.
Schritt 6. zwei Mal wiederholen.
8.
Zellen in 1 ml RPMI + 10% FCS aufnehmen und einstellen auf 5x103 / 50 µl.
9.
Effektorzellen (NK- Zellen oder PBLs) auf 5x105 einstellen (je nach Ansatz
unterschiedlich).
10.
96- well Rundbodenplatte vorbereiten, leere Wells mit 100 µl RPMI 1640
vorlegen.
Spontanrelease:
100 µl gepulste Zellen + 100 µl Medium
Maximumrelease:
100 µl gepulste Zellen + 100 µl 1% Triton X-100
Es werden jeweils Tripplets angelegt und eine Platte mit verschiedenen Effektor- /
Target- Ratios angesetzt. Die Konstrukte werden in einer Konzentration von 10
µg/ml benutzt.
Proben:
10:1 E/T
100 µl E (5x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Medium
100 µl E (5x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Konstrukt
5:1 E/T
100 µl E (2,5x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Medium
100 µl E (2,5x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Konstrukt
2,5:1 E/T
100 µl E (1,25x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Medium
100 µl E (1,25x104) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Konstrukt
1,2:1 E/T
100 µl E (6x103) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Medium
32
100 µl E (6x103) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Konstrukt
0,6:1 E/T
100 µl E (3x103) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Medium
100 µl E (3x103) + 50 µl T (5x103)+ 50 µl Konstrukt
11.
Platte fünf Minuten mit 1500 U/min zentrifugieren.
12.
Flachbodenplatte mit 200 µl Enhancementsolution vorlegen.
13.
20 µl Überstand aus Spontan- und Maximumrelease Tripletts auf
Flachbodenplatte transferieren; Platte vor Licht schützen.
14.
Rundbodenplatte für fünf Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
15.
Platte fünf Minuten mit 1500 U/min zentrifugieren.
16.
20 µl Überstand aus Wells entnehmen und auf Flachbodenplatte transferieren.
17.
Messung im Europium Reader.
Berechnung der Lyserate in %:
(Mittelwert der experimentellen Lyse bei E/T x:x – Spontrelease) x 100/ (Maximumrelease –
Spontanrelease). Der Spontanrelease lag unterhalb 25 % des Maximumrelease. Die
Ergebnisse des Zytotoxizitätsassays werden mit ± Standardabweichung angezeigt.
2.2.16.
Xenograft Modell am Kolon- Adenokarzinom mit ULBP2-BB4
CD1 Nude- Mäuse haben eine spontane Deletion im FOXN1-Gen, was bewirkt, dass sie
keinen Thymus besitzen. Eine Reifung von Thymozyten zu T- Lymphozyten kann nicht
stattfinden. Sie haben ein stark eingeschränktes Immunsystem, was sie zu einem idealen Wirt
für humane Malignome macht. Da die Tiere anfällig für Infektionen sind, wurden sie unter
sterilen Bedingungen gehalten und mit autoklaviertem Futter und Wasser versorgt.
Am Vortag wurden LS174T- Zellen in neues Medium resuspendiert, um ein exponentielles
Wachstum zu erreichen. Am Versuchsbeginn (Tag 0) wurden 2,5x107 Zellen / ml in steriles
PBS aufgenommen und je 200 µl Zellsuspension subkutan in die rechte Flanke von insgesamt
16 Tieren injiziert. Am Tag 1 erhielten PBL Kontrollgruppe und Therapiegruppe 5x106
unstimulierte PBLs, frisch aus Buffy Coats gesunder Spender gewonnen. Am Tag 1 und 10
erhielten alle Gruppen nach Schema ihre Injektionen. Diese erfolgten alle intraperitoneal. Das
Tumorwachstum in allen Gruppen betrug 100%.
-
PBS Kontrollgruppe:
200 µl PBS
-
ULBP2-BB4 Kontrollgruppe:
50 µg ULBP2-BB4 in 200 µl PBS
33
-
PBL Kontrollgruppe:
5x106 PBLs (nur Tag 1) in 200 µl PBS
-
Therapiegruppe:
50 µg ULBP2-BB4 in 100 µl PBS &
5x106 PBLs (nur Tag 1) in 100 µl PBS
Das Tumorwachstum wurde alle 3-5 Tage kontrolliert und nach der Formel Länge x Breite x
Höhe/2 (mm3) bestimmt. Am Tag 42 wurden die Tumoren letztmalig vermessen, die Tiere
getötet und das mediane Tumorvolumen der vier Mäuse in jeder Gruppe bestimmt.
2.2.17.
Transplantat
Modell
am
humanem
primären
Kolon-
Karzinom mit ULBP2-BB4
Primäres humanes Kolon- Karzinom Material wurde in 27mm3 Würfel zerkleinert und vier
Stunden in RPMI-1640 Medium mit 0.3 IU/mL Insulin, 2 µg/mL Transferrin, 1 µg/mL
Hydrokortison, 5nM Sodiumselenit, 100 µg/mL Vancomycin, 40 µg/mL Refobacin, 4 µg/mL
Ciprofloxacin und 2.5 µg/mL Amphotericin B kultiviert. Währenddessen wurde ein Teil des
Materials mit 50 IU/mL Kollagenase I und 200 IU/mL Hyaluronidase in Tesca Puffer zwei
Stunden bei 37°C verdaut, die Zellen mit einem Cellstrainer vereinzelt und auf ihre CD138
Expression mittels Durchflusszytometrie untersucht. Bei CD138 Postivität wurden die KolonKarzinom Würfel in NaCl resuspendiert und in die rechte Flanke von fünf CD1- Nude
Mäusen subkutan implantiert. In den folgenden Wochen wurden die Tiere alle drei Tage auf
Krankheitszeichen und ein beginnendes Tumorwachstum untersucht. Etwa 30 Tage nach
Implantation war ein Tumorwachstum zu verzeichnen (Tag 0) und die Therapie ab einer
Tumorgröße von ca. 50 mm3 begonnen (Tag 12). Alle fünf Tiere erhielten 5x106 PBLs vom
gleichen Spender am Tag 12. Vier der fünf Mäuse erhielten darüber hinaus drei Mal ULBP2BB4. Alle Injektionen erfolgten intraperitoneal.
-
PBL Kontrollmaus:
5x106 PBLs in 200 µl PBS (Tag 12)
-
Therapiegruppe:
5x106 PBLs in 200 µl PBS (Tag 12)
50 µg ULBP2-BB4 in 200 µl PBS (Tag
13, 17, 21)
Das Tumorwachstum wurde alle 2-3 Tage kontrolliert und nach der Formel Länge x Breite x
Höhe/2 (mm3) bestimmt. Am Tag 40 wurden die Tumoren letztmalig vermessen, die Tiere
getötet und das Tumorvolumen der fünf Mäuse bestimmt.
34
2.2.18.
Xenograft Modell am Prostata- Karzinom mit ULBP2-
PSMA+2
SCID- Mäuse leiden an einem genetischen Defekt der T- und B- Zellreihen und eignen sich
daher auch für die Inokulation von Tumoren. Darüber hinaus haben SCID- Mäuse im
Vergleich zu CD1- Nude Mäusen keine eigenen NK- Zellen. Da SCID- Mäuse genauso
anfällig für Infektionen sind, wurden sie unter sterilen Bedingungen gehalten und mit
autoklaviertem Futter und Wasser versorgt.
LNCaP- Zellen wurden am Vortag in neues Medium resuspendiert und zu Versuchsbeginn in
steriles PBS überführt. 5x106 Zellen / 100 µl wurden mit je 100 µl Matrigel vermischt und
jedem der 38 Tiere subkutan in die rechte Flanke injiziert. In den folgenden Wochen wurden
die Tiere alle 3 Tage auf Krankheitszeichen und ein beginnendes Tumorwachstum untersucht.
14-21 Tage nach Tumorzell- Inokulation entwickelten 31 von 38 Tieren einen palpablen
Tumor. Diese 31 Tiere wurden in fünf Gruppen mit je 5-7 Tieren randomisiert (Tag 0).
