Enzym-Mechanismen (Abb. 1) Bei den letzten Vorlesungen haben

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Enzym-Mechanismen
(Abb. 1) Bei den letzten Vorlesungen haben wir uns mit einigen allgemeinen
Prinzipien bezüglich Enzymwirkungsweise und Enzymkinetik befasst. Im
Folgenden werden wir uns mit drei wichtigen Enzymen, und zwar
α-Chymotrypsin, Hexokinase und Enolase beschäftigen, um ihre
Wirkungsmechanismen kennen zu lernen und weitere allgemeine Prinzipien
bezüglich Enzymfunktionsweise und Enzymkinetik zu erhalten.
Um den Wirkungsmechanismus eines isolierten und gereinigten Enzyms
vollkommen zu verstehen, sollte Folgendes bekannt sein, und zwar: (1) aus wie
vielen Phasen die Reaktion besteht, (2) die chemische Zusammensetzung der
Substrate, Zwischenprodukte, Übergangszustände, Produkte, Cofaktoren und
Regulatoren (die Natur der Übergangszustände und die Funktion der Regulatoren
werden noch heute diskutiert), (3) die Konformation des Enzyms, das heisst seine
primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Struktur, (4) die Konformation des
aktiven Zentrums, das heisst seine funktionellen Gruppen und ihre räumliche
Anordnung, (5) wie sind die einzelnen funktionellen Gruppen des Aktiven
Zentrums in Bindung und Veränderung des Substrats, der Übergangzustände, der
Zwischenprodukte und des Produkts beteiligt, (6) wie verändert sich die
Konformation des aktiven Zentrums durch den Einfluss des gebundenen Substrats,
der Zwischenprodukte und Übergangszustände, (7) wie verändert sich die
Konformation des Enzyms durch den Einfluss von Coenzymen und Regulatoren,
(8) die Kinetik der einzelnen Reaktionsphasen, (9) die Energieverhältnisse der
einzelnen Reaktionsphasen, (10) und für das betrachtete Enzym spezifische
Eigenschaften. Man muss gestehen, dass es kein Enzym gibt, bei dem alles
Wissenswerte bekannt ist.
(Abb. 2) Das erste zu diskutierende Enzym, das α-Chymotrypsin, ist eine
Protease, das die hydrolytische Spaltung von solchen Peptidbindungen katalysiert,
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die einem aromatischen Aminosäurerest benachbart sind. Über α-Chymotrypsin
haben Sie schon gehört, dass es die Peptidbindung durch eine kovalente,
nukleophile, allgemeine Säure-Base Reaktion hydrolysiert. Die Primärstruktur des
α-Chymotrypsin besteht aus einer kurzen Kette zwischen den Aminosäureresten 1
und 13, und zwei langen Ketten zwischen den Aminosäureresten 16 und 146,
beziehungsweise 149 und 245. In der dargestellten Primärstruktur fehlen vier
Aminosäurereste, 14., 15., 147. und 148. Der Grund dafür wird bei den
regulatorischen Enzymen erklärt. Diese drei Ketten sind durch zwei DisulfidBrücken miteinander verknüpft. Drei andere Disulfid-Brücken bilden
intramolekulare Ringe innerhalb der langen Ketten. Die für die Katalyse
essentiellen Aminosäurereste und zwar Histidin, der 57., Aspartat, der 102., Glycin,
der 193. und Serin, der 195. Aminosäurerest sind mit roter Farbe gekennzeichnet.
Obwohl diese Aminosäurereste in der Primärstruktur weit voneinander entfernt
existieren, sind sie in der dreidimensionalen Struktur des Enzyms im aktiven
Zentrum benachbart.
In dem Kalottenmodell des α-Chymotrypsin ist die so genannte hydrophobe
Tasche des Aktiven Zentrums, wo die fragliche aromatische AminosäureSeitenkette gebunden wird, grün. Die essentiellen Aminosäureresten befinden sich
im roten Teil des aktiven Zentrums. Abbildungsteil c stellt das Molekulargerüst des
Enzyms schematisch dar. Die hier verwendete Farbkodierung ist gleich der
Farbkodierung der Primärstruktur.