-
PBS Kontrollgruppe:
200 µl PBS
-
ULBP2-PSMA+2 Kontrollgruppe:
50 µg ULBP2-PSMA+2 in 200 µl PBS
-
PBL Kontrollgruppe:
5x106 PBLs in 200 µl PBS (Tag 1, 4, 8)
-
BB4-scfv & PBL Kontrollgruppe:
25 µg BB4 & 5x106 PBLs (Tag 1, 4, 8) in
200 µl PBS
-
Therapiegruppe:
50 µg ULBP2-PSMA+2 in 100 µl PBS &
5x106 PBLs in 100 µl PBS (Tag 1, 4, 8)
Am Tag 1, 4 und 8 erhielten PBL-, BB4-ScFv & PBL- Kontrollgruppe und die
Therapiegruppe 5x106 PBLs vom gleichen Spender. Die PBLs wurden über den Zeitraum von
8 Tagen in RPMI 1640 Medium im Brutschrank kultiviert. An den Tagen 1, 4, 8, 12, 15 und
18 erhielten alle Gruppen nach Schema ihre Injektionen. Diese erfolgten alle intraperitoneal.
Das Tumorwachstum wurde alle 3-5 Tage kontrolliert und nach der Formel Länge x Breite x
Höhe/2 (mm3) bestimmt. Am Tag 19 wurden die Tumoren letztmalig vermessen, die Tiere
getötet und das mediane Tumorvolumen der Mäuse in jeder Gruppe bestimmt.
35
3. Ergebnisse
3.1. ULBP2-BB4
verursacht
Tumorwachstums
eine
subkutaner
signifikante
LS174T-
Reduktion
Tumoren
im
des
Nude-
Mausmodell des Kolon- Karzinoms
Im ersten Experiment wurde überprüft, ob NK- Zellen in der Lage sind das Wachstum solider
Tumoren in vivo zu inhibieren. Hierzu wurde der ULBP2-BB4 Immunoligand verwandt, der
über seinen BB4- Anteil an das Oberflächenmolekül CD138 bindet, das mitunter auf einigen
soliden Tumoren und malignen Plasmazellen überexprimiert wird [139, 146]. Die CD138
positive Tumorzelllinie LS174T (Kolon- Karzinom) wurde subkutan in Nude- Mäuse injiziert
(Tag 0). Am Tag 1 erhielten diese PBLs und die erste Dosis ULBP2-BB4, BB4 oder PBS; die
zweite Dosis folgte am Tag 10. Die Tumoren wurden über einen Zeitraum von 42 Tagen
vermessen und das Tumorvolumen berechnet (Abb.1A). Das Tumorvolumen wurde auf seine
statistische Signifikanz mittels des ungepaarten t-Test bestimmt. Das Tumorvolumen ist
beispielhaft für Tag 21 aufgeführt (Abb.1B). Ein p-Wert ≤0,05 gilt als statistisch signifikant.
Wie aus Abbildung 1A ersichtlich ist, wuchsen die Tumoren nach Behandlungsbeginn in
allen Gruppen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. In den Kontrollgruppen, die entweder
mit PBS oder mit ULBP2-BB4 behandelt wurden, war das schnellste Tumorwachstum zu
verzeichnen. Nach 42 Tagen betrug das mittlere Tumorvolumen in der PBS Kontrollgruppe
~2cm3 (nicht abgebildet) und in der ULBP2-BB4 Kontrollgruppe ebenfalls ~2cm3. Hieraus
resultiert, dass der Immunoligand ohne Effektorzellen in vivo nicht zytotoxisch wirkt. In der
Gruppe, die mit PBLs alleine behandelt wurden, erreichte der Tumor am Tag 42 eine mittlere
Größe von ~1cm3, während in der Therapiegruppe ULBP2-BB4 und PBLs das mittlere
Tumorvolumen mit ~1/4cm3 am Geringsten ausfiel. Der partielle Anti- Tumor- Effekt der
PBLs lässt sich auf ihren bereits beschriebenen Mechanismus, das Lysieren von Tumorzellen
durch NK- Zellen, zurückführen. Am Tag 23 lässt sich bereits ein deutlicher Unterschied in
der mittleren Tumorgröße zwischen den Kontrollgruppen PBLs (197,6mm3) und ULBP2-BB4
(205mm3) einerseits und der Therapiegruppe ULBP2-BB4 + PBLs (15,7mm3) andererseits
feststellen. Das Ergebnis zwischen der Gruppe ULBP2-BB4 und ULBP2-BB4 + PBLs ist
statistisch signifikant (p=0,0169). Der Vergleich zwischen der Gruppe PBLs und ULBP2BB4 + PBLs fällt nicht signifikant aus (p=0,197), höchstwahrscheinlich weil zu wenige Tiere
benutzt worden sind.
36
P=0,0169
Abbildung 1
A: Wachstum subkutaner LS174T Tumoren im Nude- Mausmodell des soliden Kolon- Karzinoms. Aufgetragen
ist das mediane Tumorvolumen in mm3 von je 4-5 Mäusen jeder Behandlungsgruppe im Zeitverlauf. Die
Injektion der PBL’s erfolgte am Tag 1; die Behandlung mit ULBP2-BB4 am Tag 1 und 10.
B: Medianes Tumorvolumen in mm3 der 4-5 Mäuse je Behandlungsgruppe am Tag 23 nach
Tumorzellapplikation. Im ungepaarten t-Test wurde die Signifikanz berechnet, aufgetragen als p-Wert der
jeweiligen Gruppe und der Kontrollgruppe.
Die Kombination von PBLs und ULBP2-BB4 resultiert in einer drastischen Reduktion bzw. Verlangsamung des
Wachstums subkutaner LS174T-Tumore im Mausmodell des Kolon- Karzinoms. Die Differenz der Tumorgröße
zwischen der Gruppe ULBP2-BB4 und ULBP2-BB4 & PBLs ist statistisch signifikant.
37
3.2. ULBP2-BB4
verursacht
eine
Reduktion
der
Tumorgröße
von
transplantierten primären Kolon- Karzinomen in der Nude- Maus
Ein humaner Tumor besteht im Vergleich zu einer Tumorzelllinie aus mehreren
Bestandteilen. Neben den Tumorzellen wird der Tumor von Bindegewebe und Kollagenfasern
gestützt.
Um ein relevanteres System für die Versuchsbedingungen eines Tierversuches zu verwenden,
ist aus diesem Grunde statt einer Tumorzelllinie ein primärer, humaner Tumor benutzt
worden. Der Effekt des ULBP2-BB4 Immunoliganden sollte auf das Wachstum eines nativen
Tumors untersucht werden. Der Tumor ist, ehe er in die Nude- Maus transplantiert wurde, auf
seine CD138 Positivität untersucht worden (Abb. 2A). 30 Tage nach Transplantation war eine
durch die Haut durchscheinende Gefäßeinsprossung in den Tumor zu beobachten und ein
Wachstum zu verzeichnen, definiert als Tag 0. In einem Behandlungszeitraum von 10 Tagen
erhielten vier der fünf Mäuse eine dreimalige Injektion von ULBP2-BB4. Während des
Behandlungszeitraumes entwickelte sich in drei von vier therapierten Mäusen der Tumor
regredient. Der Tumor der Kontrollmaus wuchs innerhalb des Beobachtungszeitraumes
exponentiell (Abb. 2B). Nach dem Ende der dritten und letzten Therapieinjektion nahm das
Tumorvolumen wieder in 3 von 4 behandelten Mäusen zu.
Abbildung 2
A: Histogramm der FACS- Analyse des Primärtumors. Der Kolon- Primärtumor wurde mit 50 IU/mL
Kollagenase I und 200 IU/mL Hyaluronidase verdaut und auf seine CD138 Expression mittels aCD138Antikörper untersucht (schwarze Linie). 1x105 pro ml Zellen wurden mit dem Penta-His gekoppelten Goat Anti
Mouse Ig FITC (hellgraue, volle Kurve) als Kontrolle gefärbt.
B: Wachstum transplantierter subkutaner Kolon- Primärtumore im Nude- Mausmodell. Aufgetragen ist das
Tumorvolumen in mm3 von 5 Mäusen im Zeitverlauf. Der Beginn des Tumorwachstums ist als Tag 0 definiert.
Die Injektion der PBLs erfolgte am Tag 12 für alle Mäuse; die Behandlung mit ULBP2-BB4 erfolgte am Tag 13,
17 und 21 für vier der fünf Mäuse (schraffierte Linien). Die Kontrollmaus erhielt keine weiteren Injektionen
(schwarze durchgezogene Linie). Der Behandlungszeitraum ist grau hinterlegt. Drei von vier behandelten
Mäusen zeigen eine Reduktion des Tumorvolumens während des Behandlungszeitraumes.
38
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse aus beiden Tierversuchen, dass ULBP2-BB4
zusammen mit NK- Zellen dazu in der Lage ist, das Wachstum solider Tumoren in vivo zu
beeinflussen. CD138 wird auf vielen Zellen des menschlichen Organismus exprimiert, daher
eignet sich ULBP2-BB4 nicht als Immuntherapeutikum zur Behandlung von soliden
Tumoren. Stattdessen soll ein Immunoligand generiert werden, der spezifisch solide
Tumorzellen adressieren kann.
3.3. Klonierung der PSMA positiven Immunoliganden
Im Rahmen des vorangegangenen Projektes [138] wurde festgestellt, dass eine
Zufallsmutation in der Linkerregion des BB4-scFv zu einer Oligomerisierung des ULBP2BB4 Immunoliganden führte. Um zu überprüfen, ob diese strukturelle Veränderung essentiell
für die therapeutische Effizienz der bispezifischen Immunoliganden ist, wurden folgende
Immunoliganden generiert: ULBP2-PSMA+15 mit einem 15mer (Glyzin4-Serin)3 -Linker,
ULBP2-PSMA+5 mit einem 5mer Glyzin4-Serin - Linker, ULBP2-PSMA+2 mit einem 2mer
Glyzin-Serin - Linker und ULBP2-IleZip-PSMA+15 mit einem 15mer ScFv-Linker, sowie
einem Isoleuzin- Zipper- Peptid zwischen ULBP2 und ScFv (Abb. 3A). Anschließend wurden
sie auf einem Agarose Gel visualisiert (Abb. 3B).
Abbildung 3
A: Schematische Darstellung der Struktur der Immunoliganden. Die Linker des ULBP2-PSMA+15, ULBP2PSMA+5 und ULBP2-PSMA+2 befinden sich zwischen Vh und Vl des scFv. Beim ULBP2-IleZip-PSMA+15
wurde das IleZip-Peptid zwischen das ULBP2 und das anti-PSMA ScFv kloniert.
B: Darstellung einer PCR- Amplifikation der unterschiedlichen Komponenten am Beispiel des ULBP2-IleZipPSMA+15 Immunoliganden und seiner Produkte generiert durch „splicing-by-overlap-extension“-PCR auf
einem 1.2% Agarose Gel. 100bp: Molekularer Weight Marker, ULBP2: ~700bp, IleZip: 96bp, aPSMA-scFv:
~750bp, ULBP2-IleZip: ~800bp, ULBP2-IleZip-PSMA+15: kompletter Immunoligand, ~1650bp inkl. 1625bp
inkl. Restriktionsstellen und HIS-tag.
39
3.4. Expression
Bedingung für den Einsatz der Immunoliganden war deren Herstellung in ausreichender
Menge. Die Immunoliganden konnten mittels L-Plasmid in eukaryontischen 293T- Zellen mit
guter Effizienz exprimiert und aus dem Zellüberstand gewonnen werden (~1-2g /2L
Überstand). Der Zellüberstand wurde zwei Mal pro Woche abgenommen und bei 4°C
gelagert. Zwei Liter des gesammelten Überstandes wurden über eine regenerierende
Zellulose- Membran auf 50 ml eingeengt und anschließend über das HIS- Tag aufgereinigt.
Anschließend wurden die Proben im Western Blot oder im Comassie aufgetrennt und mit
einem anti- His- Antikörper gegen das C-terminale 6xHistidin-Tag detektiert.
Die Immunoliganden haben eine erwartete Größe von ~65 kDa. Anhand des Größenstandards
konnten sie den einzelnen Banden zugeordnet werden. Es finden sich keine weiteren Banden,
die für einen Zerfall des Immunoliganden sprechen würden. Der isolierte PSMA- Anteil wäre
bei ~32 kDa, der ULBP2- Ligand bei ~28 kDa zu erwarten gewesen. Die Immunoliganden
sind demnach in der erwarteten Größe im SDS Gel nachweisbar (Abb. 4A) und werden im
Western Blot von spezifischen Antikörpern detektiert (Abb. 4B).
Abbildung 4
Die Immunoliganden wurden in der Zelllinie 293T exprimiert, mittels Ni-NTA Superflow- Beads über das HISTag aufgereinigt und ein Coomassie (A) und Western Blot (B) durchgeführt. Im Eluat enthaltener Immunoligand
wurde mit einem anti- HIS- Antikörper im Western Blot nachgewiesen.
40
3.5. Eine Linkerverkürzung oder das Einfügen eines Zipper-Peptids
führen zu einer Oligomerisierung der Immunoliganden
Um herauszufinden, ob eine Linkerverkürzung bzw. die Einführung eines Zipper- Petides zu
einer Veränderung der Tertiärstruktur der PSMA Immunoliganden führt, wurden die 4
Immunoliganden ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2IleZip-PSMA+15 mittels der Gel-shift- Chromatographie verglichen. Das jeweilige Format
als Mono-, Di- oder Oligomer konnte in Auftrennung nach Masse gezeigt werden (Abb. 5).
Dabei wurde eine Di- und Oligomerisierung einerseits über eine Verkürzung des Standard(Glycin4-Serin)3 -Linkers von 15 Aminosäuren auf 5, bzw. 2 Aminosäuren erreicht,
andererseits über die Einführung eines Isoleuzin- Zipper- Peptides. Es erfolgte im Fall eines
5-Aminosäure-Linkers (ULBP2-PSMA+5) eine Dimerisierung, im Fall eines 2-AminosäureLinkers (ULBP2-PSMA+2) eine Oligomerisierung und im Fall des Ile-Zippers (ULBP2IleZip-PSMA+15) ebenfalls eine Oligomerisierung. Eine Verkürzung des Peptidlinkers
folgert in einer Oligomerisierung des Immunoliganden.
Abbildung 5
Auftrennung der Immunoliganden nach Masse über eine Superdex 200 Gelshift-Chromatographie, für
verschiedene ULBP2-PSMA- Immunoliganden zur Demonstration des Oligomerisierungszustandes. Das
ULBP2-PSMA+15-Konstrukt liegt dabei in einem Gemisch aus Monomer (Peak ~31min.) und Dimer (kleinerer
Peak ~28min.) vor. Das ULBP2-PSMA+5-Konstrukt liegt ausschließlich als Dimer (größerer Peak ~28min.), das
ULBP2-PSMA+2-Konstrukt als Oligomer (Peak ~21min) und das ULBP2-IleZip-PSMA+15-Konstrukt ebenfalls
als Oligomer (Peak ~18min.) vor. Die Zeit in min. ist gegen milli-absorbance units bei 280nm aufgetragen.
41
3.6. Die
Immunoliganden
binden
spezifisch
an
PSMA
positive
Tumorzellen
Für die Entfaltung des gewünschten Aktionsmechanismus muss nachgewiesen werden, dass
die Immunoliganden über das PSMA- scFv ausschließlich an PSMA positive Zelllinien
binden. Hierzu wurden durchflusszytometrische Untersuchungen mit den PSMA positiven
Zelllinien MCF7 (Mamma- Karzinom) und LNCaP (Prostata- Karzinom) durchgeführt. Die
Ergebnisse der Durchflusszytometrie werden nur für die Zellllinie MCF7 dargestellt; sie sind
identisch mit denen der Zelllinie LNCaP. PC3 (Prostata- Karzinom) wurde als PSMA
negative Zelllinie mitgeführt.
Die PSMA Positivität der Zelllinien wurde während der Experimente mittels eines
monoklonalen aPSMA-Antikörpers gekoppelt mit GAM-Fitc kontrolliert (Abb.6 C).
Nach Inkubation der PSMA positiven Zellen mit den Immunoliganden ULBP2-PSMA+15,
ULBP2-PSMA+5,
ULBP2-PSMA+2
und
ULBP2-IleZip-PSMA+15
konnte
durchflusszytometrisch mit Hilfe eines pHIS-GAM-Fitc Antikörpers eine Bindung detektiert
werden (Abb.6 A, B, D, E). Die Bindung der Immunoliganden nahm konzentrationsabhängig
zu (Daten nicht gezeigt).
Die Immunoliganden können bei gleichzeitiger Gabe von einem monoklonalen anti-PSMA
Antikörper kompetitiv verdrängt werden, da dieser aufgrund seiner zwei Bindungsstellen über
eine höhere Affinität verfügt. Gezeigt ist dies exemplarisch für den ULBP2-PSMA+2
Immunoliganden (Abb.6 F).
Keine Bindungzunahme war bei der PSMA negativen Tumorzelllinie PC3 mit allen
Immunoliganden zu verzeichnen (Abb.7 A-D). Die Bindungszunahme beruht somit auf einer
spezifischen Interaktion zwischen dem anti- PSMA der Immunoliganden und den
exprimierten PSMA auf der Zelloberfläche der Tumorzelllinien.