Abbildungsteil d ist eine Nachaufnahme des aktiven Zentrums mit dem
Stäbchen-Kügelchen-Modell eines Abschnittes des Substrats, dessen Teile
unterschiedlich gefärbt sind; die fragliche aromatische Aminosäure Seitenkette in
der hydrophoben Tasche und das Stickstoffatom der aufzuspaltenden
Peptidbindung sind blau, das Sauerstoffatom der Peptidbindung in dem OxanionLoch violett und ein nicht-reagierender Teil der des Substrats grün. Die rotfarbigen
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Stäbchen und Kügelchen symbolisieren Teile der essentiellen Serin- und HistidinReste des aktiven Zentrums, während sich die essentiellen Aspartat und Glycin
Reste an unsichtbaren Stellen befinden. Die Rolle des orangefarbigen OxanionLochs des Aktiven Zentrums wird in der nächsten Abbildung erklärt.
(Abb. 3) Die von α-Chymotrypsin katalysierte hydrolytische Spaltung einer
Peptidbindung besteht aus vier Phasen. In der ersten Phase bildet sich ein EnzymSubstrat-Komplex. Dies wandelt sich in der zweiten Phase über einen
Übergangszustand zu einem Enzym-Acyl-Komplex und dem Produkt-1, das ein
Teil des Substrats mit einer endständigen Aminogruppe ist. In der dritten Phase
wandelt sich der Enzym-Acyl-Komplex über einen Übergangszustand zu einem
Enzym-Produkt-2-Komplex. In der letzten Phase spaltet sich von dem Enzym
Produkt-2 ab, das der andere Teil des Substrats mit einer endständigen
Carboxylgruppe ist.
Aus energetischem Gesichtspunkt befinden sich sowohl das Substrat und die
Produkte als auch die drei Komplexe des Enzyms entweder mit dem Substrat oder
mit seinen Derivaten in einem metastabilen Zustand. Bei allen Übergängen aus
einem dieser Zustände zum anderen muss je eine Energiebarriere überwunden
werden. Die dazu benötigten freien Aktivierungsenthalpien können von der
durchschnittlichen thermischen Energie der Lösungsmittel-Moleküle geliefert
werden, im Gegensatz zu der großen freien Aktivierungsenthalpie der
unkatalysierten Reaktion, die von den schnellsten Lösungsmittelmolekülen
geliefert werden können, durch produktive Zusammenstösse mit den
Peptidbindungen. Außerdem könnten alle Peptidbindun-Arten gelöst werden, nicht
nur diejenigen, die einem aromatischen Aminosäurerest benachbart sind. Über die
Übergangszustände, die auf den Spitzen von zwei Energiebarrieren existieren,
werden Sie später vieles hören.
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In der siebenteiligen Abbildung ist α-Chymotrypsin hellblau, sein aktives
Zentrum dunkelblau. Das aktive Zentrum besteht aus einer hydrophoben Tasche,
einem Oxanion-Loch und einem langen Kessel. Die Seitenketten der essentiellen
Aminosäurereste des Enzyms, und zwar Aspartat, Histidin, Serin und Glycin, sind
hervorgehoben. Die Hydroxyl-Gruppe des Serinrests und die Carboxyl-Gruppe des
Aspartatrests sind über intramolekulare Wasserstoffbrücken mit den
Stickstoffatomen des Imidazol-Rings des Histidinrests gekoppelt, wobei eines der
Stickstoffatome als Protonendonator, das andere als Protonenakzeptor fungiert.
Was das Substrat betrifft, ist sein Carbonyl-Teil schwarz, sein Amid-Teil blau, die
nicht-reagierenden Peptid-Teile werden mit den Buchstaben AAn symbolisiert.
Die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes besteht darin, dass die fragliche
aromatische Seitenkette des Substrats in der hydrophoben Tasche des aktiven
Zentrums durch hydrophobe Wechselwirkungen festgebunden wird, während das
Stickstoffatom des Serinrests in dem Oxanion-Loch mit dem Sauerstoffatom der
Carbonylgruppe der aufzuspaltenden Peptidbindung eine Wasserstoffbrücke
herstellt. Unreagierende Substrat-Teile finden im Kessel Platz.
In dem Enzym-Substrat-Komplex befindet sich das Kohlenstoffatom der
Carbonylgruppe der aufzuspaltenden Peptidbindung in richtiger Position für die
Herstellung einer kovalenten Bindung mit dem Sauerstoffatom der HydroxylGruppe des Serinrests, und zwar auf dem nukleophilen Reaktionsweg, weil das
fragliche Kohlenstoffatom eine positive Partialladung und das fragliche
Sauerstoffatom eine negative Partialladung besitzen. Dabei spaltet sich das rote
Wasserstoffatom in Form eines Wasserstoffions aus der Serin-Hydroxylgruppe ab,
und stellt eine kovalente Bindung mit einem der Imidazol-Stickstoffatome her.