42
Abbildung 6
A-E: Histogramm der FACS- Analyse von MCF7- Zellen. 1x105 pro ml Zellen wurden mit dem Penta-His
gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC (hellgraue, volle Kurven) als Kontrolle gefärbt. Darstellung der Bindung
des ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 (schwarze Linie, je
10 µg/ml) erfolgte mit dem Penta-His gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC. Als positiv Kontrolle diente der
monoklonale aPSMA-Ak (schwarze Linie in C- 1µg/ml).
F: Histogramm der FACS- Analyse von MCF7- Zellen. 1x105 pro ml Zellen wurden mit dem Penta-His
gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC (hellgraue, volle Kurve) als Kontrolle gefärbt. Darstellung der Bindung
des ULBP2-PSMA+2 (10 µg/ml) auf den Targetzellen (dunkelgraue, volle Kurve), sowie der Kompetition von
ULBP2-PSMA+2 (10 µg/ml) mit aPSMA Antikörper (1µg/ml; schwarze Linie). Die Detektion erfolgte mit dem
Penta-His gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC.
43
Abbildung 7
A-D: Histogramme der FACS- Analysen von PC3- Zellen. 1x105 pro ml Zellen wurden mit dem Penta-His
gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC (hellgraue, volle Kurven) als Kontrolle gefärbt. PC3- Zellen exprimieren
kein PSMA auf der Oberfläche, die Immunoliganden ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2
und ULBP2-IleZip-PSMA+15 (je 10 µg/ml) binden nicht (schwarze Linie). Die Detektion erfolgte mit dem
Penta-His gekoppelten Goat Anti Mouse Ig FITC.
44
3.7. An die tumorzellgebundenen Immunoliganden kann gleichzeitig der
NKG2D-Rezeptor binden
Eine unerlässliche Voraussetzung ist, ob an den tumorzellgebundenen Immunoliganden
simultan NK- Zellen binden können. Dazu wurde die PSMA positive Zelllinie MCF7 mit den
Immunoliganden ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2IleZip-PSMA+15
inkubiert
und
anschließend
lösliches
rekombinantes
NKG2D-Fc
hinzugegeben. Durchflusszytometrisch konnte eine Bindungszunahme des aFc-Fitc
Antikörpers detektiert werden (Abb. 8 A-D). Eine unspezifische Bindung des aFc-Fitc wurde
durch das Mitführen von CD30-Fc als Kontrollantikörper ausgeschlossen.
Das Ergebnis legt den Schluss nahe, dass durch den Einsatz der Immunoliganden ein crosslinking von PSMA-positiven Tumorzelllinien und NK Zellen erfolgt, wodurch die NK Zelle
in die unmittelbare Nachbarschaft zur Tumorzelle direktioniert wird.
Abbildung 8
A-D: Histogramm der FACS- Analyse von MCF7- Zellen. 1x105 pro ml Zellen wurden entweder mit CD30-Fc
(10 µg/ml- hellgraue Linie) oder NKG2D-Fc (10 µg/ml; dunkelgraue, volle Kurve) als Kontrolle inkubiert und
dann mit aFc-FITC gefärbt. Beim Einsatz von ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und
ULBP2-IleZip-PSMA+15 (je 10 µg/ml) mit NKG2D-Fc (10 µg/ml; schwarze Linie) lässt sich die Bindung über
den aFc-Fitc nachweisen.
45
3.8. Die Immunoliganden binden spezifisch an NKG2D
Um die Bindung der Immunoliganden an den NKG2D- Rezeptor mit einer Zellunabhängigen Methode zu verifizieren, wurde ein ELISA durchgeführt. Hierzu wurden 96
well Platten mit entweder rhNKG2D oder IL2R-Fc (negativ Kontrolle) gecoatet und mit den
Immunoliganden inkubiert. Für die Immunoliganden konnte eine spezifische Bindung an
NKG2D nachgewiesen und eine unspezifische Bindung an einen Fc-Teil ausgeschlossen
werden (Abb.9 exemplarisch dargestellt für ULBP2-PSMA+15). Diese Ergebnisse geben
Anlass dazu, zu untersuchen, ob Immunoliganden eine NK- Zell abhängige Zytokin
Freisetzung und Zelllyse von PSMA positiven Zellen herbeiführen.
Abbildung 9
ELISA Messung der Bindung von ULBP2-PSMA+15 (weiß), ULBP2-BB4 (hellgrau) und GFP (dunkelgrau) an
immobilisierten NKG2D Rezeptor (100 µg/ml) und immobilisierten IL2 Rezeptor-Fc (50 µg/ml) mit einem antihis Antikörper. ULBP2-BB4 diente als Positivkontrolle, GFP als negativ Kontrolle. Die mittlere OD 492nm ±
SD (n=3) ist dargestellt.
3.9. Oligomerisierte Immunoliganden aktivieren NK Zellen über den
NKG2D Rezeptor
Da die Immunoliganden in der Lage sind, über den aktivierenden NKG2D- Rezeptor an NKZellen zu binden, sollte untersucht werden, ob es zu einer rezeptorvermittelten Aktivierung
der NK Zelle kommt und beide Wege durch ihre Aktivierung eingeschlagen werden können:
zu einem die Produktion von bestimmten Zytokinen, die u.a. dendritische Zellen zur Reifung
befähigen, und zu anderem die direkte Zytotoxizität. Hierzu wurden Experimente mit
primären NK Zellen, die von gesunden Spendern isoliert wurden, durchgeführt.
46
3.9.1. Oligomerisierende Immunoliganden induzieren die vermehrte
Sekretion von IFNγ & TNFα
Zur Bestimmung der Zytokinfreisetzung wurden aufgereinigte stimulierte NK Zellen
entweder mit immobilisierten oder löslichen Immunoliganden über 48 Stunden inkubiert. Als
Negativkontrolle wurde das BB4-scfv verwendet. Der zellfreie Überstand wurde zur
Detektion von TNFα und IFNγ mittels ELISA genutzt. Dazu wird eine Microtestplatte mit
Antikörpern (capture antibody) beschichtet, welche das zu bestimmende Zytokin zu binden
vermag. An diesen Antikörper- Zytokin Komplex bindet nun ein zweiter, enzymgekoppelter
Antikörper (detection antibody). Das Enzym ist nun in der Lage ein farbloses Substrat in ein
farbiges Produkt umzuwandeln. Die Bindung des zweiten Antikörpers ist proportional zur
Menge des Zytokins in der Probe, so dass man durch Vergleich mit einer Standardreihe die
Zytokinkonzentration über die Intensität der Farbentwicklung kolorimetrisch festgestellen
kann. Für die Standardreihe wurde rekombinantes humanes IFNγ und TNF α verwendet.
Die ULBP2-PSMA+15- und der ULBP2-PSMA+5 Immunoliganden, die als Monomer oder
Dimer vorliegen, rufen nur im immobilisierten Zustand eine gesteigerte IFNγ Freisetzung
hervor. Im löslichen Ansatz zeigen ULBP2-PSMA+15 und ULBP2-PSMA+5 keinerlei
Wirkung (Abb. 10 A&B).
Das als Oligomer vorliegende ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 schafft es,
NK- Zellen im immobilisierten als auch im löslichen Zustand zu aktivieren und die IFNγ
Freisetzung zu steigern (Abb. 10 A&B).
Die
Ergebnisse
implizieren
eine
deutliche
Überlegenheit
der
oligomerisierenden
Immunoliganden im Hinblick auf die IFNγ Ausschüttung im immobilisierten und vor allem
im löslichen Zustand.
Während der Durchführung dieses Projektes konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die
oligomerisierenden Immunoliganden auch dazu in der Lage sind die TNFα Freisetzung
anzuheben, wie beispielsweise für den ULBP2-PSMA+2 Immunoliganden dargestellt (Abb.
10C). Dies soll jedoch nur der Vollständigkeit halber Erwähnung finden und stellt nicht den
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit dar.
47
Abbildung 10
Aufgereinigte NK- Zellen wurden über Nacht mit IL-2 (10 U/mL) inkubiert und über 48 Stunden mit (A)
immobilisiertem ULBP2-PSMA+15 (hellgrau), ULBP2-PSMA+5 (schraffiert), ULBP2-PSMA+2 (weiß),
ULBP2-IleZip-PSMA+15 (dunkelgrau), BB4-scfv (schwarz) und (B) löslichen Immunoliganden stimuliert. Die
IFNγ Konzentration aus dem Überstand wurde mit Hilfe eines ELISA ermittelt und ist in Nanogramm pro
Milliliter angegeben. In (C) wurde analog die TNFα Konzentration nach Inkubation mit löslichen
Immunoliganden gemessen. Der Hintergrund wurde anhand des BB4- scFv bestimmt und ist von allen Werten
subtrahiert. Der Mittelwert ± SD ist angegeben (n=2).
48
3.9.2. Oligomerisierende Immunoliganden steigern die Zytotoxizität
Zur Bestimmung der Zytotoxizität, wurde die Effektivität der Immunoliganden mittels des
„Europium release assays“ getestet, der über eine Inkubation von Immunoligand mit PSMAexprimierenden
Zielzellen
(Targetzellen),
sowie
NK-Zellen
(Effektorzellen)
eine
zellvermittelte tumorspezifische Toxizität nachweisen kann.
Der Europium release assay beruht auf der Markierung von Targetzellen mit einem
Europium-Chelat-Komplex
(Eudiethylentriaminpenta-acetat),
welcher
in
die
Zellen
eingebracht wird und an Zytoplasmaproteine bindet. Die so markierten Targetzellen werden
zusammen mit Effektorzellen, und entweder mit oder ohne Immunoligand inkubiert. Nach der
Zytolyse, verursacht durch die Effektorzellen, wird der Eu3+-Komplex aus den lysierten
Targetzellen in den Zellüberstand freigesetzt.
Die Zugabe von ß-Naphthoyltrifluoroacetat, das in der sogenannten „Enhancement“- Lösung
enthalten ist, induziert die Bindung eines fluoreszierenden Chelates, welches mit einem
Fluorometer gemessen werden kann.
ULBP2-PSMA+15 und ULBP2-PSMA+5 zeigen keine gesteigerte zytotoxische Wirkung und
können, im Vergleich zu NK Zellen alleine, keine verbesserte Lyse der PSMA-positiven
Zelllinie LNCaP hervorrufen. ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 führen
hingegen zu einer gesteigerten NK- Zell vermittelten Lyse der Targetzellen. Die Lyserate ist
um 15 % erhöht im Vergleich zur Kontrolle (Abb.11 B).
Der Wirkeffekt der oligomerisierenden Immunoliganden kann mit der gleichzeitigen
Inkubation des anti-NKG2D Antikörpers unterdrückt werden. Der Antikörper bindet mit
höherer
Affinität
als
die
Immunoliganden
an
NK-
Zellen
und
inhibiert
den
Wirkungsmechanismus. Der Blockierungsversuch ist beispielsweise für ULBP2-PSMA+2
dargestellt und ident für ULBP2-IleZip-PSMA+15. Die Lyserate entspricht, nach Blockade
mit anti- NKG2D Antikörper, der Lyserate für NK- Zellen alleine (Abb.11 C).
Bei der Verwendung von PBLs anstelle von NK- Zellen als Effektorzellen, war die
gemessene Zytotoxizität insgesamt geringer. Auch bei Verwendung von PBLs erreichte der
Immunoligand eine verbesserte Lyse der Targetzellen (Abb.11 D).
49
Abbildung 11
A: Die Spender- NK- Zellen wurden selektioniert (negativ-MACS für CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36,
CD123 und Glykoprotein A, Firma Miltenyi), 18 Stunden mit 10U/ml IL-2 stimuliert und anschließend auf ihre
Spezifität (CD3 negativ, CD16-, CD56- und NKG2D positiv) getestet.
B: NK-Zytotoxizität gegenüber LNCaP- Zellen im Europium Release Assay nach 5 Stunden Inkubation unter
Verwendung der Immunoliganden ULBP2-PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2, ULBP2-IleZipPSMA+15 (je 1 µg/ml). Das Verhältnis zwischen Effektorzelle (NK- Zellen) und Zielzelle (LNCaP) ist gegen
die spezifische Zelllyse in % aufgetragen.
C: Für den Blockierungsversuch wurden NK- Zellen gleichzeitig inkubiert mit Immunoligand und anti-NKG2D
Antikörper (10 µg/ml). Der Mittelwert ± SD ist angegeben (n=3).
D: PBL- Zytotoxizität gegenüber LNCaP- Zellen im Europium Release Assay nach 5 Stunden Inkubation unter
Einsatz des ULBP2-PSMA+2. Als Effektorzellen wurden PBLs aus Buffy Coats von gesunden Spendern mittels
Dichtegradientenzentrifugation gewonnen.
50
3.10. ULBP2-PSMA+2 verursacht eine signifikante Reduktion des
Tumorwachstums
subkutaner
LNCaP-
Tumoren
im
SCID-
Mausmodell des Prostata- Karzinoms
Die hier gezeigten Ergebnisse der Cytokine release assays und der Zytotoxizitätstests zeigen,
dass die Aktivität der NK Zellen entscheidend hochreguliert wird und solide, PSMA positive
Tumore spezifisch in vitro lysiert werden. Um die in vitro Ergebnisse auf ihre klinische
Relevanz und die Übertragbarkeit auf lebende Organismen zu überprüfen, wurden in vivo
Experimente durchgeführt.
Unter Berücksichtigung der in vitro Ergebnisse wurde ein Tierversuch durchgeführt, in dem
die oligomerisierenden, für PSMA spezifischen, Immunoliganden in vivo getestet werden
sollten. Exemplarisch wurde hierzu das ULBP2-PSMA+2 verwendet und die PSMA positive
Prostata- Tumorzelllinie LNCaP in SCID- Mäuse injiziert. 14-21 Tage nach subkutaner
Tumorzellinokkulation, sobald ein Tumor palpabel war, wurden je 5-7 Tiere zufällig in fünf
Behandlungsgruppen verteilt und dies als Tag 0 definiert. Am Tag 1, 4 und 8 erhielten drei
der fünf Gruppen PBLs und je nach Gruppenzugehörigkeit PBS, BB4 oder ULBP2-PSMA+2.
Insgesamt erhielten die SCID- Mäuse sechs intraperitoneale Injektionen alle drei bis vier
Tage. Die Tumoren wurden ab Behandlungsbeginn über einen Zeitraum von 19 Tagen
vermessen und das Tumorvolumen berechnet. Anschließend wurde das Ergebnis anhand des
p-Wertes (ungepaarter t- Test) am 16. Tag auf seine statistische Signifikanz untersucht. Ein pWert ≤0,05 gilt als statistisch signifikant.
Bei der Zelllinie LNCaP handelt es sich um Zellen eines langsam wachsenden Prostata
Karzinoms.
Dies
machte
sich
in
der
nahezu
linearen
Wachstumszunahme
des
Tumorvolumens in den Kontrollgruppen BB4 & PBL’s, PBS, ULBP2-PSMA+2 und PBL’s
bemerkbar. Einzig bei der Therapiegruppe ULBP2-PSMA+2 & PBL’s begann das
Tumorwachstum ab dem 8. Tag nach Therapiebeginn zu stagnieren. Das Tumorvolumen blieb
darauf folgend bis zum 19. Tag weitgehend unverändert (Abb. 12A). Am Tag 16 betrug das
mittlere Tumorvolumen für die Kontrollgruppen BB4 & PBL’s 225,3mm3, PBS 218,3mm3,
ULBP2-PSMA+2 209,8mm3 und PBL’s 194,0mm3 und der Therapiegruppe ULBP2PSMA+2 & PBL’s 105,6mm3 (Abb.12B). Das Ergebnis zwischen der Therapiegruppe und
der Kontrollgruppe BB4-scFv + PBL’s ist statistisch signifikant (p=0,0042).
51
p=0,0042
Abbildung 12
A: Wachstum subkutaner LNCaP- Tumoren im SCID-Mausmodell des Prostata- Karzinoms. Aufgetragen ist das
mediane Tumorvolumen in mm3 von je 5-7 Mäusen pro Behandlungsgruppe gegen den Zeitverlauf nach
Therapiebeginn. An den Tagen 1, 4 und 8 erfolgte die Injektion von PBL’s. An den Tagen 1, 4, 8, 11, 14, 18 die
Injektion von PBS, BB4 und ULBP2-PSMA+2.
B: Medianes Tumorvolumen der 5-7 Mäuse je Behandlungsgruppe am Tag 16 nach Behandlungsbeginn. Im
ungepaarten t-Test wurde die Signifikanz berechnet, aufgetragen als p-Wert. Die Behandlung mit PBL’s und
ULBP2-PSMA+2 führt zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums subkutaner LNCaP- Tumoren im
Mausmodell des Prostata- Karzinoms. Das Ergebnis zwischen der Gruppe PBL’s & ULBP2-PSMA+2 und
PBL’s alleine ist statistisch signifikant.