Seine positive Ladung wird zu dem anderen Stickstoffatom des Imidazol-Rings
verschoben, während sein am Serin-Sauerstoffatom hinterlassenes
Bindungselektron zu dem Sauerstoffatom in dem Oxanion-Loch verschoben wird.
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Inzwischen bilden sich zwei neue Wasserstoffbrücken, eine zwischen dem
Sauerstoffatom im Oxanion-Loch und dem Stickstoffatom des Glycinrestes des
Enzyms, und die andere zwischen dem Stickstoffatom der aufzuspaltenden
Peptidbindung und einem Stickstoffatom des Imidazol-Rings über das rote
Wasserstoffatom.
In dem so entstandenen Übergangszustand spaltet sich danach die
Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung der fraglichen Peptidgruppe unter Freiwerden
eines Substratteils mit einer endständigen Aminogruppe, die sowohl das rote
Wasserstoffatom und die positive Ladung vom Imidazol-Ring, als auch die
negative Ladung vom Sauerstoffatom im Oxanion-Loch mitnimmt. Das
zurückbleibende Zwischenprodukt ist ein kovalent gebundener Enzym-AcylKomplex. Acyl bedeutet, wie Sie wissen, eine Carboxylgruppe ohne ihren
Hydroxyl-Teil. Inzwischen bindet das freigewordene Stickstoffatom des ImidazolRings eine Wasserstoffbrücke mit einem Wassermolekül durch das rote
Wasserstoffatom.
Der Hydroxylion-Teil dieses Wassermoleküls bindet sich danach auf dem
nukleofilen Weg an das Kohlenstoffatom der Carbonyl-Gruppe des Enzym-AcylZwischenprodukts, während sein roter Wasserstoffion-Teil von dem Stickstoffatom
des Imidazol-Rings kovalent gebunden wird. Die positive Ladung dieses
Wasserstoff-Ions wird zu dem anderen Stickstoffatom des Imidazol-Rings
verschoben, während die negative Ladung des Hydroxyl-Ions zu dem
Sauerstoffatom im Oxanion-Loch verschoben wird. Zwei neue Wasserstoffbrücken
bilden sich dabei, eine zwischen diesem Sauerstoffatom und dem Stickstoffatom
des Glycinrestes im Oxanion-Loch, die andere zwischen einem Stickstoffatom des
Imidazol-Rings und dem Sauerstoffatom des Serinrests über das rote
Wasserstoffatom.
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In dem so entstandenen Übergangszustand spaltet sich die SauerstoffKohlenstoff-Bindung zwischen dem Acyl-Teil des Substrats und des Serinrests,
wobei die negative Ladung aus dem Oxanion-Loch zum Serin-Sauerstoff
verschoben wird. Währenddessen wird von dem Imidazol-Ring das rote
Wasserstoffatom und eine positive Ladung, das heisst ein Wasserstoffion, an den
Serin-Rest des Enzyms abgegeben, wo die erwähnten positiven und negativen
Ladungen einander ausgleichen. Der so entstandene Substrat-Teil mit einer
endständigen Carboxylgruppe bleibt für eine kurze Zeit über schwache
Wechselwirkungen an das Enzym gebunden, danach verlässt er das Enzym als
Produkt-2.
Es ist bemerkenswert, dass Schritte 2 und 5 ähnlich sind. In beiden leitet ein
nicht-bindendes Elektronenpaar einer Hydroxyl-Gruppe, das heisst eine Base, die
Reaktion ein. Dagegen werden die Reaktionen in den Schritten 3 und 6 von einem
Wasserstoffion, das heisst einer Säure, eingeleitet. Das ist also eine Säure-BaseKatalyse. Das α-Chymotrypsin katalysiert also nicht die direkte Reaktion zwischen
einer Peptidbindung und einem Wassermolekül, sondern bahnt einen neuen Weg,
auf dem das an der Hydrolyse beteiligte Wasserstoffion aus dem Serin-Rest des
Enzyms stammt, wie es in Abbildungsteilen 2-4 zusehen ist. Dann bekommt dieser
Serin-Rest auf dem in Abbildungsteilen 5-7 demonstrierten Weg ein
Wasserstoffion aus einem Wassermolekül zurück. Der Histidin-Rest spielt direkt,
und der Aspartatrest indirekt mit dem Serin-Rest bei der Vermittlung der fraglichen
Wasserstoffatomen zusammen. Diese drei Aminosäurereste heißen katalytische
Triade. Der Glycinrest spielt durch vorübergehende Stabilisierung der negativen
Ladung des Sauerstoffatoms im Oxanion-Loch in den Übergangszuständen eine
Nebenrolle.