52
4. Diskussion
4.1. Immunoliganden können die Grenzen der NK- Zell basierten
Immuntherapie von Karzinomen überwinden
Die Idee, dass Immunoliganden die Grenzen der NK- Zell basierten Immuntherapie von
Karzinomen überwinden, beruht auf den Daten, die in der vorliegenden Arbeit festgestellt
werden konnten.
1)
ULBP2-BB4 verursacht zusammen mit NK- Zellen eine deutliche Reduktion des
Tumorwachstums der soliden Kolon- Tumorzelllinie LS174T in vivo und eine
Abnahme des Tumorvolumens bei transplantierten primären Kolon- Karzinomen.
2)
Auf dieser Grundlage wurden die PSMA spezifischen Immunoliganden ULBP2PSMA+15, ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15
kloniert. Die Expression, Aufreinigung und der Nachweis ihrer Bindungsfähigkeit an
den Targetzelllinien LNCaP und MCF7 und an NK- Zellen wurde nachgewiesen.
3)
Eine Linkerverkürzung in den Immunoliganden bewirkt eine Oligomerisierung und ist
essenziell notwendig für die Aktivierung der NK- Zellen in vitro. Die oligomerisierten
Immunoliganden ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 induzieren eine
verbesserte Zytokinsekretion der NK Zellen und sind einzig fähig eine NK- Zell
vermittelte Tumorzell- Lyse zu vermitteln.
4)
ULBP2-PSMA+2 ist zusammen mit NK- Zellen dazu in der Lage, das Wachstum
bereits etablierter subkutaner LNCaP- Prostata- Tumoren zu verlangsamen und stellt
eine spezifische immuntherapeutische Strategie zur Behandlung von soliden Tumoren
dar.
NK- Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem. Erkennen und zerstören NK- Zellen
eine Tumorzelle, werden Antigenfragmente von einer dendritischen Zelle (DC) aufgenommen
und zur Reifung befähigt. Diese prozessiert die Antigenfragmente und präsentiert sie
zytotoxischen CD8+ T Zellen (CTL) in Lymphknoten. Aus einer primären, angeborenen
Immunantwort, entwickelt sich binnen Tagen eine adaptive Immunantwort, zu der CTL
antigenspezifisch zur Lyse der Tumorzellen beitragen können [13, 84]. Über die Produktion
von IFNγ trägt die NK- Zelle zu einer Reihe weiterer Reaktionen bei. Sie aktiviert die CTLs
und führt zur Proliferation von CD4+ T- Helferzellen. Es wird vermutet, dass sezernierte
Zytokine darüber hinaus zu einer Modulation der B- Zell-gesteuerten Produktion von
53
tumorspezifischen Antikörpern führen [44]. Zahlreiche klinische Studien befassen sich
derweil mit der Modulation von NK- Zell Funktionen auf der Suche nach verbesserten
Karzinom- Immuntherapien [130]. Erst kürzlich wurde festgestellt, dass NK- Zellen zur Lyse
von soliden Tumorzell- Metastasen und transplantierten Tumoren fähig sind [86].
Viele tumoreigene Mechanismen stellen Hindernisse für eine zellbasierte Immuntherapie dar.
Ein Tumor stellt per se eine physikalische Barriere gegen die Migration von Effektorzellen
auf [91]. Die Größe des Tumors und die damit verbundene Wachstumsrate kann die
Immunabwehr
überfordern
und
ein
Immunoediting
gar
zum
Entkommen
einer
Immunüberwachung führen [39, 120]. Eine Aktivierung der NK- Zellen kann durch eine
Überexpression oder ektope Expression von NKG2D Liganden auf Tumorzellen trotz
vorhandener MHC-I Antigen Expression erfolgen [36, 78]. Allerdings können diese Liganden
während einer Tumorprogression herunterreguliert und geshedded werden, wodurch die NKZell Aktivität beeinträchtigt wird [141].
Angesichts der durch den Tumor aufgestellten Hindernisse, würde ein spezifisches Antigen
auf einer Tumorzelle NK- Zellen dazu befähigen können, eine effektive Immunantwort gegen
dieses Angriffziel zu leisten, falls es gelänge über ein vermittelndes Konstrukt spezifisch eine
Kommunikation zwischen Tumor- und NK-Zelle zu etablieren. Die vorliegende Arbeit
beschäftigt sich mit der Strategie, eine Quervernetzung zwischen NK- und soliden TumorZellen herzustellen, welche unabhängig von einer direkten Kommunikation zwischen beiden
Zellen ist. Der Kern dieser Strategie liegt in den Erfahrungen mit dem Konstrukt ULBP2BB4, das ursprünglich gegen das Multiple Myelom erfolgreich getestet worden ist [138]. Der
Nachweis einer erhöhten, NK- Zell vermittelten Lyse ULBP2- transfizierter 293T- Zellen
bestätigt das Prinzip der Liganden getriggerten NK- Zellaktivierung, die unabhängig von
einer MHC-1 Expression abläuft [138]. Sie bildet den ersten Grundstein der Strategie.
ULBP2-BB4 führt zu einem drastisch verzögerten Tumorwachstum der Kolon- Tumor
Zelllinie LS174T und zu einer Tumorreduktion von primären, transplantierten KolonTumoren. In der vorliegenden Arbeit konnte bestätigt werden, dass ULBP2-BB4 das
Wachstum solider Tumore effektiv beeinträchtigen und damit den zweiten und letzten nötigen
Grundstein
für
die
Generierung
eines
spezifischen
NK-
Zell
abhängigen
Immuntherapeutikums gegen solide Tumore zu legen vermag. Das ULBP2-BB4, als Muster
eines Immunoliganden, kann die Grenzen der NK Zell- basierten Immuntherapie überwinden.
Die Expression von CD138 auf unterschiedlichen neoplastischen als auch gesunden Zellen
des Menschen macht es allerdings notwendig spezifische Immunoliganden gegen andere
Tumor-assoziierte Antigene zu generieren.
54
4.2. PSMA- spezifische Immunoliganden unterscheiden sich aufgrund
ihres Oligomerisierungsgrades in ihrer Fähigkeit, NK- Zellen zu
aktivieren
ULBP2-BB4 stand nach den beschriebenen in vivo Versuchen als Grundgerüst und Modell für
die Konstruktion eines spezifischeren Immunoliganden zur Verfügung. Die Wahl eines
geeigneten tumorassoziierten Antigens spielt in der immuntherapeutischen Behandlung von
Tumoren eine signifikante Rolle [82]. Mit der Begründung solide Tumorzellen spezifisch der
NK- Zell abhängigen Lyse zugänglich zu machen, wurde das PSMA- ScFv anstelle des BB4ScFv mit einem Liganden des aktivierendem NKG2D- Rezeptors auf NK- Zellen fusioniert
und unterschiedliche Formate des Immunoliganden durch Modifikation der ScFv-Linkers
oder Insertion eines Zipper-Peptids generiert. Das Antigen PSMA zeichnet sich im Vergleich
zu BB4 durch eine höhere Tumorspezifität aus. Im gesunden Prostatagewebe wird es gering,
bei Prostata- Karzinomen, Metastasen und dem, in seiner Prognose sehr ungünstigen,
Androgen-resistenten Prostata- Karzinom hingegen sehr stark exprimiert [117]. Auf anderen
gesunden Zellen des Organismus kommt PSMA nicht vor [19]. Die Benutzung von PSMA als
ein Zielantigen ist in letzter Zeit mehr als nur ein rein hypothetischer Vorschlag geworden.
Jüngste Studien demonstrieren die Effektivität eines anti- PSMA-Radio-Immunkonjugates,
welches gegen metastasiertes Prostata- Karzinom eingesetzt werden soll und in ersten
Versuchen eine effektive Anreicherung im Tumor und Knochenmetastasen erreichte [5, 6].
Darüber hinaus wurde eine Protein- Vakzine bestehend aus der extrazellulären Domäne von
PSMA zur Therapie des metastasiertem Prostata- Karzinoms entwickelt. Die Verabreichung
wurde von den Patienten gut toleriert und resultierte in einer Bildung von eigenen
Antikörpern, die gegen die Tumorzellen reagierten [97]. Mehrere Forschungsgruppen konnten
zeigen, dass PSMA auch selektiv in Gefäßen von soliden Tumoren, jedoch nicht im normalen
Gewebe exprimiert wird [20, 56, 85, 117]. Der Gebrauch von PSMA in der AntiangiogeneseTherapie wurde mit humanisierten anti- PSMA Antikörpern anhand von zwei erfolgreichen
Phase I Studien an Patienten mit soliden Tumoren demonstriert [92, 95]. Als Bestandteil des
Immunoliganden- Konzeptes stellt PSMA einen ideales Zielantigen dar.
Eine Kürzung des Standard Linkers von 15- zu 5- und zu 2- Aminosäure –Resten und die
Verwendung
eines
Isoleuzin-
Zipper
Proteins
führt
zur
Oligomerisierung
der
Immunoliganden. Eine Oligomerisierung durch Linkerkürzung ist für ScFv beschrieben
worden und lässt sich auf die Immunoliganden übertragen. Alle vier Immunoliganden binden
sowohl an PSMA-positive Targetzellen als auch an NK- Zellen zugleich. Ihre Bindung an
55
Targetzellen kann kompetitiv mit einem PSMA- Antikörper gehemmt werden und wird somit
spezifisch über das PSMA- ScFv geschlossen.
Es ist erstrebenswert, die Immunoliganden in eine multivalente Form zu überführen, da
monovalent geschlossenen Bindungen im Gewebemilieu und in benachbarten Gefäßen eine
hohe Dissoziationsrate aufweisen und eine nur mäßige Retentionszeit am Zielantigen
garantieren [65]. Multivalente Moleküle weisen eine signifikante Verbesserung der
funktionellen
Affinität
und
eine
signifikant
langsamere
Dissoziationsrate
von
Zelloberflächenantigenen auf. Vielmehr ermöglicht die Oligomerisierung der bispezifischen
Immunoliganden nicht nur eine verbesserte Bindung an die Zielzelle, sondern auch ein
effektiveres cross-linking von Effektorzellen, das maßgeblich zu einer verbesserten NK- Zell
Aktivierung beiträgt. Die als Monomer und Dimer vorliegenden Immunoliganden ULBP2PSMA+15 und ULBP2-PSMA+5 sind zwar in immobilisierter Form dazu in der Lage die
IFNγ Sekretion der NK- Zellen zu stimulieren, dies liegt jedoch daran, dass eine
Immobilisierung der Immunoliganden ein cross-linking nachahmt. Die als Oligomer
vorliegenden Immunoliganden ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 aktivieren
NK- Zellen auch in löslicher Form und verstärken die NK- Zell abhängige Lyse von PSMA
positiven Tumorzellen in vitro. Die biologische Aktivität der oligomerisierenden
Immunoliganden wird höchstwahrscheinlich über die Bindung an den NKG2D- Rezeptor
vermittelt, da die NK- Zell Aktivierung mit einem anti-NKG2D Antikörper kompetitiv
gehemmt werden kann. Oligomerisierende Immunoliganden befähigen NK-Zellen in ihrer
Funktion als Verknüpfung des angeborenen- mit dem adaptiven Immunsystem zu wirken,
indem sie eine Zytokinausschüttung hervorrufen, die die Reifung von Dendritischen- zu
professionell antigenpräsentierenden Zellen zu initiieren vermag.
4.3. Bedeutung
des
immuntherapeutischen
ULBP2-PSMA+2
Behandlung
von
zur
soliden
spezifischen
Tumoren
am
Beispiel des Prostata- Karzinoms
Die Effektivität der Antikörper- basierten Immuntherapie beruht auf der Fähigkeit
monoklonaler Antikörper und deren Fragmente, Tumorzellen über Tumor- assoziierte
Antigene schon bei einem geringen Expressionsniveau von gesunden Zellen zu unterscheiden
[65]. Sie hat sich in der Therapie von zirkulierenden Tumorzellen bereits bewährt. Dies liegt
in einer besseren Zugänglichkeit der Lymphom- und Leukämiezellen für monoklonale
56
Antikörper als gegen solide Tumoren. In der Behandlung von soliden Tumoren ist es
notwendig, neue Ansätze zu entwickeln [150].
In der vorliegenden Arbeit konnte durch einen Tierversuch gezeigt werden, dass der
Immunoligand ULBP2-PSMA+2 das Wachstum von bereits etablierten Prostatatumoren
signifikant inhibieren konnte. Betrachtet man zusätzlich den Tierversuch 3.1, bei dem auch
eine PBL- Kontrollgruppe mitgeführt wurde, so lässt sich feststellen, dass PBL’s alleine
bereits einen Effekt auf Tumoren ausübten. In Kombination mit einem oligomerisierenden
Immunoliganden war jedoch eine deutlich verbesserte Wirkung zu erzielen. Hervorgehoben
werden soll die Tatsache, dass bereits etablierte Prostatatumoren unter der Behandlung zu
einer Regression des Wachstums gebracht werden konnten. Insofern als bei den
Tierversuchen PBLs als Effektorzellen benutzt worden sind und T- Zellen NKG2D als Kostimulatorischen Rezeptor exprimieren, kann nicht ausgeschlossen werden, dass sie an der
Tumorzell- Lyse mitbeteiligt sind. Allerdings war in Zytotoxizitäts- Versuchen der Einsatz
von aufgereinigten NK- Zellen im Vergleich zu PBLs erfolgreicher. Darüber hinaus stimmen
die erhöhten NK- Zell bedingten Lysewerte mit 10-20% mit denen aus vergleichbaren Studien
bei gleichem Effektor-/ Zielzellenverhältnis überein [18, 46, 138]. Mit der relativ geringen
Lyseaktivität konnte dabei eine signifikante Wachstumshemmung von MICA- transfizierten
Gliomzellen und der Multiplen Myelom Zelllinie RPMI-8226 durch ULBP2-BB4
bei
Versuchtieren beobachtet werden [46, 138]. Es ist jedoch unklar, welche Rolle TLymphozyten in diesem Szenario spielen. In dieser Arbeit wird demonstriert, dass der
Immunoligand ULBP2-PSMA+2 eine effektive und vor allem spezifische NK- Zell
abhängige Immunantwort vermittelt. In gleicher Weise wurde eine NK- Zell spezifische antiTumor Aktivität gegen karzinoembryonales Antigen- (CEA) und humanen epidermalen
Wachstumsfaktor 2 (Her2)- exprimierende Tumorzellen anhand eines bispezifischen Proteins
-ScFv anti-TAA/rH60-Fc- gezeigt [49].
Typischerweise werden NK- Zellen nicht in großer Zahl in Tumoren vorgefunden, was darauf
hinweist, dass sie nicht effizient in malignes Gewebe eindringen können [24, 70, 136].
Allerdings scheint eine erhöhte Infiltration von NK- Zellen in soliden Tumoren mit einer
besseren Prognose zu korrelieren. Die Fähigkeit der NK- Zellen das Tumorgewebe zu
infiltrieren hängt mit ihrem Grad der Aktivierung zusammen [57, 64]. Wald et al. konnten
zeigen, dass IFNγ eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Anreicherung von NK- Zellen
im Tumorgewebe inne hat, indem es die NK- Zellen aus ihren Speichern im Knochenmark
und der Milz in die Blutzirkulation mobilisiert. IFNγ hat jedoch keine Effekt auf die
Mobilisation von T- Zellen [140]. Idealerweise verursachen die Immunoliganden über die
57
Aktivierung der NK- Zellen und ihre Redirektionierung zu Tumorzellen eine vermehrte
Infiltration ins Tumorgewebe. Sie bedingen durch die getriggerte Ausschüttung von IFNγ eine
Anreicherung von weiteren NK- Zellen. Das cross-linking von Effektorzellen und
Tumorzellen durch den Immunoliganden ist hierbei der entscheidende Schritt zur
Überwindung der Tumorimmunität [120].
Die Behandlung mit einem Immunoliganden plus Effektorzellen hat zu einer effektiveren
anti- Tumor Antwort in allen in vitro und in vivo Versuchen geführt. Die in vivo Versuche
zeigen, dass die Immunoliganden alleine nicht toxisch sind. Das Immunoliganden Konzept
ermöglicht eine zielgerichtete biologische Therapie. Die Folgen einer systemischen
Anwendung im Hinblick auf eine Toxizität sind bisher nicht untersucht.
4.4. Mögliche Rolle von Immunoliganden und NK- Zellen für die
spezifische Immuntherapie
Das Ziel der zugrunde liegenden Arbeit war es zu zeigen, dass die Immunoliganden als neue
Werkzeuge einer zielgerichteten Tumorbehandlung, die Grenzen der NK- Zell-basierten
Immuntherapie überwinden können. Sie bieten umfangreiche neue Möglichkeiten im Hinblick
auf die Anwendbarkeit für unterschiedliche solide Tumormodelle. Die hier verwendeten
bispezifischen Immunoliganden wurden auf Basis von murinen ScFv- Antikörpern kloniert.