(Abb. 4) Neben der Hydrolyse solcher Peptidbindungen, die einem
aromatischen Aminosäurerest benachbart sind, katalysiert das α-Chymotrypsin die
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Hydrolyse von Peptidgruppen anderer Aminosäurereste, aber um Größenordnungen
langsamer. Darüber hinaus katalysiert das α-Chymotrypsin die hydrolytische
Spaltung von Carbonsäure-Estern und Carbonsäure-Amiden, die - wie
Peptidbindungen - eine Acyl-Gruppe enthalten. Die Untersuchung der
Reaktionskinetik ihrer Hydrolyse hat wichtige Hinweise für den
Wirkungsmechanismus von α-Chymotrypsin geliefert.
Der erste Hinweis auf eine kovalente Enzym-Acyl-Bindung stammt von
einem Experiment, bei dem p-Nitrophenylacetat, eine farblose Substanz, von αChymotrypsin zu Essigsäure und p-Nitrophenol, eine farbige Substanz, hydrolysiert
wurde. Die Menge des entstehenden p-Nitrophenols wurde anhand seiner Farbe
fotometrisch gemessen. Es stellte sich heraus, dass die Geschwindigkeit der pNitrophenol-Entstehung in der ersten Sekunden der Reaktion viel größer war, als
später. Daraus wurde geschlossen, dass bevor sich ein Fließgleichgewicht zwischen
der Bildung und der Spaltung des Enzym-Acyl-Komplexes einstellt, eine schnelle
Acylierung stattfindet, danach bestimmt die langsame Deacylierug die
Geschwindigkeit der Reaktion. Bei der Hydrolyse des eigentlichen Substrats von αChymotrypsin kann man dieses Phänomen nicht beobachten, weil die
Anfangsperiode, während der sich das Fließgleichgewicht einstellt, unmessbar kurz
ist.
(Abb. 5) Unter Übergangszustand versteht man die Struktur eines extrem
kurzlebigen Substrat-Derivats, das auf der Spitze einer Energiebarriere existiert. In
diesem Zustand ist die Komplementarität, das heisst die Wechselwirkung zwischen
Enzym und Substrat, am grössten.
Wegen ihrer extrem kurzen Lebenszeit kann die Struktur des SubstratDerivats im Übergangszustand nicht experimentell untersucht werden. In Kenntnis
des Reaktionsmechanismus ist es jedoch gelungen, langlebige Moleküle mit der
vermuteten Struktur der Übergangszustände zu synthetisieren. Sie werden Analoga
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der Übergangszustände genannt. Die projizierte Abbildung demonstriert die
vermuteten Übergangszustände und ihre Analoga bei der Esterhydrolyse und
Carbonat-Hydrolyse. In beiden Analoga befindet sich ein fünfwertiges, und deshalb
stabiles Phosphoratom an der intramolekularen Stelle, an der in den entsprechenden
Übergangszuständen ein fünfwertiges und deshalb sehr labiles Kohlenstoffatom
sitzt. Heutzutage gibt es einige Übergangszustand-Analoga, die sich tausendmal
stärker als das eigentliche Substrat an das aktive Zentrum des Enzyms binden
können, und daher als Inhibitor wirkende, sehr spezifische Medikamente verwendet
werden.
Wenn man ein Übergangszustand-Analogon an ein Polypeptid bindet, kann
man gegen den Analogon-Polypeptid-Komplex mithilfe der monoklonalen Technik
einen Antikörper herstellen, der als künstliches Enzym wirkt. Die heutigen
künstlichen Enzyme, die als katalytischer Antikörper bezeichnet werden, erreichen
die katalytische Wirksamkeit der entsprechenden natürlichen Enzyme noch nicht.
Sie haben aber viel versprechende industrielle und medizinische
Einsatzmöglichkeiten. Bei ärztlicher Behandlung von Kokain-Abhängigen wäre ein
künstliches Enzym für den Abbau von Kokain äußerst nützlich.
(Abb. 6) Das zweite zu diskutierende Enzym ist die Hexokinase. Sie
katalysiert die Übertragung einer Phosphorylgruppe aus Adenosintriphosphat an
das 6. Kohlenstoffatom der D-Glukose. Hexokinase bindet zwei Substrate. Eines
davon ist ein Mg++-ATP-Komplex. Das andere Substrat kann nicht nur D-Glucose
sein, sonder auch Wasser, mit dem der Mg++-ATP-Komplex unter Bildung von
Mg++-ADP-Komplex und Phosphatanion reagiert. Wassermoleküle haben
ungehinderten Zugang in das aktive Zentrum der Hexokinase. Trotzdem fällt auf
die Bildung von 106 D-Glucose-6-phosphat-Molekülen nur die Bildung eines
einzigen Phosphatanions. Der Grund dafür ist, dass Hexokinase eine
Konformationsänderung erfährt, sobald D-Glucose, das rote Molekül in der
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projizierten Abbildung, in ihrem aktiven Zentrum gebunden wird. Dadurch nimmt
die Komplementarität zwischen Hexokinase und D-Glucose erheblich zu, die eine
beachtliche Erhöhung ihre Aktivität verursacht. Die Konformationsänderung
besteht darin, dass sich die Arme des U-förmigen Enzyms zusammendrängen. Auf
Englisch heisst dieses Phänomen "induced fit". Im aktiven Zentrum gebundene
Wassermoleküle verursachen keine solchen Konformationsänderung im Enzym.
Die Tatsache der erwähnten Konformationsänderung und der dadurch
erhöhten Aktivität der Hexokinase wurde mit einem Experiment bewiesen, in dem
zu einer wässrigen Lösung von ATP-Mg++-Komplex und Hexokinase D-Xylose
zugegeben wurde. Dadurch wurde die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen
ATP und Wasser erheblich erhöht. D-Xylose ist eine Pentose, die in
stereochemischer Hinsicht der Struktur von D-Glucose ähnelt. Deshalb passt sie
präzise in das aktive Zentrum der Hexokinase und verursacht die gleiche
Konformationsänderung, wie D-Glucose. D-Xylose bleibt aber unphosphoryliert,
weil Hexokinase nur das sechste Kohlenstoffatom eines Zuckermoleküls
phosphorylieren kann. Die von der Konformationsänderung aktivierte Hexokinase
katalysiert dann die Reaktion zwischen ATP und Wasser um Größenordnungen
schneller, als ihre unveränderte Konformation.
Induced fit ist nur ein Aspekt für die katalytische Aktivität von Hexokinase.
Viele andere Aspekte, die ich Ihnen schon auseinandersetzte, wie Säure-BaseKatalyse, gelten auch bei Hexokinase.
(Abb. 7) Das dritte zu diskutierende Enzym ist Enolase. Sie katalysiert einen
Schritt der Glykolyse, die Dehydratisierung von 2-Phosphoglycerat zu
Phosphoenolpyruvat unter Freiwerden eines Wassermoleküls. Dies stammt aus
einer Hydroxyl-Gruppe am dritten Kohlenstoffatom und einem Wasserstoffatom
am zweiten Kohlenstoffatom des 2-Phosphoglycerats. An ihrer Stelle entsteht eine
Doppelbindung.
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Die Reaktion beginnt mit Bindung des 2-Phosphoglycerats vm Enzym, bei
der zwei im aktiven Zentrum des Enzyms befindliche Magnesium-Ionen essenziell
sind. Danach zieht das Stickstoffatom eines Lysinrestes des Enzyms ein
Wasserstoffatom vom zweiten Kohlenstoffatom des 2-Phosphoglycerats in Form
eines Wasserstoffions zu sich. Außerhalb des aktiven Zentrums ist eigentlich diese
Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung nicht polarisiert, weil beide beteiligten Atome
eine ähnliche Elektronegativität besitzen. Es sind die positiv geladenen
Magnesium-Ionen, die diese Bindung im aktiven Zentrum polarisieren und ihre
Spaltung durch Anziehung eines Elektrons, das heisst eine negative Ladung,
ermöglichen. Die blauen Pfeile zeigen die Richtung der Elektronenverschiebung.
Das dabei entstandene instabile Enzym-Enol-Zwischenprodukt wird dadurch
stabilisiert, dass sich seine in der Abbildung rote Hydroxyl-Gruppe in Form eines
negativ geladenen Hydroxid-Anions mit dem Wasserstoffion eines Glutamatrestes
des Enzyms zu einem Wassermolekül vereinigt. Die an dem Enzym-EnolZwischenprodukt zurückbleibende positive Ladung wird mit einer der negativen
Ladungen an seinen Carboxyl-Sauerstoffatomen durch Elektronenhüpfen
ausgeglichen. Schließlich spaltet sich das Phosphoenolpyruvat aus dem Enzym.
Diese Reaktion ist ein Beispiel nicht nur für die Metallion-Katalyse, sondern auch
für die allgemeine Säure-Base-Katalyse, weil im aktiven Zentrum des Enzyms die
Aminogruppe eines Lysinrests als Protonenakzeptor und eine Carboxylgruppe
eines Glutamatrests als Protonendonator in der Reaktion essenzielle Rolle haben.