Unter der Annahme, dass Immunoliganden während einer Therapie repetetiv verabreicht
werden sollen, wird der Einsatz von humanen ScFv bevorzugt, da murine ScFv durch die
Stimulation einer humanen anti- Maus- Antikörper- (HAMA) Immunantwort unerwünschte
Nebenwirkungen hervorrufen können. Lösliche Liganden rufen ein Shedding von NKG2DLiganden auf etablierten Tumoren hervor und verursachen, dass sich diese einer
Immunantwort entziehen können [54, 112]. Es kann spekuliert werden, dass die
oligomerisierenden Immunoliganden durch ihre komplexe Struktur zu einer veränderten
Wirkungsweise mit dem NKG2D- Rezeptor führen und es nicht zu einer Inhibition des
NKG2D- Rezeptors kommt. Coudert et al. zeigten neuerdings, dass eine anhaltende
Aktivierung der NK- Zellen über den NKG2D Rezeptor zu einer Kreuztoleranz eines DAP10
unabhängigen Aktivierungsweges, wie der ADCC oder des „Missing Self“, führt. Eine
DAP10 unabhängige Aktivierung hat umgekehrt keinen Effekt auf den NKG2D Mechanismus
[28]. Es kann gemutmaßt werden, dass eine effektivere und spezifische Aktivierung von NKZellen durch einen Immunoliganden- Cocktail, der auf mehr als nur auf einen aktivierenden
NK- Zell Rezeptor abzielt, ermöglicht werden könnte, um eine Beeinträchtigung der NKG2Dvermittelten Tumorimmunität zu verhindern. Die Entdeckung von neuen NK- Zell Rezeptor
58
aktivierenden Liganden, wie des letztlich beschriebenen Bat3, eines Liganden von NKP30,
könnte einen wichtigen Bestandteil in der Generierung eines therapeutischen Cocktails
darstellen [104]. Eine weitere Möglichkeit bestünde im Einsatz von Immunoliganden
zusammen mit Substanzen, die die Expression von Zielantigenen hochregulieren können. Als
Beispiel dient BIIB021 (CNF2024), ein Heat Shock Protein 90 (HSP90) Inhibitor, der die
Expression von NKG2D- Liganden auf Hodgkin Lymphomzellen erhöht und sie einer NKZell vermittelten Lyse zugänglich macht [11].
Die NK- Zell Funktion ist im Hinblick auf Proliferation, Aktivierbarkeit und Zytotoxizität bei
Patienten mit Neoplasien eingeschränkt [144, 145]. Behandelte Patienten mit einer hohen
peripheren NK- Zell Aktivität haben eine signifikant längere Metastasen- freie
Überlebenszeit, als jene mit einer niedrigen NK- Zell Aktivität. Patienten mit soliden
Tumoren haben generell eine geringe NK- Zell Aktivität [120]. Aus den Ergebnissen mit dem
anti-CD20 Antikörper Rituximab beim B-Zell Lymphom ist ersichtlich, dass NK- Zellen die
ADCC steigern können [93]. Ferner hat die in vivo Modulation der NK- Zell Funktion an
Bedeutung dazu gewonnen. Daran beteiligt sind die Zytokine IL2 und IL12, die
immunstimulatorischen
Medikamente
Thalidomid
und
Lenalidomid,
als
auch
immunstimulatorische DNA Komplexe, die die Zytokinsekretion der NK- Zellen beeinflussen
und diese in vivo aktivieren können [4, 25, 61]. Eine weitere Möglichkeit besteht in dem
Einsatz von Heat Shock Protein 70 (HSP70), das über die Induktion von NKG2D- Liganden
auf DCs zur Aktivierung von NK- Zellen beiträgt [107].
Die Kombination eines spezifischen Immunoliganden- Cocktails mit NK- Zell aktivierenden
Substanzen könnte die Basis für die zukünftige Entwicklung einer NK- Zell basierten
Immuntherapie gegen solide Tumoren bilden. Ob sie letztendlich dazu in der Lage sein wird,
selektiv Tumorzellen zu zerstören und das Risiko eines Rezidivs und Metastasen zu
vermindern und das Überleben zu verlängern, wird in weiteren Untersuchungen zu zeigen
sein.
59
5. Zusammenfassung
Das vermehrte Auftreten von Karzinomerkrankungen, die u.a. auf die demografische
Überalterung zurückzuführen ist, und ein Ausbleiben von kurativen Therapien bei
metastasierten Karzinomen, erfordert neue Therapiestrategien. Eine zentrale Rolle bei der
Entstehung von Karzinomen spielt das Immunsystem, welches unfähig ist entartete Zellen zu
zerstören. Diese Immuninkompetenz wird teilweise einer ineffektiven Aktivierung von NKZellen und zahlreichen Tumor- Evasionsmechanismen zugeschrieben.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ziel, eine direkte Kommunikation
unabhängig von der Expression von Liganden aktivierender NK-Zell-Rezeptoren und
ziegerichtet gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen herzustellen. Die in dieser Arbeit
eingesetzten bispezifischen Konstrukte bestehen aus einem scFv, das ein Zell- spezifisches
Antigen auf soliden Tumoren bindet, verknüpft mit einem aktivierenden Liganden des NKRezeptors NKG2D, dem ULBP2 – genannt „Immunoliganden“. Die Wirksamkeit eines
Immunoliganden wurde bereits mit dem ULBP2-BB4 gegen das Multiple Myelom (MM)
gezeigt. Das BB4- scFv bindet an CD138, das auf Zellen des MM, solider Tumoren, aber
auch auf der Oberfläche normaler Zellen exprimiert wird. Als „proof of principle“ konnte in
der zugrunde liegenden Arbeit gezeigt werden, dass ULBP2-BB4 außerdem zu einem
drastisch verzögerten Tumorwachstum der Kolon- Tumor Zelllinie LS174T und zu einer
Tumorreduktion
von
primären,
transplantierten
humanen
Kolon-
Tumoren
in
immundefizienten Mäusen führt und somit bei soliden Tumoren effektiv ist.
Mit der Begründung solide Tumorzellen spezifisch der NK- Zell abhängigen Lyse zugänglich
zu machen, wurde ein Prostata-spezifische-Membranantigen (PSMA)-spezifisches scFv
anstelle des BB4- scFv mit ULBP2 fusioniert und unterschiedliche Formate des
Immunoliganden durch Modifikation der scFv-Linker oder Insertion eines Zipper-Peptids
generiert. PSMA wird im gesunden Prostatagewebe gering, auf Prostata- Karzinomen, Metastasen und dem in seiner Prognose sehr ungünstigen, Androgen-resistenten ProstataKarzinom hingegen sehr stark exprimiert. Dies ermöglicht die Nutzung des PSMA-Moleküls
als Zielantigen für die antikörperbasierte Immuntherapie von PSMA-positiven Tumoren. Die
Expression, Aufreinigung und der Nachweis der Bindungsfähigkeit an NK- und an den
Targetzelllinien LNCaP und MCF7 wurde für die Immunoliganden ULBP2-PSMA+15,
ULBP2-PSMA+5, ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 nachgewiesen. Eine
Kürzung des Standard Linkers von 15- zu 5- und zu 2- Aminosäure -Resten und die
Verwendung
eines
Isoleuzin-
Zipper
Proteins
führte
zur
Oligomerisierung
der
Immunoliganden. Die Oligomerisierung ermöglichte nicht nur eine verbesserte Bindung an
60
die Zielzelle, sondern auch ein effektiveres cross-linking von Effektorzellen, welches
maßgeblich
zu
einer
verbesserten
NK-
Zell
Aktivierung
beitrug.
Einzig
die
oligomerisierenden Immunoliganden ULBP2-PSMA+2 und ULBP2-IleZip-PSMA+15 waren
dazu in der Lage, in vitro maligne Zellen NK- Zell abhängig zu lysieren. Darüber hinaus
gelang der Nachweis einer signifikanten Wachstumsinhibition von bereits etablierten PSMApositiven Prostatatumoren durch ULBP2-PSMA+2 in vivo. Die Daten zeigen auf, dass
Immunoliganden die Grenzen der NK Zell- basierten Immuntherapie überwinden können.
Durch die Möglichkeit des Einsatzes von ScFv gegen unterschiedliche tumorspezifische
Antigene stellen sie eine Basis für die Entwicklung neuer therapeutischer Optionen dar. Die
systemische Applikation von Immunoliganden zusammen mit Substanzen, die eine in vivo
Modulation von NK- Zellen hervorrufen, bilden ein viel versprechendes Konzept für eine
NK- Zell basierte Immuntherapie gegen solide Tumoren.
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Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung
meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
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